EA037546B1 - Рекомбинантные захватывающие белки клеточной поверхности - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к рекомбинантному антигенсвязывающему белку, который связывается с Fc-доменом IgG1 человека, Fc-доменом IgG2 человека или Fc-доменом IgG4 человека, выделенному полинуклеотиду, кодирующему указанный белок, экспрессионному вектору, клетке-хозяину, экспрессирующей указанный белок, и способу детектирования или выделения клетки-хозяина, которая экспрессирует гетеродимерный белок.

Description

Предпосылки создания изобретения

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Эта заявка испрашивает согласно § 119(e) раздела 35 свода законов США приоритет предварительной заявки на патент США № 61/726040, поданной 14 ноября 2012 года, которая при этом включена сюда посредством ссылки в ее полном объеме.

Список последовательностей

Эта заявка включает посредством ссылки список последовательностей, представленный в машиночитаемой форме как файл 8600WO_ST25.txt, созданный 12 ноября 2013 года (86267 байтов).

Область техники

Область настоящего изобретения относится к рекомбинантным захватывающим белкам клеточной поверхности и способам идентификации, выделения клеток, продуцирующих секретируемые белки, которые являются гетеродимерами, например биспецифическими белками, и обогащения ими. Конкретнее захватывающие белки клеточной поверхности и способы позволяют быстро и эффективно выделить клеточные линии, продуцирующие рекомбинантные антитела на высоком уровне экспрессии, в том числе быстро и эффективно выделить специфические гибридомы и клетки, секретирующие гетеродимерные белки, например биспецифические антитела, тем самым обогатить гетеродимерным типом молекул (биспецифической молекулой) и преимущественно отделить гетеродимерный тип от гомодимерного типа молекул.

Способы известного уровня техники для экспрессии представляющего интерес гена (GOI) в клеткехозяине известны. Вкратце, экспрессионный вектор, содержащий GOI, вводят в клетку. После стабильной интеграции стандартные методы выделения клеток с высоким уровнем экспрессии включают сбор пулов клеток, отбор вручную колоний с чашек, выделение отдельных клеток с помощью предельного разведения или другие способы, известные в данной области техники. Пулы или отдельные клоны затем размножают и подвергают скринингу в отношении продукции представляющего интерес белка (POI) путем прямого измерения активности POI, путем иммунологического детектирования POI или с помощью других подходящих методов. Эти процедуры являются трудоемкими, неэффективными, дорогостоящими, и число клонов, которое можно проанализировать, обычно ограничивается несколькими сотнями.

Большая степень неоднородности в экспрессии белков клетками после стабильной интеграции предписывает скрининг множества отдельных клонов, чтобы идентифицировать редкое событие интеграции, которое приводит к стабильной линии клеток с высоким уровнем экспрессии - продукции. Это предписание вызывает необходимость в способах, которые позволяют быстро идентифицировать и выделить клетки, показывающие самый высокий уровень продукции белка. Кроме того, при сборе пулов клонов или отобранных вручную колоний возникает угроза потери клеток с высокими уровнями экспрессии, которые часто растут более медленно по отношению к более быстро растущим клеткам с низким уровнем экспрессии. Таким образом, существует потребность в способах, которые позволяют быстро скринировать и выделить отдельные клетки, способные к экспрессии на высоком уровне секретируемого POI. Если POI содержит более одной субъединицы, необходимо осуществить отбор преимущественно в пользу желаемого гетеродимерного типа относительно гомодимерного типа.

Включение проточной цитометрии в способы, используемые для выделения стабильных экспрессирующих линий клеток, увеличило возможность скрининга большого числа отдельных клонов, однако имеющиеся в распоряжении в настоящее время способы остаются несоответствующими по различным причинам. Диффузия POI между клетками с различными характеристиками также была проблемой.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение описывает способ скрининга с высокой пропускной способностью для быстрого выделения тех клеток, которые секретируют белок, посредством прямого скрининга в отношении представляющего интерес белка (POI). Это изобретение также обеспечивает возможность удобного слежения за экспрессией POI на основе одной клетки в ходе процесса производства. Кроме того, эта технология может быть непосредственно применена к скринингу продуцирующих биспецифические антитела клеток или любой клетки, продуцирующей гетеродимерный белок. Эта технология также может быть непосредственно применена к скринингу клеток, продуцирующих модифицированные T-клеточные рецепторы, таких как, например, клетки, которые продуцируют растворимые формы T-клеточных рецепторов.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к рекомбинантному антигенсвязывающему белку, который связывается с Fc-доменом IgG1 человека, Fc-доменом IgG2 человека или Fc-доменом IgG4 человека, где рекомбинантный антигенсвязывающий белок связывается с Fc-доменом и не связывается с Fc*-доменом, где Fc-домен содержит His95 и Tyr96, а Fc*-домен содержит Arg95 и Phe96 в соответствии с системой нумерации экзонов IMGT, и содержит (i) антитело или ScFv, содержащие CDR-1 тяжелой цепи (HCDR1), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, HCDR-2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28, HCDR-3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, CDR-1 легкой цепи (LCDR-1), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, и LCDR-2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31;

(ii) мембранный якорный домен, в частности, где

- 1 037546

а) антигенсвязывающий белок содержит HCVR, имеющую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 15, и LCVR, имеющую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 16, или

b) антигенсвязывающий белок содержит HCVR, имеющую аминокислотную последовательность

SEQ ID NO: 15, и LCVR, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16.

В одном из вариантов осуществления изобретения рекомбинантный антигенсвязывающий белок представляет собой слитый с ScFv белок, включающий

а) (i) вариабельный домен тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 15, (ii) вариабельный домен легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 16, и (iii) мембранный якорный домен, включающий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 21; или

b) (i) вариабельный домен тяжелой цепи, который имеет аминокислотную последовательность, идентичную SEQ ID NO: 15, (ii) вариабельный домен легкой цепи, который имеет аминокислотную последовательность, идентичную SEQ ID NO: 16, и (iii) мембранный якорный домен, включающий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 21.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, включающему последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует

a) антигенсвязывающий белок по изобретению; или

b) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:19.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к экспрессионному вектору в виде нуклеиновой кислоты, включающему (a) полинуклеотид по изобретению;

(b) промотор, который функционально связан с полинуклеотидом; и (c) последовательность полиаденилирования, предпочтительно к вектору, дополнительно включающему последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей

a) селектируемый маркер, или

b) используемый для переноса энергии белок, содержащий зеленый флуоресцентный белок или желтый флуоресцентный белок (YFP), более предпочтительно, к вектору, где:

a) промотор представляет собой промотор CMV;

b) селектируемый маркер придает устойчивость к неомицину;

c) используемым для переноса энергии белком является зеленый флуоресцентный белок или желтый флуоресцентный белок (YFP), еще более предпочтительно к вектору, замкнутому в круг или линейному.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, экспрессирующему антигенсвязывающий белок по изобретению, предпочтительно где клеткой является клетка СНО.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу детектирования или выделения клетки-хозяина, которая экспрессирует гетеродимерный белок, включающий стадии (a) экспрессии в клетке-хозяине захватывающего белка клеточной поверхности (CSCP), содержащего антигенсвязывающий белок по изобретению, и гетеродимерного белка, где (i) CSCP связывается с первым сайтом в гетеродимерном белке с образованием комплекса CSCP-гетеродимерный белок внутри клетки-хозяина, (ii) комплекс CSCP-гетеродимерный белок переносится через клетку-хозяин и (iii) затем представляется на поверхности клетки-хозяина;

(b) приведения клетки-хозяина в контакт с детекторной молекулой, причем детекторная молекула связывается со вторым сайтом в гетеродимерном белке;

(c) отбора клетки-хозяина, которая связывается с детекторной молекулой, где в гетеродимерном белке (i) первый сайт находится в тяжелой цепи, которая имеет CH3-домен, содержащий остаток гистидина в положении 95 и остаток тирозина в положение 96 в соответствии с системой нумерации экзонов IMGT (Fc); и (ii) второй сайт находится в тяжелой цепи, которая имеет CH3-домен, содержащий остаток аргинина в положении 95 и остаток фенилаланина в положении 96 в соответствии с системой нумерации экзонов IMGT (Fc*).

В одном из вариантов осуществления изобретения способ включает стадию приведения клеткихозяина в контакт с блокирующей молекулой до отбора клетки-хозяина на стадии (c), причем блокирующая молекула связывается с CSCP, который не связан с гетеродимерным белком, но не связывается с комплексом CSCP-гетеродимерный белок, предпочтительно где стадию отбора (c) выполняют с помощью сортировки клеток с возбуждением флуоресценции.

В другом варианте осуществления изобретения в способе по изобретению гетеродимерный белок

- 2 037546 включает антитело, и первый сайт находится в антителе и расположен в тяжелой цепи, включающей

СНЗ-домен дикого типа.

В другом варианте осуществления изобретения в способе по изобретению детекторная молекула (DM) включает (a) антигенсвязывающий белок, включающий вариабельный домен тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 38, и вариабельный домен легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 39, или (b) антигенсвязывающий белок, включающий тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 40, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 41, предпочтительно где блокирующей молекулой является нечеловеческий IgG или Fcмолекула человека.

Другие цели и преимущества станут очевидными в результате рассмотрения последующего подробного описания.

Подробное описание настоящего изобретения

Прежде чем способы настоящего изобретения будут описаны, следует понимать, что это изобретение не ограничивается конкретными способами и экспериментальными условиями, которые описаны, поскольку такие способы и условия могут изменяться. Также следует понимать, что используемая здесь терминология предназначена лишь для описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения, поскольку объем настоящего изобретения будет ограничиваться только прилагаемой формулой изобретения.

Используемые в этом описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если из контекста явно не следует иное. Таким образом, например, ссылка на способ включает один или более способов и/или стадий типа, который описан здесь и/или который станет очевидным квалифицированным в данной области техники специалистам после прочтения этого описания, и так далее.

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют значение, одинаковое со значением, в котором они обычно понимаются специалистом со средним уровнем компетентности в области техники, к которой относится это изобретение. Хотя любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, которые здесь описаны, могут использоваться при осуществлении на практике или проверке настоящего изобретения, предпочтительные способы и материалы описаны ниже. Все публикации, упомянутые здесь, включены сюда посредством ссылки в их полном объеме.

Общее описание

Способ настоящего изобретения обеспечивает значительные преимущества по сравнению с существующими способами выделения и идентификации секретирующих белки клеток. Например, клетки, которые секретируют антитела, можно быстро и удобно выделить на основе желаемой специфичности, авидности или изотипа. Кроме того, количество секретируемого белка, который продуцируется, можно определить непосредственно, в отличие от многих способов в предшествующем уровне техники, в которых количество продукции секретируемого белка определяют косвенно.

В последнее время два дополнительных способа, в которых используется проточная цитометрия, были разработаны для выделения с высокой пропускной способностью стабильных линий клеток с высоким уровнем экспрессии. Первый способ включает модификацию экспрессионной плазмиды с включением транскрипционного считывания мРНК с GOI. Это чаще всего осуществляется путем вставки участка внутренней посадки рибосом (IRES) и гена, белковый продукт которого легко контролировать с помощью проточной цитометрии, чаще всего зеленый флуоресцентный белок (GFP), между стоп-кодоном в GOI и концевым сайтом полиА (Meng et al. (2000) Gene 242: 201). Присутствие IRES позволяет POI и GFP транслироваться с одной и той же мРНК. Таким образом, уровень экспрессии гена GFP косвенно связан с уровнем мРНК с GOI. Клоны, которые накапливают в GFP на высоких уровнях, выделяют с помощью проточной цитометрии, а затем подвергают скринингу на предмет продукции POI. Поскольку этот способ зависит от сочетания экспрессии GOI с геном-репортером путем использования IRES в рекомбинантной конструкции, он не применим к выделению гибридом.

Использование проточной цитометрии при выделении экспрессирующих клонов создает возможность для быстрого анализа большого числа клонов в формате высокой пропускной способности. Кроме того, использование проточной цитометрии значительно снижает прямое манипулирование клетками. К сожалению, уровень продукции GFP не является прямым показателем уровня продукции POI. Различные механизмы могут разъединять продукцию секретируемого POI от накопления GFP. Различия в продукции POI и репортера GFP могут возникнуть в результате различий в эффективности трансляции двух генов, эффективности секреции POI или стабильности полицистронной мРНК.

Другой способ, в котором используется проточная цитометрия для выделения экспрессирующих клонов, включает инкапсуляцию клеток в агарозное микродраже (Weaver et al. (1990) Methods Enzymol. 2: 234). В этом способе биотинилированные антитела, специфические для POI, связывают с биотинили- 3 037546 рованной агарозой с помощью стрептавидина, так что секретируемый POI захватывается и удерживается в микродраже (Gray et al., (1995) J. Immunol. Methods 182: 155). Захваченный POI детектируют с помощью иммуноокрашивания с использованием антитела, специфического для POI. Чтобы уменьшить поглощение POI, секретируемого из соседних клеток, инкапсулирующей агарозой, клетки помещают в среду с низким уровнем проницаемости. Эти клетки с наибольшим окрашиванием антителом POI в инкапсулирующей агарозе идентифицируют и выделяют с помощью проточной цитометрии. В способе с использованием гелевого микродраже клетки скринируются непосредственно в отношении их способности секретировать POI, а не косвенно в отношении экспрессии мРНК с GOI, но для этой процедуры необходимо наличие подходящих антител для захвата и окрашивания секретируемого POI, и для нее необходимо специальное оборудование для образования агарозного гелевого микродраже. Кроме того, некоторые клетки могут быть чувствительными к процессу инкапсуляции.

Один из вариантов этого способа позволяет обойти требование встраивать клетки в матрицу за счет непосредственного связывания антитела, специфического для POI, с клеточной поверхностью (Manz et al. (1995) PNAS 92: 1921-1925). В этом способе за неспецифическим биотинилированием белков клеточной поверхности с использованием биотин-гидроксисукцинимидного эфира следует контактирование с конъюгированным со стрептовидином антителом, способным связываться с POI. Клетки, секретирующие POI, становятся декорированными POI, который затем детектируют с помощью соответствующего меченого второго антитела. Однако диффузия POI между соседними клетками является проблематичной, и для этого способа также необходима среда с высокой вязкостью, чтобы уменьшить диффузию POI от экспрессирующих клеток. Поскольку эти среды с высокой вязкостью необходимы для различения клетки, клетки должны быть промыты и помещены в среду, подходящую для сортировки клеток, если это желательно.

Проблемы, связанные с идентификацией и выделением линий рекомбинантных клеток с высоким уровнем экспрессии, особенно распространяются на выделение гибридом, которые экспрессируют представляющее интерес антитело. Однако идентификация полезных гибридом включает несколько дополнительных проблем; их необходимо сначала скринировать в отношении антигенсвязывающей активности, затем в отношении изотипа иммуноглобулина. Кроме того, способы на основе GFP не применимы к идентификации и выделению гибридом, поскольку создание гибридом не включает рекомбинантный компонент, чтобы экспрессию генов антител можно было связать с транскрипцией репортера, такого как GFP. Скрининг гибридом является медленным, трудоемким предприятием, в котором скринируемое количество клонов ограничено существующими технологиями.

Настоящее изобретение описывает новый и ранее неизвестный способ идентификации и выделения клеток, которые продуцируют секретируемые белки. Настоящее изобретение основано на получении линии клеток, которая экспрессирует молекулу, располагаемую на поверхности клетки, которая связывается с POI. Представленный на клеточной поверхности POI можно затем детектировать посредством мечения различными детекторными молекулами. Количество POI, представленного на поверхности клеток, в определенных условиях является прямым показателем общего количества секретированного POI. Продуценты POI могут быть затем отделены от непродуцентов, и уровни продукции или характеристики POI могут быть дифференцированы. Преимущество настоящего изобретения заключается в том, что в нем непосредственно определяется количество секретируемого POI, a не косвенно измеряется мРНК.

Это изобретение относится к созданию и использованию клеток, которые экспрессируют захватывающие молекулы клеточной поверхности, которые связываются с различными секретируемыми POI в той же клетке, которая продуцирует POI. По мере секреции клеткой POI эти захватывающие молекулы клеточной поверхности связывают его, или комплексы POI и захватывающих молекул клеточной поверхности могут образовываться внутриклеточно, а затем секретироваться. Связывание может происходить аутокринным образом или при секреции. Клетки, которые продуцируют секретируемый POI, можно затем идентифицировать и выделить. Такая идентификация и выделение могут быть основаны на характеристиках POI, продукции POI или отсутствии таковых, или согласно конкретным уровням продукции. Захватывающую молекулу клеточной поверхности и/или POI может продуцировать клетка в ее природном состоянии, или захватывающие молекулы клеточной поверхности и/или POI могут быть продуцированы рекомбинантно. Посредством создания или использования такой клетки любой секретируемый белок может быть захвачен захватывающей молекулой клеточной поверхности при наличии соответствующего сродства между ними. Как объясняется далее, можно осуществлять манипулирование любой молекулой таким образом, чтобы ее можно было использовать в качестве захватывающей молекулы клеточной поверхности. Следовательно, это изобретение может использоваться для выделения любой клетки, которая секретирует белок.

Почти любой белок обладает способностью функционировать в качестве захватывающей молекулы клеточной поверхности, как описано в настоящем изобретении. Что необходимо - это способность желаемого белка к прикреплению к клеточной мембране и выставлению во внеклеточное пространство. Если желаемая клетка имеет сигнальную последовательность, то только мембранный якорь, в том числе, но без ограничения, трансмембранный якорь или сигнал сцепления GPI, нужно добавить к захватывающей молекуле клеточной поверхности, чтобы он оставался прикрепленным к клеточной мембране с об- 4 037546 ращением наружу от клетки. Кроме того, если в желаемом белке отсутствует сигнальная последовательность, сигнальная последовательность может быть добавлена к амино-концу желаемого белка, чтобы он переносился к поверхности клетки. Сигнальная последовательность и мембранный якорь могут быть природными по отношению к клетке, рекомбинантными или синтетическими.

Клетки часто секретируют широкий ряд белков, эндогенно или после введения рекомбинантной ДНК. Любой секретируемый белок можно идентифицировать, и клетку, продуцирующую его, можно выделить в соответствии со способом этого изобретения. Такие секретируемые белки включают, но без ограничения, факторы роста, рецепторы факторов роста, лиганды, растворимые компоненты рецепторов, антитела, биспецифические антитела, рекомбинантные молекулы Trap (-ловушки), Fc-содержащие слитые белки, sTCR, TCR-Fc и пептидные гормоны. Такие секретируемые белки могут быть или могут не быть рекомбинантными. Т.е. для секреции некоторых представляющих интерес белков из желаемой клетки может не требоваться введение дополнительных нуклеотидных последовательностей. Например, секреция антител из B-клеток или плазматических клеток не является результатом введения рекомбинантных нуклеотидных последовательностей в B-клетку или плазматическую клетку. Рекомбинантные секретируемые белки могут быть получены с помощью стандартных методов молекулярной биологии, хорошо известных квалифицированному специалисту (см., например, Sambrook, J., E. F. Fritsch and T. Maniatis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Vols 1, 2, and 3, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Ausubel et al., Greene Publ. Assoc, Wiley Interscience, NY). Эти секретируемые белки полезны для многих коммерческих и научных целей. Это изобретение охватывает продукцию таких секретируемых белков благодаря методологии настоящего изобретения. Детектирование клеток с представленным на поверхности POI может быть достигнуто за счет использования любой молекулы, способной прямо или косвенно связываться с представленным на поверхности POI. Такие детекторные молекулы могут способствовать детектированию и/или выделению клеток, представляющих POI на поверхности.

Настоящее изобретение применимо к выделению, в частности, a) лиганд-продуцирующих клеток, используя лиганд-специфический рецептор в качестве захватывающей молекулы клеточной поверхности, b) продуцирующих растворимые рецепторы клеток, используя специфический для связанного с поверхностью рецептора лиганд в качестве захватывающей молекулы клеточной поверхности, c) продуцирующих антитела клеток, используя связывающийся с антителом белок в качестве захватывающей молекулы клеточной поверхности, d) sTCR, используя s-TCR-связывающий белок (например, антиген, распознаваемый TCR) в качестве захватывающей молекулы клеточной поверхности, e) TCR-Fc, используя Fcсвязывающий белок в качестве захватывающей молекулы клеточной поверхности, или f) биспецифических антител, которые содержат мутацию в одном из своих CH3-доменов, которая аннулирует связывание с белком A, используя захватывающую молекулу в виде слитого белка, который включает ScFvдомен, слитый с трансмембранным и цитоплазматическим доменом FcyR.

В соответствии с методологией этого изобретения клетку сначала трансфицируют вектором, содержащим нуклеотидную последовательность, которая кодирует захватывающую молекулу клеточной поверхности, которая способна связывать секретируемый POI, в условиях, когда такая захватывающая молекула клеточной поверхности экспрессируется. Трансфицированные клетки, которые являются подходящими продуцентами таких захватывающих молекул клеточной поверхности, затем детектируют и выделяют, и такие клетки подвергают культивированию. Эти клетки или могут по своей природе продуцировать POI, или POI может продуцироваться рекомбинантно. Если клетки по своей природе продуцируют POI, они готовы к детектированию и выделению. Если POI необходимо продуцировать рекомбинантно, то выделенные и подвергнутые культивированию клетки, экспрессирующие определенную захватывающую молекулу клеточной поверхности, трансфицируют второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей секретируемый POI, в условиях, когда секретируемый POI экспрессируется. При экспрессии секретируемый POI связывается с захватывающими молекулами клеточной поверхности, и клетки, представляющие связанный POI на поверхности, детектируют и выделяют.

Если клетка продуцирует POI природно, клетку не будут трансфицировать нуклеотидной последовательностью, кодирующей POI. Следовательно, этот аспект настоящего изобретения применим к любым и всяким клеткам, продуцирующим POI. Кроме того, если клетка продуцирует природно захватывающую молекулу клеточной поверхности, клетку не нужно трансфицировать нуклеотидными последовательностями, кодирующими захватывающую молекулу клеточной поверхности. Следовательно, этот аспект настоящего изобретения применим к любым и всяким клеткам, продуцирующим захватывающую молекулу клеточной поверхности.

Широкий ряд клеток-хозяев может быть трансфицирован. Эти клетки могут иметь или эукариотическое, или прокариотическое происхождение. Часто клетки будут иммортализованными эукариотическими клетками, и в частности клетками млекопитающих, например клетками почки обезьян (COS), клетками яичника китайского хомячка (CHO), клетками HeLa, клетками почки детеныша хомячка (BHK), клетками почки эмбриона человека (HEK293), лейкоцитами, миеломами, линиями клеток, трансфицированных генами аденовируса, например AD5 E1, включая, но без ограничения, иммортализованные клет- 5 037546 ки сетчатки человека, трансфицированные геном аденовируса, например клетки PER.C6™, и эмбриональными стволовыми клетками. Эти клетки могут быть также клетками не млекопитающих, включая бактериальные клетки, клетки грибов, дрожжей и насекомых, в том числе, но без ограничения, например, Escherichia coli, Bacillus subtilus, виды Aspergillus, Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris. Все клетки могут быть выращены в среде для планшетов для культивирования в соответствующих условиях или в синергическом хозяине. Наиболее желательными клетками будут клетки млекопитающих, которые можно культивировать.

Секретируемый POI, связанный с захватывающей молекулой клеточной поверхности, можно детектировать и выделить с помощью различных методов, известных в данной области техники. Клетки в культурах, представляющие секретируемый POI на своей поверхности, можно привести в контакт с (a) молекулой(ми), способной прямо или косвенно связываться с секретируемым POI, причем такая детекторная молекула(ы) может содержать метку детектирования, такую как, например, хромогенная, флуорогенная, имеющая окраску, флуоресцентная или магнитная метка. Метку, связанную с детекторной молекулой, можно детектировать и клетки выделить, используя различные методы. Наиболее предпочтительно, когда в популяции клеток будут детектировать метку, а клетку выделять, используя проточную цитометрию. Альтернативно детекторную молекулу можно использовать для непосредственно выделения клеток, представляющих POI на своей поверхности. Это может быть достигнуто путем конъюгации детекторной молекулы с планшетом для культивирования, парамагнитными молекулами или любой другой частицей или твердой подложкой. Кроме того, представленный на поверхности POI можно детектировать непосредственно по свойствам детекторной молекулы или POI.

В одном варианте осуществления две детекторные молекулы, которые связываются друг с другом и по-разному помечены, используются для детектирования представленного на поверхности, секретированного POI, который блокирует это взаимодействие. Если клетка представляет на своей поверхности секретируемый POI, который связывается с первой детекторной молекулой и блокирует взаимодействие между первой и второй детекторной молекулой, то клетку можно выделить на основе присутствия только первой детекторной молекулы на ее поверхности. С другой стороны, если клетка представляет на своей поверхности секретируемый POI, который связывается с первой детекторной молекулой, но не блокирует взаимодействие между первой и второй детекторной молекулой, то клетку можно выделить на основе присутствия обеих детекторных молекул на ее поверхности. Например, продуцирующие антитела клетки, экспрессирующие антитела, которые специфически блокируют, или не блокируют, образование комплекса рецептор-лиганд, могут быть идентифицированы. Если детекторными молекулами являются рецептор и его лиганд, которые по-разному помечены, то продуцирующую антитело клетку, которая экспрессирует антитела, которые блокируют образование комплекса рецептор-лиганд, можно детектировать по присутствию одной метки на ее поверхности, тогда как продуцирующую антитела клетку, которая экспрессирует антитела, которые не блокируют образование комплекса рецептор-лиганд, можно детектировать по присутствию обеих меток на ее поверхности.

В любом из вариантов осуществления и в отношении отделения экспрессирующих клеток от не экспрессирующих клеток или в меньшей степени экспрессирующих клеток одним из основных препятствий, когда POI является секретируемый белок, является диффузия POI между соседними клетками. Следовательно, очень важно, что любая система, которая предназначена для захвата секретированного POI на клеточную поверхность, должна предотвратить диффузию POI из экспрессирующей клетки в соседнюю клетку и ее плотное прилегание к этой клетке. Если диффузии разрешено иметь место и соседние клетки становятся декорированными секретируемым POI, то разделение клеток на основе степени декорирования POI не сможет дифференцировать клетки с высоким уровнем экспрессии от клеток с низким уровнем экспрессии и может не эффективно отделять экспрессирующие от не экспрессирующих клеток.

Следовательно, одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является блокирование диффузии секретируемого POI между соседними клетками. Это может быть достигнуто путем добавления блокирующей молекулы, которая связывается или с захватывающей молекулой клеточной поверхности захвата, или POI, и предотвращает связывание секретируемого POI с захватывающей молекулой клеточной поверхности. В этом аспекте детекторные молекулы не связываются с блокирующей молекулой. Например, если рецептором клеточной поверхности является hFcYRI, a секретируемый POI имеет Fcфрагмент IgG человека, то диффузия секретируемого POI между соседними клетками может быть заблокирована добавлением экзогенного IgG крысы в культуральные среды. Детектирование клеток, представляющих секретируемый POI на своей поверхности, но не связанный IgG крысы, достигается за счет использования антител, специфических в отношении Fc IgG человека, которые не распознают IgG крысы. В другом варианте осуществления связывание секретируемого POI между соседними клетками уменьшают посредством увеличения вязкости сред.

В одном варианте осуществления этого изобретения не допускается накапливание секретируемого POI в средах. Это может быть достигнуто путем регуляции экспрессии секретируемого POI и/или захватывающей молекулы клеточной поверхности так, чтобы недолгая экспрессия POI приводила к достаточ

- 6 037546 ному количеству POI для связывания с захватывающей молекулой клеточной поверхности, но недостаточным количествам для диффузии. В другом варианте осуществления клетки могут быть удалены из сред, содержащих накопленный POI, связанный с клетками POI снимают и допускают продолжение экспрессии POI в течение ограниченного периода времени, так что секретируемый POI не накапливается в средах. Белки могут быть сняты с помощью способов, известных в данной области техники, например, промывки клеток буфером с низким pH.

В соответствии с этим изобретением те клетки в клеточной популяции, которые связываются больше всего с детекторными молекулами, также экспрессируют больше всего секретируемый POI. В самом деле, чем большее количество POI секретирует отдельная клетка, тем большее количество POI представлено на поверхности клеток. Эта корреляция между количеством представленного на поверхности POI и уровнем экспрессии POI в этой клетке позволяет быстро идентифицировать клетки с желаемым относительным уровнем экспрессии из популяции клеток.

В одном варианте осуществления библиотека ДНК может быть использована для экспрессии секретируемого белка, который может быть представлен на поверхности клетки с помощью захватывающей молекулы клеточной поверхности. Например, библиотеку ДНК можно также создать из кодирующих областей вариабельных доменов антител из B-клеток, выделенных из иммунизированных животных. Библиотеку ДНК можно затем экспрессировать в клетке, которая экспрессирует захватывающую молекулу клеточной поверхности, специфическую для антител так, что клоны желаемой специфичности, изотипа или авидности могут быть идентифицированы и выделены с помощью способа настоящего изобретения. В другом варианте осуществления библиотеку ДНК можно создать из кодирующих областей вариабельных доменов T-клеточных рецепторов из T-клеток, и слить, например, с Fc, способным связываться с Fc-связывающим белком. Библиотеку ДНК можно затем экспрессировать в клетке, которая экспрессирует Fc-связывающий белок, так что клоны нужной специфичности, изотипа или авидности могут быть идентифицированы и выделены, как здесь описано.

В другом варианте осуществления могут быть созданы трансгенные млекопитающие, которые экспрессируют конкретную захватывающую молекулу клеточной поверхности в одном или более типов клеток. Клетки из таких трансгенных млекопитающих могут быть затем подвергнуты скринингу непосредственно в отношении продукции POI. Например, может быть желательной экспрессия захватывающей молекулы клеточной поверхности, специфической в отношении антител, в плазматических клетках. Соответственно плазматические клетки из иммунизированных мышей могут быть получены, и эти клетки, продуцирующие антитела, специфические в отношении желаемого антигена, могут быть выделены с помощью способа настоящего изобретения.

В дальнейшем варианте осуществления настоящего изобретения продукцию антител измеряют посредством использования линии клеток СНО, которые экспрессируют рецептор FcyRI (FcyRI) человека, который связывает конкретное антитело или TCR-Fc, которое представляет собой POI.

В другом аспекте настоящего изобретения представляющий интерес белок включает один или более вариабельных доменов T-клеточных рецепторов или растворимый T-клеточный рецептор. Один или более вариабельных доменов T-клеточного рецептора могут быть ковалентно связаны с составляющей, которая может связываться с захватывающим белком клеточной поверхности. В конкретном варианте осуществления один или более вариабельных доменов T-клеточного рецептора слиты с последовательностью Fc, например последовательностью Fc человека, и захватывающим белком клеточной поверхности является Fc-рецептор, например FcyR.

Общие структуры вариабельных доменов TCR известны (см., например, Lefranc and Lefranc (2001) The T Cell Receptor FactsBook, Academic Press, который включен сюда посредством ссылки; см., например, с 17-20; см. также Lefranc et al. (2003) IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains, Developmental and Comparative Immunology 27: 55-77, и Lefranc et al. (2005) IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor constant domains and Ig superfamily C-like domains, Developmental and Comparative Immunology 29: 185-203, каждый из которых включен сюда посредством ссылки). В одном варианте осуществления вариабельный домен TCR из TCR-Fc включает N-концевую область, содержащую вариабельный домен из 104-125 аминокислот. В другом варианте осуществления TCR-Fc, кроме того, включает константную область TCR, включающую 91-129 аминокислот. В другом варианте осуществления TCR-Fc, кроме того, включает соединяющий пептид, включающий 21-62 аминокислот.

В одном варианте осуществления последовательность Fc сливают непосредственно или через линкер с вариабельным доменом TCR. В другом варианте осуществления TCR-Fc включает вариабельную область TCR и константную область TCR, и последовательность Fc сливают непосредственно или через линкер с константной областью TCR. В другом варианте осуществления TCR-Fc включает вариабельную область TCR, константную область TCR и соединяющий пептид, и последовательность Fc сливают непосредственно или через линкер с соединяющим пептидом.

sTCR, TCR-Fc или слитый белок, включающий один или более вариабельных доменов Tклеточного рецептора, может быть выбран, чтобы специфически связываться с представляющим интерес

- 7 037546 антигеном, например веществом, продуцируемым опухолевой клеткой, например веществом опухолевой клетки, которое способно вызывать иммунный ответ у хозяина. В конкретном варианте осуществления антиген представляет собой антиген, который присутствует на поверхности опухолевой клетки (т.е. опухолевый антиген) и распознается T-клеткой и который вызывает иммунный ответ у хозяина. Опухолевые антигены включают, например, альфафетопротеин (AFP), карциноэмбриональный антиген (CEA), MUC1, эпителиальный опухолевый антиген (ETA), тирозиназу (например, в случае злокачественной меланомы), связанный с меланомой антиген (MAGE) и мутантные или аномальные формы других белков, таких как, например, ras, p53 и т.д.

В одном варианте осуществления POI представляет собой TCR-Fc, и TCR-Fc включает вариабельную область α-цепи TCR, слитую с последовательностью Fc, и β-цепь TCR, слитую с последовательностью Fc (каждая из которых слита непосредственно или через линкер), причем слияние α-цепь TCR-Fc и слияние β-цепь TCR-Fc объединяются с образованием αβ TCR-Fc. В конкретном варианте осуществления αβ TCR-Fc включает следующие два полипептида: (1) вариабельную область α-цепи TCR, слитую с константной областью α-цепи TCR, слитой с последовательностью Fc, и (2) вариабельную область βцепи TCR, слитую с константной областью β-цепи TCR, слитой с последовательностью Fc.

В другом варианте осуществления POI представляет собой TCR-Fc, содержащий вариабельную область α-цепи TCR, вариабельную область β-цепи TCR и необязательно константную область α-цепи TCR и/или константную область β-цепи TCR. В конкретном варианте осуществления TCR-Fc кодируется нуклеиновой кислотой, включающей (5%3') последовательность вариабельной области α-цепи TCR, за которой необязательно следует последовательность константной области α-цепи TCR, последовательность вариабельной области β-цепи TCR, за которой необязательно следует последовательность константной области β-цепи TCR, необязательно линкер, а затем последовательность Fc. В конкретном варианте осуществления TCR-Fc кодируется нуклеиновой кислотой, включающей (5%3') последовательность вариабельной области β-цепи TCR, за которой необязательно следует последовательность константной области β-цепи TCR, последовательность вариабельной области α-цепи TCR, за которой необязательно следует последовательность константной области α-цепи TCR, необязательно линкер, а затем последовательность Fc. В различных вариантах осуществления конструкциям, кодирующим TCR-Fc, предшествуют сигнальные последовательности, например сигнальные последовательности секреции, что делает их секретируемыми.

В другом варианте осуществления POI представляет собой TCR-Fc, и TCR-Fc включает TCR-Fc, включающий γ-цепь TCR, слитую с последовательностью Fc, и вариабельную область δ-цепи TCR, слитую с последовательностью Fc, с образованием γδ TCR-Fc. В конкретном варианте осуществления γδ TCR-Fc включает следующие два полипептида: вариабельную область γ-цепи TCR, слитую с константной областью γ-цепи TCR, слитой с последовательностью Fc, и (2) вариабельную область δ-цепи TCR, слитую с константной областью δ-цепи TCR, слитой с последовательностью Fc.

Вариабельные области T-клеточного рецептора можно идентифицировать и/или клонировать любым способом, известным в данной области техники. Вариабельные области T-клеточного рецептора из представляющего интерес белка могут быть получены, например, путем экспрессии в клетке реаранжированной ДНК вариабельной области T-клеточного рецептора, например, слитой с последовательностью Fc человека. Реаранжированные вариабельные области T-клеточного рецептора, специфические в отношении конкретного антигена, могут быть получены любым подходящим способом, известным в данной области (см. ссылки ниже), например путем подвергания мыши воздействию антигена и выделения Tклеток из мыши, создания гибридом T-клетки мыши и скрининга гибридом с использованием представляющего интерес антигена для получения представляющей интерес гибридомы. Реаранжированные вариабельные области T-клеточного рецептора, специфические в отношении представляющего интерес антигена, могут быть клонированы, исходя из представляющих интерес гибридом(ы). Вариабельные области T-клеточного рецептора, специфические в отношении антигена, можно также идентифицировать, используя технологию фагового дисплея, например, как это предусмотрено в ссылках ниже. Вариабельные области можно затем клонировать и слить, например, с Fc человека для получения представляющего интерес белка, который может связываться с захватывающей молекулой клеточной поверхности, которая представляет собой FcyR.

Методы идентификации и/или клонирования вариабельных областей T-клеточного рецептора описаны, например, в патенте США № 5635354 (праймеры и методы клонирования); Genevee et al. (1992) An experimentally validated panel of subfamily-specific oligonucleotide primers (Vαl-w29/Vβl-w24) for the study of human T cell receptor variable V gene segment usage by polymerase chain reaction, Eur. J. Immunol. 22: 1261-1269 (праймеры и методы клонирования); Gorski et al. (1994) Circulating T Cell Repertoire Complexity in Normal Individuals and Bone Marrow Recipients Analyzed by CDR3 Size Spectratyping, J. Immunol. 152: 5109-5119 (праймеры и методы клонирования); Johnston, S. et al. (1995) A novel method for sequencing members of multi-gene families, Nucleic Acids Res. 23/15: 3074-3075 (праймеры и методы клонирования); Pannetier et al. (1995) T-cell repertoire diversity and clonal expansions in normal and clinical samples, Immu

- 8 037546 nology Today 16/4:176-181 (методы клонирования); Hinz, Т. and Kabelitz, D. (2000) Identification of the Tcell receptor alpha variable (TRAV) gene(s) in T-cell malignancies, J. Immunol. Methods 246: 145-148 (методы клонирования); van Dongen et al. (2002) Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: патент США № 6623957 (способы клонирования и праймеры); Report of the BIOMED-2 Concerted Action BMH4CT98-3936, Leukemia 17: 2257-2317 (праймеры и методы клонирования); Hodges et al. (2002) Diagnostic role of tests for T cell receptor (TCR) genes, J. Clin. Pathol. 56: 1-11 (методы клонирования); Moysey, R. et al. (2004) Amplification and one-step expression cloning of human T cell receptor genes, Anal. Biochem. 326: 284286 (методы клонирования); Fernandes et al. (2005) Simplified Fluorescent Multiplex PCR Method for Evaluation of the T-Cell Receptor Ve-Chain Repertoire, Clin. Diag. Lab. Immunol. 12/4: 477-483 (праймеры и методы клонирования); Li, Y. et al. (2005) Directed evolution of human T-cell receptors with picomolar affinities by phage display, Nature Biotech. 23/3: 349-354 (праймеры и методы клонирования); Wlodarski et al. (2005) Pathologic clonal cytotoxic T-cell responses: nonrandom nature of the T-cell receptor restriction in large granular lymphocyte leukemia, Blood 106/8: 2769-2780 (методы клонирования); Wlodarski et al. (2006) Molecular strategies for detection and quantitation of clonal cytotoxic T-cell responses in aplastic anemia and myelodysplastic syndrome, Blood 108/8: 2632-2641 (праймеры и методы клонирования); Boria et al. (2008) Primer sets for cloning the human repertoire of T cell Receptor Variable regions, BMC Immunology 9:50 (праймеры и методы клонирования); Richman, S. and Kranz, D. (2007) Display, engineering, and applications of antigenspecific T cell receptors, Biomolecular Engineering 24: 361-373 (методы клонирования). Примеры sTCR представлены, например, в патентах США № 6080840 и 7329731; и Laugel, В et al. (2005) Design of Soluble Recombinant T Cell Receptors for Antigen Targeting and T Cell Inhibition, J. Biol. Chem. 280: 1882-18 92; которые включены сюда посредством ссылки. Fc-последовательности описаны здесь; примеры Fcпоследовательностей и их использование в слитых белков представлены, например, в патенте США № 6927044, выданном Stahl и др. Все из вышеприведенных ссылок включены сюда посредством ссылки.

В дальнейшем варианте осуществления настоящего изобретения захватывающая молекула клеточной поверхности предназначена для взаимодействия с теми представляющими интерес белками, которые обычно не способны связываться с достаточным сродством и связываются с низким сродством с захватывающей молекулой FcyR, и представления их на поверхности. Эти представляющие интерес белки включают молекулы IgG4 и IgG2. Соответственно модульная захватывающая молекула была разработана и создана на основе ScFv-домена, слитого с трансмембранным (ТМ) и цитоплазматическим доменом FcyR. ScFv-домен был получен из антитела против Fc человека с высоким сродством и содержит вариабельный домен тяжелой цепи, слитый с вариабельным доменом легкой цепи. Трансмембранныйцитоплазматический домен FcyR был использован, чтобы обеспечить надлежащую вставку и ориентацию в плазматической мембране. Слитый белок ScFv-FcYR-TM-cyto способен связываться с IgG4 и другими Fc-содержащими молекулами, а также подтипами IgG2 и IgG1 и такими гетеродимерными молекулами (например, биспецифическими антителами), которые включают по меньшей мере один CH3-домен дикого типа, причем другой CH3-домен может содержать замену Fc*-типа.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения захватывающая молекула клеточной поверхности предназначена для взаимодействия с теми представляющими интерес белками, которые содержат модифицированный CH3-домен, например полипептид Fc*, который включает аминокислотные замены H95R и Y96F (нумерация основана на системе нумерации IMGT), например SEQ ID NO: 42, и представления их на поверхности. Эти представляющие интерес белки включают биспецифические антитела, например антитела в виде гетеротетрамеров, которые полезны при получении биспецифических антител, в общем описаны в публикации заявки на патент США № US 2010/0331527 А1, 30 декабря 2010, которая включена сюда в ее полном объеме посредством ссылки. Соответственно модульная захватывающая молекула была разработана и создана на основе ScFv*-домена, слитого с трансмембранным (ТМ) и цитоплазматическим доменом FcyR. ScFv*-домен был получен из антитела против Fc* с высоким сродством и содержит вариабельный домен тяжелой цепи, слитый с вариабельным доменом легкой цепи. Трансмембранный-цитоплазматический домен FcyR был использован, чтобы обеспечить надлежащую вставку и ориентацию в плазматической мембране. Слитый белок ScFv*-FcYR-TM-cyto связывается с любой Fc*-содержащей молекулой, например IgG3 дикого типа и гетеродимерами IgG4, IgG2 и IgG1, которые содержат по меньшей мере одну последовательность полипептида Fc*.

Примеры

Следующие примеры предлагаются для предоставления специалистам в данной области техники полного раскрытия и описания того, как изготовить и использовать способы и композиции настоящего изобретения, и не предназначены для ограничения объема того, что авторы считают своим изобретением. Были предприняты усилия, чтобы обеспечить точность в отношении используемых чисел (например, количеств, температуры и т.д.), но некоторые экспериментальные ошибки и отклонения должны учитываться. Если не указано иное, части являются весовыми частями, молекулярная масса является средней молекулярной массой, температура представлена в градусах Цельсия и давление равно или близко к атмосферному.

- 9 037546

Пример 1.

Конструирование pTE084. pTE084 конструировали посредством лигирования XbaI-фрагмента размером 1436 п.о. из pCA100, которая кодирует FcyRI человека (hFcYRI; номер доступа в GenBank: M21091) в сайт для XbaI в pRG821. Ориентацию hFcYRI в желательных плазмидах в результате лигирования исследовали с помощью рестрикционного картирования с использованием NotI, PstI, EcoRI и StuI. pTE084 была разработана для экспрессии на высоком уровне hFcYRI, рецептора клеточной поверхности с высоким сродством к Fc-домену IgG человека. Она содержит две независимые экспрессионные кассеты. Одной кассетой является ген hFcYRI под контролем промотора CMV-MIE, а второй кассетой является ген неомицин-фосфотрансферазы II (NPT), который придает устойчивость к G418, под контролем позднего промотора SV40.

Конструирование производного СНО K1, которое экспрессирует hFcYRI. Клетки СНО K1 (4х 10⁶) трансфицировали pTE084, используя Lipofectamine™ (Life Technologies; Rockville, MD), следуя указаниям производителя. Клетки помещали в культуральную среду (10% фетальной бычьей сыворотки, 90% F-12 Хэма, 2 мМ L-глутамина, все реагенты были от Life Technologies, Rockville, MD), содержащую 500 мкг/мл G418 (Life Technologies), на 15 дней. Клетки, которые переживали отбор с использованием G418, обрабатывали трипсином, объединяли и окрашивали конъюгированным с FITC Fc-фрагментом IgG человека (FITC-hFc; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). Вкратце, клетки, выращенные на 10-см чашках для культивирования, промывали один раз забуференным фосфатом солевым раствором Дульбекко (PBS) без хлорида кальция и хлорида магния (Life Technologies). Три миллилитра 0,25% трипсина (Life Technologies) добавляли в каждую чашку. Чашки вращали до отсоединения клеток от чашки. Десять миллилитров культуральной среды сразу же добавляли в каждую чашку с отсоединенными клетками. Затем клетки собирали путем центрифугированием при 1000xg в течение 4 мин. После удаления супернатанта клетки ресуспендировали в 4 мл 2 мкг/мл FITC-hFc, разведенного в культуральной среде. Затем клетки помещали на платформу шейкера и окрашивали в течение 1 ч при комнатной температуре. Для удаления не связавшегося FITC-hFc клетки дважды промывали 20 мл PBS. Уровень метки FITC-hFc на клетках измеряли с помощью проточной цитометрии в клеточном сортера MOFLO™ (Cytomation; Fort Collins, CO). FITC-hFc не окрашивал ложнотрансфицированные родительские клетки СНО K1, но вызывал распределение флуоресценции в устойчивом к G418, pTE084-трансфицированном пуле. Первый 1% больше всего флуоресцирующих клеток из отобранного пула помещали в 96-луночные планшеты в количестве 1 клетка/лунку с использованием проточной цитометрии. Через девять дней 88 клеточных клонов в 96-луночных планшетах размножали в 24-луночных планшетах. Спустя 3 дня клетки в отдельных лунках промывали один раз 1 мл PBS, окрашивали 0,5 мл 2 мкг/мл FITC-hFc в течение 1 ч, дважды промывали 1 мл PBS и исследовали на окрашивание клеточной поверхности под флуоресцентным микроскопом. Тридцать три самых флуоресцирующих клонов были отобраны, размножены, затем подвергнуты скринингу с помощью проточной цитометрии.

Диффузия секретируемого белка между экспрессирующими клетками и не экспрессирующими клетками среди клеток была блокирована путем добавления IgG: Поскольку все клетки в hFcYRI клональной клеточной линии экспрессируют hFcYRI клеточной поверхности, все они обладают способностью связывать IgG или слитые белки, состоящие из Fc-домена IgG. Поскольку hFcYRI связывает IgG различных видов (van de Winkel and Anderson, 1991)), набор IgG животных был проверен на способность блокировать связывание белка, содержащего Fc IgG1 человека (hIgG1)-метку (4SC622) с hFcYRIэкспрессирующими клетками. 4SC622 является химерной молекулой, состоящей из экстраклеточного домена IL-2Ry, слитого с экстраклеточным доменом hIL-4RY, который затем слит с Fc-доменом hIgG1. В этом эксперименте культуры RGC1 линию hFcYRI-экспрессирующих клеток, выбранную исходя из клеток СНО K1, которые были стабильно трансфицированы pTE084, инкубировали с 1 мкг/мл 4SC622 в течение 18 ч в присутствии или в отсутствие 1 мг/мл IgG различных видов в термостате для культур тканей при 37°C.

Связывание 4SC622 с клеточной поверхностью определяли с помощью проточной цитометрии после того, как промытые клетки были окрашены конъюгированным с фикоэритрином, направленным против IgG1 мыши моноклональным антителом AG184 (PE-AG184), специфическим для компонента hIL2RY из 4SC622 (BD Pharmingen, San Diego, CA), следуя процедуре, изложенной для окрашивания клеток FITC-hFc.

Было установлено, что hIgG полностью блокирует связывание 4SC622 с hFcYRI, представленным на поверхности RGC1. Полученный от крысы, кролика и собаки IgG также эффективно блокировал связывание, тогда как полученный от коров и овец IgG не блокировал такое связывание. Способность добавляемого извне IgG крысы к блокированию связывания добавляемого извне Fc hIgG1-меченного белка (4SC622) с hFcYRI клеточной поверхности предполагает, что IgG крысы также может блокировать перенос между клетками, экспрессирующими Fc hIgG1-меченный белок на различных уровнях. Для проверки этого две линии клеток, которые можно различить по присутствию или отсутствию зеленого флуоресцентного белка (EGFP), были созданы, исходя из RGC1. Вкратце, для EGFP-мечения клеток RGC1, 2х10⁶

- 10 037546 клеток RGC1 котрансфицировали 0,5 мг PTE073, которая кодирует ген гигромицин B-фосфотрансферазы под контролем промотора фосфоглицераткиназы, и 5 мг pRG816-EGFP, которая кодирует ген EGFP под контролем промотора CMV-MIE. Трансфицированные клетки отбирали с использованием 200 мкг/мл гигромицина B (Sigma, St. Louis, MO) в течение двух недель. Зеленые флуоресцирующие клетки выделяли с помощью проточной цитометрии. Один экспресссирующий EGFP и hFcYRI клон, RGC2, был использован в экспериментах по смешиванию клеток. Другая линия клеток, используемая в этих экспериментах, RGC4, был создана с помощью стабильной трансфекции RGC1 плазмидой pEE14.1-622. pEE14.1622 представляет собой плазмиду, в которой экспрессия 4SC622 находится под контролем промотора CMV-MIE и включает миниген глутаминсинтетазы, который придает устойчивость к аналогу метионинсульфоксимина (MSX), и обеспечивает отбор событий стабильной интеграции. Клетки RGC4 экспрессируют hFcYRI на поверхности клеток и секретируют Fc hIgG1-меченный белок 4SC622. Один планшет со смешанными клетками, содержащими 50% клеток RGC2 и 50% RGC4, инкубировали с 1 мг/мл IgG крысы в течение 18 ч до окрашивания PE-AG184, затем исследовали с помощью проточной цитометрии. Обусловленная EGFP флуоресценция клеток RGC2 свидетельствует о том, что клетки RGC2 также связываются с добавленным извне 4SC622 (1 мкг/мл), на что указывает увеличении флуоресценции PEAG184. RGC4 не светятся в дискриминационном окне для EGFP. Примечательно, что добавляемый извне IgG крысы не уменьшал процент клеток RGC4, которые были позитивными при окрашивании по 4SC622 на клеточной поверхности, предполагая, что связывание 4SC622 в hFcYRI произошло в то время, когда белки были в пути к поверхности клетки. При смешивании клеток RGC2 и RGC4 белок 4SC622, секретируемый из клеток RGC4, накапливался в среде и связывался больше всего с клетками RGC2. Однако добавление 1 мг/мл IgG крысы значительно уменьшало процент клеток RGC2, которые связывались с 4SC622, демонстрируя, что IgG крысы блокировал перенос секретируемого Fc hIgG1-меченного белка из экспрессирующих клеток в не экспрессирующие клетки.

Пример 2. Флуоресценция с клеточной поверхности коррелирует с уровнем экспрессии 4SC622.

Клетки RGC1 (4x106) трансфицировали pEE14.1-622, и пул стабильных трансфектантов был получен после отбора в течение 2 недель в среде, состоящей из 10% диализованной фетальной бычьей сыворотки, 90% модифицированной Дульбекко среды Игла (DMEM) без глутамина, 1xGS добавки и 25 мкМ MSX (все реагенты были от JRH Biosciences, Lenexa, KS). IgG крысы добавляли в культуральную среду до 1 мг/мл за 18 ч до иммуноокрашивания. Клетки обрабатывали трипсином, промывали PBS и окрашивали 1,5 мкг/мл FITC-конъюгированного F(ab')₂-фрагмента поликлонального антитела против IgG (H+L) человека (Jackson ImmunoResearch Laboratories) в течение 1 ч при комнатной температуре, следуя процедурам, описанным для окрашивания FITC-hFc в примере 1. Окрашивание клеток затем анализировали с помощью проточной цитометрии. Распределение флуоресценции предполагало, что выбранный пул содержит клетки с широким диапазоном уровней экспрессии 4SC622. Клетки первых 3% (группы R3), 711% (группы R5) и 15-19% (группы R7) с точки зрения их иммунофлуоресценции, разделяли на три пула и размножали в течение 9 дней. Среднюю продукцию 4SC622 в каждой клетке для пулов определяли путем измерения количества клеток и уровней 4SC622 в средах после выращивания в течение 3 дней с помощью иммуноанализа Pandex (Idexx; Westbrook, ME), следуя рекомендациям производителя. В анализе Pandex полистироловые частицы для анализа Fluoricon, покрытые козьим антителом против IgG человека, специфическим в отношении γ-цепи (Sigma), использовали для захвата 4SC622 из среды, и конъюгированное с FITC козье антитело против IgG человека, Fc-специфическое (Sigma), использовали для детектирования связанного с частицами 4SC622. Известные количества очищенного 4SC622 включали в анализ для калибровки. Клетки первых 3%, 7-11% и 15-19% пула, как было установлено, продуцируют 4SC622 на уровне, составляющем 1,42, 0,36 и 0,22 пг/клетку/день соответственно. Таким образом, существовала корреляция между окрашиванием 4SC622 клеточной поверхности и конкретной продукцией белка. Этот результат позволяет предположить, что отдельные клетки, которые экспрессируют 4SC622 на высоких уровнях, можно получить путем выделения клеток, которые были окрашены наиболее ярко FITCконъюгированным F(ab')₂-фрагментом поликлонального антитела против IgG (H+L) человека.

Пример 3. Выделение экспрессирующих клонов в RGC1: IL-4 Trap.

Для непосредственной демонстрации эффективности создания клональных клеточных линий с высоким уровнем продукции секретируемого белка с помощью методики авторов настоящего изобретения были созданы клональные, 4SC622-продуцирующие клеточные линии, исходя из RGC1. Клетки RGC1 (4x106) трансфицировали pEE14.1-622 и отбирали в течение двух недель с использованием 25 мкМ MSX для получения пула стабильных трансфектантов. MSX-резистентные клетки объединяли и инкубировали с 1 мг/мл IgG человека в течение 18 ч до окрашивания PE-AG184. Шесть клеток из первых 5% окна, как определено с помощью анализа с использованием проточной цитометрии окрашивания 4SC622 клеточной поверхности, были выделены и размножены. Продукцию 4SC622 из шести клональных линий определяли и сравнивали с продукцией 4SC622 из клонов, полученных с помощью отбора вручную, с последующим клонированием методом разведений и амплификацией отобранных колоний. Один происходящий от RGC1 клон, RGC4, продуцировал 4SC622 на уровне 12 пг/клетка/день. Этот уровень соответствует таковому наилучшего продуцента 4SC622, выделенного с помощью отбора вручную и анализа 2700

- 11 037546 клонов. Таким образом, по сравнению с колониями ручного отбора, методология, описанная в этом изобретении, оказывается гораздо более эффективной при скрининге и клонировании сильных продуцентов.

VEGF Trap. Плазмиды pTE080 и pTE081 кодируют гены для VEGF Trap, hVEGF-R1R2 и hVEGFR1R3. hVEGF-R1R2 представляет собой химерную молекулу, состоящую из первого Ig домена hVEGFRI, слитого со вторым Ig доменом hVEGFR2, который затем слит с hIg1FC-доменом. hVEGF-R1R3 представляет собой химерную молекулу, состоящую из первого Ig домена hVEGFRI, слитого со вторым Ig доменом hVEGFR3 который затем слит с hIgG1FC-доменом. В этих плазмидах ген для VEGF Trap находится под контролем промотора CMV-MIE, и миниген глутаминсинтетазы, который придает устойчивость к MSX, экспрессируют для отбора событий стабильной интеграции. Клетки RGC1 трансфицировали одной из двух этих плазмид и выращивали в среде, содержащей 25 мкМ MSX, в течение 2 недель, чтобы отобрать клетки, в которых плазмида была стабильно интегрирована. MSX-резистентные клетки инкубировали с 0,1 мкг/мл IgG2a и IgG3 мыши в течение 18 ч до окрашивания 1,5 мкг/мл FITCконъюгированного F(ab')₂-фрагмента поликлонального антитела против IgG (H+L) человека. Клетки окрашивали в течение 1 ч, затем дважды промывали PBS перед проточной цитометрией. Отдельные клетки были распределены по 96-луночным планшетам для культивирования тканей из пула клеток, флуоресценция которых была одной из самых высоких, в первом 1%. Клетки в отдельных лунках размножали и их продуктивность определяли с помощью анализов Pandex. Происходящие от RGC клоны, экспрессирующие как hVEGF-R1R2, так и hVEGF-R1R3, имели более высокую удельную продуктивность и были выделены путем скрининга меньшего количества клонов по сравнению с экспрессирующими на самом высоком уровне, отобранными вручную, MSX-устойчивыми колониями. См. табл. 1.

___________________________________________________________Таблица 1

Сравнение удельной продуктивности

Белок	Транзиент (мкг/мл)	Стабильные линии клеток СНО К1, отобранные вручную	Стабильные линии клеток, происходящие от RGC1
Удельная продуктивность (пг/клетку/ день)	# скринированных клонов	Удельная продуктивность (пг/клетку/ день)	# скринированных клонов
4SC622	1,1	12	2700	12	6
hVEGF- R1R2	33	68	190	77	62
hVEGF- R1R3	27	5	100	22, 6	42

Пример 4. Связанный с клеточной поверхностью Fc hIgG1-меченный белок интернализуется RGC1.

hFcyRI, как известно, индуцирует интернализацию связанного с клеточной поверхностью его лиганда. Для анализа того, могли ли клетки RGC1 интернализировать связанный с клеточной поверхностью 4SC622, 1 мкг/мл 4SC622 добавляли к клеткам RGC1 на 1 ч, а затем клетки сразу же обрабатывали для иммуноокрашивания 4SC622 с использованием PE-AG184 и анализа с помощью проточной цитометрии. Девяносто три процента клеток были положительными при окрашивании по 4SC622 клеточной поверхности. В качестве альтернативы 1 мкг/мл 4SC622 добавляли к клеткам RGC1 на 1 ч, затем клетки промывали и инкубировали в культуральной среде без 4SC622 с PE-AG184 в течение 18 ч. Анализ с помощью проточной цитометрии после иммуноокрашивания на 4SC622 показал, что 9% клеток сохраняли 4SC622 на клеточной поверхности. Для дополнительной характеристики потерь связанного с поверхностью 4SC622, очищенный белок 4SC622 добавляли в среды для RGC1 и родительских клеток СНО K1, затем уровни 4SC622 в средах измеряли в динамике по времени. Уровень 4SC622, добавленного до 2 мкг/мл в культуральную среду в 10-см чашке, был значительно ниже в RGC1-кондиционированной среде после инкубации в течение 3 дней по сравнению с контролем СНО K1. Эти результаты показывают, что концентрация 4SC622 в культуральной среде уменьшается в присутствии hFcyRI на клеточной поверхности. Полученные результаты свидетельствуют о том, что истощение 4SC622 из среды было результатом интернализации комплекса hFcyRI-4SC622. Эта интернализация комплексов рецептор-лиганд может облегчить эффективное удаление всех 4SC622 из не экспрессирующих клеток в присутствии блокирующего IgG в течение 18-часовой стадии блокирования.

Пример 5. Создание линий клеток СНО K1 с индуцируемой экспрессией hFcyRI.

Основанные на проточной цитометрии методы захвата аутологичной секреции (FASTR™), в кото- 12 037546 рых используется hFcYRI, позволяют быстро выделить клоны с высоким уровнем экспрессии. Однако, если hFcYRI опосредует кругооборот Fc-меченных белков, то осуществляемая продукция секретируемого белка сконструированными, экспрессирующими hFcYRI клетками была бы выше, если экспрессию hFcYRI можно было бы подавить во время периода продукции. С этой целью была создана линия клеток СНО K1, в которой экспрессия hFcYRI индуцируется с помощью тетрациклина или аналога доксициклина. В этой системе клетки СНО K1, которые экспрессируют белок-тетрациклиновый репрессор (TetR), сначала были созданы, и hFcYRI был помещен под транскрипционный контроль промотора, активность которого регулировалась TetR. Два тандемных TetR-оператора (TetO) были размещены непосредственно после (3') промотора/усилителя CMV-MIE в pTE084 для создания pTE158. TetR блокировал транскрипцию hFcYRI с промотора CMV-MIE в pTE158 в отсутствие тетрациклина или какого-либо другого подходящего индуктора. В присутствии индуктора белок TetR был неспособен к связыванию TetO, и происходила транскрипция hFcYRI.

Клетки СНО K1 трансфицировали pcDNA6/TR, плазмидой, которая придает устойчивость к бластицидину, в которой экспрессия TetR происходит с промотора CMV-MIE (Invitrogen; Carlsbad, CA). После отбора в течение двух недель с использованием 2,5 мкг/мл бластицидина (Invitrogen) стабильные трансфектанты были объединены. Этот пул затем трансфицировали pTE158, плазмидой, которая придает устойчивость к G418, в которой экспрессия hFcYRI зависит от гибридного промотора CMV-MIE/TetO. Клетки, последовательно трансфицированные pcDNA6/TR и pTE158, отбирали с использованием 400 мкг/мл G418 и 2,5 мкг/мл бластицидина в течение 12 дней, затем объединяли. Пул индуцировали в течение двух дней путем добавления 1 мкг/мл доксициклина, затем окрашивали FITC-hFc для идентификации клеток, которые экспрессируют hFcYRI. Первые 5% клеток, экспрессирующих hFcYRI, собирали в пул, размножали в течение 6 дней в отсутствие доксициклина и снова окрашивали FITC-hFc на присутствие hFcYRI. Клетки, которые не были положительными при окрашивании по hFcYRI, собирали и размножали в культуральной среде, содержащей 1 мкг/мл доксициклина, в течение трех дней. Затем пул окрашивали на присутствие hFcYRI и выделяли с помощью проточной цитометрии. Клетки, которые экспрессировали hFcYRI на высоком уровне, (первый 1%) распределяли по 96-луночным планшетам в количестве одна клетка на лунку. Эти клетки предположительно содержали клетку, которая характеризовалась низкими уровнями не индуцированной экспрессии FcYR1 и высокими уровнями индуцируемой экспрессии FcYR1. После размножения подтверждали индукцию hFcYRI доксициклином в 20 клонах с помощью иммуноокрашивания с использованием FITC-hFc и проточной цитометрии. Один клон был выбран для дальнейшего исследования и назван RGC10.

В отсутствие доксициклина RGC10 не экспрессировал hFcYRI на выявляемых уровнях, тогда как высокие уровни hFcYRI отмечались в клетках, которые были подвергнуты индукции с помощью 1 мкг/мл доксициклина в течение трех дней. Средняя флуоресценция клеток RGC10 увеличивалась более чем в 1000 раз после индукции доксициклином.

Пример 6. Выделение 4SC622-nродуцирующих клеточных линий, исходя из RGC10.

Клетки RGC10 трансфицировали pEE14.1-622 и MSX-резистентные клетки объединяли после отбора с использованием 25 мМ MSX в течение двух недель. Экспрессию hFcYRI индуцировали добавлением 1 мкг/мл доксициклина в культуральную среду на три дня. IgG крысы (1 мг/мл) добавляли в культуральную среду, содержащую доксициклин, за 18 ч до окрашивания FITC-конъюгированным F(ab')₂фрагментом поликлонального антитела против IgG (H+L) человека и анализа с помощью проточной цитометрии. Клетки, которые экспрессировали 4SC622 на самых высоких уровнях (первый 1%), распределяли по 96-луночным планшетам в количестве одна клетка на лунку. Без индукции экспрессии hFcYRI доксициклином, с помощью окрашивания FITC-конъюгированным F(ab')₂-фрагментом поликлонального антитела против IgG (H+L) человека не удается детектировать связанный с клеточной поверхностью 4SC622. Шестьдесят клонов были размножены в отсутствие доксициклина. Удельную продуктивность 13 самых лучших продуцентов определяли с помощью анализа Pandex. Удельная продуктивность клона 1C2 составляла 17,8 пг/клетку/день, что значительно выше составляющей 12 пг/клетку/день продуктивности, отмечаемой в случае лучшей линии клеток 4SC622, ранее выделенной, используя линию клеток с нерегулируемым hFcYRI-RGC1.

Пример 7. Могут быть созданы клетки миеломы SP2/0, которые экспрессируют захватывающий белок клеточной поверхности.

В этом примере была создана линия миеломных клеток Sp2/0-Ag14, которая стабильно экспрессирует hFcYRI, для демонстрации того, что способ захвата аутологичной секреции применим к клеточным линиям, отличным от СНО. Ген hFcYRI вводили в клетки миеломы с помощью инфицирования ретровирусами. Плазмиду pLXRN (Clontech; Palo Alto, CA), ретровирусный ДНК-вектор, в котором представляющий интерес ген может быть экспрессирован с расположенного 5' промотора длинного концевого повтора вируса саркомы у мыши Молони (LTR MoMuSV), использовали для создания ретровируса, кодирующего ген hFcYRI. XhoI-фрагмент размером 1363 п.о. из pTE084, кодирующий ген hFcYRI человека, клонировали в сайт для XhoI pLXRN. Плазмида, в которой экспрессия кДНК для hFcYRI зависит от LTR

- 13 037546

MoMuSV, была выбрана и названа pTE255.

Политропный ретровирус для экспрессии hFcYRI был создан, по существу, следуя предписаниям производителя. Линию пакующих клеток GP-293, линию клеток на основе HEK 293, которая стабильно экспрессирует вирусные белки gag и pol (Clontech; Palo Alto, CA), котрансфицировали 10 мг каждой из pVSV-G и pTE255. Плазмида pVSV-G позволяет экспрессировать вирусный белок оболочки VSV-G, который закрепляет за инфекционными частицами широкий ряд хозяев.

Конструирование Sp2-hFcYRI-4. Политропный ретровирус для экспрессии hFcYRI использовали для инфицирования 1х10⁷ миеломных клеток Sp2/0-Ag14 (American Type Culture Collection; Manassas, VA) с множественностью, составляющей приблизительно 10 инфекционных частиц на клетку. Через три дня после инфицирования клетки окрашивали в течение 1 ч, затем дважды промывали PBS перед анализом с помощью проточной цитометрии. Эти клетки, экспрессирующие hFcYRI, на что указывал связанный FITC-hFc, собирали в пул с помощью проточной цитометрии. Пул размножали в течение 13 дней, после чего снова окрашивали FITC-hFc, и клетки, экспрессирующие hFcYRI, собирали в пул с помощью проточной цитометрии. Эти отсортированные клетки культивировали в 10% фетальной бычьей сыворотке+90% модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) с 4,5 г/л глюкозы и 4 мМ глутамина в течение 3 недель, окрашивали FITC-hFc и клетки со средним уровнем флуоресценции в первом 1% популяции клонировали методом разбивки до одной клетки. После размножения 24 клона исследовали с помощью проточной цитометрии в отношении экспрессии hFcYRI, как описано выше, и один клон, SP2hFcYRI-4, был выбран для определения дополнительных характеристик.

Выделение клеток Sp2-hFcYRI, экспрессирующих белок 4SC622.

Клетки SP2-hFcYRI-4 (1х10⁷) трансфицировали pTE209, плазмидой, которая позволяет конститутивно экспрессировать 4SC622 с промотора CMV-MIE и придает устойчивость к гигромицину. Трансфицированные клетки помещали в среду, содержащую 10% FCS, 90% D-MEM и 400 мкг/мл гигромицина, на 14 дней. Устойчивые к гигромицину клетки инкубировали с 1 мг/мл IgG кролика в течение 18 ч до окрашивания FITC-конъюгированным F(ab')₂-фрагментом поликлонального антитела против IgG (H+L) человека. Клетки окрашивали в течение 1 ч, затем дважды промывали PBS перед анализом с помощью проточной цитометрии. Меченые клетки собирали в пул с помощью проточной цитометрии, затем культивировали в течение 5 дней и сортировали, как описано выше. Клетки из размноженного пула, которые связывались больше всего с FITC-конъюгированным F(ab')₂-фрагментом поликлонального антитела против IgG (H+L) человека, первый 1% популяции, затем клонировали методом разбивки до одной клетки. Продукцию 4SC622 из десяти клонов анализировали с помощью ELISA, и было установлено, что все 10 клонов экспрессируют 4SC622; клон 5H11 продуцировал 4SC622 на уровне 0,5 пг на клетку в день. Эти данные показали, что клоны, секретирующие 4SC622, были эффективно выделены с помощью метода захвата аутологичной секреции из гетерогенного пула клеток, полученного в результате стабильной трансфекции клеток Sp2-hFcYRI-4 pTE209.

Для подтверждения того, что 4SC622 был аутологично представлен на поверхности миеломных клеток, экспрессирующих как 4SC622, так и hFcYRI, клон 5Н11 инкубировали с 1 мг/мл IgG кролика в течение 18 ч, затем окрашивали FITC-конъюгированным F(ab')₂-фрагментом антитела против IgG (H+L) человека и, как было установлено, представляет 4SC622 на клеточной поверхности. Секретируемый белок представлялся в условиях, когда перекрестная подача была заблокирована с помощью IgG кролика, что свидетельствует об аутологичном представлении 4SC622. Эти данные свидетельствовали о том, что способ захвата аутологичной секреции, описанный выше, не ограничивался клетками СНО, а также может быть распространен на миеломные и другие типы клеток.

Пример 8. Включающий белок G химерный белок может функционировать в качестве захватывающего белка клеточной поверхности.

Чтобы продемонстрировать применимость способа захвата аутологичной секреции к захватывающему белку клеточной поверхности, отличному от hFcYRI, была создана линия клеток, экспрессирующая белок G. Белок G, из Streptococcus штамма G148, связывается со всеми подклассами IgG человека и мыши и как таковой применим для выделения рекомбинантных клеток, экспрессирующих антитела или слитые с Fc IgG белки. Чтобы продемонстрировать, что Fc IgG-связывающий домен белка G может использоваться в качестве захватывающего белка клеточной поверхности, способного связываться со всеми подклассами IgG мыши и человека, авторы настоящего изобретения создали линию клеток СНО, экспрессирующую химерный белок, состоящий из Fc-связывающего домена белка G, слитого с трансмембранным и внутриклеточным доменом hFcYRI. Fc-связывающий домен белка G содержит три гомологичных повтора длиной 55 аминокислот (Guss et al., (1986) EMBO 5: 1567 и Sjobring et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 399), и каждый повтор способен связывать один Fc IgG. Для увеличения экспрессии этого химерного белка в клетках СНО, авторы настоящего изобретения сконструировали синтетическую ДНК, в которой сигнальная последовательность из гена ROR1 мыши была слита с Fc-связывающим доменом, аминокислотами 303-497 белка G (# доступа Х06173) (SEQ ID NO: 1). Эта синтетическая ДНК была получена путем сочетания отжига олигонуклеотидов, заполнения пробелов и ПЦР-амплификации. Синтетическую ДНК затем сливали, с помощью ПЦР, с ДНК, кодирующей трансмембранный и внутриклеточ- 14 037546 ный домены, аминокислотами 279-374 (SEQ ID NO: 2), hFcYRI (№ доступа -M21091). Полученную ДНК, кодирующую химерный белок белок G/hFcYRI, клонировали в pTE158 ниже (3') промотора CMV-MIE, заменяя ген, кодирующий hFcYRI, с получением плазмиды pTE300.

Линию клеток СНО K1, адаптированную к росту в бессывороточной среде, RGC14, трансфицировали pTE300, и через три дня добавляли 400 мкг/мл G418 в культуральную среду для отбора стабильной интеграции pTE300. Через две недели после начала отбора клетки окрашивали FITC-hFc для идентификации клеток, экспрессирующих hFcYRI. Эти клетки анализировали с помощью проточной цитометрии, и клетки, экспрессирующие hFcYRI, собирали в пул. Клетки размножали в течение 10 дней, и популяцию клеток, экспрессирующих hFcYRI, снова выделяли с помощью проточной цитометрии. Клетки снова размножали, окрашивали FITC-hFc, и отдельные клетки, экспрессирующие химерный белок белок G/hFcYRI на высоком уровне, выделяли с помощью проточной цитометрии. Отдельные клетки, которые были позитивными при окрашивании по связыванию с FITC-hFc, были отобраны в среде, состоящей из 10% фетальной бычьей сыворотки, 90% F12 Хэма и 400 мкг/мл G418. После инкубации в течение двух недель 48 клонов исследовали на связывание с бычьим IgG, присутствующим в культуральной среде, посредством окрашивания FITC-конъюгированным F(ab')₂-фрагментом антитела против бычьего IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). Один клон, RGC18, который был позитивным при окрашивании этим антителом, был выбран для дальнейшей характеристики.

Выделение экспрессирующих клонов в RGC18.

Клетки RGC18 (6x106) трансфицировали pTE209 и отбирали в отношении интеграции плазмиды с помощью выращивания в 400 мкг/мл гигромицина в течение 18 дней. Устойчивые к гигромицину клетки инкубировали с 1 мг/мл IgG кролика в течение 18 ч до окрашивания FITC-конъюгированным F(ab')₂фрагментом поликлонального антитела против IgG (H+L) человека. Клетки окрашивали в течение 1 ч, затем дважды промывали PBS перед анализом с помощью проточной цитометрии. Самые флуоресцирующие клетки (первые 5%) были выделены методом разбивки до одной клетки и размножены в течение 3 недель. Десять клонов исследовали на секрецию 4SC622. Все исследованные клоны секретировали 4SC622 на высоком уровне, и самый лучший клон, RGC19, имел удельную продуктивность, составляющую 6,4 пг/клетку день. Этот результат показал, что 4SC622-экспрессирующие клетки эффективно выделены из гетерогенного пула клеток, полученного в результате стабильной трансфекции RGC18 pTE209, с помощью способа захвата аутологичной секреции. Кроме того, эти данные ясно показали, что может быть сконструирован фрагмент белка G, который включает сигнальную последовательность и трансмембранный домен и функционирует в качестве захватывающего белка клеточной поверхности.

Для подтверждения того, что 4SC622 был аутологично представлен на поверхности клеток RGC19, экспрессирующих как химерный белок белок G/hFcYRI, так и 4SC622, RGC19 инкубировали с 1 мг/мл IgG кролика в течение 18 ч, затем окрашивали FITC-конъюгированным F(ab')₂-фрaгментом антитела против IgG (H+L) человека и анализировали с помощью проточной цитометрии. Клетки RGC19, как было установлено, имеют 4SC622 на клеточной поверхности в этих условиях, когда перекрестная подача была заблокирована с помощью IgG кролика, что свидетельствует об аутологичном представлении 4SC622. IgG кролика эффективно блокировал связывание экзогенного белка 4SC622 с клетками RGC18, но не блокировал представление 4SC622 на клеточной поверхности клеток, экспрессирующих 4SC622. Эти данные показали, что свойства химерного белка белок G/hFcYRI были схожими с таковыми hFcYRI в качестве захватывающего белка клеточной поверхности, и свидетельствовали о том, что в способе захвата аутологичной секреции могут использоваться другие белки в качестве захватывающих белков клеточной поверхности.

Пример 9. Выделение продуцирующих антитела клеток из RGC10.

Чтобы продемонстрировать эффективность способа захвата аутологичной секреции для выделения линий клеток СНО, которые экспрессируют рекомбинантные антитела, авторы настоящего изобретения клонировали ДНК, кодирующую гены вариабельных областей легкой и тяжелой цепей, из гибридомы KD5. KD5 является гибридомой, которая экспрессирует моноклональное антитело, специфическое для Tie2-рецептора человека.

В последовательности генов константных областей IgG мыши были клонированы, исходя из 500 нг полиА⁺ РНК селезенки мыши (Clontech, Palo Alto, CA). Одноцепочечную кДНК синтезировали, используя систему Superscript First-Strand Synthesis System для ОТ-ПЦР, с использованием в качестве затравок случайных гексамеров в количестве 50 нг (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Последовательность ДНК для константной области легкой цепи каппа мыши (# доступа Z37499) амплифицировали, исходя из этой кДНК, с помощью ПЦР, используя праймеры 5' mCLK1 (Z37499) (5'-CGGGCTGATG CTGCACCAAC TGTATCCATC TTC-3') (SEQ ID NO: 3) и 3' mCLK1 (Z37499) (5'-ACACTCTCCC CTGTTGAAGC TCTTGACAAT GGG-3') (SEQ ID NO: 4). Последовательность ДНК для константной области IgG2a мыши (# доступа AJ294738) также амплифицировали, исходя из этой кДНК, с помощью ПЦР, используя праймеры 5' mCH2a (AJ294738) (5'-GCCAAAACAA CAGCCCCATC GGTCTATCCA C-3') (SEQ ID NO: 5) и 3' mCH2a (AJ294738) (5'-ТСАТТТАССС GGAGTCCGGG AGAAGCTCTT AGTCG-3') (SEQ ID NO: 6). Продукты

- 15 037546

ПЦР клонировали в pCR2.1-TOPO, используя набор для клонирования TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen

Life Technologies, Carlsbad, CA), и подтверждали последовательность константных областей.

Гены вариабельных областей KD5 амплифицировали с помощью ОТ-ПЦР, исходя из мРНК гибридомы KD5, и клонировали в pCR2.1-TOPO, используя смеси праймеров для вариабельных областей тяжелой и легкой цепей от Amersham-Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ). Ген вариабельной области тяжелой цепи подвергали ПЦР-амплификации, используя клонированную в pCR2.1-TOPO вариабельную область в качестве матрицы, с использованием праймеров 5' BspMI/KD5VH N-конец (5'-GAGAGTACCT GCGTCATGCA GATGTGAAAC TGCAGGAGTC TGGCCCT-3') (SEQ ID NO: 7) и 3' BspMI/KD5VH Cконец (5'-GAGAGACCTG CGTCAGCTGA GGAGACGGTG ACCGTGGT-3') (SEQ ID NO: 8), расщепляли BspMI и лигировали с расщепленным BsaI фрагментом гена константной области тяжелой цепи IgG2a, амплифицированным с помощью ПЦР с использованием праймеров 5' BsaI/CH2a N-конец (5'-GAGAGGGTCT CACAGCCAAA ACAACAGCCC CATCG-3') (SEQ ID NO: 9) и 3' BsaI/CH2a C-конец (5'-GAGAGGGTCT CCGGCCGCTC ATTTACCCGG AGTCCGGG AGAA-3') (SEQ ID NO: 10). Затем этот фрагмент лигировали в сайты для BspMI и NotI pRG882. Полученная в результате плазмида, pTE317, была способна экспрессировать рекомбинантный ген тяжелой цепи KD5, слитый с сигнальной последовательностью mROR1, с промотора CMV-MIE. Ген вариабельной области легкой цепи амплифицировали с помощью ПЦР, используя клонированную в pCR2.1-TOPO вариабельную область в качестве матрицы, с использованием праймеров 5' BsmBI/KD5VL N-конец (5'-GAGAGCGTCT CATGCAGACA TCCAGATGAC CCAGTCTCCA-3') (SEQ ID NO: 11) и 3' BsmBI/KD5VL C-конец (5'-GAGAGCGTCT CACAGCCCGT TTTATTTCCA GCTTGGTCCC-3') (SEQ ID NO: 12) расщепляли BsmBI и лигировали с расщепленным BsaI фрагментом гена константной области легкой цепи каппа, амплифицированным с помощью ПЦР с использованием праймеров 5' BsaI/CLK N-конец (5'-GAGAGGGTCT CAGCTGATGC TGCACCAACT GTATCC-3') (SEQ ID NO: 13) и 3' BsaI/CLK C-конец (5'-GAGAGGGTCT CAGGCCGCTC AACACTCTCC CCTGTTGAAG CTCTTGAC-3') (SEQ ID NO: 14). Затем этот фрагмент лигировали в сайты для BspMI и NotI pRG882. Полученная в результате плазмида pTE316 была способна экспрессировать рекомбинантный ген легкой цепи KD5, слитый с сигнальной последовательностью mROR1, с промотора CMV-MIE.

EcoRI-NotI-фрагмент размером 1450 п.о. из pTE317, кодирующий ген тяжелой цепи KD5, клонировали в сайты для EcoRI и NotI pRG980, вектора, который придает устойчивость к гигромицину и позволяет экспрессировать рекомбинантные гены с промотора UbC, с получением плазмиды pTE322. Аналогично EcoRI-NotI-фрагмент размером 750 п.н. из pTE316, кодирующий ген легкой цепи KD5, клонировали в сайты для EcoRI и NotI pRG985, вектора, который придает устойчивость к пуромицину и позволяет экспрессировать рекомбинантные гены с промотора UbC, с получением плазмиды pTE324. Клетки RGC10 (5х10⁶) трансфицировали 3 мкг pTE322 и 3 мкг pTE322 и подвергали отбору в отношении интеграции плазмид посредством выращивания в среде F12, дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки с 20 мкг пуромицина и 400 мкг/мл гигромицина в течение 14 дней. Экспрессию hFcYRI индуцировали добавлением 1 мкг/мл доксициклина в культуральную среду на три дня. Дважды резистентные клетки инкубировали с 1 мг/мл IgG кролика в течение 18 ч до окрашивания FITC-конъюгированным F(ab')₂фрагментом козьего поликлонального антитела против IgG (Fcy) мыши (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). Клетки окрашивали в течение 1 ч, затем дважды промывали PBS перед анализом с помощью проточной цитометрии. Самые флуоресцирующие клетки (первые 5%) выделяли в виде пула и размножали в течение 10 дней, после чего протокол повторяли, но первый 1% самых флуоресцирующих клеток выделяли в виде пула. Этот пул размножали в течение 10 дней, после чего первые 0,1% самых флуоресцирующих клеток выделяли в виде отдельных клеток в 96-луночных планшетах. Клоны анализировали с помощью ELISA в отношении экспрессии антитела, и семь клонов были выбраны из 53 проанализированных клонов. Средняя удельная продуктивность этих клонов составляла 35 пг/клетку/день, и лучший клон экспрессировал рекомбинантное моноклональное антитело KD5 на уровне 54 пг/клетку/день.

Пример 10. Скрининги FASTR™, на которые не влияет уровень экспрессии CSCP.

Для демонстрации того, что уровень экспрессии CSCP не влияет существенно на возможность выделения клеток, экспрессирующих связанный sPOI, сравнивали скрининги FASTR™ в отношении одного и того же sPOI в двух различных линиях клеток-хозяев, каждая из которых экспрессирует один и тот же CSCP, но или на высоком уровне, или на низком уровне.

Линия клеток-хозяев для FASTR™ RGC10 была выбрана для экспрессии белка hFcYRI на высоком уровне в результате стабильной интеграции pTE158 и, как было уставлено, содержит 40 интегированных копий гена hFcYRI. Новую линию клеток, RS527, которая экспрессировала белок hFcYRI на более низком уровне, получали из СНО K1 после стабильной трансфекции и отбора в отношении интеграции одной копии гена. Клетки RS527 экспрессировали заметно меньше белка hFcYRI, чем клетки RGC10, как определено с помощью анализа с использованием Вестерн-блоттинга лизатов целых клеток линий клеток для FASTR™.

Вкратце, клетки RGC10 и RS527 трансфицировали pTE462, плазмидой, способной экспрессировать

- 16 037546 секретируемый слитый с hFc белок Rc1-hFc и придающей устойчивость к гигромицину. Трансфицированные культуры отбирали с помощью гигромицина в течение двух недель. Устойчивые к гигромицину клетки индуцировали с помощью 1 мкг/мл доксициклина (Dox) и блокировали с помощью IgG кролика в течение ночи, в соответствии со способом FASTR™, описанным здесь. На следующий день культуры RGC10/pTE462 и RS527/pTE462 окрашивали с использованием FITC-конъюгированного антитела, специфического в отношении hFc, а затем анализировали с помощью проточной цитометрии. Три ячейки R4, R5 и R6 с клетками, характеризующимися низким, средним и высоким уровнем флуоресценции соответственно были выбраны из каждой линии хозяина и размножены в культуре ткани.

Для сравнения уровня продукции белка Rc1-hFc из шести ячеек с клетками, шесть культур были инициированы, используя равное количество клеток в случае каждой ячейки. Спустя три дня собирали кондиционированные среды. Титры белков Rc1-hFc в кондиционированных средах определяли с помощью ELISA и наносили на график в зависимости от средней флуоресценции в соответствующих ячейках с клетками. В случае обеих линий клеток RGC10 и RS527 отмечалась схожая корреляция между средней флуоресценцией (количеством Rc1-hFc, представленным на клеточной поверхности) и уровнями продукции белка sPOI выделенных пулов клеток. Самое главное, что титры sPOI в двух ячейках R6 с высоким уровнем флуоресценции, происходящих от RGC10 и RS527, были схожими. Эти данные показывают, что уровень экспрессии CSCP в линии клеток-хозяев для FASTR™ не влияет существенно на использование этого хозяина для выделения трансфицированных клеток на основе уровня экспрессии в sPOI.

Пример 11. Рецептор Tie2 в качестве захватывающего белка клеточной поверхности.

Захватывающие белки клеточной поверхности (CSCP), отличные от FcyRI, могут использоваться в описываемых здесь способах. В этом примере рецептор Tie2 функционирует в качестве CSCP и используется для выделения клеток, экспрессирующих Tie-специфический слитый белок ScFv_Cib-Fc, полученный из моноклонального антитела C1b, которое специфически связывается с экстраклеточным доменом рецептора Tie2. Хотя CSCP в случае ScFv_C1b-Fc может быть hFcYRI, этот пример показывает, что Tie2 может также использоваться в качестве CSCP в случае ScFv_C1b-Fc.

Для создания линии клеток с индуцируемой экспрессией Tie2 в качестве CSCP, СНО K1 сначала стабильно трансфицировали содержащей TetR плазмидой pcDNA6/TR. Пул устойчивых к бластицидину клеток затем стабильно трансфицировали pTE259, плазмидой, которая делает возможной индуцируемую экспрессию белка, состоящего из экстраклеточного домена и трансмембранного домена Tie2. Индуцируемые клеточные клоны выделяли с помощью проточной цитометрии после окрашивания антителом, специфическим в отношении Tie2. Клон RGC54 был выбран для изучения годности FASTR™ для экспрессии ScFv_C1b-Fc.

Клетки RGC54 стабильно трансфицировали pTE988, плазмидой, способной экспрессировать секретируемый слитый с hFc белок ScFv_C1b-Fc и придающей устойчивость к гигромицину.

Трансфицированную культуру отбирали с помощью гигромицина в течение двух недель. Устойчивые к гигромицину клетки индуцировали с помощью Dox и блокировали с использованием 1 мг/мл очищенного mAb C1b. Моноклональное антитело C1b было источником вариабельных областей в ScFv_C1bFc. На следующий день пул клеток окрашивали FITC-конъюгированным антителом, специфическим для hFc, а затем анализировали с помощью проточной цитометрии. Три ячейки R6, R7 и R8 с клетками, характеризующимися низким, средним и высоким уровнем флуоресценции соответственно, были выделены из каждой линии хозяина и размножены в культуре ткани. Три культуры были инициированы, используя равное количество клеток в случае каждой ячейки для определения продукции белка ScFvCib-Fc, как определено с помощью ELISA. Существовала корреляция между средней флуоресценцией (количеством ScFv_C1b-Fc, связывающегося с Tie2 на клеточной поверхности) и уровнями продукции белка ScFv_C1b-Fc в выделенных пулах клеток.

Эти данные показывают, что CSCP, отличные от hFcYRI, может служить в качестве CSCP, а также предполагают, что любой рецептор может быть преобразован в CSCP посредством удаления его цитоплазматического домена. Эти данные также показывают, что антиген может быть превращен в CSCP и использоваться для скрининга FASTR™ клеток, экспрессирующих антигенспецифическую, относящуюся к антителу молекулу.

Пример 12. Эффективные скрининги FASTR™ с использованием пар CSCP: sPOI с низким сродством.

Ангиопоэтин-1 представляет собой лиганд для рецептора Tie2. Химерный белок, содержащий рецептор-связывающий домен ангиопоэтина-1 и hFc (FD1-hFc), связывается с Tie2 с константой связывания по сродству, составляющей 174 нМ, как определено с помощью BIAcore™. FD1-hFc и Tie2 были выбраны в качестве sPOI и CSCP соответственно для определения того, требуется ли минимальное сродство между CSCP и sPOI для скринингов FASTR™.

В экспериментах по декорированию клеток добавляемый извне FD1-hFc специфически связывался с клетками RGC54 через Tie2. Для определения того, является сродство между Tie2 и FD1-hFc достаточным для допуска скрининга FASTR™, клетки RGC54 стабильно трансфицировали pTE942, плазмидой, способной экспрессировать секретируемый слитый с hFc белок FD1-hFc и придающей устойчивость к гигромицину. Трансфицированные культуры отбирали с помощью гигромицина в течение

- 17 037546 двух недель. Устойчивые к гигромицину клетки индуцировали с помощью Dox и блокировали с использованием 1 мг/мл очищенного FD1-mFc, включающего Fc IgG1 мыши. На следующий день пул клеток окрашивали FITC-конъюгированным антителом, специфическим для hFc, а затем анализировали с помощью проточной цитометрии. Три ячейки R6, R7 и R8 с клетками, характеризующимися высоким, средним и низким уровнем флуоресценции соответственно, были выделены. Культуры были инициированы, используя равное количество клеток в случае каждой ячейки для определения уровней продукции белка FD1-hFc в кондиционированной среде, как определено с помощью ELISA. Существовала корреляция между средней флуоресценцией (связыванием FD1-Fc со связанным с клеточной поверхностью Tie2) и уровнями продукции белка FD1-hFc в выделенных пулах клеток. В ячейке с самым высоким уровнем флуоресценции продуцировалось больше всего FD1-hFc.

Эти данные показывают, что пара CSCP:sPOI с низким сродством (KD=174 нМ) может использоваться для эффективных скринингов FASTR™. Важно отметить, что t_1/2 диссоциации для связывания FD1-Fc:Tie2 составляет менее 2 мин, предполагая, что любая пара CSCP:sPOI с измеримым сродством может работать при скринингах FASTR™. Кроме того, этот эксперимент также показывает, что не являющийся FcyRI рецептор может использоваться в качестве CSCP для выделения клеток, экспрессирующих лиганд для него.

Пример 12. Слияние трансмембранного домена с ScFv создает функциональный CSCP.

CSCP может быть любым связанным с поверхностью клетки белком, который обладает определяемым сродством к sPOI. Чтобы продемонстрировать это, полностью синтетический CSCP был сконструирован посредством слияния трансмембранного домена рецептора PDGF с ScFv, содержащим вариабельные области из мышиного, специфического в отношении каппа-цепи моноклонального антитела HB58. Хозяин для FASTR™, который экспрессирует этот химерный белок (ScFv_HB58-TM_PDGFR), был создан и использован для выделения клеток, экспрессирующих специфическое в отношении FD-домена антиопоэтина-2 антитело P12.

Линия клеток RS655, происходящая от СНО K1, конструктивно экспрессирует SCFVHB58-TMPDGFR. Клетки, экспрессирующие ScFv_HB58-TM_PDGFR, могут быть окрашены путем последовательной инкубации с mAb P12, FD2-hFc, и FITC-конъюгированное антитело против hFc -P12, захваченное на клеточной поверхности с помощью ScFv HB58, детектировали по его сродству к FD2, которое, в свою очередь, определяли с помощью распознавания hFc-метки. Клетки RS656 были получены из клеток RS655 после стабильной трансфекции плазмидой, кодирующей ген eYFP. Почти 100% клеток RS656 были eYFPположительными, и у большинства (76%) сохранялась экспрессия ScFv_HB58-TM_PDGFR, как определено по связыванию с FD2-hFc.

Клетки RS655 стабильно трансфицировали pTE693, плазмидой, способной экспрессировать тяжелые и легкие цепи антитела P12 и придающей устойчивость к пуромицину. Трансфицированную культуру отбирали с использованием пуромицина в течение двух недель с получением пула клеток, которые были неоднородными в отношении экспрессии mAb P12 (RS655/pTE693).

Для определения того, может ли ScFv_HB58-TM_PDGFR функционировать в качестве CSCP и способствовать отделению клеток, продуцирующих антитела, от непродуцентов, равные количества клеток RS656 и клеток RS655/pTE693 были смешаны и подвергнуты сокультивированию. Когда P12, экспрессируемому в клетках RS655/pTE693, предоставляли возможность диффундировать и связываться с ScFv_HB58 на поверхности клеток RS656, большая популяция желтых клеток была также положительной по связыванию FD2-hFc. Однако, если ScFv_HB58 на поверхности RS656 был связан с избыточным количеством IgG мыши, то только не являющиеся желтыми клетки были положительными по связыванию FD2-hFc демонстрируя, что экспрессирующие клетки эффективно отделяются от не экспрессирующих клеток.

Эти данные показывают, что ScFv может быть превращен в функциональной CSCP посредством ориентации его на клеточную мембрану. Эти данные также показывают, что FASTR™ позволяет детектировать клетки, экспрессирующие секретируемое антитело, с помощью антигена, соответствующего антителу.

Пример 13. Представляющий интерес белок, включающий вариабельную область T-клеточного рецептора.

Основанный на проточной цитометрии способ захвата аутологичной секреции (FASTR™) для выделения экспрессирующих на высоком уровне клонов линии клеток, экспрессирующей представляющий интерес белок, которым является TCR-Fc, подготавливают аналогично приготовлению линии клеток, экспрессирующих представляющее интерес антитело. Клоны с высоким уровнем экспрессии идентифицируют посредством скрининга клеток, которые представляют на своей поверхности представляющий интерес TCR-Fc, связанный с hFcYR.

В этих примерах используют линию клеток СНО K1 RGC10, содержащих индуцируемый hFcYR1 в качестве захватывающей молекулы клеточной поверхности. Создают линию RGC10, которая экспрессирует рекомбинантные TCR-Fc, путем клонирования вариабельных областей TCR в рамке с Fc-областью человека, или непосредственно в рамке или с использованием линкерной последовательности между вариабельными областями TCR и Fc-областью человека.

- 18 037546

Для создания представляющего интерес белка, который представляет собой димер, включающий связанный с Fc вариабельный домен α TCR и связанный с Fc вариабельный домен β TCR, RGC10 трансфицируют двумя векторами: первым вектором, способным экспрессировать слияние вариабельного домена α TCR с последовательностью Fc человека, и вторым вектором, способным экспрессировать слияние домена β TCR с той же последовательностью Fc человека. Каждый вектор включает лидерную последовательность (например, сигнальную последовательность секреции) 5' по отношению к вариабельной области TCR и селектируемый маркер, который представляет собой ген резистентности к лекарственному средству. После трансфекции каждым вектором клетки, содержащие вектор, отбирают путем отбора с использованием соответствующего лекарственного средства. Отбор приводит к линии клеток RGC10, содержащей как первый, и второй векторы. Клетки, экспрессирующие представляющие интерес белки, можно детектировать с помощью одного или более из антитела против вариабельного домена β, антитела против вариабельного домена а и антитела против Fc-домена.

Для создания представляющего интерес белка, который представляет собой димер, включающий вариабельный домен как α, так и β TCR, слитый с Fc, RGC10 трансфицируют одним вектором, кодирующим представляющий интерес белок, который конструируют следующим образом: лидерная последовательность (например, сигнальная последовательность секреции), за которой следует вариабельный домен β TCR, слитый с линкером, который, в свою очередь, слит с вариабельным доменом α TCR, который, в свою очередь, слит с последовательностью Fc. В качестве альтернативы один вектор может быть сконструирован следующим образом: лидерная последовательность (например, сигнальная последовательность секреции), за которой следует вариабельный домен α TCR, слитый с линкером, который, в свою очередь, слит с вариабельным доменом β TCR, который, в свою очередь, слит с последовательностью Fc. Клетки, экспрессирующие представляющие интерес белки, можно детектировать с помощью одного или более из антитела против вариабельного домена β, антитела против вариабельного домена α и антитела против Fc-домена.

Для создания представляющего интерес белка, описанного выше, который также включает константный домен α TCR и/или β TCR, вариабельный домен TCR (α или β) сливают с константным доменом TCR (например, вариабельный домен α TCR сливают с константным доменом α TCR, a вариабельный домен β TCR сливают с константным доменом β TCR), и вариабельный+константный домен TCR сливают непосредственно или через линкер с Fc-доменом.

Клетки, экспрессирующие представляющие интерес белки, можно детектировать с помощью одного или более из антитела против вариабельного домена β, антитела против вариабельного домена α и антитела против Fc-домена.

Клетки, экспрессирующие желаемые количества TCR-Fc, выделяют, используя методику, которая использовалась при выделении описанных здесь 4SC622-nродуцирующих клеточных линий, с использованием одного или более из антитела против вариабельного домена α, антитела против вариабельного домена β, антитела против константного домена α, антитела против константного домена β и антитела против Fc-домена. Клетки, экспрессирующие TCR-Fc на самых высоких уровнях, выбирают в качестве TCR-Fc-продуцирующих клеточных линий.

Пример 14. CSCP на основе ScFv для выделения нескольких изотипов IgG и биспецифических антител.

Генетически модифицированных мышей, у которых VDJ-сегмент, кодирующий фрагмент тяжелой цепи иммуноглобулина, и VJ-сегмент, кодирующий фрагмент легкой цепи каппа иммуноглобулина, их геномов были заменены ортологами у человека (т.е. мышей Velocimmune®, см. патент США № 7105348, который включен сюда посредством ссылки в его полном объеме) иммунизировали либо Fcфрагментом белка IgG4 человека (hFc, или просто Fc; SEQ ID NO: 26), либо полипептидом ΔAdpFc человека, содержащим дипептидную мутацию (H95R, Y96F в соответствии с IMGT; также известным как Fc*; SEQ ID NO: 42). Моноклональные антитела были получены от мышей и подвергнуты скринингу в отношении их способности к связыванию с Fc, Fc* или антителами, включающими Fc и/или Fc*. Три антитела, способные связываться с Fc (Ab1, Ab2, Ab3), и три, которые были способны связываться с Fc* (Ab4, Ab5, Ab6), были проверены на их способность связывать молекулы, имеющие один из следующих форматов: Fc/Fc, Fc/Fc* (который может быть биспецифическим антителом) и Fc/Fc*.

Измерения для определения сродства связывания и кинетических констант были сделаны на инструменте Biacore 2000. Антитела (каждое из Ab1-Ab8) были захвачены на поверхность сенсора с антителом против Fc мыши (формат захвата м Ab), и гомодимеры Fc человека (SEQ ID NO: 26), гомодимеры Fc* человека (SEQ ID NO: 42) или гетеродимеры Fc/Fc* пропускали по поверхности. Кинетические константы скорости ассоциации (ka) и диссоциации (kd) определяли посредством обработки и подгонки данных к модели связывании в соотношении 1:1, используя программное обеспечение для вычерчивания кривой по точкам Scrubber 2.0. Константы равновесия при диссоциации (K_D) и полупериод диссоциации (t_1/2) рассчитывали, исходя из кинетических констант скорости, как представлено далее: K_D (M)=k_d/k_a; и t_1/2 (мuн)=(In2/(60*kd). Как показано в табл. 2, антитела были трех различных категорий: Fcспецифическими, Fc*-специфическими и теми, которые не демонстрируют различие между Fc и Fc* (не

- 19 037546 специфическими). Fc-специфические антитела были зависимыми от аминокислот His 95 и/или Tyr 96, поскольку эти антитела не связываются с Fc* человека с дипептидной мутацией (H95R, Y96F) в нем. Напротив, Fc*-специфические антитела были зависимыми от Arg 95 и/или Phe 96, поскольку эти антитела не связываются с Fc человека дикого типа.

Пример 15. Линии клеток, продуцирующие Ab2 и слитый белок ScFv-FcyR, происходящий от Ab2.

Были секвенированы тяжелая цепь и легкая цепь Fc-специфического Ab2. Для получения рекомбинантного антитела Ab2 был сконструирован экспрессионный вектор в виде плазмиды, кодирующий тяжелую цепь, и был сконструирован экспрессионный вектор в виде плазмиды, кодирующий легкую цепь. Оба вектора допускают экспрессию и секрецию соответствующих субъединиц в клетке СНО. Для экспрессии антитела обе плазмиды трансфицировали в клетку CHO-K1, и были выделены стабильные трансформанты. Экспрессия цепей антител находилась под контролем конститутивного промотора CMV.

Таблица 2. Сродство антител - исследования с использованием поверхностного плазменного резонанса

Антитело	POI-мишень	ka (M-1 сек-1)	kd (сек'1)	KD (М)	t1/2 (мин)	Специфичность
Ат 1	Fc/Fc	1.07E+05	3.79Е-04	3.54Е-09	30	Fc
Fc/Fc*	8.16E+04	3.01 Е-04	3.69Е-09	38
Fc*/Fc*	нет данных	нет данных	нет данных	нет данных
Ат 2	Fc/Fc	7.86E+04	3.50Е-05	4.45Е-10	330	Fc
Fc/Fc*	5.45E+04	1.00-06	1.84Е-11	11550
Fc*/Fc*	нет данных	нет данных	нет данных	нет данных
Ат 3	Fc/Fc	1.77Е+05	4.08Е-02	2.30Е-07	0.3	Fc
Fc/Fc*	4.51 Е+04	2.60Е-02	5.77Е-07	0.4
Fc*/Fc*	нет данных	нет данных	нет данных	нет данных
Ат 4	Fc/Fc	нет данных	нет данных	нет данных	нет данных	Fc*
Fc/Fc*	6.00Е+03	1 Ό0Ε-06	2.00Е-10	11550
Fc*/Fc*	2.22Е+04	9.56Е-06	4.50Е-10	1209
Ат 5	Fc/Fc	нет данных	нет данных	нет данных	нет данных	Fc*
Fc/Fc*	3.11Е+05	1Ό0Ε-06	3.21Е-12	11550
Fc*/Fc*	5.57Е+05	1.00Е-06	1.79Е-12	11550
Ат 6	Fc/Fc	нет данных	нет данных	нет данных	нет данных	Fc*
Fc/Fc*	4.48Е+05	7.43Е-04	1.66Е-09	16
Fc*/Fc*	8.73Е+05	5.93Е-04	6.79Е-10	19
Ат 7	Fc/Fc	6.02Е+05	2.42Е-04	4.02Е-10	48	He специфич.
Fc/Fc*	4.90Е+05	2.15Е-04	4.39Е-10	54
Fc*/Fc*	4.46Е+05	3.20Е-02	7.18Е-08	0.4
Ат 8	Fc/Fc	2.59Е+05	4.88Е-04	1.88Е-09	24	He специфич.
Fc/Fc*	1.88Е+05	4.02Е-04	2.14Е-09	29
Fc*/Fc*	4.10Е+04	3.90Е-02	9.60Е-07	0.3

Последовательности тяжелой цепи и легкой цепи были использованы для разработки захватывающей молекулы поверхности, включающей ScFv против Fc. Для получения нуклеиновой кислоты, кодирующей захватывающую молекулу клеточной поверхности ScFv-FcyR против Fc, происходящую от Ab2, аминокислотные последовательности вариабельного домена тяжелой цепи иммуноглобулина Ab2 (SEQ ID NO: 15) и вариабельного домена легкой цепи иммуноглобулина Ab2 (SEQ ID NO: 16) были обратно переведены в нуклеотидные последовательности и подвергнуты оптимизации в отношении частоты использования кодонов для экспрессии в клетках СНО. Также C-концевая часть FcyRI человека была подвергнута оптимизации в отношении частоты использования кодонов для экспрессии в клетках СНО. Оптимизированные в отношении частоты использования кодонов нуклеотидные последовательности амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции и лигировали с образованием непрерывной последовательности нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 20), которая кодирует слитый белок ScFv-FcyR с SEQ ID NO: 19.

Нуклеиновую кислоту, кодирующую слитый белок ScFv-FcYR-TM-cyto, встраивали в экспрессионный вектор, используя стандартную ПЦР и методы клонирования с использованием эндонуклеаз рестрикции. Полученная замкнутая в круг плазмида, проиллюстрированная в SEQ ID NO: 23, включает кодирующую бета-лактамазу последовательность нуклеиновой кислоты и два оперона. Первый оперон включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую желтый флуоресцентный белок (YFP), вариант зеленого флуоресцентного белка, в рамке с маркером устойчивости к неомицину, под контролем промотора SV40 (например, SEQ ID NO: 24). Второй оперон, который является наиболее важной частью вектора для целей этого аспекта изобретения, включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую кодон-оптимизированный слитый белок ScFv-FcyR, под контролем промотора hCMV-IE и интрон hCMV (например, SEQ ID NO: 25).

Клетки CHO-K1 трансфицировали плазмидой SEQ ID NO: 23. Были выделены стабильные интегранты, которые интегрировали линейную конструкцию SEQ ID NO: 22 в свои геномы.

- 20 037546

Замкнутая в круг плазмида содержит два Lox-сайта, фланкирующие первый оперон и второй оперон, чтобы обеспечить интеграцию этих оперонов в виде линейной конструкции в геном клетки-хозяина. Линейная конструкция, простирающаяся от первого Lox-сайта до второго Lox-сайта, иллюстрируется в SEQ ID NO: 22 и включает от 5' к 3': промотор SV40, нуклеиновую кислоту, кодирующую устойчивость к неомицину, IRES, нуклеиновую кислоту, кодирующую eYFP, последовательность полиаденилирования SV40, промотор hCMV-IE, интрон hCMV, последовательность Tet-оператора (для контролируемой экспрессии слитого белка ScFv-FcyR-TM-cyto), кодирующую сигнальную последовательность mROR нуклеиновую кислоту, нуклеиновую кислоту, кодирующую ScFv Ab2, нуклеиновую кислоту, кодирующую трансмембранную и цитоплазматическую часть FcyR (SEQ ID NO: 21), и последовательность полиаденилирования SV40.

Пример 16. Целевые объекты захвата на поверхности с помощью ScFv-FcyR-TM-cyto

Клетки CHO-K1, содержащие интегрированную последовательность SEQ ID NO: 22, трансфицировали плазмидами, которые кодируют антитела различных подтипов, например IgG1, IgG2, IgG4, биспецифическое антитело подтипа IgG4, содержащее один CH3-домен с двумя заменами 95R/435R-96F/436F, в то время как другой CH3-домен является доменом дикого типа (Fc/Fc* IgG4), и биспецифическое антитело подтипа IgG1 формата Fc/Fc* IgG1. Клетки обрабатывали доксициклином для вызова продукции, захватывающей молекулы вместе с антителом. После коэкспрессии антитела и захватывающей молекулы, клетки в некоторых случаях обрабатывали hFc-блокирующим белком и детекторной молекулой (FITC-меченным антителом против hFab). В табл. 3 суммированы результаты, и в общем показано, что слитый белок для захвата на поверхности ScFv-FcyR связывает молекулы IgG4, IgG2 и IgG1, в то время как включающая FcyR дикого типа захватывающая молекула поверхности связывает IgG1, но не IgG4 или IgG2.

Таблица 3. Анализы конкуренции с использованием блокирующей молекулы

	Произвольные FITC единицы (c hFc-блокирующей молекулой или без нее) - Способ	Замена hFc?
Антитело	Без hFc	hFc (1 ч)	hFc (2 ч)	hFc (20 ч)	Без покрытия
	Захватывающая молекула = ScFv-FcyR-TM-cyto Детекторная молекула = FITC-меченное антитело против hFab
IgGl mAb-3	250	120	80	20	10	Да
IgG4 mAb-4	250	100	55	20	10	Да
IgG4 mAb-5	250	70	40	20	10	Да
IgG2 mAb-6	2001	Нет данных	ND	ND	122	Да
	Захватывающая молекула = hFcyR Детекторная молекула = FITC-меченное антитело против hFab
IgGl mAb-3	300	80	30	9	3,5	Да
IgG4 mAb-4	100	2	2	2	2	Нет
IgG4 mAb-5	35	5	5	5	5	Нет

¹ + Dox ² - Dox

Пример 17. Линии клеток, продуцирующие Ab6 и происходящий от Ab6 ScFv*-FcyR-TM-cyto.

Были секвенированы тяжелая цепь и легкая цепь Fc*-специфического Ab6. Аминокислотной последовательностью легкой цепи, как установлено, является SEQ ID NO: 41. Аминокислотной последовательностью тяжелой цепи, как установлено, является SEQ ID NO: 40. Для получения рекомбинантного антитела Ab6 был сконструирован экспрессионный вектор в виде плазмиды, кодирующий тяжелую цепь, и был сконструирован экспрессионный вектор в виде плазмиды, кодирующий легкую цепь. Для экспрессии антитела обе плазмиды трансфицировали в клетку CHO-K1, были выделены стабильные трансформанты, и экспрессия находилась под контролем конститутивного промотора CMV.

Для получения нуклеиновой кислоты, кодирующей захватывающую молекулу клеточной поверхности ScFv*-FcyR, происходящую от Ab6 и специфичную к Fc*, аминокислотные последовательности вариабельного домена тяжелой цепи иммуноглобулина антитела Ab6 (SEQ ID NO: 38) и вариабельного

- 21 037546 домена легкой цепи иммуноглобулина Ab6 (SEQ ID NO: 39) были обратно переведены в нуклеотидные последовательности и подвергнуты оптимизации в отношении частоты использования кодонов для экспрессии в клетках СНО. Также C-концевая часть FcyRI человека (SEQ ID NO: 21) была подвергнута оптимизации в отношении частоты использования кодонов для экспрессии в клетках СНО. Оптимизированные в отношении частоты использования кодонов нуклеотидные последовательности амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции и лигировали с образованием непрерывной последовательности нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 45), которая кодирует слитый белок ScFv*FcyR против Fc* (SEQ ID NO: 43).

Нуклеиновую кислоту, кодирующую слитый белок ScFv*-FcYR-TM-cyto, встраивали в экспрессионный вектор, используя стандартную ПЦР и методы клонирования с использованием эндонуклеаз рестрикции. Полученная замкнутая в круг плазмида, проиллюстрированная в SEQ ID NO: 44, включает кодирующую бета-лактамазу последовательность нуклеиновой кислоты и два оперона. Первый оперон включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую желтый флуоресцентный белок (YFP), вариант зеленого флуоресцентного белка, в рамке с маркером устойчивости к неомицину, под контролем промотора SV40 (например, SEQ ID NO: 46). Второй оперон, который является наиболее важной частью вектора для целей этого аспекта изобретения, включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую кодон-оптимизированный слитый белок ScFv-FcyR против Fc*, под контролем промотора hCMV-IE и интрон hCMV (например, SEQ ID NO: 47).

Клетки CHO-K1 трансфицировали плазмидой SEQ ID NO: 44. Были выделены стабильные интегранты, которые интегрировали линейную конструкцию SEQ ID NO: 48.

Замкнутая в круг плазмида содержит два Lox-сайта, фланкирующие первый оперон и второй оперон, чтобы обеспечить интеграцию этих оперонов в виде линейной конструкции в геном клетки-хозяина. Линейная конструкция, простирающаяся от первого Lox-сайта до второго Lox-сайта, иллюстрируется в SEQ ID NO: 48 и включает от 5' к 3': промотор SV40, нуклеиновую кислоту, кодирующую устойчивость к неомицину, IRES, нуклеиновую кислоту, кодирующую eYFP, последовательность полиаденилирования SV40, промотор hCMV-IE, интрон hCMV, последовательность Tet-оператора (для контролируемой экспрессии слитого белка ScFv* против Fc*-FcyR), кодирующую сигнальную последовательность mROR нуклеиновую кислоту, нуклеиновую кислоту, кодирующую ScFv*, происходящий от Ab6 и специфичный к Fc*, нуклеиновую кислоту, кодирующую трансмембранный и цитоплазматический домен полипептид FcyR (SEQ ID NO: 21), и последовательность полиаденилирования SV40.

Пример 18. Сортировка биспецифических антител.

Захват с использованием направленной против Fc молекулы и детектирование с использованием антитела против Fc*.

Система захвата на поверхности на основе ScFv-FcyR, происходящего от Ab2 и специфичного к Fc, была проверена на ее способность обнаруживать и обогащать в отношении клетки(ок), которые продуцируют биспецифические антитела. Для оценки способности детектировать биспецифические антитела, которые содержат замену 95R/435R-96F/436F в одном из CH3-доменов (названном Fc*), были экспрессированы различные антитела в линии клеток с захватывающей молекулой ее поверхности в виде белка ScFvFcyR, происходящего от Ab2 и специфичного к Fc, используя hFc в качестве блокирующей молекулы, и FITC-меченное антитело против Fc* Ab6 (например, mAb с НС с SEQ ID NO: 40, и LC с SEQ ID NO: 41) в качестве детекторной молекулы. Линия клеток с захватывающей молекулой на ее поверхности в виде белка ScFv-FcyR, происходящего от Ab2 и специфичного к Fc, была способна детектировать и отличать биспецифическое антитело (Fc/Fc*) от любых моноспецифических антител Fc*/Fc* или Fc/Fc, используя Fc*-специфическое антитело Ab6 в качестве детекторной молекулы (табл. 4). Линия клеток с захватывающей молекулой на ее поверхности в виде белка FcyR дикого типа не была способна провести различие между видами Fc/Fc*, Fc*/Fc* и Fc/Fc IgG4, поскольку FcyR не может связывать или связывается с очень низким сродством к IgG4.

Захват с использованием направленной против Fc* молекулы и детектирование с использованием антитела против Fc.

С другой стороны, система захвата на поверхности на основе ScFv*-FcyR, происходящего от Ab6 и специфичного к Fc*, была проверена на ее способность обнаруживать и обогащать в отношении клетки(ок), которые продуцируют биспецифические антитела. Для оценки способности детектировать биспецифические антитела, которые содержат замену 95R/435R-96F/436F в одном из CH3-доменов (названном Fc*), были экспрессированы различные антитела в линии клеток с захватывающей молекулой на ее поверхности в виде белка ScFv*-FcyR, происходящего от Ab6 и специфичного к Fc*, используя hFc в качестве блокирующей молекулы, и Alexa 488-меченное антитело против Fc Ab2, которое распознает не замещенный CH3, в качестве детекторной молекулы. Линия клеток с захватывающей молекулой на ее поверхности в виде белка происходящий от Ab6 анти-Fc*-спецuфический ScFv*-FcyR была способна детектировать и отличать биспецифическое антитело (Fc/Fc*) от любых моноспецифических антител Fc*/Fc* или Fc/Fc, используя Fc-специфическое антитело Ab2 в качестве детекторной молекулы (табл. 4). Линия клеток с захватывающей молекулой на ее поверхности в виде FcyR не была способна провести

- 22 037546 различие между видами Fc/Fc*, Fc*/Fc* и Fc/Fc IgG4.

Таблица 4. Детектирование биспецифических антител - средняя интенсивность флуоресценции (MFI)

		IgGl	IgG4
XCSCP	2 DM	Fc/Fc*	Fc*/Fc*	Fc/Fc	Fc/Fc*	Fc*/Fc*	Fc/Fc	Специфичность в отношении Fc/Fc*
FcyR	Ab 2	500	Нет данных	350	200	200	200	НЕТ
Ab 6	200	200	200	Нет данных	Нет данных	Нет данных	НЕТ
АнтиhFc	1800	Нет данных	1000	Нет данных	Нет данных	Нет данных	НЕТ
ScFv- FcyR	Ab 6	500	15	15	500	15	15	ДА
АнтиhFc	Нет данных	Нет данных	Нет данных	Нет данных	Нет данных	Нет данных	Нет данных
ScFv*- FcyR	Ab 2	150	10	10	Нет данных	Нет данных	Нет данных	ДА
АнтиhFc	200	Нет данных	10	Нет данных	Нет данных	Нет данных	ДА

¹ Захватывающий белок клеточной поверхности ² Детекторная молекула

Пример 19. Обогащение в отношении Fc/Fc* биспецифических антител.

Для оценки способности систем (происходящих от Ab2) ScFv-FcyR в качестве CSCP/антитело против Fc* (Ab6) в качестве DM (детекторной молекулы) и (происходящий от Ab6) ScFv*-FcyR в качестве CSCP/антитело против Fc (Ab2) в качестве DM к сортировке и обогащению биспецифических антител, линии клеток, коэкспрессирующие моноклональное антитело Fc/Fc* IgG4 (IgG4-мАт-2) и слитый белок ScFv-FcyR против Fc, используя hFc в качестве блокирующей молекулы и FITC-меченное антитело против Fc* (Ab6) в качестве детекторной молекулы, были подвергнуты серийной сортировке клеток с возбуждением флуоресценции и объединению для обогащения в отношении продукции видов Fc/Fc*. Клетки, вырабатывающие Fc/Fc*, из пулов пятой и шестой серии были проанализированы на титр антител в целом и титры антител каждого формата: Fc/Fc*, Fc/Fc и Fc*/Fc*. Поскольку клетки кодируют как тяжелую цепь, кодирующую не замещенный CH3-домен (Fc, т.е. включающий гистидин в положении 95 в соответствии с IMGT и тирозин в положении 96 в соответствии с IMGT), так и тяжелую цепь, кодирующей замещенный CH3-домен (Fc*, т.е. включающий аргинин в положении 95 в соответствии с IMGT и фенилаланин в положении 96 в соответствии с IMGT), согласно чисто математическому анализу с использованием решетки Пеннетта, клетка теоретически будет продуцировать 25% Fc/Fc, 50% Fc/Fc* и 25% Fc*/Fc*. Биологически, однако, можно было бы ожидать (предварительное обогащение), что большая часть продуцированного антитела будет Fc/Fc.

Как показано в табл. 5, клетки, отобранные, объединенные и обогащенные в отношении продукции биспецифических антител, продуцировали вплоть до 49% видов Fc/Fc*, с титрами Fc/Fc* биспецифических антител, составляющими по меньшей мере приблизительно 3,2 г/л.

- 23 037546

Таблица 5. Обогащение в отношении Fc/Fc* биспецифического антитела IgG4-MAm-2

		Fc/Fc*	Fc/Fc	Fc*/Fc*
Пул	Линия клеток	Титр (г/л)		Титр (г/л)		Титр (г/л)
5	1	1,2	28	2,2	50	0,99	23
2	1, 9	49	1,3	32	0,73	19
3	1,5	47	1,2	40	0,40	13
4	1, 6	37	1,3	31	1,3	32
5	1,5	48	1,1	35	0,58	18
6	1, 8	47	1,3	33	0,75	20
6	7	2, 6	44	2,0	34	1,3	23
8	3,2	42	2,4	31	2,0	27
9	2,1	45	1,5	33	1,0	22
10	2,8	43	2,0	31	1,7	28
11	2,3	44	1,6	31	1,3	24

Хотя предшествующее изобретение было описано довольно подробно с целью иллюстрации и примера, специалистам со средним уровнем компетентности в данной области техники будет очевидно, что определенные изменения и модификации могут быть внесены в идеи изобретения, не отступая от сущности или объема прилагаемой формулы изобретения.

- 24 037546

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ < 110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc.

< 12 0> РЕКОМБИНАНТНЫЕ ЗАХВАТЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ КЛЕТОЧНОЙ ПОВЕРХНОСТИ < 130> 8600-WO <150> US 61/726,040 <151> 2012-11-14 <160> 51 < 170> Патент в версии 3.5 < 210> 1 <211>195 < 212> Белок < 213> Streptococcus < 400> 1

Thr Туг Lys Leu ILe Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys GLy Glu Thr Thr 15 1015

Thr Glu Ala Vai Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys VaL Phe Lys Gin Tyr 20 2530

Ala Asn Asp Asn Gly Vai Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr 35 4045

Lys Thr Phe Thr Vai Thr Glu Lys Pro GLu Vai lie Asp Ala Ser Glu

5560

Leu Thr Pro Ala Vai Thr Thr Tyr Lys Leu Vai lie Asn Gly Lys Thr 65 70 7580

Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Vai Asp Ala Ala Thr Ala Glu 85 9095

Lys VaL Phe Lys GLn Tyr ALa Asn Asp Asn GLy VaL Asp Gly Glu Trp

100 105110

Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Vai Thr Glu Lys Pro Glu

115 120125

Vai lie Asp Ala Ser Glu Leu Thr Pro ALa Vai Thr Thr Tyr Lys Leu

130 135140

Vai lie Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Lys Ala Vai

- 25 037546

145 150

155 160

Asp Ala Glu Thr Ala Glu Lys Ala 165

Phe Lys GLn Tyr ALa Asn Asp Asn

L70 175

Gly Vai Asp Gly Vai Trp Thr Tyr 180

Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr

185 190

Vai Thr Glu

195 <210> 2 <211> 96 < 212> Белок < 213> Homo sapiens < 400> 2

Gin Vai Leu Gly Leu GLn Leu Pro

L 5

Thr Pro Vai Trp Phe His Vai Leu

L0 15

Phe Tyr Leu Ala Vai Gly lie Met 20

Phe Leu Vai Asn Thr Vai Leu Trp 25 30

Vai Thr He Arg Lys GLu Leu Lys

40

Arg Lys Lys Lys Trp Asp Leu GLu 45

LLe Ser Leu Asp Ser GLy His Glu

55

Lys Lys Vai Thr Ser Ser Leu GLn 60

Glu Asp Arg His Leu GLu GLu GLu 65 70

Leu Lys Cys GLn GLu GLn Lys GLu

80

Glu Gin Leu Gin Glu Gly Vai His 85

Arg Lys GLu Pro GLn GLy ALa Thr

95 <2L0> 3 <2L1> 33 < 2L2> ДНК < 2L3> искусственная последовательность <220>

< 2 2 3 > синтетическая < 400> 3 cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccatc ttc 33

- 26 037546 <210> 4 < 211> 33 < 212> ДНК < 213> искусственная последовательность <220>

< 2 2 3> синтетическая < 400> 4 acactctccc ctgttgaagc tcttgacaat ggg 33 <210> 5 <211> 31 < 212> ДНК < 213> искусственная последовательность <220>

< 2 2 3> синтетическая <4001 gccaaaacaa cagccccatc ggtctatcca c < 210> 6 < 211> 35 < 212> ДНК < 213> искусственная последовательность <220>

< 2 2 3> синтетическая < 400> 6 tcatttaccc ggagtccggg agaagctctt agtcg 35 < 210> 7 < 211> 47 < 212> ДНК < 213> искусственная последовательность <220>

< 2 2 3> синтетическая <400 gagagtacct gcgtcatgca gatgtgaaac tgcaggagtc tggccct < 210> 8 < 211> 38 < 212> ДНК < 213> искусственная последовательность <220>

< 2 2 3 > синтетическая < 400> 8 gagagacctg cgtcagctga ggagacggtg accgtggt 38

- 27 037546 <210> 9 <211> 35 < 212> ДНК < 213> искусственная последовательность <220>

< 2 2 3> синтетическая < 400> 9 gagagggtct cacagccaaa acaacagccc catcg 35 <210> 10 <211> 42 < 212> ДНК < 213> искусственная последовательность <220>

<2 2 3> синтетическая <400> 10 gagagggtct ccggccgctc atttacccgg agtccgggag aa 42 <210> 11 <211> 40 <212> днк <213> искусственная последовательность <220>

<2 2 3> синтетическая <400> 11 gagagcgtct catgcagaca tccagatgac ccagtctcca 40 <210> 12 <211> 40 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<2 2 3> синтетическая <400> 12 gagagcgtct cacagcccgt tttatttcca gcttggtccc 40 <210> 13 <211> 36 < 212> ДНК < 213> искусственная последовательность <220>

< 22 3> синтетическая

- 28 037546 <400> 13 gagagggtct cagctgatgc tgcaccaact gtatcc36 <210>14 <211>48 < 212> ДНК < 213> искусственная последовательность <220>

<2 2 3> синтетическая <400>14 gagagggtct caggccgctc aacactctcc cctgttgaag ctcttgac48 <210> 15 <211>113 <212> Белок <213> Homo sapiens <400> 15

Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu ALa Lys Pro Gly Ala Ser Vai 15 1015

Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp Tie 20 2530

His Trp Glu Lys GLn Arg Pro Glu Gin Gly Leu Glu Trp He Gly Tyr 35 4045

Tie Asn Pro Asn Thr Gly His Thr Glu Tyr Asn Gin Lys Phe Lys Asp

5560

Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gin 65 70 7580

Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Vai Tyr Phe Cys Ala Arg 85 9095

Thr Tyr Ser Gly Ser Ser His Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr

100 105110

Leu <210> 16 <211>112 <212> Белок

- 29 037546 <213> Homo sapiens <400> 16

Ser Asp lie Vai Met Thr Gin Thr Pro Vai Ser Leu Pro Vai Ser Leu 15 1015

Gly Asp Gin Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Vai His 20 2530

Asn Asn Gly Asp Thr Phe Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin 35 4045

Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Vai Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai 50 5560

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 7580 lie Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Leu Gly Vai Tyr Phe Cys Ser Gin

9095

Thr Thr Leu He Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He

100 105110 <210>17 <2H>21 <212> Белок <213> Homo sapiens <400>17

Vai Leu Phe Tyr Leu Ala Vai Gly He Met Phe Leu Vai Asn Thr Vai 15 1015

Leu Trp Vai

Thr He 20 <210> 18 <2H> 61 < 212> Белок < 213> Homo sapiens < 400> 18

Arg Lys Glu Leu Lys Arg Lys Lys Lys Trp Asp Leu Glu He Ser Leu

10 15

- 30 037546

Asp Ser Gly His Glu Lys Lys Vai Thr Ser Ser Leu Gin Glu Asp Arg 20 2530

His Leu Glu Glu Glu Leu Lys Cys Gin Glu Gin Lys Glu Glu Gin Leu 35 4045

Gin Glu Gly Vai His Arg Lys Glu Pro Gin Gly Ala Thr

5560 <210> 19 <2H>334 <212> Белок <213> искусственная последовательность <220>

<2 2 3> синтетический <400> 19

Gin Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala

1015

Ser Vai Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 2530

Trp lie His Trp Glu Lys Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 4045

Gly Tyr He Asn Pro Asn Thr Gly His Thr Glu Tyr Asn Gin Lys Phe 50 5560

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 7580

Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Vai Tyr Phe Cys 85 9095

Ala Arg Thr Tyr Ser Gly Ser Ser His Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly

100 105110

Thr Thr Leu He Vai Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp He Vai Met Thr Gin Thr Pro Vai Ser

130 135140

- 31 037546

Leu Pro Vai Ser Leu GLy Asp GLn ALa Ser LLe Ser Cys Arg Ser Ser

L45 L50 L55L60

GLn Ser Leu VaL His Asn Asn Gly Asp Thr Phe Leu His Trp Tyr Leu L65 L70175

Gin Lys Pro GLy GLn Ser Pro Lys Leu Leu LLe Tyr Lys VaL Ser Asn

180 185190

Arg Phe Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

195 200205

Asp Phe Thr Leu Lys LLe Ser Arg VaL Glu Ala Glu Asp Leu GLy VaL 2L0 2L5220

Tyr Phe Cys Ser GLn Thr Thr Leu LLe Pro Arg Thr Phe GLy GLy GLy

225 230 235240

Thr Lys Leu GLu LLe Lys Arg GLy GLy Gly Gly Ser Vai Leu Phe Tyr

245 250255

Leu ALa VaL GLy LLe Met Phe Leu VaL Asn Thr VaL Leu Trp VaL Thr

260 265270

LLe Arg Lys GLu Leu Lys Arg Lys Lys Lys Trp Asp Leu GLu LLe Ser

275 280285

Leu Asp Ser GLy His Glu Lys Lys VaL Thr Ser Ser Leu GLn GLu Asp

290 295300

Arg His Leu GLu GLu GLu Leu Lys Cys Gin Glu Gin Lys GLu GLu GLn

305 3L0 315320

Leu GLn GLu GLy VaL His Arg Lys GLu Pro GLn GLy ALa Thr

325330 <210> 20 <211>1005 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<2 2 3> синтетическая <400> 20 caagtacaac tgcaacaaag cggagctgaa ctggccaaac caggcgcttc cgtgaagatg 60

- 32 037546

tcttgtaaag	ccagcgggta	tacatttact	aattactgga	ttcactggga	gaagcaaaga	120
cctgaacagg	gattggaatg	gattggatac	attaatccta	acaccggaca	cacagagtat	180
aatcaaaaat	tcaaggataa	ggccaccctc	acagccgaca	gatcttcttc	aaccgcctat	240
atgcaacttt	cttccctcac	ttctgaagac	tccgcagttt	acttttgcgc	acgaacttat	300
tctggaagct	cccatttcga	ctactggggt	caaggaacaa	cactgatcgt	gtctagcggc	360
ggcggagggt	ccggcggggg	cggtagcggt	ggcggaggtt	ctgatattgt	catgactcaa	420
acacctgtct	ctctgcctgt	ttcacttgga	gatcaagcta	gcatttcctg	ccgctctagt	480
caatctctcg	tccacaacaa	cggcgatact	ttcttgcatt	ggtatctgca	gaaaccaggt	540
cagtcaccta	aactgcttat	atacaaagtc	tctaatagat	tctcaggggt	gccagatcga	600
ttcagtggtt	ctgggtccgg	tacagatttt	acactcaaga	tatccagagt	agaagcagaa	660
gatctgggcg	tgtatttctg	cagtcaaaca	acacttattc	ctcgtacttt	tggaggcggt	720
acaaaactgg	agatcaagcg	tggaggcgga	gggagtgttt	tgttttatct	ggccgttggg	780
ataatgtttc	tcgtaaatac	agtactttgg	gtaacaataa	ggaaggaact	gaagagaaag	840
aaaaaatggg	atctggaaat	atcattggac	agtggacacg	aaaaaaaagt	cacatcatca	900
ttgcaagaag	accggcactt	ggaggaggaa	ctgaaatgtc	aagagcaaaa	agaagaacaa	960
ctgcaagaag	gcgtacatag	aaaagaacca	cagggagcaa	catag		1005

<210> 21 <211>82 <212> Белок <213> Homo sapiens <400> 21

Vai Leu Phe Tyr Leu ALa VaL GLy Lie Met Phe Leu VaL Asn Thr Vai 15 1015

Leu Trp VaL Thr ILe Arg Lys GLu Leu Lys Arg Lys Lys Lys Trp Asp 20 2530

Leu GLu lie Ser Leu Asp Ser GLy His Glu Lys Lys VaL Thr Ser Ser 35 4045

Leu GLn Glu Asp Arg His Leu GLu Glu Glu Leu Lys Cys Gin Glu Gin 50 5560

Lys GLu Glu Gin Leu GLn GLu GLy VaL His Arg Lys GLu Pro Gin Gly

- 33 037546

65 Ala Thr	70	75	80
<210> 22 <211> 5759 < 212> ДНК < 213> искусственная последовательность <220> < 2 2 3 > синтетическая < 400> 22 acaacttcgt atagcataca ttatacgaag	ttatggtacc	aagcctaggc	ctccaaaaaa	60
gcctcctcac	tacttctgga	atagctcaga	ggcagaggcg	gcctcggcct	ctgcataaat	120
aaaaaaaatt	agtcagccat	ggggcggaga	atgggcggaa	ctgggcggag	ttaggggcgg	180
gatgggcgga	gttaggggcg	ggactatggt	tgctgactaa	ttgagatgca	tgctttgcat	240
acttctgcct	gctggggagc	ctggggactt	tccacacctg	gttgctgact	aattgagatg	300
catgctttgc	atacttctgc	ctgctgggga	gcctggggac	tttccacacc	ggatccacca	360
tgggttcagc	tattgagcag	gatgggttgc	atgctggtag	tcccgccgca	tgggtcgaac	420
gactgtttgg	atacgattgg	gcccaacaga	ctataggctg	ttccgacgct	gctgtctttc	480
gtctttctgc	acaaggtcgt	ccagttctgt	tcgtgaaaac	cgacttgtcc	ggagccctca	540
atgagttgca	agacgaagct	gcacgactga	gttggcttgc	caccactggt	gtcccatgtg	600
ccgcagtact	tgacgtcgtc	acagaggctg	gtcgcgattg	gttgctcctt	ggagaagtgc	660
ccggccaaga	tcttctcagt	tcccaccttg	cccctgccga	aaaagtttca	ataatggctg	720
acgctatgag	aaggctgcac	acccttgacc	ctgccacatg	tccattcgat	caccaagcca	780
aacaccgaat	tgaacgagct	agaacccgca	tggaagccgg	cctcgttgat	caagacgatt	840
tggatgagga	acaccagggt	ctcgcacccg	ctgaactctt	cgctcgcctc	aaagcacgaa	900
tgccagacgg	agatgacttg	gtcgtaaccc	acggagatgc	ctgccttcct	aacataatgg	960
tagagaatgg	aagatttagc	ggcttcattg	attgtggacg	acttggagtt	gcagatcggt	1020
accaagatat	cgctctcgct	accagagata	ttgctgaaga	attgggcgga	gaatgggctg	1080
atcggtttct	cgtactctac	ggaattgccg	cacctgattc	ccaacgcatt	gctttttacc	1140
gtcttctgga	tgagttcttc	taaacgcgtc	ccccctctcc	ctcccccccc	cctaacgtta	1200
ctggccgaag	ccgcttggaa	taaggccggt	gtgcgtttgt	ctatatgtta	ttttccacca	1260

- 34 037546

tattgccgtc	ttttggcaat	gtgagggccc	ggaaacctgg	ccctgtcttc	ttgacgagca	1320
ttcctagggg	tctttcccct	ctcgccaaag	gaatgcaagg	tctgttgaat	gtcgtgaagg	1380
aagcagttcc	tctggaagct	tcttgaagac	aaacaacgtc	tgtagcgacc	ctttgcaggc	1440
agcggaaccc	cccacctggc	gacaggtgcc	tctgcggcca	aaagccacgt	gtataagata	1500
cacctgcaaa	ggcggcacaa	ccccagtgcc	acgttgtgag	ttggatagtt	gtggaaagag	1560
tcaaatggct	ctcctcaagc	gtattcaaca	aggggctgaa	ggatgcccag	aaggtacccc	1620
attgtatggg	atctgatctg	gggcctcggt	gcacatgctt	tacatgtgtt	tagtcgaggt	1680
taaaaaacgt	ctaggccccc	cgaaccacgg	ggacgtggtt	ttcctttgaa	aaacacgatt	1740
gctcgaatca	ccatggtgag	caagggcgag	gagctgttca	ccggggtggt	gcccatcctg	1800
gtcgagctgg	acggcgacgt	aaacggccac	aagttcagcg	tgtccggcga	gggcgagggc	1860
gatgccacct	acggcaagct	gaccctgaag	ttcatctgca	ccaccggcaa	gctgcccgtg	1920
ccctggccca	ccctcgtgac	caccttcggc	tacggcctgc	agtgcttcgc	ccgctacccc	1980
gaccacatga	agcagcacga	cttcttcaag	tccgccatgc	ccgaaggcta	cgtccaggag	2040
cgcaccatct	tcttcaagga	cgacggcaac	tacaagaccc	gcgccgaggt	gaagttcgag	2100
ggcgacaccc	tggtgaaccg	catcgagctg	aagggcatcg	acttcaagga	ggacggcaac	2160
atcctggggc	acaagctgga	gtacaactac	aacagccaca	acgtctatat	catggccgac	2220
aagcagaaga	acggcatcaa	ggtgaacttc	aagatccgcc	acaacatcga	ggacggcagc	2280
gtgcagctcg	ccgaccacta	ccagcagaac	acccccatcg	gcgacggccc	cgtgctgctg	2340
cccgacaacc	actacctgag	ctaccagtcc	gccctgagca	aagaccccaa	cgagaagcgc	2400
gatcacatgg	tcctgctgga	gttcgtgacc	gccgccggga	tcactctcgg	catggacgag	2460
ctgtacaagt	aatcggccgc	taatcagcca	taccacattt	gtagaggttt	tacttgcttt	2520
aaaaaacctc	ccacacctcc	ccctgaacct	gaaacataaa	atgaatgcaa	ttgttgttgt	2580
taacttgttt	attgcagctt	ataatggtta	caaataaagc	aatagcatca	caaatttcac	2640
aaataaagca	tttttttcac	tgcattctag	ttgtggtttg	tccaaactca	tcaatgtatc	2700
ttatcatgtc	ggcgcgttga	cattgattat	tgactagtta	ttaatagtaa	tcaattacgg	2760
ggtcattagt	tcatagccca	tatatggagt	tccgcgttac	ataacttacg	gtaaatggcc	2820
cgcctggctg	accgcccaac	gacccccgcc	cattgacgtc	aataatgacg	tatgttccca	2880
tagtaacgcc	aatagggact	ttccattgac	gtcaatgggt	ggagtattta	cggtaaactg	2940
cccacttggc	agtacatcaa	gtgtatcata	tgccaagtac	gccccctatt	gacgtcaatg	3000

- 35 037546

acggtaaatg	gcccgcctgg	cattatgccc	agtacatgac	cttatgggac	tttcctactt	3060
ggcagtacat	ctacgtatta	gtcatcgcta	ttaccatggt	gatgcggttt	tggcagtaca	3120
tcaatgggcg	tggatagcgg	tttgactcac	ggggatttcc	aagtctccac	cccattgacg	3180
tcaatgggag	tttgttttgg	caccaaaatc	aacgggactt	tccaaaatgt	cgtaacaact	3240
ccgccccatt	gacgcaaatg	ggcggtaggc	gtgtacggtg	ggaggtctat	ataagcagag	3300
ctctccctat	cagtgataga	gatctcccta	tcagtgatag	agatcgtcga	cgtttagtga	3360
accgtcagat	cgcctggaga	cgccatccac	gctgttttga	cctccataga	agacaccggg	3420
accgatccag	cctccgcggc	cgggaacggt	gcattggaac	gcggattccc	cgtgccaaga	3480
gtgacgtaag	taccgcctat	agagtctata	ggcccacccc	cttggcttct	tatgcatgct	3540
atactgtttt	tggcttgggg	tctatacacc	cccgcttcct	catgttatag	gtgatggtat	3600
agcttagcct	ataggtgtgg	gttattgacc	attattgacc	actcccctat	tggtgacgat	3660
actttccatt	actaatccat	aacatggctc	tttgccacaa	ctctctttat	tggctatatg	3720
ccaatacact	gtccttcaga	gactgacacg	gactctgtat	ttttacagga	tggggtctca	3780
tttattattt	acaaattcac	atatacaaca	ccaccgtccc	cagtgcccgc	agtttttatt	3840
aaacataacg	tgggatctcc	acgcgaatct	cgggtacgtg	ttccggacat	ggtctcttct	3900
ccggtagcgg	cggagcttct	acatccgagc	cctgctccca	tgcctccagc	gactcatggt	3960
cgctcggcag	ctccttgctc	ctaacagtgg	aggccagact	taggcacagc	acgatgccca	4020
ccaccaccag	tgtgccgcac	aaggccgtgg	cggtagggta	tgtgtctgaa	aatgagctcg	4080
gggagcgggc	ttgcaccgct	gacgcatttg	gaagacttaa	ggcagcggca	gaagaagatg	4140
caggcagctg	agttgttgtg	ttctgataag	agtcagaggt	aactcccgtt	gcggtgctgt	4200
taacggtgga	gggcagtgta	gtctgagcag	tactcgttgc	tgccgcgcgc	gccaccagac	4260
ataatagctg	acagactaac	agactgttcc	tttccatggg	tcttttctgc	agtcaccgtc	4320
cttgacacga	agcttatact	cgagctctag	attgggaacc	cgggtctctc	gaattcgaga	4380
tctccaccat	gcacagacct	agacgtcgtg	gaactcgtcc	acctccactg	gcactgctcg	4440
ctgctctcct	cctggctgca	cgtggtgctg	atgcacaagt	acaactgcaa	caaagcggag	4500
ctgaactggc	caaaccaggc	gcttccgtga	agatgtcttg	taaagccagc	gggtatacat	4560
ttactaatta	ctggattcac	tgggagaagc	aaagacctga	acagggattg	gaatggattg	4620
gatacattaa	tcctaacacc	ggacacacag	agtataatca	aaaattcaag	gataaggcca	4680
ccctcacagc	cgacagatct	tcttcaaccg	cctatatgca	actttcttcc	ctcacttctg	4740

- 36 037546

aagactccgc	agtttacttt	tgcgcacgaa	cttattctgg	aagctcccat	ttcgactact	4800
ggggtcaagg	aacaacactg	atcgtgtcta	gcggcggcgg	agggtccggc	gggggcggta	4860
gcggtggcgg	aggttctgat	attgtcatga	ctcaaacacc	tgtctctctg	cctgtttcac	4920
ttggagatca	agctagcatt	tcctgccgct	ctagtcaatc	tctcgtccac	aacaacggcg	4980
atactttctt	gcattggtat	ctgcagaaac	caggtcagtc	acctaaactg	cttatataca	5040
aagtctctaa	tagattctca	ggggtgccag	atcgattcag	tggttctggg	tccggtacag	5100
attttacact	caagatatcc	agagtagaag	cagaagatct	gggcgtgtat	ttctgcagtc	5160
aaacaacact	tattcctcgt	acttttggag	gcggtacaaa	actggagatc	aagcgtggag	5220
gcggagggag	tgttttgttt	tatctggccg	ttgggataat	gtttctcgta	aatacagtac	5280
tttgggtaac	aataaggaag	gaactgaaga	gaaagaaaaa	atgggatctg	gaaatatcat	5340
tggacagtgg	acacgaaaaa	aaagtcacat	catcattgca	agaagaccgg	cacttggagg	5400
aggaactgaa	atgtcaagag	caaaaagaag	aacaactgca	agaaggcgta	catagaaaag	5460
aaccacaggg	agcaacatag	gcggccgcta	atcagccata	ccacatttgt	agaggtttta	5520
cttgctttaa	aaaacctccc	acacctcccc	ctgaacctga	aacataaaat	gaatgcaatt	5580
gttgttgtta	acttgtttat	tgcagcttat	aatggttaca	aataaagcaa	tagcatcaca	5640
aatttcacaa	ataaagcatt	tttttcactg	cattctagtt	gtggtttgtc	caaactcatc	5700
aatgtatctt	atcatgtcta	ccggtataac	ttcgtataat	gtatactata	cgaagttag	5759
<210> 23 <211> 7627 < 212> ДНК < 213> искусственная последовательность <220> < 2 2 3 > синтетическая < 400> 23 aagcttatac tcgagctcta gattgggaac	ccgggtctct	cgaattcgag	atctccacca	60
tgcacagacc	tagacgtcgt	ggaactcgtc	cacctccact	ggcactgctc	gctgctctcc	120
tcctggctgc	acgtggtgct	gatgcacaag	tacaactgca	acaaagcgga	gctgaactgg	180
ccaaaccagg	cgcttccgtg	aagatgtctt	gtaaagccag	cgggtataca	tttactaatt	240
actggattca	ctgggagaag	caaagacctg	aacagggatt	ggaatggatt	ggatacatta	300
atcctaacac	cggacacaca	gagtataatc	aaaaattcaa	ggataaggcc	accctcacag	360
ccgacagatc	ttcttcaacc	gcctatatgc	aactttcttc	cctcacttct	gaagactccg	420

- 37 037546

cagtttactt	ttgcgcacga	acttattctg	gaagctccca	tttcgactac	tggggtcaag	480
gaacaacact	gatcgtgtct	agcggcggcg	gagggtccgg	cgggggcggt	agcggtggcg	540
gaggttctga	tattgtcatg	actcaaacac	ctgtctctct	gcctgtttca	cttggagatc	600
aagctagcat	ttcctgccgc	tctagtcaat	ctctcgtcca	caacaacggc	gatactttct	660
tgcattggta	tctgcagaaa	ccaggtcagt	cacctaaact	gcttatatac	aaagtctcta	720
atagattctc	aggggtgcca	gatcgattca	gtggttctgg	gtccggtaca	gattttacac	780
tcaagatatc	cagagtagaa	gcagaagatc	tgggcgtgta	tttctgcagt	caaacaacac	840
ttattcctcg	tacttttgga	ggcggtacaa	aactggagat	caagcgtgga	ggcggaggga	900
gtgttttgtt	ttatctggcc	gttgggataa	tgtttctcgt	aaatacagta	ctttgggtaa	960
caataaggaa	ggaactgaag	agaaagaaaa	aatgggatct	ggaaatatca	ttggacagtg	1020
gacacgaaaa	aaaagtcaca	tcatcattgc	aagaagaccg	gcacttggag	gaggaactga	1080
aatgtcaaga	gcaaaaagaa	gaacaactgc	aagaaggcgt	acatagaaaa	gaaccacagg	1140
gagcaacata	ggcggccgct	aatcagccat	accacatttg	tagaggtttt	acttgcttta	1200
aaaaacctcc	cacacctccc	cctgaacctg	aaacataaaa	tgaatgcaat	tgttgttgtt	1260
aacttgttta	ttgcagctta	taatggttac	aaataaagca	atagcatcac	aaatttcaca	1320
aataaagcat	ttttttcact	gcattctagt	tgtggtttgt	ccaaactcat	caatgtatct	1380
tatcatgtct	accggtataa	cttcgtataa	tgtatactat	acgaagttag	ccggtagggc	1440
ccctctcttc	atgtgagcaa	aaggccagca	aaaggccagg	aaccgtaaaa	aggccgcgtt	1500
gctggcgttt	ttccataggc	tccgcccccc	tgacgagcat	cacaaaaatc	gacgctcaag	1560
tcagaggtgg	cgaaacccga	caggactata	aagataccag	gcgtttcccc	ctggaagctc	1620
cctcgtgcgc	tctcctgttc	cgaccctgcc	gcttaccgga	tacctgtccg	cctttctccc	1680
ttcgggaagc	gtggcgcttt	ctcatagctc	acgctgtagg	tatctcagtt	cggtgtaggt	1740
cgttcgctcc	aagctgggct	gtgtgcacga	accccccgtt	cagcccgacc	gctgcgcctt	1800
atccggtaac	tatcgtcttg	agtccaaccc	ggtaagacac	gacttatcgc	cactggcagc	1860
agccactggt	aacaggatta	gcagagcgag	gtatgtaggc	ggtgctacag	agttcttgaa	1920
gtggtggcct	aactacggct	acactagaag	aacagtattt	ggtatctgcg	ctctgctgaa	1980
gccagttacc	ttcggaaaaa	gagttggtag	ctcttgatcc	ggcaaacaaa	ccaccgctgg	2040
tagcggtggt	ttttttgttt	gcaagcagca	gattacgcgc	agaaaaaaag	gatctcaaga	2100
agatcctttg	atcttttcta	cggggtctga	cgctcagtgg	aacgaaaact	cacgttaagg	2160

- 38 037546

gattttggtc	atgggcgcgc	ctcatactcc	tgcaggcatg	agattatcaa	aaaggatctt	2220
cacctagatc	cttttaaatt	aaaaatgaag	ttttaaatca	atctaaagta	tatatgagta	2280
aacttggtct	gacagttacc	aatgcttaat	cagtgaggca	cctatctcag	cgatctgtct	2340
atttcgttca	tccatagttg	cctgactccc	cgtcgtgtag	ataactacga	tacgggaggg	2400
cttaccatct	ggccccagtg	ctgcaatgat	accgcgagac	ccacgctcac	cggctccaga	2460
tttatcagca	ataaaccagc	cagccggaag	ggccgagcgc	agaagtggtc	ctgcaacttt	2520
atccgcctcc	atccagtcta	ttaattgttg	ccgggaagct	agagtaagta	gttcgccagt	2580
taatagtttg	cgcaacgttg	ttgccattgc	tacaggcatc	gtggtgtcac	gctcgtcgtt	2640
tggtatggct	tcattcagct	ccggttccca	acgatcaagg	cgagttacat	gatcccccat	2700
gttgtgcaaa	aaagcggtta	gctccttcgg	tcctccgatc	gttgtcagaa	gtaagttggc	2760
cgcagtgtta	tcactcatgg	ttatggcagc	actgcataat	tctcttactg	tcatgccatc	2820
cgtaagatgc	ttttctgtga	ctggtgagta	ctcaaccaag	tcattctgag	aatagtgtat	2880
gcggcgaccg	agttgctctt	gcccggcgtc	aatacgggat	aatactgcgc	cacatagcag	2940
aactttaaaa	gtgctcatca	ttggaaaacg	ttcttcgggg	cgaaaactct	caaggatctt	3000
accgctgttg	agatccagtt	cgatgtaacc	cactcgtgca	cccaactgat	cttcagcatc	3060
ttttactttc	accagcgttt	ctgggtgagc	aaaaacagga	aggcaaaatg	ccgcaaaaaa	3120
gggaataagg	gcgacacgga	aatgttgaat	actcatactc	ttcctttttc	aatattattg	3180
aagcatttat	cagggttatt	gtctcatgag	cggatacata	tttgaatgta	tttagaaaaa	3240
taaacaaata	ggggttccgc	gcacatttcc	ccgaaaagtg	ccacctgacg	tcaggtacac	3300
aacttcgtat	agcatacatt	atacgaagtt	atggtaccaa	gcctaggcct	ccaaaaaagc	3360
ctcctcacta	cttctggaat	agctcagagg	cagaggcggc	ctcggcctct	gcataaataa	3420
aaaaaattag	tcagccatgg	ggcggagaat	gggcggaact	gggcggagtt	aggggcggga	3480
tgggcggagt	taggggcggg	actatggttg	ctgactaatt	gagatgcatg	ctttgcatac	3540
ttctgcctgc	tggggagcct	ggggactttc	cacacctggt	tgctgactaa	ttgagatgca	3600
tgctttgcat	acttctgcct	gctggggagc	ctggggactt	tccacaccgg	atccaccatg	3660
ggttcagcta	ttgagcagga	tgggttgcat	gctggtagtc	ccgccgcatg	ggtcgaacga	3720
ctgtttggat	acgattgggc	ccaacagact	ataggctgtt	ccgacgctgc	tgtctttcgt	3780
ctttctgcac	aaggtcgtcc	agttctgttc	gtgaaaaccg	acttgtccgg	agccctcaat	3840
gagttgcaag	acgaagctgc	acgactgagt	tggcttgcca	ccactggtgt	cccatgtgcc	3900

- 39 037546

gcagtacttg	acgtcgtcac	agaggctggt	cgcgattggt	tgctccttgg	agaagtgccc	3960
ggccaagatc	ttctcagttc	ccaccttgcc	cctgccgaaa	aagtttcaat	aatggctgac	4020
gctatgagaa	ggctgcacac	ccttgaccct	gccacatgtc	cattcgatca	ccaagccaaa	4080
caccgaattg	aacgagctag	aacccgcatg	gaagccggcc	tcgttgatca	agacgatttg	4140
gatgaggaac	accagggtct	cgcacccgct	gaactcttcg	ctcgcctcaa	agcacgaatg	4200
ccagacggag	atgacttggt	cgtaacccac	ggagatgcct	gccttcctaa	cataatggta	4260
gagaatggaa	gatttagcgg	cttcattgat	tgtggacgac	ttggagttgc	agatcggtac	4320
caagatatcg	ctctcgctac	cagagatatt	gctgaagaat	tgggcggaga	atgggctgat	4380
cggtttctcg	tactctacgg	aattgccgca	cctgattccc	aacgcattgc	tttttaccgt	4440
cttctggatg	agttcttcta	aacgcgtccc	ccctctccct	cccccccccc	taacgttact	4500
ggccgaagcc	gcttggaata	aggccggtgt	gcgtttgtct	atatgttatt	ttccaccata	4560
ttgccgtctt	ttggcaatgt	gagggcccgg	aaacctggcc	ctgtcttctt	gacgagcatt	4620
cctaggggtc	tttcccctct	cgccaaagga	atgcaaggtc	tgttgaatgt	cgtgaaggaa	4680
gcagttcctc	tggaagcttc	ttgaagacaa	acaacgtctg	tagcgaccct	ttgcaggcag	4740
cggaaccccc	cacctggcga	caggtgcctc	tgcggccaaa	agccacgtgt	ataagataca	4800
cctgcaaagg	cggcacaacc	ccagtgccac	gttgtgagtt	ggatagttgt	ggaaagagtc	4860
aaatggctct	cctcaagcgt	attcaacaag	gggctgaagg	atgcccagaa	ggtaccccat	4920
tgtatgggat	ctgatctggg	gcctcggtgc	acatgcttta	catgtgttta	gtcgaggtta	4980
aaaaacgtct	aggccccccg	aaccacgggg	acgtggtttt	cctttgaaaa	acacgattgc	5040
tcgaatcacc	atggtgagca	agggcgagga	gctgttcacc	ggggtggtgc	ccatcctggt	5100
cgagctggac	ggcgacgtaa	acggccacaa	gttcagcgtg	tccggcgagg	gcgagggcga	5160
tgccacctac	ggcaagctga	ccctgaagtt	catctgcacc	accggcaagc	tgcccgtgcc	5220
ctggcccacc	ctcgtgacca	ccttcggcta	cggcctgcag	tgcttcgccc	gctaccccga	5280
ccacatgaag	cagcacgact	tcttcaagtc	cgccatgccc	gaaggctacg	tccaggagcg	5340
caccatcttc	ttcaaggacg	acggcaacta	caagacccgc	gccgaggtga	agttcgaggg	5400
cgacaccctg	gtgaaccgca	tcgagctgaa	gggcatcgac	ttcaaggagg	acggcaacat	5460
cctggggcac	aagctggagt	acaactacaa	cagccacaac	gtctatatca	tggccgacaa	5520
gcagaagaac	ggcatcaagg	tgaacttcaa	gatccgccac	aacatcgagg	acggcagcgt	5580
gcagctcgcc	gaccactacc	agcagaacac	ccccatcggc	gacggccccg	tgctgctgcc	5640

- 40 037546

cgacaaccac	tacctgagct	accagtccgc	cctgagcaaa	gaccccaacg	agaagcgcga	5700
tcacatggtc	ctgctggagt	tcgtgaccgc	cgccgggatc	actctcggca	tggacgagct	5760
gtacaagtaa	tcggccgcta	atcagccata	ccacatttgt	agaggtttta	cttgctttaa	5820
aaaacctccc	acacctcccc	ctgaacctga	aacataaaat	gaatgcaatt	gttgttgtta	5880
acttgtttat	tgcagcttat	aatggttaca	aataaagcaa	tagcatcaca	aatttcacaa	5940
ataaagcatt	tttttcactg	cattctagtt	gtggtttgtc	caaactcatc	aatgtatctt	6000
atcatgtcgg	cgcgttgaca	ttgattattg	actagttatt	aatagtaatc	aattacgggg	6060
tcattagttc	atagcccata	tatggagttc	cgcgttacat	aacttacggt	aaatggcccg	6120
cctggctgac	cgcccaacga	cccccgccca	ttgacgtcaa	taatgacgta	tgttcccata	6180
gtaacgccaa	tagggacttt	ccattgacgt	caatgggtgg	agtatttacg	gtaaactgcc	6240
cacttggcag	tacatcaagt	gtatcatatg	ccaagtacgc	cccctattga	cgtcaatgac	6300
ggtaaatggc	ccgcctggca	ttatgcccag	tacatgacct	tatgggactt	tcctacttgg	6360
cagtacatct	acgtattagt	catcgctatt	accatggtga	tgcggttttg	gcagtacatc	6420
aatgggcgtg	gatagcggtt	tgactcacgg	ggatttccaa	gtctccaccc	cattgacgtc	6480
aatgggagtt	tgttttggca	ccaaaatcaa	cgggactttc	caaaatgtcg	taacaactcc	6540
gccccattga	cgcaaatggg	cggtaggcgt	gtacggtggg	aggtctatat	aagcagagct	6600
ctccctatca	gtgatagaga	tctccctatc	agtgatagag	atcgtcgacg	tttagtgaac	6660
cgtcagatcg	cctggagacg	ccatccacgc	tgttttgacc	tccatagaag	acaccgggac	6720
cgatccagcc	tccgcggccg	ggaacggtgc	attggaacgc	ggattccccg	tgccaagagt	6780
gacgtaagta	ccgcctatag	agtctatagg	cccaccccct	tggcttctta	tgcatgctat	6840
actgtttttg	gcttggggtc	tatacacccc	cgcttcctca	tgttataggt	gatggtatag	6900
cttagcctat	aggtgtgggt	tattgaccat	tattgaccac	tcccctattg	gtgacgatac	6960
tttccattac	taatccataa	catggctctt	tgccacaact	ctctttattg	gctatatgcc	7020
aatacactgt	ccttcagaga	ctgacacgga	ctctgtattt	ttacaggatg	gggtctcatt	7080
tattatttac	aaattcacat	atacaacacc	accgtcccca	gtgcccgcag	tttttattaa	7140
acataacgtg	ggatctccac	gcgaatctcg	ggtacgtgtt	ccggacatgg	tctcttctcc	7200
ggtagcggcg	gagcttctac	atccgagccc	tgctcccatg	cctccagcga	ctcatggtcg	7260
ctcggcagct	ccttgctcct	aacagtggag	gccagactta	ggcacagcac	gatgcccacc	7320
accaccagtg	tgccgcacaa	ggccgtggcg	gtagggtatg	tgtctgaaaa	tgagctcggg	7380

- 41 037546

gagcgggctt	gcaccgctga	cgcatttgga	agacttaagg	cagcggcaga	agaagatgca	7440
ggcagctgag	ttgttgtgtt	ctgataagag	tcagaggtaa	ctcccgttgc	ggtgctgtta	7500
acggtggagg	gcagtgtagt	ctgagcagta	ctcgttgctg	ccgcgcgcgc	caccagacat	7560
aatagctgac agactaacag actgttcctt tgacacg <210> 24 <211> 2669 < 212> ДНК < 213> искусственная последовательность <220> < 2 2 3> синтетическая < 400> 24	tccatgggtc	ttttctgcag	tcaccgtcct	7620 7627
agcctaggcc	tccaaaaaag	cctcctcact	acttctggaa	tagctcagag	gcagaggcgg	60
cctcggcctc	tgcataaata	aaaaaaatta	gtcagccatg	gggcggagaa	tgggcggaac	120
tgggcggagt	taggggcggg	atgggcggag	ttaggggcgg	gactatggtt	gctgactaat	180
tgagatgcat	gctttgcata	cttctgcctg	ctggggagcc	tggggacttt	ccacacctgg	240
ttgctgacta	attgagatgc	atgctttgca	tacttctgcc	tgctggggag	cctggggact	300
ttccacaccg	gatccaccat	gggttcagct	attgagcagg	atgggttgca	tgctggtagt	360
cccgccgcat	gggtcgaacg	actgtttgga	tacgattggg	cccaacagac	tataggctgt	420
tccgacgctg	ctgtctttcg	tctttctgca	caaggtcgtc	cagttctgtt	cgtgaaaacc	480
gacttgtccg	gagccctcaa	tgagttgcaa	gacgaagctg	cacgactgag	ttggcttgcc	540
accactggtg	tcccatgtgc	cgcagtactt	gacgtcgtca	cagaggctgg	tcgcgattgg	600
ttgctccttg	gagaagtgcc	cggccaagat	cttctcagtt	cccaccttgc	ccctgccgaa	660
aaagtttcaa	taatggctga	cgctatgaga	aggctgcaca	cccttgaccc	tgccacatgt	720
ccattcgatc	accaagccaa	acaccgaatt	gaacgagcta	gaacccgcat	ggaagccggc	780
ctcgttgatc	aagacgattt	ggatgaggaa	caccagggtc	tcgcacccgc	tgaactcttc	840
gctcgcctca	aagcacgaat	gccagacgga	gatgacttgg	tcgtaaccca	cggagatgcc	900
tgccttccta	acataatggt	agagaatgga	agatttagcg	gcttcattga	ttgtggacga	960
cttggagttg	cagatcggta	ccaagatatc	gctctcgcta	ccagagatat	tgctgaagaa	1020
ttgggcggag	aatgggctga	tcggtttctc	gtactctacg	gaattgccgc	acctgattcc	1080
caacgcattg	ctttttaccg	tcttctggat	gagttcttct	aaacgcgtcc	cccctctccc	1140

- 42 037546

tccccccccc	ctaacgttac	tggccgaagc	cgcttggaat	aaggccggtg	tgcgtttgtc	1200
tatatgttat	tttccaccat	attgccgtct	tttggcaatg	tgagggcccg	gaaacctggc	1260
cctgtcttct	tgacgagcat	tcctaggggt	ctttcccctc	tcgccaaagg	aatgcaaggt	1320
ctgttgaatg	tcgtgaagga	agcagttcct	ctggaagctt	cttgaagaca	aacaacgtct	1380
gtagcgaccc	tttgcaggca	gcggaacccc	ccacctggcg	acaggtgcct	ctgcggccaa	1440
aagccacgtg	tataagatac	acctgcaaag	gcggcacaac	cccagtgcca	cgttgtgagt	1500
tggatagttg	tggaaagagt	caaatggctc	tcctcaagcg	tattcaacaa	ggggctgaag	1560
gatgcccaga	aggtacccca	ttgtatggga	tctgatctgg	ggcctcggtg	cacatgcttt	1620
acatgtgttt	agtcgaggtt	aaaaaacgtc	taggcccccc	gaaccacggg	gacgtggttt	1680
tcctttgaaa	aacacgattg	ctcgaatcac	catggtgagc	aagggcgagg	agctgttcac	1740
cggggtggtg	cccatcctgg	tcgagctgga	cggcgacgta	aacggccaca	agttcagcgt	1800
gtccggcgag	ggcgagggcg	atgccaccta	cggcaagctg	accctgaagt	tcatctgcac	1860
caccggcaag	ctgcccgtgc	cctggcccac	cctcgtgacc	accttcggct	acggcctgca	1920
gtgcttcgcc	cgctaccccg	accacatgaa	gcagcacgac	ttcttcaagt	ccgccatgcc	1980
cgaaggctac	gtccaggagc	gcaccatctt	cttcaaggac	gacggcaact	acaagacccg	2040
cgccgaggtg	aagttcgagg	gcgacaccct	ggtgaaccgc	atcgagctga	agggcatcga	2100
cttcaaggag	gacggcaaca	tcctggggca	caagctggag	tacaactaca	acagccacaa	2160
cgtctatatc	atggccgaca	agcagaagaa	cggcatcaag	gtgaacttca	agatccgcca	2220
caacatcgag	gacggcagcg	tgcagctcgc	cgaccactac	cagcagaaca	cccccatcgg	2280
cgacggcccc	gtgctgctgc	ccgacaacca	ctacctgagc	taccagtccg	ccctgagcaa	2340
agaccccaac	gagaagcgcg	atcacatggt	cctgctggag	ttcgtgaccg	ccgccgggat	2400
cactctcggc	atggacgagc	tgtacaagta	atcggccgct	aatcagccat	accacatttg	2460
tagaggtttt	acttgcttta	aaaaacctcc	cacacctccc	cctgaacctg	aaacataaaa	2520
tgaatgcaat	tgttgttgtt	aacttgttta	ttgcagctta	taatggttac	aaataaagca	2580
atagcatcac	aaatttcaca	aataaagcat	ttttttcact	gcattctagt	tgtggtttgt	2640
ccaaactcat	caatgtatct	tatcatgtc				2669
<210> 25 <211> 3003 <212> ДНК <213> искусственная последовательность

- 43 037546 <220>

<2 2 3> синтетическая

<400> 25 gttgacattg	attattgact	agttattaat	agtaatcaat	tacggggtca	ttagttcata	60
gcccatatat	ggagttccgc	gttacataac	ttacggtaaa	tggcccgcct	ggctgaccgc	120
ccaacgaccc	ccgcccattg	acgtcaataa	tgacgtatgt	tcccatagta	acgccaatag	180
ggactttcca	ttgacgtcaa	tgggtggagt	atttacggta	aactgcccac	ttggcagtac	240
atcaagtgta	tcatatgcca	agtacgcccc	ctattgacgt	caatgacggt	aaatggcccg	300
cctggcatta	tgcccagtac	atgaccttat	gggactttcc	tacttggcag	tacatctacg	360
tattagtcat	cgctattacc	atggtgatgc	ggttttggca	gtacatcaat	gggcgtggat	420
agcggtttga	ctcacgggga	tttccaagtc	tccaccccat	tgacgtcaat	gggagtttgt	480
tttggcacca	aaatcaacgg	gactttccaa	aatgtcgtaa	caactccgcc	ccattgacgc	540
aaatgggcgg	taggcgtgta	cggtgggagg	tctatataag	cagagctctc	cctatcagtg	600
atagagatct	ccctatcagt	gatagagatc	gtcgacgttt	agtgaaccgt	cagatcgcct	660
ggagacgcca	tccacgctgt	tttgacctcc	atagaagaca	ccgggaccga	tccagcctcc	720
gcggccggga	acggtgcatt	ggaacgcgga	ttccccgtgc	caagagtgac	gtaagtaccg	780
cctatagagt	ctataggccc	acccccttgg	cttcttatgc	atgctatact	gtttttggct	840
tggggtctat	acacccccgc	ttcctcatgt	tataggtgat	ggtatagctt	agcctatagg	900
tgtgggttat	tgaccattat	tgaccactcc	cctattggtg	acgatacttt	ccattactaa	960
tccataacat	ggctctttgc	cacaactctc	tttattggct	atatgccaat	acactgtcct	1020
tcagagactg	acacggactc	tgtattttta	caggatgggg	tctcatttat	tatttacaaa	1080
ttcacatata	caacaccacc	gtccccagtg	cccgcagttt	ttattaaaca	taacgtggga	1140
tctccacgcg	aatctcgggt	acgtgttccg	gacatggtct	cttctccggt	agcggcggag	1200
cttctacatc	cgagccctgc	tcccatgcct	ccagcgactc	atggtcgctc	ggcagctcct	1260
tgctcctaac	agtggaggcc	agacttaggc	acagcacgat	gcccaccacc	accagtgtgc	1320
cgcacaaggc	cgtggcggta	gggtatgtgt	ctgaaaatga	gctcggggag	cgggcttgca	1380
ccgctgacgc	atttggaaga	cttaaggcag	cggcagaaga	agatgcaggc	agctgagttg	1440
ttgtgttctg	ataagagtca	gaggtaactc	ccgttgcggt	gctgttaacg	gtggagggca	1500
gtgtagtctg	agcagtactc	gttgctgccg	cgcgcgccac	cagacataat	agctgacaga	1560
ctaacagact	gttcctttcc	atgggtcttt	tctgcagtca	ccgtccttga	cacgaagctt	1620

- 44 037546

atactcgagc	tetagattgg	gaacccgggt	ctctcgaatt	cgagatctcc	accatgcaca	1680
gacctagacg	tcgtggaact	cgtccacctc	cactggcact	gctcgctgct	ctcctcctgg	1740
ctgcacgtgg	tgetgatgea	caagtacaac	tgcaacaaag	eggagetgaa	ctggccaaac	1800
caggcgcttc	cgtgaagatg	tettgtaaag	ccagcgggta	tacatttact	aattactgga	1860
ttcactggga	gaagcaaaga	cctgaacagg	gattggaatg	gattggatac	attaatccta	1920
acaccggaca	cacagagtat	aatcaaaaat	tcaaggataa	ggccaccctc	acagccgaca	1980
gatcttcttc	aaccgcctat	atgeaaettt	cttccctcac	ttctgaagac	tccgcagttt	2040
acttttgcgc	aegaaettat	tetggaaget	cccatttcga	ctactggggt	caaggaacaa	2100
cactgatcgt	gtetagegge	ggcggagggt	ccggcggggg	eggtageggt	ggcggaggtt	2160
ctgatattgt	catgactcaa	acacctgtct	ctctgcctgt	ttcacttgga	gatcaagcta	2220
gcatttcctg	ccgctctagt	caatctctcg	tccacaacaa	cggcgatact	ttettgeatt	2280
ggtatctgca	gaaaccaggt	cagtcaccta	aaetgettat	atacaaagtc	tetaatagat	2340
tctcaggggt	gccagatcga	ttcagtggtt	ctgggtccgg	tacagatttt	acactcaaga	2400
tatccagagt	agaagcagaa	gatctgggcg	tgtatttctg	cagtcaaaca	acacttattc	2460
ctcgtacttt	tggaggcggt	acaaaactgg	agatcaagcg	tggaggegga	gggagtgttt	2520
tgttttatct	ggccgttggg	ataatgtttc	tcgtaaatac	agtactttgg	gtaacaataa	2580
ggaaggaact	gaagagaaag	aaaaaatggg	atetggaaat	atcattggac	agtggacacg	2640
aaaaaaaagt	cacatcatca	ttgeaagaag	accggcactt	ggaggaggaa	etgaaatgte	2700
aagagcaaaa	agaagaacaa	etgeaagaag	gcgtacatag	aaaagaacca	cagggagcaa	2760
cataggcggc	cgctaatcag	ccataccaca	tttgtagagg	ttttacttgc	tttaaaaaac	2820
ctcccacacc	tccccctgaa	cctgaaacat	aaaatgaatg	caattgttgt	tgttaacttg	2880
tttattgcag	ettataatgg	ttacaaataa	agcaatagca	tcacaaattt	cacaaataaa	2940
gcattttttt	cactgcattc	tagttgtggt	ttgtccaaac	tcatcaatgt	atcttatcat	3000
gtc <210> 26 <211> 208 <212> Белок <213> Home <400> 26 Vai Phe Leu	) sapiens i Phe Pro Pro Lys Pro 1	jys Asp Thr	Leu Met lie Ser Arg	3003

10 15

- 45 037546

Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser Gin Glu Asp Pro 20 2530

Glu Vai Gin Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala 35 4045

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai

5560

Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 65 70 7580

Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser lie Glu Lys Thr 85 9095 lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu

100 105110

Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys

115 120125

Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Vai Glu Trp Glu Ser

130 135140

Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp

145 150 155160

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Vai Asp Lys Ser

165 170175

Arg Trp Gin Glu Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala

180 185190

Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

195 200205 <210> 27 <211>8 <212> Белок <213> Homo sapiens <400> 27

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp

- 46 037546 <210> 28 < 211> 8 < 212> Белок < 213> Homo sapiens < 400> 28 lie Asn Pro Asn Thr Gly His Thr

5 <210> 29 <211> 13 <212> Белок <213> Homo sapiens <400> 29

Cys Ala Arg Thr Tyr Ser Gly Ser Ser His Phe Asp Tyr 1510 <210> 30 <211>10 < 212> Белок < 213> Homo sapiens < 400> 30

Ser Leu Vai His Asn Asn Gly Asp Thr Phe 1510 < 210> 31 < 211>9 < 212> Белок < 213> Homo sapiens < 400> 31

Ser Gin Thr Thr Leu lie Pro Arg Thr

5 <210> 32 < 211> 8 < 212> Белок < 213> Homo sapiens < 400> 32

Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala Trp

5

- 47 037546 <210> 33 <2H> 10 <212> Белок <213> Homo sapiens <400> 33

He Leu Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr

1510 <210> 34 <2H>13 < 212> Белок < 213> Homo sapiens < 400> 34

Thr Thr Ala Asp Phe Trp Ser Ala Tyr Ser Ser Asp Tyr 1510 <210> 35 < 2H> 4 < 212> Белок < 213> Homo sapiens < 400> 35

Gin Ser Leu Leu 1 <210> 36 < 2H> 7 < 212> Белок < 213> Homo sapiens < 400> 36

His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr

5 <210> 37 < 2H> 9 < 212> Белок < 213> Homo sapiens < 400> 37

Met Gin Gly Leu Gin Thr Pro Tyr Thr

5 <210> 38 <2H> 122 <212> Белок

- 48 037546 <213> Homo sapiens <400> 38

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Ala He Vai Lys Pro Gly Gly 15 1015

Ser His Arg Vai Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala 20 2530

Trp Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Vai 35 4045

Gly Arg He Leu Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala 50 5560

Pro Vai Lys Asp Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Met 65 70 7580

Leu Phe Leu Gin Met Asp Ser Leu Lys He Glu Asp Thr Ala Vai Tyr 85 9095

Phe Cys Thr Thr Ala Asp Phe Trp Ser Ala Tyr Ser Ser Asp Tyr Trp

100 105110

Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser

115120 <210> 39 <2H>112 < 212> Белок < 213> Homo sapiens <400> 39

Asp He Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Vai Thr Pro Gly

1015

Glu Pro Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Ser 20 2530

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 4045

Pro Gin Leu Leu He Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Vai Pro 50 5560

- 49 037546

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 7580

Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Met Gin Gly 85 9095

Leu Gin Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys

100 105110 <210> 40 <211>452 < 212 > Белок < 213> Homo sapiens < 400> 40

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Ala lie Vai Lys Pro Gly Gly

1015

Ser His Arg Vai Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala 20 2530

Trp Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Vai 35 4045

Gly Arg lie Leu Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala 50 5560

Pro Vai Lys Asp Arg Phe Thr Lie Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Met 65 70 7580

Leu Phe Leu Gin Met Asp Ser Leu Lys lie Glu Asp Thr Ala Vai Tyr 85 9095

Phe Cys Thr Thr Ala Asp Phe Trp Ser Ala Tyr Ser Ser Asp Tyr Trp

100 105110

Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro

115 120125

Ser Vai Tyr Pro Leu Ala Pro Vai Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser

130 135140

Vai Thr Leu Gly Cys Leu Vai Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr

145 150 155160

- 50 037546

Leu Thr Trp Asn Ser GLy Ser Leu Ser Ser GLy Vai His Thr Phe Pro

165 170175

Ala Vai Leu Gin Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Vai Thr Vai

180 185190

Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gin Ser He Thr Cys Asn Vai Ala His

195 200205

Pro Ala Ser Ser Thr Lys Vai Asp Lys Lys LLe Glu Pro Arg Gly Pro

210 215220

Thr He Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu

225 230 235240

Gly Gly Pro Ser Vai Phe He Phe Pro Pro Lys Lie Lys Asp Vai Leu

245 250255

Met He Ser Leu Ser Pro Lie Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser

260 265270

Glu Asp Asp Pro Asp Vai Gin He Ser Trp Phe Vai Asn Asn Vai Glu

275 280285

Vai His Thr Ala Gin Thr Gin Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr

290 295300

Leu Arg Vai Vai Ser Ala Leu Pro He Gin His Gin Asp Trp Met Ser

305 310 315320

Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Vai Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro

325 330335

He Glu Arg Thr He Ser Lys Pro Lys Gly Ser Vai Arg Ala Pro Gin

340 345350

Vai Tyr Vai Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gin Vai

355 360365

Thr Leu Thr Cys Met VaL Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp He Tyr Vai

370 375380

- 51 037546

Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr GLu

385 390 395400

Pro VaL Leu Asp Ser Asp GLy Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg

405 410415

Vai Glu Lys Lys Asn Trp VaL GLu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser VaL

420 425430

VaL His GLu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg

435 440445

Thr Pro GLy Lys

450 <210>41 <211>219 <212> Белок <213> Homo sapiens <400>41

Asp lie Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro VaL Thr Pro GLy

5 L015

Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Ser 20 2530

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu GLn Lys Pro GLy GLn Ser 35 4045

Pro GLn Leu Leu LLe Tyr Leu GLy Ser Asn Arg ALa Ser GLy VaL Pro

5560

Asp Arg Phe Ser GLy Ser GLy Ser GLy Thr Asp Phe Thr Leu Lys LLe 65 70 7580

Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Met Gin Gly 85 9095

Leu GLn Thr Pro Tyr Thr Phe GLy GLn GLy Thr Lys Leu GLu LLe Lys

100 105110

Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Vai Ser lie Phe Pro Pro Ser Ser Glu

115 120125

- 52 037546

Gin Leu Thr Ser GLy GLy ALa Ser VaL VaL Cys

130 135

Phe Leu Asn Asn Phe 140

Tyr Pro Lys Asp LLe Asn VaL Lys Trp Lys LLe

L45 L50 L55

Asp Gly Ser Glu Arg

160

GLn Asn GLy VaL Leu Asn Ser Trp Thr Asp GLn L65 L70

Asp Ser Lys Asp Ser

175

Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr

180 185

Lys Asp GLu Tyr GLu

190

Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His

195 200

Lys Thr Ser Thr Ser

205

Pro He Vai Lys Ser Phe Asn Arg GLy GLu Cys 2L0 2L5 <210> 42 <2H> 256 <2L2> Белок <2L3> Homo sapiens <400> 42

Met Vai Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Vai Leu Leu Cys ALa Leu Leu Ser

L 5 L0 15

Cys Leu Leu Leu Thr GLy Ser Ser Ser GLy GLy Pro GLy Asp Lys Thr 20 25 30

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu GLy GLy Pro Ser 35 40 45

VaL Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met ILe Ser Arg 50 55 60

Thr Pro GLu VaL Thr Cys VaL VaL VaL Asp Vai Ser His Glu Asp Pro 65 70 75 80

Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr VaL Asp GLy Vai Glu Vai His Asn Ala 85 90 95

Lys Thr Lys Pro Arg GLu GLu GLn Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg VaL VaL LOO 105 110

- 53 037546

Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

115 120125

Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr

130 135140 lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu

145 150 155160

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys

165 170175

Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Vai Glu Trp Glu Ser

180 185190

Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp

195 200205

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser

210 215220

Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala

225 230 235240

Leu His Asn Arg Phe Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

245 250255 <210> 43 <211>336 < 212> Белок < 213> искусственная последовательность <220>

< 2 2 3> синтетический < 400> 43

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Ala He Vai Lys Pro Gly Gly

1015

Ser His Arg Vai Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala 20 2530

Trp Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Vai 35 4045

- 54 037546

Gly Arg lie Leu Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala

5560

Pro Vai Lys Asp Arg Phe Thr ILe Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Met 65 70 7580

Leu Phe Leu Gin Met Asp Ser Leu Lys lie Glu Asp Thr Ala Vai Tyr 85 9095

Phe Cys Thr Thr Ala Asp Phe Trp Ser Ala Tyr Ser Ser Asp Tyr Trp

100 105110

Gly Gin Gly Thr Leu VaL Thr VaL Ser Ser GLy GLy GLy Gly Ser Gly

115 120125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp lie Vai Met Thr Gin Ser

130 135140

Pro Leu Ser Leu Pro VaL Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser He Ser Cys

145 150 155160

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp L65 170175

Trp Tyr Leu Gin Lys Pro GLy Gin Ser Pro Gin Leu Leu He Tyr Leu

180 185190

Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly

195 200205

Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He Ser Arg Met GLu Ala Glu Asp

210 215220

Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Met Gin Gly Leu GLn Thr Pro Tyr Thr Phe

225 230 235240

GLy GLn Gly Thr Lys Leu GLu 245

He Lys GLy GLy GLy GLy Ser Vai Leu

250255

Phe

Tyr Leu Ala Vai Gly He Met Phe Leu Vai Asn Thr Vai Leu Trp

260 265270

- 55 037546

Val· Thr He Arg Lys Glu Leu Lys Arg Lys Lys Lys Trp Asp Leu Glu 275 280285

He Ser Leu Asp Ser Gly His Glu Lys Lys Val Thr Ser Ser Leu Gin 290 295300

Glu Asp Arg His Leu Glu Glu Glu Leu Lys Cys Gin Glu Gin LysGlu

305 310 315320

Glu Gin Leu Gin Glu Gly Val His Arg Lys Glu Pro Gin Gly AlaThr

325 330335

<210> 44
<2H> 7633 < 212> ДНК < 213> искусственная последовательность <220> < 2 2 3> синтетическая < 400> 44 aagcttatac tcgagctcta gattgggaac	ccgggtctct	cgaattcgag	atctccacca	60
tgcacagacc	tagacgtcgt	ggaactcgtc	cacctccact	ggcactgctc	gctgctctcc	120
tcctggctgc	acgtggtgct	gatgcagagg	tgcagctggt	ggagtctggg	ggagccatag	180
taaagccggg	ggggtcccat	agagtctcct	gtgaagcctc	tggattcact	ttcagtaacg	240
cctggatgag	ttgggtccgc	caggctccag	ggagggggct	ggagtgggtt	ggccgtattt	300
taagcaagac	tgatggtggg	acgacagact	acgctgcacc	cgtgaaagac	agattcacca	360
tttcaagaga	tgattctaaa	aatatgttgt	ttctgcaaat	ggacagcctg	aaaatcgagg	420
acacagccgt	gtatttctgt	accacggccg	atttttggag	tgcttattct	tctgactact	480
ggggccaggg	aaccctggtc	accgtctcct	caggaggtgg	aggttccggg	ggcgggggct	540
ccggcggagg	tggatcagat	attgtgatga	ctcagtctcc	actctccctg	cccgtcaccc	600
ctggagagcc	ggcctccatc	tcctgcaggt	ctagtcagag	cctcctgcat	agtaatgggt	660
acaactattt	ggattggtac	ctacagaagc	cagggcagtc	tccacaactc	ctgatctatt	720
tgggttctaa	tcgggcctcc	ggggtccctg	acaggttcag	tggcagtgga	tcaggcacag	780
attttacact	gaaaatcagc	agaatggagg	ctgaggatgt	tggggtttat	tactgcatgc	840
aaggtctaca	aactccgtac	acttttggcc	aggggaccaa	gctggagatc	aaaggaggcg	900
gagggagtgt	tttgttttat	ctggccgttg	ggataatgtt	tctcgtaaat	acagtacttt	960
gggtaacaat	aaggaaggaa	ctgaagagaa	agaaaaaatg	ggatctggaa	atatcattgg	1020

- 56 037546

acagtggaca	cgaaaaaaaa	gtcacatcat	cattgcaaga	agaccggcac	ttggaggagg	1080
aactgaaatg	tcaagagcaa	aaagaagaac	aactgcaaga	aggcgtacat	agaaaagaac	1140
cacagggagc	aacataggcg	gccgctaatc	agccatacca	catttgtaga	ggttttactt	1200
gctttaaaaa	acctcccaca	cctccccctg	aacctgaaac	ataaaatgaa	tgcaattgtt	1260
gttgttaact	tgtttattgc	agcttataat	ggttacaaat	aaagcaatag	catcacaaat	1320
ttcacaaata	aagcattttt	ttcactgcat	tctagttgtg	gtttgtccaa	actcatcaat	1380
gtatcttatc	atgtctaccg	gtataacttc	gtataatgta	tactatacga	agttagccgg	1440
tagggcccct	ctcttcatgt	gagcaaaagg	ccagcaaaag	gccaggaacc	gtaaaaaggc	1500
cgcgttgctg	gcgtttttcc	ataggctccg	cccccctgac	gagcatcaca	aaaatcgacg	1560
ctcaagtcag	aggtggcgaa	acccgacagg	actataaaga	taccaggcgt	ttccccctgg	1620
aagctccctc	gtgcgctctc	ctgttccgac	cctgccgctt	accggatacc	tgtccgcctt	1680
tctcccttcg	ggaagcgtgg	cgctttctca	tagctcacgc	tgtaggtatc	tcagttcggt	1740
gtaggtcgtt	cgctccaagc	tgggctgtgt	gcacgaaccc	cccgttcagc	ccgaccgctg	1800
cgccttatcc	ggtaactatc	gtcttgagtc	caacccggta	agacacgact	tatcgccact	1860
ggcagcagcc	actggtaaca	ggattagcag	agcgaggtat	gtaggcggtg	ctacagagtt	1920
cttgaagtgg	tggcctaact	acggctacac	tagaagaaca	gtatttggta	tctgcgctct	1980
gctgaagcca	gttaccttcg	gaaaaagagt	tggtagctct	tgatccggca	aacaaaccac	2040
cgctggtagc	ggtggttttt	ttgtttgcaa	gcagcagatt	acgcgcagaa	aaaaaggatc	2100
tcaagaagat	cctttgatct	tttctacggg	gtctgacgct	cagtggaacg	aaaactcacg	2160
ttaagggatt	ttggtcatgg	gcgcgcctca	tactcctgca	ggcatgagat	tatcaaaaag	2220
gatcttcacc	tagatccttt	taaattaaaa	atgaagtttt	aaatcaatct	aaagtatata	2280
tgagtaaact	tggtctgaca	gttaccaatg	cttaatcagt	gaggcaccta	tctcagcgat	2340
ctgtctattt	cgttcatcca	tagttgcctg	actccccgtc	gtgtagataa	ctacgatacg	2400
ggagggctta	ccatctggcc	ccagtgctgc	aatgataccg	cgagacccac	gctcaccggc	2460
tccagattta	tcagcaataa	accagccagc	cggaagggcc	gagcgcagaa	gtggtcctgc	2520
aactttatcc	gcctccatcc	agtctattaa	ttgttgccgg	gaagctagag	taagtagttc	2580
gccagttaat	agtttgcgca	acgttgttgc	cattgctaca	ggcatcgtgg	tgtcacgctc	2640
gtcgtttggt	atggcttcat	tcagctccgg	ttcccaacga	tcaaggcgag	ttacatgatc	2700
ccccatgttg	tgcaaaaaag	cggttagctc	cttcggtcct	ccgatcgttg	tcagaagtaa	2760

- 57 037546

gttggccgca	gtgttatcac	tcatggttat	ggcagcactg	cataattctc	ttactgtcat	2820
gccatccgta	agatgctttt	ctgtgactgg	tgagtactca	accaagtcat	tctgagaata	2880
gtgtatgcgg	cgaccgagtt	gctcttgccc	ggcgtcaata	cgggataata	ctgcgccaca	2940
tagcagaact	ttaaaagtgc	tcatcattgg	aaaacgttct	tcggggcgaa	aactctcaag	3000
gatcttaccg	ctgttgagat	ccagttcgat	gtaacccact	cgtgcaccca	actgatcttc	3060
agcatctttt	actttcacca	gcgtttctgg	gtgagcaaaa	acaggaaggc	aaaatgccgc	3120
aaaaaaggga	ataagggcga	cacggaaatg	ttgaatactc	atactcttcc	tttttcaata	3180
ttattgaagc	atttatcagg	gttattgtct	catgagcgga	tacatatttg	aatgtattta	3240
gaaaaataaa	caaatagggg	ttccgcgcac	atttccccga	aaagtgccac	ctgacgtcag	3300
gtacacaact	tcgtatagca	tacattatac	gaagttatgg	taccaagcct	aggcctccaa	3360
aaaagcctcc	tcactacttc	tggaatagct	cagaggcaga	ggcggcctcg	gcctctgcat	3420
aaataaaaaa	aattagtcag	ccatggggcg	gagaatgggc	ggaactgggc	ggagttaggg	3480
gcgggatggg	cggagttagg	ggcgggacta	tggttgctga	ctaattgaga	tgcatgcttt	3540
gcatacttct	gcctgctggg	gagcctgggg	actttccaca	cctggttgct	gactaattga	3600
gatgcatgct	ttgcatactt	ctgcctgctg	gggagcctgg	ggactttcca	caccggatcc	3660
accatgggtt	cagctattga	gcaggatggg	ttgcatgctg	gtagtcccgc	cgcatgggtc	3720
gaacgactgt	ttggatacga	ttgggcccaa	cagactatag	gctgttccga	cgctgctgtc	3780
tttcgtcttt	ctgcacaagg	tcgtccagtt	ctgttcgtga	aaaccgactt	gtccggagcc	3840
ctcaatgagt	tgcaagacga	agctgcacga	ctgagttggc	ttgccaccac	tggtgtccca	3900
tgtgccgcag	tacttgacgt	cgtcacagag	gctggtcgcg	attggttgct	ccttggagaa	3960
gtgcccggcc	aagatcttct	cagttcccac	cttgcccctg	ccgaaaaagt	ttcaataatg	4020
gctgacgcta	tgagaaggct	gcacaccctt	gaccctgcca	catgtccatt	cgatcaccaa	4080
gccaaacacc	gaattgaacg	agctagaacc	cgcatggaag	ccggcctcgt	tgatcaagac	4140
gatttggatg	aggaacacca	gggtctcgca	cccgctgaac	tcttcgctcg	cctcaaagca	4200
cgaatgccag	acggagatga	cttggtcgta	acccacggag	atgcctgcct	tcctaacata	4260
atggtagaga	atggaagatt	tagcggcttc	attgattgtg	gacgacttgg	agttgcagat	4320
cggtaccaag	atatcgctct	cgctaccaga	gatattgctg	aagaattggg	cggagaatgg	4380
gctgatcggt	ttctcgtact	ctacggaatt	gccgcacctg	attcccaacg	cattgctttt	4440
taccgtcttc	tggatgagtt	cttctaaacg	cgtcccccct	ctccctcccc	cccccctaac	4500

- 58 037546

gttactggcc	gaagccgctt	ggaataaggc	cggtgtgcgt	ttgtctatat	gttattttcc	4560
accatattgc	cgtcttttgg	caatgtgagg	gcccggaaac	ctggccctgt	cttcttgacg	4620
agcattccta	ggggtctttc	ccctctcgcc	aaaggaatgc	aaggtctgtt	gaatgtcgtg	4680
aaggaagcag	ttcctctgga	agcttcttga	agacaaacaa	cgtctgtagc	gaccctttgc	4740
aggcagcgga	accccccacc	tggcgacagg	tgcctctgcg	gccaaaagcc	acgtgtataa	4800
gatacacctg	caaaggcggc	acaaccccag	tgccacgttg	tgagttggat	agttgtggaa	4860
agagtcaaat	ggctctcctc	aagcgtattc	aacaaggggc	tgaaggatgc	ccagaaggta	4920
ccccattgta	tgggatctga	tctggggcct	cggtgcacat	gctttacatg	tgtttagtcg	4980
aggttaaaaa	acgtctaggc	cccccgaacc	acggggacgt	ggttttcctt	tgaaaaacac	5040
gattgctcga	atcaccatgg	tgagcaaggg	cgaggagctg	ttcaccgggg	tggtgcccat	5100
cctggtcgag	ctggacggcg	acgtaaacgg	ccacaagttc	agcgtgtccg	gcgagggcga	5160
gggcgatgcc	acctacggca	agctgaccct	gaagttcatc	tgcaccaccg	gcaagctgcc	5220
cgtgccctgg	cccaccctcg	tgaccacctt	cggctacggc	ctgcagtgct	tcgcccgcta	5280
ccccgaccac	atgaagcagc	acgacttctt	caagtccgcc	atgcccgaag	gctacgtcca	5340
ggagcgcacc	atcttcttca	aggacgacgg	caactacaag	acccgcgccg	aggtgaagtt	5400
cgagggcgac	accctggtga	accgcatcga	gctgaagggc	atcgacttca	aggaggacgg	5460
caacatcctg	gggcacaagc	tggagtacaa	ctacaacagc	cacaacgtct	atatcatggc	5520
cgacaagcag	aagaacggca	tcaaggtgaa	cttcaagatc	cgccacaaca	tcgaggacgg	5580
cagcgtgcag	ctcgccgacc	actaccagca	gaacaccccc	atcggcgacg	gccccgtgct	5640
gctgcccgac	aaccactacc	tgagctacca	gtccgccctg	agcaaagacc	ccaacgagaa	5700
gcgcgatcac	atggtcctgc	tggagttcgt	gaccgccgcc	gggatcactc	tcggcatgga	5760
cgagctgtac	aagtaatcgg	ccgctaatca	gccataccac	atttgtagag	gttttacttg	5820
ctttaaaaaa	cctcccacac	ctccccctga	acctgaaaca	taaaatgaat	gcaattgttg	5880
ttgttaactt	gtttattgca	gcttataatg	gttacaaata	aagcaatagc	atcacaaatt	5940
tcacaaataa	agcatttttt	tcactgcatt	ctagttgtgg	tttgtccaaa	ctcatcaatg	6000
tatcttatca	tgtcggcgcg	ttgacattga	ttattgacta	gttattaata	gtaatcaatt	6060
acggggtcat	tagttcatag	cccatatatg	gagttccgcg	ttacataact	tacggtaaat	6120
ggcccgcctg	gctgaccgcc	caacgacccc	cgcccattga	cgtcaataat	gacgtatgtt	6180
cccatagtaa	cgccaatagg	gactttccat	tgacgtcaat	gggtggagta	tttacggtaa	6240

- 59 037546

actgcccact	tggcagtaca	tcaagtgtat	catatgccaa	gtacgccccc	tattgacgtc	6300
aatgacggta	aatggcccgc	ctggcattat	gcccagtaca	tgaccttatg	ggactttcct	6360
acttggcagt	acatctacgt	attagtcatc	gctattacca	tggtgatgcg	gttttggcag	6420
tacatcaatg	ggcgtggata	gcggtttgac	tcacggggat	ttccaagtct	ccaccccatt	6480
gacgtcaatg	ggagtttgtt	ttggcaccaa	aatcaacggg	actttccaaa	atgtcgtaac	6540
aactccgccc	cattgacgca	aatgggcggt	aggcgtgtac	ggtgggaggt	ctatataagc	6600
agagctctcc	ctatcagtga	tagagatctc	cctatcagtg	atagagatcg	tcgacgttta	66 60
gtgaaccgtc	agatcgcctg	gagacgccat	ccacgctgtt	ttgacctcca	tagaagacac	6720
cgggaccgat	ccagcctccg	cggccgggaa	cggtgcattg	gaacgcggat	tccccgtgcc	6780
aagagtgacg	taagtaccgc	ctatagagtc	tataggccca	cccccttggc	ttcttatgca	6840
tgctatactg	tttttggctt	ggggtctata	cacccccgct	tcctcatgtt	ataggtgatg	6900
gtatagctta	gcctataggt	gtgggttatt	gaccattatt	gaccactccc	ctattggtga	69 60
cgatactttc	cattactaat	ccataacatg	gctctttgcc	acaactctct	ttattggcta	7020
tatgccaata	cactgtcctt	cagagactga	cacggactct	gtatttttac	aggatggggt	7080
ctcatttatt	atttacaaat	tcacatatac	aacaccaccg	tccccagtgc	ccgcagtttt	7140
tattaaacat	aacgtgggat	ctccacgcga	atctcgggta	cgtgttccgg	acatggtctc	7200
ttctccggta	gcggcggagc	ttctacatcc	gagccctgct	cccatgcctc	cagcgactca	7260
tggtcgctcg	gcagctcctt	gctcctaaca	gtggaggcca	gacttaggca	cagcacgatg	7320
cccaccacca	ccagtgtgcc	gcacaaggcc	gtggcggtag	ggtatgtgtc	tgaaaatgag	7380
ctcggggagc	gggcttgcac	cgctgacgca	tttggaagac	ttaaggcagc	ggcagaagaa	7440
gatgcaggca	gctgagttgt	tgtgttctga	taagagtcag	aggtaactcc	cgttgcggtg	7500
ctgttaacgg	tggagggcag	tgtagtctga	gcagtactcg	ttgctgccgc	gcgcgccacc	7560
agacataata	gctgacagac	taacagactg	ttcctttcca	tgggtctttt	ctgcagtcac	7620
cgtccttgac	acg					7633

<210> 45 <211> 1011 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<2 2 3> синтетическая

- 60 037546 <400> 45

gaggtgcagc	tggtggagtc	tgggggagcc	atagtaaagc	cgggggggtc	ccatagagtc	60
tcctgtgaag	cctctggatt	cactttcagt	aacgcctgga	tgagttgggt	ccgccaggct	120
ccagggaggg	ggctggagtg	ggttggccgt	attttaagca	agactgatgg	tgggacgaca	180
gactacgctg	cacccgtgaa	agacagattc	accatttcaa	gagatgattc	taaaaatatg	240
ttgtttctgc	aaatggacag	cctgaaaatc	gaggacacag	ccgtgtattt	ctgtaccacg	300
gccgattttt	ggagtgctta	ttcttctgac	tactggggcc	agggaaccct	ggtcaccgtc	360
tcctcaggag	gtggaggttc	cgggggcggg	ggctccggcg	gaggtggatc	agatattgtg	420
atgactcagt	ctccactctc	cctgcccgtc	acccctggag	agccggcctc	catctcctgc	480
aggtctagtc	agagcctcct	gcatagtaat	gggtacaact	atttggattg	gtacctacag	540
aagccagggc	agtctccaca	actcctgatc	tatttgggtt	ctaatcgggc	ctccggggtc	600
cctgacaggt	tcagtggcag	tggatcaggc	acagatttta	cactgaaaat	cagcagaatg	660
gaggctgagg	atgttggggt	ttattactgc	atgcaaggtc	tacaaactcc	gtacactttt	720
ggccagggga	ccaagctgga	gatcaaagga	ggcggaggga	gtgttttgtt	ttatctggcc	780
gttgggataa	tgtttctcgt	aaatacagta	ctttgggtaa	caataaggaa	ggaactgaag	840
agaaagaaaa	aatgggatct	ggaaatatca	ttggacagtg	gacacgaaaa	aaaagtcaca	900
tcatcattgc	aagaagaccg	gcacttggag	gaggaactga	aatgtcaaga	gcaaaaagaa	960
gaacaactgc	aagaaggcgt	acatagaaaa	gaaccacagg	gagcaacata	g	1011
<210> 46 <211> 2669 < 212> ДНК < 213> искусственная последовательность <220> < 2 2 3> .синтетическая < 400> 46 agcctaggcc tccaaaaaag cctcctcact	acttctggaa	tagctcagag	gcagaggcgg	60
cctcggcctc	tgcataaata	aaaaaaatta	gtcagccatg	gggcggagaa	tgggcggaac	120
tgggcggagt	taggggcggg	atgggcggag	ttaggggcgg	gactatggtt	gctgactaat	180
tgagatgcat	gctttgcata	cttctgcctg	ctggggagcc	tggggacttt	ccacacctgg	240
ttgctgacta	attgagatgc	atgctttgca	tacttctgcc	tgctggggag	cctggggact	300
ttccacaccg	gatccaccat	gggttcagct	attgagcagg	atgggttgca	tgctggtagt	360
cccgccgcat	gggtcgaacg	actgtttgga	tacgattggg	cccaacagac	tataggctgt	420

- 61 037546

tccgacgctg	ctgtctttcg	tctttctgca	caaggtcgtc	cagttctgtt	cgtgaaaacc	480
gacttgtccg	gagccctcaa	tgagttgcaa	gacgaagctg	cacgactgag	ttggcttgcc	540
accactggtg	tcccatgtgc	cgcagtactt	gacgtcgtca	cagaggctgg	tcgcgattgg	600
ttgctccttg	gagaagtgcc	cggccaagat	cttctcagtt	cccaccttgc	ccctgccgaa	660
aaagtttcaa	taatggctga	cgctatgaga	aggctgcaca	cccttgaccc	tgccacatgt	720
ccattcgatc	accaagccaa	acaccgaatt	gaacgagcta	gaacccgcat	ggaagccggc	780
ctcgttgatc	aagacgattt	ggatgaggaa	caccagggtc	tcgcacccgc	tgaactcttc	840
gctcgcctca	aagcacgaat	gccagacgga	gatgacttgg	tcgtaaccca	cggagatgcc	900
tgccttccta	acataatggt	agagaatgga	agatttagcg	gcttcattga	ttgtggacga	960
cttggagttg	cagatcggta	ccaagatatc	gctctcgcta	ccagagatat	tgctgaagaa	1020
ttgggcggag	aatgggctga	tcggtttctc	gtactctacg	gaattgccgc	acctgattcc	1080
caacgcattg	ctttttaccg	tcttctggat	gagttcttct	aaacgcgtcc	cccctctccc	1140
tccccccccc	ctaacgttac	tggccgaagc	cgcttggaat	aaggccggtg	tgcgtttgtc	1200
tatatgttat	tttccaccat	attgccgtct	tttggcaatg	tgagggcccg	gaaacctggc	1260
cctgtcttct	tgacgagcat	tcctaggggt	ctttcccctc	tcgccaaagg	aatgcaaggt	1320
ctgttgaatg	tcgtgaagga	agcagttcct	ctggaagctt	cttgaagaca	aacaacgtct	1380
gtagcgaccc	tttgcaggca	gcggaacccc	ccacctggcg	acaggtgcct	ctgcggccaa	1440
aagccacgtg	tataagatac	acctgcaaag	gcggcacaac	cccagtgcca	cgttgtgagt	1500
tggatagttg	tggaaagagt	caaatggctc	tcctcaagcg	tattcaacaa	ggggctgaag	1560
gatgcccaga	aggtacccca	ttgtatggga	tctgatctgg	ggcctcggtg	cacatgcttt	1620
acatgtgttt	agtcgaggtt	aaaaaacgtc	taggcccccc	gaaccacggg	gacgtggttt	1680
tcctttgaaa	aacacgattg	ctcgaatcac	catggtgagc	aagggcgagg	agctgttcac	1740
cggggtggtg	cccatcctgg	tcgagctgga	cggcgacgta	aacggccaca	agttcagcgt	1800
gtccggcgag	ggcgagggcg	atgccaccta	cggcaagctg	accctgaagt	tcatctgcac	1860
caccggcaag	ctgcccgtgc	cctggcccac	cctcgtgacc	accttcggct	acggcctgca	1920
gtgcttcgcc	cgctaccccg	accacatgaa	gcagcacgac	ttcttcaagt	ccgccatgcc	1980
cgaaggctac	gtccaggagc	gcaccatctt	cttcaaggac	gacggcaact	acaagacccg	2040
cgccgaggtg	aagttcgagg	gcgacaccct	ggtgaaccgc	atcgagctga	agggcatcga	2100
cttcaaggag	gacggcaaca	tcctggggca	caagctggag	tacaactaca	acagccacaa	2160

- 62 037546

cgtctatatc	atggccgaca	agcagaagaa	cggcatcaag	gtgaacttca	agatccgcca	2220
caacatcgag	gacggcagcg	tgcagctcgc	cgaccactac	cagcagaaca	cccccatcgg	2280
cgacggcccc	gtgctgctgc	ccgacaacca	ctacctgagc	taccagtccg	ccctgagcaa	2340
agaccccaac	gagaagcgcg	atcacatggt	cctgctggag	ttcgtgaccg	ccgccgggat	2400
cactctcggc	atggacgagc	tgtacaagta	atcggccgct	aatcagccat	accacatttg	2460
tagaggtttt	acttgcttta	aaaaacctcc	cacacctccc	cctgaacctg	aaacataaaa	2520
tgaatgcaat	tgttgttgtt	aacttgttta	ttgcagctta	taatggttac	aaataaagca	2580
atagcatcac aaatttcaca aataaagcat ccaaactcat caatgtatct tatcatgtc <210> 47 <211> 2992 < 212> ДНК < 213> искусственная последовательность <220> < 2 2 3> синтетическая <400> 47	ttttttcact	gcattctagt	tgtggtttgt	2640 2669
gttgacattg	attattgact	agttattaat	agtaatcaat	tacggggtca	ttagttcata	60
gcccatatat	ggagttccgc	gttacataac	ttacggtaaa	tggcccgcct	ggctgaccgc	120
ccaacgaccc	ccgcccattg	acgtcaataa	tgacgtatgt	tcccatagta	acgccaatag	180
ggactttcca	ttgacgtcaa	tgggtggagt	atttacggta	aactgcccac	ttggcagtac	240
atcaagtgta	tcatatgcca	agtacgcccc	ctattgacgt	caatgacggt	aaatggcccg	300
cctggcatta	tgcccagtac	atgaccttat	gggactttcc	tacttggcag	tacatctacg	360
tattagtcat	cgctattacc	atggtgatgc	ggttttggca	gtacatcaat	gggcgtggat	420
agcggtttga	ctcacgggga	tttccaagtc	tccaccccat	tgacgtcaat	gggagtttgt	480
tttggcacca	aaatcaacgg	gactttccaa	aatgtcgtaa	caactccgcc	ccattgacgc	540
aaatgggcgg	taggcgtgta	cggtgggagg	tctatataag	cagagctctc	cctatcagtg	600
atagagatct	ccctatcagt	gatagagatc	gtcgacgttt	agtgaaccgt	cagatcgcct	660
ggagacgcca	tccacgctgt	tttgacctcc	atagaagaca	ccgggaccga	tccagcctcc	720
gcggccggga	acggtgcatt	ggaacgcgga	ttccccgtgc	caagagtgac	gtaagtaccg	780
cctatagagt	ctataggccc	acccccttgg	cttcttatgc	atgctatact	gtttttggct	840
tggggtctat	acacccccgc	ttcctcatgt	tataggtgat	ggtatagctt	agcctatagg	900

- 63 037546

tgtgggttat	tgaccattat	tgaccactcc	cctattggtg	acgatacttt	ccattactaa	960
tccataacat	ggctctttgc	cacaactctc	tttattggct	atatgccaat	acactgtcct	1020
tcagagactg	acacggactc	tgtattttta	caggatgggg	tctcatttat	tatttacaaa	1080
ttcacatata	caacaccacc	gtccccagtg	cccgcagttt	ttattaaaca	taacgtggga	1140
tctccacgcg	aatctcgggt	acgtgttccg	gacatggtct	cttctccggt	agcggcggag	1200
cttctacatc	cgagccctgc	tcccatgcct	ccagcgactc	atggtcgctc	ggcagctcct	1260
tgctcctaac	agtggaggcc	agacttaggc	acagcacgat	gcccaccacc	accagtgtgc	1320
cgcacaaggc	cgtggcggta	gggtatgtgt	ctgaaaatga	gctcggggag	cgggcttgca	1380
ccgctgacgc	atttggaaga	cttaaggcag	cggcagaaga	agatgcaggc	agctgagttg	1440
ttgtgttctg	ataagagtca	gaggtaactc	ccgttgcggt	gctgttaacg	gtggagggca	1500
gtgtagtctg	agcagtactc	gttgctgccg	cgcgcgccac	cagacataat	agctgacaga	1560
ctaacagact	gttcctttcc	atgggtcttt	tctgcagaag	cttatactcg	agctctagat	1620
tgggaacccg	ggtctctcga	attcgagatc	tccaccatgc	acagacctag	acgtcgtgga	1680
actcgtccac	ctccactggc	actgctcgct	gctctcctcc	tggctgcacg	tggtgctgat	1740
gcagaggtgc	agctggtgga	gtctggggga	gccatagtaa	agccgggggg	gtcccataga	1800
gtctcctgtg	aagcctctgg	attcactttc	agtaacgcct	ggatgagttg	ggtccgccag	1860
gctccaggga	gggggctgga	gtgggttggc	cgtattttaa	gcaagactga	tggtgggacg	1920
acagactacg	ctgcacccgt	gaaagacaga	ttcaccattt	caagagatga	ttctaaaaat	1980
atgttgtttc	tgcaaatgga	cagcctgaaa	atcgaggaca	cagccgtgta	tttctgtacc	2040
acggccgatt	tttggagtgc	ttattcttct	gactactggg	gccagggaac	cctggtcacc	2100
gtctcctcag	gaggtggagg	ttccgggggc	gggggctccg	gcggaggtgg	atcagatatt	2160
gtgatgactc	agtctccact	ctccctgccc	gtcacccctg	gagagccggc	ctccatctcc	2220
tgcaggtcta	gtcagagcct	cctgcatagt	aatgggtaca	actatttgga	ttggtaccta	2280
cagaagccag	ggcagtctcc	acaactcctg	atctatttgg	gttctaatcg	ggcctccggg	2340
gtccctgaca	ggttcagtgg	cagtggatca	ggcacagatt	ttacactgaa	aatcagcaga	2400
atggaggctg	aggatgttgg	ggtttattac	tgcatgcaag	gtctacaaac	tccgtacact	2460
tttggccagg	ggaccaagct	ggagatcaaa	ggaggcggag	ggagtgtttt	gttttatctg	2520
gccgttggga	taatgtttct	cgtaaataca	gtactttggg	taacaataag	gaaggaactg	2580
aagagaaaga	aaaaatggga	tctggaaata	tcattggaca	gtggacacga	aaaaaaagtc	2640

- 64 037546

acatcatcat	tgcaagaaga	ccggcacttg	gaggaggaac	tgaaatgtca	agagcaaaaa	2700
gaagaacaac	tgcaagaagg	cgtacataga	aaagaaccac	agggagcaac	ataggcggcc	2760
gctaatcagc	cataccacat	ttgtagaggt	tttacttgct	ttaaaaaacc	tcccacacct	2820
ccccctgaac	ctgaaacata	aaatgaatgc	aattgttgtt	gttaacttgt	ttattgcagc	2880
ttataatggt	tacaaataaa	gcaatagcat	cacaaatttc	acaaataaag	catttttttc	2940
actgcattct	agttgtggtt	tgtccaaact	catcaatgta	tcttatcatg	tc	2992
<210> 48 <211> 5765 < 212> ДНК < 213> искусственная последовательность <220> < 2 2 3> синтетическая <400> 48 acaacttcgt atagcataca ttatacgaag	ttatggtacc	aagcctaggc	ctccaaaaaa	60
gcctcctcac	tacttctgga	atagctcaga	ggcagaggcg	gcctcggcct	ctgcataaat	120
aaaaaaaatt	agtcagccat	ggggcggaga	atgggcggaa	ctgggcggag	ttaggggcgg	180
gatgggcgga	gttaggggcg	ggactatggt	tgctgactaa	ttgagatgca	tgctttgcat	240
acttctgcct	gctggggagc	ctggggactt	tccacacctg	gttgctgact	aattgagatg	300
catgctttgc	atacttctgc	ctgctgggga	gcctggggac	tttccacacc	ggatccacca	360
tgggttcagc	tattgagcag	gatgggttgc	atgctggtag	tcccgccgca	tgggtcgaac	420
gactgtttgg	atacgattgg	gcccaacaga	ctataggctg	ttccgacgct	gctgtctttc	480
gtctttctgc	acaaggtcgt	ccagttctgt	tcgtgaaaac	cgacttgtcc	ggagccctca	540
atgagttgca	agacgaagct	gcacgactga	gttggcttgc	caccactggt	gtcccatgtg	600
ccgcagtact	tgacgtcgtc	acagaggctg	gtcgcgattg	gttgctcctt	ggagaagtgc	660
ccggccaaga	tcttctcagt	tcccaccttg	cccctgccga	aaaagtttca	ataatggctg	720
acgctatgag	aaggctgcac	acccttgacc	ctgccacatg	tccattcgat	caccaagcca	780
aacaccgaat	tgaacgagct	agaacccgca	tggaagccgg	cctcgttgat	caagacgatt	840
tggatgagga	acaccagggt	ctcgcacccg	ctgaactctt	cgctcgcctc	aaagcacgaa	900
tgccagacgg	agatgacttg	gtcgtaaccc	acggagatgc	ctgccttcct	aacataatgg	960
tagagaatgg	aagatttagc	ggcttcattg	attgtggacg	acttggagtt	gcagatcggt	1020
accaagatat	cgctctcgct	accagagata	ttgctgaaga	attgggcgga	gaatgggctg	1080

- 65 037546

atcggtttct	cgtactctac	ggaattgccg	cacctgattc	ccaacgcatt	gctttttacc	1140
gtcttctgga	tgagttcttc	taaacgcgtc	ccccctctcc	ctcccccccc	cctaacgtta	1200
ctggccgaag	ccgcttggaa	taaggccggt	gtgcgtttgt	ctatatgtta	ttttccacca	1260
tattgccgtc	ttttggcaat	gtgagggccc	ggaaacctgg	ccctgtcttc	ttgacgagca	1320
ttcctagggg	tctttcccct	ctcgccaaag	gaatgcaagg	tctgttgaat	gtcgtgaagg	1380
aagcagttcc	tctggaagct	tcttgaagac	aaacaacgtc	tgtagcgacc	ctttgcaggc	1440
agcggaaccc	cccacctggc	gacaggtgcc	tctgcggcca	aaagccacgt	gtataagata	1500
cacctgcaaa	ggcggcacaa	ccccagtgcc	acgttgtgag	ttggatagtt	gtggaaagag	1560
tcaaatggct	ctcctcaagc	gtattcaaca	aggggctgaa	ggatgcccag	aaggtacccc	1620
attgtatggg	atctgatctg	gggcctcggt	gcacatgctt	tacatgtgtt	tagtcgaggt	1680
taaaaaacgt	ctaggccccc	cgaaccacgg	ggacgtggtt	ttcctttgaa	aaacacgatt	1740
gctcgaatca	ccatggtgag	caagggcgag	gagctgttca	ccggggtggt	gcccatcctg	1800
gtcgagctgg	acggcgacgt	aaacggccac	aagttcagcg	tgtccggcga	gggcgagggc	1860
gatgccacct	acggcaagct	gaccctgaag	ttcatctgca	ccaccggcaa	gctgcccgtg	1920
ccctggccca	ccctcgtgac	caccttcggc	tacggcctgc	agtgcttcgc	ccgctacccc	1980
gaccacatga	agcagcacga	cttcttcaag	tccgccatgc	ccgaaggcta	cgtccaggag	2040
cgcaccatct	tcttcaagga	cgacggcaac	tacaagaccc	gcgccgaggt	gaagttcgag	2100
ggcgacaccc	tggtgaaccg	catcgagctg	aagggcatcg	acttcaagga	ggacggcaac	2160
atcctggggc	acaagctgga	gtacaactac	aacagccaca	acgtctatat	catggccgac	2220
aagcagaaga	acggcatcaa	ggtgaacttc	aagatccgcc	acaacatcga	ggacggcagc	2280
gtgcagctcg	ccgaccacta	ccagcagaac	acccccatcg	gcgacggccc	cgtgctgctg	2340
cccgacaacc	actacctgag	ctaccagtcc	gccctgagca	aagaccccaa	cgagaagcgc	2400
gatcacatgg	tcctgctgga	gttcgtgacc	gccgccggga	tcactctcgg	catggacgag	2460
ctgtacaagt	aatcggccgc	taatcagcca	taccacattt	gtagaggttt	tacttgcttt	2520
aaaaaacctc	ccacacctcc	ccctgaacct	gaaacataaa	atgaatgcaa	ttgttgttgt	2580
taacttgttt	attgcagctt	ataatggtta	caaataaagc	aatagcatca	caaatttcac	2640
aaataaagca	tttttttcac	tgcattctag	ttgtggtttg	tccaaactca	tcaatgtatc	2700
ttatcatgtc	ggcgcgttga	cattgattat	tgactagtta	ttaatagtaa	tcaattacgg	2760
ggtcattagt	tcatagccca	tatatggagt	tccgcgttac	ataacttacg	gtaaatggcc	2820

- 66 037546

cgcctggctg	accgcccaac	gacccccgcc	cattgacgtc	aataatgacg	tatgttccca	2880
tagtaacgcc	aatagggact	ttccattgac	gtcaatgggt	ggagtattta	cggtaaactg	2940
cccacttggc	agtacatcaa	gtgtatcata	tgccaagtac	gccccctatt	gacgtcaatg	3000
acggtaaatg	gcccgcctgg	cattatgccc	agtacatgac	cttatgggac	tttcctactt	3060
ggcagtacat	ctacgtatta	gtcatcgcta	ttaccatggt	gatgcggttt	tggcagtaca	3120
tcaatgggcg	tggatagcgg	tttgactcac	ggggatttcc	aagtctccac	cccattgacg	3180
tcaatgggag	tttgttttgg	caccaaaatc	aacgggactt	tccaaaatgt	cgtaacaact	3240
ccgccccatt	gacgcaaatg	ggcggtaggc	gtgtacggtg	ggaggtctat	ataagcagag	3300
ctctccctat	cagtgataga	gatctcccta	tcagtgatag	agatcgtcga	cgtttagtga	3360
accgtcagat	cgcctggaga	cgccatccac	gctgttttga	cctccataga	agacaccggg	3420
accgatccag	cctccgcggc	cgggaacggt	gcattggaac	gcggattccc	cgtgccaaga	3480
gtgacgtaag	taccgcctat	agagtctata	ggcccacccc	cttggcttct	tatgcatgct	3540
atactgtttt	tggcttgggg	tctatacacc	cccgcttcct	catgttatag	gtgatggtat	3600
agcttagcct	ataggtgtgg	gttattgacc	attattgacc	actcccctat	tggtgacgat	3660
actttccatt	actaatccat	aacatggctc	tttgccacaa	ctctctttat	tggctatatg	3720
ccaatacact	gtccttcaga	gactgacacg	gactctgtat	ttttacagga	tggggtctca	3780
tttattattt	acaaattcac	atatacaaca	ccaccgtccc	cagtgcccgc	agtttttatt	3840
aaacataacg	tgggatctcc	acgcgaatct	cgggtacgtg	ttccggacat	ggtctcttct	3900
ccggtagcgg	cggagcttct	acatccgagc	cctgctccca	tgcctccagc	gactcatggt	3960
cgctcggcag	ctccttgctc	ctaacagtgg	aggccagact	taggcacagc	acgatgccca	4020
ccaccaccag	tgtgccgcac	aaggccgtgg	cggtagggta	tgtgtctgaa	aatgagctcg	4080
gggagcgggc	ttgcaccgct	gacgcatttg	gaagacttaa	ggcagcggca	gaagaagatg	4140
caggcagctg	agttgttgtg	ttctgataag	agtcagaggt	aactcccgtt	gcggtgctgt	4200
taacggtgga	gggcagtgta	gtctgagcag	tactcgttgc	tgccgcgcgc	gccaccagac	4260
ataatagctg	acagactaac	agactgttcc	tttccatggg	tcttttctgc	agtcaccgtc	4320
cttgacacga	agcttatact	cgagctctag	attgggaacc	cgggtctctc	gaattcgaga	4380
tctccaccat	gcacagacct	agacgtcgtg	gaactcgtcc	acctccactg	gcactgctcg	4440
ctgctctcct	cctggctgca	cgtggtgctg	atgcagaggt	gcagctggtg	gagtctgggg	4500
gagccatagt	aaagccgggg	gggtcccata	gagtctcctg	tgaagcctct	ggattcactt	4560

- 67 037546

tcagtaacgc	ctggatgagt	tgggtccgcc	aggctccagg	gagggggctg	gagtgggttg	4620
gccgtatttt	aagcaagact	gatggtggga	cgacagacta	cgctgcaccc	gtgaaagaca	4680
gattcaccat	ttcaagagat	gattctaaaa	atatgttgtt	tctgcaaatg	gacagcctga	4740
aaatcgagga	cacagccgtg	tatttctgta	ccacggccga	tttttggagt	gettattett	4800
ctgactactg	gggccaggga	accctggtca	ccgtctcctc	aggaggtgga	ggttccgggg	4860
gcgggggctc	cggcggaggt	ggatcagata	ttgtgatgac	tcagtctcca	ctctccctgc	4920
ccgtcacccc	tggagagccg	gcctccatct	cctgcaggtc	tagteagage	ctcctgcata	4980
gtaatgggta	caactatttg	gattggtacc	tacagaagcc	agggcagtct	ccacaactcc	5040
tgatctattt	gggttctaat	cgggcctccg	gggtccctga	caggttcagt	ggcagtggat	5100
caggcacaga	ttttacactg	aaaatcagca	gaatggaggc	tgaggatgtt	ggggtttatt	5160
actgcatgca	aggtctacaa	actccgtaca	cttttggcca	ggggaccaag	etggagatea	5220
aaggaggcgg	agggagtgtt	ttgttttatc	tggccgttgg	gataatgttt	ctcgtaaata	5280
cagtactttg	ggtaacaata	aggaaggaac	tgaagagaaa	gaaaaaatgg	gatctggaaa	5340
tatcattgga	cagtggacac	gaaaaaaaag	tcacatcatc	attgeaagaa	gaccggcact	5400
tggaggagga	actgaaatgt	caagagcaaa	aagaagaaca	aetgeaagaa	ggcgtacata	5460
gaaaagaacc	acagggagca	acataggcgg	ccgctaatca	gccataccac	atttgtagag	5520
gttttacttg	ctttaaaaaa	cctcccacac	ctccccctga	acctgaaaca	taaaatgaat	5580
gcaattgttg	ttgttaactt	gtttattgca	gcttataatg	gttacaaata	aagcaatagc	5640
atcacaaatt	tcacaaataa	agcatttttt	tcactgcatt	ctagttgtgg	tttgtccaaa	5700
ctcatcaatg tatcttatca tgtctaccgg gttag <210> 49 <211> 660 < 212> ДНК < 213> искусственная последовательность <220> < 2 2 3 > синтетическая < 400> 49	tataacttcg	tataatgtat	actatacgaa	5760 5765
gacatcgtga	tgacccagtc	tccactctcc	ctgcccgtca	cccctggaga	gccggcctcc	60
atctcctgca	ggtctagtca	gagcctcctg	catagtaatg	ggtacaacta	tttggattgg	120
tacctacaga	agccagggca	gtctccacaa	ctcctgatct	atttgggttc	taategggee	180

- 68 037546

tccggggtcc	ctgacaggtt	cagtggcagt	ggatcaggca	cagattttac	actgaaaatc	240
agcagaatgg	aggctgagga	tgttggggtt	tattactgca	tgcaaggtct	acaaactccg	300
tacacttttg	gccaggggac	caagctggag	atcaaacgag	ctgatgctgc	accaactgta	360
tccatcttcc	caccatccag	tgagcagtta	acatctggag	gtgcctcagt	cgtgtgcttc	420
ttgaacaact	tctaccccaa	agacatcaat	gtcaagtgga	agattgatgg	cagtgaacga	480
caaaatggcg	tcctgaacag	ttggactgat	caggacagca	aagacagcac	ctacagcatg	540
agcagcaccc	tcacgttgac	caaggacgag	tatgaacgac	ataacagcta	tacctgtgag	600
gccactcaca	agacatcaac	ttcacccatt	gtcaagagct	tcaacagggg	agagtgttga	660
<210> 50 <211> 1359 < 212> ДНК < 21 з> искусственная последовательность <220> < 2 2 3 > синтетическая < 400> 50 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagcc	atagtaaagc	cgggggggtc	ccatagagtc	60
tcctgtgaag	cctctggatt	cactttcagt	aacgcctgga	tgagttgggt	ccgccaggct	120
ccagggaggg	ggctggagtg	ggttggccgt	attttaagca	agactgatgg	tgggacgaca	180
gactacgctg	cacccgtgaa	agacagattc	accatttcaa	gagatgattc	taaaaatatg	240
ttgtttctgc	aaatggacag	cctgaaaatc	gaggacacag	ccgtgtattt	ctgtaccacg	300
gccgattttt	ggagtgctta	ttcttctgac	tactggggcc	agggaaccct	ggtcaccgtc	360
tcctcagcca	aaacaacagc	cccatcggtc	tatccactgg	cccctgtgtg	tggagataca	420
actggctcct	cggtgactct	aggatgcctg	gtcaagggtt	atttccctga	gccagtgacc	480
ttgacctgga	actctggatc	cctgtccagt	ggtgtgcaca	ccttcccagc	tgtcctgcag	540
tctgacctct	acaccctcag	cagctcagtg	actgtaacct	cgagcacctg	gcccagccag	600
tccatcacct	gcaatgtggc	ccacccggca	agcagcacca	aggtggacaa	gaaaattgag	660
cccagagggc	ccacaatcaa	gccctgtcct	ccatgcaaat	gcccagcacc	taacctcttg	720
ggtggaccat	ccgtcttcat	cttccctcca	aagatcaagg	atgtactcat	gatctccctg	780
agccccatag	tcacatgtgt	ggtggtggat	gtgagcgagg	atgacccaga	tgtccagatc	840
agctggtttg	tgaacaacgt	ggaagtacac	acagctcaga	cacaaaccca	tagagaggat	900
tacaacagta	ctctccgggt	ggtcagtgcc	ctccccatcc	agcaccagga	ctggatgagt	960

- 69 037546

ggcaaggagt	tcaaatgcaa	ggtcaacaac	aaagacctcc	cagcgcccat	cgagagaacc	1020
atctcaaaac	ccaaagggtc	agtaagagct	ccacaggtat	atgtcttgcc	tccaccagaa	1080
gaagagatga	ctaagaaaca	ggtcactctg	acctgcatgg	tcacagactt	catgcctgaa	1140
gacatttacg	tggagtggac	caacaacggg	aaaacagagc	taaactacaa	gaacactgaa	1200
ccagtcctgg	actctgatgg	ttcttacttc	atgtacagca	agctgagagt	ggaaaagaag	1260
aactgggtgg aaagaaatag ctactcctgt cacacgacta agagcttctc ccggactccg <210> 51 <211> 1011 < 212> ДНК < 213> искусственная последовательность <220> < 2 2 3> синтетическая <400> 51	tcagtggtcc ggtaaatga	acgagggtct	gcacaatcac	1320 1359
gaggtgcagc	tggtggagtc	tgggggagcc	atagtaaagc	cgggggggtc	ccatagagtc	60
tcctgtgaag	cctctggatt	cactttcagt	aacgcctgga	tgagttgggt	ccgccaggct	120
ccagggaggg	ggctggagtg	ggttggccgt	attttaagca	agactgatgg	tgggacgaca	180
gactacgctg	cacccgtgaa	agacagattc	accatttcaa	gagatgattc	taaaaatatg	240
ttgtttctgc	aaatggacag	cctgaaaatc	gaggacacag	ccgtgtattt	ctgtaccacg	300
gccgattttt	ggagtgctta	ttcttctgac	tactggggcc	agggaaccct	ggtcaccgtc	360
tcctcaggag	gtggaggttc	cgggggcggg	ggctccggcg	gaggtggatc	agatattgtg	420
atgactcagt	ctccactctc	cctgcccgtc	acccctggag	agccggcctc	catctcctgc	480
aggtctagtc	agagcctcct	gcatagtaat	gggtacaact	atttggattg	gtacctacag	540
aagccagggc	agtctccaca	actcctgatc	tatttgggtt	ctaatcgggc	ctccggggtc	600
cctgacaggt	tcagtggcag	tggatcaggc	acagatttta	cactgaaaat	cagcagaatg	660
gaggctgagg	atgttggggt	ttattactgc	atgcaaggtc	tacaaactcc	gtacactttt	720
ggccagggga	ccaagctgga	gatcaaagga	ggcggaggga	gtgttttgtt	ttatctggcc	780
gttgggataa	tgtttctcgt	aaatacagta	ctttgggtaa	caataaggaa	ggaactgaag	840
agaaagaaaa	aatgggatct	ggaaatatca	ttggacagtg	gacacgaaaa	aaaagtcaca	900
tcatcattgc	aagaagaccg	gcacttggag	gaggaactga	aatgtcaaga	gcaaaaagaa	960
gaacaactgc	aagaaggcgt	acatagaaaa	gaaccacagg	gagcaacata	g	1011

Claims (16)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Рекомбинантный антигенсвязывающий белок, который связывается с Fc-доменом IgG1 человека, Fc-доменом IgG2 человека или Fc-доменом IgG4 человека, где рекомбинантный антигенсвязывающий белок связывается с Fc-доменом и не связывается с Fc*доменом, где Fc-домен содержит His95 и Tyr96, a Fc*-домен содержит Arg95 и Phe96 в соответствии с системой нумерации экзонов IMGT, и содержит:

   (i) антитело или ScFv, содержащие CDR-1 тяжелой цепи (HCDR1), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, HCDR-2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28, HCDR-3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, CDR-1 легкой цепи (LCDR-1), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, и LCDR-2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31, и (ii) мембранный якорный домен.
2. 2. Рекомбинантный антигенсвязывающий белок по п.1, где:

   a) антигенсвязывающий белок содержит HCVR, имеющую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 15, и LCVR, имеющую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 16, или

   b) антигенсвязывающий белок содержит HCVR, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и LCVR, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16.
3. 3. Рекомбинантный антигенсвязывающий белок по п.1 или 2, причем антигенсвязывающий белок представляет собой слитый с ScFv белок, включающий:

   а) ©вариабельный домен тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 15, (ii) вариабельный домен легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 16, и (iii) мембранный якорный домен, включающий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 21; или

   b) (i) вариабельный домен тяжелой цепи, который имеет аминокислотную последовательность, идентичную SEQ ID NO: 15, (ii) вариабельный домен легкой цепи, который имеет аминокислотную последовательность, идентичную SEQ ID NO: 16, и (iii) мембранный якорный домен, включающий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 21.
4. 4. Выделенный полинуклеотид, включающий последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует:

   a) антигенсвязывающий белок по любому из пп.1-3; или

   b) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:19.
5. 5. Экспрессионный вектор в виде нуклеиновой кислоты, включающий:

   (a) полинуклеотид по п.4;

   (b) промотор, который функционально связан с полинуклеотидом;

   (c) последовательность полиаденилирования.
6. 6. Вектор по п.5, дополнительно включающий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей:

   a) селектируемый маркер, или

   b) используемый для переноса энергии белок, содержащий зеленый флуоресцентный белок или желтый флуоресцентный белок (YFP).
7. 7. Вектор по п.5 или 6, где:

   a) промотор представляет собой промотор CMV;

   b) селектируемый маркер придает устойчивость к неомицину;

   c) используемым для переноса энергии белком является зеленый флуоресцентный белок или желтый флуоресцентный белок (YFP).
8. 8. Вектор по любому из пп.5-7, причем вектор является замкнутым в круг или линейным.
9. 9. Клетка-хозяин, экспрессирующая антигенсвязывающий белок по любому из пп.1-3.
10. 10. Клетка-хозяин по п.9, причем клеткой является клетка СНО.
11. 11. Способ детектирования или выделения клетки-хозяина, которая экспрессирует гетеродимерный белок, включающий стадии:

    (a) экспрессия в клетке-хозяине захватывающего белка клеточной поверхности (CSCP), содержащего антигенсвязывающий белок по любому из пп.1-3, и гетеродимерного белка, где (i) CSCP связывается с первым сайтом в гетеродимерном белке с образованием комплекса CSCP-гетеродимерный белок внутри клетки-хозяина, (ii) комплекс CSCP-гетеродимерный белок переносится через клетку-хозяин и (iii) затем представляется на поверхности клетки-хозяина;

    (b) приведение клетки-хозяина в контакт с детекторной молекулой, причем детекторная молекула связывается со вторым сайтом в гетеродимерном белке;

    (c) отбор клетки-хозяина, которая связывается с детекторной молекулой, где в гетеродимерном белке:

    - 71 037546 (i) первый сайт находится в тяжелой цепи, которая имеет СНЗ-домен, содержащий остаток гистидина в положении 95 и остаток тирозина в положении 96 в соответствии с системой нумерации экзонов

    IMGT (Fc); и (ii) второй сайт находится в тяжелой цепи, которая имеет CH3-домен, содержащий остаток аргинина в положении 95 и остаток фенилаланина в положении 96 в соответствии с системой нумерации экзонов IMGT (Fc*).
12. 12. Способ по п.11, включающий стадию приведения клетки-хозяина в контакт с блокирующей молекулой до отбора клетки-хозяина на стадии (c), причем блокирующая молекула связывается с CSCP, который не связан с гетеродимерным белком, но не связывается с комплексом CSCP-гетеродимерный белок.
13. 13. Способ по п.11 или 12, причем стадию отбора (c) выполняют с помощью сортировки клеток с возбуждением флуоресценции.
14. 14. Способ по любому из пп.11-13, причем гетеродимерный белок включает антитело, и первый сайт находится в антителе и расположен в тяжелой цепи, включающей CH3-домен дикого типа.
15. 15. Способ по любому из пп.11-14, причем детекторная молекула (DM) включает:

    (a) антигенсвязывающий белок, включающий вариабельный домен тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 38, и вариабельный домен легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 39, или (b) антигенсвязывающий белок, включающий тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 40, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO:41.
16. 16. Способ по любому из пп.12-15, где блокирующей молекулой является нечеловеческий IgG или Fc-молекула человека.