MX2014014505A - Agente para prevenir y/o tratar dolor neuropatico periferico causado por farmaco contra el cancer. - Google Patents

Abstract

Un medicamento eficaz en la prevención y/o tratamiento de dolor neuropático periférico, tal como la alodinia, causado por un tratamiento de fármaco contra el cáncer; en donde el medicamento contiene trombomodulina como un ingrediente activo.

Description

AGENTE PARA PREVENIR Y/O TRATAR DOLOR NEUROPÁTICO PERIFÉRICO CAUSADO POR FÁRMACO CONTRA EL CÁNCER CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un medicamento que tiene un efecto profiláctico y/o terapéutico en un dolor neuropático periférico causado por un agente contra el cáncer.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN En el tratamiento terapéutico de cánceres (tumores malignos), la cirugía, la radioterapia y la quimioterapia se utilizan de forma apropiada e independiente o en combinación. Los agentes contra el cáncer (agentes contra tumores malignos) utilizados para la quimioterapia contra el cáncer entre las terapias mencionadas anteriormente, originalmente tienen citotoxicidad y causan reacciones secundarias al dañar no sólo a las células cancerosas (tumor maligno), sino también a las células normales.

Ejemplos de las reacciones secundarias causadas por agentes contra el cáncer incluyen los trastornos de la sangre, obstrucciones de los órganos digestivos y neuropatía, pero el problema de la neuropatía aguda o crónica es especialmente cada vez más serio en los últimos años. Se considera que esto es porque las principales reacciones secundarias causadas por agentes contra el cáncer emergentes que tienen un efecto importante contra el cáncer son las neuropatías, en muchos casos, el desarrollo de la neuropatía se ve aumentado por la influencia de las terapias con múltiples fármacos tales como la terapia de FOLFOX, y reacciones secundarias tales como los trastornos de la sangre y obstrucciones de los órganos digestivos tienden a mejorarse. En las circunstancias actuales, con el fin de controlar tal neuropatía causada por agentes contra el cáncer, se está obligado a reducir las dosis de agentes contra el cáncer o interrumpir las quimioterapias para el cáncer.

Las neuropatías causadas por agentes contra el cáncer se observan también en los órganos sensibles tales como los órganos gustativos, así como en el sistema nervioso central, el sistema nervioso vegetativo y el sistema nervioso periférico. Entre ellas, las neuropatías periféricas, por ejemplo, dolores tales como dolor intenso y dolor por quemadura, entumecimiento de los extremos de las extremidades, sensaciones anormales tales como hipersensibilidad al frío, disestesias tales como la anestesia y parálisis sensorial, ataxia sensorial, reducción de la fuerza muscular y similares, se desarrollan muy frecuentemente, la alodinia por frío y la alodinia mecánica especialmente causan problemas como síntomas típicos. Los ejemplos de agentes contra el cáncer que con frecuencia causan tales neuropatías periféricas incluyen fármacos de taxano (paclitaxel, docetaxel), fármacos alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, vindesina, vinorelbina) y preparaciones de platino (oxaliplatino, cisplatino).

En la actualidad, en contra de las neuropatías periféricas causadas por agentes contra el cáncer, especialmente la alodinia, no se han establecido los métodos eficaces para tratamientos profilácticos y terapéuticos. Aunque se ha reportado la utilidad de la administración intravenosa de calcio y de magnesio o de glutatión para las neuropatías periféricas causadas por oxaliplatino, prácticamente no se utiliza porque, por ejemplo, tal terapia complica aún más la quimioterapia del cáncer y tales sustancias requieren la administración masiva. En los campos de la clínica práctica, se requiere controlar las neuropatías periféricas no deseables causadas por agentes contra el cáncer con fisioterapia, terapias complementarias tales como el masaje y la acupuntura, o combinación de terapias con fármacos, tales como las que utilizan esteroides, antidepresivos, antiepilépticos y opioides, sin embargo, la eficacia de estas terapias no ha sido verificada y tales terapias con frecuencia causan reacciones secundarias (documentos no de patente 1 y 2).

La trombomodulina se ha conocido como una sustancia que actúa para unirse específicamente a la trombina, para inhibir la actividad de coagulación de la sangre de la trombina y al mismo tiempo, ejerce la actividad anticoagulante a fin de promover significativamente la capacidad de la trombina para activar la proteína C. La trombomodulina se descubrió primero y se obtuvo como una glicoproteína expresada en las células endoteliales vasculares de varias especies animales, incluyendo los seres humanos y en cuanto a la estructura de la misma, se compone de 5 regiones, a saber una región N-terminal (residuos de aminoácidos 1 a 226), una región que tiene seis estructuras similares a EGF (residuos de aminoácidos 227 a 462), una región de glicosilación 0-enlazada (residuos de aminoácidos 463 a 497), una región transmembranal (residuos de aminoácidos 498 a 521) y una región citoplásmica (residuos de aminoácidos 522 a 557), a partir del lado N-terminal de la proteína (documento no de patente 3).

La trombomodulina de longitud completa apenas se disuelve en ausencia de un surfactante y la adición de un surfactante es esencial para la fabricación de una preparación de trombomodulina completa. También está disponible una trombomodulina soluble que se puede disolver totalmente, incluso en ausencia de un surfactante. La trombomodulina soluble se puede preparar mediante la eliminación de al menos una parte de la región transmembranal o la totalidad de la región transmembranal. Por ejemplo, se ha confirmado que una trombomodulina soluble que consiste de sólo 3 regiones, a saber, la región N-termínal, la región que tiene seis estructuras similares a EGF y la región de glicosilación O-enlazada (es decir, una trombomodulina soluble que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste de los residuos de aminoácidos 19 a 516 de la SEQ ID NO: 9) se puede obtener mediante la aplicación de téenicas de recombinación y que la trombomodulina soluble recombinante resultante tiene la misma actividad que la de la trombomodulina natural (documento de patente 1). Las trombomodulinas derivadas de la orina humana y similares también se ejemplifican (documento de patente 2).

Como se reconoce en muchos casos, como resultado de mutaciones espontáneas o las mutaciones que ocurren en el momento de la obtención, se han encontrado mutaciones polimórficas en los genes humanos. En la actualidad, se han identificado proteínas de trombomodulina en las que el aminoácido en la posición 473 del precursor de la trombomodulina humana que tiene la secuencia de aminoácidos que consiste de 575 residuos de aminoácidos, se convierte en Val o Ala. En la secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos, esta variación del residuo de aminoácido corresponde a la mutación de T o C en la posición 1418 (documento no de patente 3). Sin embargo, los dos tipos de trombomodulinas son completamente idénticos en términos de su actividad y propiedades fisicoquímicas y pueden considerarse que son sustancialmente idénticos.

En cuanto a los usos previstos de la tromboodulina, hasta el momento la sustancia se ha previsto para usos en tratamientos terapéuticos y profilácticos de enfermedades, por ejemplo, infarto del miocardio, trombosis (por ejemplo, trombosis cerebral de una etapa aguda o etapa crónica, trombosis periférica aguda o crónica de la arteria o vena y similares), embolismo (por ejemplo, embolismo cerebral de una etapa aguda o etapa crónica, embolismo periférico agudo o crónico de arteria o vena y similares), obstrucciones de los vasos periféricos (por ejemplo, enfermedad de Buerger, enfermedad de Raynaud y similares), arteriosclerosis obstructiva, obstrucciones funcionales desarrolladas después de una operación cardíaca, complicaciones de trasplante de órganos, coagulación intravascular diseminada (DIC), angina de pecho, ataque isquémico transitorio, toxemia del embarazo, trombosis venosa profunda (DVT) y similares. Además, los ejemplos de enfermedades aplicables, distintas de las acompañadas de hipercoagulación tales como trombosis y DIC, incluyen afecciones hepáticas (documento de patente 4), enfermedades de los huesos de absorción (documento de patente 5), cicatrización de heridas (documento de patente 6) y similares. Además, en cuanto a los usos de la trombomodulina junto con otros ingredientes activos, se ha descrito la cicatrización de heridas (documento de patente 7), la protección de los tejidos del cerebro (documento de patente 8) y similares. Además, se ha descrito el uso de la trombomodulina para tratamientos terapéuticos y profilácticos de dolor con trasplante de células hematopoyéticas (documento de patente 9).

REFERENCIAS DE LA TÉCNICA ANTERIOR Documentos de patente Documento de Patente 1: Publicación de patente japonesa no examinada (KOKAI) No.64-6219 Documento de patente 2: Publicación de patente japonesa no examinada No.3-86900 Documento de patente 3: W092/00325 Documento de patente 4: Publicación de patente aponesa no examinada No.8-3065 Documento de patente 5: Publicación de patente japonesa no examinada No.8-301783 Documento de patente 6: Publicación de patente japonesa no examinada No.9-20677 Documento de patente 7: Patente U.S. No. 5,976,523 Documento de patente 8: Patente U.S. No. 5,827,832 Documento de patente 9: Publicación de patente japonesa no examinada No.2012-001543 Documentos no de patente Documento no de patente 1: NCI Cáncer Bulletin, 2010, 23 de febrero, 7 (4) Documento no de patente 2: Folia Pharmacologica Japónica (Nippon Yakurigaku Zasshi), 2010, 136: 275-279 Documento no de patente 3: EMBO Journal, 1987, 6: 1891-1897 BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Objeto a ser logrado por la invención Un objeto de la presente invención es proporcionar un medicamento que permite el tratamiento profiláctico y/o terapéutico eficaz de un dolor neuropático periférico causado por el o los agentes contra el cáncer.

Medios para lograr el objeto Los inventores de la presente invención reconocieron fuertemente las situaciones actuales como problemas que, para hacer frente a la neuropatía causada por un agente contra el cáncer, se vieron obligados a reducir la dosis del agente contra el cáncer o interrumpir la administración del agente contra el cáncer y que todavía no se había establecido algún tratamiento profiláctico y terapéutico de la neuropatía causada por un agente contra el cáncer y consideraron que se trataba de un objeto importante el proporcionar un medicamento para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico eficaz de la neuropatía causada por un agente contra el cáncer, especialmente el dolor neuropático periférico causado por un agente contra el cáncer. Este es el por qué los inventores de la presente invención consideraron que los dolores neuropáticos periféricos causados por un agente contra el cáncer hicieron difícil la vida diaria de los pacientes y constituían la razón más importante para la interrupción del tratamiento terapéutico del cáncer y por lo tanto resolver el problema de la alodinia causada por un agente contra el cáncer era importante para el tratamiento terapéutico del cáncer, no sólo para mejorar la calidad de vida de los pacientes, sino también desde un punto de vista de la continuación del tratamiento terapéutico del cáncer.

Los inventores de la presente invención realizaron diversas investigaciones para lograr el objeto antes mencionado. Como resultado, se encontró sorprendentemente que la trombomodulina presentó un efecto profiláctico y/o terapéutico superior contra un dolor neuropático periférico, específicamente la alodinia, causada por un agente contra el cáncer y lograron la presente invención. Cualquier tratamiento profiláctico y/o terapéutico de la neuropatía causada por un agente contra el cáncer, especialmente el dolor neuropático periférico causado por un agente contra el cáncer, con la trombomodulina hasta ahora no se ha reportado ni sugerido. Aunque el documento de patente 9 describe que la trombomodulina tiene un efecto sobre el dolor acompañado de aumento de peso debido a edema, depósito de ascitis, o similares causados por tratamientos previos de trasplante de células hematopoyéticas, el documento no menciona ni sugiere en absoluto el dolor neuropático periférico causado por un agente contra el cáncer.

Así, la presente invención proporciona lo siguiente. [1] Un medicamento para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de un dolor neuropático periférico causado por un agente contra el cáncer, que comprende la trombomodulina como un ingrediente activo. [2] El medicamento de acuerdo con el inciso [1] mencionado anteriormente, en donde la trombomodulina es una trombomodulina soluble. [3] El medicamento de acuerdo con el inciso [1] mencionado anteriormente, en donde la trombomodulina es una trombomodulina humana. [4] El medicamento de acuerdo con cualquiera de los incisos [1] a [3] mencionados anteriormente, en donde el dolor neuropático periférico es uno o más tipos de síntomas seleccionados entre entumecimiento de las extremidades, dolor de las extremidades, reducción de la reflexión profunda de tendones, reducción de la fuerza muscular, alodinia, hiperalgesia y disfunción motora. [5] El medicamento de acuerdo con cualquiera de los incisos [1] a [4] mencionados anteriormente, en donde el dolor neuropático periférico es la alodinia. [6] El medicamento de acuerdo con el inciso [5] mencionado anteriormente, en donde la alodinia es la alodinia mecánica. [6-2] El medicamento de acuerdo con el inciso [5] mencionado anteriormente, en donde la alodinia es la alodinia por frío. [7] El medicamento de acuerdo con cualquiera de los incisos [1] a [6-2] mencionados anteriormente, en donde el agente contra el cáncer consiste de uno o más tipos de agentes seleccionados entre el grupo que consiste de un fármaco de taxano y una preparación de platino. [7-2] El medicamento de acuerdo con el inciso [7] mencionado anteriormente, en donde el fármaco de taxano consiste de uno o más tipos de fármacos seleccionados entre el grupo que consiste de paclitaxel y docetaxel. [7-3] El medicamento de acuerdo con el inciso [7] mencionado anteriormente, en donde la preparación de platino consiste de uno o más tipos de preparaciones seleccionadas entre el grupo que consiste de oxaliplatino, cisplatino, carboplatino y nedaplatino. [8] El medicamento de acuerdo con cualquiera de los incisos [1] a [6-2] mencionados anteriormente, en donde el agente contra el cáncer es p clitaxel. [8-2] El medicamento de acuerdo con cualquiera de los incisos [1] a [6-2] mencionados anteriormente, en donde el agente contra el cáncer es oxaliplatino. [9] El medicamento de acuerdo con cualquiera de los incisos [1] a [6-2] mencionados anteriormente, en donde el agente contra el cáncer se administra de acuerdo a la terapia FOLFOX o la terapia FOLFIRI. [10] El medicamento de acuerdo con cualquiera de los incisos [1] a [9] mencionados anteriormente, en donde la trombomodulina se administra intermitentemente.

Cuando los números de los incisos citados se indican como un intervalo como [1] a [9] como se mencionó anteriormente y un inciso indicado con un número de inciso tiene un subnúmero tal como [7-2] está incluido en el intervalo, significa que el inciso indicado con el número de inciso que tiene un subnúmero tal como [7-2], también se cita. Esta regla también se aplica a las siguientes descripciones. [10-2] El medicamento de acuerdo con el inciso [10] mencionado anteriormente, en donde la administración intermitente es la administración de una vez a la semana. [10-3] El medicamento de acuerdo con el inciso [10] mencionado anteriormente, en donde la administración intermitente es la administración diaria. [10-4] El medicamento de acuerdo con cualquiera de los incisos [1] a [9] mencionados anteriormente, en donde la trobomodulina se administra una vez a la semana. [10-5] El medicamento de acuerdo con cualquiera de los incisos [1] a [9] mencionados anteriormente, en donde la trombomodulina se administra diariamente. [11] El medicamento de acuerdo con cualquiera de los incisos [1] a [10-5] mencionados anteriormente, que se administra a un paciente que sufre de cáncer, de uno o más tipos de cánceres seleccionados entre el grupo que consiste de cáncer de ovario, cáncer de células no pequeñas, cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer de endometrio, cáncer de cabeza y cuello, carcinoma de esófago, leucemia, linfoma maligno, tumor pediátrico, mieloma múltiple, astrocitoma maligno, neuroglio a, enfermedad trofoblástica, tumor de células germinales, cáncer de pulmón, orquionco, cáncer vesical, tumor pélvico renal, uretrofima, cáncer de próstata, carcinoma de cuello uterino, neuroblastoma, cáncer de pulmón de células pequeñas, osteosarcoma, mesotelioma pleural maligno, osteonco maligno y cáncer de colon. [12] Un medicamento para la administración junto con un agente contra el cáncer para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de un dolor neuropático periférico causado por el agente contra el cáncer, que comprende la trombomodulina como un ingrediente activo. [12-2] El medicamento de acuerdo con el inciso [12] mencionado anteriormente, en donde el agente contra el cáncer es un fármaco de taxano o una preparación de platino. [12-3] El medicamento de acuerdo con el inciso [12] mencionado anteriormente, en donde el agente contra el cáncer es paclitaxel. [12-4] El medicamento de acuerdo con el inciso [12] mencionado anteriormente, en donde el agente contra el cáncer es oxaliplatino. [13] El medicamento de acuerdo con cualquiera de los incisos [1] a [12-4] mencionados anteriormente, en donde la trombomodulina es un péptido que se puede obtener a partir de una célula transformada, preparada por transfección de una célula hospedera con un ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos de los incisos (i—1) o (i—2) que se mencionan a continuación y el péptido es un péptido que tiene las actividades de trombomodulina; (i—1) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 u 11, o (i—2) la secuencia de aminoácidos del inciso (i-1) mencionado anteriormente, que incluye además la sustitución, supresión o adición de uno o más residuos de aminoácidos. [13-2] El medicamento de acuerdo con cualquiera de los incisos [1] a [12-4] mencionados anteriormente, en donde la trombomodulina es un péptido que se puede obtener a partir de una célula transformada, preparada por transfección de una célula hospedera con un ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos del inciso (i-1) que se menciona a continuación y el péptido es un péptido que tiene las actividades de trombomodulina; (i-1) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 u 11. [14] El medicamento de acuerdo con cualquiera de los incisos [1] a [12-4] mencionados anteriormente, en donde la trombomodulina es un péptido que contiene la secuencia de aminoácidos del inciso (i-1) o (i—2) que se mencionan a continuación y el péptido es un péptido que tiene las actividades de trombomodulina; (i-1) la secuencia de aminoácidos de las posiciones 19 a 516 en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 u 11, o (i—2) la secuencia de aminoácidos del inciso (i- 1) mencionado anteriormente, que incluye además la sustitución, supresión o adición de uno o más residuos de aminoácidos. [14-2] El medicamento de acuerdo con cualquiera de los incisos [1] a [12-4] mencionados anteriormente, en donde la trombomodulina es un péptido que contiene la secuencia de aminoácidos del inciso (i—1) que se menciona a continuación y el péptido es un péptido que tiene las actividades de trombomodulina; (i—1) la secuencia de aminoácidos de las posiciones 19 a 516 en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 u 11. [14-3] El medicamento de acuerdo con cualquiera de los incisos [1] a [12-4] mencionados anteriormente, en donde la trombomodulina es un péptido que contiene: (i) la secuencia de aminoácidos de las posiciones 367 a 480 en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 u 11 y la secuencia de aminoácidos del inciso (ii—1) o (ii- 2) que se menciona a continuación y el péptido es un péptido que tiene las actividades de trombomodulina: (ii-1) la secuencia de aminoácidos de las posiciones 19 a 244 en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 u 11, o (ii-2) la secuencia de aminoácidos del inciso (ii-1) mencionado anteriormente, que incluye además la sustitución, supresión o adición de uno o más residuos de aminoácidos. [14-4] El medicamento de acuerdo con cualquiera de los incisos [1] a [12-4] mencionados anteriormente, en donde la trombomodulina es un péptido que contiene: (i) la secuencia de aminoácidos de las posiciones 367 a 480 en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 u 11 y la secuencia de aminoácidos del inciso (ii-1) que se menciona a continuación y el péptido es un péptido que tiene las actividades de trombomodulina: (ii-1) la secuencia de aminoácidos de las posiciones 19 a 244 en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 u 11. [15] Un método para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de un dolor neuropático periférico causado por un agente contra el cáncer, que comprende el paso de administrar trombomodulina a un mamífero. [15-2] El método de acuerdo con el inciso [15] mencionado anteriormente, que tiene una o más de las características definidas en los incisos [1] a [14-4] mencionados anteriormente. [16] El uso de trombomodulina para la fabricación de un medicamento para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de un dolor neuropático periférico causado por un agente contra el cáncer. [16-2] El uso de acuerdo con el inciso [16] mencionado anteriormente, que tiene una o más de las características definidas en los incisos [1] a [14-4] mencionados anteriormente. [17] Un método para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de un dolor neuropático periférico causado por un agente contra el cáncer de un mamífero al que se le administra el agente contra el cáncer, que comprende el paso de administrar trombomodulina al mamífero. [17-2] El método de acuerdo con el inciso [17] mencionado anteriormente, que tiene una o más de las características definidas en los incisos [1] a [14-4] mencionados anteriormente. [17-3] El método de acuerdo con el inciso [17] mencionado anteriormente, que comprende el paso de administrar trombomodulina al mamífero, simultáneamente con el agente contra el cáncer, o en un momento diferente.

EFECTO DE LA INVENCIÓN La presente invención permite el tratamiento profiláctico y/o terapéutico eficaz de un dolor neuropático periférico causado por un agente contra el cáncer. Con el fin de controlar el dolor neuropático periférico causado por un agente contra el cáncer, ha sido hasta ahora indeseablemente necesario reducir la dosis del agente contra el cáncer, o interrumpir la quimioterapia del cáncer. La presente invención permite la continuación de la quimioterapia del cáncer, adecuada y la contribución al mejoramiento de la calidad de vida de los pacientes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra los resultados de la investigación del efecto profiláctico de la tromboodulina sobre la alodinia mecánica, causada por la administración de paclitaxel, la investigación se realizó de acuerdo a la prueba de von Frcy.

Flecha blanca hacia abajo: Administración de 4 mg/kg de paclitaxel Flecha negra hacia abajo: Administración de TMD123 o: Grupo de administración de solvente ·: Grupo de administración de PTX D: Grupo de administración de PTX + 0.1 mg/kg de TMD123 D gris: Grupo de administración de PTX + 1 mg/kg de TMD123 D negro: Grupo de administración de PTX + 10 mg/kg de TMD123 * : p < 0.05 **: p < 0.01 (comparación con el grupo de administración de solvente) †: p < 0.05 †††: p < 0.001 (comparación con el grupo de administración de PTX) La figura 2 muestra los resultados de la investigación del efecto terapéutico de la trombomodulina sobre la alodinia mecánica causada por la administración de paclitaxel, la investigación se realizó de acuerdo a la prueba de von Frcy, como la investigación cuyos resultados se muestran en la figura 1.

·: Grupo de administración de PTX D: Grupo de administración de PTX + 10 mg/kg de TMD123 †: p < 0.05 (comparación con el grupo de administración de PTX) rhTMa: TMD123 La figura 3 muestra los resultados de la investigación del efecto terapéutico de la trombomodulina sobre la alodinia mecánica causada por la administración de paclitaxel, la investigación se realizó de acuerdo a la prueba de Randall-Selitto mediante el uso de ratas, como la investigación cuyos resultados se muestran en la figura 1.

Flecha blanca hacia abajo: Administración de 2 mg/kg de paclitaxel Flecha negra hacia abajo: Administración de TMD123 o: Grupo de administración de solvente ¦: Grupo de administración de PTX D: Grupo de administración de PTX + 10 mg/kg de TMD123 * : p < 0.05 **: p < 0.01 (comparación con el grupo de administración de solvente) †: p < 0.05 ††: p < 0.01 (comparación con el grupo de administración de PTX) MODOS PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN De aquí en adelante, se explicarán específicamente varias modalidades preferidas de la presente invención (modos preferidos para llevar a cabo la invención, en lo sucesivo también denominadas como "modalidades" en la especificación). Sin embargo, el alcance de la presente invención no está limitado a las modalidades específicas explicadas a continuación.

Ejemplos de la trombomodulina útil como un ingrediente activo del medicamento para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de un dolor neuropático periférico causado por un agente contra el cáncer de esta modalidad incluyen la trombomodulina soluble.

La trombomodulina de esta modalidad se conoce preferentemente por tener una acción de (1) enlazarse selectivamente a la trombina (2) para promover la activación de la proteína C por la trombina. Además, se prefiere que se confirme que la trombomodulina generalmente tiene (3) una acción de prolongar el tiempo de coagulación de trombina, (4) una acción de supresión de la agregación plaquetaria causada por la trombina y/o (5) acción antiinflamatoria. Tales acciones poseídas por la trombomodulina pueden ser denominadas como las actividades de trombomodulina.

Como las actividades de trombomodulina, la trombomodulina tiene preferentemente las acciones de los incisos (1) y (2) mencionados anteriormente y más preferentemente tiene las acciones de los incisos (1) a (4) mencionados anteriormente. Como las actividades de trombomodulina, la trombomodulina más preferentemente tiene todas las acciones de los incisos (1) a (5) mencionados anteriormente.

La acción de la trombomodulina para enlazarse con la trombina, puede ser confirmada por los métodos de estudio que se describen en varias publicaciones conocidas tales como Thrombosis and Haemostasis, 1993, 70(3): 418-422 y The Journal of Biological Chemistry, 1989, 264, 9, pp. 4872-4876. En cuanto a la acción de promoción de la activación de la proteína C por la trombina, el grado de la actividad de promoción de la activación de la proteína C por la trombina, o la presencia o ausencia de la acción, se pueden confirmar fácilmente por los métodos de estudio claramente descritos en diversas publicaciones conocidas, que incluyen, por ejemplo, la publicación de patente japonesa no examinada No. 64-6219. Además, la acción de prolongar el tiempo de coagulación de trombina y/o la acción de supresión de la agregación plaquetaria causada por la trombina, se pueden confirmar de manera similar y fácilmente. Por otra parte, la acción antiinflamatoria también puede ser confirmada por los métodos de estudio que se describen en varias publicaciones conocidas que incluyen, por ejemplo, Blood, 2008, 112:3361-3670 y The Journal of Clinical Investigation, 2005, 115, 5:1267-1274.

La trombomodulina utilizada para esta modalidad no está particularmente limitada, siempre y cuando tenga las actividades de trombomodulina, pero la trombomodulina es preferentemente una trombomodulina soluble en agua, con la condición de que sea sin surfactantes. La solubilidad de la trombomodulina soluble en agua, tal como agua destilada usada para inyección (en ausencia de un surfactante tal como Tritón X-100 o polidocanol y en general de todo el intervalo del pH neutro) es preferentemente, por ejemplo, 1 mg/l o más o 10 mg/ml o más; preferentemente de 15 mg/ml o más, o 17 mg/ml o más; más preferentemente 20 mg/ml o más, 25 mg/ml o más, o 30 mg/ml o más; en particular preferentemente de 60 mg/ml o más. En algunos casos, la solubilidad es, por ejemplo, 80 mg/ml o más, o 100 mg/ml o más. Para determinar si una trombomodulina soluble se disuelve con éxito en agua o no, se entiende que la apariencia clara de una solución y la ausencia de sustancias insolubles aparentemente observables sirven como criterios simples, después de que la trombomodulina soluble se disuelve en agua y se observa la solución por inspección visual, por ejemplo, justo debajo de una luz blanca en una posición correspondiente a una iluminación de aproximadamente 1000 luxes. También es posible observar la presencia o ausencia de cualquier residuo después de la filtración.

El peso molecular de la trombomodulina no se limita, siempre y cuando tenga las actividades de trombomodulina como se describió anteriormente. El peso molecular es preferentemente 100,000 o menor, más preferentemente 90,000 o menor, aún más preferentemente 80,000 o menor, lo más preferentemente 70,000 o menor y el peso molecular es preferentemente 50,000 o mayor, lo más preferentemente 60,000 o mayor. El peso molecular de la trombomodulina soluble se puede medir fácilmente por métodos ordinarios para medir el peso molecular de la proteina. Se prefiere la medición por espectrometría de masas y el método MALDI-TOF-MS es más preferido. Para la obtención de una trombomodulina soluble que tiene un peso molecular dentro de un intervalo deseado, una trombomodulina soluble, que se obtiene por cultivo de una célula transformante, preparada por transfección de una célula hospedera con un ADN que codifica para la trombomodulina soluble usando un vector, puede ser sometida a fraccionamiento utilizando cromatografía en columna o similar, como se describe más adelante.

La trombomodulina utilizada para la presente modalidad comprende preferentemente la secuencia de aminoácidos que consiste de los residuos de aminoácidos en las posiciones 19 a 132 de la SEQ ID NO: 1, que ha sido conocida como la parte central de las actividades de trombomodulina de la trombomodulina humana y la trombomodulina no está particularmente limitada, siempre y cuando la trombomodulina comprenda la secuencia de aminoácidos que consiste de los residuos de aminoácidos en las posiciones 19 a 132 de la SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos que consiste de los residuos de aminoácidos en las posiciones 19 a 132 de la SEQ ID NO: 1 puede ser natural o artificialmente mutada, siempre y cuando la secuencia tenga una acción para promover la activación de la proteína C por la trombina, es decir, una de las actividades de trombomodulina. Específicamente, la secuencia puede comprender la sustitución, supresión o adición de uno o más residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos que consiste de los residuos de aminoácidos en las posiciones 19 a 132 de la SEQ ID NO: 1. El nivel aceptable de la mutación no está particularmente limitado, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos tenga las actividades de trombomodulina. Un ejemplo incluye una homología del 50% o más secuencias de aminoácidos y la homología es preferentemente del 70% o más, más preferentemente 80% o más, más preferentemente 90% o más, en particular preferentemente 95% o más y lo más preferentemente 98% o más. Tal secuencia de aminoácidos utados que incluye la sustitución, supresión o adición de uno o más residuos de aminoácidos se denomina como secuencia de mutación homologa. Como se describe más adelante, estas secuencias de aminoácidos mutados se pueden producir fácilmente mediante el uso de téenicas de manipulación de genes, ordinarias. La trombomodulina no está particularmente limitada, hasta el momento que tiene la secuencia anteriormente mencionada y la acción de enlazarse selectivamente a la trombina, para promover la activación de la proteína C por la trombina, al menos como la trombomodulina completa, pero la trombomodulina preferentemente también tiene la acción antiinflamatoria.

La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 comprende la mutación de Val como el aminoácido en la posición 125 de la secuencia de la SEQ ID NO: 1 a Ala. La trombomodulina utilizada para la presente invención también comprende preferentemente la secuencia de aminoácidos de la posición 19 a 132 de la SEQ ID NO: 3.

Como se describió anteriormente, aunque la trombomodulina utilizada para la presente invención no está particularmente limitada, siempre y cuando la trombomodulina tenga al menos la secuencia de aminoácidos de la posición 19 a 132 de la SEQ ID NO: 1 o 3, o una secuencia de mutación homologa de la misma y comprende al menos una secuencia de péptido que tiene las actividades de trombomodulina, los ejemplos preferidos de la trombomodulina incluyen un péptido constituido por la secuencia de la posición 19 a 132 o 17 a 132 en cualquiera de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 y un péptido que consiste de una secuencia de mutación homologa de la secuencia antes mencionada y que tiene al menos las actividades de trombomodulina. Un péptido constituido por la secuencia de la posición 19 a 132 en cualquiera de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, es más preferido. En otra modalidad, un péptido que consiste de una secuencia de mutación homologa de la secuencia de la posición 19 a 132 o 17 a 132 en cualquiera de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 y que tiene al menos las actividades de trombomodulina, es más preferido.

Como otra modalidad de la trombomodulina utilizada en esta modalidad, la trombomodulina comprende preferentemente la secuencia de aminoácidos de las posiciones 19 a 480 de la SEQ ID NO: 5, que no está limitada particularmente, siempre y cuando la trombomodulina comprenda la secuencia de aminoácidos de las posiciones 19 a 480 de la SEQ ID NO: 5. La secuencia de aminoácidos de las posiciones 19 a 480 de la SEQ ID NO: 5 puede ser una secuencia de mutación homologa de la misma, siempre y cuando la secuencia tenga una acción para promover la activación de la proteína C por trombina, es decir, una de las actividades de trombomodulina.

La secuencia de la SEQ ID NO: 7 comprende la mutación de Val como el aminoácido en la posición 473 de la secuencia de la SEQ ID NO: 5 a Ala. La trombomodulina utilizada en esta modalidad también comprende preferentemente la secuencia de aminoácidos de la posición 19 a 480 de la SEQ ID NO: 7.

Como se describió anteriormente, aunque la trombomodulina utilizada en esta modalidad no está particularmente limitada, siempre y cuando la trombomodulina tenga al menos la secuencia de la posición 19 a 480 en cualquiera de la SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7, o una secuencia de mutación homologa de la misma y comprenda al menos una secuencia de péptido que tenga las actividades de trombomodulina, los ejemplos preferidos de la trombomodulina incluyen un péptido constituido por la secuencia de la posición 19 a 480 o 17 a 480 en cualquiera de la SEQ ID NO: 5o SEQ ID NO: 7 y un péptido que consiste de una secuencia de mutación homologa de la secuencia antes mencionada y que tiene al menos las actividades de trombomodulina. Es más preferido un péptido constituido por la secuencia de la posición 19 a 480 de la SEQ ID NO: 5 o 7. En otra modalidad, un péptido que consiste de una secuencia de mutación homologa de la secuencia de la posición 19 a 480 o 17 a 480 en cualquiera de la SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7 y que tiene al menos las actividades de trombomodulina, es más preferido.

Como otra modalidad de la trombomodulina utilizada en esta modalidad, la trombomodulina comprende preferentemente la secuencia de aminoácidos de la posición 19 a 515 de la SEQ ID NO: 9, que no está limitada particularmente, siempre y cuando la trombomodulina comprenda la secuencia de aminoácidos de las posiciones 19 a 515 de la SEQ ID NO: 9. La secuencia de aminoácidos de la posición 19 a 515 de la SEQ ID NO: 9 puede ser una secuencia de mutación homologa de la misma, siempre y cuando la secuencia tenga una acción para promover la activación de la proteina C por trombina, es decir, una de las actividades de trombomodulina.

La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11 comprende la mutación de Val como el aminoácido en la posición 473 de la SEQ ID NO: 9 a Ala. La trombomodulina utilizada en esta modalidad también comprende preferentemente la secuencia de aminoácidos de la posición 19 a 515 de la SEQ ID NO: 11.

Como se describió anteriormente, aunque la trombomodulina utilizada en esta modalidad no está particularmente limitada, siempre y cuando la trombomodulina tenga al menos la secuencia de la posición 19 a 515 en cualquiera de la SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11, o una secuencia de mutación homologa de la misma y comprenda una secuencia de péptido que tiene al menos las actividades de trombomodulina, los ejemplos más preferidos incluyen un péptido que tiene la secuencia de la posición 19 a 516, 19 a 515, 17 a 516, o 17 a 515 en cualquiera de la SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11 y un péptido que consiste de una secuencia de mutación homologa de la secuencia antes mencionada y que tiene al menos las actividades de trombomodulina. Un péptido que tiene la secuencia de la posición 19 a 516, 19 a 515, 17 a 516, o 17 a 515 de la SEQ ID NO: 9 es particularmente preferido. Una mezcla de los mismos es también un ejemplo preferido. En otra modalidad, un péptido que tiene la secuencia de la posición 19 a 516, 19 a 515, 17 a 516, o 17 a 515 de la SEQ ID NO: 11 es particularmente preferido. Una mezcla de los mismos es también un ejemplo preferido. Además, un péptido que consiste de una secuencia de mutación homologa de la misma y que tiene al menos las actividades de trombomodulina es también un ejemplo preferido. Se prefiere que la tombomodulina soluble también tenga la acción antiinflamatoria.

Un péptido que tiene una secuencia de mutación homologa es como se describe anteriormente y significa un péptido que puede comprender la sustitución, supresión o adición de al menos uno, es decir, uno o más, preferentemente varios (por ejemplo, 1 a 20, preferentemente 1 a 10, más preferentemente 1 a 5, en particular preferentemente 1 a 3) residuos de aminoácidos, en la secuencia de aminoácidos del péptido indicado. Aunque el nivel aceptable de la mutación no está particularmente limitado, siempre y cuando el péptido tenga las actividades de trombomodulina, un ejemplo del nivel aceptable de homología incluye 50% o más como secuencias de aminoácidos y la homología puede ser preferentemente 70% o más, más preferentemente 80% o más, aún más preferentemente 90% o más, en particular preferentemente 95% o más y lo más preferentemente 98% o más.

Los ejemplos preferidos de la trombomodulina utilizada en esta modalidad también incluyen el péptido constituido por la secuencia de la SEQ ID NO: 14 (462 residuos de aminoácidos), el péptido que consiste de la secuencia de la SEQ ID NO: 8 (272 residuos de aminoácidos) y el péptido que consiste de la secuencia de la SEQ ID NO: 6 (236 residuos de aminoácidos) descritos en la publicación de patente japonesa no examinada No.64-6219.

La trombomodulina utilizada en esta modalidad no está particularmente limitada, siempre y cuando la trombomodulina tenga al menos la secuencia de aminoácidos de la posición 19 a 132 en cualquiera de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3. Como tal trombomodulina, se prefiere un péptido que tiene al menos la secuencia de aminoácidos de la posición 19 a 480 en cualquiera de la SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7 y es más preferido un péptido que tiene al menos la secuencia de aminoácidos de la posición 19 a 515 en cualquiera de la SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11. Un ejemplo más preferido del péptido que tiene al menos la secuencia de aminoácidos de la posición 19 a 515 en cualquiera de la SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11 es un péptido que tiene la secuencia de la posición 19 a 516, 19 a 515, 19 a 514, 17 a 516, 17 a 515, o 19 a 514 en cualquiera de la SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11. Además, una mezcla de péptidos que consisten cada uno de la secuencia de la posición 19 a 516, 19 a 515, 19 a 514, 17 a 516, 17 a 515, o 19 a 514 en cualquiera de la SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11 es también un ejemplo preferido.

En el caso de la mezcla mencionada anteriormente, la proporción de mezcla de un péptido que se inicia de la posición 17 y un péptido que comienza de la posición 19 para cada una de las SEQ ID NOS: 9 y 11 es, por ejemplo, de 30:70 a 50:50, preferentemente 35:65 a 45:55.

Además, la proporción de mezcla de un péptido que termina en la posición 514, un péptido que termina en la posición 515 y un péptido que termina en la posición 516 para cada una de las SEQ ID NOS: 9 y 11 es, por ejemplo, 0:0:100 a 0:90:10, 0:70:30 o a 10:90:0 o 10:0:90 a 20:10:70, si se desea.

La proporción de mezcla de los péptidos se puede determinar por un método ordinario.

La secuencia de las posiciones 19 a 132 en la SEQ ID NO: 1 corresponde a la secuencia de las posiciones 367 a 480 en la SEQ ID NO: 9 y la secuencia de las posiciones 19 a 480 en la SEQ ID NO: 5 corresponde a la secuencia de las posiciones 19 a 480 en la SEQ ID NO: 9. Además, la secuencia de las posiciones 19 a 132 en la SEQ ID NO: 3 corresponde a la secuencia de las posiciones 367 a 480 en la SEQ ID NO: 11 y la secuencia de las posiciones 19 a 480 en la SEQ ID NO: 7 corresponde a la secuencia de las posiciones 19 a 480 en la SEQ ID NO: 11. Además, todas las secuencias de las posiciones 1 a 18 en las SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9 y 11 son secuencias idénticas.

Como se describe más adelante, estas trobomodulinas utilizadas en esta modalidad se pueden obtener a partir de células transformantes preparadas mediante la transfección de células hospederas con un ADN que codifica para el péptido (específicamente, las secuencias de nucleótidos de las SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12 y similares) mediante el uso de un vector.

Es suficiente que estos péptidos sólo tengan las secuencias de aminoácidos antes mencionadas y una cadena de azúcar puede ser unida o no unida, que no está particularmente limitada. En las téenicas de manipulación genética, un tipo de una cadena de azúcar, una posición a la que se agrega una cadena de azúcar y un nivel de adición de los mismos difieren, dependiendo del tipo de células hospederas usadas y se puede usar cualquier técnica. En cuanto a la posición de enlace de una cadena de azúcar y un tipo de la misma, los hechos descritos en la publicación de patente japonesa no examinada No.11-341990 se conocen y las trombomodulinas utilizadas en esta modalidad se pueden agregar con la misma cadena de azúcar en la misma posición. Dos tipos de cadenas de azúcar enlazadas a N, las de tipo biantenario de fucosilo y tipo triantenario de fucosilo, pueden unirse a la trombomodulina de esta modalidad y su proporción es, por ejemplo, de 100:0 a 60:40, preferentemente de 95:5 a 60:40, más preferentemente de 90:10 a 70:30. La proporción de estas cadenas de azúcar se puede medir en un mapa bidimensional de cadena de azúcar, descrito en Biochemical Experimental Methods, Vol. 23, Methods of Researches on Glycoprotein Sugar Chains, Japan Scientific Societies Press (1990) y similares. Además, cuando se examina una composición de azúcar de la trombomodulina de esta modalidad, se detectan sacáridos, aminosacáridos y ácido siálico neutros, de los cuales el contenido puede ser, cada uno independientemente, por ejemplo, 1 a 30%, preferentemente 2 a 20%, más preferentemente 5 a 10%, en términos de proporción en peso basado en el contenido de proteina. El contenido de azúcar se puede medir por los métodos descritos en Lecture of New Biochemical Experiments, Vol. 3, Sugar I, Glycoprotein (Book 1), Tokyo Kagaku Dojin (1990) (neutral saccharides: phenol-sulfuric acid method, aminosaccharides: Elson-Morgan ethod, sialic acid: periodic acid-resorcinol method).

Aunque el método para obtener la trombomodulina no se limita a su obtención mediante manipulación genética como se describe más adelante, como una secuencia de señal que se puede utilizar para la expresión, donde la trombomodulina se obtiene por manipulación genética, se puede usar una secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos de las posiciones 1 a 18 en la SEQ ID NO: 9 y una secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos de las posiciones 1 a 16 en la SEQ ID NO: 9 y también se pueden usar otras secuencias de señal conocidas, tales como la secuencia de señal de activador del plasminógeno tisular humano (publicación internacional W088/9811).

Cuando una secuencia de ADN que codifica para la trombomodulina se introduce en una célula hospedera, los ejemplos de métodos preferidos incluyen un método para incorporar una secuencia de ADN que codifica para la trombomodulina en, preferentemente, un vector, más preferentemente un vector de expresión capaz de ser expresado en células animales y luego introducir el ADN con el vector. Un vector de expresión es una molécula de ADN que está constituida con una secuencia promotora, una secuencia para la adición de un sitio de enlace del ribosoma al ARNm, una secuencia de ADN que codifica para una proteina a expresar, una señal de empalme, una secuencia terminadora para la terminación de la transcripción, una secuencia de origen de replicación y similares. Ejemplos de vector de expresión de células animales, preferidos incluyen pSV2-X reportado por Mulligan R.C. et al. (Proc Nati Acad Sci E.U.A., 1981, 78, 2072- 2076); pBP69T (69-6) reportado por Howlcy P.M. et al. (Methods in Enzymology, 1983, 101, 387-402, Academic Press) y similares. Además, también hay otra modalidad preferida en la que se introduce ADN en un vector de expresión, expresable en un microorganismo.

Ejemplos de célula hospedera que se pueden utilizar en la producción de tales péptidos como se mencionó anteriormente incluyen células animales. Ejemplos de las células animales incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), células COS-1, células COS-7, células VERO (ATCC CCL-81), células BHK, células MDCK derivadas de riñón de caninos, células AV-12-664 de hámster y similares. Además, los ejemplos de derivados de la célula hospedera humana incluyen células HeLa, células WI38, células 293 humanas y células PER.C6. De estas células, las células CHO son muy comunes y preferidas y entre las células CHO, las células CHO deficientes en dihidrofolato-reductasa (DHFR) son más preferidas.

En un proceso de manipulación genética o un proceso de producción de péptidos, también se utilizan a menudo microorganismos tales como Escherichia coli. Preferentemente se utiliza un sistema hospedero-vector, adecuado para cada proceso y también se puede seleccionar un sistema de vector apropiado para las células hospederas anteriormente mencionadas. Un gen de la trombomodulina, utilizado en una téenica de recombinación genética ha sido clonado. Se han descrito ejemplos de producción de trombomodulina mediante tal téenica de recombinación de genes y además, también son conocidos métodos para purificar la trombomodulina para obtener un producto purificado de la misma (publicaciones de patentes japonesas no examinadas Nos.64-6219, 2-255699, 5-213998, 5-310787, 7-155176 y J. Biol Chem, 1989, 264: 10351-10353). Por lo tanto, la trombomodulina utilizada en esta modalidad se puede producir mediante el uso de los métodos descritos en los informes mencionados, o por métodos similares. Por ejemplo, la publicación de patente japonesa no examinada No. 64-6219 describe la cepa DH5 de Escherichia coli K-12 (ATCC acceso No.67283) que contiene un plásmido pSV2T J2 que contiene un ADN que codifica para la trombomodulina de longitud completa. También se puede utilizar esta cepa redepositada en el antiguo Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana (actualmente Institución Administrativa Independiente, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada, Depositaría del Organismo Internacional de Patentes) ( Escherichia coli DH5/pSV2TMJ2) (FERM BP-5570). La trombomodulina utilizada en esta modalidad se puede preparar por una técnica de manipulación genética conocida, usando un ADN que codifica para la trombomodulina de longitud completa como un material de partida.

La trombomodulina de esta modalidad se puede preparar por un método convencionalmente conocido o un método similar. Por ejemplo, se puede recurrir al método antes mencionado de Yamamoto et al. (publicación de patente japonesa no examinada No.64-6219) o al método descrito en la publicación de patente japonesa no examinada No. 5-213998. Específicamente, por ejemplo, un ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 se prepara a partir de un gen de la trombomodulina derivada de humano, por una téenica de manipulación genética y puede modificarse adicionalmente según se requiera. Para tal modificación, con el fin de obtener un ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11 (que consiste específicamente de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 12), los codones que codifican para el aminoácido en la posición 473 en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 (en particular, el nucleótido en la posición 1418 en la SEQ ID NO: 10) se mutaron mediante mutagénesis dirigida al sitio, de acuerdo con el método descrito por Zoller M.J. et al. (Method in Enzymology, 1983, 100: 468-500, Academic Press). Por ejemplo, mediante el uso de un ADN sintético para mutación que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 13, el nucleótido T en la posición 1418 en la SEQ ID NO: 10 se puede convertir en el nucleótido C para obtener un ADN imitado.

El ADN preparado como se describió anteriormente se incorpora en, por ejemplo, células de ovario de hámster chino (CHO) para obtener células transformantes. Tales células se someten a selección apropiada y la trombomodulina purificada por un método conocido puede producirse a partir de una solución de cultivo obtenida por el cultivo de una célula seleccionada. Como se describió anteriormente, el ADN (SEQ ID NO: 10) que codifica para la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 se transfecta preferentemente en la célula hospedera mencionada anteriormente.

El método para producir trombomodulina de esta modalidad no se limita al método mencionado anteriormente. Por ejemplo, también es posible extraer y purificar la trombomodulina de la orina, la sangre, otros fluidos corporales y similares, o extraer y purificar la trombomodulina a partir de un tejido que produce trombomodulina o un cultivo del tejido antes mencionado y similares. Además, la trombomodulina puede someterse adicionalmente a un tratamiento de escisión usando una proteasa, según se requiera.

Para el cultivo de la célula transformante mencionada anteriormente, se puede utilizar un medio usado para el cultivo celular ordinario y es preferible cultivar la célula transformante en diversos tipos de medios, de antemano para elegir un medio óptimo. Por ejemplo, un medio conocido tal como el medio MEM, medio DMEM y medio 199 se puede utilizar como un medio de base y se puede utilizar un medio mejorado adicional o un medio adicionado con suplementos para diversos medios. Ejemplos del método de cultivo incluyen cultivo en suero, en donde el cultivo se realiza en un medio que contiene suero de la sangre y cultivo libre de suero, en donde el cultivo se realiza en un medio que no contiene suero de la sangre. Aunque el método de cultivo no está particularmente limitado, se prefiere el cultivo libre de suero.

Cuando se agrega suero a un medio, en el caso del cultivo de suero, se prefiere el suero bovino. Ejemplos de suero bovino incluyen suero bovino fetal, suero bovino neonato, suero bovino de ternera, suero de bovino adulto y similares y se puede usar cualquiera de estos ejemplos, siempre que el suero sea adecuado para el cultivo de células. Como el medio libre de suero, utilizado en el cultivo libre de suero, se pueden utilizar los medios disponibles en el mercado. Los medios libres de suero, adecuados para diversas células se comercializan y por ejemplo, para las células CHO, se venden por Invitrogen CD-CHO, CHO-S-SFMII y CHO-III-PFM y el medio IS CHO, IS CHO-CD y similares se venden por Irvine Scientific. Estos medios pueden ser usados sin ningún tratamiento, o pueden ser mejorados o adicionados con suplementos y utilizarse. Ejemplos del medio libre de suero incluyen, además, el medio DMEM que contiene 5 mg/1 de cada una de la insulina, transferrina y ácido selenioso. Como se describió anteriormente, el medio no está particularmente limitado, siempre y cuando el medio se pueda utilizar para producir la trobomodulina de esta modalidad. El método de cultivo no está particularmente limitado y se puede utilizar cualquiera de cultivo por lotes, cultivo repetitivo por lotes, cultivo por lote alimentado, cultivo de perfusión y similares.

Cuando la trombomodulina utilizada en esta modalidad se prepara por el método de cultivo celular antes mencionado, la diversidad se puede observar en el aminoácido N-terminal debido a la modificación postraduccional de la proteína. Por ejemplo, el aminoácido de la posición 17, 18, 19 o 22 en la SEQ ID NO: 9 puede servir como el aminoácido N-terminal. Además, por ejemplo, el aminoácido N-terminal puede ser modificado, de modo que el ácido glutámico en la posición 22 se cambia a ácido piroglutámico. Se prefiere que el aminoácido de la posición 17 o 19 sirva como el aminoácido N-terminal y se prefiere más que el aminoácido de la posición 19 sirva como el aminoácido N-terminal. Además, hay también otra modalidad en la que el aminoácido de la posición 17 sirve como el aminoácido N-terminal, que es una modalidad preferida. En cuanto a la modificación, la diversidad y similares mencionados anteriormente, ejemplos similares se pueden mencionar para la secuencia de la SEQ ID NO: 11.

Además, cuando la trombomodulina soluble se prepara mediante el uso de un ADN que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 10, se puede observar la diversidad del aminoácido C-terminal y se puede producir un péptido más corto por un residuo de aminoácido. Específicamente, el aminoácido C-terminal puede ser modificado de modo que el aminoácido de la posición 515 sirve como el aminoácido C-terminal y aún más la posición 515 está amidada. Además, se puede producir un péptido más corto por dos residuos de aminoácidos. Específicamente, el aminoácido de la posición 514 puede servir como el aminoácido C-terminal. Por lo tanto, se puede producir cualquiera de los péptidos que tienen una diversidad significativa del aminoácido N-terminal y el aminoácido C-terminal, o una mezcla de ellos. Se prefiere que el aminoácido de la posición 515 o el aminoácido de la posición 516 sirvan como el aminoácido C-terminal y es más preferido que el aminoácido de la posición 516 sirva como el aminoácido C-terminal. Además, hay también otra modalidad en la que el aminoácido de la posición 514 sirve como el aminoácido C-terminal, que es una modalidad preferida. Respecto a la modificación, la diversidad y similares descritos anteriormente, lo mismo se aplicará a un ADN que tiene la secuencia de nucleótidcs de la SEQ ID NO: 12.

La trombomodulina obtenida por el método descrito anteriormente puede ser una mezcla de péptidos que tienen la diversidad en los aminoácidos N-terminal y C-terminal. Los ejemplos específicos incluyen una mezcla de péptidos que tienen las secuencias de las posiciones 19 a 516, las posiciones 19 a 515, las posiciones 19 a 514, las posiciones 17 a 516, las posiciones 17 a 515 y las posiciones 17 a 514 en la SEQ ID NO: 9.

Entonces, el aislamiento y la purificación de la trombomodulina A partir de un sobrenadante de cultivo o cultivo obtenido como se describe anteriormente, se pueden llevar a cabo por métodos conocidos [Editado por Takeichi Horio, Tanpakushitsu/Koso no Kiso Jikken Ho (Fundamental Experimental Methods for Proteins and Enzymes), 1981]. Por ejemplo, es preferible utilizar la cromatografía de intercambio iónico o la cromatografía de adsorción, que utiliza una interacción entre la trombomodulina y un portador cromatográfico en el que los grupos funcionales que tienen una carga opuesta a la de la trombomodulina se inmovilizan. Otro ejemplo preferido es la cromatografía de afinidad que utiliza una afinidad específica con la trombomodulina. Los ejemplos preferidos de adsorbente incluyen la trombina, que es un ligando de la trombomodulina y un anticuerpo antitrombomodulina. Como el anticuerpo, se pueden utilizar anticuerpos antitrombomodulina que tienen propiedades adecuadas o que reconocen epitopes apropiados. Los ejemplos incluyen, por ejemplo, los descritos en la publicación de patente japonesa (Kokoku) No.5-42920, publicaciones de patentes japonesas no examinadas Nos. 64-45398 y 6-205692 y similares. Otros ejemplos incluyen la cromatografía de filtración en gel y ultrafiltración, que utilizan el tamaño molecular -de la trombomodulina. Otros ejemplos incluyen además, la cromatografía hidrofóbica que utiliza enlace hidrofóbico entre un portador cromatográfico en el que se inmovilizan grupos hidrofóbicos y una porción hidrofóbica de la trombomodulina. Además, la hidroxiapatita puede ser utilizada como un portador en la cromatografía de adsorción, cuyos ejemplos incluyen, por ejemplo, los descritos en la publicación de patente japonesa no examinada no.9-110900. Estos medios pueden ser utilizados en combinación, según se requiera. Aunque el grado de purificación se puede seleccionar dependiendo de un propósito de uso y similares, es deseable purificar la trombomodulina hasta que se obtiene una sola banda como resultado de la electroforesis, preferentemente SDS-PAGE, o se obtiene un solo pico como resultado de la HPLC de filtración en gel o HPLC de fase inversa del producto aislado y purificado. Por supuesto, debe entenderse que, cuando se utilizan dos o más tipos de trombomodulinas, se prefiere que sólo se obtengan sustancialmente las bandas de las trombomodulinas y no se requiere obtener una sola banda.

Los ejemplos específicos del método de purificación utilizado en esta modalidad incluyen un método de purificación que usa las actividades de trombomodulina como un criterio, por ejemplo, un método de purificación que comprende la purificación sencilla de un sobrenadante de cultivo o un producto de cultivo con una columna de intercambio iónico de Q Sepharose Fast Flow para recoger una fracción que tiene las actividades de trombomodulina; a continuación, la purificación de la fracción con una columna de afinidad, columna de DIP-trombina-agarosa (diisopropilfosforiltrombina-agarosa), como la etapa de purificación principal para recuperar una fracción que tiene las actividades de trombomodulina potentes; a continuación, la concentración de la fracción recuperada y seguida por filtración en gel para obtener una fracción activa de trombomodulina como un producto purificado (Gomi K. et al, Blood, 1990, 75: 1396-1399). Un ejemplo de las actividades de trombomodulina, utilizadas como el criterio es una actividad de promoción de la activación de la proteina C por la trombina. Otros ejemplos preferidos del método de purificación se ejemplifican a continuación.

Se selecciona una resina de intercambio iónico que tenga buenas condiciones de adsorción para la trombomodulina y se realiza la purificación por cromatografía de intercambio iónico. Un ejemplo particularmente preferido es un método que comprende el uso de Q-Sepharose Fast Flow equilibrada con 0.02 mol/1 de un amortiguador de Tris-HCl (pH 7.4) que contiene 0.18 mol/1 de NaCl. Después de lavar como se requiera, se puede realizar la elución con 0.02 mol/1 de un amortiguador Tris-HCl (pH 7.4) que contiene 0.3 mol/1 de NaCl, por ejemplo, para obtener la trombomodulina como un producto purificado en forma sencilla.

Entonces, por ejemplo, una sustancia que tiene afinidad específica por la trombomodulina puede ser inmovilizada en una resina, para llevar a cabo la purificación por cromatografía de afinidad. Los ejemplos preferidos incluyen una columna de DIP-trombina-agarosa y una columna de anticuerpo monoclonal antitrombomodulina. En el caso de la columna de DIP-trombina-agarosa, la columna se equilibra previamente con 20 mmol/1 de amortiguador Tris-HCl (pH 7.4) que contiene 100 mmol/1 de NaCl y 0.05 mmol/1 de cloruro de calcio y el ya mencionado producto purificado simplemente entonces puede ser cargado en la columna, lavado según se requiera y luego eluido con, por ejemplo, 20 mmol/1 de un amortiguador Tris-HCl (pH 7.4) que contenga 1.0 mol/1 de NaCl y 0.5 mmol/1 de cloruro de calcio para obtener la trombomodulina como un producto purificado. En el caso de la columna del anticuerpo monoclonal antitrombomodulina, un ejemplo del método comprende: poner en contacto una solución de anticuerpo monoclonal antitrombomodulina en 0.1 mol/1 de amortiguador NaHCO3 (pH 8.3) que contiene 0.5 mol/1 de NaCl con Sepharose 4FF (GE Health Care Biosciences) activado con CNBr de antemano, para obtener la resina Sepharose 4FF acoplada con los anticuerpos monoclonales antitrombomodulina, equilibrar la resina cargada en una columna de antemano con, por ejemplo, 20 mmol/1 de amortiguador de fosfato (pH 7.3) que contiene 0.3 mol/1 de NaCl, lavar la resina según se requiera y luego llevar a cabo la elución con 100 mmol/1 de amortiguador de glicina-HCl (pH 3.0) que contiene 0.3 mol/1 de NaCl. Un efluente puede ser neutralizado con un amortiguador apropiado para obtener un producto en forma purificada.

Posteriormente, el producto purificado se ajusta a pH 3.5 y después se carga en un intercambiador catiónico, preferentemente SP-Sepharose FF (GE Health Care Biosciences) como un intercambiador catiónico fuerte, equilibrado con 100 mmol/1 de amortiguador de glicina-HCl (pH 3.5) que contiene 0.3 mol/1 de NaCl y el lavado se realiza con el mismo amortiguador para obtener una fracción no adsorbente. La fracción resultante se neutraliza con un amortiguador apropiado para obtener un producto altamente purificado. Estos productos se concentran preferentemente por ultrafiltración.

Además, también es preferible intercambiar el amortiguador por filtración en gel. Por ejemplo, un producto altamente purificado concentrado por ultrafiltración se puede cargar en una columna de Sephacryl S-300 o columna de S-200 equilibrada con 20 mmol/1 de amortiguador de fosfato (pH 7.3) que contiene 50 mmol/1 de NaCl y después se desarrolla para el fraccionamiento con 20 mmol/1 de amortiguador de fosfato (pH 7.3) que contiene 50 mmol/1 de NaCl. La actividad para promover la activación de la proteina C por la trombina puede ser confirmada para recoger una fracción activa y de ese modo obtener un producto altamente purificado intercambiado con amortiguador. Con el fin de mejorar la seguridad, un producto altamente purificado, obtenido como se describió anteriormente, se filtra preferentemente a través de un filtro apropiado para la eliminación de virus, tal como Planova 15N (Asahi Kasei Medical Co., Ltd.) y luego el producto resultante se puede concentrar por ultrafiltración a una concentración deseada. Finalmente, el producto se filtra preferentemente a través de un filtro de filtración aséptica.

La "quimioterapia contra el cáncer" mencionada en esta modalidad, significa un método de tratamiento de un cáncer utilizando un agente contra el cáncer.

El "agente contra el cáncer" mencionado en esta modalidad no está particularmente limitado, siempre que sea un medicamento que tenga una actividad contra el cáncer, que provoca síntomas de dolor neuropático periférico como reacciones secundarias cuando se administra a un paciente. Los ejemplos incluyen, por ejemplo, agentes contra el cáncer que inhiben el metabolismo de los ácidos nucleicos (preparación de platino y similares), agentes contra el cáncer que inhiben la polimerización de microtúbulos (agentes alcaloides de la vinca), agentes contra el cáncer que inhiben la despolimerización de microtúbulos (agentes de taxano), agentes contra el cáncer que muestran acción antagonista de hormonas (agentes antiestrógenos y similares), agentes contra el cáncer que inhiben la transducción de señal intracelular (inhibidores de proteosoma y similares), agentes contra el cáncer que actúan sobre un objeto molecular específico para un tumor maligno (inhibidores de tirosina-cinasa, las preparaciones de anticuerpos y similares) y agentes contra el cáncer que muestran una acción de activación de la inmunidad no específica (preparaciones de estreptococo hemolítico y similares), y agentes contra el cáncer que inhiben el metabolismo de los ácidos nucleicos y agentes contra el cáncer que inhiben la polimerización de microtúbulos o despolimerización, se prefieren. Por ejemplo, el agente contra el cáncer incluye uno o más tipos de agentes contra el cáncer, seleccionados entre el grupo que consiste de agentes de taxano y preparaciones de platino, el preferido es un agente de taxano o una preparación de platino y un agente de taxano es más preferido. En otra modalidad, puede ser preferible una preparación de platino.

Ejemplos de los agentes de taxanos incluyen paclitaxel, docetaxel, tamoxifeno y similares. Se prefieren uno o más tipos seleccionados entre el grupo que consiste de paclitaxel y docetaxel, el paclitaxel es más preferido.

Ejemplos de las preparaciones de platino incluyen oxaliplatino, cisplatino, carboplatino, nedaplatino y similares. Se prefieren uno o más tipos de preparaciones seleccionadas entre el grupo que consiste de oxaliplatino, cisplatino, carboplatino y nedaplatino, el oxaliplatino es más preferido.

El dolor neuropático periférico causado por un agente contra el cáncer, que es el objeto del tratamiento profiláctico y/o terapéutico usando el medicamento de esta modalidad, incluye al menos un dolor neuropático periférico causado por una terapia de un solo fármaco utilizando un único tipo de agente contra el cáncer y también abarca un dolor neuropático periférico causado por una terapia de múltiples fármacos utilizando dos o más tipos de medicamentos en combinación, a base de diferentes modos de acción. Ejemplos de la terapia de múltiples fármacos incluyen, por ejemplo, la terapia de FOLFOX, terapia de FOLFIRI y similares, pero la terapia no se limita a estos ejemplos. Como el objeto de aplicación del medicamento de esta modalidad, por ejemplo, se prefiere un dolor neuropático periférico causado por la terapia de FOLFOX. En otra modalidad, puede ser preferible un dolor neuropático periférico causado por la terapia de FOLFIRI.

La terapia de FOLFOX es una clase de quimioterapia del cáncer que utiliza oxaliplatino, fluorouracilo y levofolinato en combinación. La terapia de FOLFOX se clasifica en, por ejemplo, FOLFOX2, FOLFOX3, FOLFOX4, FOLFOX6, mFOLFOX6, FOLFOX7, mFOLFOX7 y similares, de acuerdo con el método de administración.

La terapia de FOLFIRI es una clase de la quimioterapia contra el cáncer que utiliza irinotecán, fluorouracilo, levofolinato y leucovorina en combinación.

Ejemplos de los agentes contra el cáncer que inhiben el metabolismo de los ácidos nucleicos incluyen, por ejemplo, agentes alquilantes (por ejemplo, ciclofosfamida y nimustina), antibióticos antitumorales (por ejemplo, doxorrubicina, mitomicina C y bleomicina), inhibidores de la topoisomerasa alquilantes (por ejemplo, irinotecán y etopósido), preparaciones de platino (por ejemplo, cisplatino, carboplatino y oxaliplatino), inhibidores del metabolismo de la pirimidina (por ejemplo, mercaptopurina y fludarabina) e inhibidores de la síntesis de ácido fólico (por ejemplo, metotrexato). Entre ellos, se prefieren preparaciones de platino, el oxaliplatino es más preferido ya que es un agente contra el cáncer que causa más frecuentemente dolor neuropático periférico y se desea fuertemente un método para el tratamiento de tal dolor neuropático periférico.

Ejemplos de los agentes contra el cáncer que inhiben la polimerización de microtúbulos o despolimerización incluyen agentes alcaloides de la vinca (por ejemplo, vincristina y vinblastina), agentes de taxano (por ejemplo, paclitaxel, docetaxel y tamoxifeno) y agentes antiandrógenos (por ejemplo, flutamida). Entre ellos, se prefieren los agentes de taxano, el paclitaxel es más preferido.

Ejemplos de los agentes contra el cáncer que tienen acción antagonista de hormonas incluyen, por ejemplo, agentes antiestrógenos (por ejemplo, tamoxifeno) y agentes antiandrógenos (por ejemplo, flutamida).

Ejemplos de los agentes contra el cáncer que inhiben la transducción de señal intracelular incluyen, por ejemplo, inhibidores de proteosoma (por ejemplo, bortezomib).

Ejemplos de los agentes contra el cáncer que actúan sobre un objetivo molecular específico para un tumor maligno incluyen, por ejemplo, los inhibidores de tirosina-cinasa BCR/ABL (por ejemplo, imatinib), inhibidores de tirosina-cinasa EGFR (por ejemplo, gefitinib), preparaciones de anticuerpos (por ejemplo, rituximab, trastuzumab y tocilizumab) y preparaciones de arsénico.

Ejemplos de los agentes contra el cáncer que tienen una acción de activación de la inmunidad no especifica incluyen, por ejemplo, preparaciones de estreptococo hemolítico y preparaciones de polisacárido Coriolus .

El "dolor neuropático periférico causado por un agente contra el cáncer" mencionado en esta modalidad significa un dolor neuropático periférico causado como resultado de la administración de tal agente contra el cáncer como se ejemplificó anteriormente. También puede ser denominado como "dolor neuropático periférico inducido por quimioterapia". Ejemplos de los síntomas de dolor neuropático periférico incluyen entumecimiento de las extremidades, dolor de las extremidades, reducción de la reflexión profunda de tendones, reducción de la fuerza muscular, alodinia, hiperalgesia y disfunción motora. Ejemplos de los síntomas de dolor neuropático periférico también incluyen dolores tales como dolor intenso y dolor por quemadura, entumecimiento de los extremos de las extremidades, sensación anormal tal como sensación de ardor, hiperestesia tal como hipersensibilidad al frío, disestesia tal como anestesia, parálisis sensorial y molestias, ataxia sensorial y reducción de la fuerza muscular. La alodinia por lo general significa un síntoma de la detección de un estímulo, que no suele causar un dolor (por ejemplo, contacto con la luz y presión, o un ligero estímulo de baja temperatura) como un dolor. La alodinia causada por un agente contra el cáncer incluye la alodinia aguda que aparece inmediatamente después de la administración de un agente contra el cáncer y la alodinia crónica que aparece en una forma retardada durante la continuación del tratamiento con un agente contra el cáncer, estos tipos de alodinia también se incluyen dentro del alcance del dolor neuropático periférico causado por un agente contra el cáncer, mencionado en esta modalidad. La alodinia aguda es característica para el oxaliplatino. Como los criterios de diagnóstico de la alodinia causada por un agente contra el cáncer, se utilizan DEB-NTC (Criterios de Neurotoxicidad de Debiopharm), CTCAE (Criterios de Terminología Común para Eventos Adversos) y similares.

En esta modalidad, la alodinia como el dolor neuropático periférico no está particularmente limitada, siempre y cuando se trate de un síntoma de la detección de un estímulo, como un dolor que no suele causar dolor. Los ejemplos incluyen, por ejemplo, la alodinia mecánica y la alodinia por frío, la alodinia mecánica es un ejemplo preferido. En otra modalidad, puede ser preferible la alodinia por frío.

Los ejemplos de la alodinia mecánica incluyen un síntoma de la detección de un estímulo táctil, como un dolor que no suele causar dolor. Los ejemplos incluyen, por ejemplo, los síntomas de dificultad en las acciones cotidianas, tales como abrochar los botones de camisas, sacar monedas de un monedero y caminar.

Los ejemplos de la alodinia por frío incluyen un síntoma de la detección de un estímulo frío, como un dolor que no suele causar dolor. Los ejemplos incluyen, por ejemplo, los síntomas de dificultad en este tipo de acciones cotidianas, como trabajos de cocina y lavar usando agua, sostener un vaso que contiene agua y salir en una temporada de invierno.

En esta modalidad, la trombomodulina se puede administrar antes de administrar un agente contra el cáncer (administración profiláctica), o se puede administrar después de que se administre un agente contra el cáncer (administración terapéutica). Es preferible administrarla después de que se administre un agente contra el cáncer. En otra modalidad, puede ser preferible administrarla antes de que se administre un agente contra el cáncer. Además, la trombomodulina y un agente contra el cáncer también se pueden administrar simultáneamente. Como se muestra en los Ejemplos de Prueba 1 mencionados más adelante, la administración de trombomodulina inmediatamente antes de la administración de un agente contra el cáncer o la administración de trombomodulina de forma simultánea con la administración de un agente contra el cáncer, es una de las modalidades preferidas de la administración profiláctica.

Además, tanto en la administración profiláctica como en la administración terapéutica, la trombomodulina puede ser administrada durante el periodo de administración de un agente contra el cáncer.

Desde un punto de vista de la continuidad del efecto, se prefiere la administración profiláctica. En otras palabras, el medicamento de esta modalidad es preferentemente un medicamento para el tratamiento profiláctico de un dolor neuropático periférico causado por un agente contra el cáncer.

Cuando la trombomodulina se administra antes de que se administre un agente contra el cáncer, el tiempo desde la administración de la tromboodulina hasta la administración del agente contra el cáncer no está particularmente limitado, siempre y cuando se pueda presentar el efecto de prevenir el dolor neuropático periférico. La trombomodulina se administra preferentemente 9 dias, más preferentemente 7 días, aún más preferentemente 5 días, todavía más preferentemente 3 días, lo más preferentemente 1 día antes de la administración del agente contra el cáncer o a partir de entonces. En otra modalidad, 10 más preferido es que la trombomodulina se administre 12 horas antes de la administración de un agente contra el cáncer o posterior a la misma. Por ejemplo, la trombomodulina y un esteroide para la profilaxis de un choque anafiláctico pueden administrarse simultáneamente, o pueden administrarse por separado, antes de la administración de un agente contra el cáncer. Además, la trombomodulina se puede administrar simultáneamente con, antes o después de la administración de un agente antiemético, agente antialérgico y/o agente antiinflamatorio, que por lo general se administra inmediatamente antes de la administración intravenosa de un agente contra el cáncer mediante infusión por goteo.

Cuando la trombomodulina se administra después de la administración de un agente contra el cáncer, el tiempo desde la administración del agente contra el cáncer hasta la administración de la trombomodulina no está particularmente limitado, siempre y cuando se pueda presentar el efecto del tratamiento terapéutico del dolor neuropático periférico. La trombomodulina se administra preferentemente 8 días, más preferentemente 6 dias, aún más preferentemente 4 dias, en particular preferentemente 2 dias, lo más preferentemente 6 horas, después de la administración del agente contra el cáncer o antes de la misma. En otra modalidad, lo más preferido es que la trombomodulina se administre 1 hora después de la administración de un agente contra el cáncer o antes de la misma.

El medicamento de esta modalidad puede contener un portador. Como portador utilizable en la presente invención, se prefiere un portador soluble en agua y por ejemplo, el medicamento de la presente invención se puede preparar mediante la adición de sacarosa, glicerina, modificador del pH que consiste de una sal inorgánica, o similares como aditivos. Además, pueden agregarse si es necesario, aminoácidos, sales, carbohidratos, surfactantes, albúmina, gelatina o similares, como se describe en las publicaciones de patentes japonesas no examinadas Nos. (Hei)1-6219 y (Hei)6-321805 y también es preferible agregar un conservador. Los ejemplos preferidos de conservadores incluyen ésteres de ácido parabenzoico y un ejemplo particularmente preferido es parabenzoato de metilo. La cantidad de conservador que se agrega es por lo general de 0.01 a 1.0% (en términos del % en peso, lo mismo se aplicará a las siguientes descripciones), preferentemente de 0.1 a 0.3%. El método para la adición de estos aditivos no está particularmente limitado. En el caso de preparar un producto liofilizado, los ejemplos del método incluyen, por ejemplo, un método de mezclar una solución que contiene un agente contra el cáncer y una solución que contiene la trombomodulina, luego agregar aditivos a la mezcla y un método de mezclar aditivos con un agente contra el cáncer, disuelto en agua, agua para inyección, o un amortiguador apropiado, de antemano, la adición de una solución que contiene trombomodulina a la mezcla, mezclar la mezcla resultante para preparar una solución y liofilizar la solución, de maneras tales como las empleadas comúnmente. Cuando el medicamento de la presente invención es un medicamento que comprende una combinación de componentes del medicamento, cada componente se prepara preferentemente mediante la adición de un portador de acuerdo con un método de preparación adecuado. El medicamento de esta modalidad se puede proporcionar en forma de una inyección, o en forma de una preparación liofilizada que se disuelve para su uso.

Ejemplos del método de preparación del medicamento incluyen un método de llenado de una solución que contiene de 0.05 a 15 mg/ml, preferentemente de 0.1 a 5 mg/ml, de trombomodulina y los aditivos antes mencionados en agua para inyección o un amortiguador apropiado, en una ampolleta o frasco en un volumen, por ejemplo, de 0.5 a 10 mi, congelar la solución y secar la solución bajo presión reducida. Tal solución, per se, puede prepararse como una preparación en solución acuosa para inyección.

El medicamento de la presente invención se administra deseablemente mediante la administración parenteral, tal como la administración intravenosa, administración intramuscular y administración subcutánea. El medicamento también se puede administrar por administración oral, administración intrarrectal, administración intranasal, administración sublingual o similares. Cuando el medicamento de la presente invención es un medicamento que comprende una combinación de varios ingredientes activos, cada ingrediente activo del medicamento se administra preferentemente por un método de administración, adecuado para el ingrediente.

Ejemplos de método para la administración intravenosa incluyen un método para administrar una dosis deseada del medicamento una sola vez y la administración intravenosa mediante infusión por goteo.

El método de administración de una dosis deseada del medicamento una sola vez (administración en bolo intravenoso) se prefiere desde el punto de vista que el método requiere sólo un tiempo corto para la administración. Cuando se administra el medicamento una sola vez, un periodo requerido para la administración mediante el uso de una jeringa inyectable, generalmente puede variar. En general, el periodo de tiempo requerido para la administración es, por ejemplo, 5 minutos o más corto, preferentemente 3 minutos o más corto, más preferentemente 2 minutos o más corto, todavía más preferentemente 1 minuto o más corto, en particular preferentemente 30 segundos o más corto, aunque depende del volumen que se va a administrar. Aunque el tiempo mínimo de administración no está particularmente limitado, el periodo es preferentemente de 1 segundo o más, más preferentemente 5 segundos o más, aún más preferentemente 10 segundos o más. La dosis no está particularmente limitada, siempre y cuando la dosis esté dentro de la dosis preferida antes mencionada. La administración intravenosa mediante infusión por goteo también se prefiere desde un punto de vista en que el nivel de sangre de la trombomodulina se puede mantener constante fácilmente.

Una dosis diaria del medicamento de la presente invención puede variar, dependiendo de la edad, el peso corporal de los pacientes, la gravedad de la enfermedad, la ruta de administración y similares. En general, la dosis máxima es preferentemente de 20 g/kg o menos, más preferentemente 10 mg/kg o menos, aún más preferentemente 5 mg/kg o menos, en particular preferentemente 2 mg/kg o menos y lo más preferentemente 1 mg/kg o menos y la dosis mínima es preferentemente de 0.001 mg/kg o más, más preferentemente de 0.005 mg/kg o más, aún más preferentemente de 0.01 mg/kg o más, en particular preferentemente de 0.02 mg/kg o más y lo más preferentemente de 0.05 mg/kg o más, en términos de la cantidad de trombomodulina.

En el caso de la administración en bolo intravenoso, aunque la dosis no está particularmente limitada, siempre y cuando la dosis esté dentro de la dosis preferida mencionada anteriormente, la dosis diaria máxima es preferentemente de 1 mg/kg o menos, más preferentemente 0.5 mg/kg o menos, todavía más preferentemente de 0.1 mg/kg o menos, en particular preferentemente 0.08 mg/kg o menos y lo más preferentemente 0.06 mg/kg o menos y la dosis mínima es preferentemente de 0.005 mg/kg o más, más preferentemente de 0.01 mg/kg o más, aún más preferentemente 0.02 mg/kg o más y en particular preferentemente de 0.04 mg/kg o más.

Cuando se administra el medicamento de la presente invención a ur.paciente que tiene un peso corporal superior a 100 kg, se puede administrar preferentemente a una dosis fija de 6 mg, ya que el volumen de sangre no es proporcional al peso corporal y el volumen de sangre es relativamente reducido con respecto al peso corporal en tal paciente.

En el caso de la infusión intravenosa continua, aunque la dosis no está particularmente limitada, siempre y cuando la dosis esté dentro de la dosis preferida mencionada anteriormente, la dosis diaria máxima es preferentemente de 1 mg/kg o menos, más preferentemente 0.5 mg/kg o menos, todavía más preferentemente de 0.1 mg/kg o menos, en particular preferentemente 0.08 mg/kg o menos y lo más preferentemente 0.06 mg/kg o menos y la dosis mínima es preferentemente de 0.005 mg/kg o más, más preferentemente de 0.01 mg/kg o más, aún más preferentemente 0.02 mg/kg o más y en particular preferentemente de 0.04 mg/kg o más.

El medicamento de esta modalidad no está particularmente limitado, siempre y cuando el efecto para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de un dolor neuropático periférico causado por un agente contra el cáncer pueda ser confirmado después de la administración de la trombomodulina y el efecto se confirme dentro de, por ejemplo, 24 horas, preferentemente 12 horas, más preferentemente 6 horas, aún más preferentemente 3 horas, en particular, preferentemente 1 hora, lo más preferentemente 30 minutos, después de la administración de la trombomodulina. Como se describió anteriormente, el medicamento de esta modalidad a veces puede ser caracterizado en que el efecto para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de un dolor neuropático periférico causado por un agente contra el cáncer, se puede confirmar en una etapa temprana.

El medicamento de esta modalidad se puede prescribir como una preparación para administración intermitente, o una preparación para la administración continua y se prescribe preferentemente como una preparación para la administración intermitente.

La administración intermitente significa administrar o liberar un medicamento al, o en el interior del cuerpo una vez o más veces, preferentemente dos o más veces, con un intervalo determinado de una manera discontinua. Por ejemplo, la administración intermitente puede realizarse mediante la administración una vez o dos veces al día y se prefiere la administración de una vez al día. Además, la administración intermitente puede realizarse mediante la administración diaria, o la administración de 1 a 3 dias en una semana, o la administración de 1 a 5 dias en una semana, se prefiere la administración de 1 día a la semana. En otra modalidad, puede ser preferible la administración de 5 días en una semana. En aún otra modalidad, puede ser preferible la administración diaria.

Además, la administración intermitente puede realizarse mediante la administración de una vez al día, una vez a la semana, 3 veces a la semana, 5 veces a la semana, o una vez cada dos semanas y se prefiere la administración de una vez a la semana. En otra modalidad, puede ser preferible la administración de 5 veces a la semana. En aún otra modalidad, puede ser preferible la administración diaria. Además, la administración de una vez en dos semanas puede ser preferida, como pueda ser el caso.

La administración continua significa un método de administración en el que un medicamento se libera continuamente en el interior del cuerpo durante un determinado período de tiempo, por ejemplo, al menos 5 minutos o más. Siempre y cuando se realice mediante la administración sistémica o la administración local a un tejido periférico, la ruta de administración no está limitada. Ejemplos de administración o medios de administración incluyen la administración mediante el uso de instrumentos tales como una bomba de infusión o bomba de transfusión, la administración manual, preparaciones de liberación sostenida utilizando un polímero degradable en los cuerpos vivos, como un portador y similares.

El paciente al que se administra el medicamento de esta modalidad no está particularmente limitado, siempre y cuando al paciente se le administre un agente contra el cáncer y los ejemplos específicos incluyen pacientes con cáncer. Ejemplos de los pacientes con cáncer incluyen pacientes que sufren de uno o más tipos de cánceres seleccionados entre el grupo que consiste de, por ejemplo, cáncer de ovario, cáncer de células no pequeñas, cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer de endometrio, cáncer de cabeza y cuello, carcinoma de esófago, leucemia, linfoma maligno, tumor pediátrico, mieloma múltiple, astrocitoa maligno, neuroglioma, enfermedad trofoblástica, tumor de células germinales, cáncer de pulmón, orquionco, cáncer vesical, tumor pélvico renal, uretrofima, cáncer de próstata, carcinoma de cuello uterino, neuroblastoma, cáncer de pulmón de células pequeñas, osteosarcoma, el mesotelioma pleural maligno, osteonco maligno y cáncer de colon.

El medicamento de esta modalidad se puede administrar junto con uno o más tipos de otros medicamentos, utilizados para el tratamiento de neuropatías periféricas causadas por agentes contra el cáncer, por ejemplo, uno o dos o más tipos de medicamentos seleccionados entre esteroides, antidepresivos, antiepilépticos, opioides y similares, o se puede preparar como una mezcla con tales uno o dos o más tipos de medicamentos como se mencionó anteriormente y administrarse. Además, la trombomodulina se puede administrar con la realización de fisioterapia, terapias complementarias tales como el masaje y la acupuntura y similares.

Además, la presente invención también proporciona un medicamento para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de un dolor neuropático periférico causado por un agente contra el cáncer, que se administra junto con un agente contra el cáncer y contiene trombomodulina como un ingrediente activo. Ejemplos de trombomodulina utilizada en esta modalidad incluyen los ejemplos preferidos antes mencionados de la trombomodulina soluble. Además, los ejemplos del agente contra el cáncer utilizado en esta modalidad incluyen los ejemplos preferidos antes mencionados del agente contra el cáncer. Además, los ejemplos indicados del dolor neuropático periférico en esta modalidad, incluyen los ejemplos preferidos antes mencionados de dolor neuropático periférico.

La presente invención proporciona además un medicamento para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de un dolor neuropático periférico causado por un agente contra el cáncer, que comprende trombomodulina y un agente contra el cáncer, como ingredientes activos.

Además, un método para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de un dolor neuropático periférico causado por un agente contra el cáncer, que comprende el paso de administrar trombomodulina a un mamífero, también se encuentra dentro del alcance de la presente invención.

Además, el uso de la trombomodulina para la fabricación de un medicamento para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de un dolor neuropático periférico causado por un agente contra el cáncer, también se encuentra dentro del alcance de la presente invención.

Ejemplos La presente invención se explicará en detalle con referencia a ejemplos y ejemplos de prueba. Sin embargo, la presente invención no está limitada por estos ejemplos en absoluto.

Explicación del listado de secuencias SEQ ID NO: 1: secuencia de aminoácidos codificada por el gen utilizado en la producción de TME456.

SEQ ID NO: 2: secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO: 3: secuencia de aminoácidos codificada por el gen utilizado en la producción de TME456M.

SEQ ID NO: 4: secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3.

SEQ ID NO: 5: secuencia de aminoácidos codificada por el gen utilizado en la producción de TMD12.

SEQ ID NO: 6: secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5.

SEQ ID NO: 7: secuencia de aminoácidos codificada por el gen utilizado en la producción de TMD12M.

SEQ ID NO: 8: secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7.

SEQ ID NO: 9: secuencia de aminoácidos codificada por el gen utilizado en la producción de TMD123.

SEQ ID NO: 10: secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9.

SEQ ID NO: 11: secuencia de aminoácidos codificada por el gen utilizado en la producción de TMD123M.

SEQ ID NO: 12: secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11.

SEQ ID NO: 13: ADN sintético para la mutación, utilizado para llevar a cabo la mutagénesis dirigida al sitio.

La trombomodulina de la presente invención, utilizada en los ejemplos de prueba se preparó de acuerdo con el método mencionado anteriormente de Yamamoto et al. (método descrito en la publicación de patente japonesa no examinada No. 64-6219). Ejemplos de preparación de los mismos se describen a continuación. La seguridad de las trobomodulinas obtenidas en estos ejemplos de preparación fue confirmada por pruebas de administración intravenosa únicas y repetitivas, utilizando ratas y monos, prueba de reproducción en ratón, prueba de irritación local, prueba de seguridad farmacológica, prueba de inactivación de virus y similares.

Ejemplo de preparación 1 Obtención de trombomodulina Un producto altamente purificado se obtuvo por el método anteriormente mencionado. Específicamente, células de ovario de hámster chino (CHO) se transíectaron con un ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 (que consistía específicamente de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 10). Desde el cultivo de las células transformantes anteriores, se obtuvo un producto altamente purificado, al recoger una fracción activa con 20 rrmol/1 de amortiguador de fosfato (pH 7.3) que contenía 50 m ol/1 de NaCl de acuerdo con el método de purificación convencional antes mencionado. El producto se concentró adicionalmente por ultrafiltración, para obtener una solución de trombomodulina que tenia una concentración de 11.2 mg/ml (en adelante, también abreviada como TMD123 en la especificación).

Preparación de solución aditiva Clorhidrato de arginina (480 g, Ajinomoto) se pesó, se puso en un recipiente de acero inoxidable de 101 de volumen, se agregó agua para inyección (5 1) y se disolvió. La solución se ajustó a pH 7.3 mediante la adición de 1 mol/1 de una solución de hidróxido de sodio.

Preparación y llenado de solución de fármaco El volumen total de la solución de aditivo, obtenida anteriormente, se puso en un recipiente de acero inoxidable de 20 1 y se agregó la solución de TMD123 obtenida anteriormente (2.398 mi, correspondiente a 26.88 g de la proteina trombomodulina soluble, agregada en una cantidad en exceso del 12%) y la mezcla se agitó. A la mezcla se agregó agua para inyección, para obtener un volumen total de 121 y la mezcla se hizo uniforme mediante agitación. Esta solución de fármaco se sometió a esterilización por filtración, usando un filtro con un diámetro de poro de 0.22 Opm (MCGL10S, fabricado por Millipore). El filtrado se llenó en frascos en un volumen de 1 mi cada uno y los frascos se cerraron a la mitad con tapones de caucho.

Liofilización Una etapa de liofilización se realizó bajo las condiciones siguientes en el orden de liofilización llenado de nitrógeno cierre completo con tapón de caucho atornillar la tapa para obtener una preparación que contiene TMD123, que contiene 2 g de trobomodulina soluble y 40 mg de clorhidrato de arginina en un frasco.

Condiciones de liofilización Enfriamiento preliminar (desde temperatura ambiente hasta 15°C durante 15 minutos) enfriamiento principal (de 15°C a -45°C durante 2 horas) retención (-45°C durante 2 horas) - inicio de vacio (-45°C durante 18 horas) - aumento de la temperatura (de -45°C a 25°C durante 20 horas) -> retención (25°C durante 15 horas) aumento de la temperatura (de 25°C a 45°C durante 1 hora) retención (45°C durante 5 horas) a temperatura ambiente (de 45°C a 25°C durante 2 horas) recuperación de la presión y llenado de nitrógeno (hasta 100 mHg) cierre completo con tapón roscado de tapa Ejemplo de preparación 2 Células de ovario de hámster chino (CHO) se transíectaron con un ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11 (que consiste específicamente de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 12), se obtiene una solución de trombomodulina purificada a partir de un cultivo de las anteriores células transformantes (de ahora en adelante también abreviada como TMD123M en la especificación) por el método de purificación convencional antes mencionado y se obtiene una preparación liofilizada de TMD123M de la misma manera que la descrita anteriormente.

Ejemplo de preparación 3 Células de ovario de hámster chino (CHO) se transíectaron con un ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 (que consiste específicamente de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2), se obtiene trombomodulina purificada a partir de un cultivo de las células transformantes anteriores (de ahora en adelante también abreviada como TME456 en la especificación) por el método de purificación convencional antes mencionado y se obtiene una preparación liofilizada de TME456 de la misma manera que la descrita anteriormente.

Ejemplo de preparación 4 Células de ovario de hámster chino (CHO) se transíectaron con un ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 (que consiste específicamente de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 4), se obtiene trombomodulina purificada a partir de un cultivo de las células transformantes anteriores (de ahora en adelante también abreviada como TME456M en la especificación) por el método de purificación convencional antes mencionado y se obtiene una preparación liofilizada de TME456M de la misma manera que la descrita anteriormente.

Ejemplo de preparación 5 Células de ovario de hámster chino (CHO) se transfectaron con un ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 (que consiste específicamente de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 6), se obtiene trombomodulina purificada a partir de un cultivo de las células transformantes anteriores (de ahora en adelante también abreviada como TMD12 en la especificación) por el método de purificación convencional antes mencionado y se obtiene una preparación liofilizada de TMD12 de la misma manera que la descrita anteriormente.

Ejemplo de preparación 6 Células de ovario de hámster chino (CHO) se transfectaron con un ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 (que consiste específicamente de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 8), se obtiene trombomodulina purificada a partir de un cultivo de las células transformantes anteriores (de ahora en adelante también abreviada como TMD12M en la especificación) por el método de purificación convencional antes mencionado y se obtiene una preparación liofilizada de TMD12M de la misma manera que la descrita anteriormente.

Ejemplo de prueba 1 Acción sobre alodinia en, ratón inducida por paclitaxel Con el fin de confirmar el efecto de la trobomodulina sobre la alodinia causada por un agente contra el cánoer, se investigó la acción de la trombomodulina sobre la alodinia causada por un estimulo mecánico generado cuando un agente contra el cáncer, paclitaxel, es administrado a un ratón. TMD123 como un fármaco de prueba se administró intraperitonealmente a ratones y se realizó la siguiente prueba. (1) Preparación de modelo de alodinia inducida por la administración de paclitaxel en ratones Como animales experimentales, se utilizaron ratones macho de 4 a 5 semanas de edad ddY (de 20 a 30 g) y a los ratones se les administró intraperitonealmente 4 mg/kg de paclitaxel (en adelante, también abreviado como PTX). La administración se realizó 4 veces en total cada dos días (días 0, 2, 4 y 6). A los ratones del grupo control, se les administró de manera similar 0.5 i del solvente de PTX, es decir, una solución mixta 1:1 de Cremophor EL y etanol, diluida hasta 1.5 i con solución salina fisiológica.

Como el paclitaxel, se utilizó el Paclitaxel (100 mg, LKT Laboratories, Inc.). (2) Administración de fármaco de prueba En el experimento para evaluar el efecto profiláctico, los animales experimentales consistieron de 5 grupos, es decir, un grupo control, un grupo de administración de PTX y los grupos de administración de PTX y 0.1, 1, o 10 mg/kg de trobomodulina (grupos de administración de PTX + TM). En el experimento para evaluar el efecto terapéutico, los animales experimentales consistieron de dos grupos, es decir, un grupo de administración de PTX y un grupo de administración de PTX y 10 mg/kg de trombomodulina (grupo de administración de PTX + TM). En el experimento de tratamiento profiláctico, TMD123, que es la trombomodulina, se administró intraperitonealmente a los ratones del grupo de administración de PTX + TM una vez al día durante 7 días, desde el día del inicio de la administración de PTX. Además, en el experimento de tratamiento terapéutico, TMD123 se administró intraperitonealmente una sola vez 8 o 9 días después del inicio del final de la administración de PTX. -a los ratones del grupo control y el grupo de administración de PTX, el solvente de TMD123 se administró de manera similar. (3) Análisis estadístico El análisis estadístico de los resultados se realizó utilizando la prueba de Wilcoxon para la comparación de dos grupos y la prueba de Kruskal-Wallis H y la prueba de tipo LSD (diferencia menos significativa) para la comparación de tres o más grupos y se determinó una tasa crítica del 5% o menor para indicar la presencia de diferencias significativas. Los significados de los símbolos utilizados en las gráficas son los siguientes. *, ** y ***: Comparación de los valores medidos para el grupo control y el grupo de administración de PTX, los símbolos representan p < 0.05, p < 0.01 y p < 0.001, respectivamente. † y †††: Comparación de los valores medidos para el grupo de administración de PTX y el grupo de administración de PTX y el fármaco de prueba, los símbolos representan p < 0.05 y p < 0.001, respectivamente. (4) Prueba de Von Frcy Los valores del umbral de dolor de los ratones mencionados anteriormente se midieron por el método arriba-abajo usando filamentos de von Frey. Específicamente, se utilizaron los filamentos de von Frey para las potencias de 0.008, 0.02, 0.04, 0.07, 0.16, 0.4, 0,6 y 1.0 g para las plantas de las patas traseras, estimuladas continuamente de los ratones durante 6 segundos y se observaron las reacciones de los ratones, tales como la elevación, temblores y lamerse las patas estimuladas. El estímulo se inició con una potencia más pequeña y cuando no se observó ninguna reacción, la estimulación se dio de nuevo a una potencia de un rango superior. Cuando se observó una reacción, la estimulación se dio a una potencia de rango inferior después de un intervalo de 30 segundos o más. El estimulante se repitió 5 veces a partir de la primera reacción, después de comenzar la estimulación y se determinó la potencia del filamento a la que el 50% de los ratones mostraron reacciones, como el valor de umbral nociceptivo.

El valor de umbral de base se midió antes de la administración de PTX y luego se midió el valor de umbral del dolor en el día de la administración de PTX y el día 8 o 9 después del inicio de la administración para el seguimiento. En el experimento de tratamiento terapéutico, en el día 8 o posteriormente, se confirmó una reducción suficiente del valor de umbral de dolor y luego se realizó la prueba de medición.

Como los resultados de la prueba antes mencionada (método arriba-abajo usando filamentos de von Frcy), los resultados de la administración profiláctica de TMD123 se muestran en la figura 1 y los resultados de la administración terapéutica de TMD123 se muestran en la figura 2. El valor de umbral del dolor (Umbral) disminuyó significativamente en el grupo de administración de PTX, en comparación con el grupo control, mientras que tal disminución del valor de umbral observado en el grupo de administración de PTX se suprimió significativamente en el grupo de administración profiláctica de PTX + TM. Además, en el grupo de administración terapéutica de PTX + TM, el valor de umbral, que se redujo por la administración de PTX, se aumentó significativamente de 30 minutos después de la administración y se mantuvo durante 3 horas o más después de la administración.

Con base en los resultados anteriores, se reveló que la trombomodulina tiene efecto profiláctico y/o terapéutico contra la alodinia mecánica inducida por PTX, con propiedad de acción rápida y sostenibilidad superiores.

Ejemplo de prueba 2 - Prueba de estimulación con frió 1 (prueba de placa fría) Mediante la observación de la alodinia inducida por estimulación con frío, de acuerdo con el método mostrado a continuación, se puede verificar el efecto de la presente invención en un dolor neuropático periférico causado por un agente contra el cáncer. (1) Preparación de modelo de alodinia inducida por la administración de paclitaxel en ratas Como animales experimentales, se utilizan ratas macho SD de 5 semanas de edad (de 150 a 200 g) y se administra intraperitonealmente a las ratas 4 mg/kg de PTX. La administración se lleva a cabo 4 veces en total cada dos dias (dias 0, 2, 4 y 6). Al grupo de ratas control, se administró de manera similar 0.5 i del solvente de PTX, es decir, una solución mixta 1:1 de Cremophor EL y etanol, diluida hasta 1.5 mi con solución salina fisiológica. (2) Administración de fármaco de prueba Los animales experimentales consisten de tres grupos, es decir, un grupo control, un grupo de administración de PTX y un grupo de administración de PTX y trombomodulina (grupo de administración de PTX + TM). A las ratas del grupo de administración de PTX + TM, se les administra intraperitonealmente TMD123, que es la trombomodulina, una vez al día durante 7 dias (10 mg/kg) desde el dia del inicio de la administración de PTX como la administración profiláctica y se les administra intraperitonealmente una sola vez (10 mg/kg) al dia siguiente de la administración final de PTX como la administración terapéutica. A las ratas del grupo control y el grupo de administración de PTX, se administró de manera similar el solvente de TMD123. (3) Prueba de placa fría Por la medición de tiempos latentes para las acciones evasivas después de que se dan estímulos 5 veces alternadamente a las plantas de las patas traseras derecha e izquierda de las ratas de los mencionados 5 grupos, usando una punta de una parte de estimulación fría de un dispositivo de análisis de valor de umbral de detección de frío, que se controla para estar a 8°C, para observar la alodinia inducida por estimulación con frío, se puede confirmar el efecto de la presente invención sobre el dolor neuropático periférico causado por un agente contra el cáncer. El tiempo de corte es, por ejemplo, 15 segundos. La prueba de medición se puede realizar en los tiempos 5 horas antes de la administración de PTX, 1 hora después de la administración de PTX, 2, 3, 5, 7, 9 y 11 días después de la administración de PTX, 15 días después de la administración de PTX y antes de la administración del fármaco de prueba, 15 días después de la administración de PTX y 6 horas después de la administración del fármaco de prueba, 17 y 19 días después de la administración de PTX y antes de la administración del fármaco de prueba, 22 días después de la administración de PTX y después de 3 días del período de la suspensión del fármaco, 26 días después de la administración de PTX y después de 7 días del periodo de la suspensión del fármaco y 29 días después de la administración de PTX y después de 10 días del periodo de la suspensión del fármaco.

Las condiciones experimentales se pueden cambiar apropiadamente.

Ejemplo de prueba 3 - prueba de estimulación con frío 2 Mediante el uso de ratas a las que se les administra PTX de la misma manera que en el Ejemplo de prueba 2 y la observación de la alodinia inducida por estimulación con frío, de acuerdo con el método descrito a continuación, también se puede confirmar el efecto de la presente invención sobre el dolor neuropático periférico causado por un agente contra el cáncer.

Las ratas se ponen en una jaula que tiene un fondo de tela metálica y se aclimatan durante 1 hora y luego se rocía 0.05 mi de acetona sobre las patas traseras durante 5 segundos, mediante el uso de MicroSprayer (PENN-Century) para dar estimulación con frío mediante la utilización de la acción de enfriamiento, generada en el momento de la vaporización de acetona. Se observan reacciones de evitación de las ratas durante 40 segundos desde el inicio del rocío y se registran los tiempos hasta que reaccionan (tiempos latentes). La prueba se lleva a cabo 3 veces para cada una de las patas derecha e izquierda y se calcula el promedio. La medición se puede realizar en los tiempos 5 horas antes de la administración de PTX, 1 hora después de la administración de PTX, 2, 3, 5, 7, 9 y 11 días después de la administración de PTX, 15 días después de la administración de PTX y antes de la administración del fármaco de prueba, 15 días después de la administración de PTX y 6 horas después de la administración del fármaco de prueba, 17 y 19 días después de la administración de PTX y antes de la administración del fármaco de prueba, 22 días después de la administración de PTX y después de 3 días del periodo de suspensión del fármaco, 26 días después de la administración de PTX y después de 7 días del periodo de suspensión del fármaco y 29 días después de la administración de PTX y después de 10 días del periodo de suspensión del fármaco.

Las condiciones experimentales se pueden cambiar apropiadamente.

Ejemplo de prueba 4 - Acción sobre la alodinia inducida por oxaliplatino en ratas De la misma manera que en los ejemplos de prueba 1 a 3, la prueba de von Frcy y la prueba de estimulación con frío se llevan a cabo con la administración de oxaliplatino mediante el uso de ratas. El efecto de la presente invención sobre el dolor neuropático periférico causado por un agente contra el cáncer puede ser confirmado por estos ejemplos de prueba.

Ejemplo de prueba 5 - Desnaturalización in vitro de células nerviosas Por el método siguiente, se puede confirmar el efecto de la acción de alivio de la neuropatía periférica, de la presente invención.

Con el fin de examinar la acción en la desnaturalización de células nerviosas, inducida por un tratamiento con paclitaxel, se usan células de feocromocitoma de rata de glándula suprarrenal 12 (PC12) y células de los ganglios de la raíz dorsal (DRG), que son lineas celulares modelo de diferenciación nerviosa y extensión de neuritas. (1) Cultivo de células Las células PC12 se cultivan a 37°C en una incubadora de CO2 al 5%, utilizando el medio RPMI1640 (MP Biomedicals) que contiene 5% de suero bovino fetal, 10% de suero de caballo y 100 unidades/ml de penicilina/estreptomicina (Gibco BRL). Las células DRG se extraen de una rata macho SD y se cultivan como cultivo primario y luego 5 nodos de DRG de L4 y L5 se trataron con colagenasa tipo I (Funakoshi) y dispasa I (Sanko Junyaku), se inocularon en una placa de 24 pozos y después se cultivaron. El cultivo se realizó a 37°C en una incubadora de C02 al 5%, utilizando el medio Eagle modificado de Dulbecco (medio DMEM, MP Biomedical) que contiene 10% de suero fetal bovino y 100 unidades/ml de penicilina/estreptomicina. (2) Tratamiento farmacológico y medición de la longitudde las neuritas Las células PC12 se inoculan en una placa de 24 pozos a una densidad de 10,000 células/pozo, a continuación, después de 3 horas, las células se tratan con 0.01 inmol/I de Fos-colina para permitir la extensión de las neuritas y después de 24 horas, las células se tratan con una solución de prueba. Las células DRG se cultivan durante una semana y después de confirmar la adhesión celular y la extensión de las neuritas, se tratan con una solución de prueba. Como la solución de prueba, sólo se agrega 10 ng/ml de una solución de paclitaxel, o se agrega 10 ng/ml de una solución de paclitaxel y un fármaco de prueba (10 ng/ml a 0.1 mg/ml). Después de 24 y 96 horas desde el tratamiento con una solución de prueba, se cambia el medio por un medio fresco que contiene el fármaco de prueba y después de 168 horas, sólo las células muertas se tiñen con una solución de tinción con azul de tripano, las células se fotografían con un microscopio óptico (amplificación, 200 veces; 3 vistas/pozo). Después de la toma de fotografías, se miden las longitudes de las neuritas de células vivas con el software de análisis Image J.

Las condiciones experimentales se pueden cambiar apropiadamente.

Ejemplo de prueba 6 - Acción sobre la alodínia inducida por paclitaxel en ratas De la misma manera que en el Ejemplo de prueba 1, la acción de la trombomodulina sobre la alodinia inducida por estimulación mecánica generada cuando el agente contra el cáncer, paclitaxel, se administró a ratas, se investigó por el método descrito a continuación. TMD123 como el fármaco de prueba se administró intraperitonealmente a ratas y se realizó la siguiente prueba. (1) Preparación de modelo de alodinia inducida por la administración de paclitaxel en ratas Como animales experimentales, se utilizaron ratas macho Wistar de 5 a 6 semanas de edad (de 200 a 250 g) y 2 mg/kg de PTX se administró intraperitonealmente a las ratas. La administración se realizó 4 veces en total cada dos dias (dias 0, 2, 4 y 6). Al grupo de ratas control, se administró de manera similar 0.5 mi del solvente de PTX, es decir, una solución mixta 1:1 de Cremophor EL y etanol, diluida a 1.5 mi con solución salina fisiológica. (2) Administración de fármaco de prueba En el experimento para evaluar el efecto profiláctico usando las ratas, los animales experimentales consistieron de tres grupos, es decir, un grupo control, un grupo de administración de PTX y un grupo de administración de PTX y 10 mg/kg trombomodulina (grupo de administración de PTX + TM). Como la administración profiláctica, TMD123, que es la trombomodulina, se administró intraperitonealmente a las ratas una vez al día durante 7 días (10 mg/kg) desde el día del inicio de la administración de PTX. (3) Análisis estadístico El análisis estadístico de los resultados se realizó mediante el uso de la prueba de Kruskal-Wallis H y la prueba de tipo LSD (diferencia menos significativa) y se determinó una tasa crítica del 5% o menor para indicar la presencia de diferencias significativas. Los significados de los símbolos utilizados en las gráficas son los siguientes. * y **: Comparación de los valores medidos para el grupo control y el grupo de administración de PTX, los símbolos representan p < 0.05 y p < 0.01 respectivamente. † y ††: Comparación de los valores medidos para el grupo de administración de PTX y el grupo de administración de PTX y el fármaco de prueba, los símbolos representan p < 0.05 y p < 0.01, respectivamente. (4) Prueba de Randall-Selitto Las ratas antes mencionadas fueron sometidas a una medición basada en la prueba de presión de la pata, descrita en Randall LO. et al., Arch. Int. Pharacodyn. Ther., 1957, 111, 409-419 (prueba de Randall-Selitto). Específicamente, la pata trasera derecha se presurizó gradualmente cada vez más cen un analizador de efecto analgésico con estimulación por presión y se determinó la presión a la que cada rata mostró una reacción de fonación anormal o reacción de escape, como el valor de umbral del dolor., Los resultados de la prueba para la administración profiláctica de TMD123 utilizando ratas se muestran en la figura 3. Mientras que el valor de umbral del dolor (Umbral) se redujo significativamente en el grupo de administración de PTX en comparación con el grupo control, tal disminución del valor de umbral, observada en el grupo de administración de PTX se suprimió significativamente en el grupo de administración de PTX + TM. Además, en la prueba utilizando ratas, la disminución del valor de umbral, observada en el grupo de administración de PTX se suprimió significativamente en el grupo de administración de PTX + TM en más de 28 dias.

Con base en los resultados anteriores, se reveló que la trombomodulina muestra un efecto profiláctico contra la alodinia mecánica inducida por PTX, con propiedad de acción rápida y sostenibilidad superiores.

Ejemplo de prueba 7 - Efecto profiláctico sobre el dolor neuropático periférico causado por un agente contra el cáncer en humanos Por ejemplo, cuando la quimioterapia de 12 cursos, cada uno de las cuales consiste de dos semanas, se realizan con F0LF0X6, F0LF0X6, o similares para un paciente con un tumor maligno tal como cáncer de colon, se administra al paciente TMD123 (por ejemplo, Recomodulin (marca registrada), Asahi Kasei Pharma Corporation) inmediatamente antes, durante, o inmediatamente después de la administración del agente contra el cáncer en cada curso.

Después de la terminación de la quimioterapia, mediante la investigación de tasa de abandono de la quimioterapia, la tasa de incidencia de dolor neuropático periférico, la calidad de vida, el cambio de los datos de laboratorio del estudio de coagulación, el efecto sobre el tumor y similares, se puede confirmar el efecto profiláctico de la presente invención sobre el dolor neuropático periférico causado por un agente contra el cáncer en humanos.

El tipo del agente contra el cáncer, las dosis del agente contra el cáncer y TMD123, el tiempo de administración, la duración del curso, el número del curso y similares puede ser cambiado apropiadamente con base en los conocimientos téenicos comunes.

Aplicabilidad Industrial El medicamento de la presente invención es extremadamente eficaz para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de un dolor neuropático periférico causado por un agente contra el cáncer y puede mejorar significativamente la calidad de vida de los pacientes, que es marcadamente degradada por un dolor neuropático periférico causado por un tratamiento con un agente contra el cáncer. Por lo tanto, el medicamento de la presente invención es útil en el campo de la industria farmacéutica.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Medicamento para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de un dolor neuropático periférico inducido por quimioterapia, que comprende la trombomodulina como un ingrediente activo.

2. Medicamento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la trombomodulina es una trombomodulina soluble.

3. Medicamento de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque la trombomodulina es una trombomodulina humana.

4. Medicamento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el dolor neuropático periférico es uno o más tipos de síntomas seleccionados entre entumecimiento de las extremidades, dolor de las extremidades, reducción de la reflexión profunda de tendones, reducción de la fuerza muscular, alodinia, hiperalgesia y disfunción motora.

5. Medicamento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el dolor neuropático periférico es la alodinia.

6. Medicamento de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la alodinia es la alodinia mecánica.

7. Medicamento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el agente contra el cáncer en quimioterapia consiste de uno o más tipos de agentes seleccionados entre el grupo que consiste de un fármaco de taxano y una preparación de platino.

8. Medicamento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el agente contra el cáncer en quimioterapia es paclitaxel.

9. Medicamento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el agente contra el cáncer en quimioterapia se administra de acuerdo a la terapia FOLFOX o la terapia FOLFIRI.

10. Medicamento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la trombomodulina se administra intermitentemente.

11. Medicamento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque se administra a un paciente que sufre de cáncer, de uno o más tipos de cánceres seleccionados entre el grupo que consiste de cáncer de ovario, cáncer de células no pequeñas, cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer de endometrio, cáncer de cabeza y cuello, carcinoma de esófago, leucemia, linfoa maligno, tumor pediátrico, mieloma múltiple, astrocitoma maligno, neuroglioa, enfermedad trofoblástica, tumor de células germinales, cáncer de pulmón, orquionco, cáncer vesical, tumor pélvico renal, uretrofima, cáncer de próstata, carcinoma de cuello uterino, neuroblastoma, cáncer de pulmón de células pequeñas, osteosarcoma, esotelioma pleural maligno, osteonco maligno y cáncer de colon.

12. Medicamento para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de un dolor neuropático periférico inducido por quimioterapia, caracterizado porque se administra junto con el agente contra el cáncer y comprende la trombomodulina como un ingrediente activo.

13. Medicamento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque la trombomodulina es un péptido que se puede obtener a partir de una célula transformada, preparada por transfección de una célula hospedera con un ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos de los incisos (i—1) o (i-2) que se mencionan a continuación y el péptido es un péptido que tiene las actividades de trombomodulina; (i—1) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 u 11, o (i-2) la secuencia de aminoácidos del inciso (i-1) mencionado anteriormente, que incluye además la sustitución, supresión o adición de uno o más residuos de aminoácidos.

14. Medicamento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque la trombomodulina es un péptido que contiene la secuencia de aminoácidos del inciso (i—1) o (i—2) que se mencionan a continuación y el péptido es un péptido que tiene las actividades de trombomodulina; (i—1) la secuencia de aminoácidos de las posiciones 19 a 516 en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 u 11, o (i—2) la secuencia de aminoácidos del inciso (i-1) mencionado anteriormente, que incluye además la sustitución, supresión o adición de uno o más residuos de aminoácidos.

15. Uso de trombomodulina para la fabricación de un medicamento para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de un dolor neuropático periférico inducido por quimioterapia.