MX2013001948A - Anticuerpos mejorados de la clase inmonoglubina g4 (igg4). - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona un anticuerpo de la clase IgG4 que comprende por lo menos una cadena pesada la cual comprende un dominio CH1 y una región de bisagra, en donde en cada cadena pesada: a. la cisteína intercadena en la posición 127, numerada de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, en el dominio CH1 está sustituida con otro aminoácido; y b. uno o más de los aminoácidos colocados en la región de bisagra superior está sustituido con cisteína.

Description

ANTICUERPOS MEJORADOS DE LA CLASE INMUNOGLOBULINA G4 (IgG4) CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con un anticuerpo mejorado que tiene una distribución alterada de enlaces disulfuro en comparación con un anticuerpo natural y un método para producir el anticuerpo mejorado.

La industria farmacéutica que abarca proteínas recombinantes , anticuerpos monoclonales (los mAb) y medicamentos basados en ácido nucleico están creciendo con rapidez. La manipulación de anticuerpos ha resultado en el diseño y producción de fragmentos de anticuerpo o formatos alternativos. El formato molecular preferido junto con otros aspectos tales como el rendimiento de producción, la calidad de proteína y estabilidad de almacenamiento se toman en consideración cuando se selecciona como un agente terapéutico a una proteína basada en anticuerpo.

La estructura básica de todas las moléculas de inmunoglobulina (Ig) comprende dos cadenas pesadas idénticas (las HC, por sus siglas en inglés) y dos cadenas ligeras idénticas (las LC, por sus siglas en inglés) las cuales se acoplan por enlaces disulfuro. Cada LC consiste de un dominio variable (VL) y uno constante (CL) . En base en la HC, se han reconocido cinco clases de ig: igG, IgA, IgD, IgE e igM. Para IgG, las HC consisten de un dominio variable (VH) y tres Ref.: 238702 dominios constantes (CHl-3) . Los dominios CH2 y CH3 forman la parte Fe de la molécula que es responsable de estimular la función efectora y se relaciona con el fragmento Fab (VHVL y CHCL) por una región de bisagra la cual confiere flexibilidad a la molécula de IgG. Dos sitios de reconocimiento de antígeno se localizan en los extremos de los dominios VL y VH. IgG se subdivide adicionalmente en 4 isotipos diferentes: IgGl, IgG2, IgG3 e IgG .

Las funciones efectoras mediadas por Fe, es decir, citotoxicidad dependiente de anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés) o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC, por sus siglas en inglés) son dependientes de isotipo. Cada isotipo evolucionado para realizar una función, específica dentro del cuerpo. El isotipo IgGl actualmente es el utilizado más ampliamente como una sustancia terapéutica debido a su vida media extendida, activación mejorada de ADCC y activación de complemento. Otros isotipos se consideran como agentes terapéuticos dependientes del objetivo y el efecto deseado. Por ejemplo, cuando los antígenos objetivos son simplemente neutralizados y las funciones efectoras son menos importantes, se pueden utilizar isotipos alternativos tales como IgG2 e IgG4. De manera alternativa se puede considerar IgG con función Fc/efectora re-manipulada .

IgG2 también tiene una función efectora asociada mínima pero es susceptible de dimerización la cual no se ha entendido completamente. IgG4 permanece como un isotipo útil debido a su carencia relativa de inducción de función efectora. No obstante, IgG4 ha tenido ciertas dificultades prácticas inherentes, específicamente su susceptibilidad a formar semianticuerpos, su capacidad de intercambiar semimoléculas y su vida media en suero más corta.

In vitro, las moléculas IgG4 se conforman a la estructura IgG prototípica, . pero in vivo se ha observado que forman semimoléculas, cada una constituida de una cadena ligera única y una cadena pesada única generadas por formación de enlaces disulfuro dentro de la cadena pesada, dentro de la bisagra. Se ha observado que un gran porcentaje de IgG4 circulante es biespecífico, pero funcionalmente monovalente. Esto es debido a que la semimolécula puede formar IgG4 con otras semimoléculas de IgG4 (Schuurman, J., Van Ree, R. , Perdok, G.J., Van Doorn, H.R., Tan, K.Y., Aalberse, R.C., 1999. Normal human immunoglobulin G4 is biespecific: it has two different antigen-combining sites. Immunology 97, 693-698) .

La formación de semimoléculas de IgG4 se puede reducir por introducción de una mutación Ser a Pro en la posición 241 (numerado de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat) en la bisagra (Angal, S. et al., 1993. A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human (IgG4) antibody. Mol Immunol 30, 105- 108) . Además, esta mutación puntual no influye en la estructura compacta de IgG4 con lo que se permite que IgG4 retenga su capacidad reducida para activar complemento.

Después del descubrimiento de la mutación de S241P, se han investigado mutaciones adicionales a IgG4 con el fin de comprender la interacción de intercadena pesada en anticuerpos IgG4, reducir la función efectora de IgG4 e incrementar la estabilidad estructural. En Schuurman et al. (Schuurman, J et al., 2001. The inter-heavy chain disulphide bonds of IgG4 are in equilibrium with intra-chain disulphide bonds . Molecular Immunology 38, 1-8), la inestabilidad observada de enlaces disulfuro intercadena pesada de IgG4 se investigó utilizando mutantes IgG4. En el mutante MI Cys 131 (numerado de acuerdo con el sistema de numeración EU o Cys 127 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat) el cual está involucrado en el enlace disulfuro intercadena ligera pesada (CLCHi) , ha sido sustituido por serina y se ha encontrado que este mutante resulta en la formación de dlmeros de cadenas ligeras y dímeros de cadenas pesadas. En el mutante M2 cisteína 226 (226 numerado de acuerdo con el sistema de numeración EU o 239 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat) , el cual se involucra en un enlace disulfuro intercadena pesada en la bisagra, ha sido sustituido por serina y se ha encontrado que este mutante tiene un enlace intercadena pesada más estable en comparación con IgG4 y evita la formación de un enlace disulfuro intracadena pesada.

Las mutaciones de los dominios CH2 y CH3 de los anticuerpos IgG4 también se han investigado con el fin de reducir la formación de agregados de anticuerpos IgG4. El documento de E.U.A. 2008/0063635 Takahashi et al., han investigado un mutante de IgG4 en el cual la arginina en la posición 409 (409 numerada de acuerdo con el sistema de numeración EU o 440 numerado de acuerdo con el sistema de numeración Kabat) en el dominio CH3 está sustituido con lisina, treonina, metionina o leucina con el fin de inhibir la formación de agregado a un pH bajo. También se han descrito mutaciones adicionales en L235, D265, D270, K322, P329 y P331 (L235, D265, D270, K322, P329 y P331 numerado de acuerdo con el sistema de numeración EU o L248, D278, D283, K341, P348 y P350 numerado de acuerdo con el sistema de numeración Kabat) con el fin de atenuar la actividad CDC. El documento WO 2008/145142 Van de Winkel et al., describen anticuerpos lgG4 estables que tienen capacidad reducida de experimentar intercambio Fab-brazo por sustitución del residuo arginina en la posición 409, el residuo Phe en la posición 405 o Lys en la posición 370 (R409, F405 y K370 numerado de acuerdo con el sistema de numeración de EU o R440, F436 y K393 numerado de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat) incluso en ausencia de la mutación en la región de bisagra S228P (S228 numerado de acuerdo con el sistema de numeración EU o S241 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat) .

La alteración del número de residuos cisteína presentes en la región de bisagra de los anticuerpos se ha investigado previamente. En el documento de E.U.A. 5677425 Bodmer et al., describen que el número de residuos cisteína en la región de bisagra se puede incrementar con el fin de facilitar el uso de los grupos tiol cisteína para unión de moléculas efectoras o indicadoras. El documento de E.U.A. 5677425 también describe que el número de residuos cisteína en la región de bisagra se puede reducir a uno con el fin de facilitar el ensamblado de las moléculas de anticuerpo dado que únicamente será necesario formar un enlace disulfuro único el cual proporcionará un objetivo específico para unión de la región de bisagra ya sea a otra región de bisagra o a una molécula efectora o indicadora.

No obstante, aún existe la necesidad de proporcionar anticuerpos nuevos que tengan propiedades mejoradas que los vuelva incluso más adecuados para uso como una sustancia terapéutica. La presente invención proporciona anticuerpos mutantes nuevos los cuales tienen propiedades ventajosas que incluyen propiedades biofísicas mejoradas en comparación con los anticuerpos naturales. En particular, se ha encontrado sorprendentemente que la modificación de la posición del residuo cisteína en la cadena pesada de un anticuerpo IgG4 el cual forma un enlace disulfuro con una cisteína en la cadena ligera proporciona un anticuerpo IgG4 que tiene estabilidad mejorada en comparación con un anticuerpo IgG4 natural.

SUMARIO DE LA INVENCION En un aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo de la clase IgG4 que comprende por lo menos una cadena pesada que comprende un dominio CH1 y una región de bisagra, en donde, en cada cadena pesada: a. la cisteína intercadena en la posición 127, numerada de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, en el dominio CH1 está sustituida con otro aminoácido; y b. uno o más de los aminoácidos colocados en la región de bisagra superior están sustituidos con cisteína.

La cisteína en el dominio CH1 la cual forma el enlace disulfuro intercadena con una cisteína en una cadena ligera es la cisteína en la posición 127, numerada de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, se muestra en la figura Ib.

El cambio de la posición del enlace disulfuro en la región constante IgG4 resulta en que se observe una Tm superior para el dominio Fab. La temperatura a la cual 50% de la proteína se desnaturaliza se denomina la Tm. Experimentalmente, la Tm se determina como el punto de inflexión de, por ejemplo la curva de fluorescencia versus temperatura (es decir, la temperatura en donde la curva de fluorescencia versus temperatura es la más inclinada) . Por lo tanto, una Tm superior infiere una estabilidad térmica mayor. De esta manera, las moléculas de la presente descripción tienen una estabilidad térmica mayor.

Aunque no se desea unirse a teoría alguna, esto puede ser el resultado de reducción del esfuerzo o tensión interna en el enlace disulfuro por moléculas polipeptídicas que se obtienen.

Mejoras adicionales en la estabilidad térmica también se pueden obtener por la introducción de modificaciones adicionales en la región constante IgG4.

Uno o más aminoácidos colocados en la región de bisagra superior los cuales están sustituidos con cisteína se pueden seleccionar de 226, 227, 228, 229, 230, 237 y 238 numerados de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, como se muestra en la figura Ib (los aminoácidos subrayados en la región de bisagra superior) .

En una modalidad preferida uno o más aminoácidos colocados en la región de bisagra superior los cuales están sustituidos con cisteína son uno o más de los aminoácidos en posiciones que se seleccionan de 227, 228, 229 y 230 numerados de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, como se muestra en la figura Ib y en la figura 2a. En esta última distribución entonces la formación de un enlace disulfuro intercadena (cadena ligera-cadena pesada) está en una posición análoga al puente disulfuro que se encuentra en las regiones constantes de IgGl .

Los presentes inventores han establecido que la IgGl tiene mayor estabilidad térmica que las moléculas de IgG4 sin función efectora de ADCC pero con la estabilidad térmica y/u otras propiedades útiles respecto a una molécula de IgGl.

Parece que existen tres aspectos generales los cuales influyen en la estabilidad del dominio Fab en una molécula de IgG4 formada. El primero es la posición del puente disulfuro. El segundo es el ambiente próximo al puente disulfuro, es decir, la naturaleza de los residuos alrededor del enlace disulfuro y el tercero es la longitud de la región de bisagra superior.

De esta manera, la presente invención también proporciona un anticuerpo IgG4 que comprende una cadena pesada con una bisagra superior, núcleo y una bisagra inferior, y la bisagra superior y el núcleo en la cadena pesada o cada cadena pesada en el mismo es de 13 a 17, por ejemplo, tal como 15 aminoácidos de longitud.

En una modalidad el anticuerpo IgG4 tiene una bisagra superior y un núcleo de una longitud de 15 aminoácidos.

En una modalidad, la bisagra superior y el núcleo comprenden los 12 aminoácidos naturales encontrados en una bisagra IgG4 y tres aminoácidos adicionales, por ejemplo 3 residuos alanina o 3 residuos glicina o una combinación de los mismos.

En una modalidad, la bisagra tiene una de las siguientes secuencias: ESKYGPPAAACPSCP SEQ ID NO: 72 ES YGPPGGGCPSCP SEQ ID NO: 73 ESKYGPPTHTCPSCP SEQ ID NO: 74 ESKYGDKTHTCPSCP SEQ ID NO: 75 EPSKYGPPAAACPSCP SEQ ID NO: 76 EPSKYGPPGGGCPSCP SEQ ID NO: 77 EPSKYGPPTHTCPSCP SEQ ID NO: 78 EPSKYGDKTHTCPSCP SEQ ID NO: 79 ESKSYGPPAAACPSCP SEQ ID NO: 80 ESKSYGPPGGGCPSCP SEQ ID NO: 81 ESKSYGPPTHTCPSCP SEQ ID NO: 82 ESKSYGDKTHTCPSCP SEQ ID NO: 83 ESKYGPPAAACPPCP SEQ ID NO: 84 ESKYGPPGGGCPPCP SEQ ID NO: 85 ESKYGPPTHTCPPCP SEQ ID NO: 86 ESKYGDKTHTCPPCP SEQ ID NO: 87 EPSKYGPPAAACPPCP SEQ ID NO: 88 EPSKYGPPGGGCPPCP SEQ ID NO: 89 EPSKYGPPTHTCPPCP SEQ ID NO 90 EPSKYGDKTHTCPPCP SEQ ID NO 91 ESKSYGPPAAACPPCP SEQ ID NO 92 ESKSYGPPGGGCPPCP SEQ ID NO 93 ESKSYGPPTHTCPPCP SEQ IP NO 94 ESKSYGDKTHTCPPCP SEQ ID NO: 95 En una modalidad, la bisagra superior del núcleo en la molécula de IgG4 de la descripción consiste de una bisagra IgGl natural, es decir, EPKSCDKTHTCPPC SEQ ID NO: 96 o un derivado de la misma tal como: EPKSCDKAAACPPCP SEQ ID NO: 97 EPKSCDKGGGCPPCP SEQ ID NO: 98 EPKSCDKTHTSPPCP SEQ ID NO: 99 EPKSCDKTHTCPPSP SEQ ID NO: 100 EPKSCDKTHTSPPSP SEQ ID NO: 101 EPKSCDKAAASPPCP SEQ ID NO: 102 EPKSCDKAAACPPSP SEQ ID NO: 103 EPKSCDKAAASPPSP SEQ ID NO: 104 EP SCDKGGGSPPCP SEQ ID NO: 105 EPKSCDKGGGCPPSP SEQ ID NO: 106 EPKSCDKGGGSPPSP SEQ ID NO: 107 En un aspecto adicional la invención proporciona un anticuerpo de la clase IgG4 que comprende por lo menos una cadena pesada la cual comprende un dominio CH1 y una región de bisagra, en donde en cada cadena pesada: la cisteína intercadena en la posición 127, numerada de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, en el dominio CH1 está sustituida con otro aminoácido; y la bisagra en la cadena pesada o cada cadena pesada en la misma tiene una longitud de 15 aminoácidos.

Las bisagras adecuadas se describen en lo anterior.

En un aspecto adicional, la presente invención también proporciona un anticuerpo de la clase IgG4 que comprende por lo menos una cadena pesada la cual comprende un dominio CH1 y una región de bisagra, en donde, en cada cadena pesada: a. la cisteína en la posición 127, numerada de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, está sustituida con otro aminoácido; y b. la cisteína en la posición 239 de la cisteína en la posición 242, numerada de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, está sustituida con otro aminoácido.

En una modalidad de acuerdo con este último aspecto de la invención, la molécula de IgG4 también contiene 22 aminoácidos en la bisagra, por ejemplo como se describe en lo anterior.

Los anticuerpos proporcionados por la presente invención muestran propiedades ventajosas en comparación con un anticuerpo IgG4 natural. Se ha encontrado sorprendentemente que los anticuerpos de la presente invención muestran termoestabilidad mejorada en particular del dominio Fab en comparación con un anticuerpo IgG4 natural .

En un aspecto adicional, la presente invención también proporciona un anticuerpo de la clase IgG3 que comprende por lo menos una cadena pesada la cual comprende un dominio CH1 y una región de bisagra, en donde, en cada cadena pesada : a. la cisterna en el dominio CH1 el cual forma un enlace disulfuro intercadena con una cisteína en una cadena ligera está sustituida con otro aminoácido; y b. uno o más de los aminoácidos colocados en la región de bisagra superior están sustituidos con cisteína.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo de la clase IgM que comprende por lo menos una cadena pesada la cual comprende un dominio CHI y un dominio CH2 , en donde , en la cadena pesada : a. la cisteína en el dominio CH1 el cual forma un enlace disulfuro intercadena con una cisteína y una cadena ligera está sustituida con otro aminoácido; y b. uno o más de los aminoácidos colocados en el dominio CH1 o el dominio CH2 está sustituido con cisteína.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo de la clase IgD que comprende por lo menos una cadena pesada la cual comprende un dominio CH1 y una región de bisagra, en donde, en cada cadena pesada: a. la cisteína en el dominio CH1 el cual forma el enlace disulfuro intercadena con una cisteína en una cadena ligera está sustituida con otro aminoácido; y b. uno o más de los aminoácidos colocados en la región de bisagra está sustituido con cisteína.

La presente invención también proporciona un vector de expresión que comprende una secuencia la cual codifica para los anticuerpos de la presente invención y una célula hospedadora que comprende el vector de expresión.

La presente invención también proporciona un anticuerpo como se define en lo anterior para uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno. Se proporciona adicionalmente un método para el tratamiento de una enfermedad o trastorno que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo como se define en lo anterior.

En una modalidad el anticuerpo es para uso en el tratamiento de una enfermedad diferente de cáncer.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La figura la muestra las secuencias CH1 y de bisagra humanas de IgGl natural e IgG4 natural, en donde los residuos de bisagra están subrayados y la secuencia constante de la cadena ligera kappa.

La figura 1 b muestra: la secuencia constante de cadena ligera kappa humana que indica la cisteína (subrayada) que forma el enlace disulfuro CL-CH1 intercadena; la IgG humana 1, 2, 3 y 4 de los residuos CH1 N-terminales de cadena pesada y las secuencias de región de bisagra en donde la posición de cisteína (en la bisagra superior para IgGl y en la parte N-terminal CH1 para IgG2, 3 y 4) está indicada (subrayada) , la cual forma el enlace disulfuro CL-CH1 intercadena; los residuos CH1 en la parte N terminal de la cadena pesada de IgD humana y parte de las secuencias de la región de bisagra en donde la posición de cisteína en la secuencia CH1 N-terminal está indicada (subrayada) la cual forma el enlace disulfuro CL-CH1 intercadena; los residuos CH1 de la parte C-terminal, CH1 de la parte N-terminal de la cadena pesada IgM humana y los residuos CH2 de la parte N-terminal en donde la posición de cisteína en la parte N terminal de CH1 está indicada (subrayada) la cual forma el enlace disulfuro CL-CH1 intercadena; y los residuos en la bisagra superior de IgG3 e IgG4, la bisagra de IgD y la parte C-terminal de CH1 y la de CH2 de IgM son los residuos subrayados que indican posiciones en donde uno o más residuos pueden estar sustituidos con cisteína en los anticuerpos de la presente invención.

La figura 2a muestra el residup cisteína CH1 (C127) el cual forma el puente disulfuro intercadena con . una cisteína en la cadena ligera y los residuos de bisagra superior y de núcleo IgGl natural, IgG4 natural y las posiciones en donde las mutaciones han sido introducidas en los anticuerpos IgG4 de la presente invención.

La figura 2b muestra el residuo cisteína CH1 (C127) el cual forma el enlace disulfuro intercadena con una cisteína en la cadena ligera y los residuos de bisagra de IgG3 naturales en las posiciones en donde uno o más residuos están sustituidos con cisteína en los anticuerpos IgG3 de la presente invención.

La figura 2c muestra el residuo cisteína CH1 (C127) el cual muestra el enlace disulfuro intercadenas con una cisteína en la cadena ligera y que se selecciona de los residuos CH1 y CH2 de IgM tipo silvestre y las posiciones en donde uno o más de los residuos están sustituidos con cisteína en los anticuerpos IgM de la presente invención.

La figura 2d muestra el residuo cisteína CH1 (C128) el cual forma el enlace disulfuro intercadena con una cisteína en la cadena ligera y los residuos de bisagra de IgD naturales y las posiciones en donde uno o. más residuos son sustituidos con cisteína en los anticuerpos IgD de la presente invención.

La figura 3a muestra las mutaciones introducidas en los anticuerpos IgG4 de acuerdo con la presente invención.

La figura 3b muestra las posiciones de los residuos en la cadena pesada mutada de los anticuerpos IgG4 que se muestran en la figura 3a y el enlace disulfuro predicho que se puede formar con una cisteína en ya sea la cadena ligera (LC) o con otra cadena pesada (HC) mutada. En donde la cisteína puede encontrarse con una cisteína en el LC o HC, la cadena subrayada es la distribución de enlace disulfuro predominante predicha .

La figura 4a muestra las mutaciones introducidas en los anticuerpos IgG4 de acuerdo con la presente invención.

La figura 4b muestra las posiciones de los residuos cisteína en los anticuerpos IgG4 que se muestran en la figura 4a y el enlace disulfuro predicho que se puede formar con una cisteína en ya sea la cadena ligera (LC) o la cadena pesada (HC) . En donde la cisteína se puede unir con una cisteína en la LC o HC, la cadena subrayada es la distribución de enlace disulfuro predominante predicha.

La figura 5 muestra las secuencias de CH1 y la región de bisagra de los anticuerpos IgG4 de acuerdo con la presente invención.

La figura 6 muestra las secuencias de la CH1, la región de bisagra, CH2 y CH3 de los anticuerpos IgG4 de acuerdo con la presente invención.

La figura 7 muestra el análisis Western Blot de anticuerpos de acuerdo con la presente invención con el gel superior que muestra los resultados utilizando un anticuerpo anti-Fc humano y el gel inferior muestra los resultados de utilizar un anticuerpo anti-Kappa.

La figura 8 muestra el análisis Western Blot de anticuerpos de acuerdo con la presente invención en donde el gel superior muestra los resultados de utilizar un anticuerpo anti-Fc humano y el gel inferior muestra los resultados de utilizar un anticuerpo anti-Kappa humana.

La figura 9 muestra el análisis Western Blot de anticuerpos de acuerdo con la presente invención en donde el gel superior muestra los resultados de utilizar un anticuerpo anti-Fc humano y el gel inferior muestra los resultados de utilizar un anticuerpo anti-Kappa humana.

La figura 10 muestra el análisis Western Blot de un anticuerpo de acuerdo con la presente invención en donde el gel superior muestra los resultados de utilizar un anticuerpo anti-Fc humano y el gel inferior muestra los resultados de utilizar un anticuerpo anti-Kappa humana.

La figura 11 muestra los resultados de un análisis Thermofluor de anticuerpos de la presente invención el cual muestra las termoestabilidades de los dominios Fab y CH2.

La figura 12 muestra los resultados de un análisis Thermofluor de anticuerpos de la presente invención el cual muestra las termoestabilidades de los dominios Fab y CH2.

La figura 13 muestra los resultados de un análisis Thermofluor de anticuerpos de la presente invención el cual muestra las termoestabilidades de los dominios Fab y CH2.

La figura 14 muestra los resultados de un análisis Thermofluor de anticuerpos de la presente invención el cual muestra las termoestabilidades de los dominios Fab y CH2.

La figura 15 muestra la clasificación de las termoestabilidades de los anticuerpos seleccionados de la presente invención.

La figura 16 muestra los resultados de un análisis de afinidad para anticuerpos seleccionados de la presente invención y anticuerpos control.

La figura 17 muestra los resultados de un análisis CLAR de anticuerpos seleccionados de la presente invención.

La figura 18 muestra un análisis Western Blot de anticuerpos de acuerdo con la presente invención con enlazantes diferentes.

La figura 19 muestra un análisis Western Blot de anticuerpos de acuerdo con la presente invención con enlazantes diferentes.

La figura 20 a la figura 24 muestran un análisis Western Blot de anticuerpos de acuerdo con la presente invención con diversas mutaciones .

La figura 25 y la figura 26 muestran la función efectora ADCC de los diversos anticuerpos, que incluyen ciertos anticuerpos de acuerdo con la invención.

La figura 27 muestra la expresión de diversos anticuerpos de acuerdo con la invención.

La figura 28 muestra la transferencia Western de diversas mutaciones del anticuerpo herceptina.

La figura 29 muestra la transferencia Western de diversas mutaciones del anticuerpo Tysabri.

La figura 30 muestra una transferencia Western de diversas mutaciones del anticuerpo Actemra.

La figura 31 a la figura 34 muestra los resultados de un análisis Thermofluor de diversos anticuerpos de acuerdo con la invención.

BREVE DESCRIPCION DEL LISTADO DE SECUENCIAS La SEQ ID NO: 1 muestra la secuencia de CHl y la región de bisagra de un anticuerpo IgGl natural .

La SEQ ID NO: 2 muestra la secuencia de CHl y la región de bisagra de un anticuerpo lgG4 natural.

La SEQ ID NO: 3 muestra una parte de la región constante de la cadena ligera kappa natural humana.

La SEQ ID NO: 4 muestra una parte de la secuencia N- terminal del dominio CHl de un anticuerpo IgGl humano.

La SEQ ID NO: 5 muestra la región de bisagra de un anticuerpo IgGl humano.

La SEQ ID NO: 6 muestra una parte de la secuencia N- terminal del dominio CHl de un anticuerpo IgG2 humano.

La SEQ ID NO: 7 muestra la región de bisagra de un anticuerpo IgG2 humano.

La SEQ ID NO: 8 muestra una parte de la secuencia N-terminal del dominio CHl de un anticuerpo IgG3 humano.

La SEQ ID NO: 9 muestra la región de bisagra de un anticuerpo IgG3 humano.

La SEQ ID NO: 10 muestra una parte de la secuencia N-terminal del dominio CHl de un anticuerpo IgG4 humano.

La SEQ ID NO: 11 muestra la región de bisagra del anticuerpo IgG4 humano.

Las SEC ID NOS: 12 a 37 muestran las secuencias del dominio CHl y región de bisagra de los anticuerpos 6, 7, 8, 15, 16, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 44, 45, 46, 47, 2, 3, 48, 28P y 44P, respectivamente.

Las SEC ID NOS: 38 a 63 muestran las secuencias del dominio CHl, región de bisagra, el dominio CH2 y el dominio CH3 de los anticuerpos 6, 7, 8, 15, 16, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 44, 45, 46, 47, 2, 3, 48, 28P y 44P, respectivamente.

La SEQ ID NO: 64 muestra la secuencia de dominio CH2 y CH3 de IgG4 natural.

La SEQ ID NO: 65 muestra las secuencias de dominio CH2 de IgG4 natural y el dominio CH3 de IgGl natural.

La SEQ ID NO: 66 muestra una secuencia de región constante de una cadena ligera kappa natural humana.

La SEQ ID NO: 67 muestra una parte de la secuencia N-terminal del dominio CHl de un anticuerpo IgGD humano.

La SEQ ID NO: 68 muestra una parte de la región de bisagra de un anticuerpo IgGD humano.

La SEQ ID NO: 69 muestra una parte de la secuencia N-terminal del dominio CHl de un anticuerpo IgGM humano.

La SEQ ID NO: 70 muestra una parte de la secuencia C-terminal del dominio CHl de un anticuerpo IgGM humano.

La SEQ ID NO: 71 muestra una parte del dominio CH2 de un anticuerpo IgGM humano.

Las SEC ID NOS : 72 a 295 muestran diversas regiones de bisagra.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención se describirá ahora con mayor detalle.

Los términos "proteína" y "polipéptido" se utilizan de manera intercambiable en la presente, a menos que el contexto lo indique en otro sentido. Se entiende que "péptido" se refiere a 10 o menos aminoácidos.

Los términos "polinucleótidos " incluyen un gen, ADN, ADNc, ARN, ARNm, etc., a menos que el contexto lo indique en otro sentido.

Como se utiliza en la presente, el término "que comprende" en el contexto de la presente especificación se debe interpretar que indica "que incluye".

El término "natural" en el contexto de la presente invención significa un anticuerpo como se encuentra en la naturaleza o como se puede aislar del ambiente, el cual no comprende ninguna mutación genética manipulada.

La designación para un mutante de sustitución en la presente consiste de una letra seguido por un número seguido por una letra. La primera letra designa el aminoácido en la proteína natural. El número se refiere a la posición de aminoácido en donde se realiza la sustitución de aminoácido y la segunda letra designa el aminoácido que se utiliza para sustituir al aminoácido natural.

Los residuos en los dominios variable y constante de anticuerpo se numeran convencionalmente de acuerdo con un sistema diseñado por Kabat et al. Este sistema se establece en Kabat et al., 1987 en Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH USA (a continuación "Kabat et al. (supra)").

Las designaciones de residuos de Kabat no siempre corresponden directamente a la numeración lineal de los residuos aminoácidos. La secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales que en la numeración de Kabat estricta que corresponde a un acortamiento de, o inserción en un componente estructural, ya sea de una región de infraestructura o determinadora de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) de la estructura de dominio variable básica. La numeración de residuos Kabat correcta se puede determinar para un anticuerpo dado por alineación de los residuos de homología en la secuencia del anticuerpo con una secuencia "estándar" numerada según Kabat.

De manera alternativa, la numeración de los residuos aminoácidos se puede realizar por el sistema de numeración EU-index o EU (también descrito en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, Public Health Service, National Institutes of Heath, Bethesda, MD. (1991) ) .

Un sistema de numeración adicional de los residuos aminoácidos en anticuerpos es el sistema de numeración IMGT (Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol . , 29, 185-203 (2005) ) .

El sistema de numeración de Kabat se utiliza en la presente especificación excepto que se indica en otro sentido en donde se utiliza el sistema de numeración EU o el sistema de numeración IMGT.

Entre los cuatro isotipos de IgG , las distribuciones de enlace disulfuro intracadena en la cadena pesada y la cadena ligera son similares mientras que las distribuciones de unión disulfuro intercadena son únicos para cada isotipo [Revisado por (Wypych, J. , Li, M., Guo, A., Zhang, Z., Martínez, T., Alien, M.J., Fodor, S., Kelner, D.N., Flynn, G.C., Liu, Y.D. , Bondarenko, P.V., Ricci, M.S., Dillon, T.M., Balland, A. , 2008. Human IgG2 antibodies display disulphide-mediated structural isoforms. J Biol Chem. 283, 16194-16205) ] .

Como se muestra en la figura Ib, las secuencias de región de bisagra de los cuatro isotipos IgG4 difieren. La región de bisagra completa o genética típicamente consiste de los residuos 226 a 251 (numerados en base en el sistema de numeración de Kabat) . La figura Ib muestra las secciones superior, de núcleo e inferior de las regiones de bisagra de los cuatro isotipos IgG4. Para el isotipo IgGl, la región de bisagra superior son los residuos 226 a 238, la región de bisagra de núcleo son los residuos 239 ó 243 y la región de bisagra inferior son los residuos 244 a 251. Para el isotipo IgG4, la región de bisagra superior son los residuos 226 a 238, la región de bisagra de núcleo son los residuos 239 a 243 y la región de bisagra inferior son los residuos 244 a 251.

De esta manera, la bisagra comprende la bisagra superior, el núcleo y la bisagra inferior en una IgGl tiene una longitud de 23 aminoácidos, como se muestra en la figura la. La bisagra superior tiene 10 aminoácidos. El núcleo tiene 5 aminoácidos y la bisagra inferior tiene 8, véase, por ejemplo, la figura Ib.

La bisagra que comprende la bisagra superior, el núcleo y la bisagra inferior en una IgG4 tiene una longitud de 20 aminoácidos, como se muestra en la figura la. La bisagra superior tiene 7 aminoácidos. El núcleo tiene 5 aminoácidos y la bisagra inferior tiene 8, véase, por ejemplo, la figura Ib.

Los nuevos anticuerpos IgG4 mutantes de acuerdo con la presente invención se han desarrollado al modificar las distribuciones de enlace disulfuro intercadena dentro de IgG4 , específicamente la distribución de enlace disulfuro intercadena CL-CH1 entre la cadena ligera (LC) y la cadena pesada (HC) ha sido modificada.

La figura Ib muestra secciones de las secuencias de cadena pesada y ligera de IgG humana para los isotipos de IgGl-4 indicando las posiciones cisteína (subrayadas) que forman los enlaces disulfuro intercadena CL-CH1. El enlace disulfuro inter CL-CH1 de IgGl se forma entre LC C214 (sistema de numeración de Kabat) y C233 (sistema de numeración de Kabat) de HC justo antes de la región de bisagra. En contraste, el enlace disulfuro CH1-CL para IgG2 , 3 y 4 se forma entre LC C214 y C127 N-terminal respecto al enlace disulfuro intracadena de la HC. Las secuencias LC y HC que rodean a los residuos cisteína involucrados en la formación del enlace disulfuro CL-CH1. se muestran y se alinean en la figura ib.

La presente invención se ha investigado como el enlace disulfuro CLCH1 afecta las propiedades de un anticuerpo IgG4 que incluyen la termoestabilidad, estabilidad estructural, heterogeneidad de la isoforma disulfuro y afinidad del anticuerpo.

Los mutantes de IgG4 se generan por sustitución del residuo cisteína en CH1 en la posición 127 con otro aminoácido así como la sustitución de uno o más de los aminoácidos en la región de bisagra superior, preferiblemente los aminoácidos en posiciones que se seleccionan de 227, 228, 229 y 230, numerados de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de IgG , con cisteína. Las posiciones 227, 228, 229 o 230 están en o cerca de la posición estructural equivalente en la que se sitúa la cisteína 233 de IgGl .

Cada cadena pesada puede comprender mutaciones adicionales que incluyen la sustitución de uno o ambos residuos cisteína 239 y 242 en la región de bisagra IgG4 con otro aminoácido. Una mutación para alargar la región de bisagra superior IgG4 por tres aminoácidos entre las posiciones 238 y 239 que son de la misma longitud que la bisagra IgGl también se incluye en algunos anticuerpos. La mutación S241P también se introduce en algunos anticuerpos .

Se ha encontrado que los anticuerpos IgG4 mutantes de acuerdo con la presente invención muestran propiedades ventajosas.

En una modalidad, los anticuerpos IgG4 mutantes de acuerdo con la presente invención muestran termoestabilidad aumentada en comparación con el anticuerpo IgG4 natural. Se ha encontrado sorprendentemente que los anticuerpos IgG4 mutantes los cuales han sido mutados para sustituir la cisteína en la posición 127 en el dominio CH1 con otro aminoácido y en el cual la cisteína ha sido introducida en la región de bisagra de cadena pesada entre las posiciones 227 a 230 muestra termoestabilidad mejorada en comparación con el anticuerpo IgG4 natural . La mutación para remover la cisteína en la posición 127 altera la posición en la cual se forma el enlace disulfuro intercadena entre la cadena pesada y la cadena ligera (CL-CHi) y obliga a que la cadena ligera forme un enlace disulfuro vía una cisteína la cual se introduce entre las posiciones 227 y 230 en la región de bisagra de la cadena pesada. Por lo tanto, en una modalidad, el anticuerpo IgG4 se proporciona en el cual la cisteína 127 está sustituida por otro aminoácido y la cisteína de la cadena ligera está unida vía un enlace disulfuro a una cisteína manipulada en la posición 227, 228, 229 o 230.

Una mejora adicional a la termoestabilidad también se ha encontrado sorprendentemente al agregar tres aminoácidos a la región de bisagra IgG4 con el fin de alargar la región de bisagra lgG .

También se ha encontrado sorprendentemente que los anticuerpos IgG4 mutantes los cuales han sido mutados para sustituir la cisteína en la posición 127 en el dominio CH1 con otro aminoácido y sustituir la cisteína en la posición 239 o en la posición 242 en la región de bisagra de cadena pesada con otro aminoácido muestran termoestabilidad mejorada en comparación con un anticuerpo IgG4 natural.

En una modalidad los anticuerpos de la presente invención muestran formación reducida de lo que se denominan semi-moléculas . Los anticuerpos de la presente invención los cuales comprenden una mutación en C239 pero que no presentan una mutación en C242 generalmente muestran formación reducida de semi-molécula . Sin desear unirse a teoría alguna, se considera que esto se debe a la remoción de la cisteína en la posición 239 que reduce la formación de enlace disulfuro intracadena en la cadena pesada y por lo tanto reduce el número de semi-moléculas en comparación con anticuerpos los cuales no presentan una mutación en C230 o C242. Los anticuerpos los cuales presentan una mutación en C242 pero no presentan una mutación en C239 parecen formar más semi-moléculas en comparación con anticuerpos los cuales presentan una mutación en C239 pero que no presentan una mutación en C242. Sin desear unirse a teoría alguna, se considera que la cisteína en la posición 239 es más reactiva en comparación con la cisteína en la posición 242 y es capaz de formar un enlace disulfuro con ya sea una cisteína de bisagra de cadena pesada o la cisteína de cadena ligera.

Los anticuerpos los cuales presentan una mutación tanto en C239 como en C242 forman una proporción alta de semi -moléculas debido a que no hay formación de enlace disulfuro intercadena entre las dos cadenas pesadas. No obstante, los anticuerpos que comprenden mutaciones en ambos, C239 y C242, aún son capaces de formar las moléculas de anticuerpo completas debido a la unión de las cadenas pesadas vía enlaces no covalentes.

La formación de semi-molécula reducida también se observa en anticuerpos que presentan la mutación S241P.

En una modalidad, la región de bisagra superior y de núcleo se selecciona de una de las siguientes secuencias: ESKYGPPCPSCP SEQ ID NO: 108 ESKYGDKCPSCP SEQ ID NO: 109 EPSKYGPPCPSCP SEQ ID NO: 110 EPSKYGDKCPSCP SEQ ID NO: 111 ESKSYGPPCPSCP SEQ ID NO: 112 ESKSYGDKCPSCP SEQ ID NO: 113 ESKYGPPAACPSCP SEQ ID NO: 114 ESKYGPPGGCPSCP SEQ ID NO: 115 ESKYGPPHTCPSCP SEQ ID NO: 116 ESKYGDKHTCPSCP SEQ ID NO: 117 EPSKYGPPAACPSCP SEQ ID NO: 118 EPSKYGPPGGCPSCP SEQ ID NO: 119 EPSKYGPPHTCPSCP SEQ ID NO: 120 EPSKYGDKHTCPSCP SEQ ID NO: 121 ESKSYGPPAACPSCP SEQ ID NO: 122 ESKSYGPPGGCPSCP SEQ ID NO: 123 ESKSYGPPHTCPSCP SEQ ID NO: 124 ES SYGD HTCPSCP SEQ ID NO: 125 ESKYGPPACPSCP SEQ ID NO: 126 ESKYGPPGCPSCP SEQ ID NO: 127 ESKYGPPTTCPSCP SEQ ID NO: 128 ESKYGDKTTCPSCP SEQ ID NO: 129 EPSKYGPPACPSCP SEQ ID NO: 130 EPSKYGPPGCPSCP SEQ ID NO: 131 EPSKYGPPTTCPSCP SEQ ID NO: 132 EPSKYGDKTTCPSCP SEQ ID NO: 133 ESKSYGPPACPSCP. SEQ ID NO: 134 ESKSYGPPGCPSGP SEQ ID NO: 135 ESKSYGPPTTCPSCP SEQ ID NO: 136 ESKSYGDKTTCPSCP SEQ ID NO: 137 ESKYGPPTHCPSCP SEQ ID NO: 138 ESKYGDKTHCPSCP SEQ ID NO: 139 EPSKYGPPTHCPSCP SEQ ID NO: 140 EPSKYGDKTHCPSCP SEQ ID NO: 141 ESKSYGPPTHCPSCP SEQ ID NO: 142 ESKSYGDKTHCPSCP SEQ ID NO: 143 ESKYGPPHTCPSCP SEQ ID NO: 144 ESKYGDKHTCPSCP SEQ ID NO : 145 EPSKYGPPHTCPSCP SEQ ID NO: 146 EPSKYGDKHTCPSCP SEQ ID NO: 147 ESKSYGPPHTCPSCP SEQ ID NO: 148 ESKSYGDKHTCPSCP SEQ ID NO: 149 ESKYGPPTCPSCP SEQ ID NO: 150 ESKYGDKTCPSCP SEQ ID NO: 151 EPSKYGPPTCPSCP SEQ ID NO: 152 EPSKYGDKTCPSCP SEQ ID NO: 153 ESKSYGPPTCPSCP SEQ ID NO: 154 ESKSYGDKTCPSCP SEQ ID NO: 155 ESKYGPPHCPSCP SEQ ID NO: 156 ESKYGDKHCPSCP SEQ ID NO: 157 EPSKYGPPHCPSCP SEQ ID NO: 158 EPSKYGDKHCPSCP SEQ ID NO: 159 ESKSYGPPHCPSCP SEQ ID NO : 160 ESKSYGDKHCPSCP SEQ ID NO: 161 EPKSCDKAACPPCP SEQ ID NO: 162 EPKSCDKGGCPPCP SEQ ID NO: 163 EPKSCDKHTSPPCP SEQ ID NO: 164 EPKSCDKHTCPPSP SEQ ID NO: 165 EPKSCDKHYSPPSP SEQ ID NO: 166 EPKSCDKAASPPCP SEQ ID NO: 167 EPKSCDKAACPPSP SEQ ID NO: 168 EPKSCDKAASPPSP SEQ ID NO: 169 EPKSCDKGGSPPCP SEQ ID NO: 170 EPKSCDKGGCPPSP SEQ ID NO: 171 EPKSCDKGGSPPSP SEQ ID NO: 172 EPKSCDKACPPCP SEQ ID NO: 173 EPKSCDKGCPPCP SEQ ID NO: 174 EPKSCDKTSPPCP SEQ ID NO: 175 EPKSCDKTCPPSP SEQ ID NO: 176 EPKSCDKTSPPSP SEQ ID NO: 177 EPKSCDKASPPCP SEQ ID NO: 178 EPKSCDKACPPSP SEQ ID NO: 179 EPKSCDKASPPSP SEQ ID NO: 180 EPKSCDKGSPPCP SEQ ID NO: 181 EPKSCDKGCPPSP SEQ ID NO: 182 EPKSCDKGSPPSP SEQ ID NO: 183 EPKSCDKCPPCP SEQ ID NO: 184 EPKSCDKCPPCP SEQ ID NO: 185 EPKSCDKSPPCP SEQ ID NO: 186 EPKSCDKCPPSP SEQ ID NO: 187 EPKSCDKSPPSP SEQ ID NO : 188 EPKSCDKSPPCP SEQ ID NO : 189 EPKSCDKCPPSP SEQ ID NO: 190 EPKSCDKSPPSP SEQ ID NO: 191 EPKSCDKSPPCP SEQ ID NO: 192 EPKSCDKCPPSP SEQ ID NO: 193 EPKSCDKSPPSP SEQ ID NO: 194 EPKSCDKTTSPPCP SEQ ID NO: 195 EPKSCDKTTCPPSP SEQ ID NO: 196 EPKSCDKTTSPPSP SEQ ID NO: 197 EPKSCDKTHSPPCP SEQ ID NO: 198 EPKSCDKTHCPPSP SEQ ID NO: 199 EPKSCDKTHSPPSP SEQ ID NO: 200 ESKYGPPCPPCP SEQ ID NO: 201 SKYGPPCPPCP SEQ ID NO: 202 ESKYGPPCPPCP SEQ ID NO: 203 ESKYGDKCPPCP SEQ ID NO: 204 EPSKYGPPCPPCP SEQ ID NO: 205 EPSKYGPPCPPCP SEQ ID NO: 206 EPSKYGPPCPPCP SEQ ID NO: 207 EPSKYGDKCPPCP SEQ ID NO: 208 ESKSYGPPCPPCP SEQ ID NO: 209 ESKSYGPPCPPCP SEQ ID NO: 210 ESKSYGPPCPPCP SEQ ID NO: 211 ESKSYGDKCPPCP SEQ ID NO: 212 ESKYGPPAACPPCP SEQ ID NO: 213 ESKYGPPGGCPPCP SEQ ID NO: 214 ESKYGPPHTCPPCP SEQ ID NO: 215 ESKYGDKHTCPPCP SEQ ID NO: 216 EPSKYGPPAACPPCP SEQ ID NO: 217 EPSKYGPPGGCPPCP SEQ ID NO: 218 EPSKYGPPHTCPPCP SEQ ID NO: 219 EPSKYGDKHTCPPCP SEQ ID NO: 220 ESKSYGPPAACPPCP SEQ ID NO: 221 ESKSYGPPGGCPPCP SEQ ID NO: 222 ESKSYGPPHTCPPCP SEQ ID NO: 223 ESKSYGDKHTCPPCP SEQ ID NO: 224 ESKYGPPACPPCP SEQ ID NO: 225 ESKYGPPGCPPCP SEQ ID NO: 226 ESKYGPPTTCPPCP SEQ ID NO : 227 ESKYGDKTTCPPCP SEQ ID NO : 228 EPSKYGPPACPPCP SEQ ID NO : 229 EPSKYGPPGCPPCP SEQ ID NO: 230 EPSKYGPPTTCPPCP SEQ ID NO: 231 EPSKYGDKFTCPPCP SEQ ID NO: 232 ESKSYGPPACPPCP SEQ ID NO : 233 ESKSYGPPGCPPCP SEQ ID NO: 234 ESKSYGPPTTCPPCP SEQ ID NO: 235 ESKSYGDKTTCPPCP SEQ ID NO: 236 ESKYGPPTHCPPCP SEQ ID NO: 237 ESKYGDKTHCPPCP SEQ ID NO: 238 EPSKYGPPTHCPPCP SEQ ID NO: 239 EPSKYGDKTHCPPCP SEQ ID NO: 240 ESKSYGPPTHCPPCP SEQ ID NO: 241 ESKSYGDKTHCPPCP SEQ ID NO: 242 ESKYGPPHTCPPCP SEQ ID NO: 243 ESKYGDKHTCPPCP SEQ ID NO: 244 EPSKYGPPHTCPPCP SEQ ID NO: 245 EPSKYGDKHTCPPCP SEQ ID NO: 246 ESKSYGPPHTCPPCP SEQ ID NO: 247 ESKSYGD HTCPPCP SEQ ID NO: 248 ESKYGPPTCPPCP SEQ ID NO: 249 ESKYGDKTCPPCP SEQ ID NO: 250 EPSKYGPPTCPPCP SEQ ID NO: 251 EPSKYGDKTCPPCP SEQ ID NO: 252 ESKSYGPPTCPPCP SEQ ID NO: 253 ESKSYGDKTCPPCP SEQ ID NO: 254 ESKYGPPHCPPCP SEQ ID NO: 255 ESKYGDKHCPPCP SEQ ID NO: 256 EPSKYGPPHCPPCP SEQ ID NO: 257 EPSKYGDKHCPPCP SEQ ID NO: 258 ESKSYGPPHCPPCP SEQ ID NO: 259 ESKSYGDKHCPPCP SEQ ID NO: 260 EPKSCDKTHTCPPCP SEQ ID NO: 261 EPKSCDKTHTCPSCP SEQ ID NO: 262 ESKYCPPACPSCP SEQ ID NO: 263 ESKYCPPAACPSCP SEQ ID NO: 264 ESKYCPPAAACPSCP SEQ ID NO: 265 ESKYCPPAAASPSCP SEQ ID NO: 266 ESKYCPPAAACPSSP SEQ ID NO: 267 ESKCGPPAAAACPSCP SEQ ID NO: 268 ESKYCPPAAAACPSCP SEQ ID NO: 269 ESKYCPPAAAAACPSCP SEQ ID NO: 270 ESKYCPPGGGCPSCP SEQ ID NO: 271 ESKYCPPSSSCPSCP SEQ ID NO: 272 ESKYCPPTCPSCP SEQ ID NO: 273 ESKYCPPTHCPSCP SEQ ID NO: 274 ESKYCPPTHTCPSCP SEQ ID NO: 275 ESKYCPKTHTCPSCP SEQ ID NO: 276 ESKYCDKTHTCPSCP SEQ ID NO: 277 ESKYCDKTHCPSCP SEQ ID NO: 278 ESKYCDKTCPSCP SEQ ID NO : 279 ESKYCDKAAACPSCP SEQ ID NO: 280 ESKYCDKCPSCP SEQ ID NO: 281 ESKSCDKTHTCPSCP SEQ ID NO: 282 EPKYCDKTHTCPSCP SEQ ID NO: 283 EPKSCPPCPSCP SEQ ID NO 284 ESKSCPPCPSCP SEQ ID NO 285 EPKYCPPCPSCP SEQ ID NO 286 ECKYGPPCPSCP SEQ ID NO 287 ECKYGPPSPSCP SEQ ID NO 288 ECKYGPPCPSSP SEQ ID NO 289 ESCYGPPCPSCP SEQ ID NO 290 ESCYGPPSPSCP SEQ ID NO 291 ESCYGPPCPSSP SEQ ID NO 292 ESKCGPPCPSCP SEQ ID NO 293 ESKCGPPSPSCP SEQ ID NO 294 ESKCGPPCPSSP SEQ ID NO: 295 Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención también muestran afinidad comparable hacia el antígeno objetivo en comparación con el anticuerpo IgG4 natural .

Las mutaciones a los anticuerpos de la presente invención ahora se describirán con detalle adicional. Los métodos para sustituir aminoácidos son bien conocidos en el ámbito de biología molecular. Estos métodos incluyen, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio utilizando métodos tales como PCR para suprimir y/o sustituir aminoácidos o el diseño de secuencias sintéticas de novo.

La figura 2a muestra los residuos de bisagra de IgGl natural, IgG4 natural y las posiciones en donde se han introducido mutaciones en los anticuerpos de la presente invención. La numeración se basa en el sistema de numeración de Kabat .

Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención comprenden una mutación en la posición 127 (C127) en donde el residuo cisteína es sustituido por otro aminoácido, preferiblemente un aminoácido que no contiene un grupo tiol . Mediante reemplazo o sustitución se quiere indicar que en donde la cisteína 127 intercadena normalmente se encontraría en la cadena pesada en el anticuerpo, otro aminoácido está en su lugar. La mutación en C127 puede ser cualquier mutación adecuada a uno, dos o tres de los nucleótidos que codifican para el aminoácido en la posición 127 lo cual cambia el residuo aminoácido de cisteína a otro aminoácido adecuado. Los ejemplos de aminoácidos adecuados incluyen serina, treonina, alanina, glicina o cualquier aminoácido polar. Un aminoácido preferido particularmente es serina.

La sustitución de la cisteína en la posición 127 con otro aminoácido elimina la cisteína en el dominio CH1 el cual normalmente forma un enlace disulfuro con una cisteína en la cadena ligera de la IgG4 natural. Por lo tanto, para formar un pareamiento de cadena ligera y cadena pesada por medio de un enlace disulfuro de intercadena, la cadena ligera debe formar un enlace disulfuro con una cisteína que esté colocada en la región de bisagra de la cadena pesada.

En un primer aspecto de la invención, los anticuerpos de acuerdo con la presente invención comprenden una cadena pesada en donde uno o más de los aminoácidos en las posiciones seleccionadas de 227, 228, 229 y 230, numeradas de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat se sustituyen con cisteína. En consecuencia, los anticuerpos de acuerdo con la presente invención pueden presentar una o más de las siguientes mutaciones: • S227C • K228C • Y229C • G230C Preferiblemente solo un residuo que se selecciona de 227, 228, 229 y 230 está sustituido con un residuo cisteína.

Los anticuerpos particularmente preferidos de la presente invención presentan la mutación Y229C o G230C.

La inclusión de un residuo cisteína en una posición que se selecciona de 227, 228, 229 y 230 en la región de bisagra de la cadena pesada proporciona una posición nueva para que se forme un enlace disulfuro intercadena entre la cadena pesada y la cadena ligera. Se ha encontrado por medio de los presentes inventores que esta distribución de enlace disulfuro intercadena nuevo proporciona anticuerpos IgG4 que tienen termoestabilidad mejorada en comparación con un anticuerpo IgG4 natural.

Se pueden introducir mutaciones adicionales a los anticuerpos de este aspecto de la presente invenció. En una modalidad la cisteína en la posición 239 (C239) y/o la cisteína en la posición 242 (C242) numeradas de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat en la cadena pesada está sustituido con otro aminoácido, preferiblemente un aminoácido que no contiene un grupo tiol . Al reemplazar o sustituir queremos indicar que en donde normalmente se encontraría la cisteína 239 y/o la cisteína 242 en la cadena pesada de anticuerpo, en su lugar se encuentra otro aminoácido. La mutación en C239 y/o C242 puede ser cualquier mutación adecuada a uno, dos, o tres de los nucleótidos que codifican para el aminoácido el cual cambia el residuo aminoácido de cisteína a otro aminoácido adecuado. Los ejemplos de aminoácidos adecuados incluyen serina, treonina, alanina, glicina o cualquier aminoácido polar. Un aminoácido preferido particularmente es serina.

En una modalidad, la cisteína en la posición 239 en la cadena pesada se sustituye con otro aminoácido y la cisteína en la posición 242 en la cadena pesada se sustituye con otro aminoácido. En esta modalidad, la sustitución de ambos C239 y C242 elimina ambos residuos cisteína en la región de bisagra de la cadena pesada los cuales normalmente forman enlaces disulfuro intercadena pesada con las cisteínas correspondientes en otra cadena pesada. Las semi-moléculas resultantes pueden formar moléculas de anticuerpo completas mediante unión no covalente entre dos cadenas pesadas .

En una modalidad alternativa la cisteína en la posición 239 en la cadena pesada se sustituye con otro aminoácido. En esta modalidad, la cisteína en la posición 242 no está sustituida con otro aminoácido.

En una modalidad alternativa adicional la cisteína en la posición 242 en la cadena pesada está sustituida con otro aminoácido. En esta modalidad, la cisteína en la posición 239 no está sustituida con otro aminoácido.

La sustitución de ya sea C239 o C242 deja una cisteína en la cadena pesada la cual es capaz de formar un enlace disulfuro intercadena pesada con una cisteína en otra cadena pesada. Sin desear unirse a teoría alguna, se considera que la sustitución de una cisteína en la región de bisagra, particularmente la sustitución de C239 reduce la formación de enlace disulfuro intracadena en la región de bisagra y por lo tanto puede reducir la formación de semi-moléculas de anticuerpo.

En una modalidad de la presente invención, en donde la serina en la posición 227 está sustituida con una cisteína, el anticuerpo preferiblemente no comprende mutaciones en las posiciones C239 y C242. En otra modalidad, en donde la serina en la posición 227 está sustituida con una cisteína, la cisteína en la posición 239 en la cadena pesada preferiblemente está sustituida con otro aminoácido pero la cisteína en la posición 242 no está sustituida con otro aminoácido .

En una modalidad, los anticuerpos de la presente invención comprenden una cadena pesada IgG4 que está mutada para insertar uno o más aminoácidos entre los aminoácidos 226-243. El número de aminoácidos insertados puede ser 1 a 10, 1 a 5, 1 a 3, preferiblemente 1, 2, 3 ó 4 aminoácidos se insertan. Los aminoácidos preferiblemente se insertan entre los aminoácidos 238 y 239. Se puede insertar en la región de bisagra cualquiera de los aminoácidos adecuados tales como alaninas, glicinas, serinas o treoninas y combinaciones de los mismos. Preferiblemente se insertan tres alaninas (AAA) , tres glicinas (GGG) , tres serinas (SSS) o tres treoninas (TTT) o una treonina, histidina y otra treon na (THT) . Se ha encontrado que los anticuerpos de la presente invención comprenden una cadena pesada IgG4 la cual ha sido mutada para insertar tres aminoácidos en la región de bisagra, muestra termoestabilidad mejorada.

Una mutación adicional la cual se puede introducir en los anticuerpos de acuerdo con la presente invención es la mutación S241P. Esta mutación se ha demostrado previamente que reduce la formación de semi-moléculas (Angal, S. et al., 1993. A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human (IgG4) antibody. Mol Immunol 30, 105-108) .

Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención pueden comprender una o más mutaciones adicionales en la región de bisagra. Por ejemplo, los anticuerpos pueden comprender adicionalmente una o mas de las siguientes mutaciones S227P, Y229S, P237D y P238K.

En una modalidad, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención comprende efectivamente una región de bisagra IgGl del residuo 226 a 243 (bisagra superior y bisagra de núcleo) . En consecuencia, el anticuerpo de la presente invención comprende una región de bisagra en donde la glicina en la posición 230 está sustituida con cisteína, la serina en la posición 227 está sustituida con prolina, la tirosina en la posición 229 está sustituida con serina, la prolina en la posición 237 está sustituida con ácido aspártico, la prolina en la posición 238 está sustituida con lisina, la secuencia de aminoácidos de treonina-histidina-treonina se inserta entre las posiciones 238 y 239 y la serina en la posición 241 está sustituida con prolina. Estas mutaciones también se pueden escribir como S227P, Y229S, G230C, P237D, P238KTHT y S241P, como se muestra en la figura 2a. Se ha encontrado que la introducción de estas mutaciones adicionales a la región de bisagra IgG4 proporciona un anticuerpo que tiene termoestabilidad mejorada.

El anticuerpo de acuerdo con la presente invención preferiblemente tiene una bisagra inferior IgG4 del residuo 244 a 251 (APEFLGGP) . Sin desear unirse a teoría alguna se considera que la región de bisagra inferior de IgG4 contribuye a la carencia de función efectora de un anticuerpo IgG4.

En un segundo aspecto de la presente invención, el anticuerpo comprende una cadena pesada en donde la cisteína en la posición 127 está sustituida con otro aminoácido, como se describe en lo anterior y la cisteína en la posición 239 o la cisteína en la posición 242, numerada de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat en la cadena pesada está sustituido con otro aminoácido. En este segundo aspecto, ninguno de los residuos en las posiciones 227, 228, 229 y 230 están sustituidos con un residuo cisteína.

Los anticuerpos de acuerdo con un segundo aspecto de la presente invención se han encontrado sorprendentemente que tienen termoestabilidad mejorada en comparación con un anticuerpo IgG4 natural.

En el segundo aspecto de la presente invención, el anticuerpo puede comprender una o más mutaciones adicionales. En una modalidad el anticuerpo comprende una cadena pesada IgG4 la cual es mutada para insertar tres aminoácidos entre los aminoácidos 226-243, preferiblemente entre los aminoácidos 238 y 239, como se describe en lo anterior. En una modalidad adicional el anticuerpo comprende la mutación S241P. En una modalidad adicional el anticuerpo puede comprender además una o más de las siguientes mutaciones S227P, Y229S, P237D y P238K.

La tabla 1 a continuación enumera anticuerpos ejemplares de la presente invención y las mutaciones las cuales se han introducido en comparación con una secuencia natural de IgG . La tabla 1 también incluye anticuerpos IgGl e IgG4 naturales y anticuerpos control.

TABLA 1 La figura 3a y la figura 4a muestran las mutaciones introducidas en anticuerpos IgG4 de acuerdo con la presente invención. La figura 3b y la figura 4b muestraN las posiciones de los residuos cisteína en los anticuerpos IgG4 de la presente invención y también muestra el enlace predicho de la cisteína a una cisteína en la cadena ligera (LC) u otra cadena pesada (HC) . Para residuos cisteína los cuales muestran (LC o HC) , es posible que la cisteína se una a una cisteína en la cadena ligera o la cadena pesada pero en donde cualquiera de LC o HC esté ,subrayado este es un enlace disulfuro . el cual se considera que ocurre de modo predominante .

En una modalidad preferida, la presente invención proporciona un anticuerpo que comprende por lo menos una cadena pesada, en donde cada cadena pesada comprende un dominio CH1 y una región de bisagra y cada cadena pesada comprende las mutaciones de un anticuerpo que se selecciona de 2, 3, 6, 7, 8, 15, 16, 28, 28P, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 44, 44P, 45, 46, 47 y 48 como se muestra en la tabla 1. En consecuencia, la presente invención proporciona un anticuerpo que comprende por lo menos una cadena pesada, en donde cada cadena pesada comprende un dominio CH1 y una región de bisagra y cada cadena pesada comprende una de las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 37.

En una modalidad preferida, el anticuerpo de la presente invención comprende por lo menos una cadena pesada, en donde cada cadena pesada comprende un dominio CH1 y una región de bisagra y comprende una de las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 37. De manera más preferible, el anticuerpo de la presente invención comprende por lo menos una cadena pesada en donde cada cadena pesada comprende un dominio CH1 y una región de bisagra y cada cadena pesada comprende una de las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 37.

En una modalidad preferida adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo que comprende por lo menos una cadena pesada, en donde cada cadena pesada comprende un dominio CH1, una región de bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3 y cada cadena pesada comprende las mutaciones de un anticuerpo que se selecciona de 2, 3, 6, 7, 8, 15, 16, 28, 28P, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 44, 44P, 45, 46, 47 y 48 como se muestra en la tabla 1. En consecuencia, la presente invención proporciona un anticuerpo que comprende por lo menos una cadena pesada, en donde cada cadena pesada comprende un dominio CH1, una región de bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3 y cada cadena pesada comprende una de las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NQ: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NQ: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62 y SEQ ID NO: 63.

Un anticuerpo preferido particularmente de la presente invención comprende por lo menos una cadena pesada la cual comprende un dominio CH1 y una región de bisagra, en donde la cadena pesada comprende la SEQ ID NO: 36 (anticuerpo 28P) , SEQ ID NO: 37 (anticuerpo 44P) o SEQ ID NO: 35 (anticuerpo 48) . Un anticuerpo preferido particularmente adicional de la presente invención comprende por lo menos una cadena pesada la cual comprende un dominio CH1, una región de bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3 en donde la cadena pesada comprende la SEQ ID NO: 62 (anticuerpo 28P) , SEQ ID NO: 63 (anticuerpo 44P) o SEQ ID NO: 61 (anticuerpo 48) . Los anticuerpos 28P, 44P y 48 se prefieren particularmente debido a que muestran termoestabilidad significativamente mejorada y muestran además formación reducida de semi-moléculas .

Se ha demostrado que los anticuerpos 2, 3 y 8 forman cantidades significativas de las denominadas semi-moléculas (HL, por sus siglas en inglés) . Estos mutantes pueden formar moléculas de anticuerpo completas (H2L2) in vitro bajo condiciones no desnaturalizantes pero cualquiera de las asociaciones no covalentes entre las cadenas pesadas y/o entre cadenas pesada y ligera se elimina bajo condiciones de SDS-PAGE no reductoras . Aunque con frecuencia se describe como deseable reducir la formación de semi-moléculas , los anticuerpos los cuales tienen una tendencia aumentada a formar semi-moléculas pueden ser ventajosos para ciertos usos. Los anticuerpos los cuales forman semi-moléculas (HL) estables y poco o nulo anticuerpo completo (H2L2) debido a que la cadena pesada de anticuerpos es incapaz de formar una asociación covalente o no covalente con otra cadena pesada, son de interés particular. Los anticuerpos los cuales forman serai-moléculas estables pueden ser ventajosos para la producción de anticuerpos monovalentes . Los anticuerpos los cuales forman semi-moléculas también pueden proporcionar una manera útil de producir un anticuerpo biespecífico debido a la formación de anticuerpos completos a partir de semi-moléculas que tengan especificidades diferentes, en donde el anticuerpo completo es biespecífico y monovalente para cada antígeno.

El anticuerpo 3 retiene C239 en la región de bisagra pero parece incapaz de formar enlaces disulfuro de cadena pesada interbisagra, probablemente debido a formación eficiente de un disulfuro entre la cisteína de la cadena ligera de la parte C terminal y la bisagra C239. Una comparación de los anticuerpos 2 y 3 muestra el grado del "alcance" de la cisteína C-terminal de la cadena ligera, en que los enlaces disulfuro de la cadena ligera más eficientemente a C239 que a C242 en la región de bisagra. Además, el anticuerpo 3 muestra estabilidad aumentada en comparación con el anticuerpo 2.

Aunque los anticuerpos mutados de acuerdo con la presente invención se describen en lo anterior con respecto al isotipo IgG4, las personas expertas en el ámbito apreciarán que las mutaciones realizadas al anticuerpo IgG4 también se pueden aplicar a otros isotipos o clases de anticuerpos los cuales tengan la misma distribución de enlace disulfuro que un anticuerpo IgG4 con el fin de proporcionar un anticuerpo mejorado. Los ejemplos específicos de anticuerpos los cuales tienen en la misma distribución de enlace disulfuro es un anticuerpo IgG4 son los anticuerpos IgG3 , anticuerpos IgM y anticuerpos IgD. Como se muestra en la figura Ib, IgG3 e IgM tienen una cisteína en la posición 127 en el dominio CH1 e IgD tiene una cisteína en la posición 128 en el dominio CH1 el cual es equivalente a la C127 en el dominio CH1 de la IgG4 la cual forma un enlace disulfuro intercadena con una cisteína en la cadena ligera. Además, también se puede observar de la figura Ib que las regiones de bisagra superior de IgG3 e IgD y la región C-terminal del dominio CH1 y la región N-terminal del dominio CH2 en IgM no contienen un residuo cisteína el cual sea equivalente a los residuos de la región de bisagra superior de IgGl. En consecuencia, la presente invención proporciona adicionalmente un anticuerpo IgG3 , un anticuerpo IgD y un anticuerpo IgM en donde la cisteína en el dominio CH1 el cual forma un enlace disulfuro intercadena con cisteína en una cadena ligera está sustituido con otro aminoácido y en donde uno o más aminoácidos los cuales están en posición estructuralmente análoga a la región de bisagra superior de IgGl e IgG4 están sustituidos con cisteína.

En consecuencia, la presente invención también proporciona un anticuerpo de la clase IgG3 que comprende por lo menos una cadena pesada la cual comprende un dominio CH1 y una región de bisagra, en donde, en cada cadena pesada: a. la cisteína en el dominio CH1 la cual forma un enlace disulfuro intercadena con una cisteína en una cadena ligera está sustituido con otro aminoácido; y b. uno o más de los aminoácidos colocados en la región de bisagra superior están sustituidos con cisteína.

En una modalidad preferida del anticuerpo IgG3 aspecto de la presente invención, la cisteína en el dominio CH1 el cual forma un enlace disulfuro intercadena con una cisteína en una cadena ligera es la cisteína en la posición 127, numerada de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, como se muestra en la figura Ib y en la figura 2b.

En una modalidad preferida del anticuerpo IgG3 aspecto de la presente invención, uno o más aminoácidos colocados en la región de bisagra superior los cuales pueden estar sustituidos con cisteína son uno o más de los aminoácidos en las posiciones que se selecciona de 226, 227, 228, 229, 230, 232 y 233, numerados de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, como se muestra en la figura Ib y la figura 2b.

La presente invención proporciona adicionalmente un anticuerpo de la clase IgM que consiste de por lo menos una cadena pesada la cual comprende un dominio CHl y un dominio CH2, en donde, en cada cadena pesada: a. la qisteína en el dominio CH1 la cual forma un enlace disulfuro intercadena con una cisteína en una cadena ligera está sustituida con otro aminoácido; y b. uno o más de los aminoácidos colocados en el dominio CH1 o el dominio CH2 están sustituidos con cisteína.

En una modalidad preferida del anticuerpo igM aspecto de la presente invención la cisteína en el dominio CH1 la cual forma un enlace disulfuro intercadena con una cisteína en una cadena ligera es la cisteína en la posición 127, numerada de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, como se muestra en la figura Ib y en la figura 2c.

En una modalidad preferida del anticuerpo IgM aspecto de la presente invención, uno o más de los aminoácidos colocados en el extremo C-terminal del dominio ¾1 O el extremo N-terminal del dominio CH2 están sustituidos con cisteína. La posición de aminoácidos preferida en el extremo C-terminal del dominio CH1 los cuales pueden estar sustituidos con cisteínas son uno o más aminoácidos en posiciones que se seleccionan de 223, 223A, 223B y 223C, numerados de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, como se muestra en la figura Ib y en la figura 2c. La posición de aminoácidos preferida en el extremo N-terminal del dominio CH2 los cuales pueden estar sustituidos con cisteína son uno o más de los aminoácidos en posiciones que se seleccionan de 243G, 243H y 2431, numerados de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, como se muestra en la figura Ib y en la figura 2c. En consecuencia, cualquiera de uno o más de los aminoácidos 223 a 243 puede estar sustituido con cisteína.

La presente invención proporciona adicionalmente un anticuerpo de la clase IgD que comprende por lo menos una cadena pesada la cual comprende un dominio CH1 y una región de bisagra, en donde, en cada cadena pesada: a. la cisteína en el dominio CH1 la cual forma un enlace disulfuro intercadena con una cisteína en una cadena ligera está sustituida con otro aminoácido; y b. uno o más de los aminoácidos colocados en la región de bisagra está sustituido con cisteína.

En una modalidad preferida del anticuerpo IgD aspecto de la presente invención, la cisteína en el dominio CH1 la cual forma un enlace disulfuro intercadena con una cisteína en una cadena ligera es la cisteína en la posición 128 numerada de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, como se muestra en la figura ib y la figura 2d.

La región de bisagra es un anticuerpo IgD que puede definirse como R224-P243, de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat.

En una modalidad preferida del anticuerpo IgD aspecto de la presente invención, uno o más aminoácidos colocados en la región de bisagra los cuales están sustituidos con cisteína son uno o más de los aminoácidos en posiciones que se seleccionan de 227, 228, 220, 230, 231, 232 y 233, numerados de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, como se muestra en la figura Ib y en la figura 2D .

Los anticuerpos IgG3 , IgD o IgM proporcionados por la presente invención pueden comprender una o más mutaciones adicionales a la región de bisagra como se describe en lo anterior con respecto al anticuerpo IgG4.

El término "anticuerpo", como se utiliza en la presente incluye anticuerpos intactos (completos) y fragmentos funcionalmente activos los cuales comprenden por lo menos una cadena pesada la, cual comprende un dominio VH, un dominio CH1 y una región de bisagra. El anticuerpo de acuerdo con la presente invención preferiblemente comprende por lo menos una cadena ligera. En consecuencia, el término "anticuerpo" en la presente invención cubre anticuerpos bivalentes, trivalentes o tetravalentes, fragmentos Fab' o F(ab')2f moléculas de semi-anticuerpo o semi-moléculas que comprenden un pareamiento de cadena ligera y cadena pesada únicas y moléculas de anticuerpo completas que comprenden dos pareamientos de cadena ligera y de cadena pesada.

Como es bien conocido en el ámbito, una molécula Fab1 típica comprende un par de cadenas pesada y ligera en el cual la cadena pesada comprende una región variable VH/ un dominio constante CH1 y una región de bisagra y la cadena ligera comprende una región variable VL y un dominio constante CL.

En una modalidad se proporciona un dímero de Fab1 de acuerdo con la presente descripción, por ejemplo la dimerización puede ser a través de la bisagra.

En una modalidad la cadena pesada comprende un dominio CH2 y un dominio CH3 y opcionalmente un dominio CH4. En una modalidad el anticuerpo comprende dos cadenas pesadas, cada una de las cuales es como se define en lo anterior en el primero o segundo aspecto de la presente invención. Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención también comprenden preferiblemente dos cadenas ligeras. En esta modalidad en donde el anticuerpo comprende dos cadenas pesadas, preferiblemente ambas secuencias de cadena pesada son idénticas como se define en lo anterior por el primero o segundo aspectos de la presente invención.

En una modalidad preferida el anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo completo que comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, en donde cada cadena pesada comprende una IgG4 CH1 en donde la cisteína en la posición 127, numerada de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat está sustituida con otro aminoácido, una IgGl de región de bisagra superior y media, una IgG4 de región de bisagra inferior, un dominio CH2 y un dominio CH3.

La región de bisagra completa de un anticuerpo IgG4 típicamente consiste de los residuos 226 a 251 (numeración basada en el sistema de numeración de Kabat) . No obstante, la región de bisagra se puede acortar o alargar según se requiera. Por ejemplo, los anticuerpos de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención, el aminoácido natural está sustituido con un residuo cisteína en la posición 227, 228, 229 ó 230, la región de bisagra puede finalizar después del nuevo residuo cisteína en la posición 227, 228, 229 ó 230. Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención también pueden comprender uno o más aminoácidos adicionales colocados N-terminal y/o C-terminal respecto a la región de bisagra. Además, otras características de la bisagra pueden ser controladas tales como la distancia de una o varias de las cisteínas de bisagra desde la cisteína intercadena de cadena ligera, la distancia entre las cisteínas de la bisagra y la composición de los otros aminoácidos en la bisagra que pueden alterar las propiedades de la bisagra tal como flexibilidad, por ejemplo, se pueden incorporar glicinas en la bisagra para incrementar la flexibilidad rotacional o se pueden incorporar prolinas para reducir la flexibilidad. De manera alternativa, las combinaciones de residuos cargados o hidrofóbicos se pueden incorporar en la bisagra para conferir multimerización o propiedades de purificación. Otras regiones de bisagra modificadas pueden ser que si se pueden diseñar para que presenten propiedades deseadas tales como longitud, composición y flexibilidad.

Los dominios de región constante, en particular en el dominio Fe, cuando están presentes, utilizados en la presente invención preferiblemente son del isotipo IgG4 en donde no se requieren funciones efectoras de anticuerpo. En consecuencia, cada cadena pesada preferiblemente comprende un dominio CH2 de IgG4 y un dominio CH3 , como se muestra en la SEQ ID NO: 64.

Se apreciará que también se pueden utilizar variantes de secuencia de los dominios de región constante Fe.

En una modalidad, cada cadena pesada comprende dominios CH2 y CH3 de IgG4 en donde la arginina en la posición 409 (numeración de EU) está sustituida con lisina, treonina, metionina o leucina con el fin de inhibir la formación de agregado a un pH bajo (documento de E.U.A. 2008/0063635 Takahashi et al) . Las mutaciones en L235, D265, D270, K322, P331 y P329 (numerados de acuerdo con el sistema de numeración EU) también se describen con el fin de atenuar la actividad CDC (documento de E.U.A. 2008/0063635, Takahashi et al.) .

Cada cadena pesada puede comprender las mutaciones como se describen en WO 2008/145142 Van de Winkel et al., la cual describe anticuerpos IgG4 estables que tienen capacidad reducida para experimentar intercambio de brazo Fab por sustitución del residuo arginina en la posición 409, el residuo Phe en la posición 405 o Lys en la posición 370 (numerados de acuerdo con el sistema de numeración EU) .

En una modalidad, cada cadena pesada comprende un dominio CH2 de IgG4 y un dominio CH3 de IgGl, como se muestra en la SEQ ID NO: 65.

En la modalidad de la presente invención en donde el anticuerpo es un anticuerpo mutado IgG3 ¡ IgD o IgM, cada cadena pesada preferiblemente comprende un dominio CH2 y un dominio CH3 , y opcionalmente un dominio CH . En el anticuerpo IgG3 cada cadena pesada preferiblemente comprende un dominio CH2 de IgG3 y un dominio CH3 de IgG3. En el anticuerpo IgD, cada cadena pesada preferiblemente comprende un dominio CH2 de IgD y un dominio CH3 de IgD. En el anticuerpo IgM, cada cadena pesada preferiblemente comprende un dominio CH2 de IgM, un dominio CH3 de IgM y un dominio CH4 de IgM.

En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, completamente humano, humanizado o un fragmento de anticuerpo quimérico. En una modalidad el anticuerpo es completamente humano o humanizado.

Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar por cualquier método conocido en el ámbito tal como la técnica de hibridoma (Kohler & Milstein, Nature, 1975, 256, 495-497), la técnica de trioma, la técnica de hibridoma y linfocito B humano (Kozbor et al., Immunology Today, 1983, 4, 72) y la técnica de EBV-hibridoma (Colé et al., "Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy", pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985).

Los anticuerpos para uso en la invención también se pueden generar utilizando métodos de anticuerpo de linfocito único por clonación y expresión de los ADNc de la región variable de inmunoglobulina a partir de linfocitos que se seleccionan para la producción de anticuerpos específicos, por ejemplo, mediante los métodos descritos por Babcook, J. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1996, 93(15), 7843-7848, WO 92/02551, WO2004/051268 y WO2004/106377.

Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpo de especies diferentes a la humana que tienen una o más regiones determinadoras de complementariedad (las CDR) a partir de especies no humanas y una región de infraestructura de una molécula de inmunoglobulina humana la cual opcionalmente comprende uno o más residuos donadores de la especie no humana (véase, por ejemplo, el documento de E.U.A. 5, 585, 089) .

Los anticuerpos para uso en la presente invención también se pueden generar utilizando diversos métodos de presentación por fago conocidos en el ámbito y que incluyen los descritos por Brinkman et al., J. Imnunol. Methods, 1995, 182, 41-50; Ames et al., J. Imnunol. Methods, 1995, 184, 177-186; Kettleborough et al., Eur. J. Immunol., 1994, 24, 952-958; Persic et al., Gene, 1997 187, 9-18; y Burton et al., Advanced in Immunology, 1994, 57, 191-280; WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982 y WO 95/20401; y los documentos de E.U.A. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 y 5,969,108. Además, se pueden utilizar para generar anticuerpos humanizados maíz transgénico u otros organismos que incluyen a otros mamíferos .

Los anticuerpos completamente humanos son aquellos anticuerpos en los cuales las regiones variables y las regiones constantes (cuando están presentes) de ambas, la cadenas pesada y ligera son todas de origen humano, o sustancialmente idénticas a secuencias de origen humano, no necesariamente del mismo anticuerpo. Los ejemplos de anticuerpos completamente humanos pueden incluir anticuerpos producidos, por ejemplo, por métodos de presentación en fago descritos en lo anterior y anticuerpos producidos por ratones en los cuales los genes para la región variable y/o constante de inmunoglobulina murina se han sustituido por sus contrapartes humanas, por ejemplo, como se describe en términos generales en los documentos EP0546073 Bl, documento de E.U.A. 5,545,806, documento de E.U.A. 5,569,825, documento de E.U.A. 5,625,126, documento de E.U.A. 5,633,425, documento de E.U.A. 5,661,016, documento de E.U.A. 5,770,429, EP 0438474 y EP0463151 Bl .

El material inicial de anticuerpo para uso en la presente invención se puede preparar mediante el uso de técnicas de ADN recombinante que involucra la manipulación y reexpresión de ADN que codifica para una o varias de las regiones variable y constante de anticuerpo. Se pueden utilizar técnicas de biología molecular convencionales para modificar, agregar o suprimir aminoácidos o dominios a voluntad. Cualquiera de las alteraciones de las regiones variable o constante aún están abarcadas por los términos de las regiones "variable" y "constante" como se utiliza en la presente .

El material inicial de anticuerpo se puede obtener de cualquier especie que incluye, por ejemplo, ratón, rata, conejo, hámster, camello, llama, chivo o humano. Se pueden obtener partes del anticuerpo a partir de más de una especie, por ejemplo el anticuerpo puede ser quimérico. En un ejemplo, las regiones constantes son de una especie y las regiones variables de otra. También se puede modificar el material inicial del anticuerpo. En otro ejemplo, la región variable del anticuerpo ha sido creada utilizando técnicas de manipulación de ADN recombinante. Las versiones manipuladas incluyen aquellas generadas, por ejemplo, a partir de regiones variables de anticuerpo mediante inserciones, supresiones o cambios dentro o a las secuencias de aminoácido de los anticuerpos naturales. Los ejemplos particulares de este tipo incluyen aquellos dominios de región variable manipulados que contienen por lo menos una CDR y, opcionalmente, uno o más aminoácidos de infraestructura a partir de un anticuerpo y el resto del dominio de región variable de un segundo anticuerpo. Los métodos para crear y fabricar estos anticuerpos son bien conocidos en el ámbito (véase, por ejemplo, Boss et al., documento de E.U.A. 4,816,397; Cabilly et al., documento de E.U.A. 6,331,415; Shrader et al., WO 92/02551; Ward et al., 1989, Nature, 341, 544; Orlandi et al., 1989, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 86, 3833; Riechmann et al., 1988, Nature, 322, 323; Bird et al., 1988, Science, 242, 423; Queen et al., documento de E.U.A. 5,585,089; Adair, O91/09967; Mountain and Adair, 1992, Biotechnol. Genet . Eng. Rev, 10, 1-142; Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181).

En una modalidad, el anticuerpo que comprende un par de dominio variable que forma un dominio de unión es un par afín. El par afín, como se utiliza en la presente, se pretende que se refiera a un par natural de dominios variables, es decir, aislados de un anticuerpo único o una célula que expresa anticuerpo.

Los dominios variables pueden haber sido optimizados y/o humanizados.

Los dominios variables optimizados/humanizados derivados de un par afín aún se considerarán un par afín después de optimización/humanización.

De esta manera la invención se extiende a moléculas humanas, humanizadas o quiméricas.

En una modalidad las moléculas se unen específicamente a un antígeno objetivo. Específicamente las uniones como se utilizan en la presente están destinadas para referirse a moléculas que tienen una alta afinidad por un antígeno objetivo (al cual es específico) y las cuales se unen a antígenos a los cuales no son específicos con una afinidad baja o mucho menor (o ninguna en absoluto) . Los métodos para medir afinidad se conocen por los expertos en el ámbito e incluyen ensayos tales como BIAcoreMR.

Las moléculas de anticuerpo de la presente invención adecuadamente tienen una alta afinidad de unión, en particular nanomolar o picomolar. La afinidad se puede medir utilizando cualquier método adecuado conocido en el ámbito, que incluye BIAcoreMR. En una modalidad la molécula de la presente invención tiene una afinidad de unión de aproximadamente 100 pM o mejor. En una modalidad la molécula de la presente invención tiene una afinidad de unión de aproximadamente 50 pM o mejor. En una modalidad la molécula de la presente invención tiene una afinidad de unión de aproximadamente 40 pM o mejor. En una modalidad la molécula de la presente invención tiene una afinidad de unión de aproximadamente 30 pM o mejor. En una modalidad la molécula de la presente invención es completamente humana p humanizada y tiene una afinidad de unión de aproximadamente 100 pM o mejor.

Un derivado de un dominio como se encuentra de manera natural, como se utiliza en la presente está destinado para referirse a en donde uno, dos, tres, cuatro o cinco aminoácidos en una secuencia como se encuentra de modo natural han sido sustituidos o suprimidos, por ejemplo para optimizar las propiedades del dominio tal como mediante eliminación de propiedades indeseables pero en donde se han retenido uno o varios rasgos caracterizantes del dominio.

En una modalidad las moléculas de anticuerpo de la presente invención comprenden uno o más péptidos que unen albúmina. In vivo el péptido que une albúmina, lo cual incrementa la vida media de la molécula.

El péptido que une albúmina se puede unir a partir de una o más regiones variables, una bisagra o C-terminal de la molécula o en cualquier ubicación que no interfiera con las propiedades de unión a antígeno de las moléculas.

Los ejemplos de péptidos que unen albúmina se proporcionan en el documento WO 2007/106120.

También se entenderá por una persona experta en el ámbito que el anticuerpo puede experimentar una diversidad de modificaciones post-traduccionales . El tipo y grado de estas modificaciones con frecuencia depende de la línea de células hospedadoras para expresar la molécula así como las condiciones de cultivo. Estas modificaciones pueden incluir variaciones en glucosilación, oxidación de metionina, formación de dicetopiperazina, isomerización de aspartato y desamidación de asparagina. Una modificación frecuente es la pérdida de un residuo básico carboxi-terminal (tal como lisina o arginina) debido a la acción de carboxipeptidasas (como se describe en Harris, RJ. Journal of Chromatography 705;129-134, 1995) .

Si se desea una molécula para uso en la presente invención se puede conjugar a una o más moléculas efectoras. Se apreciará que la molécula efectora puede comprender una molécula efectora única o dos o más de estas moléculas relacionadas de manera que formen una porción única que se puede unir a la molécula de anticuerpo de la presente invención. Cuando se desea obtener un anticuerpo de acuerdo con la invención unido a una molécula efectora, esto se puede preparar por procedimientos de química convencional o ADN recombinante en los cuales el anticuerpo se une ya sea directamente o vía un agente de acoplamiento a una molécula efectora. Las técnicas para conjugación de las moléculas efectoras a un anticuerpo son bien conocidos en el ámbito (véase, Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, segunda edición, Robinson et al., eds., 1987, pp. 623-53; Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. , 62:119-58 y Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123).

Los procedimientos químicos particulares incluyen, por ejemplo, los descritos en WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195, WO 89/01476 y WO 03031581. De manera alternativa, en donde la molécula efectora es una proteína o polipéptido la unión se puede llevar a cabo utilizando procedimientos de ADN recombinante, por ejemplo como se describe en WO 86/01533 y WP 0392745.

El término molécula efectora, como se describe en la presente, incluye, por ejemplo, agentes antineoplásicos, medicamentos, toxinas, proteínas biológicamente activas, por ejemplo enzimas, otro anticuerpo o fragmentos de anticuerpo, polímeros sintéticos o como se encuentran de manera natural, ácidos nucleicos y fragmentos de los mismos, por ejemplo ADN, ARN y fragmentos de los mismos, radionúclidos, particularmente radioyoduro, radioisótopos, metales quelados, nanopartículas y grupos indicadores tales como compuestos fluorescentes o compuestos los cuales se pueden detectar por RMN o espectroscopia ESR.

Los ejemplos de moléculas efectoras pueden incluir citotoxinas o agentes citotóxicos que incluyen cualquier agente que sea perjudicial (por ejemplo que destruya) a las células. Los ejemplos incluyen combrestatinas , dolastatinas, epotilonas, estaurosporina, maytansinoides , espongistatinas, rizoxina, halicondrinas, roridinas, hemiasterlinas , taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido,. tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaina, tetracaína, lidocaína, propanolol y puromicina y análogos u homólogos de los mismos .

Las moléculas efectoras también incluyen pero no se limitan a antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo descarbazina) , agentes alquilantes (por ejemplo mecloretamina, tiotepa, clorambucilo, melfalano, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU) , ciclotofosfamida, busulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina platino (II) (DPP) cisplatino) , antraciclinas (por ejemplo daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina) , antibióticos (por ejemplo dactinomicina (anteriormente actinomicina) , bleomicina, mitramicina, antramicina (AMC) , caliqueamicinas o duocarmicinas) y agentes antimicóticos (por ejemplo, vincristina o vinblastina) .

Otras moléculas efectoras pueden incluir radionúclidos quelados tales como llxIn y 90Y, Lu177, bismuto213, californio252 , iridio192 y tungsteno188/renio188; o medicamentos tales como, pero sin limitarse a alquilfosfocolinas, inhibidores de topoisomerasa I, taxoides y suramina.

Otras moléculas efectoras incluyen proteínas, péptidos y enzimas. Las enzimas de interés incluyen, pero no se limitan a enzimas proteolíticas , hidrolasas, liasas, isomerasas, transferasas . Proteínas, polipéptidos y péptidos de interés incluyen, pero no se limitan a inmunoglobulinas, toxinas tales como abrina, ricina A, exotoxina de pseudominas o toxina de difteria, una proteína tal como insulina, factor de necrosis tumoral, a-interferón, ß-interferón, factor de crecimiento de nervios, factor de crecimiento derivado de plaquetas o activador de plasminógeno tisular, un agente trombótico o un agente antiangiogénico, por ejemplo angiostatina o endostatina, o un modificador de la respuesta biológica tal como una linfocina, interleucina-1 (IL-1) , interleucina-2 (IL-2) , factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF, por sus siglas en inglés) , factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF, por sus siglas en inglés) , factor de crecimiento de nervio (NGF, por sus siglas en inglés) u otros factores de crecimiento e inmunoglobulinas .

Otras moléculas efectoras pueden incluir sustancias detectables útiles, por ejemplo, en diagnóstico. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes , núclidos radioactivos, metales que emiten positrones (para uso en tomografía de emisión de positrones) y iones metales paramagnéticos no radioactivos. Véase de manera general la patente de E.U.A. número 4,741,900 para iones de metales los cuales se pueden conjugar a anticuerpos para uso como elementos de diagnóstico. Las enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa o acetilcolina esterasa; los grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina, avidina y biotina; los materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína de diclorotiazinilamina, cloruro de dansilo y ficoeritrina; los materiales luminiscentes adecuados incluyen luminol; los materiales bioluminiscentes adecuados incluyen luciferasa, luciferina y aequorina; y los núclidos radioactivos adecuados incluyen 12SI, 131I, 1:11In y 99Tc.

En otro ejemplo la molécula efectora puede incrementar la vida media del anticuerpo in vivo y/o reducir la inmunogenicidad del anticuerpo y/o mejorar el suministro de un anticuerpo a través de la barrera epitelial al sistema inmunitario. Los ejemplos de moléculas efectoras adecuadas de este tipo incluyen polímeros, albúmina, proteínas que unen albúmina o compuestos que unen albúmina tales como los descritos en WO 05/117984.

Cuando la molécula efectora es un polímero, en general puede ser un polímero sintético o como se encuentra en la naturaleza, por ejemplo un polialquileno de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido, polialquenileno o polímero de polioxialquileno o un polisacárido ramificado o no ramificado,, por ejemplo un homo- o hetero-polisacárido .

Los sustituyentes opcionales específicos los cuales pueden estar presentes en los polímeros sintéticos mencionados antes incluyen uno o más grupos hidroxi, metilo o metoxi .

Los ejemplos específicos de polímeros sintéticos incluyen las formas de cadena lineal o ramificada, opcionalmente sustituida, de poli (etilenglicol) , poli (propilenglicol) , poli (alcohol vinílico) o derivados de los mismos, especialmente poli (etilenglicol) opcionalmente sustituido tal como metoxipoli (etilenglicol) o derivados de los mismos.

Los polímeros específicos que se encuentran de modo natural incluyen lactosa, amilosa, dextrano, glucógeno o derivados de los mismos.

Como se utiliza en la presente, los "derivados" incluyen derivados reactivos, por ejemplo grupos reactivos selectivos a tiol tales como maleimidas y similares. El grupo reactivo se puede unir directamente o a través de un segmento enlazante al polímero. Se apreciará que el residuo de tal grupo en algunos casos forma parte del producto como el grupo enlazante entre el anticuerpo de la descripción y el polímero .

El tamaño del polímero puede variar según se desee pero generalmente estará en un intervalo de peso molecular promedio de 500 Da a 50,000 Da, por ejemplo, de 5000 a 40,000 Da, tal como de 20000 a 40,000 Da. El tamaño del polímero en particular puede seleccionarse en base en el uso destinado del producto, por ejemplo, capacidad para localizar ciertos tejidos tales como tumores o una vida media circulante extendida (para una revisión véase Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545) . Así, por ejemplo, cuando el producto está destinado para abandonar la circulación y penetrar en tejido, por ejemplo, para uso en el tratamiento de un tumor, puede ser ventajoso utilizar un polímero de peso molecular pequeño, por ejemplo con un peso molecular de aproximadamente 5000 Da. Para aplicaciones en donde el producto permanece en la circulación puede ser ventajoso utilizar un polímero de peso molecular mayor, por ejemplo que tenga un peso molecular en el intervalo de 20000 Da a 40000 Da.

Los polímeros adecuados incluyen un polímero de polialquileno tal como poli (etilenglicol) o, de manera especial, un metoxipoli (etilenglicol) o un derivado del mismo, y especialmente con un peso molecular en el intervalo de aproximadamente 15000 Da a aproximadamente 40000 Da.

En un ejemplo, un anticuerpo para uso en la presente invención se une a porciones de poli (etilenglicol) (PEG) . En un ejemplo particular, las moléculas de PEG se pueden unir a través de cualquier cadena lateral de aminoácido o grupo funcional de aminoácido terminal disponibles que se localicen en el anticuerpo, por ejemplo cualquier grupo amino libre, imino, tiol, hidroxilo o carboxilo. Los aminoácidos pueden presentarse de modo natural en el anticuerpo o pueden ser manipulados en el anticuerpo utilizando métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, el documento de E.y.A. 5,219,996; el documento de E.U.A. 5,667,425 y WO 98/25971). En un ejemplo, la molécula de la presente invención es un anticuerpo modificado en donde la modificación es la adición al extremo C-terminal de su cadena pesada en uno o más aminoácidos para permitir la unión de una molécula efectora. Se pueden utilizar sitios múltiples para unir dos o más moléculas de PEG.

En una modalidad, una molécula de PEG se une a una cisteína 171 en la cadena ligera, véase, por ejemplo, O2008/038024 , incorporado en la presente como referencia.

Las moléculas de PEG adecuadas están unidas covalentemente a través de un grupo tiol de por lo menos un residuo cisteína localizado en el anticuerpo. Cada molécula de polímero unida al anticuerpo modificado puede estar unida covalentemente al átomo de azufre de un residuo cisteína localizado en el anticuerpo. El enlace covalente generalmente será un enlace disulfuro o, en particular, un enlace azufre-carbono. Cuando se utiliza un grupo tiol como el punto de unión de moléculas efectoras activadas apropiadamente, por ejemplo derivados selectivos de tiol tales como maleimidas y derivados de cisteína se pueden utilizar. Un polímero activado se puede utilizar como el material inicial en la preparación de un anticuerpo modificado con polímero como se describe en lo anterior. El polímero activado puede ser cualquier polímero que contenga un grupo reactivo tiol tal como un ácido o éster oc-halocarboxílico, por ejemplo yodoacetamida, una imida, por ejemplo maleimida, una vinilsulfona o un disulfuro. Los materiales iniciales se pueden obtener comercialmente (por ejemplo de Nektar, anteriormente Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA) o se pueden preparar a partir de materiales iniciales disponibles comercialmente utilizando procedimientos químicos convencionales. Las moléculas de PEG particulares incluyen 20K metoxi-PEG-amina (obtenible de Nektar, anteriormente Shearwater; Rapp Polymere; and SunBio) y M-PEG-SPA (obtenible de Nektar, anteriormente Shearwater) .

La presente invención también proporciona un ADN aislado que codifica para una molécula de anticuerpo descrita en la presente.

En un aspecto adicional se proporciona un vector que comprende al ADN.

Los métodos generales por medio de los cuales se pueden construir vectores, métodos de transfección y métodos de cultivo son bien conocidos por los expertos en el ámbito. A este respecto se hace referencia a "Current Protocols in Molecular Biology" , 1999, F. M. Ausubel (ed) , iley Interscience , New York and the Maniatis Manual producida por Cold Spring Harbor Publishing.

En un aspecto adicional se proporciona una célula hospedadora que comprende al vector y/o ADN .

Cualquier sistema de célula hospedadora/vector adecuado se puede utilizar para la expresión de las secuencias de ADN que codifican para la molécula de la presente invención. Los sistemas bacterianos, por ejemplo E. coli y otros sistemas microbianos se pueden utilizar o también se pueden utilizar sistemas de expresión de células hospedadoras eucarióticas , por ejemplo de mamífero. Las células hospedadoras de mamífero adecuadas incluyen CHO, células de mieloma o hibridoma.

La presente invención también proporciona un proceso para la producción de una molécula de anticuerpo como se describe en la presente que comprende cultivar una célula hospedadora que contiene un vector (y/o ADN) de la presente invención bajo condiciones adecuadas para dirigir la expresión de proteína a partir de ADN que codifica para una molécula de anticuerpo de la presente invención y aislar una molécula de anticuerpo.

Para elaboración de productos que comprenden cadenas tanto pesada como ligera, la línea de células se puede transfectar con dos vectores, un primer vector que codifica para un polipéptido de cadena ligera y un segundo vector que codifica para un polipéptido de cadena pesada. De manera alternativa, se puede utilizar un vector único, el vector incluye secuencias que codifican para los polipéptidos de cadena ligera y de cadena pesada.

Las moléculas de anticuerpo de acuerdo con la presente descripción se expresan en concentraciones adecuadas a partir de células hospedadoras volviéndolas adecuadas para procesamiento comercial .

El anticuerpo puede ser específico para cualquier antígeno objetivo. El antígeno puede ser una proteína asociada a célula, por ejemplo una proteína de superficie celular sobre células tales como células bacterianas, células de levadura, linfocitos T, células endoteliales o células tumorales o puede ser una proteína soluble. Los antígenos de interés también pueden ser cualquier proteína médicamente relevante tal como las proteínas reguladas por aumento durante la enfermedad o infección, por ejemplo receptores y/o sus ligandos correspondientes. Los ejemplos particulares de proteínas de superficie celular incluyen moléculas de adhesión, por ejemplo integrinas tales como integrinas ß?, por ejemplo VLA-4, E-selectina, P-selectina o L-selectina, CD2 , CD3 , CD4 , CD5 , CD7, CD8 , CDlla, CDllb, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD40L, CD45, CDW52, CD69, CD134 (OX40) , ICOS, BCMP7, CD137, CD27L, CDCP1, CSF1 o receptor de CSF1, DPCR1, DPCR1, dudulina2, FLJ20584, FLJ40787, HEK2 , KIAA0634, KIAA0659, KIAA1246, KIAA1455, LTBP2 , LTK, MAL2 , MRP2, similar a nectina 2, NKCC1, PTK7 , RAIG1 , TCA 1 , SC6, BCMP101, BCMP84, BCMP11, DTD, antígeno carcinoembriónico (CEA) , globulina grasa de leche humana (HMFGl y 2) , antígenos CPH clase I y CPH clase II, KDR y VEGF, PD-1, DC-SIGN, TL1A, DR3 , receptor IL-7 A y, cuando se apropiado, receptores de los mismos.

Los antígenos solubles incluyen interleucinas tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-14, IL-16 o IL-17, tales como IL17A y/o IL17F, antígenos virales, por ejemplo virus sincicial respiratorio o antígenos de citomegalovirus, inmunoglobulinas tales como IgE, interferones tales como interferón a, interferón ß o interferón ?, factor de necrosis tumoral TNF (anteriormente conocido como factor a de necrosis tumoral y denominado en la presente como TNF o TNFoc) , factor ß de necrosis tumoral, factores estimulantes de colonias tales como G-CSF o GM-CSF y factores de crecimiento derivados de plaquetas tales como PDGF-a y PDGF-ß, WISP- y, cuando sea apropiado, receptores de los mismos. Otros antígenos incluyen antígenos de superficie de células bacterianas, toxinas bacterianas, virus tales como influenza, EBV, HepA, B y C, agentes de bioterrorrismo, radionúclidos y metales pesados así como venenos y toxinas de víbora y araña.

En una modalidad, el anticuerpo se puede utilizar para alterar funcionalmente la actividad del antígeno de interés. Por ejemplo, el anticuerpo puede neutralizar, antagonizar o agonizar la actividad del antígeno, directa o indirectamente .

Las moléculas de anticuerpo de la presente invención son útiles en el tratamiento y/o profilaxis de una condición patológica.

Por lo tanto, se proporciona un anticuerpo de acuerdo con la presente invención para uso en tratamiento, mediante administración de una cantidad terapéuticamente eficaz del mismo, por ejemplo en una formulación farmacéutica. En una modalidad, el anticuerpo de acuerdo con la invención se administra tópicamente a los pulmones, por ejemplo por inhalación.

Los anticuerpos proporcionados por la presente invención son útiles en el tratamiento de enfermedades o trastornos que incluyen enfermedades y trastornos inflamatorios, enfermedades y trastornos inmunitarios, trastornos fibróticos y cánceres.

El término "enfermedad inflamatoria" o "trastorno" y "enfermedad o trastorno inmunitario" incluye artritis reumatoide, artritis psoriática, enfermedad de Still, enfermedad de Mucke Walls, psoriasis, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, SLE (siglas en inglés de lupus eritematoso sistémico) , asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, esclerosis múltiple, vasculitis, diabetes mellitus tipo I, enfermedad de transplante y rechazo inverso.

El término "trastorno fibrótico" incluye fibrosis pulmonar idiopática (IPF, por sus siglas en inglés) , esclerosis sistémica (o escleroderma) , fibrosis renal, nefropatía diabética, nefropatía de IgA, hipertensión, enfermedad renal de etapa final, fibrosis peritoneal (diálisis peritoneal ambulatoria continua) , cirrosis hepática, degeneración macular relacionada con la edad (ARMD, por sus siglas en inglés) , retinopatía, fibrosis reactiva cardíaca, cicatrización, queloides, quemaduras, úlceras cutáneas, angioplastía, cirugía de derivación coronaria, angioplastía y cirugía de cataratas.

El término "cáncer" incluye un crecimiento nuevo maligno que surge del epitelio, que se encuentra en la piel o, más comúnmente, el revestimiento de los órganos del cuerpo, por ejemplo: mama, ovario, próstata, pulmón, riñon, páncreas, estomago, vejiga o intestino. Los cánceres tienden a infiltrarse en tejido adyacente y diseminar (producir metástasis) a órganos distantes, por ejemplo: hueso, hígado, pulmón o al cerebro.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende un anticuerpo de la presente invención en combinación con uno o más excipientes, diluyentes o portadores farmacéuticamente aceptables. En consecuencia, se proporciona el uso de un anticuerpo de la invención para la elaboración de un medicamento. La composición habitualmente se suministrará como parte de una composición farmacéutica estéril que normalmente incluirá un portador farmacéuticamente aceptable. Una composición farmacéutica de la presente invención adicionalmente puede comprender un adyuvante farmacéuticamente aceptable .

La presente invención también proporciona un proceso para la preparación de una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende agregar y mezclar el anticuerpo de la presente invención junto con uno o más excipientes, diluyentes o portadores farmacéuticamente aceptables .

El anticuerpo de la descripción puede ser un ingrediente activo único en la composición farmacéutica o de diagnóstico o puede estar acompañado por otros ingredientes activos que incluyen otros ingredientes de anticuerpo, por ejemplo anti-TNF, anti-IL-?ß, anti-linfocitos T, anti-IFNy o anticuerpos anti-LPS, o ingredientes que no son anticuerpos tales como xantinas . Otros ingredientes activos adecuados incluyen anticuerpos capaces de inducir tolerancia, por ejemplo anticuerpos anti-CD3 o anti-CD4.

En una modalidad adicional el anticuerpo o composición de acuerdo con la descripción se utiliza en combinación con un agente adicional farmacéuticamente activo, por ejemplo un corticosteroide (tal como propionato de fluticasona) y/o un agonista beta-2 (tal como salbutamol, salmeterol o formoterol) o inhibidores de crecimiento y proliferación celular (tales como rapamicina, ciclofosfamida, metotrexato) o alternativa a un inhibidor de CD28 y/o CD40. En una modalidad, el inhibidor es una molécula pequeña. En otra modalidad el inhibidor es un anticuerpo específico para el objetivo.

Las composiciones farmacéuticas adecuadamente comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo de la invención. El término "cantidad terapéuticamente eficaz" como se utiliza en la presente se refiere a una cantidad de un agente terapéutico necesario para tratar, disminuir o evitar una enfermedad o condición objetivo o para presentar un efecto terapéutico o preventivo detectable. La cantidad terapéuticamente eficaz se puede calcular inicialmente ya sea en análisis de cultivo celular o en modelos en animales, habitualmente en roedores, conejos, perros, cerdos o primates. También se puede utilizar el modelo en animales para determinar el intervalo de concentración apropiado y la vía de administración. Esta información después se puede utilizar para determinar dosis y vías de administración útiles en humanos.

La cantidad terapéuticamente eficaz precisa para un sujeto humano dependerá de la gravedad del estado de enfermedad, la salud general del sujeto, la edad, peso y sexo del sujeto, dieta, hora y frecuencias de administración, una o varias combinaciones de medicamentos, sensibilidad a reacciones y tolerancia/respuesta a la terapia. Esta cantidad se puede determinar por experimentación sistemática y está dentro del juicio del médico que atiende. Generalmente una cantidad terapéuticamente eficaz será de 0.01 mg/kg a 50 mg/kg, por ejemplo, 0.1 mg/kg a 20 mg/kg. Las composiciones farmacéuticas convenientemente se pueden presentar en forma de dosis unitaria que contienen una cantidad predeterminada de un agente activo de la invención por dosis.

Las composiciones se pueden administrar individualmente a un paciente o se pueden administrar en combinación (por ejemplo, de modo simultáneo, secuencial o separado) con otros agentes, medicamentos u hormonas.

La dosis a la cual un anticuerpo de la presente invención se administra depende de la naturaleza de la condición que se va a tratar, por ejemplo el grado de enfermedad/inflamación presente y si la molécula está siendo utilizada profilácticamente o para tratar una condición existente.

La frecuencia de la dosis dependerá de una vida media del anticuerpo y la duración de su efecto. Si el anticuerpo tiene una vida media corta (por ejemplo, de 2 a 10 horas) puede ser necesario suministrar una o más dosis al día. De modo alternativo, si el anticuerpo tiene una vida media prolongada (por ejemplo, de 2 a 15 días) puede ser necesario administrar solo una dosis una vez al día, una vez a la semana o incluso una vez cada 1 ó 2 meses.

El portador farmacéuticamente aceptable en si mismo no debe inducir la producción de anticuerpos dañinos al individuo quien recibe la composición y no debe ser tóxica. Los portadores adecuados pueden ser macromoléculas grandes, metabolizadas lentamente tales como proteínas, polipéptidos, liposomas, polisacáridos , ácidos polilácticos , ácidos poliglicólidos , aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas de virus inactivos.

Se pueden utilizar sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo sales de ácido mineral tales como clorhidratos, bromhidratos , fosfatos y sulfatos o sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos y benzoatos .

Los portadores farmacéuticamente aceptables en composiciones terapéuticas adicionalmente pueden contener líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol . Adicionalmente pueden estar presentes en las composiciones sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsificantes o sustancias amortiguadoras de pH. Tales portadores permiten que las composiciones farmacéuticas se formulen como tabletas, pildoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, lechadas y suspensiones para ingestión por el paciente.

Las formas adecuadas para administración incluyen formas adecuadas para administración parenteral, por ejemplo, por inyección o infusión, por ejemplo por inyección en bolo o infusión continua. Cuando el producto es para inyección o infusión, puede adquirir la forma de una suspensión, solución o emulsión en un vehículo oleoso o acuoso y puede contener agentes de formulación tales como agentes que mejoren la suspensión, conservadores, estabilizantes y/o dispersantes. De manera alternativa, la molécula de la descripción puede estar en forma seca, para reconstitución antes de uso en un líquido estéril apropiado.

Una vez formuladas, las composiciones de la invención se pueden administrar directamente al sujeto. Los sujetos que van a ser tratados pueden ser animales.

No obstante, en una o más modalidades las composiciones están adaptadas para administración a sujetos humanos.

De manera adecuada en formulaciones de acuerdo con la presente descripción, el pH de la formulación final no es similar al valor del punto isoeléctrico del anticuerpo, por ejemplo si el pH de la formulación es 7, entonces un pl de 8-9 o superior puede ser apropiado. Aunque no se desea unirse a teoría alguna, se considera que esto finalmente puede proporcionar una formulación final con estabilidad mejorada, por ejemplo el anticuerpo permanece en solución.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención se pueden administrar por cualquier número de vías que incluyen, pero que no se limitan oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutánea (véase, por ejemplo, WO98/20734), subcutánea, intraperitoneal , intranasal, enteral, tópica, sublingual, intravaginal o rectal. Las hipoaspersiones también se pueden utilizar para administrar las composiciones farmacéuticas de la invención. Típicamente, las composiciones terapéuticas se pueden preparar como materiales inyectables, ya sea soluciones o suspensiones líquidas. Las formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en vehículos líquidos antes de su inyección también se pueden preparar.

El suministro directo de las composiciones generalmente se llevará a cabo por inyección subcutánea, intraperitoneal , intravenosa o intramuscular o suministrado en el espacio intersticial de un tejido. Las composiciones también se pueden administrar en una lesión. El tratamiento de dosificación puede ser un protocolo de dosis única o un protocolo de dosis múltiple.

Se apreciará que el ingrediente activo en la composición será un anticuerpo. De esta manera, será susceptible de degradación en el tracto gastrointestinal. Por lo tanto, si la composición va a ser administrada por una vía utilizando el tracto gastrointestinal la composición necesitará contener agentes que protejan al anticuerpo de degradación pero que liberan al anticuerpo una vez que haya sido absorbido del tracto gastrointestinal.

Una discusión exhaustiva de los portadores farmacéuticamente aceptables está disponible en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishig Company, N.J. 1991).

En una modalidad la formulación se proporciona como una formulación para administraciones tópicas que incluyen inhalación.

Las preparaciones inhalables adecuadas incluyen polvos inhalables, aerosoles dosificados que contienen gases propelentes o soluciones inhalables libres de gases propelentes . Los polvos inhalables de acuerdo con la descripción que contiene la sustancia activa pueden consistir únicamente de las sustancias activas mencionadas antes o de una mezcla de las sustancias activas mencionadas antes con excipiente fisiológicamente aceptable.

Estos polvos inhalables pueden incluir monosacáridos (por ejemplo, glucosa o arabinosa) , disacáridos (por ejemplo, lactosa, sacarosa, maltosa) , oligo- y polisacáridos (por ejemplo, dextranos) , polialcoholes (por ejemplo, sorbitol, manitol, xilitol) , sales (por ejemplo, cloruro de sodio, carbonato de calcio) o mezclas de estos entre sí. Habitualmente se utilizan mono- o disacáridos, el uso de lactosa o glucosa, particularmente pero no de manera exclusiva en forma de sus hidratos.

Las partículas para deposición en el pulmón requieren un tamaño de partícula de menos de 10 micrómetros, tal como 1-9 micrómetros, por ejemplo de 0.1 a 5 µp?, en particular de 1 a 5 µ?t?. El tamaño de partícula del ingrediente activo (tal como el anticuerpo) es de importancia fundamental .

Los gases propelentes los cuales se pueden utilizar para preparar los aerosoles inhalables se conocen en el ámbito. Los gases propelentes adecuados se seleccionan de entre hidrocarburos tales como n-propano, n-butano o isobutano y halohidrocarburos tales como derivados clorados y/o fluorados de metano, etano, propano, butano, ciclopropano o ciclobutano. Los gases propelentes mencionados en lo anterior se pueden utilizar por si mismos o en mezclas de los mismos .

Los gases propelentes adecuados particularmente son derivados de alcano halogenados que se selecciona de entre TG 11, TG 12, TG 134a y TG 227. De los hidrocarburos halogenados mencionados antes, son particularmente adecuados TG134a (1, 1, 1, 2-tetrafluoroetano) y TG 227 (1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano) y mezclas de los mismos.

Los aerosoles inhalables que contienen gas propálente también pueden contener otros ingredientes tales como cosolventes, estabilizantes, agentes tensioactivos , antioxidantes, lubricantes y medios para ajustar el pH. Todos estos ingredientes se conocen en el ámbito.

Los aerosoles que contienen gas propelente de acuerdo con la invención pueden contener hasta 5% en peso de sustancia activa. Los aerosoles de acuerdo con la invención contienen, por ejemplo, 0.002 a 5% en peso, 0.01 a 3% en peso, 0.015 a 2% en peso, 0.1 a 2% en peso, 0.5 a 2% en peso o 0.5 a 1% en peso del ingrediente activo.

De manera alternativa a las. administraciones tópicas del pulmón también pueden ser por administración de una formulación líquida en solución o suspensión, por ejemplo utilizando un dispositivo tal como un nebulizador, por ejemplo un nebulizador conectado a un compresor (por ejemplo, el nebulizador Pari LC-Jet Plus (R) conectado a un compresor Pari Master(R) fabricado por Pari Respiratory Equipment, Inc . , Richmond, Va. ) .

El anticuerpo de la invención se puede suministrar dispersado en un solvente, por ejemplo en forma de una solución o una suspensión. Se puede suspender en una solución fisiológica apropiada, por ejemplo solución salina u otro solvente farmacológicamente aceptable o una solución amortiguadora. Las soluciones amortiguadoras conocidas en el ámbito pueden contener 0.05 mg a 0.15 mg de edetato disódico, 8.0 mg a 9.0 mg de NaCl, 0.15 mg a 0.25 mg de polisorbato, 0.25 mg a 0.30 mg de ácido cítrico anhidro y 0.45 mg a 0.55 mg de citrato de sodio por 1 mi de agua de manera que se obtenga un pH de aproximadamente 4.0 a 5.0. Una suspensión puede utilizar, por ejemplo, una molécula liofilizada.

Las formulaciones en suspensión o solución terapéuticas también pueden contener uno o más excipientes. Los excipientes son bien conocidos en el ámbito e incluyen amortiguadores (por ejemplo amortiguador de citrato, amortiguador de fosfato, amortiguador de acetato y amortiguador de bicarbonato), aminoácidos, urea, alcoholes, ácido ascórbico, fosfolípidos, proteínas (por ejemplo, albúmina sérica) , EDTA, cloruro de sodio, liposomas, manitol, sorbitol y glicerol. Las soluciones o suspensiones se pueden encapsular en liposomas o microesferas biodegradables . Las formulaciones generalmente se proporcionarán en una forma sustancialmente estéril utilizando procesos de manufactura estéril .

Estos pueden incluir producción y esterilización por filtración del solvente/solución amortiguado utilizado para la formulación, suspensión aséptica de la molécula en la solución de solvente amortiguado estéril y suministro de la formulación en receptáculos estériles por métodos familiares para aquellos habitualmente expertos en el ámbito.

La formulación nebulizable de acuerdo con la presente descripción de puede proporcionar, por ejemplo, como unidades de dosis única (por ejemplo recipientes o frascos de plástico sellados) empacados en envolturas de lámina delgada. Cada frasco contiene una dosis unitaria en un volumen, por ejemplo, 2 mi de solvente/amortiguador de solución.

El anticuerpo de la presente descripción se considera que es particularmente adecuado para suministro vía nebulización. 1 El término "que comprende" en el contexto de la presente especificación significa "que incluye".

Algunas modalidades de la invención técnicamente apropiadas se pueden combinar.

La invención ahora se describirá con referencia a los siguientes ejemplos los cuales son simplemente ilustrativos y de ninguna manera deben considerarse como limitantes del alcance de la presente invención.

EJEMPLOS 1 Mutagénesis de la cadena pesada IgG4 y generación de vectores de genes únicos de cadena pesada IgG4 mutados Se realizan las mutaciones de aminoácidos utilizando el kit QuickchangeMR Lightening Multi Site Directed Mutagénesis (SDM) o el kit QuickchangeMR II DSM (obtenido de StratageneMR) (números de catálogo 210516 y 200521, respectivamente) y se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Las mutaciones se verificaron por secuenciado de ADN. Las cadenas pesadas de IgG4 de por lo menos los anticuerpos 1 a 47 en la siguiente tabla se produjeron: Otros anticuerpos preparados se describen tabla 1 anterior.

La cadena pesada del anticuerpo 48 (SEQ ID NO: 35) se genera por PC y clonación con enzimas de restricción. El producto de PCR se genera por un oligonucleótido directo que codifica para la secuencia de la región de bisagra superior y de núcleo de IgGl y el sitio de restricción Bglll y el oligonucleótido inverso codifica para la enzima de restricción DarlII. El fragmento de PCR se digiere con las enzimas mencionadas en lo anterior y se liga en un vector de gel único hG4 que contiene la región variable apropiada. 2_. Expresión de los anticuerpos IgG4 mutados Todo el ADN mutante se transfecta en células CH0K1 0 CHO-SXE. Se resuspenden las células (2 x 1Q8 células/ml) en 1 mi de solución salina equilibrada de Earles (Sigma) y se mezcla con 400 µg de ADN (200 µg de ADN de cadena pesada y 200 µg de ADN de cadena ligera kappa) . Se transfieren alícuotas de 800 µ? a cubetas de 0.4 cm (Biorad) . Para un cultivo de 500 mi se someten a electroporación seis cubetas bajo los siguientes parámetros: 1 ms, 9.6 Amps; 10 ms , 0 Amps; 40 ms, 3.2 Amps. Las células transfectadas se incuban durante 24 h, agitando a 140 rpm en un ambiente humidificado con C02 5% a 37°C y se continúa desde el día 2 posterior a la transfección a 32°C durante 10-13 días. En el día 4 posterior a la transfección se agregan al cultivo 1.6 mi de butirato de sodio 1 M. Una vez que las células han alcanzado 40% de viabilidad o hasta el día 13, se cosecha el sobrenadante. Los cultivos se centrifugan durante 45 minutos a 4000 rpm. El sobrenadante se coloca a través de un filtro Stericup de 0.22 µ? (Millipore) para ser purificado. Los datos en la figura 28 muestran que los cambios en la termoestabilidad de IgG4 codificada por las mutaciones manipuladas son los mismos cuando la proteína se produce a partir de ya sea células CHO-Kl o CHO-SXE. 3_. Purificación de los anticuerpos IgG4 mutados Se purifican sobrenadantes (200-500 mi) utilizando una columna de proteína A de 5 mi HiTrap MabSelect SuRe (GE Healthcare, Amersham, Reino Unido) . Se preparan muestras al agregar i 5oésim del volumen sobrenadante de Tris/HCl 2 M, pH 8.5. Las muestras se cargan en la columna a 1 ml/min. La columna se lava con PBS, pH 7.4. Para eluir las muestras, se corre citrato de sodio 0.1 M, pH 3.4 a través de la columna a 1 ml/min y se recolectan fracciones de 0.5 mi.

Las fracciones con concentración máxima se neutralizan al agregar 0.125 mi de Tris-HCl 2 M, pH 8.5 a cada una. La detección por UV se establece en 280 nm. 4. Caracterización de los anticuerpos IgG4 mutados purificados Análisis SDS-PAGE: El sobrenadante crudo se centrífuga a 1200 rpm durante 5 min y se cuantifica en OCTET. Se preparan muestras de anticuerpo (25-30 ng) al agregar las cantidades apropiadas de anticuerpo, amortiguador de cargado 4x (Invitrogen) y 2 µ? de NEM 100 mM. Se constituye un volumen total de 20 µ? utilizando dH20. Las muestras después se someten a ebullición durante 3 minutos a 100°C y se cargan en un gel de Tris-glicina 4-20% de 1.5 mm de 15 pozos. Los geles se corren a 150 V durante 1.5 h en amortiguador Tank lx. Los anticuerpos se transfieren a una membrana de nitrocelulosa utilizando el sistema de transferencia seco iBlot ajustado para transferencia durante 8 minutos. Se incuba la membrana durante 1 h a temperatura ambiente (t.a.) en PBS-TM en una plataforma de agitación, seguido por incubación con anticuerpo de conejo anti Pe de IgG humana conjugada a HRP (Jackson Immunoreserch) o anticuerpo de chivo anti cadena ligera kappa humana conjugado a HRP (Bethyl) durante 1 h, agitando a t.a. Esto es seguido por 3 lavados de 5 minutos cada uno con PBS-T. . Las manchas se revelaron utilizando un kit de sustrato DAB mejorado con metal de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Pierce) .

Los resultados del análisis Western Blot se muestran en las figuras 7, 8, 9 y 10. En la figura 7 a la figura 10, H significa una cadena pesada y L una cadena ligera, H2L2 es una molécula de anticuerpo completa que comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras y HL es una semi-molécula que comprende una cadena pesada y una cadena ligera.

La figura 7 muestra el análisis Western Blot para anticuerpos 15, 16, 6, 7, 8, 17, .18, 19, 1, 2, 3, 12 y 13. Se puede observar de la figura 7 que los anticuerpos muestran un buen nivel de H2L2 excepto para el anticuerpo 8, el cual muestra nada o muy poco de H2L2 debido a la presencia de ambas mutaciones de bisagra C239S y C242S. No obstante, el anticuerpo 8 puede formar H2L2 por unión no covalente entre las cadenas pesadas. El mutante 3 también muestra poco H2L2, este mutante retiene C239 pero es incapaz de formar enlaces disulfuro intercadena pesada en la bisagra, debido probablemente a la formación eficiente de un enlace disulfuro entre la cisteína de la cadena ligera C-terminal (LC) y la bisagra C239. También se puede observar que los anticuerpos los cuales comprenden la mutación C239S pero no C242S (anticuerpos 2, 6 y 12) muestran formación reducida de HL en comparación con los anticuerpos los cuales no comprenden ni C239S ni C242S o anticuerpos los cuales comprenden C242S pero no C239S. El anticuerpo 16, el cual comprende la mutación S241P también muestra formación reducida de HL. Una comparación de los mutantes 2 y 3 muestra que la extensión del "alcance" de la cisteína C-terminal de la cadena ligera para formar un enlace disulfuro con la cadena pesada, parece que la cisteína de cadena ligera se une de manera más eficiente a C239 que a C242 en la cadena pesada.

La figura 8 muestra el análisis Western Blot para los anticuerpos 15, 6, 7, 8, 28, 29, 30, 31, 17, 19, 32, 33, 33, 34, 35, 36, 37, 38 y 39. Se puede observar en la figura 8 que los anticuerpos muestran un buen nivel de H2L2 excepto para los anticuerpos 8, 31, 35 y 39 los cuales muestran nulo o muy poco H2L2 debido a la presencia de mutaciones C239S y C242S en la región de bisagra y por lo tanto no se forman enlaces disulfuro entre las dos cadenas pesadas. No obstante, los anticuerpos 8, 31, 35 y 39 pueden formar H2L2 por unión no covalente entre las cadenas pesadas . También se puede observar que los anticuerpos los cuales comprenden la mutación C239S pero no C242S (anticuerpos 6, 29, 33 y 37) muestran una formación reducida de HL en comparación con los anticuerpos los cuales no comprenden C239S ni C242S o anticuerpos los cuales comprenden C242S pero no C239S. El mutante 15 es capaz de formar un enlace disulfuro entre la cadena ligera y G230C en CHl y disulfuros intercadena pesada, y por lo tanto resulta en una proteína completamente ensamblada y unida por disulfuro. Además, una comparación de IOS mutantes 15(C127S G230C) , 28 (C127S Y229C) , 32 (C127S K228C) y 36(C127S S227C) muestra que la posición de la cisteína introducida en la bisagra superior mejora la formación de enlace disulfuro LC-HC. G230 e Y229 son posiciones particularmente preferidas para introducir una cisteína. El mutante 28 (C127S Y229C) muestra un bajo nivel de HL y H2 y por lo tanto tiene baja heterogeneidad de unión disulfuro.

La figura 9 muestra el análisis Western Blot para anticuerpos 15, 6, 7, 8, 44, 45, 46, 47, 17 y 19. Se puede observar de la figura 9 que los anticuerpos muestran un buen nivel de H2L2 excepto para los anticuerpos 8 y 47 los cuales muestran nulo o muy poco H2L2 debido a la presencia de mutaciones C239S y C242S en la región de bisagra y por lo tanto no se forman enlaces disulfuro entre dos cadenas pesadas. No obstante, los anticuerpos 8 y 47 pueden formar H2L2 por unión no covalente entre las cadenas pesadas . También se puede observar que los anticuerpos los cuales comprenden la mutación C239S pero no C242S (anticuerpos 6 y 45) muestran formación reducida de HL en comparación con los anticuerpos los cuales no comprenden C239 ni C242S o anticuerpos los cuales comprenden C242S pero no C239S. En particular, el mutante 44 muestra que la inserción de tres aminoácidos en la bisagra superior también reduce la formación de HL y H2 y por lo tanto tiene niveles menores de heterogeneidad disulfuro en comparación con el mutante 15 comparable .

La figura 10 muestra el análisis Western Blot para los anticuerpos 48, 17, 18 y 19. Se puede observar de la figura 10 que el anticuerpo 48 muestra un buen nivel de H2L2 y muy poco HL. El mutante 48 contiene la secuencia de bisagra superior de IgGl EP SCDKTHT en lugar de la secuencia de bisagra superior IgG4 junto con una mutación S241P de bisagra de núcleo. Por lo tanto, el mutante 48 tiene la secuencia de bisagra superior e inferior EPKSCDKTHTCPPCP. El mutante 48 muestra niveles menores de heterogeneidad de unión disulfuro en comparación con el anticuerpo 17 de IgG4 natural y los bajos niveles equivalentes aproximadamente de heterogeneidad de enlace disulfuro en comparación con el mutante 18 S241P IgG4 y el anticuerpo 19 de IgGl natural.

Análisis Thermofluor: Se analizaron las termoestabilidades de los mAb purificados en un análisis Thermofluor utilizando SYPROMR Orange para monitorear los procesos de desnaturalización térmica de proteínas. Se agregan juntos 5 µ? de mAb y 1 mg/ml, 5 µ? de 30xdye y 40 µ? de PBS . Se suministran 10 µ? de la mezcla por cuadruplicado a una placa de pozo óptico 384 PCR y se corre en un sistema 7900HT Fast Real-Time PCR (Agilent Technologies UK Ltd, Wokingham Reino Unido) . Este sistema PCR contiene un dispositivo de calentamiento para control de temperatura preciso establecido en 20°C a 99°C un dispositivo acoplado y cargado monitorea simultáneamente los cambios de fluorescencia en los pozos.

La figura 11, la figura 12, la figura 13, la figura 14 y la figura 15 muestran los resultados del análisis de termoestabilidad de los mutantes de anticuerpo IgG4 en comparación con los anticuerpos IgGl e IgG4 naturales.

Una comparación del mutante 15 con lgG4 natural (mutante 17) muestra un incremento en Tm de Fab debido a una distribución disulfuro alterada. Una comparación del mutante 15 y 28 muestra una mejoría adicional en Tm de Fab para el mutante 28 que comprende la mutación Y229C en comparación con el mutante 15 que comprende la mutación G230C. Una comparación del mutante 15 y 44 muestra que la Tm de Fab de un mutante G230C puede aumentar adicionalmente por inserción de los tres aminoácidos en la bisagra superior. La comparación de los mutantes 15 y 18 muestra que la mutación de bisagra media S241P no incrementa la Tm de Fab aunque reduce de modo significativo la formación de HL. El mutante 48 también muestra una Tm de Fab mejorada significativamente cuando se compara con IgG4 natural (mutante 17) y el mutante 15.

La figura 15 muestra la clasificación general de las termoestabilidades de los mutantes IgG4 seleccionados de acuerdo con la presente invención. Los mutantes 48, 44, 44P, 46, 45, 6, 29, 30, 28, 28P, 31, 8, 47 y 15 muestran valores Tm de Fab significativamente mayores en comparación con IgG4 natural (mutante 17) y S241P de IgG4 natural (mutante 18) . Afinidad de anticuerpo: La afinidad de los anticuerpos de IgG4 mutantes seleccionados . de la presente invención con la citocina soluble objetivo se mide por BiacoreMR. El formato de análisis es captación de las IgG en una superficie anti-Fc seguido por titulación de citocina soluble.

Los resultados se muestran en la figura 16, en donde se puede observar que los anticuerpos mutantes muestran afinidad comparable hacia la citocina soluble en comparación con los anticuerpos naturales IgGl e IgG4 control.

El término "kd" (s"1) se refiere a la constante de velocidad de disociación de la interacción anticu-antígeno. Este valor también se denomina como el valor lnactlvaci5n.

El término "ka" (M"1 s"1) , como se utiliza en la presente, se refiere a la constante de velocidad de asociación de la interacción anticuerpo-antígeno.

El término "KD" (M) o "kd" ( M) , como se utiliza en la presente, se refiere a la constante de equilibrio de disociación de la interacción anticuerpo-antígeno.

Análisis de CLAP por exclusión de tamaño (SEC, por sus siglas en inglés) : Aproximadamente 50 µg de anticuerpo purificado se corren en CLAR utilizando una columna S200. Se utilizan los Abs 1 a 19 para el análisis. Este resultado muestra que H2L2 asociado de manera no covalente se forma pese a las alteraciones a las distribuciones de DSB de la molécula de IgG4 humana .

Los resultados del análisis de CLAR se muestran en la figura 17.

Longitudes separadores de bisagras superior alternativas Los separadores de polialanina de entre 1 y 5 aminoácidos de longitud se insertan entre PP y CPSP, es decir, en la ubicación indicada como "A", ESKYCPPACPSPA. La figura 18 muestra que la inserción de cualquier longitud de separador es suficiente para reducir la cantidad de formación de H2 o L2 en el mutante 15. No obstante, las longitudes de inserción de 3 o más aminoácidos parecen ofrecer el incremento más grande en la termoestabilidad. Es de notar que la inserción de 3 aminoácidos imita de manera más cercana a la diferencia entre la longitud de bisagra superior entre IgGl e IgG4.

Composición de aminoácidos separador de bisagra superior alternativo Con el fin de explorar si las inserciones de tri-alanina en ESKYCPPACPSPA tienen propiedades especiales como separadores de bisagra superior, se probaron otras dos inserciones de triaminoácidos : GGG t THT. La figura 19 muestra que tanto GGG como THT son funcionales como regiones separadoras aunque los resultados sugieren que no son idénticas . GGG parece ser menos capaz que AAA o THT en reducir la formación de H2 y L2. El incremento en la termoestabilidad para GGG y THT no es tán grande como la que se observa con AAA.

Longitud y composición de aminoácidos del separador de bisagra superior alternativo IgG4 tiene un "separador" de 2 aminoácidos (PP) entre la cisteína intercadena CH1 y la primera cisteína de bisagra de núcleo, mientras que IgGl tiene un separador de 5 aminoácidos DKTHT. Se construyeron cuatro mutantes (68, 67, 66 y 56) para habilitar una comparación contra el imitante 15 (ESKYCPPCPSCP) . En primer lugar, el separador PP de IgG4 se sustituye con un separador DK de longitud igual al encontrado en IgGl; el mutante 68 (ESKYCDKCPSCP) y después por incremento de un aminoácido para imitar el separador de bisagra superior de IgGl: mutante 67 (ESKYCDKTCPSCP) mutante 66 (ESKYCDKTHCPSCP) mutante 56 (ESKYCDKTHTCPSCP) .

Los datos en la figura 21 sugieren que el único cambio más importante es de PP a DK, lo que resulta en una reducción en la formación de H2, H y L en relación al mutante 15. Las longitudes en aumento de la inserción de separador similar a IgGl adicionales (T, TH y THT) parecen lleva a cabo una reducción de incremento mínimo en H2 pero han resultado en un incremento aumentado adicional en la formación de HL. Puesto que los mutantes 68, 67, 66 y 56 contienen una secuencia de bisagra de núcleo CPSC, el incremento en la formación de HL se puede evidenciar para los separadores que son más efectivos en aislar las cisteínas de enlace disulfuro intercadena LC-HC alejándose de ls cisteínas de bisagra de núcleo y por lo tanto susceptibles a formación de enlaces disulfuro intramoleculares .

Los datos en la figura 22 sugieren que DK es preferible a PP como una elección de un separador de 2 aminoácidos en términos de reducir la heterogeneidad de isoforma disulfuro, compárese los mutantes 15 (ESKYCPPCPSCP) y 68 (ESKYCDKCPSCP) y los mutantes 55 (ESKYCPPTHTCPSCP) y 56 (ESKYCDKTHTCPSCP) . Los motivos de poli-prolina cortos tales como PP se sabe que son capaces de codificar para cierto nivel de giro de hélice potencial el cual puede resultar en una yuxtaposición local de LC-HC y cisteínas de bisagra de núcleo. Este efecto local parece ser superado mejor por una AAA adicional, como se observa en el mutante 44 (ESKYCPPAAACPSCP) . Ninguno de los mutantes 68, 55, 56, 44 o 69 parece tener termoestabilidades significativamente diferentes.

Influencia de la composición de secuencia de bisagra superior sin separador Con el fin de comprender la influencia de la composición de secuencia de la secuencia de bisagra superior N-terminal de la cisteína CH1 ínter LC-HC (ESKY en IgG4 y EPKS en IgGl) todas las permutaciones del mutante se realizaron en el contexto del mutante 15 (ESKYCPPCPSCP) . Los datos en la figura 23 muestran que en el contexto de un separador PP, ninguna de las permutaciones de la composición de bisagra superior parecen afectar significativamente la heterogeneidad de la isoforma disulfuro. Los datos mostrados en lo anterior sugieren que esta carencia de efecto se debe principalmente a proteínas que contienen un separador PP corto y un motivo de bisagra de núcleo capaz de formación de enlace disulfuro intramolecular. No obstante se observan diferencias significativas en la termoestabilidad. Ambas de las secuencias evolucionadas de modo natural: ESKP (83.8°C) y EPKS (80.6°C) son más estables que cualquiera de las secuencias híbridas; EPKY (76.3°C) y ESPK (79.0°C). Los datos muestran que la secuencia EPKS de IgGl es la más preferible.

Con el fin de comprender la importancia de los motivos de bisagra superiores ESKY o EPKS en el contexto de la región separadora DKTHT más preferible se realizaron todas las permutaciones. Los datos en la figura 24 muestran que el motivo ESKY de IgG4 natural (mutante 56, ESKYCDKTHTCPSCP) es el más susceptible a heterogeneidad de isoforma disulfuro. Los datos en la figura 24 confirman que la secuencia de bisagra superior IgGl natural (mutante 65, (EPKSCDKTHTCPSCP) tiene un potencial mínimo para heterogeneidad de la isoforma disulfuro y tiene una alta termoestabilidad.

Influencia del cambio Ser a Pro en la bisagra de núcleo Un mutante 48, más preferido (EPKSCDKTHTCPPCP) se somete a mutación con el fin de reintroducir la bisagra de núcleo IgG4 natural Ser (Ser241, por numeración de Kabat) lo que resulta en el mutante 65 (EPKSCDKTHTCPSCP) . Los datos en la figura 20 confirman que el mutante 48 tiene niveles reducidos de manera muy significativa de H2, HL, H y L en comparación con el mutante 15 (ESKYCPPCPSCP) y una termoestabilidad incrementada de manera muy significativa. La reintroducción de la bisagra de núcleo Ser241 (mutante 65) no afecta la termoestabilidad en relación al mutante 48 pero resulta en la aparición de niveles significativos de HL. Es de notar que el mutante 65 aún tiene menos H2, H y L que el- mutante 15 lo que ilustra la importancia de la longitud de secuencia de bisagra superior y la composición con respecto a la homogeneidad de la isoforma disulfuro.

Análisis de la función efectora de anticuerpo por lisis celular Las células objetivo que expresan el antígeno de superficie celular tienen sus contenidos intracelulares marcados por incubación con el ligando mej orador de fluorescencia BADTA. BADTA se convierte dentro de una célula a un ligando hidrofílico, TDA. Las células marcadas se incuban con anticuerpo y PBMC (siglas en inglés para células mononucleares de sangre periférica) como agentes líticos. Ante la lisis de células, en este ejemplo por ADCC, se libera TDA y forma un quelato fluorescente y estable, EuTDA cuando se agrega europio a los cultivos de células. En ausencia, el marcado con BADTA de contenidos celulares habilita la cuantificación de lisis celular. La lisis celular a su vez proporciona una medida de la presencia de funciones efectoras en una IgG. Las figuras 25 y 26 intentan lisar células con IgG4 por ADCC. Se elabora un análogo del anticuerpo de herceptina ( trastuzumab) tanto con igGl natural como con IgG4 natural. El antígeno Her-2 para herceptina se expresa en células MCF7 y SKBR3. Los mutantes del análogo de herceptina IgG también se generaron y se purificó IgG para uso en el análisis de ADCC. Se sabe que IgG4 tiene muy poca capacidad para realizar ADCC como se confirma por la diferencia entre la IgGl natural (wt, por sus siglas en inglés) control y la IgG4 natural (wt) . Esta carencia de potencial ADCC innato potencial no es afectada por algunos de los cuatro mutantes IgG4 probados. De manera notable, estos incluyen a los mutantes 28, 44 y 48 los cuales tienen arreglos de enlace disulfuro LC-HC intercadena alterados y de manera más notable el mutante 48 (EPKSCDKTHTCPPCP) el cual contiene los motivos de bisagra superior y de núcleo de IgGl . Por lo tanto, estos datos muestran que los mutantes descritos no adquieren funciones efectoras a través del uso de las secuencias de bisagra superior y de núcleo IgGl.

Aplicabilidad amplia de mutantes a anticuerpos IgG4 Todos los datos descritos hasta ahora son para el anticuerpo IgG4 registrado UCB particular, Ab 410. Con el fin de demostrar que las mejoras en la heterogeneidad de isoforma disulfuro y la termoestabilidad no son únicas a la estructura/estabilidad codificada de la región variable de la IgG, se generaron ejemplos de otras IgG4. Se utilizó la información de secuencia disponible públicamente para crear análogos de IgG4 de tres IgG industrialmente relevantes: Trastuzumab (herceptina) , Natalizumab (Tysabri) y Tociluzumanb (Actemra) . Colectivamente, los datos se muestran en las figuras 28 a 33 y demuestran que el desempeño relativo de los mutantes claves de IgG4 son altamente similares a todos los ejemplos de IgG4, tanto en términos de homogeneidad de isoforma disulfuro como en la termoestabilidad relativa. Las estabilidades absolutas de los ejemplos difieren entre si de la manera esperada a partir de observaciones publicadas previas respecto a la diferencia de estabilidades inherentes de las IgG. Estos datos sugieren que los mutantes descritos son capaces de mejorar la homogeneidad de isoforma disulfuro e incrementar la termoestabilidad en todas las moléculas IgG4.

Efecto de mutantes de IgG4 sobre consideraciones prácticas: expresión en células hospedadoras Los mutantes descritos tienen una homogeneidad de isoforma disulfuro mejorada y termoestabilidad aumentada en una gama de moléculas de IgG4. Los datos en la figura 27 muestran que estos mutantes no tienen incidencia negativa en la expresión de IgG4. Los datos de expresión mostrados son la media de expresión para cada mutante expresado transitoriamente a partir de células CHO para cada una de las cuatro especificidades de antígeno descritas: Ab41Q, y análogos de Trastuzumab, Natalizumab y Tocilizumab. Estos datos sugieren que la arquitectura disulfuro intercadena del brazo Fab y las secuencias de bisagra superiores y núcleo no son determinantes primarios del rendimiento a partir de las células CHO. Los datos en la figura 31 muestran que la termoestabilidad de Ab410 es la misma si los mutantes se expresan en células CHO-K1 o CHO-SXE. Estos datos soportan que las mutaciones de la arquitectura disulfuro intercadena del brazo Fab de IgG y las secuencias de bisagra superior y de núcleo son los determinantes principales de termoestabilidad mejorada.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (29)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un anticuerpo de la clase IgG4 que comprende por lo menos una cadena pesada la cual comprende un dominio CH1 y una región de bisagra, caracterÍ2ado porque en cada cadena pesada: a. una cisteína intercadena en la posición 127, numerada de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, en el dominio CH1 está sustituida con otro aminoácido; y b. uno o más de los aminoácidos colocados en la región de bisagra superior están sustituidos con cisteína.

2. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque uno o más aminoácidos colocados en la región de bisagra superior los cuales están sustituidos con cisteína se seleccionan de 227, 228, 229 y 230, numerado de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat.

3. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la glicina en la posición 230, numerada de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, está sustituida con cisteína.

4. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la tirosina en la posición 229, numerada de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, está sustituida con cisteína.

5. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la lisina en la posición 228, numerada de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, está sustituida con cisteína.

6. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la serina en la posición 227, numerada de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, está sustituida con cisteína.

7. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la cisteína en la posición 239 y la cisteína en la posición 242, numerada de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, en la cadena pesada, está sustituida con otro aminoácido.

8. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la cisteína en la posición 239, numerada de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, en la cadena pesada, está sustituida con otro aminoácido.

9. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la cisteína en la posición 242, numerada de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, en la cadena pesada está sustituida con otro aminoácido.

10. Un anticuerpo de la clase IgG4 que comprende por lo menos una cadena pesada la cual comprende un dominio CH1 y una región de bisagra, caracterizado porque en cada cadena pesada: a. la cisteína intercadena en la posición 127, numerada de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, está sustituida con otro aminoácido; y b. la cisteína en la posición 239 o la cisteína en la posición 242, numerada de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, está sustituida con otro aminoácido.

11. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, caracterizado porque la cisteína en la posición 239 y/o la cisteína en la posición 242 está sustituida por un aminoácido que no contiene tiol.

12. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el aminoácido que no contiene tiol es serina.

13. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la cisteína en la posición 127 está sustituido por un aminoácido que no contiene tiol.

14. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el aminoácido que no contiene tiol es serina.

15. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la cadena pesada se muta para insertar los tres aminoácidos entre los aminoácidos 226-243, numerados de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat.

16. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la cadena pesada está mutada para insertar tres aminoácidos entre las posiciones 238 y 239, numerados de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat .

17. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque las tres alaninas se insertan entre las posiciones 238 y 239, numerados de acuerdó con el sistema de numeración de Kabat.

18. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque una treonina, una histidina y una treonina adicional se insertan entre las posiciones 238 y 239, numeradas de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat.

19. El anticuerpo de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque la serina en la posición 241, numerada de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, está sustituida con prolina.

20. El anticuerpo de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque la glicina en la posición 230 está sustituida con cisteína, la serina en la posición 227 está sustituida con prolina, la tirosina en la posición 229 está sustituida con serina, la prolina en la posición 237 está sustituida con ácido aspártico, la prolina en la posición 238 está sustituida con lisina, la secuencia de aminoácidos treonina-histidina-treonina se inserta entre las posiciones 238 y 239 y la serina en la posición 241 está sustituida con prolina.

21. El anticuerpo de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque la cadena pesada comprende un dominio CH2 y un dominio CH3.

22. El anticuerpo de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque comprende dos cadenas pesadas de conformidad con cualquier reivindicación precedente .

23. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque las cadenas pesadas son idénticas.

24. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, caracterizado porque la cadena pesada o cada cadena pesada comprende una región de bisagra superior y una región de núcleo de una longitud de 12 a 17 aminoácidos .

25. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la región de bisagra superior y núcleo es de una longitud de 15 aminoácidos.

26. Un vector, de expresión caracterizado porque comprende una secuencia la cual codifica para un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25.

27. Una célula hospedadora, caracterizada porque comprende un vector de conformidad con la reivindicación 26.

28. Un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, para usarse en la manufactura de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno .

29. Un anticuerpo IgG4 caracterizado porque comprende una cadena pesada con una bisagra superior, un núcleo y una bisagra inferior, en donde la bisagra superior y el núcleo en la cadena pesada o en cada cadena pesada en la misma tiene una longitud de 12 a 17, tal como 15 aminoácidos.