MX2015002959A - Agente terapeutico para padecimiento sistemico oseo y uso del mismo. - Google Patents

Abstract

El objetivo es proporcionar una estrategia terapéutica novedosa que logre un efecto terapéutico alto sobre una displasia esquelética causada por la activación excesiva de FGFR3, particularmente la acondroplasia y la hipocondroplasia. Se proporciona un agente terapéutico para una displasia esquelética que incluye meclizina o su sal farmacéuticamente aceptable como un ingrediente activo.

Description

AGENTE TERAPÉUTICO PARA PADECIMIENTO SISTÉMICO ÓSEO Y USO DEL MISMO CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere a un agente terapéutico para la displasia esquelética y un uso del mismo. El agente terapéutico de la presente invención para la displasia esquelética es aplicable al tratamiento de la acondroplasia, hipocondroplasia, displasia tanatofórica, enfermedad de Crouzon, displasias acromesomélicas y acondroplasia severa con retraso de desarrollo y acantosis nigricans (SADDAN por sus siglas en inglés). La presente solicitud reclama el beneficio de prioridad de la solicitud de patente japonesa previa No.2013-47426, presentada el 10 de marzo de 2013, cuyo contenido completo se incorpora en este documento por referencia.

TÉCNICA PREVIA La acondroplasia (ACH por sus siglas en inglés) y la hipocondroplasia (HCH por sus siglas en inglés) son desarrolladas por un mutante constantemente activo del receptor de factor de crecimiento fibroblástico 3 (FGFR3), que es un regulador negativo del crecimiento óseo. Además, también se muestra la implicación de FGFR3 en la baja estatura incluyendo el enanismo idiopático. La acondroplasia es un trastorno del crecimiento óseo que no sólo provoca baja estatura sino también complicaciones serias tales como estenosis del canal espinal y estenosis del foramen magnum. No hay ninguna terapia radical para suprimir la actividad de FGFR3 en ACH/HCH. Como tratamiento complementario para la baja estatura, se lleva a cabo el tratamiento hormonal de crecimiento y la elongación ósea de maneras médicas y quirúrgicas.

Recientemente, se han identificado pequeños compuestos químicos que antagonizan la señalización de FGFR3. Los perfiles toxicológicos de estos compuestos, sin embargo, permanecen en su mayoría sin resolver (Literaturas de No Patente 1-3). El péptido natriurético tipo C (CNP) es un potente antagonista de la señalización de FGFR3 que el fenotipo de extremidades cortas de ACH/HCH a través de su inhibición de la vía de FGFR3/MAPK (Literaturas de No Patente 4 y 5). El CNP tiene una vida media muy corta y se requiere de infusión intravenosa continua para los experimentos in vivo (Literatura de No Patente 6). El análogo de CNP con vida media prolongada, BMN 111, se ha desarrollado recientemente y se demostró una recuperación importante de crecimiento óseo en ratones de ACH/HCH por administración subcutánea (Literatura de No Patente 7).

Se reportan varias estrategias terapéuticas nuevas para la acondroplasia (por ejemplo, ver Literaturas de Patente 1 a 3).

LITERATURA DE LA TÉCNICA PREVIA LITERATURA DE PATENTE Literatura de Patente 1: Publicación de Solicitud de Patente Japonesa No Examinada (Traducción de la Solicitud PCT) No.11-507828 Literatura de Patente 2: Publicación de Solicitud de Patente Japonesa No Examinada (Traducción de la Solicitud PCT) No.2011-504506 Literatura de Patente 3: Publicación de la Solicitud de Patente Japonesa No Examinada No.2003-260611 LITERATURA DE NO PATENTE Literatura de No Patente 1: Krejci, P., Murakami, S., Prochazkova, J., Trantirek, L., Chlebova, K., Ouyang, Z., Aklian, A., Smutny, J., Bryja, V., Kozubik, A. et al. (2010) NF449 is a novel inhibitor of fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) signaling active ín chondrocytes and m ltiple myeloma cells . J. Biol . Chem. , 285, 20644-20653.

Literatura de No Patente 2: Jin, M., Yu, Y., Qi, H., Xie, Y., Su, N., Wang, X., Tan, Q., Luo, F., Zhu, Y., Wang, Q. et al. (2012) A novel FGFR3-binding peptide inhibi ts FGFR3 signaling and reverses the lethal phenotype of mice mimícking human thanatophoric dysplasia . Hum . Mol . Genet . , 21, 5443-5455.

Literatura de No Patente 3: Jonquoy, A., Mugniery, E., Benoist-Lasselin, C., Kaci, N., Le Corre, L., Barbault, F., Girard, A.L., Le Merrer, Y., Busca, P., Schibler, L. et al. (2012) A novel tyrosine kinase inhibi tor restores chondrocyte differentlation and promotes bone growth in a gain-of-function Fgfr3 mouse model . Hum . Mol . Genet . , 21, 841-851.

Literatura de No Patente 4: Krejci, P., Masri, B., Fontaine, V., Mekikian, P.B., Weis, M., Prats, H. and Wilcox, W.R. (2005) Interaction of fibroblast growth factor and C-na tríuretic peptide signaling in regulation of chondrocyte proliferation and extracellular ma trix homeostasis . J. Cell Sci . , 118, 5089- 5100.

Literatura de No Patente 5: Yasoda, A., Komatsu, Y., Chusho, H., Miyazawa, T., Ozasa, A., Miura, M., Kurihara, T., Rogi, T., Tanaka, S., Suda, M. et al. (2004) Overexpression of CNP in chondrocytes rescues achondroplasia through a MAPK- dependen t pathway. Nat . Med. , 10, 80-86.

Literatura de No Patente 6: Yasoda, A., Kitamura, H., Fujii, T., Kondo, E., Murao, N., Miura, M., Kanamoto, N., Komatsu, Y., Arai, H. and Nakao, K. (2009) Systemic administration of C-type natriuretic peptide as a novel therapeutic strategy for skeletal dysplasias . Endocrinology , 150, 3138-3144.

Literatura de No Patente 7: Lorget, F., Kaci, N., Peng, J., Benoist-Lasselin, C., Mugniery, E., Oppeneer, T., Wendt, D.J., Bell, S.M., Bullens, S., Bunting, S. et al. (2012) Evaluation of the therapeutic potential of a CNP analog in a Fgfr3 mouse model recapitula ting achondroplasia . ñm J Hum Genet , 91, 1108-1114.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN PROBLEMA A SER RESUELTO POR LA INVENCIÓN El tratamiento con la hormona del crecimiento utiliza la acción del factor de crecimiento tipo insulina 1 (IGF-1) que extiende el cartílago epifisario. Sin embargo, la acondroplasia no está acompañada generalmente por la reducción de la actividad de IGF-1, por lo que no se logrará el efecto esperado. Además, el efecto se muestra sólo inmediatamente después de iniciar el tratamiento, pero el efecto disminuye lentamente. Por otro lado, la elongación ósea regenera el hueso al extender gradualmente el callo formado por la osteotomía, pero este método tiene problemas en que la maduración del callo extendido requiere de un largo período de tiempo, por lo que las complicaciones tales como infección del trayecto del clavo y contracturas articulares aumentan. Por lo tanto, la presente invención pretende proporcionar una nueva estrategia terapéutica que logre un alto efecto terapéutico en una displasia esquelética (particularmente acondroplasia e hipocondroplasia) causada por la activación excesiva de FGFR3.

MEDIOS PARA RESOLVER EL PROBLEMA.

Los presentes inventores se centraron en la activación de la señalización de FGFR3 e intentaron encontrar un compuesto de bajo peso molecular que suprimiera específicamente la activación de la señalización de FGFR3 de los fármacos aprobados. En primer lugar, se llevó a cabo una selección en el sistema experimental de que la señalización de FGFR3 se activa por la adición del factor de crecimiento fibroblástico 2 (FGF2) a las células de condrosarcoma de rata (RCS) lo que provoca la supresión de la proliferación celular y la pérdida de la matriz extracelular. Específicamente, 1,186 fármacos aprobados ( Prestwick Chemicals) se añadieron a la mezcla de las células de RCS y FGF2, y el efecto se estudió. Como resultado del estudio detallado, sorprendentemente, la meclizina, que con frecuencia se utiliza como un fármaco de cinetosis que tiene acción antihistamínica, rescató la supresión de la proliferación celular y la pérdida de la matriz extracelular de una manera dependiente de la concentración. Además, la introducción del FGFR3 mutado en las células de condrosarcoma humanas y las células de ATDC5 como las células del cartílago provocó la supresión de la proliferación celular y la pérdida de la matriz extracelular, pero la meclizina rescató estas acciones. Además, el crecimiento longitudinal del hueso fue suprimido cuando la tibia de un ratón en el día 16.5 de vida intrauterina fue cultivado en la presencia de FGF2, pero la meclizina inhibió la acción de suprimir el crecimiento longitudinal.

Como se describió anteriormente, los experimentos que utilizaron células cartilaginosas y un cultivo de órgano de huesos demostraron la efectividad de la meclizina, o que la meclizina suprime la señalización de FGFR3, y demuestra eficacia. El uso de la meclizina permite el establecimiento de una terapia radical para diversas displasias esqueléticas provocadas principalmente o en parte por la activación excesiva de FGFR3 (en particular, padecimientos con baja estatura, como la acondroplasia, hipocondroplasia, displasia tanatofórica, enfermedad de Crouzon, displasias acromesomélicas y acondroplasia severa con retraso de desarrollo y acantosis nigricans (SADDAN)). Por otro lado, el FGFR3 siempre se expresa como un regulador negativo en la extensión del cartílago epifisario normal. Por lo tanto, la meclizina es considerada igual de eficaz como un promotor del crecimiento corporal en un sujeto normal. La administración real, oral de meclizina a un ratón normal logró un efecto de crecimiento sobre la longitud corporal y la longitud de las extremidades. Más específicamente, el efecto de crecimiento de la meclizina fue confirmado por el experimento con animales. En base a estos resultados, la meclizina es considerada como eficaz también en el tratamiento/prevención del enanismo pituitario no acompañado por cierre epifisario, la baja estatura en el síndrome de Turner, la baja estatura en el síndrome de Prader-Willi, la baja estatura con deficiencia de la hormona del crecimiento (GHD por sus siglas en inglés),y la baja estatura del paciente pequeño para su edad gestacional (SGA por sus siglas en inglés).

La presente invención descrita a continuación se basa principalmente en los hallazgos y observaciones antes descritos. [1] Un agente terapéutico para una displasia esquelética causada por la activación excesiva del receptor de factor de crecimiento fibroblástico 3 (FGFR3), el agente terapéutico incluye meclizina o su sal farmacéuticamente aceptable como el ingrediente activo. [2] El agente terapéutico de [1], en donde la displasia esquelética es un padecimiento seleccionado del grupo que consiste de acondroplasia, hipocondroplasia, displasia tanatofórica, enfermedad de Crouzon, displasias acromesomélicas y acondroplasia severa con retraso de desarrollo y acantosis nigricans (SADDAN). [3] El agente terapéutico de [1] o [2], en donde el ingrediente activo es clorhidrato de meclizina. [4] Una terapia para una displasia esquelética, que incluye la administración de meclizina o su sal farmacéuticamente aceptable a un paciente con una displasia esquelética causada por la activación excesiva del receptor de factor de crecimiento fibroblástico 3 (FGFR3) en una dosis farmacéuticamente eficaz. [5] Un promotor del crecimiento corporal que incluye meclizina o su sal farmacéuticamente aceptable como el ingrediente activo. [6] Una composición que promueve el crecimiento corporal que incluye el promotor del crecimiento corporal de [5]. [7] La composición que promueve el crecimiento corporal de [6], que es un medicamento, cuasi fármaco, o alimento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Fig. 1. La meclizina promueve la proliferación de condrocitos y rescata la pérdida de la matriz extracelular en las células de RCS tratadas con FGF2. (A) Las células de RCS fueron tratadas con 5 ng/ l de FGF2 y se añadieron concentraciones en aumento de meclizina durante 48 horas. El crecimiento celular se cuantificó usando ensayo de MTS. Los datos se presentan como la media y SD de 490-nm de absorbancia normalizado para aquellos sin meclizina (n = 8). La meclizina rescató la detención del crecimiento mediado por FGF2 de las células de RCS de una manera dependiente de la dosis. La meclizina mostró toxicidad ligera a 50 mM. (B) La meclizina rescató la alteración mediada por FGF2 de la forma celular y la pérdida de la matriz extracelular. Las células de RCS fueron tratadas con 5 ng/ml de FGF2 solo o en presencia de 0.2 mM de CNP o 20 pM de meclizina durante 72 horas, y la matriz de proteoglicano sulfatado tipo cartílago se tiñó con azul alcián en la columna derecha. Las células de RCS en crecimiento estaban redondeadas y produjeron matriz de proteoglicano sulfatado tipo cartílago en la ausencia de FGF2. Estos fenotipos condrocíticos se perdieron casi totalmente por el tratamiento con FGF2. En las células de RCS tratadas con FGF2 junto con CNP o meclizina, la forma celular permaneció de forma redonda y la intensidad de la tinción de azul alcián se aproximó a la de las células negativas a FGF2. (C) La meclizina inhibió la expresión de ARNm de la metaloproteinasas de la matriz en las células de RCS tratadas con FGF2. Las células fueron tratadas con FGF2 y ya sea CNP o meclizina durante cuatro horas, y los ARNms se cuantificaron por RT-PCR en tiempo real. Los niveles de expresión de Mmpl O, Mmpl3, y Adamtsl se presentan como la media y el SD normalizado para el de las células sin tratamiento de FGF2 (n = 3). Los aumentos de ARNm de Mmpl O, Mmpl3, y Adamtsl mediados por FGF2 se antagonizaron por CNP y meclizina.

Fig. 2. La meclizina rescatada anormalmente suprimió la proliferación de los condrocitos de HCS-2/8 infectados con lentivirus que expresa FGFR3-K650E y -K650M. (A) La proliferación de las células HCS-2/8 que expresaban ya sea FGFR3-WT (silvestre) o FGFR3-K650E (TD) se cuantificó usando ensayo de MTS a las 48 horas después de la plantación. El crecimiento de HCS-2/8 que expresa FGFR3-K650E fue significativamente menor que el de FGFR3-WT (p < 0.001). La media y el SD están trazados. (B) Las células HCS-2/8 que expresan ya sea FGFR3-K650E (TD) o FGFR3-K650M (SADDAN) se cultivaron con meclizina durante 48 horas y la proliferación se cuantificó por ensayo de MTS. Los datos se presentan como la media y SD normalizado para aquellos sin meclizina (n = 12). La meclizina inhibió la detención de crecimiento impulsada por los mutantes de TD y SADDAN. (C) Inhibición del crecimiento mediada por K650E visualizada por fluorescencia de Venus expresada por el lentivirus infectado también es rescatada por el CNP y la meclizina. Los paneles superiores muestran que la eficiencia de la transfección es superior al 90%. Tanto el CNP como la meclizina aumentaron las intensidades de la señal de Venus integrada. Los datos se presentan como la media y SD normalizado para el del vehículo (n = 3).

Fig. 3. La meclizina rescató la inhibición normal de la diferenciación de condrocitos de las células ATDC5 infectadas con lentivirus que expresa FGFR3-G380R (ACH) en el cultivo de micromasa. Las células de ATDC5 en el cultivo de micromasa se trataron con CNP o con meclizina durante seis dias y se tiñeron con azul alcián. Después de la tinción, las células fueron U sadas en 200 ml de HCl de guanidina 6M y la absorbancia 610-nm se cuantificó. Los datos se presentan como la media y SD (n = 6). El CNP y la meclizina aumentaron la tinción de azul alcián de las células ATDC5 que expresan FGFR3-G380R en cultivo de micromasa.

Fig. 4. La meclizina aumentó el largo longitudinal de las tibias embrionarias con o sin tratamiento con FGF2 en el cultivo de explante óseo. Las secciones de tibia fueron teñidas con hematoxilina-eosina y azul alcián en el dia 6 del cultivo de explante. Las tibias bilaterales del mismo individuo se muestran lado a lado. Los largos longitudinales óseos se normalizan al de la tibia colateral no tratada, y se indican la media y el SD. El FGF2 provoca la inhibición del crecimiento longitudinal. En presencia de FGF2, el CNP y la meclizina aumentaron significativamente el largo longitudinal de las tibias embrionarias. Incluso sin FGF2, la meclizina mejoró significativamente el crecimiento de las tibias embrionarias.

Fig. 5. La meclizina atenúa la fosforilación de ERK mediada por FGFR3 en las células de RCS tratadas con FGF2. (A) las células de RCS fueron pretratadas con meclizina durante 30 minutos antes de agregar 5 ng/ml de FGF2 y se determinaron los niveles de fosforilación de ERK y MEK por inmunoblot ( Western blot) . Como control de carga, las membranas fueron sondeadas nuevamente con anticuerpos contra MEK y ERK. La meclizina suprimió la fosforilación de ERK mediada por FGF2 pero no la fosforilación de MEK a los cinco minutos del tratamiento con FGF2. (B) las células de RCS fueron infectadas con lentivirus que expresa mutantes constitutivamente activos (ca) de ERK, MEK y RAF. Las células fueron tratadas con meclizina y sus potencias de proliferación se cuantificaron usando ensayo de MTS. La absorbancia 490-nm se normaliza para aquellas sin tratamiento de meclizina y se presentan la media y el SD (n = 3). La meclizina rescató la detención del crecimiento mediada por caMEK y caRAF pero no tuvo efecto alguno en la detención del crecimiento mediada por caERK.

Fig. 6. La transducción de la señal de FGFR3 en cartílago y mecanismos de inhibidores de FGFR3. La proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK) y las señales de los transductores de señal y los activadores de transcripción (STAT) regulan negativamente la proliferación y diferenciación de condrocitos. La señalización de MAPK incluye la estimulación secuencial de una cascada de señalización que involucra RAS, RAF, MEK y ERK. La unión de CNP a al receptor de péptido natriurético-B induce a la generación del segundo mensajero cGMP, el cual activa el PKG y conduce a la atenuación de la vía de MAPK mediante RAF. NF449 (Referencia 14), A31 (Referencia 16) y P3 (Referencia 15) son inhibidores de FGFR3 identificados recientemente. NF449 y A31 tienen efectos inhibitorios en la actividad de la quinasa FGFR3. P3 tiene una afinidad para el dominio extracelular de FGFR3. La meclizina suprime la fosforilación de ERK.

La Fig. 7 muestra el resultado de la prueba de administración de meclizina. La meclizina fue administrada internamente a una ratona normal embarazada desde el día 14 del embarazo, y se evaluaron la longitud corporal y la longitud de las extremidades del ratón neonatal en el día 5 después de su nacimiento.

La Fig. 8 muestra el resultado de la prueba de administración de meclizina. La meclizina fue administrada internamente a un ratón normal desde la semana 2 después de su nacimiento, y la longitud corporal y la longitud de las extremidades se evaluaron en la semana 5.

MODALIDAD DE LA INVENCIÓN Un primer aspecto de la presente invención se refiere a un agente terapéutico para displasia esquelética (en adelante puede referirse como "el medicamento de la presente invención", para conveniencia de explicación) y el uso del mismo. El "agente terapéutico" significa un medicamentoque muestra efecto terapéutico o profiláctico sobre el padecimiento objetivo o el estado del padecimiento. El efecto terapéutico incluye, por ejemplo, la mitigación (alivio) del síntoma o síntomas característicos que acompañan al padecimiento objetivo/estado del padecimiento, y la inhibición o retraso del agravamiento del síntoma. Este último puede considerarse como una especie de efecto profiláctico en cuanto a la prevención del agravamiento. Por lo tanto, el efecto terapéutico y el efecto profiláctico son conceptos que se superponen parcialmente, y distinguirlos claramente es difícil y poco beneficioso. El efecto profiláctico típico es la inhibición o el retraso de la repetición de los síntomas característicos del padecimiento objetivo/estado del padecimiento. Un fármaco funciona como un agente terapéutico para el padecimiento objetivo o estado del padecimiento siempre que muestre efecto terapéutico y/o efecto profiláctico sobre el padecimiento objetivo o estado del padecimiento.

La presente invención se basa en el resultado de la búsqueda de una nueva acción farmacológica de la meclizina, más específicamente, la actividad inhibidora de la señalización de FGFR3. El medicamento de la presente invención utiliza esta acción farmacológica, y se utiliza en el tratamiento o prevención de una displasia esquelética causada por la activación excesiva de FGFR3. Aunque no se desea estar limitado por ninguna teoría, el medicamento de la presente invención suprime o inhibe la activación excesiva (en otras palabras, la activación constante) del FGFR3, y por lo tanto logra un efecto de tratamiento. Como se muestra en los ejemplos descritos más adelante, se demostró que la meclizina muestra una inhibición de la actividad descendente de la cascada clásica de RAS/MAPK (transducción de señal de MEK a ERK) (Fig.6). Este hecho sugiere que la meclizina es un agente con alta especificidad y pocos efectos secundarios.

La "displasia esquelética" a tratar o prevenir no está particularmente limitada siempre que sea causada por la activación excesiva de FGFR3. En la presente descripción, "causada por la activación excesiva de FGFR3" significa que la activación excesiva de FGFR3 es principalmente o en parte la causa del padecimiento. Ejemplos de la "displasia esquelética" aplicable incluyen acondroplasia, hipocondroplasia, displasia tanatofórica, enfermedad de Crouzon, displasias acromesomélicas y acondroplasia severa con retraso de desarrollo y acantosis nigricans (SADDAN). De conformidad con una modalidad preferida, el medicamento de la presente invención se utiliza para el tratamiento o prevención de la acondroplasia o la hipocondroplasia. La acondroplasia es un padecimiento típico que muestra enanismo proximal de extremidades cortas, y sucede con mucha frecuencia. En la mayoría de los pacientes, se encuentra la mutación de G380R en FGFR3 en el brazo corto del cromosoma 4 (sustitución de la glicina en la posición 380 por arginina). Debido a la mutación, el FGFR3 se activa constantemente, y se inhiben el crecimiento y la diferenciación de los condrocitos. Como resultado, el crecimiento del hueso largo en una dirección longitudinal es marcadamente inhibido por la osificación endocondral. La hipocondroplasia es también es un padecimiento que muestra enanismo proximal de extremidades cortas. El gen causal de la hipocondroplasia también es FGFR3, y la mutación de N540K (sustitución de la asparagina en la posición 540 por ricina) se encuentra en aproximadamente la mitad de los pacientes. En la clasificación internacional de las displasias esqueléticas, la acondroplasia y la hipocondroplasia se clasifican en el mismo grupo.

El medicamento de la presente invención contiene meclizina o su sal farmacéuticamente aceptable como el ingrediente activo. La meclizina es un compuesto con un nombre de sustancia de 1-[(4-cloro-fenil)fenilmetil]-4-[(3- etilfenil)metil]piperazina, y es conocida como un antihistaminico. La meclizina se vende como un fármaco de venta libre (OTC por sus siglas en inglés) para la cinetosis. La meclizina puede ser referida como meclozina. En la presente descripción, los términos "meclizina" y "meclozina" son intercambiables.

El ingrediente activo del medicamento de la presente invención puede ser una sal farmacéuticamente aceptable de meclizina. Las preparaciones de meclizina disponibles comercialmente se encuentran principalmente bajo la forma de un clorhidrato de meclizina. Por lo tanto, los clorhidratos son los preferidos en la presente invención. Sin embargo, la "sal farmacéuticamente aceptable" no estará limitada a los mismos, y puede ser seleccionada de varias sales tales como sales de adición de ácido, sales metálicas, sales de amonio, sales de adición de aminas orgánicas y sales de adición de aminoácidos. Ejemplos de las sales de adición de ácidos incluyen sales de ácidos inorgánicos tales como clorhidratos, sulfatos, nitratos, fosfatos y bromhidratos, y sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, maleatos, fumaratos, citratos, bencenosulfonatos, benzoatos, malatos, oxalatos, etanosufonatos y tartratos. Ejemplos de las sales metálicas incluyen sales de metales alcalinos tales como sales de sodio, sales de potasio y sales de litio, sales metálicas de tierra alcalina tales como sales de magnesio y sales de calcio, sales de aluminio y sales de zinc. Ejemplos de las sales de amonio incluyen sales de amonio y tetrametilamonio. Ejemplos de las sales de adición de aminas orgánicas incluyen sales de adición de morfolina y sales de adición de piperidina. Ejemplos de las sales de adición de aminoácidos incluyen sales de adición de glicina, sales de adición de fenilalanina, sales de adición de U sina, sales de adición de ácido aspártico y sales de adición de ácido glutámico.

La formulación del fármaco de la presente invención puede utilizar un procedimiento común. Cuando se formula, pueden añadirse otros componentes que son aceptables para formulación (por ejemplo, un portador, excipiente, un agente desintegrante, un agente amortiguador, un agente emulsionante, un agente de suspensión, un agente calmante, un estabilizador, un conservador, un antiséptico y una solución salina normal). Ejemplos del excipiente incluyen lactosa, almidón, D-manitol, sorbitol y azúcar blanca. Ejemplos del agente desintegrante incluyen almidón carboximetil celulosa y carbonato de calcio. Ejemplos del agente tamponante incluyen fosfatos, citratos y acetatos. Ejemplos del agente emulsionante incluyen goma arábiga, alginato de sodio y tragacanto. Ejemplos del agente de suspensión incluyen monoestearato de glicerol, aluminio de ácido monoesteárico, metil celulosa, carboximetilcelulosa, hidroximetil celulosa y lauril sulfato de sodio. Ejemplos del agente calmante incluyen alcohol bencílico, clorobutanol y sorbitol. Ejemplos del estabilizador incluyen propilenglicol y ácido ascórbico. Ejemplos del conservador incluyen fenol, cloruro de benzalconio, alcohol bencílico, clorobutanol y metilparabeno. Ejemplos del antiséptico incluyen cloruro de benzalconio, ácido paraoxibenzoico y clorobutano.

La forma de la formulación no está particularmente limitada. Ejemplos de la forma incluyen comprimidos, un polvo, comprimidos finos, gránulos, cápsulas, un jarabe, una inyección, una preparación externa y un supositorio. El fármaco de la presente invención se administra al sujeto por vía oral o parenteral (por ejemplo, inyección intravenosa, intraarterial, hipodérmica, intradérmica, intramuscular o intraperitoneal, administración transdérmica, nasotraqueal o transmucosa). Las administraciones locales y sistémicas son utilizadas apropiadamente según el sujeto. Estas vías de administración no son excluyentes mutuamente y dos o más opcionalmente seleccionadas pueden ser combinadas (por ejemplo, la inyección intravenosa o similar se lleva a cabo simultáneamente con la administración oral o después de un lapso de un periodo predeterminado a partir de la terminación de la administración oral). El fármaco de la presente invención contiene un ingrediente activo en una cantidad necesaria para lograr el efecto terapéutico esperado (más específicamente una cantidad terapéuticamente eficaz). La cantidad de ingrediente activo en el fármaco de la presente invención depende generalmente de la forma del fármaco. Para lograr la dosis deseada, la cantidad del ingrediente activo es, por ejemplo, de aproximadamente 0.1% a 99% en peso.

La dosis del fármaco de la presente invención está establecida para lograr los efectos terapéuticos esperados. Para el establecimiento de la dosis terapéutica eficaz, en general se toman en consideración los síntomas, la edad, sexo y el peso corporal del paciente y otros factores. Los expertos en la materia pueden establecer una dosis adecuada tomando en consideración estos factores. Por ejemplo, la dosis para un adulto (peso corporal: aproximadamente 60 kg) puede establecerse de tal manera que la cantidad del ingrediente activo sea de 1 g a 500 mg al día, preferiblemente de 5 mg a 300 mg al día, más preferiblemente de 10 mg a 200 mg al día. El horario de administración puede ser, por ejemplo, de una vez a varias veces al día, una vez cada dos días o una vez cada tres días. Para la elaboración del horario de administración, pueden tomarse en consideración el estado del padecimiento del paciente y la duración esperada del efecto del ingrediente activo. Ejemplos del método de administración local incluyen el uso durante la cirugía, y la inyección en la ubicación deseada en la forma de un portador o cualquier forma apropiada con el fin de promover el proceso de curación.

El tratamiento con el fármaco de la presente invención puede llevarse a cabo en paralelo con el tratamiento con otros fármacos (por ejemplo, un fármaco terapéutico existente). Alternativamente, un procedimiento terapéutico existente puede combinarse con el tratamiento con el fármaco de la presente invención. El ejemplo de las terapias existentes es un tratamiento con la hormona del crecimiento. El ejemplo de los procedimientos terapéuticos existentes es la elongación ósea. La elongación ósea utiliza un dispositivo de fijación (del tipo de fijación interna o externa) o un dispositivo especial llamado, por ejemplo, un elongador óseo. El método de elongación ósea generalmente incluye los procesos de osteotomía, periodo de espera, período de elongación ósea y período de consolidación ósea. Los detalles sobre la elongación ósea se describen en, por ejemplo, ADVANCE SERIES II-9, Hone Enchojutsu Saikin Mo Shinpo (Bone Lengthening: Recent advance (Kokuseido Co. , Ltd. , supervisado por Kiyonorí Harií , editado por Tsuneki Sugihara).

Como es evidente de la explicación antes descrita, la presente solicitud también proporciona una terapia gue incluye la administración del medicamento de la presente invención a un paciente con una displasia esguelética causada por la activación excesiva de FGFR3 en una dosis farmacéuticamente eficaz.

Otro aspecto de la presente invención proporciona un promotor del crecimiento corporal que incluye meclizina o su sal farmacéuticamente aceptable como el ingrediente activo. Se usan las explicaciones correspondientes en el aspecto antes descrito a menos que se indique lo contrario.

El promotor del crecimiento corporal de la presente invención es aplicable a sujetos sanos, asi como a pacientes de baja estatura. Por ejemplo, la presente invención es aplicable al tratamiento o prevención del enanismo pituitario no acompañado por cierre epifisario, la baja estatura en el síndrome de Turner, la baja estatura en el síndrome de Prader-Willi, la baja estatura con deficiencia de la hormona del crecimiento (GHD por sus siglas en inglés),y la baja estatura del paciente pequeño para su edad gestacional (SGA por sus siglas en inglés). El promotor del crecimiento corporal de la presente invención puede ser proporcionado en forma de varias composiciones (por ejemplo, una composición farmacéutica, composición de cuasi fármaco, o composición alimenticia).

Cuando el promotor del crecimiento corporal de la presente invención se proporciona en forma de una composición farmacéutica o una composición de cuasi fármaco, su formulación, forma farmacéutica, vía de administración y dosis son las mismas que en el aspecto antes descrito. Por otro lado, cuando el promotor del crecimiento corporal de la presente invención se proporciona en forma de una composición alimenticia, por ejemplo, puede ser en forma de polvo, gránulos, pastillas, pasta o líquido de un suplemento alimenticio (por ejemplo, un suplemento o bebida nutricional). La forma de una composición alimenticia hace que sea fácil tomar rutinariamente o continuamente el promotor del crecimiento corporal de la presente invención. La composición alimenticia de la presente invención contiene preferiblemente un ingrediente activo en una cantidad terapéuticamente o profilácticamente eficaz. La carga se puede establecer teniendo en cuenta la condición del padecimiento, la condición de salud, la edad, el sexo y el peso corporal del sujeto.

Ejemplos La estrategia de reposicionamiento de fármaco, en la que un fármaco utilizado actualmente para los pacientes con un padecimiento especifico se aplica a otro padecimiento, ha ganado cada vez más atención tanto de las academias como de la industria en los últimos años (Referencia 20, 21). La ventaja de esta estrategia es que los fármacos identificados pueden aplicarse fácilmente a la práctica clínica, porque las dosis óptimas y los efectos adversos ya están establecidos. Aquí, seleccionamos 1,186 compuestos aprobados por la FDA para identificar un medicamento clínicamente aplicable que mejore la ACH/HCH y otras displasias esqueléticas relacionadas con FGFR3. 1. MATERIALES Y MÉTODOS (1) Selección de 1,186 compuestos aprobados por la FDA en células de condrosarcoma (RCS) de rata.

Las células de RCS, que fueron amablemente proporcionadas por el Dr. Pavel Krejci ( Medical Genetics Institute, Cedars-Sinai Medical Center, LA), se cultivaron en medio Eaqle modificado de Dulbecco (DMEM, Invitrogen) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS, Thermo Scientific) (Referencia 14). Para los ensayos de detección del crecimiento de RCS, ~5 c 103 células se sembraron en placas de cultivo de 96 pocilios (Falcon) y se incubaron durante 48 horas en la presencia de 10 mM de 1,186 compuestos químicos aprobados por la FDA ( Prestwick Chemical) y 5 ng/ml de FGF2 (R&D Systems). La proliferación celular se cuantificó por ensayo de MTS (Cell 96 AQueus One Solution Cell Proliferation Assay, Promega) según las instrucciones del fabricante. (2) Tinción de azul alcián Para la tinción de azul alcián, se agregaron células de RCS en crecimiento en placas de 12 pocilios con 5 ng/ml de FGF2 y también con ya sea 10 mM de meclizina o 0.2 mM de CNP ( Calbiochem ) . Después de 72 horas, las células se fijaron con metanol a -20°C durante 30 minutos, y se tiñeron toda la noche con 0.5% de azul alcián 8 GX (Sigma) en 1 N de HCl. Para los análisis cuantitativos, las células teñidas de azul alcián fueron U sadas en 200 ml de HC1 de guanidina 6M durante 6 horas a temperatura ambiente (Referencia 28). Se midió la densidad óptica del tinte extraído a 610 nm utilizando PowerScan 4 ( DS Pharma Biomedical) . (3) Extracción de ARN total y análisis de RT-PCR en tiempo real El ARN total fue aislado de las células de RCS tratadas con FGF2 en presencia de 20 mM de meclizina o 0.2 mM de CNP usando Trizol. La primera hebra del ADNc se sintetizó con ReverTra Ace (Toyobo). Cuantificamos la expresión del ARNm de las proteinasas de la ( Mmpl O, Mmpl3, y Adamtsl ) utilizando LightCycler 480 Real-Time PCR (Roche) y SYBR Green (Takara). Los niveles de ARNm se normalizaron a los de Gapdh. (4) Vectores y transfección celular Los vectores de pRK7-FGFR3-WT, -K650E y -K650M que expresan el FGFR3 salvaje y mutante (Referencia 29) fueron amablemente proporcionados por el Dr. Pavel Krejci ( Medical Genetics Institute , Cedars-Sinai Medical Center, LA). El pRK7-FGFR3-G380R fue construido por el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange ( Stratagene). Los ADNcs de FGFR3 salvajes y mutantes fueron suprimidos de los vectores de pRK7-FGFR3 por doble digestión con HindIII y Bamñl . Los fragmentos se clonaron en el vector de lentivirus, CSII-CMV-MCS-IRES2-Venus usando los sitios de NHEI y BamHI . CSII-CMV-MCS-IRES2-Venus fue amablemente proporcionado por el Dr. Hiroyuki Miyoshi ( Riken BioResource Center, Tsukuba, Japón). El sitio de HindIII de inserción y el sitio de NHEI del vector fueron mitigados utilizando Quick Blunting Kit ( New England Biolabs) antes de ligarlos. Las células de HEK293 fueron emplacadas en platos de 150 mm el dia anterior a la transíección. Introdujimos los plásmidos de pLPl, pLP2, pLP/VSVG ( ViraPower Packaging Mix, Invítrogen) , y el vector de CSII-CMV-MCS-IRES2-Venus en las células de HEK293 con Lipofectamine 2000 (Invítrogen) de conformidad con el protocolo del fabricante. A las 48 horas después de la transíección, filtramos el medio que contenía las partículas de virus utilizando los filtros PVDF de 0.45 pm Millex-HV ( Millex ) y el lentivirus purificado utilizando dos pasos de ultracentrifugación ( Beckman Coulter) . El lentivirus se añadió al medio de HCS-2/8 o células de ATDC5. Después de 48 horas, confirmamos que más del 90% de las células dieron positivo para las señales de Venus.

Los clones que expresaron mutantes activos constitutivamente en la vía de MAPK/ERK, pcDNA4Myc-ERK2 (PD), pcDNA3HA-MEKl(DD) y pcDNA3Flag-C-rafAN (Referencia 30), fueron proporcionados amablemente por el Dr. Mutsuhiro Takekawa ( Medical Science Institute, Universidad de Tokio, Japón). Las inserciones fueron digeridas con BamHI y Xhol, y fueron clonadas en CSII-CMV-MCS-IRES2-Venus en los sitios de BaHI después de mitigar todos los extremos digeridos. Las partículas de lentivirus fueron generadas como se describió anteriormente y se aplicaron a las células de RCS. (5) Ensayo de crecimiento de las células HCS-2/8 Las células HCS-2/8 (Referencia 31) fueron sembradas en placas de cultivo tisular de 96 pocilios. Las células HCS-2/8 fueron después infectadas con lentivirus que expresa ya sea FGFR3-WT,-K650E o - K650M. Después de 48 horas, se calculó el número de células por ensayo de MTS. Además, ~ 1 c 105células HCS-2/8 en una placa tisular de 12 pocilios fueron introducidas con lentivirus que expresa FGFR3-K650E. Después de 72 horas, la intensidad de la fluorescencia de la proteína de Venus se cuantificó mediante el lector ArrayScan VTI HCS { Thermo Scientific) . (6) Cultivo de Micromasa de células ATDC5 Células ATDC5 derivadas de carcinoma embrionario de ratón (Referencia 32) se infectaron con lentivirus que expresa ya sea FGFR3-WT o FGFR3-G380R. Las células infectadas de ATDC5 fueron sometidas a cultivos de micromasa como se describió anteriormente (Referencia 32). Brevemente, las células ATDC5 fueron suspendidas en medio de DMEM/F-12 (1:1) (Sig a) que contiene 5% de FBS a una densidad de 1 c 107 células/ml y emplacadas en gotas de 10-ml para simular las condensaciones condrogénicas de alta densidad. Después de incubación de 1 hora, el mismo medio suplementado con selenito de insulina-transferrina-sodio ¡ITS, Sigma) se añadió a las células. El medio fue cambiado cada dos dias hasta la cosecha el dia 6. (7) Cultivo de explante óseo Para el cultivo de explantes óseos, las tibias se disectaron bajo el microscopio de embriones de ratón silvestres en E16.5, se colocaron en placas de 96 pocilios, y se cultivaron en medio esencial a-mínimo (Invitrogen) suplementado con 0.2% de albúmina de suero bovino, 1 mM de b-glicerofosfato, and 50 mg/ml de ácido ascórbico. Las tibias embrionarias se trataron aún más con 100 ng/ml de FGF2 en presencia o ausencia de 20 mM de meclizina o 0.2 mM de CNP durante 6 días, después se fijaron en 10% de formaldehído en solución salina amortiguada con fosfato, se desmineralizaron con 0.5 M de EDTA y se integraron en parafina. Las secciones fueron teñidas con hematoxilina-eosina y azul alcián. Las imágenes fueron tomadas con el microscopio SZ61 (Olympus) equipado con la cámara digital XZ-1(Olympus). El largo longitudinal del hueso, que fue definido como la longitud entre el cartílago articular proximal y distal, se midió con ImageJ (N1H). (8) Inmunoblot ( Western Blot) y estudios de señalización Las células de RCS se trataron con 20 mM de meclizina durante 30 min antes de añadir 5 ng/ml de FGF2 (el "vehículo" no es ningún grupo de tratamiento). Después de 5 minutos, las células fueron U sadas en el amortiguador de lisis de RIPA (Santa Cruz) enfriado con hielo suplementado con inhibidores de proteinasa. Todos los U sados celulares fueron separados en SDS-PAGE y transferidos a una membrana de nitrocelulosa . Se determinaron los niveles de fosforilación de las moléculas en la vía de MAPK mediante inmunoblot usando los siguientes anticuerpos: ERK1/2, fosfo-ERKl/2(Thr202/ Tyr204), MEK1/2, y fosfo-MEKl/2(Ser217/221) (Señalización celular). (9) Administración interna de meclizina a ratón normal La meclizina fue administrada internamente a una ratona normal embarazada desde el día 14 del embarazo (2 mg de meclizina contenidos en 5g de alimento), y se evaluaron la longitud corporal y la longitud de las extremidades del ratón neonatal en el día 5 después de su nacimiento. Por otra parte, la meclizina fue administrada internamente a un ratón normal desde la semana 2 después de su nacimiento, y el ratón se evaluó de la misma manera en la semana 5. 2. RESULTADOS (1) La meclizina promueve la proliferación de condrocitos y rescata la pérdida de la matriz extracelular en las células de RCS tratadas con FGF2.

Debido a que las células condrociticas de RCS expresan altos niveles de FGFR3, la administración exógena de FGF2 recapitula fácilmente los procesos celulares que suceden en las displasias esqueléticas relacionadas con FGFR-3 (Referencia 22). Por lo tanto, añadimos 10 mM de 1,186 compuestos químicos aprobados por la FDA (Prestwick Chemical) junto con 5 ng/ml de FGF2 al medio de cultivo de RCS. La cuantificación de la proliferación de RCS por ensayo de MTS reveló que la meclizina inducida constantemente en 1.4-veces o más, aumenta en la proliferación de RCS. Además, 0, 1, 2, 5, 10, 20 y 50 mM de meclizina mostraron aumentos dependientes de la dosis en la proliferación de RCS, aunque la toxicidad celular fue evidente a 50 mM (Fig.1A).

A continuación comparamos el efecto de la meclizina con el del CNP (Referencia 6, 17) como un control positivo. Las células de RCS en crecimiento producen una gran cantidad de proteoglicanos sulfatados tipo cartílago, que pueden ser visualizados por la tinción de azul alcián. Los proteoglicanos de la matriz se pierden casi por completo a las 72 horas después de la adición de FGF2 debido a la inhibición de la producción de proteoglicanos así como a la inducción de la degradación mediada por la metaloproteinasa de matriz (Referencia 6). En las células tratadas con FGF2 junto con meclizina, se restauró la tinción con azul alcián así como las formas celulares redondas tipo condrocitos, las cuales fueron similares a las observadas en las células tratadas con CNP (Fig. IB). Las células de RCS tratadas con FGF2 durante cuatro horas aumentan las expresiones de MmplO, Mmpl3, y Adamtsl (Referencia 6). También confirmamos que FGF2 induce las expresiones de Mmpl O, Mmpl3, y Adamtsl en las células de RCS y encontramos que la meclizina y el CNP suprimieron significativamente las expresiones de estas metaloproteinasas de la matriz (Fig.1). Estos resultados sugieren que la meclizina rescata la pérdida de proteoglicanos de la matriz al reducir las expresiones de las metaloproteinasas de las matriz en las células de RCS tratadas con FGF2. (2) La meclizina rescata la proliferación suprimida anormalmente de los condrocitos de HCS-2/8 que expresan FGFR3-K650E y -K650M.

Después introdujimos lentivirus que portaban mutantes activados de FGFR3 (K650E en TD II y K650M en SADDAN) en células de condrosarcoma humano (HCS-2/8) para evaluar el efecto de la meclizina en la inhibición de la señalización de FGFR3 constitutivamente activa. El ensayo de MTS demostró que el HCS-2/8 que expresa K650E mostró proliferación celular significativamente suprimida (Fig. 2A). La meclizina (20 mM) rescató parcialmente pero significativamente la detención del crecimiento sin toxicidad celular aparente en HCS-2/8 que expresa tanto K650E como K650M (Fig.2B). Las intensidades integradas de las señales de Venus, las cuales representan las intensidades de señal multiplicadas por el número de células positivas a Venus, aumentaron significativamente en el HCS-2/8 que expresa K650E tratado con meclizina (Fig. 2C). (3) La meclizina rescata la diferenciación anormal inhibida de las células condrogénicas de ATDC5 que expresan FGFR3-G380R Las células de ATDC5 conservan la potencia para diferenciarse en condrocitos y se utilizan comúnmente para estudiar la condrogénesis in vitro (Referencia 15). Para determinar si la meclizina rescata la supresión de condrogénesis mediada por FGFR3 utante, añadimos 20 mM de meclizina al cultivo de micromasa de las células de ATDC5 que fueron infectadas con lentivirus que expresa FGFR3-G380R que provoca ACH. La tinción con azul alcián reveló burdamente reveló proteoglicanos sulfatados abundantes en las células de FGFR3 silvestres, mientras que la intensidad de tinción se redujo en las células de FGFR3-G380R. La adición de meclizina desde el principio de la inducción condrogénica invirtió significativamente el efecto inhibidor de FGFR3-G380R en la condrogénesis. El análisis cuantitativo de los glucosaminoglicanos sulfatados al medir la absorbancia 610 nm del U sado celular con HCl de guanidina demostró que la meclizina aumentó significativamente los niveles de glucosaminoglicanos en las células de FGFR3-G380R, lo que destacó las observaciones morfológicas con tinción de azul alcián (Fig. 3). Estos resultados sugieren que la meclizina rescata el efecto inhibidor del FGFR3 mutante sobre la diferenciación de condrocitos. (4) La meclizina aumenta el largo longitudinal de las tibias embrionarias con o sin tratamiento con FGF2 en el cultivo de explante óseo.

A continuación examinamos el efecto de la meclizina en la inhibición mediada por FGF2 del desarrollo de cartílago en el cultivo de órgano óseo usando rudimentos de extremidad aislados de la tibia embrionaria murina en desarrollo (Referencia 14). Añadimos CNP (0.2 mM) o meclizina (20 mM) junto con FGF2 (100 ng/ml) al medio de cultivo, y comparamos la longitud de las tibias tratadas con la de la tibia de control contralateral del mismo individuo. La adición de FGF2 inhibió el crecimiento longitudinal óseo y del cartílago, mientras que el CNP y la meclizina atenuaron considerablemente la inhibición del crecimiento mediada por FGF2 de las tibias embrionarias en el día 6 (Fig. 4). Es interesante hacer notar que la meclizina también aumentó la longitud de la tibia sin tratamiento de FGF2. (5) La meclizina atenúa la fosforilación de ERK en las células de RCS tratadas con FGF2.

Después examinamos los efectos de la meclizina sobre la señalización descendente de FGFR3 en las células de RCS tratadas con FGF2. Las células de RCS fueron pretratadas con meclizina durante 30 minutos antes de añadir FGF2, y se determinaron los niveles de fosforilación de ERK y MEK mediante inmunoblot. La fosforilación de ERK1/2 mediada por FGF2 fue atenuada por la meclizina, mientras la fosforilación de MEK1/2 se mantuvo sin cambios (Fig.5A) . Después introdujimos mutantes constitutivamente activos (ca) de ERK, MEK y RAF en células de RCS usando lentivirus y crecimiento celular cuantificado con ensayo de MTS. Como se previo, la meclizina rescató la inhibición del crecimiento mediada por caMEK y caRAF, mientras que la meclizina no tuvo efecto en la inhibición de crecimiento mediada por caERK (Fig. 5B). Ambos datos apuntan a una noción de que la meclizina no inhibe la fosforilación de ERK mediada por MEK fosforilado ni activa la(s) fosfatasa(s) para ERK fosforilado (Fig.6). (6) La meclizina aumenta la longitud corporal y la longitud de extremidades La meclizina se administró internamente a una ratona normal embarazada desde el día 14 del embarazo, y el ratón neonatal fue evaluado el dia 5 después de su nacimiento; se encontró aumento de la longitud corporal, de las extremidades superiores e inferiores en el grupo de administración de meclizina (Fig.7). Además, la meclizina fue administrada a un ratón normal 2 semanas después de su nacimiento y se evaluó a las 5 semanas después de su nacimiento; se encontró aumento de la longitud corporal y la longitud de la cola en el grupo de administración de meclizina (Fig.8).

DISCUSIÓN La estrategia de reposicionamiento de fármacos es un esfuerzo para identificar nuevas indicaciones para los fármacos existentes. Esta estrategia puede evitar potencialmente costos y tiempos asociados con las pruebas multi-etapas de los compuestos exitosos (Referencia 20, 23). Entre los 1,186 fármacos aprobados por la FDA que tienen propiedades farmacocinéticas favorables o validadas y perfiles toxicológicos, identificamos la meclizina como un novedoso inhibidor de la señalización de FGFR3, que puede ser aplicado potencialmente a la práctica clínica para la baja estatura de las displasias esqueléticas (ACH/HCH). La meclizina es un bloqueador de H1 de venta libre (OTC por sus siglas en inglés), que se ha utilizado con seguridad para la cinetosis durante más de 50 años. Debido a que ya se han establecido las dosis óptimas y los efectos adversos de la meclizina, se ha confirmado que la meclizina puede prescribirse fácilmente después de un efecto inhibidor del FGFR3 en una concentración adecuada para uso clínico.

Puesto que no hay ninguna terapia racional para ACH/HCH disponible hasta la fecha, el desarrollo de modalidades novedosas para suprimir la señalización FGFR3 se ha esperado desde hace tiempo. Krejci et al. seleccionó una biblioteca de 1,120 compuestos e identificó que el NF449 inhibe la señalización de FGFR3 en condrocitos de RCS, así como en cultivos de órganos óseos embrionarios tratados con FGF2. El NF449 es estructuralmente similar a la suramina y posee actividades inhibidoras de otras cinasas de tirosina además de FGFR3 (Referencia 14). Jonquoyet et al. identificó que un compuesto sintético de A31 es un inhibidor de la cinasa de tirosina FGFR3 por análisis in silico. Demostraron que A31 suprime la fosforilación constitutiva de FGFR3 y restaura el tamaño del fémur embrionario de ratones Fgfr3Y361c en el cultivo de órganos. Además, A31 potencializa la diferenciación de condrocitos en la placa de cultivo de Fgfr3Y361c/ + (Referencia 16). Jin et al. seleccionaron una biblioteca de fagos de 12-péptidos al azar y encontraron que P3 tiene una afinidad alta y específica para el dominio extracelular de FGFR3. Mostraron que P3 promueve la proliferación y diferenciación condrogénica de las células ATDC5 cultivadas, alivia el retraso en el crecimiento óseo en rudimentos óseos de ratones TD (ratones Fgfr3Neo_K644E/ +) y finalmente invierte la mortalidad neonatal de los ratones TD (Referencia 15). Estos novedosos inhibidores de cinasa de tirosina de FGFR3, sin embargo, pueden inhibir la cinasas de tirosina diferente de FGFR3 y pueden ejercer efectos tóxicos inesperados a los seres humanos. La meclizina también puede inhibir cinasas de tirosina inesperadas, pero podemos predecir que no habrá ningún otro efecto adverso evidente, ya que la meclizina se ha recetado con seguridad por más de 50 años.

El CNP es otro agente terapéutico para la acondroplasia. A los ratones deficientes de CNP se les indujo enanismo al estrechar la zona proliferativa e hipertrófica de las placas de crecimiento (Referencia 24). La pérdida de las mutaciones de función en NPR2 que codifica un receptor para el CNP es responsable de la displasia esquelética humana de extremidades cortas, displasia acromesomélica tipo Maroteaux (AMDM) (Referencia 25). Por el contrario, la sobrexpresión de CNP impidió el acortamiento de los huesos acondroplásicos inhibiendo la via de señalización de MAPK (Referencia 17). Yasoda, et al. demostraron que la administración continua de CNP mediante perfusión intravenosa normalizó con éxito el enanismo de los ratones Fgfr3RCH. Sin embargo, era necesario perfundir continuamente el CNP debido a su corta vida media (Referencia 18). Lorget et al. demostraron que un análogo de CNP, BMN111, tiene una vida plasmática prolongada debido a su resistencia a la digestión de endopeptidasa neutra, y es capaz de conducir a una recuperación significativa del crecimiento óseo en ratones Fgfr3Y361c/ + por administración subcutánea (Referencia 19). La meclizina mostró una actividad inhibidora similar en la señalización de FGFR3 en comparación con CNP en cultivo de explante óseo ex vivo asi como las células condrogénicas in vitro. Debido a que la meclizina se ha utilizado durante mucho tiempo en la práctica clínica para la cinetosis, esperamos que la meclizina pueda usarse como un sustituto de CNP y CNP análogo.

La vía de MAPK es una de las principales vías descendentes de la señalización de FGFR3 en la proliferación y diferenciación de los condrocitos. La activación sostenida de ERK en los condrocitos conduce a la proliferación disminuida, aumento de degradación de la matriz, forma celular alterada y diferenciación disminuida (Referencia 5, 6). El CNP inhibe la fosforilación de la quinasa RAF1 mediante la inhibición de PKGII (Referencia 6, 17). Hemos demostrado que la meclizina atenúa la fosforilación de ERK en los condrocitos. Gohil et al. reportaron que la meclizina tiene una actividad de fosforilación anti-oxidativa (OXPHOS por sus siglas en inglés) además de las propiedades anti-muscarínicas y anti- histaminicas (Referencia 26, 27). En su informe, la meclizina mostró actividades citoprotectoras contra lesión isquémica en el cerebro y el corazón. Debido a que otros fármacos con propiedades anti-histaminicas, anti-muscarínicas y anti-OXPHOS no mostraron inhibición de la señalización de FGFR3 en nuestros estudios, es poco probable que las acciones farmacológicas de la meclizina en la condrogénesis sean relevantes a sus propiedades anti-histaminicas, anti-muscarinicas o anti-OXPHOS.

En los estudios actuales, hemos demostrado que la meclizina rescata la detención del crecimiento, la pérdida de matriz extracelular, la dismorfologia de la forma celular y la degradación de la matriz de los condrocitos de RCS tratados con FGF2. La meclizina también rescató la proliferación y diferenciación deterioradas de células HCS y ATDC5 que expresan FGFR3 mutante. Además, la meclizina rescató la inhibición del crecimiento mediada por FGF2 en los rudimentos de extremidades. La meclizina es una modalidad terapéutica atractiva y viable para el tratamiento de ACH/HCH.

Por otro lado, el resultado del experimento animal admite que la meclizina tiene un efecto de extensión en la longitud corporal y las extremidades. Ante este hecho, la meclizina se considera efectiva también para el enanismo pituitario no acompañado por cierre epifisario, la baja estatura en el síndrome de Turner, la baja estatura en el síndrome de Prader-Willi, la baja estatura con deficiencia de la hormona del crecimiento (GHD por sus siglas en inglés),y la baja estatura del paciente pequeño para su edad gestacional (SGA por sus siglas en inglés).

APLICACIÓN INDUSTRIAL El agente terapéutico de la presente invención demuestra su eficacia por la novedosa acción de la meclizina o la supresión de la señalización de FGFR3. La meclizina se vende como un fármaco de libre venta (OTC) para la cinetosis que se ha utilizado con seguridad durante 50 años. Por lo tanto, su seguridad está establecida, incluyendo la dosis óptima, efectos secundarios y contraindicaciones. Este hecho es notablemente ventajoso en la aplicación clínica. Se espera que la presente invención se aplique a diversas displasias esqueléticas provocadas por la activación excesiva de FGFR3 tales como la acondroplasia, hipocondroplasia, displasia tanatofórica, enfermedad de Crouzon, displasias acromesomélicas y acondroplasia severa con retraso de desarrollo y acantosis nigricans (SADDAN).

La presente invención no se limitará a la descripción de las modalidades y ejemplos de la presente invención. Diversas modificaciones hechas fácilmente por los expertos en la materia también se incluyen en la presente invención, sin apartarse del alcance de las reivindicaciones. Todo el contenido de los artículos, publicaciones de patente no examinadas, y solicitudes de patente aquí especificadas se incorporan en este documento por referencia.

Referencias 1. Waller, D.K., Correa, A., Vo, T.., Wang, Y., Hobbs, C., Langlois, P.H., Pearson, K., Romitti, P.A., Shaw, G.M. y Hecht, J.T. (2008) The population-based prevalence of achondroplasía and thana tophoric dysplasia in selected regions of the US. Am J Med Genet A, 146A, 2385-2389. 2. Horton, W.A., Hall, J.G. y Hecht, J.T. (2007) Achondroplasía . Lancet, 370, 162-172. 3. Rousseau, F., Bonaventure, J., Legeai-Mallet, L., Pelet, A., Rozet, J.M., Maroteaux, P., Le Merrer, M. y Munnich, A. (1994) Mutations in the gene encoding fibroblast growth factor receptor-3 in achondroplasía . Nature, 371, 252-254. 4. Shiang, R., Thompson, L.M., Zhu, Y.Z., Church, D.M., Fielder, T.J., Bocian, M., Winokur, S.T. y Was uth, J.J. (1994) Muta tions in the transmembrane domain of FGFR3 cause the most common genetic form of dwarfism, achondroplasia . Cell, 78, 335-342. 5. Krejci, P., Bryja, V., Pachernik, J., Hampl, A., Pogue, R., Mekikian, P. y Wilcox, W.R. (2004) FGF2 inhibits proliferation and alters the cartilage-like phenotype of RCS cells. Exp. Cell Res . , 297, 152-164. 6. Krejci, P., Masri, B., Fontaine, V., Mekikian, P.B., Weis, M., Prats, H. y Wilcox, W.R. (2005) Interaction of fibroblast growth factor and C-natriuretic peptide signaling In regulation of chondrocyte proliferation and extracellular matrix homeostasis . J. Cell Sci . , 118, 5089- 5100. 7. Murakami, S., Balmes, G., McKinncy, S., Zhang, Z., Givol, D. y de Crombrugghe, B. (2004) Constitutive activation of MEK1 in chondrocytes causes Statl-independent achondroplasia-like dwarfism and rescues the Fgfr3-deficient mouse phenotype. Genes Dev. , 18, 290-305. 8. Prinos, P., Costa, T., Sommer, A., Kilpatrick, M.W. y Tsipouras, P. (1995) A common FGFR3 gene mutation in hypochondroplasia . Hum. Mol . Genet . , 4, 2097-2101. 9. Tavormina, P.L., Bellus, G.A., Webster, M.K., Bamshad, M.J., Fraley, A.E., Mclntosh, I., Szabo, J., Jiang, W., Jabs, E.W., Wilcox, W.R. et al. (1999) A novel skeletal dysplasia with developmental delay and acanthosis nigricans is caused by a Lys650Met mutation in the fibroblast growth factor receptor 3 gene. Am J Hum Genet , 64, 722-731. 10. Tavormina, P.L., Shiang, R., Thompson, L.M., Zhu, Y.Z., Wilkin, D.J., Lachman, R.S., Wilcox, W.R., Rimoin, D.L., Cohn, D.H. y Wasmuth, J.J. (1995) Thana tophoric dysplasia (types I and ID caused by distinct muta tions in fibroblast growth factor receptor 3. Nat . Genet . , 9, 321-328. 11. Toydemir, R.M., Brassington, A.E., Bayrak-Toydemir, P., Krakowiak, P.A., Jorde, L.B., Whitby, F.G., Longo, N., Viskochil, D.H., Carcy, J.C. y Bamshad, M.J. (2006) A novel muta tion in FGFR3 causes camptodactyly , tall s tature , and hearing loss (CATSHL) syndrome . Am J Hum Genet, 79, 935-941. 12. Beever, J.E., Smit, M.A., Meyers, S.N., Hadfield, T.S., Bottema, C., Albretsen, J. y Cockett, N.E. (2006) A single-base change in the tyrosine kinase II domain of ovine FGFR3 causes heredi tary chondrodysplasia in sheep. Anim . Genet . , 37, 66-71. 13. Horton, W.A., Hecht, J.T., Hood, O.J., Marshall, R.N., Moore, W.V. y Hollowell, J.G. (1992) Growth hormone therapy in achondroplasia . Am . J. Med. Genet . , 42, 667-670. 14. Krejci, P., Murakami, S., Prochazkova, J., Trantirek, L., Chlebova, K., Ouyang, Z., Aklian, A., Smutny, J., Bryja, V., Kozubik, A. et al. (2010) NF449 is a novel inhibitor of fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) sígnaling active in chondrocytes and múl tiple myeloma cells. J. Biol . Chem. , 285, 20644-20653. 15. Jin, M., Yu, Y., Qi, H., Xie, Y., Su, N., Wang, X., Tan, Q., Luo, F., Zhu, Y., Wang, Q. et al. (2012) A novel FGFR3-binding peptide inhibits FGFR3 sígnaling and reverses the lethal phenotype of mice mimicking human thanatophoric dysplasía . Hum. Mol . Genet., 21, 5443-5455. 16. Jonguoy, A., Mugniery, E., Benoist-Lasselin, C., Kaci, N., Le Corre, L., Barbault, F., Girará, A.L., Le Merrer, Y., Busca, P., Schibler, L. et al. (2012) A novel tyrosine kinase inhibitor restores chondrocyte differentiation and promotes bone growth in a gain-of-function Fgfr3 mouse model . Hum . Mol . Genet . , 21, 841-851. 17. Yasoda, A., Komatsu, Y., Chusho, H., Miyazawa, T., Ozasa, A., Miura, M., Kurihara, T., Rogi, T., Tanaka, S., Suda, M. et al. (2004) Overexpression of CNP in chondrocytes rescues achondroplasia through a MAPK-dependent pathway. Nat . Med. , 10, 80-86. 18. Yasoda, A., Kitamura, H., Fujii, T., Kondo, E., Murao, N., Miura, M., Kanamoto, N., Komatsu, Y., Arai, H. y Nakao, K. (2009) Systemic administration of C-type natriuretic peptide as a novel therapeutic strategy for skeletal dysplasias . Endocrinology , 150, 3138-3144. 19. Lorget, F., Kaci, N., Peng, J., Benoist- Lasselin, C., Mugniery, E., Oppeneer, T., Wendt, D.J., Bell, S.M., Bullens, S., Bunting, S. et al. (2012) Evaluation of the therapeutic potential of a CNP analog in a Fgfr3 mouse model recapitulatíng achondroplasia . Am J Hum Genet, 91, 1108-1114. 20. Abbott, A. (2002) Neurologists strike gold In drug screen effort . Nature, 417, 109. 21. Bían, Y., Masuda, A., Matsuura, T., Ito, M., Okushin, K., Engel, A.G. y Ohno, K. (2009) Fannie acid facilitates expression of the polypyrimidine tract binding protein and alleviates deleterious inclusión of CHRNA1 exon P3A due to an hnRNP H-disrupting mutation in congenital myasthenic syndrome . Hum . Mol . Genet . , 18, 1229-1237. 22. Dailcy, L., Laplantine, E., Priore, R. y Basilico, C. (2003) A network of transcriptional and signaling events is activated by FGF to induce chondrocyte growth arres t and differentiation . J. Cell Biol . , 161, 1053-1066. 23. Heemskerk, J., Tobin, A.J. y Bain, L.J. (2002) Teaching oíd drugs new tricks. Meeting of the Neurodegeneration Drug Screening Consortium , 7-8 Abril 2002, Washington, DC, EUA. Trends Neurosci . , 25, 494-496. 24. Chusho, H., Tamura, N., Ogawa, Y., Yasoda, A., Suda, M., Miyazawa, T., Nakamura, K., Nakao, K., Kurihara, T., Komatsu, Y. et al. (2001) Owarfism and early death in mice lacking C-type na triuretic peptide . Proc. Nati . Acad. Sci . U. S. A. , 98, 4016-4021. 25. Bartels, C.F., Bukulmez, H., Padayatti, P., Rhee, D.K., van Ravenswaaij-Arts, C., Pauli, R.M., Mundlos, S., Chitayat, D., Shih, L.Y., Al-Gazali, L.I. et al. (2004) M uta tions in the transmembrane natriuretic peptide receptor NPR-B impair skeletal growth and cause acromesomelic dysplasia , type Maroteaux . Am J Hum Genet, 75, 27-34. 26. Gohil, V.M., Sheth, S.A., Nilsson, R., Wojtovich, A.P., Lee, J.H., Perocchi, F., Chen, W., Clish, C.B., Ayata, C., Brookes, P.S. et al. (2010) Nutrient-sensi tized screening for drugs tha t shift energy metabolism from mitochondrial respira tion to glycolysis . Nat . Biotechnol . , 28, 249-255. 27. Gohil, V.M., Offner, N., Walker, J.A., Sheth, S.A., Fossale, E., Gusella, J.F., MacDonald, M.E., Neri, C. y Mootha, V.K. (2011) Meclizine is neuroprotective in models of Huntington 's disease. Hum . Mol . Genet . , 20, 294-300. 28. De Barí, C., Dell'Accio, F. y Luyten, F.P. (2001) Human periosteum-derived cells maintain phenotypic stabili ty and chondrogenic potential throughout expansión regardless of donor age. Arthritis Rheum . , 44, 85-95. 29. Krejci, P., Masri, B., Salazar, L., Farrington-Rock, C., Prats, H., Thompson, L.M. y Wilcox, W.R. (2007) Bisindolylmaleimide I suppresses fibroblast growth factor-mediated activation of Erk MAP kinase in chondrocytes by preventing Shp2 association with the Frs2 and Gabl adaptor proteins . J. Biol . Chem. , 282, 2929-2936. 30. Emrick, M.A., Hoofnagle, A.N., Miller, A.S., Ten Eyck, L.F. y Ahn, N.G. (2001) Constitutiva activation of ext racellular sígnal-regulated kinase 2 by synergístic point mutations . J. Biol . Chem. , 276, 46469-46479. 31. Takigawa, M., Tajima, K., Pan, H.O., Enomoto, M., Kinoshita, A., Suzuki, F., Takano, Y. e Morí, Y. (1989) Establishment of a clonal human chondrosarcoma cell Une with cartilage phenotypes . Cáncer Res . , 49, 3996-4002. 32. Atsumi, T., Miwa, Y., Kimata, K. e Ikawa, Y. (1990) A chondrogenic cell Une derived from a diff rentiating culture of AT805 teratocarcinoma cells . Cell Differ. Dev. , 30, 109-116. 33. Hoogendam, J., Parlevliet, E., Miclea, R., Lowik, C.W., Wit, J.M. y Karperien, M. (2006) Novel early target genes of parathyroid hormone-related peptide in chondrocytes . Endocrinology, 147, 3141-3152.

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Un agente terapéutico para una displasia esquelética causada por la activación excesiva del receptor de factor de crecimiento fibroblástico 3 (FGFR3), el agente terapéutico comprende eclizina o su sal farmacéuticamente aceptable como un ingrediente activo.

2. El agente terapéutico de conformidad con la reivindicación 1, en donde la displasia esquelética es un padecimiento seleccionado del grupo que consiste de acondroplasia, hipocondroplasia, displasia tanatofórica, enfermedad de Crouzon, displasias acromesomélicas y acondroplasia severa con retraso de desarrollo y acantosis nigricans (SADDAN).

3. El agente terapéutico de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, en donde el ingrediente activo es clorhidrato de meclizina.

4. Una terapia para una displasia esquelética, que comprende la administración de meclizina o su sal farmacéuticamente aceptable a un paciente con una displasia esquelética causada por la activación excesiva del receptor de factor de crecimiento fibroblástico 3 (FGFR3) en una dosis farmacéuticamente eficaz.

5. Un promotor del crecimiento corporal que comprende meclizina o su sal farmacéuticamente aceptable como un ingrediente activo.

6. Una composición que promueve el crecimiento corporal que comprende el promotor del crecimiento corporal de la reivindicación 5.

7. La composición que promueve el crecimiento corporal de la reivindicación 6, que es un medicamento, cuasi fármaco, o alimento.