ES2587928T3 - Hidrolizado de colágeno y su uso - Google Patents
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Abstract
Hidrolizado de colágeno, preparado por hidrólisis enzimática de gelatina ósea de tipo B, en donde el hidrolizado de colágeno está formado por péptidos, de los cuales al menos 50% en peso, en particular, al menos 70% en peso, tienen un peso molecular de 1.500 a 13.500 Da y cuyo peso molecular medio se encuentra en el intervalo de 4.500 a 6.000 Da.
Description
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DESCRIPCION
Hidrolizado de colageno y su uso
La presente invencion se refiere a un nuevo tipo de hidrolizado de colageno.
La invencion se refiere, ademas, al uso de este nuevo tipo de hidrolizado de colageno como principio activo para conservar y/o mejorar la salud del tejido oseo, en particular, para la prevencion y/o el tratamiento de la osteoporosis. Adicionalmente, la invencion hace referencia a un complemento alimenticio que comprende el hidrolizado de colageno.
El tejido oseo de los animales vertebrados y, por lo tanto, tambien el humano, debe su elevada resistencia y estabilidad mecanica a la especial formacion de la matriz osea, sintetizada por los osteoblastos (celulas oseas). Los dos componentes esenciales de la matriz osea son, por una parte, una estructura formada por colageno reticulado que, sobre todo en el caso de la matriz osea, es colageno de tipo I. Esta reticulacion se efectua esencialmente a traves de los aminoacidos lisina e hidroxilisina. El segundo componente es hidroxiapatita (denominada tambien apatita-(CaOH)), que se deposita en la matriz osea (mineralizacion del hueso). Esta estructura del tejido oseo es, grosso modo, comparable a la del hormigon armado, en la que las propiedades del armazon de acero (correspondiente al colageno) y del hormigon (correspondiente a la hidroxiapatita) se complementan tambien con la formacion de una estructura extremadamente firme.
Al contrario que muchos otros tipos de tejidos, el hueso exhibe una capacidad de regeneracion relativamente alta, es decir, la matriz osea extracelular esta en un proceso continuo de formacion y destruccion. Si se produce una alteracion de este equilibrio, a saber, una formacion insuficiente de nueva matriz osea, se produce una perdida de tejido oseo. Esta disminucion de la densidad osea se designa como osteoporosis y puede tener diversas causas. De manera tfpica, la osteoporosis aparece con la edad avanzada (a menudo, despues del inicio de la quinta decada de vida) y, de forma especialmente frecuente, en la mujer despues de la menopausia (osteoporosis postmenopausica).
Desde hace algun tiempo, se sabe que mediante la administracion de hidrolizados de colageno por via oral es posible contrarrestar la perdida de densidad osea en la osteoporosis. Los hidrolizados de colageno, que se obtienen por hidrolisis enzimatica de colageno de origen animal, comprenden respectivamente una mezcla de peptidos con diferentes longitudes de cadena o pesos moleculares. La Patente Europea EP 0777491 B1 da a conocer, por ejemplo, el uso de un hidrolizado de colageno con un peso molecular medio de 1.000 a 40.000 Da, preparado por hidrolisis enzimatica de colageno de la piel, para tratar la osteoporosis postmenopausica. Se supone que este efecto beneficioso del hidrolizado de colageno sobre la salud del tejido oseo se debe a una estimulacion de la biosmtesis de colageno de tipo I y otras protemas de la matriz por medio de los osteoblastos, de manera similar a lo que se ha podido comprobar in vitro para los condrocitos (vease S. Oesser y J. Seiffert (2003), Cell Tissue Research, (311), 393-399).
El documento DE 102011000997 A1 da a conocer una composicion con fines nutricionales con una eficacia optimizada con respecto a la formacion de matriz osea, que comprende aproximadamente 1 hasta aproximadamente 99% en peso de hidrolizado de colageno y aproximadamente 1 hasta aproximadamente 99% en peso de uno o multiples prebioticos, siempre en relacion con la masa seca de la composicion.
El documento DE 102010060564 A1 da a conocer el uso de un hidrolizado de colageno para mejorar la salud de la piel, cabello y/o unas del ser humano, en donde al menos 70% en peso del hidrolizado de colageno tiene un peso molecular menor que aproximadamente 3.500 Da.
En un artmulo de M.C. Gomez-Guillen et al. (2011) publicado en Food Hydrocolloids (25), 1813-1827, se ofrece un resumen sobre las propiedades funcionales y bioactivas del colageno y gelatinas de ongenes alternativos, asf como sobre los hidrolizados preparados a partir de los mismos.
Los diversos hidrolizados de colageno se diferencian por la distribucion del peso molecular de los peptidos que contienen, su secuencia de aminoacidos y otros parametros, el material de partida y el procedimiento de fabricacion. La presente invencion tiene la tarea de proponer un hidrolizado de colageno que posea una eficacia especialmente elevada en relacion con la conservacion y/o la mejona de la salud del tejido oseo.
Esta mision se resuelve mediante un hidrolizado de colageno, preparado por hidrolisis enzimatica a partir de gelatina osea de tipo B, en donde el hidrolizado esta compuesto por peptidos, de los cuales al menos 50% en peso tiene un peso molecular de 1.500 a 13.500 Da, y cuyo peso molecular medio se encuentra en el intervalo de 4.500 a 6.000 Da.
Los estudios llevados a cabo por los inventores acerca de la estimulacion de la smtesis de protemas de la matriz por medio de osteoblastos in vitro, que se describen detalladamente mas adelante, han demostrado sorprendentemente que el hidrolizado de colageno de este tipo, en comparacion con otros hidrolizados diferentes, muestra una estimulacion significativamente mayor, en especial sobre la smtesis de colageno de tipo I. Un hidrolizado de colageno en el que al menos 70% en peso de los peptidos tiene un peso molecular de 1.500 a 13.500 Da, ha demostrado ser particularmente conveniente.
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En este resultado, es particularmente interesante la alta eficacia de un hidrolizado de colageno especial, preparado a partir de gelatina osea, en el que se utilizan hidrolizados de colageno o gelatinas procedentes de la piel de animales (principalmente, de la piel de cerdo, pero tambien, por ejemplo, a partir de las pieles de peces), ya conocido de la tecnica anterior. En general, la gelatina, como forma desnaturalizada y soluble de colageno, constituye un material de partida adecuado para la hidrolisis enzimatica. La gelatina osea usada, en el marco de la invencion, como material de partida para el hidrolizado, es una gelatina de tipo B preparada preferiblemente por una digestion alcalina del colageno a partir del tejido oseo de animales vertebrados, en particular, a partir de osema. La osema es tejido oseo desgrasado y desmineralizado. De manera favorable, se utiliza osema de huesos de ganado bovino.
El punto isoelectrico (IEP) de la gelatina osea usada como material de partida es, preferiblemente, menor que 5,5. Por el contrario, las gelatinas de tipo A, preparadas por una digestion acida del colageno, tienen un punto isoelectrico mayor que 7.
En el hidrolizado de colageno segun la invencion, los peptidos poseen, preferiblemente, un grado de amidacion de los restos de glutamina o acido glutamico y de los restos de asparagina o del acido aspartico por lo general menor de 15%, en especial, menor de 10%. Segun esto, el grado de amidacion se calcula dividiendo la fraccion molar de los restos de glutamina y asparagina por la fraccion molar de los restos de glutamina, acido glutamico, asparagina y acido aspartico en los peptidos. Este ultimo valor mencionado se obtiene de la composicion natural de aminoacidos del colageno y, tipicamente, es de aproximadamente 1,12 mmol/g. La fraccion molar de los restos de glutamina y asparagina se puede calcular por la hidrolisis acida de las amidas y la determinacion del amoniaco formado de este modo. Es posible alcanzar un grado de amidacion mas bajo de los peptidos sobre todo por la digestion alcalina de la gelatina empleada (Tipo B).
Es interesante senalar que los estudios sobre la estimulacion de la smtesis de protemas de la matriz por medio de los osteoblastos tambien han demostrado que el hidrolizado de colageno segun la invencion, con un peso molecular medio preferido de 4.600 a 6.000 Da, exhibe mayor eficacia que diversos hidrolizados de menor peso molecular. Asimismo, la viscosidad del hidrolizado de colageno se correlaciona tambien con el peso molecular de los peptidos obtenidos. En este sentido, se prefiere que una solucion acuosa al 20% en peso del hidrolizado de colageno tenga a 25°C una viscosidad mayor que 5 mPas, en especial, mayor que 6 mPas.
El hidrolizado de colageno segun la invencion tiene preferiblemente un contenido menor que 300 ppm tanto de amonio como de sulfato y fosfato, en particular, menor que 100 ppm. Contenidos correspondientemente bajos de sales se pueden alcanzar ya durante la preparacion de la gelatina osea usada para la hidrolisis.
Para la preparacion enzimatica del hidrolizado de colageno se pueden utilizar diferentes proteasas, en especial de origen microbiano, en donde sus distintas especificidades por determinados aminoacidos influyen sobre la estructura molecular de los peptidos resultantes y, por lo tanto, actuan directamente sobre su eficacia. Se ha demostrado que, en lo que respecta a la estimulacion de los osteoblastos, se puede preparar un hidrolizado de colageno especialmente eficaz, preferiblemente por medio de la hidrolisis de la gelatina con endoproteasa neutra de Bacillus subtilis.
Segun una realizacion preferida de la invencion, el hidrolizado de colageno se prepara mediante la accion de la endoproteasa a una temperatura de 40 a 60°C, en especial, de aproximadamente 50°C, durante un periodo de tiempo de 20 a 40 min, en especial, durante aproximadamente 30 min.
La presente invencion se refiere, ademas del hidrolizado de colageno como tal, que se ha descrito anteriormente, particularmente tambien a su uso como principio activo para conservar y/o mejorar la salud del tejido oseo, sobre todo para la prevencion y/o el tratamiento de la osteoporosis. Debido a la marcada accion estimulante del hidrolizado de colageno segun la invencion sobre la smtesis de protemas de la matriz por medio de los osteoblastos, que se ha confirmado mediante ensayos in vitro, la administracion del hidrolizado de colageno por via oral permite contrarrestar la alteracion del equilibrio entre la formacion y destruccion del tejido oseo.
Un aspecto fundamental de la invencion se refiere al uso del hidrolizado de colageno como principio activo para la prevencion y/o el tratamiento de la osteoporosis postmenopausica. Esta forma de perdida de tejido oseo afecta, segun estimaciones, a aproximadamente 50% de las mujeres con edades superiores a 50 anos; durante los cinco primeros anos de menopausia se puede perder hasta 20% de materia osea.
La presente invencion se refiere, por tanto, tambien a un procedimiento para la prevencion y/o el tratamiento de la osteoporosis, sobre todo de la osteoporosis postmenopausica, en donde el procedimiento comprende la administracion por via oral del hidrolizado de colageno segun la invencion a un paciente, en especial, a una paciente de sexo femenino mayor de 50 anos.
Dado que para los hidrolizados de protemas animales o vegetales no se requiere una autorizacion como medicamento, el hidrolizado de colageno segun la invencion se puede formular convenientemente como un complemento alimenticio. Por ejemplo, el hidrolizado de colageno puede estar presente en forma de polvo, granulado, una solucion o una suspension, o en forma de comprimidos, capsulas, pastillas o sobres, eventualmente en combinacion con adyuvantes o coadyuvantes apropiados. De manera alternativa, el hidrolizado de colageno se puede agregar tambien directamente a un alimento.
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La toma oral diaria se encuentra, preferiblemente, en el intervalo de 1 hasta 15 g del hidrolizado de colageno, preferiblemente, de 2 a 10 g, mas preferiblemente, de 2 a 7 g y, en particular, en el intervalo de 2,5 a 5 g. La cantidad correspondiente se puede formular, de modo conveniente, como una unica dosis diaria.
Una realizacion preferida adicional de la invencion se refiere a un complemento alimenticio que, ademas del hidrolizado de colageno segun la invencion, comprende uno o multiples prebioticos. La combinacion del hidrolizado de colageno con uno o multiples prebioticos tiene como base la consideracion de que para lograr una regeneracion especialmente eficaz de la materia osea, se debe estimular no solo la biosmtesis de colageno y otras protemas de la matriz, sino tambien la formacion y el deposito de hidroxiapatita en cantidad suficiente. Un factor limitante en este caso es la aportacion de la matriz osea de calcio, en donde el problema no consiste en una administracion suficiente de calcio con la alimentacion (normalmente, esta garantizada por una nutricion equilibrada), sino la absorcion intestinal de calcio, que esta limitada por la formacion de sales de calcio diffcilmente solubles.
Se ha demostrado que la administracion de prebioticos puede mejorar la absorcion de calcio y, por consiguiente, la mineralizacion del tejido oseo. En general, los prebioticos son componentes no digeribles de los alimentos capaces de potenciar de manera dirigida el crecimiento y/o la actividad de determinados microorganismos de la flora intestinal, generando de este modo un efecto positivo sobre la salud. Aun no se ha dilucidado por completo el mecanismo exacto por el cual este efecto de los prebioticos se manifiesta sobre la absorcion del calcio; sin embargo, el mencionado efecto positivo se ha confirmado, por ejemplo, para la administracion de fructanos en ninos de aproximadamente 12 anos de edad (vease S. Abrams et al. (2005), American Journal of Clinical Nutrition (82), 471476).
Por lo tanto, mediante la administracion conjunta de hidrolizado de colageno y prebioticos se puede estimular la formacion de los dos componentes esenciales de la matriz osea y lograr, de este modo, un efecto sinergico en relacion con la salud del tejido oseo, sobre todo en lo que respecta a la prevencion y/o el tratamiento de la osteoporosis.
En principio, el complemento alimenticio segun la invencion puede comprender el hidrolizado de colageno y el o los prebioticos en cualquier proporcion de peso. Con el fin de garantizar una aportacion suficiente de ambos componentes, es preferible, sin embargo, que la proporcion del hidrolizado de colageno y la del o de los prebioticos sea, respectivamente, de aproximadamente 20 a aproximadamente 80% en peso y, mas preferiblemente, de aproximadamente 40 a aproximadamente 60% en peso, respectivamente. El complemento alimenticio puede comprender, en especial, una mezcla de los dos componentes en una proporcion de peso de aproximadamente 1:1.
El o los prebioticos utilizados en el complemento alimenticio segun la invencion se seleccionan preferiblemente de oligo- y/o polisacaridos. Los oligo- y polisacaridos constituyen la mayor parte de las sustancias activas con accion prebiotica conocidas y, mediante el empleo de este tipo de sustancias, se obtiene el efecto ventajoso adicional de que se mejora claramente el sabor del complemento alimenticio en comparacion con el hidrolizado de colageno puro. Aunque por el procedimiento correspondiente es posible preparar hidrolizados de colageno cuyo sabor se puede calificar por lo general como neutro, muchos consumidores perciben como inconveniente la presencia de un sabor definido como “pegajoso”. Sorprendentemente, los componentes de sabor negativo del hidrolizado de colageno se pueden eliminar casi por completo mediante la combinacion con oligo- y/o polisacaridos prebioticos.
El o los prebioticos se seleccionan preferiblemente de inulina, fructanos, galactooligosacaridos (GOS), fructooligosacaridos (FOS), maltodextrinas resistentes, polidextrosa y mezclas de los mismos. Estos comprenden tanto sacaridos de origen natural como sacaridos preparados de manera sintetica. La inulina es un fructano que contiene hasta 100 unidades de fructosa, asf como una unidad final de glucosa. Los fructooligosacaridos y galactooligosacaridos comprenden exclusivamente unidades de fructosa o galactosa (por lo general, hasta 10) y, en el caso de polidextrosa, se trata de un polisacarido sintetico de unidades de glucosa, sorbita y acido cftrico.
Ademas, es preferible que el complemento alimenticio comprenda como componente adicional al menos una sal soluble de calcio. De esta forma, se garantiza que el consumidor recibe al mismo tiempo un aporte suficiente de calcio, independientemente de sus habitos nutricionales habituales.
En principio, se toman en consideracion todas las sales solubles de calcio que son atoxicas y que carecen de otras acciones inconvenientes. Preferiblemente, la al menos una sal soluble de calcio se selecciona de citrato de calcio, lactato de calcio, gluconato de calcio, lactato gluconato de calcio, lactobionato de calcio y sus mezclas.
El complemento alimenticio segun la invencion puede contener tambien, como preparado de combinacion, otros componentes adicionales que ejercen una accion positiva sobre la salud del tejido oseo o que, en general, son utiles para completar la nutricion. Por ejemplo, es especialmente beneficioso que el complemento alimenticio comprenda ademas una o multiples vitaminas seleccionadas de vitamina C, vitamina D, vitamina D3, vitamina E, vitamina K y sus metabolitos.
Adicionalmente, el complemento alimenticio segun la invencion se puede suplementar con diversas sustancias minerales tales como, en especial, sales de fluor, potasio y magnesio. La absorcion de estos minerales a traves de la pared intestinal se puede reforzar ademas por medio de acidos grasos de cadena corta.
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Los acidos grasos omega-3 representan una suplementacion adicional conveniente, que puede dar lugar a un incremento del contenido de calcitonina en el tejido oseo. Se les atribuye tambien una accion antiinflamatoria.
Es posible que las isoflavonas de soja tengan tambien un efecto positivo sobre la densidad osea y se les puede incluir en el complemento alimenticio segun la invencion
Por ultimo, cabe mencionar tambien especias o sus componentes tales como, por ejemplo, curcumina y chile que, con sus acciones antiinflamatorias e inmunomoduladoras pueden contribuir al efecto beneficioso del complemento alimenticio segun la invencion.
A traves del efecto positivo del hidrolizado de colageno segun la invencion sobre la salud osea, su administracion como complemento alimenticio permite, bajo determinadas circunstancias, renunciar o al menos reducir la dosis de medicamentos que se utilizan con esta finalidad, sobre todo para la prevencion y/o el tratamiento de la osteoporosis postmenopausica. Ejemplos de estas sustancias farmaceuticas, cuya administracion en parte no carece de problemas, son moduladores selectivos de receptores de estrogeno (SERM), parathormona y su analogo teriparatida, otras hormonas (en especial, estrogenos y hormona del crecimiento), bisfosfonatos y anticuerpos monoclonales.
Un objeto adicional de la invencion es un procedimiento para la preparacion del hidrolizado de colageno segun la invencion, que comprende las etapas de:
- Preparacion de una solucion acuosa de gelatina osea de tipo B con una concentracion de 5 a 20% en peso, en especial, de aproximadamente 10% en peso;
- Adicion de una endoproteasa neutra de Bacillus subtilis en una cantidad de 1 a 4% en peso, en especial de aproximadamente 2% en peso con respecto a la cantidad de gelatina;
- Dejar actuar la endoproteasa sobre la gelatina, a una temperatura de 40 a 60°C, en especial de aproximadamente 50°C, y a un valor de pH de 5,5 a 6,5, en especial de aproximadamente 6, durante un periodo de tiempo de 20 a 40 min, en especial durante aproximadamente 30 min; e
- Inactivacion termica de la endoproteasa.
Ya se han descrito las ventajas especiales y realizaciones preferidas del procedimiento segun la invencion en relacion con el hidrolizado de colageno segun la invencion.
Los siguientes ejemplos tienen como objetivo explicar mas detalladamente la invencion, haciendo referencia a las figuras.
Muestran de manera individual:
Figura 1: Cromatograma de permeacion en gel, con la distribucion del peso molecular de un hidrolizado de colageno segun la invencion y de un hidrolizado de comparacion;
Figura 2: Diagrama relativo a la estimulacion de la smtesis de colageno de tipo I y osteocalcina mediante un hidrolizado de colageno segun la invencion y un hidrolizado de comparacion;
Figura 3: Diagrama relativo a la estimulacion de la smtesis de diversas protemas de la matriz y enzimas mediante un hidrolizado de colageno segun la invencion y cuatro hidrolizados de comparacion diferentes.
Preparacion de los hidrolizados de colageno
A continuacion, se describe la preparacion de un hidrolizado de colageno segun la presente invencion (Ejemplo), asf como de cuatro hidrolizados de colageno que no corresponden a la invencion (Ejemplos comparativos 1 a 4).
Como materiales de partida se utilizaron dos gelatinas diferentes, a saber una gelatina de tipo B, procedente de tejido oseo bovino (designada en lo sucesivo gelatina osea) y una gelatina de piel de cerdo de tipo A. En la Tabla 1 se muestran sus parametros basicos.
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Tabla 1
- Gelatina osea Gelatina de piel de cerdo
- Resistencia a la eflorescencia
- 298 g 299 g
- Viscosidad
- 5,52 mPas 3,90 mPas
- (6,67% en peso, 60°C)
- Conductividad
- 111 |jS/cm 157 jS/cm
- (1% en peso, 30°C)
- Humedad
- 10,7% 9,6%
- Punto isoelectrico
- 5,04 9,16
- Grado de amidacion
- 6,7% 31,7%
Ejemplo
En 1.800 g de agua destilada, se hincharon 200 g de gelatina osea durante 30 min a temperatura ambiente. Agitando, la gelatina pre-hinchada se calento y disolvio a 58 ± 2°C. El valor de pH se ajusto a 6,0 ± 0,2 con sosa caustica. Seguidamente, se agregaron 2% en peso (con respecto a la gelatina) de una endoproteasa neutra de Bacillus subtilis. Despues de un periodo de hidrolisis de 30 min, la solucion se calento a 85°C para inactivar la enzima. La solucion se seco para obtener el hidrolizado de colageno formado.
Ejemplo comparativo 1
En 1.800 g de agua destilada, se hincharon 200 g de gelatina osea durante 30 min a temperatura ambiente. Agitando, la gelatina pre-hinchada se calento y disolvio a 49 ± 2°C y, a continuacion, se agregaron 1,64 g de CaCh ■ 2H2O. El valor de pH se ajusto a 6,0 ± 0,2 con sosa caustica. Seguidamente, se agregaron 0,6% en peso (con respecto a la gelatina) de una endoproteasa neutra de Bacillus subtilis. Despues de un periodo de hidrolisis de 30 min, se agregan 0,2% en peso (con respecto a la gelatina) de una endoproteasa neutra de Bacillus amyloliquefaciens. Despues de una hidrolisis de 180 min de duracion total, la solucion se calento a 85°C para inactivar la enzima y, seguidamente, se seco.
Ejemplo comparativo 2
En 1.800 g de agua destilada, se hincharon 200 g de gelatina osea durante 30 min a temperatura ambiente. Agitando, la gelatina pre-hinchada se calento y disolvio a 49 ± 2°C y, a continuacion, se agregaron 0,4 g de CaCl2 ■ 2H2O. El pH se ajusto a 6,5 ± 0,2 con sosa caustica. Seguidamente, se agregaron 0,6% en peso (con respecto a la gelatina) de una endoproteasa neutra de Bacillus subtilis. Despues de un periodo de hidrolisis de 60 min, se agregaron 0,2% en peso (con respecto a la gelatina) de una exoproteasa de Aspergillus sojae. Despues de un periodo total de 7 h de hidrolisis, la solucion se calento a 85°C para inactivar la enzima y, seguidamente, se seco.
Ejemplo comparativo 3
En 1.800 g de agua destilada, se hincharon 200 g de gelatina de piel de cerdo durante 30 min a temperatura ambiente. Agitando, la gelatina pre-hinchada se calento y disolvio a 57 ± 2°C. El valor de pH se ajusto a 6,0 ± 0,2 con sosa caustica. Seguidamente, se agregaron 0,3% en peso (con respecto a la gelatina) de una endoproteasa neutra de Bacillus subtilis. Despues de 180 min, la solucion se calento a 85°C para inactivar la enzima y, seguidamente, se seco.
Ejemplo comparativo 4
En 1.800 g de agua destilada, se hincharon 200 g de gelatina de piel de cerdo durante 30 min a temperatura ambiente. Agitando, la gelatina pre-hinchada se calento y disolvio a 58 ± 2°C. El valor de pH se ajusto a 7,0 ± 0,2 con sosa caustica. Seguidamente, se agregaron 2% en peso (con respecto a la gelatina) de una endoproteasa alcalina de Bacillus licheniformis. Despues de 180 min, la solucion se calento a 85°C para inactivar la enzima y, seguidamente, se seco.
Determinacion de la distribucion del peso molecular
La distribucion del peso molecular de los peptidos de los diferentes hidrolizados de colageno se determino por cromatograffa de permeacion en gel, usando los parametros siguientes:
5
10
15
20
25
30
Fase estacionaria: TSK 2000 SW XL (Tosoh Bioscience GmbH)
Fase movil: 0,4 mol/L de dihidrogeno-fosfato sodico, a pH 5,3
Caudal: 0,5 mL/min
Estandar de calibracion: Fragmentos definidos de colageno de tipo I (FILK, Freiberg)
Deteccion: Detector UV Knauer K-2501 a 214 nm
En la Tabla 2 se indican, respectivamente, la distribucion del peso molecular segun factores de peso preestablecidos, el peso molecular medio, la viscosidad y el valor de pH (siempre a 20% en peso y 25°C), asf como el grado de amidacion de los diferentes hidrolizados de colageno.
Tabla 2.
- Fracciones
- Ejemplo Ej. Comp. 1 Ej. Comp. 2 Ej. Comp. 3 Ej. Comp. 4
- >18 kDa
- 4,3 0,1 0 0,8 0
- 13,5 -18 kDa
- 2,9 0,2 0,1 2,0 0
- 7,5 -13,5 kDa
- 21,1 5,0 0,7 20,6 0
- 3,5 -7,5 kDa
- 29,8 25,4 10,6 25,8 0,9
- 1,5 -3,5 kDa
- 24,5 34,6 24,3 22,8 10,9
- 0,5 -1,5 kDa
- 15,1 31,0 46,4 20,5 70,9
- <0,5 kDa
- 2,4 3,7 18,0 7,4 17,4
- PM medio
- 5.800 Da 2.900 Da 1.800 Da 4.700 Da 950 Da
- Viscosidad
- 6,77 mPas 4,15 mPas 3,22 mPas 5,61 mPas 2,45 mPas
- Valor de pH
- 6,2 6,1 6,4 6,0 6,5
- Grado de amidacion
- 6,8% n.d. n.d. n.d. 27,6%
La Figura 1 muestra el cromatograma de permeacion en gel con la distribucion del peso molecular del hidrolizado de colageno segun la invencion de acuerdo con el ejemplo y del hidrolizado de colageno segun el Ejemplo comparativo 4. El peso molecular esta representado en la abscisa en una escala logantmica.
Estimulacion de la smtesis de protemas de la matriz y enzimas in vitro
Para confirmar la eficacia especial del hidrolizado de colageno segun la invencion, se estudio in vitro su accion estimulante sobre la smtesis de protemas de la matriz y enzimas, que llevan a cabo una funcion en la formacion y la mineralizacion de la matriz, por medio de los osteoblastos. Este analisis se efectuo determinando la expresion del correspondiente ARNm por PCR en tiempo real y una evaluacion semicuantitativa (con respecto a los controles sin hidrolizado de colageno).
Los osteoblastos humanos se aislaron de articulaciones de rodilla, incubando material oseo bajo agitacion intensa a 37°C durante 1 h en solucion de Hanks suplementado con 7 mg/mL de hialuronidasa de tipos I y III-S y 5 mg/mL de pronasa. A continuacion, se prosiguio la digestion a 37°C durante 3 a 5 h en solucion de Hanks suplementada con 16 mg/mL de colagenasa de tipo CLS IV. Despues de la digestion enzimatica, los osteoblastos primarios se cultivaron en Medio HAMs F12 suplementado con 10% de suero bovino fetal, 20 U/mL de penicilina-estreptomicina, 50 |jg/mL de partricina, 0,05 mg/mL de acido ascorbico y 0,15 mg/mL de glutamina.
Para la investigacion propiamente dicha, se incubaron cultivos celulares en monocapa de los osteoblastos humanos durante un periodo de 24 h en un medio suplementado con 0,5 mg/mL del correspondiente hidrolizado de colageno (segun el ejemplo o uno de los ejemplos comparativos). En el medio se incubo un control correspondiente, sin hidrolizado. A continuacion, se llevo a cabo la determinacion de la expresion del ARNm correspondiente de la forma descrita anteriormente.
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Los resultados de la estimulacion de la smtesis de colageno de tipo I y osteocalcina se representan en forma de un diagrama de columnas en la Figura 2, en donde la columna izquierda representa en todos los casos el ejemplo segun la invencion y la columna derecha, el Ejemplo comparativo 4. En la ordenada, se indica la expresion de ARNm con respecto al control (= 1) (valor medio y desviaciones estandares de al menos l2 ensayos independientes). Aunque el colageno de tipo I es, con diferencia, la protema de matriz mas importante del material oseo, la expresion reforzada de osteocalcina, una enzima que interviene en la diferenciacion de la matriz, favorece tambien la formacion de la matriz.
En ambos casos, se observa un efecto claramente estimulante del hidrolizado segun la invencion, a saber, un aumento de la expresion del ARNm de colageno con un factor medio de aproximadamente 2,7 y de la expresion del ARNm de osteocalcina, con un factor medio de aproximadamente 2,0. Es interesante destacar que el hidrolizado segun el Ejemplo comparativo 4, preparado con un material de partida diferente y que exhibe un peso molecular medio mas bajo, provoco, por el contrario, incluso una reduccion de la expresion de ambos ARNm, lo cual pone de manifiesto la elevada especificidad del hidrolizado de colageno segun la invencion.
Los resultados correspondientes para la estimulacion de la smtesis de colageno de tipo I, biglicano, versicano y fosfatasa alcalina estan representados en un diagrama de columnas en la Figura 3, en donde las columnas indican, de izquierda a derecha, el ejemplo segun la invencion y los Ejemplos comparativos 1, 2 y 3, respectivamente (valor medio y desviacion estandar de al menos 12 ensayos independientes). El biglicano y versicano son proteoglicanos que intervienen en la organizacion estructural de la matriz osea. La fosfatasa alcalina, ademas de otras funciones, participa, al igual que la osteocalcina, en la diferenciacion de la matriz osea.
Tambien en este caso se ve para las cuatro protemas que el hidrolizado de colageno segun la invencion desarrolla una accion mas eficaz que todos los ejemplos comparativos. De estos ultimos, tan solo el Ejemplo comparativo 3 muestra un efecto ligeramente estimulante sobre la smtesis de colageno de tipo I (factor de aproximadamente 1,3), en tanto que en todos los casos restantes, el efecto observado es nulo o, incluso, negativo, es decir, se produce una reduccion de la smtesis de ARNm. En relacion con biglicano, versicano y la fosfatasa alcalina, la accion del hidrolizado de colageno segun la invencion tambien es relativamente debil, pero, no obstante, siempre mas positiva que la de los otros hidrolizados.
La eficacia mejorada del hidrolizado de colageno segun la invencion con respecto a otros hidrolizados diferentes se confirma igualmente en relacion con todas las protemas de la matriz y enzimas estudiadas, cuya expresion potenciada favorece la formacion de la matriz osea.
Claims (15)
- 5101520253035404550REIVINDICACIONES1. Hidrolizado de colageno, preparado por hidrolisis enzimatica de gelatina osea de tipo B, en donde el hidrolizado de colageno esta formado por peptidos, de los cuales al menos 50% en peso, en particular, al menos 70% en peso, tienen un peso molecular de 1.500 a 13.500 Da y cuyo peso molecular medio se encuentra en el intervalo de 4.500 a 6.000 Da.
- 2. Hidrolizado de colageno segun la reivindicacion 1, en donde la gelatina osea se prepara por digestion alcalina del colageno del tejido oseo de animales vertebrados, en especial, de osema.
- 3. Hidrolizado de colageno segun una de las reivindicaciones anteriores, en donde la gelatina osea tiene un punto isoelectrico menor que 5,5.
- 4. Hidrolizado de colageno segun una de las reivindicaciones anteriores, en el que los peptidos tienen un grado de amidacion de los restos de glutamina o acido glutamico y de los restos de asparagina o acido aspartico, por lo general, menor de 15%, en especial, menor de 10%.
- 5. Hidrolizado de colageno segun una de las reivindicaciones anteriores, en el que una solucion acuosa al 20% en peso del hidrolizado de colageno a 25°C, tiene una viscosidad mayor que 5 mPa s, en particular, mayor que 6 mPas.
- 6. Hidrolizado de colageno segun una de las reivindicaciones anteriores, en donde el hidrolizado de colageno tiene un contenido de, respectivamente, amonio, sulfato y fosfato menor de 300 ppm, en especial, menor de 100 ppm.
- 7. Hidrolizado de colageno segun una de las reivindicaciones anteriores, en donde el hidrolizado de colageno se prepara por hidrolisis de la gelatina con una endoproteasa neutra de Bacillus subtilis.
- 8. Hidrolizado de colageno segun la reivindicacion 7, en donde el hidrolizado de colageno se prepara bajo la accion de la endoproteasa a una temperatura de 40 a 60°C, en especial, aproximadamente 50°C, durante un periodo de tiempo de 20 a 40 min, en especial, aproximadamente 30 min.
- 9. Hidrolizado de colageno segun una de las reivindicaciones anteriores, para usar como principio activo para la conservacion y/o la mejona de la salud del tejido oseo, en especial, para la prevencion y/o el tratamiento de la osteoporosis.
- 10. Hidrolizado de colageno para utilizar segun la reivindicacion 9 como principio activo para la prevencion y/o el tratamiento de la osteoporosis postmenopausica.
- 11. Hidrolizado de colageno para utilizar segun las reivindicaciones 9 o 10, en donde el hidrolizado de colageno esta formulado como complemento alimenticio, especialmente en forma de polvo, granulado, una solucion o una suspension, o en forma de comprimidos, capsulas, pastillas o sobres.
- 12. Hidrolizado de colageno para utilizar segun la reivindicacion 11, en donde se preve una toma diaria por via oral de 1 a 15 g del hidrolizado de colageno, preferiblemente de 2 a 10 g, mas preferiblemente, de 2 a 7 g y, en especial, de 2,5 a 5 g.
- 13. Complemento alimenticio que comprende el hidrolizado de colageno segun una de las reivindicaciones anteriores y uno o multiples prebioticos seleccionados preferiblemente de oligo- y/o polisacaridos, en particular de inulina, fructanos, galactooligosacaridos (GOS), fructooligosacaridos (FOS), maltodextrinas resistentes, polidextrosa y sus mezclas.
- 14. Complemento alimenticio segun la reivindicacion 13 que comprende, adicionalmente, (i) una o multiples sales solubles de calcio seleccionadas principalmente de citrato de calcio, lactato de calcio, lactato gluconato de calcio, lactobionato de calcio y sus mezclas; y/o (ii) una o multiples vitaminas, seleccionadas de vitamina C, vitamina D, vitamina D3, vitamina E, vitamina K y sus metabolitos, y/o (iii) una o multiples sustancias minerales, seleccionadas de sales de fluor, potasio y magnesio.
- 15. Procedimiento para la preparacion de un hidrolizado de colageno segun una de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende las etapas de:- preparacion de una solucion acuosa de gelatina osea de tipo B, con una concentracion de 5 a 20% en peso, en particular, de aproximadamente 10% en peso;- adicion de una endoproteasa neutra de Bacillus subtilis en una cantidad de 1 a 4% en peso, en especial, de aproximadamente 2% en peso con respecto a la gelatina;- dejar actuar la endoproteasa sobre la gelatina a una temperatura de 40 a 60°C, en especial, de aproximadamente 50°C, y a un valor de pH de 5,5 a 6,5, en particular, de aproximadamente 6, durante un periodo de tiempo de 20 a 40 min, en especial, durante aproximadamente 30 min; e- inactivacion termica de la endoproteasa.
imagen1 Peso molecular en Daimagen2 Colageno de tipo IOsteocalcinaimagen3 Colageno Biglicano Versicano Fosfatasa de tipo I alcalina
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