MX2015005649A - Hidrolizado de colageno y uso del mismo. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un hidrolizado de colágeno, que es producido por la hidrólisis enzimática de gelatina de hueso tipo B, en donde el hidrolizado de colágeno se forma a partir de péptidos de los cuales por lo menos 50% en peso, en particular por lo menos 70% en peso tiene un peso molecular molecular de 1,500 Da a 3,500 Da, y que tiene un peso molecular promedio en la escala de 4,000 Da a 8,000 Da, en particular en la escala de 4,500 Da a 6,000 Da; la invención también se refiere al uso de este hidrolizado de colágeno como un ingrediente activo para mantener y/o mejorar la salud de los huesos, en particular para prevenir y/o tratar la osteoporosis; la invención también se refiere a un complemento alimenticio que comprende el hidrolizado de colágeno.

Description

HIDROLIZADO DE COLAGENO Y USO DEL MISMO MEMORIA DESCRIPTIVA La presente invención se refiere a un novedoso hidrolizado de colágeno.

La invención también se refiere al uso de este novedoso hidrolizado de colágeno como ingrediente activo para mantener y/o mejorar la salud de los huesos, en particular para prevenir y/o tratar la osteoporosis. La invención también se refiere a un complemento nutricional que comprende el hidrolizado de colágeno.

Los huesos de los vertebrados, y por lo tanto de los seres humanos, de deben su gran resistencia y estabilidad mecánica a la estructura especial de la matriz de hueso que es sintetizada por los osteoblastos (células óseas). Los dos componentes esenciales de la matriz de hueso son, en primer lugar, una estructura de colágeno entrelazado, en donde particularmente en el caso de la matriz de hueso, éste es colágeno tipo I. El entrelazamiento del mismo es realizado esencialmente por los aminoácidos lisina e hidroxilisina. El segundo componente es hidroxilapatita (también conocida como apatita-(CaOH)) que se incrusta en la matriz de hueso (mineralización de los huesos). Esta estructura del hueso es más o menos comparable con la del concreto reforzado con acero, en donde las propiedades de la estructura de acero (correspondiente al colágeno) y del concreto (correspondiente a la hidroxilapatita) también se complementan entre sí al mismo tiempo que forman una estructura extremadamente estable.

En contraste con muchos otros tipos de tejidos, el hueso tiene una capacidad de regeneración relativamente alta, es decir, la matriz ósea extracelular se está reconstituyendo y deshaciendo otra vez. Cuando se da una alteración de este equilibrio, es decir, una reconstitución insuficiente de matriz ósea nueva, ocurre la pérdida de hueso. Esta pérdida de densidad en los huesos se conoce como osteoporosis, y se puede deber a varias causas. Normalmente la osteoporosis se da con el aumento de la edad (normalmente desde el inicio de la quinta década de vida), particularmente frecuente en las mujeres después de la menopausia (osteoporosis posmenopáusica).

Desde hace tiempo se sabe que la pérdida de densidad ósea en la osteoporosis puede ser contraatacada con la administración oral de hidrolizados de colágeno. Los hidrolizados de colágeno, que se obtienen por la hidrólisis enzimática de colágeno de origen animal, contienen una mezcla de péptidos con diferentes longitudes de cadena y pesos moleculares. Por ejemplo, la patente europea EP 0 777 491 B1 describe el uso de un hidrolizado de colágeno con un peso molecular promedio de 1,000 Da a 40,000 Da, que es producido por la hidrólisis enzimática de colágeno de la piel, para el tratamiento de la osteoporosis posmenopáusica. Se asume que este efecto ventajoso del hidrolizado de colágeno en la salud de los huesos está basado en la estimulación de la biosíntesis de colágeno tipo I y otras proteínas de matriz por parte de los osteoblastos, de manera similar a como ya se ha demostrado previamente in vitro para condrocitos (ver S. Oesser y J. Seiffert (2003), Ceb Tissue Research (311) 393-399).

Varios hidrolizados de colágeno difieren por la distribución de peso molecular de las propiedades que éstos contienen, su secuencia de aminoácidos y otros parámetros, dependiendo del material de partida y del método de producción. Un objetivo de la presente invención es proponer un hidrolizado de colágeno que tenga una efectividad particularmente buena con respecto al mantenimiento y/o a la mejora de la salud de los huesos.

Este objetivo se logra, de acuerdo con la invención, con un hidrolizado de colágeno que se produce por medio de la hidrólisis enzimática de gelatina de hueso tipo B, en donde el hidrolizado de colágeno se forma a partir de péptidos, de los cuales por lo menos el 50% en peso tiene un peso molecular de 1,500 Da a 13,500 Da, y que tienen un peso molecular promedio en la escala de 4,000 Da a 8,000 Da.

Las investigaciones que han realizado los inventores sobre la estimulación de la síntesis de proteínas de matriz por medio de osteoblastos in vitro, las cuales se describirán con más detalle a continuación, han demostrado sorprendentemente que un hidrolizado de colágeno de este tipo tiene un efecto esimulante significativamente mayor en comparación con otros hidrolizados diferentes, en particular en la síntesis de colágeno tipo I. Un hidrolizado de colágeno en el que por lo menos el 70% en peso de los péptidos tienen un peso molecular de 1,500 Da a 13,500 Da, y/o que tienen un peso molecular promedio en la escala de 4,500 a 6,000 Da, ha demostrado ser particularmente conveniente.

En este resultado es de particular interés la alta efectividad de un hidrolizado de colágeno que está hecho específicamente de gelatina de hueso, en especial porque en la téenica previa se conoce más bien el uso de hidrolizados de colágeno o gelatina de piel animal (principalmente de piel de cerdo, pero también de pieles de pescado). En general, la gelatina como forma soluble desnaturalizada de colágeno, es un material de partida muy adecuado para la hidrólisis enzimática. La gelatina de hueso, que se usa en el contexto de la invención como producto de partida para el hidrolizado, es una gelatina tipo B, que de preferencia se produce por el desglose alcalino de colágeno a partir de huesos de vertebrados, en particular de oseina. La oseina comprende huesos degrasados y desmineralizados. Convenientemente se usa la oseina de huesos de ganado.

El punto isoeléctrico (IEP) de la gelatina de hueso que se usa como material de partida, de preferencia es menor a 5.5. En contraste con lo anterior, las gelatinas tipo A, que son producidas por la descomposición ácida del colágeno, tienen un punto isoeléctrico de más de 7.

En el hidrolizado de colágeno de acuerdo con la invención, de preferencia los péptidos tienen un nivel general de amidación de los grupos glutamina y/o de los grupos de ácido glutámico y de los grupos asparagina y/o de los grupos de ácido aspártico, de menos del 15%, en particular de menos del 10%. Así, el nivel de amidación se calcula dividiendo una porción molar de los grupos glutamina y asparagina entre la proporción molar de los grupos de glutamina, ácido glutámico, asparagina y ácido aspártico en los péptidos. El último valor es dado por la composición de aminoácidos naturales del colágeno, y típicamente asciende a aproximadamente 1.12 mmol/g. La proporción molar de los grupos glutamina y asparagina se puede determinar por la hidrólisis ácida de las amidas y la determinación del amoniaco formado por los mismos. Se puede lograr un nivel de amidación bajo de los péptidos, en particular, por el desglose alcalino de la gelatina (tipo B) utilizada.

Es interesante notar que las investigaciones sobre la simulación de la síntesis de proteínas de matriz por medio de osteoblastos, también han demostrado que el hidrolizado de colágeno de acuerdo con la invención, con un peso molecular promedio preferido de 4,600 Da a 6,000 Da, tiene una mayor efectividad que varios hidrolizados de bajo peso molecular. La viscosidad del hidrolizado de colágeno también está correlacionada con el peso molecular de los péptidos obtenidos. En este sentido, es preferible que una solución acuosa al 20% en peso del hidrolizado de colágeno tenga una viscosidad a 25°C de más de 5 mPa.s, en particular de más de 6 mPa.s.

El hidrolizado de colágeno de acuerdo con la invención tiene de preferencia un contenido de amonio, sulfato y fosfato de menos de 300 ppm de cada uno, en particular de menos de 100 ppm. De manera correspondiente, ya se pueden mantener bajos contenidos de sal en la producción de la gelatina de hueso que se usa para la hidrólisis.

Para la producción enzimática de hidrolizado de colágeno, se pueden usar diferentes proteasas, en particular de origen microbiano, en donde sus diferentes especificidades para aminoácidos particulares tienen una influencia directa sobre la estructura molecular de los péptidos resultantes y por lo tanto también en sus efectividades. Con respecto a la simulación de los osteoblastos, se ha observado que, de preferencia, se puede producir un hidrolizado de colágeno particularmente efectivo por la hidrólisis de la gelatina con una endoproteasa neutra de Bacillus subtilis.

De acuerdo con una modalidad preferida de la invención, el hidrolizado de colágeno se produce a través de la acción de la endoproteasa a una temperatura de 40°C a 60°C, en particular a aproximadamente 50°C, durante un período de 20 minutos a 40 minutos, en particular durante aproximadamente 30 minutos.

Además del hidrolizado de colágeno antes descrito, la presente invención también se refiere particularmente al uso del mismo como ingrediente activo para mantener y/o mejorar la salud de los huesos, en particular para prevenir y/o tratar la osteoporosls. Gracias al importante efecto estimulante del hidrolizado de colágeno de acuerdo con la invención sobre la síntesis de proteínas de matriz por medio de los osteoblastos, lo cual puede ser demostrado por experimentos in vitro, se puede contraatacar específicamente una alteración en el equilibrio entre la formación y la degradación del hueso, por medio de la administración oral del hidrolizado de colágeno.

Un aspecto esencial de la invención se refiere al uso del hidrolizado de colágeno como ingrediente activo para prevenir y/o tratar la osteoporosis posmenopáusica. Según los cálculos, aproximadamente 50% de las mujeres con una edad de más de 50 años se ven afectadas por este tipo de pérdida de hueso y, en los primeros cinco años después de la menopausia, se puede perder hasta 20% de la sustancia ósea.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a un método para prevenir y/o tratar la osteoporosis, particularmente la osteoporosis posmenopáusica, en donde el método comprende la administración oral a un paciente del hidrolizado de colágeno de acuerdo con la invención, en particular a un paciente femenino de más de 50 años de edad.

Debido a que no se requiere de una aprobación como producto farmacéutico para los hidrolizados de proteínas animales o vegetales, el hidrolizado de colágeno de acuerdo con la invención puede ser formulado favorablemente como un complemento nutricional. Por ejemplo, el hidrolizado de colágeno puede estar presente en forma de un polvo, un granulado, una solución o una suspensión, o en forma de tabletas, cápsulas, comprimidos o bolsitas, y si es apropiado, en combinación con aditivos o ingredientes activos adecuados. Alternativamente, el hidrolizado de colágeno también se puede agregar directamente al producto alimenticio.

La dosis oral diaria de preferencia está en la escala de 1 g a 15 g del hidrolizado de colágeno, de preferencia de 2 g a 10 g, con más preferencia de 2 g a 7 g, y con particular preferencia en la escala de 2.5 g a 5 g. La cantidad relevante puede ser formulada convenientemente como una sola dosis diaria.

Otra modalidad preferida de la invención se refiere a un complemento nutricional que, además del hidrolizado de colágeno de acuerdo con la invención, comprende uno o más prebióticos. La combinación de hidrolizado de colágeno con uno o más prebióticos se basa en la consideración de que para una regeneración particularmente efectiva de la sustancia ósea, se debe habilitar no sólo la biosíntesis del colágeno y otras proteínas matriz, sino también la formación y la incorporación de hidroxilapatita en una cantidad suficiente. Aquí, un factor limitante es el suministro de calcio a la matriz de hueso, aunque la captación suficiente de calcio con la nutrición no es el problema (ésto se garantiza generalmente con una dieta balanceada), sino que más bien está limitada la resorción suficiente del calcio absorbido en el intestino, en particular debido a la formación de sales de calcio poco solubles.

Se ha observado que la resorción de caldo, y por lo tanto la mineralizadón de los huesos, puede mejorar con la administración de prebióticos. Los prebióticos son constituyentes alimenticios generalmente no digeribles que estimulan el crecimiento y/o la actividad de microorganismos particulares de la flora intestinal, y que por lo tanto tienen un efecto positivo en la salud. Aunque todavía no se ha podido explicar por completo el mecanismo exacto por medio del cual este efecto de los prebióticos tiene una influencia positiva sobre la resorción de calcio, el efecto positivo antes descrito ha sido demostrado, por ejemplo, para la administración de fructanos a los niños de aproximadamente 12 años de edad (ver S. Abrams et al. (2005), American 10urnal of CUnical Nutrition (82) 471-476).

Así, por medio de la administración conjunta de hidrolizado de colágeno y prebióticos, se estimula la formación de los dos constituyentes esenciales de la matriz de hueso y de esta forma se logra un efecto sinérgico con respecto a la salud de los huesos, en particular con respecto a la prevención y/o el tratamiento de la osteoporosis.

El complemento nutriclonal de acuerdo con la invención puede comprender, en principio, cualquier relación en peso de hidrolizado de colágeno y prebiótico o prebióticos. Sin embargo, para asegurar un suministro suficiente de los dos componentes es preferible que la proporción de hidrolizado de colágeno y del prebiótico o prebióticos hacienda en cada caso de aproximadamente 20% a aproximadamente 80% en peso, y con más preferencia de aproximadamente 40% a aproximadamente 60% en peso. En particular, el complemento nutricional puede comprender una mezcla de los dos constituyentes en una relación en peso de aproximadamente 1:1.

De preferencia, el prebiótico o prebióticos que se usan en el complemento nutricional de acuerdo con la invención se selecciona(n) de preferencia de los oligosacáridos y/o polisacáridos. Los oligosacáridos y polisacáridos constituyen la mayoría de las sustancias prebióticamente activas conocidas en las que, con el uso de dichas sustancias, se da el efecto ventajoso adicional de que mejora significativamente el sabor del complemento nutricional, en comparación con el hidrolizado de colágeno puro. Aunque los hidrolizados de colágeno que se describen típicamente con sabor neutro, se pueden producir por métodos correspondientes, muchos usuarios perciben un efecto adverso de sabor que es descrito como "glutinoso". Sorprendentemente, los componentes de sabor negativo del hidrolizado de colágeno pueden ser eliminados casi por completo por medio de la combinación con oligosacáridos y/o polisacáridos prebióticos.

De preferencia el prebiótico o prebióticos se selecciona(n) de inulina, fructanos, galacto-oligosacáridos (GOS), fructo-oligosacáridos (FOS), maltodextrinas resistentes, polidextrosa y mezclas de los mismos. Éstos comprenden polisacáridos tanto naturales como los producidos sintéticamente. La inulina es un fructano que comprende hasta 100 unidades de fructosa y una unidad de glucosa independiente. Los fructo-oligosacáridos y galacto-oligosacáridos comprenden exclusivamente unidades de fructosa o galactosa (normalmente hasta 10), y la polidextrosa comprende un polisacárido sintético hecho de unidades de glucosa, sorbitol y ácido cítrico.

También es preferible que el complemento nutricional comprenda, como componente adicional, por lo menos una sal de calcio soluble. Por este medio se asegura al mismo tiempo un suministro suficiente de calcio para el usuario, sin importar sus otros hábitos nutricionales.

En principio esto puede involucrar a todas las sales de calcio solubles que no sean tóxicas o que tengan otros efectos adversos. De preferencia la por lo menos una sal de calcio soluble se selecciona de citrato de calcio, lactato de calcio, gluconato de calcio, lactato gluconato de calcio, lactobionato de calcio y mezclas de los mismos.

El complemento nutricional de acuerdo con la invención pueden contener, como una preparación en combinación, componentes adicionales que tengan un efecto positivo en la salud de los huesos, o que sean generalmente útiles como un complemento nutricional. Es particularmente conveniente que, por ejemplo, el complemento nutricional también comprenda una o más vitaminas seleccionadas de vitamina C, vitamina D, vitamina D3, vitamina E, vitamina K y los metabolitos de las mismas.

Adicionalmente, el complemento nutricional de acuerdo con la invención también puede ser mejorado con diferentes materiales, por ejemplo, sales de flúor, sales de potasio y sales de magnesio. También se puede promover la captación de dichos minerales por parte de la pared intestinal por medio de ácidos grasos de cadena corta.

Otra adición ventajosa son los ácidos grasos omega-3, que pueden producir un aumento del contenido de calcitonina en los huesos. También se les atribuye un efecto antiinflamatorio.

Posiblemente las isoflavonas de soya también tienen un efecto positivo en la densidad de los huesos, y se pueden usar en el complemento nutricional de acuerdo con la invención.

Por último, también deben mencionarse las especies o sus ingredientes activos, por ejemplo cúrcuma y chile, que, junto con su efecto antiinflamatorio e inmunomodulador, pueden contribuir a los efectos ventajosos de los complementos nutricionales de acuerdo con la invención.

Gracias al efecto positivo del hidrolizado de colágeno de acuerdo con la invención sobre la salud de los huesos, su administración como complemento nutricional puede hacer posible que, bajo ciertas circunstancias, pueda ser administrado con, o por lo menos reducir la dosis de, fármacos que son utilizados con este propósito, en particular para prevenir y/o tratar la osteoporosis posmenopáusica. Ejemplos de dichos ingredientes activos farmacéuticos, cuyo uso algunas veces conlleva algunos problemas, son moduladores selectivos de receptores de estrógeno (SERM por sus siglas en inglés), parathormona y su teriparatida análoga, otras hormonas (en particular estrógenos y hormonas del crecimiento), bifosfonatos y anticuerpos monoclonales.

Otro objetivo de la invención es un método para producir el hidrolizado de colágeno de acuerdo con la invención, que comprende los pasos de: la producción de una solución acuosa de gelatina de hueso tipo B con una concentración de 5% a 20% en peso, en particular de aproximadamente 10% en peso; la adición de una endoproteasa neutral de Bacillus subtilis en una cantidad de 1% a 4% en peso, en particular de aproximadamente 2% con relación a la cantidad de gelatina; dejar que la endoproteasa actúe en la gelatina a una temperatura de 40°C a 60°C, en particular a aproximadamente 50°C, y con un valor de pH de 5.5 a 6.5, en particular de aproximadamente 6, durante un período de 20 min. a 40 min., en particular de aproximadamente 30 min; y la desactivación térmica de la endoproteasa.

Se describieron ventajas particulares y modalidades preferidas del método de acuerdo con la invención, junto con el hidrolizado de colágeno de acuerdo con la invención.

Ahora la invención será descrita con más detalle usando los siguientes ejemplos y haciendo referencia a las figuras, en las cuales: la figura 1: muestra un cromatograma de permeación en gel con la distribución de peso molecular de un hidrolizado de colágeno de acuerdo con la invención y un hidrolizado de comparación; la figura 2: muestra una representación gráfica referente a la estimulación de la síntesis de colágeno tipo I y osteocalcina por medio de un hidrolizado de colágeno de acuerdo con la invención y un hidrolizado de comparación; y la figura 3: muestra una representación gráfica referente a la estimulación de la síntesis de diferentes proteínas y enzimas de matriz por medio de un hidrolizado de colágeno de acuerdo con la invención, y cuatro hidrolizados de comparación diferentes.

Producción de hidrolizados de colágeno Ahora se describirá la producción de un hidrolizado de colágeno de acuerdo con la presente invención (ejemplo) y de cuatro hidrolizados de colágeno que no son de acuerdo con la invención (ejemplos comparativos 1 a 4).

Se utilizaron dos gelatinas diferentes como materiales de partida, específicamente una gelatina tipo B de huesos de res (identificada a continuación como gelatina de hueso) y una gelatina de piel de cerdo tipo A. En el cuadro 1 se muestran los parámetros esenciales de las mismas.

CUADRO 1 EJEMPLO Se impregnaron 200g de gelatina de hueso en 1800 g de agua destilada durante 30 min. a temperatura ambiente. La gelatina pre-impregnada fue calentada a 58±2°C y disuelta con agitación. El valor de pH fue ajustado con una solución de hidróxido de sodio a 6.0±0.2. Después se agregó una endoproteasa neutral de Bacillus subtilis en una cantidad de 2% en peso (con relación a la gelatina). Después de una hidrólisis con duración de 30 minutos, la solución fue calentada a 85°C para la desactivación de enzimas. Se secó la solución para obtener el hidrolizado de colágeno formado.

EJEMPLO COMPARATIVO 1 Se impregnaron 200g de gelatina de hueso en 1800 g de agua destilada durante 30 min. a temperatura ambiente. La gelatina pre-impregnada fue calentada a 49±2°C y disuelta con agitación, a continuación de lo cual se agregó 1.64 g CaCl2.2H2O. El valor de pH fue ajustado con una solución de hidróxido de sodio a 6.0±0.2. A continuación, se agregó 0.6% en peso (con relación a la gelatina) de una endoproteasa neutral de Baciüus subtilis. Después de una hidrólisis con duración de 30 min, se agregó 0.2% en peso (con relación a la gelatina) de una endoproteasa neutral de Bacillus amyioiiquefadens. Después de una hidrólisis con duración total de 180 min, se calentó la solución a 85°C para la desactivación de enzima y después se secó.

EJEMPLO COMPARATIVO 2 Se impregnaron 200g de gelatina de hueso en 1800 g de agua destilada durante 30 min. a temperatura ambiente. La gelatina pre-impregnada fue calentada a 49±2°C y disuelta con agitación, a continuación de lo cual se agregó 0.4 g CaCI2.2H2O. El valor de pH fue ajustado con una solución de hidróxido de sodio a 6.5±0.2. A continuación, se agregó 0.6% en peso (con relación a la gelatina) de una endoproteasa neutral de Bacillus subtills. Después de una hidrólisis con duración total de 60 min, se agregó 0.2% en peso (con relación a la gelatina) de una exoproteasa de Aspergillus sojae. Después de una hidrólisis con duración de 7 horas, la solución fue calentada a 85°C para la desactivación de enzima y después se secó.

EJEMPLO COMPARATIVO 3 200g de gelatina de piel de cerdo fue impregnada en 1800 g de agua destilada durante 30 min a temperatura ambiente. La gelatina pre-impregnada fue calentada a 57±2°C y disuelta con agitación. El valor de pH fue ajustado con una solución de hidróxido de sodio a 6.0±0.2. A continuación, se agregó 0.3% en peso (con relación a la gelatina) de una endoproteasa neutral de Bacillus subti/ís. Después de 180 min, la solución fue calentada a 85°C para la desactivación de enzima y después se secó.

EJEMPLO COMPARATIVO 4 200g de gelatina de piel de cerdo fue impregnada en 1800 g de agua destilada durante 30 min a temperatura ambiente. La gelatina pre-impregnada fue calentada a 58±2°C y disuelta con agitación. El valor de pH fue ajustado con una solución de hidróxido de sodio a 7.0±0.2. A continuación se agregó una endoproteasa alcalina de Bacillus Hcheniformis en una cantidad de 2% en peso (con relación a la gelatina). Después de 180 min, la solución fue calentada a 85°C para la desactivación de enzima y después se secó.

Determinación de la distribución del oeso molecular Se determinó la distribución del peso molecular de los péptidos de los diferentes hidrolizados de colágeno, por medio de cormatografía de permeación de gel, usando los siguientes parámetros: Fase estática: TSK 2000 SW XL (Tosoh Bioscience GmbH) Fase móvil: 0.4 mol/l fosfato monosódico pH 5.3 Velocidad de flujo: 0.5 ml/min Estándar de calibración: fragmentos definidos de colágeno tipo I (FILK, Freiberg) Detección: Detector UV Knauer K-2501 a 214 nm El cuadro 2 contiene la respectiva distribución de peso molecular de acuerdo con las fracciones de peso predeterminado, el peso molecular promedio, la viscosidad y el valor de pH (cada uno a 20% en peso y a 25°C) y el nivel de amidación de los distintos hidrolizados de colágeno.

CUADRO 2 La figura 1 muestra el cromatograma de permeación de gel con la distribución de peso molecular del hidrolizado de colágeno de acuerdo con la invención como en el ejemplo, y el hidrolizado de colágeno de acuerdo con el ejemplo comparativo 4. Ei peso molecular se introduce en la abscisa con una escala logarítmica.

Estimulación de la síntesis de proteínas v enzimas de matriz in vitro Como evidencia de la efectividad particular del hidrolizado de colágeno de acuerdo con la invención, se investigó in vitro el efecto estimulante del mismo en la síntesis de proteínas y enzimas de matriz, que forman parte de la constitución y mineralización de la matriz, por medio de osteoblastos. Esto se realizó con la determinación de la expresión del ARNm relevante, por medio de PCR en tiempo real y una evaluación semi-cualitativa (con relación a un control sin ningún hidrolizado de colágeno).

Los osteoblastos humanos fueron aislados a partir de articulaciones de la rodilla, en donde el material óseo fue incubado bajo agitación severa a 37°C durante 1 hora en una solución de Hanks, complementada con 7 mg/ml of hialuronidasa tipo I y III-S y 5 mg/ml pronasa. Entonces siguió la descomposición a 37°C en solución de Hanks durante 3 a 5 horas, complementada con 16 mg/ml de colagenasa tipo CLS IV. Después de la descomposición enzimática fueron cultivados osteoblastos primarios en un medio HAMs F12, complementado con 10% de suero fetal de becerro, 20 U/ml penicilina estreptomicina, 50 mg/ml patricina, 0.05 mg/ml ácido ascórbico y 0.15 mg/ml glutamina.

Para la investigación actual, cultivos celulares monocapa de osteoblastos humanos fueron incubados por un período de 24 horas en un medio que había sido complementado con 0.5 mg/ml del hidrolizado de colágeno relevante (de acuerdo con el ejemplo o uno de los ejemplos comparativos). En cada caso, el control fue incubado en un medio sin hidrolizado. Posteriormente se hizo la determinación de la expresión de ARNm relevante como ya se describió antes.

Los resultados de la estimulación de la síntesis de colágeno tipo I y osteocalcina, son como se muestra en el histograma de la figura 2, en donde la columna de la izquierda es el ejemplo de acuerdo con la invención en cada caso, y la columna derecha es el ejemplo comparativo 4 en cada caso. En la ordenada está representada la expresión de ARNm con relación al control (=1) (el valor promedio y desviación estándar de por lo menos 12 pruebas independientes). Aunque el colágeno tipo I represente por mucho la proteína de matriz más importante del material óseo, la osteocalcina es una enzima que está involucrada en la diferenciación de la matriz, cuya expresión mejorada también favorece la construcción de la matriz.

En ambos casos hay un significativo efecto estimulante del hidrolizado de acuerdo con la invención, específicamente un aumento de la expresión de ARNm de colágeno en promedio por un factor de aproximadamente 2.7, y la expresión de ARNm de osteocalcina aumenta en promedio por un factor de aproximadamente 2.0. Es interesante observar que, de manera diferente, el hidrolizado de acuerdo con el ejemplo comparativo 4, que es producido a partir de un material de partida diferente y que tiene un peso molecular promedio inferior, realmente lleva a una reducción en la expresión de los dos ARNm, lo que demuestra la alta especificidad del hidrolizado de colágeno de acuerdo con la invención.

Los resultados correspondientes para la estimulación de la síntesis de colágeno tipo I, el biglicano, el versicano y la fosfatasa alcalina, mostrados como un histograma en la figura 3, las columnas de izquierda a derecha representan, respectivamente, al ejemplo de acuerdo con la invención y los ejemplos comparativos, 1, 2 y 3 (el valor promedio y la desviación estándar de por lo menos 12 pruebas independientes). El biglicano y versicano son proteoglicanos que juegan un papel en la organización estructural de la matriz de hueso. De manera similar a la osteocalcina, la fosfatasa alcalina está involucrada - además de otras funciones - en la diferenciación de la matriz de hueso.

Aquí también se puede observar que, para las cuatro proteínas, el hidrolizado de colágeno de acuerdo con la invención tiene un efecto mejor que el de todos los ejemplos comparativos. De estos últimos sólo el el ejemplo comparativo 3 tiene un efecto ligeramente estimulante en la síntesis del colágeno tipo I (por un factor de aproximadamente 1.3), mientras que en los otros casos, no hay un efecto, e incluso hay un efecto negativo, es decir una reducción en la síntesis de ARNm. Aunque con biglicano, versicano y fosfatasa alcalina, el efecto del hidrolizado de colágeno de acuerdo con la invención también es relativamente débil, es más positivo en cada caso que el de los otros hidrolizados.

De esta forma, la efectividad mejorada del hidrolizado de colágeno de acuerdo con la invención en comparación con otros hidrolizados diferentes, se confirma con respecto a todas las proteínas y enzimas de matriz investigadas, cuya expresión mejorada promueve la constitución de la matriz de hueso.

Claims (18)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Un hidrolizado de colágeno que es producido por la hidrólisis enzimática de gelatina de hueso tipo B, en donde el hidrolizado de colágeno se forma a partir de péptidos de los cuales por lo menos 50% en peso, en particular por lo menos 70% en peso, tienen un peso molecular de 1,500 Da a 13,500 Da, y que tienen un peso molecular promedio en la escala de 4,000 Da a 8,000 Da, en particular en la escala de 4,500 Da a 6,000 Da.

2.- El hidrolizado de colágeno de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque la gelatina de hueso se produce por el desglose alcalino de colágeno a partir de huesos de vértebras, en particular de oseina.

3.- El hidrolizado de colágeno de conformidad con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque la gelatina de hueso tiene un punto isoeléctrico de menos de 5.5.

4.- El hidrolizado de colágeno de conformidad con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque los péptidos tienen un nivel de amidación general de los grupos glutamina y/o los grupos de ácido glutámico y de los grupos asparagina y/o los grupos de ácido aspártico de menos de 15%, en particular de menos de 10%.

5.- El hidrolizado de colágeno de conformidad con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque una solución acuosa al 20% en peso del hidrolizado de colágeno tiene una viscosidad a 25°C de más de 5 mPa.s, en particular más de 6 mPa.s.

6.- El hidrolizado de colágeno de conformidad con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque el hidrolizado de colágeno tiene un contenido de amonio, sulfato y fosfato de menos de 300 ppm cada uno, en particular de menos de 100 ppm.

7.- El hidrolizado de colágeno de conformidad con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque el hidrolizado de colágeno es producido por hidrólisis de la gelatina con una endoproteasa neutral de Bacillus subti/is.

8.- El hidrolizado de colágeno de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el hidrolizado de colágeno se produce a través de la acción de la endoproteasa a una temperatura de 40°C a 60°C, en particular a aproximadamente 50°C, durante un período de 20 min a 40 min, en particular de aproximadamente 30 min.

9.- El hidrolizado de colágeno de conformidad con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque es como un ingrediente activo para mantener y/o mejorar la salud de los huesos, en particular para prevenir y/o tratar la osteoporosis.

10.- El hidrolizado de colágeno de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque es un ingrediente activo para prevenir y/o tratar la osteoporosis posmenopáusica.

11.- El hidrolizado de colágeno de conformidad con la reivindicación 9 o 10, caracterizado además porque el hidrolizado de colágeno es formulado como un complemento nutricional, en particular en forma de un polvo, un granulado, una solución o una suspensión, o en forma de tabletas, cápsulas, comprimidos o bolsitas.

12.- El hidrolizado de colágeno de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado además porque se provee una toma oral diaria de 1 g a 15 g del hidrolizado de colágeno, de preferencia de 2 g a 10 g, con más preferencia de 2 g a 7 g, y particularmente preferible de 2.5 g a 5 g.

13.- Un complemento nutricional que comprende el hidrolizado de colágeno de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores y uno o más prebióticos.

14.- El complemento nutricional de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque el prebiótlco o prebióticos se selecciona(n) de oligosacáridos y/o polisacáridos, en particular de inulina, fructanos, galacto-oligosacáridos (GOS), fructo-oligosacáridos (FOS), maltodextrinas resistentes, polidextrosa y mezclas de los mismos.

15.- El complemento nutricional de conformidad con la reivindicación 13 o 14, caracterizado además porque también comprende una o más sales de calcio solubles que se seleccionan, en particular, de citrato de calcio, lactato de calcio, gluconato de calcio, lactato gluconato de calcio, lactobionato de calcio y mezclas de las mismas.

16.- El complemento nutricional de conformidad con una de las reivindicaciones 13 a 15, caracterizado además porque también comprende una o más vitaminas que se seleccionan de vitamina C, vitamina D, vitamina D3, vitamina E, vitamina K y los metabolitos de las mismas.

17.- El complemento nutricional de conformidad con una de las reivindicaciones 13 a 16, caracterizado además porque también comprende uno o más minerales que se seleccionan de sales de flúor, sales de potasio y sales de magnesio.

18.- Un método para producir un hidrolizado de colágeno de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende los pasos de: - producir una solución acuosa de gelatina de hueso tipo B con una concentración de 5% a 20% en peso, en particular de aproximadamente 10% en peso; - agregar una endoproteasa neutral de Bacillus subtilis en una cantidad de 1% a 4% en peso, en particular de aproximadamente 2% en peso, en relación con la cantidad de gelatina; - dejar que la endoproteasa actúe en la gelatina a una temperatura de 40°C a 60°C, en particular aproximadamente 50°C, y a un valor de pH de 5.5 a 6.5, en particular de aproximadamente 6, durante un período de 20 min a 40 min, en particular de aproximadamente 30 min; y - la desactivación térmica de la endoproteasa.