MX2014003075A - Nucleotidos de terminacion de rapida fotodescomposicion 5-metoxi, 3' -oh no bloqueados y metodos para secuenciacion de acido nucleico. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere generalmente a nucleótidos y nucleósidos 3'- OH marcados y no marcados con grupos de terminación que se pueden fotodescomponerse basados en nitrobencilo substituidos con 5-metoxi para usarse en métodos y sistemas relacionados con secuenciación y análisis de ADN y ARN. Estos compuestos pueden ser utilizados como terminadores reversibles ya que exhiben una rápida cinética de incorporación de nucleótido, terminación de base simple, alta selectividad de nucleótido y rápida descomposición de grupo de terminación que da como resultado un nucleótido de origen natural.

Description

NUCLEÓTIDOS DE TERMINACIÓN DE RÁPIDA FOTODESCOMPOSICIÓN 5-METOXI, 3'-OH NO BLOQUEADOS Y MÉTODOS PARA SECUENCIACIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO Solicitudes Relacionadas La presente solicitud reclama el beneficio de la prioridad de la Solicitud Provisional Norteamericana 61/627,211, presentada el 7 de octubre de 2011, y la Solicitud Provisional Norteamericana 61/534,347, presentada el 13 de septiembre de 2011, en donde los contenidos de ambas solicitudes están incorporados a la presente invención como referencia.

Campo de la Invención La presente invención se refiere a manera general a composiciones y métodos para secuenciación de ADN y otros tipos de análisis de ADN. Más particularmente, la presente invención se refiere en parte a nucleótidos y nucleosidos 3'-OH no bloqueados rápidos con grupos de descomposición fotoquímica y a métodos para su uso en un número de métodos de secuenciación de ADN, incluyendo aplicaciones en investigación biomédica.

Antecedentes de la Invención Los métodos para una rápida secuenciación de ADN son necesarios para analizar enfermedades y mutaciones en la población y terapias en desarrollo (Publicación de Metzker, 2010, la cual está incorporada a la presente invención como referencia). Las formas comúnmente observadas de variación de secuencia humana son polimorfismos de nucleótido simple (SNPs), que ocurren en aproximadamente 1 de 300 hasta 1 de 1000 pares base de secuencia genómica y variantes estructurales (SVs) incluyendo sustituciones de bloque, inserciones/eliminaciones, inversiones, duplicaciones segméntales y variantes de número de copias. Las variantes estructurales pueden abarcar el 22% de todos los eventos variables y bases más variantes que las que tienen contribución de SNPs (Publicación de Levy et al., 2001, la cual está incorporada a la presente invención como referencia). Este descubrimiento es consistente con el de Scherer, Hurles, y colegas, quienes analizaron a 270 individuos utilizando métodos con base en microformación (Publicación de Redon et al., 2006, la cual está incorporada a la presente invención como referencia). En la construcción de la secuencia completa del genoma humano, se han realizado esfuerzos para identificar el enlace genético subyacente con enfermedades comunes y cáncer a través del mapeo SNP y SV o asociación directa. Los desarrollos de tecnología enfocados en secuenciación de ADN rápida, de alto rendimiento y de bajo costo pueden facilitar la comprensión y el uso de información genética, tal como SNP y SV en medicina aplicada.

En general, del 10% al 15% de los SNPs afectarán la función de proteína alterando los residuos de aminoácido específicos, afectarán el procesamiento adecuado de los genes mediante el cambio de los mecanismos de división o afectarán el nivel de expresión normal del gen o proteína, mediante diversos mecanismos reguladores. SVs también juega un papel importante en la biología y enfermedades humanas (Publicaciones de lafrate et al., 2004; Sebat et al., 2004; Tuzun et al., 2005; Stranger et al., 2001, las cuales están incorporadas a la presente invención como referencia). Se considera que la identificación de los SNPs y SVs informativos conducirá a un diagnóstico más preciso de la enfermedad heredada, un mejor pronóstico de susceptibilidades a riesgo o identidad de mutaciones esporádicas en tejido. Una aplicación de un perfil SNP y SV del individuo puede retrasar en forma significativa la generación o el progreso de la enfermedad con terapias de fármaco profilácticas. Además, un perfil SNP y SV de los genes que metabolizan el fármaco, se puede utilizar para prescribir un régimen de fármaco específico para proporcionar resultados más seguros y más eficaces. Para lograr estas metas ambiciosas, la secuenciación de genoma se moverá hacia la fase de resecuenciación con el potencial de secuenciación parcial de una gran mayoría de la población, lo cual puede implicar secuenciar regiones específicas en paralelo, las cuales están distribuidas a lo largo del genoma humano para obtener el perfil SNP y SV para una enfermedad compleja determinada.

Las variaciones de secuencia que subyacen las enfermedades más comunes, probablemente implican múltiples SNPs, SVs, y un número de combinaciones de los mismos, que se dispersan a lo largo de los genes asociados y existen en baja frecuencia. Por lo tanto, las tecnologías de secuenciación de ADN que emplean estrategias para secuenciación de novo, es más probable que detecten y/o descubran estas variantes raras, ampliamente dispersadas, que las tecnologías que se dirigen únicamente a SNPs conocidos.

Un ejemplo de como se pueden aplicar las tecnologías NGS en la detección de variantes de SNPs, SVs, variantes de nucleótido simple (SNVs) y un número de combinaciones de los mismos, es diagnósticos de cáncer. Estos ensayos tradicionalmente han sido un método de un solo marcador, un solo ensayo que recientemente ha progresado a ensayar múltiples marcadores con un solo método experimental. Sin embargo, cada cáncer es genéticamente complejo con frecuencia con muchas mutaciones que ocurren en forma simultánea en numerosos genes. Por consiguiente, los métodos tradicionales conducen a pruebas costosas y tardadas, mientras que proporcionan información únicamente con respecto a unas cuantas y selectas variantes de secuencia conocidas. Los avances recientes en tecnologías NGS, han permitido métodos específicos que se centran en muchos objetivos de gen médicamente accionables asociados con diversos tipos de cáncer (Ver las Publicaciones de Su et al., 2011; Beadling er al. 2012). Debido a los recientes éxitos en los esfuerzos de secuenciación, tal como el proyecto The Cáncer Genome Atlas (Atlas de Genoma de Cáncer) (TCGA), el proyecto de International Cáncer Genome Consortium (Consorcio Internacional de Genoma de Cáncer) (ICGC), y la base de datos de Catalogue of Somatic Mutations in Cáncer (Catálogo de Mutaciones Somáticas en Cáncer) (COSMIC), existe un gran compendio de conocimiento con respecto a estos objetivos de gen en muchos tipos de cáncer, y el resultado de terapéuticos en cánceres que contienen dichas mutaciones (Ver la Publicación de Futreal et al., 2004). El trabajo adicional, en parte como resultado del Proyecto de Pediatric Cáncer Genome (del Genoma de Cáncer Pediátrico), ha mostrado que los cánceres pediátricos tienen distintos perfiles genéticos marcados por un menor número de mutaciones y una prevalencia de mutaciones en trayectorias moleculares alternativas (Ver las Publicaciones de Wu et al., 2012; Meldrum et al. 2011). La mayor necesidad no cumplida actual en los diagnósticos de cáncer, es una tecnología rápida, de alto rendimiento con la precisión y sensibilidad necesaria para detección en etapas tempranas, para identificar variantes de secuencias raras que pertenecen a una subpoblación limitada de células que pasan por una transformación cancerígena.

Tradicionalmente, se ha logrado la secuenciación de ADN a través del método "Sanger" o "dideoxi", que implica la terminación de cadena de la síntesis de ADN mediante la incorporación de 2\3'-dideoxinucleótidos (ddNTPs) utilizando polimerasa de ADN (Publicación de Metzker et al., 2005, la cual está incorporada a la presente invención como referencia). Desde 2005, ha habido un cambio fundamental fuera de la aplicación de la secuenciación de Sanger automática para el análisis de genoma. Las ventajas de las tecnologías de secuenciación de siguiente generación (NGS) incluyen la capacidad de producir un enorme volumen de datos con bajo precio, en algunos casos con un exceso de cientos de millones de lecturas de secuencia corta por corrida de instrumento. Muchos de estos métodos son comúnmente referidos como secuenciación mediante síntesis (SBS), que no define claramente las diferentes mecánicas de secuenciación de ADN (ver las Publicaciones Metzker, 2010; Metzker 2005, las cuales están incorporadas a la presente invención como referencia). Las estrategias dependientes de polimerasa de ADN han sido clasificadas como terminación reversible cíclica (CRT), adición de nucleótido simple (SNA, por ejemplo, pirosecuenciación) y secuenciación de tiempo real. Un método mediante el cual se reemplaza la polimerasa de ADN mediante ligasa de ADN, es referido como secuenciación mediante ligadura (SBL). Estos métodos han sido descritos en la Publicación de Metzker (2010), la cual está incorporada a la presente invención como referencia.

Las tecnologías de secuenciación incluyen un número de métodos que se agrupan ampliamente como (a) preparación de plantilla, (b) secuenciación y generación de imagen, y (c) análisis de datos. La única combinación de protocolos específicos distingue una tecnología de la otra, y determina el tipo de datos producidos de cada plataforma. Estas diferencias en la producción de datos presentan desafíos cuando se comparan plataformas con base en la calidad de datos y costo. Aunque las calificaciones de calidad y los estimados de precisión son proporcionados por cada fabricante, no existe un consenso en cuanto a una "base de calidad" a partir de una plataforma, que sea equivalente con la de otra plataforma.

Dos métodos utilizados para preparar plantillas para reacciones NGS incluyen: plantillas amplificadas en forma clonal que se originan de moléculas de ADN simples y plantillas de moléculas de ADN simples. Los métodos de secuenciación que utilizan polimerasas de ADN son clasificados como terminación reversible cíclica (CRT), adición de nucleótido simple (SNA) y secuenciación de tiempo real (Ver la Publicación de Metzker 2010). La secuenciación mediante ligadura (SBL), un método en el cual se reemplaza la polimerasa de ADN por polimerasa de ADN, también ha sido utilizada en las tecnologías NGS, (ver por ejemplo las Publicaciones de Shendure et al., 2005; Valouev et al., 2008). Los métodos de generación de imagen acoplados con estas estrategias de secuenciación fluctúan desde medir las señales bioluminiscentes hasta imágenes de cuatro colores de eventos moleculares simples. Los datos voluminosos producidos por estas plataformas NGS imponen demandas sustanciales en la tecnología de información, en términos de almacenamiento de datos, seguimiento y control de calidad (ver la Publicación de Pop & Salzberg, 2008).

La necesidad de métodos robustos que producen una fuente de material de ácido nucleico no tendenciosa, representativa del genoma bajo investigación, permanece como una meta importante. Los métodos actuales generalmente implican ADN genómico de rompimiento aleatorio en tamaños menores de los cuales se crean ya sea en plantillas de fragmento o plantillas de emparejamiento. Un tema común entre las tecnologías NGS es que la plantilla se adhiere o inmoviliza a una superficie o soporte sólido. La inmovilización de sitios de plantilla separados en forma espacial permite que se lleven a cabo en forma simultánea de miles a billones de reacciones de secuenciación.

Aunque los métodos amplificados en forma clonal ofrecen ciertas ventajas con respecto a la clonación bacteriana, algunos de los protocolos normalmente son complicados en su implementación , y requieren una gran cantidad de material de ADN genómico (3 a 20 g). La preparación de las plantillas de molécula simple es más sencilla y requiere menos material de partida (<1 pg). Además, estos métodos no requieren PCR, lo cual crea mutaciones en las plantillas amplificadas en forma clonal que se disfrazan como variantes de secuencia. Las secuencias objetivo con alto contenido de AT y alto contenido de GC también muestran tendencia de amplificación en el rendimiento del producto, lo cual da como resultado su subrepresentación en alineaciones y ensambles de genoma. Las aplicaciones cuantitativas tal como ARN (Ver Publicación de Wang et al., 2009), se llevan a cabo en forma más efectiva con fuentes de plantilla no amplificadas, que no alteran la abundancia de representación de las moléculas de mARN.

Un aspecto importante del método CRT es el terminador reversible, del cual existen dos tipos principales: 3'-0-bloqueado y 3'-OH desbloqueado (Metzker, 2010). El uso de un ddNTP, el cual actúa como un terminador de cadena en secuenciación de Sanger, proporcionó las bases para el desarrollo inicial de grupos de bloqueo reversibles adheridos al extremo 3* de los nucleótidos (Metzker et al. 1994; Canard & Sarfati, 1994). Los grupos de bloqueo tales como 3'-0-alil-dNTPs (Metzker et al., 1994; Patente Norteamericana 6,664,079; Ju et al., 2006; Patente Norteamericana 7,057,026; Patente Norteamericana 7,345, 159; Patente Norteamericana 7,635,578; Patente Norteamericana 7,713,698) y 3'-0-azidometil-dNTPs (Patente Norteamericana 7,057,026; Guo et al., 2008; Bentley et al., 2008; Patente Norteamericana 7,414,116; Patente Norteamericana 7,541,444; Patente Norteamericana 7,592,435; Patente Norteamericana 7,556,537; Patente Norteamericana 7,771,973) han sido utilizados en CRT. Los terminadores 3'-0-Bloqueados requieren la descomposición de dos enlaces químicos para eliminar el fluoroforo de la nucleobase y restaurar el grupo 3'-OH. Un inconveniente en el uso de estos terminadores reversibles, es que el grupo de bloqueo adherido al extremo 3' normalmente origina una tendencia contra la incorporación de polimerasa de ADN. La mutagénesis de la polimerasa de ADN con frecuencia es requerida para facilitar la incorporación de terminadores 3'-0-bloqueados. Un gran número de polimerasas de ADN diseñadas genéticamente han sido creadas ya sea mediante mutagénesis dirigida al sitio o aleatoria que contiene una o más sustituciones, inserciones y/o eliminaciones de aminoácido y posteriormente identificadas mediante clasificación de alto rendimiento con la meta de incorporar en forma más eficiente los nucleótidos 3'-bloqueados.

La dificultad para identificar una enzima modificada que incorpora eficientemente terminadores 3'-0-bloqueados mediante clasificación de bibliotecas grandes de polimerasas de ADN muíante, ha conducido al desarrollo de terminadores reversibles 3'-desbloqueados. Se demostró que un pequeño grupo de fotodescomposición adherido a la base de un nucleótido 3'-OH-desbloqueado, puede actuar como un terminador reversible efectivo y se incorpora eficientemente a través de polimerasas de ADN tipo natural (Wu et al., 2007; Metzker, 2010; Litosh et al., 2011, Gardner et al., 2012; Patentes Norteamericanas 7,897,737, 7,964,352; y 8, 148,503, Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana 2011/0287427). Por ejemplo, se encontró 5-hidroximetil-2'-deoxiuridina (HOMedU) naturalmente en los genomas de numerosos bacteriófagos y eucariotos inferiores (Publicación de Gommers-Ampt, 1995, la cual está incorporada a la presente invención como referencia). Su grupo hidroximetilo puede servir como un manejo molecular para adherir un pequeño grupo de terminación de fotodescomposición . Otras bases hipermodificadas de origen natural que se pueden modificar en forma adicional para funcionar como terminadores reversibles incluyen 5-hidroximetil-2'-deoxicitidina (HOMedC), que se encuentran naturalmente en los genomas de bacteriófagos T2, T4 y T6 (Wyatt & Cohén, 1953; Gommers-Ampt, 1995) y de mamíferos (Kriaucionis & Heintz, 2009; Tahiliani et al., 2009; Ito et al., 2010). La estructura de anillo de pirrolopirimidina (7-deazapurina) también se encuentra naturalmente en antibióticos de nucleósido (Publicación de Carrasco & Vázquez, 1984, la cual está incorporada a la presente invención como referencia) y bases de tARN (Limbach, et al., 1994, la cual se incorpora a la presente invención como referencia), y los compuestos de 7-deaza-7-hidroximetil-2'-deoxiadenosina (C7-HOMedA) (Rockhill et al., 1997) y 7-deaza-7-hidroximetil-2'-deoxiguanosina (C7-HOMedG) (McDougall et al., 2001) han sido reportados.

Un aspecto de la presente invención, es el uso de un grupo de 2-nitrobencilo modificado adherido a la nucleobase del nucleósido y nucleótidos de hidroximetilo. Descritas hace medio siglo atrás, las soluciones de 2-nitrotolueno (Wettermark, 1962) y sus derivados (Wettermark, 1962; Hardwick et al., 1960; Mosher et al., 1960; Sousa & Weinstein, 1962; Weinstein ef al., 1966) se reportaron como exhibiendo la propiedad de fotocromismo, un fenómeno considerado como el resultado de la formación temporal de un intermediario de anión ac/-nitro (Weinstein et al., 1966; Morrison, 1969). Sin pretender limitarse a la teoría, generalmente se acepta que la absorción de un fotón mediante el grupo nitro da como resultado la abstracción de hidrógeno del a-carbon (Mosher et al., 1960; Berson & Brown, 1955; De Mayo, 1960), la formación del intermediario de anión ac/'-nitron, y posteriormente la liberación de la molécula efectora "enjaulada" y la creación de un subproducto de nitrosocarbonilo (Corrie, 2005). Estos estudios tempranos sugieren que una a-sustitución del carbono bencílico (Wettermark, 1962) o la sustitución de la posición-4 del anillo de benceno con un grupo de donación de electrones (Sousa & Weinstein, 1962; Weinstein et al., 1966), incrementó el rango de efecto fotocrómico. Estos descubrimientos conducen al desarrollo de grupos de protección de 2-nitrobencilo fotosensibles (Barltrop et al., 1966; Patchornik, 1968; Patchornik et al., 1970). El grado en el cual se altera el rango de descomposición fotoquímica, depende normalmente, sin embargo, de numerosos factores que se reportan por incluir la sustitución del carbono bencílico (Walker et al., 1986; Hasan et al., 1997; Giegrich et al., 1998), el grupo(s) funcional adherido al anillo de bencilo (Wootton & Trentham, 1989; Hasan et al., 1997; Giegrich et al., 1998), y el grupo de partida (Walker et al., 1986) así como el pH (McCray et al., 1980; Walker et al., 1986; Wootton & Trentham, 1989), solvente (Sousa & Weinstein, 1962; McGall et al., 1997; Giegrich ef al., 1998), e intensidad de luz (McCray et al., 1980; McGall et al., 1997). Una propiedad, sin embargo, que no ha sido estudiada es la estereoquímica, mediante lo cual, la sustitución del a-carbono o carbono bencílico de 2-nitrobencilo da como resultado un centro quirálico. Para el caso de síntesis de nucleótido, el acoplamiento del alcohol de 2-nitrobencilo a-sustituido racémico puede dar como resultado dos diastereómeros, que difieren únicamente por la configuración absoluta (R o S) en el carbono bencílico.

Otra clase de nucleótidos 3'-OH no bloqueados ha sido descrita en las Publicaciones de Mitra ef al. (2003) y Turcatti ef al. (2008), que dependen del obstáculo esférico del grupo de tinta voluminoso para detener la incorporación después de la adición del primer nucleótido. Se debe observar que los análogos de nucleótido de 2-nitrobencilo sustituidos descritos por Wu et al. (2007), Litosh et al. (2011), y Gardner ef al., 2012 originan la terminación de la síntesis de ADN sin el requerimiento de sustituyentes voluminosos tales como tintas fluorescentes. Una clase adicional de nucleótidos 3'-desbloqueados ha sido descrita por Helicos Biosciences. Estos nucleótidos utilizan un segundo análogo de nucleósido o nucleótido que actúa como un inhibidor de síntesis de ADN (Bowers et al., 2009; Patente Norteamericana 7,476,734). Se observa una diferencia significativa en las propiedades de terminación cuando se comparan los compuestos de la presente invención con los descritos por Bowers. Por ejemplo, Bowers et al. describió cinéticas de preestado constante que emplean dos plantillas de homopolímeros de dos bases, para las cuales, se midieron los rangos "p0i + 2 > para los tres terminadores "virtuales" 3'-OH desbloqueados. Bowers et al. llevó sus experimentos de terminación en ensayos de terminación de concentraciones de nucleótido submicromolares (es decir, de 100 a 250 nM). En contraste, se desempeñaron varios compuestos de la presente invención en 10 µ? en un curso de tiempo de 0.5 a 20 minutos. Ambos compuestos dU.V y dU.VI, fueron incorporados rápidamente en la primera posición base (100% durante 2 minutos) y posteriormente la síntesis de ADN terminada en dicha posición. No se puede detectar señal apreciable en la posición de segunda base esperada en los tiempos de incubación de 20 minutos. Para más detalles, consultar la Publicación de Gardner et al., 2012.

Los terminadores reversibles 3'-OH desbloqueados normalmente tienen diversas ventajas con respecto a los nucleótidos 3'-0-bloqueados. Por ejemplo, para muchos terminadores reversibles 3'-OH desbloqueados la descomposición de únicamente un enlace simple elimina tanto los grupos de terminación como de fluoroforo de la nucleobase. Esto a su vez da como resultado una estrategia más eficiente para restaurar el nucleótido para el siguiente ciclo CRT. Una segunda ventaja de los terminadores reversibles 3'-OH desbloqueados es que muchos de estos compuestos muestran una incorporación enzimática más favorable, y en algunos casos, se pueden incorporar igual que un nucleótido natural con polimerasas de ADN tipo natural (Wu et al., 2007; Litosh et al., 2011 ; Gardner et al., 2012; Patente Norteamericana 7,897,737; Patente Norteamericana 7,964,352; Patente Norteamericana 8,148,503; Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana 2011/0287427), aunque en otros casos, esta eficiencia no ha sido observada (Bowers et al., 2009; Patente Norteamericana 7,476,734). Un desafío para los terminadores 3'-OH desbloqueados es crear las modificaciones adecuadas para la base, que conducen a la terminación de la síntesis de ADN después de la adición de una sola base. Esto es importante debido a que un grupo 3'-OH desbloqueado es el sustrato natural para incorporar el siguiente nucleótido entrante.

Las tecnologías de secuenciación de siguiente generación (NGS) han facilitado importantes descubrimientos biomédicos, aunque aún se necesitan mejorías químicas por una cantidad de razones, incluyendo la reducción de rangos de error, reducción de tiempos de ciclo lento. Para ser efectivos en ensayos NGS, normalmente es deseable que los terminadores reversibles exhiban una cantidad de propiedades ideales incluyendo, por ejemplo, cinéticas rápidas de incorporación de nucleótido, terminación de base simple, alta selectividad de nucleótidos y/o una rápida descomposición del grupo de terminación. Por ejemplo, existe la necesidad de desarrollar nuevos nucleósidos y nucleótidos que cumplan con estos desafíos.

Breve Descripción de la Invención En algunos aspectos, la presente descripción proporciona compuestos y composiciones novedosas que son útiles en secuenciación eficiente de información genómica en reacciones de secuenciación de alto rendimiento. En otro aspecto, se proporcionan reactivos y combinaciones de reactivos que pueden proporcionar en forma eficiente y producible información genómica. En aspectos adicionales, la presente invención proporciona bibliotecas y formaciones de reactivos para métodos de diagnóstico y para desarrollar terapéuticos dirigidos para individuos.

En algunos aspectos, la presente descripción proporciona nuevos compuestos que pueden ser utilizados en secuenciación de ADN. Por ejemplo, la presente descripción proporcionar compuestos de la fórmula: en donde: RT es hidroxi, monofosfato, difosfato, trifosfato, a-tiotrifosfato o polifosfato; R2 es hidrógeno o hidroxi; R3 es alquilo(c<8) o alquilóos) sustituido; R4 es hidrógeno, hidroxi, halo, amino, nitro, ciano, azido o mercapto; alquilo(c=6), acilo(c=6), alcoxi(c=6), aciloxi(c=6), alquilamino,c=6), dialquilamino(c<6), amido(c<6), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; R5 y R6 cada uno son independientemente: hidrógeno, hidroxi, halo, amino, nitro, ciano, azido o mercapto; alquilo(c=s), alquenilo(c=6), alquinilo,c=6), arilo(c=6), aralquilo(c=8), heteroarilo(c=6), acilo(c=6), alcoxi(c=6), aciloxi(c=6), alquilamino(c<6), dialquilamino(c=6). amido(Cs6), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; un grupo de la fórmula: en donde X es O-, -S-, o -NH-; o alcanodiilo(c=12), alquenodiilo(c=12), alquinodiilo(c=12), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; Y es -O-, -NH-, alcanodiilo(c=12) o alcanodiilo(c=i2) sustituido; n es un entero de 0 a 6; y m es un entero de 0 a 6; o un-enlazador-reportero; o una sal, tautómero o isómero óptico del mismo.

En algunas modalidades, los compuestos se definen en forma adicional como un compuesto de las fórmulas I, II, III, IV, V, VI o VII. En algunas modalidades, es hidroxi, monofosfato, difosfato, trifosfato, a-tiotrifosfato o polifosfato.

En algunas modalidades, R2 es hidrógeno, hidroxi. En algunas modalidades, R3 es alquilo(cs8), por ejemplo, alquilo(C3-4), incluyendo isopropilo o ter-butilo. En algunas modalidades, R4 es hidrógeno, nitro. En algunas modalidades, R5 es hidrógeno, yodo o alcoxi(c=6), incluyendo, por ejemplo, metoxi. En algunas modalidades R5 es un grupo de la fórmula: en donde X es -O-, -S-, o -NH-; o alcanodiilO(C=12), alquenod¡¡lo(c=12), alquinod¡ilo(cs12), arenod¡ilo(c= 12), heteroarenodiilo(c=i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y n es es un entero de 0 a 6.

En algunas modalidades, X es alquinod¡ilo{C2-8>, por ejemplo, -C=C- En algunas modalidades, n es cero. En algunas modalidades, R5 es un grupo de la fórmula: en donde X es -O-, -S-, o -NH-; o alcanodiilo(c= 2), alquenodiilo(c=12), alquinodiilo(c=i2), arenodiilo(c=12), heteroarenodiilo(c i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; Y es -O-, -NH-, alcanodiilo(c=12) o alcanodiilo(c=i2) sustituido; n es un entero de 0 a 6; y m es un entero de 0 a 6.

En algunas modalidades, X es alquinodiilo(c2-8), por ejemplo, -C = C- En algunas modalidades, Y es -CH2- En algunas modalidades, n es cero. En algunas modalidades, m es cero. En algunas modalidades, R5 es un-enlazador-reportero. En algunas modalidades, el enlazador es: en donde X es -O-, -S-, o -NH-; o alcanodiilo(0< 2), alquenodiilo(c=12), alquinodiilo(0=12), arenodiilO(C=i2), heteroarenodiilo(c= 2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y n es un entero de 0 a 6.

En algunas modalidades, X es alquinodiilo(c2-8), por ejemplo, -C=C- En algunas modalidades, n es cero. En algunas modalidades, el enlazador es: en donde X es -O-, -S-, o -NH-; o alcanodiilo(c<i2), alquenodiilo(c=12), alquinodiilo(Csi2). arenodiilo(c=12), heteroarenodiilo(c=i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; Y es -O-, -NH-, alcanodiilo(c=12) o un alcanodiilo(cs12) sustituido; n es un entero de 0 a 6; y m es un entero de 0 a 6.

En algunas modalidades, X es alquinodiilo(c2-8), por ejemplo, -C = C- En algunas modalidades, Y es -CH2-. En algunas modalidades, n es cero. En algunas modalidades, m es cero. En algunas modalidades, el reportero está basado en una tinta, en donde la tinta es zanteno, fluoresceína, rodamina, BODIPY, cianina, coumarina, pireno, ftalocianina, ficobiliproteína, o tinta de escuaraína. En algunas modalidades, el reportero es: En algunas modalidades, R6 es hidrógeno. En algunas modalidades, el átomo de carbono destacado está en la configuración S. En algunas modalidades, el átomo de carbono destacado está en la configuración R. En algunas modalidades, el compuesto se define en forma adicional como: o una sal y/o forma protonada de cualquiera de estas fórmulas.

En algunas modalidades, el compuesto se define en forma adicional como: en donde R es =0 o =S, o una sal y/o forma protonada de cualquiera de estas fórmulas.

En algunas modalidades, el compuesto es en forma adicional como: en donde R es =0 o =S, o una sal y/o forma protonada de cualquiera de estas fórmulas.

En algunas modalidades, el compuesto se define en forma adicional como: o una sal y/o forma protonada de cualquiera de estas fórmulas.

En otro aspecto de la presente invención, se proporcionan métodos para secuenciar un ácido nucleico objetivo que comprende los siguientes pasos: (i) adherir el extremo 5' de un cebador a una superficie sólida; (ii) hibridar un ácido nucleico objetivo para el cebador adherido a la superficie sólida, para formar un complejo de cebador hibridado/ácido nucleico objetivo; (iii) obtener una polimerasa y uno o más compuestos aquí descritos, siempre que el compuesto de las diferentes fórmulas l-VII tenga diferentes fluoroforos; (iv) hacer reaccionar el complejo de cebador hibridado/ácido nucleico objetivo con una polimerasa y uno o más compuestos del paso (iii), para formar una hebra de cebador de crecimiento a través de una reacción de polimerasa; (v) generar imágenes de la hebra de cebador de crecimiento para identificar el compuesto incorporado del paso (iv) a través de su fluoroforo; (vi) exponer la superficie sólida con la hebra de cebador de crecimiento a una fuente de luz para eliminar una porción de terminación de fotodescomposición de la fórmula: las variables tal como se definen en la presente invención referenciadas en el paso (iii), dando como resultado un cebador extendido con componentes de origen natural; y (vii) repetir los pasos del (iv) al (vi) una o más veces para identificar una pluralidad de bases en el ácido nucleico objetivo, en donde el cebador extendido del paso (vi) del ciclo previo reacciona en lugar del complejo de cebador hibridado/ácido nucleico objetivo en el paso (iv) del ciclo subsecuente.

En algunas modalidades, el paso (vi) se lleva a cabo en la presencia de una azida de sodio. En algunas modalidades, la concentración de azida de sodio es de 0.1 mM a 10 mM, por ejemplo, aproximadamente 1 mM. En algunas modalidades, el paso (vi) se lleva a cabo en la presencia de un acetato de sodio. En algunas modalidades, la concentración de acetato de sodio es de 0.1 mM a 10 mM, por ejemplo, aproximadamente 1 mM.

En algunas modalidades, los pasos (v) o (vi) se llevan a cabo en la presencia de tiourea. En algunas modalidades, la concentración de tiourea es de 10 mM a 500 mM, por ejemplo, aproximadamente 100 mM.

En algunas modalidades, el paso (vi) se lleva a cabo en la presencia de ditiotreitol (DTT). En otro aspecto, se proporcionan métodos de secuenciación de un ácido nucleico objetivo que comprende los siguientes pasos: (i) adherir el extremo 5' de un ácido nucleico a una superficie sólida; (ii) hibridar un cebador para el ácido nucleico adherido a la superficie sólida para formar un complejo de cebador hibridado/ácido nucleico objetivo; (iii) obtener una polimerasa y uno o más compuestos aquí descritos, siempre que el compuesto de las diferentes fórmulas I a VII tengan diferentes fluoroforos (iv) hacer reaccionar el complejo de cebador hibridado/ácido nucleico objetivo con una polimerasa y uno o más de los compuestos de paso (iii) para formar una hebra de cebador de crecimiento mediante una reacción de polimerasa; (v) generar imágenes de la hebra de cebador de crecimiento para identificar el compuesto incorporado del paso (iv) a través de su fluoroforo; (vi) exponer la superficie sólida con la hebra de cebador de crecimiento a una fuente de luz para eliminar una porción de terminación de fotodescomposición de la fórmula: con las variables tal como aquí se define, dando como resultado un cebador extendido con componentes de origen natural; y (vii) repetir los pasos del (iv) al (vi) una o más veces para identificar una pluralidad de bases en el ácido nucleico objetivo, en donde el cebador extendido del paso (vi) del ciclo previo, reacciona en lugar del complejo de cebador hibridado/ácido nucleico objetivo en el paso (iv) del ciclo subsecuente.

En algunas modalidades, el paso (vi) se lleva a cabo en la presencia de una azida de sodio. En algunas modalidades, el paso (vi) se lleva a cabo en la presencia de ditiotreitol (DTT).

En algunas modalidades, la incorporación de al menos un compuesto de acuerdo con el paso (iv) ocurre en de aproximadamente 70% hasta aproximadamente 100% de la eficiencia de incorporación de su contraparte de nucleótido natural. En algunas modalidades, la eficiencia de incorporación ocurre en de aproximadamente 85% hasta aproximadamente 100%.

En algunas modalidades, la polimerasa se selecciona del grupo que consiste en transcriptasa inversa, transferasa terminal y polimerasa de ADN. En algunas modalidades, de aproximadamente 85% hasta aproximadamente 100% de las porciones de terminación de fotodescomposición son eliminadas mediante exposición a una fuente de luz en el paso (vi). En algunas modalidades, la incorporación de al menos un compuesto de acuerdo con el paso (iv) está seguida de la terminación de el crecimiento de hebra con una eficiencia de aproximadamente 90% hasta aproximadamente 100%.

En algunas modalidades, se utiliza un detector de excitación de línea múltiple pulsada para generar imágenes en el paso (v).

En algunas modalidades, el método comprende además lavar la hebra de cebador de crecimiento después del paso (iv) o (vi).

En algunas modalidades, el método comprende además, antes del paso (iv), tapar cualquiera cebadores y hebras de cebador de crecimiento que no reaccionen en el paso (iv).

En algunas modalidades, el método comprende además secuenciar en forma sincrónica ácidos nucleicos de objetivo múltiple.

En otro aspecto de la presente invención, se proporcionan métodos para convertir un componente de origen natural en una molécula de ácido nucleico, en un componente de origen natural, en donde los métodos comprenden: (i) incorporar un compuesto aquí descrito; (ii) exponer el ácido nucleico resultante a una fuente de luz para eliminar una porción de terminación de fotodescomposición de la fórmula: con las variables tal como aquí se definen, a partir del ácido nucleico.

En algunas modalidades, el método comprende además convertir en forma sincrónica componentes de origen no natural que se encuentran en múltiples moléculas de ácido nucleico, en componentes de origen natural. En algunas modalidades, el método comprende además terminar en forma sincrónica múltiples síntesis de ácido nucleico.

En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para terminar una síntesis de ácido nucleico que comprende el paso de colocar un nucleótido o nucleósido 3'-OH desbloqueado descrito anteriormente en el ambiente de una polimerasa, y permite la incorporación de nucleótido o nucleósido 3'-OH desbloqueado en una molécula de ácido nucleico. En algunas modalidades, la eficiencia de terminación de la síntesis de ADN en la incorporación de nucleótido o nucleósido 3'-OH desbloqueado fluctúa desde aproximadamente 90% hasta aproximadamente 100%. En algunas modalidades, la eficiencia de incorporación del nucleótido o nucleósido 3'-OH desbloqueado fluctúa desde aproximadamente 70% hasta aproximadamente 100% en comparación con la eficiencia de incorporación de un nucleótido o nucleósido de origen natural con la misma base que el nucleótido o nucleósido 3'-OH desbloqueado.

En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para llevar a cabo la secuenciación de Sanger o secuenciación tipo Sanger que comprende utilizar un compuesto aquí descrito como un análogo de nucleótido de terminación.

En otro aspecto, se proporcionan métodos para determinar la secuencia de un ácido nucleico objetivo, en donde los métodos comprenden: (i) agregar un ácido nucleico objetivo a un aparato de secuenciación de Sanger o tipo Sanger, (ii) agregar uno o más compuestos aquí descritos al aparato de secuenciación, siempre que cuando esté presente más de un tipo de base, cada base se adhiere a un diferente fluoroforo; (iii) agregar un cebador complementario y una enzima de polimerasa ; (iv) llevar a cabo una reacción de polimerasa para incorporar al menos uno de los compuestos del paso (ii) en una hebra de ácido nucleico de crecimiento, y (v) analizar el resultado de la reacción de secuenciación de Sanger con instrumentación de secuenciación de fluorescencia o mediante fluorescencia de excitación de línea múltiple pulsada, en donde se pueden llevar a cabo los pasos (i) a (iii) en cualquier orden.

En algunas modalidades, la incorporación de al menos un compuesto de acuerdo con el paso (iv), está seguida por la terminación del crecimiento de hebra en una eficiencia de desde aproximadamente 90% hasta aproximadamente 100%. En algunas modalidades, la incorporación de al menos un compuesto de acuerdo con el paso (iv) ocurre en aproximadamente 70% hasta aproximadamente 100% de la eficiencia de incorporación de un sustrato nativo con la misma base en la reacción de polimerasa. En algunas modalidades, la incorporación de eficiencia ocurre en aproximadamente 85% hasta aproximadamente 100%. En algunas modalidades, la polimerasa se selecciona del grupo que consiste en transcriptasa inversa, transferasa terminal y polimerasa de ADN.

En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para incorporar un componente de origen no natural en un ácido nucleico, en donde los métodos comprenden: (i) agregar un ácido nucleico objetivo a un aparato de secuenciación; (ii) agregar uno o más compuestos aquí descritos al aparato de secuenciación, siempre que cuando está presente más de un tipo de base, cada base se adhiere a un diferente fluoroforo; (iii) agregar una enzima de polimerasa; y (iv) llevar a cabo una reacción de polimerasa para incorporar al menos uno de los compuestos del paso (ii) en una hebra de ácido nucleico de crecimiento, en donde los pasos (i) a (iii) se pueden llevar a cabo en cualquier orden.

En algunas modalidades, el método comprende además: (v) analizar el resultado de la reacción de cadena de polimerasa para incorporación de al menos un compuesto del paso (ii).

En algunas modalidades, la incorporación de al menos un compuesto de acuerdo con el paso (iv) está seguida de la terminación del crecimiento de hebra en una eficiencia de desde aproximadamente 90% hasta aproximadamente 100%. En algunas modalidades, la incorporación de al menos un compuesto de acuerdo con el paso (iv) ocurre en de aproximadamente 70% hasta aproximadamente 100% de la eficiencia de incorporación del substrato nativo con la misma base en la reacción de polimerasa, con un substrato nativo con la misma base en la reacción de polimerasa.

En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para llevar a cabo minisecuenciación o secuenciación tipo minisecuenciación que comprende la adición de un compuesto aquí descrito a un método de minisecuenciación o secuenciación tipo minisecuenciación.

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos antes descritos, el compuesto se define en forma adicional como un compuesto de la fórmula I, II, III, IV, V, VI o VII.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un sistema que comprende: una célula de flujo que comprende una pluralidad de gránulos, en donde: cada gránulo es adherido a una molécula de ADN, en donde un compuesto aquí descrito ha sido incorporado en el uso de una polimerasa; y la célula de flujo es al menos parcialmente transparente para la luz visible y UV; un dispositivo de generación de imagen configurado para capturar imágenes de la célula de flujo; una rueda de filtro que comprende al menos cuatro filtros de espectro, en donde la rueda de filtro está configurada para ciclar entre cada filtro; una lámpara configurada para crear una trayectoria de luz de la célula de flujo a través de un filtro en la rueda de filtro para el dispositivo de generación de imagen; y una fuente de luz ultravioleta configurada para proporcionar luz ultravioleta a las moléculas de ADN en la célula de flujo.

En algunas modalidades, la célula de flujo es una célula microfluida. En algunas modalidades, el sistema comprende además un lente objetivo entre la rueda del filtro y la célula de flujo. En algunas modalidades, el sistema comprende además un espejo configurado para dirigir la trayectoria de luz al dispositivo de generación de imagen.

En algunos aspectos, la presente descripción proporciona diagnósticos de cáncer que son rápidos, de alto rendimiento, precisos y sensibles para la detección de etapas tempranas, para identificar variantes de secuencia rara que pertenecen a una subpoblación de células limitadas que pasan por transformación cancerígena.

Otros objetos, características y ventajas de la presente invención podrán ser apreciados a partir de la siguiente descripción detallada. Sin embargo deberá quedar entendido que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican modalidades específicas de la presente invención, se proporcionan únicamente a manera de ilustración, ya que varios cambios y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la presente invención podrán ser apreciados por los expertos en la técnica a partir de esta descripción detallada. Se debe observar que simplemente debido a que un compuesto particular se atribuye a una fórmula genérica particular, no significa que no pueda también pertenecer a otra fórmula genérica.

Breve Descripción de las Figuras Los dibujos que se encuentran a continuación forman parte de la presente especificación y están incluidos para demostrar en forma adicional ciertos aspectos de la misma. La presente invención puede ser comprendida de mejor manera a través de la referencia a uno de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de modalidades específicas aquí presentadas.

Figura 1 - Estructuras de Análogos HOMedNTP Alquilados por 2-Nitrobencilo. "R" es H, /so-propilo o ter- butilo. "R'" es H, 4-OMe, 5-OMe, 4,5-di-OMe o 6-N02. Ver las claves para los ejemplos específicos. "*" indica dos diferentes configuraciones estereoquímicas en este átomo de carbono. La parte de las fórmulas dentro de los elipsoides punteados señala la terminación de grupos funcionales que se descomponen al momento de la exposición a luz UV.

Figura 2 - Eliminación de Producto Temporal (TP) con DTT. Imagen de gel fluorescente de una serie de tiempo de descomposición fotoquímica UV de dU.VI incorporada mediante polimerasa Therminator™ en la presencia de (A) 1 mM NaN3 y (B) 1 mM NaN3, 50 mM DTT. Columnas: "P" (cebador) contiene Therminator™ enlazado a una oligoPlantilla-4 hibridada con cebador-1 marcado con BODIPY-FL en amortiguador 1x ThermoPol (Wu et al., 2007; Litosh et al., 2011), "I" (incorporación) contiene lo que se encontró en la columna "P" más 100 nM dU.VI, y las columnas de punto de tiempo contienen lo que se encontró en la columna "I" más las muestras de tiempo descritas que fueron expuestas a luz 0.70 W/cm2 365 nm. "IP" indica el producto incorporado y "CP" indica el producto descompuesto.

Figura 3 - Estructura de Cristal de Rayos X de (1S)-canfanato de (S)-1 -(5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1 -propilo. Se tomaron medidas cristalográficas en un cristal de (1 S)-canfanato de (S)-1 -(5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1 -propilo con dimensiones de 0.50 mm x 0.05 mm x 0.05 mm tal como se describe en la Publicación de Litosh et al. (2011), lo cual está incorporado a la presente invención como referencia. Recolección de datos: radiación CuKa, ? = 1.54178 Á, T = 110 ± 2°K, 20max = 120.0°, 32,513 reflexiones recolectadas, 2,913 únicas ( int = 0.0517). GooF final = 1.091, R1 = 0.0681, wR2 = 0.1695, índices R basados en 2,913 reflexiones con l>2sigma(l) (refinamiento en F2), 290 parámetros, 43 restricciones. Lp y correcciones de absorción aplicadas, µ = 0.819 mm'1. Parámetro de estructura absoluta: 0.05 ± 0.09. Datos de cristalografía de rayos X: C22H29N07l M = 419.46. Ortorrómbico, a = 6.29, b = 15.00, c = 22.27 A (a, ß, ? = 90°), V = 2,099.29 A3, grupo de espacio P2T212L Z = 4, Dc = 1.327 g/cm"3, F(000) = 896.

Figura 4 - DTT Elimina el Intermediario Nitroso (TP). La imagen de gen fluorescente del experimento de descomposición fotoquímica UV de dU.VI incorporado mediante polimerasa Therminator™ Lente: "P" (cebador) contiene Therminator™ enlazado a oligoplantilla-4 hibridado con cebador-1 marcado con BODIPY-FL en 1x ThermoPol buffer, ?" (incorporación) contiene lo encontrado en la columna "P" más 100 nM dU.VI. Se agregaron reactivos A-G descritos como concentraciones finales en la clave, y las muestras se expusieron a luz 0.70 W/cm2 365 nm durante 10 segundos. ?" indica producto incorporado, "CP" indica producto descompuesto y "TP" indica producto temporal.

Figuras 5A y B — Preparación Óptica para Medidas de Descomposición Fotoquímica. La figura 5A muestra un esquema del corte de tubo Eppendorf de 0.5 ml_ modificado cortado a la mitad, medidor de potencia PM100, un cartucho de perforaciones de 1,000 pm utilizando una etapa de traducción manual de 3 ejes para alinear el rayo del arco. La figura 5B muestra un sujetador de muestras y el tubo de Eppendorf de 0.5 ml_ modificado con una tarjeta de alineación interna para alinear el rayo del arco en el centro de una muestra de reacción de 10 pl_ o 20 pL.

Figura 6 - Ejemplo de reacción de disociación fotoquímica. Al momento de la disociación fotoquímica inducida por UV, se libera el derivado de 2-nitrobencilo de terminación para producir un nucleótido de hid roximetilo natural. La combinación de un grupo (S)-ter-butilo estereoespecífico adherido en el carbono bencílico acoplado con un grupo 5-OMe modificado en el anillo de 2 nitrobencilo incrementó sustancialmente el rango de reacción de descomposición fotoquímica. Para el caso de C7-HOMedG, el rango incrementó en más de un orden de magnitud con respecto a su análogo de origen correspondiente.

Figura 7 - Sustitución de ter-Butilo en el a-Carbono y Sustitución Metoxi en la Posición 5 se Correlaciona con los Rangos de Descomposición Fotoquímica Mejorado. Esta figura compara los rangos de descomposición fotoquímica del origen, grupos (S)-a-ter-butilo y (S)-a-ter-butil-5-OMe 2-nitrobencilo alquilados en nucleósidos C7-HOMedA, HOMedC, C7-HOMedG y HOMedU. Los valores DT50 inferiores indican rangos de descomposición fotoquímica más rápidos.

Figura 8. Una representación esquemática de un sistema para generar imágenes de gránulos fluorescentes en una célula de flujo.

Figura 9. Ejemplo de Preparación de Gránuio y Método de Inmovilización. Ilustración esquemática de los pasos de una preparación de ejemplo de una muestra de gránuio en una célula de flujo.

Figura 10. Ilustración esquemática de los pasos de incorporación, imágenes de fluorescencia y descomposición fotoquímica en un ciclo CRT.

Figura 11. Ilustración de imágenes de multirresolución de tres ciclos CRT y designación de base subsecuente de gránulos individuales.

Figura 12 - Fórmulas Químicas de Terminadores Reversibles 3'-OH Adheridos a Tintas Genéricas ("Fluor"). La parte de las fórmulas comprendidas por el elipsoide punteado indica los grupos funcionales de terminación marcados con tinta y que son descompuestos al momento de la exposición a la luz UV.

Figura 13 - Diagrama del método de Secuenciación de Mella Aleatoria (RNS). Los Lightning Terminators™ de iluminación indicados en la figura están comprendidos de los terminadores reversibles de la presente invención.

Descripción Detallada de la Invención I. Terminadores Reversibles y Métodos de Síntesis de los Mismos En un aspecto, la presente descripción proporciona compuestos nuevos que pueden ser utilizados para funcionar como terminadores reversibles en una variedad de diferentes aplicaciones de secuenciación de ADN. Los compuestos proporcionados en la presente descripción también son referidos como terminadores reversibles, terminadores reversibles 3'-OH desbloqueados y como Lightning Terminators™ . En algunas modalidades, se proporcionan los compuestos de las siguientes fórmulas: en donde: Rn es hidroxi, monofosfato, difosfato, trifosfato, o tiotrifosfato o polifosfato; R2 es hidrógeno o hidroxi; R3 es alquil, c=8) o alquilase) sustituido; R4 es hidrógeno, hidroxi, halo, amino, nitro, ciano, azido o mercapto; alquil(C=6), ac¡l(C=6>, alcoxi(C=6), aciloxi(C=6), alquilamino(c=6), dialquilamino(c=6)anrtido(C<6), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; R5 y R6 cada uno son independientemente: hidrógeno, hidroxi, halo, amino, nitro, ciano, azido o mercapto; alquil(Cs6>. alquenil(C=6>, a I q u i n i I (C=e > , aril(C=6), aralquil(C=8), heteroaril(C=6). acil(C<6)- alcoxi(C=6), aciloxi(C<6)-alquilamino(c=6), dialquilamino(C=6), amido(C=6), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; un grupo de la fórmula: en donde X es -O-, -S-, o -NH-; o alcanodiil(c<i2), alquenodiil(C=i2), alquinodiil(C=i2). o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; Y es -O-, -NH-, alcanodiil(c=i2) un alcano-diil(C=i2) sustituido; n en un entero de 0-6; y m en un entero de 0-6; o un -enlazador-reportero; o una sal, tautómero, o isómero óptico del mismo.

Los nucleótidos de hidroximetilo alquilados con a-íBu-5-OMe-2-nitrobencil marcados con tinta pueden ser sintetizados de acuerdo con los siguientes esquemas y procedimientos.

A. Síntesis de 7-[(S)-1 -(5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propiloxi]metil-7-deaza-2'-desox i adenosina-5' -trifosfatos marcados con tinta Esquema 2a. Síntesis de 7-[(S)-1 -(5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propiloxi]metil-7-deaza-2'-desoxiadenosina-5'-trifosfato marcado con tinta. Reactivos y condiciones: (i) (S)-1-(5-metoxi-2-nitrofen¡l)-2,2-dimet¡l-1-propanol, 110°C; (¡i) n-Bu4NF, THF, temperatura ambiente; (/'//') NH3, 1 ,4-dioxano/ eOH, 100°C; (/V) N-propargiltrifluoroacetamida, Pd(PPh3)4(0), Cul, Et3N, DMF; (v) POCI3, (MeO)3PO, 0°C; (n-Bu3NH)2H2P207, n-Bu3N, DMF; 1 M HNEt3HC03.

Esquema 2b. (vi) Alexa Fluor 488 NHS, amortiguador Na2C03/NaHC03 0.1 M (pH 9.2).

Esquema 2c. (vii) 6-FAM NHS, amortiguador Na2C03/NaHC03 0.1 M (pH 9.2).

Esquema 2d. (vi i i) CF488A NHS, amortiguador Na2C03/NaHC03 0.1 M (pH 9.2).

B. Síntesis de 5-[(S)-1 -(5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2- d¡metil-propiloxi]metil-2'-desox i uridina-5 '-trifosfato marcado con tinta.

Esquema 3a. Síntesis de 5-[(S)-1 -(5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propiloxi]metil-2'-desoxiuridina-5'-trifosfato marcado con tinta. Reactivos y condiciones: (i) (S)-1-(4-yodo-5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-d¡metil-1-propanol, 110oC; (//') NH4F, MeOH, 50°C; (/'//') A/-proparg¡ltrifluoroacetam¡da, Pd(PPh3)4(0), Cul, Et3N, DMF; (iv) POCI3, esponja de protones, (MeO)3PO, 0°C; (n-Bu3NH)2H2P207, n-Bu3N, DMF; 1 M HNEt3HC03; Esquema 3b. (v) Alexa Fluor 532 NHS, amortiguador Na2C03/NaHC03 0.1 M (pH 9.2).

Esquema 3d. (v) Cy3 NHS, amortiguador Na2C03/NaHC03 (pH 9.2).

C. Síntesis de 7-[(S)-1 -(5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2- dimetil-propilox¡]metil-7-deaza-2'-desoxiguanosina-5'- trifosfato marcado con tinta Esquema 4a. Síntesis de 7-[(S)-1 -(5-metoxi-2- nitrof nil)-2,2-dimetil-propiloxi]metil-7-deaza-2'- desoxiguanosina-5'-trif osfato marcado con tinta. Reactivos y condiciones: (i) MsCI, DMAP, CH2CI2, 0°C; (//) (S)-1 -(4-yodo-5- metoxi-2-nitrofenil)-2,2-d¡metil-1 -propanol, 115°C; (//'/) n-Bu4NF, THF, temperatura ambiente; (/V) sin-piridina-2-aldoxima, guanidina de 1 ,1 ,3,3-tetrametilo, 1 ,4-dioxano/DMF, 70°C; (v) N-propargiltrifluoroacetamida, Pd(PPh3)4(0), Cul, Et3N, DMF; (vi) POCI3, esponja de protones, (MeO)3PO, 0°C; (n-Bu3N H)2H2P207, /?-Bu3N, DMF; 1 M HNEt3HC03.

Esquema 4b. (vii) Alexa Fluor 594 NHS, amortiguador Na2C03/NaHC03 0.1 M (pH 9.2).

Esquema 4c. (vi i) 6-ROX NHS, amortiguador Na2C03/NaHC03 0.1 M (pH 9.2).

D. Síntesis de 5-[(S)-1 -(5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propiloxi]metil-2'-desox¡citidina-5' -trifosfato marcado con tinta Esquema 5a. Síntesis de 5-[(S)-1 -(5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propilox¡]metil-2'-desoxicit¡d¡na-5'-trifosfato marcado con tinta. Reactivos y condiciones: (i) TBSCI, imidazol, DMF, temperatura ambiente; (/'/') clorhidrato de 2,4,6-triisopropilbencenosulfonilo, DMAP, Et3N, CH2CI2, temperatura ambiente; (//'/') NH3, 1,4-dioxano, 90°C; (/V) n-Bu4NF, THF, temperatura ambiente, 82%; (v) N-propargiltrifluoroacetamida, Pd(PPh3)4(0), Cul, Et3N, DMF; (vi) POCI3, esponja de protones, (MeO)3PO, 0°C; (n-Bu3NH)2H2P207, n-Bu3N, DMF; 1 M HNEt3HC03.

Esquema 5b. (vi) Cy5 NHS, amortiguador Na2C03/NaHC03 0.1 M (pH 9.2).

Esquema 5c. (vi) Alexa Fluor 647 NHS, amortiguador Na2C03/NaHC03 0.1 M (pH 9.2).

En algunas modalidades, se observó que la estereoquímica del alquilo sustituido en el a-carbono, puede incrementar las propiedades de descomposición fotoquímica de un grupo 2-nitrobenilo. En algunas modalidades, se observó que los rangos de descomposición fotoquímica o más rápidos resultan por combinar el grupo estereoespecífico en el a-carbono con otro grupo químico adherido al anillo de 2-nitrobencilo. Ver por ejemplo, la figura 7.

Los compuestos de la presente descripción pueden ser elaborados utilizando los métodos descritos anteriormente y en la sección de Ejemplos que se encuentra más adelante. Por ejemplo, se proporciona en el Ejemplo 8 un resumen de una síntesis para elaborar alcohol a-tBu-5-OMe-2-nitrobencílico, incluyendo una forma enantiopura del mismo. Estos métodos pueden ser modificados en forma adicional y optimizados utilizando los principios y técnicas de la química orgánica, tal como lo aplican los expertos en la técnica. Dichos principios y técnicas se enseñan, por ejemplo, en la Publicación de March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure (Química Orgánica Avanzada de March: Reacciones, Mecanismos y Estructura) (2007), la cual está incorporada a la presente invención como referencia.

Los compuestos empleados en los métodos de la presente invención pueden contener uno o más átomos de carbono o nitrógeno sustituidos en forma simétrica, y pueden aislarse en forma ópticamente activa o racémica. Por lo tanto, todas las formas quirálicas, diastereoméricas, racémicas, epiméricas, y todas las formas isoméricas geométricas de una estructura están proyectadas a menos que se indique en forma específica la estereoquímica o forma isomérica específica. Los compuestos pueden surgir como racematos o mezclas racémicas, enantiómeros simples, mezclas diastereoméricas y diastereómeros individuales. En algunas modalidades, se obtiene un diastereómero simple. Los centros quirálicos de los compuestos de la presente invención pueden tener la configuración S o R. Por ejemplo, en algunos aspectos de la presente invención, la sustitución y su estereoquímica del a-carbono del éter bencílico bases de pirimidina de 5-hidroxi metilo o 7-hidroximetil-7-deazapurina modificadas afectan la función biológica y rangos de descomposición de la reacción de dNTPs modificados por base, 3'-OH desbloqueados.

Los compuestos de la presente invención también pueden tener la ventaja de que pueden ser más eficaces, menos tóxicos, tener acción más prolongada, ser más potentes, producir menos efectos secundarios, ser más fácilmente absorbidos y/o tener un mejor perfil farmacocinético (por ejemplo, mayor biodisponibilidad oral y/o menor despeje), y/o tener otras propiedades farmacológicas, físicas o químicas con respecto a los compuestos conocidos en la técnica, ya sea para utilizarse en las indicaciones aquí manifestadas o de otra forma.

Las fórmulas químicas utilizadas para presentar compuestos de la presente invención normalmente mostrarán solo uno de los diversos tautómeros posiblemente diferentes. Por ejemplo, muchos tipos de grupos de cetonas son conocidos por existir en equilibrio con grupos de enol correspondientes. Similarmente, existen muchos grupos de imina en equilibrio con grupos de enamina. Sin importar que tautómero se ilustra para un compuesto determinado, y sin importar cuál es el más prevalente, están proyectados todos los tautómeros de una fórmula química determinada.

Además, los átomos para elaborar los compuestos de la presente invención están proyectados para incluir todas las formas isotópicas de dichos átomos. Los isótopos, tal como aquí se utilizan, incluyen los átomos que tienen el mismo número atómico, pero diferentes números de masa. A manera de ejemplo general y sin limitación, los isótopos de hidrógeno incluyen tritio y deuterio, y los isótopos de carbono incluyen 3C y 14C. Similarmente, se contempla que uno o más de los átomos de carbono de un compuesto de la presente invención, puedan ser reemplazados por un átomo de silicón. Además, está contemplado que uno o más de los átomos de oxígeno de un compuesto de la presente invención puedan ser reemplazados por un átomo(s) de azufre o selenio.

En algunas modalidades, los terminadores reversibles 3'-OH desbloqueados aquí proporcionados tienen un grupo alfa-tiofosfato, preferentemente un grupo alfa-tiotrifosfato. Ver por ejemplo, los compuestos 54b, 55b, 59b, 60b, 63b, 64b, 68b, y 69b, en el ejemplo 8 que se encuentra a continuación. Es bien sabido en la técnica que las polimerasas de ADN exhiben actividad de 3'-5'. La función de la actividad 3'-5' es eliminar solo el nucleótido incorporado de la hebra de cebador. Muchas polimerasas de ADN comercialmente disponibles se eliminan o mutan el dominio 3'-5' exonucleasa para reducir esta actividad a debajo de niveles detectables. Sin embargo, incluso la actividad de bajo nivel de algunas polimerasas de ADN puede dar como resultado una deficiente calidad de datos de secuencia debido al desfase de la señal primaria. En algunas modalidades, los terminadores reversibles 3'-OH desbloqueados que tienen grupos alfa-tiotrifosfato pueden ser utilizados para reducir, minimizar y/o eliminar la actividad de 3'-5' exonucleasa residual. Sin pretender limitarse a la teoría, es bien sabido en la técnica que las alfa-tiotrifosfatos son resistentes a actividad de exonucleasa. Ver por ejemplo, la Patente Europea EP 0 640 146 de Rosental y Brenner, la cual está incorporada a la presente invención como referencia.

Los compuestos de la presente invención también pueden existir en forma de profármaco. Ya que los profármacos son conocidos por incrementar las numerosas calidades deseables de los farmacéuticos (por ejemplo, solubilidad, biodisponibilidad, fabricación, etc.), los compuestos empleados en algunos métodos de la presente invención, si se desea, pueden suministrarse en forma de profármaco. Por lo tanto, la presente invención contempla profármacos de los compuestos de la presente invención, así como métodos para suministrar profármacos. Los profármacos de los compuestos empleados en la presente invención pueden prepararse modificando grupos funcionales presentes en el compuesto de tal forma que las modificaciones se descompongan, ya sea en manipulación de rutina o in vivo, para el compuesto de origen. Por consiguiente, los profármacos incluyen, por ejemplo, compuestos aquí descritos en los cuales el grupo hidroxi, amino, o carboxi se enlaza a cualquier grupo, el cual cuando el profármaco se administra a un sujeto, se descompone a la forma de un hidroxi, amino, o ácido carboxílico, respectivamente.

La presente descripción proporciona además compuestos de nucleótido y nucleósido, así como sales, ésteres y fosfatos de los mismos que se pueden utilizar en tecnología de secuenciación de ADN rápida. Sin embargo, deberá reconocerse que el anión o catión particular que forma parte de cualquier sal de la presente invención no es importante, siempre que la sal, como una totalidad, sea farmacológicamente aceptable. Los ejemplos adicionales de sales farmacéuticamente aceptables y sus métodos de preparación y uso se presentan en la Publicación de Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, and Use (Manual de Sales Farmacéuticas: Propiedades y Usos) (2002), la cual está incorporada a la presente invención como referencia. Los compuestos están opcionalmente en la forma de trifosfatos de ribonucleósido (NTPs) y trifosfatos de desoxiribon ucleósido (dNTP). Los compuestos de nucleótido y nucleósido en algunos casos incluyen un grupo que se puede descomponer química o enzimáticamente marcado con un grupo reportero, tal como una tinta fluorescente. Los compuestos de nucleótido y nucleósido incluyen grupos de protección química o enzimáticamente removibles que están diseñados para terminar la síntesis de ADN, así como para descomponerse rápidamente, de modo que estos monómeros se pueden utilizar para secuenciación rápida en un formato paralelo. La presencia de dichos grupos que se pueden descomponer rápidamente marcados con tintas fluorescentes en los compuestos de nucleótido y nucleósido pueden incrementar la velocidad y precisión de secuenciación de oligómeros grandes de ADN en paralelo, para permitir, por ejemplo, una rápida secuenciación de todo el genoma, y la identificación de polimorfismos y otra información genética valiosa.

Estos terminadores 3'-OH desbloqueados así como bien tolerados a través de un número de polimerasas de ADN comercialmente disponibles representan una ventaja clave con respecto a los terminadores 3'-0 bloqueados.

El grupo bencilo de los compuestos aquí descritos también puede ser derivado para incluir una tinta fluorescente seleccionada u otro grupo reportero.

II. Propiedades de Terminadores Reversibles Tal como se describió anteriormente, en un aspecto, se proporcionan nucleótidos de 2-nitrobencilo alquilados novedosos con propiedades de descomposición fotoquímica rápida que pueden ser utilizados como terminadores reversibles mejorados para aplicaciones de secuenciación de terminador reversible cíclico (CRT). Dichas aplicaciones se describen en la Publicación de Metzker (2005, 2010), la cual está incorporada a la presente invención como referencia. En algunas modalidades, se proporcionan 7-deaza-7-hidroximetil-2'-desoxiadenosina (C7-HOMedA) (Rockhill et al, 1997) y 7-deaza-7-hidroximetil-2'-desoxiguanosina (C7-HOMedG) (McDougall et al, 2001) modificados junto con HOMedC y HOMedU con una variedad de grupos de 2-nitrobencilo sustituidos. Ver figura 1. En algunas modalidades, los terminadores reversibles aquí descritos exhiben un número de propiedades adecuadas, incluyendo cinéticas rápidas de la incorporación de nucleótido, terminación de base simple, alta selectividad de nucleótido y/o rápida descomposición del grupo de terminación.

Se identificaron condiciones cromatográficas para separar los análogos C7-HOMedA en nucleótidos diastereoméricos simples, con el primer isómero de elución indicado como ds1, y el segundo como ds2. Para evaluar el efecto de disociación fotoquímica de la estereoquímica de una sustitución de grupo a-isopropilo con las modificaciones de anillo 2-nitrobencilo de 4- metoxi (4-OMe) y 6-n¡tro (6-N02), se sintetizaron tres análogos C7-HOMedA dA.lll.a - dA.lll.c, así como el dA.I de origen (ver la sección de Ejemplos que se encuentra a continuación). Se llevaron a cabo ensayos de incorporación con estos análogos C7-HOMedATP alquilados con 2-nitrobencílo y posteriormente se sometieron a experimentos de descomposición fotoquímica UV o en soluciones de azida de sodio (Tabla 1).

Tabla 1. Rangos de Descomposición Fotoquímica de Análogos C7-HOMedA En todos los casos, los isómeros ds2 de dA.lll.a - dA.lll.c mostraron rangos de descomposición fotoquímica más rápidos (es decir, menores valores DT50) por factores de 2.0x, 6 Ax, y 1.2x, respectivamente, en comparación con los de sus contrapartes. En forma interesante, los isómeros dsl exhibieron valores DT50 similares (dA.lll.c) o superiores (dA.lll.a o dA.lll.b) comparados con el análogo dAJ de origen. Estos datos proporcionan evidencia de que la estereoquímica del grupo a-isopropilo sustituido es un determinante importante y acoplado con una sustitución 4-OMe, el análogo dA.lll.b ds2 produjo el valor DT50 más bajo para el grupo a-isopropil C7-HOMedA.

El trabajo previo ha demostrado que el análogo de a-ter-butilo dU.V, exhibió propiedades CRT excelentes tal como terminación de base simple y alta selectividad de nucleótido (Litosh et al, 2011). Esto permitió la revisión adicional del efecto estereoespecífico utilizando un grupo de sustitución-a diferente acoplado con diversas sustituciones de anillo OMe sintetizando cuatro análogos de a-ter-butilo C7-HOMedG, dG.V.a - dG.V.d, junto con el dG.I de origen (figura 1). En forma consistente con los análogos a-isopropil-C7-HOMedATP, los experimentos de descomposición fotoquímica UV revelaron que los isómeros ds2 de dG.V.a - dG.V.d mostraron rangos más rápidos por factores de 3.1 x, 4.5 x, 4.4x, y 3.0x, respectivamente, en comparación con los de sus contrapartes (Tabla 2).

Tabla 2. Rangos de Descomposición Fotoquímica de Análogos C -HOMedG.

Los isómeros 5-OMe tanto ds1 como ds2 exhibieron rangos de descomposición fotoquímica más rápidos de 1.4x veces cada uno en comparación con los isómeros 4-OMe correspondientes. El isómero 4,5-di-OMe bis-sustituido ds1 mostró rangos de descomposición más rápidos en comparación con los isómeros 4-OMe (2.0x) o 5-OMe (1.5x) mono-sustituidos. Inversamente, los isómeros 5-OMe ds2 y 4,5-di-OMe ds2 exhibieron valores DT50 idénticos de solo 0.8 segundos. En la ausencia de un grupo de a-sustitución, Hasan et al (1997) reportó un incremento en rango únicamente de 1.2x para un análogo de 5-OMe-2-nitrobencilo con respecto a su origen correspondiente.

La comparación de los isómeros ds1 y ds2 de dG.V.c con dG.V.a reveló mayores incrementos de rango de 3.6x y 4.4x, respectivamente, lo que sugiere que el grupo ter-butilo estereoespecífico incremente el efecto del grupo 5-OMe. Con aplicaciones CRT de cuatro colores, esta combinación proporciona buena flexibilidad en utilidad de sistema de anillo, como una estructura enlazadora que también puede adherirse a la posición-4 para crear los análogos marcados con tinta (Patentes Norteamericanas Nos. 7,897,737 7,964,352, y 8, 148,503; Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 2011/0287427; Metzker, 2010).

Para determinar la estereoquímica de estos análogos a-fer-butilo C7-HOMedG, el ( 1 S)-camfa nato de (R/S)-1 -(5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1 -propanol se resolvió en su alcohol (S) enantipouro mediante cristalización fraccional (Corrie ef al, 1992) (figura 3). Este (S) y el alcohol (S)-a-fer-butil-2-nitrobencílico (Patente Norteamericana No. 8,148,503; Litosh et al, 2011), cada uno se acoplaron a C7-HOMedG (figura 1). El análisis RP-HPLC de sus trifosfatos correspondientes revelaron que ambos isómeros ds2 de dG.V.a y dG.V.c tuvieron tiempos de retención pico idénticos como el de dG.V y dG.V1, respectivamente, permitiéndonos de esta forma determinar que ambos isómeros ds2 pueden tener la misma configuración (S) en el a-carbono. Por inferencia, a los isómeros ds1 correspondientes de dG.V.a y dG.V.c se les ha asignado la configuración (R).

Estos alcoholes (S) posteriormente se acoplaron a los nucleósidos restantes para revisar el efecto del grupo de partida en el rango de descomposición fotoquímica. Por ejemplo, los experimentos de descomposición fotoquímica UV revelaron que los valores DT50 para los análogos 2-nitrobencilo de origen variaron de 2.0 seg para dC.I para 9.2 seg para dG.I (figura 7 y Tabla 3).

Tabla 3. Rangos de Descomposición Fotoquímica de Terminadores Reversibles [a]Producto temporal (TP) observado mediante electroforesis de gel; considerado como el producto descompuesto en el valor DT50 La sustitución de carbono bencílico con ( S)-ter-butilo dio como resultado rangos de descomposición incrementados por factores de 1.5x - 3.1 x y la sustitución adicional con un grupo 5-OMe incrementó en forma adicional los rangos por factores de 3.0x - 11.5x en comparación con los análogos de origen. Se observó el incremento de rango mayor cuando se compararon análogos C7-HOMedG, reduciendo los valores DT50 de 9.2 a 0.8 seg (figura 7, barras negras). El conjunto completo de los terminadores reversibles (S)-5-OMe-a-ter-butilo mostraron un rango más estrecho de valores DT50 de 0.6 a 0.8 seg. Estos datos sugieren que los efectos combinados de los grupos (S)-a-ter-butil y 5-OMe desempeñan un papel importante en disminuir la variación de rango de disociación observada con los grupos de partida de nucleótido particulares, teniendo la aplicación práctica de proporcionar condiciones de disociación normalizados y más rápidos para el ciclo CRT. Inesperadamente, se observaron productos temporales de los ensayos de incorporación para (S)-5-OMe-a-ter-butil-C7-HOMedA, -HOMedC y -HOMedU, pero no -C7-HOMedG, después de una breve exposición a luz UV (se mostró HOMedU únicamente en la figura 2, lado izquierdo). Ya que la única diferencia fue el nucleótido incorporado, hipotetizamos que la descomposición más rápida del grupo (S)-5-OMe-a-ter-butil-2-nitrobencilo produce un subproducto de 2-nitrosocetona más reactivo que ataca el nucleótido 3'-terminal de la hebra de cebador de crecimiento.

Para investigar las condiciones que exterminan el intermediario del nitroso, se probaron un número de agentes de amino y tiol durante los experimentos de descomposición fotoquímica UV (figura 5). De estos, únicamente ditiotreitol (DTT) (Cleland, 1964) eliminó el producto temporal (figura 2, lado derecho). En algunas modalidades, la concentración DTT efectiva es de 1 mM a 1 M. En algunas modalidades, la concentración DTT efectiva es de 5 mM a 100 mM. En algunas modalidades, la concentración DTT efectiva es de 10 mM a 50 mM. En algunas modalidades, la concentración DTT efectiva es de aproximadamente 50 mM. En algunas modalidades, el paso de descomposición fotoquímica tiene lugar en la presencia de azida de sodio. En algunas modalidades, la concentración de azida de sodio efectiva es de 0.1 mM a 1 M. En algunas modalidades, la concentración de azida de sodio efectiva es de 1 mM a 100 mM. En algunas modalidades, la concentración de azida de sodio efectiva es de 1 mM a 50 mM. En algunas modalidades, la concentración de azida de sodio efectiva es de aproximadamente 1 mM.

Para probar los efectos del rango, se repitieron experimentos de descomposición fotoquímica UV para todos los compuestos en la presencia de DTT, de los cuales se redujeron los valores DT50 de diversos isómeros de origen y ds1 (tablas 1, 2, y 3). Bart et al. (2005) propuso que DTT ataca el grupo nitroso mediante adición nucleofílica, aunque una última revisión de Corrie (2005) describe tioles protectores como innecesarios, ya que la evidencia de la interferencia biológica del subproducto de nitrosocetona permanece mínima. En otros ejemplos aquí descritos, DTT desempeña un papel protector importante contra dichas reacciones indeseadas.

La configuración estéreoespecífica (S) del grupo a-sustituido combinada con el grupo 5-metoxi se encontró como determinante en la creación de terminadores reversibles de composición rápida. El subproducto de nitrosocetona reactivo puede ser eliminado efectivamente durante la descomposición fotoquímica en la presencia de DTT, proporcionando condiciones adecuadas para mantener la integridad biológica de la reacción CRT.

III. Compuestos de Nucleótido y Nucleósido y su Uso en Secuenciacion de ADN Los terminadores reversibles de la presente invención se pueden utilizar en métodos de secuenciacion de ADN conn base con una variedad de métodos, incluyendo: • Métodos de "sanger" o "didesoxi", que implican la terminación de cadena de síntesis de ADN mediante la incorporación de 2',3'-didesoxinucleótidos (ddNTPs) utilizando polimerasa de ADN. Ver la Publicación de Metzker et al, 2005, la cual está incorporada a la presente invención como referencia .

Secuenciacion mediante síntesis (SBS), que normalmente no indica en forma clara las diferentes mecánicas de secuenciación de ADN. Consultar las Publicaciones de Metzker, 2010; Metzker 2005, las cuales están incorporadas a la presente invención como referencia.

• Estrategias que dependen de polimerasa de ADN, las cuales también se clasifican como terminación reversible cíclica (CRT), adición de nucleótido simple (SNA, por ejemplo, pirosecuenciación) y secuenciación de tiempo real. Consultar la Publicación de Metzker, 2010, la cual está incorporada a la presente invención como referencia.

· Secuenciación de moléculas simples utilizando el método de Secuenciación de Mella Aleatoria (RNS).

En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para secuenciar un ácido nucleico objetivo en donde los métodos comprenden los siguientes pasos: (i) adherir el extremo 5' del cebador a una superficie sólida ; (ii) hibridar un ácido nucleico objetivo al cebador adherido a la superficie sólida; (iii) agregar un compuesto de acuerdo con cualquiera de las estructuras aquí descritas, siempre y cuando esté presente más de un tipo de base, en donde cada base está adherida a un diferente grupo reportero. (iv) agregar una enzima de réplica de ácido nucleico al complejo de cebador hibridado/ácido nucleico objetivo para incorporar la composición del paso (iii) en la hebra de cebador de crecimiento, en donde la composición incorporada del paso (iii) termina la reacción de polimerasa con una eficiencia de entre aproximadamente 70% hasta aproximadamente 100%; (v) lavar la superficie sólida para eliminar los componentes no incorporados; (vi) detectar el grupo reportero incorporado para identificar la composición incorporada del paso (iii); (vii) agregar opcionalmente uno o más compuestos químicos para tapar permanentemente los cebadores no extendidos; (viii) eliminar la porción de terminación que comprende la descomposición fotoquímica de la porción de terminación, dando como resultado un cebador extendido, con bases de pirimidina de 5-hid roximetilo o 7-hidroximetil-7-deazapurina; (ix) lavar la superficie sólida para eliminar el grupo de terminación descompuesto; y (x) repetir los pasos (iii) a (viii) una o más veces para identificar la pluralidad de bases en el ácido nucleico objetivo.

En algunas variaciones, se invierte el orden de los pasos (iii) y (iv). En variaciones adicionales, la polimerasa y el compuesto se agregan al mismo tiempo. En modalidades, están en la misma solución.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para secuenciar un ácido nucleico objetivo que comprende los siguientes pasos: (i) adherir el extremo 5' del ácido nucleico objetivo a una superficie sólida; (ii) hibridar un cebador para el ácido nucleico objetivo adherido a la superficie sólida; (iii) agregar un compuesto de acuerdo con cualquiera de las estructuras aquí descritas, siempre y cuando esté presente más de un tipo de base, cada base se adhiere a un diferente grupo reportero; (iv) agregar una enzima de réplica de ácido nucleico al complejo de cebador hibridado/ácido nucleico objetivo para incorporar la composición del paso (iii) en la hebra de cebador de crecimiento, en donde la composición incorporada del paso (iii) termina la reacción de polimerasa con una eficiencia de entre aproximadamente 70% hasta aproximadamente 100%; (v) lavar la superficie sólida para eliminar los componentes incorporados; (vi) detectar el grupo reportero incorporado para identificar la composición incorporada del paso (iii); (vii) agregar opcionalmente uno o más compuestos químicos para tapar permanentemente cebadores no extendidos; (viii) eliminar la porción de terminación que comprende la descomposición fotoquímica de la porción de terminación, dando como resultado un cebador extendido con bases de pirimidina 5-hidroximetilo o 7-hidroximetil-7-deazapurina; (ix) lavar la superficie sólida para eliminar el grupo de terminación descompuesto; y (x) repetir los pasos (iii) al (ix) una o más veces para identificar la pluralidad de bases en el ácido nucleico objetivo.

En algunas variaciones, se invierte el orden de los pasos (iii) y (iv).

En algunas modalidades el compuesto se incorpora a una enzima que replica el ácido nucleico que es una polimerasa de ADN. En algunas modalidades la polimerasa de ADN se selecciona del grupo que consiste en polimerasa de ADN Taq, polimerasa de ADN Klenow(exo-) , polimerasa de ADN Bst, polimerasa de ADN VENT® (exo-) (polimerasa A de ADN clonada de Thermococcus litoralis que contiene las mutaciones D141A y E143A), polimerasa de ADN Pfu(exo-) y polimerasa de ADN DEEPVENT™ (exo-) (polimerasa A de ADN, clonada de la especie Pyrococcus GB-D, y que contiene las mutaciones D141A y E143A). En algunas modalidades la polimerasa de ADN se selecciona del grupo que consiste en polimerasa de ADN AMPLITAQ®, FS (polimerasa de ADN Taq que contiene las mutaciones G46D y F667Y), polimerasa de ADN THERMOSEQUENASE™ (polimerasa de ADN Taq que contiene la mutación F667Y), polimerasa de ADN THERMOSEQUENASE™ II (combinación de polimerasa de ADN THERMOSEQUENASE™ y pirofosfatasa de 7 acidophilum) , polimerasa de ADN THERMINATOR™ (polimerasa A de ADN, clonada de la especie Thermococcus 9°N-7 y que contiene mutaciones D141A, E143A y A485L), polimerasa de ADN THERMINATOR™ II (polimerasa de ADN THERMINATOR™ que contiene la mutación Y409V adicional), y polimerasa de ADN VENT® (exo-) A488L (polimerasa de ADN VENT® (exo-) que contiene la mutación A488L).

Los compuestos de la presente descripción se pueden elaborar utilizando los métodos indicados en la sección de Ejemplos. Estos métodos pueden ser modificados en forma adicional y optimizados utilizando los principios y técnicas de la química orgánica tal como lo aplica un experto en la técnica. Dichos principios y técnicas se enseñan por ejemplo en las Publicaciones de Wu et al. (2007; Litosh et al. (2011); Stupi et al. (2012); Gardner et al., 2012; Patentes Norteamericanas 7,897,737, 7,964,352 y 8,148,503; Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana 2011/0287427, las cuales están incorporadas a la presente invención como referencia.

En algunas modalidades, los componentes de muestra permiten la determinación de SNPs. El método puede ser para la identificación de alto rendimiento de los SNPs informativos. Los SNPs pueden obtenerse directamente del material de ADN genómico, del material amplificado PCR o del material ADN clonado y pueden ensayarse utilizando un método de extensión de cebador de nucleótido simple. El método de extensión de cebador de nucleótido simple puede comprender el uso de dNTPs no etiquetadas simples, dNTPs etiquetadas simples, 3'- O-modificadas con dNTPs simples, 2'-dNTPs modificadas con base simple, alfa-tio-dNTPs simples o 2',3'-dideoxinucleótidos marcados simples. El método de minisecuenciación puede comprender el uso de dNTPs no marcados simples, dNTPs no marcados simples, 3'-0-modificados con dNTPs simples, 2'-dNTPs modificados con bases simples, alfa-tio-dNTPs simples o 2',3'-dideoxinucleótidos marcados simples. Los SNPs pueden obtenerse directamente del material de ADN genómico, el material amplificado mediante PCR o de materiales de ADN clonados.

A. Compuestos de Nucleótido y Nucleósido y Su Uso en CRT En algunos aspectos de la presente invención, los compuestos de nucleótido y nucleósido aquí proporcionados (terminadores reversibles) se pueden utilizar en tecnología de secuenciación de ADN basada en terminación reversible cíclica (CRT). CRT es un método cíclico para detectar las adiciones de base simple, sincrónicas de plantillas múltiples. El método se diferencia en si mismo del método de Sanger (Metzker, 2005, la cual está incorporada a la presente invención como referencia) en que puede llevarse a cabo sin la necesidad de electroforesis de gel, un cuello de botella importante en el avance de este campo. Sin embargo igual que la secuenciación de Sanger, las longitudes de lectura más largas se traducen en menos ensayos de secuenciación necesarios para cubrir todo el genoma. El ciclo CRT normalmente comprende tres pasos, incorporación, generación de imágenes y desprotección. El término "desprotección" se puede utilizar en forma sinónima con "disociación", de modo que los tres pasos pueden ser descritos como incorporación, generación de imágenes y descomposición. Para este procedimiento, la eficiencia del ciclo, el tiempo del ciclo y la sensibilidad son factores importantes. La eficiencia del ciclo es el producto de las eficiencias de desprotección e incorporación, y determina la longitud de lectura CRT. El tiempo de ciclo CRT es la suma de la incorporación, generación de imágenes y tiempo de desprotección. Para CRT rápido para secuenciación de todo el genoma, se pueden utilizar compuestos de nucleótido y nucleósido tal como los aquí descritos, los cuales presentan propiedades de desprotección rápidas y eficientes. Estos compuestos se pueden etiquetar con grupos reporteros tales como tintas fluorescentes, adheridos directamente al grupo bencilo que tiene una sustitución de azido en el alfa carbono, proporcionaron, por ejemplo, terminadores reversibles, fluorescentes con propiedades de desprotección similares. Ha permanecido difícil de lograr la meta de lecturas CRT largas, debido a que los terminadores reversibles normalmente actúan como substratos deficientes con polimerasas ADN comercialmente disponibles. Los análogos de nucleótido modificado de la presente invención se pueden utilizar para mejorar esta tecnología, proporcionando sustratos que se incorporan igual de bien o mejor que un nucleótido natural con polimerasas ADN comercialmente disponibles.

Los grupos que se pueden fotodescomponer se adhieren a la base de un nucleótido 3'-OH desbloqueado, tal como los grupos aquí descritos, pueden actuar como un terminador reversible efectivo y pueden ser incorporados eficientemente mediante polimerasas de ADN tipo natural. Consultar las Publicaciones de Wu et al., 2007; Metzker, 2010; Litosh et al., 2011; Gardner et al., 2012; Patentes Norteamericanas 7,897,737, 7,964,352 y 8,148,503; Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana 2011/0287427, las cuales están incorporadas a la presente invención como referencia. Por ejemplo, se encuentra 5-hidroximetil-2'-deoxiuridina (HOMedU) naturalmente en los genomas de numerosos bacteriófagos y eucariotos inferiores (Gommers-Ampt, 1995, la cual está incorporada a la presente invención como referencia). Su grupo hidroximetilo puede servir como una manija molecular para adherir un pequeño grupo de terminación que se puede fotodescomponer. Otras bases hipermodificadas de origen natural que se pueden modificar en forma adicional en la forma aquí descrita, para funcionar como terminadores reversibles, incluyen 5-hidroximetil-2'-deoxicitidina (HOMedC), el cual se encuentra naturalmente en los genomas de bacteriófagos 12, T4 y T6 (Wyatt & Cohén, 1953; Gommers-Ampt, 1995) y de mamíferos (Kriaucionis & Heintz, 2009; Tahiliani et al., 2009; Ito et al., 2010). La estructura de anillo de pirrolopirimidina (7-deazapurina) también es de origen natural en antibióticos de nucleósido (Carrasco & Vázquez, 1984, la cual está incorporada a la presente invención como referencia) y bases de tARN (Limbach, et al., 1994, la cual está incorporada a la presente invención como referencia), y los compuestos 7-deaza-7-hidroximetil-2'-deoxiadenosina (C7-HOMedA) (Rockhill er al., 1997) y 7-deaza-7-hidroximetil-2'-deoxiguanos¡na (C7-HOMedG) (McDougall et al., 2001) también pueden modificarse en forma adicional en la forma aquí descrita para funcionar como terminadores reversibles.

En algunas modalidades aquí descritas, el grupo que se puede fotodescomponer es un nucleótido de 2-nitrobencilo sustituido, el cual puede ser descompuesto fotoquímicamente en forma eficiente, por ejemplo, con 365 nm de luz UV. Consultar la Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana 2010/0041041, la cual está incorporada a la presente invención como referencia. Generalmente queda entendido que las longitudes de onda >300 nm son utilizadas para minimizar el daño al ADN y proteínas (Corrie, 2005) con diversas longitudes de onda específicas además de 365 nm, siendo 340 nm (Kaplan et al., 1978) y 355 nm (Seo, 2005).

En algunas modalidades, los terminadores reversibles 3'-OH desbloqueados aquí descritos normalmente tienen diversas ventajas, incluyendo por ejemplo, la fotodescomposición de únicamente un solo enlace, elimina los grupos tanto de terminación como fluoroforo de la nucleobase. Esto a su vez se puede utilizar para restaurar en forma más eficiente el nucleótido para un ciclo CRT subsecuente. Una segunda ventaja de los terminadores reversibles 3'-OH desbloqueados aquí proporcionados, es que muchos de estos compuestos muestran una incorporación enzimática más favorable, y en algunas modalidades, se pueden incorporar en forma tan fácil como un nucleótido natural con polimerasas ADN tipo silvestre.

Un reto para los terminadores 3'-OH desbloqueados, es crear las modificaciones adecuadas a la base que conduzcan a la terminación de la síntesis de ADN después de adición de base simple. Esto normalmente es importante debido a que un grupo 3'-OH desbloqueado es el sustrato natural para incorporar el siguiente nucleótido de entrada. Los compuestos aquí descritos abordan este reto. Por ejemplo, en algunas modalidades, existen los terminadores reversibles aquí proporcionados que conducen a la terminación de síntesis de ADN después de adición de base simple.

En algunas modalidades, los compuestos aquí descritos se pueden utilizar en CRT para leer directamente del ADN genómico. El ADN genómico fragmentado se puede hibridar para un chip de oligonucleótido de alta densidad que contiene sitios de cebador que abarcan los cromosomas seleccionados. Cada secuencia de cebador está separada por la longitud de lectura estimada del método CRT. Entre las adiciones base, un generador de imágenes fluorescentes puede generar imágenes en forma simultánea de todo el chip de alta densidad, marcando mejorías significativas en velocidad y sensibilidad. En modalidades específicas, un fluoroforo, el cual se adhiere al grupo bencilo que tiene una sustitución azido en el alfa carbono o sus derivados aquí descritos, se elimina a través de una reacción enzimática o química específica liberando el grupo bencilo para la siguiente vuelta de la adición base. En otras modalidades específicas, un fluoroforo, el cual se adhiere al grupo bencilo que tiene una sustitución de amida en el alfa carbono o sus derivados aquí descritos, se elimina a través de una reacción enzimática o química específica que libera el grupo bencilo para la siguiente vuelta de la adición base. Después de aproximadamente 500 ciclos CRT, la información de secuencia del genoma completa y contigua se puede comparar con el genoma humano de referencia para determinar el grado y tipo de variación de secuencia en una muestra individual. Los terminadores reversibles que presentan mayor incorporación y eficiencia de desprotección normalmente lograrán mayores eficiencias de ciclo, y por lo tanto mayores longitudes de lectura.

La eficiencia CRT se define a través de la fórmula: (RL)Ce// = 0.5, en donde RL es la longitud de lectura en bases y Ceff es la eficiencia de ciclo general. En otras palabras, la longitud de lectura de 7 bases se puede lograr con una eficiencia de ciclo general del 90%, 70 bases se pueden lograr con una eficiencia del ciclo del 99% y 700 bases con una eficiencia del ciclo del 99.9%. La eficiencia de incorporación de los compuestos de acuerdo con la presente invención puede fluctuar de aproximadamente 70% hasta aproximadamente 100% de la incorporación del nucleósido nativo análogo. Preferentemente, la eficiencia de incorporación fluctuará desde aproximadamente 85% hasta aproximadamente 100%. Las eficiencias de disociación fotoquímica fluctuarán preferentemente desde aproximadamente 85% hasta aproximadamente 100%. Además, la terminación de la extensión de ácido nucleico fluctuará desde aproximadamente 90% hasta aproximadamente 100% al momento de la incorporación de los compuestos de acuerdo con la presente invención. Los compuestos de nucleótido y nucleósido en una modalidad tiene una eficiencia de ciclo de al menos el 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% o 99.9%.

Otro aspecto de la presente invención se dirige hacia el uso de pirosecuenciación, el cual es un método no electroforético, de bioluminiscencia que mide la liberación de pirofosfato inorgánico (PPi), convirtiéndolo proporcionalmente en luz visible a través de una serie de reacciones enzimáticas (Ronaghi ef al., 1998, la cual está incorporada a la presente invención como referencia). A diferencia de otros métodos de secuenciación que utilizan nucleótidos modificados para terminar la síntesis de ADN, el ensayo de pirosecuenciación manipula la polimerasa de ADN a través de una sola adición de un dNTP en cantidades limitantes. Posteriormente la polimerasa de ADN se extiende al cebador al momento de la incorporación del dNTP y pausas complementarias. La síntesis de ADN se reinicia después de la adición del siguiente dNTP complementario en el ciclo de suministro. El orden e intensidad de los picos de luz se registran en diagramas de flujo, que revelan la secuencia de ADN subyacente. Para repeticiones de homopolímero de hasta seis nucleótidos, el número de dNTPs agregados es directamente proporcional a la señal de luz. Las repeticiones de homopolímeros mayores a seis nucleótidos pueden dar como resultado errores de inserción, los cuales son el tipo de error más común en la pirosecuenciación. Los análogos de nucleótido modificados de la presente invención pueden mejorar esta tecnología mediante secuenciación precisa a través de repeticiones de homopolímero. Particularmente las que son mayores a seis nucleótidos de longitud.

Otro aspecto de la presente invención se dirige al uso de secuenciación de Sanger, por ejemplo, tal como se aplica a la detección de heterocigoto. A pesar del gran avance, se necesitan mejorías en la química de secuenciación de terminador dideoxi-BigDye para detección precisa de heterocigoto. Generalmente se considera que una distribución de altura pico uniforme en los datos primarios hace más confiable y precisa la detección de heterocigoto y de base calling. El patrón de terminación en secuenciación Sanger se debe principalmente a la incorporación de tendencia dependiente de la secuencia mediante polimerasa de ADN, la cual puede incorporar selectivamente nucleótidos naturales en nucleótidos modificados (Metzker et al., 1998, la cual está incorporada a la presente invención como referencia). Estos ejemplos de incorporación de tendencia son más pronunciados con la química de terminador-tinta que con la química de cebador-tinta. Esto se puede atribuir a los efectos de las grandes estructuras de tinta fluorescentes adheridas al nucleótido de terminación, que disminuyen la actividad enzimática en al menos 10 veces en comparación con la del substrato natural. Por lo tanto, la reducción de los efectos de incorporación de tendencia mediante polimerasa de ADN hacia los terminadores marcados con tinta, puede conducir a una detección mejorada de heterocigoto. Los análogos de nucleótido modificados de la presente invención pueden mejorar esta tecnología mediante incorporación tan bien o mejor que un nucleótido natural, eliminando de esta forma las tendencias de incorporación en la secuenciación de Sanger.

Otro aspecto de la presente invención se dirige hacia el uso de plantillas amplificadas en forma clonal y plantillas de molécula de ADN simples. El extremo frontal de las tecnologías NGS se puede dividir en dos campos: plantillas amplificadas en forma clonal de moléculas de ADN simples y plantillas de molécula de ADN simples. Es bien reconocido en la técnica que el ADN se puede inmovilizar a una superficie sólida ya sea adhiriendo un cebador a la superficie e hibridando un ácido nucleico objetivo a dicho cebador (Patente Norteamericana 5,770,367; Harris et al., 2008, las cuales están incorporadas a la presente invención como referencia) o adhiriendo un ácido nucleico objetivo a la superficie mediante amplificación clonal e hibridando un cebador para el ácido nucleico objetivo (Dressman et al., 2003; Margulies et al., 2005, las cuales están incorporadas a la presente invención como referencia). Se puede utilizar cualquier configuración de inmovilización en la presente invención para enlazar posteriormente una polimerasa de ADN para iniciar ya sea el método CRT o el método de pirosecuenciacion.

En un aspecto, la presente invención se dirige al uso de moléculas de plantilla simple, que consiste en fragmentos de ADN grandes (por ejemplo, 0.1 a 0.5 megabases). En algunas modalidades, se puede utilizar una estrategia libre de adaptador, llamada Secuenciación de Mella Aleatoria (RNS). Tiene diversas ventajas incluyendo (a) el no requerimiento de PCR o ligadura de adaptador, (b) secuenciación redundante de la misma plantilla para mejorar la precisión, y (c) sitios de reacción de secuenciación visible a través de la plantilla de molécula simple que proporcionan ensambles de novo localizados. Por ejemplo, el proceso PCR crea mutaciones en las plantillas amplificadas en forma clonal que se enmascaran como variantes de secuencia. Las secuencias objetivo con alto contenido de AT y alto contenido de GC también muestran tendencia de amplificación en el rendimiento del producto, dando resultado su subrepresentación en alineaciones y ensambles de genoma. El conocer la posición de las reacciones de secuenciación de una plantilla de molécula simple determinada, simplificará la asignación de posicionamiento y la organización del complejo genómico y regiones estructurales en el ensamble de los genomas.

En el método RNS, las nucleasas no específicas de azúcar, tal como las aisladas de Vibrio vulnificus {vvn), crean mellas de hebra simple aleatorias en dsADN y digieren tanto ssADN como ARN (Consultar Hsia et al., 2005). El enlace Vvn ocurre en la ranura menor del ADN, evitando el reconocimiento de nucleobases dependiente de la secuencia. Esto representa una ventaja en la generación de mellas a lo largo de la molécula ADN en una forma aleatoria sin tendencia dependiente de la secuencia. La hebra de corriente ascendente de la mella se vuelve un sitio de cebador para que la polimerasa comience la reacción RNS. Para que este método trabaje en algunas modalidades, la polimerasa debe tener la capacidad de desplazar la hebra de corriente descendente mientras se extiende la hebra de corriente ascendente. Diversas polimerasas de ADN bien conocidas que poseen esta propiedad incluyen polimerasas f29 (Consultar la Publicación de Soengas et al., 1995, la cual está incorporada a la presente invención como referencia) y Bst (Consultar la Publicación de Aliotta et al., 1996, la cual está incorporada a la presente invención como referencia). Las polimerasas Vent(exo-) (consultar la Publicación de Gardner et al., 1999, la cual está incorporada a la presente invención como referencia) y Therminator™ también muestran propiedades de desplazamiento de hebra, a pesar de que pueden limitarse a 50 bases antes de detenerse. Después de la descomposición UV, se crean nucleótidos de hidroximetilo que sirven como excelentes bases de plantilla para vueltas subsecuentes de RNS (figura 13). El desplazamiento de hebra durante RNS crea una estructura de dsADN bifurcada (aleta) similar a la creada con el ensayo Invader (Consultar la Publicación Lyamichev et al., 1999). Las endonucleasas de Aleta (FEN1) son conocidas por descomponer estas estructuras bifurcadas tal como se muestra en la figura 13, generando una hebra de extremo 5'-P04 de corriente descendente sin una brecha de nucleótido (Kaiser et al., 1999). Esto crea un substrato que se puede ligar para reparar la molécula de dsADN para vueltas subsecuentes de RNS.

B. Ensayos de Polimerasa Otro aspecto de la presente invención se dirige al uso de ensayos de polimerasa. Se probaron nucleótidos naturales y modificados para incorporación de eficiencia utilizando el "ensayo de punto extremo de polimerasa" (Wu et al., 2001, la cual está incorporada a la presente invención como referencia). Este ensayo revisa la eficiencia de incorporación en bases de plantillas acopladas y desacopladas. La eficiencia de incorporación se mide determinando la concentración en la cual el compuesto incorpora la mitad de los complejos de cebador-plantilla (IC5o). Las titulaciones de la concentración de compuesto en incremento se llevaron a cabo para generar curvas, de las cuales se puede determinar el IC50.

La secuencia de la plantilla de ADN se selecciona dependiendo de que compuesto será probado. Por ejemplo, la primera base de interrogación después del cebador en la secuencia de plantilla es la base de complemento del compuesto cuando se mide la eficiencia de incorporación, y una de tres bases desacopladas cuando se miden las propiedades de discriminación de desacoplamiento.

Para la reacción endurecida, una polimerasa de ADN (por ejemplo, polimerasa de ADN THERMINATOR™ , 0.25 unidades por reacción, New England Biolabs), Amortiguador Thermopol 1x y una concentración conocida ya sea de nucleótido natural o modificado, se agregan a cada 10 L de reacción y se incuban a una temperatura de 75°C durante 10 minutos, se enfrían en hielo, y se extinguen con 10 µ? de la solución de detención (98% de formamida: 10 mM Na2EDTA, pH = 8.0, 25 mg/ml Blue Dextran). Las reacciones detenidas se calientan a una temperatura de 75°C durante 30 segundos para desnaturalizar el ADN, y posteriormente se colocan en hielo. Los productos de extensión se analizan en un gel de poliacrilamida Long Ranger (Lonza) al 10%, utilizando un secuenciador de ADN modelo 377 ABI. Se proporcionan detalles adicionales en el Ejemplo 1 que se encuentra más adelante.

C. Discriminación y Terminación de Desacoplamiento Otro aspecto de la presente invención se dirige a la discriminación incrementada contra incorporación de desacoplamiento, por ejemplo, a través del uso de los terminadores reversibles aquí descritos. Se ha reportado que la sustitución en el a-carbono del grupo 2-nitrobencilo puede incrementar el rango de reacción de descomposición (Reichmanis et al., 1985; Cameron and Frechet, 1991; Hasan et al., 1997, las cuales están incorporadas a la presente invención como referencia). Sin pretender limitarse a teoría alguna, los resultados aquí presentados sugieren que la sustitución en el a-carbono del grupo 2-nitrobencilo también puede afectar la terminación de la síntesis de ADN de los trifosfatos de nucleótido 3'-OH desbloqueados y mejorar la discriminación contra incorporación de desacoplamiento. Además, y con base en los resultados descritos con mayor detalle más adelante, se descubrió que la estereoquímica de la sustitución del a-carbono del grupo 2-nitrobencilo puede tener un impacto significativo en el grado de discriminación de desacoplamiento y el rango de la reacción de descomposición. Sin pretender limitarse a la teoría, se encontraron al menos dos factores que tienen influencia normalmente en la terminación de la síntesis de UV después de una sola incorporación: a) sustitución en el a-carbono del grupo 2-nitrobencilo, y b) sustitución en la posición 2 del anillo de bencilo.

D. Rangos de Descomposición UV Otro aspecto de la presente invención se dirige hacia proporcionar terminadores reversibles con rangos de descomposición UV mejorados. La descomposición del grupo 2-nitrobencilo sustituido por terminación cuando se incorporaron los análogos en la hebra de cebador con 365 nm de luz UV, permite que se reanude el siguiente ciclo de incorporación. Sin pretender limitarse a la teoría, se encontraron al menos dos factores que normalmente influencian los rangos de descomposición UV de los análogos de nucleótido incorporados: a) estereoquímica de la sustitución del a-carbono del grupo 2-nitrobencilo, y b) sustitución en el anillo de bencilo.

E. Tecnologías de secuenciación de siguiente generación (NGS) Otro aspecto de la presente invención se dirige a la aplicación de terminadores reversibles y métodos aquí proporcionados a los métodos de secuenciación de siguiente generación. Las tecnologías de secuenciación incluyen un número de métodos que se agrupan en forma tan amplia como (a) preparación de plantilla, (b) secuenciación y generación de imágenes y (c) análisis de datos. La combinación única de protocolos específicos distingue una tecnología de otra y determina el tipo de datos producidos de cada plataforma. Estas diferencias en la producción de datos presentan retos cuando se comparan plataformas con base en calidad de datos y costos. Aunque las calificaciones de calidad y los estimados de precisión son proporcionados por cada fabricante, no existe consenso de que una "base de calidad" de una plataforma, sea equivalente a la de otra plataforma. Los compuestos y métodos aquí descritos se pueden utilizar en combinación con y/o aplicarse a uno o más formatos de la plantilla que se describen más adelante.

Los métodos utilizados para preparar plantillas para reacciones de NGS incluyen: plantillas amplificadas en forma clonal que se originan de las moléculas de ADN simple, y plantillas de molécula ADN simple. Los métodos de secuenciación que utilizan polimerasas de ADN se clasifican como terminación reversible cíclica (CRT), adición de nucleótido simple (SNA) y secuenciación de tiempo real. La secuenciación mediante ligadura (SBL), un método en el cual se reemplaza la polimerasa de ADN por ligasa de ADN, también ha sido utilizada en las tecnologías NGS. Ver por ejemplo las Publicaciones de Shendure et al., 2005 y Valouev et al., 2008, las cuales están' incorporadas a la presente invención como referencia. Los métodos de generación de imágenes acoplados con estas estrategias de secuenciación, fluctúan desde medir las señales bioluminiscentes hasta imágenes de cuatro colores de eventos moleculares simples. En algunas modalidades, dichos métodos combinados se combinan en forma adicional con sistemas de tecnología de información adecuadas con la capacidad de manejar los datos voluminosos producidos por las plataformas NGS, incluyendo aspectos relacionados con almacenamiento de datos, rastreo y control de calidad. Consultar la Publicación de Pop & Salzberg, 2008, la cual está incorporada a la presente invención como referencia, a) Preparación de Plantilla En algunas modalidades, la presente invención se dirige a aplicar y/o combinar los terminadores reversibles y métodos de secuenciación con una o más plantillas o métodos de preparación de plantilla. Por ejemplo, en algunas modalidades, se utilizan métodos de preparación de plantilla robustos. Éstos producen fuentes sin tendencia, representativas de material de ácido nucleico del genoma bajo investigación. En algunas modalidades, el método implica romper en forma aleatoria el ADN genómico en tamaños menores de los cuales se crea ya sea plantillas de fragmento o plantillas de pares correspondientes. En algunas modalidades, por ejemplo los asociados con tecnologías NGS, la plantilla se adhiere o inmoviliza a una superficie o soporte sólido. La inmovilización de los sitios de plantilla separados en forma espacial se puede utilizar para permitir que se lleven a cabo en forma simultánea de miles a billones de reacciones de secuenciación .

Plantillas amplificadas en forma clona!. En algunas modalidades, la presente invención comprende el uso de plantillas amplificadas en forma clonal o métodos de preparación de plantillas amplificadas en forma clonal. Por ejemplo, dichas plantillas se pueden utilizar con sistemas de generación de imágenes que no han sido diseñadas para detectar eventos fluorescentes simples. Por ejemplo, dos métodos de amplificación comunes son PCR de emulsión (también llamada emPCR) y amplificación de fase sólida. Consultar las Publicaciones de Dressman et al., 2003 and Fedurco et al., 2006, las cuales ambas están incorporadas a la presente invención como referencia. En algunas modalidades, se puede utilizar emPCR para preparar plantillas de secuenciación en un sistema libre de células, el cual tiene la ventaja de evitar la pérdida arbitraria de secuencias genómicas - un problema que normalmente es inherente en métodos de clonación bacteriana. En algunas modalidades, se crea una biblioteca de objetivos de fragmento o pares correspondientes, y se ligan los adaptadores que contienen sitios de cebador universales a los extremos objetivo, permitiendo que se amplifiquen genomas complejos con cebadores PCR comunes. Por ejemplo, después de la ligadura, el ADN se separa en hebras simples y se captura en gránulos bajo condiciones que favorecen una molécula de ADN por granulo. Consultar la Publicación de Metzker 2010, figura 1a, la cual está incorporada a la presente invención como referencia. Por ejemplo, después de la amplificación exitosa y enriquecimiento de los gránulos emPCR, se pueden inmovilizar millones en gel de poliacrilamida en una corredera de microscopio estándar (utilizada con un instrumento Polonator, consultar la Publicación de Shendure et al., 2005, la cual está incorporada a la presente invención como referencia), reticularse químicamente para una superficie de vidrio recubierta con amino (utilizada con los instrumentos Life/APG SOLiD y Polonator; por ejemplo consultar la Publicación de Kim et al., 2007, la cual está incorporada a la presente invención como referencia) o depositados ya sea en depósitos PicoTiterPlate (PTP) individuales (utilizados con el instrumento Roche/454; Margulies et al., 2005, la cual está incorporada a la presente invención como referencia) o depósito lonChip (utilizado con el instrumento Ion Torrent; Romberg et al., 2011, la cual está incorporada a la presente invención como referencia) en donde se puede llevar a cabo la química NGS. En algunas modalidades, la amplificación de fase sólida puede utilizarse para producir grupos clonalmente amplificados, distribuidos en forma aleatoria de plantillas de fragmento o de pares correspondientes en una corredera de vidrio. Consultar la Publicación de Metzker 2010, figura 1b, la cual está incorporada a la presente invención como referencia. En algunas modalidades, los cebadores directos e inversos de alta densidad se adhieren en forma covalente a la corredera, y la proporción de los cebadores a la plantilla en el soporte define la densidad de superficie de los grupos amplificados. En algunas modalidades, se puede utilizar la amplificación de fase sólida para producir de 100 a 200 millones de grupos de plantilla separados en forma espacial (lllumina/Solexa), que proporcionan extremos libres en los cuales se puede hibridar un cebador de secuenciación universal para iniciar la reacción NGS. Consultar la Publicación de Bentley et al., 2008, la cual está incorporada a la presente invención como referencia.

Plantillas de moléculas simples. En algunas modalidades, la presente invención comprende el uso de plantillas de molécula simple o métodos de preparación de plantilla de molécula simple. Aunque los métodos clonalmente amplificados ofrecen ciertas ventajas con respecto a la clonación bacteriana, algunos de los protocolos son complicados de implementar y requiere una gran cantidad de material de ADN genómico (3 a 20 g). La preparación de las plantillas de molécula simple normalmente es más sencilla y requiere menos material de partida (<1 pg). En algunas modalidades, estos métodos no requieren PCR, lo cual normalmente crea mutaciones en plantillas amplificadas clonalmente que se enmascaran como variantes de secuencia. Las secuencias objetivo con alto contenido de AT y alto contenido de GC también pueden mostrar tendencia de amplificación en el rendimiento del producto, lo cual da como resultado su subrepresentación en alineaciones y ensambles de genoma. En algunas modalidades, se pueden utilizar aplicaciones cuantitativas, tal como ARN-secuencia. Consultar la Publicación de Wang et al., 2009, la cual está incorporada a la presente invención como referencia. Dichas aplicaciones normalmente se desempeñan en forma más efectiva con fuentes de plantilla no amplificadas, que no alteran la abundancia de representación de las moléculas mARN. En algunas modalidades, y antes de que se lleve a cabo la reacción NGS, las plantillas de molécula simples normalmente se inmovilizan en soportes sólidos utilizando uno de al menos tres métodos diferentes. En el primer método, el cual se puede utilizar en algunas modalidades, las moléculas de cebador individual distribuidas en forma espacial se adhieren covalentemente al soporte sólido (Consultar la Publicación de Harris et al., 2008). La plantilla, la cual se puede preparar, por ejemplo, mediante fragmentación aleatoria del material de partida en tamaños pequeños (por ejemplo, ~200-250 pb) y agregando adaptadores comunes a los extremos de fragmento, posteriormente se híbrida al cebador inmovilizado. Consultar la Publicación de Metzker 2010, figura 1c, la cual está incorporada a la presente invención como referencia. En un segundo método, el cual se puede utilizar en algunas modalidades, las plantillas de molécula simple espacialmente distribuidas son adheridas covalentemente al soporte sólido (Consultar la Publicación Harris et al., 2008) imprimando y extendiendo las plantillas de molécula simple, de hebra simple a partir de cebadores inmovilizados. Consultar la Publicación de Metzker 2010, figura 1c, la cual está incorporada a la presente invención como referencia. En algunas modalidades, posteriormente se híbrida un cebador común para la plantilla. Consultar la Publicación de Metzker 2010, figura 1d, la cual está incorporada a la presente invención como referencia. En cualquier método, se puede utilizar la polimerasa de ADN, por ejemplo, para enlazar a la configuración de plantilla imprimada inmovilizada para iniciar la reacción NGS. En un tercer método, el cual se puede utilizar en algunas modalidades, se adhieren las moléculas de polimerasa simple distribuidas espacialmente al soporte sólido (consultar Publicación Eid et al., 2009, la cual está incorporada a la presente invención como referencia), a la cual se enlazó una molécula de plantilla imprimida (consultar Publicación Metzker 2010, figura 1e, la cual está incorporada a la presente invención como referencia). En general, consultar las Patentes Norteamericanas 7,329,492 y 6,255,083, las cuales están incorporadas a la presente invención como referencia. Las moléculas de ADN más grandes (hasta diez mil pares base) se pueden utilizar con esta técnica, por ejemplo, y a diferencia de los primeros dos métodos, el tercer método se puede utilizar con métodos de tiempo real, dando como resultado longitudes de lectura potencialmente más largas, b) Secuenciación y generación de imágenes Existen diferencias fundamentales en la secuenciación de plantillas de molécula simple y amplificadas clonalmente. La amplificación clonal se puede utilizar en algunas modalidades para producir poblaciones de plantillas idénticas, cada una de las cuales ha pasado por la reacción de secuenciación. Al momento de generar imágenes, la señal observada es un consenso de los nucleótidos o sondas agregadas a las plantillas idénticas para un ciclo determinado. Normalmente, esto impone una mayor demanda en la eficiencia del proceso de adición, ya que la extensión incompleta del ensamble de plantilla da como resultado un desfase de hebra rezagado (también llamado desfase tipo 2). La adición de múltiples nucleótidos o sondas también puede ocurrir en un ciclo determinado, dando como resultado un desfase de hebra principal (también llamado desfase tipo 1). El concepto de desfase fue descrito por Cheeseman (Consultar Patente Norteamericana 5,302,509, la cual está incorporada a la presente invención como referencia).

El desfase de señal incrementa el ruido de fluorescencia, originando errores de denominación de base y lecturas más cortas (Consultar Publicación Erlich et al., 2008). Debido a que el desfase no es un aspecto con plantillas de molécula simple, se relaja el requerimiento de eficiencia de ciclo. Sin embargo, las moléculas simples son susceptibles a múltiples adiciones de nucleótido y sonda en cualquier ciclo determinado. Aquí, se puede observar que surgen errores de eliminación, en algunas modalidades, debido a los efectos de extinción entre las moléculas de tinta adyacentes y no se detecta la señal debido a la incorporación de los nucleótidos o sondas oscuros. En las siguientes secciones, se describen estrategias de secuenciación y generación de imágenes que utilizan plantillas tanto de molécula simple como amplificadas clonalmente. En algunos aspectos de la presente invención, los terminadores reversibles del método de uso aquí proporcionado, pueden ser aplicados y/o utilizados en combinación con cualquiera de una o más estrategias dependientes de polimerasa ADN, incluyendo, por ejemplo, CRT, SNA y secuenciación de tiempo real. En algunas modalidades, los compuestos de la presente invención y su método de uso se pueden aplicar y/o utilizar en combinación con el método CRT.

Existen diversos sistemas NGS comercialmente disponibles que generan imágenes de señales fluorescentes para moléculas de ADN simples (Consultar las Publicaciones de Harris et al., 2008; Eid et al., 2009, ambas de las cuales están incorporadas a la presente invención como referencia). El resolver moléculas simples en la formación se puede llevar a cabo en una magnificación de 100x con una cámara CCD de alta sensibilidad, siempre que las moléculas de ADN individuales estén separadas por una distancia que se aproxime al limite de difracción de luz (es decir, 250 nm). Pueden ocurrir variaciones que pueden depender de la magnificación u horizontalidad de la superficie, lo cual debe ser obvio para un experto en la técnica. Una técnica que es ampliamente utilizada para detección de señales fluorescentes de moléculas simples, es microscopio de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF). (Consultar la Publicación de Axelrod, 1989, la cual está incorporada a la presente invención como referencia). Otras técnicas que se pueden utilizar en la presente invención son conocidas en la técnica incluyen pero no se limitan a, microscopio óptico de exploración de campo cercano (SNOM; Consultar Moyer et al., 1993, la cual está incorporada a la presente invención como referencia).

F. Sistema de Generación de Imágenes La figura 8 ilustra una modalidad de un sistema de generación de imágenes 100 para generar imágenes de señales fluorescentes derivadas de una plantilla amplificada clonalmente. El sistema 100 está configurado para generar imágenes de una célula de flujo microfluida 50 que ha sido preparada con gránulos de mieras que comprenden el ADN de interés .

Se puede utilizar un rango de tecnologías de generación de imágenes, tal como generación de imágenes estándar de cuatro colores o excitación de línea múltiple de pulsación de color ciego, en diversas modalidades en combinación con los terminadores reversibles 3'-OH desbloqueados. La modalidad ilustrada está configurada para generación imágenes estándar de cuatro colores.

El sistema 100 comprende un dispositivo de generación de imágenes 10 (por ejemplo, una cámara digital, fotocelda, etc.) configurado para capturar señales fluorescentes derivadas de gránulos de plantilla amplificados con emPCR inmovilizados en célula de flujo microfluida 50.

La lámpara 14 (por ejemplo, una lámpara xenón) crea una trayectoria de luz 30 entre la célula de flujo microfluida 50 y el dispositivo de generación de imágenes 10. La luz de la lámpara 14 viaja a la rueda de filtro 16. En la modalidad ilustrada, la rueda de filtro 16 es motorizada y comprende cuatro filtros de espectro de modo que se pueden capturar imágenes de cuatro colores. La rueda del filtro 16 está configurada para cambiar entre cada uno de los cuatro filtros de espectro en cada posición de mosaico de modo que el dispositivo de generación de imágenes 10 pueda capturar imágenes de cuatro colores de los terminadores reversibles 3'-OH desbloqueados incorporados.

Una parte de la luz de la lámpara 14 viaja desde la rueda del filtro 16 a través de la lente objetivo 18 a la célula de flujo microfluida 50. Otra parte de la luz de la lámpara 14 viaja desde la rueda de filtro 16 hasta el dispositivo de generación de imágenes 10. En la modalidad ilustrada, la trayectoria de luz 30 se dirige al dispositivo de generación de imágenes 10 utilizando el espejo 12. En otras modalidades, pueden no ser necesarios dichos espejos, en tanto que en otras modalidades, se pueden requerir dos o más espejos.

El sistema 100 también comprende una fuente de luz ultravioleta (UV) 20 configurada para proporcionar luz UV a la célula de flujo 50. Una fuente de luz UV 20 puede ser un diodo de emisión de luz (LED) en algunas modalidades, o puede ser cualquier otra fuente de luz UV.

G. Minimizando Contaminación por Ozono En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos de secuencias que minimizan los efectos de la contaminación por ozono. El ozono (03) es un alótropo de oxígeno que tiene atributos tanto benéficos como perjudiciales para la vida en la tierra. Por ejemplo, se crea ozono en la estratosfera mediante radiación de alta energía procedente del sol que divide el oxígeno molecular (02) en dos átomos, los cuales posteriormente se combinan con diferentes moléculas de 02 para formar 03. Esta capa estratosférica protege los organismos vivos en el planeta de la radiación ultravioleta peligrosa producida por el sol. En el nivel de tierra o troposfera, sin embargo, el ozono es considerado como un contaminante ambiental. El ozono también es creado bajo condiciones de smog en donde la luz solar actúa en la combinación de óxidos de nitrógeno y compuestos orgánicos volátiles que son producidos por instalaciones industriales, utilidades eléctricas, escapes de vehículos motorizados, vapores de gasolina y solventes químicos (Consultar Publicación EPA, 2011). Los niveles de ozono incrementan durante los meses calurosos del verano, y los efectos del ozono incrementan el daño con los niveles de humedad relativa en incremento. El ozono troposférico origina diversos daños a los cultivos y bosques (Consultar Publicación de Hewitt et al., 1990), numerosos problemas respiratorios en animales y humanos (Consultar Publicación Fairchild et al., 1959; Bhalla, 1994), así como efectos adversos con muchos productos del consumidor incluyendo llantas de automóviles (Consultar Publicación Crabtree and emp, 1946), tintas encontradas en materiales textiles (Consultar Publicación de Salvin and Waiker, 1955), así como tintas fluorescentes utilizadas en biología molecular.

Desde una perspectiva química, el ozono es un agente electrofílico que es mayormente reactivo con pares de electrones comúnmente encontrados en compuestos olefínicos (por ejemplo, químicos que contienen enlaces dobles de carbono-carbono). Ha habido extensa investigación dedicada a la química del ozono, la cual es llamada ozonización. Una extensa serie de libros de dos volúmenes proporciona una revisión integral que describe las propiedades del ozono y las numerosas reacciones por las que puede pasar con sustratos orgánicos. El volumen 1 de esta serie está dedicada en su mayoría exclusivamente a la reacción del ozono con compuestos olefínicos (Consultar la Publicación de Bailey, 1978; Bailey 1982), para lo cual los Volúmenes 1 y 2 están incorporados como referencia.

Las tintas e intermediarios de tintas son bien conocidos en la literatura, y la mayoría de los tipos de tintas utilizados actualmente han sido descubiertos hace más de un siglo (Gordon and Gregory, 1983). Las tintas pueden agruparse en clases con base en cómo se utilizan, o con base en sus estructuras químicas (Gordon, 2009). Para esto último, las tintas han sido clasificadas en las clases generales de (/') azo, (/'/) antraquinona, (/'//) benzodífuranona, (/V) carbonilo aromático policíclico, (v) indigoide, (vi) polimetina y tintas relacionadas (por ejemplo, cianina), (vii) estirilo, (viii) carbonio de di y triarilo y tintas relacionadas (por ejemplo, fluoresceína, rodamina y sus derivados sulfonados), (ix) ftalocianina, (x) quinoftalona , (xi) azufre, (xii) nitro y nitroso, y (xiii) misceláneos (por ejemplo, coumarina y BODIPY) (Gregory, 2009). La mayor parte, si no es que todas las tintas e intermediarios de tintas tienen una multiplicidad de enlaces dobles de carbono-carbono que las hace sensibles a la ozonación. A mediados de los 1970s, Lofquist y colegas enseñaron la conclusión general de que la mayor partes de las tintas pueden ser susceptibles a ozonolisis (Consultar Patente Norteamericana 3,822,996; Patente Norteamericana 3,859,045; Patente Norteamericana 3,917,499. El efecto de la exposición de ozono a las telas con tintas es un desvanecimiento de la tinta (por ejemplo, pérdida de solidez de la tinta), lo cual se reportó primero en el año 1955. Salvin and Walker acuñaron el término "desvanecimiento-O", lo cual en su prueba de servicio de telas de tapizado revelaron que el ozono originó desvanecimiento de tinta significativo cuando se expuso a diversas tintas de antraquinona azul (por ejemplo, Eastman Blue GLF, Amacel Blue y I nterchemical Blue B) así como tintas de antraquinona amarillas y rojas (Ver Publicación Salvin, 1955). Otros ejemplos de tintas de antraquinona, tal como C.l. Basic Blue (Azul Básico) 47 (Ver Patente Norteamericana 3,822,996), y Disperse Blue (Azul Disperso) 3 (Ver Patente Norteamericana 3,859,045) se han reportado como susceptibles a desvanecimiento-O. La alta humedad incrementa el desvanecimiento-O (Consultar Patente Norteamericana 3,917,449; Patente Norteamericana 4,737,155; Patente Norteamericana 3,822,996; Patente Norteamericana 4,304,568), y para telas, se ha sugerido que la humedad proporciona una movilidad suficiente de la tinta para difundirse a la superficie del material en donde ocurre la reacción por ozonación (Consultar Patente Norteamericana 4,737,155).

Las tintas fluorescentes, tal como las que pertenecen a la clase de polimetina, también han sido reportadas como susceptibles a reacciones de ozonación, lo cual reduce sus intensidades de señal fluorescente. Por ejemplo, las tintas Cy3 y Cy5 han sido ampliamente utilizadas en tecnologías de microformación para expresión de gen, genotipificación y aplicaciones de resecuenciación (Consultar Gershon, 2004). Fare y colegas mostraron los resultados de que Cy5 y su derivado sulfonado Alexa Fluor 647 fueron susceptibles a daño por ozono a niveles de exposición de 5 a 10 ppb a los 10 a 30 sec (Consultar Fare et al., 2003). Los niveles de intensidad fluorescente también fueron reducidos para Cy3 y su derivado sulfonado Alexa Fluor 555 en mayores niveles de ozono (>100 ppb). Kadushin and Getts observó que la señal de inicio puede degradarse hasta el ~10% en 1 a 5 minutos (Consultar Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana 2004/0110196).

Existe un gran número de reactivos químicos, los cuales actúan como antiozonante. Los ejemplos incluyen para-fenildiamina , dihidroquinolina, tiourea (Consultar Patente Norteamericana 4,737,155; Patente Norteamericana 4,631,066), tiorea sustituida con alquilo saturada, alquilo y fosfitos de alquilo (Consultar Patente Norteamericana 3,822,996), aminas terciarias alifáticas etoxiladas (Consultar Patente Norteamericana 3,859,045), tiourea de piperidina sustituida (Consultar Patente Norteamericana 4,304,568), tionas de oxadiazina sustituidas y tionas de tiazina sustituidas (Consultar Patente Norteamericana 4,304,568), polimerasa acrílica, copolímeros de metacrilato o etilacrilato (Consultar Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana 2004/0110196), y politiourea (Consultar Patente Norteamericana 3,917,449). Para la presente invención, se puede utilizar la tiourea en algunas modalidades, en una o más soluciones para prevenir la ozonolisis de tintas fluorescentes en la reacción de secuenciación. La Publicación de Patente WO 2012/037394, la cual está incorporada a la presente invención como referencia, proporciona métodos para utilizar tiourea en combinación con métodos que implican tecnologías NGS. En algunas modalidades, los pasos de generación de imágenes y/o descomposición fotoquímica pueden llevarse a cabo en la presencia de tiourea, por ejemplo, en las concentraciones descritas en la breve descripción de la invención anterior.

H. Preparación de Muestra Los métodos para preparar el ADN de interés para análisis NGS incluyen, por ejemplo, plantillas amplificadas clonalmente y no amplificadas (por ejemplo, moléculas simples). En algunas modalidades, se puede utilizar emulsión PCR (emPCR). Tal como se ilustra en la figura 9, las muestras pueden prepararse como se indica a continuación. Primero, se aisla el ADN genómico. Posteriormente el ADN se fragmenta en piezas más pequeñas. Posteriormente se ligan adaptadores comunes a los extremos de dichos fragmentos. Posteriormente las moléculas de ADN ligadas con adaptador se separan en hebras simples y se capturan en gránulos con tamaño 1 pm bajo condiciones que favorecen una molécula ADN por granulo. Una emulsión acuosa-aceite crea gotas acuosas individuales que encapsulan estos complejos de ADN-gránulo. Se lleva a cabo amplificación de PCR dentro de estas gotas para crear gránulos que contienen 104-106 copias de la misma secuencia de plantilla. Después de amplificación y enriquecimiento exitosos, se inmovilizan químicamente desde millones hasta cientos de millones de gránulos emPCR para una célula de flujo microfluida 50. En algunas modalidades, la celda de flujo 50 puede comprender ocho canales y puede elaborarse de vidrio.

I. Sistema de Operación Una vez que se prepara la célula de flujo 50 con los gránulos, la célula de flujo 50 puede colocarse en el sistema de secuenciación 100. La figura 10 ilustra los pasos típicos en un ciclo CRT. Se ilustra una sola molécula de ADN con propósitos ilustrativos, aunque los expertos en la técnica podrán comprender que este proceso se lleva a cabo en muchas moléculas de ADN.

Primero, en el paso de incorporación, se incorporan terminadores reversibles 3'-OH utilizando polimerasa de ADN (ilustrada como un cierre) tal como se describió anteriormente.

Posteriormente, se generan imágenes de las moléculas de ADN etiquetadas en forma fluorescente. La lámpara 14 se activa de modo que la trayectoria de luz 30 sea creada a partir de la célula de flujo 50 hacia el dispositivo de generación de imágenes 10. El dispositivo de generación de imágenes 10 captura imágenes a través de cada uno de los cuatro filtros de espectro de la rueda de filtro 16. Utilizando la rueda de filtro 16, se genera la imagen de cada canal de espectro en forma de mosaico para capturar las señales fluorescentes dentro de la célula de flujo microfluida 50. Posteriormente se lleva a cabo la designación de base a partir de las intensidades fluorescentes procesadas de los gránulos individuales (por ejemplo, una señal azul purificada puede ser designada como una base "A" ya que el terminador reversible 3'-OH fue marcado con una tinta azul). La longitud de lectura del método CRT es una función directa del número de ciclos que se ejecutan (consultar Metzker 2010; Metzker, 2005, las cuales están incorporadas a la presente invención como referencia).

Posteriormente se puede llevar a cabo la disociación fotoquímica. Utilizando una fuente de luz UV 20, la luz UV resplandece en la célula de flujo 50. La luz UV se descompone en forma fotoquímica fuera del grupo de terminación y el grupo fluorescente. En esta forma, el ácido nucleico modificado se restaura a su estado nativo.

Posteriormente se suministra un lavado, que lava el grupo de terminación y los grupos fluorescentes. La incorporación, generación de imágenes, pasos de descomposición y lavado se pueden llevar a cabo para muchos ciclos CRT, según se desee. La figura 11 ilustra imágenes de mosaico de cuatro colores a partir de tres ciclos, y la designación de base subsecuente de los gránulos individuales.

IV. Definiciones Cuando se utiliza dentro del contexto de un grupo químico, el término "hidrógeno" significa -H; "hidroxi" significa -OH; "oxo" significa =0; "halo" significa independientemente -F, -Cl, -Br o -I; "amino" significa -NH2; "hidroxiamino" significa -NHOH; "nitro" significa -N02; imino significa =NH; "ciano" significa -CN; "isocianato" significa -N = C = 0; "azido" significa -N3; en un contexto monovalente "fosfato" significa -OP(0)(OH)2 o una forma desprotonada del mismo; en un contexto divalente "fosfato" significa -OP(0)(OH)0- o una forma desprotonada del mismo; "mercapto" significa -SH; y "tío" significa =S; "sulfonilo" significa -S(0)2-; y "sulfinilo" significa -S(O)-.

Dentro del contexto de fórmulas químicas, el símbolo "-" significa un enlace simple, " = " significa un enlace doble, y "=" significa un enlace triple. El símbolo representa un enlace opcional, el cual si está presente es ya sea simple o doble. El símbolo "==" representa un enlace simple o un enlace doble.

Por lo tanto, por ejemplo, la estructura incluye las Como lo podrán apreciar los expertos en la técnica, ninguno de dichos átomos de anillo forma parte de más de un enlace doble. El símbolO'-, ??" cuando se dibuja en forma perpendicular a través de un enlace indica un punto de adhesión del grupo. Se debe observar que el punto de adhesión normalmente se identifica únicamente en esta forma para grupos más grandes, con el objeto de ayudar al lector a una identificación rápida y no ambigua de un punto de adhesión. El símbolo significa un enlace simple en donde el grupo adherido al extremo grueso del trozo está "fuera de la página". El símbolo "•••Mil" significa un enlace simple en donde el grupo adherido al extremo grueso del trozo está "dentro de la página". El símbolo significa un enlace simple en donde la conformación (por ejemplo ya sea R o S) o la geometría no está definida (por ejemplo, ya sea E o Z).

Cualquier valencia no definida en un átomo de una estructura mostrada en esta solicitud representa implícitamente un átomo de hidrógeno enlazado al átomo. Cuando un grupo "R" se ilustra como un "grupo flotante" en un sistema de anillo, por ejemplo, en la fórmula: entonces R puede reemplazar cualquier átomo de hidrógeno adherido a cualquiera de los átomos de anillo, incluyendo un hidrógeno ilustrado, implicado o definido en forma expresa, siempre que se forme una estructura estable. Cuando un grupo "R" se ilustra como un "grupo flotante" en un sistema de anillo fusionado, como por ejemplo en la fórmula: entonces R puede reemplazar cualquier hidrógeno adherido a cualquiera de los átomos de anillo de cualquiera de los anillos fusionados al menos que se especifique de otra forma. Los hidrógenos reemplazables incluyen hidrógenos ilustrados (por ejemplo, el hidrógeno adherido al nitrógeno en la fórmula anterior), hidrógenos implicados (por ejemplo, un hidrógeno de la fórmula anterior que no se muestra pero se entiende que está presente), hidrógenos definidos en forma expresa e hidrógenos opcionales cuya presencia depende de la identidad de un átomo de anillo (por ejemplo, un hidrógeno adherido al grupo X, cuando X es igual a -CH-), siempre que se forme una estructura estable. En el ejemplo ilustrado, R puede residir ya sea en el anillo de 5 miembros o de 6 miembros del sistema de anillo fusionado. En la fórmula anterior, la letra en subíndice "y" seguida inmediatamente del grupo "R" entre los paréntesis, representa una variable numérica. A menos que se especifique de otra manera, esta variable puede ser 0, 1, 2 o cualquier entero mayor a 2, limitado únicamente por el número máximo de átomos de hidrógeno reemplazables del anillo o sistema de anillo.

Para los grupos y clases que se encuentran más adelante, los siguientes subíndices entre paréntesis definen en forma adicional el grupo/clase tal como se indica: "(Cn)" define el número exacto (n) de átomos de carbono en el grupo/clase. "(C=n)" define el número máximo (n) de átomos de carbono que pueden estar en el grupo/clase, con el número mínimo tan pequeño como sea posible para el grupo en cuestión, por ejemplo, queda entendido que el número mínimo de átomos de carbono en el grupo "alquenilo(c=8>" o la clase "alqueno(c=8)'\ e dos. Por ejemplo, "alcoxi(c<i o>" designa los grupos alcoxi que tienen de 1 a 10 átomos de carbono (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, o cualquier rango derivable del mismo (por ejemplo, 3 a 10 átomos de carbono). (Cn-n') define tanto el número mínimo (n) como máximo (?') de átomos de carbono en el grupo. Similarmente, designa los grupos "alquilo(C2-io)" que tienen de 2 a 10 átomos de carbono (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, o cualquier rango derivable del mismo (por ejemplo, 3 a 10 átomos de carbono)).

El término "saturado" tal como se utiliza en la presente invención, significa el compuesto o grupo modificado que no tiene un enlace doble carbono-carbono ni enlaces triples carbono-carbono, excepto tal como se indica más adelante. El término no excluye los enlaces múltiples de carbono-heteroátomo, por ejemplo, un enlace doble de oxígeno carbono o un enlace doble de nitrógeno carbono. Además, no excluye un enlace doble carbono-carbono que puede surgir como parte del tautomerismo ceto-enol o tautomerismo imina/enamina.

El término "alifático" cuando se utiliza sin el modificador "sustituido" significa que el compuesto/grupo modificado es un grupo o compuesto de hidrocarburo acíclico o cíclico, pero no aromático. En los compuestos/grupos alifáticos, los átomos de carbono se pueden unir en cadenas rectas, cadenas ramificadas o anillos no aromáticos (alicíclico). Los compuestos/grupos alifáticos pueden ser saturados, esto es unidos por enlaces simples (alcanos/alquilo), o insaturados, con uno o más enlaces dobles (alquenos/alquenilo) o con uno o más enlaces triples (alquinos/alquinilo). Cuando se utiliza el término "alifático" sin el modificador "sustituido", entonces únicamente están presentes átomos de carbono e hidrógeno. Cuando se utiliza el término con el modificador "sustituido", se han reemplazado independientemente uno o más átomos de hidrógeno por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2, -N02, "C02H, -C02CH3, -CN, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -C(0)CH3, -NHCH3, -NHCH2CH3, -N(CH3)2, -C(0)NH2, -OC(0)CH3, o -S(0)2NH2.

El término "alquilo" cuando se utiliza sin el modificador "sustituido" se refiere a un grupo alifático saturado monovalente con un átomo de carbono como el punto de adhesión, una estructura ciclo, cíclica o acíclica lineal o ramificada, y sin átomos además del de carbono e hidrógeno. Por lo tanto, tal como se utiliza en la presente invención, cicloalquilo es un subconjunto de alquilo. Los grupos -CH3 (Me), -CH2CH3 (Et), -CH2CH2CH3 (n-Pr o propilo), -CH(CH3)2 (/-Pr, 'Pr o isopropilo), -CH(CH2)2 (ciclopropilo), -CH2CH2CH2CH3 (n-Bu), CH(CH3)CH2CH3 (sec-butilo), -CH2CH(CH3)2 (isobutilo), -C(CH3)3 (rer-butilo, í-butilo, t-Bu o 'Bu), -CH2C(CH3)3 (neo-pentilo), ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y ciclohexilmetilo son ejemplos no limitantes de grupos alquilo. El término "alcanodiilo" cuando se utiliza sin el modificador "sustituido" se refiere a un grupo alifático saturado divalente, con uno o dos átomos de carbono como el punto(s) de adhesión, una estructura ciclo, cíclica o acíclica lineal o ramificada, sin enlaces dobles o triples de carbono-carbono, y sin átomos además del de carbono e hidrógeno. Los grupos, -CH2-(metileno), -CH2CH2-, -CH2C(CH3)2CH2-, -CH2CH2CH2- y ^"^,, son ejemplos no limitantes de grupos alcanodiilo. El término "alquilideno" cuando se utiliza sin el modificador "sustituido" se refiere al grupo divalente =CRR' en donde R y R' son independientemente hidrógeno, alquilo o R y R' se toman juntos para representar un alcanodiilo que tiene al menos dos átomos de carbono. Los ejemplos no limitantes de grupos alquilideno incluyen: =CH2, =CH(CH2CH3) y =C(CH3)2. Cuando cualquiera de estos términos se utiliza con el modificador "sustituido", se han reemplazado independientemente uno o más átomos de hidrógeno mediante -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2, -N02, -C02H, -C02CH3, -CN, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -C(0)CH3, -NHCH3, -NHCH2CH3, -N(CH3)2, -C(0)NH2, -OC(0)CH3 o -S(0)2NH2. Los siguientes grupos son ejemplos no limitantes de grupos alquilo sustituido: -CH2OH, -CH2CI, -CF3, -CH2CN, -CH2C(0)OH, -CH2C(0)OCH3, -CH2C(0)NH2, -CH2C(0)CH3, -CH2OCH3, -CH2OC(0)CH3, -CH2NH2, -CH2N(CH3)2 y -CH2CH2CI. El término "haloalquilo" es un subconjunto de alquilo sustituido, en donde uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos con un grupo halo o sin otros átomos además de carbono, hidrógeno y halógeno presentes. El grupo, -CH2CI es un ejemplo no limitante de un haloalquilo. Un "alcano" se refiere al compuesto H-R, en donde R es alquilo. El término "fluoroalquilo" es un subconjunto de alquilo sustituido en donde se han sustituido uno o más hidrógenos con un grupo fluoro y sin otros átomos además de carbono, hidrógeno y fluoro estando presentes. Los grupos -CH2F, -CF3 y -CH2CF3, son ejemplos no limitantes de grupos fluoroalquilo. Un "alcano" se refiere al compuesto H-R, en donde R es alquilo.

El término "alquenilo" cuando se utiliza sin el modificador "sustituido", se refiere a un grupo alifático insaturado monovalente con un átomo de carbono como el punto de adhesión, una estructura ciclo, cíclica o acíclica lineal o ramificada, al menos un enlace doble carbono-carbono no aromático, sin enlaces triples carbono-carbono y sin átomos además de carbono y hidrógeno. Los ejemplos no limitantes de grupos carbono-carbono incluyen: -CH = CH2 (vinilo), CH = CHCH3, -CH = CHCH2CH3, -CH2CH = CH2 (a Mío) , CH2CH = CHCH3 y -CH = CH-C6H5. El término "alquenodiilo" cuando se utiliza sin el modificador "sustituido" se refiere a un grupo alifático insaturado divalente, con dos átomos de carbono como puntos de adhesión, una estructura ciclo, cíclica o acíclica lineal o ramificada, al menos un enlace doble carbono-carbono no aromático, sin enlaces triples carbono-carbono y sin átomos además del carbono e hidrógeno. Los grupos, -CH = CH-, -CH = C(CH3)CH2-, -CH = CHCH2- y -f¿^7~ son ejemplos no limitantes de grupos alquenodiilo. Cuando estos términos se utilizan con el modificador "sustituido", uno o más átomos de hidrógeno han sido reemplazados independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2, -N02, -C02H, -C02CH3, -CN, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -C(0)CH3, -NHC H3, -NHCH2CH3, -N(CH3)2, -C(0)NH2, -OC(0)CH3 o -S(0)2NH2. Los grupos, -CH = CHF, -CH = CHCI y -CH = CHBr, son ejemplos no limitantes de grupos alquenilo sustituidos. Un "alqueno" se refiere al compuesto H-R, en donde R es alquenilo.

El término "alquinilo" cuando se utiliza sin el modificador "sustituido" se refiere a un grupo alifático insaturado monovalente con un átomo de carbono como el punto de adhesión, una estructura ciclo, cíclica o acíclica lineal o ramificada, al menos un enlace triple carbono-carbono y sin átomos además de carbono e hidrogeno. Tal como se utiliza en la presente invención, el término alquinilo no excluye la presencia de uno o más enlaces dobles de carbono-carbono no aromáticos. Los grupos, -C=CH, -C = CCH3 y -CH2C = CCH3, son ejemplos no limitantes de grupos alquinilo. Cuando se utiliza alquinilo con el modificador "sustituido", se han reemplazado independientemente uno o más átomos de hidrógeno por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2, -N02, -C02H, -C02CH3, -CN, -SH, -OCH3l -OCH2CH3, -C(0)CH3, -NHCH3> -NHCH2CH3, -N(CH3)2, -C(0)NH2, -OC(0)CH3 o -S(0)2NH2. Un "alquino" se refiere al compuesto H-R, en donde R es alquinilo.

El término "arilo" cuando se utiliza sin el modificador "sustituido" se refiere a un grupo aromático insaturado monovalente con un átomo de carbono aromático como el punto de adhesión, formando parte del átomo de carbono de una o más estructuras de anillo aromático de seis miembros, en donde los átomos de anillo todos son carbono, y en donde el grupo consiste en ningún átomo además de carbono e hidrógeno. Si está presente más de un anillo, los anillos pueden ser fusionados o no fusionados. Tal como se utiliza en la presente invención, el término no excluye la presencia de uno o más grupos alquilo (permitiendo una limitación de número de carbono) adherido al primer anillo aromático o cualquier anillo aromático adicional presente. Los ejemplos no limitantes de grupos arilo incluyen fenilo (Ph), metilfenilo, (dimetil)fenilo, -C6H4CH2CH3 (etilfenilo), naftilo y el grupo monovalente derivado de bifenilo. El término "arenodiilo" cuando se utiliza sin el modificador "sustituido" se refiere a un grupo aromático divalente con dos átomos de carbono aromáticos como puntos de adhesión, formando parte los átomos de carbono de una o más estructuras de anillo aromática de seis miembros, en donde los átomos de anillo todos son carbono, y en donde el grupo monovalente consiste en no tener átomos además de carbono e hidrógeno. Tal como se utiliza en la presente invención, el término no excluye la presencia de uno o más grupos alquilo (permitiendo limitación de número de carbono) adherido al primer anillo aromático o cualquier anillo aromático adicional presente. Si está presente más de un anillo, los anillos pueden ser fusionados o no fusionados. Los ejemplos no limitantes de grupos arenodiilo incluyen: Cuando estos términos se utilizan con el modificador "sustituido", uno o más átomos de hidrógeno han sido remplazados independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2, -N02, "C02H, -C02CH3, -CN, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -C(0)CH3, -NHCH3, -NHCH2CH3, -N(CH3)2, -C(0)NH2, -OC(0)CH3 o -S(0)2NH2. Un "areno" se refiere al compuesto H-R, en donde R es arilo.

El término "aralquilo" cuando se utiliza sin el modificador "sustituido" se refiere al grupo monovalente -alcanodiilo-arilo, en donde los términos alcanodiilo y arilo cada uno se utilizan en una forma consistente con las definiciones proporcionadas anteriormente. Los ejemplos de aralquilos no limitantes son: fenilmetilo (bencilo, Bn) y 2-fenil-etilo. Cuando se utiliza el término con el modificador "sustituido", uno o más átomos de hidrógeno del alcanodiilo y/o el arilo ha sido reemplazado independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2, -N02, -C02H, -C02CH3, -CN, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -C(0)CH3, -NHCH3, -NHCH2CH3, -N(CH3)2, -C(0)NH2, -OC(0)CH3 o -S(0)2NH2- Los ejemplos no limitantes de aralquilos sustituidos son: (3-clorofenil)-metilo y 2-cloro-2-fenil-et-1 -ilo.

El término "heteroarilo" cuando se utiliza sin el modificador "sustituido" se refiere a un grupo aromático monovalente con un átomo de carbono o átomo de nitrógeno aromático como el punto de adhesión, formando parte el átomo de carbono o el átomo de nitrógeno de una o más estructuras de anillo aromático, en donde al menos uno de los átomos es nitrógeno, oxígeno o azufre, y en donde el grupo heteroarilo consiste en ningún átomo además de carbono, hidrógeno, nitrógeno aromático, oxígeno aromático o azufre aromático. Tal como se utiliza en la presente invención, el término no excluye la presencia de uno o más grupos alquilo, arilo y/o aralquilo (permitiendo la limitación de números de carbono) adheridos al anillo aromático o sistema de anillo aromático. Si está presente más de un anillo, los anillos pueden ser fusionados o no fusionados. Los ejemplos no limitantes de grupos heteroarilo incluyen furanilo, imidazolilo, indolilo, indazolilo (lm), isoxazolilo, metilpiridinilo, oxazolilo, fenilpiridinilo, piridinilo, pirrolilo, pirimidinilo, pirazinilo, quinolilo, quinazolilo, quinoxalinilo, triazinilo, tetrazolilo, tiazolilo, tienilo y triazolilo. El término "N-heteroarilo" se refiere a un grupo heteroarilo con un átomo de nitrógeno como el punto de adhesión. El término "heteroarenodiilo" cuando se utiliza sin el modificador "sustituido" se refiere a un grupo aromático divalente, con dos átomos de carbono aromáticos, dos átomos de nitrógeno aromáticos, o un átomo de carbono aromático y un átomo de nitrógeno aromático como los dos puntos de adhesión, formando parte los átomos de una o más estructuras de anillo aromáticas, en donde al menos uno de los átomos de anillo es nitrógeno, oxígeno o azufre, y en donde el grupo divalente consiste en ningún átomo además de carbono, hidrógeno, nitrógeno aromático, oxígeno aromático o azufre aromático. Tal como se utiliza en la presente invención, el término no excluye la presencia de uno o más grupos alquilo, arilo y/o aralquilo (permitiendo limitación de números de carbono) adherido al anillo aromático o sistema de anillo aromático. Si está presente más de un anillo, los anillos pueden ser fusionados o no fusionados. Los ejemplos no limitantes de grupos heteroarenodiilo incluyen: Cuando estos términos se utilizan con el modificador "sustituido", uno o más átomos de hidrógeno han sido reemplazados independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, NH2, -N02, -C02H, -C02CH3, -CN, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, C(0)CH3, -NHCH3, -NHCH2CH3, -N(CH3)2, -C(0)NH2, -OC(0)CH o -S(0)2NH2.

El término "heterocicloalquilo" cuando se utiliza sin el modificador "sustituido" se refiere a un grupo no aromático monovalente con un átomo de carbono o átomo de nitrógeno como el punto de adhesión, formando parte el átomo de carbono o átomo de nitrógeno de una o más estructuras de anillo no aromáticas en donde al menos uno de los átomos de anillo es nitrógeno, oxígeno o azufre, y en donde el grupo heterocicloalquilo consiste en ningún átomo además de carbono, hidrógeno, nitrógeno, oxígeno y azufre. Tal como se utiliza en la presente invención, el término no excluye la presencia de uno o más grupos alquilo (permitiendo limitación de números de carbono) adherida al anillo o sistema de anillo.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término no excluye la presencia de uno o más enlaces dobles en el anillo o sistema de anillo, siempre que el grupo resultante permanezca no aromático. Si está presente más de un anillo, los anillos pueden ser fusionados o no fusionados. Los ejemplos no limitantes de grupos heterocicloalquilo incluyen aziridinilo, azetidinilo, pirrolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidrotiofuranilo, tetrahidropiranilo, piranilo, oxiranilo y oxetanilo. El término "N-heterocicloalquilo" se refiere a un grupo heterocicloalquilo con un átomo de anillo como el punto de adhesión. Cuando el término "heterocicloalquilo" es utilizado con el modificador "sustituido", uno o más átomos de hidrógeno ha sido reemplazado independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2, -N02, -C02H, -C02CH3, -CN, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -C(0)CH3, -NHCH3, -NHCH2CH3, -N(CH3)2, -C(0)NH2, -OC(0)CH3, -S(0)2NH2 o -C(0)OC(CH3)3 (fer-butiloxicarbonilo, BOC).

El término "acilo" cuando se utiliza sin el modificador "sustituido" se refiere al grupo -C(0)R, en donde R es un hidrógeno, alquilo, arilo, aralquilo o heteroarilo, tal como se definieron los términos anteriormente. Los grupos, -CHO, -C(0)CH3 (acetilo, Ac), -C(0)CH2CH3, -C(0)CH2CH2CH3, -C(0)CH(CH3)2, -C(0)CH(CH2)2, -C(0)C6H5, -C(0)C6H4CH3, -C(0)CH2C6H5, -C(0)(imidazolilo) son ejemplos no limitantes de grupos acilo. Un "tioacilo" se define en una forma análoga, excepto que el átomo de oxígeno del grupo -C(0)R ha sido reemplazado con un átomo de azufre, -C(S)R. Cuando se utilizan cualquiera de estos términos con el modificador "sustituido", uno o más átomos de hidrógeno (incluyendo un átomo de hidrógeno adherido directamente al grupo carbonilo o tiocarbonilo, si es que existe) ha sido reemplazado independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2, -N02, -C02H, -C02CH3, -CN, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -C(0)CH3, -NHCH3, -NHCH2CH3, -N(CH3)2, -C(0)NH2, -OC(0)CH3 o -S(0)2NH2. Los grupos, -C(0)CH2CF3, -C02H (carboxilo), -C02CH3 (metilcarboxilo), -C02CH2CH3, -C(0)NH2 (carbamoilo) y -CON(CH3)2, son ejemplos no limitantes de grupos acilo.

El término "alcoxi" cuando se utiliza sin el modificador "sustituido" se refiere al grupo -OR, en donde R es un alquilo, tal como se definió el término anteriormente. Los ejemplos no limitantes de grupos alcoxi incluyen: -OCH3 (metoxi), -OCH2CH3 (etoxi), -OCH2CH2CH3, -OCH(CH3)2 (isopropoxi), -0(CH3)3 (ter-butoxi), -OCH(CH2)2, -O-ciclopentilo y -O-cicIohexilo. Los términos "alqueniloxi", "alquiniloxi", "ariloxi", "aralcoxi", "heteroariloxi", "heterocicloalcoxi" y "aciloxi" cuando se utilizan sin el modificador "sustituido" se refieren a grupos definidos como -OR, en donde R es alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, heterocicloalquilo y acilo, respectivamente. El término "alcoxidiilo" se refiere al grupo divalente -O-alcanodiilo-, -O-alcanodiil-O-, o -alcanodiil-O-alcanodiilo-. El término "alquiltio" y "aciltio" cuando se utilizan sin el modificador "sustituido", se refieren al grupo -SR, en donde R es alquilo y acilo, respectivamente. Cuando cualquiera de estos términos se utiliza con el modificador "sustituido", uno o más átomos de hidrógeno han sido reemplazados independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2, -N02, -C02H, -C02CH3, -CN, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -C(0)CH3, -NHCH3, -NHCH2CH3, -N(CH3)2, -C(O) H2, -OC(0)CH3 o -S(0)2NH2. El término "alcohol" corresponde a un alcano, tal como se definió anteriormente, en donde al menos uno de los átomos de hidrógeno ha sido reemplazado con un grupo hidroxi.

El término "alquilamino" cuando se utiliza sin el modificador "sustituido" se refiere al grupo -NHR, en donde R es un alquilo, tal como se definió anteriormente. Los ejemplos no limitantes de grupos alquilamino incluyen: -NHCH3 y -NHCH2CH3. El término "dialquilamino" cuando se utiliza sin el modificador "sustituido" se refiere al grupo -NRR', en donde R y R' pueden ser los mismos grupos alquilo o diferentes, o R y R' pueden tomarse juntos para representar un alcanodiilo. Los ejemplos no limitantes de grupos dialquilamino incluyen: -N(CH3)2, -N(CH3)(CH2CH3) y A- p i r r o lid i n i I o . Los términos "alcoxiamino", "alquenilamino", "alquinilamino", "arilamino", "aralquilamino", "heteroarilamino", "heterocicloalquilamino" y "alquilsulfonilamino", cuando se utilizan sin el modificador "sustituido" se refieren a grupos definidos como -NHR, en donde R es alcoxi, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, heterocicloalquilo alquilsulfonilo, respectivamente. Un ejemplo no limitante de un grupo arilamino es -NHC6H5. El término "amido" (acilamino), cuando se utiliza sin el modificador "sustituido" se refiere al grupo -NHR, en donde R es acilo, tal como se definió anteriormente. Un ejemplo no limitante de un grupo amido es -NHC(0)CH3. El término "alquilimino" cuando se utiliza sin el modificador "sustituido" se refiere a un grupo divalente =NR, en donde R es un alquilo, tal como se definió dicho término anteriormente. El término "alquilaminodiilo" se refiere al grupo divalente -NH-alcanodiilo-, -NH-alcanodiil-NH- o -alcanodiil-NH-alcanodiilo-. Cuando cualquiera de estos términos se utiliza con el modificador "sustituido", uno o más átomos de hidrógeno ha sido reemplazado independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, - H2, -N02, -C02H, -C02CH3, -CN, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -C(0)CH3, -NHCH3, -NHCH2CH3, -N(CH3)2, -C(0)NH2, -OC(0)CH3 o -S(0)2NH2. Los grupos -NHC(0)OCH3 y -NHC(0)NHCH3 son ejemplos no limitantes de grupos amido sustituidos.

El término "alquilfosfato" cuando se utiliza sin el modificador "sustituido" se refiere al grupo -OP(0)(OH)(OR), en donde R es un alquilo, tal como se definió dicho término anteriormente. Los ejemplos no limitantes de grupos alquilfosfato incluyen: -OP(0)(OH)(OMe) y -OP(0)(OH)(OEt). El término "dialquilfosfato" cuando se utiliza sin el modificador "sustituido" se refiere al grupo -OP(0)(OR)(OR'), en donde R y R' pueden ser los mismos grupos alquilo o diferentes, o R y R' pueden tomarse juntos para representar un alcanodiilo. Los ejemplos no limitantes de grupos dialquilfosfato incluyen: -OP(0)(OMe)2, -OP(0)(OEt)(OMe) y -OP(0)(OEt)2. Cuando cualquiera de estos términos se utiliza con el modificador "sustituido", uno o más átomos de hidrógeno ha sido reemplazado por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, - H2, -N02, -C02H, -CO2CH3, -CN, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -C(0)CH3, -NHCH3, -NHCH2CH3, -N(CH3)2, -C(0)NH2, -OC(0)CH3 o -S(0)2NH2.

Los términos "alquilsulfonilo" y "alquilsulfinilo" cuando se utilizan sin el modificador "sustituido" se refiere a grupos -S(0)2R y -S(0)R, respectivamente, en donde R es un alquilo, tal como se definió dicho término anteriormente. Los términos "alquenilsulfonilo", "alquinilsulfonilo", "arilsulfonilo", "aralquilsulfonilo", "heteroarilsulfonilo" y "heterocicloalquilsulfonilo", se definen en una forma análoga. Cuando cualquiera de estos términos se utiliza con el modificador "sustituido", uno o más átomos de hidrógeno ha sido reemplazado independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2, -NO2, -C02H, -C02CH3, -CN, -SH, -OCH3, -OCH2CH3) -C(0)CH3, -NHCH3, -NHCH2CH3, -N(CH3)2, -C(0)NH2l -OC(0)CH3 o -S(0)2NH2.

Tal como se utiliza en la presente invención, un "auxiliar quirálico" se refiere a un grupo quirálico removible que tiene la capacidad de influenciar la estereoselectividad de una reacción. Los expertos en la técnica están familiarizados con dichos compuestos, y muchos de ellos están comercialmente disponibles.

El uso de la palabra "un" o "uno, una" cuando se utiliza junto con el término "que comprende" en las reivindicaciones y/o especificación, puede significar "uno", aunque también es consistente con el significado de "uno o más", "al menos uno" y "uno o más de uno".

A lo largo de la presente solicitud, el término "aproximadamente" se utiliza para indicar que un valor incluye la variación de error inherente del dispositivo, siendo empleado el método para determinar el valor o la variación que existe entre los sujetos de estudio.

Los términos "comprende", "tiene" y "incluye", son verbos de enlace de extremo abierto. Cualquiera de las formas en las que uno o más de estos verbos se utilicen, tal como "comprende", "que comprende", "tiene", "que tiene", "incluye" y "que incluye", también son de extremo abierto. Por ejemplo, cualquier método que "comprenda", "tenga" o "incluya" uno o más pasos, no está limitado a poseer únicamente el uno o más pasos, y también cubre otros pasos no descritos.

El término "efectivo", como dicho término se utiliza en la especificación y/o reivindicaciones, significa adecuado para lograr un resultado deseado, esperado o proyectado. La "cantidad efectiva", "cantidad terapéuticamente efectiva" o "cantidad farmacéuticamente efectiva" cuando se utiliza dentro del contexto de tratar a un paciente o sujeto con un compuesto, significa la cantidad del compuesto la cual, cuando se administra a un sujeto o paciente para tratar una enfermedad, es suficiente para efectuar el tratamiento para la enfermedad.

El término "hidrato" cuando se utiliza como un modificador para un compuesto significa que el compuesto tiene menos de una (por ejemplo, hemihidrato), una (por ejemplo, monohidrato) o más de una (por ejemplo, dihidrato) moléculas de agua asociadas con cada molécula de compuesto, tal como en formas sólidas del compuesto.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "IC50" se refiere a una dosis inhibidora la cual es el 50% de la respuesta máxima obtenida. Esta medida cuantitativa indica que se necesita tanto un fármaco particular, como otra sustancia (inhibidor) para inhibir un proceso biológico, bioquímico o químico determinado (o componente de un proceso, por ejemplo, una enzima, célula, receptor celular o microorganismo) a la mitad.

Un "isómero" en un primer compuesto es un compuesto separado en donde cada molécula contiene los mismos átomos constituyentes que el primer compuesto, pero en donde difiere la configuración de estos átomos en tres dimensiones.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "paciente" o "sujeto" se refiere a un organismo mamífero vivo, tal como humano, mono, vaca, oveja, cabra, perro, gato, ratón, rata, cerdo de Guinea o especies transgénicas de los mismos. En ciertas modalidades, el paciente o sujeto es un primate. Los ejemplos no limitantes de sujetos humanos son adultos, jóvenes, infantes o fetos.

Tal como se utiliza generalmente en la presente invención el término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a los compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación las cuales, dentro del alcance del juicio médico notable, son adecuadas para utilizarse en contacto con tejidos, órganos y/o fluidos corporales de seres humanos y animales sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica, u otros problemas o complicaciones excesivos con una proporción razonable de beneficio/riesgo.

Las "sales farmacéuticamente aceptables" significa sales de los compuestos de la presente invención que son farmacéuticamente aceptables, tal como se definió anteriormente, y que poseen la actividad farmacológica deseada. Dichas sales incluyen sales de adición de ácido formadas con ácidos inorgánicos tales como ácido hidroclórico, ácido hidrobrómico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, y similares; o con ácidos orgánicos tales como ácido ,2-etanodisulfónico, ácido 2-hidroxi etanosulfónico, ácido 2-naftalenosulfónico, ácido 3-fen¡lpropiónico, ácido 4,4'- metilenobis(3-hidroxi-2-eno-1 -carboxílico), ácido 4-metilbiciclo[2.2.2]oct-2-eno-1 -carboxílico, ácido acético, ácidos alifáticos mono- y dicarboxílicos, ácidos sulfúrico alifáticos, ácidos sulfúricos aromáticos, ácido bencenosulfónico, ácido benzoico, ácido canforsulfónico, ácido carbónico, ácido cinámico, ácido cítrico, ácido ciclopentanopropiónico, ácido etanpsulfónico, ácido fumárico, ácido glucoheptónico, ácido glucónico, ácido glutámico, ácido glicólico, ácido heptanoico, ácido hexanoico, ácido hidroxinaftoico, ácido láctico, ácido laurilsulfúrico, ácido maleico, ácido málico, ácido malónico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido mucónico ácido o-(4-hidroxibenzoil)benzoico, ácido oxálico, ácido p-clorobencenosulfónico, ácidos fenil-alcanoicos sustituidos, ácido propiónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido pirúvico, ácido salicílico, ácido esteárico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido tertiaributilacético, ácido trimetilacético y similares. Las sales farmacéuticamente aceptables también incluyen sales de adición base que pueden formarse cuando los protones ácidos presentes tienen la capacidad de reaccionar con las bases inorgánicas u orgánicas. Las bases inorgánicas aceptables incluyen hidróxido de sodio, carbonato de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de aluminio e hidróxido de calcio. Las bases orgánicas aceptables incluyen etanolamína, dietanolamina, trietanolamina, trometamina, N-metilglucamina y similares. Deberá reconocerse que el anión o catión particular que forma parte de cualquier sal de la presente invención no es importante, siempre que la sal, en su totalidad, sea farmacológicamente aceptable. Los ejemplos adicionales de sales farmacéuticamente aceptables y sus métodos de preparación y uso se presentan en Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, and Use (Manual de Sales Farmacéuticas: Propiedades y Uso) (P. H. Stahl & C. G. Wermuth eds., Verlag Helvética Chimica Acta, 2002).

El término "transportador farmacéuticamente aceptable" tal como se utiliza en la presente invención, significa un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como un rellenador, diluyente, excipiente, solvente o material encapsulante líquido o sólido, implicado en llevar o transportar un agente químico.

El término "prevención" o "prevenir" incluye: (1) inhibir la generación de una enfermedad en un sujeto o paciente que está en riesgo y/o predispuesto a la enfermedad pero que aún no experimenta o muestra cualquiera o toda la patología o sintomatología de la enfermedad, y/o (2) detiene la generación de la patología o sintomatología de una enfermedad en un sujeto o paciente que puede estar en riesgo y/o predispuesto a la enfermedad, pero que aún experimenta o muestra cualquiera o toda la patología o sintomatología de la enfermedad.

Un "estereoisómero" o "isómero óptico" es un isómero de un compuesto determinado en donde se enlazan los mismos átomos a los mismos otros átomos, pero en donde difiere la configuración de dichos átomos en tridimensiones. Los "enantiómeros" son estereoisómeros de un compuesto determinado que son imágenes de espejo una de la otra, tipo manos izquierdas y derechas. Los "diastereómeros" son estereoisómeros de un compuesto determinado que no son enantiómeros. Las moléculas quirálicas contienen un centro quirálico, también referido como un estereocentro o centro estereogénico, el cual es cualquier punto, aunque no necesariamente un átomo, en una molécula que contiene grupos de modo que un intercambio de cualquiera de los dos grupos conduce a un estereoisómero. En compuestos orgánicos, el centro quirálico normalmente es un átomo de carbono, fósforo o azufre, aunque también es posible que otros átomos sean estereocentros en compuestos orgánicos o inorgánicos. Una molécula puede tener estereocentros múltiples, proporcionándoles muchos estereoisómeros. En compuestos cuyo estereoisomerismo se debe a centros estereogénicos tetrahédricos (por ejemplo, carbono tetrahédrico), el número total de estereoisómeros hipotéticamente posibles no excederá 2n, en donde n es el número de estereocentros tetrahédricos. Las moléculas con simetría, frecuentemente tienen menos de un número máximo posible de estereoisómeros. Una mezcla 50:50 de enantiómeros es referida como una mezcla racémica. Alternativamente, una mezcla de enantiómeros puede ser enriquecida enantioméricamente de modo que esté presente un enantiómero en una cantidad mayor al 50%. Normalmente, los enantiómeros y/o diasterómeros pueden ser resueltos o separados utilizando técnicas conocidas en el arte. Se contempla que para cualquier estereocentro o eje de quiralidad para el cual no se haya definido la estereoquímica, dicho estereocentro o eje de quiralidad puede estar presente en su forma R, forma S, o como una mezcla de formas R y S, incluyendo mezclas racémicas y no racémicas. Tal como se utiliza en la presente invención, la frase "sustancialmente libre de otros estereoisómeros" significa que la composición contiene = 15%, más preferentemente <10%, incuso más preferentemente =5%, o más preferentemente =1% de otro estereoisómero(s) .

El término "tratamiento" o "tratar" incluye (1) inhibir una enfermedad en un sujeto o paciente que experimenta o muestra la patología o sintomatolog ía de la enfermedad (por ejemplo, deteniendo el desarrollo adicional de la patología y/o sintomatología), (2) aliviar una enfermedad en un sujeto o paciente que está experimentando o mostrando la patología o sintomatología de la enfermedad (por ejemplo, revirtiendo la patología y/o sintomatología) y/o (3) efectuando cualquier disminución medible en una enfermedad en un sujeto o paciente que está experimentando o mostrando la patología o sintomatología de la enfermedad.

Los términos "base de nucleótido", "nucleobase" o simplemente "base", tal como se utiliza en la presente invención, se refieren a un anillo heteroaromático de origen que contiene nitrógeno sustituido o no sustituido de un tipo que es comúnmente encontrado en ácidos nucleicos, así como las variantes naturales sustituidas, modificadas, o diseñadas o análogos de las mismas. En una modalidad típica, la nucleobase tiene la capacidad de formar enlaces de hidrógeno de Watson-Crick y/o Hoogsteen con una nucleobase adecuadamente complementaria. Las nucleobases de ejemplo incluyen pero no se limitan a, purinas tales como 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina, adenina (A), etenoadenina, N6-A2-isopenteniladenina (6iA), A/6-A2-isopentenil-2-metiltioadenina (2ms6iA), A/6-metiladenina, guanina (G), isoguanina, N2-dimetilguanina (dmG), 7-metilguanina (7mG), 2-tiopirimidina, 6-tioguanina (6sG), hipoxantina y 06-metilguanina; 7-deaza-purinas tales como 7-deazaadenina (7-deaza-A), 7-deazaguanina (7-deaza-G), 7-deaza-7-hidroximetiladenina, 7-deaza-7-aminometiladenina y 7-deaza-7-hidroximetilguanina; pirimidinas tales como citosina (C), 5-propinilcitosina, isocitosina, 5-hidroxilmetilcitosina (HOMeC), 5-aminometil-citosina, timina (T), 4-tiotimina (4sT), 5,6-dihidrotimina, O4-metiltimina, uracilo (U), 4-tiouracilo (4sU), 5-hidroxilmetiluracilo (HOMeU), 5-aminometil-uracilo y 5,6-dihidrouracilo (dihidrouracilo; D); Índoles tales como nitroindol y 4-metilindol; pirróles tales como nitropirrol; nebularina; base (Y); etc.

Las nucleobases de ejemplo adicionales se pueden encontrar en la Publicación de Lehninger, 2005, la cual está incorporada a la presente invención como referencia, y las referencias ahí mencionadas.

El término "nucleósido" tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a una glicosilamina que consiste en una nucleobase enlazada a un azúcar de cinco carbonos, normalmente una ribosa o desoxirribosa . Los ejemplos de éstos incluyen pero no se limitan a, citidina, 2'-desoxicitidina, 5-hidroxilmetilcitidina, 2'-desoxi-5-hidroxilmetilcitidina, 5-aminometilcitidina, 2'-desoxi-5-aminometilcitidina, uridina, 2'-desoxiuridina, 5-hidroxilmetiluridina, 2'-desoxi-5-hidroxilmetiluridina, 5-aminometiluridina , 2'-desoxi-5-aminometiluridina, adenosina, 2'-desoxiadenosina , 7-deaza-7-hidroximetiladenosina, 2'-desoxi-7-deaza-7-hidroximetiladenosina, 7-deaza-7-aminometiladenosina, 2'-desoxi-7-deaza-7-amino-metiladenosina, guanosina, 2'-desoxiguanosina, guanosina de 7-deaza-7-hidroximetilo, 2'-desoxi-7-deaza-7-hidroximetilo, guanosina de 7-deaza-7-aminometilo, guanosina de 2'-desoxi-7-deaza-7-aminometilo, timidina y 2'-desoxitimidina.

Un "nucleótido" está compuesto de un nucleósido con uno, dos, tres o más grupos fosfato enlazados en cadena al azúcar de 5 carbonos del nucleósido.

El término "desfase" es un fenómeno que ocurre con métodos de adición por etapas, incluyendo pero sin limitarse a métodos, CRT, SNA y SBL, cuando los cebadores en crecimiento se mueven de la sincronicidad de cualquier ciclo determinado. El desfase de hebra de rezago o tipo 2 (por ejemplo, n + 1 del ciclo esperado) resulta de la extensión incompleta, y el desfase de la hebra principal o tipo 1 (por ejemplo, n + 1) resulta de la adición de múltiples nucleótidos o sondas en una población de plantillas idénticas.

El término "nucleótido oscuro" o "sonda oscura" se refiere a un nucleótido o sonda que no contiene una etiqueta fluorescente. Puede generarse de su descomposición o llevarse del ciclo previo o puede hidrolizarse in situ a partir de su contraparte etiquetada con tinta en el ciclo actual.

A menos que se especifique de otra forma, un "enlazador" se refiere a uno o más grupos divalentes (miembros de enlace) que funcionan como un puente molecular enlazado en forma covalente entre otros dos grupos. Un enlazador puede contener uno o más miembros de enlace y uno o más tipos de miembros de enlace. Los miembros de enlace de ejemplo incluyen: -C(0)NH- -C(0)0-, -NH-, -S-, -S(0)n- en donde n es 0, 1 o 2, -O- -OP(0)(OH)0-, -OP(0)(0')0-, alcanodiilo, alquenodiilo, alquinodiilo, arenodiilo, heteroarenodiilo o una combinación de los mismos. Algunos enlazadores tienen cadenas laterales pendientes o grupos funcionales pendientes (o ambos). Los ejemplos de dichas porciones pendientes son modificadores de hidrofilicidad, por ejemplo, grupos de solubilización tipo, por ejemplo, -S03H o -S03". En algunas modalidades, un enlazador puede conectar un reportero a otra porción tal como un grupo química o enzimáticamente reactivo (por ejemplo, una porción de terminación disociable o no disociable). En otras modalidades, un enlazador conecta un reportero a un componente biológico o no biológico, por ejemplo, una nucleobase, un nucleósido o un nucleótido. En modalidades adicionales, un enlazador conecta grupos químicamente reactivos a una nucleobase, un nucleósido o un nucleótido. La porción formada por un enlazador enlazada a un reportero puede ser designada como -L-Reportero. Dependiendo de factores tales como las moléculas que serán enlazadas y las condiciones en las cuales se lleva a cabo el método de síntesis de hebra, el enlazador puede variar en longitud y composición para optimizar propiedades tales como estabilidad, longitud, eficiencia FRET, resistencia a ciertos químicos y/o parámetros de temperatura, y ser de suficiente estereoselectividad o tamaño para enlazar en forma operable una etiqueta a un nucleótido de modo que el conjugado resultante sea útil para optimizar una reacción de polimerización. Los enlazadores pueden ser empleados utilizando técnicas químicas estándar e incluir pero no limitarse a, enlazadores de amina para adherir etiquetas a nucleótidos (consultar, por ejemplo la Publicación de Hobbs and Trainor, Patente Norteamericana 5,151,507, la cual está incorporada a la presente invención como referencia); un enlazador normalmente contiene una amina primaria o secundaria para enlazar en forma operable una etiqueta a un nucleótido; y un brazo de hidrocarburo rígido agregado a una base de nucleótido (consultar, por ejemplo la Publicación de Service, 1998, la cual está incorporada a la presente invención como referencia). Algunas metodologías de enlace de ejemplo para adhesión de reporteros a moléculas de base se proporcionan en las Patentes Norteamericanas 4,439,356 y 5,188,934; Solicitud de Patente Europea 87310256.0; Solicitud Internacional PCT/US90/05565 y en la Publicación de Barone et al., 2001, cada una de las cuales está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia.

Un "enlazador que se puede descomponer" es un enlazador que tiene uno o más grupos que se pueden descomponer o que pueden romperse como resultado de una reacción o condición. El término "grupo que se puede descomponer" se refiere a una porción que permite la liberación de una porción, por ejemplo, una porción fluorogénica o fluorescente. Dicha descomposición normalmente es transmitida en forma química, fotoquímica o enzimática. Los grupos que se pueden descomponer enzimáticamente de ejemplo incluyen fosfatos, o grupos adheridos a través de un enlace de péptido.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "IC5o" se refiere pero no se limita a la concentración de un análogo de nucleótido en donde su incorporación en un complejo de cebador-plantilla produce números iguales de moles de sustrato y producto y/o pueden definirse, pero no limitarse a la eficiencia de incorporación medida determinando la concentración en la cual el compuesto se incorpora a nombre de los complejos de cebador-plantilla.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "oligonucleótido" se refiere a fragmentos de ADN de 2 a 200 nucleótidos enlazados en forma covalente.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "reportero" se refiere a una porción química que tiene la capacidad de producir una señal detectable en forma directa o indirecta. Los ejemplos de reporteros incluyen grupos de tinta fluorescentes, etiquetas radioactivas o grupos que producen una señal por medios quimioluminiscentes o bioluminiscentes. Los ejemplos de grupos de tinta fluorescente incluyen zanteno, fluoresceína , rodamina, BODIPY, cianina, coumarina, pireno, ftalocianina, ficobiliproteína , ALEXA FLUOR® 350, ALEXA FLUOR® 405, ALEXA FLUOR® 430, ALEXA FLUOR® 488, ALEXA FLUOR® 514, ALEXA FLUOR® 532, ALEXA FLUOR® 546, ALEXA FLUOR® 555, ALEXA FLUOR® 568, ALEXA FLUOR® 568, ALEXA FLUOR® 594, ALEXA FLUOR® 610, ALEXA FLUOR® 633, ALEXA FLUOR® 647, ALEXA FLUOR® 660, ALEXA FLUOR® 680, ALEXA FLUOR® 700, ALEXA FLUOR® 750, y una tinta de escuarina. Los ejemplos adicionales de grupos de tinta fluorescente que se pueden utilizar en algunas modalidades de la presente invención se describen a lo largo de la presente especificación y en la Publicación de Haugland, 2005 y en las Patentes Norteamericanas 4,439,356 y 5,188,934, las cuales están incorporadas a la presente invención como referencia. Los ejemplos de etiquetas radioactivas que se pueden utilizar como reporteros en algunas modalidades de la presente invención, son bien conocidas en la técnica, tal como 35S, 3H, 32P o 33P. Los ejemplos de reporteros que funcionan por medios quimioluminiscentes o bioluminiscentes y que se pueden utilizar como reporteros en algunas modalidades de la presente invención se describen en las Publicaciones de Nieman, 1989; Given & Schowen, 1989; Orosz et al., 1996; and Hastings, 1983, las cuales están incorporadas a la presente invención como referencia .

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "plantilla" puede referirse a un oligonucleótido que sirve como la hebra complementaria para síntesis de ADN (incorporación) o una molécula de ADN recombinante que se elabora de una región conocida, normalmente una secuencia de vector o adaptadora a la cual se puede enlazar un cebador universal, y la secuencia objetivo, la cual normalmente es una porción desconocida que será secuenciada.

El término "plantillas de fragmento" se refiere a una biblioteca de fragmentos que han sido preparadas mediante ADN genómico de corte aleatorio en pequeños tamaños de <1 kb y ligando los adaptadores a cada extremo del fragmento. Estas plantillas generalmente requieren menos ADN de lo que podría necesitarse para una biblioteca de par correspondiente.

El término "plantilla de par correspondiente" se refiere a una biblioteca genómica que se ha preparado circulando el corte del ADN fragmento que ha sido seleccionado para un tamaño determinado (los ejemplos incluyen 2 kb o 5kb o 10 kb o 20 kb o cualquier otro tamaño deseado), llevando de esta forma los extremos que estaban previamente distantes uno de los otros en proximidad cercana. El corte de estos círculos en fragmentos de ADN lineal crea plantillas de par correspondiente.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "cebador" se refiere a un oligonucleótido que se híbrida para una secuencia de complemento en la hebra de plantilla (normalmente una secuencia conocida) utilizada para iniciar la síntesis de ADN (incorporación).

Cuando en la presente invención se utiliza en el sentido científico o técnico, el término "incorporación" se refiere a un análogo de nucleótido o nucleótido que forma un par base de complemento con la hebra de plantilla y un enlace covalente a una hebra de cebador a través de una polimerasa. El complejo de cebador-plantilla se extiende una o más bases desde la hebra de cebador inicial.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "descomposición" se refiere a la eliminación del grupo de terminación mediante disociación química, disociación enzimática o similares.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "ciclo de incorporación" se refiere a la incorporación de un análogo de nucleótido o nucleótido a través de una polimerasa, la detección e identificación del análogo de nucleótido o nucleótido, y si es un análogo de nucleótido, la descomposición del grupo de terminación, y si está originalmente presente en el análogo de nucleótido, el grupo de tinta fluorescente de dicho análogo.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "falta de incorporación" se refiere a un análogo de nucleótido o nucleótido que forma un par base sin complemento con la hebra de plantilla, y un enlace covalente a un cebador a través de una polimerasa. El complejo de cebador-plantilla se extiende una o más bases desde la hebra de cebador inicial.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "discriminación" se refiere a las diferencias de concentración IC50 para falta de incorporación versus incorporación de los análogos de nucleótido o nucleótido a través de una polimerasa.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "terminación" se refiere a la incorporación de un análogo de nucleótido o nucleótido que forma un par base de complemento o sin complemento con la hebra de plantilla y un enlace covalente a un cebador a través de una polimerasa. El complejo de cebador-plantilla se extiende únicamente una base desde la hebra de cebador inicial o hebra de cebador en crecimiento para cualquier ciclo de incorporación determinado.

Los términos "porción de terminación" y "grupo de terminación" tal como se utiliza en la presente invención, son sinónimos, se refieren a un grupo químico pequeño (por ejemplo, <500 daltons, excluyendo cualquier modificación, tal como un enlazador o enlazador/tinta) que cuando se adhiere al menos a una parte de un nucleósido (por ejemplo, azúcar o nucleobase) o nucleótido (por ejemplo, azúcar, nucleobase o grupo de fosfato) confiere propiedades de terminación sustancial al nucleósido o nucleótido. En algunas modalidades, la porción de terminación se modifica en forma adicional con un enlazador y/o un enlazador adherido a una tinta. En modalidades preferidas, las propiedades de terminación de dicho grupo de terminación modificado no son sustancialmente alteradas.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "DT50" se refiere a la cantidad de tiempo requerida para disociar el 50% del análogo base incorporado en el complejo de cebador-plantilla.

El término "análogo" tal como se utiliza en la presente invención, queda entendido que es una sustancia que no comprende el mismo esqueleto de carbono básico y funcionalidad de carbono en su estructura como un "compuesto determinado", pero puede mimetizar el compuesto determinado incorporando una o más sustituciones adecuadas tal como por ejemplo, sustitución de carbono por heteroátomos.

Las definiciones anteriores superan cualquier definición en conflicto en cualquiera de las referencias que estén incorporadas a la presente invención. El hecho de que ciertos términos sean definidos, sin embargo, no deberá considerarse como que indica que cualquier término no está definido o es indefinido. Más bien, todos los términos utilizados se considera que describen la invención en términos de modo que el experto en la técnica pueda apreciar el alcance y practicar la presente invención.

V. Ejemplos Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar las modalidades preferidas de la presente invención. Los expertos en la técnica podrán apreciar que las técnicas descritas en los ejemplos que se encuentran a continuación, representan las técnicas descubiertas por el inventor para funcionar bien en la práctica de la presente invención, y por lo tanto se pueden considerar que constituyen modos preferidos para su práctica. Sin embargo, los expertos en la técnica, a la luz de la presente descripción, deben apreciar que se pueden realizar muchos cambios en las modalidades específicas que se describen y aún obtener un resultado igual o similar sin apartarse del espíritu y alcance de la presente invención.

Ejemplo 1 - Métodos y Materiales Reactivos y materiales. Todos los reactivos se compraron de fuentes comerciales y se utilizaron tal como se recibieron, a menos que se indique de otra manera.

Instrumentación espectroscópica y analítica. Se registraron los espectros H RMN, 13C RMN y 31P RMN en un espectrómetro Bruker DPX 400 tal como se describió previamente en la Publicación de Wu et al. (2007), la cual está incorporada a la presente invención como referencia. Se proporcionaron análisis de espectro de masa a través del Mass Spectrometry Laboratory (Laboratorio de Espectrometría de Masa) en el MD Anderson Cáncer Center (Houston, TX) y la Core Mass Spectrometry Facility (Instalación de Espectrometría de Masa de Núcleo) en Rice University (Houston, TX). Se llevó a cabo cristalografía rayos X a través del X-ray Diffraction Laboratory en Texas A&M University (College Station, TX). Las medidas UV/Vis se tomaron utilizando un espectrofotómetro Beckman DU-800. Se llevó a cabo cromatografía de intercambio de aniones utilizando una columna Q Sepharose FF (2.5 x 20 cm) con un gradiente lineal de bicarbonato de trietilamonio al 75% (TEAB, 0.1 M) en acetonitrilo al 25% para TEAB 75% (1.5 M) en acetonitrilo al 25% durante 240 minutos en un rango de flujo de 4.5 mL por min. Se llevó a cabo cromatografía líquido de alto desempeño de fase inversa (RP-HPLC) utilizando un Beckman System Gold equipado con un módulo de solvente 128 y un detector UV 166 o detector UV/Vis de formación de fotodiodo 168. Se llevó a cabo RP-HPLC para análogos de nucleósidos y nucleótido utilizando una columna 4.6 mm x 250 mm Aquapore OD-300 C18, con amortiguador A que contiene acetato de trietilamonio 100 mM (TEAA), pH 7.0, y amortiguador B que contiene 100 mM TEAA, pH 7.0, acetonitrilo al 70% (v/v).

Ejemplo 2 - Síntesis de alcoholes de 2-nitrobencil a- sustituidos (R/S)-1 -(2-Nitrofeni¡)-2-metil-1 -propanol: Se reportó previamente la síntesis de (R/S)-1 -(2-nitrofenil)-2-metil-1 -propanol. Ver la Publicación de Litosh et al. (2011), la cual está incorporada a la presente invención como referencia.

(R/S)-1 -(2-Nitrofenil)-2, 2-dimetil-1 -propanol: Se reportó previamente la síntesis de (R/Sj-'i -(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1 -propanol. Ver la Publicación de Litosh et al. (2011), la cual está incorporada a la presente invención como referencia.

(R/S)-1-(2, 6- Di nitrofen i l)-2-meti 1-1 -propanol: 1-yodo-2,6- (ft/S)- 1 -(2,6-dinitrofenii)- dinitrobenceno 2-me ti 1-1 -propanol Esquema S1. Síntesis de ( ?/S)-1 -(2,6-dinitrofenil)-2-metil-1 -propanol. Reactivos y condiciones: (i) PhMgBr, THF, menos 50°C; /-PrCHO, menos 50°C a temperatura ambiente, 30%.

A una solución de 1 -yodo-2,6-dinitrobenceno (Smith y Ho, 1990), la cual está incorporada a la presente invención como referencia) (1.55 g, 5.27 mmol) en THF anhidro (18 mL) en menos 50°C bajo una atmósfera de nitrógeno, se le agregó en forma de gotas bromuro de fenilmagnesio (2 M en THF, 3.2 mL, 6.4 mmol) en un rango de modo que la temperatura no excediera menos 45°C. Al término de la adición, la mezcla se agitó a menos 50°C durante cinco minutos, seguido de la adición de isobutiraldehído (0.96 mL, 1 1 mmol). La mezcla se templó gradualmente a temperatura ambiente, se extinguió con una solución NH4CI saturada (10 mL), y posteriormente se diluyó con agua (50 mL). La mezcla se extrajo con CH2CI2 (100 mL) tres veces. La fase orgánica combinada se lavó con salmuera (50 mL), se secó sobre Na2S04, se concentró al vacío, y el residuo se purificó mediante cromatografía de columna de gel de sílice para producir (ft/S)-1 -(2,6-dinitrofenil)-2 -metil-1-propanol (0.375 g, 30%) en la forma de un aceite amarillo. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 7.82 (d, 2 H, J = 8.0 Hz, Ph-H), 7.59 (t, 1 H, J = 8.0 Hz, Ph-H), 4.83 (dd, 1 H, J = 9.2 y 7.6 Hz, Ph-CH), 2.87 (d, 1 H, J = 7.6 Hz, OH), 2.19 (m, 1 H, CH), 1.12 (d, 3 H, J= 6.4 Hz, CH3), 0.76 (d, 3 H, J= 6.8 Hz, CH3).

(R/S)-1 -(4- Meto-2-nítrofen i l)-2-metil-1 -propanol 4-yodo- (R/S)-1-(4-metox¡- 3-nitroanisoi 2-nitrofenil)-2-metil- 1 -propanol Esquema S2. Síntesis de (R/S)-1 -(4-metoxi-2-nitrofen¡l)-2-metil-1 -propanol. Reactivos y condiciones: (i) PhMgCI, THF, menos 40°C; /-PrCHO, menos 40°C a temperatura ambiente, 67%.

A una solución de 4-yodo-3-nitroanisol (2.79 g, 10.0 mmol) en THF anhidro (20 mL) en menos 40°C bajo una atmósfera de nitrógeno, se le agregó en forma de gotas cloruro de fenilmagnesio (2 M en THF, 6.0 mL, 12 mmol) en un rango de modo que la temperatura no excediera menos 35°C. Al término de la adición, la mezcla se agitó en menos 40°C durante cinco minutos, seguido de la adición de isobutiraldehído (1.8 mL, 20 mmol). La mezcla se templó gradualmente a temperatura ambiente, se extinguió con una solución NH4CI saturada (5.0 mL), se diluyó con CH2CI2 (100 mL) y se lavó con agua (100 mL). La fase orgánica se separó, y la fase acuosa se extrajo con CH2CI2 (50 mL) tres veces. La fase orgánica combinada se lavó con salmuera (40 mL), se secó sobre Na2S04, se concentró in vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de columna de gel de sílice para producir (R/S)-1 -(4-metoxi-2-nitrofenil)-2-metil-1 -propanol (1.5 g, 67%) en la forma de un aceite amarillo claro. 1H R N (400 MHz, CDCI3): d 7.61 (d, 1 H, J = 8.8 Hz, Ph-H), 7.34 (d, 1 H, J = 2.8 Hz, Ph-H), 7.15 (dd, 1 H, J = 8.8 y 2.8 Hz, Ph-H), 4.92 (dd, 1 H, J = 5.6 y 3.2 Hz, Ph-CH), 2.46 (br s, 1 H, OH), 2.00 (m, 1 H, CH), 0.97 (d, 3 H, J = 6.4 Hz, CH3), 0.86 (d, 3 H, J= 6.8 Hz, CH3).

(R/S)-1 -(4-Metoxi-2-nitrofenil)-2, 2-d ¡metí 1-1 -propanol 4-yodo- {R/S)- 1-(4-metoxi- 3-nitroanisol 2-nitrofenil)- 2,2-dimetiM -propanol Esquema S3. Síntesis de (R/S)-1 -(4-metoxi-2-nitrofenil)- 2, 2-dimet¡l-1 -propanol. Reactivos y condiciones: (i) PhMgCI, THF, menos 40°C; (CH3)3CCHO, menos 40°C a temperatura ambiente, 74%.

A una solución de 4-yodo-3-nitroanisol (2.38 g, 8.50 mmol) en THF anhidro (10 mL) en menos 40°C bajo una atmósfera de nitrógeno, se agregó en forma de gotas cloruro de fenilmagnesio (2 M en THF, 4.7 mL, 9.4 mmol) en un rango de modo que la temperatura no excediera menos 35°C. Al término de la adición, la mezcla se agitó en menos 40°C durante una hora, seguido de la adición de trimetilacetaldehído (1.13 mL, 10.2 mmol). La mezcla se agitó en menos 40°C durante dos horas y posteriormente a temperatura ambiente durante otra hora. La reacción se extinguió con salmuera (100 mL), y la mezcla se extrajo con CH2CI2 (40 ml_) tres veces. La fase orgánica combinada se secó sobre Na2S04 y se concentró in vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de columna de gel de sílice para producir fR/S 1 -(4-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1 -propanol racémico (1.52 g, 74%). 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 7.67 (d, 1 H, J = 9.2 Hz, Ph-H), 7.22 (d, 1 H, J = 2.4 Hz, Ph-H), 7.12 (dd, 1 H, J= 8.8 y 2.8 Hz, Ph-H), 5.27 (d, 1 H, J= 4.0 Hz, Ph-CH), 3.86 (s, 3 H, OCH3), 2.01 (d, 1 H, J= 4.0 Hz, OH), 0.86 (s, 9 H, C(CH3)3).

(R/S)-1 -(5-Metoxi-2-nitrofenil)-2, 2-dimetil-1 -propanol y (S)-1-(5-metoxi-2-nitro-fenil)-2, 2-dimetil-1 -propanol 3- yodo- [R/S)- 1-(5-metoxi- (R^S)-1-(5-metox¡- 4- nitroanisol 2-nitrofenil)-2,2-dimetil- 2-nitrofen¡l)-2,2-dimetil- 1-propanol 1-propil (1 S)-camfanato (S)-1-(5-metox¡- (S)-1-(5-metoxi- 2-nitrofenil)-2,2-d¡metil- 2-nitrofenil)- 1-propil (IS)-camfanato 2,2-dimetil-1-propanol Esquema S4. Síntesis de ( ?/S)-1 -(5-metoxi-2-n¡trofenil)-2, 2-dimetil-1 -propanol y (S)- -(5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1 -propanol Reactivos y condiciones: (i) PhMgCI, THF anhidro, menos 40°C; (CH3)3CCHO, menos 40°C a temperatura ambiente, 88%; (ii) cloruro de ácido (1 S)-camfánico, DMAP, CH2CI2, temperatura ambiente; (///') cristalización fraccional a partir de acetato de etilo/hexano, 43%; (/V) K2C03, MeOH, reflujo, 99%.

A una solución de 3-yodo-4-nitroanisol (2.79 g, 10.0 mmol) en THF anhidro (10 mL) en menos 40°C bajo una atmósfera de nitrógeno, se le agregó en forma de gotas cloruro de fenilmagnesio (2 M en THF, 4.2 mL, 8.3 mmol) en un rango de modo que la temperatura no excediera menos 35°C. Al término de la adición, la mezcla se agitó en menos 40°C durante dos horas, seguido de la adición de trimetilacetaldehído (1.1 mL, 10 mmol). La mezcla se agitó en menos 40°C durante dos horas y posteriormente a temperatura ambiente durante otra hora. La reacción se extinguió posteriormente con salmuera (100 mL), y la mezcla se extrajo con CH2CI2 (40 mL) tres veces. La fase orgánica combinada se secó sobre Na2S04, se concentró in vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de columna de gel de sílice para producir (R/S)-'\ -(5-metox¡-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1 -propanol racémico (1.76 g, 88%). 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 7.89 (d, 1 H, J = 9.2 Hz, Ph-H), 7.27 (d, 1 H, J = 2.8 Hz, Ph-H), 6.84 (dd, 1 H, J= 8.8 y 2.8 Hz, Ph- H) , 5.62 (d, 1 H , J= 4.0 Hz, PhCH), 3.89 (s, 3 H, OCH3), 2.08 (d, 1 H, J= 4.0 Hz, OH), 0.89 (s, 9 H, C(CH3)3).

A una solución de (R/S)-1 -(5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1 -propanol racémico (1.75 g, 7.3 mmol) y DMAP (2.92 g, 23.9 mmol) en CH2CI2 anhidro (10 mL), se le agregó cloruro de ( 1 Sj-camfánico (Corrie et al, 1992), la cual está incorporada a la presente invención por referencia) (2.6 g, 12 mmol), y la mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente bajo una atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se diluyó con CH2CI2 (50 mL) y se lavó con una solución NaHC03 saturada (50 mL). La fase orgánica se secó sobre Na2S04, se concentró in vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de columna de gel de sílice para producir (1S)-camfanato de (R/S)-1 -(5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1 -propilo (2.5 g, 85%, 1:1 mezcla de diastereómeros). El camfanato se disolvió en acetato de etilo (30 mL) seguido de la adición lenta de hexano (120 mL) con agitación. Los cristales de aguja se formaron gradualmente a partir de la solución en un período de dos horas. Los cristales se recolectaron mediante filtración para producir el diastereómero simple puro (1 S)-camfanato de (S)-1-(5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propilo. El filtrado se concentró in vacuo, y el proceso de cristalización se repitió dos veces para proporcionar ( 1 S)-camfa nato de (S)-1-(5-metoxi-2-nitrofenil)-2 ,2-dimetil-1 -propilo adicional (total 1.08 g, 43%). '? RMN (400 MHz, CDCI3): d 8.04 (d, 1 H, J = 9.2 Hz, Ph-H), 7.27 (d, 1 H, J= 2.8 Hz, Ph-H), 6.88 (dd, 1 H, J= 2.8 y 8.8 Hz, Ph-H), 6.81 (3, 1 H, Ph-CH), 3.87 (s, 3 H , OCH3), 2.36 (m, 1 H, CH), 1.92 (m, 2 H , CH2), 1-66 (m, 1 H , CH), 1.12 (s, 3 H, CH3), 1.06 (s, 3 H, CH3), 1.02 (s, 3 H, CH3), 0.95 (s, 9 H, C(CH3)3).

Método para obtener datos de cristalografía de rayos X: Se tomaron medidas cristalográficas sobre un cristal de (1S)-camfanato de (S)-1 - (5-metoxi-2-nitrofenil)-2 ,2-dimetil-1 - propilo con dimensiones de 0.50 mm x 0.05 mm x 0.05 mm tal como se describe en la Publicación de Litosh et al (2011), la cual está incorporada a la presente invención como referencia. Ver la figura 3.

Recolección de datos: radiación CuKa, ? = 1.54178 Á, T = 110 ± 2°K, 20max = 120.0°, 32,513 reflexiones recolectadas, 2,913 únicas (Rin, = 0.0517). GooF Final = 1.091, R1 = 0.0681, wR2 = 0.1695, índices R basados en 2,913 reflexiones con l>2sigma(l) (refinamiento en F2), 290 parámetros, 43 restricciones. Correcciones Lp y de absorción aplicadas, µ -0.819 mm'1. Parámetro de estructura absoluto: 0.05 ± 0.09.

Datos de cristalografía de rayos X: C22H29NO7, M - 419.46. Ortorómbico, a = 6.29, b = 15.00, c = 22.27 A (a, ß, ? = 90°), V = 2,099.29 A3, grupo de espacio P2,2121, Z = 4, Dc = I .327 g/cm'3, F(000) = 896.

Una mezcla de (1 S)-camfanato de (S)-1 -(5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propilo (590 mg, 1.4 mmol) y K2CQ3 (389 mg, 2.8 mmol) en metanol (MeOH, 25 ml_) se calentó a reflujo durante una hora, posteriormente se enfrió, se concentró in vacuo, y se diluyó con CH2CI2 (50 ml_). La fase orgánica se lavó con salmuera (50 ml_), se secó sobre Na2S04, se concentró in vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de columna de gel de sílice para producir (S)-1 -(5-metoxi-2- nitrofenil)-2,2-dimetil-1 -propanol enantiopuro (333 mg, 99%). H RMN fue idéntica a la del alcohol racémico.

(R/S)-1 -(4, 5-Dimetoxi-2-nitrofenil)-2, 2-dimetil-1 -propanol 1,2-dimetox¡- 4,5-d¡yodo-1,2- 4-yodo-5-nitro- (/VS)- 1 -(4,5-dimetoxi- benceno dimetoxi- 1,2-dimetoxi- 2-nitrofen¡l)-2,2- benceno benceno dimetil-1-propanol Esquema S5. Síntesis de (R/S)-1 -(4,5-dimetoxi-2-nitrofenil)- 2, 2-dimetil-1 -propanol. Reactivos y condiciones: (/') ICI, CH3COOH, 100°C, 62%; (/ ) HNO3, CH3COOH, temperatura ambiente, 75%; (/'/'/) PhMgCI, THF, menos 40°C; (CH3)3CCHO, menos 40°C a temperatura ambiente, 20%.

Se disolvió 1 ,2-dimetoxibenceno (5.0 g, 36 mmol) en ácido acético (10 ml_), y la solución se enfrió en un baño de hielo- agua seguido de la adición en forma de gotas de cloruro de yodo (8.7 g, 54 mmol). Después de 10 minutos, la mezcla de reacción se calentó a una temperatura de 100°C durante dos horas y posteriormente se enfrió a temperatura ambiente. Los cristales de aguja que se precipitaron de la solución se filtraron y lavaron con ácido acético (5.0 mL) tres veces. Los cristales se secaron durante la noche bajo alto vacío para producir 4,5-diyodo-1 ,2-dimetoxibenceno (8.8 g, 62%). 1H R N (400 MHz, CDCI3): d 7.28 (s, 2 H, Ph-H), 3.85 (s, 6 H, OCH3).

Se agregó 4, 5-diyodo-1 ,2-dimetoxibenceno (8.8 g, 23 mmol) en ácido acético (300 mL), y la mezcla se calentó a una temperatura de 100°C para disolver el sólido. La mezcla clara se enfrió posteriormente a temperatura ambiente seguido de la adición en porciones de ácido nítrico (68-70%, 120 mL). La mezcla de reacción se agitó at temperatura ambiente durante la noche y posteriormente se vertió en hielo-agua (200 mL). La mezcla se extrajo mediante CH2CI2 (100 mL) tres veces. La fase orgánica combinada se lavó con una solución NaHC03 saturada (200 mL), salmuera (100 mL), y se secó sobre Na2S04, se concentró in vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de columna de gel de sílice para producir 4-yodo-5-nitro-1 ,2-dimetoxibenceno (5.25 g, 75%). 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 7.60 (S, 1 H, Ph-H), 7.38 (s, 1 H, Ph-H), 3.98 (s, 3 H, OCH3), 3.92 (s, 3 H, OCH3).

A una solución de 4-yodo-5-nitro-1 ,2-dimetoxibenceno (4.6 g, 15 mmol) en THF anhidro (10 mL) en menos 40°C bajo una atmósfera de nitrógeno, se le agregó en forma de gotas cloruro de fenilmagnesio (2 M en THF, 7.5 mL, 15 mmol) en un rango de modo que la temperatura no excediera menos 35°C. Al término de la adición, la mezcla se agitó en menos 40°C durante dos horas, seguido de la adición de acetaldehído de trimetilo (2.0 ml_, 18 mmol). La mezcla se agitó en menos 40°C durante dos horas y posteriormente a temperatura ambiente durante otra hora. La reacción se extinguió con salmuera (100 mL), y la mezcla se extrajo con CH2CI2 (40 mL) tres veces. La fase orgánica combinada se secó sobre Na2S04 y se concentró in vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de columna de gel de sílice para producir (R/S)-1 -(4,5-dimetoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1 -propanol racémico (0.8 g, 20%). 1H RMN (400 MHZ, CDCI3): d 7.41 (1, 1 H, Ph-H), 7.21 (s, 1 H, Ph-H), 5.60 (s, 1 H, PhCH), 3.95 (s, 3 H, OCH3), 3.92 (s, 3 H, OCH3), 0.90 (s, 9 H, (CH3)3).

Ejemplo 3 - Síntesis de Análogos de Trifosfato de 7-HOMe-7- Deaza-2'-Desoxiadenosina 7-(2-nitrobenciloxi)metil- 7-deaza-2'-desoxiadenosina-5'- tri fosfato 6 dA.I Esquema S6. Síntesis de 7-(2-nitrobenciloxi)metil-7-deaza-2'-desox¡adenosina-5'-trifosfato. Reactivos y condiciones: (i) TBSCI, imidazol, DMF, temperatura ambiente, 87%; (/'/) CO, PdCI2[PhCN]2, MeOH/1 ,4-dioxano, 50°C, 98%; (///) LiBH4, MeOH, THF, reflujo, 45%; (iv) bromuro de 2-nitrobencilo, n-Bu + NBr, CH2CI2/aq. NaOH, temperatura ambiente, 50%; (v) n-Bu4NF, THF, 0°C a temperatura ambiente; (vi) NH3, 1 ,4-dioxano/MeOH, 100°C, 91% en dos pasos; (vii) POCI3, (MeO)3PO, menos 40°C; ( 7-Bu3NH)2H2P207, n-Bu3N, DMF; 1 M HNEt3HC03.

El compuesto 1 (Seela et al. (2005), la cual está incorporada a la presente invención como referencia), (0.79 g, 2.0 mmol) se evaporó de piridina anhidro (2.0 mL) tres veces y se disolvió en DMF anhidro (4.0 mL). Se agregaron cloruro de ter-butildimetilsililo (0.90 g, 6.0 mmol) e imidazol (0.82 g, 12 mmol), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. La reacción se concentró in vacuo y purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 9-[ -D-3',5'-0-bis-(ter-butildimetilsilil)-2'-desoxiribofuranosil]-6-cloro-7-yodo-7-deazapurina 2 (1.08 g, 87%) en la forma de una espuma blanca. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 8.61 (s, 1 H, H- 2), 7.81 (s, 1 H, H-8), 6.74 (t, 1 H, J= 6.4 Hz, H-1'), 4.56 (m, 1 H, H-4'), 4.01 (m, 1 H, H-3'), 3.87 (dd, 1 H, ?-5'a), 3.79 (dd, 1 H, ?-5'b), 2.39 (m, 2 H, ?-2'a y ?-2'b), 0.96 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0.91 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0.18 (2s, 6 H, (CH3)2Si), 0.15 (s, 6 H, (CH3)2Si).

A una solución del compuesto 2 (1.55 g, 2.48 mmol) en 1,4-dioxano anhidro (42 mL) y MeOH anhidro (42 mL), se le agregó trietilamina (0.87 mL). Después de agitar durante 10 minutos bajo una atmósfera CO, se agregó bis(benzonitrilo)dicloropaladio(l I) (0.05 g, 0.13 mmol), y la reacción se agitó a una temperatura de 50°C durante 48 horas bajo una atmósfera de CO. La mezcla se concentró posteriormente in vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 9-^-D-3\5'-0-bis-(ter-butildimetilsilil)-2'-desoxiribofuranosil]-6-cloro-7-metoxicarbonil-7-deazapurina 3 (1.36 g, 98%) en la forma de un aceite viscoso. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 8.69 (s, 1 H, H-2), 8.31 (S, 1 H, H-8), 6.77 (t, 1 H, J = 6.8 Hz, H-1'), 4.58 (m, 1 H, H-4'), 4.06 (m, 1 H, H-3'), 3.90 (s, 3 H, CH30), 3.87 (dd, 1 H, H-5'a), 3.81 (dd, 1 H, ?-5'b), 2.42 (m, 2 H, ?-2'a y ?-2'b), 0.93 (s, 18 H, (CH3)3CSi), 0.13 (s, 6 H, (CH3)2Si), 0.12 (s, 6 H, (CH3)2Si).

A una solución del compuesto 3 (0.28 g, 0.50 mmol) en THF anhidro (4.0 mL), se le agregó borohidruro de litio (44 mg, 2.0 mmol), seguido de MeOH (0.1 mL). La mezcla de reacción se agitó at temperatura ambiente durante 10 minutos y posteriormente se calentó a reflujo durante 45 minutos. Al enfriarse a temperatura ambiente, la mezcla se diluyó con CH2CI2 (20 mL) y agua (2.0 mL). La capa orgánica se separó, se lavó con salmuera (5.0 mL) dos veces, se secó sobre Na2S04, y concentró in vacuo. El residuo se purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 9-[ -D-3',5'-0-bis-(rer-butildimetilsilil)-2'-desoxiribofuranosil]-6-cloro-7-hidroximetil-7-deazapurina 4 (0.12 g, 45%) como una espuma color blanco. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 8.62 (s, 1 H, H-8), 7.61 (s, 1 H, H-2), 6.75 (dd, 1 H, J = 6.0 y 7.2 Hz, H-l '), 4.96 (AB d, 1 H, J= 1 1.6 Hz, 7-CH2a), 4.91 (AB d, 1 H, J= 11.6 Hz, 7-CH2b), 4.57 (m, 1 H, H-4'), 4.00 (m, 1 H, H-3'), 3.80 (m, 2 H, ?-5'a y ?-5'b), 2.44 (m, 1 H, ?-2'a), 2.04 (m, 1 H, ?-2'b), 0.91 (2 s, 18 H, (CH3)3CSi), 0.11 (2 s, 12 H, (CH3)2Si).

A una solución del compuesto 4 (30 mg, 0.057 mmol) en CH2CI2 (2.0 ml_), se le agregaron n-Bu4NBr (9 mg, 0.029 mmol), bromuro de 2-nitrobencilo (37 mg, 0.17 mmol) y una solución NaOH (1 M, 2.0 ml_). La mezcla de reacción se agitó vigorosamente a temperatura ambiente durante 48 horas en la oscuridad. La capa orgánica se separó, se secó sobre Na2S04, se concentró in vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 9-[ 3-D-3',5'-0-bis-(ter-butildimetilsilil)-2'-desoxiribofuranosil]-6-cloro-7-(2-nitrobenciloxi)metil-7-deazapurina 5 (19 mg, 50%) en la forma de un aceite viscoso. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 8.63 (s, 1 H, H-2), 8.06 (dd, 1 H, J= 8.4 y 1.2 Hz, Ph-H), 7.84 (d, 1 H, J = 7.6 Hz, Ph-H), 7.64 (s, 1 H, H-8), 7.62 (m, 1 H, Ph-H), 7.43 (t, 1 H, Ph-H), 6.75 (dd, 1 H, J = 7.2 y 6.0 Hz, H-l '), 5.03 (s, 2 H, PhCH2), 4.95 (AB d, 1 H, J= 12.0 Hz, 7-CH2a), 4.88 (AB d, 1 H, J= 12.0 Hz, 7-CH2b), 4.59 (m, 1 H, H-4'), 4.00 (m, 1 H, H-3"), 3.80 (m, 2 H, ?-5'a y ?-5'b), 2.48 (m, 1 H, ?-2'a), 2.37 (m, 1 H, ?-2'b), 0.92 (2 s, 18 H, (CH3)3CSi), 0.1 1 (s, 6 H, (CH3)2Si), 0.10 (s, 6 H, (CH3)2Si).

Una solución de r?-Bu4NF (17 mg, 0.054 mmol) en THF (1.0 mL) se agregó a una solución del compuesto 5 (18 mg, 0.028 mmol) en THF (1.0 mL) a una temperatura de 0°C. La mezcla de reacción se templó gradualmente a temperatura ambiente y se agitó durante dos horas. La mezcla se concentró in vacuo, se disolvió en 1,4-dioxano (2.0 mL), seguido de la adición de NH3 en una solución MeOH (7 M, 4.0 mL). La mezcla se transfirió en un tubo sellado y se agitó a una temperatura de 100°C durante 16 horas, posteriormente se enfrió a temperatura ambiente, se concentró in vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 7-(2-nitrobenciloxi)metil-7-deaza-2'-desoxiadenosina 6 (10 mg, 91%) en la forma de una espuma blanca. 1H RMN (400 MHz, DMSO-de): d 8.08 (s, 1 H, H-2), 8.06 (m, 1 H, Ph-H), 7.75 (m, 2 H, Ph-H), 7.58 (m, 1 H, Ph-H), 7.42 (s, 1 H, H-8), 6.64 (bs, 2 H, D20 intercambiable, 6-NH2), 6.48 (dd, 1 H, J= 2.0 y 6.0 Hz, H-1'), 5.25 (d, 1 H, J = 4.0 Hz, D20 intercambiable, 3'-OH), 5.08 (t, 1 H, J = 5.6 Hz, D20 intercambiable, 5'-OH), 4.90 (s, 2 H, PhCH2), 4.75 (AB dd, 2 H, 7-CH2), 4.33 (m, 1 H, H-3'), 3.81 (m, 1 H, H-4'), 3.54 (m, 2 H, ?-5'a y ?-5'b), 2.47 (m, 1 H, ?-2'a), 2.15 (m, 1 H, ?-2'b).

Se fosforiló el compuesto 6 (6 mg, 0.014 mmol) con POCI3 (2.6 µ?, 0.028 mmol) en esponja de protones (6 mg, 0.028 mmol) en trimetilfosfato (0.25 mL) en menos 40°C durante cuatro horas bajo una atmósfera de nitrógeno. Se agregó una solución de pirofosfato de bis-tri-n-butilamonio (66 mg, 0.14 mmol) y tri-n-butilamina (28 µ?) en DMF anhidro (0.28 mL). Después de 30 minutos de agitación, se agregó amortiguador de bicarbonato de trietilamonio (1 M, pH 7.5; 1.0 mL). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante una hora y posteriormente se concentró in vacuo. El residuo se disolvió en agua (2.0 mL), se filtró, y purificó utilizando RP-HPLC (ver anteriormente) para producir 7-(2-nitro-benciloxi)metil-7-deaza-2'-desoxiadenosina- 5'-trifosfato dA.I. HRMS (ESI): Para el ion molecular CigHasNgC sPs [M-H]', la masa calculada fue de 654.0403, y la masa observada fue de 654.0397. 7-[ 1-(2-nitrofenil)-2-metil-propilox¡] metil- 7-deaz a-2'- d esox i a de nosin a -5' -trifosfato dA.lll.a Esquema S7. Síntesis de 7-[1 -(2-nitrofenil)-2-metil- propiloxi]metil-7-deaza-2'-desoxiadenosina-5'-trifosfato Reactivos y condiciones: (i) TsCI, DMAP, CH2CI2, temperatura ambiente, 39%; (/'/) (/?/S)-(2-nitrofenil)-2-metil-propanol racémico, puro, 105°C, 54%; ( /) n-Bu4NF, THF, 0°C a temperatura ambiente; (vi) NH3, 1 ,4-dioxano/MeOH , 100°C, 76% en dos pasos; (v) POCI3, (MeO)3PO, menos 40°C a 0°C; (n- Bu3NH)2H2P207, n-BusN, DMF; 1 M H Et3HC03.

A una solución del compuesto 4 (0.26 g, 0.49 mmol) en CH2CI2 anhidro (12 ml_), se le agregaron 4-dimetilaminopiridina (DMAP; 0.15 g, 1.2 mmol) y cloruro de tosilo (0.11 g, 0.58 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas y posteriormente se concentró in vacuo. El residuo se purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 9-[ß-?-3' ,5'-0-bis-(ter-butildimetilsilil)-2'-desoxiribofuranosil]-6-cloro-7-clorometil-7-deazapurina 7 (0.103 g, 39%) como un aceite viscoso. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 8.64 (s, 1 H, H-2), 7.72 (s, 1 H, H-8), 6.73 (t, 1 H, J = 6.8 Hz, H-1'), 4.95 (AB d, J = 12.4 Hz, 7-CH2a), 4.91 (AB d, J= 12.0 Hz, 7-CH2b), 4.58 (m, 1 H, H-3'), 4.00 (m, 1 H, H-4'), 3.82 (m, 2 H, ?-5'a y ?-5'b), 2.41 (m, 2 H, ?-2'a y ?-2'b), 0.95 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0.93 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0.12 (s, 6 H, (CH3)2Si), 0.11 (s, 6 H, (CH3)2Si).

El compuesto 7 (54 mg, 0.10 mmol) y (R/S)-A-(2-nitrofenil)-2-metil-propanol racémico (191 mg, 0.98 mmol) se disolvieron en CH2CI2 anhidro (10 ml_). El solvente se eliminó in vacuo, y el residuo se calentó durante una hora bajo una atmósfera de nitrógeno, posteriormente se disolvió en una cantidad mínima de acetato de etilo y se purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 9-[ -D-3',5'-0-bis-(íer-butildimetilsilil)-2'-desoxiribofuranosil]-6-cloro-7-[1-(2-nitro-fenil)-2-metil-propiloxi]metil-7-deazapurina 8 (38 mg, 54%) como una mezcla 1:1 de los dos diastereómeros. 1H RMN (400 MHz, CDCIs) para diastereómeros: d 8.60 y 8.59 (2 s, 1 H, H-2), 7.83 (m, 1 H, Ph-H), 7.79 (m, 1 H, Ph-H), 7.56 (m, 1 H, Ph-H), 7.48 y 7.47 (2 s, 1 H, H-8), 7.38 (m, 1 H, Ph-H) , 6.70 (m, 1 H, H-1'), 4.81 (m, 1 H, Ph-CH), 4.70 (m, 1H, 7-CH2a), 4.58 (m, 2 H, 7-CH2b y H-3 ), 3.99 (m, 1 H, H-4'), 3.78 (m, 2 H, ?-5'a y H-5'b). 2.48 (m, 1 H, ?-2'a), 2.35 (m, 1 H, ?-2'b), 1.96 (m, 1 H, CH), 0.98 y 0.96 (2 d, 3 H, CH3), 0.93 (2 s, 9 H, (CH3)3CSi), 0.89 (2 s, 9 H, (CH3)3CSi), 0.82 y 0.78 (2 d, 3 H, CH3), 0.12 (2 s, 6 H, (CH3)2Si), 0.08 y 0.07 (2 s, 3 H, (CH3)2Si), 0.06 y 0.05 (2 s, 3 H, (CH3)2Si).

Una solución de n-BU4NF (44 mg, 0.14 mmol) en THF (2.0 ml_) se agregó a una solución del compuesto 8 (38 mg, 0.05 mmol) en THF (2.0 ml_) a una temperatura de 0°C. La reacción se templó gradualmente a temperatura ambiente y se agitó durante dos horas. La mezcla se concentró ¡n vacuo, se disolvió en 1,4-dioxano (4.0 mL), seguido de la adición de NH3 en una solución MeOH (7 M, 8.0 mL). La mezcla se transfirió a un tubo sellado, se agitó a una temperatura de 100°C durante 24 horas, se enfrió a temperatura ambiente, y posteriormente se concentró ¡n vacuo. El residuo se purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 7-[1 -(2-nitrofenil)-2-metil-propiloxi]metil-7-deaza-2'-desoxiadenosina 9 (19 mg, 76%) en la forma de una mezcla 1:1 de dos diastereómeros.1 H RMN (400 MHz, DMSO-d6) para diastereómeros: d 8.06 y 8.04 (2 s, 1 H, H-2), 7.90 (m, 1 H, Ph-H), 7.67 (m, 2 H, Ph-H), 7.56 (m, 2 H , Ph-H), 7.19 y 7.16 (2 s, 1 H , H-8), 6.63 (bs, 2 H, D20 intercambiable, 6-NH2), 6.39 (m, 1 H, H-1'), 5.23 (m, 1 H, D20 intercambiable, 3'-OH), 5.00 (m, 1 H, D20 intercambiable, 5'-OH), 4.72 (2 d, 1 H, Ph-CH), 4.45 (s, 2 H, 7-CH2), 4.30 (m, 1 H, H-3'), 3.77 (m, 1 H , H-4'), 3.49 (m, 2 H, ?-5'a y ?-5'b), 2.40 (m, 1 H, ?-2'a), 2.12 (m, 1 H, ?-2'b), 1.94 (m, 1 H, CH), 0.87 (m, 3 H, CH3), 0.74 (m, 3 H, CH3).

Se fosforiló el compuesto 9 (19 mg, 0.041 mmol) con POCI3 (16 µ?, 0.16 mmol) y una esponja de protones (18 mg, 0.082 mmol) en trimetilfosfato (0.4 mL) en menos 40°C durante cinco horas bajo una atmósfera de nitrógeno. Se agregó una solución de pirofosfato de bis-tri-n-butilamonio (97 mg, 0.20 mmol) y tri-n-butilamina (40 pL) en DMF anhidro (0.40 mL). Después de 30 minutos de agitación, se agregó un amortiguador de bicarbonato de trietilamonio (1 M, pH 7.5; 10 mL). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante una hora y posteriormente se concentró in vacuo. El residuo se disolvió en agua (5.0 mL), se filtró, y purificó mediante cromatografía de intercambio de aniones. Las fracciones que contienen trifosfato se combinaron y liofilizaron para producir 7-[1 -(2-nitrofenil)-2-metil-propiloxi]metil-7-deaza-2'-desoxiadenosina-5' -trifosfato dA.lll.a en la forma de una mezcla 1:1 de dos diastereómeros, los cuales se separaron utilizando RP-HPLC para producir los diastereómeros simples dA.lll.a ds1 y dA.lll.a ds2. En todos los casos, el diastereómero (ds1) se eluyó más rápido que el diastereómero 2 (ds2) mediante RP-HPLC. HRMS (ESI): Para el ión molecular C22H29N50 5P3 [M-H]~, la masa calculada fue de 696.0873, y la masa observada fue de 696.0864. 7-[1-(4-Metoxi-2-nitrofenil)-2-metil-propiloxi]metil-7-deaza-2'-desoxiadenosina-5'-tri fosfato dA.lll.b Esquema S8. Síntesis de 7-[1 -(4-metoxi-2-nitrofenil)-2-metil-propiloxi]metil-7-deaza-2'-desoxiadenosina-5' -trifosfato Reactivos y condiciones: (i) (R/S)-1-(4-metoxi-2-nitrofenil)-2-metil-1 -propanol racémico, 108°C; (//') n-Bu4NF, THF, 0°C a temperatura ambiente; (//'/') NH3, 1 ,4-dioxano/MeOH, 100°C, 32% en tres pasos; (iv) POCI3, (MeO)3PO, 0°C; (n-BusNH HaPaOy, n-Bu3N, DMF; 1 M HNEt3HC03.

El compuesto 7 (103 mg, 0.19 mmol) y (R/S)-1 -(4-metox¡-2-nitrofenil)-2-metil-1 -propanol racémico (428 mg, 1.9 mmol) se disolvieron en CH2CI2 anhidro (3.0 ml_). El solvente se eliminó in vacuo, y el residuo se calentó a una temperatura de 108°C durante 30 minutos bajo una atmósfera de nitrógeno, se enfrió a temperatura ambiente, se disolvió en una cantidad mínima de acetato de etilo, y purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 2'-desoxiribonucleósidos de 6-cloro-7-[1 -(4-metoxi-2-nitrofenil)-2-metil-propiloxi]metil-7-deazapurina 10. La muestra se disolvió en THF (8.0 ml_), se enfrió a una temperatura de 0°C, y posteriormente se agregó a una solución de n-Bu4NF (68 mg, 0.22 mmol) en THF (2.0 mL). La reacción se templó gradualmente a temperatura ambiente y se agitó durante 30 minutos. La mezcla se concentró in vacuo, se disolvió en 1,4-dioxano (8.0 mL), seguido de la adición de NH3 en MeOH (7 N, 24 mL). La mezcla se transfirió a un tubo sellado y se agitó a una temperatura de 100°C durante 16 horas, posteriormente se enfrió a temperatura ambiente, y se concentró in vacuo. El residuo se purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 7-[1-(4-metoxi-2-nitrofenil)-2-metil-propiloxi]metil-7-deaza-2'-desoxiadenosina 11 (30 mg, 32% en tres pasos) en la forma de una mezcla 1:1 de dos diastereómeros. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) para diastereómeros: d 8.06 y 8.05 (2 s, 1 H, H- 2), 7.57 y 7.54 (2 d, 1 H, J = 8.8 Hz, Ph-H), 7.47 y 7.44 (2 d, 1 H, J = 2.6 Hz, Ph-H), 7.33 y 7.27 (2 dd, J= 8.8 y 2.6 Hz, 1 H, Ph-H), 7.18 y 7.15 (2 s, 1 H, H-8), 6.63 (bs, 2 H, D20 intercambiable, 6-NH2), 6.43 (m, 1 H, H-1*), 5.24 (m, 1 H, D20 intercambiable, 3'-0H), 5.03 (m, 1 H, D20 intercambiable, 5'-OH), 4.55 (m, 2 H, Ph-CH, 7-CH2a), 4.30 (m, 2 H, 7-CH2b y H-3'), 3.86 y 3.84 (2 s, 3 H, MeO), 3.78 (m, 1 H, H-4'), 3.48 (m, 2 H, H-5'), 2.45 (m, 1 H, ?-2'a), 2.12 (m, 1 H, ?-2'b), 1.93 (m, 1 H, CH(CH3)2), 0.88 (m, 3 H, CH3), 0.74 y 0.71 (2 d, J = 6.8 Hz, 3 H, CH3).

Se fosforiló el compuesto 11 (28 mg, 0.06 mmol) con POCI3 (11 µ?, 0.12 mmol) y esponja de protones (25 mg, 0.12 mmol) en trimetilfosfato (0.35 ml_) a una temperatura de 0°C durante dos horas bajo una atmósfera de nitrógeno. Una solución de pirofosfato de bis-tri-n-butilamonio (237 mg, 0.50 mmol) y tri-n-butilamina (100 µ en DMF anhidro (1.0 ml_). Después de 10 minutos de agitación, se agregó amortiguador de bicarbonato de trietilamonio (1 M, pH 7.5; 10 ml_). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante una hora y posteriormente se concentró in vacuo. El residuo se disolvió en 20% de acetonitrilo acuoso (10 ml_), se filtró, y purificó mediante cromatografía de intercambio de anión. Las fracciones que contienen el trifosfato se combinaron y liofilizaron para producir 7-[1-(4-metoxi-2-nitrofenil)-2-metil-propiloxi]metil-7-deaza-2'-desoxiadenosina-5'-trifosfato dA.lll.b en la forma de una mezcla 1:1 de dos diastereomeros, los cuales se separaron utilizando RP-HPLC para producir los diastereomeros simples dA.lll.b ds1 y dA.lll.b ds2. HRMS (ESI): Para el ión molecular C23H31N50116P3 [M-H]", la masa calculada fue de 726.0979, y la masa observada fue de 726.0984. 7-[ 1-(2, 6-DinitrofenH)-2-tnetil-propHoxi]met¡l- 7-deaza-2'-desoxiadenosina-5' -trifosfato dA.lll.c Esquema S9. Síntesis de 7-[1 -(2,6-dinitrofenil)-2-metil-propiloxi]metil-7-deaza-2'-desoxi-adenosina-5'-trifosfato.

Reactivos y condiciones: (i) (R/S)-1 -(2,6-dinitrofenil)-2-metil-1-propanol racémico, 108°C; (//) n-Bu NF, THF, 0°C a temperatura ambiente; (//'/') NH3, 1 ,4-dioxano/MeOH , 100°C, 38% para tres pasos; (vi) POCI3, (MeO)3PO, 0°C; (f)-Bu3NH)2H2P207l n-Bu3N, DMF; 1 M H Et3HC03.

Se disolvieron el compuesto 7 (109 mg, 0.20 mmol) y (R/S)-1 -(2, 6-dinitrofenil)-2-metil-1 -propanol racémico (448 mg, 1.9 mmol) en CH2CI2 anhidro (10 ml_). El solvente se eliminó in vacuo, y el residuo se calentó a una temperatura de 108°C durante 30 minutos bajo una atmósfera de nitrógeno, posteriormente se disolvió en una cantidad mínima de acetato de etilo y se purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 6-cloro-7-[1 -(2,6-dinitrofenil)-2-metil-propiloxi]metil-7-deazapurina-2'-desoxiribo-nucleósidos 12. La muestra se disolvió en THF (5.0 mL), se enfrió a una temperatura de 0°C, y posteriormente se agregó a una solución de n-BU4NF (31 mg, 0.10 mmol) en THF (2.0 mL). La reacción se templó gradualmente a temperatura ambiente y se agitó durante dos horas. La mezcla se concentró in vacuo, se disolvió en 1,4-dioxano (4.0 mL), seguido de la adición de NH3 en MeOH (7 N, 18 mL). La mezcla se transfirió a un tubo sellado, se agitó a una temperatura de 100°C durante 36 horas, se enfrió a temperatura ambiente, y posteriormente se concentró in vacuo. El residuo se purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 7-[1-(2,6-dinitrofenil)-2-metil-propiloxi]metil-7-deaza-2'-desoxiadenosina 13 (38 mg, 38% en tres pasos) en la forma de una mezcla 1:1 de dos diastereómeros. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) para diastereómeros: d 8.17 (m, 1 ?, Ph-H), 8.07 y 8.06 (2 s, 1 H, H-2), 7.85 (m, 1 H, Ph-H), 7.69 (m, 1 H, Ph-H), 7.20 y 7.18 (2 s, 1 H, H-8), 6.57 (bs, 2 H, D20 intercambiable, 6-NH2), 6.46 (m, 1 H, H-1'), 5.26 (d, J = 3.6 Hz, 1 H, D20 intercambiable, 3'-OH), 5.01 (m, 1 H, D20 intercambiable, 5'-OH), 4.60 (m, 2 H, Ph-CH y 7-CH2a), 4.29 (m, 1 H, 7-CH2b), 4.13 (m, 1 H, H-3'), 3.80 (m, 1 H, H-4'), 3.51 (m, 2 H, ?-5'a y ?-5'b), 2.49 (m, 1 H, CH(CH3)3), 2.16 (m, 2 H, H-2'a y H-2*b), 0.91 (m, 3 H, CH3), 0.65 (m, 3 H, CH3). ToF-MS (ESI): Para el ion molecular C22H27N608[M + H]\ la masa calculada fue de 503.1890, y la masa observada fue de 503.2029.

Se fosforiló el compuesto 13 (30 mg, 0.06 mmol) con POCI3 (17 µ?_, 0.18 mmol) y una esponja de protones (26 mg, 0.12 mmol) en trimetilfosfato (0.4 mL) a una temperatura de 0°C durante cuatro horas bajo una atmósfera de nitrógeno. Se agregó una solución de pirofosfato de bis-tri-n-butilamonio (285 mg, 0.6 mmol) y tri-n-butilamina (120 µ?_) en DMF anhidro (1.2 mL). Después de 30 minutos de agitación, se agregó un amortiguador de bicarbonato de trietilamonio (1 M, pH 7.5; 10 mL). La reacción se agitó durante una hora a temperatura ambiente y posteriormente se concentró in vacuo. El residuo se disolvió en 20% de acetonitrilo acuoso (10 mL), se filtró, y purificó mediante cromatografía de intercambio de aniones. Las fracciones que contienen el trifosfato se combinaron y Mofilizaron para producir 7-[1 -(2,6-dinitrofenil)-2-metil-propiloxi]metil-7-deaza-2'-desoxiadenos¡na-5'-tr¡ fosfato dA.lll.c en la forma de una mezcla 1:1 de dos diastereómeros los cuales se separaron utilizando RP-HPLC para producir los diastereómeros simples dA.lll.c ds1 y dA.lll.c ds2. HRMS (ESI): Para el ión molecular C22H28N6017P3 [M-H]\ la masa calculada fue 741.0724, y la masa observada fue de 741.0731. 7-[(S)-1 -(2-Nitrofenil)-2, 2-dimetil-propi¡oxi]metil-7-deaza-2'-desoxiadenosina-5'-tri fosfato Esquema S10. Síntesis de 7-[(S)-1 -(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propiloxi]metil-7-deaza-2'-desoxiadenosina-5' -trifosfato.

Reactivos y condiciones: (i) (S)-1-(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propanol, 110°C; (//) n-Bu4NF, THF, temperatura ambiente; 75% en dos pasos; (//'/') NH3, 1 ,4-dioxano/MeOH , 100°C, 93%; (/V) POCI3, (MeO)3PO, 0°C; (n-Bu3NH)2H2P207, n-Bu3N, DMF; 1 M HNEt3HC03.

Se calentaron el compuesto 7 (130 mg, 0.24 mmol) y (S)-1-(2-n¡trofen¡l)-2,2-dimet¡l-1 -propanol (290 mg, 1.4 mmol) a una temperatura de 110°C durante 45 minutos bajo una atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se disolvió en THF (10 mL) seguido de la adición de /1-BU4NF (189 mg, 0.60 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante dos horas y posteriormente se concentró in vacuo. El residuo se disolvió en CH2CI2 (20 mL) y se lavó con salmuera (30 mL), y la fase acuosa se extrajo con CH2CI2 (20 mL) dos veces. La fase orgánica combinada se secó sobre Na2S04, se concentró in vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 6-cloro-9-[ -D-2'-desoxiribofuranosil]-7-[(S)-1-(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propiloxi]metil-7-deazapurina 14 (90 mg, 75%). 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 8.51 (s, 1 H, H-2), 7.68 (m, 2 H, Ph-H), 7.45 (t, 1 H, J = 7.2 Hz, Ph-H), 7.38 (s, 1 H, H-8), 7.29 (t, 1 H, J= 7.2 Hz, Ph-H), 6.39 (dd, 1 H, J= 6.0 y 8.0 Hz, H-1'), 4.97 (s, 1 H, Ph-CH), 4.70 (m, 3 H, 7-CH2 y H-3'), 4.16 (m, 1 H, H-4'), 3.83 (m, 2 H, H-5'), 2.80 (m, 1 H, ?-2'a), 2.35 (m, 1 H, ?-2'b), 0.82 (s, 9 H, C(CH3)3).

Se disolvió el compuesto 14 (90 mg, 0.18 mmol) en 1,4-dioxano (8.0 mL) seguido de la adición de NH3 en MeOH (7 N, 16 ml_). La mezcla se transfirió a un tubo sellado y se agitó a una temperatura de 100°C durante 24 horas, se enfrió a temperatura ambiente, y posteriormente se concentró in vacuo. El residuo se purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 7-[(S)-1 -(2-nitrofenil)-2 ,2-dimetil-propiloxi]metil-7-deaza-2'-desoxiadenosina 15 (80 mg, 93%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-de): d 8.09 (s, 1 H, H-2), 7.91 (dd, 1 H, J = 1.2 y 8.0 Hz, Ph-H), 7.71 (m, 2 H, Ph-H), 7.58 (m, 1 H, Ph-H), 7.24 (s, 1 H, H-8), 6.68 (bs, 2 H, D20 intercambiable, 6-NH2), 6.46 (dd, 1 H, J = 6.0 y 8.0 Hz, H-1'), 5.27 (d, 1 H, D20 intercambiable, 3'-OH), 5.06 (t, 1 H, D20 intercambiable, 5'-OH), 4.87 (s, 1 H, Ph-CH), 4.65 (d, 1 H, J= 12.8 Hz, 7-CH2a), 4.49 (m, 1 H, H-3'), 4.36 (d, 1 H, 7-CH2b), 3.80 (m, 1 H, H-4'), 3.49 (m, 2 H, H-5'), 2.45 (m, 1 H, ?-2'a), 2.17 (m, 1 H, ?-2'b), 0.75 (s, 9 H, C(CH3)3).

Se fosforiló el compuesto 15 (25 mg, 0.053 mmol) con POCI3 (22 ?, 0.24 mmol) y esponja de protones (23 mg, 0.11 mmol) en trimetilfosfato (0.35 ml_) a una temperatura de 0°C durante 4.5 horas bajo una atmósfera de nitrógeno. Se agregó una solución de pirofosfato de bis-tri-n-butilamonio (237 mg, 0.50 mmol) y tri-n-butilamina (100 µ?_) en DMF anhidro (1.0 ml_). Después de 10 minutos de agitación, se agregó amortiguador de bicarbonato de trietilamonio (1 M, pH 7.5; 10 ml_). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante una hora y posteriormente se concentró in vacuo. El residuo se disolvió en 20% de acetonitrilo acuoso (20 ml_), se filtró, y purificó mediante cromatografía de intercambio de aniones. Las fracciones que contienen trifosfato se combinaron y liofilizaron para producir 7-[(S)-1-(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propiloxi]metil-7-deaza-2'-desoxiadenosina-5'-trifosfato dA.V, el cual se purificó en forma adicional utilizando RP-HPLC. HRMS (ESI): Para el ión molecular C23H31 N5013P3 [M-H]", la masa calculada fue 710.1029, y la masa observada fue de 710.1032. 7-[(S)-1-(5-Metoxi-2-nitrofenil)-2, 2-dimetil-propiloxi]metil-7-deaza-2'-desoxi adenosina- 5' -trifosfato dA.VI Esquema S11. Síntesis de 7-[(S)-1 -(5-metox¡-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propiloxi]metil-7-deaza-2'-desoxiadenosina-5'-trifosfato. Reactivos y condiciones: (i) (S)-1 -(5-metoxi-2- nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propanol, 110°C; (ii) n-Bu4NF, THF, temperatura ambiente; 78% en dos pasos; ( //') NH3, 1,4-dioxano/MeOH, 100°C, 74%; (/V) POCI3, (MeO)3PO, 0°C; (n-Bu3NH)2H2P207, A?-BU3N, DMF; 1 M HNEt3HC03.

Se calentaron el compuesto 7 (165 mg, 0.30 mmol) y (S)- 1-(5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1 -propanol (330 mg, 1.4 mmol) a una temperatura de 110°C durante 45 minutos bajo una atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se disolvió en THF (10 mL), seguido de la adición de n-Bu NF (236 mg, 0.75 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante dos horas y posteriormente se concentró in vacuo. El residuo se disolvió en CH2CI2 (40 mL) y se lavó con salmuera (50 mL), y la fase acuosa se extrajo con CH2CI2 (40 mL) dos veces. La fase orgánica combinada se secó sobre Na2S04, se concentró in vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 6-cloro-9-[p-D-2'-desoxiribofuranosil]-7-[(S)-1 -(5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propiloxi]metil-7-deazapurina 16 (122 mg, 78%). 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 8.55 (s, 1 H, H-2), 7.79 (d, 1 H, J= 9.2 Hz, Ph-H), 7.35 (s, 1 H, H-8), 7.15 (d, 1 H, J= 3.2 Hz, Ph-H), 6.68 (dd, 1 H, J = 3.2 y 9.2 Hz, Ph-H), 6.33 (dd, 1 H, J = 5.6 y 8.8 Hz, H-1'), 5.26 (s, 1 H, Ph-CH), 4.85 (d, 1 H, J = 8.8 Hz, 7-CH2a), 4.75 (m, 1 H, H-3'), 4.70 (d, 1 H, J = 8.8 Hz, 7-CH2b), 4.13 (m, 1 H, H-4'), 3.95 (m, 1 H, ?-5'a), 3.83 (s, 3 H, OCH3), 3.78 (m, 1 H, ?-5'b), 2.86 (m, 1 H, ?-2'a), 2.30 (m, 1 H, ?-2'b), 0.83 (s, 9 H , C(CH3)3).

Se disolvió el compuesto 16 (120 mg, 0.23 mmol) en 1,4-dioxano (10 mL) seguido de la adición de NH3 en MeOH (7 N, 10 mL). La mezcla se transfirió a un tubo sellado y se agitó a una temperatura de 100°C durante 24 horas, posteriormente se enfrió a temperatura ambiente, se concentró in vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 7-[(s)-1 - (5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propiloxi]metil-7-deaza-2'-desoxiadenosina 17 (87 mg, 74%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 8.06 (s, 1 H, H-2), 7.97 (d, 1 H, J = 9.2 Hz, Ph-H), 7.22 (s, 1 H, H-8), 7.08 (d, 1 H, J= 2.8 Hz, Ph-H), 7.05 (dd, 1 H, J= 2.8 y 9.2 Hz, Ph-H), 6.66 (bs, 2 H, D20 intercambiable, 6-NH2), 6.42 (dd, 1 H, J = 6.0 y 8.0 Hz, H-1'), 5.25 (d, 1 H, D20 intercambiable, 3'-OH), 5.15 (s, 1 H, Ph-CH), 5.03 (t, 1 H, D20 intercambiable, 5'-OH), 4.64 (d, 1 H, J = 12.8 Hz, 7-CH2a), 4.43 (d, 1 H, J = 12.8 Hz, 7-CH2b), 4.30 (m, 1 H, H-3'), 3.84 (s, 3 H, OCH3), 3.77 (m, 1 H, H-4'), 3.45 (m, 2 H, H-5'), 2.43 (m, 1 H, ?-2'a), 2.14 (m, 1 H, ?-2'b), 0.75 (s, 9 H, C(CH3)3).

Se fosforiló el compuesto 17 (21 mg, 0.042 mmol) con POCI3 (40 µ?, 0.43 mmol) y una esponja de protones (18 mg, 0.084 mmol) en trimetilfosfato (0.35 mL) a una temperatura de 0°C durante 7.5 horas bajo una atmósfera de nitrógeno. Se agregó una solución de pirofosfato de bis-tri-7-butilamonio (237 mg, 0.50 mmol) y tri-n-butilamina (100 µ? en DMF anhidro (1.0 ml_). Después de 10 minutos de agitación, se agregó amortiguador de bicarbonato de trietilamonio (0.1 , pH 7.5; 10 ml_). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante una hora y posteriormente se concentró ¡n vacuo. El residuo se disolvió en acetonitrilo acuoso al 20% (20 mL), se filtró, y purificó mediante cromatografía de intercambio de aniones. Las fracciones que contienen el trifosfato se combinaron y liofilizaron para producir 7-[( S)-1 -(5-metoxi-2-nitrofenil)-2 ,2-dimetil-propiloxi]metil-7-deaza-2'-desoxiadenosina-5' -trifosfato dA.VI, el cual se purificó en forma adicional utilizando RP-HPLC. HRMS (ESI): Para el ión molecular [M-H]\ la masa calculada fue 740.1 135, y la masa observada fue de 740.1156.

Ejemplo 4 - Síntesis de Análogos de Trifosfato de 7-HOMe-7-0eaza-2'-desoxiguanosina 7-(2-nitrobencilox¡)metil- 7-deaza-2'-de$oxiguanosina-5'- tri fosfato dG.I Esquema S12. Síntesis de 7-(2-nitrobenciloxi)metil-7-deaza- 2'-desoxiguanosina-5'-tri fosfato. Reactivos y condiciones: (i) TBSCI, imidazol, DMF, temperatura ambiente, 60%; (//') CO, PdCI2[PhCN]2) MeOH/1 ,4-dioxano, 50°C, 91%; (/'/'/) LiBH4, MeOH, THF, reflujo, 54%; (/V) bromuro de 2-nitrobencilo, n-Bu NBr, CH2CI2/aq. NaOH, temperatura ambiente, 48%; (v) n-Bu4NF, THF, 0°C a temperatura ambiente, 95%; (vi) DABCO, H20, reflujo, 30%; (vH) POCI3, esponja de protones, (MeO)3PO, 0°C; (n-Bu3NH)2H2P207l n-Bu3N, DMF; 1 M HNEt3HC03.

El compuesto 18 (Seela y Peng, 2005, la cual está incorporada a la presente invención como referencia) (1.35 g, 3.29 mmol) se evaporó a partir de piridina anhidro (3.0 mL) tres veces y posteriormente se disolvió en DMF anhidro (6.0 mL). Se agregaron cloruro de ter-butildimetilsililo (5.95 g, 39.5 mmol) e imidazol (5.37 g, 78.9 mmol) y la mezcla se agitó a una temperatura de 50°C durante 48 horas con cloruro de ter-butildimetilsililo adicional (2.97 g, 19.7 mmol) e imidazol (2.69 g, 39.4 mmol) siendo agregado cada seis horas. La mezcla de reacción se concentró in vacuo y se purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 9-|^-D-3',5'-0-bis-(ter-butildimetilsilil)-2'-desoxiribofuranosil]-2-(fer-butildimetilsilil)amino-6-cloro-7-yodo-7-deazapurina 19 (1.48 g, 60% rendimiento) en la forma de una espuma blanca. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 7.35 (s, 1 H, H-8), 6.53 (t, 1 H, J = 6.0 Hz, H-1'), 4.70 (s, 1 H, 2-NH), 4.47 (m, 1 H, H-3'), 3.97 (m, 1 H, H-4'), 3.78 (m, 2 H, ?-5'a y ?-5'b), 2.23 (m, 2 H, ?-2'a y ?-2'b), 0.98 (s, 9 H, (CH3)3CS¡), 0.95 (s, 9 H , (CH3)3CSi), 0.90 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0.29 (2 s, 6 H , (CH3)2Si), 0.13 (2 s, 6 H , CH3)2Si), 0.09 (s, 6 H, CH3)2Si).

Una solución del compuesto 19 (720 mg, 0.96 mmol) se disolvió en 1,4-dioxano anhidro (30 mL). Se agregaron MeOH anhidro (30 mL) y trietilamina (0.58 mL), y la mezcla se agitó durante 10 minutos bajo una atmósfera de CO, seguido de la adición de bis(benzonitrilo)dicloropaladio(ll) (20 mg, 0.05 mmol). La reacción se agitó a una temperatura de 58°C durante 24 horas bajo una atmósfera de CO, y posteriormente se concentró in vacuo. El residuo se purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 9-[ -D-3',5'-0-bis-(ter-butildimetilsilil)-2'-desoxir¡bofuranosil]-2-(ter-butildimetilsilil)amino-6-cloro-7-metoxicarbonil-7-deazapurina 20 (600 mg, 91%) en la forma de un aceite viscoso. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 7.92 (s, 1 H, H-8), 6.57 (dd, 1 H, J = 8.0 y 6.0 Hz, H-1'), 4.78 (s, 1 H, 2-NH), 4.49 (m, 1 H, H-3'), 4.02 (m, 1 H, H-4'), 3.85 (s, 3 H, CH3), 3.81 (m, 2 H, ?-5'a y ?-5'b), 2.25 (m, 2 H, ?-2'a y ?-2'b), 0.98 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0.93 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0.92 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0.31 (s, 6 H, (CH3)2Si), 0.13 (2 s, 6 H, (CH3)2Si), 0.11 (s, 6 H, (CH3)2Si).

A una solución del compuesto 20 (1.11 g, 1.63 mmol) en THF anhidro (56 mL), se le agregó borohidruro de litio (143 mg, 6.5 mmol), seguido de MeOH (0.94 mL). La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante una hora. Al enfriarse a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se diluyó con CH2CI2 (700 ml_) y se extinguió con agua (70 ml_). La fase orgánica se separó, se secó sobre Na2S04, y se concentró in vacuo. El residuo se purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 9-[ß-?-3' ,5'-0-bis-(ter-butildimetilsilil)-2'-desoxiribofuranosil]-2-(ter-butildimetilsilil)amino-6-cloro-7-hidroximetil-7-deazapurina 21 (0.58 g, 54%) en la forma de un aceite viscoso. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 7.16 (s, 1 H, H-8), 6.56 (t, 1 H, J= 6.4 Hz, H-1'), 4.79 (AB d, J= 13.6 Hz, 7-CH2a), 4.75 (AB d, J= 13.6 Hz, 7-CH2b), 4.70 (s, 1 H, 2-NH), 4.50 (m, 1 H, H-3'), 3.96 (m, 1 H, H-4'), 3.76 (m, 2 H, ?-5'a y ?-5'b), 2.23 (m, 2 H, ?-2'a y ?-2'b), 0.98 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0.94 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0.92 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0.30 (s, 3 H, (CH3)2Si), 0.29 (s, 3 H, (CH3)2Si), 0.11 (s, 6 H, (CH3)2Si) , 0.10 (s, 6 H, (CH3)2Si).

A una solución del compuesto 21 (150 mg, 0.23 mmol) en CH2CI2 (3.0 ml_), se le agregaron r?-Bu4N Br (37 mg, 0.12 mmol), bromuro de 2-nitrobencilo (148 mg, 0.68 mmol) y una solución NaOH (1 M, 3.0 ml_). La mezcla de reacción se agitó vigorosamente a temperatura ambiente durante dos días en la oscuridad. La fase orgánica se separó, se secó sobre Na2S04, se concentró in vacuo, y purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 9-[ß-?-3' ,5'-0-bis-(ter-butildimetilsilil)-2'-desoxiribofuranosil]-2-(íer-butildimetilsilil)amino-6-cloro-7-(2-nitrobenciloxi)metil-7-deazapurina 22 (87 mg, 48%) en la forma de un aceite viscoso. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 8.06 (dd, 1H, J= 8.0 y 1.2 Hz, Ph-H), 7.87 (d, 1 H, J = 7.2 Hz, Ph-H), 7.61 (dt, 1 H, J= 7.6 y 1.2 Hz, Ph-H), 7.43 (m, 1 H, Ph-H), 7.20 (s, 1 H, H-8), 6.56 (dd, 1 H, J= 7.6 y 6.0 Hz, H-1'), 4.99 (s, 2 H, PhCH2), 4.83 (AB d, 1 H, J = 1 1.4 Hz, 7-CH2a), 4.75 (AB d, 1 H, J= 11.4 Hz, 7-CH2b), 4.67 (s, 1 H, 2-NH), 4.50 (m, 1 H, H-3'), 3.96 (m, 1 H, H-4'), 3.77 (m, 2 H, H-5*a y ?-5'b), 2.25 (m, 2 H, ?-2'a y H-2'b), 0.98 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0.92 (s, 18 H, (CH3)3CSi), 0.30 (s, 3 H, (CH3)2Si), 0.29 (s, 3 H, (CH3)2S¡), 0.09 (m, 12 H, (CH3)2Si).

Se agregó en forma de gotas una solución de n-Bu NF (123 mg, 0.39 mmol) en THF (2.0 ml_), a una solución del compuesto 22 (105 mg, 0.13 mmol) en THF (3.0 ml_) a una temperatura de 0°C. La mezcla de reacción se agitó a una temperatura de 0°C durante una hora y posteriormente a temperatura ambiente durante dos horas. La mezcla se concentró in vacuo y purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 2-amino-6-cloro-9-[p-D-2'-desoxi-ribofuranosil]-7-(2-nitrobenciloxi)metil-7-deazapurina 23 (57 mg, 95%) en la forma de una espuma amarilla. H RMN (400 MHz, DMSO-de): d, 8.02 (m, 1 H, Ph-H), 7.74 (m, 2 H, Ph-H), 7.55 (m, 1 H, Ph-H), 7.41 (s, 1 H, H-8), 6.73 (s, 2 H, D20 intercambiable, NH2), 6.41 (dd, 1 H, J= 8.4 y 6.0 Hz, H-1'), 5.26 (d, 1 H, D20 intercambiable, 3'-OH), 4.91 (t, 1 H, D20 intercambiable, 5'-OH), 4.88 (s, 2 H, Ph-CH2), 4.66 (dd, 2 H, J = 11.6 Hz, 7-CH2), 4.31 (m, 1 H , ?-3'), 3.78 (m, 1 H, H-4')t 3.50 (m, 2 H , H-5'), 2.38 (m, 1 H, ?-2'a), 2.15 (m, 1 H, ?-2'b).

Una mezcla de 23 (38 mg, 0.085 mmol) y 1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano (11 mg, 0.1 mmol) en agua (4.0 mL) se calentó a reflujo durante cuatro horas bajo una atmósfera de nitrógeno. Se eliminó el agua in vacuo, y el residuo se evaporó a partir de MeOH (3.0 mL) tres veces, y purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 7-(2-nitrobenciloxi)metil-7-deaza-2'-desoxiguanosina 24 (11 mg, 30%). ? R N (400 MHz, DMSO-d6): d 10.4 (s, 1 H, D20 intercambiable, N-H), 8.03 (dd, 1 H, J = 8.4 y 0.8 Hz, Ph-H), 7.83 (d, 1 H, J = 7.6 Hz, Ph-H), 7.73 (m, 1 H, Ph-H), 7.55 (m, 1 H, Ph-H), 6.92 (s, 1 H, H-8), 6.28 (m, 1 H, H-1'), 6.26 (bs, 2 H, D20 intercambiable, NH2), 5.21 (d, 1 H, D20 intercambiable, 3'-OH), 4.89 (t, 1 H, D20 intercambiable, 5'-OH), 4.88 (s, 2 H, Ph-CH2), 4.60 (dd, 2 H, 7-CH2), 4.28 (m, 1 H, H-3'), 3.74 (m, 1 H, H-4'), 3.48 (m, 2 H, H-5'), 2.32 (m, 1 H, ?-2'a), 2.08 (m, 1 H, H-2'b).

Se fosforiló el compuesto 24 (11 mg, 0.025 mmol) con POCI3 (15 pL, 0.05 mmol) y una esponja de protones (11 mg, 0.05 mmol) en trimetilfosfato (0.3 mL) a una temperatura de 0°C durante dos horas bajo una atmósfera de nitrógeno. Se agregó una solución de pirofosfato de bis-tri-n-butilamonio (118 mg, 0.25 mmol) y tri-n-butilamina (50 pL) en DMF anhidro (0.5 mL). Después de 30 minutos de agitación, se agregó amortiguador de bicarbonato de trietilamonio (1 M, pH 7.5; 5.0 mL). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante una hora y posteriormente se concentró in vacuo. El residuo se disolvió en agua (10 mL), se filtró, y purificó mediante cromatografía de intercambio de anión. Las fracciones que contienen el trifosfato se combinaron y liofilizaron para producir 7-(2-nitrobenciloxi)metil-7-deaza-2'-desoxiguanosina-5'-tri fosfato dG.I, el cual se purificó en forma adicional utilizando RP-HPLC. HRMS (ESI): para el ión molecular dghhsNsOiePs [M-H]\ la masa calculada fue 670.0353, y la masa observada fue de 670.0344. 7-[1 -(2-Nitrofenil)-2, 2-dimetil-propiloxi]metil-7-deaza-2'-desox ¡guano sin a- 5' -trifosfato dG.V.a Esquema S13. Síntesis de 7-[1 -(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propiloxi]metil-7-deaza-2'-desoxi-guanosina-5' -trifosfato.

Reactivos y condiciones: (i) MsCI, DMAP, CH2CI2, 0°C; (/'/') (7?/Sj-1-(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propanol racémico, 115°C; (//'/') /7-BU4NF, THF, temperatura ambiente, 26% en tres pasos; (/V) sin-piridina-2-aldoxima, guanidina de 1 ,1 ,3,3-tetrametilo, 1 ,4-dioxano/DMF, 70°C, 70%; (v) POCI3, esponja de protones, (MeO)3PO, 0°C; (n-Bu3NH)2H2P207, n-Bu3N, DMF; 1 M HNEt3HC03.

Se agregaron DMAP (148 mg, 1.2 mmol) y MsCI (71 µ?_, 0.9 mmol) a una solución del compuesto 21 (200 mg, 0.30 mmol) en CH2CI2 anhidro (5.0 ml_) a una temperatura de 0°C bajo una atmósfera de nitrógeno. La reacción se agitó a una temperatura de 0°C durante 10 minutos y se diluyó con CH2CI2 (15 ml_). La solución se aplicó en un tapón de gel de sílice corto (2 x 3 cm) y se eluyó rápidamente con un sistema de solvente de hexano/acetato de etilo/trietilamina (proporción de volumen: 80/20/0.5). El eluente se concentró in vacuo, y el residuo se mezcló con (R/S)-A -(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1 -propanol racémico (500 mg, 2.4 mmol). La mezcla se calentó a una temperatura de 115 C durante 45 minutos bajo una atmósfera de nitrógeno, se enfrió a temperatura ambiente y posteriormente se disolvió en THF (10 mL) seguido de la adición de n-Bu4NF (283 mg, 0.90 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante cuatro horas y posteriormente se concentró in vacuo. El residuo se disolvió en CH2CI2 (25 mL) y se lavó con salmuera (25 mL), y la fase acuosa se extrajo con CH2CI2 (25 mL) dos veces. La fase orgánica combinada se secó sobre Na2S0 , se concentró in vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 2-amino-6-cloro-9-[3-D-2'-desoxiribofuranosil]-7-[1 - (2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propiloxi] metil-7-deazapurina 25 (40 mg, 26% para tres pasos) en la forma de una mezcla 1:1 de dos diastereómeros.

A una solución del compuesto 25 (40 mg, 0.08 mmol) en ,4-dioxano (1.0 mL) y DMF (2.0 mL), se le agregaron sin-pirimidina-2-aldoxima (180 mg, 1.5 mmol) y guanidina de 1 , 1 ,3,3-tetrametilo (211 µ?, 1.68 mmol). La mezcla se calentó durante la noche a una temperatura de 70°C bajo una atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se diluyó con CH2CI2 (20 mL) y se lavó en secuencias con una solución de ácido acético (0.1 M, 30 mL), una solución de NaHC03 saturado (30 mL), y salmuera (30 mL). La fase orgánica se secó sobre Na2S0 , se concentró in vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 7-[1 -(2-nitrofenil)- 2,2-dimetil-propiloxi]metil-7-deaza-2'-desoxiguanosina 26 (27 mg, 70%) como una mezcla 1:1 de dos diastereómeros. 1H RMN (400 MHz, MeOH-d4) para diastereómeros: d 7.79 (m, 1 H, Ph-H), 7.73 (m, 1 H, Ph-H), 7.56 (m, 1 H, Ph-H), 7.39 (m, 1 H, Ph-H), 6.87 y 6.86 (2 s, 1 H, H-8), 6.30 (m, 1 H, H-1'), 4.99 y 4.97 (2 s, 1 H, Ph-CH), 4.63-4.36 (m, 3 H, 7-CH2 y H-3'), 3.91 (m, 1 H, H-4'), 3.69 (m, 2 H, H-5'), 2.48 (m, 1 H, ?-2'a), 2.20 (m, 1H, ?-2'b), 0.79 y 0.77 (2 s, 9 H, (CH3)3).

El compuesto 26 (25 mg, 0.05 mmol) se fosforiló con POCIs (20 µ?, 0.21 mmol) y esponja de protones (21 mg, 0.1 mmol) en trimetilfosfato (0.35 mL) a una temperatura de 0°C durante 3.5 horas bajo una atmósfera de nitrógeno. Se agregó una solución de pirofosfato de bis-tri-?-butilamonio (237 mg, 0.50 mmol) y tri-n-butilamina (100 µ?_) en DMF anhidro (1.0 mL). Después de 10 minutos de agitación, se agregó un amortiguador de bicarbonato de trietilamonio (0.1 M, pH 7.5; 10 mL). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante una hora y posteriormente se concentró ¡n vacuo. El residuo se disolvió en 20% de acetonitrilo acuoso (20 mL), se filtró, y purificó mediante cromatografía de intercambio de anión. Las fracciones que contienen el trifosfato se combinaron y liofilizaron para producir 7-[1-(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propiloxi]metil-7-deaza-2'-desoxi guanosina-5'-trifosfato dG.V.a en la forma de una mezcla 1:1 de dos diastereómeros, los cuales se separaron utilizando RP-HPLC para producir los diastereómeros simples dG.V.a ds1 y dG.V.a ds2. HRMS (ESI): Para el ión molecular C23H3iN5016P3 [M-H]", la masa calculada fue 726.0979, y la masa observada fue de 726.0992. 7-[(S)-1 -(2-Nitrofenil)-2, 2-dimetil-propiloxi]m til-7 -deaza-2' -desoxigu ano si na- 5 '-trifosfato Esquema S14. Síntesis de 7-[(S)-1 -(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propiloxi] metí l-7-deaza -2' -desoxi -guanos i na -5' -trifosfato.

Reactivos y condiciones: (i) MsCI, DMAP, CH2CI2, 0°C; (/'/) (S)-1-(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-7-propanol, 115°C; (//'/') n-Bu4NF, THF, temperatura ambiente, 35% en tres pasos; (/V) NaOMe, MeOH, reflujo, 74%; (v) 1 ,4-dioxano, 2 M NaOH, reflujo, 33%; (vi) POCI3, esponja de protones, (MeO)3PO, 0°C; (n-Bu3NH)2H2P207, n-Bu3N, DMF; 1 M HNEt3HC03.

Se agregaron DMAP (224 mg, 1.8 mmol) y MsCI (107 µ?_, 1.4 mmol) a una solución del compuesto 21 (300 mg, 0.46 mmol) en CH2CI2 anhidro (10 ml_) a una temperatura de 0°C bajo una atmósfera de nitrógeno. La reacción se agitó a una temperatura de 0°C durante 10 minutos y se diluyó con CH2CI2 (20 mL). La solución se aplicó sobre un tapón de gel de sílice corto (2 x 3 cm) y se eluyó rápidamente con un sistema de solvente de hexano/acetato de etilo/trietilamina (proporción de volumen 80/20/0.5). El eluente se concentró in vacuo, y el residuo se mezcló con (S)-1-(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1 -propanol (520 mg, 2.5 mmol). La mezcla se calentó a una temperatura de 115°C durante 45 minutos bajo una atmósfera de nitrógeno, se enfrió a temperatura ambiente y se disolvió en THF (20 mL) seguido de la adición de A?-BU NF (491 mg, 1.6 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante cuatro horas y posteriormente se concentró in vacuo. El residuo se disolvió en CH2CI2 (20 mL) y se lavó con salmuera (30 mL), y la fase acuosa se extrajo con CH2CI2 (20 mL) dos veces. La fase orgánica combinada se secó sobre Na2S04, se concentró in vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 2-amino-6-cloro-9-[ -D-2'- desox¡ribofuranosil]-7-[(S)-1 -(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propiloxi]metil-7-deazapurina 27 (81 mg, 35% para tres pasos). 1H RMN (400 Hz, MeOH-d4): d 7.79 (m, 2 H, Ph-H), 7.60 (dt, 1 H, J = 1.2 y 8.0 Hz, Ph-H), 7.46 (dt, 1 H, J = 1.2 y 8.0 Hz, Ph-H), 7.27 (s, 1 H, H-8), 6.47 (dd, 1 H, J = 6.4 y 8.0 Hz, H-1'), 4.98 (s, 1 H, Ph-CH), 4.71 (d, 1 H, J= 12.4 Hz, 7-CH2 a), 4.50 (m, 1 H, H-3'), 4.47 (d, 1 H, J = 12.4 Hz, 7-CH2 b), 3.96 (m, 1 H, H-4'), 3.73 (m, 2 H, H-5'), 2.59 (m, 1 H, ?-2'a), 2.30 (m, 1 H, H-2'b), 0.80 (s, 9 H, (CH,),).

Se disolvió el compuesto 27 (104 mg, 0.21 mmol) en una solución de metóxido de sodio en MeOH (0.5 M, 10 ml_), y la mezcla se calentó a reflujo durante una hora bajo una atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente, se neutralizó con ácido acético, y posteriormente se concentró in vacuo. El residuo se purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 2-amino-6-metox¡-9-[p-D-2'-desoxiribofuranosil]-7-[(S)-1 - (2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propiloxi]metil-7-deazapurina 28 (75 mg, 74%). ? RMN (400 MHz, CDCI3): d 7.74 (m, 2 H, Ph-H), 7.52 (t, 1 H, J = 8.0 Hz, Ph-H), 7.36 (t, 1 H, J = 8.0 Hz, Ph-H), 6.71 (s, 1 H, H-8), 6.47 (dd, 1 H, J= 5.6 y 9.6 Hz, H-1'), 5.04 (s, 1 H, Ph-CH), 4.71 (m, 1 H, H-3'), 4.47 (dd, 2 H, J = 12 Hz, 7-CH2 ), 4.15 (m, 1 H, H-4'), 3.94 (s, 3 H, OCH3), 3.76 (m, 2 H, H-5'), 3.01 (m, 1 H, H-2'a), 2.19 (m, 1 H, ?-2'b), 0.82 (s, 9 H, (CH3)3).

Se disolvió el compuesto 28 (70 mg, 0.14 mmol) en 1,4- dioxano (6.0 mL) seguido de la adición de una solución acuosa de hidróxido de sodio (2 M, 12 mL). La mezcla se calentó a reflujo durante cuatro días bajo una atmósfera de nitrógeno, se enfrió a temperatura ambiente, se neutralizó con ácido clorhídrico diluido (1 M), y se concentró in vacuo. El residuo se evaporó a partir de MeOH (5.0 mL) tres veces y posteriormente se purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 7-[(S)-1-(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propiloxi]metil-7-deaza-2'-desoxiguanosina 29 (22 mg, 33%). El material de partida 28 (42 mg, 60%) también se recuperó de la reacción. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 11.02 (br s, 1 H, NH), 7.69 (m, 2 H, Ph-H), 7.52 (t, 1 H, J = 7.2 Hz, Ph-H), 7.33 (t, 1 H, J= 7.2 Hz, Ph-H), 6.66 (s, 1 H, H-8), 6.13 (t, 1 H, J = 6.8 Hz, H- 1'), 6.03 (br s, 2 H, 6-NH2), 4.92 (s, 1 H, Ph-CH), 4.77 (m, 1 H, H-3'), 4.57 (d, 1 H, J = 12.8 Hz, 7-CH2a), 4.12 (m, 1 H, H-4'), 3.05 (d, 1 H, J = 12.8 Hz, 7-CH2 b), 3.75 (m, 2 H, H-5'), 2.87 (m, 1 H, H-2'a), 2.29 (m, 1 H, ?-2'b), 0.76 (s, 9 H, (CH3)3).

Se fosforiló el compuesto 29 (16 mg, 0.033 mmol) con POCI3 (17 pL, 0.18 mmol) y una esponja de protones (14 mg, 0.066 mmol) en trimetilfosfato (0.35 mL) a una temperatura de 0°C durante cuatro horas bajo una atmósfera de nitrógeno. Se agregó una solución de pirofosfato de bis-tri-n-butilamonio (237 mg, 0.50 mmol) y tri-n-butilamina (100 pL) en DMF anhidro (1.0 mL). Después de 10 minutos de agitación, se agregó unamortiguador de bicarbonato de trietilamonio (0.1 M, pH 7.5; 10 ml_). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante una hora y posteriormente se concentró in vacuo. El residuo se disolvió en acetonitrilo acuoso al 20% (20 ml_), se filtró, y purificó mediante cromatografía de intercambio de anión. Las fracciones que contienen el trifosfato se combinaron y liofilizaron para producir 7-[(S)-1 -(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propiloxi]metil-7-deaza-2'-desoxiguanosina-5'-tri fosfato dG.V, el cual se purificó en forma adicional utilizando condiciones RP-HPLC. El tiempo de retención de dG.V fue idéntico al de dG.V.a ds2 mediante análisis RP-HPLC utilizando la misma condición (datos no mostrados). HRMS (ESI): Para el ión molecular C23H3iN5016P3 [M-H]\ la masa calculada fue 726.0979, y la masa observada fue de 726.0986. 7-[ 1-(4-Metoxi-2-nitrofenil)-2, 2-dimetil-propiloxi]metil-7-deaza-2'-desoxiguanosina-5'-tri fosfato 30 31 dG.V.b Esquema S15. Síntesis de 7-[1 -(4-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propilox¡]met¡l-7-deaza-2'-desoxiguanosina-5'-trifosfato. Reactivos y condiciones: (/) MsCI, DMAP, CH2CI2, 0o C; (¡i) (ft/S)-1-(4-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1 -propanol racémico, 115°C; (///) n-Bu4NF, THF, temperatura ambiente, 21% en tres pasos; (/V) sin-piridina-2-aldoxima, guanidina de 1 ,1 ,3,3-tetrametilo, 1 ,4-dioxano/DMF, 70°C, 59%; (v) POCI3, esponja de protones, (MeO)3PO, 0°C; (n-Bu3NH)2H2P207, n-Bu3N, DMF; 1 M HNEt3HC03.

Se agregaron DMAP (346 mg, 2.8 mmol) y MsCI (165 µ?_, 2.1 mmol) a una solución del compuesto 21 (470 mg, 0.72 mmol) en CH2CI2 anhidro (5.0 ml_) a una temperatura de 0°C bajo una atmósfera de nitrógeno. La reacción se agitó a una temperatura de 0°C durante 10 minutos y se diluyó con CH2CI2 (20 ml_). La solución se aplicó sobre un tapón de gel de sílice corto (2 x 3 cm) y se eluyó rápidamente con un sistema de solvente de hexano/acetato de etilo/trietilamina (proporción de volumen 80/20/0.5). El eluente se concentró in vacuo, y el residuo se mezcló con (R/S)-1 -(4-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1 -propanol racémico (1.6 g, 6.69 mmol). La mezcla se calentó a una temperatura de 115°C durante 45 minutos bajo una atmósfera de nitrógeno, se enfrió a temperatura ambiente, y se disolvió en THF (20 mL) seguido de la adición de n-Bu4NF (788 mg, 2.5 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante cuatro horas y posteriormente se concentró in vacuo. El residuo se disolvió en CH2CI2 (20 mL) y se lavó con salmuera (30 mL), y la fase acuosa se extrajo con CH2CI2 (20 mL) dos veces. La fase orgánica combinada se secó sobre Na2S04, se concentró in vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 2-amino-6-cloro-9-[ -D-2'-desoxiribofuranosil]-7-[(S)-1-(4-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propiloxi]-metil-7-deazapurina 30 (80 mg, 21% para tres pasos) en la forma de una mezcla 1:1 de dos diastereómeros.

A una solución del compuesto 30 (80 mg, 0.15 mmol) en 1,4-dioxano (1.0 mL) y DMF (2.0 mL), se le agregaron sin-pirimidina-2-aldoxima (366 mg, 3.0 mmol) y guanidina de 1 , 1 ,3,3-tetrametilo (414 pL, 3.3 mmol), y la mezcla se calentó durante la noche a una temperatura de 70°C bajo una atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se diluyó con CH2CI2 (20 mL) y se lavó en secuencias con ácido acético (0.1 M, 30 mL), una solución NaHC03 saturada (30 mL), y salmuera (30 mL). La fase orgánica se secó sobre Na2S0 , se concentró in vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 7-[(S)-1 -(4-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propiloxi]metil-7-deaza-2'-desoxi-guanosina 31 (45 mg, 59%) en la forma de una mezcla 1:1 de dos diastereómeros. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) para diastereómeros: d 10.31 (br s, 1 H, D20 intercambiable, NH), 7.63 y 7.62 (2 d, 1 H, J= 2,8 Hz, Ph-H), 7.41 y 7.40 (2 d, 1 H, J = 2,8 Hz, Ph-H), 7.27 (m, 1 H, Ph-H), 6.98 y 6.96 (2 s, 1 H, H-8), 6.28 (m, 1 H, H-1'), 6.22 (br s, 2 H, D20 intercambiable, NH2), 5.22 (d, 1 H, D20 intercambiable, 3'-OH), 4.88 (t, 1 H, D20 intercambiable, 5'-OH), 4.73 y 4.71 (2 s, 1 H, Ph-CH), 4.47-4.24 (m, 3 H, 7-CH2 y H-3'), 3.85 y 3.83 (2 s, 3 H, OCH3), 3.74 (m, 1 H, H-4'), 3.48 (m, 2 H, H-5'), 2.28 (m, 1 H, ?-2'a), 2.06 (m, 1 H, ?-2'b), 0.80 y 0.78 (2 s, 9 H, (CH3)3).

Se fosforiló el compuesto 31 (25 mg, 0.048 mmol) con POCI3 (15 µ?_, 0.18 mmol) y una esponja de protones (21 mg, 0.10 mmol) en trimetilfosfato (0.35 mL) a una temperatura de 0°C durante 3.5 horas bajo una atmósfera de nitrógeno. Se agregó una solución de pirofosfato de bis-tri-n-butilamonio (237 mg, 0.50 mmol) y tri-n-butilamina (100 µ?) en DMF anhidro (1.0 mL). Después de 10 minutos de agitación, se agregó amortiguador de bicarbonato de trietilamonio (0.1 M, pH 7.5; 10 mL). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante una hora y posteriormente se concentró in vacuo. El residuo se disolvió en acetonitrilo acuoso al 20% (20 mL), se filtró, y purificó mediante cromatografía de intercambio de anión. Las fracciones que contienen el trifosfato se combinaron y liofilizaron para producir 7-[1 -(4-metoxi-2-nitrofenil)-2 , 2-dimetil-propiloxi]metil-7-deaza-2'-desoxiguanosina-5'-trifosfato dG.V.b en la forma de una mezcla 1:1 de dos diastereómeros, los cuales se separaron utilizando RP-HPLC para producir los diastereómeros simples dG.V.b ds1 y dG.V.b ds2. HRMS (ESI): Para el ión molecular C24H33N5017P3 [M-H]\ la masa calculada fue 756.1084, y la masa observada fue de 756.1101. 7-[1 -(5-Metoxi-2-nitrofenil)-2, 2-dimetil-propiloxi]metil- 7-deaza-2'-desoxiguanosina-5'-tri fosfato dG.V.c Esquema S16. Síntesis de 7-[1 -(5-metoxi-2-nitrofen¡l)-2,2-dimetil-propiloxi]metil-7-deaza-2'-desoxiguanosina-5'-trifosfato. Reactivos y condiciones: (i) MsCI, DMAP, CH2CI2, 0o C; (/'/') (R/S)-1 -(5-metoxi-2-n ¡trof en il)-2,2-dimetil-1 - propanol racémico, 115°C; (/'/'/') n-Bu4NF, THF, temperatura ambiente, 24% en tres pasos; (/V) sin-piridina-2-aldoxima, guanidina de 1 ,1 ,3,3-tetrametilo, 1 ,4-dioxano/DMF, 70°C, 57%; (v) POCI3, esponja de protones, (MeO)3PO, 0°C; (n-Bu3NH)2H2P207, n-Bu3N, DMF; 1 HNEt3HC03.

Se agregaron DMAP (302 mg, 2.5 mmol) y MsCI (145 µ?_, 1.9 mmol) a una solución del compuesto 21 (410 mg, 0.62 mmol) en CH2CI2 anhidro (5.0 mL) a una temperatura de 0°C bajo una atmósfera de nitrógeno. La reacción se agitó a una temperatura de 0°C durante 10 minutos y se diluyó con CH2CI2 (20 mL). La solución se aplicó a un tapón de gel de sílice corto (2 x 3 cm) y se eluyó rápidamente con un sistema de solvente de hexano/acetato de etilo/trietilamina (proporción de volumen: 80/20/0.5). El eluente se concentró in vacuo, y el residuo se mezcló con (R/Sj- -(5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propanol racémico (800 mg, 2.2 mmol). La mezcla se calentó a una temperatura de 115°C durante 45 minutos bajo una atmósfera de nitrógeno, se enfrió a temperatura ambiente, y se disolvió en THF (10 mL) seguido de la adición de n-Bu4NF (683 mg, 3.3 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante cuatro horas y posteriormente se concentró in vacuo. El residuo se disolvió en CH2CI2 (20 mL) y se lavó con salmuera (30 mL), y la fase acuosa se extrajo con CH2CI2 (20 mL) dos veces. La fase orgánica combinada se secó sobre Na2S04, se concentró in vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 2-amino-6-cloro-9-[3-D-2'-desoxiribofuranosil]-7-[1-(5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propiloxi]metil-7-deazapurina 32 (80 mg, 24% para tres pasos) como una mezcla 1:1 de dos diastereómeros. 1H RMN (400 MHz, CDCI3) para diastereómeros: d 7.86 y 7.83 (2 d, 1 H, J = 8.8 Hz, Ph-H), 7.19 y 7.17 (2 d, 1 H, J = 2.8 Hz, Ph-H), 6.91 y 6.90 (2 s, 1 H, H-8), 6.80 y 6.75 (2 dd, 1 H, J= .8 y 8.8 Hz, Ph-H), 6.17 (m, 1 H, H-1'), 5.23 y 5.21 (2 s, 1 H, Ph-CH), 5.01 y 5.00 (2 br s, 2 H, NH2), 4.73 (m, 1 H, H-3'), 4.65-4.49 (m, 2 H, 7-CH2), 4.14 (m, 1 H, H-4'), 3.84 (m, 5 H, H-5' y OCH3), 2.78 (m, 1 H, ?-2'a), 2.33 (m, 1 H, ?-2'b), 0.82 y 0.81 (2 s, 9 H, (CH3)3).

A una solución del compuesto 32 (80 mg, 0.15 mmol) en 1,4-dioxano (1.0 mL) y DMF (2.0 mL), se le agregaron sin-pirimidina-2-aldoxima (360 mg, 3.0 mmol) y guanidina de 1 , 1 ,3,3-tetrametilo (414 pL, 3.3 mmol), y la mezcla se calentó a una temperatura de 70°C durante la noche bajo una atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se diluyó con CH2CI2 (20 mL) y se lavó en secuencias con ácido acético (0.1 M, 30 mL), una solución NaHC03 saturada (30 mL), y salmuera (30 mL). La fase orgánica se secó sobre Na2S04, se concentró in vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 7-[1 -(5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propiloxi]metil-7-deaza-2'-desoxiguanosina 33 (43 mg, 57%) en la forma de una mezcla 1:1 de dos diastereómeros. H RMN (400 MHz, DMSO-d6) para diastereómeros: d 10.34 (br s, 1 H, D20 intercambiable, NH), 7.92 y 7.89 (2 d, 1 H, J = 8,8 Hz, Ph-H), 7.15 (m, 1 H, Ph-H), 6.95 (m, 1 H, Ph-H), 6.82 y 6.81 (2 s, 1 H, H-8), 6.22 (m, 3 H, 2 H D20 intercambiable, H-1' y NH2), 5.19 (d, 1 H, D20 intercambiable, 3'-OH), 5.12 y 5.10 (2 s, 1 H, Ph-CH), 4.84 (t, 1 H, D20 intercambiable, 5'-OH), 4.47-4.31 (m, 2 H, 7-CH2), 4.24 (m, 1 H, H-3'), 3.85 y 3.83 (2 s, 3 H, OCH3), 3.71 (m, 1 H , H-4'), 3.44 (m, 2 H, H-5'), 2.24 (m, 1 H, ?-2'a), 2.01 (m, 1 H, ?-2'b), 0.76 y 0.74 (2 s, 9 H, (CH3)3).

Se fosforiló el compuesto 33 (20 mg, 0.04 mmol) con POCI3 (25 µ?_, 0.27 mmol) y una esponja de protones (16 mg, 0.08 mmol) en trimetilfosfato (0.30 mL) a una temperatura de 0°C durante seis horas bajo una atmósfera de nitrógeno. Se agregó una solución de pirofosfato de bis-tri-n-butilamonio (237 mg, 0.50 mmol) y tri-n-butilamina (100 µ?_) en DMF anhidro (1.0 mL). Después de 10 minutos de agitación, se agregó amortiguador de bicarbonato de trietilamonio (0.1 M, pH 7.5; 10 mL). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante una hora y posteriormente se concentró in vacuo. El residuo se disolvió en acetonitrilo acuoso al 20% (20 mL), se filtró, y purificó mediante cromatografía de intercambio de anión. Las fracciones que contienen el trifosfato se combinaron y liofilizaron para producir 7-[1 -(5-metoxi-2-nitrofenil)-2 ,2-dimetil-propiloxi]metil-7-deaza-2'-desoxiguanosina-5'-tri fosfato dG.V.c en la forma de una mezcla 1:1 de dos diastereómeros, los cuales se separaron utilizando RP-HPLC para producir los diastereómeros simples dG.V.c ds1 y dG.V.c ds2. HRMS (ESI): Para el ión molecular C24H33N5017P3 [M-H]\ la masa calculada fue 756.1084, y la masa observada fue de 756.1088. 7-[1-(4, 5-Dimetoxi-2-nitrofenil)-2, 2-dimetil-propiloxi]metil-7 -de ai a- 2' -d esox ig u a nos i da- 5' -trifosfato Esquema S17. Síntesis de 7-[1 -(4,5-dimetoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propilox¡]metil-7-deaza-2'-desoxiguanosina-5'-trifosfato. Reactivos y condiciones; (i) MsCI, DMAP, CH2CI2, 0°C; (/'/') (ft/S)-1-(4,5-dimetoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimet¡l-1-propanol racémico, 115°C; (///') n-Bu4NF, THF, temperatura ambiente, 23% en tres pasos; (/V) sin-piridina-2-aldoxima, guanidina de 1 ,1 ,3,3-tetrametilo, dioxano/DMF, 70°C, 68%; (v) POCIs, esponja de protones, (MeO)3PO, 0°C; (/7-Bu3NH)2H2P207, n-Bu3N, DMF; 1 M HNEt3HC03.

Se agregaron DMAP (273 mg, 2.2 mmol) y MsCI (130 µ?_, 1.7 mmol) a una solución del compuesto 21 (370 mg, 0.56 mmol) en CH2CI2 anhidro (5.0 mL) a una temperatura de 0°C bajo una atmósfera de nitrógeno. La reacción se agitó a una temperatura de 0°C durante 30 minutos y se diluyó con CH2CI2 (25 mL). La solución se aplicó sobre un tapón de gel de sílice corto (2 x 3 cm) y se eluyó rápidamente con un sistema de solvente de hexano/acetato de etilo/trietilamina (proporción de volumen: 80/20/0.5). El eluente se concentró in vacuo, y el residuo se mezcló con (R/S)-1 -(4,5-dimetoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1 -propanol racémico (800 mg, 3.0 mmol). La mezcla se calentó a una temperatura de 115°C durante 45 minutos bajo una atmósfera de nitrógeno, se enfrió a temperatura ambiente y se disolvió en THF (10 mL) seguido de la adición de n-Bu4NF (530 mg, 1.7 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante dos horas y posteriormente se concentró in vacuo. El residuo se disolvió en CH2CI2 (40 ml_) y se lavó con salmuera (50 ml_), y la fase acuosa se extrajo con CH2CI2 (40 ml_) dos veces. La fase orgánica combinada se secó sobre Na2S04 y se concentró in vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 2-amino-6-cloro-9-[ -D-2'-desoxiríbofuranosil]-7-[1 - (4,5-dimetoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propiloxi]metil-7-deazapurina 34 (70 mg, 23% para tres pasos) como una mezcla 1:1 de dos diastereómeros. 1H RMN (400 MHz, CDCI3) para diastereómeros: d 7.42 y 7.39 (2 s, 1 H, Ph-H), 7.15 y 7.13 (2 s, 1 H, Ph-H), 6.89 y 6.84 (2 s, 1 H, H-8), 6.12 (m, 1 H, H-r), 5.22 y 5.16 (2 s, 1 H, Ph-CH), 5.10 y 5.08 (2 bs, 2 H, NH2), 4.71-4.41 (m, 3 H, H-3' y 7-CH2), 4.13 (m, 1 H, H-4'), 3.94 (4 s, 7 H, OCH3 x 2 y ?-5'a), 3. 78 (m, 1 H, H-5'b), 2.90 (m, 1 H, ?-2'a), 2.25 (m, 1 H, ?-2'b), 0.82 y 0.80 (2 s, 9 H, (CH3)3).

A una solución del compuesto 34 (65 mg, 0.1 1 mmol) en I, 4-dioxano (1.0 ml_) y DMF (2.0 mL), se le agregaron sin-pirimidina-2-aldoxima (292 mg, 2.4 mmol) y guanidina de 1 , 1 ,3,3-tetrametilo (330 µ?_, 2.6 mmol), y la mezcla se calentó a una temperatura de 70°C durante la noche bajo una atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se diluyó con CH2CI2 (40 mL) y se lavó en secuencias con ácido acético (0.1 M, 50 mL), una solución NaHC03 saturada (50 mL), y salmuera (50 mL). La fase orgánica se secó sobre Na2S0 , se concentró in vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 7-[1 -(4,5-dimetoxi-2-nitrofenil)-2 ,2-dimetil-propiloxi]metil-7-deaza-2'-desoxiguanosina 35 (42 mg, 68%) en la forma de una mezcla 1:1 de dos diastereómeros. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) para diastereómeros: d 10.33 (br s, 1 H, D20 intercambiable, NH), 7.47 y 7.44 (2 s, 1 H, Ph-H), 7.16 y 7.15 (2 S, 1 H, Ph-H), 6.83 y 6.82 (2 s, 1 H, H-8), 6.22 (m, 3 H, 2 H D20 intercambiable, NH2 y H-1'), 5.18 (br s, 1 H, D20 intercambiable, 3'-OH), 5.06 y 5.04 (2 s, 1 H, Ph-CH), 4.83 (t, 1 H, D20 intercambiable, 5'-OH), 4.44-4.23 (m, 3 H, 7-CH2 y H-3'), 3.82 (4 s, 6 H, OCH3 x 2), 3.70 (m, 1 H, H-4'), 3.42 (m, 2 H, H-5'), 2.22 (m, 1 H, H-2*a), 2.01 (m, 1 H, ?-2'b), 0.77 y 0.75 (2 s, 9 H, (CH3)3).

Se fosforiló el compuesto 35 (40 mg, 0.073 mmol) con POCI3 (14 µ?_, 0.15 mmol) y una esponja de protones (31 mg, 0.15 mmol) en trimetilfosfato (0.35 mL) a una temperatura de 0°C durante dos horas bajo una atmósfera de nitrógeno. Se agregó una solución de pirofosfato de bis-tri-n-butilamon ¡o (237 mg, 0.50 mmol) y tri-n-butilamina (100 µ?_) en DMF anhidro (1.0 mL). Después de 10 minutos de agitación, se agregó un amortiguador de bicarbonato de trietilamonio (0.1 M, pH 7.5; 10 mL). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante una hora y posteriormente se concentró in vacuo. El residuo se disolvió en acetonitrilo acuoso al 20% (20 mL), se filtró, y purificó mediante cromatografía de intercambio de anión. Las fracciones que contienen el trifosfato se combinaron y liofilizaron para proporcionar 7-[1 -(4,5-dimetoxi-2-n¡trofenil)-2,2-dimetil-propiloxi]metil-7-deaza-2'-desox¡guanosina-5'-trifosfato dG.V.d en la forma de una mezcla 1:1 de dos diastereómeros, los cuales se separaron utilizando RP-HPLC para producir los diastereómeros simples dG.V.d ds1 y dG.V.d ds2. HRMS (ESI): Para el ión molecular C25H3N5018P3 [M-H]', la masa calculada fue 786.1190, y la masa observada fue de 786.1206. 7-[(S)-1-(5-Metoxi-2-nitrofenil)-2, 2-dimetil-propiloxi]metil-7-deaza-2'-desoxiguanosina-5'-tri fosfato dG.VI Esquema S18. Síntesis de 7-[(S)-1 -(S-metoxi^-nitrofeniO-a^-dimetil-propiloxiJmetil-T-deaza^'-desoxiguanosina-S'-trifosfato. Reactivos y condiciones: (i) MsCI, DMAP, CH2CI2, 0o C; (/ ) (S)-1 - (5-metoxi-2-nitrofen i l)-2 ,2-d¡meti 1-1 - propanol, 115°C; (/' /) n-Bu4NF, THF, temperatura ambiente, 27% para tres pasos; ( v) sin-piridina-2-aldoxima , guanidina de 1,1,3,3-tetrametilo, 1 ,4-dioxano/DMF, 70°C, 76%; (v) POCI3, esponja de protones, (MeO)3PO, 0°C; (/?-Bu3NH)2H2P207, n-Bu3N, DMF; 1 M HNEt3HC03.

Se agregaron DMAP (224 mg, 1.8 mmol) y MsCI (106 pL, 1.4 mmol) a una solución del compuesto 21 (300 mg, 0.46 mmol) en CH2CI2 anhidro (5.0 ml_) a una temperatura de 0°C bajo una atmósfera de nitrógeno. La reacción se agitó a una temperatura de 0°C durante 10 minutos y se diluyó con CH2CI2 (20 mL). La solución se aplicó sobre un tapón de gel de sílice corto (2 x 3 cm) y se eluyó rápidamente con un sistema de solvente de hexano/acetato de etilo/trietilamina (proporción en volumen: 80/20/0.5). El eluente se concentró in vacuo, y el residuo se mezcló con (S)-1 -(5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2- dimetil-1-propanol (500 mg, 2.1 mmol). La mezcla se calentó a una temperatura de 115°C durante 45 minutos bajo una atmósfera de nitrógeno, se enfrió a temperatura ambiente y se disolvió en THF (10 mL) seguido de la adición de n-Bu4NF (507 mg, 1.6 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante cuatro horas y posteriormente se concentró in vacuo. El residuo se disolvió en CH2CI2 (20 mL) y se lavó con salmuera (30 mL), y la fase acuosa se extrajo con CH2CI2 (20 mL) dos veces. La fase orgánica combinada se secó sobre Na2S04, se concentró in vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 2-amino-6-cloro-9-^-D-2'-desoxiribofuranosil]-7-[(S)-1-(5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propiloxi]-metil-7-deazapurina 36 (67 mg, 27% para tres pasos). 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 7.82 (d, 1 H, J = 8.8 Hz, Ph-H), 7.16 (d, 1 H, J = 2.8 Hz, Ph-H), 6.90 (s, 1 H, H-8), 6.72 (dd, 1 H, J = 8.8 y 2.8 Hz, Ph-H), 6.12 (dd, 1 H, J = 9.2 y 6.0 Hz, H-1'), 5.22 (s, 1 H, Ph-CH), 5.15 (br s, 2 H, NH2), 4.69-4.55 (m, 3 H, H-3' y 7-CH2), 4.11 (m, 1 H, H-4'), 3.92 (m, 1 H, ?-5'a), 3.82 (s, 3 H, OCH3), 3. 73 (m, 1 H, ?-5'b), 2.81 (m, 1 H, ?-2'a), 2.21 (m, 1 H, ?-2'b), 0.82 (s, 9 H, (CH3)3).

A una solución del compuesto 36 (65 mg, 0.12 mmol) en I, 4-dioxano (1.0 mL) y DMF (2.0 mL), se le agregaron sin-pirimidina-2-aldoxima (292 mg, 2.4 mmol) y guanidina de 1 , 1 ,3,3-tetrametilo (331 µ?, 2.6 mmol), y la mezcla se calentó durante la noche a una temperatura de 70°C bajo una atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se diluyó con CH2CI2 (20 mL) y se lavó en secuencias con ácido acético (0.1 M, 30 mL), una solución de NaHC03 saturada (30 mL), y salmuera (30 mL). La fase orgánica se secó sobre Na2S04, se concentró in vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 7-[(S)-1-(5-metoxi-2-nitrofeníl)-2,2-dimetil- propiloxi]metil-7-deaza-2'-desoxiguanosina 37 (48 mg, 76%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 10.37 (br s, 1 H, D20 intercambiable, NH), 7.95 (d, 1 H, J = 9.2 Hz, Ph-H), 7.18 (d, 1 H, J= 2.8 Hz, Ph-H), 7.03 (dd, 1 H , J= 9.2 y 2.8 Hz, Ph-H), 6.84 (s, 1 H, H-8), 6.23 (m, 3 H, 2 H D20 intercambiable, NH2 y H-1*), 5.20 (d, 1 H, D20 intercambiable, 3'-OH), 5.13 (s, 1 H, Ph-CH), 4.84 (t, 1 H , D20 intercambiable, 5'-OH), 4.48 (d, 1 H, J = 12.0 Hz, 7-CH2a), 4.32 (d, 1 H, J = 12.0 Hz, 7-CH2b), 4.27 (m, 1 H, H-3'), 3.88 (s, 3 H , OCH3), 3.73 (m, 1 H, H-4'), 3.46 (m, 2 H, H-5'), 2.30 (m, 1 H, ?-2'a), 2.05 (m, 1 H, ?-2'b), 0.77 (s, 9 H, (CH3)3).

Se fosforiló el compuesto 37 (10 mg, 0.02 mmol) con POCI3 (26 µ?, 0.26 mmol) y una esponja de protones (8 mg, 0.04 mmol) en trimetilfosfato (0.3 mL) a una temperatura de 0°C durante 6.5 horas bajo una atmósfera de nitrógeno. Se agregó una solución de pirofosfato de bis-tri-n-butilamonio (237 mg, 0.50 mmol) y tri-n-butilamina (100 pL) en DMF anhidro (1.0 mL). Después de 10 minutos de agitación, se agregó amortiguador de bicarbonato de trietilamonio (0.1 , pH 7.5; 10 mL). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante una hora y posteriormente se concentró in vacuo. El residuo se disolvió en acetonitrilo acuoso al 20% (10 mL), se filtró, y purificó mediante cromatografía de intercambio de anión. Las fracciones que contienen el trifosfato se combinaron y liofilizaron para proporcionar 7-[(S)-1 -(5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil- propiloxi]met¡l-7-deaza-2'-desox¡guanos¡na-5'-tri fosfato dG.VI , el cual se purificó en forma adicional utilizando RP-HPLC. El tiempo de retención de dG.VI fue idéntico al de dG.V.c ds2 mediante análisis RP-HPLC bajo la misma condición. HRMS (ESI): Para el ión molecular C24H33N5O17P3 [M-H]", la masa calculada fue 756.1084, y la masa observada fue de 756.1101. Ejemplo 5 - Síntesis de Análogo de Trifosfato de 5-HOMe-2'- Desoxiuridina 5-[(S)-1 - (5-Metoxi-2-nitrofenil)-2, 2-dimetil-pro iloxi]metil- 2' -desoxiuridi na-' -trifosfato 38 39 dU.VI Esquema S19. Síntesis de 5-[(S)-1 -(5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2- dimetil-propiloxi]metil-2'-desoxiuridina-5' -trifosfato.

Reactivos y condiciones: (i) (S)-1 -(5-metoxi-2-nitrofenil)-2 ,2- dimetil-1-propanol, 110°C; (//') NH4F, MeOH , 50°C, 56% en dos pasos; (/ /') POCI3, esponja de protones, (MeO)3PO, 0°C; (n- Bu3NH)2H2P207, A?-BU3N, DMF; 1 M HNEt3HC03.

El compuesto 38 (Litosh ef al, 2011, la cual está incorporada a la presente invención como referencia) (315 mg, 0.49 mmol) y (S)-1-(5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propanol (490 mg, 2.1 mmol) se calentaron a una temperatura de 110°C durante 45 minutos bajo una atmósfera de nitrógeno. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente, se disolvió en MeOH (10 mL), y seguido de la adición de NH4F (400 mg, 11 mmol). La mezcla se agitó a una temperatura de 50°C durante 12 horas, se concentró in vacuo, se disolvió en CH2CI2 (50 mL), y se lavó con salmuera (50 mL). La fase orgánica se secó sobre Na2S04, se concentró in vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 5-[(S)-1 -(5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propiloxi]metil-2'-desoxiuridina 39 (130 mg, 56%). H RMN (400 MHz, CDCh): d 9.14 (br s, 1 H, NH), 7.90 (d, 1 H, J = 9.2 Hz, Ph-H), 7.67 (s, 1 H, H-6), 7.17 (d, 1 H, J = 2.8 Hz, Ph-H), 6.84 (dd, 1 H, J = 9.2 y 2.8 Hz, Ph-H), 6.18 (t, 1 H, J = 6.4 Hz, H-1'), 5.22 (s, 1 H, Ph-CH). 4.56 (m, 1 H, H-3'), 4.24 (d, 1 H, J= 12.4 Hz, 5-CH2a), 4.15 (d, 1 H, J= 12.4 Hz, 5-CH2b), 4.00 (m, 1 H, H-4'), 3.90 (m, 1 H, ?-5'a), 3.88 (s, 3 H, OCH3), 3.81 (m, 1 H, ?-5'b), 2.35 (m, 2 H, H-2), 0.83 (s. 9 H, C(CH3)3).

Se fosforiló el compuesto 39 (30 mg, 0.065 mmol) con POCI3 (9 µ?, 0.097 mmol) y esponja de protones (28 mg, 0.13 mmol) en trimetilfosfato (0.35 mL) a una temperatura de 0°C durante una hora bajo una atmósfera de nitrógeno. Se agregó una solución de pirofosfato de tri-n-butilamonio (147 mg, 0.32 mmol) y tri-n-butilamina (64 ML) en DMF anhidro (0.64 mL). Después de 10 minutos de agitación, se agregó amortiguador de bicarbonato de trietilamonio (0.1 M, pH 7.5; 10 mL). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante una hora y posteriormente se concentró in vacuo. El residuo se disolvió en acetonitrilo acuoso al 20% (10 mL), se filtró, y purificó mediante cromatografía de intercambio de anión. Las fracciones que contienen el trifosfato se combinaron y liofilizaron para proporcionar 5-[(S)-1-(5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propiloxi]metil-2'-desoxiuridina-5'-trifosfato dU.VI, el cual se purificó en forma adicional utilizando RP-HPLC. HRMS (ESI): Para el ión molecular ?22?31?3?1 d 3 [M-H]\ la masa calculada fue 718.0815, y la masa observada fue de 718.0824.

Ejemplo 6 - Síntesis de Análogos de Trifosfato de 5-HOMe-2'-Desoxicitidina 5-(2-nit ro bencilox i )me ti 1-2 '-de so xicitidina-5: -trifosfato 42 43 dC.I Esquema S20. Síntesis de 5-(2-nitrobenciloxi)metil-2'-desoxicitidina-5'-trifosfato. Reactivos y condiciones: (i) alcohol 2-nitrobencílico, 110°C; (/'/) n-BU4NF, THF, temperatura ambiente, 53% en dos pasos; (/ /) TBSCI, imidazol, DMF, temperatura ambiente, 80%; (/V) cloruro de 2,4,6-triisopropilbencenosulfonilo, DMAP, Et3N, CH2CI2, temperatura ambiente; (v) NH3, ,4-dioxano, 90°C, 69% en dos pasos; (vi) n-Bu4NF, THF, temperatura ambiente, 96%; (v/7) POCI3, esponja de protones, (MeO)3PO, 0°C; (n-Bu3NH)2H2P207, n-Bu3N, DMF; 1 M HNEt3HC03.

El compuesto 38 (300 mg, 0.46 mmol) y alcohol 2-nitrobencílico (500 mg, 3.3 mmol) se calentaron a una temperatura de 110°C durante 45 minutos bajo una atmósfera de nitrógeno. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente, se disolvió en THF (20 mL) seguido de la adición de n-Bu4NF (362 mg, 1.2 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante cuatro horas, se concentró in vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 5-(2-nitrobenciloxi)metil-2'-desoxiuridina 40 (Lítosh y asociados, 2011, la cual está incorporada a la presente invención como referencia) (95 mg, 53%). 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 8.45 (br s, 1 H, NH), 8.05 (s, 1 H, H-6), 8.02 (d, J = 8.0 Hz, 1 H, Ph-H), 7.80 (d, 1 H, J = 8.0 Hz, Ph-H), 7.69 (t, 1 H, J = 8.0 Hz, Ph-H), 7.43 (t, 1 H, J = 8.0 Hz, Ph-H), 6.21 (t, 1 H, J = 6.0 Hz, H-1'), 4.94 (dd, J = 14.4 Hz, 2 H, Ph-CH2), 4.66 (m, 1 H, H-3"), 4.35 (s, 2 H, 5-CH2), 3.95 (m, 3 H, H-41 y H-5'), 2.42 (m, 1 H, ?-2'a), 2.30 (m, 1 H, ?-2'b).

A una solución del compuesto 40 (Litosh y asociados, 2011, la cual está incorporada a la presente invención como referencia) (70 mg, 0.18 mmol) en DMF anhidro (2.0 mL), se le agregaron TBSCI (60 mg, 0.40 mmol) e imidazol (54 mg, 0.80 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente bajo una atmósfera de nitrógeno, se concentró in vacuo, se disolvió en CH2CI2 (20 mL), y se lavó con una solución NaHC03 saturada (30 mL). Las fases orgánica y acuosa se separaron, y la fase acuosa se extrajo con CH2CI2 (20 mL) dos veces. La fase orgánica combinada se secó con Na2S04, se concentró in vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 3',5'-0-bis-(ter-butildimetilsilil)-5-(2-nitrobenciloxi)-metil-2'-desoxiuridina 41 (90 mg, 80%). 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 8.04 (d, J= 8.0 Hz, 1 H, Ph-H), 7.98 (br s, 1 H, NH), 7.80 (d, 1 H, J= 8.0 Hz, Ph-H), 7.74 (s, 1 H, H-6), 7.64 (q, 1 H, J = 8.0 Hz, Ph-H), 7.44 (t, 1 H, J = 8.0 Hz, Ph-H), 6.21 (q, 1 H, J = 6.0 Hz, H-1"), 4.95 (s, 2 H, Ph-CH2), 4.41 (m, 1 H, H-3'), 4.34 (dd, 2 H, J= 11.6 Hz, 5-CH2), 3.96 (m, 1 H, H-4'), 3.79 (m, 2 H, ?-5'), 2.29 (m, 1 H, ?-2'a), 2.05 (m, 1 H, ?-2'b), 0.89 (2 s, 18 H, C(CHj)3), 0.08 (4 s, 12 H , CH3).

Se agregó cloruro de bencenosulfonilo de 2,4,6-triisopropilo (176 mg, 0.59 mmol) a una solución del compuesto 41 (85 mg, 0.14 mmol), DMAP (19 mg, 0.16 mmol), y trietilamina (0.18 ml_, 1.3 mmol) en CH2CI2 anhidro (5.0 ml_). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche bajo una atmósfera de nitrógeno, se concentró in vacuo, y el residuo se disolvió en una solución de NH3 en 1,4-dioxano (0.5 M, 15 mL). La mezcla se transfirió en un tubo sellado y se calentó durante la noche a una temperatura de 90°C. La mezcla se enfrío a temperatura ambiente, se concentró in vacuo, se disolvió en CH2CI2 (30 mL), y se lavó con salmuera (30 mL). Las fases orgánicas y acuosas se separaron, y la fase acuosa se extrajo con CH2CI2 (30 mL) dos veces. La fase orgánica combinada se secó sobre Na2S04, se concentró in vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de columna de gel de sílice para producir 3',5'-0-bis-(ter-butildimetilsilil)-5-(2-nitrobenciloxi)metil-2'-desoxicitidina 42 (60 mg, 69% para dos pasos). 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 8.08 (d, J = 8.0 Hz, 1 H, Ph-H), 7.81 (s, 1 H, H-6), 7.65 (m, 2 H, Ph-H), 7.64 (q, 1 H, J = 8.0 Hz, Ph-H), 7.49 (m, 1 H, Ph-H), 6.29 (t, 1 H, J = 6.4 Hz, H-1'), 5.75 (br s, 1 H, NH2), 4.85 (dd, 2 H, J = 13.6 Hz, Ph-CH2), 4.41 (s, 2 H, 5-CH2), 4.34 (m, 1 H, H-3'), 3.95 (m, 1 H, H-4'), 3.89 (dd, 1 H, J = 2.8 Hz, ?-5'a), 3.76 (dd, 1 H, J = 2.8 Hz, H- 5'b). 2.46 (m, 1 H( ?-2'a), 1.98 (m, 1 H, ?-2'b), 0.92 y 0.89 (2 s, 18 H, C(CH3)3), 0.11-0.08 (4 s, 12 H , CH3).

A una solución del compuesto 42 se le agregó (55 mg, 0.09 mmol) en THF (10 ml_), n-Bu4NF (63 mg, 0.20 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante cuatro horas y se concentró in vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de columna de gel de sílice para producir 5-(2-nitrobenciloxi)metil-2'-desoxicitidina 43 (34 mg, 96%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-de): d 8.05 (d, J = 8.0 Hz, 1 H, Ph-H), 7.89 (s, 1 H, H-6), 7.74 (m, 2 H, Ph-H), 7.55 (m, 1 H, Ph-H), 7.39 (br s, 1 H, D20 intercambiable, NH2), 6.74 (br s, 1 H, D20 intercambiable, NH2), 6.12 (t, 1 H, J = 6.4 Hz, H-1'), 5.21 (br s, 1 H, D20 intercambiable, 3'-OH), 4.99 (br s, 1 H, D20 intercambiable, 5'-OH), 4.81 (s, 2 H, Ph-CH2), 4.30 (dd, 2 H, J = 11.6 Hz, 5-CH2), 4.20 (m, 1 H, H-3'), 3.76 (m, 1 H, H-4*), 3.55 (m, 2 H, H-5'), 2.11 (m, 1 H, ?-2'a), 1.95 (m, 1 H, ?-2'b).

Se fosforiló el compuesto 43 (32 mg, 0.081 mmol) con POCI3 (30 pL,, 0.32 mmol) y una esponja de protones (35 mg, 0.16 mmol) en trimetilfosfato (0.35 ml_) a una temperatura de 0°C durante tres horas bajo una atmósfera de nitrógeno. Se agregó una solución de pirofosfato de tri-n-butilamonio (237 mg, 0.50 mmol) y tri-n-butilamina (100 pL) en DMF anhidro (1.0 ml_). Después de 10 minutos de agitación, se agregó amortiguador de bicarbonato de trietilamonio (0.1 , pH 7.5; 10 ml_). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante una hora y posteriormente se concentró in vacuo. El residuo se disolvió en acetonitrilo acuoso al 20% (20 mL), se filtró y se purificó mediante cromatografía de intercambio de aniones. Se combinaron las fracciones que contienen trifosfato y se liofilizaron para proporcionar 5-(2-nitrobenciloxi)metil-2'-desoxicitidina-5'-trifosfato dC.I, el cual se purificó en forma adicional utilizando RP-HPLC. HRMS (ESI): Para el ión molecular C17H22N4016P3 [M-H]\ la masa calculada fue 631.0244, y la masa observada fue 631.0258. 5-[(S)-1 -(2-nitrofeni¡)-2, 2-dimetil-propiloxi]metil-2'-desoxicitidina-5 '-trifosfato Esquema S21. Síntesis de 5-[(S)-1 -(2-n¡trofenil)-2,2-dimetil-propiloxi]metil-2'-desoxicitidina-5' -trifosfato Reactivos y condiciones: (i) (S)-1 -(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1 -propanol, 110°C, 21%; (ii) cloruro de 2,4,6-triisopropilbencenosulfonil, DMAP, Et3N, CH2CI2, temperatura ambiente, 31%; (iii) NH3, 1,4-dioxano, 90°C, 91%; (iv) n-Bu4NF, THF, temperatura ambiente, 82%; (v) POCI3, esponja de protón, (MeO)3PO, 0°C; (n-Bu3NH)2H2P207, n-Bu3N, DMF; 1 M HNEt3HC03.

Se calentaron a una temperatura de 110°C el compuesto 38 (Litosh y asociados, 2011, la cual está incorporada a la presente invención como referencia) (520 mg, 0.80 mmol) y (S)-1-(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propanol (580 mg, 2.8 mmol) durante una hora bajo una atmósfera de nitrógeno. La mezcla se enfrío a temperatura ambiente, se disolvió en una cantidad mínima de acetato de etilo, y se purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 3', 5'-0-bis-(ter-butilsimetilsilil)-5-[(S)-1-(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propiloxi]metil-2'-desoxiuridina 44 (115 mg, 21%). También se obtuvieron de la reacción (3' o 5')-0-(ter-butilsimetilsilil)-5-[(S)-1-(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propiloxi]metil-2'-desoxiuridina (78 mg, 17%) y 5-[(S)-1-(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propiloxi]metil-2'-desoxiuridina (16 mg, 4%). 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 8.97 (s, 1 H, NH), 7.76 (d, 2 H, J = 8.0 Hz, Ph-H), 7.60 (m, 2 H, Ph-H y H-6), 7.41 (s, 1 H, Ph-H), 6.29 (dd, 1 H, J = 6.0 y 7.6 Hz, H-1'), 4.97 (s 1 H, Ph- CH), 4.42 (m, 1 H, H-3'), 4.28 (AB d, 1 H, J = 12.0 Hz, 5-CH2a), 4.06 (AB d, 1 H, J = 12.0 Hz, 5-CH2b), 3.92 (m, 1 H, H-4'), 3.76 (m, 2 H, H-5'), 2.30 (m, 1 H, ?-2'a), 2.05 (m, 1 H, ?-2'b), 0.95 (s, 9 H, (CH3)3CS¡), 0.90 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0.83 (s, 9 H, (CH3)3C), 0.12 (s, 3 H, CH3Si), 0.09 (s, 3 H, CH3S¡), 0.07 (s, 3 H, CH3Si), 0.06 (s, 3 H, CH3Si).

Se agregó cloruro de bencenosulfonilo de 2,4,6-triisopropilo (61 mg, 0.20 mmol) a una solución del compuesto 44 (110 mg, 0.16 mmol), DMAP (20 mg, 0.17 mmol), y trietilamina (63 pL, 0.45 mmol) en CH2CI2 anhidro (3.0 ml_). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 36 horas bajo una atmósfera de nitrógeno, se concentró in vacuo, y el residuo se purificó mediante una cromatografía de columna de gel de sílice para producir 3',5'-0-bis-(ter-butilsimetilsilil)-5-[(S)-1 -(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propiloxi]metil-04-(2,4,6-triisopropilbencenosulfonil)-2'-desoxiuridina 45 (47 mg, 31%). H RMN (500 M Hz, CDCI3): d 8.08 (s, 1 H, H-6), 7.80 (dd, 1 H, J = 1.2 y 8.0 Hz, Ph-H), 7.78 (dd, 1 H, J = 1.6 y 8.0 Hz, Ph-H), 7.67 (m, 1 H, Ph-H), 7.46 (m, 1 H, Ph-H), 7.20 (s, 2 H, Ph-H), 6.09 (t, 1 H, J = 6.4 Hz, H-1'), 4.98 (s, 1 H, Ph-CH), 4.35 (m, 1 H, H-3'), 4.25 (AB d, 1 H, J = 11.6 Hz, 5-CH2a), 4.11 (AB d, 1 H, J= 11.6 Hz, 5-CH2b), 3.97 (m, 1 H, H-4'), 3.79 (dd, 1 H, J= 3.6 y 11.6 Hz, ?-5'a), 3.74 (dd, 1 H, J= 11.6 y 3.6 Hz, ?-5'b), 2.90 (m, 1 H, CH), 2.50 (m, 2 H, H-2'), 1.98 (m, 2 H, CH), 1.31 - 1.22 (m, 18 H, (CH3)2CH x 3), 0.88 (2 s, 18 H, (CH3)3CSi x 2), 0.87 (s, 9 H , (CH3)3C), 0.07 (s, 6 H , (CH3)2Si), 0.06 (s, 6 H, (CH3)2S¡).

Se agregó una solución de NH3 en 1,4-dioxano (0.5 M, 2.0 ml_) a una solución del compuesto 45 (47 mg, 0.05 mmol) en I, 4-dioxano anhidro (2.0 ml_). La mezcla se transfirió a un tubo sellado y se calentó a una temperatura de 90°C durante diez horas. La mezcla se enfrío a temperatura ambiente, se concentró in vacuo y el residuo se purificó mediante cromatografía de columna de gel de sílice para producir 3',5'-0-bis-(ter-butildimetilsilil)-5-[(S)-1-(2-nitrofenil)-2J2-dimetil-propiloxi]-metil-2'-desoxicitidina 46 (31 mg, 91%). 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 7.67 (m, 3 H, Ph-H), 7.53 (s, 1 H, H-6), 7.45 (m, 1 H, Ph-H), 6.30 (t, 1 H, J = 6.6 Hz, H-1*), 5.72 (br s, 2 H, NH2), 4.88 (s, 1 H, Ph-CH), 4.32 (m, 1 H, H-3'), 4.28 (AB d, 1 H, J = 12.8 Hz, 5-CH2a), 4.08 (AB d, 1 H, J = 12.8 Hz, 5-CH2b), 3.87 (m, 1 H, H-4'), 3.74 (dd, 1 H, J = 3.6 y 14.8 Hz, ?-5'a), 3.66 (dd, 1 H, J = 3.6 y 11.3 Hz, ?-5'b), 2.41 (m, 1 H, ?-2'a), 2.03 (m, 1 H, ?-2'b), 0.90 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0.87 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0.83 (s, 9 H, C(CH3)3), 0.09 (2 s, 6 H, (CH3)2Si), 0.06 (2 s, 6 H, (CH3)2Si).

Se agregó una solución de n-Bu4NF (28 mg, 0.09 mmol) en THF (1.0 niL) a una solución del compuesto 46 (20 mg, 0.03 mmol) en THF (2.0 mL). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 min y se concentró in vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de columna de gel de sílice para producir 5-[(S)-1 -(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propiloxi]metil- 2'-desoxicitidina 47 (11 mg, 82%). H RMN (400 MHz, CD3OD): d 7.87 (S, 1 H, H-6), 7.82 (dd, 1 H, J = 1.2 y 8.4 Hz, Ph-H), 7.76 (dd, 1 H, J = 1.6 y 8.0 Hz, Ph-H), 7.68 (m, 1 H, Ph-H), 7.51 (m, 1 H, Ph-H), 6.23 (t, 1 H , J= 6.6 Hz, H-1'), 4.94 (s, 1 H , P -CH), 4.44 (AB d, 1 H, J = 13.2 Hz, 5-CH2a), 4.34 (m, 1 H, H-3"), 4.11 (AB d, 1 H , J= 13.2 Hz, 5-CH2b), 3.88 (m, 1 H , H-4'), 3.71 (dd, 1 H, J= 3.2 y 12.0 Hz, ?-5'a), 3.63 (dd, 1 H, J= 4.0 y 12.0 Hz, H-5'b), 2.35 (m, 1 H , ?-2'a), 2.14 (m, 1 H , ?-2'b), 0.80 (s, 9 H , C(CH3)3).

Se fosforiló el compuesto 47 (11 mg, 0.025 mmol) con POCI3 (7 µ?_,, 0.075 mmol) y esponja de protón (11 mg, 0.05 mmol) en trimetilfosfato (0.3 mL) a una temperatura de 0°C durante tres horas bajo una atmósfera de nitrógeno. Se agregó una solución de pirofosfato de tri-n-butilamonio (59 mg, 0.125 mmol) y tri-n-butilamina (30 µ?_) en DMF anhidro (0.25 mL). Después de 5 minutos de agitación, se agregó amortiguador de bicarbonato de trietilamonio (1 M, pH 7.5; 5.0 mL). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante una hora y posteriormente se liofilizó hasta secarse. El residuo se disolvió en agua (5.0 mL), se filtró y purificó mediante cromatografía de intercambio de anión. Las fracciones que contienen trifosfato se combinaron y se liofilizaron para proporcionar 5-[(S)-1-(2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propiloxi]metil-2'-desoxicitidina-5'-trifosfato dC.V, el cual se purificó utilizando además RP-HPLC. HRMS (ESI): Para el ión molecular C2iH3oN4016P3 [M-H]\ la masa calculada fue 687.0870, y la masa observada fue 687.0873. 5-[(S)-1 -(5-Metoxi-2-nitrofenil)-2, 2-dimetil-propiloxi]metil- 2'-desoxicit¡dina-5'-tr¡ fosfato Esquema S22. Síntesis de 5-[(S)-1 -(5-metoxi-2- nitrofenil)-2,2-dimetil-propiloxi]met¡l-2'-desoxic¡tidina-5'- trifosfato. Reactivos y condiciones: (i) TBSCI, imidazol, DMF, temperatura ambiente, 70%; (¡i) cloruro de 2,4,6- triisopropilbencenosulfonil, DMAP, Et3N, CH2CI2, temperatura ambiente; (iii) NH3, 1 ,4-dioxano, 90°C, 65% para dos pasos; (iv) n-Bu4NF, THF, temperatura ambiente, 82%; (v) POCI3, esponja de protón, (MeO)3PO, a una temperatura de 0°C; (n-Bu3NH)2H2P207, n-Bu3N, DMF; 1 M HNEt3HC03.

Se agregó a una solución del compuesto 39 (235 mg, 0.49 mmol) en DMF anhidro (3.0 ml_), TBSCI (320 mg, 0.8 mmol) e imidazol (109 mg, 1.6 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante seis horas, se concentró in vacuo, se disolvió en CH2CI2 (20 ml_), y se lavó con una solución NaHC03 saturada (50 ml_). Se separaron las fases orgánica y acuosa, y la fase acuosa se extrajo con CH2CI2 (30 ml_) tres veces. La fase orgánica combinada se secó con Na2S04, se concentró in vacuo, y el residuo se purificó mediante una cromatografía de gel de sílice para producir 3',5'-0-bis-(ter-butildimetilsilil)-5-[(S)-1 -(5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propiloxi]metil-2'-desoxiuridina 48 (245 mg, 70%). 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 8.00 (br s, 1 H, NH), 7.88 (d, J = 9.2 Hz, 1 H, Ph-H), 7.60 (s, 1 H, H-6), 7.22 (d, 1 H, J = 2.8 Hz, Ph-H), 6.84 (dd, 1 H, J = 2.8 y 8.0 Hz, Ph-H), 6.25 (dd, 1 H, J = 5.6 y 8.0 Hz, H-1 ') , 5.23 (s, 1 H, Ph-CH), 4.40 (m, 1 H, H-3"), 4.26(d, 1 H, J= 12 Hz, 5-CH2a), 4.11 (d, 1 H, J= 12 Hz,5-CH2b), 3.89 (m, 4 H, OCH3 y H-4'), 3.78 (m, 2 H, H-5'), 2.27 (m, 1 H, ?-2'a), 2.04 (m, 1 H, H-2*b), 0.90 y 88 (2 s, 18 H, SiC(CH3)3), 0.84 (s, 9 H, C(CH3)3), 0.08 (3 s, 12 H, CH3).

Se agregó cloruro de bencenosulfonilo de 2,4,6- Triisopropilo (363 mg, 1.2 mmol) a una solución del compuesto 48 (170 mg, 0.24 mmol), DMAP (32 mg, 0.26 mmol), y trietilamina (0.34 ml_, 2.4 mmol) en CH2CI2 anhidro (8.0 ml_). La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante la noche bajo una atmósfera de nitrógeno, se concentró in vacuo, y se disolvió el residuo en una solución de NH3 en 1 ,4-dioxano (0.5 M, 20 ml_). La mezcla se transfirió a un tubo sellado y se calentó durante la noche a una temperatura de 90°C. La mezcla se enfrío a temperatura ambiente, se concentró in vacuo, se disolvió en CH2CI2 (20 mL), y se lavó con salmuera (50 mL). Se separaron las fases orgánica y acuosa, y la fase acuosa se extrajo con CH2CI2 (30 mL) tres veces. La fase orgánica combinada se secó sobre Na2S04, se concentró in vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de columna de gel de sílice para producir 3',5'-0-bis-(ter-butildimetilsilil)-5-[(S)-1 -(5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propiloxi]metil-2'-desoxicitidina 49 (110 mg, 65% para dos pasos). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 7.96 (d, J = 8.8 Hz, 1 H, Ph-H), 7.50 (br s, 1 H, NH2), 7.38 (s, 1 H, H-6), 7.08 (dd, 1 H, J = 2.8 y 8.8 Hz, Ph-H), 7.04 (d, 1 H , J = 2.8 Hz, Ph-H), 6.80 (br s, 1 H, NH2), 6.13 (t, 1 H, J = 6.4 Hz, H-1'), 5.09 (s, 1 H, Ph-CH), 4.31 (m, 1 H, H-3'), 4.25 (d, 1 H, J= 12.8 Hz, 5-CH2a), 4.08 (d, 1 H, J = 12.8 Hz, 5-CH2b), 3.87(s, 3 H, OCH3), 3.76 (m, 1 H, H-4'). 3.64 (m, 2 H, H-5'), 3.76 (dd, 1 H, J= 2.8 Hz, ?-5'b), 2.10 (m, 1 H, ?-2'a), 2.00 (m, 1 H, ?-2'b), 0.87 (s, 9 H, C(CH3)3), 0.78 y 0.76 (2 s, 18 H, S¡C(CH3)3), 0.07, 0.06, -0.01, y -0.04 (4 s, 12 H, S¡CH3).

Se agregó a una solución del compuesto 49 (130 mg, 0.18 mmol) en THF (10 mL), n-Bu NF (141 mg, 0.44 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante cuatro horas, se concentró in vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de columna de gel de sílice para producir 5-[(S)-1-(5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propiloxi]metil-2'-desoxicitidina 50 (72 mg, 82%). 1H RMN (400 MHZ, DMSO-d6): d 7.99 (d, J = 8.0 Hz, 1 H, Ph-H), 7.65 (s, 1 H, H-6), 7.42 (br s, 1 H, D20 intercambiable, NH2a), 7.06 (m, 2 H, Ph-H), 6.72 (br s, 1 H, D20 intercambiable, NH2b), 6.11 (t, 1 H, J = 6.4 Hz, H-1'), 5.17 (d, 1 H, D20 intercambiable, 3'-OH), 5.12 (s, 1 H, Ph-CH), 4.78 (t, 1 H, D20 intercambiable, 5'-OH), 4.25 (d, 1 H, J = 12.4 Hz, 5-CH2a), 4.15 (m, 1 H, H-3'), 4.05 (d, 1 H, J = 12.4 Hz, 5-CH2b), 3.87(s, 3 H, OCH3), 3.72 (m, 1 H, H-41), 3.44 (m, 2 H, H-5'), 3.76 (dd, 1 H, J = 2.8 Hz, ?-5'b), 2.08 (m, 1 H, ?-2'a), 1.95 (m, 1 H, ?-2'b), 0.77 (s, 9 H, C(CH3)3).

Se fosforiló el compuesto 50 (20 mg, 0.043 mmol) con POCI3 (24 µ?_,, 0.26 mmol) y una esponja de protón (19 mg, 0.086 mmol) en trimetilfosfato (0.3 mL) a una temperatura de 0°C durante seis horas bajo una atmósfera de nitrógeno. Se agregó a una solución de pirofosfato de tri-n-butilamonio (237 mg, 0.50 mmol) y tri-n-butilamina (100 \L) en DMF anhidro (1.0 mL). Después de 10 minutos de agitación, se agregó amortiguador de bicarbonato de trietilamonio (0.1 M, pH 7.5; 10 ml_). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante una hora y posteriormente se concentró in vacuo. El residuo se disolvió en 20% acetonitrilo acuoso (20 mL), se filtró, y se purificó mediante cromatografía de intercambio de anión. Se combinaron las fracciones que tienen trifosfato y se liofilizaron para proporcionar 5-[(S)-1-(5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propiloxi]metil-2'-desoxicitidina-5'-trifosfato dC.VI, el cual se purificó en forma adicional utilizando RP-HPLC. HRMS (ESI): Para el ion molecular C22H32N 017 3 [M-H]', la masa calculada fue 719.0975, la masa observada fue 719.0983.

Ejemplo 7 -Síntesis de (R/S)-1 -(4-yodo-5-nr»etox¡-2-nitrofenil)-2, 2-dimetil-1 -propanol y (S)-1 -(4-yodo-5-metoxi-2-nitrofenil)- 2,2-dimetil-1-propanol 3-yodoanisol 3,6-diyodo - {R S)- 1-(4-yodo-5-metox¡ (IS)-camfanato de nitroanisol 2-nitrofenil)-2,2<lirnetil- (/?/S)-1 -(4-yodo-5-metox¡- 1 -propanol 2-nitrofenil)-2,2-dimetil- 1 -propilo (IS)-camfanato de (S)-1 -(4^odo-5-metoxi- (S)-1-(4-yodo-5-metoxi- 2-nitrofen¡l)-2,2<üme1il- 2-nitrofenil)-2,2-d¡met¡l- 1-propanol 1 -propilo Esquema S23. Síntesis de (R/S)-1 -(4-y odo-5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1 -propanol y (S)- 1 -(4-y odo-5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propanol. (i) Na N02, CH3COOH, HNO3, temperatura ambiente; l2, 60 °C, 25% para dos pasos (80% puro); (ii) PhMgCI, (C H3)3C C HO , THF, menos 40°C a temperatura ambiente, 72%; (iii) cloruro de ácido de (1S)-camfánico, DMAP, CH2CI2 , temperatura ambiente, 80%; (iii) cristalización fraccional a partir de etanol, 63%; (iv) K2C03, MeOH, reflujo.

Se mezcló lentamente ácido nítrico (68-70%, 125 mL) con ácido acético glacial (125 mi) a temperatura ambiente, seguida de la adición de NaN02 (400 mg, 5.8 mmol) y 3-yodoanisol (10 g, 42.7 mmol). Después de que se agitó la reacción a temperatura ambiente durante 24 horas, se agregó (10.8 g, 42.7 mmol) y la mezcla se agitó durante la noche a una temperatura de 60°C. La mezcla de reacción se vertió en hielo-agua (500 mi) y se extrajo mediante CH2CI2 (100 mi) tres veces. La fase orgánica combinada se neutralizó con una solución NaHC03 saturada (500 mi), se lavó con una solución acuosa de Na2S203 (20%, 100 mi), se secó sobre Na2S04, y se concentró in vacuo. El residuo se purificó mediante una cromatografía de columna de gel de sílice para producir 3,6-diyodo-4-nitroanisol crudo (5.4 g), el cual se mezcló con un sub-producto desconocido (20%) y se utilizó en el siguiente paso sin purificación adicional. H RMN (400 MHz, CDCI3): d 8.42 (s, 1 H, Ph-H), 7.33 (s, 1 H, Ph-H), 3.97 (s, 3 H , OCH3).

A una solución de 3,6-diyodo-4-nitroanisol crudo (770 mg, 80% pureza, 1.52 mmol) en THF anhidro (10 mL) a una temperatura de menos 40°C bajo una atmósfera de nitrógeno, se agregó en forma de gotas cloruro de fenilmagnesio (2 M en THF, 0.46 mL, 0.92 mmol) en un rango tal que la temperatura no podría exceder menos de 35°C. Al termino de la adición, la mezcla se agitó a una temperatura menos de 40°C durante dos horas, seguida por la adición de trimetilacetaldeh ido (0.22 mL, 1.97 mmol). La mezcla se agitó a una temperatura de menos de 30°C durante dos horas y posteriormente a temperatura ambiente durante otra hora. Posteriormente la reacción se extinguió con salmuera (1.0 mL), se diluyó con CH2CI2 (100 mL), y la solución se lavó con CH3COOH (0.1 N, 50 mi) y salmuera (50 mi) en secuencias. La fase orgánica se secó sobre Na2S04, se concentró ¡n vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de columna de gel de sílice para producir (R/S)-1-(4-yodo-5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-d¡metil-1-propanol racémico (399 mg, 72%). 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 8.32 (s, 1 H, Ph-H), 7.17 (s, 1 H, Ph-H), 5.60 (d, 1 H, J = 4.0 Hz, PhCH), 3.98 (s, 3 H, OCH3), 2.12 (d, 1 H, J= 4.0 Hz, OH), 0.89 (s, 9H,C(CH3)3).

A una solución de (R/S)-1 -(4-yodo-5-metoxi-2-nitrofenil)-2, 2-dimetil-1 -propanol racémica (395 mg, 1.1 mmol) y DMAP (263 mg, 2.16 mmol) en CH2CI2 anhidro (5.0 mL), se le agregó cloruro de ( 1 S)-camfánico (Corrie y asociados, 1992, la cual está incorporada a la presente invención como referencia) (350 mg, 1.62 mmol), y la mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente bajo una atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se diluyó con CH2CI2 (50 ml_) y se lavó con una solución NaHC03 saturada (50 ml_). La fase orgánica se secó sobre Na2S04, se concentró ¡n vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de columna de gel de sílice para producir ( 1 S)-camfanato de (R/S)-1 -(4-yodo-5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1 -propilo (490 mg, 80%, mezcla de diastereómeros 1:1).

Se disolvió ( 1 S)-camfanato de (f?/S)-1 -(4-yodo-5-metox¡-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1 -propilo (3.4 g) en etanol hirviendo (150 mi), la solución se mantuvo en un baño de aceite caliente y se enfrío lentamente a temperatura ambiente y se mantuvo durante la noche. Se formaron gradualmente cristales de aguja y se recolectaron mediante filtración para producir el diastereómero simple puro (1 S)-camfanato de (R)-1 -(4-yodo-5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1 -propil (870 mg, 51%). El licor madre restante se concentró in vacuo, y el residuo se disolvió nuevamente en etanol hirviendo (150 mi), y la solución se enfrío rápidamente a temperatura ambiente y los cristales de aguja se formaron a las dos horas. Los cristales se recolectaron mediante filtración para producir el diastereómero simple puro (1 S)-camfanato ' de (S)-1 -(4-yodo-5-metoxi-2-nitrofen¡l)-2,2- dimetil-1 -propilo. El proceso de cristalización se repitió dos veces para producir (S)-diastereómero puro adicional (total 1.07 g, 63 %). H RMN (400 MHz, CDCI3) para ( 1 S)-camfanato de (R)-1 -(4 -yodo-5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1 - propilo: d 8.48 (s, 1 H, Ph-H), 6.94 (s, 1 H, Ph-H), 6.84 (s, 1 H, Ph-CH), 3.93 (s, 3 H, OCH3), 2.42 (m, 1 H, CH), 2.11 (m, 1 H, CH), 1.92 (m, 1 H, CH2), 1.75 (m, 1 H, CH2), 1.11 (s, 3 H, CH3), 1.05 (s, 3 H, CH3), 0.97 (s, 9 H, C(CH3)j), 0.86 (s, 3 H, CH3). 1H RMN (400 MHz, CDCI3) para (1 S)-camfanato de (S)-1 -(4-y odo-5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propilo: d 8.48 (s, 1 H, Ph-H), 6.95 (s, 1 H, Ph-H), 6.80 (s, 1 H, Ph-CH), 3.96 (s, 3 H, OCH3), 2.37 (m, 1 H, CH), 1.92 (m, 2 H, CH2), 1.66 (m, 1 H, CH), 1.14 (s, 3 H, CH3), 1.07 (s, 3 H, CH3), 1.06 (s, 3 H, CH3), 0.98 (s, 9 H, C(CH3)3).

Una mezcla de ( 1 S)-camfanato de (S)-1 -(4-yodo-5-metoxi- 2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1 -propilo (1.1 g, 2.0 mmol) y K2C03 (552 mg, 4.0 mmol) en metanol (50 ml_) se calentó a reflujo durante una hora, y posteriormente se enfrío, se concentró in vacuo, y se diluyó con CH2CI2 (50 mJ_). La fase orgánica se lavó con salmuera (50 mL), se secó sobre Na2S04, se concentró in vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de columna de gel de sílice para producir (S)-1 -(4-yodo-5-metox¡-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1 -propanol enantiopuro (720 mg, 98%). 1H RMN (400 MHz. CDCI3): d 8.32 (s, 1 H, Ph-H), 7.17 (s, 1 H, Ph-H), 5.60 (d, 1 H, J= 4.0 Hz, PhCH), 3.98 (s, 3 H, OCH3), 2.12 (d, 1 H, J= 4.0 Hz, OH), 0.89 (s, 9H,C(CH3)3).

Ejemplo 8 - Síntesis de Nucieótidos de Hidroximetilo Alquilados con tBu-5-OMe-2-nitrobencilo Etiquetados con Tinta Síntesis de (R/S)-1 -(4-yodo-5-metoxi-2-nitrofenil)-2, 2-d i metí 1-1 -propanol y (S)-1 -(4-yodo-5-metoxi-2-nitrofenil)-2, 2-dimetil-1 -propanol 3-yodoanisol 3,6-diyodo-4- {R/S)- 1-(4-yodo-5-metox¡. (IS)-camfanato de nitroanisol 2-n¡trofenil)-2,2-dimetil- (R/S)-1-(4-yodo-5-metox¡- 1 -propanol 2-nitrofenil)-2,2-dimetil- 1 -propilo (IS)-camfanato de (S)-1 -(4-yodo-5-metoxi- (s)"1 -(4-yodo.5-metox¡- 2-nitrofenil)-2.2-dimetil- 2-nitrofenil)-2,2-d¡metil- 1 -propilo 1-propanol Esquema S24. Síntesis de (R/S)-1 -(4-y odo-5-metox¡-2-nitrofenil)-2,2-dimet¡l-1 -propanol y (S)-1 -(4-yodo-5-metox¡-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propanol. (i) NaN02, CH3COOH, HN03, temperatura ambiente; l2, 60°C, 25% durante dos pasos (80% puro); (ii) PhMgCI, (CH3)3CCHO, THF, menos 40°C a temperatura ambiente, 72%; (iii) cloruro de ácido (1S)-camfánico, DMAP, CH2CI2 , temperatura ambiente, 80%; (iii) cristalización fraccional a partir de etanol, 63%; (iv) K2C03, MeOH, reflujo, 98%.

Se mezcló lentamente ácido nítrico (68-70%, 125 mL) con ácido acético glacial (125 mi) a temperatura ambiente, seguido de la adición de NaN02 (400 mg, 5.8 mmol) y 3-yodoanisol (10 g, 42.7 mmol). Después de que la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas, se agregó l2 (10.8 g, 42.7 mmol) y la mezcla se agitó durante la noche a una temperatura de 60°C. La mezcla de reacción se vertió en hielo-agua (500 mi) y se extrajo mediante CH2CI2 (100 mi) tres veces. La fase orgánica combinada se neutralizó con una solución NaHC03 saturada (500 mi), se lavó con una solución acuosa de Na2S203 (20%, 100 mi), se secó sobre Na2S04, y se concentró in vacuo. El residuo se purificó mediante cromatografía de columna de gel de sílice para producir 3,6-diyodo-4-nitroanisol crudo (5.4 g), el cual se mezcló con un sub-producto desconocido (20%) y se utilizó en el siguiente paso sin purificación adicional. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 8.42 (s, 1 H, Ph-H), 7.33 (s, 1 H, Ph-H), 3.97 (s, 3 H, OCH3).

A una solución de 3,6-diyodo-4-nitroanisol crudo (770 mg, 80% pureza, 1.52 mmol) en THF anhidro (10 mL) a una temperatura de menos de 40°C bajo una atmósfera de nitrógeno, se le agregó en forma de gotas cloruro de fenilmagnesio (2 M en THF, 0.46 mL, 0.92 mmol) en un rango tal que la temperatura no puede exceder menos de 35°C. Al termino de la adición, la mezcla se agitó a una temperatura de menos de 40°C durante dos horas, seguido de la adición de trimetilacetaldehído (0.22 mL, 1.97 mmol). La mezcla se agitó a una temperatura de menos de 30°C durante dos horas y posteriormente durante la noche una hora. . La reacción se extinguió posteriormente con salmuera (1.0 mL), se diluyó con CH2CI2 (100 mL), y la solución se lavó con CH3COOH (0.1 N, 50 mi) y salmuera (50 mi) en secuencias. La fase orgánica se secó sobre Na2S04, se concentró in vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de columna de gel de sílice para producir (R/S)-1 - (4-yodo-5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1 -propanol racémico (399 mg, 72%). H RMN (400 MHz, CDCI3): d 8.32 (s, 1 H, Ph-H), 7.17 (s, 1 H, Ph-H), 5.60 (d, 1 H, J = 4.0 Hz, PhCH), 3.98 (s, 3 H, OCH3), 2.12 (d, 1 H, J= 4.0 Hz, OH), 0.89 (s, 9H,C(CH3)3).

A una solución de (R/S)-1 -(4-yodo-5-metoxi-2-nitrofenil)-2, 2-dimetil-1 -propanol racémica (395 mg, 1.1 mmol) y DMAP (263 mg, 2.16 mmol) en CH2CI2 anhidro (5.0 mL), se le agregó cloruro de ( 1 S)-camfánico (Corrie y asociados, 1992, la cual está incorporada a la presente invención como referencia) (350 mg, 1.62 mmol), y la mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente bajo una atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se diluyó con CH2CI2 (50 mL) y se lavó con una solución de NaHCo3 saturada (50 ml_). La fase orgánica se secó sobre Na2S0 , se concentró in vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de columna de gel de sílice para producir ( 1 S)-camfanato de (R/S)-1 -(4-yodo-5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1 -propilo (490 mg, 80%, mezcla de diastereómeros).

Se disolvió en ( 15)-camfanato de (R/S)-1 -(4-yodo-5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1 -propil (3.4 g) en etanol hirviendo (150 mi), La solución se mantuvo en un baño de aceite caliente y se enfrío lentamente a temperatura ambiente y se mantuvo durante la noche. Se formaron gradualmente cristales de aguja y se recolectaron mediante filtración para producir el diastereómero simple puro (1 S)-camfanato de (R)-1-(4-yodo-5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1 -propilo (870 mg, 51%). El licor madre restante se concentró in vacuo, y el residuo se disolvió nuevamente en etanol hirviendo (150 mi), y la solución se enfrío rápidamente a temperatura ambiente y se formaron cristales de aguja a las dos horas. Los cristales se recolectaron mediante filtración para producir un diastereómero simple puro (1 S)-camfanato de (S)-1 -(4-yodo-5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1 -propilo. El proceso de cristalización se repitió dos veces para producir (S)-diastereómero puro adicional (total 1.07 g, 63 %). 1H RMN (400 MHz, CDCI3) para (1 S)-camfanato de (R)-1 -(4-yodo-5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1 -propil: d 8.48 (s, 1 H, Ph-H), 6.94 (s, 1 H, Ph-H), 6.84 (s, 1 H , Ph-CH), 3.93 (s, 3 H , OCH3), 2.42 (m, 1 H, CH), 2.11 (m, 1 H, CH), 1.92 (m, 1 H, CH2), 1.75 (m, 1 H, CH2), 1.11 (s, 3 H, CH3), 1.05 (s, 3 H , CH3), 0.97 (s, 9 H , C(CH3)3), 0.86 (s, 3 H, CH3). 1H RMN (400 MHz, CDCI3) para (1 S)-camfanato de (S)-1-(4-yodo-5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1 -propilo: d 8.48 (s, 1 H , Ph-H), 6.95 (s, 1 H , Ph-H), 6.80 (s, 1 H, Ph-CH), 3.96 (s, 3 H, OCH3), 2.37 (m, 1 H, CH), 1.92 (m, 2 H, CH2), 1.66 (m, 1 H , CH), 1.14 (s, 3 H, CH3), 1-07 (s, 3 H, CH3), 1.06 (s, 3 H, CH3), 0.98 (s, 9 H, C(CH3)3).

Una mezcla de ( 1 S)-camfanato de (S)-1 -(4-yodo-5-metox¡- 2-n¡trofenil)-2,2-dimet¡l-1 -propilo (1.1 g, 2.0 mmol) y K2C03 (552 mg, 4.0 mmol) en metanol (50 mL) se calentó a reflujo durante una hora, posteriormente se enfrío, se concentró in vacuo, y se diluyó con CH2CI2 (50 mL). La fase orgánica se lavó con salmuera (50 mL), se secó sobre Na2S04, se concentró in vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de columna de gel de sílice para producir un (S)-1 -(4-yodo-5-metoxi-2-nitrofenil)-2 ,2-dimetil-1 -propanol enantiopuro (720 mg, 98%). 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 8.32 (s, 1 H, Ph-H), 7.17 (s, 1 H, Ph-H), 5.60 (d, 1 H, J= 4.0 Hz, PhCH), 3.98 (s, 3 H, OCH3), 2.12 (d, 1 H, J= 4.0 Hz, OH), 0.89 (s, 9H,C(CH3)3).

Síntesis de 7-{(S)-1 -[4-(3-amino-1 -propinil)-5-metoxi-2-nitrofenil]-2, 2-dimetil-propiloxi}metil- 7-deaza-2'-desoxiadenosina-5'-trifosfato y 5'-a-tiotri fosfato etiquetado con tinta 53 54a R = O 54b R = S Esquema S25a. Síntesis de 7-{(S)-1 -[4-(3-amino-1 -propinil)-5-metox¡-2-nitrofenil]-2,2-dimetil-propiloxi}metil-7-deaza-2'-desoxiadenosina-5'-trifosfato y 5'-a-tiotrif osfato etiquetado con tinta. Reactivos y condiciones: (i) MsCI, DMAP, CH2CI2. (i i) (S)-1-(4-yodo-5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propanol, 110°C; (iii) n-Bu4NF, THF, temperatura ambiente; 29% para tres pasos; (iv) NH3, 1 ,4-dioxano/MeOH , 100°C, 80%; (v) N-propargiltrifluoroacetamida, Pd(PPh3)4(0), Cul, Et3N, DMF, 98%; (vi) Para 54a: POCI3, esponja de protón, (MeO)3PO, 0°C; (r?-Bu3NH)2H2P207, n-Bu3N, DMF; 1 M HNEt3HC03; NH4OH. Para 54b: PSCI3, 2,4,6-colidina, (EtO)3PO, 0°C a temperatura ambiente; (n-Bu3N H)2H2P207, n-Bu3N, DMF; 1 M HNEt3HC03; NH4OH. 55b R = S Esquema S25b. (vi) Alexa Fluor 488 NHS, amortiguador 0.1 M Na2C03/NaHC03 (pH 9.2).

Se agregaron DMAP (463 mg, 3.80 mmol) y MsCI (177 µ?_, 2.28 mmol) a una solución del compuesto 4 (400 mg, 0.76 mmol) en CH2CI2 anhidro (5.0 ml_) a una temperatura de 0°C bajo una atmósfera de nitrógeno La reacción se agitó a una temperatura de 0°C durante 10 minutos y por la noche a temperatura ambiente durante 3 horas. Posteriormente la reacción se diluyó con CH2CI2 (20 ml_). La solución se aplicó en un tapón de gel de sílice corto (2 x 3 cm) y se eluyó rápidamente con un sistema de solvente de hexa no/acetato de etilo/trietilamina (80 mL, proporción de volumen: 80/20/0.5). El eluente se concentró in vacuo, y el residuo se mezcló con (S)-1 - (4-yodo-5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1 - propanol (500 mg, 1.37 mmol). La mezcla se calentó a una temperatura de 115°C durante 45 minutos bajo una atmósfera de nitrógeno, se enfrío a temperatura ambiente y se disolvió en THF (10 mL). Se agregó n-Bu4NF (526 mg, 1.67 mmol) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 12 horas y posteriormente se concentró in vacuo. El residuo se disolvió en CH2CI2 (50 mL) y se lavó con salmuera (50 mL), y la fase acuosa se extrajo con CH2CI2 (20 mL) dos veces. La fase orgánica combinada se secó sobre Na2S04, se concentró in vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 6-cloro-9-(p-D-2'-desoxiribofuranosil)-7-[(5)-1-(4-yodo-5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propiloxi]-metil-7-deazapurina 51 (135 mg, 29% para tres pasos). 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 8.56 (s, 1 H, H-2), 8.21 (s, 1 H, Ph-H), 7.34 (s, 1 H, H-8), 7.02 (s, 1 H, Ph-H), 6.35 (dd, 1 H, J= 6.0 y 8.8 Hz, H-1*), 5.20 (s, 1 H, Ph-CH), 4.76 (dd, 2 H, J= 12.4 y 36.4 Hz, 7-CH2), 4.74 (m, 1 H, H-3'), 4.13 (m, 1 H, H-4'), 3.96 (m, 1 H, ?-5'a), 3.92 (s, 3 H, OCH3), 3.80 (m, 1 H, ?-5'b), 2.85 (m, 1 H, ?-2'a), 2.30 (m, 1 H, ?-2'b), 0.83 (s, 9 H, C(CH3)3).

Se disolvió el Compuesto 51 (135 mg, 0.22 mmol) en 1,4-dioxano (10 mL) seguido de la adición de NH3 en MeOH (7 N, 20 mL). La mezcla se transfirió a un tubo sellado y se agitó a una temperatura de 100°C durante 24 horas, posteriormente se enfrío a temperatura ambiente, se concentró ¡n vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 7-[(S)-1 - (4-yodo-5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propiloxi]metil-7-deaza-2'-desoxiadenosina 52 (110 mg, 80%). 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 8.24 (s, 1 H, H-2), 8.22 (s, 1H, Ph-H), 6.96 (s, 1 H, Ph-H), 6.79 (s, 1 H, H-8), 6.14 (dd, 1 H, J = 6.0 y 7.6 Hz, H-1'), 5.21 (s, 1 H, Ph-CH), 4.74 (m, 1 H, H-3'), 4.56 (dd, 2H, J = 13.2 y 24.8 Hz, 7-CH2), 4.17 (m, 1 H, H-4'), 3.93 (m, 1H, ?-5'a), 3.83 (s, 3H, OCH3), 3.79 (m, 1H, ?-5'b), 2.96 (m, 1 H, ?-2'a), 2.21 (m, 1 H, ?-2'b), 0.83 (s, 9 H, C(CH3)3).

Una solución del compuesto 52 (183 mg, 0.29 mmol), N-propargiltrifluoroacetilamida (435 mg, 2.9 mmol), tetrakis(trifenilfosfina)-paladio(0) (66 mg, 0.057 mmol), Cul (21 mg, 0.11 mmol), y Et3N (170 µ?, 1.22 mmol) en DMF anhidro (4.0 mL) se agitó a una temperatura de 50°C durante 24 horas. La mezcla se concentró in vacuo y se purificó mediante cromatografía de columna de gel de sílice para producir 7-{(S)-1 - [5-metoxi-4-(3-trifluoroacetamido-1 - propinil)-2-nitrofenil]-2,2-dimetil-propiloxi}metil-7-deaza-2'-desoxiadenosina 53 (185 mg, 98%). 1H RMN (400 MHz, MeOH-d4): d 8.06 (s, 1 H, H-2), 7.89 (s, 1 H, Ph-H), 7.17 (s, 1 H, H-8), 7.15 (s, 1 H , Ph-H), 6.37 (dd, 1 H , J= 6.0 y 7.6 Hz, H-1'), 5.23 (s, 1 H , Ph-CH), 4.68 (d, 1 H, J = 12.8 Hz, 7-CH2a), 4.49 (m, 1 H, H-3'), 4.34 (s, 2H, CH2), 3.97 (m, 1 H , ?-4·), 3.86 (s, 3 H , OCH3), 3.70 (m, 2 H, H-5'), 2.59 (m, 1 H , ?-2'a), 2.2.8 (m, 1 H, ?-2'b), 0.85 (s, 9 H, C(CH3)3).

Se fosforiló el Compuesto 53 (52 mg, 0.08 mmol) con POCI3 (14 µ?_, 0.15 mmol) y una esponja de protón (34 mg, 0.16 mmol) en trimetilfosfato (0.5 mL) a una temperatura de 0°C durante 3 horas bajo una atmósfera de nitrógeno. Se agregó una solución de pirofosfato de bis-tri-n-butilamonio (237 mg, 0.5 mmol) y tri-n-butilamina (100 µ?_) en DMF anhidro (1.0 mL). Después de 10 minutos de agitación, se agregó una solución de bicarbonato de trietilamonio (TEAB, 0.1 , pH 7.5; 10 mL). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante una hora y posteriormente se concentró in vacuo. El residuo se disolvió en 75% 0.1 M TEAB/25% de acetonitrilo (20 mL), se filtró y purificó mediante cromatografía de intercambio de anión utilizando una columna Q Sefarosa FF (2.5 x 20 cm). Fase móvil: A, 75% 0.1 M TEAB/25% acetonitrilo; B, 75% 1.5 M TEAB/25% acetonitrilo. Las fracciones que contienen trifosfato se combinaron y liofilizaron hasta secarse. El residuo se disolvió en agua (10 mL) y se trató con hidróxido de amonio concentrado (10 mL, 27%) a temperatura ambiente durante una hora para producir 7-{(S)-1-[4-(3-am¡no-1-propinil)-5-meto i-2-nitrofenil]-2,2-d¡metil-propiloxi}metil-7-deaza-2'-desoxiadenosina-5'-trifosfato 54a, el cual se purificó en forma adicional mediante HPLC de fase inversa sobre una columna PerkinElmer Aquapore OD-300 (7 pm, 250 x 4.6 mm). Fase móvil: A, 0.1 M TEAB; B, acetonitrilo. HRMS (ESI): Para el ión molecular [ -H]", la masa calculada fue 793.1401, y la masa observada fue 793.1426.

Se tiofosforiló el compuesto 53 (91 mg, 0.14 mmol) con PSC (14 µ?_, 0.14 mmol) y 2,4,6-colidina (34 mg, 0.28 mmol) en trietilfosfato (1.0 mL) a una temperatura de 0°C durante 1 hora bajo una atmósfera de nitrógeno. Se agregó una solución de pirofosfato de bis-tri-n-butilamonio (332 mg, 0.7 mmol) y tri-n-butilamina (140 µ?_) en DMF anhidro (1.4 mL). Después de 2 minutos de agitación, se agregó una solución de bicarbonato de trietilamonio (TEAB, 1 M, pH 7.5; 20 mL). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante una hora y posteriormente se concentró in vacuo. El residuo se disolvió en 75% 0.1 M TEAB/25% acetonitrilo (20 mL), se filtró, y purificó mediante cromatografía de intercambio de aniones utilizando una columna Q Sefarosa FF (2.5 x 20 cm). Fase móvil: A, 75% 0.1 M TEAB/25% acetonitrilo; B, 75% 1.5 M TEAB/25% acetonitrilo. Las fracciones que contienen el tiotrifosfato se combinaron y liofilizaron hasta secarse. El residuo se disolvió en agua (10 mL) y se trataron con hidróxido de amonio concentrado (10 mL, 27%) a temperatura ambiente durante una hora para producir 7-{(S)-1-[4-(3-amino-1-propinil)-5-metoxi-2-nitrofenil]-2,2-dimetil- propiloxi}metil-7-deaza-2'-desox¡adenosina-5'-a-tiotr¡ fosfato 54b, el cual se purificó en forma adicional mediante HPLC de fase inversa sobre una columna PerkinElmer Aquapore OD-300 (7 pm, 250 x 4.6 mm). Fase móvil: A, 0.1 M TEAB; B, acetonitrilo. HRMS (ESI): Para el ión molecular C27H36N6Oi5 3S [M-H]~, la masa calculada fue 809.1172, y la masa observada fue 809.1155.

Se agregó una solución de Alexa Fluor 488 NHS (5 mg, 7.8 pmol) en D SO anhidro (200 pL a una solución de trifosfato 54a (1.6 µ?t???) en amortiguador NaHC03/Na2C03 (0.1 M, 30 pH 9.2, 0.4 ml_). La mezcla se dejó a temperatura ambiente en la oscuridad durante una hora. La mezcla se purificó primero mediante HPLC de intercambio de aniones en una columna Dionex ADNpac PA200 (250 x 4 mm). Fase móvil: A, 75% 0.1 M TEAB/25% acetonitrilo; B, 75% 1.5 M TEAB/25% acetonitrilo. Las fracciones que contienen el trifosfato 55a marcado con tinta se combinaron y concentraron hasta obtener un volumen pequeño, y el producto se purificó en forma adicional mediante HPLC de fase inversa sobre una columna PerkinElmer Aquapore OD-300 (7 pm, 250 x 4.6 mm). Fase móvil: A, 0.1 M TEAB; B, acetonitrilo.

Se agregó una solución de Alexa Fluor 488 NHS (5 mg, 7.8 pmol en DMSO anhidro (200 pL) a una solución de tiotrifosfato 54b (4.1 pmol) en amortiguador NaHC03/Na2C03 (0.1 M, pH 9.2, 1.0 mL). La mezcla se dejó a temperatura ambiente en la oscuridad durante una hora. La mezcla se purificó primero mediante cromatografía de intercambio de aniones utilizando una columna Q Sefarosa FF (2.5 x 10 cm). Fase móvil: A, 75% 0.1 M TEAB/25% acetonitrilo; B, 75% 1.5 M TEAB/25% acetonitrilo. Las fracciones que contienen el tiotrifosfato 55b marcado con tinta se combinaron y liofilizaron hasta secarse, y el producto se purificó en forma adicional mediante HPLC de fase inversa sobre una columna PerkinElmer Aquapore OD-300 (7 pam, 250 x 4.6 mm). Fase móvil: A, 0.1 M TEAB; B, acetonitrilo.

Síntesis de 7-{(S)-1 -[4-(3-amino-1 -propinil)-5-metoxi-2-nitrofen¡IJ-2, 2-dimetil-propiloxijmetil- 7 -deaza-2' -desoxiguanosina-5'-trifosfato y 5'-a-tiotri fosfato 59a R 59b R Esquema S26a. Síntesis de 7-{(S)-1 -[4-(3-amino-1 -propinil)-5-metoxi-2-nitrofenil]-2,2-dimetil-propiloxi}metil-7-deaza-2'-desoxiguanosina-5'-trifosfato y 5'-a-tiotrifosfato marcado con tinta. Reactivos y condiciones: (i) MsCI, DMAP, CH2CI2, 0°C; (ii) (S)-1-(4-yodo-5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1-propanol, 115°C; (iii) n-Bu4NF, THF, temperatura ambiente; 18% para tres pasos; (iv) sin-piridina-2-aldoxima , guanidina de 1,1,3,3-tetrametilo, 1 ,4-d¡oxano/DM F , 70°C, 72%; (v) N-propargiltrifluoroacetamida, Pd(PPh3)4(0), Cul, Et3N, DMF, 96%; (vi) Para 59a: POCI3, esponja de protones, (MeO)3PO, 0°C; (n-Bu3NH)2H2P207> n-Bu3N, DMF; 1 M HNEt3HC03; NH4OH. Para 59b: PSCI3, 2,4,6-colidina, (EtO)3PO, 0°C a temperatura" ambiente; (n-Bu3NH)2H2P207, n-Bu3N, 1 M HNEt3HC03; NH4OH. 60b R = S Esquema S26b. (viii) Alexa Fluor 594 NHS, amortiguador Na2C03/NaHC03 0.1 M (pH 9.2).

Se agregaron DMAP (502 mg, 4.1 mmol) y MsCI (238 µ?_, 3.1 mmol) a una solución del compuesto 18 (680 mg, 1.0 mmol) en CH2CI2 anhidro (6.0 mL) a una temperatura de 0°C bajo una atmósfera de nitrógeno. La reacción se agitó a una temperatura de 0°C durante 10 minutos y posteriormente se diluyó con CH2CI2 (20 mL). La solución se aplicó sobre un tapón de gel de sílice corto (2 x 3 cm) y se eluyó rápidamente con un sistema de solvente de hexano/acetato de etilo/trietilamina (80 mL, proporción de volumen: 80/20/0.5). El eluyente se concentró in vacuo, y el residuo se mezcló con (S)-1 -(4-yodo-5-metoxi-2- nitrofen¡l)-2,2-dimetil-1 -propanol (500 mg, 2.1 mmol). La mezcla se calentó a una temperatura de 115°C durante 45 minutos bajo una atmósfera de nitrógeno, se enfrió a temperatura ambiente y se disolvió en THF (10 ml_). Se agregó n-BU4NF (1.07 g, 3.40 mmol) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 12 horas y posteriormente se concentró in vacuo. El residuo se disolvió en CH2CI2 (50 mL) y se lavó con salmuera (50 ml_), y la fase acuosa se extrajo con CH2CI2 (20 mL) dos veces. La fase orgánica combinada se secó sobre Na2S04, se concentró in vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 2-am¡no-6-cloro-9-(p-D-2'-desoxiribofiiranosil)-7-[(S)-1-(4-yodo-5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propiloxi]-metil-7-deazapurina 56 (125 mg, 18% para tres pasos). 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 8.24 (s, 1 H , Ph-H), 7.04 (s, 1 H, Ph-H), 6.91 (s, 1 H, H-8), 6.17 (dd, 1 H, J= 6.0 y 8.4 Hz, H-1'), 5.18 (s, 1 H, Ph-CH), 5.11 (br s, 2 H, NH2), 5 4.71 (m, 1 H, H-3'), 4.59 ( dd, 2 H, J = 12.4 y 24.4 Hz, 7-CH2), 4.13 (m, 1 H, H-4'), 3.96 (s, 3 H, OCH3), 3.88 (m, 1 H, ?-5'a), 3. 79 (m, 1 H, ?-5'b), 2.76 (m, 1 H, ?-2'a), 2.32 (m, 1 H.H-2'b),0.81(s,9H)(CH3)3).

A una solución del compuesto 56 (100 mg, 0.16 mmol) en 1,4-dioxano (1.5 mL) y DMF (3.0 mL), se le agregaron sin-pirimidina-2-aldoxima (389 mg, 3.2 mmol) y guanidina de 1 , 1 ,3,3-tetrametilo (439 µ?, 3.5 mmol), y la mezcla se calentó durante la noche a una temperatura de 70°C, bajo una atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se diluyó con CH2CI2 (20 ml_) y se lavó en secuencias con una solución de ácido acético (0.1 M, 50 mL), una solución NaHC03 saturada (50 mL), y salmuera (50 mL). La fase orgánica se secó sobre Na2S04, se concentró in vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 7-[(S)-1-(4 yodo-5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propiloxi]metil-7-deaza-2'-desoxiguanosina 57 (70 mg, 72%). 1H RMN (400 MHz, MeOH-d4): d 8.20 (s, 1 H, Ph-H), 7.17 (s, 1 H, Ph-H), 6.82 (s, 1 H, H-8), 6.18 (m, 1 H, H-1'), 5.23 (s, 1 H, Ph-CH), 4.71 (d, 1 H, J= 12.0 Hz, 7-CH2a), 4.52 (d, 1 H, J = 12.0 Hz, 7-CH2b), 4.43 (m, 1 H, H-3'), 3.97 (s, 3 H, OCH3), 3.91 (m, 1 H, H-4'), 3.71 (m, 2 H, H-5'), 2.49 (m, 1 H, ?-2'a), 2.19 (m, 1 H, ?-2'b), 0.85 (s, 9 H, (CH3)3).

Una solución del compuesto 57 (50 mg, 0.08 mmol), N-propargiltrifluoroacetilamida (117 mg, 0.8 mmol), tetrakis(trifenilfosfina)-paladio (0) (18 mg, 0.02 mmol), Cul (5.9 mg, 0.03 mmol), y Et3N (48 pL, 0.34 mmol) en DMF anhidro (3.0 mL) se agitó a una temperatura de 50°C durante 12 horas. La mezcla se concentró in vacuo y el residuo se purificó mediante cromatografía de columna de gel de sílice para producir 7-{(S)-1-[5-metoxi-4-(3-trifluoroacetamido-1-propinil)-2-nitrofenil]-2,2-dimetil-propiloxi}metil-7-deaza-2'-desoxiguanosina 58 (50 mg, 96%). 1H RMN (400 MHz, MeOH-d4): d 7.87 (s, 1 H, Ph-H), 7.26 (s, 1 H, Ph-H), 6.84 (s, 1 H, H-8), 6.20 (m, 1 H, H-1'), 5.25 (s, 1 H, Ph-CH), 4.67 (d, 1 H , /= 12.0 Hz, 7-CH2a), 4.54 (d, 1 H , / = 12.0 Hz, 7-CH2b), 4.43 (m, 1 H, H-3'), 4.33 (s, 2 H, CH2), 3.95 (s, 3 H, OCH3), 3.89 (m, 1 H, H-4'), 3.70 (m, 2 H, H-5'), 2.46 (m, 1 H, ?-2'a), 2.18 (m, 1 H , ?-2'b), 300.86 (s, 9 H, (CH3)3).

Se fosforiló el compuesto 58 (52 mg, 0.08 mmol) con POC (27 µ?, 0.3 mmol) y una esponja de protones (33 mg, 0.16 mmol) en trimetilfosfato (0.35 mL) a una temperatura de 0°C durante 4 horas bajo una atmósfera de nitrógeno. Se agregó una solución de pirofosfato de bis-tri-n-butilamonio (237 mg, 0.5 mmol) y tri-n-butilamina (100 µ?_) en DMF anhidro (1.0 mL). Después de 10 minutos de agitación, se agregó una solución de bicarbonato de trietilamonio (TEAB, 0.1 M, pH 7.5; 10 mL). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante una hora y posteriormente se concentró in vacuo. El residuo se disolvió en 75% 0.1 M TEAB/25% acetonitrilo (20 5 mL), se filtró y purificó cromatografía de intercambio de aniones utilizando una columna Q Sefarosa FF (2.5 x 20 cm). Fase móvil: A, 75% 0.1 M TEAB/25% acetonitrilo; B, 75% 1.5 M TEAB/25% acetonitrilo. Se combinaron las fracciones que contienen trifosfato y se liofilizaron hasta secarse. El residuo se disolvió en agua (10 mL) y se trató con hidróxido de amonio concentrado (10 mL, 27%) a temperatura ambiente durante una hora para producir 7-{(S}-1-[4-(3-amino-1-propinil)-5-metoxi-2-nitrofenil]-2,2-dimetil-propiloxi}metil-7-deaza-2'-desoxiguanosina-5'-trifosfato 59a, el cual se purificó en forma adicional mediante HPLC de fase inversa sobre una columna PerkinElmer Aquapore OD-300(7 pm, 250 x 4.6 mm). Fase móvil: A, 0.1 M TEAB; B, acetonitrilo. HRMS (ESI): Para el ión molecular C27H36NS017P3 [M-H]\ la masa calculada fue 809.1350, y la masa observada fue 15 809.1360.

Se tiofosforiló el compuesto 59 (50 mg, 0.075 mmol) con PSCI3 (9 µ?, 0.09 mmol) y 2,4,6-colidina (18 mg, 0.15 mmol) en trietilfosfato (0.5 mL) a temperatura ambiente durante 2.5 horas bajo una atmósfera de nitrógeno. Se agregó una solución de pirofosfato de bis-tri-n-butilamonio (237 mg, 0.5 mmol) y tri-n-butilamina (100 µ?) en DMF anhidro (1.0 mL). Después de 2 minutos de agitación, se agregó una solución de bicarbonato de trietilamonio (TEAB, 1 M, pH 7.5; 20 mL). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante una hora y posteriormente se concentró in vacuo. El residuo se disolvió en 75% de TEAB/0.1 M 25% de acetonitrilo (20 mL), se filtró, y purificó mediante cromatografía de intercambio de aniones utilizando una columna Q Sefarosa FF (2.5 x 20 cm). Fase móvil: A, 75% 0.1 25 M TEAB/25% acetonitrilo; B, 75% 1.5 M TEAB/25% acetonitrilo. Las fracciones que contienen el tiotrifosfato se combinaron y liofilizaron hasta secarse. El residuo se disolvió en agua (10 mL) y se trató con hidróxido de amonio concentrado (10 mL, 27%) a temperatura ambiente durante una hora para producir 7-{(S)-1 -[4-(3-amino-1 -propinil)-5-metoxi-2-nitrofenil]-2,2-dimetil-propiloxi}metil-7-deaza-2'-desoxiguanosina-5'-a-30 tiotrifosfato 59b, el cual se purificó en forma adicional mediante HPLC de fase inversa sobre una columna PerkinElmer Aquapore OD-300 (7 µ??, 250 x 4.6 mm). Fase móvil: A, 0.1 M TEAB; B, acetonitrilo. HRMS (ESI): Para el ión molecular C27H36N6016P3S [M-H], la masa calculada fue 825.1121, y la masa observada fue 825.1103.

Una solución de Alexa Fluor 594 NHS (4.2 mg, 5.2 µ????) en DMSO anhidro (170 µ?_) se agregó a una solución de trifosfato 59a (2.2 µ????) en amortiguador NaHC03/Na2C03 (0.1 M, pH 9.2, 0.5 ml_). La mezcla se dejó a temperatura ambiente en la oscuridad durante una hora. La mezcla se purificó primero mediante HPLC de intercambio de aniones en una columna Dionex ADNpac PA200 (250 x 4 mm). Fase móvil: A, 75% 0.1 M TEAB/25% acetonitrilo; B, 75% 1.5 M TEAB/25% acetonitrilo. Las fracciones que contienen el trifosfato 60a marcado con tinta se combinaron y concentraron hasta obtener un pequeño volumen, y el producto se purificó en forma adicional mediante HPLC de fase inversa sobre una columna PerkinElmer Aquapore OD-300(7 pm, 250 x 4.6 mm). Fase móvil: A, 0.1 M TEAB; B, acetonitrilo.

Se agregó una solución de Alexa Fluor 594 NHS (5 mg, 6.2 µ????) en DMSO anhidro (200 µ?) a una solución de tiotrifosfato 59b (4.45 µ?t???) en amortiguador NaHC03/Na2C03 (0.1 M, pH 9.2, 0.78 mL). La mezcla se dejó a temperatura ambiente en la oscuridad durante una hora. La mezcla se purificó primero mediante cromatografía de intercambio de aniones utilizando una columna Q Sefarosa FF (2.5 x 10 cm). Fase móvil: A, 75% 0.1 M TEAB/25% acetonitrilo; B, 75% 1.5 M TEAB/25% acetonitrilo. Las fracciones que contienen el tiotrifosfato 60b marcado con tinta se combinaron, y concentraron hasta obtener un volumen pequeño, y el producto se purificó en forma adicional mediante HPLC de fase inversa sobre una columna PerkinElmer Aquapore OD-300(7 pm, 250 x 4.6 mm). Fase móvil: A, 0.1 M TEAB; B, acetonitrilo.

Síntesis de 5-{(S)-1 -[4-(3-amino-1 -propinil)-5-metoxi-2-nitrofenil]-2, 2-dimetil-propiloxi}metil-2'-desoxiuridine-5'-trifosfato y 5' -a-tiotrifosfato marcado con tinta Esquema S27a. Síntesis de 5-{S)-1 -[4-(3-amino-1 -propinil)-5- metoxi-2-nitrofenil]-2,2-dimetil-propiloxi}metil-2'- desoxiuridina-5'-trifosfato marcado con tinta. Reactivos y condiciones: (i) (S)-1-(4-yodo-5-metox¡-2-nitrofenil)-2,2-dimetil- 1-propanol, 110°C; (//) NH4F MeOH , 50°C, 28% para dos pasos; (/'//) /V-propargiltrifluoroacetamida, Pd(PPh3)4(0), Cul, Et3N, DMF, 90%; (/V) Para 63a: POCI3, esponja de protones, (MeO)3PO, 0°C; (n-Bu3NH)2H2P207, A?-BU3N, DMF; 1 M HNEt3HC03; NH4OH. Para 63b: PSCI3, 2,6-lutidina, (EtO)3PO, 0°C a temperatura ambiente; (n-Bu3N H )2H2P207 , i-Bu3N, DMF; 1 M HNEt3HC03; NH4OH. 64a R 64b R Esquema S27b. (v) Alexa Fluor 532 NHS, amortiguador NaHC03/Na2C03 0.1 M (pH 9.2).

Se calentaron el compuesto 38 (350 mg, 0.54 mmol) y (S)-1-(4-yodo-5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-1 - propanol (720 mg, 1.97 mmol) a una temperatura de 110°C durante 45 minutos bajo una atmósfera de nitrógeno. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente, se disolvió en MeOH (10 mL), y seguido de la adición de NH F (400 mg, 11.1 mmol). La mezcla se agitó a una temperatura de 50°C durante 12 horas, se concentró in vacuo, se disolvió en CH2CI2 (50 mL), y se lavó con salmuera (50 mL). La fase orgánica se secó sobre Na2S04, se concentró in vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 5-[(S)-1 -(4-yodo-5-metoxi-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propiloxi]metil-2'-desoxiuridina 61 (90 mg, 28%). 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 8.34 (s, 1 H, Ph-H), 7.65 (s, 1 H, H-6), 7.12 (s, 1 H, Ph-H), 6.17 (t, 1 H, /= 6.8 Hz, H-F), 5.18 (s, 1 H, Ph-CH), 4.59 (m, 1 H, H-3'), 4.27 (d, 1 H, J= 12.0 Hz, 5-CH2a), 4.15 (d, 1 H, J= 12.0 Hz, 5-CH2b), 4.00 (m, 1 H, H-4'), 3.97 (s, 3 H, OCH3), 3.95 (m, 1 H, ?-5'a), 3.82 (m, 1 H, ?-5'b), 2.34 (m, 2 H, H-2), 0.84 (s, 9 H, C(CH3)3).

Una solución del compuesto 61 (80 mg, 0.13 mmol), N-propargiltrifluoroacetilamida (196 mg, 1.30 mmol), tetrakis(trifenilfosfina)-paladio (0) (30 mg, 0.026 mmol), Cul (9.9 mg, 0.052 mmol), y Et3N (80 pL) en DMF anhidro (3.0 mL) se agitó a una temperatura de 50°C durante 12 horas. La mezcla se concentró in vacuo y el residuo se purificó mediante cromatografía de columna de gel de sílice para producir 5-{(S)-1-[5-metoxi-4-(3-trifluoroacetamido-1-propinil)-2-nitrofenil]-2,2-dimetil-propiloxi}metil-2'-desoxiuridina 62 (75 mg, 90%). 1 H RMN (400 MHz, MeOD-d4): d 8.11 (s, 1 H, H-6), 8.08 (s, 1 H, Ph-H), 7.36 (s, 1 H, Ph-H), 6.27 (t, 1 H, y = 6.4 Hz, H-1'), 5.33 (s, 1 H, Ph-CH), 4.47 (m, 1 H, H-3'), 4.44 (s, 2 H, 5-CH2), 4.32 (d, 2 H, J= 2.0 Hz, CH2), 4.08 (s, 3 H, OCH3), 3.99 (m, 1 H, H-4'), 3.87 (m, 1 H, ?-5'a), 5 3.79 (m, 1 H, ?-5'b), 2.30 (m, 2 H, H-2), 0.93 (s, 9 H, C(CH3)3).

Se fosforiló el compuesto 62 (40 mg, 0.064 mmol) con POCI3 (21 µ?, 0.22 mmol) y esponja de protones (27 mg, 0.13 mmol) en trimetilfosfato (0.35 ml_) a una temperatura de 0°C durante 4 horas bajo una atmósfera de nitrógeno. Se agregó una solución de pirofosfato de bis-tri-n-butilamonio (237 mg, 0.5 mmol)- y tri-n-butilamina (100 µ?_) en DMF anhidro (1.0 ml_). Después de 10 minutos de agitación, se agregó una solución de bicarbonato de trietilamonio (TEAB, 0.1 M, pH 7.5; 10 ml_). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante una hora y posteriormente se concentró in vacuo. El residuo se disolvió en 75% 0.1 M TEAB/25% acetonitrilo (20 ml_), se filtró, y purificó mediante cromatografía de intercambio de aniones utilizando una columna Q Sefarosa FF (2.5 x 20 cm). Fase móvil: A, 75% 0.1 M TEAB/25% acetonitrilo; B, 75% 1.5 M TEAB/25% acetonitrilo. Las fracciones que contienen el trifosfato se combinaron y liofilizaron hasta secarse. El residuo se disolvió en agua (10 mL) y se trató con hidróxido de amonio concentrado (10 mL, 27%) a temperatura ambiente durante una hora para producir 5-{(S) -1-[4-(3-amino-1-propinil)-5-metoxi-2-nitrofenil]-2,2-dimetil-propiloxi}metil-2'-desoxiuridina-5 -trifosfato 63a, el cual se purificó en forma adicional mediante HPLC de fase inversa sobre una columna PerkinElmer Aquapore OD-300(7 pm, 250 x 4.6 mm). Fase móvil: A, 0.1 M TEAB; B, acetonitrilo.

Se tiofosforiló el compuesto 62 (130 mg, 0.21 mmol) con PSCI3 (26 pL, 0.25 mmol) y 2,6-lutidina (89 mg, 0.84 mmol) en trietilfosfato (0.6 mL) a temperatura ambiente durante 1 hora bajo una atmósfera de nitrógeno. Se agregó una solución de pirofosfato bis-tri-n-butilamonio (474 mg, 1.0 mmol) y tri-n-butilamina (200 pL) en DMF anhidro (2.0 mL). Después de 2 minutos de agitación, se agregó una solución de bicarbonato de trietilamonio (TEAB, 1 M, pH 7.5; 20 mL). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante una hora y posteriormente se concentró in vacuo. El residuo se disolvió en 75% 0.1 M TEAB/25% acetonitrilo (20 mL), se filtró, y purificó mediante cromatografía de intercambio de aniones utilizando una columna Q Sefarosa FF (2.5 x 20 cm). Fase móvil: A, 75% 0.1 M TEAB/25% acetonitrilo; B, 75% 1.5 M TEAB/25% acetonitrilo. Las fracciones que contienen el tiotrifosfato se combinaron y liofilizaron hasta secarse. El residuo se disolvió en agua (10 mL) y se trató con hidróxido de amonio concentrado (10 mL, 27%) a temperatura ambiente durante una hora para producir 5- {(S)-1-[4-(3-amino-1-propinil)-5-metoxi-2-nitrofenil]-2,2-dimetil-propiloxi}metil-2'-desoxiuridina-5'-a-tiotrifosfato 63b, el cual se purificó en forma adicional mediante HPLC de fase inversa en una columna PerkinElmer Aquapore OD-300(7 pm, 250 x 4.6 mm). Fase móvil: A, 0.1 M TEAB; B, acetonitrilo. HRMS (ESI): Para el ión molecular C2sH 34O17P3S [M-H] , la masa calculada fue 787.0853, y la masa observada fue 787.0884.

Se agregó una solución de Alexa Fluor 532 NHS (2 mg, 2.76 pmol) en DMSO anhidro (80 pL), a una solución de trifosfato 62a (1.07 pmol) en amortiguador NaHC03/Na2C03 (0.1 M, pH 9.2, 0.3 mL). La mezcla se dejó a temperatura ambiente en la oscuridad durante una hora. La mezcla se purificó primero mediante HPLC de intercambio de aniones en una columna Dionex ADNpac PA200 (250 x 4 mm). Fase móvil: A, 75% 0.1 M TEAB/25% acetonitrilo; B, 75% 1.5 M TEAB/25% acetonitrilo. Las fracciones que contienen el trifosfato 63a marcado con tinta se combinaron y concentraron hasta obtener un volumen pequeño, y el producto se purificó en forma adicional mediante HPLC de fase inversa sobre una columna PerkinElmer Aquapore OD-300(7 pm, 250 x 4.6 mm). Fase móvil: A, 0.1 M TEAB; B, acetonitrilo.

Se agregó una solución de Alexa Fluor 532 NHS (2.5 mg, 3.45 pmol) en DMSO anhidro (100 pL) a una solución de tiotrifosfato 62b (1.03 pmol) en amortiguador NaHC03/Na2C03 (0.1 M, pH 9.2, 0.15 mL). La mezcla se dejó a temperatura ambiente en la oscuridad durante una hora. La mezcla se purificó primero mediante cromatografía de intercambio de aniones utilizando una columna Q Sefarosa FF (2.5 x 10 cm). Fase móvil: A, 75% 0.1 M TEAB/25% acetonitrilo; B, 75% 1.5 M TEAB/25% acetonitrilo. Las fracciones que contienen el tiotrifosfato 63b marcado con tinta se combinaron y liofilizaron hasta secarse, y el producto se purificó en forma adicional mediante HPLC de fase inversa sobre una columna PerkinElmer Aquapore OD-300(7 µ??, 250 x 4.6 mm). Fase móvil: A, 0.1 MTEAB; B, acetonitrilo.

Síntesis de 5-{(S)-1 -[4-(3-amino-1 -propinil)-5-metoxi-2-nitrofenil]-2, 2-dimetil- ropiloxi}metil-2'-desoxicitidina-5'-trifosfato y 5'-a-tiotri fosfato marcado con tinta Esquema S28a. Síntesis de 5-{(S -1 -[4-(3-am¡no-1 -propinil)-5-metoxi-2-nitrofenil]-2,2-dimetil-propiloxi}metil-2'-desoxicitidina-5'-trifosfato marcado con tinta.

Reactivos y condiciones: (i) TBSCI, ¡midazol, DMF, temperatura ambiente, 96%; (//') cloruro de 2,4,6-triisopropilbencenosulfonilo, DMAP, Et3N, CH2CI2, temperatura ambiente; (//'/') NH3) 1,4-dioxano, 90°C; (iv) A?-BU4NF, THF, temperatura ambiente, 83% para tres pasos; (v) N-propargiltrifluoroacetamida, Pd(PPh3)4(0), Cul, Et3N, DMF, 91%; (vi) Para 68a: POCI3, esponja de protones, (MeO)3PO, 0°C; (n-Bu3NH)2H2P207, n-Bu3N, DMF; 1 M HNEt3HC03; NH OH. Para 68b: PSCI3, 2,6-lutidina, (EtO)3PO, 0°C; (A7-Bu3NH)2H2P207, n-Bu3N, DMF; 1 M HNEt3HC03; NH4OH.

Esquema S28b. (vii) Cy5 NHS, amortiguador Na2C03/NaHC03 0.1 M (pH 9.2).

A una solución del compuesto 61 (295 mg, 0.49 mmol) en DMF anhidro (5.0 mL), se le agregaron TBSCI (185 mg, 1.23 mmol) e imidazol (160 mg, 2.35 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 12 horas, concentraron in vacuo, y se disolvió en CH2CI2 (50 mL). La solución se lavó con una solución NaHC03 (50 mL) y la fase acuosa se extrajo con CH2CI2 (30 mL) tres veces. La fase orgánica combinada se secó con Na2S04, se concentró in vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de gel de sílice para producir 3',5'-0-bis-(ter-butildimetilsilil)-5-[(S)-1-(4-yodo-5-metoxi-2-nitrofenil)- 2,2-dimetil-propiloxi]metil-2'-desoxiuridina 65 (400 mg, 96%). 1 H RMN (400 MHz, CD03): d 8.32 (s, 1 H, Ph-H), 7.64 (s, 1 H, H-6), 7.12 (s, 1 H, Ph-H), 6.12 (t, 1 H , y = 6.8 Hz, H-1'), 5.20 (s, 1 H, Ph-CH), 4.60 (m, 1 H, H-3'), 4.25 (d, 1 H, J = 12.0 Hz, 5-CH2a), 4.14 (d, 1 H , J= 12.0 Hz, 5-CH2b), 4.02 (m, 1 H , H-4'), 3.97 (s, 3 H , OCH3), 3.94 (m, 1 H, ?-5'a), 3.83 (m, 1 H, ?-5'b), 2.34 (m, 2 H, H-2), 0.90 y 88 (2 s, 18 H, SiC(CH3)3), 0.84 (s, 9 H, C(CH3)3), 0.08 (3 s, 12 H, CH3).

Se agregó cloruro de bencenosulfonilo de 2,4,6-triisopropilo (581 mg, 1.92 mmol) a una solución del compuesto 65 (400 mg, 0.48 mmol), DMAP (64 mg, 0.53 mmol), y trietilamina (0.60 mL, 4.32 mmol) en CH2CI2 anhidro (15 mL). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche bajo una atmósfera de nitrógeno, concentraron in vacuo, y el residuo se disolvió en una solución de NH3 en 1,4-dioxano (0.5 M, 20 mL). La mezcla se transfirió en un tubo sellado y se calentó durante la noche a una temperatura de 90°C. La reacción posteriormente se enfrió a temperatura ambiente, se concentró in vacuo, y el residuo se disolvió en THF (8.0 mL) seguido de la adición de n-Bu4NF (333 mg, 1.06 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante cuatro horas, se concentró in vacuo, y el residuo se purificó mediante cromatografía de columna de gel de sílice para producir 5-[(S)-1 -(4-yodo-5-meto i-2-nitrofenil)-2,2-dimetil-propiloxi]metil-2'-desoxicitidina 66 (240 mg, 83% para tres pasos en total). 1H RMN (400 MHz, MeOD-d4): d 8.33 (s, 1 H , Ph-H), 7.91 (s, 1 H , H-6), 7.10 (s, 1 H , Ph-H), 6.16 (t, 1 H, J = 6.4 Hz, H-1'), 5.19 (s, 1 H , Ph-CH), 4.41 (d, 1 H, J = 12.4 Hz, 5-CH2a), 4.33 (m, 1 H , H-3'), 4.26 (d, 1 H, J= 12.4 Hz, 5-CH2b), 3.97(s, 3 H, OCH3), 3.88 (m, 1 H , H-4'), 3.70 (m, 2 H, H-5'), 2.34 (m, 1 H, ?-2'a), 2.17 (m, 1 H, H-2'b). 0.84 (s, 9 H, C(CH3)3).

Una solución del compuesto 66 (245 mg, 0.4 mmol), n-propargiltrifluoroacetilamida (603 mg, 4.0 mmol), tetrakis(trifenilfosfina)-paladio(0) (92 mg, 0.8 mmol), Cul (30 mg, 0.16 mmol), y Et3N (240 µ?_, 1.7 mmol) en DMF anhidro (5.0 ml_) se agitó a una temperatura de 50°C durante 12 horas. La mezcla se concentró in vacuo y purificó mediante cromatografía de columna de gel de sílice para producir 5-{(S}-1 -[5-metox¡-4-(3-trifluoroacetamido-1-propinil)-2-nitrofenil]-2,2-dimetil-propiloxi}metil-2'-desoxicitidina 67 (230 mg, 91%). 1H RMN (400 MHz, MeOD-d4): d 7.98 (s, 1 H, Ph-H), 7.92 (s, 1 H, H-6), 7.19 (s, 1 H, Ph-H), 6.15 (t, 1 H, J = 6.4 Hz, H-1'), 5.21 (s, 1 H, Ph-CH), 4.41 (d, 1 H, J = 13.2 Hz, 5-CH2a), 4.33 (m, 3 H, H-3' y CH2), 4.27 (d, 1 H, J= 13.2 Hz, 5-CH2b), 3.96 (s, 3 H, OCH3), 3.88 (m, 1 H, H-4'), 3.72 (m, 2 H, H-5'), 2.30 (m, 1 H, ?-2'a), 2.12 (m, 1 H, ?-2'b), 0.84 (s, 9 H, C(CH3)3).

Se fosforiló el compuesto 67 (45 mg, 0.072 mmol) con POCI3 (15 µ?_, 0.16 mmol) y una esponja de protones (31 mg, 0.14 mmol) en trimetilfosfato (0.35 mL) a una temperatura de 0°C durante 4 horas bajo una atmósfera de nitrógeno. Se agregó una solución de pirofosfato de bis-tri-n-butilamonio (237 mg, 0.5 mmol) y tri-n-butilamina (100 µ?_) en DMF anhidro (1.0 mL). Después de 10 minutos de agitación, se agregó una solución de bicarbonato de trietilamonio (TEAB, 0.1 M, pH 7.5; 10 mL). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante una hora y posteriormente se concentró in vacuo. El residuo se disolvió en 75% 0.1 M TEAB/25% acetonitrilo (20 mL), se filtró, y purificó mediante cromatografía de intercambio de aniones utilizando una columna Q Sefarosa FF (2.5 x 20 cm). Fase móvil: A, 75% 0.1 M TEAB/25% acetonitrilo; B, 75% 1.5 M TEAB/25% acetonitrilo. Las fracciones que contienen el trifosfato se combinaron y liofilizaron hasta secarse. El residuo se disolvió en agua (10 mL) y se trató con hidróxido de amonio concentrado (10 mL, 27%) a temperatura ambiente durante una hora para producir 5-{(S)-1 -[4-(3-amino-1 -propinil)-5-metoxi-2-nitrofenil]-2,2-dimetil-propiloxi}metil-2'-desoxicitidina-5'-trifosfato 68a, el cual se purificó en forma adicional mediante HPLC de fase inversa sobre una columna PerkinElmer Aquapore OD-300 (7 µ??, 250 x 4.6 mm). Fase móvil: A, 0.1 M TEAB; B, acetonitrilo. HRMS (ESI): Para el ión molecular CasHssNsO Ps [M-H]\ la masa calculada fue 770.1241, y la masa observada fue 770.1234.

Se tiofosforiló el compuesto 67 (118 mg, 0.19 mmol) con PSCI3 (24 pL, 0.23 mmol) y 2,6-lutidina (80 mg, 0.75 mmol) en trietilfosfato (0.5 mL) a una temperatura de 0°C durante 1 hora bajo una atmósfera de nitrógeno. Se agregó una solución de pirofosfato de bis-tri-n-butilamonio (474 10 mg, 1.0 mmol) y tri-n-butilamina (200 µ?_) en DMF anhidro (2.0 ml_). Después de 2 minutos de agitación, se agregó una solución de bicarbonato de trietilamonio (TEAB, 1 M, pH 7.5; 20 mL). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante una hora y posteriormente se concentró in vacuo. El residuo se disolvió en 75% 0.1 M TEAB/25% acetonitrilo (20 mL), se filtró, y purificó mediante cromatografía de intercambio de aniones utilizando una columna Q Sefarosa FF (2.5 x 20 15 cm). Fase móvil: A, 75% 0.1 M TEAB/25% acetonitrilo; B, 75% 1.5 M TEAB/25% acetonitrilo. Las fracciones que contienen el tiotrifosfato se combinaron y I iof il iza ron hasta secarse. El residuo se disolvió en agua (10 mL) y se trató con hidróxido de amonio concentrado (10 mL, 27%) a temperatura ambiente durante una hora para producir 5-{(S)-1-[4-(3-amino-1-propinil)-5-metoxi-2-nitrofenil]-2,2-dimetil-propiloxi}metil-2'-desoxicitidina-5'-a-tiotrifosfato 68b, el cual se purificó en forma adicional mediante HPLC de fase inversa sobre una columna PerkinElmer Aquapore OD-300(7 µ??, 250 x 4.6 mm). Fase móvil: A, 0.1 M TEAB; B, acetonitrilo. HRMS (ESI): Para el ión molecular C25H35N5O16P3S [M-H]', la masa calculada fue 786.1012, y la masa observada fue 786.0983.

Se agregó una solución de Cy5 NHS (5 mg, 6.3 pmol) en DMSO anhidro (200 L) a una solución de trifosfato 68a (1.59 µ????) en amortiguador NaHC03/Na2C03 (0.1 M, pH 9.2, 0.35 ml_). La mezcla se dejó a temperatura ambiente en la oscuridad durante una hora. Se purificó primero el trifosfato marcado con tinta mediante HPLC de intercambio de aniones en una columna Dionex DNApac PA200 (250 x 4 mm). Fase móvil: A, 75% 0.1 M TEAB/25% acetonitrilo; B, 75% 1.5 M TEAB/25% acetonitrilo. Las fracciones que contienen el trifosfato 69a marcado con tinta se combinaron y concentraron hasta obtener un pequeño volumen, y el producto se purificó mediante HPLC de fase inversa en una columna PerkinElmer Aquapore OD-300(7 µ??, 250 x 4.6 mm). Fase móvil: A, 0.1 M TEAB; B, acetonitrilo.

Una solución de Cy5 NHS (5 mg, 6.3 mol) en DMSO anhidro (200 µ?) se agregó a una solución de tiotrifosfato 68b (2.96 pmol) en amortiguador NaHC03/Na2C03 (0.1 M, pH 9.2, 0.53 mL). La mezcla se dejó a temperatura ambiente en la oscuridad durante una hora. Se purificó primero el tiotrifosfato marcado con tinta mediante cromatografía de intercambio de aniones utilizando una columna Q Sefarosa FF (2.5 x 10 cm). Fase móvil: A, 75% 0.1 M TEAB/25% acetonitrilo; B, 75% 1.5 M TEAB/25% acetonitrilo. Las fracciones que contienen el tiotrifosfato 69b marcado con tinta se combinaron y liofilizaron hasta secarse, y el producto se purificó en forma adicional mediante HPLC de fase inversa sobre una columna PerkinElmer Aquapore OD-300(7 µp?, 250 x 4.6 mm). Fase móvil: A, 0.1 MTEAB; B, acetonitrilo.

Todos los métodos descritos y reivindicados en la presente invención se pueden elaborar y ejecutar sin experimentación indebida a la luz de la presente descripción. Aunque las composiciones y métodos de la presente invención han sido descritas en términos de ciertas modalidades, los expertos en la técnica podrán apreciar que se pueden aplicar variaciones a los métodos y a los pasos o a las secuencias de pasos del método aquí descrito sin apartarse del concepto, esencia y alcance de la invención. Más específicamente, se podrá apreciar que ciertos agentes que están tanto química como fisiológicamente relacionados, pueden ser sustituidos por los agentes aquí descritos, pudiéndose lograr al mismo tiempo resultados iguales o similares. Todos de dichos sustituyentes y modificaciones similares que pueden ser apreciados por los expertos en la técnica, serán considerados como dentro del espíritu, esencia y concepto de la presente invención tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplo 9 - Estudios de Fotodescomposición UV Se descubrió que el rango de fotodescomposición UV depende de un número de factores experimentales incluyendo intensidad de luz. Ver las Publicaciones de McCray et al (1980) y McGall et al. (1997), las cuales están incorporadas a la presente invención como referencia. Para comparar los rangos de descomposición fotoquímica entre los análogos de nucleótido aquí descritos, se desarrolla un protocolo para suministrar una producción de intensidad de luz diaria de 0.70 ± 0.01 W/cm2 a las muestras, ver a continuación. Un desprotector UV diseñado a la medida utilizado en estos estudios ha sido descrito previamente en la Publicación de Wu et al. (2007), la cual está incorporada a la presente invención como referencia, y el protocolo implementado se describe a continuación.

Configuración del desprotector UV: Se encendió el suministro de energía durante aproximadamente 30 minutos antes de la lámpara y el baño de recirculación tal como lo describe el fabricante. El filtro del líquido IR se enfrió a una temperatura de 9°C. Se determinó la intensidad de luz utilizando un medidor de energía modelo PM100 (Thorlabs), una perforación de 1000 pm (Edmund Optics), un tubo Eppendorf de 0.5 ml_ modificado cortado a la mitad y una tapa de translación manual de 3 ejes (Newport), ver figura 5. El tubo Eppendorf cortado a la mitad se colocó en la parte frontal de la perforación y el detector del medidor de energía arriba para abarcar la distorsión de la forma geométrica de la luz conforme pasa a través de la solución de reacción. Posteriormente se utilizó la etapa de traslación para alinear el tubo/perforación/dispositivo detector con la intensidad más alta desde el rayo del arco.

Ajuste de intensidad en 0.7W/cm2 : Para estabilizar su salida, la lámpara se dejó encendida durante una hora antes de las medidas de intensidad. Posteriormente, se ajustó la energía medida incrementando la corriente del suministro de energía.

Con el objeto de alcanzar la intensidad (/) de 0.70 W/cm2, se ajustó la energía media (P) a -5.5 mW, de acuerdo con la ecuación : en donde r es el radio de la perforación. Se registraron las lecturas de energía durante un período de cinco minutos (en intervalos de un segundo) y se convirtieron en lecturas de intensidad, las cuales fluctuaron durante un período de seis semanas. Entre 0.68 ± 0.01 y 0.72 ± 0.02 W/cm2.

Alineación de rayo con el sujetador de tubo de 0.5 mL: El tubo Eppendorf modificado, la perforación y el medidor de energía posteriormente se eliminaron del desprotector UV, y se instaló el sujetador de muestras giratorio con una altura de 67.18 ± 0.25 mm. Posteriormente se enfocó el rayo colocando un tubo Eppendorf de 0.5 mL en un sujetador de muestras, cuyo tubo se modificó con una tarjeta de alineación interna para proporcionar líneas de referencia para alturas de volumen de 10 µ? y 20 µ?_, ver la figura 5. Las líneas de referencia permitieron que el rayo se centrara en un volumen de reacción determinado. La alineación del rayo se verificó en forma adicional observando la imagen del arco de mercurio de la lámpara producido por el reflector trasero. Se colocó una segunda tarjeta de alineación en el sujetador de muestra giratoria para ver la imagen, la cual cuando se alineó en forma adecuada utilizando el reflector, puede producir una imagen de arco invertida en la propia abertura. Este paso aseguró que los puntos del arco no fueran sobreimpuestos , lo cual podría originar un sobrecalentamiento, manteniendo al mismo tiempo, una salida de energía de ~5.5 mW. La velocidad del sujetador de la muestra de rotación se ajustó en un rango de 1,200 a 1,350 rpm utilizando un estroboscopio Nova-Strobe DA Plus (Monarch Instrument) ajustando la torsión del motor con un tornillo de ajuste.

Ensayos de descomposición fotoquímica: Se incorporaron análogos de nucleótido utilizando reacciones de 10 µ?_, tal como se describe para los ensayos PEP, en una concentración final de 100 n . Ver la Publicación de Litosh et al. (2011), la cual está incorporada a la presente invención como referencia. La oligoplantilla-2 , oligoplantilla-5, y oligoplantilla-4, cada una hibridada con cebador-1 marcado con BODIPY-FL, se utilizaron para los análogos C7-HO edA, C7-HOMedG, y HOMedU, respectivamente. La oligoplantilla-8 hibridada con cebador-3 etiquetada con BODIPY-FL, se utilizó para ensayar los análogos HOMedC. Las reacciones incorporadas se extinguieron ya sea con una solución de azida de sodio 1 mM; azida de sodio; solución DTT 50 mM; o reactivos C-G (ver la clave en la figura 4), expuestos a luz ultravioleta (UV) 365 nm para diversos puntos de tiempo utilizando un desprotector UV, y posteriormente se colocaron en hielo. Se agregaron diez pL de la solución de detención (formamida desionizada al 98%; 10 mM de Na2EDTA, pH 8.0; 25 mg/mL de Azul de Dextran, MW 2,000,000), y las muestras se analizaron utilizando un secuenciador de ADN AB modelo 377. Se llevaron a cabo ensayos de descomposición por triplicado para calcular el valor DT50 ± ISD promedio, tal como se describe en la Publicación de Litosh et al. (2011), la cual está incorporada a la presente invención como referencia.

REFERENCIAS Las siguientes referencias, las cuales se describen en el Apéndice, hasta el grado en que proporcionen procedimientos de ejemplos u otros detalles suplementarios para los aquí establecidos, están incorporadas en forma específica a la presente invención como referencia.

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Claims (115)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto de la fórmula: en donde es hidroxi, monofosfato, difosfato, trifosfato, tiotrifosfato o polifosfato; R2 es hidrógeno o hidroxi; R3 es alquilo(c=8) o alquilóos) sustituido; R4 es hidrógeno, hidroxi, halo, amino, nitro, ciano, azido o mercapto; alquilo(c<6), acilo(c<6). alcoxi(c<6>, aciloxi(c=6), alquilamino(c=6), dialquil-amino(c=6), amido{c<6), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; R5 y R6 cada uno son independientemente; hidrógeno, hidroxi, halo, amino, nitro, ciano, azido o mercapto; alquilo(c=6), alquenilo(c=6), alquinilo(c=6), arilo(c=6), aralquilo(c=8), heteroarilo(c=6), acilo(c=6), alcoxi(c<6)- aciloxi(c=6), alquilamino(c=6), dialquil-amino(c=6), amido(c<6), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; un grupo de la fórmula: X es -O-, -S-, o -NH- alcanodiilO(C=i 2), alquenodiilo(c=i 2>, alquinodiilo(c=12), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; Y es -O-, -NH-, alcanodiilo(c=i2) o alcano-diilo(c=i2) sustituido; n es un entero de 0 a 6; y m es un entero de 0 a 6; o un-enlazador- reportero; o una sal, tautómero o isómero óptico del mismo.

2. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, definido en forma adicional como un compuesto de la fórmula I.

3. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, definido en forma adicional como un compuesto de la fórmula II.

4. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, definido en forma adicional como un compuesto de la fórmula III.

5. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, definido en forma adicional como un compuesto de la fórmula IV.

6. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, definido en forma adicional como un compuesto de la fórmula V.

7. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, definido en forma adicional como un compuesto de la fórmula VI.

8. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, definido en forma adicional como un compuesto de la fórmula VII.

9. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 8, en donde es hidroxi.

10. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 8, en donde Ri es un monofosfato.

11. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 8, en donde R-? es un difosfato.

12. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 8, en donde R, es un trifosfato.

13. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 8, en donde es un a-tiotrifosfato.

14. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 8, en donde R1 es un polifosfato.

15. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 14, en donde R2 es hidrógeno.

16. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 14, en donde R2 es hidroxi.

17. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 16, en donde R3 es alquilo(c<8).

18. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 17, en donde R3 es alq uilo(c3-4)

19. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 18, en donde R3 es isopropilo.

20. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 18, en donde R3 es ter-butilo.

21. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 20, en donde R4 es hidrógeno.

22. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 20, en donde R4 es nitro.

23. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 22, en donde R5 es hidrógeno.

24. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 22, en donde R5 es yodo.

25. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 22, en donde R5 es alcoxi(c=6).

26. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 25, en donde R5 es metoxi.

27. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 22, en donde R5 es un grupo de la fórmula: en donde X es -O-, -S-, o -NH-; o alcanodiilo(c= 2), alquenodiilo(c=i 2) , alquinodiilo(c=i 2). arenodiilo(c<12), heteroarenodiilo(c=12), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y n es un entero de 0 a 6.

28. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 27, en donde X es alquinodiilo(c2.8)

29. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 28, en donde X es -C=C-.

30. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 27 a la 29, en donde n es cero.

31. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 22, en donde R5 es un grupo de la fórmula : en donde X es -O-, -S-, o -NH-; o alcanodiilo(c=12), alquenodiilo(c=12), alquinod¡¡lo(0=12), arenodiilO(C=i 2) , heteroarenodiilo(c< i 2) , o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; Y es -O-, -NH-, alcanodiilO(C=i 2) o alcanod¡ilo(c<12) sustituido; n es un entero de 0 a 6; y m es un entero de 0 a 6.

32. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 31, en donde X es alquinodiilo<c2.8)

33. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 32, en donde X es -C = C-.

34. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 31 a la 33, en donde Y es -CH2-.

35. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 31 a la 34, en donde n es cero.

36. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 31 a la 35, en donde m es cero.

37. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 22, en donde R5 es un -enlazador-reportero.

38. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 37, en donde el enlazador es. en donde X es -O-, -S-, o -NH-; o alcanodiilo(c=i2), alquenodiilo(c<i2)- alquinodiilo(c=i2), arenodiilo(c=12), heteroarenodiilo(c=12), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y n es un entero de 0 a 6.

39. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 38, en donde X es alquinodiilo(c2-8)-

40. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 39, en donde X es -C=C-.

41. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 38 a la 40, en donde n es cero.

42. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 37, en donde el enlazador es: en donde X es -O-, -S-, o -NH-; o alcanodiilO(C= i 2) . alquenodiilo(c=12), alquinodiilo(c<12), arenodiilo(c=i 2) . eteroarenodiilo(c< i 2) , o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; Y es -O-, -NH-, alcanodiilo(c=12) o alcanodiilo( c=i 2) sustituido; n es un entero de 0 a 6; y m es un entero de 0 a 6.

43. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 42, en donde X es alquinodiilo(c2.8).

44. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 43, en donde X es -C=C-.

45. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 42 a la 44, en donde Y es -CH2-.

46. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 42 a la 45, en donde n es cero.

47. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 42 a la 46, en donde m es cero.

48. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 37 a la 47, en donde el reportero está basado en una tinta, en donde la tinta es zanteno, fluoresceína, rodamina, BODIPY, cianina, coumarina, pireno, ftalocianina, ficobiliproteína, o una tinta de escuarina.

49. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 37 a la 47, en donde el reportero es:

50. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 49, en donde R6 es hidrógeno.

51. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 50, en donde el átomo de carbono estrellado está en la configuración S.

52. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 50, en donde el átomo de carbono estrellado está en la configuración R.

53. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, que se define en forma adicional como: 290 o una sal y/o forma protonada de cualquiera de estas fórmulas.

54. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, que se define en forma adicional como: en donde R es =0 o =S, o una sal y/o forma protonada de cualquiera de estas fórmulas.

55. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, que se define en forma adicional como: ?? en donde R es =0 o =S o una sal y/o forma protonada cualquiera de estas fórmulas.

56. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, se define en forma adicional como: ?95 ?96 o una sal y/o forma protonada de cualquiera de estas fórmulas.

57. Un método para secuenciar un ácido nucleico objetivo que comprende los siguientes pasos: (i) adherir el extremo 5' del cebador a una superficie sólida ; (ii) hibridar un ácido nucleico objetivo al cebador adherido a la superficie sólida para formar un complejo de cebador hibridado/ácido nucleico objetivo; (iii) obtener una polimerasa y uno o más compuestos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 56, siempre que el compuesto de las diferentes fórmulas l-VII tenga diferentes fluoroforos; (iv) hacer reaccionar el complejo de cebador hibridado/ácido nucleico objetivo con una polimerasa y uno o más compuestos del paso (iii) para formar una hebra de cebador en crecimiento a través de una reacción de polimerasa; (v) generar imágenes de la hebra de cebador en crecimiento para identificar el compuesto incorporado del paso (iv) a través de su fluoroforo; (vi) exponer la superficie sólida con la hebra de cebador de crecimiento a una fuente de luz para eliminar la porción de terminación que se puede fotodescomponer de la fórmula: con las variables tal como se define en la reivindicación referenciada en el paso (iii), dando como resultado un cebador extendido con componentes de origen natural; y (vii) repetir los pasos (iv) a (vi) una o más veces para identificar una pluralidad de bases en el ácido nucleico objetivo, en donde el cebador extendido del paso (vi) del ciclo previo reacciona en lugar del complejo de cebador hibridado/ácido nucleico objetivo en el paso (iv) del ciclo subsecuente.

58. El método de acuerdo con la reivindicación 57, en donde el paso (vi) se lleva a cabo en la presencia de azida de sodio.

59. El método de acuerdo con la reivindicación 58, en donde la concentración de azida de sodio es de 0.1 mM a 10 m M .

60. El método de acuerdo con la reivindicación 59, en donde la concentración de azida de sodio es de aproximadamente 1 mM.

61. El método de acuerdo con la reivindicación 57, en donde el paso (vi) se lleva a cabo en la presencia de acetato de sodio.

62. El método de acuerdo con la reivindicación 61, en donde la concentración de acetato de sodio es de 0.1 mM a 10 mM.

63. El método de acuerdo con la reivindicación 61, en donde la concentración de acetato de sodio es de aproximadamente 1 mM.

64. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 57 a la 63, en donde los pasos (v) o (vi) se llevan a cabo en la presencia de tiourea.

65. El método de acuerdo con la reivindicación 64, en donde la concentración de tiourea es de 10 mM a 500 mM.

66. El método de acuerdo con la reivindicación 64, en donde la concentración de tiourea es de aproximadamente 100 mM.

67. El método de acuerdo con la reivindicación 58, en donde el paso (vi) se lleva a cabo en la presencia de ditiotreitol (DTT).

68. Un método para secuenciar un ácido nucleico objetivo que comprende los siguientes pasos: (i) adherir el extremo 5' de un ácido nucleico a una superficie sólida; (ii) hibridar un cebador para el ácido nucleico adherido a la superficie sólida para formar un complejo de cebador hibridado/ácido nucleico objetivo; (iii) obtener una polimerasa y uno o más compuestos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 56, siempre que el compuesto de las diferentes fórmulas l-VII tenga diferentes fluoroforos. (iv) hacer reaccionar el complejo de cebador hibridado/ácido nucleico objetivo con una polimerasa y uno o más compuestos del paso (iii) para formar una hebra de cebador en crecimiento a través de una reacción de polimerasa; (v) generar imágenes de la hebra de cebador en crecimiento para identificar el compuesto incorporado del paso (iv) a través de su fluoroforo; (vi) exponer la superficie sólida con la hebra de cebador de crecimiento a una fuente de luz para eliminar la porción de terminación que se puede fotodescomponer de la fórmula: con las variables tal como se define en la reivindicación referenciada en el paso (iii), dando como resultado un cebador extendido con componentes de origen natural; y (vii) repetir los pasos (iv) a (vi) una o más veces para identificar una pluralidad de bases en el ácido nucleico objetivo, en donde el cebador extendido del paso (vi) del ciclo previo reacciona en lugar del complejo de cebador hibridado/ácido nucleico objetivo en el paso (iv) del ciclo subsecuente.

69. El método de acuerdo con la reivindicación 68, en donde el paso (vi) se lleva a cabo en la presencia de azida de sodio.

70. El método de acuerdo con la reivindicación 69, en donde el paso (vi) se lleva a cabo en la presencia de ditiotreitol (DTT).

71. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 57 y 68, en donde la incorporación de al menos un compuesto de acuerdo con el paso (iv) ocurre de aproximadamente 70% hasta aproximadamente 100% de la eficiencia de incorporación de su contraparte de nucleótido natural.

72. El método de acuerdo con la reivindicación 71, en donde la eficiencia de incorporación ocurre de aproximadamente 85% hasta aproximadamente 100%.

73. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 57 y 68, en donde la polimerasa se selecciona del grupo que consiste en transcriptasa inversa, transferasa terminal y polimerasa de ADN.

74. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 57 y 68, en donde de aproximadamente 85% hasta aproximadamente 100% de las porciones de terminación que se pueden fotodescomponer se eliminan mediante exposición a una fuente de luz en el paso (vi).

75. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 57 y 68, en donde la incorporación de al menos un compuesto de acuerdo con el paso (iv) es seguida por la terminación de una hebra crecida en una eficiencia de aproximadamente 90% hasta aproximadamente 100%.

76. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 57 y 68, en donde del detector de excitación de línea múltiple pulsada se utiliza para generar imágenes en el paso (v).

77. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 57 y 68, que comprende además lavar la hebra de cebador en crecimiento antes del paso (iv).

78. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 57 y 68, que comprende además lavar el cebador extendido después del paso (vi).

79. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 57 y 68, que comprende además, antes del paso (iv) tapar cualquiera de los cebadores o hebras de cebador de crecimiento que no reaccionaron en el paso (iv).

80. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 57 y 68, que comprende además secuenciar en forma sincrónica ácidos nucleicos objetivo múltiples.

81. Un método para convertir un componente de origen no natural que se encuentra en una molécula de ácido nucleico en un componente de origen natural, en donde el método comprende: (i) incorporar un compuesto de acuerdo con cualquiera reivindicaciones de la 1 a la 56; (ii) exponer el ácido nucleico resultante a una fuente de luz para eliminar una porción de terminación que se puede fotodescomponer de la fórmula: con las variables tal como se define en la reivindicación referenciada en el paso (ni), a partir del ácido nucleico.

82. El método de acuerdo con la reivindicación 81, que comprende además convertir en forma sincrónica componentes de origen no natural que se encuentran en múltiples moléculas de ácido nucleico en componentes de origen natural.

83. El método de acuerdo con la reivindicación 82, que comprende además terminar en forma sincrónica múltiples síntesis de ácido nucleico.

84. Un método para terminar una síntesis de ácido nucleico, en donde el método comprende el paso de colocar un nucleotido o nucleósido 3'-OH desbloqueado de acuerdo con la reivindicación 1 en el ambiente de una polimerasa, y permitir la incorporación del nucleotido o nucleósido 3'-OH desbloqueado en una molécula de ácido nucleico.

85. El método de acuerdo con la reivindicación 84, en donde la eficiencia de terminación de la síntesis de ADN al momento de la incorporación del nucleotido o nucleósido 3'-OH desbloqueado fluctúa desde aproximadamente 90% hasta aproximadamente 100%.

86. El método de acuerdo con la reivindicación 84, en donde la eficiencia de la incorporación del nucleotido o nucleósido 3'-OH desbloqueado fluctúa desde aproximadamente 70% hasta aproximadamente 100% en comparación con la eficiencia de incorporación de un nucleotido o nucleósido de origen natural con la misma base que el nucleotido o nucleósido 3'-OH desbloqueado.

87. Un método para llevar a cabo una secuenclación de Sanger o tipo Sanger, en donde el método comprende utilizar un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 56, como un análogo de nucleótido de terminación.

88. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 57, 68, 81, 84 y 87, en donde el compuesto se define en forma adicional como un compuesto de la fórmula (I).

89. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 57, 68, 81, 84 y 87, en donde el compuesto se define en forma adicional como un compuesto de la fórmula (II).

90. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 57, 68, 81, 84 y 87, en donde el compuesto se define en forma adicional como un compuesto de la fórmula (III).

91. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 57, 68, 81, 84 y 87, en donde el compuesto se define en forma adicional como un compuesto de la fórmula (IV).

92. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 57, 68, 81, 84 y 87, en donde el compuesto se define en forma adicional como un compuesto de la fórmula (V).

93. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 57, 68, 81, 84 y 87, en donde el compuesto se define en forma adicional como un compuesto de la fórmula (VI).

94. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 57, 68, 81, 84 y 87, en donde el compuesto se define en forma adicional como un compuesto de la fórmula (VII).

95. Un método para determinar la secuencia de un ácido nucleico objetivo, en donde el método comprende: (i) agregar un ácido nucleico objetivo a un aparato de secuenciación Sanger o tipo Sanger, (ii) agregar uno o más compuestos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 56 al aparato de secuenciación, siempre y cuando esté presente más de un tipo de base, en donde cada base está adherida a un diferente fluoroforo; (iii) agregar un cebador complementario y una enzima de polimerasa , (iv) llevar a cabo una reacción de polimerasa para incorporar al menos uno de los compuestos del paso (ii) en una hebra de ácido nucleico de crecimiento, y (v) analizar el resultado de la reacción de secuenciación de Sanger con instrumentación de secuencia de fluorescencia o mediante fluorescencia de excitación de línea múltiple pulsada, en donde los pasos (i) a (iii) se pueden llevar a cabo en cualquier orden.

96. El método de acuerdo con la reivindicación 95, en donde la incorporación de al menos un compuesto de acuerdo con el paso (iv) está seguida de la terminación del crecimiento de hebra en una eficiencia de desde aproximadamente 90% hasta aproximadamente 100%.

97. El método de acuerdo con la reivindicación 95, en donde la incorporación de al menos un compuesto de acuerdo con el paso (iv) ocurre en de aproximadamente 70% hasta aproximadamente 100% de la eficiencia de incorporación de un substrato nativo con la misma base en la reacción de polimerasa.

98. El método de acuerdo con la reivindicación 97, en donde la eficiencia de incorporación ocurre en de aproximadamente 85% hasta aproximadamente 100%.

99. El método de acuerdo con la reivindicación 95, en donde la polimerasa se selecciona del grupo que consiste en transcriptasa inversa, transferasa terminal y polimerasa de ADN.

100. Un método para incorporar un componente de origen no natural en un ácido nucleico, en donde el método comprende: (i) agregar un ácido nucleico objetivo a un aparato de secuenciación; (ii) agregar uno o más compuestos de acuerdo con la reivindicación 1 al aparato de secuenciación, siempre y cuando esté presente más de un tipo de base, estando adherida cada base a un diferente fluoroforo; (iii) agregar una enzima de polimerasa; y (iv) llevar a cabo una reacción de polimerasa para incorporar al menos uno de los compuestos del paso (ii) en una hebra de ácido nucleico de crecimiento, en donde los pasos (i) a (iii) se pueden llevar a cabo en cualquier orden.

101. El método de acuerdo con la reivindicación 100, en donde el método comprende además (v) analizar el resultado de la reacción de cadena de polimerasa para la incorporación de al menos un compuesto del paso (ii).

102. El método de acuerdo con la reivindicación 100, en donde la incorporación de al menos un compuesto con el paso (iv) está seguida de la terminación del crecimiento de hebra en una eficiencia de desde aproximadamente 90% hasta aproximadamente 100%.

103. El método de acuerdo con la reivindicación 100, en donde la incorporación de al menos un compuesto de acuerdo con el paso (iv) ocurre en de aproximadamente 70% hasta aproximadamente 100% de la eficiencia de incorporación del sustrato nativo con la misma base en la reacción de polimerasa.

104. Un método para llevar a cabo una minisecuenciación o secuenciación tipo minisecuenciación, en donde el método comprende la adición de un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 a un método de minisecuenciación o secuenciación tipo minisecuenciación.

105. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 95, 100 y 104, en donde el compuesto se define en forma adicional como un compuesto de la fórmula (I).

106. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 95, 100 y 104, en donde el compuesto se define en forma adicional como un compuesto de la fórmula (II).

107. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 95, 100 y 104, en donde el compuesto se define en forma adicional como un compuesto de la fórmula (III) .

108. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 95, 100 y 104, en donde el compuesto se define en forma adicional como un compuesto de la fórmula (IV) .

109. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 95, 100 y 104, en donde el compuesto se define en forma adicional como un compuesto de la fórmula (V).

110. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 95, 100 y 104, en donde el compuesto se define en forma adicional como un compuesto de la fórmula (VI).

111. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 95, 100 y 104, en donde el compuesto se define en forma adicional como un compuesto de la fórmula (VII).

112. Un sistema que comprende: una célula de flujo que comprende una pluralidad de gránulos, en donde: cada gránulo está adherido a una molécula de ADN, en donde un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 56 ha sido incorporado utilizando una polimerasa; y la célula de flujo es al menos parcialmente transparente a la luz visible y UV; un aparato de generación de imágenes configurado para capturar imágenes de la célula de flujo; una rueda de filtro que comprende al menos cuatro filtros de espectro, en donde la rueda del filtro está configurada para ciclar entre cada filtro; una lámpara configurada para crear una trayectoria de luz desde la célula de flujo, a través de un filtro en la rueda de filtro, hasta el aparato de generación de imágenes; y una fuente de luz ultravioleta configurada para proporcionar luz ultravioleta a las moléculas de ADN que se encuentran en la célula de flujo.

113. El sistema de acuerdo con la reivindicación 112, en donde la célula de flujo es una célula de flujo microfluida.

114. El sistema de acuerdo con la reivindicación 112, que comprende además un lente objetivo entre la rueda de filtro y la célula de flujo.

115. El sistema de acuerdo con la reivindicación 112, que comprende además un espejo configurado para dirigir la trayectoria de luz hacia el aparato de generación de imagen.