KR20130099950A - 클래스 ｉｇｇ４의 개선된 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 CH1 도메인 및 힌지 영역을 포함하는 하나 이상의 중쇄를 포함하는 클래스 IgG4의 항체로서, 이 때 각각의 중쇄에서:
a. CH1 도메인에서 케이뱃 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 위치 127의 사슬간(inter-chain) 시스테인이 또 다른 아미노산으로 치환되고;
b. 상부 힌지 영역에 정위된 아미노산들 중 하나 이상이 시스테인으로 치환되는 클래스 IgG4의 항체를 제공한다.

Description

클래스 ＩＧＧ４의 개선된 항체{IMPROVED ANTIBODIES OF THE CLASS IGG4}
본 발명은 야생형 항체에 비해 변경된 이황화 결합의 배열을 갖는 개선된 항체 및 상기 개선된 항체를 생산하는 방법에 관한 것이다.
재조합 단백질, 모노클로날 항체 (mAb) 및 핵산-기반 약물을 포함하는 생물약제학 산업은 빠르게 성장하고 있다. 항체 공학처리는 항체 단편 또는 대안적인 포맷의 설계 및 생산을 이끌었다. 생산 수율, 단백질 품질 및 저장 안정성과 같은 다른 양태와 함께 바람직한 분자 포맷이 항체-기반 단백질을 치료제로서 선택할 때 참작된다.
모든 면역글로불린 (Ig) 분자의 기본 구조는 이황화 결합에 의해 커플링된 두 개의 동일한 중쇄 (HC) 및 두 개의 동일한 경쇄 (LC)를 포함한다. 각각의 LC는 가변 (VL) 및 불변 도메인 (CL)으로 구성된다. HC에 기반하여, 5개의 주요 Ig 클래스가 인지된다: IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM. IgG의 경우, HC는 한 개의 가변 도메인 (VH) 및 세 개의 불변 도메인 (CH1-3)으로 구성된다. CH2 및 CH3 도메인은 이펙터(effector) 기능을 자극하는 원인이 되고 IgG 분자에 가요성을 부여하는 힌지 영역에 의해 Fab 단편 (VHVL 및 CHCL)에 연결된 분자의 Fc 부분을 형성한다. 두 개의 항원 인지 부위가 VL 및 VH 도메인의 끝에 위치한다. IgG는 4개의 상이한 아이소형: IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 추가로 세분된다.
Fc-매개된 이펙터 기능, 즉, 항체 의존성 세포독성 (ADCC) 또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)은 아이소형 의존성이다. 각각의 아이소형은 신체내에서 특수한 기능을 수행하도록 발달되었다. IgG1 아이소형은 그 연장된 반감기, 향상된 ADCC 활성화 및 보체 활성화로 인해 현재 가장 광범하게 치료제로서 이용된다. 그 밖의 아이소형이 표적 및 요망되는 효과에 따라 치료제로서 고려된다. 예를 들어, 표적 항원이 간단히 중화되어야 하고 이펙터 기능이 덜 중요할 때, IgG2 및 IgG4와 같은 대안적인 아이소형이 이용될 수 있다. 대안적으로, 재공학처리된 Fc/이펙터 기능을 갖는 IgG가 고려될 수 있다.
IgG2가 또한 극미한 관련 이펙터 기능을 갖지만 완전히 이해되지 않은 이합체화의 경향이 있다. IgG4는 그 이펙터 기능 유도의 상대적인 부족으로 인해 유용한 아이소형으로 남아 있다. 그러나, IgG4는 또한 몇몇 고유의 실질적인 곤란성, 즉 그 하프(half) 항체를 형성하는 경향, 하프 분자를 교환하는 능력 및 짧은 혈청 반감기를 갖는다.
시험관내에서, IgG4 분자는 원형의 IgG 구조에 따르나, 생체내에서 이들은 힌지내에서 중쇄내 이황화 결합의 형성으로 야기된 단일 경쇄 및 단일 중쇄를 각각 포함하는 하프-분자를 형성하는 것으로 관찰되었다. 많은 비율의 순환하는 IgG4는 이중특이적이나 기능적으로 일가인 것으로 관찰되었다. 이는 하프-분자가 다른 IgG4 하프-분자와 IgG4를 형성할 수 있기 때문이다 (Schuurman,J., Van Ree,R., Perdok,G.J., Van Doorn,H.R., Tan,K.Y., Aalberse,R.C., 1999. Normal human immunoglobulin G4 is bispecific: it has two different antigen-combining sites. Immunology 97, 693-698).
IgG4의 하프 분자의 형성은 힌지의 위치 241 (케이뱃 넘버링 시스템에 따라 넘버링됨)에 Ser에서 Pro으로의 돌연변이를 도입시킴에 의해 감소될 수 있다 (Angal,S. et al., 1993. A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human (IgG4) antiboty. Mol Immunol 30, 105-108). 또한, 이러한 점 돌연변이는 IgG4의 치밀 구조에 영향을 미치지 않으므로 IgG4로 하여금 보체를 활성화하는 그 감소된 능력을 보유하게 한다.
S241P 돌연변이의 발견 이후에, IgG4 항체의 중쇄간(inter-heavy chain) 상호작용을 이해하고, IgG4 이펙터 기능을 감소시키고 구조적 안정성을 향상시키기 위해 IgG4에 대한 추가의 돌연변이가 연구되었다. 문헌[Schuurman et al.](Schuurman,J et al., 2001. The inter-heavy chain disulphide bonds of IgG4 are in equilibrium with intra-chain disulphide bonds. Molecular Immunology 38, 1-8)에서, 관찰된 IgG4의 중쇄간 이황화 결합의 불안정성을 IgG4 돌연변이체를 이용하여 조사하였다. 돌연변이체 M1에서 중쇄-경쇄간 (CL-CH1) 이황화 결합과 관련된 Cys 131 (EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링, 혹은 케이뱃 넘버링 시스템에 따르면 Cys 127)을 세린으로 대체하였고, 이러한 돌연변이체는 경쇄의 이합체 및 중쇄의 이합체를 형성시키는 것으로 나타났다. 돌연변이체 M2에서, 힌지의 중쇄간 이황화 결합과 관련된 시스테인 226 (EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 226, 혹은 케이뱃 넘버링 시스템에 따르면 239)을 세린으로 대체하였고, 이러한 돌연변이체는 IgG4에 비해 더욱 안정한 중쇄간 연결을 지니고 중쇄내 이황화 결합의 형성을 막는 것으로 나타났다.
IgG4 항체의 응집물 형성을 감소시키기 위해 IgG4 항체의 CH2 및 CH3 도메인에서의 돌연변이를 또한 조사하였다. 문헌[US 2008/0063635 Takahashi et al.]은 CH3 도메인에서 위치 409 (EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 409, 혹은 케이뱃 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는 경우 440)의 아르기닌을 리신, 트레오닌, 메티오닌 또는 류신으로 치환시켜 낮은 pH에서 응집물 형성을 억제하는 IgG4의 돌연변이체를 연구하였다. CDC 활성을 약독화시키기 위해 L235, D265, D270, K322, P329 및 P331 (EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 L235, D265, D270, K322, P329 및 P331, 혹은 케이뱃 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는 경우 L248, D278, D283, K341, P348 및 P350)에서의 추가의 돌연변이가 또한 교시된다. 문헌[WO2008/145142 Van de Winkel et al.]은 심지어 힌지 영역에서 S228P (EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 S228, 혹은 케이뱃 넘버링 시스템에 따르면 S241) 돌연변이의 부재시에도 위치 409에서 아르기닌 잔기, 위치 405에서 Phe 잔기 또는 위치 370에서 Lys (EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 R409, F405 및 K370, 혹은 케이뱃 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는 경우 R440, F436 및 K393)의 치환에 의해 Fab-아암(arm) 교환을 진행하는 능력이 감소된 안정한 IgG4 항체를 기재한다.
항체의 힌지 영역에 존재하는 시스테인 잔기의 수의 변화가 미리 조사되었다. 문헌[US 5677425 Bodmer et al.]은 이펙터 또는 리포터 분자를 부착시키기 위한 시스테인 티올기의 이용을 촉진하기 위해 힌지 영역에서 시스테인 잔기의 수가 증가될 수 있음을 기재한다. US 5677425호는 또한 항체 분자의 어셈블리를 촉진시키기 위해 힌지 영역에서 시스테인 잔기의 수가 감소될 수 있음을 기재하는데, 그 이유는 힌지 영역을 또 다른 힌지 영역 또는 이펙터 또는 리포터 분자에 부착시키기 위한 특수한 표적을 제공할, 단일 이황화 결합을 형성하는 것만이 필요할 것이기 때문이다.
그러나, 새로운 항체를 치료제로서 사용하기에 실로 더욱 적합하게 하는 개선된 특징을 갖는 새로운 항체의 제공에 대한 요구가 여전히 존재한다. 본 발명은 야생형 항체에 비해 개선된 생물물리학적 성질을 포함하는 유리한 특징을 갖는 새로운 돌연변이체 항체를 제공한다. 특히, 놀랍게도 경쇄의 시스테인과 이황화 결합을 형성하는 IgG4 항체의 중쇄에서의 시스테인 잔기의 위치의 변형이 야생형 IgG4 항체에 비해 개선된 안정성을 갖는 IgG4 항체를 제공한다는 것이 발견되었다.
발명의 개요
일 양태에서, 본 발명은 CH1 도메인 및 힌지 영역을 포함하는 하나 이상의 중쇄를 포함하는 클래스 IgG4의 항체를 제공하며, 이 때 각각의 중쇄에서:
a. CH1 도메인에서 케이뱃 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 위치 127의 사슬간(inter-chain) 시스테인은 또 다른 아미노산으로 치환되고;
b. 상부 힌지 영역에 정위된 아미노산들 중 하나 이상은 시스테인으로 치환된다.
경쇄의 시스테인과 사슬간 이황화 결합을 형성하는 CH1 도메인의 시스테인은 케이뱃 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 위치 127의 시스테인이고, 이는 도 1b에 도시되어 있다.
IgG4 불변 영역에서 이황화 결합의 위치를 변경시켜 Fab 도메인에 대해 더 높은 Tm이 관찰되게 한다. 단백질의 50%가 언폴딩되는 온도를 Tm으로 지정한다. 실험상, Tm은, 예를 들어 형광-대-온도 곡선의 변곡점 (즉, 형광-대-온도 곡선이 가장 가파른 온도)으로서 결정된다.
따라서, 보다 높은 Tm은 더 높은 열 안정성을 나타낸다. 이런 식으로, 본 발명의 분자는 높은 열 안정성을 갖는다.
이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, 이는 이황화 결합 또는 수득된 폴리펩티드 분자에서 스트레인 또는 내부 장력이 감소한 결과일 수 있다.
추가 변형을 IgG4 불변 영역에 도입시킴에 의해 열 안정성에서의 추가 개선이 또한 얻어질 수 있다.
시스테인으로 치환된 상부 힌지 영역에 정위된 하나 이상의 아미노산은 도 1b에 도시된 대로 케이뱃 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 226, 227, 228, 229, 230, 237 및 238으로부터 선택될 수 있다 (상부 힌지 영역에서 밑줄로 표시된 아미노산).
바람직한 구체예에서, 시스테인으로 치환된 상부 힌지 영역에 정위된 하나 이상의 아미노산은 도 1b 및 2a에 도시된 대로 케이뱃 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 227, 228, 229 및 230으로부터 선택된 위치에 있는 아미노산들 중 하나 이상이다. 이어서 후자의 배열에서 사슬간 (경쇄-중쇄) 이황화 결합은 IgG1 불변 영역에서 발견된 이황화 연결과 유사한 위치에 형성된다.
본 발명자들은 IgG1이 Fab 및 Fc 도메인에서 IgG4 분자보다 높은 열 안정성을 지님을 확인하였다. 그러나, 본 발명은 ADCC 이펙터 기능은 없으나 IgG1 분자와 같은 열 안정성 및/또는 그 밖의 유리한 성질을 갖는 IgG4 분자의 제공을 가능하게 한다.
형성된 IgG4 분자에서 Fab 도메인의 안정성에 영향을 주는 세 가지 일반적인 양태가 있는 것으로 보인다. 첫 번째는 이황화 다리의 위치이다. 두 번째는 이황화 다리에 인접한 환경, 즉 이황화 결합 주위에 있는 잔기의 특성이고, 세 번째는 상부 힌지 영역의 길이이다.
따라서, 본 발명은 또한 상부 힌지, 코어 및 하부 힌지를 포함하는 IgG4 항체를 제공하고, 그 안에 있는 중쇄 또는 각각의 중쇄에서 상기 상부 힌지 및 코어의 길이는 13 내지 17개, 예컨대 15개의 아미노산이다.
일 구체예에서, IgG4 항체는 15개 아미노산의 길이인 상부 힌지 및 코어를 갖는다.
일 구체예에서, 상부 힌지 및 코어는 IgG4 힌지에서 발견되는 천연의 12개 아미노산 및 추가로 세 개의 아미노산, 예를 들어 3개의 알라닌 잔기 또는 3개의 글리신 잔기 또는 이의 조합을 포함한다.
일 구체예에서, 힌지는 하기 서열들 중 하나를 갖는다:
Figure pct00001
Figure pct00002
일 구체예에서, 본 발명의 IgG4 분자의 상부 힌지 및 코어는 천연 IgG1 힌지, 즉
Figure pct00003
또는 하기와 같은 이의 유도체로 구성된다:
Figure pct00004
추가의 양태에서, 본 발명은 CH1 도메인 및 힌지 영역을 포함하는 하나 이상의 중쇄를 포함하는 클래스 IgG4의 항체를 제공하고, 이 때 각각의 중쇄에서:
CH1 도메인에서 케이뱃 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 위치 127의 사슬간 시스테인은 또 다른 아미노산으로 치환되고;
그 안에 있는 중쇄 또는 각각의 중쇄에서의 힌지는 15개의 아미노산 길이이다.
적합한 힌지는 상기 기재되어 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 또한 CH1 도메인 및 힌지 영역을 포함하는 하나 이상의 중쇄를 포함하는 클래스 IgG4의 항체를 제공하고, 이 때 각각의 중쇄에서:
a. 케이뱃 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 위치 127의 시스테인은 또 다른 아미노산으로 치환되고;
b. 케이뱃 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 위치 239의 시스테인 또는 위치 242의 시스테인은 또 다른 아미노산으로 치환된다.
일 구체예에서, 본 발명의 나중 양태에 따르면, IgG4 분자는 또한, 예를 들어 상기 기재된 대로 힌지에 22개의 아미노산을 함유한다.
본 발명에 의해 제공된 항체는 야생형 IgG4 항체에 비해 유리한 특징을 나타낸다. 놀랍게도 본 발명의 항체는 야생형 IgG4 항체에 비해 특히 Fab 도메인의 개선된 열 안정성을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
추가 양태에서, 본 발명은 또한 CH1 도메인 및 힌지 영역을 포함하는 하나 이상의 중쇄를 포함하는 클래스 IgG3의 항체를 제공하고, 이 때 각각의 중쇄에서:
a. 경쇄의 시스테인과 사슬간 이황화 결합을 형성하는 CH1 도메인의 시스테인은 또 다른 아미노산으로 치환되고;
b. 상부 힌지 영역에 정위된 아미노산들 중 하나 이상은 시스테인으로 치환된다.
추가 양태에서, 본 발명은 CH1 도메인 및 CH2 도메인을 포함하는 하나 이상의 중쇄를 포함하는 클래스 IgM의 항체를 제공하고, 이 때 각각의 중쇄에서:
a. 경쇄의 시스테인과 사슬간 이황화 결합을 형성하는 CH1 도메인의 시스테인은 또 다른 아미노산으로 치환되고;
b. CH1 도메인 또는 CH2 도메인에 정위된 아미노산들 중 하나 이상은 시스테인으로 치환된다.
추가 양태에서, 본 발명은 CH1 도메인 및 힌지 영역을 포함하는 하나 이상의 중쇄를 포함하는 클래스 IgD의 항체를 제공하고, 이 때 각각의 중쇄에서:
a. 경쇄의 시스테인과 사슬간 이황화 결합을 형성하는 CH1 도메인의 시스테인은 또 다른 아미노산으로 치환되고;
b. 힌지 영역에 정위된 아미노산들 중 하나 이상은 시스테인으로 치환된다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체를 엔코딩하는 서열을 포함하는 발현 벡터 및 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 질환 또는 질병의 치료에 사용하기 위한 상기 정의된 항체를 제공한다. 상기 정의된 치료적 유효량의 항체를 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 질병을 치료하는 방법이 추가로 제공된다.
일 구체예에서, 항체는 암 이외의 질병을 치료하는데 사용하기 위한 것이다.
도 1a는 IgG1 야생형 및 IgG4 야생형의 인간 CH1 및 힌지 서열 (여기서 힌지 잔기는 밑줄로 표시됨), 및 카파 경쇄 불변 서열을 도시한다.
도 1b는,
사슬간 CL-CH1 이황화 결합을 형성하는 시스테인 (밑줄로 표시됨)을 나타내는 인간 카파 경쇄 불변 서열;
인간 IgG 1, 2, 3 및 4 중쇄 N-말단 CH1 잔기 및 힌지 영역 서열 (여기서 사슬간 CL-CH1 이황화 결합을 형성하는 시스테인 위치 (IgG1의 경우 상부 힌지 및 IgG 2, 3 및 4의 경우 N-말단 CH1에서)가 표시된다(밑줄로 표시됨));
인간 IgD 중쇄 N-말단 CH1 잔기 및 힌지 영역 서열의 일부 (여기서 사슬간 CL-CH1 이황화 결합을 형성하는 N-말단 CH1 서열에서의 시스테인 위치가 표시된다(밑줄로 표시됨));
인간 IgM 중쇄 N-말단 CH1, C-말단 CH1 잔기 및 선택된 N-말단 CH2 잔기 (여기서 사슬간 CL-CH1 이황화 결합을 형성하는 N-말단 CH1에서의 시스테인 위치가 표시된다(밑줄로 표시됨));
IgG3 및 IgG4의 상부 힌지, IgD의 힌지 및 IgM의 C-말단 CH1 및 CH2에서의 잔기 (여기서 밑줄친 잔기는 본 발명의 항체에서 하나 이상의 잔기가 시스테인으로 치환될 수 있는 위치를 나타냄)를 도시한다.
도 2a는 경쇄의 시스테인과 사슬간 이황화 결합을 형성하는 CH1 시스테인 잔기 (C127) 및 IgG1 야생형, IgG4 야생형의 상부 및 코어 힌지 잔기 및 본 발명의 IgG4 항체 코어에서 돌연변이가 도입된 위치를 도시한다.
도 2b는 경쇄의 시스테인과 사슬간 이황화 결합을 형성는 CH1 시스테인 잔기 (C127) 및 IgG3 야생형의 힌지 잔기 및 본 발명의 IgG3 항체에서 하나 이상의 잔기가 시스테인으로 치환되는 위치를 도시한다.
도 2c는 경쇄의 시스테인과 사슬간 이황화 결합을 형성하는 CH1 시스테인 잔기 (C127) 및 IgM 야생형의 선택된 CH1 및 CH2 잔기 및 본 발명의 IgM 항체에서 하나 이상의 잔기가 시스테인으로 치환되는 위치를 도시한다.
도 2d는 경쇄의 시스테인과 사슬간 이황화 결합을 형성하는 CH1 시스테인 잔기 (C128) 및 IgD 야생형의 힌지 잔기 및 본 발명의 IgD 항체에서 하나 이상의 잔기가 시스테인으로 치환되는 위치를 도시한다.
도 3a는 본 발명에 따른 IgG4 항체에서 도입된 돌연변이를 도시한다.
도 3b는 도 3a에 도시된 IgG4 항체의 돌연변이된 중쇄에서의 잔기의 위치 및 경쇄 (LC)의 시스테인 또는 또 다른 돌연변이된 중쇄 (HC)와 형성할 수 있는 예측된 이황화 결합을 도시한다. 시스테인이 LC 또는 HC의 시스테인과 결합할 수 있는 경우, 밑줄친 사슬은 예측된 유력한 이황화 결합 배열이다.
도 4a는 본 발명에 따른 IgG4 항체에서 도입된 돌연변이를 도시한다.
도 4b는 도 4a에 도시된 IgG4 항체에서 시스테인 잔기의 위치 및 경쇄 (LC) 또는 중쇄 (HC)의 시스테인과 형성할 수 있는 예측된 이황화 결합을 도시한다. 시스테인이 LC 또는 HC의 시스테인과 결합할 수 있는 경우, 밑줄친 사슬은 예측된 유력한 이황화 결합 배열이다.
도 5는 본 발명에 따른 IgG4 항체의 CH1 및 힌지 영역의 서열을 도시한다.
도 6은 본 발명에 따른 IgG4 항체의 CH1, 힌지 영역, CH2 및 CH3의 서열을 도시한다.
도 7은 항-인간 Fc 항체를 이용한 결과를 나타내는 상부 겔 및 항-카파 항체를 이용한 결과를 나타내는 하부 겔을 이용하여 본 발명에 따른 항체의 웨스턴 블롯(Western Blot) 분석을 도시한다.
도 8은 항-인간 Fc 항체를 이용한 결과를 나타내는 상부 겔 및 항-인간 카파 항체를 이용한 결과를 나타내는 하부 겔을 이용하여 본 발명에 따른 항체의 웨스턴 블롯 분석을 도시한다.
도 9는 항-인간 Fc 항체를 이용한 결과를 나타내는 상부 겔 및 항-인간 카파 항체를 이용한 결과를 나타내는 하부 겔을 이용하여 본 발명에 따른 항체의 웨스턴 블롯 분석을 도시한다.
도 10은 항-인간 Fc 항체를 이용한 결과를 나타내는 상부 겔 및 항-인간 카파 항체를 이용한 결과를 나타내는 하부 겔을 이용하여 본 발명에 따른 항체의 웨스턴 블롯 분석을 도시한다..
도 11은 Fab 및 CH2 도메인 열 안정성을 도시하는 본 발명의 항체의 써모플루오르(Thermofluor) 분석 결과를 도시한다.
도 12는 Fab 및 CH2 도메인 열 안정성을 도시하는 본 발명의 항체의 써모플루오르 분석 결과를 도시한다.
도 13은 Fab 및 CH2 도메인 열 안정성을 도시하는 본 발명의 항체의 써모플루오르 분석 결과를 도시한다.
도 14는 Fab 및 CH2 도메인 열 안정성을 도시하는 본 발명의 항체의 써모플루오르 분석 결과를 도시한다.
도 15는 본 발명의 선택된 항체의 열 안정성의 랭킹을 도시한다.
도 16은 본 발명의 선택된 항체 및 대조 항체의 친화성 검정 결과를 도시한다.
도 17은 본 발명의 선택된 항체의 HPLC 분석 결과를 도시한다.
도 18은 상이한 링커를 갖는 본 발명에 따른 항체의 웨스턴 블롯 분석을 도시한다.
도 19는 상이한 링커를 갖는 본 발명에 따른 항체의 웨스턴 블롯 분석을 도시한다.
도 20 내지 24는 다양한 돌연변이를 갖는 본 발명에 따른 항체의 웨스턴 블롯 분석을 도시한다.
도 25 및 26은 본 발명에 따른 특정 항체를 포함하는, 다양한 항체의 ADCC 이펙터 기능을 도시한다.
도 27은 본 발명에 따른 다양한 항체의 발현을 도시한다.
도 28은 항체 헤르셉틴(Herceptin)의 다양한 돌연변이의 웨스턴 블롯을 도시한다.
도 29는 항체 티사브리(Tysabri)의 다양한 돌연변이의 웨스턴 블롯을 도시한다.
도 30은 항체 악템라(Actemra)의 다양한 돌연변이의 웨스턴 블롯을 도시한다.
도 31 내지 34는 본 발명에 따른 다양한 항체의 써모플루오르 분석 결과를 도시한다.
서열의 간단한 설명
SEQ ID NO: 1은 IgG1 야생형 항체의 CH1 및 힌지 영역 서열을 도시한다.
SEQ ID NO: 2는 IgG4 야생형 항체의 CH1 및 힌지 영역 서열을 도시한다.
SEQ ID NO: 3은 인간 야생형 카파 경쇄의 불변 영역의 일부를 도시한다.
SEQ ID NO: 4는 인간 IgG1 항체의 CH1 도메인의 N-말단 서열의 일부를 도시한다.
SEQ ID NO: 5는 인간 IgG1 항체의 힌지 영역을 도시한다.
SEQ ID NO: 6은 인간 IgG2 항체의 CH1 도메인의 N-말단 서열의 일부를 도시한다.
SEQ ID NO: 7은 인간 IgG2 항체의 힌지 영역을 도시한다.
SEQ ID NO: 8은 인간 IgG3 항체의 CH1 도메인의 N-말단 서열의 일부를 도시한다.
SEQ ID NO: 9는 인간 IgG3 항체의 힌지 영역을 도시한다.
SEQ ID NO: 10은 인간 IgG4 항체의 CH1 도메인의 N-말단 서열의 일부를 도시한다.
SEQ ID NO: 11은 인간 IgG4 항체의 힌지 영역을 도시한다.
SEQ ID NO: 12 내지 37은 항체 6, 7, 8, 15, 16, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 44, 45, 46, 47, 2, 3, 48, 28P 및 44P의 CH1 도메인 및 힌지 영역 서열을 각각 도시한다.
SEQ ID NO: 38 내지 63은 항체 6, 7, 8, 15, 16, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 44, 45, 46, 47, 2, 3, 48, 28P 및 44P의 CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인 서열을 각각 도시한다.
SEQ ID NO: 64는 야생형 IgG4 CH2 및 CH3 도메인 서열을 도시한다.
SEQ ID NO: 65는 야생형 IgG4 CH2 및 야생형 IgG1 CH3 도메인 서열을 도시한다.
SEQ ID NO: 66은 인간 야생형 카파 경쇄의 불변 영역 서열을 도시한다.
SEQ ID NO: 67은 인간 IgGD 항체의 CH1 도메인의 N-말단 서열의 일부를 도시한다.
SEQ ID NO: 68은 인간 IgGD 항체의 힌지 영역의 일부를 도시한다.
SEQ ID NO: 69는 인간 IgGM 항체의 CH1 도메인의 N-말단 서열의 일부를 도시한다.
SEQ ID NO: 70은 인간 IgGM 항체의 CH1 도메인의 C-말단 서열의 일부를 도시한다.
SEQ ID NO: 71은 인간 IgGM 항체의 CH2 도메인의 일부를 도시한다.
SEQ ID NO: 72 내지 295는 다양한 힌지 영역을 도시한다.
본 발명의 바람직한 구체예의 상세한 설명
이제 본 발명을 더욱 상세히 설명할 것이다.
용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 문맥에서 달리 지시되지 않는 한 본원에서 상호교환적으로 이용된다. "펩티드"는 10개 또는 그 미만의 아미노산을 지칭하고자 한다.
용어 "폴리누클레오티드"는 문맥에서 달리 지시되지 않는 한 유전자, DNA, cDNA, RNA, mRNA 등을 포함한다.
본원에서 사용된 대로, 본 명세서의 문맥에서 용어 "포함하는"은 "함께 포함하는" 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 문맥에서 용어 "야생형"은 어떠한 유전적으로 공학처리된 돌연변이를 포함하지 않는, 자연에서 발생할 수 있거나 주위환경으로부터 단리될 수 있는 항체를 의미한다.
본원에서 치환 돌연변이체에 대한 지정은 문자 뒤에 숫자, 그리고 그 뒤에 문자로 구성된다. 맨 처음 문자는 야생형 단백질에서의 아미노산을 나타낸다. 숫자는 아미노산 치환이 이루어진 아미노산 위치를 지칭하고, 두 번째 문자는 야생형 아미노산을 대체하는데 이용된 아미노산을 나타낸다.
항체 가변 및 불변 도메인에서의 잔기는 통상적으로 케이뱃 등(Kabat et al.)에 의해 고안된 시스템에 따라 넘버링된다. 이러한 시스템은 문헌[Kabat et al., 1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA(이후, "Kabat et al. (supra)")]에 기재되어 있다.
케이뱃 잔기 지정은 아미노산 잔기의 선형 넘버링과 항상 직접적으로 일치하는 것은 아니다. 실제 선형 아미노산 서열은 프레임워크 또는 상보성 결정 영역(CDR) 여부에 상관 없이 염기성 가변 도메인 구조의 구조적 성분의 생략 또는 여기로의 삽입에 해당하는 엄격한 케이뱃 넘버링에서 보다 적거나 추가적인 아미노산을 함유할 수 있다. 잔기의 정확한 케이뱃 넘버링은 "표준" 케이뱃 넘버링된 서열과의 항체의 서열에서의 상동성 잔기의 정렬에 의해 제공된 항체에 대해 결정될 수 있다.
대안적으로, 아미노산 잔기의 넘버링은 EU-인덱스 또는 EU 넘버링 시스템 (역시 Kabat et al.에 기재됨, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))에 의해 수행될 수 있다.
항체에서 아미노산 잔기의 추가의 넘버링 시스템은 IMGT 넘버링 시스템 (Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 29, 185-203 (2005)) 이다.
EU 넘버링 시스템 또는 IMGT 넘버링 시스템이 이용되었다고 달리 지시된 경우를 제외하고는 케이뱃 넘버링 시스템이 본 명세서에서 이용된다.
4개의 IgG4 아이소형들 간에, 중쇄 및 경쇄에서의 사슬내 이황화 결합 배열은 유사한 반면, 각각의 아이소형에 대한 사슬간 이황화 결합 배열은 독특하다 [(Wypych,J., Li,M., Guo,A., Zhang,Z., Martinez,T., Allen,M.J., Fodor,S., Kelner,D.N., Flynn,G.C., Liu,Y.D., Bondarenko,P.V., Ricci,M.S., Dillon,T.M., Balland,A., 2008. Human IgG2 antibodies display disulphide-mediated structural 아이소형s. J Biol Chem. 283, 16194-16205)에 의해 검토됨].
도 1b에 도시된 대로, 4개의 IgG4 아이소형의 힌지 영역 서열은 상이하다. 완전하거나 유전적 힌지 영역은 통상적으로 잔기 226 내지 251로 구성된다 (케이뱃 넘버링 시스템에 기반한 넘버링). 도 1b는 4개의 IgG4 아이소형의 힌지 영역의 상부, 코어 및 하부 섹션을 도시한다. IgG1 아이소형의 경우, 상부 힌지 영역은 잔기 226 내지 238이고, 코어 힌지 영역은 잔기 239 내지 243이며, 하부 힌지 영역은 잔기 244 내지 251이다. IgG4 아이소형의 경우, 상부 힌지 영역은 잔기 226 내지 238이고, 코어 힌지 영역은 잔기 239 내지 243이며, 하부 힌지 영역은 잔기 244 내지 251이다.
따라서, IgG1에서 상부 힌지, 코어 및 하부 힌지를 포함하는 힌지는 도 1a에 도시된 대로 23개 아미노산 길이이다. 상부 힌지는 10개의 아미노산이다. 코어는 5개 아미노산이고 하부 힌지는 8개이다. 예를 들어, 도 1b를 참조하라.
IgG4에서 상부 힌지, 코어 및 하부 힌지를 포함하는 힌지는 도 1a에 도시된 대로 20개 아미노산 길이이다. 상부 힌지는 7개의 아미노산이다. 코어는 5개 아미노산이고 하부 힌지는 8개이다. 예를 들어, 도 1b를 참조하라.
IgG4내 사슬간 이황화 결합 배열을 변형시킴에 의해, 특히 경쇄 (LC) 및 중쇄 (HC) 간의 CL-CH1 사슬간 이황화 결합 배열을 변형시켜 본 발명에 따른 신규한 돌연변이체 IgG4 항체를 개발하였다.
도 1b는 CL-CH1 사슬간 이황화 결합을 형성하는 시스테인 위치 (밑줄로 표시됨)를 나타내는 IgG 1-4 아이소형에 대한 인간 IgG 중쇄 및 경쇄 서열의 섹션을 도시한다. IgG1의 CL-CH1간 이황화 결합은 LC C214 (케이뱃 넘버링 시스템) 및 힌지 영역 바로 전에 HC의 C233 (케이뱃 넘버링 시스템) 사이에 형성된다. 대조적으로, IgG2, 3 및 4에 대한 CH1-CL 이황화 결합은 LC C214 및 HC의 사슬내 이황화 결합에 대한 N-말단측 C127 사이에 형성된다. CL-CH1 이황화 결합 형성에 수반된 시스테인 잔기를 둘러싼 LC 및 HC 서열은 도 1b에 도시되고 정렬된다.
본 발명은 CL-CH1 이황화 결합이 열 안정성, 구조적 안정성, 이황화 아이소형 이종성 및 항체의 친화성을 포함하는 IgG4 항체의 특성에 어떻게 영향을 미치는 지에 대해 연구하였다.
CH1의 위치 127에 있는 시스테인 잔기를 또 다른 아미노산으로 치환시키고, 또한 상부 힌지 영역의 아미노산들 중 하나 이상, 바람직하게는 IgG4의 케이뱃 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 227, 228, 229 및 230으로부터 선택된 위치에 있는 아미노산을 시스테인으로 치환시킴에 의해 IgG4의 돌연변이체를 생성하였다. 위치 227, 228, 229 또는 230은 IgG1 시스테인 233이 놓인 곳과 동등한 구조적 위치이거나 이에 가깝다.
각각의 중쇄는 IgG4 힌지 영역의 시스테인 잔기 239 및 242 중 하나 또는 둘 모두를 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 포함하는 추가의 돌연변이를 포함할 수 있다. IgG1 힌지와 동일한 길이가 되도록 IgG4 상부 힌지 영역을 3개의 아미노산만큼 위치 238 및 239 사이에서 늘이는 돌연변이가 또한 일부 항체에 포함되었다. S241P 돌연변이가 또한 일부 항체에 도입되었다.
본 발명에 따른 돌연변이체 IgG4 항체는 유리한 특징을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 돌연변이체 IgG4 항체는 야생형 IgG4 항체에 비해 증가된 열 안정성을 나타낸다. 놀랍게도 CH1 도메인의 위치 127에 있는 시스테인이 또 다른 아미노산으로 대체되도록 돌연변이되고 시스테인이 중쇄 힌지 영역에 위치 227 내지 230 사이에서 도입된 돌연변이체 IgG4 항체는 야생형 IgG4 항체에 비해 증가된 열 안정성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 위치 127에 있는 시스테인을 제거하는 돌연변이는 중쇄 및 경쇄 사이에 (CL-CH1) 사슬간 이황화 결합이 형성되는 위치를 변경시키고 경쇄로 하여금 중쇄의 힌지 영역에서 위치 227 내지 230 사이에서 도입된 시스테인과 이황화 결합을 형성하도록 강제한다. 따라서, 일 구체예에서, 시스테인 127이 또 다른 아미노산으로 치환되고 경쇄의 시스테인이 위치 227, 228, 229 또는 230의 공학처리된 시스테인에 이황화 결합을 통해 연결되는 IgG4 항체가 제공된다.
또한 놀랍게도, IgG4 힌지 영역을 늘이기 위해 3개의 아미노산을 IgG4 힌지 영역에 첨가함으로써 열 안정성에 대한 추가 개선이 발견되었다.
또한 놀랍게도, CH1 도메인의 위치 127에 있는 시스테인이 또 다른 아미노산으로 대체되고 중쇄 힌지 영역의 위치 239 또는 위치 242에 있는 시스테인이 또 다른 아미노산으로 대체되도록 돌연변이된 돌연변이체 IgG4 항체가 야생형 IgG4 항체에 비해 개선된 열 안정성을 나타내었음이 밝혀졌다.
일 구체예에서, 본 발명의 항체는 소위 하프-분자(half-molecule)의 감소된 형성을 나타낸다. C239에 돌연변이를 포함하지만 C242에 돌연변이를 지니지 않는 본 발명의 항체는 일반적으로 감소된 하프-분자 형성을 나타낸다. 이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, 이는 위치 239의 시스테인의 제거가 중쇄에서 사슬내 이황화 결합의 형성을 감소시킴으로써 C239 또는 C242에 돌연변이를 지니지 않은 항체에 비해 하프-분자의 수를 감소시키기 때문인 것으로 여겨진다. C242에 돌연변이를 지니지만 C239에 돌연변이를 지니지 않는 항체는 C239에 돌연변이를 지니지만 C242에 돌연변이를 지니지 않은 항체에 비해 더 많은 하프-분자를 형성하는 것 같다. 이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, 위치 239의 시스테인이 위치 242의 시스테인에 비해 더욱 반응성이고 중쇄 힌지 시스테인 또는 경쇄 시스테인과 이황화 결합을 형성할 수 있는 것으로 여겨진다.
C239 및 C242 둘 모두에 돌연변이를 지니는 항체는 2개의 중쇄 간에 사슬간 이황화 결합을 형성하지 않기 때문에 높은 비율의 하프-분자를 형성한다. 그러나, C239 및 C242 둘 모두에 돌연변이를 포함하는 항체는 비공유 결합을 통한 중쇄의 결합으로 인해 여전히 완전한(whole) 항체 분자를 형성할 수 있다.
감소된 하프-분자 형성은 또한 S241P 돌연변이를 지니는 항체에서 관찰된다.
일 구체예에서, 상부 힌지 및 코어 영역은 하기 서열 중 하나로부터 선택된다:
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
본 발명에 따른 항체는 또한 항체 야생형 IgG4 항체에 비해 표적 항원에 대해 유사한 친화성을 나타낸다.
본 발명의 항체에 대한 돌연변이를 이제 추가로 상세히 기재할 것이다. 아미노산을 대체하는 방법은 분자 생물학 분야에 널리 공지되어 있다. 그러한 방법은, 예를 들어 아미노산을 결실 및/또는 치환시키거나 새로이 합성 서열을 설계하기 위해 PCR과 같은 방법을 이용한 부위 지정 돌연변이유발을 포함한다.
도 2a는 IgG1 야생형, IgG4 야생형의 힌지 잔기 및 돌연변이가 본 발명의 항체에 도입된 위치를 도시한다. 넘버링은 케이뱃 넘버링 시스템에 기반하였다.
본 발명에 따른 항체는 위치 127 (C127)에서의 돌연변이를 포함하고, 여기서 시스테인 잔기는 또 다른 아미노산, 바람직하게는 티올기를 함유하지 않는 아미노산에 의해 대체된다. 대체 또는 치환이라 함은 사슬간 시스테인 127이 항체 중쇄에서 평소대로 발견될 경우, 또 다른 아미노산이 그 위치에 놓였음을 의미한다. C127에서의 돌연변이는 아미노산 잔기를 시스테인에서 또 다른 적합한 아미노산으로 바꾸는 위치 127의 아미노산을 엔코딩하는 누클레오티드들 중 하나, 2개 또는 3개에 대한 임의의 적합한 돌연변이일 수 있다. 적합한 아미노산의 예는 세린, 트레오닌, 알라닌, 글리신 또는 어떠한 극성 아미노산을 포함한다. 특히 바람직한 아미노산은 세린이다.
위치 127에 있는 시스테인의 또 다른 아미노산으로의 치환은 야생형 IgG4의 경쇄에 있는 시스테인과 일반적으로 이황화 결합을 형성하는 CH1 도메인의 시스테인을 제거한다. 따라서, 사슬간 이황화 결합을 통해 경쇄 및 중쇄 쌍을 형성하기 위해서는, 경쇄가 중쇄의 힌지 영역에 정위된 시스테인과 이황화 결합을 형성하여야 한다.
본 발명의 첫 번째 양태에서, 본 발명에 따른 항체는 케이뱃 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 227, 228, 229 및 230으로부터 선택된 위치의 아미노산들 중 하나 이상이 시스테인으로 치환된 중쇄를 포함한다. 따라서, 본 발명에 따른 항체는 하기 돌연변이들 중 하나 이상을 지닐 수 있다:
S227C
K228C
Y229C
G230C
바람직하게는, 227, 228, 229 및 230으로부터 선택된 단 하나의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된다.
본 발명의 특히 바람직한 항체는 돌연변이 Y229C 또는 G230C를 지닌다.
중쇄의 힌지 영역에서 227, 228, 229 및 230으로부터 선택된 위치에 시스테인 잔기를 포함시키는 것은 중쇄 및 경쇄 사이를 구성하는 사슬간 이황화 결합을 위한 새로운 위치를 제공한다. 이렇게 새로운 사슬간 이황화 결합 배열이 야생형 IgG4 항체에 비해 개선된 열 안정성을 갖는 IgG4 항체를 제공함이 본 발명자들에 의해 밝혀졌다.
본 발명의 이러한 양태의 항체에 추가의 돌연변이가 도입될 수 있다. 일 구체예에서, 중쇄에서 케이뱃 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 위치 239 (C239)의 시스테인 및/또는 위치 242 (C242)의 시스테인은 또 다른 아미노산, 바람직하게는 티올기를 함유하지 않는 아미노산으로 치환된다. 대체 또는 치환이라 함은 시스테인 239 및/또는 시스테인 242가 항체 중쇄에서 평소대로 발견될 경우, 또 다른 아미노산이 그 위치에 놓였음을 의미한다. C239 및/또는 C242에서의 돌연변이는 아미노산 잔기를 시스테인에서 또 다른 적합한 아미노산으로 바꾸는 아미노산을 엔코딩하는 누클레오티드들 중 하나, 2개 또는 3개에 대한 임의의 적합한 돌연변이일 수 있다. 적합한 아미노산의 예는 세린, 트레오닌, 알라닌, 글리신 또는 어떠한 극성 아미노산을 포함한다. 특히 바람직한 아미노산은 세린이다.
일 구체예에서, 중쇄에서 위치 239의 시스테인이 또 다른 아미노산으로 치환되고 중쇄에서 위치 242의 시스테인이 또 다른 아미노산으로 치환된다. 이러한 구체예에서, C239 및 C242 둘 모두의 치환은 또 다른 중쇄의 상응하는 시스테인과 평소대로 중쇄간 이황화 결합을 형성하는 중쇄의 힌지 영역에 있는 두 개 모두의 시스테인 잔기를 제거한다. 생성된 하프-분자는 두 개의 중쇄 간의 비공유 결합을 통해 완전한 항체 분자를 형성할 수 있다.
대안적인 구체예에서, 중쇄에서 위치 239의 시스테인은 또 다른 아미노산으로 치환된다. 이러한 구체예에서, 위치 242의 시스테인은 또 다른 아미노산으로 치환되지 않는다.
추가의 대안적인 구체예에서, 중쇄에서 위치 242의 시스테인은 또 다른 아미노산으로 치환된다. 이러한 구체예에서, 위치 239의 시스테인은 또 다른 아미노산으로 치환되지 않는다.
C239 또는 C242 중 어느 한쪽의 치환은 또 다른 중쇄의 시스테인과 중쇄간 이황화 결합을 형성할 수 있는 하나의 시스테인을 중쇄에 남긴다. 이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, 힌지 영역에서 하나의 시스테인의 치환, 특히 C239의 치환은 힌지 영역에서 사슬내 이황화 결합의 형성을 감소시킴으로써 하프 항체 분자의 형성을 감소시킬 수 있는 것으로 여겨진다.
위치 227의 세린이 시스테인으로 치환된 본 발명의 일 구체예에서, 항체는 바람직하게는 위치 C239 및 C242에 돌연변이를 포함하지 않는다. 위치 227의 세린이 시스테인으로 치환된 또 다른 구체예에서, 중쇄의 위치 239의 시스테인은 바람직하게는 또 다른 아미노산으로 치환되지만 위치 242의 시스테인은 또 다른 아미노산으로 치환되지 않는다.
일 구체예에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 아미노산이 아미노산 226-243 사이에 삽입되도록 돌연변이된 IgG4 중쇄를 포함한다. 삽입된 아미노산의 수는 1 내지 10개, 1 내지 5개, 1 내지 3개일 수 있고, 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산이 삽입된다. 아미노산은 아미노산 238과 239 사이에 삽입되는 것이 바람직하다. 알라닌, 글리신, 세린 또는 트레오닌 및 이들의 조합과 같은 임의의 적합한 아미노산이 힌지 영역에 삽입될 수 있다. 바람직하게는 3개의 알라닌 (AAA), 3개의 글리신 (GGG), 3개의 세린 (SSS) 또는 3개의 트레오닌 (TTT)이 삽입되거나 트레오닌, 히스티딘 및 또 다른 트레오닌 (THT)이 삽입된다. 힌지 영역에 3개의 아미노산이 삽입되도록 돌연변이된 IgG4 중쇄를 포함하는 본 발명의 항체가 개선된 열 안정성을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
본 발명에 따른 항체에 도입될 수 있는 추가의 돌연변이는 돌연변이 S241P이다. 이러한 돌연변이는 하프 분자의 형성을 감소시키는 것으로 이미 밝혀졌다 (Angal,S. et al., 1993. A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human (IgG4) antibody. Mol Immunol 30, 105-108).
본 발명에 따른 항체는 힌지 영역에 하나 이상의 추가 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체는 하기 돌연변이들 S227P, Y229S, P237D 및 P238K 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 항체는 잔기 226으로부터 243까지의 IgG1 힌지 영역 (상부 힌지 및 코어 힌지)을 유효하게 포함한다. 따라서, 본 발명의 항체는 위치 230의 글리신이 시스테인으로 치환되고, 위치 227의 세린이 프롤린으로 치환되고, 위치 229의 티로신이 세린으로 치환되고, 위치 237의 프롤린이 아스파르트산으로 치환되고, 위치 238의 프롤린이 리신으로 치환되고, 아미노산 서열 트레오닌-히스티딘-트레오닌이 위치 238과 239 사이에 삽입되고, 위치 241의 세린이 프롤린으로 치환된 힌지 영역을 포함한다. 이러한 돌연변이는 또한 도 2a에 도시된 대로 S227P, Y229S, G230C, P237D, P238KTHT 및 S241P로서 기재될 수 있다. IgG4 힌지 영역에 이러한 추가의 돌연변이를 도입시켜 개선된 열 안정성을 갖는 항체를 제공함이 밝혀졌다.
본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 잔기 244에서 251까지의 (APEFLGGP) IgG4 하부 힌지를 갖는다. 이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, IgG4 하부 힌지 영역이 IgG4 항체의 이펙터 기능의 부족에 기여하는 것으로 여겨진다.
본 발명의 두 번째 양태에서, 항체는 위치 127의 시스테인이 상기 기재된 대로 또 다른 아미노산으로 치환되고, 중쇄에서 케이뱃 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 위치 239의 시스테인 또는 위치 242의 시스테인이 또 다른 아미노산으로 치환된 중쇄를 포함한다. 이러한 두 번째 양태에서, 위치 227, 228, 229 및 230의 잔기들 중 어떤 것도 시스테인 잔기로 치환되지 않는다.
본 발명의 두 번째 양태에 따른 항체는 놀랍게도 야생형 IgG4 항체에 비해 개선된 열 안정성을 갖는 것으로 나타났다.
본 발명의 두 번째 양태에서, 항체는 하나 이상의 추가의 돌연변이를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 항체는 상기 기재된 대로 3개의 아미노산이 아미노산 226-243 사이, 바람직하게는 아미노산 238과 239 사이에 삽입되도록 돌연변이된 IgG4 중쇄를 포함한다. 추가의 구체예에서, 항체는 돌연변이 S241P를 포함한다. 추가의 구체예에서, 항체는 하기 돌연변이들 S227P, Y229S, P237D 및 P238K 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
하기 표 1은 본 발명의 견본 항체 및 IgG4 야생형 서열에 비해 도입된 돌연변이를 나열한다. 표 1은 또한 야생형 IgG1 및 IgG4 항체 그리고 대조군 항체를 포함한다.
표 1:
Figure pct00011
Figure pct00012
도 3a 및 4a는 또한 본 발명에 따른 IgG4 항체에 도입된 돌연변이를 나타낸다. 도 3b 및 4b는 본 발명의 IgG4 항체에서 시스테인 잔기의 위치를 나타내고 또한 경쇄 (LC) 또는 또 다른 중쇄 (HC)의 시스테인에 대한 시스테인의 예측된 결합을 나타낸다. 제시된 (LC 또는 HC) 시스테인 잔기의 경우, 시스테인은 경쇄 또는 중쇄의 시스테인에 결합될 수 있으나 LC 또는 HC가 밑줄로 표시된 경우, 이것은 유력하게 일어나는 것으로 여겨지는 이황화 결합이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 각각의 중쇄가 CH1 도메인 및 힌지 영역을 포함하고 각각의 중쇄가 표 1에 도시된 대로 2, 3, 6, 7, 8, 15, 16, 28, 28P, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 44, 44P, 45, 46, 47 및 48로부터 선택된 항체의 돌연변이를 포함하는, 하나 이상의 중쇄를 포함하는 항체를 제공한다. 이에 따라, 본 발명은 각각의 중쇄가 CH1 도메인 및 힌지 영역을 포함하고 각각의 중쇄가 하기 서열들 중 하나를 포함하는, 하나 이상의 중쇄를 포함하는 항체를 제공한다: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 및 SEQ ID NO: 37.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체는 각각의 중쇄가 CH1 도메인 및 힌지 영역을 포함하고, 하기 서열들 중 하나를 포함하는, 하나 이상의 중쇄를 포함한다: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 및 SEQ ID NO: 37. 보다 바람직하게는, 본 발명의 항체는 각각의 중쇄가 CH1 도메인 및 힌지 영역을 포함하고 각각의 중쇄가 하기 서열들 중 하나를 포함하는, 하나 이상의 중쇄를 포함한다: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 및 SEQ ID NO: 37.
추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명은 각각의 중쇄가 CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고 각각의 중쇄가 표 1에 도시된 대로 2, 3, 6, 7, 8, 15, 16, 28, 28P, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 44, 44P, 45, 46, 47 및 48로부터 선택된 항체의 돌연변이를 포함하는, 하나 이상의 중쇄를 포함하는 항체를 제공한다. 따라서, 본 발명은 각각의 중쇄가 CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고 각각의 중쇄가 하기 서열들 중 하나를 포함하는, 하나 이상의 중쇄를 포함하는 항체를 제공한다: SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62 및 SEQ ID NO: 63.
본 발명의 특히 바람직한 항체는 CH1 도메인 및 힌지 영역을 포함하는 하나 이상의 중쇄를 포함하고, 여기서 중쇄는 SEQ ID NO: 36 (항체 28P), SEQ ID NO: 37 (항체 44P) 또는 SEQ ID NO: 35 (항체 48)를 포함한다. 본 발명의 추가의 특히 바람직한 항체는 CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 하나 이상의 중쇄를 포함하고, 여기서 중쇄는 SEQ ID NO: 62 (항체 28P), SEQ ID NO: 63 (항체 44P) 또는 SEQ ID NO: 61 (항체 48)을 포함한다. 항체 28P, 44P 및 48은 현저히 개선된 열 안정성을 나타내고 추가로 감소된 하프-분자 형성을 나타내므로 특히 바람직하다.
항체 2, 3 및 8은 현저한 양의 소위 하프-분자 (HL)를 형성하는 것으로 나타났다. 이러한 돌연변이체는 비변성 조건하에 시험관에서 완전한 항체 분자 (H2L2)를 형성할 수 있지만 중쇄들 간 및/또는 중쇄와 경쇄 간의 어떠한 비공유 회합은 비환원 SDS-PAGE 조건하에 제거된다. 하프-분자의 형성을 감소시키는 것이 바람직하다고 종종 교시되지만, 하프-분자를 형성하는 경향이 증가된 항체가 특정 용도에 유리할 수 있다. 항체 중쇄가 또 다른 중쇄와 공유 또는 비공유 회합을 형성할 수 없기 때문에 안정한 하프-분자 (HL)를 형성하고 완전한 항체 (H2L2)를 거의 또는 전혀 형성하지 않는 항체가 특히 흥미롭다. 안정한 하프-분자를 형성하는 항체가 일가 항체의 생산에 유리할 수 있다. 하프-분자를 형성하는 항체는 또한 상이한 특이성을 갖는 하프-분자로부터 완전한 항체를 형성함으로 인해 이중특이적 항체를 생산하는 유용한 방법을 제공할 수 있고, 여기서 완전한 항체는 각각의 항원에 대해 이중특이적이고 일가이다.
항체 3은 힌지 영역에 C239를 보유하나, 힌지간 중쇄 이황화(dulphide) 결합을 형성할 수 없을 것으로 보이는데, 그 이유는 아마도 C-말단 경쇄 시스테인과 힌지 C239 간의 이황화 결합의 능률적인 형성 때문이다. 항체 2 및 3의 비교는, 경쇄 이황화 결합이 힌지 영역에서 C242보다 C239에 보다 효율적이라는 점에서, 경쇄의 C-말단 시스테인의 '도달' 정도를 도시한다. 더욱이 항체 3은 항체 2에 비해 증가된 안정성을 나타낸다.
본 발명에 따른 돌연변이된 항체가 IgG4 아이소형에 관해 상기 기재되었으나, 당업자는 IgG4 항체에 대해 이루어진 돌연변이가 IgG4 항체와 동일한 이황화 결합 배열을 갖는 그 밖의 항체 아이소형 또는 클래스에 또한 적용될 수 있어서 개선된 항체를 제공할 수 있음을 이해할 것이다. IgG4 항체와 동일한 이황화 결합 배열을 갖는 항체의 특수한 예는 IgG3 항체, IgM 항체 및 IgD 항체이다. 도 1b에 도시된 대로, IgG3 및 IgM은 CH1 도메인의 위치 127에 시스테인을 갖고, IgD는 경쇄의 시스테인과 사슬간 이황화 결합을 형성하는 IgG4의 CH1 도메인에서의 C127과 동등한 CH1 도메인에서의 위치 128에 시스테인을 갖는다. 추가로, IgG3 및 IgD의 상부 힌지 영역 및 IgM에서의 CH1 도메인의 C-말단 영역 및 CH2 도메인의 N-말단 영역은 IgG1의 상부 힌지 영역의 잔기와 동등한 시스테인 잔기를 함유하지 않는 것이 도 1b로부터 또한 관찰되었다. 따라서, 본 발명은 경쇄의 시스테인과 사슬간 이황화 결합을 형성하는 CH1 도메인의 시스테인이 또 다른 아미노산으로 치환되고 IgG1 또는 IgG4의 상부 힌지 영역과 구조적으로 유사한 위치에 있는 하나 이상의 아미노산이 시스테인으로 치환된 IgG3 항체, IgD 항체 및 IgM 항체를 추가로 제공한다.
따라서, 본 발명은 CH1 도메인 및 힌지 영역을 포함하는 하나 이상의 중쇄를 포함하는 클래스 IgG3의 항체를 또한 제공하고, 이 때 각각의 중쇄에서:
a. 경쇄의 시스테인과 사슬간 이황화 결합을 형성하는 CH1 도메인의 시스테인은 또 다른 아미노산으로 치환되고;
b. 상부 힌지 영역에 정위된 아미노산들 중 하나 이상은 시스테인으로 치환된다.
본 발명의 IgG3 항체 양태의 바람직한 구체예에서, 경쇄의 시스테인과 사슬간 이황화 결합을 형성하는 CH1 도메인의 시스테인은 도 1b 및 2b에 도시된 대로 케이뱃 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 위치 127의 시스테인이다.
본 발명의 IgG3 항체 양태의 바람직한 구체예에서, 시스테인으로 치환될 수 있는 상부 힌지 영역에 정위된 하나 이상의 아미노산은 도 1b 및 2b에 도시된 대로 케이뱃 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 226, 227, 228, 229, 230, 232 및 233으로부터 선택된 위치에 있는 아미노산들 중 하나 이상이다.
본 발명은 CH1 도메인 및 CH2 도메인을 포함하는 하나 이상의 중쇄를 포함하는 클래스 IgM의 항체를 추가로 제공하고, 이 때 각각의 중쇄에서:
a. 경쇄의 시스테인과 사슬간 이황화 결합을 형성하는 CH1 도메인의 시스테인은 또 다른 아미노산으로 치환되고;
b. CH1 도메인 또는 CH2 도메인에 정위된 아미노산들 중 하나 이상은 시스테인으로 치환된다.
본 발명의 IgM 항체 양태의 바람직한 구체예에서, 경쇄의 시스테인과 사슬간 이황화 결합을 형성하는 CH1 도메인의 시스테인은 도 1b 및 2b에 도시된 대로 케이뱃 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 위치 127의 시스테인이다.
본 발명의 IgM 항체 양태의 바람직한 구체예에서, CH1 도메인의 C-말단 끝 또는 CH2 도메인의 N-말단 끝에 정위된 하나 이상의 아미노산은 시스테인으로 치환된다. 시스테인으로 치환될 수 있는 CH1 도메인의 C-말단 끝에서의 바람직한 아미노산 위치는 도 1b 및 2c에 도시된 대로 케이뱃 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 223, 223A, 223B 및 223C로부터 선택된 위치에 있는 아미노산들 중 하나 이상이다. 시스테인으로 치환될 수 있는 CH2 도메인의 N-말단 끝에서의 바람직한 아미노산 위치는 도 1b 및 2c에 도시된 대로 케이뱃 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 243G, 243H 및 243I로부터 선택된 위치에 있는 아미노산들 중 하나 이상이다. 따라서, 아미노산 223 내지 243 중의 어떠한 하나 이상의 아미노산은 시스테인으로 치환될 수 있다.
본 발명은 CH1 도메인 및 힌지 영역을 포함하는 하나 이상의 중쇄를 포함하는 클래스 IgD의 항체를 추가로 제공하고, 이 때 각각의 중쇄에서:
a. 경쇄의 시스테인과 사슬간 이황화 결합을 형성하는 CH1 도메인의 시스테인은 또 다른 아미노산으로 치환되고;
b. 힌지 영역에 정위된 아미노산들 중 하나 이상은 시스테인으로 치환된다.
본 발명의 IgD 항체 양태의 바람직한 구체예에서, 경쇄의 시스테인과 사슬간 이황화 결합을 형성하는 CH1 도메인의 시스테인은 도 1b 및 2d에 도시된 대로 케이뱃 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 위치 128의 시스테인이다.
IgD 항체의 힌지 영역은 케이뱃 넘버링 시스템에 따라 R224-P243으로서 정의될 수 있다.
본 발명의 IgD 항체 양태의 바람직한 구체예에서, 시스테인으로 치환되는 힌지 영역에 정위된 하나 이상의 아미노산은 도 1b 및 2d에 도시된 대로 케이뱃 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 227, 228, 229, 230, 231, 232 및 233으로부터 선택된 위치에 있는 아미노산들 중 하나 이상이다.
본 발명에 의해 제공된 IgG3, IgD 또는 IgM 항체는 IgG4 항체에 관해 상기 논의된 대로 힌지 영역에 하나 이상의 추가의 돌연변이를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 '항체'는 무손상(완전한) 항체 및 VH 도메인, CH1 도메인 및 힌지 영역을 포함하는 하나 이상의 중쇄를 포함하는 기능적으로 활성인 단편을 포함한다. 본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 하나 이상의 경쇄를 포함한다. 따라서, 본 발명에서의 용어 "항체"는 2가, 3가 또는 4가 항체, Fab' 및 F(ab')2 단편, 하프-항체 분자 또는 단일 경쇄 및 중쇄 쌍을 포함하는 하프-분자 및 두 개의 경쇄 및 중쇄 쌍을 포함하는 완전한 항체 분자를 포함한다.
당 분야에 널리 공지된 대로, 전형적인 Fab' 분자는 중쇄가 가변 영역 VH , 불변 도메인 CH1 및 힌지 영역을 포함하고 경쇄가 가변 영역 VL 및 불변 도메인 CL을 포함하는 중쇄 및 경쇄 쌍을 포함한다.
일 구체예에서, 예를 들어 이합체화가 힌지를 통해 이루어질 수 있는 본 발명의 개시에 따른 Fab'의 이합체가 제공된다.
일 구체예에서, 중쇄는 CH2 도메인 및 CH3 도메인 그리고 임의로 CH4 도메인을 포함한다. 일 구체예에서, 항체는 각각이 본 발명의 첫 번째 또는 두 번째 양태에서 상기 정의된 바와 같은 2개의 중쇄를 포함한다. 본 발명에 따른 항체는 또한 2개의 경쇄를 포함하는 것이 바람직하다. 항체가 2개의 중쇄를 포함하는 이러한 구체예에서, 바람직하게는 중쇄 서열 둘 모두가 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 양태에 의해 상기 정의된 바와 같이 동일하다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하는 완전한 항체이고, 여기서 각각의 중쇄는 케이뱃 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 위치 127의 시스테인이 또 다른 아미노산에 의해 치환된 IgG4 CH1, IgG1 상부 및 중간 힌지 영역, IgG4 하부 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다.
IgG4 항체의 완전한 힌지 영역은 전형적으로 잔기 226 내지 251로 구성된다 (케이뱃 넘버링 시스템에 기반하여 넘버링). 그러나, 힌지 영역은 필요에 따라 짧아지거나 늘어날 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 첫 번째 양태에 따른 항체에서, 야생형 아미노산은 위치 227, 228, 229 또는 230에서 시스테인 잔기로 치환되고, 힌지 영역은 위치 227, 228, 229 또는 230에서 새로운 시스테인 잔기 뒤에서 끝날 수 있다. 본 발명에 따른 항체는 또한 힌지 영역의 N-말단 및/또는 C-말단에 정위된 하나 이상의 추가의 아미노산을 포함할 수 있다. 또한 경쇄 사슬간 시스테인으로부터 힌지 시스테인(들)의 간격, 힌지 시스테인들 간의 간격과 같은 힌지의 그 밖의 특성이 조절될 수 있고 글리신과 같이 가요성과 같은 힌지의 특성에 영향을 미칠 수 있는 힌지에서의 다른 아미노산의 구성을 힌지 내에 혼입시켜 회전 가요성을 증가시키거나 프롤린을 혼입시켜 가요성을 감소시킬 수 있다. 대안적으로 하전되거나 소수성인 잔기의 조합을 힌지 내에 혼입시켜 다합체화 또는 정제 특성을 부여할 수 있다. 그 밖의 변형된 힌지 영역은 완전히 합성일 수 있고, 길이, 조성 및 가요성과 같은 요망되는 특성을 소유하도록 설계될 수 있다.
본 발명에 적용된, 존재할 경우, 특히 Fc 도메인에서의 불변 영역 도메인은 항체 이펙터 기능이 요구되지 않는 IgG4 아이소형을 갖는 것이 바람직하다. 이에 따라 각각의 중쇄는 바람직하게는 SEQ ID NO: 64에 도시된 대로 IgG4 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다.
Fc 불변 영역 도메인의 서열 변이체가 또한 이용될 수 있음을 이해할 것이다.
일 구체예에서, 각각의 중쇄는 위치 409 (EU 넘버링)의 아르기닌이 리신, 트레오닌, 메티오닌 또는 류신으로 치환되어 저 pH에서 응집물 형성을 억제하는 IgG4 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다 (US 2008/0063635 Takahashi et al.). L235, D265, D270, K322, P331 및 P329 (EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된)에서의 돌연변이가 또한 CDC 활성을 약독화시키는 것으로 교시된다 (US 2008/0063635 Takahashi et al.).
각각의 중쇄는 위치 409의 아르기닌 잔기, 위치 405의 Phe 잔기 또는 위치 370의 리신 (EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된)의 치환에 의해 Fab-아암 교환을 진행하는 능력이 감소된 안정한 IgG4 항체를 기재하고 있는 문헌[WO2008/145142 Van de Winkel et al.]에 교시된 돌연변이를 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 각각의 중쇄는 SEQ ID NO: 65에 도시된 대로 IgG4 CH2 도메인 및 IgG1 CH3 도메인을 포함한다.
항체가 돌연변이된 IgG3, IgD 또는 IgM 항체인 본 발명의 구체예에서, 각각의 중쇄는 바람직하게는 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, 임의로 CH4 도메인을 포함한다. IgG3 항체에서, 각각의 중쇄는 바람직하게는 IgG3 CH2 도메인 및 IgG3 CH3 도메인을 포함한다. IgD 항체에서, 각각의 중쇄는 바람직하게는 IgD CH2 도메인 및 IgD CH3 도메인을 포함한다. IgM 항체에서, 각각의 중쇄는 바람직하게는 IgM CH2 도메인, IgM CH3 도메인 및 IgM CH4 도메인을 포함한다.
일 구체예에서, 항체는 모노클로날, 완전한 인간, 인간화 또는 키메라 항체 단편이다. 일 구체예에서, 항체는 완전한 인간 또는 인간화 항체이다.
모노클로날 항체는 하이브리도마 기법 (Kohler & Milstein, Nature, 1975, 256, 495-497), 트리오마 기법, 인간 B-세포 하이브리도마 기법 (Kozbor et al ., Immunology Today, 1983, 4, 72) 및 EBV-하이브리도마 기법 (Cole et al ., "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985)과 같은 당 분야에 공지된 어떠한 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에 사용되는 항체는 또한, 예를 들어, 문헌[Babcook, J. et al., Proc. Natl . Acad . Sci . USA, 1996, 93(15), 7843-7848, WO 92/02551, WO2004/051268 and WO2004/106377]에 기재된 방법에 의해 특수한 항체의 생산을 위해 선택된 단일 림프구로부터 생성된 면역글로불린 가변 영역 cDNA를 클로닝시키고 발현시킴에 의해 단일 림프구 항체 방법을 이용하여 생성될 수 있다.
인간화 항체는 비-인간 종으로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR) 및 비-인간 종으로부터의 하나 이상의 공여체 잔기를 임의로 포함하는 인간 면역글로불린 분자로부터의 프레임워크 영역을 갖는 비-인간 종으로부터의 항체 분자이다 (참조: 예를 들어, US 5,585,089).
본 발명에서 사용되는 항체는 또한 당 분야에 공지된 다양한 파지 디스플레이 방법을 이용하여 생성될 수 있고 문헌[Brinkman et al., J. Immunol . Methods, 1995, 182, 41-50; Ames et al., J. Immunol . Methods, 1995, 184, 177-186; Kettleborough et al . Eur . J. Immunol., 1994, 24, 952-958; Persic et al., Gene, 1997 187, 9-18; and Burton et al., Advances in Immunology, 1994, 57, 191-280; WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; and WO 95/20401; and US 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743; and 5,969,108]에 기재된 것들을 포함한다. 또한, 유전자이식 마우스, 또는 다른 포유동물을 포함하는 그 밖의 유기체를 인간화 항체를 생성하는데 이용할 수 있다.
완전한 인간 항체는 중쇄 및 경쇄 둘 모두의 가변 영역 및 불변 영역(존재시)이 모두 인간 기원의 것이거나, 반드시 동일 항체로부터가 아닌 인간 기원의 서열과 실질적으로 동일한 항체이다. 완전한 인간 항체의 예는, EP 0546073호, US 5,545,806호, US 5,569,825호, US 5,625,126호, US 5,633,425호, US 5,661,016호, US 5,770,429호, EP 0438474호 및 EP 0463151호에서 전반적인 용어로 기재된 바와 같이, 예를 들어, 상기 기재된 파지 디스플레이 방법에 의해 생성된 항체, 및 뮤린 면역글로불린 가변 및/또는 불변 영역 유전자가 이의 인간 대응물로 대체된 마우스에 의해 생산된 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에 사용되는 항체 출발 물질은 항체 가변 및 불변 영역(들)을 엔코딩하는 DNA의 조작 및 재발현을 포함하는 재조합 DNA 기법의 이용에 의해 제조될 수 있다. 표준 분자 생물학 기법을 이용하여 요망에 따라 아미노산 또는 도메인을 변형, 첨가 또는 결실시킬 수 있다. 가변 또는 불변 영역에 대한 어떠한 변경은 본원에서 사용된 용어 '가변' 및 '불변' 영역에 여전히 포함된다.
항체 출발 물질은, 예를 들어 마우스, 랫트, 토끼, 햄스터, 낙타, 라마, 염소 또는 인간을 포함하는 어떠한 종으로부터 수득될 수 있다. 항체의 일부가 하나를 초과하는 종으로부터 수득될 수 있고, 예를 들어 항체는 키메라일 수 있다. 일례에서, 불변 영역이 하나의 종에서 비롯되고 가변 영역이 또 다른 종에서 비롯된다. 항체 출발 물질이 또한 변형될 수 있다. 또 다른 예에서, 항체의 가변 영역은 재조합 DNA 공학처리 기법을 이용하여 생성되었다. 그러한 공학처리된 버젼은, 예를 들어, 천연 항체의 아미노산 서열에서의 또는 아미노산 서열에 대한 삽입, 결실 또는 교환에 의해 천연 항체 가변 영역으로부터 생성된 것들을 포함한다. 이러한 유형의 특정 예는 하나 이상의 CDR 및, 임의로 하나의 항체로부터의 하나 이상의 프레임워크 아미노산 및 두 번째 항체로부터의 가변 영역의 나머지를 함유하는 그러한 공학처리된 가변 영역 도메인을 포함한다. 이러한 항체를 생성하고 제조하는 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다 (참조: 예를 들어, Boss et al., US 4,816,397; Cabilly et al., US 6,331,415; Shrader et al., WO 92/02551; Ward et al., 1989, Nature, 341, 544; Orlandi et al., 1989, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 86, 3833; Riechmann et al., 1988, Nature, 322, 323; Bird et al, 1988, Science, 242, 423; Queen et al., US 5,585,089; Adair, WO91/09967; Mountain and Adair, 1992, Biotechnol. Genet. Eng. Rev, 10, 1-142; Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181).
일 구체예에서, 항체는 동족 쌍(cognate pair)인 결합 도메인을 형성하는 가변 도메인 쌍을 포함한다. 본원에서 사용된 동족 쌍은 가변 도메인의 천연 쌍, 즉 단일 항체 또는 항체 발현 세포로부터 단리된 것을 지칭하고자 한다.
가변 도메인은 최적화 및/또는 인간화될 수 있었다.
동족 쌍으로부터 유래된 최적화/인간화 가변 도메인은 최적화/인간화 후에도 여전히 동족 쌍으로 고려될 것이다.
따라서, 본 발명은 인간, 인간화 또는 키메라 분자로 확대된다.
일 구체예에서, 분자는 특이적으로 표적 항원에 결합한다. 본원에서 사용된 특이적으로 결합한다는 것은 표적 항원(여기에 특이적임)에 높은 친화성을 갖고 특이적이지 않은 항원에 낮거나 매우 낮은 친화성 (또는 전혀 없음)으로 결합하는 분자를 지칭하고자 한다. 친화성을 측정하는 방법은 당업자에게 알려져 있고 BIAcore™와 같은 검정을 포함한다.
본 발명의 항체 분자는 적합하게는 높은 결합 친화성, 특히 나노몰 또는 피코몰의 결합 친화성을 갖는다. 친화성은 BIAcore™를 포함하는 당 분야에 공지된 어떠한 적합한 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명의 분자는 약 100 pM 또는 그보다 양호한 결합 친화성을 갖는다. 일 구체예에서, 본 발명의 분자는 약 50pM 또는 그보다 양호한 결합 친화성을 갖는다. 일 구체예에서, 본 발명의 분자는 약 40pM 또는 그보다 양호한 결합 친화성을 갖는다. 일 구체예에서, 본 발명의 분자는 약 30pM 또는 그보다 양호한 결합 친화성을 갖는다. 일 구체예에서, 본 발명의 분자는 완전한 인간 또는 인간화 항체이고 약 100pM 또는 그보다 양호한 결합 친화성을 갖는다.
본원에 사용된 천연 발생 도메인의 유도체는, 예컨대 도메인의 특징적인 특성(들)은 유지하면서 요망되지 않는 특성을 제거함에 의해 예를 들어 도메인의 특성을 최적화하기 위해, 천연 발생 서열에 있는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산이 대체되거나 결실된 것을 지칭하고자 한다.
일 구체예에서, 본 발명의 항체 분자는 하나 이상의 알부민 결합 펩티드를 포함한다. 생체내 펩티드는 알부민에 결합하여 분자의 반감기를 증가시킨다.
알부민 결합 펩티드는 분자의 하나 이상의 가변 영역, 힌지 또는 C-말단 또는 분자 항원 결합 특성을 방해하지 않는 임의의 위치로부터 부가될 수 있다
알부민 결합 펩티드는 예가 WO 2007/106120호에 제공되어 있다.
항체가 다양한 번역후 변형을 겪을 수 있음이 또한 당업자에 의해 이해될 것이다. 이러한 변형의 유형 및 정도는 종종 분자를 발현하는데 사용되는 숙주 세포주 뿐만 아니라 배양 조건에 좌우된다. 이러한 변형은 당화, 메티오닌 산화, 디케토피페라진 형성, 아스파테이트 이성화 및 아스파라긴 탈아미드화에서 변형을 포함할 수 있다. 빈번한 변형은 카르복시펩티다제의 작용으로 인한 카르복시-말단 염기성 잔기(예를 들어, 리신 또는 아르기닌)의 손실이다(Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995에 기재됨).
요망되는 경우, 본 발명에 사용되는 분자는 하나 이상의 이펙터 분자(들)에 컨주게이션될 수 있다. 이펙터 분자가 단일 이펙터 분자를 포함하거나, 결합되어 본 발명의 항체에 부착될 수 있는 단일 부분을 형성하는 둘 이상의 상기 분자를 포함할 수 있음이 인지될 것이다. 이펙터 분자에 결합된 본 발명의 항체를 수득하는 것이 요망되는 경우, 이는 항체를 직접 또는 커플링제에 의해 이펙터 분자에 결합시키는 표준 화학적 또는 재조합 DNA 공정에 의해 제조될 수 있다. 상기 이펙터 분자를 항체에 컨주게이션하는 기술은 당 분야에 널리 공지되어 있다(참조, Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., Robinson et al., eds., 1987, pp. 623-53; Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev., 62:119-58 and Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123). 특정 화학적 공정으로는, 예를 들어 WO 93/06231호, WO 92/22583호, WO 89/00195호, WO 89/01476호 및 WO03031581호에 기재된 것들이 있다. 대안적으로, 이펙터 분자가 단백질 또는 폴리펩티드인 경우, 결합은, 예를 들어 WO 86/01533호 및 EP0392745호에 기재된 재조합 DNA 공정을 이용하여 달성될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 이펙터 분자는, 예를 들어 항신생물제, 약물, 독소, 생물학적 활성 단백질, 예를 들어 효소, 다른 항체 또는 항체 단편, 합성 또는 천연 발생 중합체, 핵산 및 이의 단편, 예를 들어 DNA, RNA 및 이의 단편, 방사성핵종, 특히 방사성 요오다이드, 방사성 동위원소, 킬레이트 금속, 나노입자 및 리포터 그룹, 예를 들어 형광 화합물 또는 NMR 또는 ESR 분광학에 의해 검출될 수 있는 화합물을 포함한다.
이펙터 분자의 예로는 세포에 유해한(예를 들어, 치사시키는) 임의의 작용제를 포함하는 세포독소 또는 세포독성제가 있을 수 있다. 예로는 콤브레스타틴, 돌라스타틴, 에포틸론, 스타우로스포린, 메이탠시노이드, 스폰기스타틴, 리족신, 할리콘드린, 로리딘, 헤미아스텔린, 탁솔, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜치신, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미토크산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 푸로마이신 및 이들의 유사체 또는 동족체가 있다.
이펙터 분자는 항대사물질(예를 들어, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제(예를 들어, 메클로르에타민, 티오에파 클로르암부실, 멜팔란, 카르무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 시클로토스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 백금(II)(DDP) 시스플라틴), 안트라시클린(예를 들어, 다우노루비신(이전에는 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예를 들어, 닥티노마이신(이전에는 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 안트라마이신(AMC), 칼리케아미신 또는 두오카르마이신), 및 항-유사분열제(예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)도 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
다른 이펙터 분자는 111In 및 90Y, Lu177, 비스무트213, 칼리포르늄252, 이리듐192 및 텅스텐188/레늄188과 같은 킬레이트 방사성핵종; 또는 이로 제한되지 않는 알킬포스포콜린, 토포이소머라제 I 억제제, 탁소이드 및 수라민과 같은 약물을 포함할 수 있다.
다른 이펙터 분자는 단백질, 펩티드 및 효소를 포함한다. 관심 효소로는 단백질분해 효소, 히드롤라아제(hydrolase), 리아제(lyase), 이소머라제, 트랜스퍼라제가 있으나 이에 제한되지 않는다. 관심 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드로는 면역글로불린, 아브린, 리신 A, 슈도모나스 엑소톡신 또는 디프테리아 독소와 같은 독소, 인슐린, 종양 괴사 인자, α-인터페론, β-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자 또는 조직 플라스미노겐 활성화제와 같은 단백질, 혈전제 또는 항-혈관형성제, 예를 들어 안지오스타틴 또는 엔도스타틴, 또는 생물학적 반응 변형제, 예를 들어 림포카인, 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-2(IL-2), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 신경 성장 인자(NGF) 또는 다른 성장 인자 및 면역글로불린이 있으나 이에 제한되지 않는다.
다른 이펙터 분자는, 예를 들어 진단에서 유용한 검출가능한 물질을 포함할 수 있다. 검출가능한 물질의 예로는 다양한 효소, 보조 분자족(prosthetic groups), 형광 물질, 발광 물질, 생체발광 물질, 방사성 핵종, 양전자 방출 금속(양전자 방출 단층촬영법에 이용됨), 및 비방사성 상자성 금속 이온이 있다. 진단용 항체에 컨주게이션될 수 있는 금속 이온에 대해서는 미국 특허 제4,741,900호를 참조하라. 적합한 효소로는 호스라디쉬 퍼옥시다아제, 알칼리성 포스파타아제, 베타-갈락토시다아제, 또는 아세틸콜린에스테라아제가 있고; 적합한 보조 분자족에는 스트렙타비딘, 아비딘 및 비오틴이 있으며; 적합한 형광 물질에는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 및 피코에리트린이 있고; 적합한 발광 물질로는 루미놀이 있으며; 적합한 생체발광물질에는 루시퍼라제, 루시페린 및 아에쿠오린이 있고; 적합한 방사성 핵종으로는 125I, 131I, 111In 및 99Tc가 있다.
또 다른 예에서, 이펙터 분자는 생체내에서 항체의 반감기를 증가시키고/거나, 항체의 면역원성을 감소시키고/거나, 상피 장벽을 지나 면역계로의 항체의 전달을 향상시킬 수 있다. 이러한 유형의 적합한 이펙터 분자의 예로는 WO05/117984호에 기재된 것들과 같은 중합체, 알부민, 알부민 결합 단백질 또는 알부민 결합 화합물이 있다.
이펙터 분자가 중합체일 때, 이는 일반적으로 합성 또는 천연 발생 중합체일 수 있으며, 예를 들어 치환되거나 치환되지 않은 직쇄 또는 분지쇄 폴리알킬렌, 폴리알케닐렌 또는 폴리옥시알킬렌 중합체 또는 분지되거나 분지되지 않은 다당류, 예를 들어 호모-다당류 또는 헤테로-다당류이다.
상기 언급된 합성 중합체에 제공될 수 있는 특정 치환기에는 하나 이상의 히드록시, 메틸 또는 메톡시기가 있다.
합성 중합체의 특정 예로는 치환되거나 치환되지 않은 직쇄 또는 분지쇄 폴리(에틸렌글리콜), 폴리(프로필렌글리콜) 폴리(비닐알코올) 또는 이들의 유도체, 특히 메톡시폴리(에틸렌글리콜)과 같은 치환되거나 치환되지 않은 폴리(에틸렌글리콜) 또는 이의 유도체가 있다.
특정한 천연 발생 중합체로는 락토오스, 아밀로오스, 덱스트란, 글리코겐 또는 이들의 유도체가 있다.
본원에서 사용되는 "유도체"는 반응성 유도체, 예를 들어 말레이미드 등과 같은 티올-선택적 반응성기를 포함하도록 의도된다. 반응성기는 중합체에 직접 결합되거나 링커 세그먼트를 통해 결합될 수 있다. 일부 경우에 상기 기의 잔기가 본 발명의 항체와 중합체 사이의 연결기(linking group)로서 생성물의 일부를 형성할 것임이 인지될 것이다.
중합체의 크기는 요망에 따라 다양할 수 있으나, 일반적으로 평균 분자량이 500Da 내지 50000Da, 예를 들어, 5000 내지 40000Da, 예를 들어, 20000 내지 40000Da의 범위일 것이다. 중합체 크기는 특히 종양과 같은 특정 조직에 국소화시키는 능력 또는 순환되는 반감기를 연장시키는 능력과 같은 생성물의 의도된 용도에 기초하여 선택될 수 있다(개관을 위해, 문헌[Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545] 참조). 따라서, 예를 들어, 생성물이 순환을 중지하고 조직으로 침투할 때, 예를 들어, 종양의 치료에 사용하기 위해서는, 예를 들어 약 5000Da의 분자량을 지니는 저분자량의 중합체를 이용하는 것이 유리할 수 있다. 생성물이 여전히 순환중인 적용의 경우에, 예를 들어 20000Da 내지 40000Da 범위의 분자량을 지니는 고분자량의 중합체를 이용하는 것이 유리할 수 있다.
적합한 중합체는 폴리알킬렌 중합체, 예를 들어 폴리(에틸렌글리콜) 또는, 특히, 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 이들의 유도체, 및 특히 분자량의 범위가 약 15000Da 내지 약 40000Da인 것이다.
일례에서, 본 발명에 사용되는 항체는 폴리(에틸렌글리콜)(PEG) 부분에 부착된다. 구체적인 일례에서, PEG 분자는 임의의 이용가능한 아미노산 측쇄 또는 항체에 위치한 말단 아미노산 작용기, 예를 들어 임의의 유리 아미노기, 이미노기, 티올기, 히드록실기 또는 카르복실기를 통해 부착될 수 있다. 이러한 아미노산은 항체에서 천연 발생할 수 있거나 재조합 DNA 방법을 이용하여 항체로 공학처리될 수 있다(참조, 예를 들어 US 5,219,996호; US 5,667,425호; WO98/25971호). 일례에서, 본 발명의 분자는 변형된 항체이고, 여기서 변형은 이의 중쇄의 C-말단 끝에 이펙터 분자의 부착을 가능하게 하는 하나 이상의 아미노산의 첨가이다. 둘 이상의 PEG 분자를 부착시키기 위해 다수의 부위가 이용될 수 있다.
일 구체예에서, PEG 분자는 경쇄에서 시스테인 171에 연결되며, 예를 들어 본원에 참조로서 포함된 WO2008/038024호를 참조하라.
적합하게는, PEG 분자가 항체에 위치한 하나 이상의 시스테인 잔기의 티올기를 통해 공유적으로 결합된다. 변형된 항체에 부착된 각 중합체 분자는 항체에 위치한 시스테인 잔기의 황 원자에 공유적으로 결합될 수 있다. 공유 결합은 일반적으로 이황화 결합, 또는 특히 황-탄소 결합일 것이다. 티올기가 부착점(point of attachment)으로서 이용되는 경우, 적합하게 활성화된 이펙터 분자, 예를 들어 말레이미드 및 시스테인 유도체와 같은 티올 선택적인 유도체가 이용될 수 있다. 활성화된 중합체는 상기 기재된 중합체-변형된 항체의 제조에서 출발 물질로 이용될 수 있다. 활성화된 중합체는 아이오도아세트아미드, 이미드, 예를 들어 말레이미드, 비닐 설폰 또는 디설파이드와 같이 α-할로카르복실산 또는 에스테르와 같은 티올 반응성기를 함유하는 임의의 중합체일 수 있다. 이러한 출발 물질은 상업적으로 입수할 수 있거나(예를 들어, Nektar, 이전에는 Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA), 시판되는 출발 물질로부터 통상의 화학적 공정을 이용하여 제조될 수 있다. 특정 PEG 분자는 2OK 메톡시-PEG-아민(Nektar, 이전에는 Shearwater; Rapp Polymere; and SunBio로부터 수득할 수 있음) 및 M-PEG-SPA(Nektar, 이전에는 Shearwater로부터 수득할 수 있음)를 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 항체 분자를 엔코딩하는 단리된 DNA를 제공한다.
추가의 양태에서, 상기 DNA를 포함하는 벡터가 제공된다.
벡터를 작제할 수 있는 일반적인 방법, 트랜스펙션 방법 및 배양 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 이에 관해, 문헌["Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York and the Maniatis Manual produced by Cold Spring Harbor Publishing]을 참조한다.
추가의 양태에서, 상기 벡터 및/또는 DNA를 포함하는 숙주 세포가 제공된다.
임의의 적합한 숙주 세포/벡터 시스템을 본 발명의 분자를 엔코딩하는 DNA 서열의 발현에 이용할 수 있다. 박테리아, 예를 들어 이. 콜라이(E. coli) 및 그 밖의 미생물 시스템을 이용할 수 있거나, 진핵생물, 예를 들어 포유동물, 숙주 세포 발현 시스템을 또한 이용할 수 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포는 CHO, 골수종 또는 하이브리도마 세포를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 벡터 (및/또는 DNA)를 함유하는 숙주 세포를 본 발명의 항체 분자를 엔코딩하는 DNA로부터 단백질의 발현을 유도하기에 적합한 조건하에 배양시키고, 항체 분자를 단리시키는 것을 포함하는, 본원에 기재된 항체 분자를 생산하는 방법을 제공한다.
중쇄 및 경쇄 둘 모두를 포함하는 생성물의 생산을 위해, 세포주를, 첫 번째 벡터는 경쇄 폴리펩티드를 엔코딩하고 두 번째 벡터는 중쇄 폴리펩티드를 엔코딩하는 2개의 벡터로 트랜스펙션시킬 수 있다. 대안적으로, 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드를 엔코딩하는 서열을 포함하는 벡터로서, 단일 벡터를 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 항체 분자는 이들이 상업적 처리에 도움이 되도록 하는 숙주 세포로부터 적합한 수준으로 발현된다.
항체는 임의의 표적 항원에 특이적일 수 있다. 항원은 세포-관련 단백질, 예를 들어 박테리아 세포, 효모 세포, T-세포, 내피 세포 또는 종양 세포와 같이 세포 상의 세포 표면 단백질일 수 있거나, 이것은 가용성 단백질일 수 있다. 관심있는 항원은 또한 어떠한 의학적으로 관련된 단백질, 예컨대 질병 또는 감염 동안 상향조절되는 그러한 단백질, 예를 들어 수용체 및/또는 이들의 상응하는 리간드일 수 있다. 세포 표면 단백질의 특수한 예는 부착 분자, 예를 들어 β1 인테그린과 같은 인테그린, 예컨대 VLA-4, E-셀렉틴, P 셀렉틴 또는 L-셀렉틴, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD11a, CD11b, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD40L, CD45, CDW52, CD69, CD134 (OX40), ICOS, BCMP7, CD137, CD27L, CDCP1, CSF1 또는 CSF1-수용체, DPCR1, DPCR1, 두둘린(dudulin)2, FLJ20584, FLJ40787, HEK2, KIAA0634, KIAA0659, KIAA1246, KIAA1455, LTBP2, LTK, MAL2, MRP2, 넥틴-유사2, NKCC1, PTK7, RAIG1, TCAM1, SC6, BCMP101, BCMP84, BCMP11, DTD, 암배아 항원 (CEA), 인간 유지방 글로불린 (HMFG1 및 2), MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 항원, KDR 및 VEGF, PD-1, DC-SIGN, TL1A, DR3, IL-7 수용체 A 및 적절한 경우, 이들의 수용체를 포함한다.
가용성 항원은 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-14, IL-16 또는 IL-17과 같은 인터루킨, 예컨대, IL17A 및/또는 IL17F, 바이러스 항원, 예를 들어 호흡기세포융합 바이러스 또는 시토메갈로바이러스 항원, 면역글로불린, 예컨대 IgE, 인터페론 α, 인터페론 β 또는 인터페론 γ와 같은 인터페론, 종양 괴사 인자 TNF (이전에는 종양 괴사 인자-α로서 공지되었고 본원에서 TNF 또는 TNFα로서 지칭됨), 종양 괴사 인자-β, 콜로니 자극 인자, 예컨대 G-CSF 또는 GM-CSF, 및 혈소판 유래 성장 인자, 예컨대 PDGF-α 및 PDGF-β, WISP-1 및 적절한 경우, 이들의 수용체를 포함한다. 그 밖의 항원은 박테리아 세포 표면 항원, 박테리아 독소, 바이러스, 예컨대 인플루엔자, EBV, HepA, B 및 C, 생물테러제, 방사성핵종 및 중금속, 및 뱀독 및 거미독 그리고 독소를 포함한다.
일 구체예에서, 항체를 이용하여 관심있는 항원의 활성을 기능적으로 변경시킬 수 있다. 예를 들어, 항체는 상기 항원의 활성을 직접적으로 또는 간접적으로 중화, 길항 또는 촉진시킬 수 있다.
본 발명의 항체 분자는 병리학적 질환의 치료 및/또는 예방에 유용하다.
따라서, 본 발명에 따른 항체의 치료적 유효량을, 예를 들어 약제학적 제형으로 투여시킴으로써 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 항체가 제공된다. 일 구체예에서, 본 발명에 따른 항체는, 예를 들어 흡입에 의해 폐로 국소적으로 투여된다.
본 발명에 의해 제공된 항체는 염증 질환 및 질병, 면역 질환 및 질병, 및 섬유화 질환 및 질병을 포함하는 질환 또는 질병의 치료에 유용하다.
용어 "염증 질환 또는 질병" 및 "면역 질환 또는 질병"은 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 건선 관절염(psoriatic arthritis), 스틸병(still's disease), 머클 웰스병(Muckle Wells disease), 건선(psoriasis), 크론병(Crohn's disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), SLE (전신홍반루푸스), 천식(asthma), 알레르기 비염(allergic rhinitis), 아토피 피부염(atopic dermatitis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 혈관염(vasculitis), 타입 I 당뇨병(Type I diabetes mellitus), 이식(transplantation) 및 이식편대숙주병(graft-versus-host disease)을 포함한다.
용어 "섬유화 질병"은 특발성 폐섬유화증(idiopathic pulmonary fibrosis)(IPF), 전신 경화증(systemic sclerosis)(또는 공피증(scleroderma)), 신장 섬유증(kidney fibrosis), 당뇨 신장병증(diabetic nephropathy), IgA 신장병증, 고혈압(hypertension), 말기 신장병(end-stage renal disease), 복막 섬유증(peritoneal fibrosis)(지속 복막 투석법(continuous ambulatory peritoneal dialysis)), 간경화증(liver cirrhosis), 연령관련 황반 변성(age-related macular degeneration)(ARMD), 망막병증(retinopathy), 심반응 섬유증(cardiac reactive fibrosis), 흉터형성(scarring), 켈로이드(keloids), 화상(burns), 피부 궤양(skin ulcers), 혈관성형술(angioplasty), 관상동맥 우회로 조성술(coronary bypass surgery), 관절성형술(arthroplasty) 및 백내장 수술(cataract surgery)을 포함한다.
용어 "암"은 상피로부터 발생하거나, 피부 또는 보다 일반적으로 신체 기관, 예를 들어 유방, 난소, 전립선, 폐, 신장, 췌장, 위, 방광 또는 창자의 내층에서 발견되는 새로운 악성 성장을 포함한다. 암은 인접한 조직으로 침윤되어 골, 간, 폐 또는 뇌와 같은 떨어져 있는 기관으로 퍼지는 (전이) 경향이 있다.
본 발명은 또한 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 본 발명의 항체를 포함하는 약제학적 조성물 또는 진단용 조성물을 제공한다. 따라서, 약제를 제조하기 위한 본 발명의 항체의 용도가 제공된다. 조성물은 보통은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 살균된 약제학적 조성물의 일부로서 일반적으로 공급될 것이다. 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 애주번트를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 본 발명의 항체를 첨가하고 혼합시키는 것을 포함하여, 약제학적 또는 진단용 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 항체는 약제학적 또는 진단용 조성물에서 유일한 활성 성분일 수 있거나 다른 항체 성분, 예를 들어 항-TNF, 항-IL-1β, 항-T 세포, 항-IFNγ 또는 항-LPS 항체, 또는 비-항체 성분, 예를 들어 크산틴을 포함하는 다른 활성 성분을 동반할 수 있다. 다른 적합한 활성 성분은 내성을 유도할 수 있는 항체, 예를 들어, 항-CD3 또는 항-CD4 항체를 포함한다.
추가 구체예에서, 본 발명의 개시에 따른 항체 또는 조성물은 추가의 약제학적 활성제, 예를 들어, 코르티코스테로이드(예를 들어, 플루티카손 프로피오네이트) 및/또는 베타-2-효능제(예를 들어, 살부타몰, 살메테롤 또는 포르모테롤) 또는 세포 성장 및 증식의 억제제(예를 들어, 라파마이신, 시클로포스파미드, 메토트렉세이트) 또는 대안적으로 CD28 및/또는 CD40 억제제와 조합하여 사용된다. 일 구체예에서, 억제제는 소분자이다. 또 다른 구체예에서, 억제제는 표적에 특이적인 항체이다.
약제학적 조성물은 적합하게는 치료적 유효량의 본 발명의 항체를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "치료적 유효량"은 표적 질병 또는 질환을 치료, 경감 또는 예방하는데 필요한 치료제의 양, 또는 검출할 수 있는 치료 또는 예방 효과를 나타내는 양을 의미한다. 치료적 유효량은 세포 배양 검정 또는 동물 모델에서, 일반적으로 설치류, 토끼, 개, 돼지 또는 영장류에서 초기에 산정될 수 있다. 동물 모델은 또한 적합한 농도 범위 및 투여 경로를 결정하는데에도 이용될 수 있다. 이러한 정보는 이후 인간에게 투여하기 위한 유용한 용량 및 경로를 결정하는데 이용될 수 있다.
인간 피검체에 대한 정확한 치료적 유효량은 질병 상태의 중증도, 피검체의 일반적인 건강 상태, 피검체의 연령, 체중 및 성별, 식이, 투여 시간 및 빈도, 약물 조합물(들), 반응 민감성 및 치료에 대한 내성/반응에 의존적일 것이다. 이러한 양은 관례적인 실험에 의해 결정될 수 있고, 이는 임상의의 판단하에 있다. 일반적으로, 치료적 유효량은 0.01 ㎎/kg 내지 50 ㎎/kg일 것이고, 예를 들어, 0.1 ㎎/kg 내지 20 ㎎/kg이다. 약제학적 조성물은 용량 당 소정량의 본 발명의 활성제를 함유하는 단위 용량 형태로 편리하게 제공될 수 있다.
조성물은 환자에게 개별적으로 투여될 수 있거나 다른 작용제, 약물 또는 호르몬과 함께(예를 들어, 동시에, 차례로 또는 별도로) 투여될 수 있다.
투여되는 본 발명의 항체의 용량은 치료하려는 질병의 특성, 예를 들어 존재하는 질병/염증의 정도 및 분자가 예방용인지 현재의 질병을 치료하기 위해 이용되는 것인지의 여부에 의존적이다.
투여 빈도는 항체의 반감기 및 이의 효과의 지속기간에 의존적일 것이다. 항체가 짧은 반감기를 지니는 경우(예를 들어, 2 내지 10시간), 매일 1회 이상 투여될 필요가 있다. 대안적으로, 항체 분자가 긴 반감기를 지니는 경우(예를 들어, 2 내지 15일), 매일 1회, 1주에 1회, 또는 매 1개월 또는 심지어 2개월에 1회 투여를 제공하는 것만이 필요할 수 있다.
약제학적으로 허용되는 담체는 조성물을 투여받는 개체에게 해로운 항체의 생성을 자체적으로 유도하지 않고 유독하지 않아야 한다. 적합한 담체로는 단백질, 폴리펩티드, 리포솜, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 고분자 아미노산, 아미노산 공중합체 및 불활성 바이러스 입자와 같은 천천히 대사되는 큰 거대분자일 수 있다.
약제학적으로 허용되는 염, 예를 들어 광산염, 예를 들어 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 포스페이트 및 설페이트, 또는 유기산의 염, 예를 들어 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트 및 벤조에이트가 사용될 수 있다.
치료용 조성물 중의 약제학적으로 허용되는 담체는 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체를 추가로 함유할 수 있다. 추가로, 보조 물질, 예를 들어 습윤제 또는 에멀젼화제 또는 pH 완충 물질이 이러한 조성물에 존재할 수 있다. 이러한 담체들은 약제학적 조성물이 환자에 의해 섭취되는 정제, 알약, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리 및 현탁액으로 제형화될 수 있게 한다.
적합한 투여 형태는 주사 또는 주입, 예를 들어 볼루스(bolus) 주사 또는 연속 주입과 같이 비경구 투여에 적합한 형태를 포함한다. 생성물이 주사 또는 주입을 위한 것일 때, 이것은 지성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 에멀젼의 형태를 취할 수 있고, 현탁제, 방부제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 개시된 분자는 사용 전에 적합한 살균 액체와 재구성되는 건조 형태일 수 있다.
일단 제형화되면, 본 발명의 조성물은 피검체에게 직접 투여될 수 있다. 치료하려는 피검체는 동물일 수 있다. 그러나, 하나 이상의 구체예에서, 조성물이 인간 피검체에게 투여되기 위해 적합화되는 것이 바람직하다.
적합하게는, 본 발명의 개시에 따른 제형에서, 최종 제형의 pH는 항체의 등전점의 값과 유사하지 않고, 예를 들어, 제형의 pH가 7인 경우, 8-9 또는 그보다 높은 pI가 적합할 수 있다. 이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, 이는 궁극적으로 개선된 안정성을 갖는 최종 제형을 제공할 수 있으며, 예를 들어, 항체는 용해된 상태로 유지되는 것으로 여겨진다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구, 정맥내, 근내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심실내, 경피(transdermal), 경피(transcutaneous)(예를 들어, WO98/20734호 참조), 피하, 복막내, 비내, 창자, 국소, 설하, 질내 또는 직장 경로를 포함하나 이에 제한되지 않는 다수의 경로에 의해 투여될 수 있다. 하이포스프레이(hypospray)도 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는데 사용될 수 있다. 통상적으로, 치료용 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사가능하게 제조될 수 있다. 주사 전에 액체 비히클 중의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태로 제조될 수 있다.
조성물의 직접 전달은 일반적으로 주사, 피하, 복막내, 정맥내 또는 근내에 의해 달성되거나, 조직의 사이질 공간으로 전달될 것이다. 조성물은 병변으로 투여될 수도 있다. 투여 치료는 단일 투여 스케줄 또는 다수 투여 스케줄일 수 있다.
조성물 중의 활성 성분이 항체임이 인지될 것이다. 이와 같이, 이것은 위장관에서의 분해에 민감할 것이다. 따라서, 조성물이 위장관을 이용한 경로에 의해 투여되어야 하는 경우, 조성물은 분해로부터 항체를 보호하나 일단 위장관으로부터 흡수되면 항체를 방출시키는 작용제를 함유할 필요가 있을 것이다.
약제학적으로 허용되는 담체의 면밀한 논의는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991)]을 이용할 수 있다.
일 구체예에서, 제형은 흡입을 포함하는 국소 투여용 제형으로 제공된다.
적합한 흡입 제조물은 흡입용 분말, 추진 가스를 함유하는 계량 에어로졸 또는 추진 가스를 함유하지 않는 흡입용 용액을 포함하다. 활성 물질을 함유하는 본 발명의 개시에 따른 흡입용 분말은 상기 언급된 활성 물질 단독으로 구성될 수 있거나, 상기 언급된 활성 물질과 생리학적으로 허용되는 부형제의 혼합물로 구성될 수 있다.
이러한 흡입용 분말은 단당류(예를 들어, 글루코오스 또는 아라비노오스), 이당류(예를 들어, 락토오스, 당류, 말토오스), 올리고당류 및 다당류(예를 들어, 덱스트란), 폴리알코올(예를 들어, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨), 염(예를 들어, 염화나트륨, 탄산칼슘) 또는 상기와 다른 물질의 혼합물을 포함할 수 있다. 단당류 또는 이당류가 적합하게 사용되나, 락토오스 또는 글루코오스, 특히 이의 수화물 형태가 배타적이지 않게 사용된다.
폐에서의 침착용 입자는 10 마이크론 미만, 예를 들어, 1-9 마이크론, 예를 들어, 0.1 내지 5 ㎛, 특히 1 내지 5 ㎛의 입자 크기를 필요로 한다. 활성 물질(예를 들어, 항체)의 입자 크기가 가장 중요하다.
흡입용 에어로졸을 제조하기 위해 사용될 수 있는 추진 가스가 당 분야에 공지되어 있다. 적합한 추진 가스가 탄화수소, 예를 들어, n-프로판, n-부탄 또는 이소부탄 및 할로히드로카본, 예를 들어, 메탄, 에탄, 프로판, 부탄, 시클로프로판 또는 시클로부탄의 염소화 및/또는 플루오르화 유도체로부터 선택된다. 상기 언급된 추진 가스가 단독으로 사용되거나, 이의 혼합물로 사용될 수 있다.
특히 적합한 추진 가스는 TG11, TG12, TG134a 및 TG227로부터 선택된 할로겐화된 알칸 유도체이다. 상기 언급된 할로겐화된 탄화수소 중 TG134a(1,1,1,2-테트라플루오로에탄) 및 TG227(1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로프로판)과 이의 혼합물이 특히 적합하다.
추진 가스를 함유하는 흡입용 에어로졸은 또한 다른 성분, 예를 들어, 공용매, 안정화제, 표면 활성제(계면활성제), 항산화제, 윤활제 및 pH를 조정하기 위한 수단을 함유할 수 있다. 모든 이러한 성분은 당 분야에 공지되어 있다.
본 발명에 따른 추진 가스를 함유하는 흡입용 에어로졸은 5 중량% 이하의 활성 물질을 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 에어로졸은, 예를 들어, 0.002 내지 5 중량%, 0.01 내지 3 중량%, 0.015 내지 2 중량%, 0.1 내지 2 중량%, 0.5 내지 2 중량% 또는 0.5 내지 1 중량%의 활성 물질을 함유한다.
대안적으로, 폐로의 국소 투여는 또한, 예를 들어, 분무기, 예를 들어, 압축기에 연결된 분무기와 같은 장치를 이용하여 액체 용액 또는 현탁액 제형의 투여에 의해 이루어질 수 있다(예를 들어, Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Va.에 의해 제조된 Pari Master(R) 압축기에 연결된 Pari LC-Jet Plus(R) 분무기).
본 발명의 항체는 용매 중에 분산된 형태, 예를 들어, 용액 또는 현탁액 형태로 전달될 수 있다. 이는 적절한 생리학적 용액, 예를 들어, 생리학적 염수, 약리학적으로 허용되는 용매 또는 완충 용액에 현탁될 수 있다. 당 분야에 공지된 완충 용액은 약 4.0 내지 5.0의 pH를 달성하기 위해 1 ㎖의 물 당 0.05 ㎎ 내지 0.15 ㎎의 에데트산 이나트륨(disodium edetate), 8.0 ㎎ 내지 9.0 ㎎의 NaCl, 0.15 ㎎ 내지 0.25 ㎎의 폴리소르베이트, 0.25 ㎎ 내지 0.30 ㎎의 무수 시트르산, 및 0.45 ㎎ 내지 0.55 ㎎의 시트르산 나트륨을 함유할 수 있다. 현탁액은, 예를 들어, 동결건조된 분자를 이용할 수 있다.
치료 현탁액 또는 용액 제형은 또한 하나 이상의 부형제를 함유할 수 있다. 부형제는 당 분야에 널리 공지되어 있고, 이는 완충액(예를 들어, 시트레이트 완충액, 포스페이트 완충액, 아세테이트 완충액 및 비카르보네이트 완충액), 아미노산, 우레아, 알코올, 아스코르브산, 인지질, 단백질(예를 들어, 혈청 알부민), EDTA, 염화나트륨, 리포솜, 만니톨, 소르비톨, 및 글리세롤을 포함한다. 용액 또는 현탁액은 리포솜 또는 생분해성 미세구에 캡슐화될 수 있다. 제형은 일반적으로 멸균 제조 방법을 이용하여 실질적으로 멸균 형태로 제공될 것이다.
이는 제형에 사용되는 완충 용매/용액의 여과, 멸균 완충 용매 용액 중에서의 분자의 무균 현탁, 및 당업자에게 친숙한 방법에 의한 멸균 용기로의 제형의 분배에 의한 생성 및 멸균을 포함할 수 있다.
본 발명의 개시에 따른 분무용 제형은, 예를 들어, 호일 덮개에 패킹된 단일 용량 단위(예를 들어, 밀봉된 플라스틱 용기 또는 바이얼)로 제공될 수 있다. 각각의 바이얼은 일정 부피, 예를 들어, 2 ㎖의 용매/용액 완충액 중에 단위 용량을 함유한다.
본 발명에 개시된 항체는 분무를 통한 전달에 특히 적합한 것으로 생각된다.
본 명세서의 문맥에서 포함한다는 것은 함께 포함하는 것을 의미하고자 한다.
기술적으로 적절한 경우, 본 발명의 구체예들을 합칠 수 있다.
이제 본 발명을 하기 실시예를 참조로 하여 기재할 것이며, 이는 단지 예시적인 것이며 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예
1. IgG4 중쇄의 돌연변이유발 및 돌연변이된 IgG4 중쇄 단일 유전자 벡터의 생성
Quickchange® Lightening Multi Site Directed Mutagenesis (SDM) 키트 또는 Quickchange® II DSM 키트 (Stratagene®으로부터 수득함)(카탈로그 번호 각각 210516 및 200521)를 이용하여 아미노산 돌연변이를 수행하였고 제조자의 지시에 따라 수행하였다.
돌연변이를 DNA 시퀀싱에 의해 입증하였다. 하기 표에서 적어도 항체 1 내지 47의 IgG4 중쇄가 생산되었다.
Figure pct00013
Figure pct00014
제조된 그 밖의 항체를 상기 표 1에 기재한다.
항체 48의 중쇄 (SEG ID NO: 35)를 PCR 및 제한 효소 클로닝에 의해 생성하였다. PCR 생성물을 IgG1 상부 및 코어 힌지 영역 서열 및 제한 부위 BglII을 엔코딩하는 정방향 올리고 및 제한 효소 DraIII을 엔코딩하는 역방향 올리고에 의해 생성하였다. 그 후 상기 언급된 효소로 PCR 단편을 분해시키고 적절한 가변 영역을 함유하는 hG4 단일 유전자 벡터내로 라이게이션시켰다.
2. 돌연변이된 IgG4 항체의 발현
모든 돌연변이체 DNA를 CHOK1 세포 또는 CHO-SXE 세포로 트랜스펙션시켰다. 세포 (2x108개 세포/ml)를 1 ml의 얼스 밸런스 염용액 (Sigma)에 재현탁시키고 400 ㎍의 DNA (200 ㎍ 중쇄 DNA 및 200 ㎍ 카파 경쇄 DNA)와 혼합시켰다. 800 ㎕의 분취량을 0.4 cm 큐벳 (Biorad)으로 옮겼다. 500 ml의 배양액에 대해, 6개의 큐벳을 하기 파라메터하에 일렉트로포레이션시켰다: 1 ms, 9.6 Amps; 10 ms, 0 Amps; 40 ms, 3.2 Amps. 트랜스펙션된 세포를 5% CO2 가습된 환경에서 37℃에서 140 rpm으로 진탕시키면서 24 hrs 동안 인큐베이션하고 트랜스펙션된 지 2일 후로부터 32℃에서 10-13일간 지속시켰다. 트랜스펙션 후 4일째 되는 날에, 1.6 mls의 1 M 소듐 부티레이트를 배양액에 첨가시켰다. 일단 세포가 40%의 생존력 또는 13일에 도달하면, 상층액을 회수하였다. 배양액을 45분간 4000 rpm에서 원심분리시켰다. 상층액을 0.22 μM Stericup 필터 (밀리포어)로 통과시켜 정제하였다. 도 28의 데이터는 공학처리된 돌연변이에 의해 엔코딩된 IgG4 열 안정성에서의 변화가 단백질이 CHO-K1 또는 CHO-SXE 세포 어느 쪽에서 생산되었을 때에도 동일하였음을 나타낸다.
3. 돌연변이된 IgG4 항체의 정제
상층액 (200-500 ml)을 Protein A 5 ml HiTrap MabSelect SuRe 컬럼 (GE Healthcare, Amersham UK)을 이용하여 정제시켰다. 1/50th의 상층액 부피의 2 M Tris-HCl pH 8.5을 첨가시켜 샘플을 제조하였다. 샘플을 1 ml/min으로 컬럼에 로딩시켰다. 컬럼을 PBS pH 7.4로 세척하였다. 샘플을 용리시키기 위해, 0.1 M 소듐 시트레이트, pH 3.4를 1 ml/min으로 컬럼을 통해 이동시켰고 0.5 ml의 분획들을 수집하였다. 각각에 0.125 ml의 2 M Tris-HCl pH 8.5를 첨가시켜 피크 분획들을 중화시켰다. UV 검출을 280 nm로 설정하였다.
4. 정제된 돌연변이된 IgG4 항체의 특성규명
SDS PAGE 분석:
미정제 상층액을 1200 rpm에서 5분간 원심분리시키고 OCTET 상에서 정량하였다. 적절한 양의 항체, 4x 로딩 완충제 (Invitrogen) 및 2 ㎕ 100mM NEM을 첨가시켜 항체 샘플 (25-30ng)을 제조하였다. dH2O를 이용하여 20 ㎕의 총 부피를 만들었다. 이어서 샘플을 100℃에서 3분간 비등시키고 15웰 1.5 mm 4-20% Tris-글리신 겔 상에 로딩시켰다. 겔을 1x Tank 완충제에서 1.5 hrs 동안 150 V로 진행시켰다. 8분간 이동으로 설정된 iBlot 건조 이동 시스템을 이용하여 항체를 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. 막을 1 hr 동안 실온에서 (RT) PBS-TM에서 진탕 플랫폼 상에서 인큐베이션한 다음, 토끼 항-인간 IgG Fc HRP 컨주게이션된 항체 (Jackson Immunoresearch) 또는 염소 항-인간 카파 경쇄 HRP 컨주게이션된 항체 (Bethyl)와 1 hr 동안 RT에서 진탕하면서 인큐베이션시켰다. 이어서 PBS-T로 각각 5분간 3회 세척하였다. 금속 강화된 DAB 기질 키트를 이용하여 제조자의 지시에 따라 (Pierce) 블롯이 나타났다.
웨스턴 블롯 분석의 결과가 도 7, 8, 9 및 10에 도시되어 있다. 도 7-10에서, H는 중쇄를 나타내고, L은 경쇄를 나타내며, H2L2는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 완전한 항체 분자이고, HL은 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄를 포함하는 하프 분자이다.
도 7은 항체 15, 16, 6, 7, 8, 17, 18, 19, 1, 2, 3, 12 및 13에 대한 웨스턴 블롯 분석을 도시한다. 항체 8이 힌지 돌연변이 C239S 및 C242S 둘 모두의 존재로 인해 H2L2를 전혀 나타내지 않거나 H2L2를 매우 적게 나타내는 것을 제외하고는, 항체들이 양호한 수준의 H2L2를 나타냄을 도 7로부터 알 수 있다. 그러나, 항체 8은 중쇄들 간의 비공유 결합에 의해 H2L2를 형성할 수 있다. 돌연변이체 3이 또한 H2L2를 거의 나타내지 않는데, 이러한 돌연변이체는 C239를 보유하지만 힌지에서 중쇄간 이황화물을 형성할 수 없고, 그 이유는 아마도 C-말단 경쇄 (LC) 시스테인 및 힌지 C239 간에 이황화물의 효율적인 형성 때문이다. 돌연변이 C239S를 포함하지만 C242S는 포함하지 않는 항체 (항체 2, 6 및 12)는 C239S도 C242S도 포함하지 않는 항체 또는 C242S를 포함하지만 C239S는 포함하지 않는 항체에 비해 HL의 감소된 형성을 나타냄을 또한 알 수 있다. S241P 돌연변이를 포함하는 항체 16이 또한 HL의 감소된 형성을 나타낸다. 돌연변이체 2 및 3의 비교는 중쇄와 이황화 결합을 형성하는 경쇄의 C-말단 시스테인의 '도달' 정도를 나타내며, 경쇄 시스테인이 중쇄의 C242보다 C239에 보다 효율적으로 결합하는 것 같다.
도 8은 항체 15, 6, 7, 8, 28, 29, 30, 31, 17, 19, 32, 33, 33, 34, 35, 36, 37, 38 및 39에 대한 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 항체 8, 31, 35 및 39가 힌지 영역에서 돌연변이 C239S 및 C242S의 존재로 인해 H2L2를 전혀 나타내지 않거나 H2L2를 매우 적게 나타냄으로써 2개의 중쇄들 간에 이황화 결합이 형성되지 않는 것을 제외하고는, 항체들이 양호한 수준의 H2L2를 나타냄을 도 8로부터 알 수 있다. 그러나, 항체 8, 31, 35 및 39는 중쇄들 간의 비공유 결합에 의해 H2L2를 형성할 수 있다. 돌연변이 C239S를 포함하지만 C242S는 포함하지 않는 항체 (항체 6, 29, 33 및 37)는 C239S도 C242S도 포함하지 않는 항체 또는 C242S를 포함하지만 C239S는 포함하지 않는 항체에 비해 HL의 감소된 형성을 나타냄을 또한 알 수 있다. 돌연변이체 15는 경쇄와 CH1의 G230C 사이에 이황화 결합을 형성할 수 있고 중쇄간 이황화물을 형성할 수 있어서 완전히 어셈블링되고 이황화 결합된 단백질을 생성한다. 더욱이, 돌연변이체 15(C127S G230C), 28(C127S Y229C), 32(C127S K228C) 및 36(C127S S227C)의 비교는 상부 힌지에서 도입되는 시스테인의 위치가 LC-HC간 이황화 결합 형성을 향상시킴을 나타낸다. G230 및 Y229는 시스테인을 도입하기에 특히 바람직한 위치이다. 돌연변이체 28 (C127S Y229C)은 낮은 수준의 HL 및 H2를 나타내므로 낮은 이황화 결합 이종성을 갖는다.
도 9는 항체 15, 6, 7, 8, 44, 45, 46, 47, 17 및 19에 대한 웨스턴 블롯 분석을 도시한다. 항체 8 및 47이 힌지 영역에서 돌연변이 C239S 및 C242S의 존재로 인해 H2L2를 전혀 나타내지 않거나 H2L2를 매우 적게 나타냄으로써 2개의 중쇄들 간에 이황화 결합이 형성되지 않는 것을 제외하고는, 항체들이 양호한 수준의 H2L2를 나타냄을 도 9로부터 알 수 있다. 그러나, 항체 8 및 47은 중쇄들 간의 비공유 결합에 의해 H2L2를 형성할 수 있다. 돌연변이 C239S를 포함하지만 C242S는 포함하지 않는 항체 (항체 6 및 14)는 C239S도 C242S도 포함하지 않는 항체 또는 C242S를 포함하지만 C239S는 포함하지 않는 항체에 비해 HL의 감소된 형성을 나타냄을 또한 알 수 있다. 특히, 돌연변이체 44는, 상부 힌지에서 3개의 아미노산의 삽입이 또한 HL 및 H2의 형성을 감소시킬 수 있으므로 유사한 돌연변이체 15보다 낮은 수준의 이황화물 이종성을 지님을 나타낸다.
도 10은 항체 48, 17, 18 및 19에 대한 웨스턴 블롯 분석을 도시한다. 항체 48이 양호한 수준의 H2L2와 극히 적은 HL을 나타냄을 도 10으로부터 알 수 있다. 돌연변이체 48은 코어 힌지 S241P 돌연변이와 함께 IgG4 상부 힌지 서열 대신에 IgG1 상부 힌지 서열 EPKSCDKTHT를 함유한다. 따라서, 돌연변이체 48은 상부 및 코어 힌지 서열 EPKSCDKTHTCPPCP을 갖는다. 돌연변이체 48은 야생형 IgG4 항체 17에 비해 낮은 수준의 이황화 결합 이종성 및 IgG4 S241P 돌연변이체 18 및 야생형 IgG1 항체 19에 비해 대략 동등하게 낮은 수준의 이황화 결합 이종성을 나타낸다.
써모플루오르 검정:
정제된 mAb의 열 안정성을 SYPRO® Orange를 이용하여 써모플루오르 검정에서 분석하여 단백질의 열 언폴딩 과정을 모니터하였다. 5 ㎕의 1 mg/ml의 mAb, 5 ㎕의 30xdye, 및 40 ㎕의 PBS를 함께 첨가하였다. 10 ㎕의 혼합물을 384 PCR 광학 웰 플레이트에 4중으로 분배시키고, 7900HT 패스트 실시간 PCR 시스템 (Agilent Technologies UK Ltd, Wokingham UK)상에서 진행시켰다. 이러한 PCR 시스템은 20℃ 내지 99℃로 설정된 정밀한 온도 제어를 위해 가열 장치를 함유한다; 하전된 커플링 장치가 웰에서의 형광성 변화를 동시에 모니터한다.
도 11, 12, 13, 14 및 15는 야생형 IgG1 및 IgG4 항체에 비해 IgG4 항체 돌연변이체의 열 안정성 분석 결과를 도시한다.
돌연변이체 15와 야생형 IgG4 (돌연변이체 17)의 비교는 변경된 이황화물 배열로 인한 Fab Tm에서의 증가를 나타낸다. 돌연변이체 15 및 28의 비교는 G230C 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 15에 비해 Y229C 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 28에 대한 Fab Tm에 있어서의 추가의 개선을 나타낸다. 돌연변이체 15 및 44의 비교는 G230C 돌연변이체의 Fab Tm이 상부 힌지에서 3개의 아미노산의 삽입에 의해 추가로 증가될 수 있음을 나타낸다. 돌연변이체 17 및 18의 비교는 비록 S241P 중간 힌지 돌연변이가 HL 형성을 현저하게 감소시킬지라도 Fab Tm을 증가시키지 않음을 나타낸다. 돌연변이체 48은 또한 야생형 IgG4 (돌연변이체 17) 및 돌연변이체 15 둘 모두와 비교할 때 현저하게 개선된 Fab Tm 값을 나타낸다.
도 15는 본 발명에 따른 선택된 IgG4 돌연변이체들의 열 안정성의 전반적인 랭킹을 도시한다. 돌연변이체 48, 44, 44P, 46, 45, 6, 29, 30, 28, 28P, 31, 8, 47 및 15는 모두 야생형 IgG4 (돌연변이체 17) 및 야생형 IgG4 S241P (돌연변이체 18)에 비해 현저히 높은 Fab Tm을 나타낸다.
항체 친화성:
표적 가용성 사이토카인에 대한 본 발명의 선택된 돌연변이체 IgG4 항체의 친화성을 Biacore™에 의해 측정하였다. 검정 포맷은 항-Fc 표면 상에서 IgG들의 포획에 이어 가용성 사이토카인의 적정이었다.
결과가 도 16에 도시되며, 여기서 돌연변이체 항체가 대조군 IgG1 및 IgG4 야생형 항체에 비해 가용성 사이토카인에 대해 유사한 친화성을 나타내었음을 알 수 있다.
용어 "kd" (s -1)는 항체-항원 상호작용의 분리 속도 상수룰 지칭한다. 상기 값은 또한 koff 값으로서 언급된다.
본원에서 사용된 용어 "ka" (M -1 s -1)는 항체-항원 상호작용의 결합 속도 상수를 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "KD" (M) 또는 "KD" (pM)은 항체-항원 상호작용의 분리 평형 상수를 지칭한다.
크기 배제 ( SEC ) HPLC 분석:
약 50ug의 정제된 항체를 S200 컬럼을 이용하여 HPLC 상에서 진행시켰다. 분석에 Ab 1 내지 19를 이용하였다. 이러한 결과는 인간 IgG4 분자의 DSB 배열에 대한 변경에도 불구하고 비공유적으로 결합된 H2L2가 형성됨을 나타낸다.
HPLC 분석 결과를 도 17에 도시한다.
대안적인 상부 힌지 스페이서 길이
길이가 1 내지 5개 아미노산인 폴리-알라닌 스페이서를 PP와 CPSP 사이, 즉 ESKYCPP^CPSPA에서 '^'로 표시된 위치에 삽입하였다. 도 18은 임의의 길이의 스페이서의 삽입이 돌연변이체 15에서 H2 또는 L2 형성량을 감소시키기에 충분함을 나타낸다. 그러나, 길이가 3개 이상인 아미노산의 삽입이 열 안정성에서 가장 큰 증가를 제공하는 것으로 보인다. 3개의 아미노산의 삽입은 IgG1 및 IgG4 간의 상부 힌지 길이에서의 차이를 가장 밀접하게 모방함이 주목되어야 한다.
대안적인 상부 힌지 스페이서 아미노산 조성
ESKYCPP^CPSPA에서 트리-알라닌 삽입이 상부 힌지 스페이서로서 특수한 특징을 갖는 지를 조사하기 위해, 2가지의 다른 트리-아미노산 삽입을 시험하였다: GGG 및 THT. 도 19는 GGG 및 THT 둘 모두가, 비록 결과는 이들이 동일하지 않음을 시사할지라도 스페이서 영역으로서 기능적이었음을 나타낸다. GGG는 AAA 또는 THT보다 H2 및 L2 형성을 덜 감소시킬 수 있는 것으로 나타났다. GGG 및 THT에 대한 열 안정성에서의 증가는 AAA를 이용하여 관찰된 것만큼 크지 않았다.
대안적인 상부 힌지 스페이서 아미노산 길이 및 조성
IgG4는 CH1 사슬간 시스테인 및 첫 번째 코어 힌지 시스테인 사이에 2개의 아미노산 (PP) '스페이서'를 갖는 한편, IgG1은 5개의 아미노산 DKTHT 스페이서를 갖는다. 돌연변이체 15 (ESKYCPPCPSCP)에 대해 비교할 수 있도록 4개의 돌연변이체 (68, 67, 66 및 56)를 작제하였다. 먼저 IgG4의 PP 스페이서를 IgG1에서 발견된 동일한 길이의 DK 스페이서로 대체하고; 돌연변이체 68 (ESKYCDKCPSCP), 이어서 IgG1 상부 힌지 스페이서를 모방하기 위해 1개의 아미노산을 증분시켰다:
돌연변이체 67 (ESKYCDKTCPSCP)
돌연변이체 66 (ESKYCDKTHCPSCP)
돌연변이체 56 (ESKYCDKTHTCPSCP).
도 21의 데이터는 단 하나의 가장 중요한 변화가 PP에서 DK로의 변화임을 시사하며, 이러한 변화는 돌연변이체 15에 비해 H2, H 및 L 형성을 감소시켰다. 스페이서 삽입 (T, TH 및 THT)과 같이 추가의 IgG1 길이를 증가시키는 것은 H2에서의 최소의 증분적 감소(incremental reduction)를 초래하나 HL 형성에서는 추가의 증분적 증가를 가져올 수 있는 것 같다. 돌연변이체 68, 67, 66, 및 56이 CPSC 코어 힌지 서열을 함유하기 때문에, HL 형성의 증가는 스페이서가 코어 힌지 시스테인과 떨어져 LC-HC 사슬간 이황화 결합 시스테인을 분리시키는데 더욱 효과적이고 이에 따라 분자내 이황화 결합을 형성하기 쉽다는 증거일 수 있다.
도 22의 데이터는 이황화 아이소형 이종성, 비교 돌연변이체 15 (ESKYCPPCPSCP) 및 68 (ESKYCDKCPSCP) 그리고 돌연변이체 55 (ESKYCPPTHTCPSCP) 및 56 (ESKYCDKTHTCPSCP)을 감소시키는 것에 관해 2개의 아미노산 스페이서의 선택으로서 DK가 PP보다 낫다는 것을 시사한다. PP와 같이 짧은 폴리-프롤린 모티프는 LC-HC 및 코어 힌지 시스테인의 국소 병렬 배치를 초래할 수 있는 어느 정도의 헬릭스 턴 포텐셜(helix turn potential)을 엔코딩할 수 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 국소 효과는 돌연변이체 44 (ESKYCPPAAACPSCP)에서 보여진 추가의 AAA에 의해 보다 잘 극복되는 것으로 보인다. 돌연변이체 68, 55, 56, 44 또는 69 중 어느 것도 현저하게 상이한 열 안정성을 갖지 않는 것으로 나타났다.
비- 스페이서 상부 힌지 서열 조성의 영향
LC-HC CH1간 시스테인의 상부 힌지 서열 N-말단의 서열 조성 (IgG4에서 ESKY 및 IgG1에서 EPKS)의 영향을 이해하기 위해, 돌연변이의 모든 과돌연변이를 돌연변이체 15 (ESKYCPPCPSCP)에 관해 만들었다. 도 23의 데이터는 PP 스페이서에 관해, 상부 힌지 조성의 과돌연변이들 중 어떤 것도 이황화 아이소형 이종성에 현저한 영향을 미치지 않는 것으로 보임을 나타낸다. 상기 제시된 데이터는 이러한 효과의 결핍이 주로 분자내 이황화 결합을 형성할 수 있는 짧은 PP 스페이서 및 코어 힌지 모티프를 단백질이 함유하기 때문임을 시사한다. 그러나, 열 안정성에서의 상당한 차이가 관찰되었다. 자연에서 발달된 서열 둘 모두; ESKP (83.8℃) 및 EPKS (80.6℃)가 하이브리드 서열; EPKY (76.3℃) 및 EPKS (79.0℃)보다 더욱 안정하였다. 이러한 데이터는 IgG1 EPKS 서열이 가장 바람직함을 나타낸다.
더욱 바람직한 DKTHT 스페이서 영역에 관해 ESKY 또는 EPKS 상부 힌지 모티프의 중요성을 이해하기 위해, 모든 과돌연변이들을 제조하였다. 도 24의 데이터는 천연 IgG4 ESKY 모티프 (돌연변이체 56 ESKYCDKTHTCPSCP)가 이황화 아이소형 이종성에 가장 민감함을 나타낸다. 도 24의 데이터는 천연 IgG1 상부 힌지 서열 (돌연변이체 65 EPKSCDKTHTCPSCP)이 이황화 아이소형 이종성에 최소의 포텐셜을 갖고 높은 열 안정성을 지님을 확인시켜 준다.
코어 힌지 Ser 에서 Pro 으로의 교환의 영향
천연 IgG4 코어 힌지 Ser (케이뱃 넘버링에 의해 Ser241)을 재도입시키기 위해 가장 바람직한 돌연변이체 48 (EPKSCDKTHTCPPCP)을 돌연변이시켜 돌연변이체 65 (EPKSCDKTHTCPSCP)를 생성하였다. 도 20의 데이터는 돌연변이체 48이 돌연변이체 15 (ESKYCPPCPSCP)에 비해 매우 현저하게 감소된 수준의 H2, HL, H 및 L을 갖고 매우 현저하게 증가된 열 안정성을 지님을 확인시켜 준다. 코어 힌지 Ser241 (돌연변이체 65)의 재도입은 돌연변이체 48에 비해 열 안정성에는 영향을 미치지 않았으나, HL의 현저한 수준의 재출현(reappearence)을 초래하였다. 돌연변이체 65는 여전히 돌연변이체 15에 비해 적은 H2, H 및 L을 지녔고, 이는 이황화 아이소형 동질성에 관해 상부 힌지 서열 길이 및 조성의 중요성을 설명하는 것임을 주목하여야 한다.
세포 용해에 의한 항체 이펙터 기능
세포 표면 항원을 발현시키는 표적 세포는 형광성 증강 리간드 BADTA와의 인큐베이션에 의해 표지된 그 세포내 함량을 지녔다. BADTA는 세포내에서 친수성 리간드로 전환된다. 표지된 세포를 항체 및 용해제인 PBMC (말초혈 단핵세포)와 인큐베이션하였다. 세포의 용해시에, ADCC에 의한 이러한 예에서, TDA가 방출되고 유로퓸이 세포 배양액으로 첨가될 때 안정한 형광성 킬레이트 EuTDA가 형성된다. 본질적으로, 세포 함량의 BADTA 표지화는 세포 용해를 정량할 수 있게 한다. 세포 용해는 다시 IgG에서의 이펙터 기능의 존재의 척도를 제공한다. 도 25 및 26은 세포를 IgG4로 ADCC에 의해 용해시키고자 한다. 헤르셉틴 항체 (트라스투주맙)의 유사체를 IgG1 야생형 및 IgG4 야생형 둘 모두로서 만들었다. 헤르셉틴에 대한 Her-2 항원을 MCF7 및 SKBR3 세포에서 발현시켰다. IgG 헤르셉틴 유사체의 돌연변이체를 또한 생성하고 ADCC 검정에 사용하기 위해 IgG를 정제시켰다. IgG4는 대조군 IgG1 야생형 (wt) 및 IgG4 야생형 (wt) 간의 차이에 의해 확인된 대로 ADCC를 수행하는 능력이 매우 낮은 것으로 알려져 있다. 선천적인 ADCC 포텐셜의 이러한 부족은 시험된 4개의 IgG4 돌연변이체들 중 어떠한 것에 의해서도 영향을 받지 않았다. 주목할 만하게는, 이들은 변경된 LC-HC 사슬간 이황화 결합 배열을 갖는 돌연변이체 28, 44 및 48을 포함하고, 가장 현저하게는 IgG1 상부 및 코어 힌지 모티프를 함유하는 돌연변이체 48 (EPKSCDKTHTCPPCP)을 포함한다. 그러므로, 이러한 데이터는 개시된 돌연변이체가 IgG1 상부 및 코어 힌지 서열의 이용을 통해 이펙터 기능을 획득하지 않음을 나타낸다.
IgG4 항체에 대한 돌연변이체의 광범한 적용가능성.
지금까지 기재된 모든 데이터는 특정 UCB 소유주 IgG4 항체인 Ab 410에 대한 것이다. 이황화 아이소형 동질성 및 열 안정성에서의 개선이 가변 영역 엔코딩된 이러한 IgG의 구조/안정성에 유일하지 않음을 입증하기 위해, 그 밖의 IgG4의 견본들을 생성하였다. 공개적으로 이용가능한 서열 정보를 이용하여 3개의 산업적으로 관련된 IgG들의 IgG4 유사체를 생성하였다: 트라스투주맙 (헤르셉틴), 나탈리주맙 (티사브리) 및 토실리주맙 (악템라). 총괄적으로, 도 28 내지 33에 도시된 데이터는 IgG4의 중요한 돌연변이체들의 상대적인 성능이 이황화 아이소형 동질성 및 상대 열 안정성 둘 모두에 관해, 모든 IgG4 견본들에서 고도로 유사하였음을 나타낸다. 각각의 견본의 절대 안정성은 IgG들의 상이한 고유 안정성에 대해 이전에 공개된 관찰로부터 예상된 바대로 서로 상이하다. 이러한 데이터는 개시된 돌연변이체들이 모든 IgG4 분자에서 이황화 아이소형 동질성을 개선시킬 수 있고 열 안정성을 증가시킬 수 있음을 시사한다.
실제 고려사항: 발현 및 숙주 세포에 대한 IgG4 돌연변이체의 효과
개시된 돌연변이체들은 많은 IgG4 분자의 이황화 아이소형 동질성을 개선시키고 열 안정성을 증가시켰다. 도 27의 데이터는 이러한 돌연변이체가 IgG4 발현에 불리한 영향을 주지 않음을 나타낸다. 제시된 발현 데이터는 개시된 4개의 항원, 즉 Ab410, 및 트라스투주맙, 나탈리주맙 및 토실리주맙의 유사체 각각의 특이성에 대해 CHO 세포로부터 일시적으로 발현된 각각의 돌연변이체에 대한 평균 발현이다. 이러한 데이터는 Fab 아암 사슬간 이황화 구조 및 상부 및 코어 힌지 서열이 CHO 세포로부터의 수율의 중요한 결정요소가 아님을 시사한다. 도 31의 데이터는 돌연변이체가 CHO-K1 또는 CHO-SXE 세포에서 발현되든지 간에 Ab410의 열 안정성이 같음을 나타낸다. 이러한 데이터는 IgG Fab 아암 사슬간 이황화 구조 및 상부 코어 힌지 서열에 대한 돌연변이가 개선된 열 안정성의 중요한 결정요소라는 것을 뒷받침한다.
SEQUENCE LISTING <110> UCB Pharma S.A. <120> Biological Products <130> G0138-WO01 <140> PCT/GB2011/051563 <141> 2011-08-19 <160> 71 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Hinge <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is absent or alanine <220> <221> misc_feature <222> (99)..(99) <223> Xaa is absent or glutamic acid <400> 1 Xaa Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Xaa Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Gly Gly Pro 115 120 <210> 2 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Hinge <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is absent or alanine <220> <221> misc_feature <222> (99)..(99) <223> Xaa is absent or glutamic acid <400> 2 Xaa Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Xaa Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro 115 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Light Chain <400> 3 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Heavy Chain IgG1 <400> 4 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 1 5 <210> 5 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Heavy Chain IgG1 <220> <221> misc_feature <222> (10)..(11) <223> discontinuous sequence <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> discontinuous sequence <400> 5 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 20 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Heavy Chain IgG2 <400> 6 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser 1 5 <210> 7 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Heavy Chain IgG2 <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> discontinuous sequence <220> <221> misc_feature <222> (12)..(13) <223> discontinuous sequence <400> 7 Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 1 5 10 Pro Val Ala Gly Pro 15 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Heavy Chain IgG3 <400> 8 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser 1 5 <210> 9 <211> 70 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Heavy Chain IgG3 <220> <221> misc_feature <222> (12)..(13) <223> discontinuous sequence <220> <221> misc_feature <222> (62)..(63) <223> discontinuous sequence <400> 9 Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg 1 5 10 15 Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys 20 25 30 Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 35 40 45 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 50 55 60 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 65 70 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Heavh Chain IgG4 <400> 10 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser 1 5 <210> 11 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Heavy Chain IgG4 <400> 11 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro... 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is absent or glutamic acid <400> 31 Xaa Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Xaa Ser Lys Tyr Cys Pro Pro Ala Ala Ala Cys Pro Ser Ser 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro 115 120 <210> 32 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Antibody 47 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is absent or alanine <220> <221> misc_feature <222> (99)..(99) <223> Xaa is absent or glutamic acid <400> 32 Xaa Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr 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Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 35 40 45 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 67 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Heavy chain IgD fragment <400> 67 Ile Ile Ser Gly Cys Arg His Pro Lys 1 5 <210> 68 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Heavy chain IgD Hinge fragment <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is absent or glutamic acid <400> 68 Xaa Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala Gln Pro Gln 1 5 10 15 Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg 20 25 30 Asn Thr <210> 69 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Heavy Chain IgM fragment <400> 69 Leu Val Ser Cys Glu Asn Ser Pro Ser 1 5 <210> 70 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Heavy Chain IgM fragment <400> 70 Glu Lys Asn Val Pro Leu Pro 1 5 <210> 71 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Heavy Chain IgM fragment <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is absent or valine <400> 71 Xaa Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys Val Ser Val 1 5 10

Claims (30)

  1. CH1 도메인 및 힌지 영역을 포함하는 하나 이상의 중쇄를 포함하는 클래스 IgG4의 항체로서, 이 때 각각의 중쇄에서:
    a. CH1 도메인에서 케이뱃(Kabat) 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 위치 127의 사슬간(inter-chain) 시스테인이 또 다른 아미노산으로 치환되고;
    b. 상부 힌지 영역에 정위된 아미노산들 중 하나 이상이 시스테인으로 치환되는, 클래스 IgG4의 항체.
  2. 제 1항에 있어서, 시스테인으로 치환되는 상부 힌지 영역에 정위된 하나 이상의 아미노산들이 케이뱃 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 227, 228, 229 및 230으로부터 선택되는 항체.
  3. 제 2항에 있어서, 케이뱃 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 위치 230의 글리신이 시스테인으로 치환되는 항체.
  4. 제 2항에 있어서, 케이뱃 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 위치 229의 티로신이 시스테인으로 치환되는 항체.
  5. 제 2항에 있어서, 케이뱃 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 위치 228의 리신이 시스테인으로 치환되는 항체.
  6. 제 2항에 있어서, 케이뱃 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 위치 227의 세린이 시스테인으로 치환되는 항체.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄에서 케이뱃 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 위치 239의 시스테인 및 위치 242의 시스테인이 또 다른 아미노산으로 치환되는 항체.
  8. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄에서 케이뱃 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 위치 239의 시스테인이 또 다른 아미노산으로 치환되는 항체.
  9. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄에서 케이뱃 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 위치 242의 시스테인이 또 다른 아미노산으로 치환되는 항체.
  10. CH1 도메인 및 힌지 영역을 포함하는 하나 이상의 중쇄를 포함하는 클래스 IgG4의 항체로서, 이 때 각각의 중쇄에서:
    a. 케이뱃 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 위치 127의 사슬간 시스테인이 또 다른 아미노산으로 치환되고;
    b. 케이뱃 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 위치 239의 시스테인 또는 위치 242의 시스테인이 또 다른 아미노산으로 치환되는, 클래스 IgG4의 항체.
  11. 제 7항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 239의 시스테인 및/또는 위치 242의 시스테인이 티올을 함유하지 않는 아미노산으로 치환되는 항체.
  12. 제 11항에 있어서, 티올을 함유하지 않는 아미노산이 세린인 항체.
  13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 127의 시스테인이 티올을 함유하지 않는 아미노산으로 치환되는 항체.
  14. 제 13항에 있어서, 티올을 함유하지 않는 아미노산이 세린인 항체.
  15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄가 케이뱃 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 아미노산 226-243 사이에 3개의 아미노산이 삽입되도록 돌연변이되는 항체.
  16. 제 15항에 있어서, 중쇄가 케이뱃 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 위치 238과 239 사이에 3개의 아미노산이 삽입되도록 돌연변이되는 항체.
  17. 제 16항에 있어서, 3개의 알라닌이 케이뱃 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 위치 238과 239 사이에 삽입되는 항체.
  18. 제 16항에 있어서, 트레오닌, 히스티딘 및 추가의 트레오닌이 케이뱃 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 위치 238과 239 사이에 삽입되는 항체.
  19. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 케이뱃 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 위치 241의 세린이 프롤린으로 치환되는 항체.
  20. 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 230의 글리신이 시스테인으로 치환되고, 위치 227의 세린이 프롤린으로 치환되고, 위치 229의 티로신이 세린으로 치환되고, 위치 237의 프롤린이 아스파르트산으로 치환되고, 위치 238의 프롤린이 리신으로 치환되고, 아미노산 서열 트레오닌-히스티딘-트레오닌이 위치 238과 239 사이에 삽입되고, 위치 241의 세린이 프롤린으로 치환되는 항체.
  21. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄가 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 방법.
  22. 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 2개의 중쇄를 포함하는 항체.
  23. 제 22항에 있어서, 중쇄들이 동일한 것인 항체.
  24. 제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 또는 각각의 중쇄가 길이가 12 내지 17개 아미노산인 상부 힌지 영역 및 코어 영역을 포함하는 항체.
  25. 제 24항에 있어서, 상부 힌지 및 코어 영역이 15개의 아미노산 길이를 갖는 항체.
  26. 제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 정의된 항체를 엔코딩하는 서열을 포함하는 발현 벡터.
  27. 제 26항에 정의된 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  28. 질환 또는 질병의 치료에 사용하기 위한 제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 정의된 항체.
  29. 제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 정의된 치료적 유효량의 항체를 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 질병을 치료하는 방법.
  30. 상부 힌지, 코어 및 하부 힌지를 갖는 중쇄를 포함하는 IgG4 항체로서, 그 안에 있는 중쇄 또는 각각의 중쇄에서 상기 상부 힌지 및 코어가 12 내지 17개의 아미노산 길이, 예컨대 15개의 아미노산 길이인 IgG4 항체.

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