MX2014014412A - Composiciones y metodos relacionados con la prevencion y el tratamiento de infecciones por rabia. - Google Patents

Composiciones y metodos relacionados con la prevencion y el tratamiento de infecciones por rabia.

Info

Publication number
MX2014014412A
MX2014014412A MX2014014412A MX2014014412A MX2014014412A MX 2014014412 A MX2014014412 A MX 2014014412A MX 2014014412 A MX2014014412 A MX 2014014412A MX 2014014412 A MX2014014412 A MX 2014014412A MX 2014014412 A MX2014014412 A MX 2014014412A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
seq
antibody
rabies
antibodies
cdr
Prior art date
Application number
MX2014014412A
Other languages
English (en)
Other versions
MX369626B (es
Inventor
Enyun Shen
Shiqi Ren
Original Assignee
Mountgate Group Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mountgate Group Ltd filed Critical Mountgate Group Ltd
Publication of MX2014014412A publication Critical patent/MX2014014412A/es
Publication of MX369626B publication Critical patent/MX369626B/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/145—Rhabdoviridae, e.g. rabies virus, Duvenhage virus, Mokola virus or vesicular stomatitis virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host

Abstract

La presente descripción se refiere generalmente a anticuerpos contra la rabia que pueden unir y neutralizar el virus de la rabia. Los anticuerpos de la tecnología son útiles solos o en combinación con terapias conocidas en la técnica para el tratamiento o prevención de la infección de rabia.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS RELACIONADOS CON LA PREVENCIÓN Y EL TRATAMIENTO DE INFECCIONES POR RABIA CAMPO TÉCNICO Esta teenología se refiere generalmente a la preparación de anticuerpos contra la rabia y a los usos de los mismos. En particular, la tecnología actual se refiere a la preparación de anticuerpos neutralizantes del virus de la rabia y su uso en la prevención y el tratamiento de la infección por rabia.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La siguiente descripción se proporciona para ayudar a la comprensión del lector. No se admite que nada de la información proporcionada o las referencias citadas sea parte del estado de la técnica para los métodos de la presente.
La rabia es una infección viral con distribución casi mundial que afecta a los animales salvajes y domésticos principalmente, pero también afecta a los seres humanos. La infección provoca una devastadora encefalitis y, si no es tratada, casi invariablemente fatal. Más de 70,000 personas mueren cada año por infecciones de la rabia, y millones más requieren tratamiento post-exposición.
El virus de la rabia es un virus ARN de cadena sencilla de la familia Rhabdovirus y género Lyssavirus. El genoma del virus de la rabia codifica cinco proteínas: ARN polimerasa dependiente de ARN (L); una nucleoproteína (N); una proteína fosforilada (P); una proteína de la matriz (M) situada en la parte interior de la envolvente de la proteína viral; y una glicoproteína de superficie externa (G). La proteína G (62-67 kDa) es una glicoproteína tipo-I compuesta por 505 aminoácidos, con dos a cuatro sitios potenciales de N-glicosilación, de los cuales sólo uno o dos están glicosilados, dependiendo de la cepa viral. La proteína G forma protuberancias que cubren la superficie externa de la envoltura del virión y se sabe que induce la producción de anticuerpos neutralizantes de virus (ver Gaudin et al., 1999).
La infección por rabia puede ser tratada o prevenida por vacunas tanto pasivas como activas. La profilaxis post exposición de la rabia (PEP) incluye la pronta atención de la herida local y la administración de inmunizaciones activas (vacunas) y pasivas (inmunoglobulinas antirrábicas). En la actualidad, las inmunoglobulinas antirrábicas (RIG) son preparadas a partir del suero de sujetos humanos (HRIG) o equinos (ERIG). Sin embargo, el uso de inmunoglobulinas de estas fuentes plantea varias dificultades, incluyendo la transmisión de la enfermedad, el costo y en el caso de la inmunoglobulina equina, reacciones adversas tales como shock anafiláctico. Para superar estos inconvenientes, se ha sugerido utilizar anticuerpos monoclonales capaces de neutralizar el virus de la rabia en la profilaxis postexposición.
Los anticuerpos monoclonales murinos neutralizantes del virus de la rabia son conocidos en la materia (ver Schumacher et al., 1989). Sin embargo, el uso de anticuerpos murinos in vivo es limitado debido a los problemas asociados con la administración de anticuerpos murinos a los seres humanos, tales como suero de vida media corta, una incapacidad para activar determinadas funciones efectoras humanas y la estimulación de una respuesta inmune indeseada dramática contra el anticuerpo murino en un ser humano (la reacción "anticuerpo humano anti-ratón" (HAMA)). En la actualidad, hay una necesidad de nuevos anticuerpos monoclonales neutralizantes del virus de la rabia humana con potencial mejorado profiláctico posterior a la exposición. Es ventajoso que los anticuerpos administrados conjuntamente con vacunas contra la rabia no interfieran con la antigenicidad de la vacuna, reduciendo así su eficacia.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La teenología actual se relaciona generalmente con los anticuerpos que neutralizan el virus de la rabia que se unen a la glicoproteína del virus de la rabia. Una ventaja de estos anticuerpos es que tienen la capacidad para reducir la infectividad del virus de la rabia, pero no interfieren con la eficacia de una vacuna contra la rabia. Los anticuerpos neutralizantes de la rabia actualmente disponibles simultáneamente inhiben la eficacia de la vacunación cuando neutralizan los virus. Por lo tanto, la dosis de los anticuerpos convencionales debe ser limitada, lo que a su vez sólo proporciona una protección mínima durante la primera semana de la infección. Por el contrario, los anticuerpos descritos en la presente superan este problema al exhibir actividad neutralizante superior sin interferir con la eficacia de la vacunación. Por lo tanto, los anticuerpos pueden utilizarse en combinación con una vacuna de la rabia para proporcionar un tratamiento para la infección aguda así como una inmunidad duradera.
En un aspecto, la teenología actual ofrece un anticuerpo aislado que se une a la glicoproteína de virus de la rabia en el cual el anticuerpo que comprende una o más secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR seleccionadas del grupo formado por DYIML (SEQ ID NO: 56), DIYPYYGSTSYNLKFKG (SEQ ID NO: 57), QGGDGNYVLFDY (SEQ ID NO: 58), GFAMS (SEQ ID NO: 59), TISSGGTYTYSPDSVMG (SEQ ID NO: 60), y RLRRNYYSMDY (SEQ ID NO: 61), o una variante de las mismas con una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras; y el anticuerpo comprende una o más secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR seleccionadas del grupo formado por KASQNVGTTVA (SEQ ID NO: 62), SASYRYS (SEQ ID NO: 63), QQYNSYPFT (SEQ ID NO: 64), KSTKSLLNSDGFTYLD (SEQ ID NO: 65), LVS RFS (SEQ ID NO: 66) y FQSNYLPFT (SEQ ID NO: 67), o una variante de las mismas con una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras.
En una modalidad, el anticuerpo comprende las secuencias de cadena pesada CDR: DYIML (SEQ ID NO: 56), DIYPYYGSTSYNLKFKG (SEQ ID NO: 57) y QGGDGNYVLFDY (SEQ ID NO: 58) y comprende las secuencias de cadena ligera CDR: KASQNVGTTVA (SEQ ID NO: 62), SASYRYS (SEQ ID NO: 63) y QQYNSYPFT (SEQ ID NO: 64). En una modalidad, el anticuerpo comprende las secuencias de cadena pesada CDR: GFAMS (SEQ ID NO: 59), TISSGGTYTYSPDSVMG (SEQ ID NO: 60) y RLRRNYYSMDY (SEQ ID NO: 61) y comprende las secuencias de cadena ligera de CDR: KSTKSLLNSDGFTYLD (SEQ ID NO: 65), LVSNRFS (SEQ ID NO: 66) y FQSNYLPFT (SEQ ID NO: 67).
En un aspecto, la actual teenología proporciona un anticuerpo aislado que se une a la glicoproteína del virus de la rabia, en donde el anticuerpo tiene la misma especificidad de unión del antígeno que un anticuerpo producido por una línea de células de hibrido a seleccionada del grupo formado por los números de acceso CGMCC 4805 y 4806.
En una modalidad, el anticuerpo es capaz de reducir la infectividad del virus de la rabia y no interfiere con la inmunogenicidad de la vacuna antirrábica. En una modalidad, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo murino, un anticuerpo quimérico y un anticuerpo humanizado.
En una modalidad, la teenología actual proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo RVNA o un cóctel de uno o más anticuerpos RVNA y un portador farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, la composición farmacéutica comprende un cóctel de anticuerpos en el cual un primer anticuerpo comprende las secuencias de cadena pesada CDR: DYIML (SEQ ID NO: 56), DIYPYYGSTSYNLKFKG (SEQ ID NO: 57) y QGGDGNYVLFDY (SEQ ID NO: 58) y secuencias de cadena ligera de CDR que comprenden: KASQNVGTTVA (SEQ ID NO: 62), SASYRYS (SEQ ID NO: 63) y QQYNSYPFT (SEQ ID NO: 64); y en el cual un segundo anticuerpo comprende las secuencias de cadena pesada CDR: GFAMS (SEQ ID NO: 59), TISSGGTYTYSPDSV G (SEQ ID NO: 60) y RLRRNYYSMDY (SEQ ID NO: 61) y comprende las secuencias de cadena ligera CDR: KSTKSLLNSDGFTYLD (SEQ ID NO: 65), LVSNRFS (SEQ ID NO: 66) y FQSNYLPFT (SEQ ID NO: 67).
En una modalidad, la tecnología actual proporciona el uso de un anticuerpo RVNA descrito en la fabricación de un medicamento para tratar la infección por rabia en un sujeto que lo necesita. En una modalidad, el anticuerpo reduce la infectividad del virus de la rabia pero no interfiere con la inmunogenicidad de la vacuna antirrábica.
En una modalidad, la teenología actual proporciona un método para tratar la infección por rabia en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de uno o más de los anticuerpos RVNA descritos. En una modalidad, el anticuerpo se administra al sujeto antes, después o simultáneamente con la vacuna de la rabia. En una modalidad, el anticuerpo se administra al sujeto antes, después, o simultáneamente con una inmunoglobulina antirrábica.
En uno de los aspectos, la tecnología actual ofrece un kit para tratar la infección por rabia en un sujeto que lo necesita que comprende uno más anticuerpos que se unen a la glicoproteína del virus de la rabia y las instrucciones para el uso del anticuerpo, en donde: el anticuerpo que comprende una o más secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR seleccionadas del grupo formado por DYIML (SEQ ID NO: 56), DIYPYYGSTSYNLKFKG (SEQ ID NO: 57), QGGDGNYVLFDY (SEQ ID NO: 58), GFAMS (SEQ ID NO: 59), TISSGGTYTYSPDSVMG (SEQ ID NO: 60) y RLRRNYYSMDY (SEQ ID NO: 61), o una variante de las mismas con una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras; y el anticuerpo que comprende una o más secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR seleccionadas del grupo formado por KASQNVGTTVA (SEQ ID NO: 62), SASYRYS (SEQ ID NO: 63), QQYNSYPFT (SEQ ID NO: 64), KSTKSLLNSDGFTYLD (SEQ ID NO: 65), LVSNRFS (SEQ ID NO: 66) y FQSNYLPFT (SEQ ID NO: 67), o una variante de las mismas con una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras.
En un aspecto, la teenología actual ofrece un kit para la detección de virus de la rabia en una muestra que comprende un anticuerpo que se une a la glicoproteína del virus de la rabia y las instrucciones para el uso del anticuerpo, en donde: el anticuerpo comprende una o más secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR seleccionadas del grupo formado por DYIML (NO SEQ ID: 56), DIYPYYGSTSYNLKFKG (SEQ ID NO: 57), QGGDGNYVLFDY (SEQ ID NO: 58), GFAMS (SEQ ID NO: 59), TISSGGTYTYSPDSVMG (SEQ ID NO: 60), y RLRRNYYSMDY (SEQ ID NO: 61), o una variante de las mismas con una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras; y el anticuerpo comprende una o más secuencias de aminoácidos cadena de ligera CDR seleccionadas del grupo formado por KASQNVGTTVA (SEQ ID NO: 62), SASYRYS (SEQ ID NO: 63), QQYNSYPFT (SEQ ID NO: 64), KSTKSLLNSDGFTYLD (SEQ ID NO: 65), LVS RFS (SEQ ID NO: 66) y FQSNYLPFT (SEQ ID NO: 67), o una variante de las mismas con uno o más sustituciones de aminoácidos conservadoras. En una modalidad, el anticuerpo se acopla a una o más etiquetas detectables. En una modalidad, además el kit consta de un anticuerpo secundario que se une específicamente al anticuerpo de glicoproteína del virus de la rabia. En una modalidad, el anticuerpo secundario está acoplado a una o más etiquetas detectables.
En otro aspecto, la actual teenología proporciona un ácido nucleico aislado que codifica los anticuerpos RVNA descritos en la presente. En otro aspecto, la actual tecnología proporciona una célula hospedera, compuesta por el ácido nucleico aislado que codifica los anticuerpos RVNA descritos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es un gráfico que muestra curvas de ligadura ejemplares de cinco anticuerpos neutralizantes del virus de la rabia (RVNA) ilustrativos a la glicoproteína de RV.
La figura 2 es un ensaye Western Blot mostrando los cinco RNVAs que reconocen el epítope lineal o epítope conformacional en la glicoproteína del virus de la rabia (RVGP). Los carriles son como sigue: carril 1: 50 ml de RVGP reductor con 7G11A3; carril 2: 5 ml de RVGP reductor con 7G11A3; carril 3: 5 m? de RVGP no reductor con 7G11A3; carril 4: 50 m? de RVGP reductor con 5A1C10; carril 5: 5 m? de RVGP reductor con 5A1C10; carril 6: 5 m? de RVGP no reductor con 5AlCIO; carril 7: 50 m? de RVGP reductor con 6F11C1; carril 8: 5 ml de RVGP reductor con 6F11C1; carril 9: 5 ml de RVGP no reductor con 6F11C1; carril 10: 50 m? de RVGP reductor con 3H10D3; carril 11: 5 m? de RVGP reductor con 3H10D3; carril 12: 5 m? de RVGP no reductor con 3H10D3; carril 13: 50 m? de RVGP reductor con 3D11E3; carril 14: 5 m? de RVGP reductor con 3D11E3; carril 15: 5 m? de RVGP no reductor con 3D11E3.
Las figuras 3A-4E son una serie de gráficos mostrando resultados ejemplares de CLEIA indirecto en el cual los cinco RVNA ilustrativos se ligan a la glicoproteína del virus de la rabia que fue tratada con detergentes diferentes. La figura 3A: capacidad de ligadura de 3D11E3 a la glicoproteína RV; figura 3B: capacidad de ligadura de 3H10D3 a la glicoproteína del RV; figura 3C: capacidad de ligadura de 5A1C10 a la glicoproteína del RV; figura 3D: capacidad de ligadura de 6F11C1 a la glicoproteína de RV; Figura 3E: capacidad de ligadura de 7G11A3 a la glicoproteína de RV.
Las figuras 4A-4J son una serie de gráficos mostrando la supervivencia porcentual de los ratones con una variedad de virus de la rabia en una prueba de neutralización en ratón (MNT). Figura 4A: YNI (ser humano); figura 4B: DRV (ciervo); figura 4C: HN35 (ser humano); figura 4D: SC-CD09 (perro); figura 4E: GN07 (perro); figura 4F: ZJ-HZ09 (perro); figura 4G: BD06 (perro); figura 4H: JX08-45 (tejón); figura 41: JX09-27 (tejón); figura 4J: ZJ-LA (tejón).
Las figuras 5A-50 son una serie de gráficos que representan resultados ejemplares de un conjunto de experimentos de competencia llevados a cabo utilizando un formato CLEIA. RVNAs 3D11E3, 3H10D3, 5A1C10, 6F11C1 y 711A3 compiten entre sí para unirse a la glicoproteína del virus de la rabia (RVGP). Los cinco RVNAs ilustrativos fueron permitidos ligarse a la glicoproteína que compite con 3D11E3-HRP (figuras 5A - 5C), 3H10D3-HRP (figuras 5D-5F), 5A1C10-HRP (figuras 5G-5I), 6F11C1-HRP (figuras 5J - 5L) y 7G11A3-HRP (figuras 5M-50).
Figuras 6A-6E son una serie de gráficos que muestran títulos de suero RVNA en ratones BALB/c sin desafíos. Los ratones de cada grupo de tratamiento (n = 6 por grupo) fueron vacunados con la vacuna antirrábica y tratados el día 0 con: figura 6A: 50 mg /dosis 7G11A3; figura 6B: 50 pg /dosis 3D11E3; figura 6C: 50 mg/dosis 3H10D3; o figura 6D: 20 Ul/kg inmunoglobulina antirrábica humana (HRIG). Los ratones en el grupo control (figura 6E) recibieron solamente la vacuna Rabipur®. En los días 1, 3, 7, 14 y 28, la sangre fue recogida de la órbita de ratones y se mezcló si suero del ratón 6 con 3 sueros en cada grupo. El título RVNA en cada muestra de suero se determinó mediante una prueba rápida de la inhibición de foco fluorescente, y títulos de la media geométrica fueron calculados y graficados contra el tiempo. Las líneas largas representan los medios y las líneas cortas representan máx y mín, respectivamente.
La figura 7 es un gráfico que muestra las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier para hámster sirio (n = 10 por grupo) desafiados con virus de la rabia de perros callejeros (BD06).
La figura 8 es una representación esquemática del vector de expresión pCHlA9.
La figura 9 es un análisis SDS PAGE de CT.3D11E3 RV 1 A9 (carril 1), Chi A9 (carril 2), Huí A9-1 (carril 3) y los anticuerpos Huí A9-2 (carril 4). Se usó el estándar pre-teñido SeeBlue® Plus2 de Invitrogen (Invitrogen, de Grand Island, NY, EE. UU.; # de catálogo LC5925) como estándar de peso molecular (carril 5).
La figura 10 es un gráfico de un análisis ELISA mostrando la ligadura de anticuerpos Chi A9, HulA9-l y Huí A9-2 de la vacuna del virus de la rabia inactivado (Rabipur®, Chiron Behring GmbH & Co., de Liederbach, Alemania).
La figura 11 es una representación esquemática del vector de expresión pCh2Gll.
La figura 12 es análisis SDS PAGE de CT.RV 711A31H5 (carril 2), Ch2Gl 1 (carril 3), Hu2Gl 1-1 (carril 4) y los anticuerpos Hu2Gl 1-2 (carril 5). Las muestras (5 mg cada una) fueron corridas en un gel SDS PAGE al 4-20 % bajo condiciones de reducción. Se utilizó el estándar pre-teñido SeeBlue® Plus2 de Invitrogen (Invitrogen, de Grand Island, NY, EE. UU.; # de catálogo LC5925) como estándar de peso molecular (carril 1). H y L denotan la posición de las cadenas pesadas y ligeras, respectivamente.
La figura 13 es un gráfico de un análisis ELISA competitivo mostrando la ligadura de los anticuerpos Ch2Gll, Hu2Gll-1 y Hu2Gll-2 a la vacuna del virus de la rabia inactivado (Rabipur®, Chiron Behring GmbH & Co., de Liederbach, Alemania). Una placa de ELISA fue cubierta con Rabipur®. La ligadura del ratón 7 11A3 1H5 a Rabipur® fue examinado en presencia de varias concentraciones de Ch2Gll, Hu2Gll-l o Hu2Gll-2.7G11A3 ligado de ratón fue detectado por el anticuerpo policlonal IgG anti-ratón de cabra conjugado con HRP, específico a la cadena Fcy, absorbido por IgG humana.
Las figuras 14A y 14B son gráficos de un análisis ELISA de la ligadura de los anticuerpos Ch2Gll, Hu2Gll-l y Hu2Gll-2 con vacuna del virus de la rabia inactivado (Rabipur®, Chiron Behring GmbH & Co., de Liederbach, Alemania). Placas ELISA fueron recubiertas con 2.5 ^g/ml (figura 14A) o 1.0 mg/ml (figura 14B) de Ch2Gll, Hu2Gll-l o Hu2Gll-2. Se detectó Rabipur® capturada por anticuerpos revestidos por el conjugado-HRP 3D10.
Las figuras 15A-15F son una serie de gráficos que muestran las curvas de ligadura de los RNVAs humanizados y quiméricos 2G11 con la glicoproteína 2G11 según se determinó por CLEIA. Los 2G11 quimérico y humanizado fueron utilizados como anticuerpos de captura y detección, respectivamente. La glicoproteína fue diluida a 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800 y 1:1600 y luego se agregó a la micro-placa. El RV murino 3D10-HRP y IgG-HRP anti-humana de ratón fueron utilizados como el conjugado enzimático. La unidad de luminiscencia relacionada (RLU) representa la señal de quimioluminiscencia.
Las figuras 16A-16J son una serie de curvas de ligadura de los RVNAs 2G11 a la glicoproteína RV humanizada, quimérica y murina, según se determinó por CLEIA. Los 1A9 quimérico y humanizado fueron usados como anticuerpos de captura y detección, respectivamente. La glicoproteína fue diluida a 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800 y 1:1600 y luego se agregó a la micro-placa. El RV murino 3D 10-HRP y IgG-HRP anti-humana de ratón fueron utilizados como el conjugado enzimático. Unidad de luminiscencia relacionada (RLU) representa la señal de quimioluminiscencia.
Las figuras 17A-17F son una serie de gráficos mostrando la supervivencia porcentual de ratones BALB/C en experimentos MNT. Se muestran las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier de 0 a 21 días.
Las figuras 18A-18B son una serie de gráficos que muestran la supervivencia porcentual de los hámster sirios (n = 5 por grupo) que fueron desafiados con RV de perros callejeros (BD06) en el día 1. Se muestran las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier de 0 a 28 días.
La figura 19 es una serie de gráficos que muestra títulos de RVNAs del suero de ratones BALB/c no desafiados. Los ratones de cada grupo de tratamiento (n = 8 por grupo) fueron vacunados con la vacuna antirrábica y tratados con un cóctel de Hu2Gl 1-l/Hul A9-2 (1) 5000 IU/kg, (2) cóctel 1000 Ul/kg Hu2Gl 1-l/Hul A9-2, (3) 200 Ul/kg Hu2Gl 1-l/Hul A9-2 cóctel, o (4) 20 Ul/kg inmunoglobulina de rabia humana (HRIG) en el día 0, los ratones en el grupo control (5) sólo recibieron la vacuna y los ratones ques solamente recibieron PBS fueron el control negativo (6).
La figura 20 es un gráfico que muestra una comparación entre un cóctel RVNA y HRIG con la vacuna en hámsteres sirios.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los detalles de una o varias modalidades de la teenología actual se establecen en la correspondiente descripción de abajo. En la práctica los métodos actuales, muchas de las técnicas convencionales en biología molecular, bioquímica de proteínas, biología celular, Inmunología, microbiología y ADN recombinante se utilizan. Estas técnicas son conocidas y están explicadas en, por ejemplo, los protocolos actuales en Biología Molecular, Vols. I-III, Ausubel, Ed. (1997); Sabrook et ah, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Ed. (Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, NY, 1989); DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. I and II, Glover, Ed. (1985); Oligonucleotide Synthesis, Gait, Ed. (1984); Nucleic Acid Hybridization, Hames & Higgins, Eds. (1985); Transcription and Translation, Hames & Higgins, Eds. (1984); Animal Cell Culture, Freshncy, Ed. (1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Meth. Enzymol, (Academic Press, Inc., 1984); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, Miller & Calos, Eds. (Coid Spring Harbor Laboratory, NY, 1987); y Meth. Enzymol, Vols.154 and 155, Wu & Grossman, and Wu, Eds., respectivamente. Métodos para detectar y medir los niveles de productos de expresión del gen polipéptido (es decir, nivel de la traducción de genes) son bien sabido en la téenica e incluyen el uso de métodos de detección de polipéptido tales como técnicas de detección y cuantificación de anticuerpos. (Véase también Strachan & leer, Human Molecular Genetics, segunda edición. (John Wiley y Sons, Inc., Nueva York, 1999)).
AS menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento generalmente tienen el mismo significado como comúnmente entendido por uno téenico con conocimientos medios en la materia a la que pertenece esta tecnología. Como se usada en esta especificación y las reivindicaciones anexadas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen plurales referentes a menos que el contenido dicta claramente lo contrario. Por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una combinación de dos o más células y similares.
Generalmente, la nomenclatura utilizada en este documento y los procedimientos de laboratorio de cultivo celular, genética molecular, química orgánica, química analítica y química de ácidos nucleicos e hibridación que se describen a continuación son los conocidos y comúnmente emplean en la técnica. A continuación se proporcionan las definiciones de algunos términos como se usa en esta especificación. Definiciones de otros términos se pueden encontrar en el Illustrated Dictionary of Immunology, 2a Edición (Cruse, J.M. and Lewis, R.E., editores., Boca Ratón, Forida, EE. UU.; CRC Press, 1995).
Como se utiliza en este documento, la "administración" de un agente o droga a un sujeto o asunto incluye cualquier ruta de introducción o entrega a un sujeto de un compuesto para realizar su función. La administración puede realizarse por cualquier ruta adecuada, incluyendo por vía oral, intranasal, por vía parenteral (por vía intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea), por vía rectal, intracranealmente, intratecal, o por vía tópica. La administración incluye administración propia y la administración por otra.
Como se utiliza en este documento, el término "aminoácido" incluye naturalmente aminoácidos y aminoácidos sintéticos, así como análogos del ácido amino y análogos de aminoácidos que funcionan de manera similar a los aminoácidos que ocurren naturalmente. Naturalmente los aminoácidos son codificados por el código genético, así como los aminoácidos que son posteriormente modificados, por ejemplo, hidroxiprolina, g-carboxiglutamato y O-fosfoserina. Análogos del ácido amino se refiere a compuestos que tienen la misma estructura química básica como un aminoácido natural, es decir, un carbono que está enlazado a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucine, sulfóxido de metionina, sulfonio etil metionina. Estos análogos han modificado los grupos R (por ejemplo, norleucina) o cadenas principales de péptido modificado, pero conservan la misma estructura química básica como un aminoácido natural. Análogos de aminoácidos se refiere a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente a la estructura química general de un aminoácido, pero que funciona de manera similar a un natur lmente-ácido amino. Los aminoácidos pueden ser referidos en este documento, ya sea por su carta tres comúnmente conocidos símbolos o los símbolos de una letra recomendada por la Comisión de nomenclatura bioquímica IUPAC-IUB. Los nucleótidos, asimismo, pueden ser referidos por sus códigos sola letra comúnmente aceptados.
Este documento, el término "anticuerpos" significa un polipéptido que conforman una región de marco de un gen de inmunoglobulina o fragmentos de éstos que se une específicamente y reconoce un antígeno, por ejemplo, una glicoproteína de la rabia. Uso del anticuerpo contra término pretende incluir anticuerpos enteros, incluyendo los anticuerpos todo cadena simple, y antígeno vinculantes sus fragmentos. El término "anticuerpos" incluye tienen anticuerpos y anticuerpos multiespecíficas mientras que exhiben la función o actividad biológica deseada. El término anticuerpo también se refiere a fragmentos de anticuerpos de unión de antígeno, incluyendo anticuerpos de cadena simple, que abarcan las regiones variables solas, o en combinación, con todo o parte de los siguientes elementos de polipéptido: región bisagra, dominios (¾ , CH2 y CH3 de una molécula de anticuerpo. También se incluye en la teenología son cualquier combinación de regiones variables y región bisagra, dominios CHi, CH2 y CH3. Moléculas relacionadas con anticuerpos útiles en los métodos actuales, por ejemplo, pero no se limitan a, Fab, Fab' y F(ab')2, Fd, Fvs (scFv) cadena simple, anticuerpos de cadena simple, disulfuro-unidos Fvs (sdFv) y fragmentos que comprenden el dominio VL o VH. Los ejemplos incluyen: (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente consiste en los dominios VL, VH, CL y (¾ ; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd consiste en los dominios VH y CHi; (iv) un fragmento Fv consiste en los dominios de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., Nature 341: 544-546, 1989), que consiste en un dominio VH; y (vi) una región determinante de complementariedad aislada (CDR). Como tal "fragmentos de anticuerpo" pueden constar de una parte de un anticuerpo de longitud completa, generalmente la unión del antígeno o región variable. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos Fab, Fab', F(ab')2 y fragmentos Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpos de cadena simple; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. Las moléculas de anticuerpos de cadena simple pueden componerse de un polímero con un número de moléculas individuales, por ejemplo, dímero, trímero u otros polímeros.
En este documento, el término "anticuerpo quimérico" significa un anticuerpo en el cual la región constante Fe de un anticuerpo monoclonal de una especie (por ejemplo, una región constante Fe ratón) se sustituye, utilizando téenicas de ADN recombinante, con una región constante Fe de un anticuerpo de otra especie (por ejemplo, una región constante Fe de humano).
En este documento, el término "epítope" significa un determinante de proteína capaz de unión específica a un anticuerpo. Epítopes consisten generalmente en agrupaciones superficies químicamente activas de moléculas como los aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y tienen generalmente tres dimensiones estructurales características, así como las características de carga específica.
Los epítopes conformacionales y no conformacionales se distinguen en que la unión al anterior pero no el último se pierde en presencia de solventes de desnaturalización. En una modalidad, un "epítope" de la glicoproteína del virus de la rabia es una región de la proteína a la que los anticuerpos contra la rabia de la tecnología actual específicamente se unen.
Como se utiliza en este documento, el término "cantidad efectiva" o "cantidad farmacéuticamente efectiva" o "cantidad terapéuticamente efectiva" de una composición, es una cantidad suficiente para lograr un efecto terapéutico o profiláctico deseado, por ejemplo, una cantidad que se traduce en la prevención de, o una disminución de los síntomas asociados con una enfermedad que está siendo tratada, por ejemplo, infección de rabia. La cantidad de una composición de la actual teenología administrada al sujeto dependerá del tipo y severidad de la enfermedad y sobre las características del individuo, como el estado general de salud, edad, sexo, peso corporal y la tolerancia a los fármacos. También dependerá del grado, severidad y tipo de enfermedad. El experto será capaz de determinar las dosis apropiadas dependiendo de estos y otros factores. Las composiciones de la presente tecnología también pueden administrarse en combinación con uno o más compuestos terapéuticos adicionales. Por ejemplo, las composiciones de la tecnología actual pueden incorporarse en la profilaxis postexposición para las personas expuestas al virus de la rabia y administrado en combinación con anti terapias conocido en la técnica como las vacunas contra la rabia. Los anticuerpos de la tecnología actual son convenientes para la administración en combinación con las vacunas antirrábicas incluyendo pero no limitándose a vacuna de células de embrión pollito purificada (PCECV; RabAvert®, Novartis, Basilea, Suiza; Rabipur®, Chiron Behring GmbH & Co., Liederbach, Alemania), vacuna de células diploides humanas (HDCV; Imovax®, Sanofi Pasteur, Swiftwater, PA, USA), vacuna contra la rabia adsorbida (RVA) y la globulina inmune de la rabia humana (HRIG). En algunas modalidades, "cantidad efectiva" se refiere a la cantidad de anticuerpos contra la rabia de la teenología actual que es parcial o totalmente eficaz en la neutralización de virus de la rabia.
Como se utiliza en este documento, el término "rabia" refiere a los virus del género Lyssavirus, de la familia Rhabdoviridae, orden Mononegavirales. Lyssavirus tienen simetría helicoidal, con una longitud de aproximadamente 180 nm y un diámetro transversal de aproximadamente 75 nm. Estos virus son envueltos y tienen un genoma de ARN de cadena simple con sentido negativo. La información genética está empaquetada como un complejo ribonucleoproteína en el cual ARN está estrechamente unido por la nucleoproteína viral. El genoma de ARN del virus codifica cinco genes cuyo orden es altamente conservada: nucleoproteínas (N), fosfoproteínas (P), proteína de la matriz (M), glicoproteína (G) y la polimerasa del ARN viral (L).
Como se utiliza en este documento, el término formas "humanizadas" de anticuerpos no humano (por ejemplo, murina) son anticuerpos quiméricos que contienen la secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son las inmunoglobulinas humanas en donde los residuos de la región hipervariable del destinatario son sustituidos por residuos de región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo del donante) como ratón, rata, conejo o primate no humano teniendo la especificidad deseada, afinidad y capacidad. En algunos casos, residuos de región marco Fv (FR) de la inmunoglobulina humana son sustituidos por residuos correspondientes no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden componerse de residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo de donantes. Estas modificaciones se realizan para refinar aún más el rendimiento de anticuerpos tales como afinidad obligatoria. Generalmente, el anticuerpo humanizado constará de sustancialmente todos de al menos uno y típicamente dos dominios variables, en donde todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humanos y todos o sustancialmente todas de las regiones FR son los de una secuencia de inmunoglobulina humana aunque las regiones FR pueden incluir una o más sustituciones de aminoácidos que mejoran la afinidad de unión. El número de esas sustituciones de aminoácidos en el FR es típicamente no más de 6 en la cadena H y la cadena L, no más de 3. El anticuerpo humanizado opcionalmente también abarcará al menos una parte de una región constante de la inmunoglobulina (Fe), típicamente de una inmunoglobulina humana. Para más información, vea Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol.2:593-596 (1992).
Como se utiliza en este documento, el término "región hipervariable" se refiere a los residuos del aminoácido de un anticuerpo que se encargan de la unión del antígeno. La región hipervariable consta generalmente de residuos de aminoácidos de una "región determinante de coplementariedad" o "CDR" (por ejemplo, alrededor de aproximadamente residuos 24-34 (Ll), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el VL y alrededor de cerca de 31-35B (Hl), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el VH Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o los residuos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo, residuos de 26-32 (Ll), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el VL y 26-32 (Hl), 52A-55 (H2) y 96-101 (H3) en el VH (Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)).
Como se utiliza en este documento, las términos "idéntico" o porcentaje "identidad", cuando se utiliza en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias de polipéptido, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que son las mismas o que tengan un porcentaje determinado de los residuos del aminoácido o nucleótidos que son los mismos (es decir, sobre el 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad sobre una región determinada (por ejemplo, la secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo descrito o secuencia de aminoácidos de un anticuerpo descrito), cuando se compara y alinea para la máxima correspondencia sobre una ventana de comparación o designado región) medido usando unos algoritmos de comparación de secuencia BLAST o BLA.ST 2.0 con parámetros de falla que se describen a continuación, o por alineación manual y visual véase, por ejemplo, sitio web NCBI). Tales secuencias entonces se dice que son "sustancialmente idénticas". Este término también se refiere, o se puede aplicar a, el complemento de una secuencia de prueba. El término también incluye secuencias que tienen supresiones y/o adiciones, así como aquellos que tienen sustituciones. Como se describe a continuación, los algoritmos pueden explicar los espacios y similares. En algunas modalidades, identidad existe sobre una región que es por lo menos aproximadamente 25 aminoácidos o nucleótidos de longitud, 50-100 aminoácidos o nucleótidos de longitud.
Un polipéptido "aislado" o "purificado" o porción biológicamente activos del mismo es sustancialmente libre de material celular u otros polipéptidos contaminantes de la fuente de la célula o fuente de tejido del cual se deriva el polipéptido o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetizan químicamente. Por ejemplo, un anticuerpo anti-rabia aislado sería libre de materiales que puedan interferir con el diagnóstico o usos terapéuticos del agente. Tales materiales interferentes pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos y no proteináceos. Alternativamente, una glicoproteína aislada la rabia, que es inmuno-reactiva con un anticuerpo antirrábico de la teenología actual, sería sustancialmente libre de materiales que pueda interferir con el diagnóstico o usos terapéuticos del polipéptido.
En este documento, los términos "reactivo cruzado inmunológicamente" y "reactivo inmunológicamente" se usan indistintamente para significar un antigeno que está específicamente reactivo con un anticuerpo que se generó con el mismo antígeno ("inmunológicamente reactivo") o diferente ("reactivo cruzado inmunológicamente"). Generalmente, el antígeno es una glicoproteína de la rabia, una variante o subsecuencia de la misma.
Como se utiliza en este documento, los término "condiciones reactivas inmunológicamente" significa condiciones que permiten a un anticuerpo, generado a un epítope particular de un antígeno, unirse a ese epítope a un grado perceptiblemente mayor que el anticuerpo se une a substancialmente los epítopes, generalmente por lo menos dos veces arriba de la unión de fondo, o por lo menos cinco veces arriba del fondo. Condiciones reactivas inmunológicamente dependen del formato de la reacción de unión del anticuerpo y típicamente son aquellos utilizados en los protocolos de inmunoensayo. Ver Harlow & Lañe, Antibodies, A Laboratory Manual (Coid Spring Harbor Publications, New York, 1988) para una descripción de formatos de inmunoensayo y condiciones.
Como se utiliza en este documento, el término "afección médica" incluye, pero no se limita a, por ejemplo, cualquier condición o enfermedad manifestada como uno o más síntomas físicos o psicológicos para la cual el tratamiento y/o prevención es deseable e incluye enfermedades y otros trastornos previamente y nuevamente identificados. Por ejemplo, una condición médica puede ser una infección de rabia.
El término "anticuerpo monoclonal" en este documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto posibles mutaciones que pueden estar presentes en cantidades menores. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal puede ser un anticuerpo que se deriva de una sola copia, incluyendo cualquier eucariotas, procariotas, o clones de fago y no es el método por el cual se produce. Una anticuerpo monoclonal composición muestra un enlace único especificidad y afinidad por un epítope particular. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, siendo dirigido contra un único sitio antigénico. Además, en contraste con las preparaciones convencionales (policlonal) anticuerpo que típicamente incluyen diversos anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo determinante en el antígeno. El modificador "monoclonal" indica el carácter de los anticuerpos como ser obtenidos de una población homogénea substancialmente de anticuerpos y no debe interpretarse como que requiere la producción de anticuerpos por cualquier método en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden preparar usando una amplia variedad de téenicas conocidas en la técnica incluyendo, pero no limitado a, hibridoma, recombinante y tecnologías de visualización de fago. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales para utilizarse de acuerdo a los métodos actuales puede efectuarse por el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature 256:495 (1975), o puede hacerse por métodos de ADN recombinantes (véase, por ejemplo, patente de Estados Unidos No.4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" también puede ser aislados de las genotecas de anticuerpos de fago usando las téenicas descritas en Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) y Mark et al, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), por ejemplo.
En este documento, el término "anticuerpo policlonal" significa una preparación de anticuerpos derivados de por lo menos dos (2) diferentes líneas de células productoras de anticuerpos. El uso de este término incluye preparaciones de por lo menos dos (2) anticuerpos que contienen anticuerpos que se unen específicamente a diferentes epítopes o regiones de un antígeno.
Como se utiliza en este documento, los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en el presente para referirse a un polímero compuesto por dos o más aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados, es decir, un péptido isosteres. Polipéptido se refiere a ambas cadenas cortas, comúnmente contempladas como péptidos, glicopéptidos u oligómeros y cadenas más largas, generalmente contempladas como proteínas. Los polipéptidos pueden contener aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos codificados por el gen. Los polipéptidos incluyen secuencias de aminoácidos modificadas por procesos naturales, como el procesamiento de post translación, o por técnicas de modificación química que son bien sabidas en la técnica. Dichas modificaciones están bien descritas en textos básicos y monografías más detalladas, así como en una voluminosa bibliografía. En una modalidad particular, el polipéptido contiene secuencias polipeptídica de una proteína de anticuerpo de la rabia.
Como se utiliza en este documento, "la profilaxis post exposición" o "PEP" se refiere a un régimen de tratamiento que está indicado para las personas posiblemente expuestas a un animal rabioso. Posibles exposiciones incluyen la exposición de la mordida (es decir, cualquier penetración de la piel por los dientes) incluyendo mordeduras de animales y la exposición sin mordedura. PEP típicamente incluye la administración de anticuerpos contra la rabia en conjunción con una vacuna contra la rabia, como la vacuna de células (PCEC) de embrión de pollito purificada (Rab Avert®, Novartis, Basel, Switzerland; Rabipur®, Chiron Behring GmbH & Co., Liederbach, Alemania), vacuna de célula diploide humana (HDCV; Imovax®, Sanofi Pasteur, Swiftwater, PA, USA), vacuna contra la rabia adsorbida (RVA). PEP a menudo incluye la administración de inmunoglobulina de rabia humana (HRIG), una gammaglobulina antirrábica concentrada de plasma de donantes humanos hiperinmunizada. HRIG es un agente inmunizante administrado típicamente a un individuo tras la exposición al virus de la rabia.
Como se utiliza en este documento, el término "recombinante" cuando se usa con referencia, por ejemplo, a una célula, o ácidos nucleicos, proteínas o vector, indica que la célula, ácidos nucleicos, proteínas o vector, ha sido modificado por la introducción de un ácido nucleico heterólogo o proteína o la alteración de una proteína o ácido nucleico nativo, o que el material se deriva de una célula modificada. Así, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no-recombinante) de la célula o expresan genes nativos que son lo contrario a lo anormalmente expresado, sub-expresado o no expresado en absoluto.
En este documento, el término "unión específica" significa el contacto entre un anticuerpo anti-rabia y un antígeno con una afinidad de unión de al menos 106 M. En algunas modalidades, los anticuerpos se unen específicamente con afinidades de por lo menos aproximadamente 107 M, 108 M, 10-9 M, 1010 M, 10-11 M, o 10-12 M.
Como se utiliza en este documento, el término "sujeto" se refiere a un animal humano o no humano, por ejemplo, los animales domésticos (por ejemplo, perros, gatos y similares), animales de granja (por ejemplo, vacas, ovejas, cerdos, caballos y similares), animales salvajes, (murciélagos, mapaches, zorros, zorrillos, ardillas, ardillas, ratones, conejos y similares) y los animales de laboratorio (por ejemplo, mono, ratas, ratones, conejos, cuyos y similares).
Como se utiliza en este documento, el término "sustitución" es una de las mutaciones que se utiliza generalmente en la téenica. Esas variantes de sustitución tienen al menos un residuo de aminoácido en la molécula de anticuerpo antirrábico substituida por un residuo diferente. Los sitios de mayor interés para reposición mutagénesis incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan las alteraciones FR. Las sustituciones pueden ser conservadoras, es decir, un aminoácido se sustituye por uno de similar forma y carga. Las substituciones conservadoras son bien sabidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, los cambios de: alanina a la serina; arginina para U sina; asparagina a la glutamina o histidina; aspartato-glutamato; cisterna a la serina; glutamina a la asparagina; glutamato a aspartato; glicina a la prolina; histidina a asparagina o glutamina; isoleucina aeucina o valina; leucina valina o isoleucina; lisina a arginina; metionina a leucina o isoleucina; fenilalanina a tirosina, leucina o metionina; serina a treonina; treonina a serina; triptófano a tirosina; tirosina a triptófano o fenilalanina; y valina a isoleucina o leucina. Alternativamente, las sustituciones pueden ser no conservadoras tal que una función o actividad del polipéptido es afectada. Los cambios no conservadoras típicamente involucran sustituir un residuo con uno que es químicamente diferente, tal como un aminoácido polar o cargado por un aminoácido no polar o sin cargar y viceversa.
Como se utiliza en este documento, los términos "tratar" o "tratamiento" o "alivio" se refiere a tratamiento terapéutico y profiláctico o medidas preventivas, en donde el objetivo es prevenir o retrasar (disminuir) la condición patológica específica o desorden. Un sujeto es "tratado" con éxito por la rabia o un trastorno relacionado con la rabia si, después de recibir una cantidad terapéutica de anticuerpos neutralizantes del virus de la rabia según los métodos de la teenología actual, el sujeto muestra una reducción observable y/o mensurable o ausencia de uno o más signos y síntomas de la infección/condición de la rabia. También se puede apreciar que los diversos modos de tratamiento o prevención de afecciones descritas pretenden significar "sustancial", que incluye total, pero también menos tratamiento o prevención total, y en donde se logra un resultado biológicamente o médicamente relevante.
. Composiciones de la teenología actual La presente descripción generalmente proporciona anticuerpos antirrábicos, que se pueden enlazar a la glicoproteína de la rabia y neutralizar la infectividad de un virus de la rabia. Los anticuerpos son útiles para tratar o prevenir la rabia que infecta a los sujetos humanos y no humanos expuestos al virus de la rabia. En consecuencia, los diversos aspectos de los métodos actuales se refieren a la preparación, caracterización y manipulación de los anticuerpos contra la rabia. Los anticuerpos de la teenología actual son útiles solos o en combinación con terapias de la rabia en la técnica para tratar o prevenir la infección de rabia. La presente descripción además se refiere a métodos para la administración de anticuerpos contra la rabia de la tecnología actual a un sujeto en necesidad de los mismos.
La presente descripción abarca anticuerpos antirrábicos que se unen a la glicoproteína del virus de la rabia. En modalidades selectas, los anticuerpos constituyen los anticuerpos resumidos en el cuadro 1.
CUADRO 1 Anticuerpos anti-rábicos Los depósitos de materiales biológicos de la teenología actual se hicieron con el centro de colección de cultivo microbiológico general de China (CGMCC), China Committee for Culture Collection of Microorganisms, P.O. Box 2714, Beijing 100080, La República Popular de China as como se detalla en el cuadro 2 abajo.
CUADRO 2 Depósitos biológicos La tecnología actual incluye anticuerpos que unen específicamente epítopes que son epítopes conformacionales así como epítopes lineales o no conformacionales. Como se señaló anteriormente, los epítopes conformacionales o epítopes no conformacionales se distinguen en que se pierde la unión al anterior pero no el último en presencia de solventes desnaturalizantes.
Anticuerpos contra la rabia en el ámbito de la tecnología actual incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a, diacuerpo monoclonal, policlonal, quimérico, humanizado y anticuerpos humanos monoclonales y humanos policlonales que unen específicamente la glicoproteína de la rabia, un homólogo, derivado o un fragmento de la misma. Anticuerpos útiles para los métodos descritos aquí incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a, IgG (incluyendo IgGi, IgG2, IgG3 e IgG4), IgA (incluyendo la IgA1 y IgA2), IgD, IgE, o IgM y IgY.
En una modalidad, los anticuerpos contra la rabia de la teenología actual se unen específicamente a la glicoproteína de la rabia. En una modalidad, los anticuerpos son capaces de reducir la infectividad del virus de la rabia y no reducen la inmunogenicidad de la vacuna antirrábica. En seleccionados modalidades, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales, anticuerpos murina, quiméricos anticuerpos o anticuerpos humanizados.
En algunas modalidades, los anticuerpos de la actual tecnología comprenden una o más secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR seleccionadas del grupo formado por DYIML (SEQ ID NO: 57), DIYPYYGSTSYNLKFKG (SEQ ID NO: 58), QGGDGNYVLFDY (SEQ ID NO: 59), GFAMS (SEQ ID NO: 60), TISSGGTYTYSPDSVMG (SEQ ID NO: 61), RLRRNYYSMDY (SEQ ID NO: 62), o una variante de las mismas con una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras. En algunas modalidades, los anticuerpos de la actual tecnología comprenden una o más secuencias de aminoácidos de cadena ligera de CDR seleccionadas del grupo formado por KASQNVGTTVA (SEQ ID NO: 63), SASYRYS (SEQ ID NO: 64), QQYNSYPFT (SEQ ID NO: 65), KSTKSLLNSDGFTYLD (SEQ ID NO: 66), LVSMRFS (SEQ ID NO: 67), FQSNYLPFT (SEQ ID NO: 68) o una variante de las mismas con una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras.
En algunas modalidades, la teenología actual consta de un ácido nucleico que codifica un anticuerpo neutralizante del virus de la rabia o su fragmento. En algunas modalidades, la tecnología abarca una célula hospedera o ácido nucleico que abarca el ácido nucleico aislado de codificación del anticuerpo.
La tecnología actual además incluye anticuerpos que son anti-idiotípicos a los anticuerpos de la tecnología actual. Los anticuerpos de la tecnología actual pueden ser monoespecífíeos, biespecíficos, trispecíficos o de multispecificidad mayor. Los anticuerpos multiespecífíeos pueden ser específicos para diferentes epítopes de la glicoproteína de la rabia o pueden ser específicos para ambos la glicoproteína de la rabia así como en cuanto a composiciones heterólogas, como un polipéptido heterólogo o material de soporte sólido. Véase, por ejemplo, WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt et al, J. Immunol. 147: 60-69 (1991); patentes US 5,573,920, 4,474,893, 5,601,819, 4,714,681, 4,925,648; 6,106,835; Kostelny et al, J. Immunol. 148: 1547-1553 (1992). Los anticuerpos pueden ser de I cualquier origen animal incluyendo aves y mamíferos. En algunas modalidades, los anticuerpos son humanos, murinos, de conejo, cabra, conejillos de Indias, camello, caballo o pollo. En algunas modalidades, los anticuerpos son quiméricos. En algunas modalidades, los anticuerpos son humanizados.
Los anticuerpos de la teenología actual pueden utilizarse solos o en combinación con otras composiciones. Por ejemplo, los anticuerpos neutralizantes del virus de la rabia puede utilizarse en combinación con terapias antirrábica una o más conocidas en la técnica, como los mencionados antes. Los anticuerpos de la tecnología actual pueden ser administrados a un sujeto que necesita de la misma antes, con posterioridad a, o simultáneamente a la administración de una o más terapias adicionales de la rabia, como una vacuna contra la rabia se incluyen.
Los anticuerpos de la tecnología actual pueden aún más ser recombinantemente fusionados a un polipéptido heterólogo en el N- o C-terminal o químicamente conjugado (incluyendo conjugaciones covalente y no covalentemente) a polipéptidos u otras composiciones. Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser fusionados por vía recombinante o conjugados a moléculas útiles como las etiquetas en los análisis de detección y moléculas efectoras como polipéptidos heterólogos, fármacos o toxinas. Véase, por ejemplo, WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; patentes US 5,314,995; y EP 0396 387.
A. Métodos de preparación de los anticuerpos contra la rabia de la teenología actual La preparación de los anticuerpos antirrábicos específicos para la glicoproteína del virus de la rabia se ilustra en el ejemplo 1, infra. Debe entenderse que no sólo son anticuerpos naturales adecuados para su uso de acuerdo a la presente descripción, anticuerpos y fragmentos de anticuerpos diseñados por vía recombinante, por ejemplo, polipéptidos relacionados con anticuerpos, que se dirigen a la glicoproteína de la rabia y sus fragmentos son también adecuados. Los anticuerpos contra la rabia que pueden ser sometidos a las técnicas establecidas incluyen anticuerpos monoclonales y policlonales, y fragmentos de anticuerpos tales como Fab, Fab ', F(ab')2, Fd, scFv, diacuerpos, cadenas ligeras de anticuerpos, cadenas pesadas de anticuerpo y/o fragmentos de anticuerpos. Métodos útiles para la producción de alto rendimiento de polipéptidos que contienen Fv anticuerpos, por ejemplo, fragmentos de anticuerpos Fab' y F(ab')2 se han descrito. Ver la Patente de Estados Unidos No.5,648,237.
Anticuerpo monoclonal. En una modalidad de la tecnología actual, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal contra la rabia. Por ejemplo, en algunas modalidades, el anticuerpo monoclonal anti-rabia puede ser un anticuerpo monoclonal anti-rabia humano o de ratón. Para la preparación de anticuerpos monoclonales dirigidos hacia una glicoproteína particular de rabia, o derivados, fragmentos, análogos o sus homólogos, puede utilizarse cualquier téenica que provee la producción de moléculas de anticuerpos por el cultivo de linea celular continua. Estas técnicas incluyen, pero no se limitan a, la técnica del hibridoma (véase, por ejemplo, Kohler & Milstein, 1975. Nature 256: 495-497); la técnica trioma; la técnica de hibridomas humana de células B (véase, por ejemplo, Kozbor, et al, 1983. Immunol. Today 4: 72) y la técnica de hibridomas EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (véase, por ejemplo, Colé, et al., 1985. In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96).
Los anticuerpos monoclonales humanos pueden ser utilizados en la práctica de la tecnología actual y puede ser producidos mediante el uso de hibridomas humanos (véase, por ejemplo, Cote, et al., 1983. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80:2026-2030) o mediante la transformación de células B humanas con el Virus de Epstein Barr in vitro (véase, por ejemplo, Colé, et al, 1985. In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R.
Liss, Inc., pp. 77-96). Por ejemplo, una población de ácidos nucleicos que codifican las regiones de anticuerpos puede ser aislada. PCR utilizando cebadores derivados de secuencias que codifican regiones conservadas de los anticuerpos se utiliza para amplificar secuencias de codificación de porciones de anticuerpos de la población y luego reconstruir ADNA de codificación de anticuerpos o sus fragmentos, como los dominios variables, de las secuencias amplificadas. Tales secuencias amplificadas también se pueden fusionar a ADN de codificación de otras proteínas - por ejemplo, una capa de bacteriófagos, o una proteína superficial de célula bacteriana - para la expresión y exhibición de los polipéptidos de fusión en fagos o bacterias. Las secuencias amplificadas pueden entonces expresarse y además seleccionarse o aislarse basándose, por ejemplo, en la afinidad del anticuerpo expresado o su fragmento para un antígeno o epítope presente en la glicoproteína de la rabia. Alternativamente, se pueden preparar hibridomas expresando los anticuerpos monoclonales anti-rabia al inmunizar un sujeto y luego aislar hibridomas del bazo del sujeto utilizando métodos de rutina. Véase, por ejemplo, Milstein et al., (Galfre y Milstein, Methods Enzymol (1981) 73: 3-46). La detección de hibridomas usando métodos estándar producirá anticuerpos monoclonales de especificidad variable (es decir, para diferentes epítopes) y afinidad. Puede utilizarse un anticuerpo monoclonal seleccionado con las propiedades deseadas, por ejemplo, la unión de rabia, según lo expresado por el hibridoma, puede estar unido a una molécula como polietilenglicol (PEG) para alterar sus propiedades o un ADNc que lo codifica puede ser aislado, secuenciado y manipulado de diversas maneras. Árboles sintéticos dendroméricos pueden añadirse unas cadenas laterales reactivas del aminoácido, por ejemplo, lisina para mejorar las propiedades inmunogénicas de la glicoproteína de la rabia. Además, la téenica CPG-dinucleótido puede utilizarse para mejorar las propiedades inmunogénicas de la glicoproteína de la rabia. Otras manipulaciones incluyen la sustitución o eliminación de residuos de amino acilo particular que contribuyen a la inestabilidad del anticuerpo durante el almacenamiento o después de la administración a un sujeto y las técnicas de maduración de afinidad para mejorar la afinidad del anticuerpo de la glicoproteína de la rabia.
En una modalidad, el anticuerpo de la tecnología actual es un anticuerpo monoclonal antirrábico producido por un hibridoma que incluye una célula B obtenida de un animal transgénico no humano, por ejemplo, un ratón transgénico, con un genoma que comprende un transgen humano de cadena pesada y un transgen de cadena ligera fusionado a una célula inmortalizada. Las técnicas de hibridoma incluyen aquellas conocidas en la técnica y mostradas en Harlow et al, Antibodies: A Laboratory Manual Coid Spring Harbor Laboratory, Coid Spring Harbor, NY, 349 (1988); Hammerling et al, Monoclonal Antibodies And T-Cell Hybridomas, 563-681 (1981). Otros métodos para la producción de hibridomas y los anticuerpos monoclonales son conocidos por los de habilidad en la téenica.
Técnica de visualización del fago. Los anticuerpos de la tecnología actual pueden ser producidos a través de la aplicación de ADN recombinante y tecnología de visualización del fago. Por ejemplo, los anticuerpos contra la rabia, pueden prepararse utilizando diversos métodos de visualización del fago conocidos en la técnica. En los métodos de visualización del fago, los dominios de anticuerpos funcionales aparecen en la superficie de una partícula del fago que lleva las secuencias de polinucleótido que los codifica. Fago con una propiedad de unión deseada se seleccionan de un repertorio o genoteca combinatoria de anticuerpo (por ejemplo, humano o murina) seleccionando directamente con el antígeno, típicamente antígeno unido o capturado a una superficie sólida o del grano. El fago utilizado en estos métodos es fago típicamente filamentoso incluyendo fd y M13 con Fab, Fv o dominios anticuerpos Fv estabilizados con disulfuro están fusionados por vía recombinante a la proteína del gen VIII o gen fago III. Además, los métodos pueden ser adaptados para la construcción de genotecas de expresión Fab (véase, por ejemplo, Huse, et al.,. Science 246: 1275-1281, 1989) para permitir una rápida y eficaz identificación de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada para un polipéptido de virus de la rabia, por ejemplo, un polipéptido o derivados, fragmentos, análogos o sus homólogos. Otros ejemplos de métodos de visualización de fago que pueden ser utilizados para hacer los anticuerpos de la teenología actual son los conocidos en la técnica. Se han descrito métodos útiles para mostrar los polipéptidos en la superficie de las partículas del bacteriófago uniendo los polipéptidos mediante enlaces disulfuro por Lohning, patente de Estados Unidos No. 6,753,136. Después de la selección de fago, las regiones de codificación del anticuerpo de los fagos pueden ser aisladas y utilizadas para generar anticuerpos enteros, incluyendo los anticuerpos humanos o cualquier otro fragmento de unión de antígeno deseado y expresado en cualquier hospedero deseados incluyendo células mamíferas, células de insecto, las células vegetales, levaduras y bacterias. Por ejemplo, técnicas para producir por vía recombinante fragmentos Fab, Fab' y F(ab')2 también se pueden emplear usando métodos conocidos en la técnica como los descritos en WO 92/22324; Mullinax et al, BioTechniques 12: 864-869, 1992; y Sawai et al., AJRI 34: 26-34, 1995; y Better et al, Science 240: 1041-1043, 1988.
Generalmente, los anticuerpos híbridos o fragmentos de anticuerpos híbridos que son clonados en un vector de visualización pueden seleccionarse contra el antígeno apropiado para identificar variantes que mantienen actividad de unión buena, porque el anticuerpo o fragmento de anticuerpo estará presente en la superficie de la partícula del fago o fagémido. Véase, por ejemplo, Barbas III et al, Phage Display, A Laboratory Manual (Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, N.Y., 2001). Sin embargo, otros formatos vectoriales podrían usarse para este proceso, como la clonación de la genoteca de fragmento de anticuerpo en un vector de fago lítico (sistemas modificados T7 o Labda Zap) para la selección y/o detección.
Expresión de anticuerpos recombinantes antirrábicos. Como se señaló anteriormente, los anticuerpos de la teenología actual pueden ser producidos a través de la aplicación de la tecnología del ADN recombinante. Constructos de polinucleótido recombinantes que codifican un anticuerpo antirrábico de la tecnología actual típicamente incluyen una secuencia de control de expresión unida operablemente a las secuencias de codificación de las cadenas de anticuerpo antirrábico, incluyendo regiones promotoras naturalmente asociadas o heterólogas. Por lo tanto, otro aspecto de la tecnología incluye vectores que contienen una o más secuencias de ácido nucleico que codifican un anticuerpo antirrábico de la actual teenología. Para la expresión recombinante de uno o más polipéptidos de la tecnología, el ácido nucleico que contiene todos o una porción de la secuencia de nucleótido de codificación del anticuerpo antirrábico se inserta en un vector apropiado de clonación o un vector de expresión (es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia de codificación del polipéptido insertado) por técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la técnica y como se detalla a continuación. Métodos para la producción de diversas poblaciones de vectores se han descrito por Lerner et al, patentes US 6,291,16Oeteo, 192.
En general, los vectores de expresión útiles en técnicas de ADN recombinante son a menudo en forma de plásmidos. En la presente especificación, "plásmido" y "vector" pueden utilizarse indistintamente como el plásmido más comúnmente utilizado forma de vector. Sin embargo, la tecnología actual está diseñada para incluir otras formas de vectores de expresión que no son técnicamente plásmidos, como vectores virales {por ejemplo, retrovirus defectuoso de replicación, adenovirus y virus adeno-asociado), que cumplen funciones equivalentes. Tales vectores virales permiten la infección de un sujeto y expresión en el sujeto de un compuesto. En algunas modalidades, las secuencias de control de expresión son sistemas eucarióticos promotores en vectores capaces de transformar o transferir las células eucariotas hospederas. Una vez que el vector se ha incorporado en el hospedero apropiado, el hospedero se mantiene en condiciones adecuadas para la expresión de nivel alto de las secuencias de nucleótidos que codifican el anticuerpo antirrábico y la colección y purificación de anticuerpos antirrábico, por ejemplo, los anticuerpos contra la rabia de reacción cruzada. En general, ver la solicitud de Estados Unidos No. 20020199213. Estos vectores de expresión son típicamente replicables en los organismos hospederos como episomas o como una parte integral del ADN cromosómico hospedero. Comúnmente, los vectores de expresión contienen marcadores de selección, por ejemplo, resistencia a la ampicilina o resistencia a higromicina, para permitir la detección de esas células transformadas con las secuencias de ADN deseadas. Los vectores también pueden codificar el péptido de señal, por ejemplo, pectato liasa, útil para dirigir la secreción de fragmentos de anticuerpo extracelular.
Los vectores de expresión recombinante de la actual teenología comprenden un ácido nucleico de codificación de un compuesto con propiedades de enlace de la rabia en un formato adecuado para la expresión del ácido nucleico en una célula huésped, que significa que los vectores de expresión recombinante incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas sobre la base de las células hospederas para ser utilizadas para la expresión que es operativamente unida a la secuencia de ácido nucleico para expresarse. Dentro de un vector de expresión recombinante, "unido operablemente" se pretende decir que la secuencia de nucleótidos de interés está ligada a la ó las secuencias reguladoras de una manera que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula huésped cuando el vector se introduce en la célula huésped). El término "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, potenciadores y demás elementos de control de expresiones (por ejemplo, señales de poliadenilación). Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, California, EE. UU. (1990). Secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de la célula hospedera y aquellos que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos sólo en ciertas células hospederas (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas de tejidos). Será apreciado por los entendidos en la materia que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped para transformarse, el nivel de expresión del polipéptido deseado, etc. Las secuencias reguladoras típicas útiles como promotores de expresión de polipéptido recombinante (por ejemplo, anticuerpo antirrábico), incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a, 3-fosfoglicerato quinasa y otras enzimas glicolíticas. Promotores inducibles de levadura incluyen, entre otros, promotores de alcohol deshidrogenasa, isocitocromo C y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. En una modalidad, un polinucleótido que codifica un anticuerpo antirrábico de la actual teenología es unido operablemente a un promotor ara B y expresable en una célula huésped. Ver patente US 5,028,530. Los vectores de expresión de la tecnología actual pueden introducirse en las células hospederas para producir de tal modo polipéptidos o péptidos, incluyendo los polipéptidos de fusión, codificados por ácidos nucleicos y como se describe en este documento (por ejemplo, anticuerpos contra la rabia, etc.).
Otro aspecto de la tecnología actual pertenece a células hospederas expresando anticuerpos antirrábicos, que contienen un ácido nucleico de codificación de uno o más anticuerpos contra la rabia. Los vectores de expresión recombinante de la tecnología actual pueden ser diseñados para la expresión de un anticuerpo antirrábico en células procarióticas o eucarióticas. Por ejemplo, un anticuerpo antirrábico puede expresarse en células bacterianas como Escherichia coli, células de insecto (utilizando vectores de expresión baculovirus), células fúngicas, por ejemplo, células de levadura o células mamíferas. Las células hospederas adecuadas se discuten más en Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, California, EE. UU. (1990). Alternativamente, el vector de expresión recombinante puede ser transcrito y traducido in vitro, por ejemplo, usando secuencias reguladoras de promotor T7 y T7 polimerasa. Se han descrito métodos útiles para la preparación de selección de polipéptidos teniendo una propiedad predeterminada, por ejemplo, anticuerpo antirrábico, mediante la expresión de secuencias generadas estocásticamente de polinucleótido. Ver las patente US 5,763,192; 5,723,323; 5,814,476; 5,817,483; 5,824,514; 5,976,862; 6,492,107; 6,569,641.
La expresión de polipéptidos en procariotas más a menudo es realizada en E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles al dirigir la expresión de los polipéptidos de fusión o no fusión. Vectores de fusión añaden un número de aminoácidos de un polipéptido codificado, generalmente al amino terminal del polipéptido recombinante. Estos vectores de fusión sirven típicamente tres propósitos: (i) aumentar la expresión del polipéptido recombinante; (ii) aumentar la solubilidad del polipéptido recombinante; y (iii) ayudar en la purificación del polipéptido recombinante actuando como un ligando en la purificación de afinidad. A menudo, en los vectores de expresión de fusión, un sitio de división proteolítico es introducido en el cruce de la parte de fusión y el polipéptido recombinante para permitir la separación del polipéptido recombinante de la parte de fusión con posterioridad a la purificación del polipéptido de fusión. Estas enzimas y sus secuencias de reconocimiento cognado, ,incluyen la trombina, Factor Xa y enteroquinasa. Vectores de la expresión de la fusión típicos incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith y Johnson, 1988. Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Massachusetts, EE. UU.) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, New Jerscy, EE. UU.) que fusionan S- transferasa de glutatión (GST), polipéptido de ligadura de maltosa E o polipéptido A, respectivamente, con el polipéptido recombinante objetivo.
Ejemplos de vectores de expresión de E. coli inducible adecuado no fusión incluyen pTrc (Amrann et al, (1988) Gene 69: 301-315) and pET 1 id (Studier et al, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89). Métodos para montaje específico del péptido activo distinto o dominios de la proteína producen polipéptidos multifuncionales mediante fusión de polipéptido se ha descrito por Pack et al, patentes US. 6,294,353; 6,692,935. Una estrategia para maximizar la expresión de polipéptido recombinante, por ejemplo, un anticuerpo antirrábico, en E. coli es expresar el polipéptido en bacterias hospederas con una capacidad deteriorada para dividir proteolíticamente el polipéptido recombinante. Véase, por ejemplo, Gottesman, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, California, EE. UU. (1990) 119-128. Otra estrategia consiste en alterar la secuencia del ácido nucléico del ácido nucleico para ser insertado en un vector de expresión para que los codones individuales para cada aminoácido son aquellos preferentemente utilizados en el hospedero de expresión, por ejemplo, E. coli (véase, por ejemplo, Wada, et al, 1992. Nucí. Acids Res.20: 2111-2118). Tal alteración de secuencias de ácido nucleico de la teenología actual puede llevarse a cabo mediante técnicas de síntesis de ADN estándar.
En otra modalidad, el vector de expresión de anticuerpo antirrábico es un vector de expresión de la levadura. Ejemplos de vectores de expresión en la levadura Saccharomyces cerevisiae incluyen pYepSecl (Baldari, et al., 1987. EMBO J.6: 229-234), pMFa (Kurjan y Herskowitz, Cell 30: 933-943, 1982), pJRY88 (Schultz et al, Gene 54: 113-123, 1987), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, California, EE. UU.), y picZ (Invitrogen Corp, San Diego, California, EE. UU.). Alternativamente, se puede expresar un anticuerpo antirrábico en células de insecto utilizando vectores de expresión de baculovirus. Los vectores de baculovirus disponibles para la expresión de polipéptidos, por ejemplo, el anticuerpo antirrábico, en células cultivadas de insectos (por ejemplo, células SF9) incluyen la serie pAc (Smith, et al., Mol. Cell. Biol.3 : 2156-2165, 1983) y la serie pVL (Lucklow and Summers, 1989. Virology 170: 31-39).
En otra modalidad, un ácido nucleico que codifica un anticuerpo antirrábico de la actual teenología se expresa en células de mamífero usando un vector de expresión mamífera. Ejemplos de vectores de expresión mamífera incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a, pCDM8 (ver. Nature 329:840, 1987) y pMT2PC (Kaufman, et al., EMBO J.6: 187-195, 1987).
Cuando se utiliza en células de mamíferos, las funciones de control del vector de expresión a menudo son proporcionadas por elementos reguladores virales. Por ejemplo, promotores utilizados comúnmente se derivan del polioma, adenovirus 2, citomegalovirus y virus de simio 40. Para otros sistemas de expresión adecuados para las células procariotas y eucariotas útiles para la expresión de anticuerpos contra la rabia de la tecnología actual. Véase, por ejemplo, los capítulos 16 y 17 de Sambrook, et al, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL.2a ed., Coid Spring Harbor Laboratory, Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, N.Y., 1989.
En otra modalidad, el vector de expresión recombinante de mamífero es capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico en un tipo de célula particular (por ejemplo, elementos reguladores específicos de tejidos se utilizan para expresar el ácido nucleico). Elementos reguladores específicos de tejidos son conocidos en la téenica. Ejemplos sin limitación promotores específicos de tejido convenientes del promotor de albúmina (específico de hígado; Pinkert, et al., Genes Dev 1: 268-277, 1987), promotores específicos de linfoide (Caíame y Eaton, Adv. Immunol.43:235-275, 1988), en particular promotores de receptores de las células T (Winoto y Baltimore, EMBO J. 8: 729-733, 1989) e inmunoglobulinas (Banerji, et al., 1983. Cell 33 : 729-740; Queen and Baltimore, Cell 33 : 741-748, 1983.), promotores específicos de neuronas (por ejemplo, el promotor de neurofilamento; Byrne y Ruddle, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477, 1989), promotores específicos de páncreas (Edlund, et al., 1985. Science 230: 912-916) y los promotores específicos de glándula mamaria (por ejemplo, promotor de suero de leche; patente US 4,873,316 y publicación EP 0 264,166). También son considerados los promotores regulados por el desarrollo, por ejemplo, los promotores de hox murina (Kessel y Gruss, Science 249: 374-379, 1990) y el promotor de a-fetoproteína (Campes y Tilghman, Genes Dev.3: 537-546, 1989).
Otro aspecto de los métodos actuales se refiere a las células hospederas en donde se ha introducido un vector de expresión recombinante de la teenología actual. Los términos "célula hospedera" y "célula hospedera recombinante" se usan indistintamente en este documento. Se entiende que esos términos se refieren no sólo a la célula en cuestión particular, sino también a la progenie o descendientes potenciales de una célula. Ya que pueden producirse ciertas modificaciones en las sucesivas generaciones debido a la mutación o influencias ambientales, tal progenie puede no, de hecho, ser idéntica a la célula madre, pero es todavía incluida en el alcance del término en este documento.
Una célula hospedera puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Por ejemplo, un anticuerpo antirrábico puede expresarse en células bacterianas tales como E. coli, las células de insecto, levadura o células de mamíferos. Las células mamíferas son un huésped adecuado para expresar los segmentos de nucleótidos de codificación de inmunoglobulinas o fragmentos de éstos. Ver Winnacker, From Genes To Clones, (VCH Publishers, NY, 1987). Un número de líneas de células huésped adecuadas capaces de secretar proteínas heterólogas intactas se han desarrollado en la técnica e incluyen líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO), varias líneas de células COS, células HeLa, células L y líneas celulares de mieloma. En algunas modalidades, las células son humanas. Los vectores de expresión de estas células pueden incluir secuencias de control de expresión, como un origen de replicación, un promotor, un potenciador y sitios de información de procesamiento necesarias, tales como sitios de unión del ribosoma, sitios de empalme de ARN, sitios de poliadenilación y secuencias terminadoras transcripcionales. Queen et al, Imunol. Rev. 89: 49, 1986. Las secuencias de control de la expresión ilustrativa son promotores derivados de genes endógenos, citomegalovirus, SV40, adenovirus, virus del papiloma bovino y lo similar. Co et al, J Immunol.148: 1149, 1992. Otras células hospederas adecuadas son conocidas por los téenicos en la materia.
El ADN de vector puede ser introducido en las células procariotas o eucariotas mediante técnicas de transfección o transformación convencionales. Como se utiliza en este documento, los términos "transformación" y "transfección" pretenden referirse a una variedad de técnicas de arte reconocida para la introducción de ácidos nucleicos externos (por ejemplo, DNA) en una célula huésped, incluyendo fosfato de calcio o co-precipitación de cloruro de calcio, transfección mediado por DEAE-dextrano, lipofection o electroporación, biolistica o transfección viral-basada puede ser utilizada para otros hospederos celulares. Otros métodos utilizados para transformar células de mamíferos incluyen el uso de polibreno, la fusión de protoplasto, liposomas, electroporación y microinyección (ver generalmente, Sambrook et al, Molecular Cloning). Métodos adecuados para transformar o transferir las células huésped pueden encontrarse en Sambrook, et al. (MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL.2a ed., Coid Spring Harbor Laboratory, Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, N.Y., 1989) y otros manuales de laboratorio. Los vectores que contienen los segmentos de ADN de interés pueden ser transferidos a la célula huésped por métodos bien conocidos, dependiendo del tipo de hospedero celular.
Para la transfección estable de células de mamíferos, es conocido que, dependiendo de la téenica de vector y transfección de expresión utilizada, sólo una pequeña fracción de las células puede integrar el ADN extraño en su genoma. Con el fin de identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a los antibióticos) generalmente se introduce en las células huésped junto con el gen de interés. Diversos marcadores seleccionables son los que confieren resistencia a los fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexato. Ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable de codificación puede introducirse en una célula huésped en el mismo vector que codifica el anticuerpo antirrábico o puede introducirse en un vector separado. Células transíectadas con el ácido nucleico introducido estable pueden ser identificadas por selección de fármacos (por ejemplo, las células que han incorporado el gen marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que el otro las células mueren).
Una célula huésped que incluye un anticuerpo antirrábico de la teenología actual, como una célula huésped procariota o eucariota en el cultivo, puede ser utilizada para producir (es decir, expresar) anticuerpo antirrábico recombinante. En una modalidad, el método comprende el cultivo de la célula hospedera (en la cual un vector de expresión recombinante de codificación del anticuerpo antirrábico se ha introducido) en un medio apropiado tal que se produce el anticuerpo antirrábico. En otra modalidad, el método además comprende el paso de aislar los anticuerpos contra la rabia del medio o la célula hospedera. Una vez expresadas, las colecciones del anticuerpo contra la rabia, por ejemplo, los anticuerpos contra la rabia o los polipéptidos relacionados con anticuerpos contra la rabia son purificados de medios de cultivo y las células hospederas. El anticuerpo contra la rabia puede ser purificado según los procedimientos estándar de la téenica, incluyendo purificación HPLC, cromatografía de columna, electroforesis en gel y similares. En una modalidad, el anticuerpo antirrábico se produce en un organismo por el método de Boss et al, patente US 4,816,397. Generalmente, las cadenas de anticuerpo antirrábico se expresan con secuencias de la señal y así se liberan a los medios de cultivo. Sin embargo, si las cadenas anticuerpo antirrábico naturalmente no son secretadas por las células huésped, las cadenas de anticuerpos contra la rabia se pueden liberar por tratamiento con un detergente suave. La purificación de polipéptidos recombinantes es bien sabido en la técnica e incluyen precipitación de sulfato de amonio, técnica de purificación de cromatografía de afinidad, cromatografía en columna, técnica de purificación de intercambio iónico, electroforesis de gel y los similares (ver generalmente Scopes, Protein Purification (Springer- Verlag, M.Y., 1982).
Los polinucleótidos de codificación de anticuerpos contra la rabia, por ejemplo, las secuencias de codificación de anticuerpo antirrábico pueden incorporarse en los transgenes para su introducción en el genoma de un animal transgénico y expresión posterior en la leche de los animales transgénicos. Véase, por ejemplo, patente US 5,741,957, 5,304,489 y 5,849,992. Los transgenes adecuados incluyen codificación de secuencias para las cadenas ligeras y/o pesadas en la unión operable con un promotor y potenciador de un gen específico de la glándula mamaria, como la caseína o b-lactoglobulina. Para la producción de animales transgénicos, los transgenes pueden ser microinyectados en ovocitos fertilizados, o pueden ser incorporados en el genoma de las células madre embrionarias, y los núcleos de estas células transfieren en ovocitos enucleados.
Debido a la degeneración de las secuencias de codificación del ácido nucleico, pueden utilizarse otras secuencias que codifican substancialmente las mismas secuencias de aminoácidos como las de las proteínas que ocurren naturalmente en la práctica de la teenología actual. Estos incluyen, pero no se limitan a, las secuencias de ácido nucleico incluyendo todas o partes de las secuencias de ácido nucleico de codificación de los polipéptidos anteriores, que son alterados por la sustitución de diferentes codones que codifican un residuo de aminoácido funcionalmente equivalentes dentro de la secuencia, produciendo así un cambio silencioso. Se aprecia que la secuencia de nucleótidos de una inmunoglobulina según la tecnología actual tolera variaciones de homología de secuencia de hasta un 25% calculado por métodos estándar Current Methods in Sequence Comparison and Analysis," Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp. 127-149, 1998, Alan R. Liss, Inc.) mientras que una variante forme un anticuerpo operativo que reconoce la rabia o glicoproteínas tipo rabia. Por ejemplo, uno o más residuos de aminoácidos dentro de una secuencia de polipéptidos pueden sustituirse por otro aminoácido de una polaridad similar que actúa como un equivalente funcional, resultando en una alteración silenciosa. La sustitución de un aminoácido dentro de la secuencia puede ser seleccionada de otros miembros de la clase a la cual pertenece el aminoácido. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrofóbicos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen el ácido aspártico y ácido glutámico. También se incluyen en el ámbito de la teenología actual son proteínas o fragmentos o sus derivados que son diferencialmente durante o después de la traducción, por ejemplo, por glicosilación, división proteolítico, unión a una molécula de anticuerpo u otros ligandos celulares, etc. Cualquier técnica de mutagénesis, conocida en la técnica se puede utilizar, incluyendo pero no limitado a in vitro sitio dirigida mutagénesis, J Biol Chem 253:6551, uso de enlazadores Tab (Pharmacia) y similares.
Anticuerpos de cadena simple. En una modalidad, el anticuerpo antirrábico de la teenología actual es un anticuerpo antirrábico de cadena simple. Según la tecnología actual, las técnicas pueden ser adaptadas para la producción de cadena simple anticuerpos específicos a una glicoproteína rabia (véase, por ejemplo, patente US 4,946,778). Ejemplos de técnicas que pueden utilizarse para producir Fvs de una sola cadena y anticuerpos de la tecnología actual incluyen los descritos en la patente US.4,946,778 y 5,258,498; Huston et al, Methods in Enzymology, 203 : 46-88, 1991; Shu, L. et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90: 7995-7999, 1993; y Skerra et al, Science 240: 1038-1040, 1988.
Anticuerpos quiméricos y humanizados. En una modalidad, el anticuerpo antirrábico de la tecnología actual es un anticuerpo quimérico antirrábico. En una modalidad, el anticuerpo contra la rabia de la tecnología actual es un anticuerpo humanizado antirrábico. En una modalidad de la tecnología actual, los anticuerpos del donante y receptor son anticuerpos monoclonales de especies diferentes. Por ejemplo, el anticuerpo aceptor es un anticuerpo humano (para minimizar su antigenicidad en un ser humano), en cuyo caso el anticuerpo CDR-injertado resultante se denomina un anticuerpo humanizado".
Anticuerpos recombinantes antirrábicos, tales como los anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, que comprenden las porciones tanto humanas como no humanas, puede realizarse utilizando téenicas de ADN recombinante estándar y en el ámbito de la tecnología actual. Para algunos usos, incluyendo el uso in vivo de los anticuerpos contra la rabia de la tecnología presente en los seres humanos, así como el uso de estos agentes ensayos de detección in vitro, es posible utilizar anticuerpos antirrábicas quiméricos, humanizados o humanos. Estos anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados puede producirse por técnicas de ADN recombinante, conocidas en la técnica.
En una modalidad, la tecnología actual permite la construcción de anticuerpos humanizados antirrábicos que es poco probable que induzcan una respuesta de anticuerpos humanos anti-ratón (en lo sucesivo, "HAMA"), sin dejar de tener una función efectora de anticuerpo eficaz. Como se utiliza en este documento, los términos "humanos" y "humanizados", en relación a los anticuerpos, se refieren a los anticuerpos que se espera que provoquen una respuesta inmunogénica débil terapéuticamente tolerable en un sujeto humano. En una modalidad, la tecnología actual prevé un anticuerpo antirrábico humanizado, inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera.
Anticuerpos CDR. En una modalidad, el anticuerpo antirrábico de la teenología actual es un anticuerpo de CDR antirrábico. Generalmente los anticuerpos donadores y aceptores utilizados para generar el anticuerpo CDR antirrábico son anticuerpos monoclonales de diferentes especies; típicamente el anticuerpo aceptador es un anticuerpo humano (para minimizar su antigenicidad en un ser humano), en cuyo caso el anticuerpo CDR-injertado resultante se denomina un anticuerpo "humanizado". El injerto puede ser de una CDR sencilla (o incluso una porción de una CDR sencilla) dentro de una VH o VL sencilla del anticuerpo receptor, o puede ser de múltiples CDR (o sus partes) dentro de una o ambas VH y VL. Con frecuencia todas las tres CDR en todos los dominios variables del anticuerpo aceptador se reemplazará con las CDR correspondientes donantes, aunque uno necesita reemplazar solamente como sea necesario para permitir la adecuada unión del anticuerpo resultante CDR-injertada a MetAp3. Métodos para generar anticuerpos CDR-injertado y humanizados son mostrados por las patentes US de Queen et al. 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; y de Winter 5,225,539; así como el documento EP 0 682 040. Métodos útiles para preparar polipéptidos VH y VL son enseñados por Winter et al., patentes US 4,816,397; 6,291,158; 6,291,159; 6,291,161; 6,545,142; EP 0 368 684; EP 0451 216; EP O 120694.
Después de seleccionar los candidatos de región de marco adecuados de la misma familia y/o miembro de la misma familia, una o ambas regiones variables de cadena pesada y ligera se producen por injerto de CDR de las especies originarias en las regiones de marco híbrido. El montaje de anticuerpos híbridos o fragmentos de anticuerpos híbridos con las regiones variables de cadena híbrida con respecto a cualquiera de los aspectos anteriores se puede lograr usando métodos convencionales conocidos por los expertos en la téenica. Por ejemplo, las secuencias de ADN que codifican los híbrido variable dominios descritos (es decir, los marcos basados en las especies objetivo y CDR de las especies originarias) pueden ser producidas por síntesis de oligonucleótidos o PCR. El ácido nucleico CDR regiones de codificación puede aislado de los anticuerpos de especies originarias utilizando enzimas de restricción adecuadas y ligado en el marco de las especies objetivo de ligar con las enzimas de la ligadura adecuado. Por otra parte, las regiones del marco de las cadenas variables del anticuerpo especies originarias pueden cambiarse mediante mutagénesis sitio-dirigida.
Puesto que los híbridos se construyen de opciones entre múltiples candidatos correspondientes a cada región de marco, existen muchas combinaciones de secuencias que son susceptibles de construcción con arreglo a los principios descritos. En consecuencia, las genotecas de los híbridos pueden montarse con miembros con diferentes combinaciones de las regiones individuales de marco. Estas genotecas pueden ser colecciones de base de datos electrónica de secuencias o colecciones físicas de híbridos.
Este proceso normalmente no altera las FR del anticuerpo aceptador flanqueando las CDR injertadas. Sin embargo, un experto en la téenica a veces puede mejorar afinidad de unión del antígeno del anticuerpo antirrábico injertado de CDR resultante mediante la sustitución de ciertos residuos de un determinado FR para hacer la FR más similar a la FR correspondiente del anticuerpo donante. Localizaciones convenientes de las sustituciones incluyen residuos de aminoácidos adyacentes a las CDR, o que son capaces de interactuar con una CDR (ver, por ejemplo, US 5,585,089, especialmente las columnas 12-16).0 uno especializado en la técnica puede iniciar con la FR donante y modificarlo para que sea más similar a la FR aceptadora o una FR consenso humana. Las técnicas para hacer estas modificaciones son conocidas en la técnica. Particularmente si la FR resultante encaja en una FR consenso humana para esa posición, o sea al menos el 90% o más idéntica a una FR consenso, haciendo así que puede no aumentar la antigenicidad del anticuerpo CDR antirrábico modificado resultante significativamente en comparación con el mismo anticuerpo con una FR plenamente humana Proteínas de fusión. En una modalidad, el anticuerpo antirrábico de la teenología actual es una proteína de fusión. Los anticuerpos contra la rabia de la tecnología actual, cuando se fusionan a una segunda proteína, pueden utilizarse como una etiqueta antigénica. Ejemplos de dominios que se pueden fusionar a polipéptidos no sólo son secuencias heterólogas de señal, sino también otras regiones funcionales heterólogos. La fusión no necesariamente necesita ser directa, pero puede ocurrir a través de las secuencias enlazadoras. Además, también pueden diseñarse proteínas de fusión de la tecnología actual para mejorar las características de los anticuerpos contra la rabia. Por ejemplo, una región de aminoácidos adicionales, particularmente cargado de aminoácidos, puede agregarse a la N-terminal del anticuerpo antirrábico para mejorar la estabilidad y persistencia durante la depuración de la célula huésped o posterior manipulación y almacenamiento. Además, partes de péptido pueden agregarse a un anticuerpo anti-rabia para facilitar la purificación. Estas regiones pueden eliminarse antes de la preparación final del anticuerpo antirrábico. La adición de fracciones de péptidos para facilitar el manejo de los polipéptidos son técnicas rutinarias y familiares en la técnica. El anticuerpo antirrábico de la teenología actual se puede fusionar a las secuencias marcadoras, como un péptido que facilita la purificación del polipéptido fusionado. En modalidades de selección, la secuencia del aminoácido marcador es un péptido de hexa-histidina, como por ejemplo la etiqueta proporcionada en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, California, EE: UU.), entre otros, muchos de los cuales están comercialmente disponibles. Como se describe en Gentz et al., Proc. Nati. Acad. SCI USA 86:821-824, 1989, por ejemplo, hexa-histidina prevé conveniente purificación de la proteína de fusión. Otra etiqueta péptido útil para la purificación, la etiqueta de "HA", corresponde a un epítope derivado de la proteína hemaglutinina influenza. Wilson et al., Cell 37:767, 1984. Por lo tanto, cualquiera de estas fusiones puede diseñarse utilizando los polinucleótidos o los polipéptidos de la tecnología actual. Además, la proteína de fusión puede mostrar un aumento de la vida media in vivo.
Las proteínas de fusión con estructuras diméricas disulfuro-ligadas (debido a la IgG) pueden ser más eficientes en la unión y neutralización de otras moléculas, que la proteína secretada monomérica o fragmento de proteína sola. Fountoulakis et al., J. Biochem.270: 3958-3964, 1995.
Del mismo modo, EP 0464 533 (contraparte canadiense 2045869) describe proteínas de fusión que comprenden diversas partes de la región constante de las moléculas de inmunoglobulinas junto con otra proteína humana o partes. En muchos casos, la parte Fe en una proteína de fusión es beneficiosa en el diagnóstico y la terapia y por lo tanto puede ocasionar, por ejemplo, propiedades farmacocinéticas mejoradas. Ver EP A 0232 262. Alternativamente, la supresión de la parte Fe después que la proteína de fusión ha sido expresada, detectada y purificada, sería deseable. Por ejemplo, la porción Fe puede dificultar la terapia y el diagnóstico si la proteína de fusión se utiliza como un antígeno para vacunas. En el descubrimiento de medicamentos, por ejemplo, las proteínas humanas, tales como hIL-5, se han fusionado con las porciones Fe con el propósito de ensayos de detección de alto rendimiento para identificar a los antagonistas de hIL-5. Bennett et al, J. Molecular Recognition 8: 52-58, 1995; Johanson et al., J. Biol. Chem., 270: 9459- 9471, 1995.
Anticuerpos contra la rabia marcados. En una modalidad, el anticuerpo antirrábico de la teenología actual se acopla con un radical de etiqueta, es decir, grupo perceptible. La etiqueta particular o grupo detectable conjugado con el anticuerpo contra la rabia no es un aspecto crítico de la tecnología, siempre y cuando no interfiera significativamente con la unión específica del anticuerpo contra la rabia de la teenología actual para la glicoproteína de la rabia o la glicoproteína tipo rabia. El grupo detectable puede ser cualquier material con una propiedad física o química detectable. Tales etiquetas detectables han sido desarrolladas en el ámbito de los inmunoensayos y proyección de imagen, en general, la mayoría de cualquier etiqueta útil en tales métodos puede aplicarse a la tecnología actual. Por lo tanto, una etiqueta es cualquier composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos. Etiquetas útiles en la práctica de la tecnología actual incluyen granos magnéticos (por ejemplo, Dynabeads™), tintes fluorescentes (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína, Texas red, rodamina y similares), radiolabels (por ejemplo, 3H, 14C, 35S, 125I, 121I, 131I, 112In, 99mTc), otros agentes de imágenes como microburbujas (para imágenes por ultrasonido), 18F, 11C, 150, (por emisión de positrones), 99raTC, C111h (para tomografía por emisión de fotón único), enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y otros utilizados en un ELISA) y etiquetas calorimétricas como oro coloidal o vidrio coloreado o granos de plástico (por ejemplo, poliestireno, polipropileno, látex y similares). Las patentes que describe el uso de tales etiquetas incluyen las patente US 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149; y 4,366,241, cada una incorporada en el presente documento mediante referencia en su totalidad y para todos los efectos. Ver también Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6a Ed., Molecular Probes, Inc., Eugene OR.).
La etiqueta puede acoplarse directamente o indirectamente al componente deseado de un ensayo según métodos bien conocidos en la téenica. Como se ha indicado anteriormente, puede utilizarse una amplia variedad de etiquetas, con la opción de la etiqueta según la sensibilidad necesaria, facilidad de conjugación con el compuesto, los requisitos de estabilidad, instrumentación disponible y disposiciones de eliminación.
Las etiquetas no radiactivas se unen a menudo por métodos indirectos. Por lo general, una molécula de ligando (por ejemplo, biotina) se une covalentemente a la molécula. El ligando entonces se une a una molécula de anti-ligando (por ejemplo, estreptavidina) que es inherentemente detectable o covalentemente a un sistema de señal, como una enzima detectable, un compuesto fluorescente o un compuesto quimioluminiscente. Puede utilizarse un número de ligandos y anti-ligandos. Cuando un ligando tiene un ligando anti natural, por ejemplo, biotina, tiroxina y Cortisol, puede utilizarse en conjunción con los anti-ligandos etiquetados, naturalmente. Alternativamente, cualquier compuesto hapténicos o antigénico puede utilizarse en combinación con un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo antirrábico.
Las moléculas también pueden ser conjugadas directamente para generar compuestos, por ejemplo, la señal por la conjugación con una enzima o un fluoróforo. Enzimas de interés como etiquetas voluntad principalmente ser hidrolasas, particularmente las fosfatasas, esterasas y glicosidasas, u oxidorreductasas, particularmente peroxidasas. Fluorescentes compuestos útiles como radicales de etiquetado, incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, la fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona y similares. Compuestos quimioluminiscentes útiles como radicales de etiquetado, incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, luciferina y 2,3-dihidroftalazinadionas, por ejemplo, luminol. Para una revisión de distintos sistemas de etiquetado o productoras de señal que puede ser utilizado, véase la Patente de Estados Unidos No.4,391,904.
Medios de detección de etiquetas son conocidos por los de habilidad en la téenica. Así, por ejemplo, donde la etiqueta es una etiqueta radiactiva, medios de detección incluyen un contador de centelleo o película fotográfica como autorradiografía. Donde la etiqueta es una etiqueta fluorescente, puede ser detectada por emocionante el fluorocromo con la correspondiente longitud de onda de la luz y detectar la fluorescencia resultante. La fluorescencia puede detectarse visualmente, por medio de película fotográfica, por el uso de detectores electrónicos tales como carga acoplado dispositivos (CCD) o fotomultiplicadores y similares. Del mismo modo, pueden detectarse enzimáticas etiquetas proporcionando los sustratos adecuados para la enzima y detectar el producto resultante de la reacción. Finalmente pueden detectarse simples etiquetas colorimétricas simplemente observando el color asociado con la etiqueta. Por lo tanto, en varios ensayos de tiras reactivas, oro conjugado aparece a menudo rosado, mientras que varios granos conjugados aparecen el color del grano.
Algunos formatos de ensayo no requieren el uso de componentes marcados. Por ejemplo, pruebas de aglutinación pueden utilizarse para detectar la presencia de los anticuerpos de destino, por ejemplo, los anticuerpos anti rabia. En este caso, las partículas recubiertas con antígeno son aglutinadas por las muestras que comprende los anticuerpos objetivo. En este formato, ninguno de los componentes necesita « ser etiquetado y se detectó la presencia del anticuerpo contra objetivo mediante la simple inspección visual.
B. Identificar y caracterizar los anticuerpos contra la rabia de la teenología actual Métodos útiles para identificar y detectar anticuerpos contra la rabia y polipéptidos relacionados con la rabia para aquellos que poseen la especificidad deseada a una glicoproteina de rabia incluyen cualquier téenica mediada inmunológicamente conocida dentro de la técnica. Los componentes de la respuesta inmune pueden detectarse in vitro mediante diversos métodos que son conocidos por aquellos con experiencia en la técnica. Por ejemplo, (1) los linfocitos T citotóxicos pueden ser incubados con células objetivo marcados radiactivamente y la lisis de estas células objetivo detectadas por la liberación de radiactividad; (2) los linfocitos T auxiliares pueden incubarse con antígenos y células que presentan antígenos y la síntesis y secreción de citoquinas medidas por métodos estándar (Windhagen A; et al, Immunity, 2: 373-80, 1995); (3) las células presentadoras de antígeno puede incubarse con antígeno de proteína entera y la presentación de ese antígeno en MHC detectada por análisis de activación de linfocitos T o métodos biofísicos (Harding et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 86: 4230-4, 1989); (4) los mastocitos pueden incubarse con reactivos que enlazarán sus receptores Fc-epsilon y liberación de hista ina medido por inmunoensayo enzimático (Siraganian et al., TIPS, 4: 432-437, 1983); y (5) ensayo inmunosorbente enlazado por enzima (ELISA).
Del mismo modo, los productos de la respuesta inmune en un organismo modelo (por ejemplo, ratón) o un sujeto humano también pueden detectarse mediante diversos métodos que son conocidos por los de ordinario habilidad en la téenica. Por ejemplo, (1) la producción de anticuerpos en respuesta a la vacunación puede ser detectada fácilmente por métodos estándar usados actualmente en Laboratorios clínicos, por ejemplo, un ELISA; (2) la migración de las células inmunes a los sitios de inflamación puede ser detectada por rayar la superficie de la piel y colocar un recipiente estéril para capturar la migración de las células al sitio rayado (Peters et al, Blood, 72: 1310-5, 1988); (3) la proliferación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en respuesta a mitógenos o reacción linfocitaria mixta puede medirse utilizando 3H-timidina; (4) la capacidad fagocitaria de los granulocitos, macrófagos y otros fagocitos en PBMC puede medirse colocando PBMC en pozos junto con partículas marcadas (Peters et al, Blood, 72: 1310-5, 1988); y (5) la diferenciación de células del sistema inmunitario puede medirse mediante etiquetado PBMC con los anticuerpos a las moléculas de CD como CD4 y CD8 y medir la fracción de la PBMC expresan estos marcadores.
En una modalidad, los anticuerpos contra la rabia de la tecnología actual se seleccionan mediante visualización de péptidos de la rabia en la superficie de los paquetes genéticos replicables. Véase, por ejemplo, las patentes US 5,514,548; 5,837,500; 5,871,907; 5,885,793; 5,969,108; 6,225,447; 6,291,650; 6,492,160; EP 0 585 287; EP 0605 522; EP 0616 640; EP 1024 191; EP 0589 877; EP 0774 511; EP 0 844 306. Se han descrito métodos útiles para producir/seleccionar una partícula de bacteriófagos filamentosos que contienen un genoma de fagémido que codifica para una molécula de unión con una especificidad deseada. Véase, por ejemplo, EP 0 7743511; US 5,871,907; US 5,969,108; US 6,225,447; US 6,291,650; US 6,492,160.
En una modalidad, anticuerpos contra la rabia de la teenología actual se seleccionan mediante visualización de péptidos de la rabia en la superficie de una célula huésped de levadura. Métodos útiles para el aislamiento de polipéptidos scFv por pantalla superficial levadura se han descrito por Kieke et al, Protein Eng.1997 Nov; 10(11): 1303-10.
En una modalidad, anticuerpos antirrábicos de la presente tecnología son seleccionados utilizando el despliegue del ribosoma. Los métodos útiles para la identificación de ligandos en genotecas de péptidos utilizando el despliegue de ribosoma se han descrito por Mattheakis et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91: 9022-26, 1994; y Hanes et al, Proc. Nati.
Acad. Sci. USA 94: 4937-42, 1997.
En una modalidad, anticuerpos antirrábicos de la presente teenología son seleccionados utilizando el despliegue de ARNt de peptidos de la rabia. Los métodos útiles para la selección in vitro de ligandos utilizando el despliegue de ARNt se han descrito por Merryman et al., Che . Biol., 9:741-46, 2002.
En una modalidad, anticuerpos antirrábicos de la presente tecnología son seleccionados utilizando el despliegue del ARN. Los métodos útiles para selección de péptidos y proteínas usando genotecas que despliegan ARN han sido descritos por Roberts et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 94: 12297-302, 1997; y Nemoto et al, FEB S Lett., 414:405-8, 1997.
Los métodos útiles para la selección de péptidos y proteínas usando genotecas de despliegue de ARN no natural han sido descritos por Frankel et al, Curr. Opin. Struct. Biol, 13: 506-12, 2003.
En una modalidad, anticuerpos antirrábicos de la presente tecnología son expresados en el periplasma de bacterias gram negativas y se mezclan con glicoproteína de rabia etiquetadas. Véase WO02/34886. En clones que expresan polipéptidos recombinantes con afinidad para la glicoproteína de rabia, la concentración de la glicoproteína de rabia etiquetada unida a los anticuerpos antirrábicos se incrementa y permite que las células sean aisladas del resto de la genoteca como se describe en Harvey et al., Proc. Nati. Acad.
Sci. 22: 9193-982004 y publicación US 2004/0058403.
Después de la selección de los anticuerpos antirrábicos deseados, se prevé que puede producirse en grandes volúmenes por cualquier téenica conocida para aquellos con experiencia en la técnica, por ejemplo, la expresión de célula procariota o eucariota y lo similar. Los anticuerpos antirrábicos que son, por ejemplo, pero no limitados a, anticuerpos híbridos antirrábicos o fragmentos pueden producirse al utilizar técnicas convencionales para construir un vector de expresión que codifica una cadena pesada del anticuerpo en el cual las CDR y, si es necesario, una porción mínima del marco de región variable, que son requeridos para conservar la especificidad de unión de anticuerpos de especies originales (como se diseña de acuerdo con las técnicas descritas aquí) se derivan de los anticuerpos de especies originarias y el resto del anticuerpo es derivado de una inmunoglobulina de especies objetivo que puede ser manipulada como se describe aquí, de tal modo produciendo un vector para la expresión de una cadena pesada del anticuerpo híbrido.
Medición de la unión del virus de la rabia. En una modalidad, un ensayo de unión de la rabia se refiere a un formato de ensayo en donde una glicoproteína de rabia y un anticuerpo antirrábico se mezclan bajo condiciones adecuadas para la unión entre la rabia o la glicoproteína tipo rabia y el anticuerpo antirrábico y evaluar la cantidad de unión entre la rabia o la glicoproteína tipo rabia y el anticuerpo antirrábico. La cantidad de unión se compara con un control adecuado, que puede ser la cantidad de unión en ausencia de la glicoproteína de rabia, la cantidad de la unión en presencia de composición de inmunoglobulina no específica, o ambas. La cantidad de unión puede ser evaluada por cualquier método adecuado. Los métodos de ensayo de unión incluyen, por ejemplo, ELISA, radioinmunoensayos, ensayos de proximidad del centelleo, ensayos de transferencia de energía de fluorescencia, cromatografía líquida, ensayos de filtración de membrana y lo similar. Los ensayos biofísicos para la medición directa de unión de glicoproteína de rabia al anticuerpo antirrábico son, por ejemplo, la resonancia magnética nuclear, fluorescencia, polarización de fluorescencia, resonancia de plasmón de superficie (virutas de BIACOR) y lo similar. La unión específica se determina por ensayos estándar conocidos en la téenica, por ejemplo, ensayos de unión de radioligando, ELISA, FRET, inmunoprecipitación, SPR, RMN (2D-RMN), espectrometría de masas y lo similares. Si la unión específica de anticuerpo antirrábico candidato es menos de 1 por ciento mayor que la unión observada en la ausencia del anticuerpo antirrábico candidato, el anticuerpo antirrábico candidato es útil como un anticuerpo antirrábico de la tecnología presente.
Los cristales Co de las glicoproteínas de la rabia y los anticuerpos antirrábicos también son proporcionados por la presente teenología como un método para determinar las interacciones moleculares. Las condiciones adecuadas para la unión entre un anticuerpo antirrábico y una glicoproteína de rabia dependerán del compuesto y su ligando y pueden determinarse fácilmente por una persona con experiencia ordinaria en la técnica.
Medición de neutralización del virus de la rabia. Como se utiliza aquí, "neutralización del virus de la rabia" se refiere a la reducción de la contagiosidad del virus de la rabia a través de la unión de un anticuerpo antirrábico. La capacidad de los anticuerpos antirrábicos de la presente tecnología para neutralizar un virus de la rabia puede evaluarse in vitro o in vivo utilizando métodos conocidos la técnica. Los métodos in vitro ilustrativos incluyen la prueba de inhibición de foco fluorescente rápida (RFFIT), como se describe en Smith et al, "A rapid fluorescent focus inhibition test (RFFIT) for determining rabies virus-neutralizing antibody, " in: Meslin F-X, Kaplan MM, Koprowski H, eds. Laboratory techniques in rabies.4A ed. Geneva, Switzerland: World Health Organization 1996; 181-192. Los métodos in vivo ilustrativos incluyen pero no se limitan a prueba de neutralización en ratón (MNT), tal como se describe en Hasse, et al., 13(2) J. Biol Stand.123-28 (1985). Los resultados ilustrativos de RFFIT y MNT se muestran en los ejemplos, infra. En algunas modalidades, la infectividad del virus de la rabia es neutralizada al menos 5 %, al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 25 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 75 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 99 %, menos 99.5 %, al menos el 99.9 % o al menos 100 %.
Medición de interferencia de la vacuna de la rabia. Los anticuerpos antirrábicos de la presente teenología tienen la capacidad de neutralizar el virus de la rabia en un sujeto en su necesidad, sin interferir con la eficacia de una vacuna contra la rabia. Este aspecto de la presente tecnología es de particular valor porque las terapias usuales contra la rabia comprenden la coadministración de vacunas contra la rabia y los anticuerpos. El grado al que un anticuerpo antirrábico interfiere con la eficacia de una vacuna de rabia puede evaluarse utilizando métodos conocidos en la técnica, tal como el que se demuestra en los ejemplos, infra. Brevemente, vacuna contra la rabia puede administrarse a los sujetos animales junto con o en la ausencia de anticuerpos antirrábicos. Tras un periodo de tiempo suficiente para que la vacuna provoque una respuesta inmune en los sujetos, los títulos específicos de vacuna de los sujetos administrados con la vacuna sola se comparan con aquellos sujetos administrados con la vacuna en conjunción con el anticuerpo. El grado al que un anticuerpo antirrábico interfiere con la eficacia de la vacuna se refleja en un anticuerpo específico de vacuna reducido. Los resultados ilustrativos de dicho experimento se muestran en los ejemplos, infra. En algunas modalidades, el anticuerpo interfiere con la respuesta inmune inducida por la vacuna antirrábica, menos de 0.1 %, menos de 0.5 %, menos de 1 %, menos de 2 %, menos del 5 %, menos de 10 %, menos de 20 %, menos de 25 %, menos de 50 %, o menos de 75 % en comparación con un sujeto de control que se administra con la vacuna pero no administrado con el anticuerpo.
Medida de profilaxis post-exposición. Los anticuerpos antirrábicos pueden ser evaluados para la profilaxis post exposición en sujetos expuestos al virus de la rabia utilizando métodos conocidos en la materia como aquéllos mostrados en los ejemplos, infra. Brevemente, los sujetos animales expuestos al virus de la rabia pueden ser administrados con uno o más anticuerpos antirrábicos candidato como un componente del tratamiento post-exposición. El anticuerpo se puede administrar solo o en combinación con terapias de rabia conocidas tal como una vacuna. Después de un período de tiempo suficiente para la infección de rabia a sobrevenir, la tasa de supervivencia de los sujetos administrados con el anticuerpo es comparado con los controles adecuados, en que ningún anticuerpo candidato se administra. La reducción de infectividad del virus de la rabia se refleja en una tasa incrementada o duración de supervivencia de los sujetos administrados al anticuerpo candidato en comparación con los controles. Los resultados ilustrativos de dichos experimentos se muestran en los ejemplos, infra.
II. Usos de los anticuerpos antirrábicos de la presente teenología A. Usos de diagnóstico de anticuerpos antirrábicos Los anticuerpos antirrábicos de la presente tecnología son útiles en los métodos de diagnóstico. Como tal, la presente tecnología proporciona métodos usando los anticuerpos en el diagnóstico de la infección por rabia en un sujeto. Los anticuerpos antirrábicos de la presente tecnología pueden ser seleccionados tal que tienen algún nivel especificidad de unión de epítope y afinidad de unión muy alta para una glicoproteína de la rabia. En general, cuanto mayor sea la afinidad de unión de un anticuerpo las condiciones de lavado más estrictas se pueden realizar en un inmunoensayo para eliminar un material de unión no específicamente sin la eliminación del polipéptido objetivo. En consecuencia, los anticuerpos antirrábicos útiles de la presente tecnología en ensayos de diagnósticos generalmente tienen afinidades de unión de al menos 10®, 109, 1010, 1011, 1012 M. Además, es deseable que anticuerpos antirrábicos utilizados como reactivos de diagnóstico tienen una tasa cinética suficiente para alcanzar el equilibrio bajo condiciones estándar en al menos 12 h, por lo menos cinco (5) h, o por lo menos una (1) hora.
Los anticuerpos antirrábicos pueden utilizarse para detectar una rabia inmunorreactiva o una glicoproteína tipo rabia inmunoreactiva en una variedad de formatos de ensayo estándar. Dichos formatos incluyen inmunoprecipitación, Western Blot, ELISA, radioinmunoanálisis, y ensayos inmunométríeos. Véase Harlow & Lañe, Antibodies, A Laboratory Manual (Coid Spring Harbor Publications, New York, 1988); patentes US 3,791,932; 3,839, 153; 3,850,752; 3,879,262; 4,034,074, 3,791,932; 3,817,837; 3,839, 153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; y 4,098,876. Las muestras biológicas pueden obtenerse de cualquier tejido o fluido corporal de un sujeto.
B. Uso profiláctico y terapéutico de anticuerpos antirrábicos Los anticuerpos antirrábicos de la presente teenología son útiles en la terapia de profilaxis post exposición (PPE) para los sujetos expuestos al virus de la rabia. Las posibles exposiciones incluyen la exposición a mordida (es decir, cualquier penetración de la piel por los dientes) incluyendo mordeduras de animales y la exposición a no mordedura. La exposición sin mordedura incluye el contacto con animales infectados o productos animales, tal como pero no limitado a pelo, por ejemplo, sangre, tejidos, orina, heces y saliva. Terapia de PEP típicamente comprende la administración de anticuerpos antirrábicos a un sujeto en necesidad de los mismos en combinación con una vacuna antirrábica.
Las composiciones de la presente teenología pueden emplearse en conjunción con otras moléculas útiles en la profilaxis y/o el tratamiento de la infección o exposición a la rabia. Por ejemplo, pueden ser administrados con una o más vacunas contra el virus de la rabia. Alternativamente, los anticuerpos de la presente tecnología pueden ser administrados antes o después de una o más vacunas. Los anticuerpos pueden administrarse en combinación con las vacunas antirrábicas, incluyendo pero no limitado a, por ejemplo, vacuna de células embrionarias de polluelo purificadas (PCECV; RabAvert ®, Novartis, Basel, Suiza; Rabipur®, Chiron Behring GmbH & Co., Liederbach, Alemania), vacuna de células diploides humanas (HDCV; Imovax®, Sanofi Pasteur, Swiftwater, PA, USA) y la vacuna de la rabia adsorbida (RVA). Adicionalmente o alternativamente, las composiciones de la presente tecnología además pueden administrarse conjuntamente con inmunoglobulina de rabia humana (HRIG) o inmunoglobulina de rabia equina (ERIG).
Las composiciones de la presente teenología pueden opcionalmente ser administradas como un bolo único a un sujeto en su necesitad. Alternativamente, el régimen de dosificación puede comprender múltiples administraciones realizadas en diferentes tiempos post-exposición. Por ejemplo, el régimen de dosificación puede abarcar cinco dosis de vacuna contra la rabia por vía intramuscular y/o por vía intraperitoneal en los días 0, 3, 7, 14 y 28 después de la exposición. El sitio de administración puede variar en relación con el sitio de la exposición a la rabia. Por ejemplo, las composiciones de la presente tecnología pueden ser administradas en y alrededor de las heridas en el día 0 o de otra manera tan pronto como sea posible después de la exposición, con el volumen restante dado por vía intramuscular en un sitio distante del sitio. Alternativamente, todas las composiciones pueden ser administradas en un sitio distante al sitio de la exposición. Las composiciones de la presente tecnología pueden ser administradas en el mismo sitio o en un sitio diferente como la administración de una vacuna contra la rabia.
La administración puede realizarse por cualquier ruta adecuada, incluyendo oralmente, intranasalmente, parenteralmente (por intravenosamente, intramuscularmente, intraperitonealmente, o subcutáneamente), rectalmente, intracranealmente, intratecalmente, o tópicamente. La administración incluye auto-administración y la administración por otra. También puede apreciarse que los diversos modos de tratamiento o prevención de condiciones médicas descritas como se destina que signifique "sustancial", que incluye total pero también tratamiento menos total o la prevención, y en donde se logra un resultado relevante biológicamente o médicamente.
En algunas modalidades, los anticuerpos de la presente teenología comprenden formulaciones farmacéuticas que pueden administrarse a los sujetos en su necesidad en una o más dosis. Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica o una respuesta profiláctica).
Por lo general, una cantidad efectiva de las composiciones de la presente tecnología, suficiente para lograr un efecto terapéutico o profiláctico, varía de aproximadamente 0.000001 mg por kilogramo de peso corporal por día a unos 10,000 mg por kilogramo de peso corporal por día. Por lo general, los intervalos de dosificación son de aproximadamente 0.0001 mg por kilogramo de peso corporal por día a aproximadamente 100 mg por kilogramo de peso corporal al día. Para la administración de anticuerpos antirrábicos, la dosificación oscila entre aproximadamente 0.0001 a 100 mg/kg, y más generalmente 0.01 a 5 mg/kg cada semana, cada dos semanas o cada tres semanas, el peso corporal del huésped. Por ejemplo las dosificaciones pueden ser 1 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal cada semana, cada dos semanas o cada tres semanas o dentro del intervalo de 1-10 mg/kg cada semana, cada dos semanas o cada tres semanas. En una modalidad, una sola dosis del anticuerpo varía de 0.1-10,000 microgramos por kg de peso corporal. En una modalidad, las concentraciones de anticuerpos en un portador varían de 0.2 a 2000 microgramos por mililitro suministrado. Un régimen de tratamiento ejemplar implica la administración de una vez por cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses. Los anticuerpos antirrábicos pueden ser administrados en múltiples ocasiones. Los intervalos entre las dosificaciones únicas pueden ser cada hora, diariamente, semanalmente, mensualmente o anualmente. Los intervalos también pueden ser irregulares como se indica mediante la medición de los niveles sanguíneos de anticuerpos en el sujeto. En algunos métodos, la dosificación se ajusta para lograr una concentración de anticuerpo del suero en el sujeto de aproximadamente 75 mg/ml a aproximadamente 125 pg/ml, 100 pg/ml a aproximadamente 150 mg/ml, de aproximadamente 125 mg/ml a aproximadamente 175 pg/ml, o de aproximadamente 150 ug/ml a aproximadamente 200 pg/ml. Alternativamente, los anticuerpos antirrábicos pueden ser administrados como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso la administración menos frecuente es requerida. La dosificación y frecuencia varían según la vida media del anticuerpo en el sujeto. La dosificación y la frecuencia de administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, es administrada una dosificación relativamente baja a intervalos relativamente infrecuentes durante un largo período de tiempo. En aplicaciones terapéuticas, una dosificación relativamente alta en intervalos relativamente cortos a veces se requiere hasta la progresión de la enfermedad es reducida o terminada, o hasta que el sujeto muestra mejoría parcial o total de los síntomas de la enfermedad. Posteriormente, puede administrase al paciente un régimen profiláctico.
Toxicidad. Óptimamente, una cantidad efectiva (por ejemplo, dosis) del anticuerpo antirrábico descrito aquí ofrecerá beneficios terapéuticos sin causar toxicidad substancial al sujeto. La toxicidad del anticuerpo antirrábico descrito puede determinarse por procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o en animales de experimentación, por ejemplo, mediante la determinación de DL50 (la dosis letal al 50 % de la población) o la LD100 (la dosis letal al 100 % de la población). La relación de dosis entre el efecto tóxico y terapéutico es el índice terapéutico. Los datos obtenidos en estos ensayos de cultivo celular y los estudios en animales pueden ser utilizados en la formulación de un intervalo de dosificación que no es tóxico para el uso en humanos. La dosis del anticuerpo antirrábico descrita aquí se encuentra dentro de un intervalo de concentraciones de circulación que incluyen la dosis efectiva con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. La formulación exacta, ruta de administración y dosificación puede ser elegida por el médico individual teniendo en cuenta la condición del sujeto. Véase, por ejemplo, Fingí et al, In: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch.1 (1975).
Formulaciones de composiciones farmacéuticas. De acuerdo con los métodos de la presente teenología, puede incorporarse anticuerpo antirrábico en composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración. Las composiciones farmacéuticas comprenden generalmente anticuerpo nativo purificado sustancialmente o recombinante y un portador frmacéuticamente aceptable en una forma adecuada para la administración a un sujeto. Los portadores farmacéuticamente aceptables son determinados en parte por la particular composición siendo administrada, así como por el particular método usado para administrar la composición. En consecuencia, existe una amplia variedad de formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas para la administración de las composiciones de anticuerpo (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, EE.UU., 18a ed., 1990). Las composiciones farmacéuticas generalmente se formulan como estériles, isotónicas sustancialmente y en plena conformidad con todas las regulaciones de buenas prácticas de manufactura (GMP) de la Administración de alimentos y fármacos de los EE. UU.
Los términos "farmacéuticamente aceptable", "fisiológicamente tolerable", y sus variaciones gramaticales, como se refieren a las composiciones, portadores, diluyentes y reactivos se usan indistintamente y representan que los materiales son capaces de administración para o sobre un sujeto sin la producción de efectos fisiológicos no deseados al grado de que prohibiría la administración de la composición. Por ejemplo, "excipiente farmacéuticamente aceptable" significa un excipiente que es útil en la preparación de una composición farmacéutica que es generalmente seguro, no tóxico, y deseable e incluye excipientes que son aceptables para uso veterinario así como para uso farmacéutico humano. Dichos excipientes pueden ser sólidos, líquidos, semisólidos o, en el caso de una composición del aerosol, gaseosa. "Sales y esteres farmacéuticamente aceptables" significa sales y ásteres son farmacéuticamente aceptables y tienen las propiedades frmacológicas deseadas. Dichas sales incluyen sales que se pueden formar donde los protones ácidos presentes en la composición son capaces de reaccionar con bases orgánicas o inorgánicas. Las sales inorgánicas adecuadas incluyen aquellas que se formaron con los metales alcalinos, por ejemplo, sodio y potasio, magnesio, calcio y aluminio. Las sales orgánicas adecuadas incluyen aquellas formadas con bases orgánicas tales como bases de amina, por ejemplo, etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, trometamina, N-metilglucamina y lo similar. Estas sales también incluyen sales de adición ácida formadas con ácidos inorgánicos (por ejemplo, ácido clorhídrico y bromhídrico) y ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido acético, ácido cítrico, ácido maléico y los ácidos alcano- y areno-sulfónico tal como ácido metanosulfónico y ácido bencenosulfónico). Los ésteres farmacéuticamente aceptables incluyen ésteres formados a partir de grupos carboxi, sulfoniloxi, y fosfonoxi presentes en el anticuerpo antirrábico, por ejemplo, ésteres de alquilo Ci-6. Cuando hay dos grupos ácidos presentes, una sal farmacéuticamente aceptable o éster puede ser un mono-ácido-mono-sal o éster o una di-sal o áster; y del mismo modo donde existen más de dos grupos ácidos presentes, todos o algunos de estos grupos pueden ser salificados o esterificados. El anticuerpo antirrábico nombrado en esta teenología puede estar presente en forma no salificada o no esterificada, o en forma esterificada y/o salificada, y el nombramiento de dichos anticuerpos antirrábicos pretende incluir tanto el compuesto original (no salificado y no esterificado) y su sus sales y ásteres farmacéuticamente aceptables. También, ciertas modalidades de la presente tecnología pueden estar presentes en más de una forma estereoisomérica, y el nombramiento de dicho anticuerpo antirrábico pretende incluir todos los estereoisomeros solos y todas las mezclas (sea racémico o no) de dichos estereoisómeros. Una persona de experiencia ordinaria en la técnica, no tendría ninguna dificultad para determinar el momento apropiado, secuencia y dosificaciones de administración para fármacos particulares y composiciones de la presente tecnología.
Los ejemplos de dichos portadores o diluyentes incluyen, pero no se limitan a, agua, solución salina, soluciones de Ringer, solución de dextrosa y 5% albúmina sérica humana. Liposomas y vehículos no acuosos tales como los aceites fijos también pueden ser utilizados. El uso de dichos medios y compuestos para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la téenica. Excepto si es que cualquier media convencional o compuesto es incompatible con el anticuerpo antirrábico, su uso en las composiciones se contempla. Los compuestos activos complementarios también pueden ser incorporados en las composiciones.
Una composición farmacéutica de la presente tecnología está formulada para que sea compatible con su ruta prevista de administración. Las composiciones de anticuerpo antirrábico de la presente tecnología pueden ser administradas por rutas parenteral, tópica, intravenosa, oral, subcutánea, intraarterial, intradérmica, transdérmica, rectal, intracraneal, intratecal, intraperitoneal, intranasal; o intramusculares, o como inhalantes. El anticuerpo antirrábico opcionalmente puede administrarse en combinación con otros agentes que son al menos parcialmente efectivos en el tratamiento de varias enfermedades que incluyen varias enfermedades relacionadas con actina o microfilamentos.
Las soluciones o suspensiones utilizadas para uso parenteral, intradérmico o subcutáneo pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como el agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros solventes sintéticos; compuestos antibacterianos tal como alcohol bencílico o metil parabenos,- antioxidantes tal como el ácido ascórbico o bisulfito de sodio; compuestos quelantes tales como ácido etilendiaminotetracético (EDTA); reguladores de pH tal como acetatos, citratos o fosfatos y compuestos para el ajuste de tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. Puede ajustarse el pH con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede ser incluida en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiples hechas de vidrio o plástico.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para el uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (donde sean solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones inyectables estériles o dispersión. Para la administración intravenosa, portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, N.J., EE.
UU.) o solución salina regulada de pH con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que existe capacidad para disponerse en jeringa de manera fácil. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe preservarse contra la acción contaminante de microorganismos tal como bacterias y hongos. El portador puede ser un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y lo similar) y sus mezclas adecuadas. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y por el uso de surfactantes. La prevención de la acción de microorganismos puede lograrse mediante varios compuestos antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y lo similar. En muchos casos, será deseable incluir compuestos isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tal como manitol, sorbítol, cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede realizarse mediante la inclusión en la corrposición de un compuesto que retrasa la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse mediante la incorporación de los anticuerpos antirrábicos en la cantidad necesaria en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan mediante la incorporación del anticuerpo antirrábico en un vehículo estéril que contiene un medio básico de dispersión y requiere los otros ingredientes de aquellos enumerados anteriormente.
En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones estériles inyectables, los métodos de preparación son secar al vacío y secar por congelación que produce un polvo de cualquier ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de su solución filtrada estéril. Los anticuerpos de la presente teenología pueden ser administrados en forma de una inyección de depósito o preparación de implante que puede ser formulada de tal manera que permite una liberación sostenida o pulsátil del ingrediente activo.
Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un portador comestible. Pueden ser encerrados en cápsulas de gelatina o comprimidos en tabletas. Con el propósito de la administración terapéutica oral, el anticuerpo antirrábico puede ser incorporado con excipientes y utilizado en forma de tabletas, trociscos o cápsulas. Las composiciones orales también pueden prepararse utilizando un portador fluido para su uso como un enjuague bucal, en donde el compuesto en el fluido portador se aplica por vía oral y se disuelve en la boca y es expectorada o tragada. Los compuestos de unión farmacéuticamente compatibles, y/o materiales adyuvantes pueden ser incluidos como parte de la composición. Las tabletas, pastillas, cápsulas, trociscos y lo similar pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de naturaleza similar; un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un compuesto de desintegración tal como ácido algínico, primogel o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un deslizante tal como el dióxido de silicio coloidal; un compuesto edulcorante tal como la sacarosa o sacarina; o un compuesto saborizante tal como menta, salicilato de metilo o saborizante de naranja.
Para la administración por inhalación, el anticuerpo antirrábico se suministra en la forma de un rociador en aerosol del contenedor presurizado o dispensador que contiene un propulsor adecuado, por ejemplo, un gas tal como el dióxido de carbono, o un nebulizador.
La administración sistémica también puede ser por medio transmucosal o transdérmico. Para la administración transmucosal o transdérmica, penetrantes apropiados a la barrera para ser penetrada se utilizan en la formulación. Dichos penetrantes generalmente son conocidos en la téenica e incluyen, por ejemplo, para administración transmucosal, detergentes, sales biliares y derivados de ácido fusídico. La administración transmucosal puede lograrse mediante el uso de rociadores nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, el anticuerpo antirrábico está formulado en ungüentos, bálsamos, geles o cremas como generalmente conocidos en la téenica.
El anticuerpo antirrábico también se puede preparar como composiciones farmacéuticas en la forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorio convencionales tal como la manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para suministro rectal.
En una modalidad, el anticuerpo antirrábico se prepara con portadores que protegerán el anticuerpo antirrábico contra la eliminación rápida del cuerpo, tales como una formulación de liberación controlada, que incluyen implantes y sistemas de suministro microencapsulados. Pueden utilizarse polímeros biodegradables, biocompatibles, tal como acetato de etileno vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de dichas formulaciones serán evidentes para aquellos con experiencia en la técnica. Los materiales también pueden obtenerse comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones liposómicas (que incluyen los liposomas dirigidos a las células infectadas con anticuerpos monoclonales para antígenos virales) también pueden utilizarse como portadores farmacéuticamente aceptable. Estos pueden prepararse de acuerdo con métodos conocidos por aquellos especializados en la téenica, por ejemplo, como se describe en patente US 4,522,811.
C. Kits La presente tecnología proporciona kits para el diagnóstico, profilaxis y/o tratamiento de infección por rabia, que comprenden al menos un anticuerpo de la presente tecnología, o su variante funcional. Opcionalmente, los componentes descritos anteriormente de los kits de la presente tecnología son envasados en contenedores adecuados y etiquetados para el diagnóstico, profilaxis y/o tratamiento de rabia. Los componentes mencionados anteriormente pueden almacenarse en unidad o contenedores de dosis múltiples, por ejemplo, ampollas selladas, viales, botellas, jeringas y tubos de ensayo, como una solución acuosa, preferentemente estéril, o como una formulación liofilizada, preferentemente estéril, para la reconstitución. El kit puede comprender además un contenedor que mantiene un diluyente adecuado para diluir la composición farmacéutica hacia un volumen más alto. Los diluyentes adecuados incluyen, pero no se limitan a, el excipiente farmacéuticamente aceptable de la composición farmacéutica y una solución salina. Además, el kit puede comprender las instrucciones para diluir la composición farmacéutica y/o instrucciones para administrar la composición farmacéutica, ya sea diluida o no. Los contenedores pueden formarse a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico y pueden tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el contenedor puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón que puede ser atravesado por una aguja de inyección hipodérmica). El kit puede además comprender más contenedores que comprenden un regulador de pH farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina regulada de pH con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Además puede incluir otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, que incluyen otros reguladores de pH, diluyentes, filtros, agujas, jeringas, medio de cultivo para uno o más huéspedes adecuados. Los kits pueden incluir opcionalmente instrucciones habitualmente incluidas en paquetes comerciales de productos terapéuticos, profilácticos o de diagnósticos, que contienen información sobre, por ejemplo, las indicaciones, uso, dosificación, fabricación, administración, contraindicaciones y/o advertencias relativas al uso de dichos productos terapéuticos, profilácticos o de diagnóstico.
Los kits son útiles para detectar la presencia de una glicoproteína de rabia inmunoreactiva o una glicoproteína tipo rabia inmunoreactiva en una muestra biológica, por ejemplo, cualquier fluido corporal incluyendo, pero sin limitarse a, por ejemplo, suero, plasma, linfa, fluido cístico, orina, heces, líquido cefalorraquídeo, líquido ascítico o sangre e incluyendo las muestras de biopsia de tejido corporal. Por ejemplo, el kit puede comprender uno o más anticuerpos antirrábicos capaces de unir una glicoproteína de rabia o una glicoproteína tipo rabia en una muestra biológica (por ejemplo, un anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno que tienen la misma especificidad de unión a antígeno de anticuerpos producidos por una línea celular depositada seleccionada del grupo que consiste de: CGMCC Nos. de acceso 4805 y 4806); medios para determinar el importe de la glicoproteína de rabia o la glicoproteína tipo rabia en la muestra; y los medios para comparar la cantidad de la glicoproteína de rabia inmunoreactiva o la glicoproteína tipo rabia inmunoreactiva en la muestra con un estándar. Uno o más de los anticuerpos antirrábicos pueden etiquetarse. Los componentes del kit, (por ejemplo, reactivos) pueden ser empacados en un contenedor adecuado. El kit puede implicar además instrucciones para utilizar el kit para detectar la glicoproteína de rabia inmunoreactiva o la glicoproteína tipo rabia.
Para los kits basados en anticuerpos, el kit puede comprender, por ejemplo, 1) un primer anticuerpo, por ejemplo, unido a un soporte sólido, que se une a una glicoproteína de rabia, correspondiente a la presente teenología; y, opcionalmente; 2) un segundo anticuerpo diferente que se une a la glicoproteína de rabia o al primer anticuerpo y se conjuga con una etiqueta detectadle.
El kit puede comprender, por ejemplo, un agente regulador de pH, un preservativo o un agente estabilizador de proteína. El kit puede comprender además de los componentes necesarios para detectar la etiqueta detectadle, por ejemplo, una enzima o un substrato. El kit también puede contener una muestra de control o una serie de muestras de control, que puede ser analizada y comparado a la muestra de prueba. Cada componente del kit puede ser incluido dentro de un contenedor individual y todos los diversos contenedores pueden estar dentro de un solo paquete, junto con instrucciones para interpretar los resultados de los ensayos realizados utilizando el kit. Los kits de la presente teenología pueden contener un producto escrito en o en el contenedor del kit. El producto escrito describe ahora cómo utilizar los reactivos incluidos en el kit, por ejemplo, para la detección de una glicoproteína del virus de la rabia in vitro o in vivo, o para el tratamiento o la prevención de la infección por rabia en un individuo en su necesidad. En varias modalidades, el uso de los reactivos puede ser de acuerdo con los métodos de la presente tecnología.
EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar más plenamente las modalidades selectas de la presente teenología. Estos ejemplos no deben en ninguna manera interpretarse como limitación del alcance de la presente tecnología, según lo definido por las reivindicaciones anexadas.
Los siguientes ejemplos muestran la preparación, caracterización y uso de los anticuerpos antirrábicos ilustrativos de la presente tecnología. El ejemplo 1 describe la preparación de anticuerpos monoclonales murinos. Los ejemplos 2-7 demuestran la especificidad de los anticuerpos ilustrativos de glicoproteína de virus de la rabia, la capacidad de los anticuerpos para neutralizar el virus de la rabia, la competencia entre los anticuerpos para unir a la glicoproteína de virus de la rabia, el grado al que los anticuerpos efectúan la inmunogenicidad de una vacuna contra la rabia, y la capacidad de una combinación de los anticuerpos que neutralizan el virus de la rabia. Los ejemplos 8-15 demuestran la producción de versiones quiméricas y humanizadas de dos de los anticuerpos ilustrativos y la caracterización de sus especificidades de unión, las capacidades para neutralizar el virus de la rabia, y el uso en la protección post exposición contra la infección del virus de la rabia.
EJEMPLO 1 Preparación y caracterización de anticuerpos neutralizantes del virus de la rabia murina Los anticuerpos neutralizantes del virus de la rabia murina pueden obtenerse por cultivar un hibridoma que, a su vez, puede obtenerse por inmunización de un ratón con la glicoproteína de rabia y posteriormente fusionar las células del bazo o células del nodo linfático de ratón con células de mieloma de ratón. El procedimiento para la preparación de los anticuerpos antirrábicos se detalla a continuación con referencia a los pasos descritos anteriormente. Este método para la preparación de un anticuerpo de la presente invención se destina solamente a ser ilustrativa de los métodos de preparación y no se limita al mismo. Pueden seguirse otros procedimientos conocidos.
La presente teenología utiliza una glicoproteína de girus de rabia (GenBank No. de acceso ABY1950) como un inmunógeno para inducir un anticuerpo capaz de neutralizar el virus de la rabia. El inmunógeno preparado se mezcla con un adyuvante, tal como adyuvante de Freund completo o incompleto y administrado a un ratón. Las rutas de administración adecuadas para inmunizar un animal experimental incluyen las inyecciones subcutáneas, intraperitoneales, intravenosas, intradérmicas e intramusculares, con inyecciones subcutáneas e intraperitoneales que son preferidas. Las inmunizaciones opcionalmente se realizan por una sola dosis o, por varias dosis repetidas a intervalos apropiados. La producción de anticuerpo de animales inmunizados está determinada por los niveles séricos de un anticuerpo específico del antígeno. Cuando se logran altos títulos de anticuerpo, los animales pueden utilizarse como una fuente para la preparación de células productoras de anticuerpo. En general, las células de producción de anticuerpo pueden ser colectadas en 3-5 días después de la última inyección con un inmunógeno.
Los linfocitos y células plasmáticas obtenidos de cualquier parte adecuada del animal son células precursoras para producir el anticuerpo. Fuentes de linfocitos o células plasmáticas incluyen bazo, ganglios linfáticos, sangre periférica o cualquier combinación apropiada de los mismos, con células del bazo, que son la fuente más común. Después de la última inyección de refuerzo, la suspensión del linfocito único se prepara de tejido linfoide en el cual las células que producen anticuerpo están presentes. La téenica de fusión incluye lavado de células del bazo y mieloma con medio sin suero (tal como RPMI 1640) o solución salina regulada de pH con fosfato (en lo sucesivo referido como "PBS") para que la relación de número de células del bazo a células del mieloma sea aproximadamente entre 5:1 y 10:1 y luego se centrifuga. Después de que el sobrenadante ha sido desechado y las células pelladas suficientemente aflojadas, 1 mi de medio libre de suero que contiene 50% (p/v) de polietilenglicol (p.m.1,000 a 4,000) se agrega gota a gota con mezclado. Posteriormente, 10 mi de medio libre de suero se añade lentamente y luego se centrifuga. El sobrenadante se desecha otra vez, y las células pelladas se suspenden en una cantidad adecuada de medio HAT que contiene una solución de hipoxantina, aminopterina y timidina (en lo sucesivo, referido como "HAT").
Las células de líneas celulares de ratón establecidas sirven como la fuente de células del mieloma para la fusión, incluyendo P3X63Ag8U.l (P3-U1), P3/NSl/l-Ag4-l(NS-1). SP2/0- Agl4 (SP-2), P3X63Ag8.653 y P3X63 Ag8 (X63), que pueden adquirirse de ATCC. La línea celular seleccionada se transfiere en serie en un medio apropiado, tal como el medio de 8-azaguanina. El medio de 8-azaguanina incluye medio modificado de Dulbecco de Iscove (en lo sucesivo referido como "IMDM") o medio Eagle modificado de Dulbecco (en lo sucesivo, referido como "DMEM"). Medio RPMI-1640 suplementado con glutamina, 2-mercaptoetanol, gentamicina, suero fetal de ternero (en lo sucesivo, referido como "FCS") y 8-azaguanina.
Después de la fusión, cualquiera de las células del mieloma no fusionadas y cualquiera de las fusiones mieloma-mieloma son incapaces de sobrevivir en medio HAT. Por otro lado, las fusiones de anticuerpo producen células con unos a otros, así como hibridomas de células productoras de anticuerpos con células de mieloma pueden sobrevivir, el anterior solamente teniendo una vida limitada. En consecuencia, se continúa la incubación en resultados de medios HAT en selección de sólo los hibridomas deseados. Los hibridomas resultantes crecen en colonias que luego se transfieren a medio HAT que carece de aminopterina (medio HT). Posteriormente, se eliminan las alícuotas del sobrenadante del cultivo para determinar el título del anticuerpo mediante, por ejemplo, ELISA. Los hibridomas que han sido mostrados por producir anticuerpos específicos se transfieren a otra placa para clonación.
Los hibridomas ratón-ratón RV3D11E31A9 y RV7G11A32G11, que son una base para los anticuerpos de la presente teenología, se depositaron con CGMCC el 12 de mayo de 2011 y tienen los números de acceso de CGMCC 4805 y 4806, respectivamente.
Después de obtener hibridoma productor de anticuerpo estable, el cultivo de hibridoma seleccionado puede ser ampliado. El sobrenadante del cultivo a gran escala entonces es cosechado y purificado por un método adecuado, tal como cromatografía de afinidad y filtración con gel. El hibridoma también puede ser cultivado por vía intraperitoneal en un ratón singenéico, tal como un ratón BALB/c o un ratón nu/nu, para obtener ascitis que contiene un anticuerpo monoclonal antirrábico en grandes cantidades.
EJEMPLO 2 Actividad de unión de anticuerpos neutralizantes del virus de la rabia murina La actividad de unión de cinco anticuerpos neutralizantes del virus de la rabia (RVNAs) a la glicoproteína RV del virus de rabia se estudió en este ejemplo. Los RVNAs de murina y otros materiales biológicos usados en los ejemplos 1-6 se muestran en el cuadro 3. Los animales utilizados en estos estudios incluyen ratones BALB/c, hembras, de 6-8 semanas, que pesan 20 a 30 gramos, grado SPF y hámsteres sirios, de 2-3 meses, que pesan 100 gramos, grado SPF.
CUADRO 3 Bio-Reactivos Las curvas de unión de las cinco RVNAs a glicoproteína RV según lo determinado por el inmunoensayo enzimático de quimioluminiscencia indirecta (CLEIA) se muestran en la figura 1. La glicoproteína se diluye a 1:500 en PBS y luego se recubre la microplaca. Cinco clones de RVNA se diluyeron hasta 10000, 2000, 400, 80, 16, 3.2 y 0.64 ng/ l, respectivamente. IgG2a-FIRP anti-ratón de cabra y IgG2b-FIRP anti-ratón de cabra se utilizan como el anticuerpo secundario conjugado con enzima. La unidad de luminosidad relativa (RLU) representa la señal de quimioluminiscencia.
Estos resultados demuestran que los anticuerpos antirrábicos de la presente teenología unen específicamente glicoproteína del virus de la rabia, y que son útiles en los métodos relacionados con dicha unión específica, incluyendo métodos para detectar la glicoproteína del virus de la rabia en una muestra, o tratar o prevenir la infección de rabia en un sujeto en necesidad del mismo y métodos para proporcionar la protección post-exposición contra la infección de la rabia a un sujeto en su necesidad.
EJEMPLO 3 Potencia neutralizante de RVNAs de murina y caracterización del epitope La potencia neutralizante in vitro de los cinco RVNAs y el epitope neutralizante reconocido por RVNAs como se describe aquí. Para preparar el virus CVS-ll, monocapas de células de neuroblastoma se infectan con virus de desafío estándar-11 (CVS-ll) u otros virus en una multiplicidad de infección (MOI) de 0.3 durante 15 min a 37°C/0.5 % de CO2. El inoculo de virus entonces se elimina, se añade medio fresco a las células, y la incubación se continúa por 40 h a 37°C/0.5 % de C02. Los sobrenadantes de cultivo se recogen y almacenados a -80°C hasta su uso posterior.
La prueba de inhibición de foco fluorescente rápida estándar (RFFITs) para la neutralización se realiza como se describe anteriormente en Smith et al., (Una prueba de inhibición de foco fluorescente rápida (RFFIT) para la determinación de anticuerpo neutralizante de virus de la rabia. En: Meslin F-X, Kaplan MM, Koprowski H, eds. Laboratory techniques in rabies.4a ed. Geneva, Switzerland: World Health Organization 1996; 181-192). Para determinar la potencia neutralizante de cada RVNA, el 50 % de los títulos neutralizantes se compararon con el 50 % del título neutralizante del estándar (estándar GB), que se define como 21.4 IU/mL. Los resultados de la prueba RFFIT usando virus de la rabia CVS-11 se muestra en el cuadro 4.
CUADRO 4 Potencia neutralizante in vitro de RVNAs Para identificar las características del epítope de glicoproteína que se reconoce por 3D11E3, 3H10D3, 5A1C10, 6F11C1 y 7G11A3, análisis Western y CLEIA se realizan. Para el Western Blot, las glicoproteínas reducidas y no reducidas se separan por electroforesis SDS-PAGE, y se prueba con los cinco RVNAs (FIG. 2). Para los RVNAs, se utilizó 1 mg/mL de anticuerpo. El anticuerpo secundario es Ig (H+L)-HRP anti-ratón de cabra, diluido 1:2000. Se encuentra que la glicoproteína del virus de la rabia puede ser reconocida por todos los 5 RVNAs bajo condición de no reducción. Sin embargo, solo 3D11E3, 3H10D3 y 5A1C10 pueden reconocer la glicoproteína reducida. Los resultados confirman que el epítope reconocido por 3D11E3, 3H10D3 o 5A1C10 es un epítope lineal mientras que el epítope reconocido por 6F11C1 o 7G11A3 es un epítope conformacional.
Los cinco RVNAs se unen a la glicoproteína de virus de la rabia (RVGP) que se trata con diferentes reguladores de pH. La glicoproteína se disuelve en regulador de pH de carbonato (CB), regulador de pH de carbonato que incluye 0.1 % de sulfato dodecil de sodio (CB+0.1 % peso/vol de SDS) y regulador de pH de carbonato que incluye sulfato dodecil de sodio al 0.1 % y 0.1 % de b-mercaptoetanol (CB+0.1 % peso/vol SDS + b-ME), respectivamente y después se recubre con micro-placa. Los cinco RVNAs se diluyen hasta 10000, 2000, 400, 80, 16, 3.2 y 0.64 ng/mL y luego se hace reaccionar con el RVGP.
IgG2a-HRP anti-ratón de cabra y IgG2b-HRP anti-ratón de cabra diluido 1:2000 se utilizan como el conjugado de enzima de anticuerpo secundario. La señal de quimioluminiscencia (RLU) se muestra en las figuras 3A-E. Los resultados indican que el epítope se reconoce por 6F11C1 o 7G11A3 es más sensible al SDS que el reconocido por 3D11E3, 3H10D3 o 5A1C10. Por lo tanto, los resultados obtenidos de los dos métodos son consistentes entre sí epítopes lineales reconocidos 3D11E3, 3H10D3 y 5A1C10 epítopes conformacionales reconocidos 6F11C1 y 7G11A3.
Estos resultados muestran que los anticuerpos antirrábicos de la presente teenología neutralizan la infectividad del virus de la rabia, y que son útiles en métodos relacionados con la neutralización del virus de la rabia, que incluyen los métodos para tratar o prevenir la infección de rabia en un sujeto en su necesidad, y los métodos para proporcionar la protección post-exposición contra el virus de la rabia a un sujeto en su necesidad.
EJEMPLO 4 Amplitud de neutralización contra un panel de virus de la rabia Para analizar la amplitud de la neutralización, la cobertura de los cinco RVNAs (3D11E3, 3H10D3, 5A1C10, 6F11C1 y 7G11A3) contra un panel representativo de los 10 virus de la rabia de la calle (RVs) se determinan mediante la prueba de neutralización en ratón (MNT) (véase Hasse, et al., 13(2) J. Biol Stand. 123-28 (1985). Los resultados se muestran en la figura 4I-J y se resumen en el cuadro 5. Todos los RVNAs producen protección neutralizante contra la mayoría de los RV. Aunque una pequeña minoría de los sujetos en el grupo experimental muere, la muerte ocurre por lo menos 2 días después que el grupo de control (FIG. 4). En general, los resultados indican que todos los cinco RVNAs potentemente pueden neutralizar todo el panel de RVs.
CUADRO 5 ; i Estos resultados muestran que los anticuerpos antirrábicos de la presente teenología neutralizan la infectividad del virus de la rabia, y que son útiles en métodos relacionados con la neutralización del virus de la rabia, que incluyen los métodos para tratar o prevenir la infección de rabia en un sujeto en su necesidad, y los métodos para proporcionar la protección post-exposición contra el virus de la rabia a un sujeto en su necesidad.
EJEMPLO 5 Competencia entre anticuerpos neutralizantes antirrábicos Para investigar si los anticuerpos 3D11E3, 3H10D3, 5A1C10, 6F11C1 y 7G11A3 compiten entre sí para unir a la glicoproteína del virus de la rabia, un conjunto de experimentos de competencia se realizó usando CLEIA (Figura 5A-0). Brevemente, una microplaca de 96 pozos se recubre con glicoproteína de virus de la rabia diluida a 1:500 en PBS. Los microlitros (50 ml) se diluyen con anticuerpo antirrábico y 50 ml. mAb-HRP antirrábico se agregan a cada pozo y se incuban a 37°C durante 1 hora. Después de la incubación, la placa se lava con solución de lavado y 50 m? de solución de sustrato de quimioluminescencia mezclado se agrega. La placa se mantiene en un cuarto oscuro durante 3 minutos y luego se mide la intensidad de quimioluminiscencia.
El RLU del pozo que no tiene mAb antirrábico y sólo tiene conjugado mAb-HRP antirrábico se define como B0. El RLU de los otros pozos que tienen ambos mAb antirrábicos y conjugado mAb-HRP antirrábico se define como B. La tasa de unión se obtiene dividiendo BO por B. El anticuerpo no específico no bloquea la unión de cinco RVNA etiquetados con HRP (Figura 5C, F, I, L, O), de tal modo que sirve como el control negativo. Cuanto más baja la tasa de unión sea, más grande es la competencia de RVNA con el RVNA etiquetado con HRP. Los resultados muestran que 7G11A3 no efectúa substancialmente la unión de 3D11 A3-HRP (Figura 5A, B, C), 3H10D3-HRP (Figura 5D, E, F), 5A1C10-HRP (Figura 5G, H, I) o 6F11C1-HRP (Figura 5J, K, L) a la glicoproteína. La competición de 3H10D3 o 3D11E3 fue menor en comparación con la de los otros tres RVNAs para la unión del 7G11A3-HRP para RVGP (Figura 5M, N, O). En general, la competencia entre 3D11E3, 3H10D3 y 7G11A3 es relativamente menor en comparación con los otros desperdicios. Sobre esta base, 3D11E3, 3H10D3, y 7G11A3 se seleccionan para experimentos adicionales.
EJEMPLO 6 Inmunogenicidad de vacuna en hámsteres sirios no desafiados tratados con 3H10D3, 7G11A3, 3D11E3 o inmunoglobulina de virus de la rabia humana Durante la profilaxis post-exposición (PPE), existe la posibilidad que la administración simultánea de RVNAs y la vacuna disminuye la capacidad de la vacuna para inducir a los niveles de umbral de anticuerpos de neutralización necesarios para la protección. Por lo tanto, es importante evaluar el grado de la interferencia del tratamiento de mAb a la vacunación. Para determinar el efecto de RVNA en potencia de la vacuna, se realizó un experimento in vivo de animales en ausencia de RV (Figura 6). Para PEP, ratones BALB/c se administran con 50 mg/dosis de RVNA más vacuna o 20 UI/kg de inmunoglobulina de la rabia humana (HRIG) más la vacuna. Ratones de control son solamente administrados con la vacuna. Existen 6 ratones en cada grupo experimental. En los días 1, 3, 7, 14 y 28, se extrae la sangre de la órbita. Se combinaron los pares de muestras en cada grupo, dando un total de tres muestras de suero replicado para cada condición. Se midieron los títulos RVNA 1, 3, 7, 14 y 28 días post-tratamiento. Los resultados se resumen en la figura 6.
En los días 1 y 3, los títulos RVNA de suero son altos en ratones que recibieron 50 mg/dosis de RVNA (Figura 6A-C). Los títulos son menores en sujetos administrados con 20 IU/kg de HRIG junto con la vacuna, pero están todavía dentro del requisito WHO de > 0.5 Ul/ml (Figura 6). Los títulos no se detectan en sujetos administrados solo con la vacuna (Figura 6E). Los títulos de RVNA en ratones que reciben 50 pg/dosis de 7G11A3 (Figura 6A) o 50 pg/dosis de 3D11E3 (Figura 6B) se mantienen altos durante el período de 7-28 días y son superiores o equivalentes a los de los sujetos administrados sólo con la vacuna (Figura 6E). Sin embargo, los títulos RVNA en ratones que reciben 50 pg/dosis de 3H10D3 disminuyen notablemente desde el día 7 hasta el día 28 (Figura 6C). Este resultado indica que 11G7A3 y 3D11E3 no interfieren con la capacidad de la vacuna para inducir la producción de anticuerpos neutralizantes, y 3H10D3 reduce la eficacia de la vacuna.
Estos resultados muestran que los anticuerpos antirrábicos de la presente teenología neutralizan la inefectividad del virus de la rabia sin reducir la inmunogenicidad de la vacuna antirrábica. Como tal, son útiles en los métodos relativos a la neutralización del virus de la rabia en conjunto con la administración de una vacuna contra la rabia, incluyendo los métodos para tratar o prevenir la infección de rabia en un sujeto en su necesidad y métodos para proporcionar la protección a la post-exposición contra la infección por rabia a un sujeto en su necesidad.
EJEMPLO 7 Rendimiento neutralizante in vivo de cóctel mAbs antirrábico en comparación con HRIG policlonal Para evaluar el desempeño neutralizante in vivo de un coctel 3D11E3/7G11A3, se realiza un estudio de hámster sirio. Los hámsteres (n = 10 por grupo) se infectan con RV de perro callejero (BD06) en el día 1. Los animales se vacunan con la vacuna de la rabia (Rabipur®, Chiron Behring GmbH & Co., Liederbach, Alemania), vacuna de células diploides humanas (HDCV; Imovax®, Sanofi Pasteur, Swiftwater, Pennsylvania, EE. UU.) en el día 0 y luego se tratan con cóctel 3D11E3/7G11A3 que consiste de cantidades iguales de 3D11E3 y 7G11A3 (0.5 mg/kg) o 20 Ul/kg de inmunoglobulina de rabia humana (Shuanglin farmacéutica) con decaimiento de 24 horas o 72 horas, administrada en el sitio de inoculación del virus (es decir, gastroenemio derecho). Se administran dosis adicionales de vacuna en el músculo gastrocnemio izquierdo en los días 3, 7, 14 y 28. Los grupos de control recibieron vacuna sola o son no tratados. Los hámsters se examinan diariamente, y si muestran signos clínicos de infección de rabia se sacrifican. Los signos clínicos de la rabia incluyen: letargo, fiebre, vómitos y anorexia. El progreso de señales dentro de días a la disfunción cerebral, la disfunción del nervio craneal, ataxia, debilidad, parálisis, convulsiones, dificultad para respirar, dificultad para tragar, salivación excesiva, comportamiento anormal, agresión y/o automutilación. Los resultados se resumen en la figura 7.
El grupo de control negativo sin tratamiento tiene una tasa de supervivencia del 10%, indicando que la infección viral fue efectiva. Con el decaimiento de 24 horas, la vacuna administrada a sujetos junto con el cóctel de 3D11E3/7G11A3 muestra una tasa de supervivencia del 90 % (9/10), y aquellos administrados con la vacuna junto con HRIG muestran una tasa de supervivencia de 80 % (8/10). Por el contrario, con un decaimiento de 72 horas, los sujetos administrados con la vacuna junto con el cóctel de 3D11E3/7G11A3 y HRIG cae a 50% (5/10) y el 20 % (2/10), respectivamente.
Estos resultados muestran que una combinación de anticuerpos antirrábicos de la presente teenología neutralizan la infectividad del virus de la rabia, y que son útiles en los métodos relativos a la neutralización de virus de la rabia, incluyendo métodos para tratar o prevenir la infección de rabia en un sujeto en su necesidad y métodos para proporcionar la protección post-exposición contra la infección por rabia a un sujeto en su necesidad.
EJEMPLO 8 Generación de anticuerpos 3D11E3-1A9 quiméricos y humanizados Este ejemplo describe la preparación de formas quiméricas y humanizadas del anticuerpo 3D11E3-1A9 descrita en los ejemplos anteriores 2-7.
Clonación y secuenciación de genes de región variable 1A9 de ratón. Células de hibridoma CT.RV 3D11E3 1A9 de ratón (denominadas "1A9" en este ejemplo) se cultivan en Hibridoma-SFM (Invitrogen, Carlsbad, CA) que contienen 12% de suero fetal bovino (SFB; HyClone, Logan, Utah, EE. UU.) a 37°C en una incubadora con 7.5% CO2. Se extrajo el ARN total de aproximadamente 107 células de hibridoma mediante reactivo TRIzol (Invitrogen) según el protocolo del proveedor. ADNc Oligo dT-cebado para 51-RACE se sintetiza mediante el kit de amplificación de ADNc SMARTer RACE (Clontech, Mountain View, CA) siguiendo el protocolo del proveedor. Los ADNc de región variable para cadenas pesadas y ligeras de 1A9 se amplifican por la reacción en cadena de polimerasa (PCR) con polimerasa de ADN Phusion (New England Biolabs, Beverly, Massachusetts, EE. UU.) usando los iniciadores 3' que templan respectivamente a las regiones constantes de cadena gamma-2a y kappa, y el iniciador 51-RACE (iniciador universal una mezcla o iniciador universal anidado A) proporcionado en el kit de amplificación de ADNc SMARTer RACE. Para la amplificación por PCR de la región variable de la cadena pesada (VH), se utilizaron dos iniciadores 3'. Tienen la secuencia 5'-GCCAGTGGATAGACCGATGG-3' (SEQ ID NO: 1) y 5'-ACAGTCACTGAGCTGC-3' (SEQ ID NO: 2). Para la amplificación por PCR de la región variable de la cadena ligera (VL), el iniciador 3' tiene la secuencia 5 '-GATGGATACAGTTGGTGCAGC-3' (SEQ ID NO: 3). Los ADNc VH y VL amplificados fueron clonados en el vector pCR4Blunt-T0P0 (Invitrogen) para la determinación de la secuencia. La secuenciación de ADN se realizó en Tocore (Menlo Park, California, EE. UU.). Varios clones de cadena pesada y ligera fueron secuenciados y homólogos de secuencias únicas a las regiones variables de cadena pesada y ligera de ratón se identifican. No se notaron características inusuales en las secuencias de aminoácido de VH y VL de 1A9 maduro.
La secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 4) del ADN VH 1A9 se muestra en el cuadro 6 junto con la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO: 5). la secuencia del péptido señal está en cursivas. El residuo de aminoácido N-terminal (E) del VH maduro es doble subrayado. Secuencias de CDR de acuerdo con la definición de Kabat et al. (Secuencias de proteínas de interés inmunológico, quinta edición, N1H publicación No.91-3242, Estados Unidos Departamento de salud y servicios humanos, 1991) están subrayados.
CUADRO 6 Núcleotido (SEQ ID NO: 4) y aminoácido (SEQ ID NO: 5) secuencias de ADNc VH 1A9 de murina La secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 6) del ADNc VL 1A9 de ratón se muestra en el cuadro 7 junto con la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO: 7). La secuencia del péptido señal está en cursivas. El residuo de aminoácido N-terminal (D) del VL maduro es doble subrayado. Las secuencias CDR de acuerdo con la definición de Kabat et al (1991) están subrayadas.
CUADRO 7 Núcleotido (SEQ ID NO: 6) y aminoácido (SEQ ID NO: 7) secuencias de ADNc VL 1A9 murino S GTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTACTGTTGCCTGGTATCAACAGAAACCA V T C K A S Q N V Q T T V A W Y Q Q K P GGACAATCTCCTAAAGCACTGATTTACTCGGCATCCTACCGG ACAGTGGAGTCCCTGAT G Q S P K A L I Y S A S Y R Y B G V P D CGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAATGTGCAGTCT R F T G S G S G T D F T L T I S N V Q S GAAGACT TGGCAGAATATTTCTGTCAGCAATATAACAGCTATCCATTCACGTTCGGCTCG E D L A E Y F C Q Q Y N g Y P F T F G S GGGACAAAGTTGGAAATAAAA G T K L E I K Construcción de anticuerpo quimérico 1A9 IgGl/k. Un gen que codifica VH 1A9 se genera como un exón incluyendo una señal de donador de empalme y sitios de enzima de restricción de flanqueo apropiados por PCR usando ADNc VH 1A9 como una plantilla 5'-GCAACTAGTACCACCATGGGAGGGATCTGGATC-3' (SEQ ID NO: 8) (sitio Spel es subrayado) como un iniciador 5' y 5'-GGGAAGCTTGTTTTAAGGACTCACCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGTGCC-3' (SEQ ID NO: 9) (sitio Hindlll es subrayado) como un iniciador 3'. La secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 10) del gen VH ChlA9 designado flanqueado por sitios de Spel y Hindlll (subrayados) se muestra en el cuadro 8 junto con la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO: 11). La secuencia del péptido de señal está en cursivas. El residuo de aminoácido N-terminal (E) del VH maduro es doble subrayado. Las secuencias CDR de acuerdo con la definición de Kabat et al (1991) están subrayadas. La secuencia del intrón está en cursivas.
CUADRO 8 Nucleótido (SEQ ID NO: 10) y aminoácido (SEQ ID NO: 11) secuencias de ADNc VH 1A9 quimerico i i i Del mismo modo, un gen que codifica Chi A9 VL se genera como un exón que incluye una señal de donador de empalme y sitios de enzima de la restricción de flanqueo apropiados por PCR usando ADNc VL Chi A9 como una plantilla, 51-GCTGCTAGCACCACCATGGAGTCACAGACTCAG-31 (SEQ ID NO: 12) (sitio Nhel está subrayado) como un iniciador 5' y 5 '-GGGGAATTCGCAAAAGTCTACTTACGTTTTATTTCCAACTTTGTCCCCGA-31 (SEQ ID NO: 13) (sitio EcoRI es subrayado) como un iniciador 3'.
La secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 14) del gen Chi A9 VL diseñado flanqueado por sitios Nhel y EcoRI (subrayados) se muestra en el cuadro 9 junto con la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO: 15). La secuencia de péptido de señal está en cursivas. El residuo de aminoácido N-terminal (D) del VL maduro es doble subrayado. Las secuencias CDR de acuerdo con la definición de Kabat et al (1991) están subrayadas. La secuencia del intrón está en cursivas.
CUADRO 9 Nucleótido (SEQ ID NO: 14) y aminoácido (SEQ ID NO: 15) secuencias de ADNc Vi 1A9 quimérico Las señales de donador del empalme de los exones VH y VL ChlA9 se derivaron de las secuencias JH2 y Jk4 de la línea germinal de ratón, respectivamente. Los fragmentos amplificados con PCR se purificaron con gel mediante el kit NucleoSpin Extraction II (Machercy-Nagel, Bethlehem, PA) y se clonan en el vector pCR4Blunt-T0P0 para confirmación de secuencia. Los fragmentos V correctos son digeridos con Spel y Hindlll (para VH) o Nhel y EcoRI (para VL), se purifican con gel y se clonan en las regiones constantes gamma-1 y kappa humanas que portan el vector de expresión de mamífero para la producción de anticuerpo quimérico Chi A9 IgGl/k. La estructura esquemática del vector de expresión resultante, pChlA9, se muestra en la figura 8.
Diseño de genes VH y VL 1A9 humanizados. Las secuencias CDR junto con los residuos de aminoácidos de marco importantes para mantener la estructura CDR se injertan de VH y VL 1A9 en las secuencias de marco humano seleccionadas correspondientes. Las secuencias VH humanas homologas a los marcos VH 1A9 se buscaron dentro de la base de datos GenBank, y la secuencia VH codificada por el ADNc DA980102 humano (DA980102 VH) (número de acceso GenBank; Kimura et al., Genome Res. 16:55-65, 2006) se elige como un aceptor de humanización. Las secuencias de CDR de VH 1A9 fueron trasladados primero a las posiciones correspondientes de VH DA980102.
Basado en la búsqueda de homología con las secuencias de marco VL 1A9, la región VK humana codificada por el ADNc de CB958542 (CB958542 VL) (número de acceso a GenBank; N1H-MGC EST Sequencing Project, 1999) se elige como un aceptor de humanización. Las secuencias CDR de VL 1A9 fueron transferidas primero a las posiciones correspondientes de CB958542 VL. A continuación, en la posición de marco 46, un residuo de aminoácido de VL 1A9 de ratón fue sustituido por el residuo humano correspondiente. Mientras Ala en la posición 46 en VL 1A9 de ratón está situado en una posición de marco importante para la formación de la estructura de CDR, análisis detallado de las regiones variables de 1A9 que un residuo de aminoácido en la posición 46 en HulA9 VLI pueden reemplazarse con el residuo humano correspondiente, Val, en VL CB958542 sin perder la afinidad de unión del antígeno. Con el fin de reducir aún más el potencial inmunogenicidad de anticuerpo 1A9 humanizado, se diseña una segunda VL humanizada (Huí A9 VL2), en que Ala en la posición 46 en Huí A9 VL1 fue reemplazado con Val.
Construcción de genes VH y VL 1A9 humanizados. Un gen que codifica HulA9 VH se diseña como un exón incluyendo un péptido de señal, una señal de donador de empalme, y sitios de enzima de restricción apropiada para clonación posterior en un vector de expresión de mamífero. La señal de donador de empalme del exón VH HulA9 se deriva de la secuencia JH1 de la línea germinal humana. Puesto que el péptido d3e señal codificado por el gen 1A9 VH de ratón fue predicho para ser subóptimo para escisión precisa por el software de predicción de péptido de señal SIG-Pred, la secuencia de péptido de señal del gene VH DA980102 humano se utiliza en HulA9 VH.
Cada uno de los genes que codifican HulA9 VL1 y VL2 se diseña como un exón que incluye un péptido de señal, una señal de donador de empalme, y sitios de enzima de restricción apropiados para clonación posterior en un vector de expresión de mamífero. La señal de donador de empalme de los exones se deriva de la secuencia jk2 de la línea germinal humana. La secuencia del péptido de señal en cada uno de los exones VL1 y VL2 HulA9 se derivan de la secuencia VL 1A9 de ratón correspondiente.
Los genes VH y VL HulA9 se construyen por GenScript USA (Piscataway, NJ). Después de la digestión con Spel y HindIII (para VH) o Nhel y EcoRI (para VL), genes VH y VL HulA9 se subclonan en los sitios correspondientes en un vector de expresión de mamífero para la producción en la forma humana de IgGl/k. El vector de expresión resultante, pHul A9-1, expresa un anticuerpo humanizado que contienen las regiones VH y V^l HulA9 (HulA9-l). Asimismo, pHulA9-2 expresa un anticuerpo humanizado que contienen VH y VL2 HÍ1A9 (HulA9-2).
La secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 16) del gen HulA9 VH flanqueado por sitios de Spel y HindIII (subrayados) se muestra en el cuadro 10 junto con la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO: 17). La secuencia de péptido de señal está en cursivas. El residuo de aminoácido N-terminal (Q) del VH maduro es subrayado doble. Las secuencias CDR de acuerdo con la definición de Kabat et al (1991) están subrayadas. La secuencia intrón está en cursivas.
CUADRO 10 Núcleotido (SEQ ID NO: 16) y aminoácido (SEQ ID NO: 17) secuencias del gen VH HulA9 humanizado i ; La secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 18) del gen HulA9 VL1 flanqueado por sitios Nhel y EcoRI (subrayados) se muestra en el cuadro 11 junto con la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO: 19). La secuencia del péptido de señal está en cursiva. El residuo de aminoácido N-terminal (D) del VL maduro es doble subrayado. Las secuencias según la definición de Kabat et al (1991) están subrayadas. La secuencia de intrón está en cursivas.
CUADRO 11 Nucleótido (SEQ ID NO: 18) y aminoácido (SEQ ID NO: 19) secuencias del gen VL1 HulA9 humanizado ! La secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 20) del gen VL2 HulA9 flanqueado por los sitios Nhel y EcoRI (subrayados) se muestra en el cuadro 12 junto con la secuencia de aminoácido deducida (SEQ ID NO: 21). La secuencia del péptido de señal está en cursivas. El residuo de aminoácido N-terminal (D) del VL maduro es doble subrayado. Las secuencias de CDR de acuerdo con la definición de Kabat et al (1991) están subrayadas. La secuencia de intrón está en cursivas.
CUADRO 12 Núcleo tido (SEQ ID NO : 20) y aminoácido (SEQ ID NO : 21) secuencias del gen VL2 1A9 humanizado i i Generación de transfectantes estables NSO que producen anticuerpos quiméricos y humanizados 1A9 IgGl/k. Para obtener líneas celulares estables que producen anticuerpos ChlA9, HulA9-l y HulA9-2, los vectores de expresión pChlA9, pHulA9-1 y pHul A9-2, respectivamente, fueron introducidos en el cromosoma de una línea celular de mieloma de ratón NSO (colección europea de cultivos celulares animales, Salisbury, Wiltshire, Reino Unido). Las células NSO se cultivan en medio DME que contiene 10% de FBS a 37°C en una incubadora con 7.5% CO2. La transfección estable en NSO se llevó a cabo por la electroporación como se describe en Bebbington et al (Bio/teenology 10:169-175, 1992). Antes de transfección, cada vector de expresión se linealiza usando Fspl. Aproximadamente 107 células fueron transfectadas con 20 )ng de plásmido lineal, se suspendieron en medio DME que contiene 10% de FBS y se platean en varias placas de 96 pozos. Después de 48 horas, medios de selección (medio DME que contiene 10% de FBS, suplemento de medio HT (Sigma, St. Louis, MO), 0.25 mg/ml de xantina y 1 mV/pi? de ácido micofenólico) se aplican. Aproximadamente 10 días después de la iniciación de la selección, se ensayaron los sobrenadantes del cultivo para la producción de anticuerpos.
La expresión de anticuerpos ChlA9, HulA9-l y HulA9-2 se mide mediante ELISA de intercalado. En un experimento típico, una placa de ELISA se recubre durante la noche a 4°C con 100 ml/rozo de anticuerpo policlonal específico de cadena Fcy IgG anti-humano de cabra diluido 1/2,000 (Sigma) en PBS, lavado con regulador de pH de lavado (PBS que contiene 0.05% de Tween 20) y bloqueado por 0.5 hr a temperatura ambiente con 300 ml/rozo de regulador de pH de bloque (PBS que contiene 2% de leche descremada y un 0.05% de Tween 20). Después de lavar con regulador de pH de lavado, 100 ml/rozo de muestras apropiadamente diluidas en regulador de pH de ELISA (PBS que contiene 1% de leche descremada y 0.025% de Tween 20) se aplica a la placa ELISA. Un anticuerpo humanizado apropiado de IgGl/k se utiliza como un estándar. Después de incubar la placa ELISA durante 1 hora a temperatura ambiente y lavada con regulador de pH de lavado, se detectan anticuerpos unidos utilizando 100 m?/rozo de anticuerpo policlonal de cadena kappa anti-humana de cabra conjugada con HRP diluida 1/2,000 (SouthernBiotech). Después de incubar durante 0.5 horas a temperatura ambiente y lavar con regulador de pH de lavado, el desarrollo de color se realizó mediante la adición de 100 m?/rozo de sustrato ABTS (bioWORLD, Dublin, OH). El desarrollo del color se detiene mediante la adición de 100 m?/rozo de 2% de ácido oxálico. Se lcyó la absorbancia a 405 nm. Los transfectantes estables NS0 que producen un alto nivel de anticuerpos ChlA9, HulA9-l y HulA9 (NS0-ChlA91C11, NS0-HulA9-1 3F9 y NS0-HulA9-2 3C9, respectivamente) fueron adaptados para el crecimiento en medios libres de suero usando hibridoma-SFM.
La autenticidad de las cadenas pesadas y ligeras producidas en NS0-ChlA9 1C11, NS0-HulA9-l 3F9 y NSO-HulA9-2 3C9 se confirma por la secuenciación de ADNc. La secuencia de nucleótido obtenida de la región de codificación para cada cadena pesada ChlA9, cadena ligera ChlA9, cadena pesada HulA9-1, cadena ligera HulA9-l, cadena pesada HulA9-2 y cadena ligera HulA9-2 perfectamente emparejado con la secuencia correspondiente en vector pChlA9, pHulA9-l o pHulA9-2 (cuadro 13).
CUADRO 13 Secuencia de regiones de codificación de cadenas pesada y ligera pChlA9 EJEMPLO 9 Caracterización de los anticuerpos ChlA9, HulA9-l y HulA9-2 Las células NS0-ChlA91C11, NS0-HulA9-l 3F9, y NSO-HulA9-2 9C3 se cultivan en hibridoma-SFM en una botella de rodillos a la densidad de aproximadamente 106/ml, alimentados con volumen 1/10° de 60 mg/ml de hidrolizado de soya ultrafiltrado (Irvine Scientific, Santa Ana, California, EE. UU.) disuelto en medios SFM4MAb (HyClone) y se hacen crecer hasta que la viabilidad celular se convierte en menos del 50%. Después de la centrifugación y filtración, el sobrenadante de cultivo se carga en una columna de prote£na-A sefarosa (HiTrap MABSelect SuRe, GE Healthcare, Piscataway, NJ). La columna se lavan con PBS antes de que el anticuerpo se eluya con glicina-HCl 0.1M (pH 3.0). Tras la neutralización con Tris-HCl 1M (pH 8), el regulador de pH del anticuerpo diluido se cambia a PBS por diálisis. La concentración de anticuerpo se determina mediante la medición de la absorbancia a 280 nm (1 mg/ml = 1.4 OD). El rendimiento es 8.2 mg de ChlA9 (a partir de 1000 mi de sobrenadante del cultivo), 7.7 mg para HulA9-l (de 500 mi) y 10.8 mg para HulA9-2 (de 500 mi).
Las ChlA9, HulA9-l y HulA9-2 purificadas se caracterizaron por SDS-PAGE de acuerdo con los procedimientos estándar. El análisis bajo condiciones de reducción indica que cada uno de los tres anticuerpos se compone de una cadena pesada con un peso molecular de aproximadamente 50 kDa y una cadena ligera con un peso molecular de aproximadamente 25 kDa (Figura 9). La pureza de cada anticuerpo parece ser más del 95%.
La unión de antígeno de anticuerpos ChlA9, HulA9-l y HulA9-2 se examina por ELISA. En un experimento típico, una placa de ELISA fue cubierta con 100 ml/rozo de vacuna de virus de rabia inactivado l/500-diluido (Rabipur®, Chiron Behring GmbH & Co., Liederbach, Alemania) en regulador de pH de bicarbonato de sodio 0.2 M (pH 9.4) durante la noche a 4°C, se lava con regulador de pH de lavado, y se bloquea por 0.5 hr a temperatura ambiente con 300 ml/rozo de regulador de pH de bloqueo. Después de lavar con regulador de pH de lavado, 100 m?/rozo de muestras apropiadamente diluidas en regulador de pH de ELISA se aplican a la placa de ELISA. Después de incubar la placa de ELISA durante 1 hora a temperatura ambiente y lavar con regulador de pH de lavado, se detectaron anticuerpos unidos utilizando 100 m?/rozo de IgG anti-humano de cabra HRP-conjugado 1/2,000-diluido, anticuerpo policlonal específico de cadena Fcy (Jackson ImunoResearch, West Grove, PA, USA). Después de incubar durante 0.5 horas a temperatura ambiente y lavar con regulador de pH de lavado, el desarrollo de color se realiza mediante la adición de 100 m?/rozo de sustrato de ABTS. El desarrollo de color se detiene mediante la adición de 100 ml/rozo de 2% de ácido oxálico. Se lcyó la absorbancia a 405 nm. Los valores EC50 calculados usando GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, California, EE. UU.) son 0.052 pg/ml para ChlA9, 0.025 mg/ml para HulA9-l y 0.016 yg/ml de HulA9-2 (Figura 10). Este resultado indica que HulA9-l y HulA9-2 retienen la afinidad de unión del antígeno del anticuerpo quimérico 1A9.
Estos resultados muestran que los anticuerpos antirrábicos de la presente teenología específicamente unen glicoproteína del virus de la rabia, y que son útiles en los métodos relacionados con dicha unión específica, incluyendo métodos para detectar la glicoproteína del virus de la rabia en una muestra, o tratar o prevenir la infección de rabia en un sujeto en su necesidad y métodos para proporcionar la protección post-exposición contra la infección por rabia a un sujeto en su necesidad.
EJEMPLO 10 Generación de anticuerpo 2G11 humanizado Este ejemplo describe la preparación de formas quiméricas y humanizadas del anticuerpo 7G11A3 2G11 descritas en los ejemplos 1-6 anteriormente.
Clonación y secuenciación de genes de región variable 2G11 de ratón. Las células de hibridoma CT.RV 7G11A32G11 de ratón (referidas con 2G11 en este ejemplo) se cultivan en Hibridoma-SFM (Invitrogen, Carlsbad, California, EE. UU.) que contiene 12% de suero fetal bovino (FBS; HyClone, Logan, Utah, EE. UU.) a 37°C en una incubadora de 7.5% CO2. Se extrae ARN total de aproximadamente 107 células de hibridoma mediante reactivo TRIzol (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del proveedor. ADNc Oligo dt-iniciado para 5'-RACE se sintetiza usando el kit de amplificación de ADNc SMARTer RACE (Clontech, Mountain View, California, EE. UU.) siguiendo el protocolo del proveedor. Los ADNc de región variable para las cadenas pesadas y ligeras de 2G11 se amplifican por la reacción en cadena de polimerasa (PCR) con polimerasa de ADN Phusion (New England Biolabs, Beverly, Masachsetts, EE. UU.) utilizando iniciadores 3' que recuecen respectivamente a las regiones constantes de cadena kappa y gamma-2a, y el iniciador 5'-RACE (iniciador Universal una mezcla o iniciador Universal A anidado) proporcionado en el Kit de amplificación de ADNc SMARTer RACE. Para la amplificación por PCR de la región variable de la cadena pesada (VH), el iniciador 31 tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1. Para la amplificación por PCR de la región variable de cadena ligera (VL), el iniciador 3' tiene la secuencia de SEQ ID NO: 3. Los ADN VH y VL amplificados fueron clonados en el vector pCR4Blunt-TOPO (Invitrogen) para la determinación de la secuencia. La secuenciación de ADN se realiza en Tocore (Menlo Park, California, EE. UU.). Varios clones de cadena pesada y ligera son secuenciados y los homólogos de secuencias únicas a regiones variables de cadena pesada y ligera de ratón se identifican.
La secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 32) del ADNc VH 2G11 de ratón se muestra en el cuadro 14 junto con la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO: 33). La secuencia del péptido de señal está en cursivas. El residuo de aminoácido N-terminal (E) de VH maduro es doble subrayado. Las secuencias CDR de acuerdo con la definición de Kabat et al (Secuencias de proteínas de interés inmunológico, quinta edición, N1H publicación No.91-3242, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE. UU., 1991) están subrayados.
CUADRO 14 Nucieótido (SEQ ID NO: 32) y aminoácido (SEQ ID NO: 33) secuencias de ADNc VH 2G11 de murina La secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 34) de ADNc VL 2G11 de ratón se muestra en el cuadro 15 junto con la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO: 35). Los residuos del aminoácido se muestran en el código de letras individuales. La secuencia del péptido de señal está en cursivas. El residuo de aminoácido N-terminal (D) de VL maduro es doble subrayado. Las secuencias de CDR de acuerdo con la definición de Kabat et al (1991) están subrayadas.
CUADRO 15 Nucleótido (SEQ XD NO: 34) y aminoácido (SEQ ID NO: 35) secuencias de ADNc VL 2Gil de murina Construcción de anticuerpo quimérico 2G11 IgGl/k. Un gen que codifica 2G11 VH se genera como un exón que incluye una señal de donador de empalme y flanqueo de sitios de enzima de restricción por PCR usando ADNc VH 2G11 como una plantilla, 51-GCAACTAGTACCACCATGAACTTTGTGCTCAGC-3' (SEQ ID NO: 37) como un cebador 5', 5'- GGGAAGCTTGAGAGGCCATTCTTACCTGAGGAGACGGTGACTGAGGT-3' (SEQ ID NO: 37) como un cabador 3'. La secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 38) del gen VH 2G11 flanqueado por sitios de Spel y Hindlll (subrayados) se muestra en el cuadro 16 junto con la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO: 39). La secuencia de péptido de señal está en cursivas. El residuo de aminoácido N-terminal (E) del VH maduro es doble subrayado. Las secuencias CDR de acuerdo con la definición de Kabat et al (1991) están subrayadas. La secuencia de intrón está en cursivas.
CUADRO 16 Núcleo tido (SEQ ID NO : 38) y aminoácido (SEQ ID NO : 39) secuencia del gen VH 2G11 quimérico ! : Asimismo, un gen que codifica 2G11 VL se genera como un exón que incluye una señal de donador de empalme y sitios de enzima de restricción de flanqueo apropiados por PCR. La secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 40) del gen 2G11 VL flanqueado por sitios Nhel y EcoRI (subrayados) se muestra en el cuadro 17 junto con la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO: 41). La secuencia del péptido de señal está en cursivas. El residuo de aminoácido N-terminal (D) del VL maduro es doble-subrayado. Las secuencias de CDR de acuerdo con la definición de Kabat et al (1991) están subrayadas. La secuencia del intrón está en cursivas.
CUADRO 17 Nucleótido (SEQ ID NO: 40) y aminoácido (SEQ ID NO: 41) secuencia del gen VL 2Gil quimérico i Las señales de donadores de empalme de los exones VH y VL 2G11 se derivan de las secuencias JH2 y Jk4 de línea germinal de ratón, respectivamente. Los fragmentos amplificados con PCR son purificados con gel usando kit NucleoSpin Ectraction II (Machercy-Nagel, Bethlehem, PA) y se clonan en el vector pCR4Blunt-T0P0 para confirmación de secuencia. Los fragmentos V correctos fueron digeridos con Spel y HindIII (para VH) o Nhel y EcoRI (para VL), purificado con gel y clonado en unas regiones constantes gamma-1 y kappa que portan la expresión del mamífero para el anticuerpo quimérico 2G11 (Ch2Gll) IgGl/k. La estructura esquemática del vector de expresión resultante, pCh2Gll, se muestra en la Figura 13.
Diseño los genes VH y VL 2G11 humanizados. Las secuencias de CDR junto con los residuos de aminoácidos de marco importantes para mantener la estructura de CDR se injertan de 2G11 VH y VL en las secuencias de marco humano seleccionadas correspondientes. Las secuencias VH humanas homologas a los marcos de 2G11 VH se buscaron dentro de la base de datos GenBank y la secuencia VH codificada por el ADNc U96282 humano (U96282 VH) (número de acceso a GenBank; Rassenti and Kipps, J. Exp. Med. 185:1435-1445, 1997) se elige como un aceptor de humanización. Las secuencias de CDR de 2G11 VH se transfirieron a las posiciones correspondientes de U96282 VH. No se predice que la sustitución de residuos del aminoácido de marco humano sea necesaria para mantener la estructura de CDR.
Aunque el modelo tridimensional de las regiones variables 2G11 de ratón indican que un residuo de aminoácido en la posición 19 de VH se encuentra lejos de la CDR y no debería afectar la formación de la estructura de CDR, la presencia de un residuo de isoleucina en esta posición, en lugar de una lisina típica o residuo de arginina, es inusual y podría influir en la naturaleza funcional y/o bioquímica del anticuerpo. La segunda VH humanizada se diseña por lo tanto, en la que un residuo de arginina en Hu2Gll VH 1 en la posición 19 se reemplaza por un residuo de isoleucina.
Basado en la búsqueda de homología con las secuencias de marco 2G11 VL, la región VK humana codificada por ADNc X72466 (X72466 VL) (número de acceso a GenBank; Klein et al, Eur. J. Immunol.23: 3248-3262, 1993) se elige como un aceptor de humanización. Las secuencias de CDR de 2G11 VL fueron transferidas primero a las posiciones correspondientes de X72466 VL. No se predice que la sustitución de aminoácidos de marco humano sea necesaria para mantener la estructura de CDR.
Construcción de genes VH y VL 2G11. Cada uno de los genes que codifican Hu2Gll VH1 y VH2 se diseña como un exón que incluye un péptido de señal, una señal de donador de empalme y sitios Spel y HindIII de flanqueo para la clonación posterior en un vector de expresión de mamífero. La señal de donador de empalme utilizada en los exones VH1 y VH2 Hu2Gll se derivan de la secuencia JH3 de línea germinal humana. Puesto que el péptido de señal codificado por el gen 2G11 VH de ratón se predice que sea subóptimo para escisión precisa por el software de predicción de péptido de señal SIG-Pred, la secuencia de péptido de señal del gen humano U96282 VH se usa en Hu2Gll VH1 y VH2.
Un gene que codifica Hu2Gll VL se diseña como un exón que incluye un péptido de señal, una señal de donador de empalme y sitios Nhel y EcoRI de flanqueo para clonación posterior en un vector de expresión de mamífero. La señal de donador de empalme se deriva de la secuencia Jk4 de línea germinal humana. El péptido de señal codificado por el gen VL 2G11 de ratón se predice que es subóptimo para la escisión precisa por el software de predicción del péptido de señal SIG-Pred, de modo que la secuencia de péptido de señal del gen VL X72466 humano se utiliza en Hu2Gll VL.
Los genes VH1, VH2 y VL Hu2Gll se construyen por GenScript USA (Piscataway, New Jerscy, EE. UU.). Después de la digestión con Spel y HindIII (para VH) o Nhel y EcoRI (para VL), los genes HU2G11 VH1, VH2 y VL se subclonan en los sitios correspondientes en un vector de expresión de mamífero para la producción de anticuerpos en la forma humana de IgGl/k. El vector de expresión resultante, pHu2Gll-l, expresa un anticuerpo humanizado que contiene Hu2Gll VH1 y VL (HU2G11-1). Asimismo, pHu2Gl 1-2 expresa un anticuerpo humanizado que contienen Hu2Gll VH2 y VL (Hu2Gll-2).
La secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 42) del gen Hu2Gll VH2 (también llamado VHR19I) flanqueado por sitios Spel y HindIII (subrayados) se muestra en el cuadro 18 junto con la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO: 43) . La secuencia del péptido de señal está en cursivas. El residuo de aminoácido N-terminal (E) del VH maduro es doble subrayado. Las secuencias de CDR de acuerdo con la definición de Kabat et al (1991) están subrayadas. La ubicación del aminoácido en el recuadro indica la diferencia entre Hu2Gll VH1 y VH2. La secuencia de intrón está en cursivas.
CUADRO 18 Nucleótido (SEQ ID NO: 42) y aminoácido (SEQ ID NO: 43) secuencia del gen VH 2G11 humanizado La secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 44) del gen Hu2G11 VL flanqueado por sitios Nhel y EcoRI (subrayados) se muestra en el cuadro 19 junto con la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO: 45). La secuencia del péptido de señal está en cursivas. El residuo de aminoácido N-terminal (D) del VL maduro es doble subrayado. Las secuencias de CDR de acuerdo con la definición de Kabat et al (1991) están subrayadas. La secuencia de intrón está en cursivas.
CUADRO 19 Núcleotido (SEQ ID NO: 44) y aminoácido (SEQ ID NO: 45) secuencia del gen VL 2G11 humanizado Generación de transfectantes estables NSO que producien anticuerpos 2G11 IgGl/k quiméricos y humanizados. Para obtener las líneas celulares que producen establemente anticuerpos Ch2Gll, Hu2Gll-l y Hu2Gll-2, los vectores de expresión pCh2Gll, pHu2Gll-l y pHu2Gll-2, respectivamente, son introducidos en el cromosoma de una línea celular de mieloma de ratón NSO (colección europea de cultivos de células animales, Salisbury, Wiltshire, Reino Unido). Las células NSO se cultivan en medio DME que contiene 10% de FBS a 37°C en una incubadora de 7.5% CO2. La transfección estable en NSO se lleva a cabo por la electroporación como se describe en Bebbington et al (10 Bio/Technology 10:169-175, 1992). Antes de la transfección, cada vector de expresión se linealiza usando FspI. Aproximadamente 107 células se transfectan con 20 mg de plásmido linealizado, suspendido en medio DME que contiene 10% de FBS y plateado en varias placas de 96 pozos. Después de 48 horas, los medios de selección (medio DME que contiene 10% de FBS, suplemento de medios HT (Sig a, St. Louis, MO), 0.25 mg/ml de xantina y 1 gg/ml de ácido micofenólico) se aplican. Aproximadamente 10 días después de la iniciación de la selección, los sobrenadantes de cultivo se analizaron para la producción de anticuerpos.
La expresión de anticuerpos Ch2Gll, Hu2Gll-l y Hu2Gll-2 se mide mediante ELISA intercalado. En un experimento típico, una placa de ELISA se recubre durante la noche a 4°C con 100 ml/rozo de anticuerpo policlonal específico de cadena Fcy de IgG anti-humano de cabra 1/2,000-diluido (Sigma) en PBS, se lava con regulador de pH de lavado (PBS que contiene 0.05% de Tween 20) y se bloquea por 0.5 horas a temperatura ambiente con 300 ml/rozo de regulador de pH de bloque (PBS que contiene 2% de leche descremada y 0.05% de Tween 20). Después de lavar con regulador de pH de lavado, 100 m?/rozo de muestras apropiadamente diluidas en regulador de pH de ELISA (PBS que contiene 1% de leche descremada y 0.025% de Tween 20) se aplican a la placa ELISA. Un anticuerpo humanizado apropiado de IgGl/k se utiliza como un estándar. Después de incubar la placa de ELISA durante 1 hora a temperatura ambiente y de lavarse con regulador de pH de lavado, los anticuerpos unidos se detectan utilizando 100 ml/rozo de anticuerpo policlonal de cadena kappa anti-humana de cabra HRP-conjugado 1/2,000-diluido (SouthernBiotech, Birmingham, AL, Estados Unidos). Después de incubar durante 0.5 horas a temperatura ambiente y de lavar con regulador de pH de lavado, el desarrollo de color se realiza mediante la adición de 100 ml/rozo de sustrato de ABTS (bioWORLD, Dublin, OH). El desarrollo del color se detiene mediante la adición de 100 m?/rozo de 2% de ácido oxálico. Se lcyó la absorbancia a 405 nm. Los transfectantes estables de NS0 que producen un alto nivel de anticuerpos Ch2Gl, Hu2Gll-l y Hu2Gll-2 (NS0-Ch2Gll 1E7, NS0-Hu2Gll-l 1E5 y NS0-Hu2Gll-2 1A7, respectivamente) se adaptan para el crecimiento en medios libres de suero usando hibridoma-SFM.
La autenticidad de las cadenas pesadas y ligeras producidas en NS0-Ch2Gll 1E7, NS0-Hu2Gll-l 1E5, y NS0-Hu2Gll-2 1A7 se confirma por la secuenciación del ADNc. La secuencia de nucleótido obtenida de la región de codificación para cada cadena pesada Ch2Gll, cadena ligera Ch2Gll, cadena pesada Hu2Gll-l, cadena ligera Hu2Gll-l, cadena pesada Hu2Gll, y cadena ligera Hu2Gll-2 se muestran en los cuadros 24-28. Las secuencias emparejan perfectamente con la secuencia correspondiente en el vector pCh2Gll, pHu2Gll-l, o pHu2Gll-2.
CUADRO 20 Secuencia de regiones de codificación de cadenas pesada y ligera pCh2Gll EJEMPLO 11 Purificación de anticuerpos Ch2Gll, Hu2Gll-l y Hu2Gll-2.
Las células NS0-Ch2Gll 1E7, NS0-HU2G11-1 IES y NS0- Hu2Gll-2 1A7 se cultivan en hibridoma-SFM en una botella de rodillos a la densidad de aproximadamente 106/ml, alimentada con volumen 1/10° de 60 mg/ml de hidrolizado de soya ultrafiltrado (Irvine Scientific, Santa Ana, California, EE UU.) disuelto en medios SFM4MAb (HyClone) y se hace crecer hasta que la viabilidad celular se convierte en menos de 50%. Después de la centrifugación y filtración, el sobrenadante de cultivo se carga en una columna de prote£na-A sefarosa (HiTrap MABSelect SuRe, GE Healthcare, Piscataway, New Jerscy, EE. UU.). La columna se lava con PBS antes de que el anticuerpo se eluya con glicina-HCl 0 .1M (pH 3.0). Después de la neutralización con Tris-HCl 1M (pH 8), el regulador de pH del anticuerpo eluido se cambia a PBS por diálisis. La concentración de anticuerpo se determina mediante la medición de la absorbancia a 280 nm (1 mg/ml = 1.4 OD). El rendimiento es de 2.8 mg por Ch2Gll (a partir de 500 mi de sobrenadante de cultivo), 3.4 mg para Hu2Gll-l (de 500 mi) y 1.1 mg para Hu2Gll-2 (de 500 mi).
Los anticuerpos Ch2Gll, Hu2Gll-l y Hu2Gll-2 se caracterizaron por SDS-PAGE de acuerdo con los procedimientos estándar. Los análisis bajo condiciones de reducción indican que cada uno de los tres anticuerpos se compone de una cadena pesada con un peso molecular de aproximadamente 50 kDa y una cadena ligera con un peso molecular de aproximadamente 25 kDa (Figura 12). La pureza de cada anticuerpo parece ser más del 90%.
EJEMPLO 12 Caracterización de los anticuerpos Ch2Gl, Hu2Gll-l y Hu2Gll-2 La unión de antígeno de anticuerpos Ch2Gll, Hu2Gll-l y Hu2Gll-2 se examina por un ELISA de unión competitiva. Una placa de ELISA se recubre con 100 ml/rozo de vacuna de virus de rabia inactiva 1/200-diluida (Rabipur®, Chiron Behring GmbH & Co., Liederbach, Alemania) en regulador de pH de bicarbonato de sodio 0.2 M (pH 9.4) durante la noche a 4°C, se lava con regulador de pH de lavado (PBS) y se bloquea con 300 ml/rozo de regulador de pH de bloqueo (3% de BSA PBS) durante 0.5 h a temperatura ambiente. Después de lavar con regulador de pH de lavado, una mezcla de anticuerpo 7G11A3 1H5 (0.2 mg/ml; suministrados por Asia Vision) y anticuerpo competidor (Ch2Gll, Hu2Gll-l o Hu2Gll-2; a partir de una concentración final de 100 mg/ml y serie de diluciones de tres veces) en regulador de pH de ELISA se aplica en 100 m?/rozo por duplicado. Después de incubar la placa de ELISA durante 1 hora a temperatura ambiente y se lava con regulador de pH de lavado, los anticuerpos 7G11A3 1H5 de ratón de unión se detectan usando 100 m?/rozo de anticuerpo policlona, IgG-absorbido, especifico de cadena Fcy, de igG anti-ratón de cabra HRP-conjugado 1/2,000-diluido (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). Después de incubar durante 0.5 horas a temperatura ambiente y lavar con regulador de pH de lavado, el desarrollo del color se realiza mediante la adición de 100 m?/rozo de sustrato de ABTS y se detiene por 100 m?/rozo de 2% de ácido oxálico. Se lcyó la absorbancia a 405 nm. Los valores de IC50 se calculan usando GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA) son 0.11 mg/ml para Ch2Gll, 0.20 pg/ml para Hu2Gll-1 y 0.23 mg/ml para Hu2Gll-2 (Figura 13). Este resultado indica que ambos Hu2Gll-l y Hu2Gll-2 retienen la afinidad de unión a antígeno del anticuerpo 2G11 de ratón.
La unión de antígeno de Ch2Gll, Hu2Gll-l y Hu2Gll-2 también se examina por ELISA como se describe a continuación. Una placa de ELISA se recubre con 1 o 2.5 mg/ml de Ch2Gll, HU2G11-1 o Hu2Gll-2 en PBS durante la noche a 4°C y se bloquea como se describió anteriormente. Después de lavar con regulador de pH de lavado, 100 ml/rozo de Rabipur® 1/50, 1/100 o 1/200-diluido en regulador de pH de ELISA se agrega e incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar con regulador de pH de lavado, Rabipur® capturado por cada anticuerpo de prueba se detecta usando 100 ml/rozo de anticuerpo monoclonal de ratón HRP-conjugado 1/1,000-diluido 3D10 suministrado por Asia Visión. Después de incubar durante 0.5 horas a temperatura ambiente y lavar con regulador de pH de lavado, el desarrollo del color se realiza como se describió anteriormente. Se leyó la absorbancia a 405 nm. El orden de la señal de mayor a menor fue Hu2Gll-2, Ch2Gll y Hu2Gll-l (Figura 14), que sugiere que Hu2Gll-2 puede unir al antígeno mejor que Hu2Gll-l lo hace.
Estos resultados muestran que los anticuerpos antirrábicos de la presente teenología unen específicamente la glicoproteína del virus de la rabia, y que son útiles en los métodos relacionados con dicha unión específica, incluyendo métodos para detectar la glicoproteína del virus de la rabia en una muestra, o tratar o prevenir la infección de rabia en un sujeto en su necesidad y métodos para proporcionar la protección post-exposición contra la infección por rabia a un sujeto en su necesidad.
EJEMPLO 13 Actividad de unión de RVNAs humanizados La actividad de unión de RVNA humanizado a glicoproteína RV se estudia en este ejemplo. El RVNA humanizado y otros materiales biológicos usados en los ejemplos se muestran en el cuadro 21. Los animales utilizados en estos estudios incluyen ratones BALB/c, hembra, 6-8 semanas, que pesan 20 a 30 gramos, grado SPF y hámsteres sirios, 2-3 meses, que pesan 100 gramos, grado SPF.
CUADRO 21 Bio-Reactivos La unión de RVNAs2Gll humanizado y quimérico a glicoproteína RV se determina por CLEIA (Figura 15). Las versiones quiméricas y humanizadas de 2G11 se utilizan como la captura (Figura 15A-C) y los anticuerpos de detección (Figura 15 D-F), respectivamente. RVGP se diluye a 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 800:1 y 1:1600 y luego se agrega en la micro-placa. RV de murina 3D10-HRP y IgG-HRP anti-humano de ratón se utilizan como el conjugado enzimático. RLU (unidad de luminiscencia relacionada) representa la señal de quimioluminiscencia. Este resultado indica que la actividad de unión de Ch2Gll quimérico a RVGP es mejor que la humanizado.
La ligadura de RVNA murino quimérico, humanizado a RVGP se determina por CLEIA (Figura 16). El 1A9 quimérico y humanizado se usa como anticuerpos de captura (Figura 16A-E) y de detección (Figura 16F-J), respectivamente. RVGP se diluye a 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 800:1 y 1:1600 y luego se agrega en la micro-placa. RV 3D10-HRP de murina e IgG-HRP anti-humano de ratón se utilizan como el Conjugado enzimático. RLU (unidad de luminiscencia relacionada) representa la señal de quimioluminiscencia. El resultado muestra que la actividad de unión de ChlA9 quimérico es superior a la del humanizado.
Estos resultados muestran que los anticuerpos antirrábicos de la presente teenología unen específicamente glicoproteína del virus de la rabia, y que son útiles en los métodos relacionados con dicha unión específica, incluyendo métodos para detectar la glicoproteína del virus de la rabia en una muestra, o tratar o prevenir la infección de rabia en un sujeto en su necesidad y métodos para proporcionar la protección post-exposición contra la infección por rabia a un sujeto en su necesidad.
EJEMPLO 14 Potencia neutralizante in vitro de RVNAs humanizados La potencia neutralizante in vitro de los RVNAs se miden por la prueba de inhibición de foso fluorescente rápida (RFFIT) y prueba de neutralización del virus del anticuerpo fluorescente (FAVN) usando virus de la rabia CVS-11. Los resultados se muestran en el cuadro 22. Los resultados de los dos métodos estuvieron de acuerdo en que el nivel de potencia neutralizante in vitro del 2G11 humanizado es inferior a la de la murina y el 2G11 quimérico, el HulA9-l humanizado tiene la mejor actividad neutralizante in vitro de todos los cuatro anticuerpos 1A9.
CUADRO 22 Potencia neutralizante in vitro de RVNA humanizado medido por RFFIT y FAVN Para comparar la actividad de neutralización de los 7G11A32G11 humanizado o 3D11E31A9 con la murina y el RVNA quimérico, una prueba de neutralización del ratón (MNT) se realiza. Los virus de rabia 100LD50/0.03 mi de CVS-1 se neutraliza por el volumen igual de RVNAs a 37°C durante 1 hora y luego se inyecta en el cerebro de los ratones BALB/C (n = 8 por grupo). El grupo de control se inyecta con virus no neutralizante. Los ratones se examinan diariamente, y si muestran signos clínicos de infección de rabia son sacrificados. La supervivencia de ratones BALB/C se observa (Figura 17). Todos los animales de control murieron dentro de 9 días, demostrando que el experimento fue eficaz. No hubo diferencias de la supervivencia porcentual entre la murina y el grupo humanizado cuando la concentración de RVNA es superior a 0.02 mg/ml. Sin embargo, el rendimiento neutralizante de 2G11 de murina es superior al del quimérico y humanizado al disminuir la dosis de 0.004 mg/mL. Al incrementar las cantidades de cantidades de tratamiento de 7G11A32G11 humanizado puede ayudar a mejorar su rendimiento neutralizante. Además, la tasa de supervivencia de los ratones que se trataron con 0.004 mg/mL de HulA9-l humanizado o m-A19 de murina alcanza el 100% (8/8) y el 50% (4/8), respectivamente.
Los resultados muestran que los anticuerpos antirrábicos de la presente teenología neutralizan la infectividad del virus de la rabia, y que son útiles en métodos relacionados con la neutralización del virus de la rabia, que incluyen los métodos para tratar o prevenir la infección de rabia en un sujeto en su necesidad, y los métodos para proporcionar la protección post-exposición contra el virus de la rabia a un sujeto en su necesidad.
EJEMPLO 15 Rendimiento de protección post-exposición de los dos RVNAs humanizados Para evaluar el desempeño de protección post exposición de los 2G11 y 1A9 humanizados, se realiza un estudio hámster sirio que el RVNA humanizado se compara con RVNA de murina o quimérico. Los hámsteres (n = 5 por grupo) se infectan RV de perro callejero (BD06) en el d£a-l. Los animales se tratan con las cantidades iguales de 2G11 o 1A9 de murina, quiméricos o humanizados (1 mg/kg) con decaimiento de 16 horas, administrados en el sitio de inoculación del virus (es decir, gastroenemio derecho). El grupo de control no se trata. Los hámsteres se examinan diariamente, y si mostraron signos clínicos de infección de rabia fueron sacrificados. La supervivencia de los hámsteres sirios se observa (Figura 18). Todos los animales no tratados murieron dentro de 9 días, demostrando que el experimento fue eficaz. Para 2G11, no hubo diferencias de la supervivencia porcentual entre el grupo de murina y el humanizado. Sin embargo, la tasa de supervivencia de los hámsteres que se trataron con el 1A9-1 humanizado o el 1A9 de murina alcanzó el 100% (5/5) y el 60% (3/5), respectivamente.
Estos resultados muestran que los anticuerpos antirrábicos de la presente teenología proporcionan protección post-exposición contra la infección por rabia, y que son útiles en los métodos relativos a dicha protección, incluyendo los métodos para tratar o prevenir la infección de rabia en un sujeto en su necesidad y los métodos para proporcionar la protección post-exposición contra el virus de la rabia a un sujeto en su necesidad.
EJEMPLO 16 Inmunogenicidad de la vacuna en animales tratados con cóctel Hu2Gll-l/HulA9-2 o HRIG Para evaluar el desempeño de protección post-exposición de un cóctel Hu2Gll-l/HulA9-2 humanizado, se realiza un estudio en animales. Las monocapas de células de neuroblastoma se infectaron con el virus de desafío estándar-11 (CVS-11) u otros virus en una multiplicidad de infección (MOI) de 0.3 durante 15 min a 37°C/0.5% CO2. El inoculo de virus entonces se remueve, el medio fresco ha sido añadido a las células y la incubación se continúa por 40h a 37°C/0.5% C02. Los sobrenadantes de cultivo se recogen y almacenan a -80°C hasta su uso posterior. RFFITs estándar para la neutralización se realizaron como se describió anteriormente. Para determinar la potencia neutralizante de cada anticuerpo neutralizante del virus de la rabia (RVNA), su 50% de los títulos de neutralización se compararon con el 50% del título neutralizante del estándar (estándar GB), que se define como 21.4 IU/L.
Durante la profilaxis post-exposición (PPE), existe la posibilidad de que la administración simultánea de RVNAs y la vacuna disminuyan la capacidad de la vacuna para inducir a los niveles de umbral de neutralización anticuerpos necesarios para la protección. Por lo tanto, es fundamental evaluar el grado de la interferencia del tratamiento de coctel Hu2Gll-l/HulA9-2 para la vacunación. Para determinar el efecto del coctel Hu2Gll-l/HulA9-2 en potencia de la vacuna, un experimento animal in vivo se realiza en la ausencia de RV (Figura 19). Para PEP, ratones BALB/c se administran en tres dosis de coctel Hu2Gll-l/HulA9-2 más la vacuna o 20 Ul/kg HRIG más vacuna. Las tres dosis de coctel Hu2Gll-l/HulA9-2 son 5000 IU/kg, 1000 IU/kg o 200 Ul/kg, respectivamente. Los ratones que solo se administran con vacunas se utilizan como control. Existen 8 ratones en cada grupo experimental. También, los 6 ratones que sólo se administran con PBS se utilizan como control negativo. En los días 1, 2, 4, 8, 16 y 32, se extrae sangre de la órbita del ratón. Suero de 8 ratones se mezclan con 4 sueros en cada grupo de experimento y entonces determinan el título de RVNA de suero. El día 1, día 2 y día 4, los títulos RVNA de suero son altos en ratones que reciben coctel Hu2Gll-l/HulA9-2 cóctel, son menores en ratones que reciben 20 UI/kg de HRIG (sólo 2 sueros pueden cumplir el requisito de WHO, 0.5 IU/mL) y no se pueden detectar en los ratones que sólo son vacunados. El título de RVNA en ratones que reciben coctel Hu2Gll-l/HulA9-2 permanece elevado durante 8-32 días, superiores o equivalentes con el título de RVNA en ratones que reciben HRIG. Este resultado indica que el coctel de Hu2Gll-l/HulA9-2 no interfiere con la vacuna para inducir anticuerpos de neutralización. Además, el título de RVNA en ratones que reciben cóctel Hu2Gll-l/HulA9-2 muestra un efecto dependiente de dosis obvio durante 8-32 días: cuanto mayor sea la dosis del cóctel Hu2Gll-l/HulA9-2 recibido, más alto es el título de RVNA inducido en los ratones.
Estos resultados muestran que los anticuerpos antirrábicos de la presente teenología proporcionan protección post-exposición contra la infección por rabia, y que son útiles en los métodos relativos a dicha protección, incluyendo métodos para tratar o prevenir la infección de rabia en un sujeto en su necesidad y los métodos para proporcionar la protección post-exposición contra el virus de la rabia a un sujeto en su necesidad misma.
EJEMPLO 17 Rendimiento neutralizante in vivo del cóctel Hu2611-l/HulA9-2 en comparación con HRIG policlonal Para evaluar el desempeño neutralizante in vivo del cóctel Hu2Gll-l/HulA9-2, se realizó un estudio de hámster sirio. Los hámsteres (n = 10 por grupo) fueron infectados con RV de perro callejero (BD06). Los animales fueron vacunados con la vacuna antirrábica (Rabipur, Chiron Behring) en el día 0 y tratados con 1000, 500, 200 Ul/kg de cóctel Hu2Gll-l/HulA.9-2 o 20 Ul/kg de inmunoglobulina de rabia humana {Shuanglin Pharmaceutical) con decaimiento de 24 horas, administrado en el sitio de inoculación del virus {es decir, gastroenemio derecho). Se administran dosis adicionales de vacunas en el músculo gastrocnemio izquierdo los días 3, 7, 14 y 28. Los grupos de control reciben vacuna sola o sin tratar. Los hámsteres se examinan diariamente, y si muestran signos clínicos de infección de rabia son sacrificados. La supervivencia de los hámsteres sirios se observó (Figura 20). El grupo de control negativo tiene una tasa de supervivencia del 20%, demostrando que el experimento fue eficaz. Con el decaimiento de 24 horas, las tasas de supervivencia cerradas pueden observarse tal que el tratamiento de hámsteres con vacuna y cóctel Hu2Gll-l/HulA9-2 dio lugar en la tasa de supervivencia del 100% (10/10) y la tasa de supervivencia de los hámsteres que son tratados con la vacuna y HRIG es 90% (9/10). Este resultado muestra que la potencia neutralizante in vivo del cóctel Hu2Gll-l/HulA9-2 es muy fuerte.
Estos resultados muestran que una combinación de anticuerpos antirrábicos de la presente teenología neutraliza la infectividad del virus de la rabia, y que son útiles en los métodos relativos a la neutralización de virus de la rabia, incluyendo métodos para tratar o prevenir la infección de rabia en un sujeto en su necesidad y métodos para proporcionar la protección post-exposición contra la infección por rabia a un sujeto en su necesidad.
EJEMPLO 18 Rendimiento de protección post-exposición de los dos RVNAs humanizados en sujetos humanos Este ejemplo demostrará el desempeño post-exposición de 2G11 y 1A9 humanizados en sujetos humanos expuestos al virus de la rabia. Los seres humanos expuestos a o sospechosos de ser expuestos al virus de la rabia son administrados con 2G11 o 1A9 quimérico y humanizado (1 mg/kg) con decaimiento de 16 horas, administrados en el sitio de inoculación del virus {es decir, el sitio de mordedura de un animal). Se espera que los sujetos tratados mostrarán una tasa de supervivencia del 100%, mostrarán menos o nada de síntomas clínicos de la rabia que sujetos no tratados, y mostrarán una recuperación más rápida y más completa de la exposición a la rabia que los sujetos no tratados.
Estos resultados mostrarán que los anticuerpos antirrábicos de la presente teenología proporcionan post exposición contra la infección por rabia en seres humanos, y que son útiles en los métodos relativos a dicha protección, incluyendo métodos para tratar o prevenir la infección de rabia en un sujeto en su necesidad y los métodos para proporcionar la protección post-exposición contra el virus de la rabia a un sujeto en su necesidad.
EJEMPLO 19 Rendimiento neutralizante in vivo del cóctel Hu2Gll-l/HulA9-2 en comparación con HRIG policlonal Este ejemplo demostrará el rendimiento neutralizante in vivo del cóctel Hu2Gll-l/HulA9-2 en sujetos humanos expuestos al virus de la rabia. Los seres humanos expuestos a o sospechosos de ser expuestos al virus de la rabia son administrados con 1000, 500, 200 Ul/kg de cóctel Hu2Gll-l/HulA9-2 con decaimiento de 24 horas, administrado en el sitio de inoculación del virus {es decir, el sitio de la mordedura de un animal). Se espera que los sujetos tratados muestren una tasa de supervivencia del 100%, mostrarán menos o nada de síntomas clínicos de la rabia que los sujetos no tratados, y mostrarán una recuperación más rápida y más completa de la exposición a la rabia que los sujetos no tratados.
Estos resultados mostrarán que una combinación de anticuerpos antirrábicos de la presente teenología neutraliza la infectividad del virus de la rabia, y que son útiles en los métodos relativos a la neutralización de virus de la rabia, incluyendo métodos para tratar o prevenir la infección de rabia en un sujeto en su necesidad y métodos para proporcionar la protección post-exposición contra la infección por rabia a un sujeto en su necesidad.
La presente tecnología no es para ser limitada en términos de las modalidades particulares descritas en esta aplicación, que se destinan como ilustraciones únicamente de aspectos individuales de la presente tecnología. Muchas modificaciones y variaciones de esta tecnología pueden hacerse sin desviarse de su esencia y su alcance, como será evidente para aquellos con experiencia en la técnica. Los métodos equivalentes funcionalmente y aparatos dentro del alcance de la presente tecnología, además de los enumerados aquí, serán evidentes para aquellos con experiencia en la técnica de las descripciones anteriores. Dichas modificaciones y variaciones pretenden caer dentro del alcance de las reivindicaciones anexadas. La presente tecnología está limitada solamente por los términos de las reivindicaciones anexadas, junto con el alcance completo de equivalentes a los que dichas reivindicaciones corresponden. Es de entenderse que esta teenología no se limita a determinados métodos, reactivos, compuestos, composiciones o sistemas biológicos, que por supuesto, pueden variar. Es también para entenderse que la terminología utilizada aquí es con el propósito de describir las modalidades particulares solamente, y no pretende ser limitante. Otras modalidades se establecen dentro de las siguientes reivindicaciones.
Todas las referencias citadas aquí se incorporan aquí para referencia en sus totalidades y para todos los propósitos en la misma medida como si cada publicación individual, patente o solicitud de patente sea individualmente y específicamente incorporada mediante referencia en su totalidad para todos los propósitos.

Claims (20)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo aislado que se liga a la glicoproteína del virus de la rabia, en donde: a. el anticuerpo comprende una o más secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR seleccionadas del grupo formado por DYIML (SEQ ID NO: 56), DIYPYYGSTSYNLKFKG (SEQ ID NO: 57), QGGDGNYVLFDY (SEQ ID NO: 58), GFAMS (SEQ ID NO: 59), TISSGGTYTYSPDSVMG (SEQ ID NO: 60) y RLRRNYYSMDY (SEQ ID NO: 61); y b. el anticuerpo comprende una o más secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR seleccionadas del grupo formado por KASQNVGTTVA (SEQ ID NO: 62), SASYRYS (SEQ ID NO: 63), QQYNSYPFT (SEQ ID NO: 64), KSTKSLLNSDGFTYLD (SEQ ID NO: 65), LVSNRFS (SEQ ID NO: 66) y FQSNYLPFT (SEQ ID NO: 67).
2. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo comprende las secuencias de cadena pesada CDR: DYIML (NO SEQ ID: 56), DIYPYYGSTSYNLKFKG (SEQ ID NO: 57), QGGDGNYVLFDY (SEQ ID NO: 58) y comprende secuencias de cadena ligera CDR: KASQNVGTTVA (SEQ ID NO: 62), SASYRYS (SEQ ID NO: 63), y QQYNSYPFT (SEQ ID NO: 64).
3. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo comprende las secuencias de cadena pesada CDR: GFAMS (SEQ ID NO: 59), TISSGGTYTYSPDSVMG (SEQ ID NO: 60) y RLRRNYYSMDY (SEQ ID NO: 61) y comprende las secuencias de cadena ligera de CDR: KSTKSLLNSDGFTYLD (SEQ ID NO: 65), LVSNRFS (SEQ ID NO: 66) y FQSNYLPFT (SEQ ID NO: 67).
4. Un anticuerpo aislado que se liga a la glicoproteína del virus de la rabia, en donde el anticuerpo tiene la misma especificidad de unión del antígeno como un anticuerpo producido por una línea de células de hibridoma seleccionada del grupo formado por CGMCC Nos. de acceso 4805 y 4806.
5. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque el anticuerpo es capaz de reducir la infectividad del virus de la rabia y no interfiere con la inmunogenicidad de la vacuna antirrábica.
6. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo murina, un anticuerpo quimérico y un anticuerpo humanizado.
7. Una composición farmacéutica que comprende uno o más anticuerpos de cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y un portador farmacéuticamente aceptable.
8. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque comprende un cóctel de anticuerpos en donde un primer anticuerpo comprende secuencias de cadena pesada CDR: DYIML (SEQ ID NO: 56), DIYPYYGSTSYNLKFKG (SEQ ID NO: 57) y QGGDGNYVLFDY (SEQ ID NO: 58) y secuencias de cadena ligera de CDR que comprende: KA.SQNVGTTVA (SEQ ID NO: 62), SASYRYS (SEQ ID NO: 63) y QQYNSYPFT (SEQ ID NO: 64); y en donde un segundo anticuerpo comprende las secuencias de cadena pesada CDR: GFAMS (SEQ ID NO: 59), TISSGGTYTYSPDSVMG (SEQ ID NO: 60) y RLRRNYYSMDY (SEQ ID NO: 61) y comprende las secuencias de cadena ligera de CDR: KSTKSLLNSDGFTYLD (SEQ ID NO: 65), LVSNRFS (SEQ ID NO: 66) y FQSNYLPFT (SEQ ID NO: 67).
9. El uso de anticuerpos de cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en la fabricación de un medicamento para tratar la infección de rabia en un sujeto que lo necesita.
10. El uso que se reclama en la reivindicación 9, en donde el anticuerpo reduce la infectividad del virus de la rabia pero no interfiere con la inmunogenicidad de una vacuna antirrábica.
11. Un método para tratar la infección de rabia en un sujeto que lo necesita que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de uno o más de los anticuerpos de cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el anticuerpo se selecciona de un grupo que consiste de un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo murina, un anticuerpo quimérico y un anticuerpo humanizado.
13. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el anticuerpo se administra al sujeto antes, después, o simultáneamente con la vacuna de la rabia.
14. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el anticuerpo se administra al sujeto antes, después, o simultáneamente con una inmunoglobulina antirrábica.
15. Un kit para tratar la infección de rabia en un sujeto que lo necesita que comprende uno o más anticuerpos que se unen a la glicoproteína del virus de la rabia y las instrucciones para el uso del anticuerpo, en donde: a. el anticuerpo comprende una o más secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR seleccionadas del grupo formado por DYIML (SEQ ID NO: 56), DIYPYYGSTSYNLKFKG (SEQ ID NO: 57), QGGDGNYVLFDY (SEQ ID NO: 58), GFAMS (SEQ ID NO: 59), TISSGGTYTYSPDSVMG (SEQ ID NO: 60) y RLRRNYYSMDY (SEQ ID NO: 61); y b. el anticuerpo comprende una o más secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR seleccionadas del grupo formado por KASQNVGTTVA (SEQ ID NO: 62), SASYRYS (SEQ ID NO: 63), QQYNSYPFT (SEQ ID NO: 64), KSTKSLLNSDGFTYLD (SEQ ID NO: 65), LVSNRFS (SEQ ID NO: 66) y FQSNYLPFT (SEQ ID NO: 67).
16. Un kit de detección del virus de la rabia en una muestra que comprende un anticuerpo que se liga a la glicoproteína del virus de la rabia y las instrucciones para el uso del anticuerpo, en donde: a. el anticuerpo comprende una o más secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR seleccionadas del grupo formado por DYIML (SEQ ID NO: 56), DIYPYYGSTSYNLKFKG (SEQ ID NO: 57), QGGDGNYVLFDY (SEQ ID NO: 58), GFAMS (SEQ ID NO: 59), TISSGGTYTYSPDSVMG (SEQ ID NO: 60) y RLRRNYYSMDY (SEQ ID NO: 61); y b. el anticuerpo comprende una o más secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR seleccionadas del grupo formado por KASQNVGTTVA (SEQ ID NO: 62), SASYRYS (SEQ ID NO: 63), QQYNSYPFT (SEQ ID NO: 64), KSTKSLLNSDGFTYLD (SEQ ID NO: 65), LVSNRFS (SEQ ID NO: 66) y FQSNYLPFT (SEQ ID NO: 67).
17. El kit de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el anticuerpo se acopla a una o más etiquetas detectables.
18. El kit de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque comprende además un anticuerpo secundario que se une específicamente al anticuerpo de glicoproteína del virus de la rabia.
19. Un ácido nucleico aislado de codificación del anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
20. Una célula hospedera que comprende el ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 19. Reslimen La presente descripción se refiere generalmente a anticuerpos contra la rabia que pueden unir y neutralizar el virus de la rabia. Los anticuerpos de la teenología actual son útiles solos o en combinación con terapias conocidas en la técnica para el tratamiento o prevención de la infección de rabia.
MX2014014412A 2012-05-24 2012-05-24 Composiciones y metodos relacionados con la prevencion y el tratamiento de infecciones por rabia. MX369626B (es)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/CN2012/076012 WO2013174003A1 (en) 2012-05-24 2012-05-24 Compositions and methods related to prevention and treatment of rabies infection

Publications (2)

Publication Number Publication Date
MX2014014412A true MX2014014412A (es) 2015-07-21
MX369626B MX369626B (es) 2019-11-13

Family

ID=49623026

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2014014412A MX369626B (es) 2012-05-24 2012-05-24 Composiciones y metodos relacionados con la prevencion y el tratamiento de infecciones por rabia.

Country Status (12)

Country Link
US (1) US9290564B2 (es)
EP (2) EP3508497A1 (es)
JP (1) JP5868549B2 (es)
KR (1) KR101937733B1 (es)
CN (1) CN104603149B (es)
BR (1) BR112014029274B1 (es)
HK (1) HK1210187A1 (es)
IN (1) IN2014KN02831A (es)
MX (1) MX369626B (es)
PH (1) PH12014502628B1 (es)
SG (1) SG11201408330XA (es)
WO (1) WO2013174003A1 (es)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9290564B2 (en) * 2012-05-24 2016-03-22 Mountgate Group Limited Compositions and methods related to the prevention and treatment of rabies infection
CN104193823B (zh) * 2014-08-22 2019-06-11 兰州生物制品研究所有限责任公司 一种抗狂犬病病毒特异性人源抗体及应用
CN107580604A (zh) * 2014-09-03 2018-01-12 伊缪诺金公司 包含细胞结合剂和细胞毒性剂的缀合物
BR122020023406B1 (pt) * 2014-11-18 2023-10-31 Institut Pasteur Anticorpos que neutralizam de modo potente vírus da raiva e outros lissavírus, moléculas de ácido nucleico, vetor, célula isolada, composição farmacêutica, usos dos mesmos, e kit de partes
US10450367B2 (en) 2015-08-13 2019-10-22 University Of Massachusetts Human antibodies against rabies and uses thereof
IL262892B2 (en) * 2016-05-18 2024-04-01 Boehringer Ingelheim Int Anti-PD-1 and anti-LAG3 antibodies for cancer treatment
KR101990795B1 (ko) * 2017-12-07 2019-06-19 대한민국 광견병바이러스 특이 항체 및 이를 이용한 광견병바이러스 검출방법
CN109970852B (zh) * 2019-04-01 2020-10-13 浙江大学 分泌抗狂犬病毒m蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用
CN111171145B (zh) * 2020-01-21 2021-11-05 兰州生物制品研究所有限责任公司 一种抗狂犬病病毒单克隆抗体、制备方法及用途
CN111888470A (zh) * 2020-08-12 2020-11-06 赵静 具有中和狂犬病病毒效能的冲洗液及其活性检测方法
WO2023215746A2 (en) * 2022-05-02 2023-11-09 Javelin Oncology, Inc. Anti-alppl2 antibodies and chimeric antigen receptors, and compositions and methods of use

Family Cites Families (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154600B (nl) 1971-02-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen.
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
NL154599B (nl) 1970-12-28 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen, alsmede testverpakking.
US3817837A (en) 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
US3901654A (en) 1971-06-21 1975-08-26 Biological Developments Receptor assays of biologically active compounds employing biologically specific receptors
US3853987A (en) 1971-09-01 1974-12-10 W Dreyer Immunological reagent and radioimmuno assay
US3867517A (en) 1971-12-21 1975-02-18 Abbott Lab Direct radioimmunoassay for antigens and their antibodies
NL171930C (nl) 1972-05-11 1983-06-01 Akzo Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van haptenen, alsmede testverpakkingen.
US3850578A (en) 1973-03-12 1974-11-26 H Mcconnell Process for assaying for biologically active molecules
US3935074A (en) 1973-12-17 1976-01-27 Syva Company Antibody steric hindrance immunoassay with two antibodies
US3939350A (en) 1974-04-29 1976-02-17 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescent immunoassay employing total reflection for activation
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4034074A (en) 1974-09-19 1977-07-05 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Universal reagent 2-site immunoradiometric assay using labelled anti (IgG)
US3984533A (en) 1975-11-13 1976-10-05 General Electric Company Electrophoretic method of detecting antigen-antibody reaction
US4098876A (en) 1976-10-26 1978-07-04 Corning Glass Works Reverse sandwich immunoassay
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4277437A (en) 1978-04-05 1981-07-07 Syva Company Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay
US4391904A (en) 1979-12-26 1983-07-05 Syva Company Test strip kits in immunoassays and compositions therein
US4366241A (en) 1980-08-07 1982-12-28 Syva Company Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays
US4474893A (en) 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
US4714681A (en) 1981-07-01 1987-12-22 The Board Of Reagents, The University Of Texas System Cancer Center Quadroma cells and trioma cells and methods for the production of same
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5028530A (en) 1985-01-28 1991-07-02 Xoma Corporation AraB promoters and method of producing polypeptides, including cecropins, by microbiological techniques
US6492107B1 (en) 1986-11-20 2002-12-10 Stuart Kauffman Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique
DE3546807C2 (es) 1985-03-30 1991-03-28 Marc Genf/Geneve Ch Ballivet
EP0232262A4 (en) 1985-08-15 1989-09-19 Stauffer Chemical Co MICROORGANISM PRODUCING TRYPTOPHANE.
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
DE3751873T2 (de) 1986-04-09 1997-02-13 Genzyme Corp Genetisch transformierte Tiere, die ein gewünschtes Protein in Milch absondern
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
EP0832981A1 (en) 1987-02-17 1998-04-01 Pharming B.V. DNA sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
DE68921982T4 (de) 1988-06-14 1996-04-25 Cetus Oncology Corp Kupplungsmittel und sterisch gehinderte, mit disulfid gebundene konjugate daraus.
US4925648A (en) 1988-07-29 1990-05-15 Immunomedics, Inc. Detection and treatment of infectious and inflammatory lesions
US5601819A (en) 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
EP0368684B2 (en) 1988-11-11 2004-09-29 Medical Research Council Cloning immunoglobulin variable domain sequences.
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
ZA902949B (en) 1989-05-05 1992-02-26 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
US6291158B1 (en) 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for tapping the immunological repertoire
US6291160B1 (en) 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for producing polymers having a preselected activity
US6291159B1 (en) 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for producing polymers having a preselected activity
US6680192B1 (en) 1989-05-16 2004-01-20 Scripps Research Institute Method for producing polymers having a preselected activity
US6291161B1 (en) 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for tapping the immunological repertiore
EP0739904A1 (en) 1989-06-29 1996-10-30 Medarex, Inc. Bispecific reagents for aids therapy
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
JP3319594B2 (ja) 1990-03-20 2002-09-03 ザ・トラスティーズ・オブ・コランビア・ユニバーシティー・イン・ザ・シティー・オブ・ニューヨーク 定常領域の代わりに受容体結合性リガンドを有するキメラ抗体
DE59109032D1 (de) 1990-06-28 1998-09-03 Hoechst Ag Fusionsproteine mit immunglobulinanteilen, ihre Herstellung und Verwendung
US5304389A (en) 1991-06-18 1994-04-19 Mitsubishi Kasei Corporation Non-hygroscopic icing composition
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
CA2109602C (en) 1990-07-10 2002-10-01 Gregory P. Winter Methods for producing members of specific binding pairs
AU667460B2 (en) 1990-10-05 1996-03-28 Medarex, Inc. Targeted immunostimulation with bispecific reagents
DE69128253T2 (de) 1990-10-29 1998-06-18 Chiron Corp Bispezifische antikörper, verfahren zu ihrer herstellung und deren verwendungen
ATE218889T1 (de) 1990-11-09 2002-06-15 Stephen D Gillies Cytokine immunokonjugate
US6106835A (en) 1991-04-19 2000-08-22 Tanox, Inc. Modified binding molecules specific for T or B lymphocytes and their use as in vivo immune modulators
US5573920A (en) 1991-04-26 1996-11-12 Surface Active Limited Antibodies, and methods for their use
US6225447B1 (en) 1991-05-15 2001-05-01 Cambridge Antibody Technology Ltd. Methods for producing members of specific binding pairs
US6492160B1 (en) 1991-05-15 2002-12-10 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
DE69230142T2 (de) 1991-05-15 2000-03-09 Cambridge Antibody Tech Verfahren zur herstellung von spezifischen bindungspaargliedern
CA2110799A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Arnold H. Horwitz Microbially-produced antibody fragments and their conjugates
US7018809B1 (en) 1991-09-19 2006-03-28 Genentech, Inc. Expression of functional antibody fragments
WO1993006213A1 (en) 1991-09-23 1993-04-01 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
DE69233408T2 (de) 1991-12-02 2005-09-22 Cambridge Antibody Technology Ltd., Melbourn Herstellung von Antikörpern auf Phagenoberflächen ausgehend von Antikörpersegmentbibliotheken.
WO1993011236A1 (en) 1991-12-02 1993-06-10 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
ES2193143T3 (es) 1992-03-05 2003-11-01 Univ Texas Uso de inmunoconjugados para la diagnosis y/o terapia de tumores vascularizaos.
CA2115811A1 (en) 1993-02-17 1994-08-18 Claus Krebber A method for in vivo selection of ligand-binding proteins
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
WO1996013583A2 (en) 1994-10-20 1996-05-09 Morphosys Gesellschaft Für Proteinoptimierung Mbh Targeted hetero-association of recombinant proteins to multi-functional complexes
DK1144607T5 (da) 1999-07-20 2009-10-05 Morphosys Ag Fremgangsmåde til præsentation af (poly)peptider/proteiner på bakteriofage partikler via disulfidbindinger
US7094571B2 (en) 2000-10-27 2006-08-22 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Combinatorial protein library screening by periplasmic expression
US7083945B1 (en) 2000-10-27 2006-08-01 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Isolation of binding proteins with high affinity to ligands
KR100857943B1 (ko) 2000-11-30 2008-09-09 메다렉스, 인코포레이티드 인간 항체의 제조를 위한 형질전환 트랜스염색체 설치류
WO2011080765A2 (en) * 2010-01-04 2011-07-07 Indian Immunologicals Limited Recombinant human bivalent diabody against rabies virus and uses thereof
CN101812130B (zh) * 2010-05-06 2012-07-04 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性抗体(RVFab5)
CN101812131B (zh) * 2010-05-06 2012-07-04 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性抗体(RVFab8)
CN101812132B (zh) * 2010-05-06 2012-07-04 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性抗体(RVFab3)
US9290564B2 (en) * 2012-05-24 2016-03-22 Mountgate Group Limited Compositions and methods related to the prevention and treatment of rabies infection

Also Published As

Publication number Publication date
EP2855521A4 (en) 2016-03-02
KR101937733B1 (ko) 2019-01-11
SG11201408330XA (en) 2015-01-29
IN2014KN02831A (es) 2015-05-08
CN104603149A (zh) 2015-05-06
WO2013174003A1 (en) 2013-11-28
PH12014502628A1 (en) 2015-01-26
EP2855521A1 (en) 2015-04-08
JP2015525206A (ja) 2015-09-03
PH12014502628B1 (en) 2015-01-26
EP3508497A1 (en) 2019-07-10
BR112014029274A2 (pt) 2018-04-24
US9290564B2 (en) 2016-03-22
CN104603149B (zh) 2017-06-30
KR20150016590A (ko) 2015-02-12
JP5868549B2 (ja) 2016-02-24
US20150110781A1 (en) 2015-04-23
MX369626B (es) 2019-11-13
BR112014029274B1 (pt) 2022-02-15
HK1210187A1 (en) 2016-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6974409B2 (ja) アンタゴニストの、抗イヌｐｄ−１抗体
US9290564B2 (en) Compositions and methods related to the prevention and treatment of rabies infection
KR101732056B1 (ko) 중화 항-인플루엔자 ａ 바이러스 항체 및 이의 용도
JP6797111B2 (ja) イヌｐｄ−ｌ１と結合するｐｄ−ｌ１抗体
US11591385B2 (en) Methods and compositions for the generation and use of humanized conformation-specific phosphorylated tau antibodies
US9902765B2 (en) Antibodies against chikungunya virus and uses thereof
CN115697491A (zh) Sars-cov-2抗体及其选择和使用方法
US20190002534A1 (en) Human antibodies against rabies and uses thereof
CN107922939B (zh) 中和全部种类埃博拉病毒的感染性的单克隆抗体
CA3105415A1 (en) Antibodies specific to folate receptor alpha
US20240101649A1 (en) ANTI-CfaE ANTIBODIES AND METHODS OF USE
JP2022520632A (ja) 共通軽鎖を含む抗体及びその使用
JP2021525071A (ja) Ｂ型肝炎抗体
CA3133862A1 (en) Monoclonal antibodies for prevention and treatment of herpes simplex viral infections

Legal Events

Date Code Title Description
FG Grant or registration