KR101406956B1 - Ｆｇｆ 억제제로서의 피리미디닐 아릴 우레아 유도체 - Google Patents

Ｆｇｆ 억제제로서의 피리미디닐 아릴 우레아 유도체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하기 화학식 IA의 헤테로아릴 아릴 우레아; 단백질 키나제 의존성 질환의 치료에서의 상기 화합물의 용도; 상기 헤테로아릴 아릴 우레아를 포함하는 제약 제제; 상기 신규 화합물의 제조 방법; 및 상기 헤테로아릴 아릴 우레아를 사용하는 것을 포함하는 치료 방법에 관한 것이다.
<화학식 IA>
Figure 112008052214826-pct00115
식 중, 라디칼 및 기호는 본원에 정의된 의미를 갖는다.
피리미디닐 아릴 우레아 유도체, 단백질 키나제 의존성 질환

Description

ＦＧＦ 억제제로서의 피리미디닐 아릴 우레아 유도체 {PYRIMIDINYL ARYL UREA DERIVATIVES BEING FGF INHIBITORS}
<발명의 요약>
본 발명은 신규 화합물, 제제, 방법 및 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 신규 헤테로아릴 아릴 우레아, 및/또는 단백질 키나제 의존성 질환의 치료에서, 또는 단백질 키나제 의존성 질환의 치료에 유용한 제약 제제의 제조에서 헤테로아릴 아릴 우레아로 기술될 수 있는 화합물의 용도 또는 이 화합물의 사용을 포함하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 질환의 치료에서 상기 화합물의 사용 방법, 헤테로아릴 아릴 우레아를 포함하는 제약 제제, 및 상기 신규 헤테로아릴 아릴 우레아의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 하기 개시된 여타 사항에 관한 것이다.
단백질 키나제 (PK)는, 세포 단백질에서 특정한 세린, 트레오닌 또는 티로신 잔기의 인산화에 대해 촉매 작용을 하는 효소이다. 기질 단백질의 번역후 변형은 세포 증식, 활성화 및/또는 분화를 조절하는 분자 스위치로서 작용한다. 비정상적이거나 과도한 PK 활성은 양성 및 악성 증식성 장애를 비롯한 여러 질환 상태에서 관찰되었다. 수많은 경우에서, 시험관 내 및 수많은 경우에 생체 내에서 PK 억제 제를 사용함으로써 증식성 장애와 같은 질환을 치료할 수 있었다.
키나제는 크게 두 부류, 즉 세린 및 트레오닌 인산화에 대해 특이적인 키나제, 및 티로신 인산화에 대해 특이적인 키나제로 구분된다. 또한, 특정 키나제 ("이중 특이성" 키나제로 지칭됨)는 세린/트레오닌 잔기 뿐만 아니라 티로신 잔기도 인산화시킬 수 있다.
또한, 단백질 키나제는 세포 내에서의 그의 위치를 특징으로 할 수 있다. 특정 키나제는 외부의 리간드를 세포 막에 결합시킬 수 있는 막횡단 수용체 단백질이다. 리간드가 결합되면 수용체 단백질 키나제의 촉매적 활성이 변경된다. 다른 단백질 키나제로는 막횡단 도메인이 없는 비-수용체 단백질이 있고, 또다른 단백질 키나제로는 막횡단 단백질의 세포외 (엑토 (ecto)) 부분 상에 촉매 도메인을 갖거나, 가용성 세포외 단백질로서 분비되는 엑토-키나제가 있다.
수많은 키나제는 조절 캐스케이드에 관여하고, 이들의 기질은 인산화 상태에 의해 활성이 조절되는 다른 키나제를 포함할 수 있다. 따라서, 하향 이펙터의 활성은 경로 활성화로 인한 인산화에 의해 조절된다.
수용체 단백질 티로신 키나제 (RPTK)는 고유의 리간드-자극성 티로신 키나제 활성을 갖는 막횡단-걸침 (transmembrane-spanning) 수용체의 아류이다. RPTK 활성은 정밀하게 제어된다. RPTK는 돌연변이되거나 구조적으로 변형되는 경우에 강력한 종양단백질이 될 수 있고, 이는 세포 형질전환 또는 적어도 탈조절화를 초래한다. 원칙적으로, 암에 관여하는 모든 RPTK의 경우, 발암성 (oncogenic) 탈조절화는 촉매 도메인의 정상적인 억제를 보장하는 자가제어 메카니즘들 중 하나 이상 의 감소 또는 불안으로부터 발생한다. 알려져 있는 RPTK 중 절반 이상은 인간 악성 종양 (산발성인 경우 포함; 문헌 [Blume-Jensen et al., Nature 411: 355-365 (2001)])과 관련된 돌연변이 또는 과발현 형태에서 반복적으로 발견되었다.
RPTK가 과발현되면 이량체의 농도가 증가됨으로써 구성적 키나제 활성화가 이루어진다. Neu/ErbB2 및 상피세포 성장 인자 수용체 (EGFR) (유방 및 폐 암종에서 종종 증폭됨), 및 골격 및 증식성 장애와 관련된 섬유모세포 성장 인자 수용체 (FGFR) (문헌 [Blume-Jensen et al., 2001])가 그 예이다.
맥관형성 (angiogenesis)이란, 기존의 혈관으로부터 새로운 모세관이 형성되는 메카니즘이다. 필요한 경우, 혈관계는 조직 및 기관의 적절한 기능을 유지하기 위해 새로운 모세관 네트워크 (network)를 생성할 수 있는 가능성을 갖는다. 그러나, 성인의 경우, 맥관형성은 상당히 제한되며, 상처 치유, 및 월경 동안 자궁내막의 혈관신생 (neovascularization)의 과정에서만 발생한다. 문헌 [Merenmies et al., Cell Growth ＆ Differentiation, 8, 3-10 (1997)]을 참조한다. 한편, 원하지 않는 맥관형성은 여러 질환, 예를 들어 망막병증, 건선, 류마티스성 관절염, 노화-관련 황반 변성 (AMD) 및 암 (고형 종양)의 특징이다 (문헌 [Folkman, Nature Med., 1, 27-31 (1995)]). 맥관형성 과정에 관여하는 것으로 밝혀진 단백질 키나제에는 성장 인자 수용체 티로신 키나제 군의 세 구성원, 즉 VEGF-R2 (혈관 내피세포 성장 인자 수용체 2; KDR (키나제 삽입 도메인 수용체) 및 FLK-1로도 알려져 있음); FGF-R (섬유모세포 성장 인자 수용체); 및 TEK (Tie-2로도 알려져 있음)가 포함된다.
TEK (Tie-2로도 알려져 있음)는, 맥관형성에 참여하는 것으로 밝혀진 내피 세포 상에서만 발현되는 수용체 티로신 키나제이다. 안지오포이에틴-1 인자가 결합되면, 키나제 도메인이 자가인산화되고, 내피 세포와 내피세포 주위 지지 세포의 상호작용을 매개하는 것으로 판단되는 신호 전달 과정이 수행되며, 이로써 새롭게 형성된 혈관의 성숙이 촉진된다. 한편, 안지오포이에틴-2 인자는 TEK에 대한 안지오포이에틴-1의 작용에 대해 길항 작용을 하는 것으로 판단되며, 상기 인자는 맥관형성을 붕괴시킨다 (문헌 [Maisonpierre et al., Science, 277, 55-60 (1997)]).
Ad-ExTek (Tie-2의 가용성 아데노바이러스 발현 세포외 도메인)의 투여는, 종양 전이의 임상 관련 마우스 모델에서 원발성 종양의 외과적 제거시에 전달되면 종양 전이를 억제하였다 (문헌 [Lin et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 8829-8834 (1998)]). ExTek에 의한 Tie-2 기능의 억제는, 안지오포이에틴 리간드의 격리 및/또는 천연 (native) Tie-2 수용체에 의한 헤테로이량체화의 결과일 수 있다. 상기 연구는, Tie-2 신호 전달 경로의 붕괴가 (1) 건강한 유기체에서 잘 용인될 수 있고 (2) 치료적 이점을 제공할 수 있음을 입증한다.
필라델피아 (Philadelphia) 염색체는 만성 골수성 백혈병 (CML)의 특징이며, bcr 유전자의 N-말단 엑손 및 c-abl 유전자의 주요 C-말단 부분 (엑손 2-11)을 함유하는 하이브리드 유전자를 갖는다. 유전자 생성물은 210 kD 단백질 (p210 Bcr-Abl)이다. Bcr-Abl 단백질의 Abl 부분은, 야생형 c-abl에서는 엄격하게 조절되나 Bcr-Abl 융합 단백질에서는 구성적으로 활성화되는 abl-티로신 키나제를 함유한다. 이러한 탈조절화 티로신 키나제는 세포의 형질전환 및 탈조절화 증식을 유도하는 다수의 세포 신호전달 경로와 상호작용한다 (문헌 [Lugo et al., Science 247, 1079 [1990]]).
또한, Bcr-Abl 단백질의 돌연변이 형태가 확인되었다. Bcr-Abl 돌연변이 형태에 대한 상세한 검토가 공개되었다 (문헌 [Cowan-Jones et al., Mini Reviews in Medicinal Chemistry, 2004, 4 285-299]).
EphB4 (HTK로도 명명됨) 및 그의 리간드인 에프린B2 (HTKL)는 혈관망의 구축 및 결정에서 중요한 역할을 수행한다. 정맥 상피에서는 EphB4가 특이적으로 발현되지만, 초기 혈관 생성 단계 동안에는 에프린B2가 동맥 상피 세포에서 특이적이고 상호적으로 발현된다. 기능이상 유전자는 마우스에서 배아의 사멸을 일으키고, 결함이 있는 에프린B2 및 EphB4의 경우에 배아는 모세혈관 연결부 형성시 동일한 결함을 나타낸다. 상기 에프린B2 및 EpHB4는 배아형성 동안 조혈 및 혈관 발생의 첫번째 부위에서 발현된다. 적합한 조혈, 내피, 혈관모세포 및 원시 중배엽의 발생을 위한 본질적 역할은 확립되어 있다. EphB4 결핍은 배아 줄기 세포의 변형된 중배엽 분화 결과를 초래한다. 유선 조직에서의 EphB4의 이소성 (ectopic) 발현은 흐트러진 구조, 비정상적인 조직 기능 및 악성 종양에 대한 소인을 초래한다 (예를 들어, 문헌 [N. Munarini et al., J. Cell. Sci. 115, 25-37 (2002)] 참조). 상기 및 또다른 데이타로부터, 부적절한 EphB4 발현이 악성 종양의 형성에 관여하며, 이에 따라 EphB4의 억제가 악성 종양, 예를 들어 암 등의 퇴치 도구인 것으로 예상될 수 있다는 결론에 도달하였다.
c-Src (p60 c-Src로도 알려져 있음)는 세포질성 (cytosolic) 비-수용체 티로 신 키나제이다. c-Src는, 상피세포 성장 인자 (EGF) 및 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF)와 같은 수많은 폴리펩티드 성장 인자로부터의 미토겐 신호 전달에 관여한다. c-Src는 유두암, 췌장암, 신경모세포종 등에서 과발현된다. 돌연변이 c-Src는 인간 대장암에서 확인되었다. c-Src는, 세포외 매트릭스와 세포질 액틴 세포골격 사이의 누화 (cross-talk)의 조절에 관여하는 수많은 단백질을 인산화시킨다. cSrc 활성의 조절은 세포 증식, 분화 및 사멸과 관련된 질환에 관여할 수 있었다 (문헌 [Bjorge, J. D. et al. (2000) Ongogene 19(49):5620-5635]; [Halpern, M. S. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93(2), 824-7]; [Belsches, A. P. et al. (1997) Frontiers in Bioscience [Electronic Publication] 2:D501-D518]; [Zhan, X. et al. (2001) Chemical Reviews 101:2477-2496]; [Haskell, M. D. et al. (2001) Chemical Reviews 101:2425-2440] 참조).
fms-유사 티로신 키나제 3 (FLT3) 수용체 티로신 키나제는 골수성 및 특정 림프구성 백혈병의 발병에 있어서 중요한 매개체로 인식되고 있다. 백혈병 세포 상에서 FLT3 리간드에 의해 FLT3이 활성화되면, 수용체 이량체화 및 경로에서의 신호 전달이 발생함에 따라 세포 성장이 촉진되고 아팝토시스 (apoptosis)가 억제된다 (문헌 [Blood, Vol. 98, No. 3, pp.885-887 (2001)]).
AML 치료를 위한 티로신 키나제 억제제를 사용한다면 키나제 촉매 도메인에서 돌연변이가 발생한다는 점이 장애가 되며, BCR-ABL의 경우에 이들 돌연변이는 이마티니브에 대한 내성을 부여한다.
FLT3은 AML 및 특정 경우의 급성 림프구성 백혈병에서 광범위하게 발현된다. FLT3에서의 활성화 돌연변이는 AML 환자에서 불안한 위험을 부여한다. 따라서, FLT3은 치료적 개입을 위한 유망한 표적이다.
혈소판-유래 성장 인자 수용체 (PDGFR) 티로신 키나제는 수많은 종양, 예를 들어 소세포 폐암, 전립선 암 및 교모세포종, 및 수많은 종양의 지질 (stromal) 및 혈관 구획에서 발현된다. PDGF 및 PDGF 수용체 (PDGFR)의 발현은 췌장암에서 관찰되었다 (문헌 [Ebert M et al., Int J Cancer, 62:529-535 (1995]).
Raf 세린/트레오닌 키나제는, 외부 세포 자극에 반응하여 복합적인 전사 프로그램을 제어하는 Ras/미토겐-활성화 단백질 키나제 (MAPK) 신호 전달 모듈의 필수적인 요소이다. Raf 유전자는 ras 종양유전자에 결합하는 것으로 알려진 고보존성 세린-트레오닌-특이적 단백질 키나제를 코딩한다. 이들은 수용체 티로신 키나제, p21 ras, Raf 단백질 키나제, Mek1 (ERK 활성화제 또는 MAPKK) 키나제 및 ERK (MAPK) 키나제 (최종적으로 전사 인자들을 인산화시킴)로 구성되는 것으로 판단되는 신호 전달 경로의 일부를 형성한다. 상기 경로에서, Raf 키나제는 Ras에 의해 활성화되어 2종의 미토겐-활성화 단백질 키나제 키나제 (Mek1 및 Mek2로 지칭됨) 동형체 (isoform)를 인산화 및 활성화시키며, 이들은 2중 특이성 트레오닌/티로신 키나제이다. 두 Mek 동형체는 미토겐 활성화 키나제 1 및 2 (MAPK; 세포외 리간드 조절 키나제 1 및 2, 또는 Erk1 및 Erk2로도 지칭됨)를 활성화시킨다. MAPK는 전사 인자를 비롯한 수많은 기질을 인산화시키고, 인산화시에 그의 전사 프로그램을 설정한다. Raf 키나제의 Ras/MAPK 경로 참여는 증식, 분화, 생존, 발암성 형질전환 및 아팝토시스와 같은 수많은 세포 기능에 영향을 미치며 이러한 세포 기능을 조절한다.
수많은 신호 전달 경로에서 Raf의 본질적인 역할 및 위치는, 포유동물 세포에서의 탈조절화 및 우성 억제 Raf 돌연변이를 이용한 연구, 및 생화학 및 유전공학적 기술 모델 유기체를 이용한 연구로부터 입증되었다. 수많은 경우에서, 세포 티로신 인산화를 자극하는 수용체에 의한 Raf 활성화는 Ras 활성에 좌우되며, 이는 Ras가 Raf의 상류로 기능함을 나타낸다. 활성화시에 Raf-1는 Mek1를 인산화 및 활성화시키고, 이에 따라 하향 이펙터, 예를 들어 MAPK (미토겐-활성화 단백질 키나제)에 대한 신호가 전파된다 (문헌 [Crews et al. (1993) Cell 74:215]). Raf 세린/트레오닌 키나제는 동물 세포 증식에 관여하는 주요 Ras 이펙터인 것으로 판단된다 (문헌 [Avruch et al. (1994) Trends Biochem. Sci. 19:279]).
Raf 키나제는 3종의 개별 동형체, 즉 Raf-1 (c-Raf), A-Raf 및 B-Raf를 가지며, Ras와 상호작용하여 MAPK 키나제 경로, 조직 분배 및 세포내 위치 결정 (sub-cellular localization)을 활성화시킬 수 있는 능력에 따라 구분된다 (문헌 [Marias et al., Biochem. J. 351: 289-305, 2000]; [Weber et. al., Oncogene 19:169-176, 2000]; [Pritchard et al., Mol. Cell. Biol. 15:6430-6442, 1995]).
최근 연구 결과, 피부 모반에서의 B-Raf 돌연변이는 멜라닌세포성 신생물의 개시에 있어서 중요한 단계인 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Pollock et. al., Nature Genetics 25: 1-2, 2002]). 또한, 가장 최근 연구에 따르면, B-Raf의 키나제 도메인에서의 활성화 돌연변이가 흑색종의 약 66％, 대장 암종의 12％ 및 간암의 14％에서 나타나는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Davies et. al., Nature 417:949-954, 2002]) (문헌 [Yuen et. al., Cancer Research 62:6451-6455, 2002]) (문헌 [Brose et. al., Cancer Research 62:6997-7000, 2002]).
Raf 키나제 수준에서의 Raf/MEK/ERK 경로 억제제는 과발현되거나 돌연변이된 수용체 티로신 키나제와 관련된 종양, 활성화 세포내 티로신 키나제와 관련된 종양, 비정상적으로 발현된 Grb2 (Sos 교환 인자에 의해 Ras의 자극을 가능하게 하는 어댑터 (adapter) 단백질)와 관련된 종양, 및 Raf 자체의 활성화 돌연변이를 함유하는 종양에 대한 치료제로서 잠재적으로 유효할 수 있다. 초기 임상 기록에서, Raf-1 키나제의 억제제 (B-Raf도 억제함)는 항암 요법의 치료제로서의 가능성을 나타냈다 (문헌 [Crump, Current Pharmaceutical Design 8: 2243-2248, 2002]; [Sebastien et. al., Current Pharmaceutical Design 8: 2249-2253, 2002]).
RNA 안티센스 기술의 적용을 통해 세포주에서의 Raf 발현을 붕괴시키면 Ras 및 Raf-매개 종양형성이 억제되는 것으로 나타났다 (문헌 [Kolch et al., Nature 349:416-428, 1991]; [Monia et al., Nature Medicine 2(6):668-675, 1996]).
섬유모세포 성장 인자
조직의 회복 및 리모델링 뿐만 아니라 정상적인 성장에서도 활성화 성장 인자 및 이들의 수용체의 특이적이고 섬세한 제어가 요구된다. 섬유모세포 성장 인자 (FGF)는, 발전적으로 조절되고 각종 조직에서 발현되는, 20종이 넘는 구조적으로 관련된 폴리펩티드들의 군을 구성한다. FGF는 증식, 세포 이동 및 분화를 자극하고, 골격 및 사지 발달, 상처 치유, 조직 회복, 조혈, 맥관형성 및 종양발생에서 주요한 역할을 한다 (문헌 [Ornitz, Novartis Found Svmp 232: 63-76; discussion 76-80, 272-82 (2001)]에서 검토됨).
FGF의 생물학적 작용은 RPTK 군의 단백질 키나제에 속하는 특이적 세포 표면 수용체에 의해 매개된다. 이러한 단백질은 세포외 리간드 결합 도메인, 단일 막횡단 도메인 및 세포내 티로신 키나제 도메인 (FGF 결합시 인산화됨)으로 구성된다. 지금까지 4종의 FGFR, 즉 FGFR1 (Flg, fms-유사 유전자, flt-2, bFGFR, N-bFGFR 또는 Cek1로도 지칭됨), FGFR2 (Bek-박테리아 발현 키나제, KGFR, Ksam, Ksaml 또는 Cek3으로도 지칭됨), FGFR3 (Cek2로도 지칭됨) 및 FGFR4가 확인되었다. 모든 성숙 FGFR은 아미노 말단 신호 펩티드, 3종의 세포외 면역글로불린-유사 도메인 (Ig 도메인 I, Ig 도메인 II, Ig 도메인 III)과 함께, Ig 도메인들 사이의 산성 영역 ("산성 박스" 도메인), 막횡단 도메인 및 세포내 키나제 도메인으로 이루어진 공통의 구조를 공유한다 (문헌 [Ullrich and Schlessinger, Cell 61: 203,1990]; [Johnson and Williams (1992) Adv. Cancer Res. 60: 1-41]). 개별 FGFR 동형체들은 상이한 FGF 리간드에 대해 상이한 결합 친화성을 가지며, 따라서 FGF8 (안드로겐-유도 성장 인자) 및 FGF9 (글리알 활성화 인자)가 FGFR3에 대한 증가된 선택성을 갖는 것으로 판단된다 (문헌 [Chellaiah et al., J Biol. Chem 1994; 269: 11620]).
세포 표면 결합 부위의 또다른 주요 군에는 헤파란 술페이트프로테오글리칸 (HSPG)에 대한 결합 부위가 포함되고, 이는 FGF 군의 모든 구성원의 고친화성 상호작용 및 활성화를 위해 필요하다. 헤파란 술페이트 구조 변형체의 조직-특이적 발현은 FGF의 리간드-수용체 특이성 및 활성을 부여한다.
FGFR-관련 질환
최근 연구에 따르면, 그 수가 증가하고 있는 골격 이상 (인간 왜소증의 가장 통상적인 형태인 연골무형성증 포함)은 FGFR에서의 돌연변이로 인한 것으로 나타난다.
FGF-R1, FGF-R2 및 FGF-R3의 다양한 도메인에서의 특정 지점 돌연변이는 두개골조기유합 증후군 및 왜소 증후군으로 분류되는 상염색체 우성 인간 골격 이형성증과 관련된다 (문헌 [Coumoul and Deng, Birth Defects Research 69: 286-304 (2003)]). FGF-R3 돌연변이-관련 골격 이형성증에는 연골저형성증, 발달 지체 및 흑색극세포증 (acanthosis nigricans)을 수반하는 중증 연골무형성증 (SADDAN), 및 치사성 (thanatophoric) 이형성증 (TD)이 포함된다 (문헌 [Webster et al., Trends Genetics 13 (5): 178-182 (1997)]; [Tavormina et al., Am. J. Hum. Genet., 64: 722-731 (1999)]). FGFR3 돌연변이는 2종의 두개골조기유합증 표현형, 즉 뮌케 (Muenke) 관상 두개골조기유합증 (문헌 [Bellus et al., Nature Genetics, 14: 174-176 (1996)]; [Muenke et al., Am. J. Hum. Genet., 60: 555-564 (1997)]) 및 흑색극세포증을 수반하는 크루존 증후군 (Crouzon syndrome) (문헌 [Meyers et al., Nature Genetics, 11 : 462-464 (1995)])으로도 기술되었다. 크루존 증후군은 FGFR2에서의 특정 지점 돌연변이와 연관되고, 가족성 및 산발성 형태의 파이퍼 증후군 (Pfeiffer syndrome)은 FGFR1 및 FGFR2에서의 돌연변이와 연관된다 (문헌 [Galvin et al., PNAS USA, 93: 7894-7899 (1996)]; [Schell et al., Hum Mol Gen, 4: 323-328 (1995)]). FGFR에서 돌연변이가 발생하면, 돌연변이된 수용체의 구성적 활성화가 이루어지고 수용체 단백질 티로신 키나제 활성이 증가되어, 세포 및 조직이 분화할 수 없게 된다.
구체적으로, 연골무형성증 돌연변이는 돌연변이된 수용체의 안정성을 증진시키고, 이에 따라 하향-조절로부터 수용체 활성화가 분리됨으로써 연골세포 성숙이 억제되고 골 성장이 억제된다 (문헌 [Vajo et al., Endocrine Reviews, 21(1): 23-39 (2000)]에서 검토됨).
각종 유형의 암에서 FGFR3을 활성화시키는 돌연변이에 대한 축적된 증거가 있다.
2종의 통상적인 상피 암, 즉 방광암 및 자궁경부암, 및 다발성 골수종에서 구성적으로 활성화된 FGFR3은, 암종에서 FGFR3의 발암 역할에 대한 첫번째 증거이다. 또한, 최신 연구 결과는, 대부분의 양성 피부 종양에서 FGFR3 활성화 돌연변이가 존재하는 것으로 보고하고 있다 (문헌 [Logie et al., Hum Mol Genet 2005]). 현재, FGFR3은 방광암에서 가장 빈번하게 돌연변이되는 종양유전자인 것으로 판단된다 (FGFR3은 방광 암 전체 경우의 거의 50％ 및 표재성 방광 종양을 갖는 경우의 약 70％에서 돌연변이됨) (문헌 [Cappellen et al., Nature Genetics 1999, 23;19-20]; [van Rhijn et al., Cancer Research 2001, 61: 1265-1268]; [Billerey et al., Am. J. Pathol. 2001, 158:1955-1959]; WO 2004/085676). 또한, (표재성 및 침윤성) 방광암에서 FGFR3의 과발현이 보고되었다 (문헌 [Gomez-Roman et al., Clinical Cancer Research 2005]).
염색체 전위 t(4,14)로 인한 FGFR3 비정상적 과발현은 다발성 골수종 경우의 10 내지 25％에서 보고된다 (문헌 [Chesi et al., Nature Genetics 1997, 16: 260- 264]; [Richelda et al., Blood 1997, 90: 4061-4070]; [Sibley et al., BJH 2002, 118: 514-520]; [Santra et al., Blood 2003, 101: 2374-2476]). FGFR3 활성화 돌연변이는 다발성 골수종의 5 내지 10％에서 t(4,14)와 함께 나타나며, 종양 진행과 관련된다 (문헌 [Chesi et al., Nature Genetics 1997, 16: 260-264]; [Chesi et al., Blood, 97(3): 729-736 (2001); Intini et al., BJH 2001, 114: 362-364]).
이와 같은 문맥에서, FGFR3 신호 전달의 결과는 종종 세포 유형-특이적인 것으로 판단된다. FGFR3 과다활성화는 연골세포에서 성장의 억제를 초래하나 (문헌 [Omitz, 2001]에서 검토됨), 골수종 세포에서는 종양 진행에 기여한다 (문헌 [Chesi et al., 2001]).
FGFR3 활성의 억제는 T-세포-매개 염증성 또는 자가면역성 질환, 예를 들어 류마티스성 관절염 (RA), 콜라겐 II 관절염, 다발성 경화증 (MS), 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 건선, 연소성 당뇨병, 쇼그렌 질환 (Sjogren's disease), 갑상선 질환, 사르코이드증, 자가면역성 포도막염, 염증성 장 질환 (크론 질환 (Crohn's disease) 및 궤양성 대장염), 복강 (celiac) 질환 및 중증 근무력증 (이에 제한되지는 않음)을 비롯한 T-세포-매개 염증성 또는 자가면역성 질환의 치료를 위한 수단에 해당되는 것으로 밝혀졌다. WO 2004/110487을 참조한다.
또한, FGFR3 돌연변이로 인한 장애는 WO 03/023004 및 WO 02/102972에 기재되어 있다.
FGFR3 및 여타 FGFR (특히, 예를 들어 비정상적 FGF23 혈청 수준과 관련됨)에 의해 촉진되는 질환들 중에서, 추가의 상염색체 우성 저인산혈성 구루병 (ADHR), X-염색체-연관 저인산혈성 구루병 (XLH), 종양-유발 골연화증 (TIO), 섬유성 골 이형성증 (FH)이 언급된다 (또한, 문헌 [X. Yu et al., Cytokine ＆ Growth Factor Reviews 16, 221-232 (2005)] 및 [X. Yu et al., Therapeutic Apheresis and Dialysis 9(4), 308-312 (2005)] 참조).
FGFR1, FGFR2 및 FGFR4의 유전자 증폭 및/또는 과발현은 유방 암과 관련된다 (문헌 [Penault-Llorca et al., Int J Cancer 1995]; [Theillet et al., Genes Chrom. Cancer 1993]; [Adnane et al., Oncogene 1991]; [Jaakola et al., Int J Cancer 1993]; [Yamada et al., Neuro Res 2002]). 또한, FGFR1 및 FGFR4의 과발현은 췌장 선암종 및 성상세포종과 관련된다 (문헌 [Kobrin et al., Cancer Research 1993]; [Yamanaka et al., Cancer Research 1993]; [Shah et al., Oncogene 2002]; [Yamaguchi et al., PNAS 1994]; [Yamada et al., Neuro Res 2002]). 또한, 전립선 암은 FGFR1 과발현과 관련된다 (문헌 [Giri et al., Clin Cancer Res 1999]).
또한, FGF/FGFR은 맥관형성에 관여한다. 따라서, FGFR 시스템의 표적화는 또한, 원발성 종양 및 전이를 치료하기 위한 항맥관형성 요법인 것으로 예상된다 (예를 들어, 문헌 [Presta et al., Cytokine ＆ Growth Factors Reviews 16, 159-178 (2005)] 참조).
또한, 특히 FGFR3 (예를 들어, FGFR3b)에서의 돌연변이는 구강 편평 세포 암종의 경우에 이들 수용체의 구성적 활성화에 관여하는 것으로 기술되었다 (예를 들어, 문헌 [Y. Zhang et al., Int. J. Cancer 117, 166-168 (2005)] 참조).
FGFR, 특히 FGFR1의 (특히, 기관지에서의) 증가된 발현은 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)과 연관된 것으로 보고되었다 (예를 들어, 문헌 [A. Kranenburg et al., J. Pathol. 206, 28-38 (2005)] 참조).
FGF-R1 좌위 (locus)를 수반하며 FGR-R1의 활성화 형태를 초래하는 염색체 전위는 8p11 골수증식성 증후군 (= 호산구성 골수증식성 증후군 (EMS))에 관여하는 것으로 보고되었다 (문헌 [D. Macdonald et al., Cross NCP (2002) Acta Haematologica 107: 101-107] 참조).
또한, FGFR, 특히 FGFR1 또는 FGFR4를 길항하는 방법은 비만증, 당뇨병 및/또는 관련 질환, 예를 들어 대사성 증후군, 심혈관 질환, 고혈압, 비정상적 콜레스테롤 및 트리글리세리드 수준, 피부 장애 (예를 들어, 감염, 정맥류성 정맥 (varicose vein), 흑색극세포증, 습진, 운동 불내성, 2형 당뇨병, 인슐린 내성, 고콜레스테롤혈증, 담석증, 정형외과적 손상, 혈전색전성 질환, 관상동맥 또는 혈관 억제 (예를 들어, 아테롬성 동맥경화증), 주간졸림증, 수면성 무호흡, 말기 신장 질환, 담낭 질환, 통풍, 고열 장애, 면역 반응 손상, 호흡 기능 손상, 상처후 감염, 불임증, 간 질환, 요통, 산부인과 합병증, 췌장염, 뇌졸중, 외과 합병증, 복압성 요실금 및/또는 위장관 장애의 치료에서 유용한 것으로 기술되었다 (예를 들어, WO 2005/037235 A2 참조).
또한, 산성 섬유모세포 성장 인자 (특히, FGF-1) 및 FGFR1은 망막모세포종에서의 비정상적 신호 전달 (이는 FGF-1 결합시 증식을 유도함)에 관여하는 것으로 기술되었다 (예를 들어, 문헌 [S. Siffroi-Fernandez et al., Arch. Ophthalmology 123, 368-376 (2005)] 참조).
활막성 육종의 성장은 섬유모세포 성장 인자 신호 전달 경로의 붕괴에 의해 억제되는 것으로 밝혀졌다 (예를 들어, [T. Ishibe et al., Clin. Cancer Res. 11(7), 2702-2712 (2005)] 참조).
또한, 갑상선 암종의 경우에 FGFR 관여 여부가 입증될 수 있었다.
상피세포 성장 인자 군 및 관련 질환
상피세포 성장 인자 수용체 (EGF-R) 및 ErbB-2 키나제는, 군 구성원인 ErbB-3 및 ErbB-4와 함께 수많은 포유동물 세포 (인간 세포 포함), 특히 상피 세포, 면역계 세포 및 중추 및 말초 신경계 세포에서의 신호 전달에 있어서 핵심적인 역할을 하는 단백질 티로신 키나제 수용체이다. 예를 들어, 각종 세포 유형에서 수용체-관련 단백질 티로신 키나제의 EGF-유도 활성화는 세포 분열을 위한 필수 조건이며, 따라서 세포 집단의 증식을 위한 필수 조건이다. 가장 중요하게는, EGF-R (HER-1) 및/또는 ErbB-2 (HER-2)의 과발현은 수많은 인간 종양의 상당 부분에서 관찰되었다. 예를 들어, EGF-R은 비-소세포 폐암, 편평 암종 (두경부), 유방암, 위암, 난소암, 대장암, 전립선암 및 신경교종에서 과발현되는 것으로 밝혀졌다. ErbB-2는 편평 암종 (두경부), 유방암, 위암, 난소암 및 신경교종에서 과발현되는 것으로 밝혀졌다.
단백질 키나제가 관여하는 상기 언급된 모든 경우에서, 비정상적 활성의 조절 (특히, 상기 키나제 활성의 억제)은 언급된 질환에서 상당히 유용한 것으로 예상될 수 있다.
따라서, 비정상적 구성적 수용체 단백질 티로신 키나제 활성, 특히 FGFR 활성을 차단함으로써 상기 언급된 돌연변이와 관련된 임상 증상에 대처하고 생물학적 기능을 조절할 수 있는 높은 친화성 및/또는 선택성의 분자에 대한 충족되지 않은 요구가 존재한다.
대다수의 단백질 키나제 억제제 및 수많은 증식성 및 여타 PK-관련 질환의 측면에서, PK 억제제로서 유용하며 이에 따라 단백질 티로신 키나제 (PTK)-관련 질환의 치료에 유용한 새로운 화합물 군을 제공할 필요성이 항상 존재한다. PK를 억제하는 제약학적으로 유리한 신규 화합물 군이 요구되고 있다.
<발명의 개괄적인 설명>
아래에 보다 상세하게 제공된 화합물 (헤테로아릴 아릴 우레아 군에 속하는 것으로 기재될 수 있음)은 수많은 단백질 티로신 키나제, 특히 본원에 언급된 모든 키나제, 보다 특히 FGFR의 억제 활성을 나타낸다.
본 개시의 화합물에 의해 억제되는 키나제의 예로는 특히, FGFR1, FGFR2, FGFR3 및 FGFR4가 언급될 수 있다. 억제되는 또다른 키나제는 티로신 키나제 수용체 VEGF-R, 특히 VEGF 수용체 KDR (VEGF-R2)이다. 개시된 화합물은 상기 및/또는 여타 단백질 티로신 키나제 중 하나 이상의 억제에 적절하고/거나 이들 효소의 돌연변이의 억제에 적절하다. 활성의 측면에서, 상기 화합물은, 특히 상기 유형의 키나제, 특히 언급된 키나제의 비정상적이거나 과도한 활성과 관련된 질환의 치료를 위해 사용될 수 있다.
본 개시의 화합물은 유리 산, 유리 염기, 에스테르 및 여타 전구약물, 염 및 호변이성질체와 같은 다양한 형태로 존재할 수 있고, 예를 들어 본 개시에는 상기 화합물의 모든 변형체 형태가 포함된다.
보호 범위는, 본 발명의 화합물을 실제로 함유하는지 여부에 관계 없이, 그리고 상기 화합물이 치료적 유효량으로 함유되었는지 여부에 관계 없이, 본 발명의 화합물을 함유하거나 함유한다고 주장하는 모조 또는 부정 제품을 포괄한다. 따라서, 패키지가 본 발명의 특정 생성물 또는 제약 제제 또는 조성물을 함유하고 있음을 나타내는 설명서 또는 지침서, 및 이러한 제제 또는 특정 생성물 자체이거나 이들을 포함하는 (또는, 이러한 제제, 조성물 또는 특정 생성물 자체이거나 이들을 포함하고 있음을 주장하는) 제품을 포함하는 패키지가 보호 범위에 포함된다.
본 명세서의 발명의 상세한 설명 및 청구의 범위 전반에 걸쳐, 문맥상 달리 요구되지 않는다면 단수형 어휘는 복수형 어휘를 포괄한다. 특히, 부정 관사가 사용되는 경우, 문맥상 달리 요구되지 않는다면 본 명세서에서는 단수형 뿐만 아니라 복수형도 고려되는 것으로 이해해야 한다.
본 발명의 특정한 측면, 실시양태 또는 실시예와 관련하여 기재된 특징부, 정수, 특성, 화합물, 화학 잔기 또는 화학 기는, 본원에 기재된 다른 모든 측면, 실시양태 또는 실시예에 적용될 수 있는 것으로 이해해야 한다 (이들에게 부적절하지 않은 경우임).
본 명세서의 발명의 상세한 설명 및 청구의 범위 전반에 걸쳐, "포함하다" 및 "함유하다"란 용어 및 이들 용어의 변형 (예를 들어, "포함하는" 및 "포함되는")은 "포함하지만 그에 제한되지는 않음"을 의미하며, 그밖의 잔기, 첨가제, 성 분, 정수 또는 구간을 배제하거나 배제하려는 것은 아니다.
본 개시의 또다른 측면 및 실시양태는 하기 발명의 상세한 설명 및 청구의 범위에 기술되어 있다.
하기 화학식 IA의 신규 화합물; 또는
Figure 112008052214826-pct00001
[식 중,
X, Y 및 Z 중 둘은 N (질소)이고, 나머지 하나는 CH 또는 N이고 (바람직하게는, Y 및 Z는 N이고, X는 CH임);
R1은 히드록시, 페닐-C1-C7-알킬옥시, 피페라진-1-일 또는 4-(페닐-C1-C7-알킬)-피페라진-1-일로 치환된 페닐; 또는 (i) 할로 또는 C1-C7-알콕시 및 추가로 (ii) 히드록시, 페닐-C1-C7-알킬옥시, N-모노- 또는 N,N-디-(C1-C7-알킬)-아미노-C1-C7-알킬, 피롤리디노-C1-C7-알콕시, 1-(C1-C7-알킬)-피페리딘-4-일, 모르폴리노-C1-C7-알콕시, 티오모르폴리노-C1-C7-알콕시, 피페라진-1-일, 4-(페닐-C1-C7-알킬)-피페 라진-1-일, 4-(C1-C7-알킬)-피페라진-1-일, [4-(C1-C7-알킬)-피페라진-1-일]-C1-C7-알킬, N-모노- 또는 N,N-디-(C1-C7-알킬)-아미노-C1-C7-알킬, N-모노- 또는 N,N-디-(C1-C7-알킬)-아미노-C1-C7-알콕시, [4-(C1-C7-알킬)-피페라진-1-일]-C1-C7-알콕시 또는 [4-(C1-C7-알킬)-피페라진-1-일]-카르보닐로 치환된 페닐이고;
R2는 수소, C1-C7-알킬, C1-C7-알콕시 또는 할로이고;
R3은 수소, C1-C7-알킬 또는 페닐-C1-C7-알킬이고;
각 R4는 서로 독립적으로, C1-C7-알킬, 할로-C1-C7-알킬, 할로 또는 C1-C7-알콕시이고;
n은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이거나; 또는
R1은 히드록시, 페닐-C1-C7-알킬옥시, 피페라진-1-일, 4-(페닐-C1-C7-알킬)-피페라진-1-일, N-모노- 또는 N,N-디-(C1-C7-알킬)-아미노-C1-C7-알킬, 피롤리디노-C1-C7-알콕시, 1-(C1-C7-알킬)-피페리딘-4-일, 모르폴리노-C1-C7-알콕시, 티오모르폴리노-C1-C7-알콕시, 4-(C1-C7-알킬)-피페라진-1-일, [4-(C1-C7-알킬)-피페라진-1-일]-C1-C7-알킬, N-모노- 또는 N,N-디-(C1-C7-알킬)-아미노-C1-C7-알킬, N-모노- 또는 N,N-디-(C1-C7-알킬)-아미노-C1-C7-알콕시, [4-(C1-C7-알킬)-피페라진-1-일]-C1-C7-알 콕시 또는 [4-(C1-C7-알킬)-피페라진-1-일]-카르보닐로 치환된 페닐; 또는 본 단락에서 지금까지 언급된 치환기들 중 하나, 및 추가로 할로 또는 C1-C7-알콕시로부터 선택된 치환기를 갖는 페닐이고;
R2는 수소, C1-C7-알킬, C1-C7-알콕시 또는 할로이고;
R3은 수소, C1-C7-알킬 또는 페닐-C1-C7-알킬이고;
R5는 수소 (바람직함), C1-C7-알킬 또는 페닐-C1-C7-알킬이고;
n은 3, 4 또는 5이고, R4는 C1-C7-알킬, C1-C7-알콕시 또는 할로로부터 선택되되, C1-C7-알킬, C1-C7-알콕시 및 할로가 각각 하나 이상 존재하거나; 또는
n은 2이고, 하나의 R4는 할로-C1-C7-알킬이고, 나머지 R4는 C1-C7-알콕시이거나; 또는
n은 3, 4 또는 5이고, R4는 할로, 요오도 또는 C1-C7-알콕시로부터 선택되되, 할로, 요오도 및 C1-C7-알콕시가 각각 하나 이상 존재하거나; 또는
n은 3, 4 또는 5이고, R4는 할로, 할로-C1-C7-알킬 또는 C1-C7-알콕시로부터 선택되되, 할로, 할로-C1-C7-알킬 및 C1-C7-알콕시가 각각 하나 이상 존재하거 나; 또는
Y 및 Z는 N (질소)이고, X는 CH이고;
R1은 N-C1-C7-알킬-피페라진-1-일로 일치환된 3-피리딜이고;
R2는 수소이고;
R3은 수소이고;
각 R4는 서로 독립적으로, C1-C7-알킬, 할로-C1-C7-알킬, 할로 또는 C1-C7-알콕시이고;
R5는 수소이고;
n은 1, 2, 3, 4 또는 5임]
R1이 4-(2-모르폴린-4-일-에톡시)-페닐아미노이고; R2가 수소이고; R3이 수소이고; R4가 2- 및 6-클로로 및 3- 및 5-메톡시이고; n이 4이고; R5가 수소이고; Y 및 Z가 N이고; X가 CH인 화학식 IA의 화합물; 또는
R1이 3-(4-메틸-피페라진-1-일메틸)-페닐아미노이고; R2가 수소이고; R3이 메틸이고; R4가 2- 및 6-클로로 및 3- 및 5-메톡시이고; n이 4이고; R5가 수소이고; Y 및 Z가 N이고; X가 CH인 화학식 IA의 화합물; 또는
R1이 3-(4-에틸-피페라진-1-일)-페닐아미노이고; R2가 수소이고; R3이 메틸이고; R4가 2- 및 6-클로로 및 3- 및 5-메톡시이고; n이 4이고; R5가 수소이고; Y 및 Z가 N이고; X가 CH인 화학식 IA의 화합물; 또는
R1이 4-(2-모르폴린-4-일-에톡시)-페닐아미노이고; R2가 수소이고; R3이 메틸이고; R4가 2- 및 6-클로로 및 3- 및 5-메톡시이고; n이 4이고; R5가 수소이고; Y 및 Z가 N이고; X가 CH인 화학식 IA의 화합물; 또는
R1이 4-(1-에틸-피페리딘-4-일)-페닐아미노이고; R2가 수소이고; R3이 메틸이고; R4가 2- 및 6-클로로 및 3- 및 5-메톡시이고; n이 4이고; R5가 수소이고; Y 및 Z가 N이고; X가 CH인 화학식 IA의 화합물; 또는
R1이 4-(4-에틸-피페라진-1-일)-페닐아미노이고; R2가 수소이고; R3이 에틸이고; R4가 2- 및 6-클로로 및 3- 및 5-메톡시이고; n이 4이고; R5가 수소이고; Y 및 Z가 N이고; X가 CH인 화학식 IA의 화합물; 또는
R1이 4-(4-에틸-피페라진-1-카르보닐)-페닐아미노이고; R2가 수소이고; R3이 메틸이고; R4가 2- 및 6-클로로 및 3- 및 5-메톡시이고; n이 4이고; R5가 수소이고; Y 및 Z가 N이고; X가 CH인 화학식 IA의 화합물; 또는
2종 이상의 화학식 IA의 화합물의 혼합물; 또는
(이상 및 이하에 언급된 바와 같은) 화학식 IA의 화합물 각각의 경우에서 그의 염, 전구약물, N-옥시드 또는 에스테르는 단백질 키나제 활성과 관련된 장애, 특히 단백질 티로신 키나제 조절성 화합물, 보다 특히 FGFR 조절성 화합물에 의해 치료될 수 있는 질환의 치료에 있어서 유용한 것으로 밝혀졌다.
따라서, 본 발명은 1종 이상의 상기 화학식 IA의 화합물, 그의 염, 전구약물, N-옥시드 또는 에스테르, 및 상기 언급된 용도, 방법 및 제약 제제에 관한 것이다.
특히, 본 발명은
X, Y 및 Z 중 둘이 N (질소)이고, 나머지 하나가 CH 또는 N이되 (바람직하게는, Y 및 Z는 N이고, X는 CH임);
(A) R1이 히드록시, 페닐-C1-C7-알킬옥시 (특히, 벤질옥시), 피페라진-1-일 또는 4-(페닐-C1-C7-알킬)-피페라진-1-일 (특히, 4-벤질-피페라진-1-일)로 치환된 페닐; 또는 (i) 할로 (특히, 플루오로 또는 클로로) 또는 C1-C7-알콕시 (특히, 메톡시)로 (1회) 및 추가로 (ii) 히드록시, 페닐-C1-C7-알킬옥시 (특히, 벤질옥시), N-모노- 또는 N,N-디-(C1-C7-알킬)-아미노-C1-C7-알킬 (특히, 디메틸아미노메틸), 피롤리디노-C1-C7-알콕시 (특히, 2-피롤리디노-에톡시), 1-(C1-C7-알킬)-피페리딘-4-일 (특히, 1-에틸-피페리딘-4-일), 모르폴리노-C1-C7-알콕시 (특히, 2-모르폴리노-에톡 시), 티오모르폴리노-C1-C7-알콕시 (특히, 2-티오모르폴리노-에톡시), 피페라진-1-일, 4-(페닐-C1-C7-알킬)-피페라진-1-일 (특히, 4-벤질피페라진-1-일), 4-(C1-C7-알킬)-피페라진-1-일 (특히, 4-(메틸, 에틸 또는 이소프로필)-피페라진-1-일), [4-(C1-C7-알킬)-피페라진-1-일]-C1-C7-알킬 (특히, 2-[4-(메틸 또는 에틸)-피페라진-1-일]-에틸), N-모노- 또는 N,N-디-(C1-C7-알킬)-아미노-C1-C7-알킬 (특히, 디메틸아미노메틸), N-모노- 또는 N,N-디-(C1-C7-알킬)-아미노-C1-C7-알콕시 (특히, 2-(디메틸아미노)-에톡시), [4-(C1-C7-알킬)-피페라진-1-일]-C1-C7-알콕시 (특히, 2-(4-메틸피페라진-1-일)-에톡시) 또는 [4-(C1-C7-알킬)-피페라진-1-일]-카르보닐 (특히, 4-에틸피페라진-1-카르보닐)로 (1회) 치환된 페닐이고;
R2가 수소 (바람직함), C1-C7-알킬, C1-C7-알콕시 또는 (덜 바람직하게는) 할로이고;
R3이 수소 (바람직함), C1-C7-알킬 (바람직함) 또는 페닐-C1-C7-알킬이고;
각 R4가 서로 독립적으로, C1-C7-알킬, 할로-C1-C7-알킬, 할로 또는 C1-C7-알콕시이고;
R5가 수소 (바람직함), C1-C7-알킬 또는 페닐-C1-C7-알킬이고;
n이 0, 1, 2, 3, 4 또는 5인 화학식 IA의 화합물; 또는
(B) R1이 히드록시, 페닐-C1-C7-알킬옥시 (특히, 벤질옥시), 피페라진-1-일, 4-(페닐-C1-C7-알킬)-피페라진-1-일 (특히, 4-벤질-피페라진-1-일), N-모노- 또는 N,N-디-(C1-C7-알킬)-아미노-C1-C7-알킬 (특히, 디메틸아미노메틸), 피롤리디노-C1-C7-알콕시 (특히, 2-피롤리디노-에톡시), 1-(C1-C7-알킬)-피페리딘-4-일 (특히, 1-에틸-피페리딘-4-일), 모르폴리노-C1-C7-알콕시 (특히, 2-모르폴리노-에톡시), 티오모르폴리노-C1-C7-알콕시 (특히, 2-티오모르폴리노-에톡시), 4-(C1-C7-알킬)-피페라진-1-일 (특히, 4-(메틸, 에틸 또는 이소프로필)-피페라진-1-일), [4-(C1-C7-알킬)-피페라진-1-일]-C1-C7-알킬 (특히, 2-[4-(메틸 또는 에틸)-피페라진-1-일]-에틸), N-모노- 또는 N,N-디-(C1-C7-알킬)-아미노-C1-C7-알킬 (특히, 디메틸아미노메틸), N-모노- 또는 N,N-디-(C1-C7-알킬)-아미노-C1-C7-알콕시 (특히, 2-(디메틸아미노)-에톡시), [4-(C1-C7-알킬)-피페라진-1-일]-C1-C7-알콕시 (특히, 2-(4-메틸피페라진-1-일)-에톡시) 또는 [4-(C1-C7-알킬)-피페라진-1-일]-카르보닐 (특히, 4-에틸피페라진-1-카르보닐)로 치환된 페닐; 또는 본 단락에서 지금까지 R1에 대해 언급된 치환기들 중 하나, 및 추가로 할로 또는 C1-C7-알콕시로부터 선택된 치환기를 갖는 페닐이 고;
R2가 수소 (바람직함), C1-C7-알킬, C1-C7-알콕시 또는 (덜 바람직하게는) 할로이고;
R3이 수소 (바람직함), C1-C7-알킬 (바람직함) 또는 페닐-C1-C7-알킬이고;
R5가 수소 (바람직함), C1-C7-알킬 또는 페닐-C1-C7-알킬이고;
n이 3, 4 또는 5이고; R4가 C1-C7-알킬, C1-C7-알콕시 또는 할로로부터 선택되되, C1-C7-알킬, C1-C7-알콕시 및 할로가 각각 하나 이상 존재하거나; 또는
n이 2이고, 하나의 R4가 할로-C1-C7-알킬이고, 나머지 R4가 C1-C7-알콕시이거나; 또는
n이 3, 4 또는 5이고, R4가 할로, 요오도 또는 C1-C7-알콕시로부터 선택되되, 할로, 요오도 및 C1-C7-알콕시가 각각 하나 이상 존재하거나; 또는
n이 3, 4 또는 5이고, R4가 할로, 할로-C1-C7-알킬 또는 C1-C7-알콕시로부터 선택되되, 할로, 할로-C1-C7-알킬 및 C1-C7-알콕시가 각각 하나 이상 존재하는 것인 화학식 IA의 화합물; 또는
(C) 화합물명이
1-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-3-{6-[4-(2-모르폴린-4-일-에톡시)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-우레아 (화학식 IA의 경우에 R1이 4-(2-모르폴린-4-일-에톡시)-페닐아미노이고; R2가 수소이고; R3이 수소이고; R4가 2- 및 6-클로로 및 3- 및 5-메톡시이고; n이 4이고; R5가 수소임);
3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-메틸-1-{6-[3-(4-메틸-피페라진-1-일메틸)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-우레아 (화학식 IA의 경우에 R1이 3-(4-메틸-피페라진-1-일메틸)-페닐아미노이고; R2가 수소이고; R3이 메틸이고; R4가 2- 및 6-클로로 및 3- 및 5-메톡시이고; n이 4이고; R5가 수소임);
3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-{6-[3-(4-에틸-피페라진-1-일)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-1-메틸-우레아 (화학식 IA의 경우에 R1이 3-(4-에틸-피페라진-1-일)-페닐아미노이고; R2가 수소이고; R3이 메틸이고; R4가 2- 및 6-클로로 및 3- 및 5-메톡시이고; n이 4이고; R5가 수소임);
3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-메틸-1-{6-[4-(2-모르폴린-4-일-에톡시)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-우레아 (화학식 IA의 경우에 R1이 4-(2-모르폴린-4-일-에톡시)-페닐아미노이고; R2가 수소이고; R3이 메틸이고; R4가 2- 및 6-클로로 및 3- 및 5-메톡시이고; n이 4이고; R5가 수소임);
3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-{6-[4-(1-에틸-피페리딘-4-일)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-1-메틸-우레아 (화학식 IA의 경우에 R1이 4-(1-에틸-피페리딘-4-일)-페닐아미노이고; R2가 수소이고; R3이 메틸이고; R4가 2- 및 6-클로로 및 3- 및 5-메톡시이고; n이 4이고; R5가 수소임);
3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-에틸-1-{6-[4-(4-에틸-피페라진-1-일)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-우레아 (화학식 IA의 경우에 R1이 4-(4-에틸-피페라진-1-일)-페닐아미노이고; R2가 수소이고; R3이 에틸이고; R4가 2- 및 6-클로로 및 3- 및 5-메톡시이고; n이 4이고; R5가 수소임); 또는
3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-{6-[4-(4-에틸-피페라진-1-카르보닐)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-1-메틸-우레아 (화학식 IA의 경우에 R1이 4-(4-에틸-피페라진-1-카르보닐)-페닐아미노이고; R2가 수소이고; R3이 메틸이고; R4가 2- 및 6-클로로 및 3- 및 5-메톡시이고; n이 4이고; R5가 수소임)인 화학식 IA의 화합물; 및
(이들 화합물 각각에서, 화학식 IA의 R1, R2, R3, R4, R5, X, Y, Z 및 n에 상응하는 잔기들은 각각, 이들 화합물에 대해 주어진 각각의 의미로 정의됨)
(이들 화합물 각각에서, Y 및 Z는 질소이고 X는 CH임)
(이상 및 이하에 언급된 바와 같은) 화학식 IA의 화합물 각각의 경우에서 그의 염, 전구약물, N-옥시드 또는 에스테르에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은
Y 및 Z가 N (질소)이고, X가 CH이고;
R1이 N-C1-C7-알킬-피페라진-1-일로 일치환된 3-피리딜이고;
R2가 수소이고;
R3이 수소이고;
각 R4가 서로 독립적으로, C1-C7-알킬, 할로-C1-C7-알킬, 할로 또는 C1-C7-알콕시이고;
R5가 수소이고;
n이 1, 2, 3, 4 또는 5인 화학식 IA의 화합물을 제공한다.
상기 실시양태에서, R4는 서로 독립적으로, 바람직하게는 할로 또는 C1-C7-알콕시이고, n은 바람직하게는 3, 4 또는 5, 가장 바람직하게는 4이다.
바람직한 정의
달리 명시되지 않는다면, 이상 및 이하에서 사용된 일반 용어는 본 개시의 문맥 내에서 다음과 같은 의미를 갖는다.
"저급" 또는 "C1-C7"이란 선행어는 7개 이하의 쇄내 원자, 특히 4개 이하의 쇄내 원자를 갖는 라디칼을 의미한다. 특정 부류의 알킬 및 지방족은 1, 2, 3 또는 4개의 탄소원자를 포함한다. 해당 라디칼은 선형이거나, 1회 또는 수회 분지된 분지형이다.
"저급 알킬" 또는 "C1-C7-알킬"은 바람직하게는, 1 내지 7개의 탄소 원자, 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4개의 탄소 원자를 갖는 알킬이며 선형 또는 분지형이고, 저급 알킬은 예를 들어, 부틸, 예를 들어 n-부틸, sec-부틸, 이소부틸, tert-부틸, 프로필, 예를 들어 n-프로필 또는 이소프로필, 에틸 또는 메틸이다. 예시적인 저급 알킬은 메틸, 에틸 또는 이소프로필이다.
화합물, 염 등이 복수형으로 사용되는 경우, 이는 단일의 화합물, 염 등도 의미한다.
화학식 IA에서, 페닐이 고리 결합 R1-NR5로서 R1 중에 존재하는 경우, 치환기 히드록시, 페닐-C1-C7-알킬옥시, 피페라진-1-일, 4-(페닐-C1-C7-알킬)-피페라진-1-일, N-모노- 또는 N,N-디-(C1-C7-알킬)-아미노-C1-C7-알킬, 피롤리디노-C1-C7-알콕시, 1-(C1-C7-알킬)-피페리딘-4-일, 모르폴리노-C1-C7-알콕시, 티오모르폴리노-C1-C7-알콕시, 4-(C1-C7-알킬)-피페라진-1-일, [4-(C1-C7-알킬)-피페라진-1-일]-C1-C7-알킬, N-모노- 또는 N,N-디-(C1-C7-알킬)-아미노-C1-C7-알킬, N-모노- 또는 N,N-디-(C1-C7-알 킬)-아미노-C1-C7-알콕시, [4-(C1-C7-알킬)-피페라진-1-일]-C1-C7-알콕시, [4-(C1-C7-알킬)-피페라진-1-일]-카르보닐은 NR3으로의 결합을 기준으로 3-위치 또는 4-위치에 존재하는 것이 바람직하다.
임의의 비대칭 탄소 원자는 (R)-배열, (S)-배열 또는 (R,S)-배열, 바람직하게는 (R)-배열 또는 (S)-배열로 존재할 수 있다. 임의의 불포화를 갖는 라디칼은 시스-, 트랜스- 또는 (시스, 트랜스) 형태로 존재한다. 따라서, 화합물은 이성질체들의 혼합물 또는 순수한 이성질체, 바람직하게는 거울상이성질체적으로 순수한 부분입체이성질체로서 존재할 수 있다.
또한, 본 발명은 개시된 화합물의 가능한 호변이성질체에 관한 것이다.
적절하고 유리한 경우 및 달리 언급되지 않는 경우, 유리 형태 및 염 형태 (예를 들어, 신규 화합물, 호변이성질체 또는 호변이성질체 혼합물 및 이들의 염의 정제 또는 식별시에 중간체로서 사용될 수 있는 염 포함)의 화학식 IA의 화합물들 사이의 밀접한 관계를 고려하면, 이상 및 이하에서 상기 화합물에 대한 모든 언급은 이들 화합물의 상응하는 호변이성질체들 또는 이들 중 임의의 것의 염도 언급하는 것으로 이해해야 한다.
예를 들어, 호변이성질체는, 아미노 또는 히드록시가 각각 1개 이상의 결합된 수소와 함께, 이중 결합에 의해 인접 원자에 결합된 탄소 원자에 결합된 경우에 존재할 수 있다 (예를 들어, 케토-에놀 또는 이민-엔아민 호변이성질체).
"화합물 ..., 그의 호변이성질체, 또는 이들의 염" 등이 언급되는 경우, 이 는 "화합물 ..., 그의 호변이성질체, 또는 상기 화합물 및/또는 호변이성질체의 염"을 의미한다.
"할로겐 (할로)"은 특히, 불소, 염소, 브롬 또는 요오드, 특히 (바람직하게는 화학식 IA의 화합물에서) 불소, 염소 또는 요오드이다.
"할로-C1-C7-알킬"은 1개 이상의 수소 원자가 할로겐 원자로 치환된 것인 C1-C7-알킬, 예를 들어 트리플루오로메틸을 의미한다.
"[4-(C1-C7-알킬)-피페라진-1-일]-카르보닐"은 [4-(C1-C7-알킬)-피페라진-1-일]-C(=O)-를 의미한다.
본 발명은 상기 기재된 화학식 IA의 화합물 및 그의 염, 에스테르, N-옥시드 또는 전구약물에 관한 것이다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 화학식 IA의 화합물 및/또는 그의 염, 에스테르, N-옥시드 또는 전구약물인 생성물을 제공한다.
상기 염은 특히, (특히, 이들이 염-형성 기를 형성하는 경우) 화학식 IA (또는 그의 예시적인 화학식)의 화합물의 제약상 허용되는 염이다.
염-형성 기는 염기성 또는 산성을 갖는 기 또는 라디칼이다. 1개 이상의 염기성 기 또는 1개 이상의 염기성 라디칼, 예를 들어 염기성 질소, 예를 들어 아미노, 2급 아미노 기 (펩티드를 형성하지 않음) 또는 3급 아미노 기를 갖는 화합물은, 예를 들어 무기 산, 예를 들어 염산, 황산 또는 인산과의 산 부가염, 또는 적합한 유기 카르복실산 또는 술폰산, 예를 들어 지방족 모노- 또는 디-카르복실산, 예를 들어 트리플루오로아세트산, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 숙신산, 말레 산, 푸마르산, 히드록시말레산, 말산, 타르타르산, 시트르산 또는 옥살산, 또는 아미노산, 예를 들어 아르기닌 또는 리신, 방향족 카르복실산, 예를 들어 벤조산, 2-페녹시-벤조산, 2-아세톡시-벤조산, 살리실산, 4-아미노살리실산, 방향족-지방족 카르복실산, 예를 들어 만델산 또는 신남산, 헤테로방향족 카르복실산, 예를 들어 니코틴산 또는 이소니코틴산, 지방족 술폰산, 예를 들어 메탄-, 에탄- 또는 2-히드록시에탄술폰산, 또는 방향족 술폰산, 예를 들어 벤젠-, p-톨루엔- 또는 나프탈렌-2-술폰산과의 산 부가염을 형성할 수 있다. 다수의 염기성 기가 존재하는 경우, 모노- 또는 폴리-산 부가염이 형성될 수 있다.
산성 기, 카르복시 기 또는 페놀계 히드록시 기를 갖는 화합물은 금속 염 또는 암모늄 염, 예를 들어 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염, 예를 들어 나트륨 염, 칼륨 염, 마그네슘 염 또는 칼슘 염, 또는 암모니아 또는 적합한 유기 아민, 예를 들어 3급 모노아민, 예를 들어 트리에틸아민 또는 트리-(2-히드록시에틸)-아민, 또는 헤테로시클릭 염기, 예를 들어 N-에틸-피페리딘 또는 N,N'-디메틸피페라진과의 암모늄 염을 형성할 수 있다. 염들의 혼합물도 가능하다.
산성 기 및 염기성 기를 둘 다 갖는 화합물은 내부 염을 형성할 수 있다.
또한, 단리 또는 정제를 목적으로, 그리고 중간체로도 사용되는 화합물의 경우, 제약상 허용되지 않는 염, 예를 들어 피크레이트를 사용하는 것도 가능하다. 오직 제약상 허용되는 무독성의 염이 치료 목적을 위해 사용될 수 있으며, 이에 따라 이들 염이 바람직하다.
적절하고 유리한 경우, 유리 형태 및 염 형태 (예를 들어, 신규 화합물의 염 의 정제 또는 식별시에 중간체로서 사용될 수 있는 염 포함)의 신규 화합물들 또는 이들의 N-옥시드 사이의 밀접한 관계를 고려하면, 이상 및 이하에서 유리 화합물 (화학식 IA의 화합물, 중간체 및 출발 물질 포함)에 대한 모든 언급은 상응하는 N-옥시드, 및/또는 염, 수화물, 용매화물 및/또는 결정 형태의 화합물 또는 그의 N-옥시드도 언급하는 것으로 이해해야 한다.
화학식 IA (또는 그의 예시적인 화학식)의 화합물은 이상 및 이하에 기재된 바와 같이 유용한 약리학적 특성을 갖는다.
생물학
Bcr-Abl, c-KIT, EphB4, EGF-R, VEGF-R2 (KDR), FGF-R, Tie-2 (Tek), Ret, PDGFR, raf, FLT3, c-src 및/또는 FGFR3 수용체 티로신 키나제 활성의 억제제로서의 본 발명의 화합물의 효능은 다음과 같이 입증될 수 있다.
다음 기재에서, "억제제", "활성 화합물" 등은 화학식 IA의 화합물을 나타낸다.
Bcr-Abl에 대한 활성 시험
p210 Bcr-Abl 발현 벡터 pGDp210Bcr/Abl로 형질감염된 뮤린 골수 전구 세포주 32Dcl3 (32D-bcr/abl)은 제이. 그리핀 (J. Griffin) (미국 메사추세츠주 보스턴에 소재한 다나 페이버 캔서 인스티튜트 (Dana Faber Cancer Institute))으로부터 입수한다. 세포는 구성적으로 활성인 abl 키나제를 갖는 융합 Bcr-Abl 단백질을 발현하며, 성장 인자에 대해 비의존적으로 증식한다. 세포를 RPMI 1640 (아미메드 (AMIMED)), 10％ 소 태아 혈청 및 2 mM 글루타민 (기브코 (Gibco)) ("완전 배지") 중에서 확장시키고, 냉동 매질 (95％ FCS, 5％ DMSO (시그마 (SIGMA))) 중에 분취량의 2 × 106개/바이알을 냉동시킴으로써 작업 원액을 제조한다. 해동 후, 세포를 실험의 최대 10 내지 12계대 동안 사용한다. 항체 항-abl SH3 도메인 (업스테이트 바이오테크놀로지 (Upstate Biotechnology)의 카탈로그 번호 06-466)을 ELISA에 사용한다. bcr-abl 인산화를 검출하기 위해, 자이메드 (ZYMED)의 알칼리성 포스파타제로 표지된 항-포스포티로신 항체 Ab PY20 (PY10(AP)) (카탈로그 번호 03-7722)을 사용한다. 비교 및 참조 화합물로서, 메탄 술포네이트 (모노메실레이트) 염 형태의 (N-{5-[4-(4-메틸-피페라지노-메틸)-벤조일아미도]-2-메틸페닐}-4-(3-피리딜)-2-피리미딘-아민 (STI571) (노파르티스 (Novartis)의 글리벡 ((Gleevec, 등록상표) 또는 Glivec (등록상표))으로 시판됨)을 사용한다. 10 mM의 원액을 DMSO 중에서 제조하고, -20 ℃에서 저장한다. 세포 분석을 위해, 원액을 완전 배지에서 2단계로 희석하여 (1:100 및 1:10) 출발 농도 10 μM을 달성한 후에 완전 배지에서 연속 3배 희석액을 제조한다. 이 절차 동안 용해도 문제는 발생하지 않는다. 시험 화합물을 유사한 방식으로 처리한다. 분석을 위해, 200,000개의 32D-bcr/abl 세포를 96웰 둥근 바닥 조직 배양 플레이트에 웰 당 50 ㎕로 시딩한다. 시험 화합물의 연속 3배 희석액 (50 ㎕/웰)을 세포에 첨가한다 (희석액 하나 당 3벌). 시험 화합물의 최종 농도는, 예를 들어 5 μM 내지 0.01 μM 범위이다. 비처리 세포를 대조군으로서 사용한다. 화합물을 세포와 함께 37 ℃ 및 5％ CO2에서 90 분간 인큐베이션한 후, 조직 배양 플레이트를 1300 rpm으로 원심분리하고 (벡먼 (Beckman) GPR 원 심분리기), 펠렛화된 세포가 조금이라도 제거되지 않도록 주의하면서 조심스럽게 흡인함으로써 상층액을 분리한다. 150 ㎕의 용해 완충액 (50 mM Tris/HCl (pH 7.4), 150 mM 염화나트륨, 5 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1％ NP-40 (비-이온성 계면활성제, 독일 만하임에 소재한 로슈 다이어그노스틱스 게엠베하 (Roche Diagnostics GmbH)), 2 mM 나트륨 오르토-바나데이트, 1 mM 페닐메틸 술포닐플루오라이드, 50 ㎍/mL 아프로티닌 및 80 ㎍/mL 류펩틴)을 첨가함으로써 세포 펠렛을 용해시키고, ELISA에 즉시 사용하거나, 또는 사용될 때까지 -20 ℃에서 냉동 저장한다. 항-abl SH3 도메인 항체를 밤새 4 ℃에서 블랙 ELISA 플레이트 (팩커드 (Packard)의 HTRF-96 블랙 플레이트; 6005207)에서 웰 당 200 ng (50 ㎕의 PBS 중)으로 코팅한다. 200 ㎕/웰의 0.05％ 트윈 20-함유 PBS (PBST) 및 0.5％ 탑블록 (TopBlock; 유로 (Juro), 카탈로그 번호 TB 232010)으로 3회 세척한 후, 남은 단백질 결합 부위를 4시간 동안 실온에서 200 ㎕/웰의 PBST, 3％ 탑블록으로 블로킹한 다음, 4 ℃에서 3 내지 4시간 동안 시험 화합물로 처리되거나 처리되지 않은 세포의 용해물 50 ㎕ (총 단백질 20 ㎍/웰)와 함께 인큐베이션한다. 3회 세척 후, 블로킹 완충액 중에서 0.5 ㎍/mL로 희석된 50 ㎕/웰의 PY20(AP) (자이메드)를 첨가하고, 밤새 4 ℃에서 인큐베이션한다. 모든 인큐베이션 단계에서, 플레이트를 플레이트 씰러 (코스타 (Costar), 카탈로그 번호 3095)로 밀봉한다. 최종적으로, 플레이트를 세척 완충액으로 3회 더 세척하고, 탈이온수로 1회 세척한 후, AP 기질 (에메랄드 (Emerald) II를 함유하는 CPDStar RTU) 90 ㎕/웰을 첨가한다. 팩커드 탑 씰 (Top Seal, 상표명)-A 플레이트 씰러 (카탈로그 번호 6005185)로 밀봉된 플레이트를 암 실에서 45 분간 실온에서 인큐베이션하고, 팩커드 탑 카운트 마이크로플레이트 섬광 계수기 (탑 카운트 (Top Count))를 이용하여 초 당 계수값 (CPS)을 측정함으로써 발광을 정량한다. 최종 최적화 버전의 ELISA를 위해, 96웰 조직 배양 플레이트에서 성장, 처리 및 용해된 세포의 용해물 50 ㎕를, 상기 플레이트로부터 50 ng/웰의 토끼 폴리클로날 항-abl-SH3 도메인 AB 06-466 (업스테이트)으로 예비코팅된 ELISA 플레이트에 직접 옮긴다. 항-포스포티로신 AB PY20(AP)의 농도는 0.2 ㎍/mL로 감소될 수 있다. 세척, 블로킹 및 발광 기질과의 인큐베이션은 상기와 같다. 정량은 다음과 같이 수행한다. 비처리된 32D-bcr/abl 세포의 용해물에 대해 얻어진 ELISA 판독값 (CPS)과, 분석 배경값 (세포 용해물을 제외한 모든 성분)에 대한 판독값 사이의 차이를 계산하고, 이는 이들 세포에 존재하는 구성적으로 인산화된 Bcr-abl 단백질을 100％ 반영하는 것으로 간주한다. bcr-abl 키나제 활성에 있어서 화합물의 활성은 bcr-abl 인산화의 감소율로서 나타낸다. IC50 값은 용량 반응 곡선으로부터 그래프 내삽법 또는 외삽법에 의해 결정한다. 본 발명의 화합물은 바람직하게는 15 nM 내지 500 μM, 가장 바람직하게는 15 nM 내지 200 μM 범위의 IC50 값을 나타낸다.
세포 분석을 위해, 화합물을 DMSO에 용해시키고, 완전 배지에 희석시켜 출발 농도 10 μM을 달성한 후에 완전 배지에서 3배 연속 희석액을 제조한다. 'wt'-Bcr-Abl 또는 Bcr-Abl 돌연변이를 발현하는 32D 또는 Ba/F3 세포 (예를 들어, T-315-I)를 96웰 둥근 바닥 조직 배양 플레이트에 웰 당 200,000개 세포 (50 ㎕ 완전 배지 중)로 시딩한다. 시험 화합물의 연속 3배 희석액 (50 ㎕/웰)을 세포에 첨가한다 (희석액 하나 당 3벌). 비처리 세포를 대조군으로서 사용한다. 화합물을 세포와 함께 37 ℃ 및 5％ CO2에서 90분간 인큐베이션한 후, 조직 배양 플레이트를 1300 rpm으로 원심분리하고 (벡먼 GPR 원심분리기), 펠렛화된 세포가 분리되지 않도록 주의하면서 조심스럽게 흡인함으로써 상층액을 분리한다. 150 ㎕의 용해 완충액 (50 mM Tris/HCl (pH 7.4), 150 mM 염화나트륨, 5 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1％ NP-40, 2 mM 나트륨 오르토-바나데이트, 1 mM PMSF, 50 ㎍/mL 아프로티닌 및 80 ㎍/mL 류펩틴)을 첨가함으로써 세포 펠렛을 용해시키고, ELISA에 즉시 사용하거나, 또는 사용될 때까지 플레이트에서 -20 ℃로 냉동 저장한다.
업스테이트의 토끼 폴리클로날 항-abl-SH3 도메인 Ab 06-466을 밤새 4 ℃에서 웰 당 50 ng (50 ㎕의 PBS 중)으로 블랙 ELISA 플레이트 (팩커드 HTRF-96 블랙 플레이트; 6005207)에서 코팅한다. 200 ㎕/웰의 0.05％ 트윈20을 함유하는 PBS (PBST) 및 0.5％ 탑블록 (유로)으로 3회 세척 후, 남은 단백질 결합 부위를 실온에서 4시간 동안 200 ㎕/웰의 PBST 및 3％ 탑블록으로 블로킹한 다음, 시험 화합물로 처리되거나 처리되지 않은 세포의 용해물 50 L (20 ㎍의 총 단백질/웰)와 함께 3 내지 4시간 동안 4 ℃에서 인큐베이션한다. 3회 세척 후, 블로킹 완충액에서 0.2 ㎍/mL로 희석된 알칼리성 포스파타제 (자이메드)-표지 항-포스포티로신 Ab PY20(AP) 50 ㎕/웰을 첨가하고, 밤새 4 ℃에서 인큐베이션한다. 모든 인큐베이션 단계에서, 플레이트를 플레이트 씰러 (코스타)로 밀봉한다. 최종적으로, 플레이트 를 세척 완충액으로 3회 더 세척하고, 탈이온수로 1회 세척한 후, AP 기질 (에메랄드 II를 함유하는 CPDStar RTU)을 90 ㎕/웰로 첨가한다. 팩커드 탑씰-A 플레이트 씰러로 밀봉된 플레이트를 암실에서 45분간 실온에서 인큐베이션하고, 팩커드 탑 카운트 마이크로플레이트 섬광 계수기 (탑 카운트)를 이용하여 초 당 계수값 (CPS)을 측정함으로써 발광을 정량한다.
비처리된 32D-Bcr/Abl 세포의 용해물에 대해 얻어진 ELISA 판독값 (CPS)과, 분석 배경값 (세포 용해물을 제외한 모든 성분)에 대한 판독값 사이의 차이를 계산하고, 이는 세포에 존재하는 구성적으로 인산화된 Bcr-Abl 단백질을 100％ 반영하는 것으로 간주한다. Bcr-Abl 키나제 활성에 있어서 화합물의 활성은 Bcr-abl 인산화의 감소율로서 나타낸다. IC50 값 (및 IC90 값)은 용량 반응 곡선으로부터 그래프 외삽법에 의해 결정한다.
본 발명의 화합물은 바람직하게는, 자가인산화 억제, 및 Ba/F3 형질감염 세포 (특히, T315I)에서 Bcr-Abl 돌연변이의 IL-3-비의존성 증식의 억제에 대해 50 nM 내지 500 μM 범위의 IC50 값을 나타낼 수 있다.
32D cl3 세포는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection)으로부터 입수하고 (ATCC CRL11346), Ba/F3 세포는 도이체 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; DSMZ, 독일 브라운슈바이크 소재)로부터 입수한다 (DSMZ ACC 300).
문헌 [Palacios et al., Nature, 309:1984, 126, PubMed ID 6201749].
문헌 [Palacios et al., Cell, 41:1985, 727, PubMed ID 3924409].
Ba/F3.p210 세포 및 뮤린 조혈성 32D cl3 세포 (32D p210 세포)는 IL-3-의존성 뮤린 조혈성 Ba/F3 세포주를 p210Bcr-abl (B2A2) cDNA를 함유하는 pGD 벡터로 감염시킴으로써 얻어진다.
문헌 [Daley and Baltimore, 1988]; [Sattler et al., 1996]; [Okuda et al., 1996].
문헌 [Daley, G.Q., Baltimore, D. (1988) Transformation of an interleukin 3-dependent hematopoietic cell line by the chronic myeloid leukemia-specific 210 Bcr-abl protein. PNAS 85,9312-9316].
문헌 [Sattler M, Salgia R, Okuda K, Uemura N, Durstin MA, Pisick E, et al. (1996) The proto-oncogene product p120CBL and the adaptor proteins CRKL and c-CRK link c-ABL, p190Bcr-abl and p210Bcr-abl to the phosphatidylinositol-3' kinase pathway. Oncogene 12, 839-46].
문헌 [Okuda K, Golub TR, Gilliland DG, Griffin JD. (1996) p210Bcr-abl, p190Bcr-abl, and TEL/ABL activate similar transduction pathways in hematopoietic cell lines. Oncogene 13, 1147-52].
c-KIT에 대한 활성 시험
배큘로바이러스 공여체 벡터 pFbacG01 (기브코)을 사용하여, 인간 c-Kit의 세포질 키나제 도메인의 아미노산 544-976으로부터 아미노산 영역을 발현하는 재조 합 배큘로바이러스를 생성한다. c-Kit의 세포질 도메인에 대한 코딩 서열을 인간 자궁 c-DNA 라이브러리 (클론테크 (Clontech))로부터 PCR에 의해 증폭시킨다. 증폭된 DNA 단편 및 pFbacG01 벡터를, BamH1 및 EcoRI를 이용한 절단에 의해 라이게이션에 적합하도록 만든다. 이들 DNA 단편을 라이게이션하면 배큘로바이러스 공여체 플라스미드 c-Kit가 생성된다. 바이러스의 생성, Sf9 세포에서의 단백질 발현, 및 GST-융합 단백질의 정제는 다음과 같이 수행한다.
바이러스의 생성: c-Kit 키나제 도메인을 함유하는 전달 벡터 pFbacG01-c-Kit를 DH10Bac 세포주 (기브코)에 형질감염시키고, 형질감염된 세포를 선별 한천 플레이트 상에 플레이팅한다. 융합 서열이 바이러스 게놈으로 삽입 (박테리아에 의해 운반됨)되지 않은 콜로니는 청색이다. 단일의 백색 콜로니를 피킹하고, 박테리아로부터 표준 플라스미드 정제 절차에 의해 바이러스 DNA (백미드 (bacmid))를 단리한다. 이후, 25 cm2 플라스크 중에서 셀펙틴 (Cellfectin) 시약을 사용하여 Sf9 세포 또는 Sf21 세포 (아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션)를 바이러스 DNA로 형질감염시킨다.
Sf9 세포에서의 소규모 단백질 발현의 측정: 바이러스-함유 배지를 형질감염된 세포 배양물로부터 수집하고, 이를 감염에 사용하여 역가를 증가시킨다. 2회 감염 후에 얻어진 바이러스-함유 배지를 대규모 단백질 발현을 위해 사용한다. 대규모 단백질 발현을 위해, 100 cm2 둥근 조직 배양 플레이트에 플레이트 당 5 × 107개의 세포를 시딩하고, 1 mL의 바이러스-함유 배지 (약 5 MOI)로 감염시킨다. 3 일 후, 세포를 플레이트로부터 긁어내어 5분간 500 rpm으로 원심분리한다. 10 내지 20개의 100 cm2 플레이트로부터의 세포 펠렛을 50 mL의 빙냉 용해 완충액 (25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2 mM EDTA, 1％ NP-40, 1 mM DTT, 1 mM PMSF)에 재현탁시킨다. 세포를 얼음 상에서 15분간 교반한 후, 20분간 5000 rpm으로 원심분리한다.
GST-태그가 부착된 단백질의 정제: 원심분리된 세포 용해물을 2 mL 글루타티온-세파로스 컬럼 (파마시아 (Pharmacia)) 상에 로딩하고, 10 mL의 25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2 mM EDTA, 1 mM DTT, 200 mM NaCl로 3회 세척한다. GST-태그가 부착된 단백질을 25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM 환원 글루타티온, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 10％ 글리세롤의 10회 적용 (각각 1 mL씩)에 의해 용출시키고, -70 ℃에서 저장한다.
키나제 분석: 정제된 GST-c-Kit를 이용한 티로신 단백질 키나제 분석은 200-1800 ng 효소 단백질 (비 활성 (specific activity)에 따라 달라짐), 20　mM Tris-HCl (pH　7.6), 3 mM MnCl2, 3 mM MgCl2, 1　mM DTT, 10　μM Na3VO4, 5　㎍/mL 폴리(Glu,Tyr) 4:1, 1％ DMSO 및 10　μM ATP 및 0.1　μCi [γ33P]ATP를 함유하는 최종 부피 30　mL로 수행한다. 억제제의 존재 또는 부재 하에 [γ33P]ATP로부터의 33P가 폴리(Glu,Tyr) 4:1 기질에 혼입된 수준을 측정함으로써 활성을 분석한다. 96웰 플레이트에서 상기 기재된 조건 하에 20분간 상온에서 분석 (30 ㎕)을 수행하고, 125 mM EDTA 20 ㎕를 첨가함으로써 종결시킨다. 이어서, 40 ㎕의 반응 혼합물을 임모빌론 (Immobilon)-PVDF 막 (미국 메사추세츠주 베드포드에 소재한 밀리포어 (Millipore)) (미리 메탄올 중에서 5분간 침지시킴)으로 옮기고, 물로 세정한 후에 0.5％ H3PO4 중에서 침지시키고, 차단 상태의 진공 공급원을 갖는 진공 매니폴드 (vacuum manifold) 상에 놓는다. 모든 샘플을 스폿팅한 후, 진공을 연결하고, 각 웰을 0.5％ H3PO4 200 ㎕로 세정한다. 막을 분리하고, 진탕기에서 1.0％ H3PO4로 4회 세척하고 에탄올로 1회 세척한다. 이를 상온에서 건조시키고, 팩커드 탑카운트 96웰 프레임 상에 놓고, 마이크로신트 (Microscint, 상표명) (팩커드) 10 ㎕/웰을 첨가한 후에 막을 계수한다. 4가지 농도 (통상적으로 0.01, 0.1, 1 및 10 μM)에서 각 화합물의 억제 백분율에 대한 선형 회귀 분석을 2회씩 수행함으로써 IC50 값을 계산한다. 단백질 키나제 활성 1 단위는 37 ℃에서 1분에 단백질 1 mg 당 [γ33P] ATP로부터 1 nmol의 33P ATP가 기질 단백질로 전달된 것으로 정의된다. 본 발명에 따른 화학식 IA의 화합물의 경우, 바람직하게는 50 nM 내지 500 μM 범위의 IC50 값이 나타날 수 있다.
EphB4에 대한 활성 시험
억제제 또는 에프린 B4 수용체 (EphB4) 키나제로서 화학식 IA의 화합물의 효능은 다음과 같이 입증될 수 있다.
Bac-to-Bac (상표명; 스위스 바젤에 소재한 인비트로젠 라이프 테크놀로지스 (Invitrogen Life Technologies)) GST-융합 발현 벡터의 생성: EphB 군의 전체 세 포질 코딩 영역들을 각각, 인간 태반 또는 뇌로부터 유래된 cDNA 라이브러리로부터 PCR에 의해 증폭시킨다. 인간 EphB4 수용체 (스위스프로트 (SwissProt) 데이타베이스, 기탁 번호 P54760)의 아미노산 566-987로부터 아미노산 영역을 발현하는 재조합 배큘로바이러스를 생성한다. GST 서열을 pFastBac1 (등록상표) 벡터 (스위스 바젤에 소재한 인비트로젠 라이프 테크놀로지스) 내로 클로닝하고, PCR에 의해 증폭시킨다. EphB4-수용체 도메인을 코딩하는 cDNA들을 각각, 상기 변형 FastBac1 벡터 내로 프레임에 맞게 (in frame) GST 서열에 대해 3' 방향으로 클로닝하여 pBac-to-Bac (상표명) 공여체 벡터를 생성한다. 소규모의 플라스미드 생성을 위해, 형질전환으로부터 생성된 단일 콜로니를 접종하여 밤새 배양한다. 플라스미드 DNA의 제한 효소 분석은, 다수의 클론이 예상 크기의 삽입물을 함유함을 보여준다. 삽입물 및 약 50 bp의 플랭킹 (flanking) 벡터의 자동화 서열분석에 의해 두 가닥 모두에서 서열을 확인한다.
바이러스의 생성: 달리 언급되지 않는다면, 각 키나제에 대한 바이러스를 기브코가 제공하는 프로토콜에 따라 제조한다. 요컨대, 키나제 도메인을 함유하는 전달 벡터를 DH10Bac 세포주 (기브코)에 형질감염시키고, 선별 한천 플레이트 상에 플레이팅한다. 융합 서열이 바이러스 게놈으로 삽입 (박테리아에 의해 운반됨)되지 않은 콜로니는 청색이다. 단일의 백색 콜로니를 피킹하고, 박테리아로부터 표준 플라스미드 정제 절차에 의해 바이러스 DNA (백미드)를 단리한다. 이후, 25 cm2 플라스크 중에서 셀펙틴 시약을 사용하여 상기 프로토콜에 따라 Sf9 세포 또는 Sf21 세포를 바이러스 DNA로 형질감염시킨다.
GST-태그가 부착된 키나제의 정제: 원심분리된 세포 용해물을 2 mL 글루타티온-세파로스 컬럼 (파마시아) 상에 로딩하고, 10 mL의 25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2 mM EDTA, 1 mM DTT, 200 mM NaCl로 3회 세척한다. 이후, GST-태그가 부착된 단백질을 25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM 환원 글루타티온, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 10％ 글리세롤의 10회 적용 (각각 1 mL씩)에 의해 용출시키고, -70 ℃에서 저장한다.
단백질 키나제 분석: 단백질 키나제의 활성은 억제제의 존재 또는 부재 하에 [γ33P]ATP로부터의 33P가 기질로서 글루탐산과 티로신의 중합체 (폴리(Glu,Tyr))에 혼입된 수준을 측정함으로써 분석한다. 정제된 GST-EphB (30 ng)를 이용한 키나제 분석은 15 내지 30분간 상온에서, 20　mM Tris-HCl (pH　7.5), 10　mM MgCl2, 3-50 mM MnCl2, 0.01　mM Na3VO4, 1％ DMSO, 1　mM DTT, 3　㎍/mL 폴리(Glu,Tyr) 4:1 (미국 미주리주 세인트루이스에 소재한 시그마) 및 2.0-3.0　μM ATP (γ-[33P]-ATP 0.1　μCi)를 함유하는 최종 부피 30　mL로 수행한다. 125 mM EDTA 20 ㎕를 첨가함으로써 분석을 종결시킨다. 이어서, 반응 혼합물 40 ㎕를 임모빌론-PVDF 막 (미국 매사추세츠주 베드포드에 소재한 밀리포어) (미리 메탄올 중에서 5분간 침지시킴)으로 옮기고, 물로 세정한 후에 0.5％ H3PO4 중에서 침지시키고, 차단 상태의 진공 공급원을 갖는 진공 매니폴드 상에 놓는다. 모든 샘플을 스폿팅한 후, 진공을 연결하고, 각 웰을 0.5％ H3PO4 200 ㎕로 세정한다. 막을 분리하고, 진탕기에서 1.0％ H3PO4로 4회 세척하고 에탄올로 1회 세척한다. 이를 상온에서 건조시키고, 팩커드 탑카운트 96웰 프레임 상에 놓고, 마이크로신트 (상표명) (팩커드) 10 ㎕/웰을 첨가한 후에 막을 계수한다. 4가지 농도 (통상적으로 0.01, 0.1, 1 및 10 μM)에서 각 화합물의 억제 백분율에 대한 선형 회귀 분석을 2회씩 수행함으로써 IC50 값을 계산한다. 단백질 키나제 활성 1 단위는 37 ℃에서 1분에 단백질 1 mg 당 [γ33P] ATP로부터 1 nmol의 33P ATP가 기질 단백질로 전달된 것으로 정의된다. 본 발명에 따른 화학식 IA의 화합물의 경우, 바람직하게는 50 nM 내지 500 μM 범위의 IC50 값이 나타날 수 있다.
EGF-R에 대한 활성 시험:
EGF-R 티로신 키나제 활성의 억제는 공지된 방법에 의해, 예를 들어 EGF-수용체의 재조합 세포내 도메인 (EGF-R ICD; 예를 들어, 문헌 [E. McGlynn et al., Europ. J. Biochem. 207, 265-275 (1992)] 참조)을 이용하여 입증할 수 있다. 화학식 IA의 화합물은 억제제가 없는 대조군과 비교시, 예를 들어 0.05 내지 500 μM의 농도에서 효소 활성을 50％ 억제한다 (IC50).
화학식 IA의 화합물은 EGF-R 티로신 키나제 활성을 억제하는 것 이외에도, 또는 EGF-R 티로신 키나제 활성을 억제하는 대신에, ErbB-2와 같은 수용체 군의 여타 구성원을 억제한다. 억제 활성 (IC50)은 약 0.01 내지 500 μM의 범위이다. ErbB-2 티로신 키나제 (HER-2) 억제 수준은, 예를 들어 EGF-R 단백질 티로신 키나제에 대해 이용되는 방법과 유사한 방식으로 측정될 수 있다 (문헌 [C. House et al., Europ. J. Biochem. 140, 363-367 (1984)] 참조). ErbB-2 키나제는 공지된 프로토콜에 의해, 예를 들어 문헌 [T. Akiyama et al., Science 232, 1644 (1986)]에 따라 단리될 수 있고, 그의 활성이 측정될 수 있다.
VEGF-R2 (KDR)에 대한 활성 시험:
VEGF-유도된 수용체 자가인산화의 억제 수준은, 형질감염된 CHO 세포 (영구적으로 인간 VEGF-R2 수용체 (KDR)를 발현하며, 6웰 세포 배양 플레이트의 완전 배양 배지 (10％ 소 태아 혈청 (=FCS) 함유)에 시딩되고, 약 80％의 전면 배양 (confluency)이 나타날 때까지 5％ CO2 하에 37 ℃에서 인큐베이션됨)와 같은 세포에서의 추가적인 시험관내 실험에 의해 확인될 수 있다. 이후, 시험 화합물을 배양 배지 (FCS 미함유, 0.1％ 소 혈청 알부민 함유) 중에 희석시키고, 세포에 첨가한다 (대조군은 시험 화합물을 함유하지 않는 배지로 구성됨). 이를 2시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션한 후, 재조합 VEGF를 첨가한다 (최종 VEGF 농도는 20 ng/mL임). 이를 37 ℃에서 5분 더 인큐베이션한 후, 세포를 빙냉 PBS (포스페이트-완충 염수)로 2회 세척하고, 100 ㎕/웰의 용해 완충액에 바로 용해시킨다. 이후, 용해물을 원심분리하여 세포 핵을 분리하고, 시판되는 단백질 분석법 (바이오래드 (BIORAD))을 이용하여 상층액의 단백질 농도를 측정한다. 이후, 용해물은 바로 사용될 수 있거나, 필요한 경우 -20 ℃에서 저장될 수 있다.
샌드위치 (sandwich) ELISA를 수행하여 VEGF-R2 인산화 수준을 측정한다: VEGF-R2에 대한 모노클로날 항체 (예를 들어, Mab 1495.12.14; 노파르티스의 토브빈 (H. Towbin)에 의해 제조된 모노클로날 항체 또는 필적하는 모노클로날 항체)를 블랙 ELISA 플레이트 (팩커드의 옵티플레이트 (OptiPlate, 상표명) HTRF-96) 상에 고정시킨다. 이후, 플레이트를 세척하고, 트윈 20 (등록상표) (폴리옥시에틸렌(20)-소르비탄 모노라우레이트, ICI/유니케마 (Uniquema))을 함유하는 포스페이트 완충 염수 (PBST) 중에서 3％ 탑블록 (등록상표; 유로, 카탈로그 번호 TB232010)으로 나머지 유리 단백질-결합 부위를 포화시킨다. 이후, 세포 용해물 (웰 당 20 ㎍의 단백질)을 상기 플레이트에서, 알칼리성 포스파타제와 커플링된 항-포스포티로신 항체 (PY20:AP; 자이메드)와 함께 밤새 4 ℃에서 인큐베이션한다. 이후, (플레이트를 다시 세척한 후) 발광 AP 기질 (어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems)의 CDP-Star, 바로 사용가능한 형태, 에메랄드 II (Emerald II) 함유)을 사용하여, 포획된 인산화 수용체로의 항-포스포티로신 항체의 결합을 분석한다. 팩커드 탑 카운트 마이크로플레이트 섬광 계수기에서 발광 수준을 측정한다. 양성 대조군 (VEGF에 의해 자극됨)의 신호와, 음성 대조군 (VEGF에 의해 자극되지 않음)의 신호와의 차이는 VEGF-유도된 VEGF-R2 인산화 수준 (= 100％)에 상응한다. 시험 물질의 활성은 VEGF-유도된 VEGF-R2 인산화의 억제율 (％)로 계산되며, 최대 억제 수준의 1/2을 유도하는 물질의 농도가 IC50 (50％ 억제를 위한 억제 용량)으로 정의된다. 본 발명에 따른 화학식 IA의 화합물의 경우, 바람직하게는 20 nM 내지 500 μM 범위의 IC50 값이 나타날 수 있다.
재조합 단백질 키나제 Ret (Ret-Men2A), Tie-2 (Tek) 및 FGFR3-K650E에 대한 활성 시험:
재조합 단백질 키나제의 클로닝 및 발현: (Ret); 배큘로바이러스 공여체 벡터 pFB-GSTX3을 사용하여, 인간 Ret-Men2A의 세포질내 키나제 도메인 (Ret의 야생형 키나제 도메인에 상응함)의 아미노산 658-1072로부터 아미노산 영역을 발현하는 재조합 배큘로바이러스를 생성한다. Ret의 세포질 도메인에 대한 코딩 서열을 플라스미드 pBABEpuro RET-Men2A (미국 신시내티 대학교 약학 대학의 제임스 퍼진 박사 (Dr. James Fagin) (노파르티스 공동 연구))로부터 PCR에 의해 증폭시킨다. 증폭된 DNA 단편 및 pFB-GSTX3 벡터를, SalI 및 KpnI를 이용한 절단에 의해 라이게이션에 적합하도록 만든다. 이들 DNA 단편을 라이게이션하면 배큘로바이러스 공여체 플라스미드 pFB-GX3-Ret(-Men2A)가 생성된다.
(Tie-2/Tek): 배큘로바이러스 공여체 벡터 pFbacG01을 사용하여, 인간 Tek의 세포질내 키나제 도메인 (GST에 N-말단 융합됨) [공동 연구를 기초로 하여 마르메 박사 (Dr. Marme) (독일 프라이부르크에 소재한 인스티튜트 오브 몰레큘라 메디신)가 제공함]의 아미노산 773-1124로부터 아미노산 영역을 발현하는 재조합 배큘로바이러스를 생성한다. Tek를 EcoRI 절단 및 EcoRI-절단 pFbacG01 (FBG-Tie2/Tek)로의 라이게이션에 의해 pFbacG01 전달 벡터 내로 재클로닝한다.
(FGFR-3-K650E): 배큘로바이러스 공여체 벡터 pFastBacGST2를 사용하여, 인 간 FGFR-3의 세포질 키나제 도메인 (GST에 N-말단 융합됨) [공동 연구를 기초로 하여 짐 그리핀 박사 (Dr. Jim Griffin) (미국 보스턴 다나 파버 캔서 인스티튜트)가 제공함]의 아미노산 (aa) 411-806으로부터 아미노산 영역을 발현하는 재조합 배큘로바이러스를 생성한다. 아미노산 411-806을 코딩하는 DNA를 PCR에 의해 증폭시키고, pFastBac-GT2 벡터에 삽입하여 pFB-GT2-FGFR3-wt를 생성한다. 이어서, 이 플라스미드를 사용하여, K650에서 돌연변이를 갖는 FGFR3(411-806)을 코딩하는 벡터를 생성한다 (스트라타진 (Stratagene)의 XL-부위 지향 돌연변이 유발 키트를 사용하여 pFB-GT2-FGFR3-K650E를 생성함). 바이러스의 생성, Sf9 세포에서의 단백질 발현, 및 GST-융합 단백질의 정제는 다음 섹션에 기재된 바와 같이 수행한다.
바이러스의 생성: 키나제 도메인을 함유하는 전달 벡터를 DH10Bac 세포주 (기브코)에 형질감염시키고, 선별 한천 플레이트 상에 플레이팅한다. 융합 서열이 바이러스 게놈으로 삽입 (박테리아에 의해 운반됨)되지 않은 콜로니는 청색이다. 단일의 백색 콜로니를 피킹하고, 박테리아로부터 표준 플라스미드 정제 절차에 의해 바이러스 DNA (백미드)를 단리한다. 이후, 25 cm2 플라스크 중에서 셀펙틴 시약을 사용하여 Sf9 세포 또는 Sf21 세포를 바이러스 DNA로 형질감염시킨다.
Sf9 세포에서의 소규모 단백질 발현의 측정: 바이러스-함유 배지를 형질감염된 세포 배양물로부터 수집하고, 이를 감염에 사용하여 역가를 증가시킨다. 2회 감염 후에 얻어진 바이러스-함유 배지를 대규모 단백질 발현을 위해 사용한다. 대규모 단백질 발현을 위해, 100 cm2 둥근 조직 배양 플레이트에 플레이트 당 5 × 107개의 세포를 시딩하고, 1 mL의 바이러스-함유 배지 (약 5 MOI)로 감염시킨다. 3일 후, 세포를 플레이트로부터 긁어내어 5분간 500 rpm으로 원심분리한다. 10 내지 20개의 100 cm2 플레이트로부터의 세포 펠렛을 50 mL의 빙냉 용해 완충액 (25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2 mM EDTA, 1％ NP-40, 1 mM DTT, 1 mM MSF)에 재현탁시킨다. 세포를 얼음 상에서 15분간 교반한 후, 20분간 5000 rpm으로 원심분리한다.
GST-태그가 부착된 키나제의 정제: 원심분리된 세포 용해물을 2 mL 글루타티온-세파로스 컬럼 상에 로딩하고, 10 mL의 25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2 mM EDTA, 1 mM DTT, 200 mM NaCl로 3회 세척한다. 이후, GST-태그가 부착된 단백질을 25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM 환원 글루타티온, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 10％ 글리세롤의 10회 적용 (각각 1 mL씩)에 의해 용출시키고, -70 ℃에서 저장한다.
효소 활성의 측정: 정제된 GST-Ret, GST-Tek 또는 GST-FGFR-3-K650E를 이용한 티로신 단백질 키나제 분석은, 다음과 같은 성분들을 갖는 최종 부피 30 ㎕로 수행한다. Ret에는 15 ng GST-Ret, 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM MnCl2, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 3 ㎍/mL 폴리(Glu,Tyr) 4:1, 1％ DMSO 및 2.0 μM ATP (γ-[33P]-ATP 0.1 μCi)가 포함된다. Tek에는 150 ng GST-Tek, 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 3 mM MnCl2, 3 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0.01 mM Na3VO4, 250 ㎍/mL PEG 20,000, 10 ㎍/mL 폴리(Glu,Tyr) 4:1, 1％ DMSO 및 4.0 μM ATP (γ-[33P]-ATP 0.1 μCi)가 포함된다. FGFR-3-K650E에는 10 ng GST-FGFR-3-K650E, 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 3 mM MnCl2, 3 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0.01 mM PEG 20,000, 10 ㎍/mL 폴리(Glu,Tyr) 4:1, 1％ DMSO 및 4.0 μM ATP (γ-[33P]-ATP 0.1 μCi)가 포함된다. 억제제의 존재 또는 부재 하에 [γ33P]ATP로부터의 33P가 폴리(Glu,Tyr) 4:1에 혼입된 수준을 측정함으로써 활성을 분석한다. 96웰 플레이트에서 상기 기재된 조건 하에 30분간 상온에서 분석을 수행하고, 125 mM EDTA 50 ㎕를 첨가함으로써 종결시킨다. 이어서, 60 ㎕의 반응 혼합물을 임모빌론-PVDF 막 (미국 메사추세츠주 베드포드에 소재한 밀리포어) (미리 메탄올 중에서 5분간 침지시킴)으로 옮기고, 물로 세정한 후에 0.5％ H3PO4 중에서 5분간 침지시키고, 차단 상태의 진공 공급원을 갖는 진공 매니폴드 상에 놓는다. 모든 샘플을 스폿팅한 후, 진공을 연결하고, 각 웰을 0.5％ H3PO4 200 ㎕로 세정한다. 막을 분리하고, 진탕기에서 1.0％ H3PO4로 4회 세척하고 에탄올로 1회 세척한다. 이를 상온에서 건조시키고, 팩커드 탑카운트 96웰 프레임 상에 놓고, 마이크로신트 (상표명) (팩커드) 10 ㎕/웰을 첨가한 후에 막을 계수한다. 4가지 농도 (통상적으로 0.01, 0.1, 1 및 10 μM)에서 각 화합물의 억제 백분율에 대한 선형 회귀 분석을 2회씩 수행함으로써 IC50 값을 계산한다. 단백질 키나제 활성 1 단위는 37 ℃에서 1분에 단백질 1 mg 당 [γ33P] ATP로부터 1 nmol의 33P ATP가 기질 단백질로 전달된 것으로 정의된다. 본 발명에 따른 화학식 IA의 화합물의 경우, 바람직하게는 50 nM 내지 500 μM 범위의 IC50 값이 나타날 수 있다.
FGFR3 (효소 분석)
정제된 FGFR3 (업스테이트)을 이용한 키나제 활성 분석은, 키나제 완충액 (30 mM Tris-HCl (pH 7.5), 15 mM MgCl2, 4.5 mM MnCl2, 15 μM Na3VO4 및 50 ㎍/mL BSA) 중에 효소 0.25 ㎍/mL 및 기질 (5 ㎍/mL 비오틴-폴리-EY(Glu, Tyr) (CIS-US, Inc.) 및 3 μM ATP)을 함유하는 최종 부피 10 ㎕로 수행한다. 2가지 용액을 다음과 같이 제조한다. 키나제 완충액 중의 FGFR3 효소를 함유하는 제1 용액 (5 ㎕)을 우선 384웰 방식 프록시플레이트 (ProxiPlate, 등록상표) (퍼킨-엘머 (Perkin-Elmer))에 분배한 후에 DMSO에 용해된 화합물 50 nL를 첨가한 다음, 키나제 완충액 중의 기질 (폴리-EY) 및 ATP를 함유하는 제2 용액 (5 ㎕)을 각 웰에 첨가한다. 반응물을 실온에서 1시간 인큐베이션하고, 10 ㎕의 HTRF 검출 혼합물 [30 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.5 M KF, 50 mM ETDA, 0.2 mg/mL BSA, 15 ㎍/mL 스트렙타비딘-XL665 (CIS-US, Inc.) 및 150 ng/mL 크립테이트와 컨쥬케이션된 항-포스포티로신 항체 (CIS-US, Inc.) 함유]을 첨가함으로써 중지시킨다. 스트렙타비딘-비오틴 상호작용이 달성되도록 이를 실온에서 1시간 인큐베이션한 후, 애널리스트 GT (몰레큘라 디바이시스 코포레이션 (Molecular Devices Corp.)) 상에서 시간-분해 형광 신호를 판독한다. 12가지 농도 (50 μM → 0.28 nM 1:3 희석)에서 각 화합물의 억제 백분율에 대한 선형 회귀 분석을 수행함으로써 IC50 값을 계산한다. 예를 들어, 이 분석에서 본 발명의 화합물은 바람직하게는 2 nM 내지 400 μM 범위, 보다 바람 직하게는 5 nM 내지 100 μM 범위의 IC50을 가질 수 있다.
FGFR3 (세포 분석)
본 발명의 화합물 (화학식 IA의 화합물)을 형질전환된 Ba/F3-TEL-FGFR3 세포 증식의 억제 능력에 대해 시험한다 (FGFR3 세포 키나제 활성에 좌우됨). Ba/F3-TEL-FGFR3을 배양 배지로서의 현탁액 (10％ 소 태아 혈청이 보강된 RPMI 1640 함유) 중에서 800,000 세포/mL까지 배양한다. 384웰 방식 플레이트에서 세포를 50 ㎕ 배양 배지에 5000개 세포/웰로 분배한다. 본 발명의 화합물을 디메틸술폭시드 (DMSO)에 용해 및 희석시킨다. 12지점 1:3 연속 희석액을 DMSO 중에서 제조하여, 통상적으로 10 mM → 0.05 μM 범위의 농도 구배를 생성한다. 세포에 50 nL의 희석 화합물을 첨가하고, 세포 배양 인큐베이터에서 48시간 동안 인큐베이션한다. 증식 세포에 의해 생성되는 환원 환경을 모니터링하기 위해 이용될 수 있는 알라마블루 (AlamarBlue, 등록상표) (TREK 다이아그노스틱 시스템즈 (TREK Diagnostic Systems))를 세포에 첨가한다 (10％ 최종 농도). 이를 세포 배양물 인큐베이터 (37 ℃)에서 추가 4시간 동안 인큐베이션한 후, 환원 알라마블루 (등록상표) (530 nm에서 여기되고, 580 nm에서 방출됨)로부터의 형광 신호를 애널리스트 GT (몰레큘라 디바이시스 코포레이션) 상에서 정량한다. 12가지 농도에서 각 화합물의 억제 백분율에 대한 선형 회귀 분석을 수행함으로써 IC50 값을 계산한다. 본 발명에 따른 화학식 IA의 화합물의 경우, 바람직하게는 2 nM 내지 400 μM 범위의 IC50 값이 나타날 수 있다.
업스테이트의 키나제프로파일러 (KinaseProfiler, 상표명) - 방사선-효소 여과 결합 분석
본 발명의 화합물을 키나제 패널의 개별 구성원의 억제 능력에 대해 평가한다 (키나제의 부분적인 비제한적 목록에는 Abl, Bcr-abl, BMX, FGFR3, Lck, JNK1, JNK2, CSK, RAF, MKK6 및 P38이 포함됨). 화합물을 일반적인 프로토콜에 따라 최종 농도 10 μM로 2회씩 시험한다. 키나제 완충액 조성 및 기질은 "업스테이트 키나제프로파일러 (상표명)" 패널에 포함된 키나제의 종류에 따라 달라진다는 점을 주의한다. 화합물을 일반적인 프로토콜에 따라 최종 농도 10 μM로 2회씩 시험한다. 키나제 완충액 조성 및 기질은 "업스테이트 키나제프로파일러 (상표명)" 패널에 포함된 키나제의 종류에 따라 달라진다는 점을 주의한다. 키나제 완충액 (2.5 ㎕, 10x - 필요시 MnCl2 함유), 활성 키나제 (0.001 내지 0.01 단위; 2.5 ㎕), 특정 폴리(Glu4-Tyr) 펩티드 (5-500 μM 또는 0.01 mg/mL) (키나제 완충액 중) 및 키나제 완충액 (50 μM; 5 ㎕)을 에펜도르프 장치의 얼음 상에서 혼합한다. Mg/ATP 믹스 (10 ㎕; 67.5 (또는 33.75) mM MgCl2, 450 (또는 225) μM ATP 및 1 μCi/㎕ [γ-32P]-ATP (3000 Ci/mmol))를 첨가하고, 반응물을 약 30 ℃에서 약 10분간 인큐베이션한다. 반응 혼합물을 2 cm × 2 cm P81 (포스포셀룰로스, (+) 하전된 펩티드 기질의 경우) 또는 와트먼 (Whatman) No. 1 (폴리(Glu4-Tyr) 펩티드 기질의 경우) 페이퍼 스퀘어 상에 스폿팅 (20 ㎕)한다. 분석 스퀘어를 0.75％ 인산으로 4회 세척하고 (각각 5분간), 아세톤으로 5분간 1회 세척한다. 분석 스퀘어를 섬광 바이알에 옮기고, 5 mL 섬광 칵테일을 첨가하고, 펩티드 기질에 혼입된 32P의 수준 (cpm)을 벡먼 섬광 계수기로 정량한다. 각 반응에 대해 억제 백분율을 계산한다.
또한, 화학식 IA의 화합물은 또다른 티로신 단백질 키나제, 예를 들어 특히, 동물, 특히 포유동물의 세포 (인간 세포 포함)에서 성장 조절 및 형질전환에 참여하는 c-Src 키나제를 억제할 수 있다. 적절한 분석법은 문헌 [Andrejauskas-Buchdunger et al., Cancer Res. 52, 5353-8 (1992)]에 기재되어 있다. 상기 시험 시스템 이용시, 화학식 IA의 화합물은 c-Src의 억제에 대해, 예를 들어 0.05 내지 500 μM 범위의 IC50 값을 나타낼 수 있다.
또한, 화학식 IA의 화합물은 b-raf (V599E)를 억제하는 데 사용될 수 있다. 억제제의 존재 또는 부재 하에 [γ33P]ATP로부터의 33P가 (His)-IκB에 혼입된 수준을 측정함으로써 B-Raf-V599E의 활성을 분석한다. 시험 화합물을 DMSO (10 mM)에 용해시키고, -20 ℃에서 저장한다. 연속 희석액을 DMSO 중에서 새롭게 제조하고, 순수한 물로 추가로 희석시켜 3회 농축 시험 용액 (3％ DMSO 중)을 얻는다. 분석물의 최종 부피 (30 ㎕)는 10 ㎕의 시험 용액 (1％ DMSO), 10 ㎕의 분석 믹스 (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 3 mM MnCl2, 3 mM MgCl2, 1 nM DTT, 3 ㎍/mL (His)-IκB, 1％ DMSO 및 3.5 μM ATP [γ33P]-ATP 0.1 μCi) 및 10 ㎕의 효소 희석액 (600 ng GST-B-Raf-V599E)을 함유한다. 피펫팅 단계가 멀티프로브 (MultiPROBE) Iix, 멀티프로브 IILx 또는 해밀턴스타 (HamiltonSTAR) 로보트 상에서 96웰 방식으로 수행되 도록 프로그래밍한다. 문헌 (문헌 [C. Garcia-Echeverria et al., Cancer Cel.. 5, 231-9 (2004)] 참조)에 기재된 바와 같이 분석을 수행한다 (20 ㎕의 125 mM EDTA를 첨가함으로써 종결됨). 필터 결합 방법에 의해 인산화 펩티드의 포획을 다음과 같이 수행한다. 40 ㎕의 반응 혼합물을 임모빌론-PVDF 막 (미리 메탄올 중에서 5분간 침지시킴)으로 옮기고, 물로 세정한 후에 0.5％ H3PO4 중에서 침지시키고, 차단 상태의 진공 공급원을 갖는 진공 매니폴드 상에 놓는다. 모든 샘플을 스폿팅한 후, 진공을 연결하고, 각 웰을 200 ㎕의 0.5％ H3PO4로 세정한다. 유리된 막을 분리하고, 진탕기에서 1.0％ H3PO4로 4회 세척하고, 에탄올로 1회 세척한다. 이를 상온에서 건조시키고, 팩커드 탑카운트 96웰 프레임 상에 놓고, 마이크로신트 (상표명) 10 ㎕/웰을 첨가한 후에 막을 계수한다. 최종적으로, 플레이트를 밀폐시키고, 마이크로플레이트 섬광 계수기 (탑카운트 NXT, 탑카운트 NXT HTS)에서 계수한다. 플래시 플레이트 방법의 경우, 우선 키나제 반응을 폴리스티렌계 플라스틱 플레이트에서 수행한 다음, 60분 후에 20 ㎕의 125 mM EDTA를 첨가함으로써 중지시킨다. 포획 (60분, 실온)을 위해, 바이오티닐화 기질을 니켈-코팅 플래시 플레이트에 옮긴다. 분석 플레이트를 PBS로 3회 세척하고, 실온으로 건조시킨다. 이후, 플레이트를 밀폐시키고, 마이크로플레이트 섬광 계수기 (탑카운트 NXT, 탑카운트 NXT HTS)에서 계수한다. 4가지 농도 (통상적으로 0.01, 0.1, 1 및 10 μM)에서 화합물에 의한 억제 백분율의 선형 회귀 분석을 2회씩 수행함으로써 IC50 값을 계산하 거나, 8-단일 지점 IC50 (10 μM에서 출발하고, 이어서 1:3 희석)으로서 IC50 값을 계산한다. b-raf 억제의 경우, 화학식 IA의 화합물은 바람직하게는 0.05 내지 500 μM 범위의 IC50 값을 나타낼 수 있다.
FLT3 수용체 키나제
FLT3을 표적으로 하는 화합물을 발견하기 위해, 2가지의 상이한 분석법이 이용될 수 있다.
Flt3 키나제 활성은 다음과 같이 측정한다. 배큘로바이러스 공여체 벡터 pFbacG01 (기브코)을 사용하여, 인간 Flt3의 세포질 키나제 도메인의 아미노산 563-993으로부터 아미노산 영역을 발현하는 재조합 배큘로바이러스를 생성한다. Flt3의 세포질 도메인에 대한 코딩 서열을 인간 자궁 c-DNA 라이브러리 (클론테크)로부터 PCR에 의해 증폭시킨다. 증폭된 DNA 단편 및 pFbacG01 벡터를, BamH1 및 HindIII을 이용한 절단에 의해 라이게이션에 적합하도록 만든다. 이들 DNA 단편을 라이게이션하면 배큘로바이러스 공여체 플라스미드 Flt-3(1.1)이 생성된다. 바이러스의 생성, Sf9 세포에서의 단백질 발현, 및 GST-융합 단백질의 정제는 다음과 같이 수행한다.
바이러스의 생성: Flt3 키나제 도메인을 함유하는 전달 벡터 pFbacG01-Flt-3을 DH10Bac 세포주 (기브코)에 형질감염시키고, 형질감염된 세포를 선별 한천 플레이트 상에 플레이팅한다. 융합 서열이 바이러스 게놈으로 삽입 (박테리아에 의해 운반됨)되지 않은 콜로니는 청색이다. 단일의 백색 콜로니를 피킹하고, 박테리아 로부터 표준 플라스미드 정제 절차에 의해 바이러스 DNA (백미드)를 단리한다. 이후, 플라스크 중에서 셀펙틴 시약을 사용하여 Sf9 세포 또는 Sf21 세포 (아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션)를 바이러스 DNA로 형질감염시킨다.
Sf9 세포에서의 소규모 단백질 발현의 측정: 바이러스-함유 배지를 형질감염된 세포 배양물로부터 수집하고, 이를 감염에 사용하여 역가를 증가시킨다. 2회 감염 후에 얻어진 바이러스-함유 배지를 대규모 단백질 발현을 위해 사용한다. 대규모 단백질 발현을 위해, 100 cm2 둥근 조직 배양 플레이트에 플레이트 당 5 × 107개의 세포를 시딩하고, 1 mL의 바이러스-함유 배지 (약 5 MOI)로 감염시킨다. 3일 후, 세포를 플레이트로부터 긁어내어 5분간 500 rpm으로 원심분리한다. 10 내지 20개의 100 cm2 플레이트로부터의 세포 펠렛을 50 mL의 빙냉 용해 완충액 (25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2 mM EDTA, 1％ NP-40, 1 mM DTT, 1 mM PMSF)에 재현탁시킨다. 세포를 얼음 상에서 15분간 교반한 후, 20분간 5000 rpm으로 원심분리한다.
GST-태그가 부착된 키나제의 정제: 원심분리된 세포 용해물을 2 mL 글루타티온-세파로스 컬럼 (파마시아) 상에 로딩하고, 10 mL의 25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2 mM EDTA, 1 mM DTT, 200 mM NaCl로 3회 세척한다. 이후, GST-태그가 부착된 단백질을 25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM 환원 글루타티온, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 10％ 글리세롤의 10회 적용 (각각 1 mL씩)에 의해 용출시키고, -70 ℃에서 저장한다.
효소 활성의 측정: 정제된 GST-Flt2를 이용한 티로신 단백질 키나제 분석은 200-1800 ng 효소 단백질 (비 활성에 따라 달라짐), 20　mM Tris-HCl (pH　7.6), 3 mM MnCl2, 3 mM MgCl2, 1　mM DTT, 10　μM Na3VO4, 3　㎍/mL 폴리(Glu,Tyr) 4:1, 1％ DMSO 및 6.0　μM ATP 및 0.1　μCi [γ33P]ATP를 함유하는 최종 부피 30　mL로 수행한다. 억제제의 존재 또는 부재 하에 [γ33P]ATP로부터의 33P가 폴리(Glu,Tyr) 4:1 기질에 혼입된 수준을 측정함으로써 활성을 분석한다. 96웰 플레이트에서 상기 기재된 조건 하에 20분간 상온에서 분석 (30 ㎕/웰)을 수행하고, 125 mM EDTA 20 ㎕를 첨가함으로써 종결시킨다. 이어서, 40 ㎕의 반응 혼합물을 임모빌론-PVDF 막 (미국 메사추세츠주 베드포드에 소재한 밀리포어) (미리 메탄올 중에서 5분간 침지시킴)으로 옮기고, 물로 세정한 후에 0.5％ H3PO4 중에서 5분간 침지시키고, 차단 상태의 진공 공급원을 갖는 진공 매니폴드 상에 놓는다. 모든 샘플을 스폿팅한 후, 진공을 연결하고, 각 웰을 0.5％ H3PO4 200 ㎕로 세정한다. 막을 분리하고, 진탕기에서 1.0％ H3PO4로 4회 세척하고 에탄올로 1회 세척한다. 이를 상온에서 건조시키고, 팩커드 탑카운트 96웰 프레임 상에 놓고, 마이크로신트 (상표명) (팩커드) 10 ㎕/웰을 첨가한 후에 막을 계수한다. 4가지 농도 (통상적으로 0.01, 0.1, 1 및 10 μM)에서 각 화합물의 억제 백분율에 대한 선형 회귀 분석을 2회씩 수행함으로써 IC50 값을 계산한다. 단백질 키나제 활성 1 단위는 37 ℃에서 1분에 단백질 1 mg 당 [γ33P] ATP로부터 1 nmol의 33P ATP가 기질 단백질로 전달된 것으로 정의된 다. 화학식 IA의 화합물은, 바람직하게는 0.05 내지 500 μM 범위의 IC50 값을 나타낼 수 있다.
또한, 세포 기반 분석법을 이용하여 돌연변이 FLT3 티로신 키나제 수용체의 억제제를 확인할 수 있다. 일반적인 기술에는, 증식을 위해 돌연변이 FLT3에 의존하는 세포주와, 증식을 위해 돌연변이체 FLT3에 의존하지 않는 세포주에 대한 가능한 억제제들의 효과를 비교하는 것이 포함한다. 2종의 상이한 형태의 돌연변이 및 활성화 FLT3을 발현하는 세포주가 사용된다:
- 수용체의 막-인접 도메인 내에서 "내부 직렬 반복부 (ITD)"를 갖는 FLT3 돌연변이를 발현하는 Ba/F3-FLT3-ITD 세포.
- 위치 835의 아스파라긴을 티로신으로 전환시키는 돌연변이를 함유하는 FLT3 수용체를 발현하는 Ba/F3-FLT3-D835Y 세포.
바람직하게는, 화학식 IA의 화합물은 50 nM 내지 500 μM의 IC50에서 Ba/F3-FLT3-ITD 및 Ba/F3-D835Y 세포의 증식을 억제하는 것으로 나타날 수 있고, 한편 이들은 통상적으로 500 nM 이하의 농도에서 비-형질전환된 Ba/F3 세포의 성장을 억제하지 않으며, Ba/F3-FLT3-ITD 세포에 대한 화학식 IA의 화합물의 성장 억제 효과는 또다른 생존 신호를 제공하기 위한 고농도의 IL-3의 첨가에 의해 역전될 수 있다. 화학식 IA의 화합물은 FLT3-의존성 세포주 증식의 억제에 필요한 농도에서, 돌연변이 FLT3 수용체 (과다활성화 키나제)를 갖지 않는 다수의 인간 백혈병 및 림프종 세포주에 대한 세포독성제가 아닌 것으로 나타날 수 있고, 이는 그 약물이 세포독 성제로서 예상하지 못한 높은 수준의 특이성을 갖는다는 점을 시사한다. 결국, 상기 결과는, 화학식 IA의 화합물이 돌연변이 FLT3 수용체 티로신 키나제 활성의 강력한 억제제일 수 있고 돌연변이 FLT3 수용체를 갖는 환자의 치료에 사용될 유망한 후보임을 나타낸다. 특히, 화학식 IA의 화합물은 0.05 내지 500 μM 범위의 농도에서 FLT3 수용체 티로신 키나제 활성을 억제하는 것으로 나타날 수 있다.
상기 기재된 억제 연구를 기초로 하여, 본 발명에 따른 화학식 IA (또는 그의 예시적인 화학식)의 화합물은, 특히 단백질 키나제에 의존성인 장애 (= 특히, 단백질 키나제의 조절, 보다 구체적으로는 억제에 반응하는 장애), 특히 증식성 질환, 예를 들어 상기 "배경기술"에서 언급된 질환에 대한 치료적 효능을 나타낸다.
또한, 화학식 IA의 화합물의 생체내 항종양 활성을 입증하는 실험이 존재한다. 예를 들어, 화학식 IA의 화합물이 방광 암종의 성장을 억제하는지 여부를 시험하기 위해 다음과 같은 시험 시스템이 적용될 수 있다.
RT-112 인간 방광 전이성 세포 암종 세포주를 본 발명에 기재된 화합물의 생체내 활성을 시험하기 위한 생체내 모델로서 이용한다. 상기 세포주는 처치되지 않은 원발성 방광 암종을 갖는 여성 환자 (연령 미상, 1973)로부터 유래된다. 이 세포주는 FGF-R3을 높은 수준으로 발현한다.
5 × 106개의 세포를 마트리겔 (matrigel)과 함께 암컷 누드 마우스 (n=8)의 옆구리에 피하 접종하고, 종양을 발생시킨다. 종양 크기를 2 내지 3일마다 캘리퍼를 이용하여 수동으로 측정한다. 동물 체중을 동물 건강의 척도로서 모니터링 한다.
억제제 처치는 종양 부피가 약 100 mm3에 도달했을 때 (약 7 일) 시작한다. 마우스를 종양 부피에 따라 임의 선택하고, 14일간 비히클 (NMP/PEG300) 또는 시험 화합물 (n=8)로 처치한다. 투여 경로는 경구 위관이고, 일정은 1x 일/ 7x 주이다. 항종양 활성을 T/C％ [(처치된 동물의 평균 종양 부피 변화량 / 대조군 동물의 평균 종양 부피 변화량) × 100]로서 계산한다
이종이식 종양 크기를 캘리퍼를 이용하여 수동으로 측정하고, 식 (W × H × L) × π/6 [여기서, 폭 (W), 높이 (H) 및 길이 (L)는 가장 큰 3개의 직경임]을 이용하여 종양 부피를 추정한다.
시그마스탯 (SigmaStat) 2.03을 이용하여 통계적 평가를 수행한다. 3개 이상의 동물 군이 실험에 포함된 경우, 평가 당일에 한방향 ANOVA 시험을 이용하여 절대 종양 부피 또는 체중에 대한 통계적 평가를 수행한다. 대조군을 다른 모든 처치 군과 비교시 던넷 (Dunnett)의 ad hoc 포스트 시험을 이용한다. 모든 군을 서로와 비교하여 평가시 터키 (Tukey) 및 SNK (스튜던트-뉴원-쿨스 (Student-Newman-Keuls)) ad hoc 포스트 시험을 이용한다.
종양 샘플을 절개하고, 액체 N2에서 스냅 냉동시킨다. 냉동 상태를 유지하면서 종양을 분쇄한다. 분취량의 냉동 분말을 프로테아제 및 포스파타제 억제제를 함유하는 1％ 트리톤 추출 완충액에 용해시킨다. 용해물을 원심분리에 의해 투명하게 만들고, 단백질 농도를 측정한다. 단백질 용해물을 사용하여 종양에서의 FGFR 수용체 및 경로의 억제 수준을 측정한다.
본 발명에 기재된 화학식 IA의 화합물은 종양 성장을 억제하며 10 mg/kg 이상의 용량으로 퇴행을 유도할 수 있다.
개시된 화학식 IA의 화합물에 의해 억제되는 키나제의 예로는 c-Abl 및 Bcr-Abl이 언급될 수 있고, 특히 Bcr-Abl의 억제가 언급될 수 있다. 억제되는 또다른 키나제는 티로신 키나제 수용체 VEGF-R, 특히 VEGF 수용체 KDR (VEGF-R2)이다. 또한, 본 발명의 화합물은 돌연변이 형태의 Bcr-Abl 키나제를 억제한다. 개시된 화합물은 상기 및/또는 그밖의 단백질 티로신 키나제 및/또는 비-수용체 티로신 키나제 Raf 중 하나 이상의 억제에 적절하고/거나 이들 효소의 돌연변이의 억제에 적절하다. 활성의 측면에서, 상기 화합물은, 특히 상기 유형의 키나제, 특히 언급된 키나제의 비정상적이거나 과도한 활성과 관련된 질환의 치료를 위해 사용될 수 있다.
바람직하게는, 단백질 키나제 활성의 조절 능력은 단백질 키나제 활성의 억제 수준을 나타낸다.
예를 들어, VEGF-수용체 티로신 키나제 활성 억제제로서 본 발명의 화합물은 혈관 성장을 1차적으로 억제할 수 있고, 따라서 이들은 예를 들어, 탈조절화된 맥관형성과 관련된 수많은 질환, 특히 안구 혈관신생으로 인한 질환, 특히 망막병증, 예를 들어 당뇨병성 망막병증 또는 노화-관련 황반 변성, 건선, 혈관모세포종, 예를 들어 혈관종, 혈관간 (mesangial) 세포 증식성 장애, 예를 들어 만성 또는 급성 신장 질환, 예를 들어 당뇨병성 신장병증, 악성 신장경화증, 혈전성 미세혈관병증 성 증후군 또는 이식 거부증, 또는 특히 염증성 신장 질환, 예를 들어 사구체신염, 특히 사구체간질증식성 사구체신염, 용혈성-요독성 증후군, 당뇨병성 신장병증, 고혈압성 신장경화증, 아테롬, 동맥 재협착, 자가면역성 질환, 당뇨병, 자궁내막증, 만성 천식, 및 특히, 신생물성 질환 (고형 종양, 및 백혈병 및 여타 "액형 종양", 특히 c-kit, KDR, Flt-1 또는 Flt-3을 발현하는 종양들), 예를 들어 특히, 유방암, 대장암, 폐암 (특히, 소세포 폐암), 전립선암 또는 카포시 육종 (Kaposi's sarcoma)에 대해 효과적이다. 화학식 IA (또는 그의 예시적인 화학식)의 화합물 (또는 그의 N-옥시드)는 종양 성장을 억제하며, 특히 종양의 전이성 확장 및 미세전이의 성장을 예방하도록 적합화되었다.
본 발명의 화합물의 한 표적 키나제 군은 Bcr-Abl 돌연변이이다. 특히, 돌연변이 Glu255→리신, Glu255→발린 또는 Thr315→이소류신, 가장 특히 Thr315→이소류신 돌연변이가 언급될 수 있다.
그밖의 Bcr-Abl 돌연변이로는 Met244→Val, Phe317→Leu, Leu248→Val, Met343→Thr, Gly250→Ala, Met351→Thr, Gly250→Glu, Glu355→Gly, Gln252→His, Phe358→Ala, Gln252→Arg, Phe359→Val, Tyr253→His, Val379→Ile, Tyr253→Phe, Phe382→Leu, Glu255→Lys, Leu387→Met, Glu255→Val, His396→Pro, Phe311→Ile, His396→Arg, Phe311→Leu, Ser417→Tyr, Thr315→Ile, Glu459→Lys 및 Phe486→Ser이 포함된다.
특히, 화학식 IA의 화합물은 Flt-3의 티로신 키나제 도메인의 억제를 통해 AML을 치료하기에 유용하다. 본 발명의 또다른 실시양태는 치료적 유효량의 청구 된 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 급성 골수성 백혈병 (AML)의 치료 방법이다.
화학식 IA의 화합물 (또는 그의 (특히, 제약상 허용되는) 염)은 그의 FGFR 억제 능력으로 인해, (특히, 비정상적인) 성장, 조직 회복, 리모델링; 세포 이동, 세포 분화, 골격 및/또는 사지 발달, 상처 치유, 신호 전달, 조혈 및/또는 맥관형성, 및 종양형성, 또는 종양 또는 암 (전이 및 전이 형성 포함)의 치료, 특히 인간 종양, 예를 들어 비-소세포 폐암, 편평 암종 (두경부), 유방암, 위암, 예를 들어 췌장 선암종, 난소암, 대장암 및/또는 전립선 암, 및 성상세포종, 신경교종, 방광암, 상피암, 예를 들어 방광암 또는 자궁경부암, 다발성 골수종, 편평 암종 (두경부), 예를 들어 구강 편평 세포 암종, 망막모세포종, 육종, 예를 들어 활막성 암종, 및/또는 피부 종양; 8p11 골수증식성 증후군 (= 호산구성 골수증식성 증후군 (EMS)); 골격 이상, 인간 왜소증, 예를 들어 연골무형성증, 두개골조기유합 증후군 및 왜소 증후군, 골격 이형성증, 예를 들어 연골저형성증, 발달 지체를 수반하는 중증 연골무형성증, 흑색극세포증, 치사성 이형성증, 두개골조기유합증 표현형, 예를 들어 뮌케 관상 두개골조기유합증 또는 흑색극세포증을 수반하는 크루존 증후군, 파이퍼 증후군, 연골세포 성숙 억제, 골 성장 억제; 염증성 또는 자가면역성 질환, 예를 들어 류마티스성 관절염 (RA), 콜라겐 II 관절염, 다발성 경화증 (MS), 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 건선, 연소성 당뇨병, 쇼그렌 질환, 갑상선 질환, 사르코이드증, 자가면역성 포도막염, 염증성 장 질환 (크론 질환 및 궤양성 대장염), 복강 질환 및/또는 중증 근무력증; 상염색체 우성 저인산혈성 구루병 (ADHR), X-염색체-연관 저인산혈성 구루병 (XLH), 종양-유발 골연화증 (TIO), 섬유성 골 이형성증 (FH); 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD); 비만증, 당뇨병 및/또는 관련 질환, 예를 들어 대사성 증후군, 심혈관 질환, 고혈압, 비정상적인 콜레스테롤 및 트리글리세리드 수준, 피부 장애 (예를 들어, 감염, 정맥류성 정맥, 흑색극세포증, 습진, 운동 불내성, 2형 당뇨병, 인슐린 내성, 고콜레스테롤혈증, 담석증, 정형외과적 손상, 혈전색전성 질환, 관상동맥 또는 혈관 억제 (예를 들어, 아테롬성 동맥경화증), 주간졸림증, 수면성 무호흡, 말기 신장 질환, 담낭 질환, 통풍, 고열 장애, 면역 반응 손상, 호흡 기능 손상, 상처후 감염, 불임증, 간 질환, 요통, 산부인과 합병증, 췌장염, 뇌졸중, 외과 합병증, 복압성 요실금 및/또는 위장관 장애의 치료에 특히 유용하다.
특정 키나제 억제제를 연골에 국소적으로 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 연골에서 국소적 연골신생 (neochondrogenesis)을 촉진하는 방법은 WO 2006/038112에 기재되어 있다. 놀랍게도, 본원에 기재된 화학식 IA의 화합물이 그와 동일한 방식으로 이용될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 또한, 상기 기재된 화학식 IA의 우레아 유도체 또는 그의 제약상 허용되는 염, 수화물, 용매화물, 에스테르, N-옥시드 보호 유도체, 개별 이성질체 및 이성질체 혼합물 또는 그의 전구약물을 국소적 연골신생의 촉진에 효과적인 양으로 연골에 국소적으로 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 연골에서 국소적 연골신생을 촉진하는 방법에 관한 것이다.
"치료"란 용어에는 (예를 들어, 돌연변이 또는 변화가 발견되어 질환이 발생하기 쉽거나 쉬울 수 있는 환자에서의) 예방 (prophylaxis), 예를 들어 예방적 처 치, 또는 바람직하게는 상기 질환, 특히 상기 언급된 질환들 중 임의의 하나 이상의 치료적 처치 (완화적, 치유적, 증상-완화적, 증상-경감적, 질환- 또는 증상-억제적, 진행-지연적, 키나제-조절적 및/또는 키나제-억제적 처치 (이에 제한되지는 않음) 포함)가 포함된다.
동물의 치료가 바람직하다. 상기 동물은 바람직하게는 온혈 동물, 보다 바람직하게는 포유동물이다. 인간 (일반적으로, 일반 용어인 "동물"의 범주 내에 있음)은 특히, (예를 들어, 특정 돌연변이 또는 여타 특징부로 인해) 이상 및 이하에 정의된 질환에 걸릴 위험이 있는 사람 또는 환자이다.
제약 제제, 방법 및 용도
또한, 본 발명은 화학식 IA (또는 그의 예시적인 화학식)의 화합물 또는 그의 N-옥시드를 활성 성분으로서 포함하며, 특히 상기 언급된 질환의 치료에 사용될 수 있는 제약 조성물에 관한 것이다.
예를 들어, 약리학상 허용되는 본 발명의 화합물은, 활성 성분으로서 제약학적 유효량의 화학식 IA (또는 그의 예시적인 화학식)의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 유의한 양의 1종 이상의 무기성 또는 유기성의 제약상 허용되는 고체 또는 액체 담체와 함께, 또는 상기 담체와의 혼합 상태로 포함하는 제약 조성물의 제조를 위해 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 티로신 단백질 키나제 활성의 억제에 반응하는 질환, 특히 화학식 IA (또는 그의 예시적인 화학식)의 화합물이 사용되기에 바람직한 상기 언급된 질환들 중 하나의 치료 또는 본 발명의 보다 넓은 측면에서 방지 (= 예방)를 위한, 상기 억제에 유효한 양의 화학식 IA (또는 그의 예시적인 화학식)의 신규 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 1종 이상의 제약상 허용되는 담체와 함께 포함하며 온혈 동물, 특히 인간 (또는 온혈 동물, 특히 인간, 예를 들어 림프구로부터 유래된 세포 또는 세포주)에게 투여하기에 적합한 제약 조성물에 관한 것이다.
온혈 동물, 특히 인간에게 소화관내 투여, 예를 들어 비내, 구강내, 직장내 또는 특히 경구 투여, 및 비경구 투여, 예를 들어 정맥내, 근육내 또는 피하 투여하기 위한 조성물이 특히 바람직하다. 상기 조성물은 활성 성분을 단독으로, 또는 바람직하게는 제약상 허용되는 담체와 함께 포함한다. 활성 성분의 투여량은 치료할 질환, 및 종 (species), 그의 연령, 체중 및 개별 상태, 개별 약동학적 데이타 및 투여 방식에 따라 달라진다.
특히, 본 발명은 화학식 IA (또는 그의 예시적인 화학식)의 화합물, 그의 호변이성질체, N-옥시드 또는 제약상 허용되는 염, 또는 수화물 또는 용매화물, 및 1종 이상의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 인간 또는 동물의 신체의 예방적 관리 또는 특히 치료적 관리 방법에서 사용하기 위한 제약 조성물, (특히, 종양 치료용 조성물 형태로) 상기 조성물을 제조하는 방법, 및 (특히, 종양) 질환, 특히 상기 언급된 질환의 치료 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 화학식 IA (또는 그의 예시적인 화학식)의 화합물 또는 그의 N-옥시드를 활성 성분으로서 포함하는 제약 제제의 제조 방법, 및 화학식 IA (또는 그의 예시적인 화학식)의 화합물 또는 그의 N-옥시드의 용도에 관한 것이다.
상기 제약 조성물은 약 1％ 내지 약 95％의 활성 성분을 포함하고, 단일 용량 투여 형태는 바람직한 실시양태에서 약 20％ 내지 약 90％의 활성 성분을 포함하고, 비-단일 용량 형태는 바람직한 실시양태에서 약 5％ 내지 약 20％의 활성 성분을 포함한다. 예를 들어, 단위 용량 형태는 코팅 및 비-코팅 정제, 앰풀, 바이알, 좌약 또는 캡슐이다. 또다른 투여형으로는 예를 들어, 연고, 크림, 페이스트, 포말, 팅크제, 스프레이 등이 있다. 약 0.05 g 내지 약 1.0 g의 활성 성분을 함유하는 캡슐이 그 예이다.
본 발명의 제약 조성물은 공지된 방식으로, 예를 들어 통상적인 혼합 공정, 과립화 공정, 코팅 공정, 용해 공정 또는 동결건조 공정에 의해 제조된다.
활성 성분의 용액, 및 현탁액 또는 분산액, 특히 등장성 수용액, (예를 들어, 활성 성분을 단독으로, 또는 담체와 함께 포함하는 동결건조 조성물의 경우) 사용 전에 구성될 수 있는 분산액 또는 현탁액을 사용하는 것이 바람직하다. 제약 조성물은 멸균될 수 있고/거나 부형제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤화제 및/또는 유화제, 가용화제, 삼투압 조절용 염 및/또는 완충액을 포함할 수 있으며, 공지된 방식으로, 예를 들어 통상적인 용해 공정 또는 동결건조 공정에 의해 제조된다. 상기 용액 또는 현탁액은 점도 증가제 또는 가용화제, 예를 들어 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈 또는 젤라틴을 포함할 수 있다.
오일중 현탁액은 주사 목적을 위해 통상적으로 사용되는 식물성, 합성 또는 반-합성 오일을 오일 성분으로서 포함한다. 이러한 오일로는, 특히 산 성분으로서 8 내지 22개, 특히 12 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 장쇄 지방산, 예를 들어 라우르산, 트리데실산, 미리스트산, 펜타데실산, 팔미트산, 마르가르산, 스테아르산, 아라키딕산, 베헨산 또는 상응하는 불포화 산, 예를 들어 올레산, 엘라이드산, 에루스산, 브라시드산 또는 리놀레산을, 원하는 경우 항산화제, 예를 들어 비타민 E, β-카로텐 또는 3,5-디-tert-부틸-4-히드록시톨루엔과 함께 함유하는 액상 지방산 에스테르가 언급될 수 있다. 이러한 지방산 에스테르의 알콜 성분은 최대 6개의 탄소 원자를 갖고, 모노- 또는 폴리-히드록시, 예를 들어 모노-, 디- 또는 트리-히드록시, 알콜, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 또는 펜탄올, 또는 이들의 이성질체, 특히 글리콜 및 글리세롤이다. 따라서, 다음과 같은 지방산 에스테르의 예가 언급된다: 에틸 올레에이트, 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, "라브라필 (LabRafil) M 2375" (폴리옥시에틸렌 글리세롤 트리올레에이트, 프랑스 파리에 소재한 가테포세 (Gattefosse)), "미글리올 (Miglyol) 812" (C8 내지 C12의 쇄 길이를 갖는 포화 지방산의 트리글리세리드, 독일에 소재한 휠스 아게 (Huels AG)), 특히 식물성 오일, 예를 들어 면실 오일, 아몬드 오일, 올리브 오일, 피마자 오일, 참깨 오일, 대두 오일, 보다 특히 땅콩 (groundnut) 오일.
주사용 조성물은 멸균 조건 하에 통상적인 방식으로 제조되고, 이는 조성물을 앰풀 또는 바이알에 도입하거나 용기를 밀봉하는 경우에도 적용된다.
경구 투여용 제약 조성물은 활성 성분을 고형 담체와 배합하고, 원하는 경우에 생성된 혼합물을 과립화하고, 원하거나 필요한 경우에 적절한 부형제를 첨가한 다음 혼합물을 정제, 당의정 코어 또는 캡슐로 가공함으로써 얻어질 수 있다. 또한, 활성 성분이 계량된 양으로 확산되거나 방출될 수 있는 플라스틱 용기에 상기 제약 조성물을 담을 수 있다.
적합한 담체는 특히, 충전재, 예를 들어 당 (예를 들어, 락토스, 사카로스, 만니톨 또는 소르비톨), 셀룰로스 제조물 및/또는 칼슘 포스페이트, 예를 들어 트리칼슘 포스페이트 또는 칼슘 수소 포스페이트 및 결합제, 예를 들어 옥수수, 밀, 쌀 또는 감자 전분을 사용하는 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸트, 메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈 및/또는 원하는 경우, 붕해제, 예를 들어 상기 언급된 전분 및/또는 카르복시메틸 전분, 가교된 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 그의 염, 예를 들어 나트륨 알기네이트이다. 부형제는 특히, 유동 조절제 및 윤활제, 예를 들어 규산, 탈크, 스테아르산 또는 그의 염, 예를 들어 마그네슘 또는 칼슘 스테아레이트, 및/또는 폴리에틸렌 글리콜이다. 당의정 코어는 적합한 (임의로, 장용성의) 코팅을 가지며, 특히 아라비아 검, 탈크, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 이산화티탄을 포함할 수 있는 농축 당 용액, 또는 적합한 유기 용매 중의 코팅 용액, 또는 장용성 코팅의 제조에 적합한 셀룰로스 제조물, 예를 들어 에틸셀룰로스 프탈레이트 또는 히드록시프로필메틸셀룰로스 프탈레이트의 용액이 사용된다. 캡슐은 젤라틴으로 제조된 건식 충전 캡슐, 및 젤라틴 및 가소제 (예를 들어, 글리세롤 또는 소르비톨)로 제조된 연질의 밀봉 캡슐이다. 건식 충전 캡슐은, 예를 들어 충전재, 예를 들어 락토스, 결합제, 예를 들어 전분 및/또는 활택제, 예를 들어 탈크 또는 마그네슘 스테아레이트, 및 원하는 경우, 안정화제와 함께 과립 형태의 활성 성분을 포함할 수 있다. 연질 캡슐의 경우, 활성 성분은 적합한 오일성 부형제, 예를 들어 지방 오일, 파라핀 오일 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜에 용해 또는 현탁되는 것이 바람직하고, 안정화제 및/또는 항균제도 첨가될 수 있다. 예를 들어, 식별 목적으로 또는 활성 성분의 다양한 용량을 표시하기 위해 정제 또는 당의정 코팅 또는 캡슐 케이싱에 염료 또는 안료가 첨가될 수 있다.
정제 코어에는, 특히 아라비아 검, 탈크, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 티탄 디옥시드를 포함할 수 있는 농축 당 용액, 또는 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물 중의 코팅 용액, 또는 (장용성 코팅의 제조를 위한) 적합한 셀룰로스 제조물 용액을 사용함으로써, (임의로 장용성의) 적합한 코팅이 제공될 수 있다.
또한, 경구 투여용 제약 조성물에는 젤라틴으로 구성된 경질 캡슐, 및 젤라틴 및 가소제로 구성된 연질 밀봉 캡슐이 포함된다. 경질 캡슐은 과립 형태의 활성 성분을, 예를 들어 충전재, 결합제 및/또는 활택제 및 임의로 안정화제와 함께 함유할 수 있다. 연질 캡슐의 경우, 활성 성분은 적합한 액체 부형제에 용해되거나 현탁되는 것이 바람직하고, 안정화제 및/또는 계면활성제도 첨가될 수 있다.
직장내 투여에 적합한 제약 조성물은 예를 들어, 활성 성분 및 좌약 베이스 조합으로 구성된 좌약이다.
비경구 투여의 경우, 수용성 형태 (예를 들어, 수용성 염)의 활성 성분의 수용액, 또는 점도-증가 물질, 예를 들어 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 소르비톨 및 /또는 덱스트란, 및 필요한 경우 안정화제를 함유하는 수성 주사용 현탁액이 특히 적합하다. 또한, 활성 성분은 (임의로, 부형제와 함께) 동결건조물 형태일 수 있고, 비경구 투여 전에 적합한 용매가 첨가됨으로써 용액으로 제조될 수 있다.
또한, 예를 들어 비경구 투여에 사용되는 용액은 주입 용액으로서 사용될 수 있다.
마찬가지로, 본 발명은 본원에 언급된 질환들 (병리 증상들) 중 하나, 특히 티로신 키나제의 억제에 반응하는 질환, 보다 특히 상기 언급된 질환, 가장 특히 FGFR, 특히 상응하는 신생물성 질환을 치료하는 과정 또는 방법에 관한 것이다. 화학식 IA (또는 그의 예시적인 화학식)의 화합물 또는 그의 N-옥시드 (염, 에스테르 등도 포함)는 동물, 바람직하게는 온혈 동물, 예를 들어 인간 (각각, 바람직하게는 상기 질환의 치료가 필요함)에게 상기 질환에 대해 유효한 양으로 예방적 또는 치료적으로 그대로 투여될 수 있거나 또는 특히 제약 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 체중 약 70 kg의 개인의 경우, 투여되는 1일 용량은 예를 들어, 약 0.001 g 내지 약 12 g, 바람직하게는 예를 들어, 약 0.1 g 내지 약 3 g의 본 발명의 화합물이다. "약"은 각각 주어진 수로부터 바람직하게는 10％ 이하의 편차, 보다 바람직하게는 1％ 미만의 편차가 있음을 의미한다.
"~에 반응하는" 질환이란, 유익한 특정 효과가 나타날 수 있는 질환이다.
또한, 본 발명은 온혈 동물, 예를 들어 인간에게 본 발명의 화합물과 함께 1종 이상의 세포증식억제성 또는 세포독성 화합물, 예를 들어 글리벡 (등록상표)을 동시에 또는 개별적으로 투여하는 것을 포함하는, 단백질 키나제 의존성 질환의 치 료 방법을 제공한다. "동시"란 용어는 다른 하나가 투여된 직후에 또는 신속하게 연속 투여되는 것을 의미한다.
또한, 본 발명은 특히, 화학식 IA (또는 그의 예시적인 화학식)의 화합물 또는 그의 N-옥시드, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 특히 바람직한 것으로 언급된 화학식 IA (또는 그의 예시적인 화학식)의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 자체로서, 또는 상기 언급된 질환들 중 하나 이상, 바람직하게는 단백질 키나제의 억제에 반응하는 질환, 특히 신생물성 질환, 보다 특히 Abl 티로신 키나제의 억제에 반응하는 백혈병의 치료적 및 예방적 관리를 위한 1종 이상의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 제제의 형태를 취하는, 화학식 IA (또는 그의 예시적인 화학식)의 화합물 또는 그의 N-옥시드, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 특히 바람직한 것으로 언급된 화학식 IA (또는 그의 예시적인 화학식)의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도에 관한 것이다.
각 경우에서 사용되는 제약 제제 (의약)의 바람직한 용량, 조성 및 제법은 상기 기재된 바와 같다.
또한, 화학식 IA (또는 그의 예시적인 화학식)의 화합물은 또다른 항증식제와 함께 사용되는 것이 유리할 수 있다. 이러한 항증식제로는 아로마타제 억제제, 항에스트로겐, 토포이소머라제 I 억제제, 토포이소머라제 II 억제제, 미세관 활성제, 알킬화제, 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제, 파르네실 트랜스퍼라제 억제제, COX-2 억제제, MMP 억제제, mTOR 억제제, 항신생물성 항대사제, 플라틴 화합물, 단백질 키나제 활성 및 ATPase 활성을 감소시키는 화합물 및 또다른 항맥관형성 화합 물, 고나도렐린 효능제, 항안드로겐, 벵가미드 (bengamide), 비스포스포네이트, 항증식성 항체, 테모졸로미드 (테모달 (TEMODAL, 등록상표)), 에스테로이드, 유사 덱사메타손, 프로테아좀 억제제, 유사 벨케이드 및/또는 탈리도미드가 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용된 "아로마타제 억제제"란 용어는 에스트로겐 생성, 즉 기질인 안드로스텐디온 및 테스토스테론이 각각, 에스트론 및 에스트라디올로 전환되는 것을 억제하는 화합물을 지칭한다. 상기 용어에는 스테로이드, 특히 엑세메스탄 및 포르메스탄, 및 특히 비-스테로이드, 특히 아미노글루테티미드, 보로졸, 파드로졸, 아나스트로졸 및 매우 특히 레트로졸이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 엑세메스탄은 예를 들어, 상표명 아로마신 (AROMASIN)으로 시판되는 형태 그대로 투여될 수 있다. 포르메스탄은 예를 들어, 상표명 렌타론 (LENTARON)으로 시판되는 형태 그대로 투여될 수 있다. 파드로졸은 예를 들어, 상표명 아페마 (AFEMA)로 시판되는 형태 그대로 투여될 수 있다. 아나스트로졸은 예를 들어, 상표명 아리미덱스 (ARIMIDEX)로 시판되는 형태 그대로 투여될 수 있다. 레트로졸은 예를 들어, 상표명 페마라 (FEMARA) 또는 페마르 (FEMAR)로 시판되는 형태 그대로 투여될 수 있다. 아미노글루테티미드는 예를 들어, 상표명 오리메텐 (ORIMETEN)으로 시판되는 형태 그대로 투여될 수 있다.
아로마타제 억제제인 항신생물제를 포함하는 본 발명의 조합물은 호르몬 수용체 양성 유방 종양의 치료에 특히 유용하다.
본원에서 사용된 "항에스트로겐"이란 용어는 에스트로겐 수용체 수준에서 에 스트로겐의 효과를 길항하는 화합물을 지칭한다. 상기 용어에는 타목시펜, 풀베스트란트, 랄록시펜 및 랄록시펜 히드로클로라이드가 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 타목시펜은 예를 들어, 상표명 놀바덱스 (NOLVADEX)로 시판되는 형태 그대로 투여될 수 있다. 랄록시펜 히드로클로라이드는 예를 들어, 상표명 에비스타 (EVISTA)로 시판되는 형태 그대로 투여될 수 있다. 풀베스트란트는 US 4,659,516에 기재된 바와 같이 제조될 수 있거나 예를 들어, 상표명 파슬로덱스 (FASLODEX)로 시판되는 형태 그대로 투여될 수 있다.
본원에서 사용된 "토포이소머라제 I 억제제"란 용어에는 토포테칸, 이리노테칸, 9-니트로캄프토테신 및 거대분자 캄프토테신 접합체 PNU-166148 (WO 99/17804의 화합물 A1)이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 이리노테칸은 예를 들어, 상표명 캄프토사르 (CAMPTOSAR)로 시판되는 형태 그대로 투여될 수 있다. 토포테칸은 예를 들어, 상표명 히캄틴 (HYCAMTIN)으로 시판되는 형태 그대로 투여될 수 있다.
본원에서 사용된 "토포이소머라제 II 억제제"란 용어에는 안트라시클린, 독소루비신 (리포좀 제제, 예를 들어 캘릭스 (CAELYX; 상표명) 포함), 에피루비신, 이다루비신 및 네모루비신, 안트라퀴논 미톡산트론 및 로속산트론, 및 포도필로톡신 에토포시드 및 테니포시드가 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 에토포시드는 예를 들어, 상표명 에토포포스 (ETOPOPHOS)로 시판되는 형태 그대로 투여될 수 있다. 테니포시드는 예를 들어, 상표명 VM 26-브리스톨 (VM 26-BRISTOL)로 시판되는 형태 그대로 투여될 수 있다. 독소루비신은 예를 들어, 상표명 아드리블라스틴 (ADRIBLASTIN)으로 시판되는 형태 그대로 투여될 수 있다. 에피루비신은 예를 들어, 상표명 파르모루비신 (FARMORUBICIN)으로 시판되는 형태 그대로 투여될 수 있다. 이다루비신은 예를 들어, 상표명 자베도스 (ZAVEDOS)로 시판되는 형태 그대로 투여될 수 있다. 미톡산트론은 예를 들어, 상표명 노반트론 (NOVANTRON)으로 시판되는 형태 그대로 투여될 수 있다.
"미세관 활성제"란 용어는 탁산인 파클리탁셀 및 도세탁셀, 빈카 알칼로이드, 예를 들어 빈블라스틴, 특히 빈블라스틴 술페이트, 빈크리스틴, 특히 빈크리스틴 술페이트 및 비노렐빈, 디스코더몰리드 및 에포틸론, 예를 들어 에포틸론 B 또는 D (이에 제한되지는 않음)를 비롯한 미세관 안정화제 및 미세관 탈안정화제에 관한 것이다. 도세탁셀은 예를 들어, 상표명 탁소테르 (TAXOTERE)로 시판되는 형태 그대로 투여될 수 있다. 빈블라스틴 술페이트는 예를 들어, 상표명 빈블라스틴 알.피. (VINBLASTIN R.P.)로 시판되는 형태 그대로 투여될 수 있다. 빈크리스틴 술페이트는 예를 들어, 상표명 파르미스틴 (FARMISTIN)으로 시판되는 형태 그대로 투여될 수 있다.
본원에서 사용된 "알킬화제"란 용어에는 시클로포스파미드, 이포스파미드 및 멜파란이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 시클로포스파미드는 예를 들어, 상표명 시클로스틴 (CYCLOSTIN)으로 시판되는 형태 그대로 투여될 수 있다. 이포스파미드는 예를 들어, 상표명 홀록산 (HOLOXAN)으로 시판되는 형태 그대로 투여될 수 있다.
"히스톤 탈아세틸화 효소 억제제"란 용어는, 히스톤 탈아세틸화 효소를 억제 하며 항증식성 활성을 갖는 화합물을 지칭한다.
"파르네실 트랜스퍼라제 억제제"란 용어는, 파르네실 트랜스퍼라제를 억제하며 항증식성 활성을 갖는 화합물을 지칭한다.
"COX-2 억제제"란 용어는, 시클로옥시게나제 2형 효소 (COX-2)를 억제하며 항증식성 활성을 갖는 화합물, 예를 들어 셀레콕시브 (셀레브렉스 (Celebrex, 등록상표)), 로페콕시브 (비옥스 (Vioxx, 등록상표)) 및 루미라콕시브 (COX189)를 지칭한다.
"MMP 억제제"란 용어는, 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP)를 억제하며 항증식성 활성을 갖는 화합물을 지칭한다.
"mTOR 억제제"란 용어는, 라파마이신의 포유동물 표적 (mTOR)을 억제하며 항증식성 활성을 갖는 화합물, 예를 들어 시로리무스 (라파뮨 (Rapamune, 등록상표)), 에버롤리무스 (세르티칸 (Certican, 상표명)), CCI-779 및 ABT578을 지칭한다.
"항신생물성 항대사제"란 용어에는 5-플루오로우라실, 테가푸르, 카페시타빈, 클라드리빈, 시타라빈, 플루다라빈 포스페이트, 플루오로우리딘, 젬시타빈, 6-메르캅토퓨린, 히드록시우레아, 메토트렉세이트, 에다트렉세이트 및 이들 화합물의 염, 및 ZD 1694 (랄티트렉세드 (RALTITREXED, 상표명)), LY231514 (알림타 (ALIMTA, 상표명)), LY264618 (로모트렉솔 (LOMOTREXOL, 상표명)) 및 OGT719가 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용된 "플라틴 화합물"이란 용어에는 카르보플라틴, 시스-플라틴 및 옥살리플라틴이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 카르보플라틴은 예를 들 어, 상표명 카르보플랫 (CARBOPLAT)으로 시판되는 형태 그대로 투여될 수 있다. 옥살리플라틴은 예를 들어, 상표명 엘록사틴 (ELOXATIN)으로 시판되는 형태 그대로 투여될 수 있다.
본원에서 사용된 "단백질 키나제 활성을 감소시키는 화합물 및 또다른 항맥관형성 화합물"이란 용어에는, 예를 들어 혈관 내피세포 성장 인자 (VEGF), 상피세포 성장 인자 (EGF), c-Src, 단백질 키나제 C, 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), Bcr-Abl, c-Kit, Flt-3, 인슐린-유사 성장 인자 I 수용체 (IGF-IR) 및 시클린-의존성 키나제 (CDK)의 활성을 감소시키는 화합물, 포스파티딜 이노시톨 3 키나제 억제제 (PI3K) 및 단백질 키나제 B (PKB) 억제제 (예를 들어, WO 2005/054238 및 WO 2005/054237에 언급된 것들), 열 쇼크 단백질 90 (HSP90) (ATPase 효소) 억제제, 및 단백질 키나제 활성을 감소시키는 또다른 작용 메카니즘을 갖는 항맥관형성 화합물이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
VEGF 활성을 감소시키는 화합물은 특히, VEGF 수용체, 특히 VEGF 수용체의 티로신 키나제 활성을 억제하는 화합물, 및 VEGF에 결합하는 화합물이며, 특히 WO 98/35958, WO 00/09495, WO 00/27820, WO 00/59509, WO 98/11223, WO 00/27819, WO 01/55114, WO 01/58899 및 EP 0 769 947에 개괄적 및 구체적으로 개시된 화합물, 단백질 및 모노클로날 항체; 문헌 [M. Prewett et al., Cancer Research 59 (1999) 5209-5218], [F. Yuan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 93, pp. 14765-14770, December 1996], [Z. Zhu et al., Cancer Res. 58, 1998, 3209-3214] 및 [J. Mordenti et al., Toxicologic Pathology, vol. 27, no. 1, pp 14-21, 1999]에 기재된 화합물; WO 00/37502 및 WO 94/10202에 기재된 화합물; 문헌 [M. S. O'Reilly et al., Cell 79, 1994, 315-328]에 기재된 안지오스타틴 (상표명); 문헌 [M. S. O'Reilly et al, Cell 88, 1997, 277-285]에 기재된 엔도스타틴 (상표명)이고,
EGF 활성을 감소시키는 화합물은 특히, EGF 수용체, 특히 EGF 수용체의 티로신 키나제 활성을 억제하는 화합물, 및 EGF에 결합하는 화합물이며, 특히 WO 97/02266, EP 0 564 409, WO 99/03854, EP 0520722, EP 0 566 226, EP 0 787 722, EP 0 837 063, WO 98/10767, WO 97/30034, WO 97/49688, WO 97/38983 및 특히 WO 96/33980에 개괄적 및 구체적으로 개시된 화합물이고,
c-Src 활성을 감소시키는 화합물에는 하기 정의된 c-Src 단백질 티로신 키나제 활성을 억제하는 화합물, 및 SH2 상호작용 억제제, 예를 들어 WO 97/07131 및 WO 97/08193에 개시된 억제제 (이에 제한되지는 않음)가 포함되고,
c-Src 단백질 티로신 키나제 활성을 억제하는 화합물에는 피롤로피리미딘, 특히 피롤로[2,3-d]피리미딘, 퓨린, 피라조피리미딘, 특히 피라조[3,4-d]피리미딘, 피라조피리미딘, 특히 피라조[3,4-d]피리미딘 및 피리도피리미딘, 특히 피리도[2,3-d]피리미딘의 구조 부류에 속하는 화합물 (이에 제한되지는 않음)이 포함되고 (바람직하게는, 상기 용어는 WO 96/10028, WO 97/28161, WO 97/32879 및 WO 97/49706에 개시된 화합물을 나타냄),
단백질 키나제 C의 활성을 감소시키는 화합물은 특히, EP 0 296 110에 개시된 스타우로스포린 유도체 (WO 00/48571에 기재된 제약 제제)이며, 이러한 화합물 은 단백질 키나제 C 억제제이고,
본 발명의 화합물과 함께 사용될 수 있는, 단백질 키나제 활성을 감소시키는 또다른 특정 화합물은 이마티니브 (글리벡 (Gleevec (등록상표)/Glivec (등록상표)), PKC412, 이레싸 (Iressa, 상표명) (ZD1839), PKI166, PTK787, ZD6474, GW2016, CHIR-200131, CEP-7055/CEP-5214, CP-547632, KRN-633 및 SU5416이고,
단백질 키나제 활성을 감소시키는 또다른 작용 메카니즘을 갖는 항맥관형성 화합물에는, 예를 들어 탈리도미드 (탈로미드 (THALOMID)), 셀레콕시브 (셀레브렉스 (Celebrex)) 및 ZD6126 (이에 제한되지는 않음)이 포함된다.
본원에 사용된 "고나도렐린 효능제"란 용어에는 아바렐릭스, 고세렐린 및 고세렐린 아세테이트가 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 고세렐린은 US 4,100,274에 개시되어 있고, 예를 들어 상표명 졸라덱스 (ZOLADEX)로 시판되는 형태 그대로 투여될 수 있다. 아바렐릭스는 US 5,843,901에 개시된 바와 같이 제조될 수 있다.
본원에 사용된 "항안드로겐"이란 용어에는, 예를 들어 US 4,636,505에 기재된 바와 같이 제조될 수 있는 비칼루타미드 (카소덱스 (CASODEX, 상표명))가 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "벵가미드"는 항증식성 특성을 갖는 벵가미드 및 그의 유도체를 나타낸다.
본원에 사용된 "비스포스포네이트"란 용어에는 에트리돈산, 클로드론산, 틸루드론산, 파미드론산, 알렌드론산, 이반드론산, 리세드론산 및 졸레드론산이 포함 되나, 이에 제한되지는 않는다. "에트리돈산"은 예를 들어, 상표명 디드로넬 (DIDRONEL)로 시판되는 형태 그대로 투여될 수 있다. "클로드론산"은 예를 들어, 상표명 보네포스 (BONEFOS)로 시판되는 형태 그대로 투여될 수 있다. "틸루드론산"은 예를 들어, 상표명 스켈리드 (SKELID)로 시판되는 형태 그대로 투여될 수 있다. "파미드론산"은 예를 들어, 상표명 아레디아 (AREDIA, 상표명)로 시판되는 형태 그대로 투여될 수 있다. "알렌드론산"은 예를 들어, 상표명 포사맥스 (FOSAMAX)로 시판되는 형태 그대로 투여될 수 있다. "이반드론산"은 예를 들어, 상표명 본드라네이트 (BONDRANAT)로 시판되는 형태 그대로 투여될 수 있다. "리세드론산"은 예를 들어, 상표명 액토넬 (ACTONEL)로 시판되는 형태 그대로 투여될 수 있다. "졸레드론산"은 예를 들어, 상표명 조메타 (ZOMETA)로 시판되는 형태 그대로 투여될 수 있다.
본원에 사용된 "항증식성 항체"란 용어에는 트라스투주마브 (헤르셉틴 (Herceptin, 상표명)), 트라스투주마브-DM1, 엘로티니브 (타르세바 (Tarceva, 상표명)), 베바시주마브 (아바스틴 (Avastin, 상표명)), 리툭시마브 (리툭산 (Rituxan, 등록상표)), PRO64553 (항-CD40) 및 2C4 항체가 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
급성 골수성 백혈병 (AML)의 치료를 위해, 화학식 IA (또는 그의 예시적인 화학식)의 화합물은 표준 백혈병 요법과 함께, 특히 AML의 치료를 위해 사용되는 요법과 함께 사용될 수 있다. 구체적으로, 화학식 IA (또는 그의 예시적인 화학식)의 화합물은 예를 들어, 파르네실 트랜스퍼라제 억제제 및/또는 AML의 치료에 유용한 다른 약물, 예를 들어 다우노루비신, 아드리아마이신, Ara-C, VP-16, 테니포시드, 미톡산트론, 이다루비신, 카르보플래티넘 및 PKC412와 함께 투여될 수 있다.
코드 번호, 일반명 또는 상표명으로 식별되는 활성 물질의 구조는 표준 일람 "머크 인덱스 (The Merck Index)"의 현행판, 또는 데이타베이스, 예를 들어 패턴츠 인터내셔널 (Patents International) (예를 들어, IMS 월드 퍼블리케이션스 (IMS World Publications))로부터 입수할 수 있다.
화학식 IA (또는 그의 예시적인 화학식)의 화합물과 함께 사용될 수 있는 상기 언급된 화합물은 (상기 인용된 문헌에서와 같이) 당업계에 개시된 바와 같이 제조 및 투여될 수 있다.
본원에서 사용된 "공동 투여" 또는 "조합 투여" 등과 같은 용어에는 선택된 치료제들을 단일 환자에게 투여하는 것이 포함되며, 작용제들이 반드시 동일한 투여 경로로 또는 동시에 투여되는 것은 아닌 치료 요법이 포함된다.
이상 또는 이하에서 (화학식 IA의 화합물 또는 그의 (특히, 제약상 허용되는) 염의 용도와 관련하여) "용도 (사용)"란 용어가 (동사 또는 명사로서) 언급된 경우, (달리 명시되지 않거나 문맥상 달리 제안되지 않는다면) 이는 (달리 언급되지 않는다면) 다음과 같은 본 발명의 실시양태들 중 임의의 하나 이상을 각각 포함한다: 달리 언급되지 않는다면, 적절하고 편리한 경우, 단백질 (특히, 티로신) 키나제 조절 (특히, 억제) 반응성 질환의 치료에서의 용도; 단백질 키나제 조절 (특히, 억제) 반응성 질환 치료용 제약 조성물의 제조를 위한 용도; 단백질 키나제 조 절 (특히, 억제) 반응성 및/또는 증식성 질환의 치료에서 1종 이상의 화학식 IA의 화합물의 사용 방법; 1종 이상의 화학식 IA의 화합물을 포함하는, 상기 단백질 키나제 조절 (특히, 억제) 반응성 질환 치료용 제약 제제; 및 상기 단백질 키나제 조절 (특히, 억제) 반응성 질환의 치료에서의 1종 이상의 화학식 IA의 화합물. 특히, 화학식 IA의 화합물의 "용도"에 바람직한 치료할 질환은, 상기 언급된 (특히, 티로신) 단백질 키나제 조절 (특히, 억제) 반응성 ("의존성" 뿐 아니라 "지지성 (supported)"도 의미함; 질환이 단백질 키나제의 조절 (특히, 억제)에 반응하는 상황, 즉 단백질 키나제 활성이 질환 증상을 지지하거나 심지어 유발하는 상황도 포함됨) 질환 또는 특히 이상 또는 이하에 언급된 증식성 질환으로부터 선택된다. 바람직하게는, 단백질 키나제 조절 (특히, 억제) 반응성 질환은 이상 및 이하에 언급된 키나제들 중 하나 이상, 보다 바람직하게는 FGFR의 억제에 반응하는 질환이다.
제조 방법
화학식 IA의 화합물은, 원칙적으로 다른 화합물에 대해 당업계에 공지된 방법과 유사한 방식으로 제조되고, 따라서 화학식 IA의 신규 화합물을 위한 공정은, 바람직하게는 하기 화학식 IIA의 아닐린 화합물을 이중반응성 (bisreactive) 탄산 유도체의 존재 하에 하기 화학식 IIIA의 아민과 반응시키고, 필요한 경우 화학식 IA의 화합물을 화학식 IA의 상이한 화합물로 전환시키고/거나, 수득가능한 화학식 IA의 화합물의 염을 유리 화합물 또는 상이한 염으로 전환시키고/거나, 수득가능한 화학식 IA의 유리 화합물을 그의 염으로 전환시키고/거나, 화학식 IA의 화합물의 수득가능한 이성질체 혼합물을 개별 이성질체들로 분리한다는 점에서 유사 공정으로서 신규하다.
Figure 112008052214826-pct00002
식 중, R4 및 n은 화학식 IA의 화합물에 대해 정의된 바와 같다.
Figure 112008052214826-pct00003
식 중, R1, R2, R3, R5, X, Y 및 Z는 화학식 IA의 화합물에 대해 정의된 바와 같다.
상기 반응에서, 이중반응성 탄산 유도체는 바람직하게는 탄산의 수화물 또는 보다 바람직하게는 탄산 이할로겐화물, 특히 탄산 디클로라이드 (포스겐)이다. 바람직하게는, 상기 반응은 우선 화학식 IIA의 화합물 (바람직함) 또는 화학식 IIIA의 화합물을 이중반응성 탄산 유도체와 반응시켜 상응하는 이소시아네이트를 생성한 후에 다른 화합물 (각각, 화학식 IIIA 또는 IIA의 화합물)을 첨가함으로써 수행될 수 있다. 제1 반응은 적절한 용매, 예를 들어 에테르, 예를 들어 디옥산 중에 서 승온, 예를 들어 20 ℃ 내지 반응 혼합물의 환류 온도에서 수행되는 것이 바람직하고, 이어서 바람직하게는 생성된 이소시아네이트 용액을 농축하여, 바람직하게는 고체 또는 오일 형태의 이소시아네이트를 제공할 수 있다. 이후, 승온, 예를 들어 20 ℃ 내지 반응 혼합물의 환류 온도에서 적절한 용매, 특히 N-메틸피롤리돈 (NMP) 및/또는 톨루엔을 첨가하고, 각각 상보적인 화학식 IIIA 또는 IIA의 아민을 첨가한 후에 이소시아네이트의 제2 반응을 수행한다.
상기 두 반응은 보호된 기체, 특히 질소 또는 아르곤 하에 수행되는 것이 바람직하다.
선택적인 반응 및 전환
화학식 IA의 화합물은 화학식 IA의 상이한 화합물로 전환될 수 있다.
예를 들어, R1이 벤질옥시페닐아미노 또는 4-벤질-피페라진-1-일-페닐아미노인 화학식 IA의 화합물에서, 벤질 잔기는 예를 들어, 귀금속 촉매, 예를 들어 탄상 팔라듐의 존재 하에 적절한 용매, 예를 들어 알콜, 예를 들어 메탄올 중에서 적절한 온도, 예를 들어 0 내지 50 ℃에서 (피페라진 질소로부터 제거되는 경우에는 추가로 산, 예를 들어 HCl의 존재 하에) 수소화에 의해 제거되어, 벤질 잔기 대신에 수소가 존재하는 상응하는 화합물을 생성할 수 있다.
화학식 IA의 화합물은 상응하는 N-옥시드로 전환될 수 있다. 이러한 반응은 적합한 산화제, 바람직하게는 퍼옥시드, 예를 들어 m-클로로퍼벤조산과 함께 적합한 용매, 예를 들어 할로겐화 탄화수소, 통상적으로 클로로포름 또는 디클로로메 탄, 또는 저급 알칸카르복실산, 통상적으로 아세트산 중에서, 바람직하게는 0 ℃ 내지 반응 혼합물의 비등 온도, 특히 대략 실온에서 수행된다.
비-산화 형태의 본 발명의 화합물은, 본 발명의 화합물의 N-옥시드로부터 출발하여 적합한 불활성 유기 용매 (예를 들어, 아세토니트릴, 에탄올, 수성 디옥산, 등) 중에서 0 내지 80 ℃에서 환원제 (예를 들어, 황, 이산화황, 트리페닐 포스핀, 리튬 보로하이드라이드, 나트륨 보로하이드라이드, 인 트리클로라이드, 트리브로마이드 등)로 처리함으로써 제조될 수 있다.
1개 이상의 염-형성 기를 갖는 화학식 IA의 화합물의 염은 공지된 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 염기성 기 (예를 들어, 염기성 질소)를 갖는 화학식 IA의 화합물의 산 부가염은 통상적인 방식으로, 예를 들어 화학식 IA의 화합물을 산 또는 적합한 음이온 교환 시약으로 처리함으로써 얻어질 수 있다. 산성 기를 갖는 화학식 IA의 화합물의 염은 화합물을 금속 화합물, 예를 들어 적합한 유기 카르복실산의 알칼리 금속 염, 예를 들어 2-에틸헥산산의 나트륨 염; 유기 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 화합물, 예를 들어 상응하는 수산화물, 탄산염 또는 탄산수소염, 예를 들어 나트륨 또는 칼륨의 수산화물, 탄산염 또는 탄산수소염; 상응하는 칼슘 화합물; 또는 암모니아 또는 적합한 유기 아민으로 처리함으로써 형성될 수 있고, 이때 화학량론적인 양 또는 약간만 과량의 염-형성제가 사용되는 것이 바람직하다. 화학식 IA의 화합물의 산 부가염은 통상적인 방법으로, 예를 들어 화학식 IA의 화합물을 산 또는 적합한 음이온 교환 시약으로 처리함으로써 얻어질 수 있다. 산성 및 염기성의 염-형성 기, 예를 들어 유리 카르복시 기 및 유리 아미노 기를 함유하는 화학식 IA의 화합물의 내부 염은, 예를 들어 염, 예를 들어 산 부가염을, 예를 들어 약염기에 의해 등전점으로 중화시키거나, 또는 이온 교환제로 처리함으로써 형성될 수 있다.
화학식 IA의 화합물 (= 본 발명의 화합물)의 염은 통상적인 방식으로 유리 화합물로 전환될 수 있고, 금속 또는 암모늄 염은, 예를 들어 적합한 산으로 처리함으로써 상이한 염으로 전환될 수 있고, 산 부가염은, 예를 들어 적합한 염기성 물질로 처리함으로써 상이한 염으로 전환될 수 있다. 두 경우 모두에서, 적합한 이온 교환제가 사용될 수 있다.
입체이성질체 혼합물, 예를 들어 부분입체이성질체 혼합물은 공지된 방식으로 적절한 분리 방법에 의해 그의 상응하는 이성질체들로 분리될 수 있다. 예를 들어, 부분입체이성질체 혼합물은 분별 결정화, 크로마토그래피, 용매 분배 및 유사한 절차에 의해 개별 부분입체이성질체들로 분리될 수 있다. 상기 분리는 출발 화합물들 중 한 화합물의 수준에서 또는 화학식 IA의 화합물 자체에서 수행될 수 있다. 거울상이성질체는 부분입체이성질체 염의 형성을 통해, 예를 들어 거울상이성질체적으로 순수한 키랄 산과의 염 형성에 의해, 또는 크로마토그래피, 예를 들어 HPLC (키랄 리간드를 갖는 크로마토그래피 기질 사용)에 의해 분리될 수 있다. 라세미 혼합물로부터 화합물의 입체이성질체를 분리하는 데 적용될 수 있는 기술에 대한 보다 상세한 설명은 문헌 [Jean Jacques, Andre Collet, Samuel H. Wilen, "Enantiomers, Racemates and Resolutions", John Wiley And Sons, Inc., 1981]에서 찾아볼 수 있다.
본 발명의 화합물의 전구약물 유도체는 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, 추가의 상세 내용을 위해서는 문헌 [Saulnier et al. (1994), Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, Vol. 4, p. 1985] 참조). 예를 들어, 적절한 전구약물은 본 발명의 비-유도체화 화합물을 적합한 카르바밀화제 (예를 들어, 1,1-아실옥시알킬카르바노클로리데이트, 파라-니트로페닐 카르보네이트 등)와 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
본 발명의 화합물의 보호된 유도체는 당업자에게 공지된 수단에 의해 제조될 수 있다. 보호기의 생성 및 그의 제거에 적용될 수 있는 기술에 대한 상세한 설명은 문헌 [T. W. Greene, "Protecting Groups in Organic Chemistry", 3rd edition, John Wiley and Sons, Inc., 1999]에서 찾아볼 수 있다.
본 발명의 화합물은 용매화물 (예를 들어, 수화물)로서 편리하게 제조되거나 본 발명의 공정 동안 형성될 수 있다. 본 발명의 화합물의 수화물은 디옥신, 테트라히드로푸란 또는 메탄올과 같은 유기 용매를 이용한 수성/유기 용매 혼합물에서의 재결정화에 의해 편리하게 제조될 수 있다.
중간체 및 최종 생성물은 표준 방법에 따라, 예를 들어 크로마토그래피 방법, 분배 방법, (재)결정화 방법 등에 의해 후처리 및/또는 정제될 수 있다.
출발 물질
(특히, 화학식 IIA 및 IIIA의) 출발 물질 및 중간체 (각 경우에서 이들의 염 포함)는 실시예에 기재된 방법과 유사한 방식으로 제조된 화합물이고/거나, 당업계에 공지된 방법에 따라 또는 이와 유사한 방식으로 제조된 화합물이고/거나, 시판 중인 화합물일 수 있다.
예를 들어, 출발 물질은 바람직하게는 다음과 같이 제조될 수 있다.
출발 물질 및 중간체에서 R1, R2, R3, R4, R5, X, Y, Z 및 n이 사용되는 경우, 달리 명시되어 있지 않다면 이들 기호는 화학식 IA의 화합물에 대해 주어진 의미를 갖는 것이 바람직하다.
예를 들어, 1개 이상의 할로 잔기를 갖는 화학식 IIA의 화합물 또는 화학식 IIA에 상응하는 화합물 [C1-C7-알킬, 할로-C1-C7-알킬, 할로 또는 C1-C7-알콕시로부터 선택된 4개 이하의 다른 잔기 R4가 존재하고, 아미노 기는, 예를 들어 아세틸 또는 tert-부톡시카르보닐에 의해 보호되고 (보호기의 도입을 위해서는 예를 들어, 하기 실시예 또는 "일반 공정 조건" 참조), 추후에 보호기가 제거됨 (예를 들어, 아세틸의 경우에 적절한 용매, 예를 들어 에탄올 중에서 승온, 예를 들어 30 ℃ 내지 혼합물의 환류 온도에서 알칼리 금속 히드록시드, 예를 들어 칼륨 히드록시드로 처리되고, tert-부톡시카르보닐의 경우에 적절한 용매, 예를 들어 디옥산 중에서, 예를 들어 -20 내지 30 ℃의 온도에서 산, 예를 들어 HCl과의 반응이 수행됨)]은 적절한 용매, 예를 들어 아세토니트릴, 디클로로메탄 및/또는 테트라히드로푸란 중에서, 바람직하게는 -40 내지 25 ℃ 범위의 온도에서 (예를 들어, 무기 산 할라이드, 예를 들어 술푸릴 클로라이드를 이용한) 할로겐화에 의해 제조될 수 있다.
R4 (= C1-C7-알킬, 특히 메틸)는, 화학식 IIA의 전구체 화합물을 적절한 용 매, 예를 들어 펜탄 및 테트라히드로푸란 중에서 -80 내지 0 ℃의 바람직한 온도에서 강염기, 예를 들어 부틸- 또는 tert-부틸-리튬과 반응시킨 후에 화학식 IIA의 상응하는 전구체 화합물 (아미노 기는 선행 단락에 기재된 바와 같이 보호 및 탈보호됨)의 페닐 고리 (특히, 이미 C1-C7-알콕시 잔기 R4가 존재하는 페닐 고리)를 적절한 용매, 예를 들어 테트라히드로푸란 중에서, 바람직하게는 -50 내지 25 ℃의 온도에서 C1-C7-알킬할로겐화물 (예를 들어, -요오다이드)에 의해 알킬화시킴으로써 도입될 수 있다.
예를 들어, 화학식 IIIA의 화합물은 다음과 같이, (필요한 경우, 튜브 내에서) 하기 화학식 IVA의 화합물을 산, 예를 들어 아세트산 또는 염산의 존재 하에 적절한 용매, 예를 들어 물 또는 디옥산 중에서 승온, 예를 들어 50 내지 160 ℃ 범위의 온도에서 하기 화학식 VA의 아민과 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
Figure 112008052214826-pct00004
식 중, Hal은 할로겐, 특히 클로로 또는 브로모이다.
Figure 112008052214826-pct00005
또한, R1이 [4-(C1-C7-알킬)-피페라진-1-일]-카르보닐로 치환된 페닐인 화학식 IIIA의 화합물은, (예를 들어, 마이크로웨이브 오븐 내에서) 상기 정의된 화학식 IVA의 화합물을 바람직하게는 산, 예를 들어 HCl의 존재 하에 적절한 용매, 예를 들어 디옥산 중에서 승온, 예를 들어 50 내지 170 ℃에서 하기 화학식 VIA의 화합물과 반응시킨 후에 생성된 하기 화학식 VIIA의 화합물을 커플링제, 예를 들어 프로필포스폰산 수화물의 존재 하에 적절한 용매, 예를 들어 DMF 중에서 질소 염기, 예를 들어 트리에틸아민 및/또는 4-디메틸아미노-피리딘의 존재 하에, 바람직하게는 0 내지 50 ℃ 범위의 온도에서 반응시켜 상응하는 화학식 IIIA의 화합물을 생성함으로써 얻어질 수 있다.
Figure 112008052214826-pct00006
식 중, A는 수소, C1-C7-알콕시 또는 할로이다.
Figure 112008052214826-pct00007
식 중, 잔기들은 화학식 IVA 및 VIA에 대해 정의된 바와 같다.
예를 들어, R5가 수소인 화학식 VA의 화합물은, 아미노 기 (NR3) 대신에 니트로 기가 존재하는 상응하는 화합물을, 예를 들어 에탄올, 물 및 아세트산 중에서 승온, 예를 들어 30 내지 100 ℃에서 철 분말에 의해 환원시키거나, 촉매, 예를 들어 라니-Ni의 존재 하에 메탄올 중에서, 예를 들어 0 내지 50 ℃의 온도에서 수소에 의해 환원시킴으로써 얻어질 수 있다. 두 경우 모두에서, 여타 통상적인 용매가 가능하다. 이후, R5가 C1-C7-알킬인 상응하는 화학식 VA의 화합물은, 예를 들어 상응하는 C1-C7-알킬할로겐화물을 이용한 알킬화에 의해 얻어질 수 있다.
상응하는 출발 물질 및 여타 화학식 VA의 화합물은 실시예에 기재된 방법에 의해 또는 그와 유사한 방식으로, 또는 당업계에 공지된 절차에 따라 얻어질 수 있는 화합물일 수 있거나, 시판중인 화합물이다.
일반 공정 조건
일반적으로, 다음 기재는 이상 및 이하에서 언급된 모든 공정에 적용되며, 이상 또는 이하에서 구체적으로 언급된 반응 조건이 바람직하다.
이상 및 이하에서 언급된 모든 반응에서, 보호기는 적절하거나 필요한 경우 (구체적으로 언급되지 않더라도), 주어진 반응에 참여하지 않는 관능기를 보호하기 위해 사용될 수 있으며, 이들은 적절하거나 바람직한 단계에서 도입되고/거나 제거될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 보호 및/또는 탈보호의 구체적인 언급 없이 반응이 기재되어 있어도, 보호기의 사용을 포함하는 반응이 본 발명에 포함된다.
본 개시의 범주 내에서, 문맥상 달리 명시되지 않는다면, 화학식 IA의 목적하는 특정 최종 생성물의 성분이 아닌 용이하게 제거가능한 기만이 "보호기"로 지칭된다. 보호기에 의한 관능기의 보호, 보호기 자체 및 이들의 제거를 위한 적절한 반응은, 예를 들어 표준 참고문헌, 예를 들어 문헌 [J. F. W. McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, London and New York 1973], [T. W. Greene and P. G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", Third edition, Wiley, New York 1999], ["The Peptides"; Volume 3 (editors: E. Gross and J. Meienhofer), Academic Press, London and New York 1981], ["Methoden der organischen Chemie" (Methods of Organic Chemistry), Houben Weyl, 4th edition, Volume 15/I, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974], [H. D. Jakubke and H. Jeschkeit, "Aminosaeuren, Peptide, Proteine" (Amino acids, Peptides, Proteins), Verlag Chemie, Weinheim, Deerfield Beach, and Basel 1982] 및 [Jochen Lehmann, "Chemie der Kohlenhydrate: Monosaccharide und Derivate" (Chemistry of Carbohydrates: Monosaccharides and Derivatives), Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974]에 기재되어 있다. 보호기의 특징은, 이들이 예를 들어, 가용매분해, 환원, 광분해 또는 생리학적 조건에 의해 (예를 들어, 효소적 절단에 의해) 용이하게 (즉, 원하지 않는 2차 반응이 발생되지 않으면서) 제거될 수 있다는 점이다.
상기 언급된 모든 공정 단계는 공지된 반응 조건, 바람직하게는 구체적으로 언급된 조건 하에, 용매 또는 희석제, 바람직하게는 사용되는 시약에 대해 불활성이며 이들을 용해시키는 용매 또는 희석제의 부재 또는 통상적으로는 존재 하에, 그리고 촉매, 축합제 또는 중화제, 예를 들어 이온 교환제, 예를 들어 양이온 교환제 (예를 들어, H+ 형태)의 존재 또는 부재 하에 (반응 및/또는 반응물의 특징에 따라 달라짐) 감온, 평온 또는 승온, 예를 들어 약 -100 ℃ 내지 약 190 ℃, 바람직하게는 약 -80 ℃ 내지 약 150 ℃, 예를 들어 -80 내지 -60 ℃, 실온, -20 내지 40 ℃, 또는 환류 온도에서, 대기압 하에 또는 밀폐된 용기 중에서, 적절한 경우 가압 하에, 및/또는 불활성 분위기, 예를 들어 아르곤 또는 질소 분위기 하에 수행될 수 있다.
용매는 임의의 특정 반응에 적합한 용매로부터 선택될 수 있으며, 공정에 대한 기재에서 달리 명시되지 않는다면, 이러한 용매로는 구체적으로 언급된 용매 또는 예를 들어, 물, 에스테르, 예를 들어 저급 알킬-저급 알카노에이트, 예를 들어 에틸 아세테이트, 에테르, 예를 들어 지방족 에테르, 예를 들어 디에틸 에테르 또는 시클릭 에테르, 예를 들어 테트라히드로푸란 또는 디옥산, 액체 방향족 탄화수 소, 예를 들어 벤젠 또는 톨루엔, 알콜, 예를 들어 메탄올, 에탄올 또는 1-프로판올 또는 2-프로판올, 니트릴, 예를 들어 아세토니트릴, 할로겐화된 탄화수소, 예를 들어 메틸렌 클로라이드 또는 클로로포름, 산 아미드, 예를 들어 디메틸포름아미드 또는 디메틸 아세트아미드, 염기, 예를 들어 헤테로시클릭 질소 염기, 예를 들어 피리딘 또는 N-메틸피롤리딘-2-온, 카르복실산 무수물, 예를 들어 저급 알칸산 무수물, 예를 들어 아세트산 무수물, 고리형, 선형 또는 분지형 탄화수소, 예를 들어 시클로헥산, 헥산 또는 이소펜탄, 또는 이들의 혼합물 (예를 들어, 수용액)로부터 선택될 수 있다. 이러한 용매 혼합물은, 예를 들어 크로마토그래피 및 분배에 의한 후처리에서도 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 임의의 공정 단계에서 중간체로서 얻어질 수 있는 화합물을 출발 물질로 사용하여 나머지 공정 단계를 수행하는 공정 형태; 또는 출발 물질이 반응 조건 하에 형성되거나 또는 유도체 형태, 예를 들어 보호된 형태 또는 염 형태로 사용되거나, 또는 본 발명에 따른 공정에 의해 얻어질 수 있는 화합물이 공정 조건 하에 생성되어 동일계에서 추가로 처리되는 공정 형태에 관한 것이다. 본 발명의 공정에서는, 바람직한 것으로 기재된 화학식 IA의 화합물을 생성하는 출발 물질이 사용되는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명은 신규한 중간체 및/또는 출발 물질에 관한 것이다. 실시예에 언급된 것들과 동일하거나 유사한 반응 조건 및 신규 중간체가 특히 바람직하다.
본 발명에 따른 바람직한 실시양태:
바람직한 실시양태 및 보다 일반적인 범주에 있는 선행 및 후행 실시양태, 및 청구의 범위에서, 임의의 하나 이상 또는 모든 일반적인 표현 또는 기호는 서로 독립적으로, 이상 및 이하에 제공된 상응하는 보다 구체적인 정의로 대체될 수 있고, 이에 따라 본 발명의 보다 바람직한 실시양태가 제공된다.
청구의 범위에 주어진 실시양태가 바람직하고, 따라서 이들은 이 거명을 통해 본원에 포함된다. 특히, 상기 A, B 또는 C 군 중 임의의 한 군으로 주어진 화학식 IA의 화합물이 바람직하다. 실시예에 주어진 1종 이상의 화학식 IA의 화합물 및 그의 (특히, 제약상 허용되는) 염이 매우 바람직하다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하나, 본 발명의 범주를 제한하지는 않는다. 온도는 섭씨 온도로 측정되었다. 달리 명시되지 않는다면, 반응은 실온에서 수행되었다. Rf 값은 용출액이 앞쪽으로 이동한 거리에 대한 각 물질이 이동한 거리의 비율을 나타내고, 실리카 겔 박층 플레이트 (5 × 10 cm TLC 플레이트, 실리카 겔 F254, 독일 다름스타트에 소재한 머크) 상에서 하기 명시된 용매 시스템을 이용한 박층 크로마토그래피에 의해 측정되었다.
분석용 HPLC 조건:
시스템 1
선형 구배 20-100％ CH3CN (5분) + 100％ CH3CN (0.1％ TFA) (1.5분); 215 nm에서 검출; 유속 1 mL/분 (30 ℃). 컬럼: 뉴클레오실 (Nucleosil) 100-3 C18 (70 × 4.0 mm).
약어 및 두문자어:
AcOH 아세트산
API-MS 대기압 이온화 질량 분광법
염수 물 중 NaCl의 포화 용액
셀라이트 셀라이트 (Celite, 등록상표) (셀라이트 코포레이션 (The Celite Corporation)) = 규조토-기재 여과 보조제
CH3CN 아세토니트릴
DCM 디클로로메탄
conc. 농축
DIEA 디이소프로필에틸아민
DMAP 4-디메틸아미노-피리딘
DMF 디메틸 포름아미드
DMP 1,3-디메틸-3,4,5,6-테트라히드로-2-(1H)-피리미디논
DMSO 디메틸술폭시드
equiv 당량
ESI-MS 전자분무 이온화 질량 분광법
Et2O 디에틸 에테르
Et3N 트리에틸아민
EtOAc 에틸 아세테이트
EtOH 에탄올
HNO3 질산
H2SO4 황산
h 시간
Hex 헥산
HCl 염산
H2O 물
HPLC 고압 액체 크로마토그래피
L 리터
LiOH 수산화리튬
Me 메틸
MeOH 메탄올
mL 밀리리터
min 분
m.p. 융점
MPLC 중압 액체 크로마토그래피
MS 질량 스펙트럼
NaH 수소화나트륨
Na2CO3 탄산나트륨
NaHCO3 중탄산나트륨
Na2SO4 황산나트륨
NH3 aq 수성 암모니아
NMP 1-메틸-2-피롤리돈
NMR 핵 자기 공명
PdCl2(dppf) [1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]디클로로팔라듐(II)
Pd(PPh3)4 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0)
Pd(PhCN)2Cl2 비스(벤조니트릴)팔라듐 (II) 클로라이드
Ph 페닐
Rf 전개율 (TLC)
RT 실온
TBTU O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트
TFA CF3COOH (트리플루오로아세트산)
THF 테트라히드로푸란
TLC 박층 크로마토그래피
TR 체류 시간
wt. 중량
마이크로웨이브 장치: 엠리스 옵티마이저 (Emrys Optimizer) (바이오티지 (Biotage))
반응식의 예
Figure 112008052214826-pct00008
실시예 1: 1-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-3-{6-[4-(2-모르폴린-4-일-에톡시)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-우레아
아르곤 분위기 하에 포스겐 (톨루엔 중 20％, 0.8 mL, 1.58 mmol, 2.4 equiv)을 디옥산 (2.5 mL) 중 2,6-디클로로-3,5-디메톡시아닐린 (175 mg, 0.79 mmol, 1.2 equiv)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 가열 환류시키고, 1시간 동안 교반하고, 실온으로 냉각시키고, 진공 하에 농축하였다. 생성된 이소시아네이트를 75 ℃에서 아르곤 분위기 하에 NMP (2 mL) 중 N-[4-(2-모르폴린-4-일-에톡시)-페 닐]-피리미딘-4,6-디아민 (208.5 mg, 0.66 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 2시간 동안 75 ℃에서 교반하고, 실온으로 냉각시킨 후, DCM 및 NaHCO3 포화 수용액으로 희석시켰다. 수성층을 분리하고, DCM으로 추출하였다. 유기상을 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고, 농축하였다. 조질의 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (DCM/MeOH + 1％ NH3 aq, 96:4)에 의해 정제한 후, 생성된 물질을 MeOH 중에서 분쇄하여 표제 화합물을 백색 고체로서 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00009
단계 1.1: N-[4-(2-모르폴린-4-일-에톡시)-페닐]-피리미딘-4,6-디아민
H2O (1 mL) 및 빙초산 (5 mL) 중 6-클로로-피리미딘-4-일아민 (194 mg, 1.5 mmol, 1.3 equiv) 및 4-(2-모르폴린-4-일-에톡시)-페닐아민 (256 mg, 1.15 mmol)의 혼합물을 16시간 동안 100 ℃에서 교반하였다. 용매 증발 후, 잔류물을 DCM에 용해시키고, NaHCO3 포화 수용액으로 희석시켰다. 수성층을 분리하고, DCM으로 추출하였다. 유기상을 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고, 농축하였다. 잔류물을 EtOAc 중에서 분쇄하여 표제 화합물을 회색 고체로서 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00010
단계 1.2: 4-(2-모르폴린-4-일-에톡시)-페닐아민
아르곤 분위기 하에 4-(2-클로로-에틸)-모르폴린 히드로클로라이드 (4.2 g, 22 mmol, 1.2 equiv)를 DMF (32 mL) 중 4-아미노페놀 (2 g, 18.3 mmol) 및 수산화나트륨 미세 분말 (1.87 g, 45.8 mmol, 2.5 equiv)의 혼합물에 한꺼번에 첨가하였다. 반응 혼합물을 23.5시간 동안 실온에서 교반하였다. 생성된 암색 현탁액을 여과하였다. 여액을 DCM (200 mL)으로 희석시키고, 염수 (2 × 60 mL)로 세척하였다. 유기상을 건조시키고 (황산나트륨), 여과하고, 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (DCM/EtOH, 95:5 → 7:3)에 의해 정제하여 표제 화합물을 황갈색 고체로서 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00011
단계 1.3: 2,6-디클로로-3,5-디메톡시아닐린
에탄올 (1.3 L) 중 N-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-아세트아미드 (34.5 g, 264 mmol)의 용액에 2 M KOH (0.72 L)를 첨가하였다. 이후, 반응 혼합물을 가열 환류시키고, 44시간 동안 환류 온도에서 교반한 다음, 실온으로 냉각시켰다. 생성된 현탁액을 0 ℃로 냉각시키고, 1시간 동안 교반하고, 여과하였다. 중성에 도달할 때까지 잔류물을 소량의 차가운 EtOH/H2O (1:1) 및 차가운 H2O로 세척하고, 건조시켜 표제 화합물을 백색 고체로서 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00012
단계 1.4: N-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-아세트아미드
아르곤 분위기 하에 술푸릴클로라이드 (26.9 mL, 325 mmol, 1.93 equiv)를 CH3CN (500 mL) 중 N-(3,5-디메톡시페닐)-아세트아미드 (32.9 g, 169 mmol)의 차가운 (0 ℃) 현탁액에 첨가하였다 (7분). 생성된 황색빛 혼합물을 30분간 교반하고, 중탄산나트륨 포화 수용액 (250 mL)을 적가함으로써 켄칭하였다. 생성된 침전물을 진공 여과에 의해 수집하고, H2O (300 mL)로 세척하고, 건조시켜 20 g의 원하는 생성물 (뱃치 1)을 얻었다. 여액을 NaHCO3 포화 수용액 (300 mL)으로 희석시키고, EtOAc (2 × 300 mL)로 추출하였다. 유기상을 H2O 및 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고, 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/Hex, 1:1 → 2:1)에 정제하여 8.8 g의 생성물 (뱃치 2)을 얻었다. 뱃치 1 및 2를 합하고, 헥산 중에서 교반하였다. 고체를 여과에 의해 수집하고, 헥산으로 세척하고, 건조시켜 표제 화합물을 백색 고체로서 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00013
단계 1.5: N-(3,5-디메톡시-페닐)-아세트아미드
아세트산 수화물 (13 mL, 137 mmol, 1.05 equiv)을 톨루엔 (110 mL) 중 3,5-디메톡시아닐린 (20 g, 131 mmol)의 현탁액에 첨가하면서 (15분), 내부 온도를 35 내지 45 ℃ 범위로 유지시켰다. 반응 혼합물을 20시간 동안 실온에서 교반하였다. 생성된 진한 회색 현탁액을 헥산 (55 mL)으로 희석시키고, 여과하였다. 여과기 상의 잔류물을 톨루엔/Hex (2:1, 70 mL) 및 Hex로 세척하고, 건조시켜 표제 화합물을 백색 고체로서 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00014
실시예 2: 3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-메틸-1-{6-[3-(4-메틸-피페라진-1-일메틸)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-우레아
아르곤 분위기 하에 포스겐 (톨루엔 중 20％, 1 mL, 2.0 mmol, 2.4 equiv)을 디옥산 (2.5 mL) 중 2,6-디클로로-3,5-디메톡시아닐린 (221 mg, 1.0 mmol, 1.2 equiv)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 가열 환류시키고, 1시간 동안 교반하고, 실온으로 냉각시키고, 진공 하에 농축하였다. 생성된 이소시아네이트를 환류 온도에서 아르곤 분위기 하에 톨루엔 (5 mL) 중 N-메틸-N'-[3-(4-메틸-피페라진-1-일메틸)-페닐]-피리미딘-4,6-디아민 (단계 2.1) (259 mg, 0.83 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 3시간 동안 환류 온도에서 교반하고, 실온으로 냉각시키고, DCM 및 NaHCO3 포화 수용액으로 희석시켰다. 수성층을 분리하고, DCM으로 추출하였다. 유기상을 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고, 농축하였다. 조질의 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (DCM/MeOH + 1％ NH3 aq, 95:5)에 의해 정제하여 표제 화합물을 황색 고체로서 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00015
단계 2.1: N-메틸-N'-[3-(4-메틸-피페라진-1-일메틸)-페닐]-피리미딘-4,6-디아민
디옥산 (7 mL) 중 (6-클로로-피리미딘-4-일)-메틸-아민 (385 mg, 2.68 mmol, 1.1 equiv), 3-(4-메틸-피페라진-1-일메틸)-페닐아민 (500 mg, 2.44 mmol) 및 4 N HCl의 혼합물을 밀봉 튜브 중에서 17.5시간 동안 150 ℃로 가열하였다. 용매를 제거하고, 잔류물을 DCM 및 NaHCO3 포화 수용액으로 희석시켰다. 수성층을 분리하고, DCM 및 DCM/MeOH (95:5)로 추출하였다. 유기상을 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고, 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 MPLC (DCM/MeOH + 1％ NH3 aq, 95:5)에 의해 정제하여 표제 화합물을 베이지색 고체로서 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00016
단계 2.2: 3-(4-메틸-피페라진-1-일메틸)-페닐아민
MeOH (150 mL) 중 1-메틸-4-(3-니트로-벤질)-피페라진 (6.9 g, 29.14 mmol) 및 라니 니켈 (2 g)의 현탁액을 5시간 동안 실온에서 수소 분위기 하에 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 농축하여 표제 화합물을 황색 고체로서 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00017
단계 2.3: 1-메틸-4-(3-니트로-벤질)-피페라진
3-니트로벤질클로라이드 (5 g, 29.14 mmol), N-메틸피페라진 (3.9 mL, 34.97 mmol, 1.2 equiv), 탄산칼륨 (8 g, 58.28, 2 equiv) 및 아세톤 (100 mL)의 혼합물을 15시간 동안 환류 온도에서 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 여과하고, 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 MPLC (DCM/MeOH + 1％ NH3 aq, 95:5)에 의해 정제하여 표제 화합물을 갈색 오일로서 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00018
실시예 3: 3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-{6-[3-(4-에틸-피페라진-1-일)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-1-메틸-우레아
실시예 2에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
Figure 112008052214826-pct00019
단계 3.1: N-[3-(4-에틸-피페라진-1-일)-페닐]-N'-메틸-피리미딘-4,6-디아민
단계 2.1에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
Figure 112008052214826-pct00020
단계 3.2: 3-(4-에틸-피페라진-1-일)-페닐아민
단계 2.2에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
Figure 112008052214826-pct00021
단계 3.3: 1-에틸-4-(3-니트로-페닐)-피페라진
1-플루오로-3-니트로벤젠 (3.2 mL, 29.7 mmol) 및 N-에틸-피페라진 (7.6 mL, 59.4 mmol, 2 equiv)의 혼합물을 가열 환류시키고, 117시간 동안 교반하였다. 반 응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, H2O (40 mL) 및 DCM/MeOH (9:1, 80 mL)로 희석시켰다. 수성층을 분리하고, DCM/MeOH (9:1)로 추출하였다. 유기상을 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고, 농축하였다. 조질의 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (DCM/MeOH, 1:0 → 95:5)에 의해 정제하여 표제 화합물을 갈색 오일로서 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00022
실시예 4: 3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-메틸-1-{6-[4-(2-모르폴린-4-일-에톡시)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-우레아
실시예 1에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
Figure 112008052214826-pct00023
단계 4.1: N-메틸-N'-[4-(2-모르폴린-4-일-에톡시)-페닐]-피리미딘-4,6-디아민
단계 1.1에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
Figure 112008052214826-pct00024
실시예 5: 1-[6-(4-벤질옥시-페닐아미노)-피리미딘-4-일]-3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-메틸-우레아
실시예 2에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
Figure 112008052214826-pct00025
단계 5.1: N-(4-벤질옥시-페닐)-N'-메틸-피리미딘-4,6-디아민
단계 1.1에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
Figure 112008052214826-pct00026
실시예 6: 3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-[6-(4-히드록시-페닐아미노)-피리미딘-4-일]-1-메틸-우레아
1-[6-(4-벤질옥시-페닐아미노)-피리미딘-4-일]-3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-메틸-우레아 (실시예 5) (67 mg, 0.121 mmol), 탄소상 팔라듐 (20 mg) 및 MeOH (3.5 mL)의 현탁액을 3시간 동안 실온에서 수소 분위기 하에 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 정제하여 표제 화합물을 갈색 고체로서 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00027
실시예 7: 1-(2-클로로-3,5-디메톡시-6-메틸-페닐)-3-{6-[4-(4-에틸-피페라진-1-일)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-우레아
실시예 2에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
Figure 112008052214826-pct00028
단계 7.1: N-[4-(4-에틸-피페라진-1-일)-페닐]-피리미딘-4,6-디아민
단계 1.1에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
Figure 112008052214826-pct00029
단계 7.2: 4-(4-에틸피페라진-1-일)-아닐린
MeOH (120 mL) 중 1-에틸-4-(4-니트로-페닐)-피페라진 (6.2 g, 26.35 mmol) 및 라니 니켈 (2 g)의 현탁액을 7시간 동안 실온에서 수소 분위기 하에 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 농축하여 표제 화합물을 보라색 고체로서 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00030
단계 7.3: 1-에틸-4-(4-니트로-페닐)-피페라진
1-브로모-4-니트로벤젠 (6 g, 29.7 mmol) 및 1-에틸피페라진 (7.6 mL, 59.4 mmol, 2 equiv)의 혼합물을 15시간 동안 80 ℃로 가열하였다. 이를 실온으로 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 물 및 DCM/MeOH (9:1)로 희석시켰다. 수성층을 분리하고, DCM/MeOH (9:1)로 추출하였다. 유기상을 염수로 세척하고, 건조시키고 (황산나트륨), 여과하고, 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (DCM/MeOH + 1％ NH3 aq, 9:1)에 의해 정제하여 표제 화합물을 황색 고체로서 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00031
단계 7.4: 2-클로로-3,5-디메톡시-6-메틸-페닐-아민
아르곤 분위기 하에 HCl (91 mL, 360 mmol, 8 equiv, 디옥산 중 4 N)을 디옥산 (150 mL) 중 (2-클로로-3,5-디메톡시-6-메틸-페닐)-카르밤산 tert-부틸 에스테 르 (13.8 g, 45.7 mmol)의 차가운 (10 ℃) 용액에 적가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 24시간 동안 교반하고, 농축하였다. 잔류물을 EtOAc로 희석시키고, NaHCO3 포화 수용액 및 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고, 농축하였다. 잔류물을 DCM/Hex 중에서 결정화에 의해 정제하여 표제 화합물을 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00032
단계 7.5: (2-클로로-3,5-디메톡시-6-메틸-페닐)-카르밤산 tert-부틸 에스테르
아르곤 분위기 하에 DCM (140 mL) 중 술푸릴클로라이드 (6.7 mL, 79.8 mmol, 1.05 equiv)의 용액을 THF (330 mL) 중 (3,5-디메톡시-2-메틸-페닐)-카르밤산 tert-부틸 에스테르 (20.4 g, 76.3 mmol)의 차가운 (-15 ℃) 용액에 적가하였다. 반응 혼합물을 3시간 동안 -15 ℃에서 교반한 후, 얼음/H2O (400 mL), NaHCO3 포화 수용액 (400 mL) 및 EtOAc (400 mL)의 혼합물에 부었다. 층들을 분리하고, 수성상을 EtOAc (2 × 200 mL)로 추출하였다. 합한 유기상을 H2O (3 × 200 mL) 및 염수 (200 mL)로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고, 농축하였다. 잔류물을 디에틸 에테르 중에서 분쇄에 의해 정제한 후, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (Hex/아세톤, 95:5)로 처리하여 표제 화합물을 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00033
단계 7.6: (3,5-디메톡시-2-메틸-페닐)-카르밤산 tert-부틸 에스테르
아르곤 분위기 하에 tert-부틸리튬 용액 (200 mL, 340 mmol, 2.4 equiv, 펜 탄 중 1.7 M)을 THF (250 mL) 중 (3,5-디메톡시-페닐)-카르밤산 tert-부틸 에스테르 (36.1 g, 142 mmol)의 차가운 (-65 ℃) 용액에 적가하였다. 혼합물을 15분간 -65 ℃에서 교반한 후에 -25 ℃로 가온하였다. 이후, THF (140 mL) 중 메틸요오다이드 (10.7 mL, 171 mmol, 1.2 equiv)의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 -25 ℃에서 교반한 후, 얼음/H2O (300 mL) 및 EtOAc (300 mL)의 혼합물에 부었다. 층들을 분리하고, 수성상을 EtOAc (2 × 150 mL)로 추출하였다. 합한 유기상을 H2O (3 × 150 mL) 및 염수 (200 mL)로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고, 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (Hex/아세톤, 95:5 → 9:1 → 4:1)에 의해 정제하여 표제 화합물을 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00034
단계 7.7: (3,5-디메톡시-페닐)-카르밤산 tert-부틸 에스테르
실온에서 아르곤 분위기 하에 THF (200 mL) 중 디-tert-부틸-디카르보네이트 (145 g, 651 mmol, 1.3 equiv)의 용액을 THF (1.5 L) 중 3,5-디메톡시아닐린 (78.2 g, 500 mmol)의 용액에 적하였다. 반응 혼합물을 4.5시간 동안 가열 환류시키고 (가열시 상당한 양의 기체 방출이 관찰되었음), 실온으로 냉각시키고, 농축하였다. 잔류물을 EtOAc (800 mL) 및 H2O (800 mL)로 희석시켰다. 층들을 분리하고, 수성상을 EtOAc (2 × 200 mL)로 추출하였다. 합한 유기상을 0.1 N HCl (200 mL), H2O 및 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고, 농축하였다. 잔류물을 DCM/Hex 중에서 결정화시켜 표제 화합물을 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00035
실시예 8: 3-(2-클로로-3,5-디메톡시-6-메틸-페닐)-1-{6-[4-(4-에틸-피페라진-1-일)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-1-메틸-우레아
실시예 1에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
Figure 112008052214826-pct00036
실시예 9: 3-(2-클로로-3,5-디메톡시-6-메틸-페닐)-1-{6-[4-(2-디메틸아미노-에톡시)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-1-메틸-우레아
실시예 1에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
Figure 112008052214826-pct00037
단계 9.1: N-[4-(2-디메틸아미노-에톡시)-페닐]-N'-메틸-피리미딘-4,6-디아민
단계 1.1에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
Figure 112008052214826-pct00038
단계 9.2: 4-(2-디메틸아미노-에톡시)-페닐아민
단계 1.2에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
Figure 112008052214826-pct00039
실시예 10: 3-(2-클로로-3,5-디메톡시-6-메틸-페닐)-1-메틸-(6-{4-[2-(4-메틸-피페라진-1-일)-에톡시]-페닐아미노}-피리미딘-4-일)-우레아
실시예 2에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
Figure 112008052214826-pct00040
단계 10.1: N-메틸-N'-{4-[2-(4-메틸-피페라진-1-일)-에톡시]-페닐}-피리미딘-4,6-디아민
단계 1.1에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
Figure 112008052214826-pct00041
실시예 11: 3-(2-클로로-6-요오도-3,5-디메톡시-페닐)-1-{6-[4-(4-에틸-피페라진-1-일)-페닐아미노}-피리미딘-4-일}-1-메틸-우레아
실시예 1에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
Figure 112008052214826-pct00042
단계 11.1 N-[4-(4-에틸-피페라진-1-일)-페닐]-N'-메틸-피리미딘-4,6-디아민
단계 1.1에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
Figure 112008052214826-pct00043
단계 11.2: 2-클로로-6-요오도-3,5-디메톡시-페닐-아민
아르곤 분위기 하에 HCl (6.46 mL, 26 mmol, 9.1 equiv, 디옥산 중 4 N)을 디옥산 (10 mL) 중 (2-클로로-3,5-디메톡시-6-메틸-페닐)-카르밤산 tert-부틸 에스테르 (1.28 g, 2.85 mmol, 92％ 순도)의 차가운 (10 ℃) 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온한 후, 1.5시간 동안 교반하였다. 잔류물을 EtOAc 및 얼음/물로 희석시키고, NaHCO3 포화 수용액을 첨가함으로써 염기성화시켰다. 층들을 분리하였다. 수성층을 EtOAc로 추출하였다. 유기상을 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고, 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (DCM)에 의해 정제하여 표제 화합물을 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00044
단계 11.3: (2-클로로-6-요오도-3,5-디메톡시-페닐)-카르밤산 tert-부틸 에스테르
아르곤 분위기 하에 DCM (20 mL) 중 술푸릴클로라이드 (0.92 mL, 11.0 mmol, 1.16 equiv)의 용액을 THF (48 mL) 중 (2-요오도-3,5-디메톡시-페닐)-카르밤산 tert-부틸 에스테르 (3.6 g, 9.49 mmol)의 차가운 (-15 ℃) 용액에 적가하였다 (30분). 반응 혼합물을 1시간 동안 -15 ℃에서 교반한 후, 얼음/H2O (100 mL), NaHCO3 포화 수용액 (80 mL) 및 EtOAc (100 mL)의 혼합물에 부었다. 층들을 분리하고, 수성상을 EtOAc (2 × 100 mL)로 추출하였다. 합한 유기상을 H2O (3 × 60 mL) 및 염수 (60 mL)로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고, 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (DCM)에 의해 정제한 후, DCM/Hex 중에서 결정화시켜 표제 화합물을 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00045
단계 11.4: (2-요오도-3,5-디메톡시-페닐)-카르밤산 tert-부틸 에스테르
아르곤 분위기 하에 tert-부틸리튬 용액 (14.1 mL, 24 mmol, 2.4 equiv, 펜탄 중 1.7 M)을 THF (18 mL) 중 (3,5-디메톡시-페닐)-카르밤산 tert-부틸 에스테르 (2.53 g, 10 mmol)의 차가운 (-65 ℃) 용액에 적가하였다 (15분). 혼합물을 15분간 -65 ℃에서 교반한 후, -25 ℃로 가온하였다. 과량의 트리플루오로메틸요오다이드를 황색 반응 혼합물 내로 버블링시켰다. 생성된 암색 혼합물을 얼음/H2O (60 mL) 및 EtOAc (60 mL)의 혼합물에 부었다. 층들을 분리하고, 수성상을 EtOAc (2 × 30 mL)로 추출하였다. 합한 유기상을 H2O (3 × 40 mL) 및 염수 (60 mL)로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고, 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (DCM/Hex, 2:1)에 의해 정제하여 표제 화합물을 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00046
단계 11.5: (3,5-디메톡시-페닐)-카르밤산 tert-부틸 에스테르
THF (100 mL) 중 디-tert-부틸-디카르보네이트 (69.5 g, 312 mmol, 1.3 equiv)의 용액을 THF (600 mL) 중 3,5-디메톡시아닐린 (37.5 g, 240 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 3시간 동안 가열 환류시키고, 실온으로 냉각시키고, 밤새 교반하고, 농축하였다. 잔류물을 EtOAc (500 mL)와 H2O (500 mL) 사이에 분배시켰다. 층들을 분리하고, 수성상을 EtOAc (2 × 100 mL)로 추출하였다. 합한 유기상을 0.1 N HCl (2 × 100 mL), H2O 및 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고, 농축하였다. 잔류물을 헥산을 이용한 분쇄에 의해 정제하여 표제 화합물을 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00047
실시예 12: 3-(2-클로로-3,5-디메톡시-6-메틸-페닐)-1-{6-[4-(4-이소프로필-피페라진-1-일)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-1-메틸-우레아
실시예 1에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
Figure 112008052214826-pct00048
단계 12.1: N-[4-(4-이소프로필-피페라진-1-일)-페닐]-N'-메틸-피리미딘-4,6-디아민
단계 1.1에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
Figure 112008052214826-pct00049
단계 12.2: 4-(4-이소프로필피페라진-1-일)-아닐린
MeOH (100 mL) 중 1-이소프로필-4-(4-니트로-페닐)-피페라진 (5.18 g, 20.80 mmol) 및 탄소상 5％ 팔라듐 (0.5 g)의 현탁액을 2.7시간 동안 실온에서 수소 분위기 하에 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 농축하여 표제 화합물을 보라색 고체로서 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00050
단계 12.3: 1-이소프로필-4-(4-니트로-페닐)-피페라진
1-브로모-4-니트로벤젠 (6 g, 29.7 mmol) 및 1-에틸피페라진 (7.6 mL, 59.4 mmol, 2 equiv)의 혼합물을 15시간 동안 80 ℃로 가열하였다. 이를 실온으로 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (DCM/MeOH, 95:5)에 의해 정제하여 표제 화합물을 황색 고체로서 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00051
실시예 13: 1-{6-[4-(4-벤질-피페라진-1-일)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-메틸-우레아
실시예 2에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
Figure 112008052214826-pct00052
단계 13.1: N-[4-(4-벤질-피페라진-1-일)-페닐]-N'-메틸-피리미딘-4,6-디아민
단계 1.1에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
Figure 112008052214826-pct00053
단계 13.2: 4-(4-벤질-피페라진-1-일)-페닐아민
철 분말 (5.4 g, 97 mmol, 4 equiv)을 1-벤질-4-(4-니트로-페닐)-피페라진 (7.2 g, 24.2 mmol), EtOH (150 mL), H2O (40 mL) 및 AcOH (20 mL)의 80 ℃ 혼합물에 나누어 첨가하였다. 반응 혼합물을 1.75시간 동안 80 ℃에서 교반하고, 실온으로 냉각시키고, 농축하였다. 잔류물을 EtOAc 및 Na2CO3 포화 수용액으로 희석시켰다. 층들을 분리하고, 수성상을 EtOAc로 추출하였다. 합한 유기상을 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고, 농축하여 표제 화합물을 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00054
단계 13.3: 1-벤질-4-(4-니트로-페닐)-피페라진
1-브로모-4-니트로벤젠 (5 g, 24.8 mmol) 및 1-벤질피페라진 (8.6 mL, 49.5 mmol, 2 equiv)의 혼합물을 17시간 동안 80 ℃로 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, DCM/H2O으로 희석시켰다. 층들을 분리하고, 수성상을 DCM으로 추출하였다. 합한 유기상을 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고, 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (Hex/EtOAc, 1:1)에 의해 정제하여 표제 화합물을 황색 고체로서 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00055
실시예 14: 3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-메틸-1-[6-(4-피페라진-1-일-페닐아미노)-피리미딘-4-일]-우레아
1-{6-[4-(4-벤질-피페라진-1-일)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-6-메틸-페닐)-1-메틸-우레아 (100 mg, 0.161 mmol) (실시예 13), 탄소상 팔라듐 (30 mg), MeOH (6 mL) 및 HCl (37％, 16 ㎕)의 현탁액을 5일간 실온에서 수소 분위기 하에 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (DCM/2 N NH3 (MeOH 중), 95:5)에 의해 정제하여 표제 화합물을 베이지색 고체로서 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00056
실시예 15: 3-(2-클로로-3,5-디메톡시-6-메틸-페닐)-1-[6-(3-디메틸아미노메 틸-페닐아미노)-피리미딘-4-일]-1-메틸-우레아
실시예 2에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
Figure 112008052214826-pct00057
실시예 16: 3-(2-클로로-3,5-디메톡시-6-메틸-페닐)-1-{6-[3-(4-에틸-피페라진-1-일)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-1-메틸-우레아
실시예 2에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
Figure 112008052214826-pct00058
실시예 17: 3-(2-클로로-3,5-디메톡시-6-메틸-페닐)-1-{6-[4-(2-피롤리딘-1-일-에톡시)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-1-메틸-우레아
실시예 2에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
Figure 112008052214826-pct00059
단계 17.1: N-메틸-N'-[4-(2-피롤리딘-1-일-에톡시)-페닐]-피리미딘-4,6-디아민
단계 2.1에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
Figure 112008052214826-pct00060
단계 17.2: 4-(2-피롤리딘-1-일-에톡시)-페닐아민
단계 1.2에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
Figure 112008052214826-pct00061
실시예 18: 3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-{6-[3-플루오로-4-(2-피롤리딘-1-일-에톡시)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-1-메틸-우레아
실시예 2에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
Figure 112008052214826-pct00062
단계 18.1: N-[3-플루오로-4-(2-피롤리딘-1-일-에톡시)-페닐]-N'-메틸-피리미딘-4,6-디아민
단계 1.1에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
Figure 112008052214826-pct00063
단계 18.2: 3-플루오로-4-(2-피롤리딘-1-일-에톡시)-페닐아민
EtOH (20 mL) 중 1-[2-(2-플루오로-4-니트로-페녹시)-에틸]-피롤리딘 (1.25 g, 4.92 mmol) 및 탄소상 10％ 팔라듐 (0.2 g)의 현탁액을 1시간 동안 실온에서 수소 분위기 하에 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 농축하여 표제 화합물을 갈색 오일로서 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00064
단계 18.3: 1-[2-(2-플루오로-4-니트로-페녹시)-에틸]-피롤리딘
1-(2-클로로-에틸)-피롤리딘 히드로클로라이드 (1.2 g, 7.0 mmol, 1.1 equiv)를 DMF (20 mL) 중 2-플루오로-4-니트로페놀 (1 g, 6.4 mmol) 및 탄산세슘 (5.2 g, 15.9 mmol, 2.5 equiv)의 현탁액에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 80 ℃로 가열하고, 18시간 동안 교반하였다. 추가량 (1 g)의 1-(2-클로로-에틸)-피롤리딘 히드로클로라이드를 첨가하고, 혼합물을 3시간 동안 80 ℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, EtOAc 및 H2O로 희석시켰다. 층들을 분리하고, 수성층을 EtOAc로 추출하였다. 유기상을 H2O로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고, 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (DCM/MeOH + 1％ NH3 aq, 95:5)에 의해 정제하여 표제 화합물을 황색 고체로서 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00065
실시예 19: 3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-{6-[4-(1-에틸-피페리딘-4-일)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-1-메틸-우레아
실시예 2에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
Figure 112008052214826-pct00066
단계 19.1: N-[4-(1-에틸-피페리딘-4-일)-페닐-N'-메틸-피리미딘-4,6-디아민
단계 1.1에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
Figure 112008052214826-pct00067
단계 19.2: 4-(1-에틸-피페리딘-4-일)-페닐아민
EtOH (10 mL) 중 1-에틸-4-(4-니트로-페닐)-피페리딘 (0.8 g, 4.92 mmol) 및 탄소상 10％ 팔라듐 (0.1 g)의 현탁액을 3시간 동안 실온에서 수소 분위기 하에 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (DCM/MeOH + 1％ NH3 aq, 95:5)에 의해 정제하여 표 제 화합물을 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00068
단계 19.3: 1-에틸-4-(4-니트로-페닐)-피페리딘
나트륨 트리아세톡시보로하이드라이드 (3.1 g, 14.6 mmol, 3 equiv)를 DCM (20 mL) 중 4-(4-니트로-페닐)-피페리딘 (1 g, 4.9 mmol) 및 아세트알데히드 (0.82 mL, 14.6 mmol, 3 equiv)의 차가운 (5 ℃) 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 5 ℃에서 교반한 후, DCM 및 NaHCO3 포화 수용액으로 희석시켰다. 층들을 분리하고, 수성층을 DCM으로 추출하였다. 유기상을 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고, 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (DCM/MeOH + 1％ NH3 aq, 98:2)에 의해 정제하여 표제 화합물을 황색 오일로서 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00069
단계 19.4: 4-(4-니트로-페닐)-피페리딘
AcOH (40 mL) 중 진한 H2SO4 (2.65 mL)의 용액 및 AcOH (20 mL) 중 진한 HNO3 (2.1 mL)의 용액을 AcOH 중 4-페닐피페리딘의 용액 (40 mL)에 순서대로 적가하면서 온도를 20 ℃ 미만으로 유지시켰다. 이후, 진한 H2SO4 (40 mL)를 첨가하였다 (냉각은 수행되지 않았고, 내부 온도는 60 ℃에 도달하였음). 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 얼음/물 (100 g)에 붓고, 고체 NaHCO3 (150 g)을 첨가함으로써 중화시키고, DCM으로 추출하였다. 유기상을 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고, 농축하였다. 잔류물을 Et2O 중에서 분쇄에 의해 정제하여 표제 화합물을 황색 고체로서 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00070
실시예 20: 3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-에틸-1-{6-[4-(4-에틸-피페라진-1-일)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-우레아
실시예 2에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
Figure 112008052214826-pct00071
단계 20.1: N-에틸-N'-[4-(4-에틸-피페라진-1-일)-페닐]-피리미딘-4,6-디아민
단계 1.1에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
Figure 112008052214826-pct00072
실시예 21: 3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-{6-[2-플루오로-4-(2-피롤리딘-1-일-에톡시)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-1-메틸-우레아
실시예 2에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
Figure 112008052214826-pct00073
단계 21.1: N-[2-플루오로-4-(2-피롤리딘-1-일-에톡시)-페닐]-N'-메틸-피리미딘-4,6-디아민
단계 2.1에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
Figure 112008052214826-pct00074
단계 21.2: 2-플루오로-4-(2-피롤리딘-1-일-에톡시)-페닐아민
MeOH (40 mL) 중 1-[2-(3-플루오로-4-니트로-페녹시)-에틸]-피롤리딘 (1.96 g, 7.7 mmol) 및 탄소상 10％ 팔라듐 (0.2 g)의 현탁액을 0.5시간 동안 실온에서 수소 분위기 하에 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 농축하여 표제 화합물을 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00075
단계 21.3: 1-[2-(3-플루오로-4-니트로-페녹시)-에틸]-피롤리딘
1-(2-클로로-에틸)-피롤리딘 히드로클로라이드 (2.6 g, 15.4 mmol, 1.3 equiv)를 DMF (40 mL) 중 3-플루오로-4-니트로페놀 (1.84 g, 11.7 mmol) 및 탄산세슘 (9.1 g, 27.9 mmol, 2.5 equiv)의 혼합물에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 80 ℃로 가열하고, 3시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시킨 후, DCM 및 H2O으로 희석시켰다. 층들을 분리하고, 수성층을 DCM으로 추출하였다. 유기상을 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고, 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (DCM/MeOH + 1％ NH3 aq, 97:3)에 의해 정제하여 1.96 g의 표제 화합물을 암황색 고체로서 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00076
실시예 22: 3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-{6-[4-(4-에틸-피페라진-1-일)-2-메톡시-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-1-메틸-우레아
실시예 2에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
Figure 112008052214826-pct00077
단계 22.1: N-[4-(4-에틸-피페라진-1-일)-2-메톡시-페닐]-N'-메틸-피리미딘-4,6-디아민
단계 1.1에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
Figure 112008052214826-pct00078
단계 22.2: 4-(4-에틸-피페라진-1-일)-2-메톡시-페닐아민
MeOH (80 mL) 중 1-에틸-4-(3-메톡시-4-니트로-페닐)-피페라진 (4 g, 15.1 mmol) 및 라니 니켈 (1 g)의 현탁액을 10.5시간 동안 실온에서 수소 분위기 하에 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 농축하여 표제 화합물을 갈색 오일로서 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00079
단계 22.3: 1-에틸-4-(3-메톡시-4-니트로-페닐)-피페라진
단계 7.3에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
Figure 112008052214826-pct00080
실시예 23: 3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-{6-[4-(4-에틸-피페라진-1-카르보닐)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-1-메틸-우레아
실시예 2에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
Figure 112008052214826-pct00081
단계 23.1: (4-에틸-피페라진-1-일)-[4-(6-메틸아미노-피리미딘-4-일아미노)-페닐]-메탄온
실온에서 아르곤 분위기 하에 프로필포스폰산 수화물 (DMF 중 50％, 2.72 mL, 4.7 mmol, 2 equiv)을 DMF (25 mL) 중 4-(6-메틸아미노-피리미딘-4-일아미노)-벤조산 (0.570 g, 2.33 mmol), N-에틸-피페라진 (0.33 mL, 2.57 mmol, 1.1 equiv), DMAP (7 mg) 및 Et3N (3.3 mL, 23.3 mmol, 10 equiv)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 실온에서 교반하고, EtOAc로 희석시키고, H2O로 세척하였다. 수성층을 EtOAc로 추출하였다. 합한 유기상을 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고, 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (DCM → DCM/2 N NH3 (MeOH 중), 86:14)에 의해 정제하여 표제 화합물을 황색 포말로서 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00082
단계 23.2: 4-(6-메틸아미노-피리미딘-4-일아미노)-벤조산
단계 2.1에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
Figure 112008052214826-pct00083
실시예 24: 3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-{6-[4-(4-에틸-피페라진- 1-일)-3-플루오로-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-1-메틸-우레아
실시예 2에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
Figure 112008052214826-pct00084
단계 24.1: N-[4-(4-에틸-피페라진-1-일)-3-플루오로-페닐]-N'-메틸-피리미딘-4,6-디아민
단계 2.1에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하되, 반응 혼합물을 마이크로웨이브 장치에서 15분간 160 ℃에서 교반하였다. 조질의 생성물을 EtOAc 중에서 분쇄에 의해 정제하여 표제 화합물을 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00085
단계 24.2: 4-(4-에틸-피페라진-1-일)-3-플루오로-페닐아민
MeOH (6 mL) 중 1-에틸-4-(2-플루오로-4-니트로-페닐)-피페라진 (1.24 g, 15.1 mmol) 및 라니 니켈 (13 mg)의 현탁액을 17시간 동안 실온에서 수소 분위기 하에 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 농축하여 표제 화합물을 자주색 오일로서 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00086
단계 24.3: 1-에틸-4-(2-플루오로-4-니트로-페닐)-피페라진
N-에틸피페라진 (0.96 mL, 7.6 mmol, 1.2 equiv)을 DMF (10 mL) 중 3,4-디플루오로니트로벤젠 (0.7 mL, 6.32 mmol) 및 탄산칼륨 (1.74 g, 12.6 mmol, 2 equiv)의 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 17시간 동안 90 ℃에서 교반하고, 실온으 로 냉각시키고, H2O로 희석시키고, DCM으로 추출하였다. 유기상을 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고, 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (DCM/MeOH + 1％ NH3 aq, 97:3)에 의해 정제하여 표제 화합물을 황색 고체로서 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00087
실시예 25: 3-(2,4-디클로로-5-메톡시-3-트리플루오로메틸-페닐)-1-{6-[4-(4-에틸-피페라진-1-일)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-1-메틸-우레아
질소 분위기 하에 포스겐 (톨루엔 중 20％, 0.54 mL, 1.0 mmol, 2.0 equiv)을 디옥산 (2 mL) 중 2,4-디클로로-5-메톡시-3-트리플루오로메틸아닐린 (156 mg, 0.60 mmol, 1.2 equiv)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 가열 환류시키고, 75분간 교반하고, 실온으로 냉각시키고, 진공 하에 농축하였다. 생성된 고체 2,4-디클로로-5-메톡시-3-트리플루오로메틸-페닐이소시아네이트를 질소 분위기 하에 톨루엔 (6 mL) 중 N-[4-(4-에틸-피페라진-1-일)-페닐]-N'-메틸-피리미딘-4,6-디아민의 비등 용액 (156 mg, 0.50 mmol; 제법은 단계 25.5 참조)에 나누어 첨가하였다. 반응 혼합물을 3.3시간 동안 110 ℃에서 교반하고, 실온으로 냉각시키고, DCM 및 NaHCO3 포화 수용액으로 희석시켰다. 수성층을 분리하고, DCM으로 2회 추출하였다. 유기상을 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고, 농축하였다. 생성된 고체를 두 분량의 MeOH와 함께 분쇄하여 표제 화합물을 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00088
단계 25.1: 2,4-디클로로-5-메톡시-3-트리플루오로메틸아닐린
물 (1.87 mL) 중 KOH의 2 M 용액을 EtOH (3 mL) 중 N-(2,4-디클로로-5-메톡시-3-트리플루오로메틸-페닐)-아세트아미드 (104 mg, 0.344 mmol)의 용액에 첨가하였다. 이를 3.5시간 동안 80 ℃에서 교반하고 실온으로 냉각시킨 후, 용매를 증발시키고, 잔류물을 EtOAc 및 NaHCO3 포화 수용액에 용해시켰다. 분리된 수성 층을 EtOAc로 2회 추출하였다. 유기상을 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고, 농축하여 표제 화합물을 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00089
단계 25.2: N-(2,4-디클로로-5-메톡시-3-트리플루오로메틸-페닐)-아세트아미드
얼음 배스에서 질소 분위기 하에 N-(5-메톡시-3-트리플루오로메틸-페닐)-아세트아미드 (233 mg, 1.0 mmol)의 용액을 냉각시켰다 (침전). 이후, DCM 중 SO2Cl2의 1 M 용액 1.93 mL를 첨가하였다. 2시간 후, 추가량의 SO2Cl2 용액 (1.93 mL)을 첨가하고, 총 4시간 동안 0 ℃에서 교반을 계속하였다. 현탁액을 DCM 및 NaHCO3 포화 수용액으로 희석시켰다. 분리된 무기상을 DCM으로 2회 추출하였다. 유기상을 물 및 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고, 농축하였다. 컬럼 크로마토그래피 (헥산/EtOAc, 7:3)에 의해 표제 화합물을 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00090
단계 25.3: N-(5-메톡시-3-트리플루오로메틸-페닐)-아세트아미드
25 내지 33 ℃의 온도에서 아세트산 수화물 (1.22 mL, 12.8 mmol)을 톨루엔 (10 mL) 중 5-메톡시-3-트리플루오로메틸-아닐린 (2.29 g, 12.0 mmol)의 용액을 10분 동안 첨가하였다. 실온에서 90분 후, 헥산 (10 mL)을 첨가하고, 현탁액을 20분간 교반하였다. 이를 여과하고, 톨루엔/헥산 (2:1) 및 헥산으로 세척하여 표제 화합물을 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00091
단계 25.4: 5-메톡시-3-트리플루오로메틸-아닐린
MeOH (140 mL) 중 3-메톡시-5-니트로벤조트리플루오라이드 (6.19 g, 28 mmol)의 용액을 Pd-C (0.62 g, 10％)의 존재 하에 수소화시키고, 여과에 의해 촉매를 제거하고, 생성된 여액을 진공 하에 농축하여 표제 화합물을 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00092
단계 25.5: N-[4-(4-에틸-피페라진-1-일)-페닐]-N'-메틸-피리미딘-4,6-디아민
밀봉 튜브에서 디옥산 (15 mL) 중 4-(4-에틸피페라진-1-일)-아닐린 (1 g, 4.88 mmol) (실시예 7의 단계 7.2와 유사한 방식으로 제조됨), (6-클로로-피리미딘-4-일)-메틸-아민 (1.81 g, 12.68 mmol, 1.3 equiv) 및 4 N HCl의 혼합물을 5시간 동안 150 ℃로 가열하였다. 반응 혼합물을 농축하고, DCM 및 중탄산나트륨 포화 수용액으로 희석시켰다. 수성층을 분리하고, DCM으로 추출하였다. 유기상을 염수로 세척하고, 건조시키고 (황산나트륨), 여과하고, 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (DCM/MeOH, 93:7)에 의해 정제한 후에 디에틸 에테르 중에서 분쇄하여 표제 화합물을 백색 고체로서 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00093
실시예 26: 3-(5-메톡시-3-트리플루오로메틸-페닐)-1-{6-[4-(4-에틸-피페라진-1-일)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-1-메틸-우레아
질소 분위기 하에 포스겐 (톨루엔 중 20％, 1.62 mL, 3.0 mmol, 2.0 equiv)을 디옥산 (6 mL) 중 5-메톡시-3-트리플루오로메틸아닐린 (344 mg, 1.8 mmol, 1.2 equiv)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 가열 환류시키고, 80분간 교반하고, 실온으로 냉각시키고, 진공 하에 농축하였다. 45분간 질소 분위기 하에 톨루엔 중 생성된 오일성 5-메톡시-3-트리플루오로메틸-페닐이소시아네이트의 농축 용액을 톨루엔 (18 mL) 중 N-[4-(4-에틸-피페라진-1-일)-페닐]-N'-메틸-피리미딘-4,6-디아민 (468 mg, 1.50 mmol; 단계 242.1)의 비등 용액에 나누어 첨가하였다. 반응 혼합물을 4시간 동안 110 ℃에서 교반하고, 실온으로 냉각시키고, DCM 및 NaHCO3 포화 수용액으로 희석시켰다. 수성층을 분리하고, DCM으로 2회 추출하였다. 유기상을 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고, 농축하였다. 컬럼 크로마토그래피 (DCM/MeOH, 49:1 → 24:1)에 의해 표제 화합물을 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00094
실시예 27: 3-(5-메톡시-3-트리플루오로메틸-페닐)-1-{6-[3-클로로-4-(4-에틸-피페라진-1-일)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-1-메틸-우레아
DCM 중 SO2Cl2의 1 M 용액 (0.4 mL)의 일부를 27시간에 걸쳐 아세토니트릴 (6 mL) 중 3-(5-메톡시-3-트리플루오로메틸-페닐)-1-{6-[4-(4-에틸-피페라진-1-일)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-1-메틸-우레아 (105 mg, 0.20 mmol) (실시예 26)의 빙냉 현탁액에 반복적으로 첨가하였다. 반응 후에 HPLC 분석을 수행하였다. 반응 혼합물 (출발 물질을 여전히 함유함)을 DCM 및 NaHCO3 포화 수용액으로 희석시켰다. 수성층을 분리하고, DCM으로 2회 추출하였다. 유기상을 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고, 농축하였다. 생성물을 함유하는 분획을 NaHCO3에 의해 중화시키고, 부분적으로 농축하고, DCM으로 추출한 후에 역상 MPLC (H2O/CH3CN + 0.1％ TFA)로 처리하여 표제 화합물을 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00095
실시예 28: 1-{6-[2-클로로-4-(4-에틸-피페라진-1-일)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-메틸-우레아
실시예 2에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다 (1시간 20분간 환류 온도에서 교반하였음).
Figure 112008052214826-pct00096
단계 28.1: N-[2-클로로-4-(4-에틸-피페라진-1-일)-페닐]-N'-메틸-피리미딘-4,6-디아민
단계 1.1에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다
Figure 112008052214826-pct00097
단계 28.2: 2-클로로-4-(4-에틸-피페라진-1-일)-페닐아민
MeOH (20 mL) 중 1-(3-클로로-4-니트로-페닐)-4-에틸-피페라진 (1 g, 3.7 mmol) 및 라니 니켈 (0.1 g)의 현탁액을 8시간 동안 실온에서 수소 분위기 하에 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (DCM/MeOH + 1％ NH3 aq, 95:5)에 의해 정제하여 표제 화합물을 회백색 고체로서 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00098
단계 28.3: 1-(3-클로로-4-니트로-페닐)-4-에틸-피페라진
N-에틸피페라진 (4.3 mL, 34.3 mmol, 1.2 equiv)을 DMF (50 mL) 중 2-클로로-4-플루오로니트로벤젠 (5 g, 28.6 mmol) 및 탄산칼륨 (7.9 g, 57.1 mmol, 2 equiv)의 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 6시간 동안 100 ℃에서 교반하고, 실온으로 냉각시키고, H2O로 희석시키고, EtOAc로 추출하였다. 유기상을 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고, 농축하였다. 잔류물을 디에틸 에테르 중에서 분쇄에 의해 정제하여 5.6 g의 표제 화합물을 황색 고체로서 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00099
실시예 29: 3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-{6-[2-(4-에틸-피페라진-1-일)-4-플루오로-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-1-메틸-우레아
실시예 2에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다 (1시간 동안 환류 온도에서 교반하고, DCM 대신에 EtOAc를 사용하여 생성물을 추출하였음)
Figure 112008052214826-pct00100
단계 29.1: N-[2-(4-에틸-피페라진-1-일)-4-플루오로-페닐]-N'-메틸-피리미딘-4,6-디아민
단계 2.1에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하되, 반응 혼합물을 마이크로웨이브 장치에서 1시간 동안 160 ℃에서 교반하고, DCM 대신에 EtOAc를 사용하여 생성물을 추출하였다.
Figure 112008052214826-pct00101
단계 29.2: 2-(4-에틸-피페라진-1-일)-4-플루오로-페닐아민
MeOH (140 mL) 중 1-에틸-4-(3-플루오로-4-니트로-페닐)-피페라진 (7 g, 27.7 mmol) 및 탄소상 Pd (10％) (0.35 g)의 현탁액을 3시간 동안 실온에서 수소 분위기 하에 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (DCM/MeOH + 1％ NH3 aq, 95:5)에 의해 정제하여 표제 화합물을 백색 고체로서 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00102
단계 29.3: 1-에틸-4-(3-플루오로-6-니트로-페닐)-피페라진
N-에틸피페라진 (4.8 mL, 37.7 mmol, 1.2 equiv)을 DMF (50 mL) 중 2,4-디플루오로니트로벤젠 (5 g, 31.4 mmol) 및 탄산칼륨 (8.7 g, 62.9 mmol, 2 equiv)의 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 6시간 동안 100 ℃에서 교반하고, 실온으로 냉각시키고, H2O로 희석시키고, EtOAc로 추출하였다. 유기상을 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고, 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (DCM/MeOH + 1％ NH3 aq, 95:5)에 의해 정제하여 표제 화합물을 황색 오일로서 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00103
실시예 30: 3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-{6-[6-(4-이소프로필-피페라진-1-일)-피리딘-3-일아미노]-피리미딘-4-일}-1-메틸-우레아
실시예 1에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다 (이소시아네이트 형성을 위해 2 equiv의 포스겐을 사용하고, 후속 단계에서 16시간 동안 70 ℃에서 교반하고, DCM 대신에 EtOAc를 사용하여 생성물을 추출하였음).
Figure 112008052214826-pct00104
단계 30.1: N-[6-(4-이소프로필-피페라진-1-일)-피리딘-3-일]-N'-메틸-피리 미딘-4,6-디아민
단계 1.1에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
Figure 112008052214826-pct00105
단계 30.2: 6-(4-이소프로필-피페라진-1-일)-피리딘-3-일아민
철 분말 (1.4 g, 25.3 mmol, 4 equiv), 1-이소프로필-4-(5-니트로-피리딘-2-일)-피페라진 (1.58 g, 6.32 mmol), EtOH (20 mL), H2O (5 mL) 및 AcOH (2.5 mL)의 혼합물을 2시간 동안 90 ℃에서 교반하고, 실온으로 냉각시키고, 수성 암모니아를 첨가함으로써 염기성화시키고, 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 부분적으로 농축하여 EtOH를 제거하였다. 수성 잔류물을 염화나트륨으로 포화시키고, EtOAc 및 DCM으로 추출하였다. 합한 유기상을 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고, 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (DCM/MeOH/NH3 aq, 91:8:1)에 의해 정제하여 표제 화합물을 자주색 고체로서 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00106
단계 30.3: 1-이소프로필-4-(5-니트로-피리딘-2-일)-피페라진 (NVP-BKT293)
N-이소프로필피페라진 (1.8 mL, 12.7 mmol, 2 equiv)을 DCM (5 mL) 중 2-클로로-5-니트로피리딘 (1 g, 6.3 mmol)의 차가운 (5 ℃) 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 16시간 동안 교반하고, DCM/H2O으로 희석시키고, DCM으로 추출하였다. 유기상을 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고, 농축하여 표제 화합물을 황색 고체로서 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00107
실시예 31: 3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-{6-[6-(4-에틸-피페라진-1-일)-피리딘-3-일아미노]-피리미딘-4-일}-1-메틸-우레아
실시예 1에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다. (이소시아네이트 형성을 위해 2 equiv의 포스겐을 사용하고, 후속 단계에서 4시간 동안 환류 온도에서 교반하고, DCM 대신에 EtOAc를 사용하여 생성물을 추출하였음).
Figure 112008052214826-pct00108
단계 31.1: N-[6-(4-에틸-피페라진-1-일)-피리딘-3-일]-N'-메틸-피리미딘-4,6-디아민
단계 1.1에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
Figure 112008052214826-pct00109
단계 31.2: 6-(4-에틸-피페라진-1-일)-피리딘-3-일아민
MeOH (30 mL) 중 1-에틸-4-(5-니트로-피리딘-2-일)-피페라진 (1.4 g) 및 라니-니켈 (140 mg)의 현탁액을 10시간 동안 실온에서 수소 분위기 하에 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (DCM/MeOH/NH3 aq, 94:5:1)에 의해 정제하여 표제 화합물을 자주색 오일로서 얻었다.
Figure 112008052214826-pct00110
단계 31.3: 1-에틸-4-(5-니트로-피리딘-2-일)-피페라진
단계 30.3에 기재된 절차와 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하되, N-에틸피페라진을 사용하였다.
Figure 112008052214826-pct00111
실시예 32: 연질 캡슐
선행 실시예 1 내지 29 중 어느 하나에서 언급된 화학식 IA의 화합물 중 어느 하나 (0.05 g)를 활성 성분으로서 각각 포함하는 5000개의 연질 젤라틴 캡슐을 다음과 같이 제조하였다.
조성
활성 성분 250 g
라우로글리콜 2 L
제조 방법: 분쇄된 활성 성분을 라우로글리콜* (프로필렌 글리콜 라우레이트, 프랑스 생 프리스트에 소재한 가테포세 소시에테 아노님 (Gattefosse S.A.))에 현탁시키고, 습식 분쇄기 (pulverizer)에서 분쇄하여 약 1 내지 3 μM의 입자 크기를 제조하였다. 이후, 캡슐 충전기를 이용하여 혼합물의 일부 (0.419 g)를 연질 젤라틴 캡슐에 담았다.
실시예 33: 화학식 IA의 화합물을 포함하는 정제
선행 실시예 1 내지 29 중 어느 하나의 화학식 IA의 화합물 중 어느 하나 (100 mg)를 활성 성분으로서 포함하며 다음과 같은 조성을 갖는 정제를 하기 표준 절차에 따라 제조하였다.
조성
활성 성분 100 mg
결정질 락토스 240 mg
아비셀 80 mg
PVPPXL 20 mg
에어로실 2 mg
마그네슘 스테아레이트 5 mg
--------------
447 mg
제법: 활성 성분을 담체 물질과 혼합하고, 정제화기 (코르쉬 (Korsch) EKO, 스탬프 직경 10 mm)에 의해 압축하였다.
아비셀 (Avicel, 등록상표)은 미정질 셀룰로스 (미국 필라델피아에 소재한 FMC)이다. PVPPXL은 가교 폴리비닐폴리피롤리돈 (독일의 바스프 (BASF))이다. 에어로실 (Aerosil, 등록상표)은 이산화규소 (독일의 데구싸 (Degussa))이다.

Claims (11)

1-[6-(4-벤질옥시-페닐아미노)-피리미딘-4-일]-3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-메틸-우레아,
3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-[6-(4-히드록시-페닐아미노)-피리미딘-4-일]-1-메틸-우레아,
1-{6-[4-(4-벤질-피페라진-1-일)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-메틸-우레아,
3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-메틸-1-[6-(4-피페라진-1-일-페닐아미노)-피리미딘-4-일]-우레아,
3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-{6-[2-플루오로-4-(2-피롤리딘-1-일-에톡시)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-1-메틸-우레아,
3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-{6-[4-(4-에틸-피페라진-1-일)-2-메톡시-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-1-메틸-우레아,
3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-{6-[4-(4-에틸-피페라진-1-일)-3-플루오로-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-1-메틸-우레아,
3-(5-메톡시-3-트리플루오로메틸-페닐)-1-{6-[3-클로로-4-(4-에틸-피페라진-1-일)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-1-메틸-우레아,
1-{6-[2-클로로-4-(4-에틸-피페라진-1-일)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-메틸-우레아 및
3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-{6-[2-(4-에틸-피페라진-1-일)-4-플루오로-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-1-메틸-우레아
로 구성된 화합물 군으로부터 선택된 화합물 또는 그의 염 또는 N-옥시드.
1-(2-클로로-3,5-디메톡시-6-메틸-페닐)-3-{6-[4-(4-에틸-피페라진-1-일)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-우레아,
3-(2-클로로-3,5-디메톡시-6-메틸-페닐)-1-{6-[4-(4-에틸-피페라진-1-일)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-1-메틸-우레아,
3-(2-클로로-3,5-디메톡시-6-메틸-페닐)-1-{6-[4-(2-디메틸아미노-에톡시)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-1-메틸-우레아,
3-(2-클로로-3,5-디메톡시-6-메틸-페닐)-1-메틸-(6-{4-[2-(4-메틸-피페라진-1-일)-에톡시]-페닐아미노}-피리미딘-4-일)-우레아,
3-(2-클로로-6-요오도-3,5-디메톡시-페닐)-1-{6-[4-(4-에틸-피페라진-1-일)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-1-메틸-우레아,
3-(2-클로로-3,5-디메톡시-6-메틸-페닐)-1-{6-[4-(4-이소프로필-피페라진-1-일)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-1-메틸-우레아,
3-(2-클로로-3,5-디메톡시-6-메틸-페닐)-1-[6-(3-디메틸아미노메틸-페닐아미노)-피리미딘-4-일]-1-메틸-우레아,
3-(2-클로로-3,5-디메톡시-6-메틸-페닐)-1-{6-[3-(4-에틸-피페라진-1-일)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-1-메틸-우레아,
3-(2-클로로-3,5-디메톡시-6-메틸-페닐)-1-{6-[4-(2-피롤리딘-1-일-에톡시)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-1-메틸-우레아,
3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-{6-[3-플루오로-4-(2-피롤리딘-1-일-에톡시)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-1-메틸-우레아,
3-(2,4-디클로로-5-메톡시-3-트리플루오로메틸-페닐)-1-{6-[4-(4-에틸-피페라진-1-일)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-1-메틸-우레아 및
3-(5-메톡시-3-트리플루오로메틸-페닐)-1-{6-[4-(4-에틸-피페라진-1-일)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-1-메틸-우레아
로 구성된 화합물 군으로부터 선택된 화합물 또는 그의 염 또는 N-옥시드.
1-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-3-{6-[4-(2-모르폴린-4-일-에톡시)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-우레아,
3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-메틸-1-{6-[3-(4-메틸-피페라진-1-일메틸)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-우레아,
3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-{6-[3-(4-에틸-피페라진-1-일)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-1-메틸-우레아,
3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-메틸-1-{6-[4-(2-모르폴린-4-일-에톡시)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-우레아,
3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-{6-[4-(1-에틸-피페리딘-4-일)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-1-메틸-우레아,
3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-에틸-1-{6-[4-(4-에틸-피페라진-1-일)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-우레아 및
3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-{6-[4-(4-에틸-피페라진-1-카르보닐)-페닐아미노]-피리미딘-4-일}-1-메틸-우레아
로 구성된 화합물 군으로부터 선택된 화합물 또는 그의 염 또는 N-옥시드.
3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-{6-[6-(4-에틸-피페라진-1-일)-피리딘-3-일아미노]-피리미딘-4-일}-1-메틸-우레아 및
3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-{6-[6-(4-이소프로필-피페라진-1-일)-피리딘-3-일아미노]-피리미딘-4-일}-1-메틸-우레아
로 구성된 화합물 군으로부터 선택된 화합물 또는 그의 염 또는 N-옥시드.
3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-메틸-1-[6-(4-피페라진-1-일-페닐아미노)-피리미딘-4-일]-우레아 또는 그의 염 또는 N-옥시드.
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