JP2005536747A

JP2005536747A - 保護コーティングをアッセイ基質に形成する為の方法と組成物及び、これにより生産された基質

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Publication number: JP2005536747A
Application number: JP2004531054A
Authority: JP
Inventors: エム．カドゥシンジェイムス; シー．ゲッツロバート
Original assignee: データスコープ・インヴェストメント・コーポレイション
Priority date: 2002-08-21
Filing date: 2003-08-19
Publication date: 2005-12-02
Also published as: AU2003259901A8; IL166253A0; US20040110196A1; WO2004018992A2; EP1551627A4; WO2004018992A3; AU2003259901A1; EP1551627A2

Abstract

アッセイ基質の表面上に配される保護コーティングを形成するための組成物であって、検出シグナルを発生可能な指示薬を備える。該組成物は、保護コーティング形成材料を備えるとともに、アッセイ基質の表面を覆うのに十分な量の保護コーティング形成材料を供給する供給システムを有する。供給システムは、アッセイ基質の表面から蒸発し、保護コーティングを形成する。該保護コーティングは、少なくとも略保護コーティング形成材料からなる。保護コーティング形成材料は、略透明であり、指示薬により発せられる検出シグナルを透過可能である。本発明は、更に、アッセイ基質表面上に保護コーティングを形成する方法並びに該方法により作られる基質にも関連する。

Description

本発明は米国特許出願第60／406,015号、出願日２００２年８月２６日、発明の名称溺ETHOD AND DEVICE FOR PRESERVING THE FLUORESCENCE OF FLUOROCHROMES FROM DEGRADATION IN TYPICAL LABELING/DETECTION ASSAYS BY USING A NON-FLUORESCENT TRANSPARENT COATING 「非蛍光性透明コーティングの使用により、通常のラベリング／検出アッセイにおいて退色から蛍光色素の蛍光発光を保つ為の方法及び装置」)の優先権を主張する。さらに、米国特許出願第が60／404,958号で２００２年８月２１日に出願された、発明の名称が溺ETHOD AND DEVICE FOR PRESERVING THE FLUORESCENCE OF FLUOROCHROMES FROM DEGRADATION IN TYPICAL LABELING/DETECTION ASSAYS BY USING A NON-FLUORESCENT TRANSPARENT COATING 「非蛍光性透明コーティングの使用により、通常のラベリング／検出アッセイにおいて退色から蛍光色素の蛍光発光を保つ為の方法及び装置」)に対して優先権を主張する。その内容は参照により十分に本願明細書に援用されている。
本発明は保護コーティングをアッセイ基質上に形成する為の方法及び組成物、より具体的には保護コーティングを形成して寿命を延ばす事、シグナル発生ダイの酸化率及び、アッセイ基質に関連して使用される蛍光性分子を含むラベルの酸化率を遅らせる方法と組成物に関する。

アッセイには例えばＤＮＡマイクロアレイが含まれる。ＤＮＡマイクロアレイは一般的にはラベルとダイの形式にある一連の指示薬を利用する。一連の指示薬は、標本内の1つまたはそれ以上の要素の質的及び／又は量的特性（言い換えれば、存在、非存在、寸法または質）を明らかにする。これらの指示剤は一般的には情報つまりシグナルを発生し、その後の検出と分析がされる事により、対応する検査と測定がされる。化学的に活性の指示薬のシグナル発生は概して、関与する成分の存在又は非存在により誘因された化学的反応又は事象を通じて起こされる。これらの指示薬は化学的に活性である為、指示薬はしばしば酸化剤の存在に対して反応しやすい。酸化剤になる物はオゾン等と、一般的に外気に存在する他の物質である。

例えば、従来の核酸検出は典型的には核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の２つの相補鎖をハイブリダイズする事により実行される。検出可能なシグナルを発生すべく、ラベルされたヌクレオチドを有する対象物とプローブは、それぞれ直接的又は間接的にＤＮＡ鎖の中に組み込まれている。ラベルは放射性同位原素であればよく、^３２Ｐ、ビオチン、ジゴキシゲニン、多様な蛍光性分子、可視ダイ、酵素ベースのコントラスト・エージェント(contrast agents)を含むコントラスト・エージェント、並びに当業者に知られているその他である。各種のラベルは明確な蛍光標識を生ずる為の特徴的な構造とスキームを必要とする。アッセイの種類により、1つのラベルが他よりも好まれ得るが、相応するラベルの適当な選択は当技術に精通しているものには知られている。本発明の実施例では特に関心を寄せるラベルは蛍光色素または蛍光性のダイである。これらのラベルは典型的には核酸ベースのアッセイに存在するようにヌクレオチド類似体として、またはプロテインベースのアッセイに存在するように化学的誘導体として直接組み込まれている。

典型的アッセイのいくつかの一般的な例は蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリッド形成法（ＦＩＳＨ）、免疫組織化学のアッセイ、発現された遺伝子の検出と分析に使われる蛍光性のマイクロアレイを含む。いったん蛍光発光ラベルがアッセイにレポーターとして組み込まれると、そのアッセイの為に特に設計されたある種の計装を使用して検出されるが、その選択は当業者には十分に知られている。蛍光発光の測定の為に設計された機器全てに共通しているものはレーザーなどの光源で、波長の長さで光を発する能力をもつものは「励起波長」として言及され、蛍光色素原子内で電子を代替のエネルギー準位に「励起」させるのに適する。次に電子はエネルギーの光子を発し、元のエネルギー準位に回復する。この特性は蛍光発光と一般的に言及される。放出されたエネルギーは典型的には、当初蛍光色素を励起するのに必要とされるエネルギーと比較して、長い波長（低いエネルギー）である。発せられたエネルギーは機器で検出され適当な出力形式に変換される。一般的な蛍光色素や蛍光性のダイの例には、ニュージャージー州ピスカタウェイ（Piscataway, New Jersey）のアマシャム・ファルマシア・バイオテク株式会社（Amersham Pharmacia Biotech Inc.）によるシアニンダイ（商標登録）（Cyanine^TM）のＣｙ３とＣｙ５、アレクサ・フロールダイ（商標登録）（Alexa Fluor^TM）の、アレクサ４８８、アレクサ５４６、アレクサ５９４、アレクサ６４７や類似するものがあり、それぞれモレキュラー・プローブ（Molecular Probes）から入手可能である。

放射性のラベルと違い、蛍光性の分子は自然な退色工程を明瞭にしない。しかしながら、本発明の発明者が発見したように蛍光性のラベルはその化学的構造を変化させ得る因子に対して反応しやすく、従ってその蛍光特性が減少または破壊がされる。そういった蛍光性のラベルに影響を及ぼす因子の例には、光、空気中に見られる酸化剤でオゾンや、基本的化合物やそういったものが含まれる。幾つかのケースではこれらの因子はフリーラジカルを発生させ蛍光色素の化学的構造を誘導または変化させる。「レッド・チャネル」（red channel）ダイ、Ｃｙ５、アレクサ６４７やそういったものは、この形式の劣化に最も影響されやすく、しばしばこれらのダイを含む実験からのデータは使用不能であるので、実験は繰り返さる必要がある。また、多くの場合においてこれらの「レッド・チャネル」ダイからのシグナルは短寿命で、初めのシグナルの１０％以下に、アッセイ完成後１−５分といった短時間で弱まり得る。読み取り機器においてシグナル検出に先立って長時間経つような場合には、信頼の置ける結果を得るのは略不可能である。

蛍光性のシグナルの劣化により、一般的に信頼の置けない結果を出す傾向にあるアッセイの一例はマイクロ・アッセイにおける発現された遺伝子の分析である。概して、マイクロアレイは支持手段を含み、ガラス製顕微鏡用スライド、シリコン板またはナイロン膜等のほぼ完全に平面な基質を持ち、直径約２０ミクロンを特徴とする小さな点の格子で覆われている。それぞれの点つまり特徴は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の一本鎖から抽出された核酸の特定配列の何百万もの複製を含む事である。含まれる多数の特徴により、典型的にコンピューターが使用され、それぞれの所定の特徴に位置するそれぞれの配列が知られる。それぞれのマイクロアレイは、個々の「試験管」実験の何千回に相当する実験を短い期間の間に実行する能力を持ち、その結果何千もの発現された遺伝子の迅速で同時の検出を提供する。マイクロアレイは標本の遺伝子の変異型、もしくは突然変異型（すなわち遺伝子型）の存在に対する分析、または発現された遺伝子のプロフィール分析といった一連のアプリケーションでの手段となってきた。

発現の分析には鋳型としてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が細胞の標本から抽出され、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を産生するために通常逆転写される。先行技術の最初の例として、１またはそれ以上の、指示薬（蛍光性ダイなどといったラベルまたはマーカーを含む）または検出手段は直接ｃＤＮＡの複製に逆転写の過程で組み込まれる。適当なハイブリダイゼーション条件下では、ラベル付けされた断片はハイブリダイズまたは相補的核酸配列（すなわち遺伝子プローブ）と組み合わされる。相補的核酸はすぐにそこから検出できるようにマイクロアレイの構造に付着している。このラベル方式は一般的に「直接の結合」として言及されてきた。もう１つの方法、他のラベリング方式が本発明で使用可能であり、例えばデンドリマーを利用するラベリング方式である。これは米国特許第5,175,270号及び5,484,904号及び5,487,973号に記載されており、その内容は本願に引用して援用される。または、線状ポリマーを使用するラベリング方式もあり、これは米国特許出願第60/388,196号に記載されておりその内容は本願に引用して援用される。

米国特許第5,175,270号米国特許第5,484,904号米国特許第5,487,973号

マイクロアレイに対するｃＤＮＡのハイブリダイゼーションにあたり、検出可能なシグナル（例えば蛍光発光）が、ｃＤＮＡ断片を含むそれぞれの特徴からの陽性反応として発せられる。ｃＤＮＡ断片は、そこに付着した相補的遺伝子プローブとハイブリダイズされている。検出可能なシグナルは、適当なスキャナ装置又は顕微鏡で見ることが可能であり、それからコンピューターや使用者がハイブリダイゼーション・パターンを生成する為の分析が可能である。マイクロアレイ（プローブ）におけるそれぞれの構造で核酸配列は既知であるので、何であれ、特定の構造での陽性反応（たとえばシグナル発生）は、相補的ｃＤＮＡ配列が標本細胞内に存在することを示す。時折不適当な組み合わせがあるが、それぞれのスポットつまり構造にある、何百万の遺伝子プローブの付着物は、試験標本の相補的ｃＤＮＡが存在するときにのみ、検出可能なシグナルが強力に発せられている事を保証する。しかしながら特定のアッセイのシグナルが急速な劣化を起こす傾向があるならば、結果はほとんど役に立たず、解釈は困難であるかも知れない。

保護コーティングをアッセイ基質に形成し、指示薬（例えば蛍光性のダイまたはラベル）を、オゾンや埃やそういったものと同様に不都合な影響を及ぼす環境因子から、保護と保存する為の組成物と方法を開発することは望ましい事である。アッセイ基質に関連する指示薬を密閉してふさぎ、周囲の大気から隔離して指示薬の寿命を延ばす、保護コーティングを供給する必要がある。指示薬から発せられるシグナルの検出を望ましくなく妨げ得る、有害な非特異的シグナル（すなわちバックグラウンドノイズ）の量を、最小限に寄与する一方、指示薬から発せられたシグナルの通過を容易にする為の実質的透明性を供給する必要がある。

本発明は、アッセイ基質表面上に保護コーティングを形成するための組成物並びに方法に関する。アッセイ基質は、検出シグナルを発生可能な指示薬を備える。組成物は、供給システムを有し、該供給システムは、保護コーティング形成材料をアッセイ基質表面に供給する。供給システムは、制御下で蒸発可能とされ、アッセイ基質表面上の保護コーティングを後に残す。本発明の組成物並びに方法から形成される保護コーティングは、気密に指示薬を周囲の大気に対してシールする。それ故、指示薬のシグナル発生寿命は大幅に延長されることとなる。保護コーティングは更に、指示薬によって発せられるシグナルを透過可能とする。その一方で、非特異的シグナル発生（即ち、バックグランド・ノイズ）を防止し或いは最小限化する。このような非特異性シグナル発生は、指示薬により発せられるシグナルの検出に、望ましくない干渉をもたらすものである。本発明は、本発明の方法並びに組成物により製造されるアッセイ基質にも関する。

本発明の一の実施形態において、検出シグナルを発生可能な指示薬を備えるアッセイ基質の表面上の保護コーティングを形成するための組成物であって、該組成物は、保護コーティング形成材料と、アッセイ基質の表面をコーティングするために十分な量の前記保護コーティング形成材料を供給する供給システムからなり、前記供給システムは前記アッセイ表面から蒸発し、保護コーティングを形成し、該保護コーティングは少なくとも略保護コーティング形成材料からなり、該保護コーティング形成材料は、前記指示薬によって発生される検出シグナルに対して少なくとも略透明であることを特徴とする組成物を提供する。本発明の組成物は、液体或いはエアロゾルの形態である。

本発明の他の実施形態において、検出シグナルを発生可能な指示薬を備えるアッセイ基質の表面上に配設される略透明な保護コーティングを形成する方法であって、保護コーティングを形成するのに十分な量の上記組成物を前記アッセイ表面に供給し、周囲の大気から指示薬をシールする段階と、前記組成物を乾燥させ、前記供給システムを除去し、略透明な保護コーティングを生じさせる段階からなることを特徴とする方法を提供する。
本発明の更なる実施形態において、（ａ）指示薬を支持する材料と、（ｂ）検出シグナルを発生可能な指示薬と、（ｃ）保護コーティング形成材料を主としてなる保護コーティングからなり、前記保護コーティング形成材料は、前記指示薬によって発生される検出シグナルに対して少なくとも略透明であることを特徴とするアッセイ内での使用に好適な基質を提供する。

以下の図面は本発明の実施形態を図解したものであり、出願の一部をなす請求の範囲によって記述されるものとして、本発明を限定することは、意図されていない。
本発明の大部分は、組成物、及び、付随する検出シグナルを生成する能力を持つ指示薬を含むアッセイ基質表面上に、保護コーティングを形成するための方法に関するものである。この方法によると、指示薬を気密封止して周囲大気から隔離することで、生成されたシグナルの寿命を、有意差が生まれる程度まで、拡大できると同時に、検出シグナル観察のための、完全な透明性を確保できる。本発明の組成物から形成される保護コーティングは、さらに、指示薬により生成されるシグナルの検出に有害な量の非特異性の生成を妨害する特性を持つ。本発明の組成物は、液体またはエアロゾルの状態をとる。本発明は、さらに、本発明の方法、および組成物によって生産されるアッセイ基質を含む。

本発明の組成物は、様々な基質と用いることができる。様々な基質とは、ガラス基質、アミノシラン基質、エポキシ基質、ポリ-L-リジン基質などを含む。指示薬は、一般的な生体蛍光ダイまたは蛍光ダイ、³²Ｐなどのラジオアイソトープ、ビオチン、ジゴキシゲニン、各種の蛍光分子、可視ダイ、および、酵素をもとにした造影剤など、当分野において既知のその他の造影剤を含む。アミノアリル及びそれに類するものなどの指示薬は、直接取り込みで用いられる。

本発明の一つの形態では、当組成物は、保護コーティング形成材料をアッセイ基質表面まで運ぶ、供給システムを含む。供給システムは、水溶性ベース溶媒システムまたは、有機ベース溶媒システムからなる。供給システムの種類は、溶媒和かつ送達される能力のある、保護コーティング形成材料の種類により特定される。保護コーティング形成材料は、次のような種類であることが望ましい。純粋な、中程度の硬度の、熱可塑性アクリル樹脂で、耐用性があり、非架橋性で、少なくとも鋳造直後には完全に透明であることが望ましい。望ましい一つの形態では、保護コーティング形成材料は、たとえば、メチルアクリレ−トとエチルメタアクリレートのコポリマー及びそれに類するものなどから選ばれた、アクリルポリマー樹脂である。代表的な適当なアクリル樹脂には、アクリロイドＡＴ４１０、パラロイド（登録商標）Ｂ７２、パラロイド（登録商標）Ｂ６６などがある。いずれも、Rohm & Hassより購入可能である。

本発明の一形態では、当組成物は、総量に対する体積率で、およそ、１％から９０％の保護コーティング形成材料を含有する。より望ましいのは、体積率で、およそ、１０％から５０％、最適であるのは、体積率で９％である。

本発明における供給システムは、本発明における保護コーティング形成材料を容易に溶解するように、処方されている。供給システムは、保護コーティングとの溶液から、少なくとも大部分が保護コーティング形成材料からなる保護コーティングを残すように制御をされて、揮発する。保護コーティングは中の保護コーティング形成材料は、好ましくは最低９５％、さらに好ましくは最低９８％で、１００％に接近するのが望ましい。結果として形成される、保護コーティングは、以下で述べるような望ましい特性を発揮する。

本発明の一形態では、供給システムは、最低一種の揮発性溶媒からなる。ここでの、揮発性溶媒は、組成物のアッセイ基質表面へのアプリケーションにおいて、保護コーティング形成材料を溶解可能かつ、制御されながら、容易に揮発可能なものである。適当な揮発性溶媒は、使用される保護コーティング形成材料によるが、有機および水溶性溶媒である。このような溶媒には、これらには限らないが、水、アルコール類、トルエン、キシレン、ヘプタン、ブタノール、n-ブチルアセテート、メチルアミルケトン、エチルベンゼン、エチレングリコールブチルエーテル、エチル-3-エトキシプロピネート、イソプロピルアルコール、芳香族１５０、エタノール、メトキシプロパノール、アセトン、及びこれらの組合わせ、及びそれに類するものがある。

供給システムにより沈着された保護コーティングは、蛍光ダイまたは生体蛍光色素などの指示薬を励起させるのに必要な、励起波長を透過しやすい。また、生成された、検出のための蛍光波長を透過しやすい。保護コーティングは、例えばオゾンなどの大気中に存在する気体を含む気体の浸透を、充分に防ぐ。このようにして、保護コーティングは、外界物質に対して有効な障壁を形成する。外界物質は、指示薬を不都合に、酸化させたり、性能を損ねたりしかねない。さらに、保護コーティングは、有害量の、蛍光の形をとった非特異性（つまりバックグラウンドノイズ）を生成しない。このような蛍光は、指示薬により生成された、シグナルを検出する妨げとなりうる。

本発明の組成物は、さらに、保存料を含む。保存料は、保護コーティングの、黄変または変色を、最小化または排除する。保護コーティングは、供給システムの揮発途中および、結果得られる保護コーティングの耐用期間中における、酸化作用またはその他の有害な作用からの保護を役目とする。選択的に保存料を取り込むことにより、シグナルの伝達性および検出可能性は、増強する。また、さらには、不都合な、非特異性の生成または蛍光を低減または排除する。このような保存料には、ナフタレンなどの芳香族ナフサ、またはそれに類するものなどがある。本発明の組成物中に取り込まれる保存料の量は、組成物の総量に対して、体積率でおよそ、０．１％から１０％の範囲に収まる。より好ましくは、体積率でおよそ、０．２％から１．５％、最適であるのは、体積率で約０．５２%である。

本発明の一形態では、本発明の組成物は、メチルアクリレ−トとエチルメタアクリレートのコポリマーと、アセトン、トルエン、ナフタレン、及びエチル-3-エトキシプロピネートから成る供給システムを含む。一つの好ましい形態では、組成物は、体積率で８．７５％のメチルアクリレ−トとエチルメタアクリレートのコポリマー、体積率で０．５２％のナフタレン、体積率で２６．３５％のアセトン、体積率で６４．０３％のトルエン、及び体積率で０．３５％のエチル-3-エトキシプロピネートから成る。いずれの比率も、組成物全体の体積に基づく。

本発明の組成物は、さらに、アクリルポリマー樹脂に通常微量含まれる可能性のある、石油留出物を含む。エアロゾルの状態をとる当組成物は、さらに、炭化水素噴霧剤およびそれに類するものを含む。

本発明はさらに、付随する検出シグナルを生成する指示薬を含む、アッセイ基質表面上に、完全に透明な保護コーティングを形成する方法を含む。検査材料および指示薬を含む、調整済みのアッセイ基質は、まず、余分な水分を取り除くために乾燥される。アッセイ基質は、清浄な、塵のない環境に、保管されるのが好ましい。必要であれば、圧縮空気を吹き付けることにより、アッセイ基質から、いかなる潜在的な、汚染源または周囲物質をも除去しうる。本発明の組成物は、指示薬に接するアッセイ基質表面に、用いられる。本発明の組成物をアッセイ基質に、用いる際には、いかなる適当な方法を取ってもよい。例えば、スプレイ、浸漬、ピペッティング及びそれに類する方法などがある。好ましくは、アッセイ基質を、当組成物で満たした浴槽に浸漬する。アッセイ基質を、およそ、５秒から１０秒浸す。アッセイ基質を浴槽から取り出し、余剰分は全て、タオルで、吸い取られるまたは除去される。アッセイ基質は垂直にして、およそ３分から５分、放置、乾燥される。

または、当組成物を使用する手順を反復してもよい。その場合、外気に露出することで受ける悪影響から、指示薬を、より保護できる。

ひとたび、保護コーティング組成材料が乾燥されると、コーティングされたアッセイ基質は、検出および分析のために走査されうる。コーティングされたアッセイ基質を暗所にて保管すると、指示薬は、最低３週間、活性に保たれる。

一つの代替実施形態では、本発明の組成物を、アッセイ基質表面全体に、適量ピペッティングして用いることが可能である。次に、アッセイ基質を、３秒間未満揺らして、アッセイ基質表面全体に、均一に、組成物を分配する。その後、アッセイを垂直に置き、本発明の組成物の余剰分をタオルに吸い取らせる。アッセイ基質を垂直状態で、およそ、３分から５分間乾燥させる。

ひとたび保護コーティング形成材料が乾燥すると、アッセイ基質は、信号の走査及び読取を強化するプロセスに用いられる。保護コーティングは、不均一に分配されうるので、結果、偽信号またはひずみを生みうる。このことは、走査およびアッセイの結果に悪影響を与えかねない。保護コーティングの不均一な分配は、研磨過程を機能させることで、是正されうる。研磨過程は不均一分配を除去するために必要な限り、反復されうる。本発明の一つの形態では、研磨溶液が、溶媒混合物を含むように調製されている。溶媒混合物は、乾燥した保護コーティング基材を溶解し、またアッセイ基材から除去するのに適格な、最低１種類の溶媒を含む。この際、残りの保護コーティングに、悪影響を及ぼすことはない。溶媒混合物は、アセトンおよびトルエンを、およそ、１：２から１：３の体積比で含む混合物であるのが望ましい。アセトンとトルエンを、約１：３の体積比で含む混合物が、最適である。

研磨溶液で満たされた浴槽を用意する。アッセイ基質は、研磨溶液に浸漬されると、迅速に取り出される。研磨溶液が、乾燥した保護コーティングの層を基質表面から除去する。アッセイ基質は、その場で放置、乾燥される。研磨の過程は、均一な保護コーティングが形成されるまで、必要な限り、繰り返されうる。

（試験例１）
ここでは、記述の都合上、マイクロアレイについての言及となるが、この発明は、マイクロアレイに限らず、他のアッセイ形式に用いられうる。他のアッセイ形式とは、現在使用されている、または、今後開発される検出方法(例えば、蛍光ダイまたはそれに類するもの）のいずれをも含む。蛍光ダイまたはそれに類するものは、化学構造を変化させたり、被検出能力を損ねかねないような薬剤に対する感度が高い。つまり、蛍光ダイが、自身の蛍光性を検出しうる。

次のような単純なマイクロアレイ試験により、オゾンが蛍光ダイの完全性に与える影響が、テストされる。初めに、この分野の技術者に知られている方法に従って、マウスの全ＲＮＡを相補ＤＮＡに逆転写した。その例はGenisphere Submicro Oligoの記述中、付録Bプロトコルに詳述されている。相補（コピー)ＤＮＡつまりｃＤＮＡは、５ピコモル/μＬの逆転写開始剤を含むＣｙ３およびＣｙ５逆転写開始剤の両方を用いて、調製した。逆転写反応は、先に述べたように、最終的に３５μＬに達すると、停止された。Genisphere社製のバイアル６ハイブリッド形成緩衝液１２０μＬ中に１０μg含む、マイクロアレイの主要ハイブリッド形成混合物を、準備刺激を受けたＣｙ３およびＣｙ５相補ＤＮＡを各１７．５μＬと、Ｃｙ３およびＣｙ５３ＤＮＡ（商標登録）キャプチャー試薬（バイアル１）（Genisphere, Inc., Montvale, NJ)各１２．５μＬを、Genisphere Submicro Oligo kitのバイアル６ハイブリット形成混合物６０μＬと混合して調製した。上記の手法に関連する詳細は米国特許出願番号第09/802,162号にある。その内容はここで、参照に示した。

結果として得られた主要ハイブリッド形成混合物は、加熱ブロックで、１０分間８０℃まで加熱された。混合物は、相補ＤＮＡを３ＤＮＡ試薬にプレハイブリダイズするために、５５℃に冷却するまで４５分間放置された。４５分後５５℃で、捕獲連鎖阻害剤５μＬを主要ハイブリッド形成混合物に加え、その混合物は２０分間温置された。２５μＬの混合物は、４つのマイクロアレイに、それぞれ用いられた。４つのマイクロアレイは、既知のマウス遺伝子から生成された、７０塩基長のオリゴヌクレオチドを含む。カバーガラス（２２×３０）が各マイクロアレイに取り付けられ、マイクロアレイは２００μＬの、脱イオン水が加えられた中に水平に置かれた、コーニング社の５０ml遠心分離チューブに挿入された。各マイクロアレイは、乾燥したハイブリッド形成オーブン内で一晩、５５℃に温置された。翌朝、４つのマイクロアレイは、Genisphere Submicro Oligoプロトコルに示された通りに洗浄された。４つのマイクロアレイが乾燥するまで、スピンした後、４つのうち、２つのマイクロアレイは、保護コーティングを形成するためにエアロゾルを噴霧され、２つはそのまま放置された。４つのマイクロアレイは、その後、Axon 4000B マイクロアレイ・スキャナ内で、走査された。これらの走査により得られたデータは、その後の比較のために保持された。データが集められた後、４つのマイクロアレイは最大にセットしたオゾン発生装置とともに、箱内に置かれた。箱が閉められ、発生装置は、コンセントにつながれ、スイッチを入れられた。５分後、オゾン発生装置は、スイッチを切られ、マイクロアレイは同じ環境で再び走査された。

図１は、上記のようにエアロゾルを噴霧した２つのマイクロアレイのうち１つと、処理を受けなかった二番目のマイクロアレイの像を表す。図１に示されたように、噴霧処理されたマイクロアレイは、処理を受けないマイクロアレイと、ほぼ同じに見える。このことは、噴霧により形成された保護コーティングは蛍光ダイの蛍光特性を阻害しないことを示す。また、アプリケーションに対して高いバックグラウンドを要求しないことを示す。図１はまた、保護コーティング形成のための噴霧は、明らかに、「レッド」ダイの蛍光シグナルが脆化するのを妨げるように作用することを示す。これは、黄色シグナルが緑色に変化し、マイクロアレイ上でＣｙ５を標識する、レッドシグナルが完全に失われていることから、観測可能である。

保護コーティングは、上記の必要条件を満たす、どのような材料からも形成されうる。保護コーティングを形成する典型的な材料は、ポリマーおよび樹脂のいずれかまたは両方の混合物である。上記の形態では、保護コーティングはアクリルを基にした材料から形成された。具体的には、クリスタルクリアーアクリルコーティング（クリロン）である。クリロンは次の成分からなる。2-プロパノン、ジメチルベンゼン、石油留出物、メチルベンゼン、ナフタレン、1, 2, 4-トリメチルベンゼン、炭化水素噴霧剤。

上記の材料から成功裡な結果が得られたが、これらの材料は、この申請に用いられる保護コーティングを形成するための、唯一または必須の材料と考えられるべきではない。同様の物理的または化学的特性をもつ成分は、上記の材料の一部または全てを用いる場合、および異なる材料を異なる量または比率で混合した場合のいずれの場合でも、このアプリケーションの範囲内に入る。保護コーティングを形成する最低１つの成分は、気体不浸透性を持つことが望ましい。保護コーティングがラベルを保護し、ラベルが大気中に存在する気体（例えばオゾン）により侵されることを防止できるのが望ましい。

本発明の形態は保護コーティング自体、または、保護コーティングを持つ二次基質を、随伴するラベルまたはマーカーを持つ支持手段から取り除くことが可能である。このように、支持手段は、微量検定法が完了後に、再利用されうる。

（試験例２）
（保護コーティングをアッセイ基質に付加する過程）
この過程は全てのアッセイ基質で行われる。微量検定法の基質を最終調整した後、アッセイ基質は遠心分離などの、適した手法を用いて、乾燥される。アッセイ基質は光を遮断した容器内に置かれ、保護コーティング形成組成物は、次の表１の成分全てを含むように調製された。
（表１）

コーティング組成物は、コポリマーとアセトンおよびトルエンを完全に混合した後、その混合物に、残りの成分を加え、混合して調製された。アッセイ基質はダストが含まれていないかを検査された。アッセイ基質に高圧ガスを吹き付けて、存在する可能性のある塵やデブリが取り除かれた。次の数段階には、換気フードと、手袋、保護メガネが必要である。本発明の組成物５０ｍＬが、小さなガラスビーカーの中に置かれた。アッセイ基質は、本発明の組成物に約５秒から１０秒間浸された。アッセイ基質は、本発明の組成物中から取り出され、約３分から５分間放置乾燥された。アッセイ基質はスキャン可能になるまで、暗所に置かれた。指示薬は、最低３週間は安定していると、決定された。

（試験例３）
単純なマイクロアレイ試験が行われ、太陽光露出並びに周辺大気の蛍光ダイ結合性への影響が以下の如く調査された。試験例１に示すものと同様の手順で、一対のマイクロアレイが準備された。保護コーティング形成組成物は、試験例２に開示される組成と同一の組成を備える。

試験例２に説明される手順に従って、準備されたマイクロアレイのうち１つに組成物が与えられ、処理されたマイクロアレイが準備される。残りのマイクロアレイは非処理状態にある。２つのマイクロアレイは、Axon 4000Bマイクロアレイ・スキャナによって、走査される。これら走査からのデータは、保存され、その後比較される。処理されたマイクロアレイと非処理のマイクロアレイは、直射日光並びに外気に約３．５時間曝された。この露出の後、マイクロアレイはスキャナ下で走査され、露出前の走査データとの比較のためのデータが取られる。

図２は、上記露出前後の処理されたマイクロアレイ並びに非処理のマイクロアレイの像を示している。図２に示す如く、露出前において、処理されたマイクロアレイは、非処理のマイクロアレイと略同等であり、ディップから形成された保護コーティングは蛍光ダイの蛍光特性に干渉せず、またアプリケーション上への高いバックグランド・ノイズを生じさせるものでもない。図２は更に、保護コーティングを形成する保護コーティング形成組成物の適用が、明らかに蛍光性ダイの蛍光シグナルの劣化を防いでいることを示している。

上記の説明においては、単に本発明の特定の実施形態について開示し説明しているものである。上記説明並びに添付の図面、請求の範囲に基づき、請求の範囲に記載される本発明の要旨から外れることなしに様々な変更、改良を行うことが可能である。

本発明の組成物により処理された２つのマイクロアレイのうちの１つ及び第二の未処理マイクロアレイの１つの像を表わす。本発明の組成物により処理されたマイクロアレイの１つ及び第二の未処理のマイクロアレイを表わす。

Claims

（ａ）指示薬を支持する材料と、
（ｂ）検出シグナルを発生可能な指示薬と、
（ｃ）保護コーティング形成材料を主としてなる保護コーティングからなり、
前記保護コーティング形成材料は、前記指示薬によって発生される検出シグナルに対して少なくとも略透明であることを特徴とするアッセイ内での使用に好適な基質。
前記保護コーティングが、前記保護形成材料と、前記保護コーティング形成材料を前記基質へ供給可能な供給システムを備える組成物として適用され、
前記供給システムが前記保護コーティングを残して前記組成物から揮発することを特徴とする請求項１記載の基質。
前記保護コーティング形成材料がアクリル・ポリマ樹脂からなることを特徴とする請求項１記載の基質。
前記アクリル・ポリマ樹脂がメチル・アクリレートとエチル・メタアクリレートとの共重合体であることを特徴とする請求項２記載の基質。
前記保護コーティングが前記指示薬を気密にシールし、有害な非特異的シグナルを発生させないことを特徴とする請求項１記載の基質。
前記供給システムが少なくとも１つの揮発性溶剤からなることを特徴とする請求項２記載の基質。
前記少なくとも１つの揮発性溶剤が、水、アルコール、トルエン、キシレン、ヘプタン、ブタノール、ｎ−ブチルアセテート、メチル・アミル・ケトン、エチル・ベンゼン、エチレン・グリコール・ブチルエーテル、エチル−３−エトキシ・プロピオナート、イソプロピル・アルコール、エタノール、メトキシ・プロパノール、アセトン及びこれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする請求項６記載の基質。
前記少なくとも１つの揮発性溶剤が、トルエン、アセトン、エチル−３−エトキシ・プロピオナート及びこれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする請求項７記載の基質。
前記供給システムが更に、保存剤を有し、
該保存剤は保護コーティング形成材料の酸化並びに他の有害な反応を防ぎ、
前記供給システムの蒸発の間、結果として生ずる保護コーティングの透明度を向上させることを特徴とする請求項２記載の基質。
前記保存剤が芳香族ナフサであることを特徴とする請求項９記載の基質。
前記芳香族ナフサがナフタレンであることを特徴とする請求項１０記載の組成物。
前記保護コーティング材料が、前記組成物の全体体積に対して、約１％から９０％の体積量で存在することを特徴とする請求項１２記載の組成物。
前記保護コーティング形成材料が約９％の体積だけ存在することと特徴とする請求項１２記載の基質。
前記保存剤が、前記組成物の全体体積に対して、約０．１％から１０％の体積量だけ存在することを特徴とする請求項９記載の基質。
前記保存剤が、前記組成物の全体体積に対して０．５２％の体積量だけ存在することを特徴とする請求項１４記載の基質。
前記組成物が、液体及びエアロゾルからなる群から選択される形態であることを特徴とする請求項２記載の基質。
検出シグナルを発生可能な指示薬を備えるアッセイ基質の表面上の保護コーティングを形成するための組成物であって、
該組成物は、保護コーティング形成材料と、
アッセイ基質の表面をコーティングするために十分な量の前記保護コーティング形成材料を供給する供給システムからなり、
前記供給システムは前記アッセイ表面から蒸発し、保護コーティングを形成し、
該保護コーティングは少なくとも略保護コーティング形成材料からなり、
該保護コーティング形成材料は、前記指示薬によって発生される検出シグナルに対して少なくとも略透明であることを特徴とする組成物。
前記保護コーティング形成材料が、アクリル・ポリマ樹脂からなることを特徴とする請求項１８記載の組成物。
前記アクリル・ポリマ樹脂がメチル・アクリレートとエチル・メタアクリレートとの共重合体であることを特徴とする請求項１８記載の組成物。
検出シグナルを発生可能な指示薬を備えるアッセイ基質の表面上に配設される略透明な保護コーティングを形成する方法であって、
前記保護コーティングを形成するのに十分な量の請求項１７の組成物を前記アッセイ表面に供給し、周囲の大気から指示薬をシールする段階と、
前記組成物を乾燥させ、前記供給システムを除去し、略透明な保護コーティングを生じさせる段階からなることを特徴とする方法。
前記保護コーティングを磨き、前記保護コーティングの透明の質を高める段階を更に備えることを特徴とする請求項２０記載の方法。
前記供給段階が更に、前記アッセイ基質を請求項１７の組成物内に十分な時間浸し、前記組成物を前記アッセイ基質の表面に固着させる段階と、
前記組成物から前記アッセイ基質を回収する段階を更に備えることを特徴とする請求項２０記載の方法。
前記アッセイ基質が約５秒から１０秒の間浸されることを特徴とする請求項２２記載の方法。
前記供給段階が更に、十分な量の請求項１７の組成物を、ピペッティングし、前記指示薬と結合する前記アッセイ基質の表面をコーティングする段階と、
前記アッセイ基質を幅方向に十分な時間揺動させ、基質表面にわたって前記組成物を均一に分布させ、保護コーティングを形成する段階を備えることを特徴とする請求項２０記載の方法。
前記供給段階が更に、十分な量の請求項１７の組成物を噴霧し、前記指示薬と結合する前記アッセイ基質の表面をコーティングする段階と、
前記アッセイ基質を幅方向に十分な時間揺動させ、基質表面にわたって前記組成物を均一に分布させ、保護コーティングを形成する段階を備えることを特徴とする請求項２０記載の方法。
前記研磨段階が更に、
溶剤からなる研磨溶液を準備する段階と、
十分な時間、前記研磨溶液中に前記アッセイ基質を浮遊させ、保護コーティングの層部分を除去する段階と、
前記研磨溶液からアッセイ基質を回収する段階と、
前記アッセイ基質から余分な研磨溶液を振り落とす段階と、
前記アッセイ基質を乾燥させる段階と、
必要に応じて上記工程を繰り返す段階を備えることを特徴とする請求項２１記載の方法。
前記溶剤が、トルエン、アセトン及びこれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする請求項２６記載の方法。
前記溶剤が、アセトン及びトルエンが約１：２から１：３の体積比で含む混合物であることを特徴とする請求項２７記載の方法。