BR112013003262B1 - Anticorpos melhorados da classe igg4 - Google Patents

Abstract

ANTICORPOS MELHORADOS DA CLASSE IGG4. A presente invenção fornece um anticorpo da classe igG4 que compreendendo pelo menos uma cadeia pesada que compreende um domínio de CH1 e uma região da dobradiça em que em cada cadeia pesada: a. a cisteína inter-cadeias na posição 127, numerada de acordo com o sistema de numeração Kabat, no domínio de CH1 é substituída com outro aminoácido; e b. um ou mais dos aminoácidos posicionados na região da dobradiça superior são substituídos com cisteína.

Description

[0001] A presente invenção refere-se a um anticorpo melhorado tendo uma disposição alterada de ligações de dissulfeto em comparação com um anticorpo do tipo silvestre e um método para produzir o anticorpo melhorado.

[0002] A indústria biofarmacêutica que abrange as proteínas recombinantes, anticorpos monoclonais (mAbs) e medicamentos à base de ácido nucléico está crescendo rapidamente. A engenharia de anticorpos resultou no projeto e produção de fragmentos de anticorpos ou formatos alternativos. O formato molecular preferido juntamente com os outros aspectos tais como rendimento de produção, qualidade da proteína e estabilidade de armazenamento são levados em consideração quando se seleciona uma proteína à base de anticorpos como um agente terapêutico.

[0003] A estrutura básica de todas as moléculas de imunoglobulina (Ig) compreende duas cadeias pesadas idênticas (HCs) e duas cadeias leves idênticas (LCs), que estão acopladas por ligações de dissulfeto. Cada LC consiste de um domínio variável (VL) e constante (CL). Com base na HC, cinco classes principais de Ig são reconhecidas: IgG, IgA, IgD, IgE e IgM. Para a IgG, a HC consiste de um domínio variável (VH) e três domínios constantes (CH1-3). Os domínios CH2 e CH3 formam a parte de Fc da molécula que é responsável pela estimulação da função efetora e está ligada ao fragmento Fab (VHVL e CHCL) por uma região da dobradiça que confere flexibilidade à molécula de IgG. Dois sítios de reconhecimento do antígeno estão localizados nas extremidades dos domínios VL e VH. A IgG é ainda subdividida em 4 isótipos diferentes: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.

[0004] As funções efetoras mediadas por Fc, isto é, a citotoxicidade dependente de anticorpo (ADCC) ou a citotoxicidade dependente do complemento (CDC), são dependentes do isótipo. Cada isótipo evolui para executar uma função específica dentro do corpo. O isótipo de IgG1 é atualmente o mais amplamente utilizado como um produto terapêutico devido à sua meia-vida prolongada, ativação de ADCC acentuada e ativação do complemento. Outros isótipos são considerados como agentes terapêuticos dependentes do alvo e efeito desejado. Por exemplo, quando os antígenos alvos devem ser simplesmente neutralizados e as funções efetoras forem menos importantes, isótipos alternativos tais como IgG2 e IgG4 podem ser usados. Alternativamente, a IgG com a função Fc/efetoara re-planejada pode ser considerada.

[0005] A IgG2 também possui a função efetora associada mínima mas é propensa a dimerização que não é totalmente compreendida. A IgG4 permanece um isótipo útil por causa da sua falta relativa de indução da função efetora. No entanto, a IgG4 também possui algumas dificuldades práticas inerentes, a saber, a sua propensão em formar um anticorpo pela metade, a sua capacidade em trocar moléculas ao meio e a sua meia vida no soro mais curta.

[0006] In vitro, as moléculas de IgG4 se adaptam à estrutura prototípica de IgG, mas in vivo têm sido observadas de formar meias moléculas de cada uma compreendendo uma única cadeia leve e uma única cadeia pesada motivada pela formação de ligações de dissulfeto intra cadeia pesada dentro da dobradiça. Uma grande porcentagem de IgG4 circulante têm sido observada ser biespecífica, mas funcionalmente monovalente. Isto é porque a meia-molécula pode formar IgG4 com outras meias moléculas de IgG4 (Schuurman, J., Van Ree, R., Perdok, G.J., Van Doorn, H.R., Tan, K.Y., Aalberse, R.C., 1999. Normal human immunoglobulin G4 is bispecific: it has two different antigen-combining sites. Immunology 97, 693-698).

[0007] A formação de moléculas pela metade de IgG4 pode ser reduzida pela introdução de uma mutação de Ser a Pro na posição 241 (numerada de acordo com o sistema de numeração Kabat) na dobradiça (Angal,S. et al., 1993. A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human (IgG4) antibody. Mol Immunol 30, 105-108). Além disso, esta mutação pontual não influencia a estrutura compacta da IgG4 permitindo assim a IgG4 de reter a sua capacidade reduzida em ativar o complemento.

[0008] Seguindo a descoberta da mutação S241P, outras mutações para a IgG4 têm sido investigadas a fim de compreender a interação inter-cadeia pesada nos anticorpos de IgG4, reduzir a função efetora de IgG4 e intensificar a estabilidade estrutural. Em Schuurman et al. (Schuurman,J et al., 2001. The inter-heavy chain disulphide bonds of IgG4 are in equilibrium with intra-chain disulphide bonds. Molecular Immunology 38, 1-8), a instabilidade observada de ligações de dissulfeto inter-cadeia pesada de IgG4 foi investigada utilizando mutantes de IgG4. No mutante M1 Cys 131 (numerado de acordo com o sistema de numeração da EU ou Cys 127 de acordo com o sistema de numeração Kabat), que está envolvido na ligação de dissulfeto inter-cadeia pesado-leve (CL-CH1), foi substituído por serina e observou-se que este mutante resultou na formação de dímeros de cadeias leves e dímeros de cadeias pesadas. No mutante M2 a cisteína 226 (numerada 226 de acordo com o sistema de numeração da EU ou 239 de acordo com o sistema de numeração Kabat), que está envolvida em uma ligação de dissulfeto inter-cadeia pesada na dobradiça, foi substitua por serina e observou-se que este mutante tinha uma ligação inter-cadeia pesada mais estável em comparação com a IgG4 e impede a formação de uma ligação de dissulfeto inter-cadeia pesada.

[0009] As mutações nos domínios de CH2 e CH3 de anticorpos de IgG4 também foram investigadas a fim de reduzir a formação de agregados de anticorpos de IgG4. A US 2008/0063635 Takahashi et al. investigou um mutante de IgG4 em que a arginina na posição 409 (numerada 409 de acordo com o sistema de numeração da EU ou numerada 440 de acordo com o sistema de numeração Kabat) no domínio CH3 é substituída por lisina, treonina, metionina ou leucina de modo a inibir a formação de agregados em pH baixo. Outras mutações em L235, D265, D270, K322, P329 e P331 (L235, D265, D270, K322, P329 e P331 numeradas de acordo com o sistema de numeração da EU ou L248, D278, D283, K341, P348 e P350 numeradas de acordo com o sistema de numeração Kabat) também são instruídas a fim de atenuar a atividade de CDC. A WO 2008/145142 Van de Winkel et al. divulga anticorpos de IgG4 estáveis que possuem uma capacidade reduzida de passar pela troca de ramificação Fab através da substituição do resíduo de arginina na posição 409, do resíduo Phe na posição 405 ou do Lys na posição 370 (numerados R409, F405 e K370 de acordo com o sistema de numeração da EU ou numerados R440, F436 e K393 de acordo com o sistema de numeração Kabat) mesmo na ausência da mutação S228P (numerada S228 de acordo com o sistema de numeração da EU ou S241 de acordo com o sistema de numeração Kabat) na região da dobradiça.

[0010] A alteração do número de resíduos de cisteína presentes na região da dobradiça de anticorpos foi previamente investigada. A US 5677425 Bodmer et al. divulga que o número de resíduos de cisteína na região da dobradiça pode ser aumentado a fim de facilitar a utilização dos grupos de cisteína tiol para a fixação de moléculas efetoras ou repórter. A US 5677425 também ensina que o número de resíduos de cisteína na região da dobradiça pode ser reduzido para um, de modo a facilitar a montagem das moléculas de anticorpo, visto que apenas será necessário formar uma ligação de dissulfeto única, o que irá fornecer um alvo específico para a ligação da região da dobradiça a outra região da dobradiça ou a uma molécula efetora ou repórter.

[0011] No entanto, existe ainda uma necessidade de fornecer novos anticorpos tendo propriedades melhoradas que os torna ainda mais adequados para uso como um produto terapêutico. A presente invenção fornece novos anticorpos mutantes que possuem propriedades vantajosas, incluindo propriedades biofísicas melhoradas em comparação com os anticorpos do tipo silvestre. Em particular, foi surpreendentemente observado que a modificação da posição do resíduo de cisteína na cadeia pesada de um anticorpo de IgG4 que forma uma ligação de dissulfeto com uma cisteína na cadeia leve fornece um anticorpo de IgG4 tendo estabilidade melhorada em comparação com um anticorpo de IgG4 tipo silvestre. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0012] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo da classe IgG4 que compreende pelo menos uma cadeia pesada que compreende um domínio de CH1 e uma região da dobradiça, em que em cada cadeia pesada: a. a cisteína inter-cadeia na posição 127, numerada de acordo com o sistema de numeração Kabat, no domínio de CH1, é substituída com outro aminoácido; e b. um ou mais dos aminoácidos posicionados na região da dobradiça superior são substituídos com cisteína.

[0013] A cisteína no domínio de CH1, que forma uma ligação de dissulfeto de inter- cadeia com uma cisteína em uma cadeia leve é a cisteína na posição 127, numerada de acordo com o sistema de numeração Kabat, é mostrada na Figura 1b.

[0014] A alteração da posição da ligação de dissulfeto na região constante de IgG4 resulta em uma Tm superior sendo observada para o domínio de Fab. A temperatura em que 50 % da proteína é desdobrada é designada a Tm. Experimentalmente, a Tm é determinada como o ponto de inflexão, por exemplo, da curva de fluorescência vs. temperatura (isto é, a temperatura onde a curva de fluorescência vs. temperatura é mais íngreme).

[0015] Assim, uma Tm mais elevada infere uma maior estabilidade térmica. Assim, as moléculas da presente divulgação possuem uma estabilidade térmica mais elevada.

[0016] Embora não desejando ser limitado pela teoria, este pode ser o resultado da redução da pressão ou tensão interna na ligação de dissulfeto ou nas moléculas polipeptídicas obtidas.

[0017] Outras melhoras na estabilidade térmica também pode ser obtidas pela introdução de modificações adicionais dentro da região constante de IgG4.

[0018] Os um ou mais aminoácidos posicionados na região da dobradiça superior que são substituídos com cisteína podem ser selecionados de 226, 227, 228, 229, 230, 237 e 238, numerados de acordo com o sistema de numeração Kabat, conforme mostrado na Figura 1b (aminoácidos sublinhados na região da dobradiça superior).

[0019] Em uma forma de realização preferida, o um ou mais aminoácidos posicionados na região da dobradiça superior, que são substituídos com cisteína, são um ou mais dos aminoácidos nas posições selecionadas de 227, 228, 229 e 230, numeradas de acordo com o sistema de numeração Kabat, conforme mostrado nas Figuras 1b e 2a. Nesta última disposição a formação da ligação de dissulfeto inter-cadeias (cadeia leve-cadeia pesada) está em uma posição análoga à ponte de dissulfeto observada nas regiões constantes de IgG1.

[0020] Os presentes inventores estabeleceram que as moléculas de IgG1 possuem maior estabilidade térmica do que as moléculas de IgG4 nos domínios de Fab e Fc. No entanto, a presente divulgação permite a provisão de uma molécula de IgG4 sem função efetora ADCC, mas com a estabilidade térmica e/ou outras propriedades vantajosas como para uma molécula de IgG1.

[0021] Parece haver três aspectos gerais que influenciam a estabilidade do domínio de Fab na molécula de IgG4 formada. O primeiro é a posição da ponte de dissulfeto. O segundo é o ambiente próximo à ponte de dissulfeto, isto é, a natureza dos resíduos em torno da ligação de dissulfeto e o terceiro é a extensão da região da dobradiça superior.

[0022] Assim a presente invenção também fornece um anticorpo de IgG4 compreendendo uma cadeia pesada com uma dobradiça superior, núcleo e dobradiça inferior, e dita dobradiça superior e núcleo na cadeia pesada ou cada cadeia pesada nesse particular é de 13 a 17, tal como 15 aminoácidos de comprimento.

[0023] Em uma forma de realização, o anticorpo de IgG4 possui uma dobradiça superior e núcleo de 15 aminoácidos de comprimento.

[0024] Em uma forma de realização a dobradiça superior e o núcleo compreendem os 12 aminoácidos naturais encontrados em uma dobradiça de IgG4 e aidna três aminoácidos, por exemplo, três resíduos de alanina, ou 3 resíduos de glicina ou uma combinação destes.

[0025] Em uma forma de realização a dobradiça possui uma das seguintes sequências: ESKYGPPAAACPSCP SEQ ID No: 72 ESKYGPPGGGCPSCP SEQ ID No: 73 ESKYGPPTHTCPSCP SEQ ID No: 74 ESKYGDKTHTCPSCP SEQ ID No: 75 EPSKYGPPAAACPSCP SEQ ID No: 76 EPSKYGPPGGGCPSCP SEQ ID No: 77 EPSKYGPPTHTCPSCP SEQ ID No: 78 EPSKYGDKTHTCPSCP SEQ ID No: 79 ESKSYGPPAAACPSCP SEQ ID No: 80 ESKSYGPPGGGCPSCP SEQ ID No: 81 ESKSYGPPTHTCPSCP SEQ ID No: 82 ESKSYGDKTHTCPSCP SEQ ID No: 83 ESKYGPPAAACPPCP SEQ ID No: 84 ESKYGPPGGGCPPCP SEQ ID No: 85 ESKYGPPTHTCPPCP SEQ ID No: 86 ESKYGDKTHTCPPCP SEQ ID No: 87 EPSKYGPPAAACPPCP SEQ ID No: 88 EPSKYGPPGGGCPPCP SEQ ID No: 89 EPSKYGPPTHTCPPCP SEQ ID No: 90 EPSKYGDKTHTCPPCP SEQ ID No: 91 ESKSYGPPAAACPPCP SEQ ID No: 92 ESKSYGPPGGGCPPCP SEQ ID No: 93 ESKSYGPPTHTCPPCP SEQ ID No: 94 ESKSYGDKTHTCPPCP SEQ ID No: 95

[0026] Em uma forma de realização a dobradiça superior e o núcleo na molécula de IgG4 da divulgação consiste de uma dobradiça de IgG1 natural, isto é, EPKSCDKTHTCPPC SEQ ID No: 96, ou um seu derivado, tais como: EPKSCDKAAACPPCP SEQ ID No: 97 EPKSCDKGGGCPPCP SEQ ID No: 98 EPKSCDKTHTSPPCP SEQ ID No: 99 EPKSCDKTHTCPPSP SEQ ID No: 100 EPKSCDKTHTSPPSP SEQ ID No: 101 EPKSCDKAAASPPCP SEQ ID No: 102 EPKSCDKAAACPPSP SEQ ID No: 103 EPKSCDKAAASPPSP SEQ ID No: 104 EPKSCDKGGGSPPCP SEQ ID No: 105 EPKSCDKGGGCPPSP SEQ ID No: 106 EPKSCDKGGGSPPSP SEQ ID No: 107

[0027] Em um outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo da classe IgG4 compreendendo pelo menos uma cadeia pesada que compreende um domínio de CH1 e uma região da dobradiça, em que em cada cadeia pesada: a cisteína inter-cadeias na posição 127, numerada de acordo com o sistema de numeração Kabat, no domínio de CH1 é substituída com outro aminoácido, e a dobradiça na cadeia pesada ou cada cadeia pesada nesse particular é de 15 aminoácidos de comprimento.

[0028] As dobradiças adequadas são descritas acima.

[0029] Em um outro aspecto, a presente invenção também fornece um anticorpo da classe IgG4 compreendendo pelo menos uma cadeia pesada que compreende um domínio de CH1 e uma região da dobradiça, em que em cada cadeia pesada: a. a cisteína na posição 127, numerada de acordo com o sistema de numeração Kabat, é substituída com outro aminoácido; e b. a cisteína na posição 239 ou a cisteína na posição 242, numerada de acordo com o sistema de numeração Kabat, são substituídas por outro aminoácido.

[0030] Em uma forma de realização de acordo com o último aspecto da invenção, a molécula de IgG4 também contém 22 aminoácidos na dobradiça, por exemplo, como descrito acima.

[0031] Os anticorpos fornecidos pela presente invenção apresentam propriedades vantajosas em comparação com um anticorpo de IgG4 tipo silvestre. Foi surpreendentemente observado que os anticorpos da presente invenção apresentam estabilidade térmica melhorada, em particular do domínio de Fab em comparação com um anticorpo de IgG4 tipo silvestre.

[0032] Em um outro aspecto, a presente invenção também fornece um anticorpo da classe IgG3 que compreende pelo menos uma cadeia pesada que compreende um domínio de CH1 e uma região da dobradiça, em que em cada cadeia pesada: a. a cisteína no domínio de CH1 que forma uma ligação de dissulfeto inter- cadeias com uma cisteína em uma cadeia leve é substituída com outro aminoácido; e b. um ou mais dos aminoácidos posicionados na região da dobradiça superior são substituídos com cisteína.

[0033] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um anticorpo da classe IgM compreendendo pelo menos uma cadeia pesada que compreende um domínio de CH1 e um domínio CH2, em que em cada cadeia pesada: a. a cisteína no domínio CH1 que forma uma ligação de dissulfeto inter- cadeias com uma cisteína em uma cadeia leve é substituída com outro aminoácido; e b. um ou mais dos aminoácidos posicionados no domínio de CH1 ou no domínio de CH2 são substituídos com cisteína.

[0034] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo da classe IgD compreendendo pelo menos uma cadeia pesada que compreende um domínio de CH1 e uma região da dobradiça, em que em cada cadeia pesada: a. a cisteína no domínio de CH1 que forma uma ligação de dissulfeto inter- cadeias com uma cisteína em uma cadeia leve é substituída com outro aminoácido, e b. um ou mais dos aminoácidos posicionados na região da dobradiça são substituídos por cisteína.

[0035] A presente invenção também fornece um vetor de expressão que compreende uma sequência que codifica os anticorpos da presente invenção e uma célula hospedeira que compreende o vetor de expressão.

[0036] A presente invenção também fornece um anticorpo como definido acima para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio. Além disso, é fornecido um método para o tratamento de uma doença ou distúrbio compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo como definido acima.

[0037] Em uma forma de realização o anticorpo é para uso no tratamento de uma doença diferente de câncer.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0038] A Figura 1a mostra as sequências humanas de CH1 e da dobradiça de IgG1 tipo silvestre e IgG4 tipo silvestre, em que os resíduos da dobradiça são sublinhados, e a sequência constante de cadeia leve capa.

[0039] A Figura 1b mostra: a sequência constante humana de cadeia leve capa que indica a cisteína (sublinhada) que forma a ligação de dissulfeto inter-cadeias CL-CH1; os resíduos CH1 N-terminais de cadeia pesada de IgG 1, 2, 3 e 4 humanos e as sequências da região da dobradiça em que a posição da cisteína (na dobradiça superior para IgG1 e na CH1 N-terminal para IgG 2, 3 e 4) é indicada (sublinhada) que forma a ligação de dissulfeto inter-cadeias CL-CH1; os resíduos de CH1 N-terminais de cadeia pesada IgD humanos e parte das sequências da região de dobradiça em que a posição da cisteína na sequência N- terminal é indicada (sublinhada) a qual forma a ligação de dissulfeto CL-CH1 inter- cadeias; a cadeia pesada de IgM humana N-terminal CH1, os resíduos de CH1 C- terminais e os resíduos de CH2 N-terminais selecionados em que a posição da cisteína no CH1 N-terminal é indicada (sublinhada) a qual forma a ligação de dissulfeto de CL-CH1 inter-cadeias; e os resíduos na dobradiça superior de IgG3 e IgG4, a dobradiça de IgD e na CH1 C-terminal e na CH2 de IgM onde os resíduos sublinhados indicam as posições onde um ou mais resíduos podem ser substituídos com cisteína nos anticorpos da presente invenção.

[0040] A Figura 2a mostra o resíduo de cisteína CH1 (C127) que forma a ligação de dissulfeto inter-cadeias com uma cisteína na cadeia leve e nos resíduos da dobradiça superior e núcleo de IgG1 tipo silvestre, IgG4 tipo silvestre e nas posições onde as mutações foram introduzidas no anticorpos de IgG4 da presente invenção.

[0041] A Figura 2b mostra o resíduo de cisteína CH1 (C127) que forma a ligação de dissulfeto inter-cadeias com uma cisteína na cadeia leve e nos resíduos da dobradiça de IgG3 tipo silvestre e nas posições onde um ou mais resíduos são substituídos com cisteína nos anticorpos de IgG3 da presente invenção.

[0042] A Figura 2c mostra o resíduo de cisteína CH1 (C127) que forma a ligação de dissulfeto inter-cadeias com uma cisteína na cadeia leve e resíduos de CH1 e CH2 selecionados de IgM tipo silvestre e nas posições onde um ou mais resíduos são substituídos com cisteína nos anticorpos de IgM da presente invenção.

[0043] A Figura 2d mostra o resíduo de cisteína CH1 (C128) que forma a ligação de dissulfeto inter-cadeias com uma cisteína na cadeia leve e nos resíduos da dobradiça de IgD tipo silvestre e nas posições onde um ou mais resíduos são substituídos com cisteína nos anticorpos de IgD da presente invenção.

[0044] A Figura 3a mostra as mutações introduzidas nos anticorpos de IgG4 de acordo com a presente invenção.

[0045] A Figura 3b mostra as posições dos resíduos na cadeia pesada transformada dos anticorpos de IgG4 mostrados na Figura 3a e a ligação de dissulfeto prevista que se pode formar com uma cisteína na cadeia leve (LC) ou com uma outra cadeia pesada transformada (HC). Onde a cisteína pode se ligar com uma cisteína na LC ou HC, a cadeia sublinhada é a disposição da ligação de dissulfeto predominante prevista.

[0046] A Figura 4a mostra as mutações introduzidas nos anticorpos IgG4 de acordo com a presente invenção.

[0047] A Figura 4b mostra as posições dos resíduos de cisteína nos anticorpos de IgG4 mostrados na Figura 4a e a ligação de dissulfeto prevista que se pode formar com uma cisteína na cadeia leve (LC) ou na cadeia pesada (HC). Onde a cisteína pode se ligar com uma cisteína na LC ou HC, a cadeia sublinhada é a disposição da ligação de dissulfeto predominante prevista.

[0048] A Figura 5 mostra as sequências da CH1 e região da dobradiça de anticorpos de IgG4 de acordo com a presente invenção.

[0049] A Figura 6 mostra as sequências da CH1, da região de dobradiça, CH2 e CH3 de anticorpos de IgG4 de acordo com a presente invenção.

[0050] A Figura 7 mostra a análise de Western Blot de anticorpos de acordo com a presente invenção com o gel da parte superior que mostra os resultados utilizando um anticorpo de Fc anti-humano e o gel da parte inferior que mostra os resultados utilizando um anticorpo anti-capa.

[0051] A Figura 8 mostra a análise de Western Blot de anticorpos de acordo com a presente invenção com o gel da parte superior que mostra os resultados utilizando um anticorpo de Fc anti-humano e o gel da parte inferior que mostra os resultados utilizando um anticorpo capa anti-humano.

[0052] A Figura 9 mostra a análise de Western Blot de anticorpos de acordo com a presente invenção com o gel da parte superior que mostra os resultados utilizando um anticorpo de Fc anti-humano e o gel da parte inferior que mostra os resultados utilizando um anticorpo capa anti-humano.

[0053] A Figura 10 mostra a análise de Western Blot de um anticorpo de acordo com a presente invenção com o gel da parte superior que mostra os resultados utilizando um anticorpo de Fc anti-humano e o gel da parte inferior que mostra os resultados utilizando um anticorpo capa anti-humano.

[0054] A Figura 11 mostra os resultados de uma análise Thermofluor de anticorpos da presente invenção que mostra as estabilidades térmicas do domínio de Fab e CH2.

[0055] A Figura 12 mostra os resultados de uma análise Thermofluor de anticorpos da presente invenção que mostra as estabilidades térmicas do domínio de Fab e CH2.

[0056] A Figura 13 mostra os resultados de uma análise Thermofluor de anticorpos da presente invenção que mostra as estabilidades térmicas do domínio de Fab e CH2.

[0057] A Figura 14 mostra os resultados de uma análise Thermofluor de anticorpos da presente invenção que mostra as estabilidades térmicas do domínio de Fab e CH2.

[0058] A Figura 15 mostra a classificação das estabilidades térmicas dos anticorpos selecionados da presente invenção.

[0059] A Figura 16 mostra os resultados de um ensaio de afinidade para os anticorpos selecionados da presente invenção e para os anticorpos de controle.

[0060] A Figura 17 mostra os resultados de uma análise de HPLC de anticorpos selecionados da presente invenção.

[0061] A Figura 18 mostra uma análise de Western Blot de anticorpos de acordo com a presente invenção com ligantes diferentes.

[0062] A Figura 19 mostra uma análise de Western Blot de anticorpos de acordo com a presente invenção com ligantes diferentes.

[0063] As Figuras de 20 a 24 mostram uma análise de Western Blot de anticorpos de acordo com a presente invenção com várias mutações.

[0064] As Figuras 25 e 26 mostram a função efetora ADCC dos vários anticorpos incluindo certos anticorpos de acordo com a invenção.

[0065] A Figura 27 mostra a expressão de vários anticorpos de acordo com a invenção.

[0066] A Figura 28 mostra um Western Blot de várias mutações do anticorpo Herceptin.

[0067] A Figura 29 mostra um Western Blot de várias mutações do anticorpo Tysabri.

[0068] A Figura 30 mostra um Western Blot de várias mutações do anticorpo Actemra.

[0069] As Figuras de 31 a 34 mostram os resultados de uma análise Thermofluor de vários anticorpos de acordo com a invenção.

BREVE DIVULGAÇÃO DAS SEQUÊNCIAS

[0070] A SEQ ID NO: 1 mostra a sequência de CH1 e região da dobradiça de um anticorpo de IgG1 tipo silvestre.

[0071] A SEQ ID NO: 2 mostra a sequência de CH1 e região da dobradiça de um anticorpo de IgG4 tipo silvestre.

[0072] A SEQ ID NO: 3 mostra uma parte da região constante de uma cadeia leve capa humana tipo silvestre.

[0073] A SEQ ID NO: 4 mostra uma parte da sequência N-terminal do domínio de CH1 de um anticorpo de IgG1 humano.

[0074] A SEQ ID NO: 5 mostra a região da dobradiça de um anticorpo de IgG1 humano.

[0075] A SEQ ID NO: 6 mostra uma parte da sequência N-terminal do domínio de CH1 de um anticorpo de IgG2 humano.

[0076] A SEQ ID NO: 7 apresenta a região da dobradiça de um anticorpo de IgG2 humano.

[0077] A SEQ ID NO: 8 mostra uma parte da sequência N-terminal do domínio de CH1 de um anticorpo de IgG3 humano.

[0078] A SEQ ID NO: 9 mostra a região da dobradiça de um anticorpo de IgG3 humano.

[0079] A SEQ ID NO: 10 mostra uma parte da sequência N-terminal do domínio de CH1 de um anticorpo de IgG4 humano.

[0080] A SEQ ID NO: 11 mostra a região da dobradiça de um anticorpo de IgG4 humano.

[0081] As SEQ ID NOs: 12 a 37 mostram o domínio de CH1 e as sequências da região da dobradiça de anticorpos 6, 7, 8, 15, 16, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 44, 45, 46, 47, 2, 3, 48, 28P e 44P, respectivamente.

[0082] As SEQ ID NOs: 38 a 63 mostram o domínio de CH1, a região da dobradiça, sequências de domínio de CH2 e domínio de CH3 de anticorpos 6, 7, 8, 15, 16, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 44, 45, 46, 47, 2, 3, 48, 28P e 44P, respectivamente.

[0083] A SEQ ID NO: 64 mostra as sequências de domínio de CH2 e CH3 de IgG4 tipo silvestre.

[0084] A SEQ ID NO: 65 mostra as sequências de domínio de CH2 de IgG4 tipo silvestre e de CH3 de IgG1 tipo silvestre.

[0085] A SEQ ID NO: 66 mostra a sequência da região constante de uma cadeia leve capa humana tipo silvestre.

[0086] A SEQ ID NO: 67 apresenta uma parte da sequência N-terminal do domínio de CH1 de um anticorpo de IgGD humano.

[0087] A SEQ ID NO: 68 mostra uma parte da região da dobradiça de um anticorpo de IgGD humano.

[0088] A SEQ ID NO: 69 mostra uma parte da sequência N-terminal do domínio de CH1 de um anticorpo de IgGM humano.

[0089] A SEQ ID NO: 70 mostra uma parte da sequência C-terminal do domínio de CH1 de um anticorpo de IgGM humano.

[0090] A SEQ ID NO: 71 mostra uma parte do domínio de CH2 de um anticorpo de IgGM humano.

[0091] As SEQ ID NOs: 72 a 295 mostram as várias regiões da dobradiça.

[0092] Descrição Detalhada das Formas de Realização Preferidas da Invenção

[0093] A presente invenção será agora descrita com maiores detalhes.

[0094] Os termos “proteína” e “polipeptídeo” são aqui usados de modo trocável, a não ser que o contexto indique de outra maneira. “Peptídeo” destina-se a se referir a 10 ou menos aminoácidos.

[0095] Os termos “polinucleotídeo” inclui um gene, DNA, cDNA, RNA, mRNA, etc a não ser que o contexto indique de outra maneira.

[0096] Como aqui utilizado, o termo “compreendendo” no contexto do presente relatório descritivo deve ser interpretado como “incluindo”.

[0097] O termo “tipo silvestre” no contexto da presente invenção significa um anticorpo como pode ocorrer na natureza ou pode ser isolado do meio ambiente, que não compreende quaisquer mutações geneticamente planejadas.

[0098] A designação para uma mutante de substituição aqui consiste de uma letra seguida por um número seguido por uma letra. A primeira letra designa o aminoácido na proteína tipo silvestre. O número refere-se à posição de aminoácido onde a substituição de aminoácido está sendo feita, e a segunda letra designa o aminoácido que é utilizado para substituir o aminoácido tipo silvestre.

[0099] Os resíduos nos domínios de anticorpo variáveis e constantes são convencionalmente numerados de acordo com um sistema planejado por Kabat et al. Este sistema é apresentado em Kabat et al. This system is set forth in Kabat et al., 1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (hereafter “Kabat et al. (supra)”).

[00100] As designações de resíduo Kabat nem sempre correspondem diretamente com a numeração linear dos resíduos de aminoácido. A sequência de aminoácido linear real pode conter menos aminoácidos ou adicionais do que na numeração de Kabat estrita que corresponde a um encurtamento, ou inserção, de um componente estrutural, quer na estrutura quer na região determinante complementar (CDR), da estrutura do domínio variável básica. A numeração de Kabat correta dos resíduos pode ser determinada para um dado anticorpo mediante o alinhamento dos resíduos de homologia da sequência do anticorpo com uma sequência numerada Kabat “padrão”.

[00101] Alternativamente, a numeração de resíduos de aminoácido pode ser executada pelo índice EU ou sistema de numeração EU (também descrito em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)).

[00102] Um outro sistema de numeração de resíduos de aminoácido nos anticorpos é o sistema de numeração IMGT (Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 29, 185-203 (2005)).

[00103] O sistema de numeração Kabat é utilizado no presente relatório descritivo exceto onde de outra maneira indicado em que o sistema de numeração da EU ou sistema de numeração IMGT é utilizado.

[00104] Entre os quatro isótipos IgG4, as disposições de ligação de dissulfeto intracadeias na cadeia pesada e leve são semelhantes, enquanto que as disposições de ligação de dissulfeto intercadeias são únicas para cada isótipo [Revisado por (Wypych,J., Li,M., Guo,A., Zhang,Z., Martinez,T., Allen,M.J., Fodor,S., Kelner,D.N., Flynn,G.C., Liu,Y.D., Bondarenko,P.V., Ricci,M.S., Dillon,T.M., Balland,A., 2008. Human IgG2 antibodies display disulphide-mediated structural isoforms. J Biol Chem. 283, 16194-16205)].

[00105] Como mostrado na Figura 1b, as sequências da região da dobradiça dos quatro isótipos IgG4 diferem. A região da dobradiça completa ou genética consiste tipicamente de resíduos de 226 a 251 (numeração com base no sistema de numeração Kabat). A Figura 1b mostra as seções superiores, de núcleo e inferiores das regiões da dobradiça dos quatro isótipos IgG4. Para o isótipo IgG1, a região da dobradiça superior é os resíduos de 226 a 238, a região da dobradiça do núcleo é os resíduos de 239 a 243 e a região da dobradiça inferior é os resíduos de 244 a 251. Para o isótipo IgG4, a região da dobradiça superior é os resíduos de 226 a 238, a região da dobradiça do núcleo é os resíduos de 239 a 243 e a região da dobradiça inferior é os resíduos de 244 a 251.

[00106] Assim, a dobradiça compreendendo a dobradiça superior, de núcleo e a dobradiça inferior de uma IgG1 possui 23 aminoácidos de comprimento como mostrado na Figura 1a. A dobradiça superior é de 10 aminoácidos. O núcleo é de 5 aminoácidos e a dobradiça inferior é de 8, ver, por exemplo, a figura 1b.

[00107] A dobradiça que compreende a dobradiça superior, de núcleo e a dobradiça inferior em uma IgG4 é de 20 aminoácidos de comprimento como mostrado na Figura 1a. A dobradiça superior é de 7 aminoácidos. O núcleo é de 5 aminoácidos e a dobradiça inferior é de 8, ver por exemplo a figura 1b.

[00108] Os novos anticorpos de IgG4 mutantes de acordo com a presente invenção têm sido desenvolvidos através da modificação das disposições ligação de dissulfeto intercadeias dentro da IgG4, especificamente a disposição de ligação de dissulfeto intercadeias de CL-CH1 entre a cadeia leve (LC) e a cadeia pesada (HC) foi modificada.

[00109] A Figura 1b mostra seções das sequências de cadeia pesada e leve de IgG humana para os isótipos de IgG 1 a 4 indicando as posições de cisteína (sublinhadas) que formam as ligações dissulfeto intercadeias de CL-CH1. A ligação de dissulfeto inter CL-CH1 de IgG1 é formada entre a LC C214 (sistema de numeração Kabat) e C233 (sistema de numeração Kabat) da HC imediatamente antes da região da dobradiça. Ao contrário, a ligação de dissulfeto de CH1-CL para IgG2, 3 e 4 é formada entre a LC C214 e C127 N-terminal para a ligação de dissulfeto intracadeias da HC. As sequências de LC e HC em torno dos resíduos de cisteína envolvidos na formação da ligação de dissulfeto CL-CH1 são mostradas e alinhadas na Figura 1b.

[00110] A presente invenção investigou como a ligação de dissulfeto de CL-CH1 afeta as propriedades de um anticorpo de IgG4 incluindo a estabilidade térmica, estabilidade estrutural, heterogeneidade da isoforma de dissulfeto e a afinidade do anticorpo.

[00111] Os mutantes de IgG4 foram gerados pela substituição do resíduo de cisteína em CH1 na posição 127 com outro aminoácido assim como a substituição de um ou mais dos aminoácidos na região da dobradiça superior, de preferência os aminoácidos nas posições selecionadas de 227, 228, 229 e 230, numeradas de acordo com o sistema de numeração Kabat de IgG4, com cisteína. As posições 227, 228, 229 ou 230 estão na ou perto da posição estrutural equivalente em que a IgG1 cisteína 233 está situada.

[00112] Cada cadeia pesada pode compreender outras mutações incluindo a substituição de um ou ambos resíduos de cisteína 239 e 242 na região da dobradiça de IgG4 com outro aminoácido. Uma mutação para alongar a região da dobradiça superior de IgG4 em três aminoácidos entre as posições 238 e 239 para ser do mesmo comprimento como a dobradiça de IgG1, também foi incluída em alguns anticorpos. A mutação S241P também foi introduzida em alguns anticorpos.

[00113] Observou-se que os anticorpos de IgG4 mutantes de acordo com a presente invenção apresentam propriedades vantajosas.

[00114] Em uma forma de realização, os anticorpos de IgG4 mutantes de acordo com a presente invenção apresentam maior estabilidade térmica em comparação com um anticorpo de IgG4 tipo silvestre. Foi surpreendentemente observado que os anticorpos de IgG4 mutantes que foram transformados para substituir a cisteína na posição 127 no domínio de CH1 com outro aminoácido e em que uma cisteína foi introduzida na região da dobradiça de cadeia pesada entre as posições de 227 a 230, apresentam estabilidade térmica melhorada em comparação com um anticorpo de IgG4 tipo silvestre. A mutação para remover a cisteína na posição 127 altera a posição em que a ligação de dissulfeto inter-cadeias se forma entre a cadeia pesada e da cadeia leve (CL-CH1) e força a cadeia leve de modo a formar uma ligação de dissulfeto com uma cisteína que é introduzida entre as posições 227 e 230 na região da dobradiça da cadeia pesada. Por isso em uma forma de realização, um anticorpo de IgG4 é fornecido em que a cisteína 127 é substituída por outro aminoácido e a cisteína da cadeia leve é ligada através de uma ligação de dissulfeto à uma cisteína planejada na posição 227, 228, 229 ou 230.

[00115] Uma outra melhora da estabilidade térmica também foi surpreendentemente observada pela adição de três aminoácidos na região da dobradiça de IgG4, a fim de prolongar a região da dobradiça de IgG4.

[00116] Também foi surpreendentemente observado que os anticorpos de IgG4 mutantes que foram transformados para substituir a cisteína na posição 127 no domínio de CH1 com outro aminoácido e para substituir a cisteína na posição 239 ou na posição 242 na região da dobradiça de cadeia pesada com outro aminoácido, apresentaram estabilidade térmica melhorada em comparação com um anticorpo de IgG4 tipo silvestre.

[00117] Em uma forma de realização os anticorpos da presente invenção apresentam formação reduzida das assim chamadas semi-moléculas. Os anticorpos da presente invenção que compreendem uma mutação na C239, mas não carregam uma mutação na C242 geralmente apresentam formação de semi-molécula reduzida. Sem ser limitado pela teoria, acredita-se que a remoção da cisteína na posição 239 reduz a formação de ligação de dissulfeto intra-cadeias na cadeia pesada e, portanto, reduz o número de semi-moléculas em comparação com os anticorpos que não carregam uma mutação na C239 ou C242. Os anticorpos que carregam uma mutação na C242, mas não carregam uma mutação na C239, parecem formar mais semi-moléculas em comparação com os anticorpos que carregam uma mutação na C239, mas não carregam uma mutação na C242. Sem estar limitado pela teoria, acredita-se que a cisteína na posição 239 é mais reativa em comparação com a cisteína na posição 242, e é capaz de formar uma ligação dissulfeto com uma cisteína da dobradiça de cadeia pesada ou a cisteína de cadeia leve.

[00118] Os anticorpos que carregam a mutação tanto na C239 quanto na C242 formam uma proporção elevada de semi-moléculas devido à não formação de ligação dissulfeto inter-cadeias entre as duas cadeias pesadas. No entanto, os anticorpos que compreendem as mutações tanto na C239 quanto na C242 são ainda capazes de formar moléculas de anticorpo inteiras, devido à ligação de cadeias pesadas por meio de ligações não covalentes.

[00119] A formação reduzida de semi-moléculas também é observada em anticorpos que carregam a mutação S241P.

[00120] Em uma forma de realização, a região da dobradiça superior e de núcleo é selecionada de uma das seguintes sequências: ESKYGPPCPSCP SEQ ID No: 108 ESKYGDKCPSCP SEQ ID No: 109 EPSKYGPPCPSCP SEQ ID No: 110 EPSKYGDKCPSCP SEQ ID No: 111 ESKSYGPPCPSCP SEQ ID No: 112 ESKSYGDKCPSCP SEQ ID No: 113 ESKYGPPAACPSCP SEQ ID No: 114 ESKYGPPGGCPSCP SEQ ID No: 115 ESKYGPPHTCPSCP SEQ ID No: 116 ESKYGDKHTCPSCP SEQ ID No: 117 EPSKYGPPAACPSCP SEQ ID No: 118 EPSKYGPPGGCPSCP SEQ ID No: 119 EPSKYGPPHTCPSCP SEQ ID No: 120 EPSKYGDKHTCPSCP SEQ ID No: 121 ESKSYGPPAACPSCP SEQ ID No: 122 ESKSYGPPGGCPSCP SEQ ID No: 123 ESKSYGPPHTCPSCP SEQ ID No: 124 ESKSYGDKHTCPSCP SEQ ID No: 125 ESKYGPPACPSCP SEQ ID No: 126 ESKYGPPGCPSCP SEQ ID No: 127 ESKYGPPTTCPSCP SEQ ID No: 128 ESKYGDKTTCPSCP SEQ ID No: 129 EPSKYGPPACPSCP SEQ ID No: 130 EPSKYGPPGCPSCP SEQ ID No: 131 EPSKYGPPTTCPSCP SEQ ID No: 132 EPSKYGDKTTCPSCP SEQ ID No: 133 ESKSYGPPACPSCP SEQ ID No: 134 ESKSYGPPGCPSCP SEQ ID No: 135 ESKSYGPPTTCPSCP SEQ ID No: 136 ESKSYGDKTTCPSCP SEQ ID No: 137 ESKYGPPTHCPSCP SEQ ID No: 138 ESKYGDKTHCPSCP SEQ ID No: 139 EPSKYGPPTHCPSCP SEQ ID No: 140 EPSKYGDKTHCPSCP SEQ ID No: 141 ESKSYGPPTHCPSCP SEQ ID No: 142 ESKSYGDKTHCPSCP SEQ ID No: 143 ESKYGPPHTCPSCP SEQ ID No: 144 ESKYGDKHTCPSCP SEQ ID No: 145 EPSKYGPPHTCPSCP SEQ ID No: 146 EPSKYGDKHTCPSCP SEQ ID No: 147 ESKSYGPPHTCPSCP SEQ ID No: 148 ESKSYGDKHTCPSCP SEQ ID No: 149 ESKYGPPTCPSCP SEQ ID No: 150 ESKYGDKTCPSCP SEQ ID No: 151 EPSKYGPPTCPSCP SEQ ID No: 152 EPSKYGDKTCPSCP SEQ ID No: 153 ESKSYGPPTCPSCP SEQ ID No: 154 ESKSYGDKTCPSCP SEQ ID No: 155 ESKYGPPHCPSCP SEQ ID No: 156 ESKYGDKHCPSCP SEQ ID No: 157 EPSKYGPPHCPSCP SEQ ID No: 158 EPSKYGDKHCPSCP SEQ ID No: 159 ESKSYGPPHCPSCP SEQ ID No: 160 ESKSYGDKHCPSCP SEQ ID No: 161 EPKSCDKAACPPCP SEQ ID No: 162 EPKSCDKGGCPPCP SEQ ID No: 163 EPKSCDKHTSPPCP SEQ ID No: 164 EPKSCDKHTCPPSP SEQ ID No: 165 EPKSCDKHTSPPSP SEQ ID No: 166 EPKSCDKAASPPCP SEQ ID No: 167 EPKSCDKAACPPSP SEQ ID No: 168 EPKSCDKAASPPSP SEQ ID No: 169 EPKSCDKGGSPPCP SEQ ID No: 170 EPKSCDKGGCPPSP SEQ ID No: 171 EPKSCDKGGSPPSP SEQ ID No: 172 EPKSCDKACPPCP SEQ ID No: 173 EPKSCDKGCPPCP SEQ ID No: 174 EPKSCDKTSPPCP SEQ ID No: 175 EPKSCDKTCPPSP SEQ ID No: 176 EPKSCDKTSPPSP SEQ ID No: 177 EPKSCDKASPPCP SEQ ID No: 178 EPKSCDKACPPSP SEQ ID No: 179 EPKSCDKASPPSP SEQ ID No: 180 EPKSCDKGSPPCP SEQ ID No: 181 EPKSCDKGCPPSP SEQ ID No: 182 EPKSCDKGSPPSP SEQ ID No: 183 EPKSCDKCPPCP SEQ ID No: 184 EPKSCDKCPPCP SEQ ID No: 185 EPKSCDKSPPCP SEQ ID No: 186 EPKSCDKCPPSP SEQ ID No: 187 EPKSCDKSPPSP SEQ ID No: 188 EPKSCDKSPPCP SEQ ID No: 189 EPKSCDKCPPSP SEQ ID No: 190 EPKSCDKSPPSP SEQ ID No: 191 EPKSCDKSPPCP SEQ ID No: 192 EPKSCDKCPPSP SEQ ID No: 193 EPKSCDKSPPSP SEQ ID No: 194 EPKSCDKTTSPPCP SEQ ID No: 195 EPKSCDKTTCPPSP SEQ ID No: 196 EPKSCDKTTSPPSP EPKSCDKTHSPPCP EPKSCDKTHCPPSP EPKSCDKTHSPPSP ESKYGPPCPPCP ESKYGPPCPPCP ESKYGPPCPPCP ESKYGDKCPPCP EPSKYGPPCPPCP EPSKYGPPCPPCP EPSKYGPPCPPCP EPSKYGDKCPPCP ESKSYGPPCPPCP ESKSYGPPCPPCP ESKSYGPPCPPCP ESKSYGDKCPPCP ESKYGPPAACPPCP ESKYGPPGGCPPCP ESKYGPPHTCPPCP ESKYGDKHTCPPCP EPSKYGPPAACPPCP EPSKYGPPGGCPPCP EPSKYGPPHTCPPCP EPSKYGDKHTCPPCP ESKSYGPPAACPPCP ESKSYGPPGGCPPCP ESKSYGPPHTCPPCP ESKSYGDKHTCPPCP ESKYGPPACPPCP ESKYGPPGCPPCP ESKYGPPTTCPPCP ESKYGDKTTCPPCP EPSKYGPPACPPCP EPSKYGPPGCPPCP EPSKYGPPTTCPPCP EPSKYGDKTTCPPCP ESKSYGPPACPPCP ESKSYGPPGCPPCP ESKSYGPPTTCPPCP ESKSYGDKTTCPPCP ESKYGPPTHCPPCP ESKYGDKTHCPPCP EPSKYGPPTHCPPCP EPSKYGDKTHCPPCP ESKSYGPPTHCPPCP ESKSYGDKTHCPPCP ESKYGPPHTCPPCP ESKYGDKHTCPPCP EPSKYGPPHTCPPCP EPSKYGDKHTCPPCP ESKSYGPPHTCPPCP ESKSYGDKHTCPPCP ESKYGPPTCPPCP ESKYGDKTCPPCP EPSKYGPPTCPPCP EPSKYGDKTCPPCP ESKSYGPPTCPPCP ESKSYGDKTCPPCP ESKYGPPHCPPCP ESKYGDKHCPPCP EPSKYGPPHCPPCP EPSKYGDKHCPPCP ESKSYGPPHCPPCP ESKSYGDKHCPPCP EPKSCDKTHTCPPCP EPKSCDKTHTCPSCP ESKYCPPACPSCP ESKYCPPAACPSCP ESKYCPPAAACPSCP ESKYCPPAAASPSCP ESKYCPPAAACPSSP ESKCGPPAAACPSCP ESKYCPPAAAACPSCP ESKYCPPAAAAACPSCP ESKYCPPGGGCPSCP ESKYCPPSSSCPSCP ESKYCPPTCPSCP ESKYCPPTHCPSCP ESKYCPPTHTCPSCP ESKYCPKTHTCPSCP ESKYCDKTHTCPSCP ESKYCDKTHCPSCP ESKYCDKTCPSCP ESKYCDKAAACPSCP ESKYCDKCPSCP ESKSCDKTHTCPSCP EPKYCDKTHTCPSCP EPKSCPPCPSCP ESKSCPPCPSCP EPKYCPPCPSCP ECKYGPPCPSCP SEQ ID No: 287 ECKYGPPSPSCP SEQ ID No: 288 ECKYGPPCPSSP SEQ ID No: 289 ESCYGPPCPSCP SEQ ID No: 290 ESCYGPPSPSCP SEQ ID No: 291 ESCYGPPCPSSP SEQ ID No: 292 ESKCGPPCPSCP SEQ ID No: 293 ESKCGPPSPSCP SEQ ID No: 294 ESKCGPPCPSSP SEQ ID No: 295

[00121] Os anticorpos de acordo com a presente invenção também demonstram afinidade com respeito ao antígeno alvo em relação ao anticorpo de IgG4 tipo silvestre.

[00122] As mutações para os anticorpos da presente invenção serão agora descritas com maiores detalhes. Os métodos para a substituição de aminoácidos são bem conhecidos na técnica de biologia molecular. Tais métodos incluem, por exemplo, a mutagênese direcioanda ao sítio utilizando métodos tais como PCR para eliminar e/ou substituir aminoácidos ou a concepção mais uma vez das sequências sintéticas.

[00123] A Figura 2a mostra os resíduos da dobradiça de IgG1 tipo silvestre, IgG4 tipo silvestre e as posições onde as mutações foram introduzidas nos anticorpos da presente invenção. Numeração com base no sistema de numeração Kabat.

[00124] Os anticorpos de acordo com a presente invenção compreendem uma mutação na posição 127 (C127), em que o resíduo de cisteína é substituído por outro aminoácido, de preferência um aminoácido que não contenha um grupo de tiol. Por repor ou substituir queremos dizer que onde a cisteína intercadeia 127 deve normalmente ser encontrada na cadeia pesada do anticorpo outro aminoácido está no seu lugar. A mutação em C127 pode ser qualquer mutação adequada para um, dois ou três dos nucleótidos que codificam o aminoácido na posição 127 que altera o resíduo de aminoácido de cisteína em outro aminoácido adequado. Exemplos de aminoácidos adequados incluem serina, treonina, alanina, glicina ou qualquer aminoácido polar. Um aminoácido particularmente preferido é serina.

[00125] A substituição da cisteína na posição 127 com outro aminoácido remove a cisteína no domínio de CH1 que normalmente forma uma ligação de dissulfeto com a cisteina na cadeia leve de IgG4 tipo silvestre. Portanto, a fim de formar uma cadeia leve e uma cadeia pesada que formam um par através de uma ligação de dissulfeto inter-cadeias, a cadeia leve deve formar uma ligação de dissulfeto com uma cisteína que está posicionada na região da dobradiça da cadeia pesada.

[00126] Em um primeiro aspecto da invenção, os anticorpos de acordo com a presente invenção compreendem uma cadeia pesada em que um ou mais dos aminoácidos nas posições selecionadas de 227, 228, 229 e 230, numerados de acordo com o sistema de numeração Kabat, são substituídos com cisteína. Conseqüentemente, os anticorpos de acordo com a presente invenção podem carregar um ou mais das seguintes mutações: • S227C • K228C • Y229C • G230C

[00127] Preferivelmente apenas um resíduo selecionado de 227, 228, 229 e 230 é substituído com um resíduo de cisteína.

[00128] Os anticorpos particularmente preferidos da presente invenção carregam a mutação Y229C ou G230C.

[00129] A inclusão de um resíduo de cisteína em uma posição selecionada de 227, 228, 229 e 230, na região da dobradiça da cadeia pesada, fornece uma nova posição para uma ligação de dissulfeto inter-cadeias para se formar entre a cadeia pesada e a cadeia leve. Foi observado pelos presentes inventores que esta nova disposição de ligação de dissulfeto inter-cadeias fornece anticorpos de IgG4 tendo estabilidade térmica melhorada em comparação com um anticorpo de IgG4 tipo silvestre.

[00130] Outras mutações podem ser introduzidas aos anticorpos deste aspecto da presente invenção. Em uma forma de realização a cisteína na posição 239 (C239) e/ou a cisteína na posição 242 (C242), numeradas de acordo com o sistema de numeração Kabat, na cadeia pesada são substituídas por outro aminoácido, de preferência um aminoácido que não contenha um grupo de tiol. Por repor ou substituir queremos dizer que onde a cisteína 239 e/ou a cisteína 242 seriam normalmente encontradas na cadeia pesada do anticorpo, outro aminoácido está em seu lugar. A mutação em C239 e/ou C242 pode ser qualquer mutação adequada para um, dois ou três dos nucleotídeos que codificam o aminoácido que altera o resíduo de aminoácido da cisteína em outro aminoácido adequado. Exemplos de aminoácidos adequados incluem serina, treonina, alanina, glicina ou qualquer aminoácido polar. Um aminoácido particularmente preferível é serina.

[00131] Em uma forma de realização a cisteína na posição 239 da cadeia pesada é substituída com outro aminoácido e a cisteína na posição 242 da cadeia pesada é substituída com outro aminoácido. Nesta forma de realização, a substituição tanto de C239 quanto de C242 remove ambos os resíduos de cisteína na região da dobradiça da cadeia pesada, que normalmente formam ligações de dissulfeto inter-cadeias pesadas com as cisteínas correspondentes em outra cadeia pesada. As semi- moléculas resultantes podem formar moléculas inteiras de anticorpo através de ligação não covalente entre duas cadeias pesadas.

[00132] Em uma forma de realização alternativa a cisteína na posição 239 na cadeia pesada é substituída por outro aminoácido. Nesta forma de realização a cisteína na posição 242 não é substituída por outro aminoácido.

[00133] Em uma outra forma de realização alternativa a cisteína na posição 242 na cadeia pesada é substituída com outro aminoácido. Nesta forma de realização, a cisteína na posição 239 não é substituída com outro aminoácido.

[00134] A substituição de C239 ou C242, deixa ficar uma cisteína na cadeia pesada que é capaz de formar uma ligação de dissulfeto inter-cadeias pesadas com uma cisteína em outra cadeia pesada. Sem ser limitado pela teoria, acredita-se que a substituição de uma cisteína na região da dobradiça, particularmente a substituição de C239, reduz a formação de uma ligação de dissulfeto intra-cadeias na região da dobradiça e, portanto, pode reduzir a formação de semi-moléculas de anticorpo.

[00135] Em uma forma de realização da presente invenção, em que a serina na posição 227 é substituída com uma cisteína, o anticorpo preferivelmente não compreende mutações nas posições C239 e C242. Em outra forma de realização, em que a serina na posição 227 é substituída por uma cisteína, a cisteína na posição 239 na cadeia pesada é de preferência substituída por outro aminoácido, mas a cisteína na posição 242 não é substituída por outro aminoácido.

[00136] Em uma forma de realização, os anticorpos da presente invenção compreendem uma cadeia pesada de IgG4 que é transformada para inserir um ou mais aminoácidos entre os aminoácidos de 226 a 243. O número de aminoácidos inseridos pode ser de 1 a 10, de 1 a 5, de 1 a 3, de preferência 1, 2, 3 ou 4 aminoácidos são inseridos. Os aminoácidos são preferivelmente inseridos entre os aminoácidos 238 e 239. Quaisquer aminoácidos adequados podem ser inseridos na região da dobradiça, tais como alaninas, glicinas, serinas ou treoninas e suas combinações. Preferivelmente três alaninas (AAA), três glicinas (GGG), três serinas (SSS) ou três treoninas (TTT) são inseridas ou uma treonina, histidina e outra treonina (THT). Observou-se que os anticorpos da presente invenção compreendendo uma cadeia pesada de IgG4 que foi transformada para inserir três aminoácidos na região da dobradiça apresentam estabilidade térmica melhorada.

[00137] Uma outra mutação que pode ser introduzida nos anticorpos de acordo com a presente invenção é a mutação S241P. Esta mutação foi anteriormente mostrada de reduzir a formação de meias-moléculas (Angal,S. et al., 1993. A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human (IgG4) antibody. Mol Immunol 30, 105-108).

[00138] Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem compreender uma ou mais mutações adicionais na região da dobradiça. Por exemplo, os anticorpos podem ainda compreender uma ou mais das seguintes mutações S227P, Y229S, P237D e P238K.

[00139] Em uma forma de realização o anticorpo de acordo com a presente invenção eficazmente compreende uma região da dobradiça de IgG1 de resíduos de 226 a 243 (dobradiça superior e dobradiça de núcleo). Conseqüentemente, o anticorpo da presente invenção compreende uma região da dobradiça em que a glicina na posição 230 é substituída com cisteína, a serina na posição 227 é substituída com prolina, a tirosina na posição 229 é substituída com serina, a prolina na posição 237 é substituída com ácido aspártico, a prolina na posição 238 é substituída com lisina, a sequência de aminoácido treonina-histidina-treonina é inserida entre as posições 238 e 239 e a serina na posição 241 é substituída com prolina. Estas mutações também podem ser escritas como S227P, Y229S, G230C, P237D, P238KTHT e S241P, como mostrado na Figura 2a. Observou-se que a introdução destas mutações adicionais na região da dobradiça de IgG4 fornece um anticorpo tendo melhor estabilidade térmica.

[00140] O anticorpo de acordo com a presente invenção preferivelmente possui uma dobradiça inferior de IgG4 a partir do resíduo de 244 a 251 (APEFLGGP). Sem ser limitado pela teoria, acredita-se que a região da dobradiça inferior de lgG4 contribui para a falta de função efetora de um anticorpo de IgG4.

[00141] Em um segundo aspecto da presente invenção, o anticorpo compreende uma cadeia pesada em que a cisteína na posição 127 é substituída por outro aminoácido, como descrito acima, e a cisteína na posição 239 ou a cisteína na posição 242, numerada de acordo com o sistema de numeração Kabat, na cadeia pesada é substituída por outro aminoácido. Neste segundo aspecto, nenhum dos resíduos nas posições 227, 228, 229 e 230 é substituído com um resíduo de cisteína.

[00142] Os anticorpos de acordo com o segundo aspecto da presente invenção foram surpreendentemente observados de ter estabilidade térmica melhorada em comparação com um anticorpo de IgG4 tipo silvestre.

[00143] No segundo aspecto da presente invenção, o anticorpo pode compreender uma ou mais mutações adicionais. Em uma forma de realização o anticorpo compreende uma cadeia pesada de IgG4 que é transformada para inserir três aminoácidos entre os aminoácidos de 226 a 243, de preferência entre os aminoácidos 238 e 239, como descrito acima. Em uma forma de realização adicional o anticorpo compreende a mutação S241P. Em uma outra forma de realização, o anticorpo pode ainda compreender uma ou mais das seguintes mutações S227P, Y229S, P237D e P238K.

[00144] A Tabela 1 abaixo lista os anticorpos exemplares da presente invenção e as mutações que foram introduzidas em comparação com a sequência de IgG4 tipo silvestre. A Tabela 1 também inclui os anticorpos IgG1 e IgG4 do tipo silvestre e anticorpos de controle.

[00145] Tabela 1:

[00146] As Figuras 3a e 4a também mostram as mutações introduzidas nos anticorpos de IgG4 de acordo com a presente invenção. As Figuras 3b e 4b mostram as posições dos resíduos de cisteína nos anticorpos de IgG4 da presente invenção e também mostram a ligação prevista da cisteína à uma cisteína na cadeia leve (LC) ou outra cadeia pesada (HC). Para os resíduos de cisteína que mostram (LC ou HC), é possível que a cisteína esteja em ligação à uma cisteína na cadeia leve ou na cadeia pesada, mas onde a LC ou a HC foi sublinhada esta é a ligação de dissulfeto que se acredita de ocorrer predominantemente.

[00147] Em uma forma de realização preferida, a presente invenção fornece um anticorpo que compreende pelo menos uma cadeia pesada, em que cada cadeia pesada compreende um domínio de CH1 e uma região da dobradiça e cada cadeia pesada compreende as mutações de um anticorpo selecionado de 2, 3, 6, 7, 8, 15, 16, 28, 28P, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 44, 44P, 45, 46, 47 e 48, como mostrado na Tabela 1. Conseqüentemente, a presente invenção fornece um anticorpo que compreende pelo menos uma cadeia pesada, em que cada cadeia pesada compreende um domínio de CH1 e uma região da dobradiça e cada cadeia pesada compreende uma das seguintes sequências: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 , SEQ ID NO:15 , SEQ ID NO:16 , SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO: 36 e SEQ ID NO: 37.

[00148] Em uma forma de realização preferida o anticorpo da presente invenção compreende pelo menos uma cadeia pesada em que cada cadeia pesada compreende um domínio de CH1 e uma região da dobradiça, e compreende uma das seguintes sequências: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 , SEQ ID NO:15 , SEQ ID NO:16 , SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:35, SEQ ID NO: 36 e SEQ ID NO: 37. Mais preferivelmente, o anticorpo da presente invenção compreende pelo menos uma cadeia pesada em que cada cadeia pesada compreende um domínio de CH1 e uma região da dobradiça e cada cadeia pesada compreende uma das seguintes sequências: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 , SEQ ID NO:15 , SEQ ID NO:16 , SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:35, SEQ ID NO: 36 e SEQ ID NO: 37.

[00149] Em uma outra forma de realização preferida, a presente invenção fornece um anticorpo que compreende pelo menos uma cadeia pesada, em que cada cadeia pesada compreende um domínio de CH1, uma região da dobradiça, um domínio de CH2 e um domínio de CH3, e cada cadeia pesada compreende as mutações de um anticorpo selecionadas de 2, 3, 6, 7, 8, 15, 16, 28, 28P, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 44, 44P, 45, 46, 47 e 48, como mostrado na Tabela 1. Conseqüentemente, a presente invenção fornece um anticorpo que compreende pelo menos uma cadeia pesada, em que cada cadeia pesada compreende um domínio de CH1, uma região da dobradiça, um domínio de CH2 e um domínio de CH3, e cada cadeia pesada compreende uma das seguintes sequências: SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40 , SEQ ID NO:41 , SEQ ID NO:42 , SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO: 62 e SEQ ID NO: 63.

[00150] Um anticorpo particularmente preferido da presente invenção compreende pelo menos uma cadeia pesada que compreende um domínio de CH1 e uma região da dobradiça, em que a cadeia pesada compreende a SEQ ID NO: 36 (anticorpo 28P), a SEQ ID NO: 37 (anticorpo 44P) ou a SEQ ID NO: 35 (anticorpo 48). Um outro anticorpo particularmente preferido da presente invenção compreende pelo menos uma cadeia pesada que compreende um domínio de CH1, uma região da dobradiça, um domínio de CH2 e um domínio de CH3, em que a cadeia pesada compreende a SEQ ID NO: 62 (anticorpo 28P), a SEQ ID NO: 63 (anticorpo 44P) ou a SEQ ID NO: 61 (anticorpo 48). Os anticorpos 28P, 44P e 48 são particularmente preferidos porque eles apresentam estabilidade térmica significativamente melhorada e ainda apresentam formação reduzida de semi-molécula.

[00151] Os anticorpos 2, 3 e 8 foram mostrados de formar quantidades significativas das assim chamadas semi-moléculas (HL). Estes mutantes podem formar moléculas inteiras de anticorpo (H2L2) in vitro sob condições não desnaturantes, mas quaisquer associações não covalentes entre as cadeias pesadas e/ou entre as cadeias pesada e leves são removidas sob condições de SDS-PAGE não redutoras. Embora freqüentemente ensinado ser desejável reduzir a formação de semi- moléculas, os anticorpos que possuem uma maior tendência em formar semi- moléculas podem ser vantajosos para determinados usos. Os anticorpos que formam semi-moléculas (HL) estáveis e pouco ou nenhum anticorpo inteiro (H2L2) devido à cadeia pesada do anticorpo sendo incapaz de formar uma associação covalente ou não covalente com outra cadeia pesada são de particular interesse. Os anticorpos que formam semi-moléculas estáveis podem ser vantajosos para a produção de anticorpos monovalentes. Os anticorpos formam semi-moléculas também podem fornecer um meio útil para produzir um anticorpo biespecífico, devido à formação de anticorpos inteiros a partir de semi-moléculas que possuem diferentes especificidades, em que o anticorpo inteiro é biespecífico e monovalente para cada antígeno.

[00152] O anticorpo 3 retém a C239 na região da dobradiça, mas parece incapaz de formar ligações de dissulfeto de cadeia pesada inter-dobradiças, provavelmente devido à formação eficiente de um dissulfeto entre a cisteína de cadeia leve C- terminal e a dobradiça C239. Uma comparação de anticorpos 2 e 3 mostra a extensão do “alcance” da cisteína C-terminal da cadeia leve, em que o dissulfeto de cadeia leve se liga de forma mais eficiente à C239 do que à C242 na região da dobradiça. Além disso, o anticorpo 3 mostra uma maior estabilidade em comparação com o anticorpo 2.

[00153] Embora os anticorpos transformados de acordo com o presente invenção sejam descritos acima em relação ao isótipo de IgG4, a pessoa versada irá observar que as mutações feitas ao anticorpo de IgG4 também podem ser aplicadas a outros isótipos ou classes de anticorpos que têm a mesma disposição de ligação de dissulfeto como um anticorpo de IgG4, a fim de fornecer um anticorpo melhorado. Exemplos específicos de anticorpos que possuem a mesma disposição de ligação de dissulfeto como um anticorpo de IgG4 são os anticorpos de IgG3, anticorpos de IgM e anticorpos de IgD. Como mostrado na figura 1b, IgG3 e IgM possuem uma cisteína na posição 127 no domínio de CH1 e IgD possui uma cisteína na posição 128 no domínio de CH1, o qual é equivalente à C127 no domínio de CH1 da IgG4 que forma uma ligação de dissulfeto inter-cadeias com uma cisteina na cadeia leve. Além disso, também pode ser visto a partir de Figura 1b que as regiões da dobradiça superior de IgG3 e IgD e a região C-terminal do domínio de CH1 e a região N- terminal do domínio de CH2 em IgM não contêm um resíduo de cisteína que é equivalente aos resíduos da região da dobradiça superior de IgG1. Conseqüentemente, a presente invenção fornece ainda um anticorpo de IgG3, um anticorpo de IgD e um anticorpo de IgM, em que a cisteína no domínio de CH1 que forma uma ligação de dissulfeto inter-cadeias com uma cisteína em uma cadeia leve é substituída por outro aminoácido, e em que um ou mais aminoácidos que estão em uma posição estruturalmente análoga à região da dobradiça superior de IgG1 ou IgG4 são substituídos com a cisteína.

[00154] Conseqüentemente, a presente invenção também fornece um anticorpo da classe IgG 3 compreendendo pelo menos uma cadeia pesada que compreende um domínio de CH1 e uma região da dobradiça, em que em cada cadeia pesada: a. a cisteína no domínio de CH1 que forma uma ligação de dissulfeto inter- cadeias com uma cisteína em uma cadeia leve é substituída com outro aminoácido; e b. um ou mais dos aminoácidos posicionados na região da dobradiça superior são substituídos com cisteína.

[00155] Em uma forma de realização preferida do aspecto de anticorpo de IgG3 da presente invenção, a cisteína no domínio de CH1 que forma uma ligação de dissulfeto inter-cadeias com uma cisteína em uma cadeia leve é a cisteína na posição 127, numerada de acordo com o sistema de numeração Kabat, como mostrado na Figura 1b e 2b.

[00156] Em uma forma de realização preferida do aspecto do anticorpo de IgG3 da presente invenção, o um ou mais aminoácidos posicionados na região da dobradiça superior que podem ser substituídos com a cisteínas são um ou mais dos aminoácidos nas posições selecionadas de 226, 227, 228 229, 230, 232 e 233, numerados de acordo com o sistema de numeração Kabat, conforme mostrado nas Figuras 1b e 2b.

[00157] A presente invenção fornece um anticorpo da classe IgM que compreende pelo menos uma cadeia pesada que compreende um domínio de CH1 e um domínio de CH2, em que em cada cadeia pesada: a. a cisteína no domínio CH1 que forma uma ligação de dissulfeto inter- cadeias com uma cisteína em uma cadeia leve é substituída com um outro aminoácido; e b. um ou mais dos aminoácidos posicionados no domínio de CH1 ou domínio de CH2 são substituídos com cisteína.

[00158] Em uma forma de realização preferida do aspecto do anticorpo de IgM da presente invenção, a cisteína no domínio de CH1 que forma uma ligação de dissulfeto inter-cadeias com uma cisteína em uma cadeia leve é a cisteína na posição 127, numerada de acordo com o sistema de numeração Kabat, como mostrado nas Figuras 1b e 2c.

[00159] Em uma forma de realização preferida do aspecto do anticorpo de IgM da presente invenção, um ou mais aminoácidos posicionados na extremidade C- terminal do domínio de CH1 ou na extremidade N-terminal do domínio de CH2 são substituídos com cisteína. A posição preferida dos aminoácidos na extremidade C- terminal do domínio de CH1 que podem ser substituídos com cisteína, é um ou mais dos aminoácidos nas posições selecionadas de 223, 223A, 223B e 223C, numerados de acordo com o sistema de numeração Kabat, conforme mostrado nas Figuras 1b e 2c. A posição preferida dos aminoácidos na extremidade N-terminal do domínio de CH2 que podem ser substituídos com cisteína, é um ou mais dos aminoácidos nas posições selecionadas de 243G, 243H e 243I, numerados de acordo com o sistema de numeração Kabat, conforme mostrado nas Figuras 1b e 2c. Conseqüentemente, qualquer um ou mais dos aminoácidos de 223 a 243 podem ser substituídos com cisteína.

[00160] A presente invenção ainda fornece um anticorpo da classe IgD compreendendo pelo menos uma cadeia pesada que compreende um domínio de CH1 e uma região da dobradiça, em que em cada cadeia pesada: a. a cisteína no domínio de CH1 que forma uma ligação de dissulfeto inter- cadeias com uma cisteína em uma cadeia leve é substituída com outro aminoácido; e b. um ou mais dos aminoácidos posicionados na região da dobradiça são substituídos com cisteína.

[00161] Em uma forma de realização preferida do aspecto de anticorpos de IgD da presente invenção, a cisteína no domínio de CH1 que forma uma ligação de dissulfeto inter-cadeias com uma cisteína em uma cadeia leve é a cisteína na posição 128 numerada de acordo com o sistema de numeração Kabat, conforme mostrado nas Figuras 1b e 2d.

[00162] A região da dobradiça de um anticorpo de IgD pode ser definida como R224- P243, de acordo com o sistema de numeração Kabat.

[00163] Em uma forma de realização preferida do aspecto de anticorpos de IgD da presente invenção, o um ou mais aminoácidos posicionados na região da dobradiça que são substituídos com cisteína são um ou mais dos aminoácidos nas posições selecionadas de 227, 228, 229, 230, 231, 232 e 233, numerados de acordo com o sistema de numeração Kabat, conforme mostrado nas Figuras 1B e 2d.

[00164] Os anticorpos de IgG3, IgD ou IgM fornecidos pela presente invenção podem compreender uma ou mais mutações adicionais na região da dobradiça conforme debatido acima em relação ao anticorpo de IgG4.

[00165] O termo “anticorpo” como aqui utilizado inclui anticorpos intactos (inteiros) e fragmentos funcionalmente ativos que compreendem pelo menos uma cadeia pesada compreendendo um domínio de VH, um domínio CH1 e uma região da dobradiça. O anticorpo de acordo com a presente invenção preferivelmente compreende pelo menos uma cadeia leve. Conseqüentemente, o termo “anticorpo” na presente invenção abrange os anticorpos bi, tri ou tetra-valentes, fragmentos Fab’ e F(ab’)2, semi-moléculas de anticorpo ou semi-moléculas compreendendo uma cadeia leve isolada e formação de par de cadeia pesada e moléculas inteiras de anticorpo compreendendo duas formações de par de cadeia leve e cadeia pesada.

[00166] Como é bem conhecido na técnica, uma molécula de Fab’ típica compreende um par de cadeia pesada e leve em que a cadeia pesada compreende uma região variável VH, um domínio constante CH1 e uma região da dobradiça e a cadeia leve compreende uma região variável VL e domínio constante CL.

[00167] Em uma forma de realização se fornece um dímero de Fab’ de acordo com a presente divulgação, por exemplo, a dimerização pode ser por meio da dobradiça.

[00168] Em uma forma de realização a cadeia pesada compreende um domínio de CH2 e um domínio de CH3 e opcionalmente um domínio de CH4. Em uma forma de realização o anticorpo compreende duas cadeias pesadas, cada uma das quais é como definido acima no primeiro ou no segundo aspecto da presente invenção. Os anticorpos de acordo com a presente invenção também preferivelmente compreendem duas cadeias leves. Nesta forma de realização em que o anticorpo compreende duas cadeias pesadas, de preferência ambas as sequências de cadeia pesada são idênticas como definido acima pelo primeiro ou segundo aspecto da presente invenção.

[00169] Em uma forma de realização preferida o anticorpo da presente invenção é um anticorpo inteiro que compreende duas cadeias leves e duas cadeias pesadas, em que cada cadeia pesada compreende um IgG4 CH1 em que a cisteína na posição 127, numerada de acordo com o sistema de numeração Kabat, é substituída com um outro aminoácido, uma região da dobradiça de IgG1 superior e média, uma região da dobradiça de IgG4 inferior, um domínio de CH2 e um domínio de CH3.

[00170] A região da dobradiça completa de um anticorpo de IgG4 tipicamente consiste de resíduos de 226 a 251 (numeração com base no sistema de numeração Kabat). No entanto, a região da dobradiça pode ser reduzida ou aumentada conforme requerido. Por exemplo, os anticorpos de acordo com o primeiro aspecto do presente invenção, o aminoácido tipo silvestre é substituído por um resíduo de cisteína na posição 227, 228, 229 ou 230, a região da dobradiça pode terminar após o novo resíduo de cisteína na posição 227, 228, 229 ou 230. Os anticorpos de acordo com a presente invenção também podem compreender um ou mais de outros aminoácidos posicionados N-terminal e/ou C-terminal da região da dobradiça. Além disso, outras características da dobradiça podem ser controladas, tais como a distância das cisteínas da dobradiça a partir da cisteína inter-cadeias de cadeia leve, a distância entre as cisteínas da dobradiça e da composição de outros aminoácidos na dobradiça que pode afetar as propriedades da dobradiça tais como flexibilidade, por exemplo, as glicinas podem ser incorporadas na dobradiça para aumentar a flexibilidade rotacional ou as prolinas podem ser incorporadas para reduzir a flexibilidade. Alternativamente as combinações de resíduos carregados ou hidrofóbicos podem ser incorporadas na dobradiça para conferir propriedades multimerização ou purificação. Outras regiões da dobradiça modificadas podem ser totalmente sintéticas e podem ser designadas para possuir as propriedades desejadas tais como comprimento, composição e flexibilidade.

[00171] Os domínios da região constante, em particular no domínio de Fc, onde presentes, empregados na presente invenção, são de preferência de isótipo IgG4 onde as funções efetoras de anticorpo não são necessárias. Conseqüentemente, cada cadeia pesada preferivelmente compreende um domínio de IgG4 CH2 e um domínio de CH3, como apresentado na SEQ ID NO: 64.

[00172] Será observado que as variantes da sequência dos domínios da região constante Fc também podem ser usadas.

[00173] Em uma forma de realização cada cadeia pesada compreende domínios de IgG4 CH2 e CH3 em que a arginina na posição 409 (numeração EU) é substituída por lisina, treonina, metionina, ou leucina de modo a inibir a formação de agregados em pH baixo (US 2008/0063635 Takahashi et al.). As mutações em L235, D265, D270, K322, P331 e P329 (numeradas de acordo com o sistema de numeração da EU) também são instruídas de forma a atenuar a atividade de CDC (US 2008/0063635 Takahashi et al.).

[00174] Cada cadeia pesada pode compreender as mutações como instruídas na WO 2008/145142 Van de Winkel et al. que divulga anticorpos de IgG4 estáveis que possuem uma capacidade reduzida de sofrer troca da ramificação Fab mediante a substituição do resíduo de arginina na posição 409, do resíduo Phe na posição 405 ou do Lys na posição 370 (numeração de acordo com o sistema de numeração da EU).

[00175] Em uma forma de realização cada cadeia pesada compreende um domínio de IgG4 CH2 e um domínio IgG1 CH3, como mostrado na SEQ ID NO: 65.

[00176] Na forma de realização da presente invenção em que o anticorpo é um anticorpo de IgG3, IgD ou IgM transformado, cada cadeia pesada preferivelmente compreende um domínio de CH2 e um domínio de CH3, e opcionalmente um domínio de CH4. No anticorpo de IgG3 cada cadeia pesada preferivelmente compreende o domínio de IgG3 CH2 e um domínio de IgG3 CH3. No anticorpo de IgD cada cadeia pesada preferivelmente compreende o domínio de IgD CH2 e um domínio de IgD CH3. No anticorpo de IgM de cada cadeia pesada preferivelmente compreende o domínio de IgM CH2, um domínio de IgM CH3 e um domínio de IgM CH4.

[00177] Em uma forma de realização, o anticorpo é um fragmento de anticorpo monoclonal completamente humano, humanizado ou quimérico. Em uma forma de realização o anticorpo é completamente humano ou humanizado.

[00178] Os anticorpos monoclonais podem ser preparados por qualquer método conhecido na técnica tal como a técnica do hibridoma (Kohler & Milstein, Nature, 1975, 256, 495-497), a técnica do trioma, a técnica do hibridoma de células B humanas (Kozbor et al., Immunology Today, 1983, 4, 72) e a técnica do hibridoma de EBV (Cole et al., “Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy”, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985).

[00179] Os anticorpos para uso na presente invenção também podem ser gerados usando métodos de anticorpos de linfócitos isolados através da clonagem e expressão da região variável da imunoglobulina cDNAs gerados a partir de linfócitos individuais selecionados para a produção de anticorpos específicos, por exemplo, os métodos descritos em Babcook, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93(15), 7843-7848, WO 92/02551, WO2004/051268 e WO2004/106377.

[00180] Os anticorpos humanizados são moléculas de anticorpo de espécies não humanas tendo uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) das espécies não humanas e uma região de estrutura de uma molécula de imunoglobulina humana que opcionalmente compreendem um ou mais resíduos de doador das espécies não humanas (ver, por exemplo, US 5.585.089).

[00181] Os anticorpos para uso na presente invenção também podem ser gerados usando vários métodos de exibição em fagos conhecidos na técnica e incluem aqueles descritos por Brinkman et al., J. Immunol. Methods, 1995, 182, 41-50; Ames et al., J. Immunol. Methods, 1995, 184, 177-186; Kettleborough et al. Eur. J. Immunol., 1994, 24, 952-958; Persic et al., Gene, 1997 187, 9-18; e Burton et al., Advances in Immunology, 1994, 57, 191-280; WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; e WO 95/20401; e US 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743; e 5.969.108. Da mesma forma, camundongos transgênicos, ou outros organismos, incluindo outros mamíferos, podem ser usados para gerar anticorpos humanizados.

[00182] Os anticorpos totalmente humanos são aqueles anticorpos em que as regiões variáveis e as regiões constantes (onde presentes) de cadeias tanto leves quanto pesadas são todas de origem humana, ou substancialmente idênticas às sequências de origem humana, e não necessariamente do mesmo anticorpo. Exemplos de anticorpos totalmente humanos podem incluir os anticorpos produzidos, por exemplo, pelos métodos de exibição em fagos acima descritos e anticorpos produzidos por camundongos em que a variável de imunoglobulina de murino e/ou os genes de regiões constantes foram substituídos pelos seus equivalentes humanos, por exemplo, como descrito em termos gerais em EP 0546073 B1, US 5.545.806, US 5.569.825, US 5.625.126, US 5.633.425, US 5.661.016, US 5.770.429, EP 0438474 B1 e EP 0463151 B1.

[00183] O material de partida de anticorpo para uso na presente invenção pode ser preparado através da utilização de técnicas de DNA recombinante envolvendo a manipulação e re-expressão do DNA que codifica as regiões variáveis e constantes do anticorpo. As técnicas de biologia molecular padrão podem ser usadas para modificar, adicionar ou eliminar os aminoácidos ou domínios conforme desejado. Quaisquer alterações nas regiões variáveis ou constantes são ainda incluídas pelos termos regiões ‘variáveis’ e ‘constantes’, como aqui utilizados.

[00184] O material de partida de anticorpo pode ser obtido a partir de qualquer espécie incluindo, por exemplo, camundongo, rato, coelho, hamster, camelo, lhama, cabra ou ser humano. Partes do anticorpo podem ser obtidas de mais do que uma espécie, por exemplo, o anticorpo pode ser quimérico. Em um exemplo, as regiões constantes são de uma espécie e as regiões variáveis de outra. O material de partida de anticorpo também pode ser modificado. Em outro exemplo, a região variável do anticorpo foi criada utilizando as técnicas de engenharia de DNA recombinante. Tais versões planejadas incluem aquelas criadas, por exemplo, de regiões variáveis de anticorpos naturais por inserções, anulações ou alterações nas sequências de aminoácido dos anticorpos naturais. Exemplos particulares deste tipo incluem aqueles domínios de região variável planejados contendo pelo menos uma CDR e, opcionalmente, um ou mais aminoácidos estruturais de um anticorpo e o restante do domínio da região variável de um segundo anticorpo. Os métodos para a criação e produção destes anticorpos são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Boss et al., US 4.816.397; Cabilly et al., US 6.331.415; Shrader et al., WO 92/02551; Ward et al., 1989, Nature, 341, 544; Orlandi et al., 1989, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 86, 3833; Riechmann et al., 1988, Nature, 322, 323; Bird et al, 1988, Science, 242, 423; Queen et al., US 5.585.089; Adair, WO91/09967; Mountain and Adair, 1992, Biotechnol. Genet. Eng. Rev, 10, 1-142; Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181).

[00185] Em uma forma de realização, o anticorpo compreende um par de domínio variável que forma um domínio de ligação em um par cognato. O par cognato como aqui empregado é planejado para se referir a um par natural de domínios variáveis, isto é, isolado a partir de um anticorpo único ou anticorpo que expressa uma célula.

[00186] Os domínios variáveis podem ter sido otimizados e/ou humanizados.

[00187] Os domínios variáveis otimizados/humanizados derivados de um par cognato ainda serão considerados um par cognato após a otimização/humanização.

[00188] Assim o invento estende-se às moléculas humanas, humanizadas ou quiméricas.

[00189] Em uma forma de realização a molécula especificamente se liga a um antígeno alvo. Especificamente se liga como aqui empregado destina-se a se referir às moléculas tendo alta afinidade com relação a um antígeno alvo (ao qual ele é específico) e que se liga aos antígenos que não são específicos com uma afinidade baixa ou muito mais baixa (ou em nenhuma hipótese). Métodos de medição da afinidade são bem conhecidos daqueles versados na técnica e incluem tais ensaios como BIAcore™.

[00190] As moléculas de anticorpo da presente invenção adequadamente possuem uma alta afinidade de ligação, em particular, nanomolar ou picomolar. A afinidade pode ser medido usando qualquer método adequado conhecido na técnica, incluindo BIAcore™. Em uma forma de realização a molécula da presente invenção possui uma afinidade de ligação de cerca de 100 pM ou melhor. Em uma forma de realização a molécula da presente invenção possui uma afinidade de ligação de cerca de 50 pM ou melhor. Em uma forma de realização a molécula da presente invenção possui uma afinidade de ligação de cerca de 40 pM ou melhor. Em uma forma de realização a molécula da presente invenção possui uma afinidade de ligação de cerca de 30 pm ou melhor. Em uma forma de realização a molécula da presente invenção é totalmente humana ou humanizada e possui uma afinidade de ligação de cerca de 100 pM ou melhor.

[00191] Um derivado de um domínio de ocorrência natural como aqui empregado destina-se a se referir onde um, dois, três, quatro ou cinco aminoácidos de uma sequência de ocorrência natural foi substituído ou eliminado, por exemplo, para otimizar as propriedades do domínio tais como através da eliminação das propriedades indesejáveis, mas em que os aspectos de caracterização domínio são mantidos.

[00192] Em uma forma de realização as moléculas de anticorpo da presente invenção compreendem um ou mais peptídeos de ligação à albumina. In vivo, o peptídeo se liga à albumina, a qual aumenta a meia-vida da molécula.

[00193] O peptídeo de ligação a albumina pode ser anexado a partir de uma ou mais regiões variáveis, uma dobradiça ou C-terminal da molécula ou qualquer local que não interfira com as propriedades de ligação ao antígeno das moléculas.

[00194] Exemplos de peptídeos de ligação a albumina são fornecidos na WO 2007/106120.

[00195] Também será entendido por uma pessoa versada na técnica que o anticorpo pode ser sofrer uma variedade de modificações pós-translação. O tipo e extensão destas modificações dependem muitas vezes da linhagem celular de hospedeiro utilizada para expressar a molécula, assim como as condições de cultura. Tais modificações podem incluir variações na glicosilação, oxidação de metionina, formação de dicetopiperazina, isomerização de aspartato e desamidação de asparagina. Uma modificação freqüente é a perda de um resíduo básico carbóxi- terminal (tal como lisina ou arginina) devido à ação de carboxipeptidases (como descrito em Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995).

[00196] Se desejável, uma molécula para uso na presente invenção pode ser conjugada à uma ou mais moléculas efetoras. Será observado que a molécula efetora pode compreender uma única molécula efetora ou duas ou mais de tais moléculas ligadas de modo a formar um componente único que pode ser ligado à molécula de anticorpo da presente invenção. Onde se deseja obter um anticorpo de acordo com a invenção ligado a uma molécula efetora, este pode ser preparado por procedimentos de DNA químicos ou recombinantes padrão em que o anticorpo é ligado diretamente ou através de um agente de acoplamento à molécula efetora. As técnicas para a conjugação de tais moléculas efetoras a um anticorpo são bem conhecidas na técnica (ver, Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., Robinson et al., eds., 1987, pp. 623-53; Thorpe et al., 1982 , Immunol. Rev., 62:11958 e Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123). Os procedimentos químicos particulares incluem, por exemplo, aqueles descritos na WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195, WO 89/01476 e WO 03031581. Alternativamente, onde a molécula efetora for uma proteína ou um polipeptídeo a ligação pode ser alcançada utilizando procedimentos de DNA recombinante, por exemplo, como descrito na WO 86/01533 e EP 0392745.

[00197] O termo molécula efetora como aqui utilizado inclui, por exemplo, agentes anti-neoplásicos, medicamentos, toxinas, proteínas biologicamente ativas, por exemplo enzimas, outros anticorpos ou fragmentos de anticorpos, polímeros sintéticos ou de ocorrência natural, ácidos nucléicos e seus fragmentos, por exemplo, DNA, RNA e seus fragmentos, radionuclídeos, em particular radioiodeto, radioisótopos, metais quelados, nanopartículas e grupos repórter tais como compostos fluorescentes ou compostos que podem ser detectados por espectroscopia de NMR ou ESR.

[00198] Exemplos de moléculas efetoras podem incluir citotoxinas ou agentes citotóxicos incluindo qualquer agente que seja prejudicial às células (por exemplo, extermínio). Exemplos incluem combrestatinas, dolastatinas, epotilonas, estaurosporina, maitansinóides, espongistatinas, rizoxina, halicondrinas, roridinas, hemiasterlinas, taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposídeo, tenoposídeo, vincristina, vinblastina, colquicina, doxorrubicina, daunorrubicina, diidróxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deidrotestosterona, glicocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, e puromicina e seus análogos ou homólogos.

[00199] As moléculas efetoras também incluem, mas não são limitadas a estas, antimetabólitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina), agentes de alquilação (por exemplo, mecloretamina, clorambucil tioepa, melfalano, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), cyclotosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, e cis-diclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (por exemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina) e doxorrubicina), antibióticos (por exemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina, antramicina (AMC), caliqueamicinas ou duocarmicinas), e agentes anti-mitóticos (por exemplo, vincristina e vinblastina).

[00200] Outras moléculas efetoras podem incluir radionuclídeos, tais como 111In e 90Y, Lu177, Bismuto213, Califórnio252, Irídio192 e Tungstênio188/Rênio188; ou medicamentos, tais como, mas não limitado a estes, alquilfosfocolinas, inibidores da topoisomerase I, taxóides e suramina.

[00201] Outras moléculas efetoras incluem proteínas, peptídeos e enzimas. As enzimas de interesse incluem, mas não são limitadas a estas, enzimas proteolíticas, hidrolases, liases, isomerases, transferases. As proteínas, polipeptídeos e peptídeos de interesse incluem, mas não são limitados a estes, imunoglobulinas, toxinas, tais como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, ou toxina da difteria, uma proteína, tal como insulina, fator de necrose tumoral, -interferon, -interferon, fator de crescimento do nervo, fator de crescimento derivado de plaquetas ou ativador do plasminogênio tecidual, um agente trombótico ou um agente anti-angiogênico, por exemplo, angiostatina ou endostatina, ou, um modificador de resposta biológica tal como uma linfocina, interleucina-1 (IL-1), interleucina-2 (IL-2), fator de estimulação de colônias granulócitas macrófagas (GM-CSF), fator de estimulação de colônias granulócita (G-CSF), factor de crescimento do nervo (NGF) ou outro fator de crescimento e imunoglobulinas.

[00202] Outras moléculas efetoras podem incluir substâncias detectáveis úteis, por exemplo, em diagnóstico. Exemplos de substâncias detectáveis incluem várias enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais bioluminescentes, nuclídeos radioativos, metais emissores de pósitrons (para uso na tomografia de emissão de pósitrons) e íons metálicos não radioativos paramagnéticos. Ver de uma forma geral a Patente US no 4.741.900 para íons metálicos que podem ser conjugados aos anticorpos para uso como agentes de diagnóstico. As enzimas adequadas incluem peroxidase de rábano picante, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, ou acetilcolinesterase; grupos prostéticos adequados incluem estreptavidina, avidina e biotina; materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, dichlorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansila e ficoeritrina; materiais luminescentes adequados incluem luminol; materiais bioluminescentes adequados incluem luciferase, luciferina, e aquorina; e nuclídeos radioativos adequados incluem 125I, 131I, 111In e 99Tc.

[00203] Em outro exemplo, a molécula efetora pode aumentar a meia-vida do anticorpo in vivo, e/ou reduzir a imunogenicidade do anticorpo e/ou de intensificar a liberação de um anticorpo através de uma barreira epitelial ao sistema imunológico. Exemplos de moléculas efetoras adequadas deste tipo incluem polímeros, albumina, proteínas de ligação a albumina ou compostos de ligação a albumina tais como aqueles descritos na WO 05/117984.

[00204] Onde a molécula efetora for um polímero pode, em geral, ser um polímero sintético ou de ocorrência natural, por exemplo, um polímero de polialquileno, polialquenileno ou polioxialquileno de cadeia reta ou ramificada opcionalmente substituído ou um polissacarídeo ramificado ou não ramificado, por exemplo, um homo- ou hetero-polissacarídeo.

[00205] Os substituintes opcionais específicos que podem estar presentes nos polímeros sintéticos acima mencionados incluem um ou mais grupos de hidróxi, metila ou metóxi.

[00206] Exemplos específicos de polímeros sintéticos incluem poli(etileno glicol), poli(propileno glicol), poli(álcool vinílico), ou seus derivados de cadeia reta ou ramificada opcionalmente substituído, especialmente poli(etileno glicol) opcionalmente substituído tal como metoxipoli(etileno glicol) ou seus derivados.

[00207] Os polímeros de ocorrência natural específicos incluem lactose, amilose, dextrano, glicogênio, ou seus derivados.

[00208] “Derivados” como aqui utilizado pretende-se incluir derivados reativos, por exemplo, grupos reativos seletivos a tiol tais como maleimidas e outros mais. O grupo reativo pode estar ligado diretamente ou através de um segmento de ligação ao polímero. Será observado que o resíduo de um tal grupo em alguns casos irá fazer parte do produto como o grupo de ligação entre o anticorpo da divulgação e o polímero.

[00209] O tamanho do polímero pode ser variado conforme desejado, mas geralmente estará em uma faixa média de peso molecular de 500Da a 50000Da, por exemplo, de 5000 a 40000Da, tal como de 20000 a 40000Da. O tamanho do polímero pode, em particular, ser selecionado na base do uso planejado do produto, por exemplo, a capacidade de localizar em certos tecidos tais como tumores ou estender a meia-vida circulante (para revisão ver Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545). Assim, por exemplo, onde o produto se destina a deixar a circulação e penetrar o tecido, por exemplo, para uso no tratamento de um tumor, pode ser vantajoso utilizar um polímero de baixo peso molecular, por exemplo, com um peso molecular ao redor de 5000Da. Para aplicações onde o produto permanece na circulação, pode ser vantajoso utilizar um polímero de peso molecular mais elevado, por exemplo, tendo um peso molecular na gama de 20000Da a 40000Da.

[00210] Os polímeros adequados incluem um polímero de polialquileno, tal como um poli(etileno glicol) ou, especialmente, um metoxipoli(etileno glicol) ou um derivado deste, e especialmente com um peso molecular na faixa de cerca de 15000Da a cerca de 40000Da.

[00211] Em um exemplo, um anticorpo para uso na presente invenção está ligado aos componentes de poli(etileno glicol) (PEG). Em um exemplo particular as moléculas de PEG podem ser ligadas através de qualquer cadeia lateral de aminoácido disponível ou grupo funcional de aminoácido terminal localizado no anticorpo, por exemplo, qualquer grupo de amino, imino, tiol, hidroxila ou carboxila livre. Tais aminoácidos podem ocorrer naturalmente no anticorpo ou podem ser planejados no anticorpo usando métodos de DNA recombinante (ver, por exemplo, US 5.219.996; US 5.667.425; WO 98/25971). Em um exemplo a molécula da presente invenção é um anticorpo modificado em que a modificação é a adição à extremidade C-terminal de sua cadeia pesada de um ou mais aminoácidos para permitir a ligação de uma molécula efetora. Múltiplos sítios podem ser utilizados para ligar duas ou mais moléculas de PEG.

[00212] Em uma forma de realização uma molécula de PEG é ligada a uma cisteína 171 na cadeia leve, por exemplo, ver a WO 2008/038024 aqui incorporada por referência.

[00213] Adequadamente as moléculas de PEG são ligadas de forma covalente através de um grupo de tiol de pelo menos um resíduo de cisteína localizado no anticorpo. Cada molécula de polímero ligada ao anticorpo modificado pode ser ligada covalentemente ao átomo de enxofre de um resíduo de cisteína localizado no anticorpo. A ligação covalente geralmente será uma ligação de dissulfeto ou, em particular, uma ligação enxofre-carbono. Onde um grupo de tiol for utilizado como o ponto de ligação das moléculas efetoras apropriadamente ativadas, por exemplo, os derivados seletivos de tiol tais como maleimidas e derivados de cisteína podem ser usados. Um polímero ativado pode ser usado como o material de partida na preparação do anticorpo modificado por polímero como descrito acima. O polímero ativado pode ser qualquer polímero contendo um grupo reativo de tiol tal como um ácido ou éster -halocarboxílico, por exemplo, iodoacetamida, uma imida, por exemplo, maleimida, uma vinil sulfona, ou um dissulfeto. Tais materiais de partida podem ser obtidos comercialmente (por exemplo, da Nektar, anteriormente Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA) ou podem ser preparados a partir de materiais de partida comercialmente disponíveis utilizando procedimentos químicos convencionais. Moléculas de PEG particulares incluem 20K metóxi-PEG-amina (obtenível da Nektar, anteriormente Shearwater; Rapp Polymere, and SunBio) e M-PEG-SPA (obtenível da Nektar, anteriormente Shearwater).

[00214] A presente invenção também fornece DNA isolado que codifica uma molécula de anticorpo aqui descrita.

[00215] Em um outro aspecto é fornecido um vetor compreendendo dito DNA.

[00216] Os métodos gerais pelos quais os vetores podem ser construídos, métodos de transfecção e métodos de cultura, são bem conhecidos daqueles versados na técnica. A este respeito, referência é feita a “Current Protocols in Molecular Biology”, 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York and the Maniatis Manual produced by Cold Spring Harbor Publishing.

[00217] Em um aspecto adicional se fornece uma célula hospedeira compreendendo dito vetor e/ou DNA.

[00218] Qualquer sistema de célula hospedeira/vetor adequado pode ser utilizado para a expressão das sequências de DNA que codificam a molécula da presente invenção. Bacteriano, por exemplo, E. coli e outros sistemas microbianos podem ser usados ou eucariótico, por exemplo, mamífero, sistemas de expressão de células hospedeiras também podem ser utilizados. As células hospedeiras de mamífero adequadas incluem CHO, células de mieloma ou hibridoma.

[00219] A presente invenção também fornece um processo para a produção de uma molécula de anticorpo como aqui descrita que compreende cultivar uma célula hospedeira contendo um vetor (e/ou DNA) da presente invenção sob condições adequadas para levar à expressão de proteína a partir do DNA que codifica uma molécula de anticorpo da presente invenção, e isolar uma molécula de anticorpo.

[00220] Para a produção de produtos compreendendo as cadeias tanto leves quanto pesadas, a linhagem celular pode ser transfectada com dois vectores, um primeiro vetor que codifica um polipeptídeo de cadeia leve e um segundo vetor que codifica um polipeptídeo de cadeia pesada. Alternativamente, um único vetor pode ser utilizado, o vetor que inclui as sequências que codificam os polipeptídeos de cadeia leve e de cadeia pesada.

[00221] As moléculas de anticorpos de acordo com a presente divulgação são expressas em níveis adequados a partir de células hospedeiras que as torna propícias para o processamento comercial.

[00222] O anticorpo pode ser específico para qualquer antígeno alvo. O antígeno pode ser uma proteína associada a célula, por exemplo, uma proteína da superfície celular sobre as células tais como células bacterianas, células de levedura, células T, células endoteliais ou células de tumor, ou pode ser uma proteína solúvel. Os antígenos de interesse também podem ser qualquer proteína clinicamente relevante tal como aquelas proteínas supra-reguladas durante a doença ou infecção, por exemplo, receptores e/ou seus ligandos correspondentes. Exemplos particulares de proteínas da superfície celular incluem moléculas de aderência, por exemplo, integrinas tais como integrinas 1, por exemplo, VLA-4, E-selectina, P-selectina ou L-selectina, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD11a, CD11b, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD40L, CD45 , CDW52, CD69, CD134 (OX40), ICOS, BCMP7, CD137, CD27L, CDCP1, CSF1 ou Receptor de CSF1, DPCR1, DPCR1, dudulin2, FLJ20584, FLJ40787, HEK2, KIAA0634, KIAA0659, KIAA1246, KIAA1455, LTBP2, LTK, MAL2, MRP2, nectina-como2, NKCC1, PTK7, RAIG1, TCAM1, SC6, BCMP101, BCMP84, BCMP11, DTD, antígeno carcinoembrionário (CEA), globulina da gordura do leite humano (HMFG1 e 2), antígenos MHC Classe I e MHC Classe II, KDR e VEGF, PD-1, DC-SIGN, TL1A, DR3, receptor de IL-7 A e, onde apropriado, receptores destes.

[00223] Os antígenos solúveis incluem interleucinas tais como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-14, IL-16 ou IL-17, tal como IL17A e/ou IL17F, antígenos virais, por exemplo, vírus sincicial respiratório, ou antígenos de citomegalovírus, imunoglobulinas, tais como IgE, interferons tais como interferon , interferon ou interferon , fator de necrose tumoral TNF (anteriormente conhecido como fator de necrose tumoral- e aqui referido como TNF ou TNF), fator- de necrose tumoral, fatores de estimulação da colônia tais como G-CSF ou GM-CSF, e os fatores de crescimento derivados de plaquetas tais como PDGF-, PDGF-, e WISP-1 e onde os receptores apropriados destes. Outros antígenos incluem os antígenos da superfície de células bacterianos, toxinas bacterianas, vírus tais como influenza, EBV, HepA, B e C, agentes de bioterrorismo, radionuclídeos e metais pesados, e venenos e toxinas de cobra e aranha.

[00224] Em uma forma de realização, o anticorpo pode ser utilizado para funcionalmente alterar a atividade do antígeno de interesse. Por exemplo, o anticorpo pode neutralizar, antagonizar ou agonizar a atividade de dito antígeno, direta ou indiretamente.

[00225] As moléculas de anticorpo da presente invenção são úteis no tratamento e/ou profilaxia de uma condição patológica.

[00226] Assim é fornecido um anticorpo de acordo com a presente invenção para uso no tratamento, mediante a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz deste, por exemplo, em uma formulação farmacêutica. Em uma forma de realização o anticorpo de acordo com a invenção é administrado por via tópica nos pulmões, por exemplo, através de inalação.

[00227] Os anticorpos fornecidos pela presente invenção são úteis no tratamento de doenças ou distúrbios incluindo doenças e distúrbios inflamatórios, doenças e distúrbios imunes, distúrbios fibróticos e cânceres.

[00228] O termo “doença inflamatória” ou “distúrbio” e “doença ou distúrbio imune” inclui artrite reumatóide, artrite psoriática, doença de Still, doença de Muckle Wells, psoríase, doença de Crohn, colite ulcerativa, SLE (Lúpus Eritematoso Sistêmico), asma, rinite alérgica, dermatite atópica, esclerose múltipla, vasculite, diabetes melito tipo I, transplante e doenças de enxerto versus hospedeiro.

[00229] O termo “distúrbio fibrótico” inclui fibrose pulmonar idiopática (IPF), esclerose sistêmica (ou esclerodermia), fibrose renal, nefropatia diabética, nefropatia por IgA, hipertensão, doença renal em estágio final, fibrose peritoneal (diálise peritoneal ambulatorial contínua), cirrose hepática, degeneração macular relacionada à idade (ARMD), retinopatia, fibrose reativa cardíaca, cicatrizes, quelóides, queimaduras, úlceras de pele, angioplastia, cirurgia de revascularização, artroplastia e cirurgia de catarata.

[00230] O termo “câncer” inclui um novo crescimento maligno que surge a partir do epitélio, encontrado na pele ou, de forma mais comum, no revestimento de órgãos do corpo, por exemplo: mama, ovário, próstata, pulmão, rim, pâncreas, estômago, bexiga ou intestino. Os cânceres tendem a infiltrar no tecido adjacente e espalhar (metástase) para órgãos distantes, por exemplo: para o osso, fígado, pulmão ou cérebro.

[00231] A presente invenção também fornece uma composição farmacêutica ou de diagnóstico que compreende um anticorpo da presente invenção em combinação com um ou mais de um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável. Conseqüentemente, é fornecido o uso de um anticorpo da invenção para a fabricação de um medicamento. A composição geralmente será fornecida como parte de uma composição farmacêutica estéril que incluirá normalmente um portador farmaceuticamente aceitável. Uma composição farmacêutica da presente invenção pode compreender adicionalmente um adjuvante farmaceuticamente aceitável.

[00232] A presente invenção também fornece um processo para a preparação de uma composição farmacêutica ou de diagnóstico que compreende a adição e mistura do anticorpo da presente invenção juntamente com um ou mais de um excipiente, diluente ou portador farmaceuticamente aceitável.

[00233] O anticorpo da divulgação pode ser o único ingrediente ativo na composição farmacêutica ou de diagnóstico ou pode ser acompanhado de outros ingredientes ativos incluindo outros ingredientes de anticorpos, por exemplo, anticorpos anti-TNF, anti-IL-1 β, anti- células T, anti-IFNY ou anti-LPS, ou ingredientes sem não anticorpos tais como xantinas. Outros ingredientes ativos adequados incluem anticorpos capazes de induzir tolerância, por exemplo, anticorpos anti-CD3 ou anti-CD4.

[00234] Em uma forma de realização adicional o anticorpo ou composição de acordo com a divulgação é empregado em combinação com um outro agente farmaceuticamente ativo, por exemplo, um corticosteróide (tal como propionato de fluticasona) e/ou um beta-2-agonista (tal como salbutamol, salmeterol ou formoterol ) ou inibidores do crescimento e proliferação celular (tais como a rapamicina, ciclofosfamida, metotrexato) ou em alternativa um inibidor de CD28 e/ou CD40. Em uma forma de realização o inibidor é uma molécula pequena. Em outra forma de realização o inibidor é um anticorpo específico do alvo.

[00235] As composições farmacêuticas adequadamente compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo da invenção. O termo “quantidade terapeuticamente eficaz” conforme aqui usado refere-se a uma quantidade de um agente terapêutico necessário para tratar, melhorar ou prevenir uma doença ou condição direcionada, ou para apresentar um efeito terapêutico ou preventivo detectável. A quantidade terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente nos ensaios de cultura celular ou em modelos animais, geralmente em roedores, coelhos, cães, porcos ou primatas. O modelo animal também pode ser utilizado para determinar a faixa de concentração apropriada e via de administração. Tal informação pode então ser usada para determinar doses úteis e vias de administração em seres humanos.

[00236] A quantidade terapeuticamente eficaz precisa para um indivíduo humano dependerá da gravidade do estado doentio, da saúde geral do indivíduo, da idade, peso e sexo do indivíduo, dieta, tempo e freqüência de administração, combinação de medicamentos, sensibilidades de reação e tolerância/resposta à terapia. Esta quantidade pode ser determinada por experimentação de rotina e está dentro da avaliação do médico. Geralmente, uma quantidade terapeuticamente eficaz será de 0,01 mg/kg a 50 mg/kg, por exemplo, de 0,1 mg/kg a 20 mg/kg. As composições farmacêuticas podem ser convenientemente apresentadas em formas de dose unitária contendo uma quantidade predeterminada de um agente ativo da invenção por dose.

[00237] As composições podem ser administradas individualmente a um paciente ou podem ser administradas em combinação (por exemplo, simultânea, seqüencial ou separadamente) com outros agentes, medicamentos ou hormônios.

[00238] A dose em que um anticorpo da presente invenção é administrado depende da natureza da condição a ser tratada, por exemplo, a extensão da doença/inflamação presente e sobre se a molécula está sendo utilizada profilaticamente ou para o tratamento de uma condição existente.

[00239] A freqüência de dosagem irá depender da meia-vida do anticorpo e da duração do seu efeito. Se o anticorpo tiver uma meia-vida curta (por exemplo, de 2 a 10 horas) pode ser necessário fornecer uma ou mais doses por dia. Alternativamente, se o anticorpo tiver uma meia-vida longa (por exemplo, de 2 a 15 dias) pode ser apenas necessário fornecer uma dosagem de uma vez por dia, uma vez por semana ou mesmo uma vez cada 1 ou 2 meses.

[00240] O portador farmaceuticamente aceitável não deve induzir a si mesmo à produção de anticorpos prejudiciais ao indivíduo que recebe a composição e não deve ser tóxica. Os portadores adequados podem ser macromoléculas grandes lentamente metabolizadas tais como proteínas, polipeptídeos, lipossomas, polissacarídeos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido e partículas de vírus inativo.

[00241] Os sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser utilizados, por exemplo, sais de ácido mineral tais como cloridretos, bromidretos, fosfatos e sulfatos, ou sais de ácidos orgânicos, tais como acetatos, propionatos, malonatos e benzoatos.

[00242] Os portadores farmaceuticamente aceitáveis nas composições terapêuticas podem adicionalmente conter líquidos tais como água, salina, glicerol e etanol. Adicionalmente, as substâncias auxiliares tais como agentes umectantes ou emulsificantes ou substâncias tamponantes de pH, podem estar presentes em tais composições. Tais portadores permitem que as composições farmacêuticas sejam formuladas como comprimidos, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas fluidas e suspensões, para ingestão pelo paciente.

[00243] As formas adequadas para administração incluem formas adequadas para a administração parenteral, por exemplo, através de injeção ou infusão, por exemplo, através de injeção de bolo ou infusão contínua. Onde o produto for para injeção ou infusão, pode tomar a forma de uma solução, suspensão ou emulsão em um veículo oleoso ou aquoso e pode conter agentes de formulação, tais como agentes de suspensão, conservantes, estabilizantes e/ou dispersantes. Alternativamente, a molécula da divulgação pode estar na forma seca, para reconstituição antes do uso com um líquido estéril apropriado.

[00244] Assim que formuladas, as composições da invenção podem ser administradas diretamente ao indivíduo. Os indivíduos a serem tratados podem ser animais. No entanto, em uma ou mais formas de realização, as composições são adaptadas para a administração em seres humanos.

[00245] Adequadamente nas formulações de acordo com a presente divulgação, o pH da formulação final não é semelhante ao valor do ponto isoelétrico do anticorpo, por exemplo, se o pH da formulação for 7, então um pI de 8 a 9 ou acima pode ser apropriado. Embora não desejando ser limitado pela teoria, acredita-se que isto pode vir a fornecer uma formulação final com estabilidade melhorada, por exemplo, o anticorpo permanece na solução.

[00246] As composições farmacêuticas desta invenção podem ser administradas por qualquer número de vias incluindo, mas não limitando a estas, vias oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutânea (por exemplo, ver a WO 98/20734), subcutânea, intraperitoneal, intranasal, enteral, tópica, sublingual, intravaginal ou retal. Hipopulverizações também podem ser utilizadas para administrar as composições farmacêuticas da invenção. Tipicamente, as composições terapêuticas podem ser preparadas como injetáveis, como soluções ou suspensões líquidas. As formas sólidas adequadas para solução, ou suspensão, em veículos líquidos antes da injeção também podem ser preparadas.

[00247] A liberação direta das composições geralmente será executada por injeção, por via subcutânea, intraperitoneal, intravenosa ou intramuscular, ou liberada no espaço intersticial de um tecido. As composições também podem ser administradas em uma lesão. O tratamento de dosagem pode ser um esquema de dose única ou um esquema de múltiplas doses.

[00248] Será observado que o ingrediente ativo na composição irá ser um anticorpo. Como tal, será susceptível à degradação no trato gastrointestinal. Assim, se a composição for administrada por uma via que utiliza o trato gastrointestinal, a composição necessitará conter agentes que protegem o anticorpo da degradação, mas que liberam o anticorpo assim que ele tiver sido absorvido a partir do trato gastrointestinal.

[00249] Um debate completo de portadores farmaceuticamente aceitáveis está disponível em Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J., 1991).

[00250] Em uma forma de realização a formulação é fornecida como uma formulação para administrações tópicas incluindo a inalação.

[00251] As preparações inaláveis adequadas incluem pós inaláveis, aerossóis de medição contendo gases propulsores ou soluções inaláveis livres de gases propulsores. Os pós inaláveis de acordo com a divulgação contendo a substância ativa podem consistir apenas das substâncias ativas anteriormente mencionadas ou de uma mistura das substâncias ativas acima mencionadas com excipiente fisiologicamente aceitável.

[00252] Estes pós inaláveis podem incluir monossacarídeos (por exemplo, glicose ou arabinose), dissacarídeos (por exemplo, lactose, sacarose, maltose), oligo- e polissacarídeos (por exemplo, dextranos), poliálcoois (por exemplo, sorbitol, manitol, xilitol), sais (por exemplo, cloreto de sódio, carbonato de cálcio ) ou misturas destes entre si. Os mono ou dissacarídeos são adequadamente utilizados, o uso de lactose ou glicose, particularmente, mas não exclusivamente, na forma dos seus hidratos.

[00253] As partículas para deposição no pulmão requerem um tamanho de partícula menor do que 10 mícrons, tais como de 1 a 9 mícrons, por exemplo, de 0,1 a 5 m, em particular de 1 a 5 m. O tamanho de partícula do ingrediente ativo (tal como o anticorpo) é de importância primordial.

[00254] Os gases propulsores que podem ser utilizados para preparar os aerossóis inaláveis são conhecidos na técnica. Os gases propulsores adequados são selecionados dentre hidrocarbonetos tais como n-propano, n-butano ou isobutano e hidrocarbonetos halogenados tais como derivados clorados e/ou fluorados de metano, etano, propano, butano, ciclopropano ou ciclobutano. Os gases propulsores acima referidos podem ser utilizados isoladamente ou em misturas.

[00255] Os gases propulsores particularmente adequados são derivados halogenados de alcano selecionados dentre TG 11, TG 12, TG 134a e TG227. Os hidrocarbonetos halogenados acima mencionados, TG134a (1,1,1,2- tetrafluoroetano) e TG227 (1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano) e suas misturas são particularmente adequados.

[00256] Os aerossóis inaláveis contendo gás propulsor também podem conter outros ingredientes tais como co-solventes, estabilizantes, agentes tensoativos (surfactantes), antioxidantes, lubrificantes e meios para ajustar o pH. Todos estes ingredientes são conhecidos na técnica.

[00257] Os aerossóis inaláveis contendo gás propulsor de acordo com a invenção podem conter até 5 % em peso da substância ativa. Os aerossóis de acordo com a invenção contêm, por exemplo, de 0,002 a 5 % em peso, de 0,01 a 3 % em peso, de 0,015 a 2 % em peso, de 0,1 a 2 % em peso, de 0,5 a 2 % em peso ou de 0,5 a 1 % em peso do ingrediente ativo.

[00258] Alternativamente as administrações tópicas no pulmão também podem ser através da administração de uma formulação líquida de solução ou suspensão, por exemplo, empregando um dispositivo tal como um nebulizador, por exemplo, um nebulizador conectado a um compressor (por exemplo, o nebulizador Pari LC-Jet Plus(R) conectado a um compressor Pari Master(R) fabricado pela Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Va.).

[00259] O anticorpo do presente invento pode ser liberado disperso em um solvente, por exemplo, na forma de uma solução ou uma suspensão. Ele pode ser colocado em suspensão em uma solução fisiológica adequada, por exemplo, salina ou outro solvente farmaceuticamente aceitável ou uma solução tamponada. As soluções tamponadas conhecidas na técnica podem conter de 0,05 mg a 0,15 mg de edetato dissódico, 8,0 mg a 9,0 mg de NaCl, 0,15 mg a 0,25 mg de polissorbato, de 0,25 mg a 0,30 mg de ácido cítrico anidro, e de 0,45 mg a 0,55 mg de citrato de sódio por 1 ml de água de modo a atingir um pH de cerca de 4,0 a 5,0. A suspensão pode empregar, por exemplo, a molécula liofilizada.

[00260] As suspensões terapêuticas ou formulações de solução também podem conter um ou mais excipientes. Os excipientes são bem conhecidos na técnica e incluem tampões (por exemplo, tampão de citrato, tampão de fosfato, tampão de acetato e tampão de bicarbonato), aminoácidos, uréia, álcoois, ácido ascórbico, fosfolipídeos, proteínas (por exemplo, albumina do soro), EDTA, cloreto de sódio, lipossomas, manitol, sorbitol, e glicerol. As soluções ou suspensões podem ser encapsuladas em lipossomas ou microesferas biodegradáveis. A formulação geralmente será fornecida em uma forma substancialmente estéril empregando processos de fabricação estéreis.

[00261] Isto pode incluir a produção e esterilização por filtração do solvente/solução tamponado utilizado para a formulação, suspensão asséptica da molécula na solução de solvente tamponada estéril, e distribuição da formulação em recipientes esterilizados por métodos familiares para aqueles de habilidade prática na técnica.

[00262] A formulação nebulizável de acordo com a presente divulgação pode ser fornecida, por exemplo, como unidades de dose única (por exemplo, recipientes ou frascos pequenos de plástico lacrados) acondicionadas em envelopes de alumínio. Cada frasco contém uma dose unitária em um volume, por exemplo, 2 ml, de solvente/solução tampão.

[00263] Acredita-se que o anticorpo da presente divulgação seja particularmente adequado para liberação através de nebulização.

[00264] Compreendendo no contexto do presente relatório descritivo destina-se a significar incluindo.

[00265] Onde tecnicamente apropriado as formas de realização da invenção podem ser combinadas.

[00266] A invenção será agora descrita com referência aos exemplos que se seguem, que são meramente ilustrativos e não devem ser de forma alguma interpretados como limitativos do escopo da presente invenção.

[00267] Exemplos

[00268] 1. Mutagênese de cadeia pesada de IgG4 e geração de vetores genéticos isolados de cadeia pesada de IgG4 transformados.

[00269] Mutações de aminoácido foram executadas usando o kit Quickchange® Lightening Multi Site Directed Mutagenesis (SDM) ou o kit Quickchange® II DSM (obtido da Stratagene®) (números de catálogo 210516 e 200521, respectivamente), e executadas de acordo com as instruções do fabricante.

[00270] As mutações foram verificadas por seqüenciamento de DNA. As cadeias pesadas de IgG4 dos pelo menos anticorpos de 1 a 47 na seguinte tabela foram produzidas:

[00271] Outros anticorpos preparados são descritos na tabela 1 acima.

[00272] A cadeia pesada do anticorpo 48 (Sequência ID NO 35) foi gerada por PCR e clonagem da enzima de restrição. O produto da PCR foi gerado por um oligo de avanço que codifica a sequência da região da dobradiça superior e de núcleo da IgG1 e um sítio de restrição BglII e um oligo inverso que codifica a enzima de restrição DralII. O fragmento da PCR foi então digerido com as enzimas acima mencionadas e ligado ao vetor genético isolado hG4 contendo a região variável apropriada.

[00273] 2. Expressão dos anticorpos de IgG4 transformados

[00274] Todo DNA mutante foi transfectado em células CHOK1 ou células CHO- SXE. As células (2 x 108 células/ml) foram colocadas novamente em suspensão em 1 ml de Earles Balance Salt Solution (Sigma) e misturadas com 400 g de DNA (200 g de DNA de cadeia pesada e 200 g de DNA de cadeia leve capa). Alíquotas de 800 l foram transferidas para cubetas de 0,4 cm (Biorad). Para uma cultura de 500 ml, seis cubetas foram submetidas a eletroporação sob os seguintes parâmetros: 1 ms, 9,6 Amps; 10 ms, 0 Amps, 40 ms, 3,2 Amps. As células transfectadas foram incubadas durante 24 horas, agitação em 140 rpm em um ambiente umidificado de CO2 a 5 % a 37 °C e continuaram a partir do dia 2 pós-transfecção a 32 oC durante 10 a 13 dias. No dia 4 pós-transfecção 1,6 ml de butirato de sódio a 1 M foi adicionado à cultura. Assim que as células alcançaram a viabilidade de 40 % ou até o dia 13, o sobrenadante foi colhido. As culturas foram centrifugadas durante 45 minutos a 4000 rpm. O sobrenadante foi colocado através de um filtro Stericup de 0,22 M (Millipore) para ser purificado. Os dados na Figura 28 mostram que as alterações na estabilidade térmica de IgG4 codificada pelas mutações planejadas foram as mesmas quando a proteína foi produzida de células CHO-K1 ou CHO-SXE.

[00275] 3. Purificação de anticorpos de IgG4 transformados

[00276] Os sobrenadantes (200 a 500 ml) foram purificados utilizando uma coluna Protein A 5 ml HiTrap MabSelect SuRe (GE Healthcare, Amersham UK). As amostras foram preparadas pela adição de 1/50o do volume de sobrenadante de 2 M Tris-HCl pH 8,5. As amostras foram carregadas na coluna em 1 ml/min. A coluna foi lavada com PBS pH 7,4. Para eluir as amostras, citrato de sódio a 0,1 M, pH 3,4, foi passado pela coluna em 1 ml/min e frações de 0,5 ml foram coletadas. As frações máximas foram neutralizadas pela adição de 0,125 ml de 2 M Tris-HCl pH 8,5 em cada uma. A detecção de UV foi fixada a 280 nm.

[00277] 4. Caracterização de anticorpos de IgG4 transformados purificados

[00278] Análise de SDS PAGE:

[00279] O sobrenadante bruto foi centrifugado a 1200 rpm durante 5 minutos e quantificado no OCTET. As amostras de anticorpo (25 a 30 ng) foi preparadas pela adição das quantidades apropriadas de anticorpo, Tampão de Carga 4x (Invitrogen) e 2 l de 100 mM NEM. Um volume total de 20 l foi preparado utilizando dH2O. As amostras foram então submetidas a ebulição durante 3 min a 100 °C e carregadas em um gel de Tris-Glicina de 1,5 mm 4 a 20 % de 15 reservatórios. Os géis foram operados em 150 V durante 1,5 hora em tampão 1x Tank. Os anticorpos foram transferidos para uma membrana de nitrocelulose usando o sistema de transferência seco iBlot definido para transferir durante 8 minutos. A membrana foi incubada durante 1 hora na temperatura ambiente (RT) em PBS-TM sobre uma plataforma de agitação, seguido pela incubação com um anticorpo conjugado IgG Fc HRP anti- humano de coelho (Jackson Immunoresearch) ou anticorpo conjugado de HRP de cadeia leve Capa anti-humano de cabra (Bethyl) durante 1 hora, agitação na RT. Isto foi seguido por 3 lavagens de 5 minutos cada com PBS-T. As manchas foram reveladas usando um kit de substrato DAB reforçado com metal acordo com as instruções do fabricante (Pierce).

[00280] Os resultados da análise Western blot são mostrados nas Figuras 7, 8, 9 e 10. Na Figura 7-10, H representa a cadeia pesada e L a cadeia leve, H2L2 é uma molécula de anticorpo inteira compreendendo duas cadeias pesadas e duas cadeias leves e HL é uma semi-molécula que compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve.

[00281] A Figura 7 mostra a análise Western blot para os anticorpos 15, 16, 6, 7, 8, 17, 18, 19, 1, 2, 3, 12 e 13. Pode ser visto a partir da Figura 7 que os anticorpos apresentam um bom nível de H2L2, exceto para o anticorpo 8 que não apresenta nenhum ou muito pouca H2L2 devido à presença de ambos as mutações da dobradiça C239S e C242S. No entanto, o anticorpo 8 pode formar H2L2 mediante a ligação não-covalente entre as cadeias pesadas. O mutante 3 também mostra pouco H2L2, este mutante retenha C239, mas é incapaz de formar dissulfetos inter-cadeias pesadas na dobradiça, presumivelmente devido à formação eficiente de um dissulfeto entre a cisteína de cadeia leve C-terminal (LC) e a dobradiça C239. Também pode ser visto que os anticorpos que compreendem a mutação C239S, mas não a C242S (anticorpos 2, 6 e 12), mostram a formação reduzida de HL em comparação com os anticorpos que não compreendem nem C239S nem C242S ou anticorpos que compreendem C242S, mas não C239S. O anticorpo 16 que compreende a mutação S241P também mostra a formação reduzida de HL. Uma comparação dos mutantes 2 e 3 mostra a extensão do “alcance” da cisteína C- terminal de cadeia leve em formar uma ligação de dissulfeto com a cadeia pesada, parece que a cisteína de cadeia leve se liga de forma mais eficiente ao C239 do que ao C242 na cadeia pesada.

[00282] A figura 8 mostra a análise de Western blot para os anticorpos 15, 6, 7, 8, 28, 29, 30, 31, 17, 19, 32, 33, 33, 34, 35, 36, 37, 38 e 39. Pode ser visto a partir da Figura 8 que os anticorpos apresentam um bom nível de H2L2, exceto para os anticorpos 8, 31, 35 e 39 que não apresentam nenhum ou muito pouco H2L2 devido à presença de mutações C239S e C242S na região da dobradiça e, portanto, nenhuma ligação de dissulfeto se forma entre as duas cadeias pesadas. No entanto, os anticorpos 8, 31, 35 e 39 podem formar H2L2 através da ligação não covalente entre as cadeias pesadas. Também pode ser visto que os anticorpos que compreendem a mutação C239S, mas não C242S (anticorpos 6, 29, 33 e 37) mostram formação reduzida de HL em comparação com anticorpos que não compreendem nem C239S nem C242S ou anticorpos que compreendem C242S, mas não C239S. O mutante 15 é capaz de formar uma ligação de dissulfeto entre a cadeia leve e G230C na CH1 e dissulfuretos inter-cadeias pesadas, em consequência resultando em uma proteína completamente montada e ligada com dissulfeto. Além disso, uma comparação de mutantes 15(C127S G230C), 28(C127S Y229C), 32(C127S K228C) e 36(C127S S227C) mostra que a posição da cisteína introduzida na dobradiça superior melhora a formação de ligações de dissulfeto inter LC-HC. G230 e Y229 são posições particularmente preferidas para se introduzir uma cisteína. O mutante 28 (C127S Y229C) mostra um nível baixo de HL e H2 e, portanto, possui uma baixa heterogeneidade de ligação de dissulfeto.

[00283] A Figura 9 mostra a análise Western blot para os anticorpos 15, 6, 7, 8, 44, 45, 46, 47, 17 e 19. Pode ser visto a partir da Figura 9 que os anticorpos apresentam um bom nível de H2L2, exceto para os anticorpos 8 e 47 que apresentam nenhum ou muito pouco H2L2, devido à presença de mutações C239S e C242S na região da dobradiça e, portanto, nenhuma ligação de dissulfeto se forma entre as duas cadeias pesadas. No entanto, os anticorpos 8 e 47 podem formar H2L2 através da ligação não covalente entre as cadeias pesadas. Também pode ser visto que os anticorpos que compreendem a mutação C239S, mas não a C242S (anticorpos 6 e 45), apresentam formação reduzida de HL em comparação com os anticorpos que não compreendem nem C239S nem C242S ou anticorpos que compreendem C242S, mas não C239S. Em particular, o mutante 44 mostra que a inserção de três aminoácidos na dobradiça superior também pode reduzir a formação de HL e H2 e, portanto, possui níveis mais baixos de heterogeneidade de dissulfeto do que o mutante comparável 15.

[00284] A Figura 10 mostra a análise Western blot para os anticorpos 48, 17, 18 e 19. Pode ser visto a partir da Figura 10, que o anticorpo 48 apresenta um bom nível de H2L2 e muito pouco HL. O mutante 48 contém a sequência da dobradiça superior de IgG1 EPKSCDKTHT no lugar da sequência da dobradiça superior de IgG4 juntamente com uma mutação de S241P da dobradiça de núcleo. Por isso o mutante 48 possui a sequência da dobradiça superior e núcleo EPKSCDKTHTCPPCP. O mutante 48 mostra níveis mais baixos de heterogeneidade de ligação dissulfeto em comparação com o anticorpo de IgG4 tipo silvestre 17 e níveis baixos aproximadamente equivalentes de heterogeneidade de ligação de dissulfeto em comparação com o mutante de IgG4 S241P 18 e anticorpo de IgG1 tipo silvestre 19.

[00285] Ensaio Termoflúor:

[00286] As estabilidades térmicas de mAbs purificados foram analisadas em um ensaio de termoflúor usando SYPRO® Orange para monitorar o processo de desdobramento térmico de proteínas. 5 l de mAb em 1 mg/ml, 5 l de tintura 30x, e 40 l de PBS foram adicionados. Dez l da mistura foram dispensados em quadruplicata em uma placa de reservatórios ótica da PCR 384 e foram operados no 7900HT Fast Real-Time PCR System (Agilent Technologies UK Ltd, Wokingham UK). Este sistema de PCR contém um dispositivo de aquecimento para o controle preciso da temperatura fixada em 20 °C a 99 °C; um dispositivo acoplado carregado simultaneamente monitora as mudanças de fluorescência nos reservatórios.

[00287] As Figuras 11, 12, 13, 14 e 15 mostram os resultados da análise da estabilidade térmica dos mutantes de anticorpo de IgG4 em comparação aos anticorpos de IgG1 tipo silvestre e IgG4.

[00288] Uma comparação do mutante 15 com a IgG4 tipo silvestre (mutante 17) mostra um aumento na FAB Tm devido à disposição alterada de dissulfeto. Uma comparação do mutante 15 e 28 mostra outra melhora na Fab Tm para o mutante 28 que compreende a mutação Y229C em comparação com o mutante 15 que compreende a mutação G230C. Uma comparação de mutantes 15 e 44 mostra que a Tm Fab de um mutante G230C pode ainda ser aumentada pela inserção de três aminoácidos na dobradiça superior. A comparação dos mutantes 17 e 18 mostra que a mutação da dobradiça do meio S241P não aumenta a Fab Tm mesmo embora reduza significativamente a formação de HL. O mutante 48 também mostra Fab Tm significativamente melhorada em comparação tanto com a IgG4 tipo silvestre (mutante 17) quanto com o mutante 15.

[00289] A Figura 15 mostra a classificação total das estabilidades térmicas de mutantes de IgG4 selecionados de acordo com a presente invenção. Os mutantes 48, 44, 44P, 46, 45, 6, 29, 30, 28, 28P, 31, 8, 47 e 15 todos apresentam valores Fab Tm significativamente maiores em comparação com a IgG4 tipo silvestre (mutante 17) e IgG4 S241P tipo silvestre (mutante 18).

[00290] Afinidade de Anticorpos:

[00291] A afinidade dos anticorpos de IgG4 mutantes selecionados da presente invenção com a citocina solúvel alvo foi medida por Biacore™. O formato de ensaio foi capturado do IgG’s sobre uma superfície anti-Fc seguido pela titulação de citocina solúvel.

[00292] Os resultados são mostrados na Figura 16, onde ele pode ser ver que os anticorpos mutantes apresentaram afinidade comparável com respeito a citocina solúvel em comparação com os anticorpos de IgG1 e IgG4 tipo silvestre de controle.

[00293] O termo “Kd”, (s-1), refere-se à taxa de dissociação constante da interação de anticorpo-antígeno. Dito valor também é referido como o valor de koff.

[00294] O termo “ka” (M-1 s-1), como aqui usado, refere-se à taxa de associação constante da interação de anticorpo-antígeno.

[00295] O termo “KD” (M) ou “KD” (pM), conforme aqui usado, refere-se à constante de equilíbrio de dissociação da interação de anticorpo-antígeno.

[00296] Análise de HPLC de Exclusão de Tamanho (SEC):

[00297] Aproximadamente 50 ug de anticorpo purificado foram operados no HPLC utilizando uma coluna S200. Abs de 1 a 19 foram utilizados para a análise. Este resultado mostra que H2L2 não covalentemente associado é formado apesar das alterações nas disposições de DSB de uma molécula de IgG4 humana.

[00298] Os resultados da análise de HPLC são mostrados na Figura 17.

[00299] Comprimentos alternativos do espaçador da dobradiça superior

[00300] Os espaçadores de poli-alanina entre 1 e 5 aminoácidos de comprimento foram inseridos entre PP e CPSP, ou seja, no local indicado por ‘A’, ESKYCPPACPSPA. A Figura 18 mostra que inserção de qualquer comprimento de espaçador é suficiente para reduzir a quantidade de formação de H2 ou L2 no mutante 15. No entanto, os comprimentos de inserção de 3 ou mais aminoácidos pareciam oferecer o maior aumento na estabilidade térmica. É digno de nota que uma inserção de aminoácido mais atentamente imita a diferença no comprimento da dobradiça superior entre IgG1 e IgG4.

[00301] Composição de aminoácido do espaçador da dobradiça superior alternativo

[00302] A fim de explorar se as inserções de tri-alanina na ESKYCPPACPSPA tinham propriedades especiais como espaçadores da dobradiça superior, duas outras inserções de tri-aminoácidos foram testadas: GGG e THT. A Figura 19 mostra que tanto a GGG quanto a THT foram funcionais como regiões espaçadoras embora os resultados tenham sugerido que elas não eram idênticas. A GGG pareceu ser menos capaz do que a AAA ou THT em reduzir a formação de H2 e L2. O aumento na estabilidade térmica para GGG e THT e não foi tão grande quanto aquela observada com a AAA.

[00303] Comprimento e composição alternativos do aminoácido espaçador da dobradiça superior

[00304] IgG4 possui um ‘espaçador’ de aminoácido 2 (PP) entre a cisteína de intercadeias CH1 e a primeira cisteína da dobradiça do núcleo, enquanto que a IgG1 possui um espaçador DKTHT de aminoácido 5. Quatro mutantes (68, 67, 66 e 56) foram construídos de modo a permitir uma comparação contra o mutante 15 (ESKYCPPCPSCP). Primeiro o espaçador PP de IgG4 foi substituído por um espaçador DK de comprimento igual como encontrado na IgG1; mutante 68 (ESKYCDKCPSCP) e depois por incrementos de um aminoácido para imitar o espaçador da dobradiça superior IgG1: mutante 67 (ESKYCDKTCPSCP) mutante 66 (ESKYCDKTHCPSCP) mutante 56 (ESKYCDKTHTCPSCP).

[00305] Os dados na Figura 21 sugerem que a modificação única mais importante é a de PP para DK, o que resultou em uma redução na formação de H2, H e L em relação ao mutante 15. Comprimentos crescentes de inserção de espaçador como IgG1 adicional (T, TH e THT) apareceram para efetuar a redução gradual mínima em H2, mas pode ter resultado em um aumento gradual adicional na formação de HL. Visto que os mutantes 68, 67, 66, e 56 contêm uma sequência de dobradiça do núcleo CPSC, o aumento na formação de HL pode ser evidência para os espaçadores que são mais eficazes em isolar as cisteínas de ligação de dissulfeto intercadeias LC-HC longe das cisteínas da dobradiça do núcleo que são conseqüentemente propensas à formação de ligações de dissulfeto intra- moleculares.

[00306] Os dados na figura 22 sugerem que DK é preferível à PP como uma escolha de espaçador de aminoácido 2 em termos de redução da heterogeneidade de isoformas de dissulfeto, em comparação aos mutantes 15 (ESKYCPPCPSCP) e 68 (ESKYCDKCPSCP) e mutantes de 55 (ESKYCPPTHTCPSCP) e 56 (ESKYCDKTHTCPSCP). Motivos curtos de poli-prolina tais como PP são conhecidos de serem capazes de codificar um certo nível de potencial de giro de hélice que pode resultar em uma justaposição local de LC-HC e cisteínas da dobradiça do núcleo. Este efeito local parece ser melhor superado por uma AAA adicional como visto no mutante 44 (ESKYCPPAAACPSCP). Nenhum dos mutantes 68, 55, 56, 44 ou 69 pareceu ter estabilidades térmicas significativamente diferentes.

[00307] Influência da composição de sequência da dobradiça superior sem espaçador

[00308] A fim de compreender a influência da composição de sequência da sequência da dobradiça superior N-terminal da cisteína CH1 inter LC-HC (ESKY em IgG4 e EPKS em IgG1) todas as permutações de mutante foram produzidas no contexto do mutante 15 (ESKYCPPCPSCP). Os dados na Figura 23 mostram que no contexto de um espaçador PP, nenhuma das permutações de composição da dobradiça superior pareceu significativamente afetar a heterogeneidade da isoforma de dissulfeto. Os dados apresentados acima sugerem que esta falta de efeito é principalmente porque as proteínas contêm um espaçador PP curto e um motivo da dobradiça de núcleo capaz de formação de ligação de dissulfeto intra-molecular. No entanto, diferenças significativas na estabilidade térmica foram observadas. Ambas as sequências naturalmente evoluíram; ESKP (83,8 oC) e EPKS (80,6 oC) foram mais estáveis do que qualquer uma das sequências híbridas; EPKY (76,3 oC) e EPKS (79,0 oC). Os dados mostram que a sequência de IgG1 EPKS é a mais preferível.

[00309] A fim de compreender a importância dos motivos da dobradiça superior ESKY ou EPKS no contexto da região de espaçador DKTHT mais preferível todas as permutações foram feitas. Os dados da Figura 24 mostram que o motivo de IgG4 ESKY natural (mutante 56 ESKYCDKTHTCPSCP) é o mais suscetível à heterogeneidade da isoforma de dissulfeto. Os dados na Figura 24 confirmam que a sequência da dobradiça superior de IgG1 natural (mutante 65 EPKSCDKTHTCPSCP) possui um potencial mínimo para a heterogeneidade da isoforma de dissulfeto e possui uma estabilidade térmica elevada.

[00310] Influência da troca de Ser para Pro da dobradiça do núcleo

[00311] Um mutante mais preferido 48 (EPKSCDKTHTCPPCP) foi transformado de modo a reintroduzir a Ser da dobradiça do núcleo de IgG4 natural (Ser241 através da numeração Kabat), resultando no mutante 65 (EPKSCDKTHTCPSCP). Os dados na Figura 20 confirmam que o mutante 48 possui níveis significativamente muito reduzidos de H2, HL, H e L em comparação com o mutante 15 (ESKYCPPCPSCP) e uma estabilidade térmica significativamente muito aumentada. A reintrodução da dobradiça do núcleo Ser241 (mutante 65) não afetou a estabilidade térmica em relação ao mutante 48, mas resultou no reaparecimento de níveis significativos de HL. É digno de nota que o mutante 65 ainda tenha menos H2, H e L do que o mutante 15 que ilustra a importância do comprimento e composição da sequência da dobradiça superior no que diz respeito à homogeneidade da isoforma de dissulfeto.

[00312] Ensaio da função efetora do anticorpo através da lise celular

[00313] O antígeno da superfície celular de expressão das células alvo possui seus conteúdos intracelulares rotulados pela incubação com o ligante de reforço da fluorescência BADTA. BADTA é convertido dentro da célula em um ligando hidrófilo, TDA. As células rotuladas são incubadas com o anticorpo e PBMC’s (células mononucleares do sangue periférico) como agentes líticos. Após a lise das células, neste exemplo, por ADCC, TDA é liberado e forma um quelante fluorescente e estável EuTDA quando európio é adicionado nas culturas de células. Em essência, a rotulação com BADTA dos conteúdos celulares permite uma quantificação da lise celular. A lise celular por sua vez fornece uma medida da presença das funções efetoras em uma IgG. As Figuras 25 e 26 tentam submeter a lise as células com IgG4 através de ADCC. Um análogo do anticorpo Herceptin (trastuzumab), foi produzido tanto como IgG1 tipo silvestre quanto como IgG4 tipo silvestre. O antígeno Her-2 para a Herceptin é expresso nas células MCF7 e de SKBR3. Os mutantes do análogo de Herceptin da IgG também foram gerados, e a IgG purificada para uso no ensaio de ADCC. A IgG4 é conhecida de ter uma capacidade muito baixa para executar ADCC como confirmado pela diferença entre a IgG1 de controle tipo silvestre (wt) e a IgG4 tipo silvestre (wt). Esta falta de potencial inato de ADCC não foi afetada por qualquer um dos quatro mutantes de IgG4 testados. Notavelmente estes incluem os mutantes 28, 44 e 48 que possuem disposições de ligação de dissulfeto intercadeias LC-HC alteradas e mais notavelmente o mutante 48 (EPKSCDKTHTCPPCP) que contém os motivos da dobradiça superior e do núcleo de IgG1. Portanto, estes dados mostram que os mutantes descritos não ganham funções efetoras através da utilização de sequências da dobradiça superior e do núcleo de IgG1.

[00314] Ampla aplicabilidade de mutantes aos anticorpos de IgG4.

[00315] Todos os dados descritos até agora descritas são para um anticorpo de IgG4 proprietário UCB particular, Ab 410. A fim de demonstrar que as melhoras na homogeneidade da isoforma de dissulfeto e estabilidade térmica não eram únicas para a estrutura/estabilidade codificada da região variável desta IgG, exemplos de outro IgG4 foram gerados. Informação da sequência publicamente disponível foi usada para criar análogos de IgG4 de três IgG’s industrialmente releventes: trastuzumab (Herceptin), natalizumab (Tysabri) e Tocilizumab (Actemra). Coletivamente, os dados apresentados nas Figuras de 28 a 33 mostram que o desempenho relativo dos mutantes chaves da IgG4 são altamente semelhantes em todos os exemplos de IgG4, tanto em termos da homogeneidade da isoforma de dissulfeto quanto em termos da estabilidade térmica relativa. As estabilidades absolutas de cada exemplar diferem entre si de uma maneira esperada a partir das observações publicadas anteriormente sobre as estabilidades inerentes diferentes de IgG’s. Estes dados sugerem que os mutantes descritos são capazes de melhorar a homogeneidade da isoforma de dissulfeto e aumentar a estabilidade térmica em todas as moléculas de IgG4.

[00316] Efeito de mutantes de IgG4 em considerações práticas: expressão e célula hospedeira

[00317] Os mutantes descritos têm melhorado a homogeneidade da isoforma de dissulfeto e aumentado a estabilidade térmica na faixa de moléculas de IgG4. Os dados na Figura 27 mostram que esses mutantes não afetam negativamente a expressão de IgG4. Os dados de expressão mostrados são a expressão média para cada mutante transitoriamente expresso a partir de células CHO para cada um das 4 especificidades de antígeno descritas; Ab410, e análogos de Trastuzumab, Natalizumab e Tocilizumab. Estes dados sugerem que a arquitetura de dissulfeto inter-cadeias de ramificação Fab e as sequências da dobradiça superior do núcleo não são determinantes primários de rendimento a partir das células CHO. Os dados na Figura 31 mostram que a estabilidade térmica de Ab410 é a mesma quer os mutantes sejam expressos nas células CHO-K1 quer nas células CHO-SXE. Estes dados sustentam que as mutações da arquitetura de dissulfeto inter-cadeias de ramificaão FAB de IgG e as sequências da dobradiça superior e do núcleo são os principais determinantes da estabilidade térmica melhorada.

Claims (21)

1. Anticorpo da classe IgG4 compreendendo pelo menos uma cadeia pesada que compreende um domínio de CH1 e uma região da dobradiça, caracterizado pelo fato de que em cada cadeia pesada: a. a cisteína inter-cadeias na posição 127, numerada de acordo com o sistema de numeração Kabat, no domínio de CH1 é substituída com um aminoácido livre de tiol; e b. um ou mais dos aminoácidos posicionados na região da dobradiça superior são substituídos com cisteína, em que o um ou mais aminoácidos posicionados na região da dobradiça superior que é substituída com cisteína são selecionados dentre 227, 228, 229 e 230, numerado de acordo com o sistema de numeração Kabat, em que cada cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 38 a 52, 55 a 58 e 62 a 63.

2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a glicina na posição 230, numerada de acordo com o sistema de numeração Kabat, é substituída por cisteína.

3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a tirosina na posição 229, numerada de acordo com o sistema de numeração Kabat, é substituída por cisteína.

4. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a lisina na posição 228, numerada de acordo com o sistema de numeração Kabat, é substituída por cisteína.

5. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a serina na posição 227, numerada de acordo com o sistema de numeração Kabat, é substituída por cisteína.

6. Anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a cisteína na posição 239 e a cisteína na posição 242, numeradas de acordo com o sistema de numeração Kabat, na cadeia pesada são substituídas por um aminoácido livre de tiol.

7. Anticorpo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a cisteína na posição 239, numerada de acordo com o sistema de numeração Kabat, na cadeia pesada é substituída por um aminoácido livre de tiol.

8. Anticorpo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a cisteína na posição 242, numerada de acordo com o sistema de numeração Kabat, na cadeia pesada é substituída por um aminoácido livre de tiol.

9. Anticorpo da classe IgG4 compreendendo pelo menos uma cadeia pesada que compreende um domínio de CH1 e uma região da dobradiça, caracterizado pelo fato de que em cada cadeia pesada: a. a cisteína inter-cadeias na posição 127, numerada de acordo com o sistema de numeração Kabat, é substituída com um aminoácido livre de tiol; e b. a cisteína na posição 239 ou a cisteína na posição 242, numerada de acordo com o sistema de numeração Kabat, é substituída com um aminoácido livre de tiol; em que cada cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 38, 39, 44, 45, 48, 49, 52, 56, 57, 59 e 60.

10. Anticorpo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o aminoácido não contendo tiol é serina.

11. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a cisteína na posição 127 é substituída por serina.

12. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que três alaninas são inseridas entre as posições 238 e 239, numeradas de acordo com o sistema de numeração Kabat.

13. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que uma treonina, uma histidina e uma outra teronina são inseridas entre as posições 238 e 239, numeradas de acordo com o sistema de numeração Kabat.

14. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a serina na posição 241, numerada de acordo com o sistema de numeração Kabat, é substituída com prolina.

15. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a glicina na posição 230 é substituída com cisteína, a serina na posição 227 é substituída com prolina, a tirosina na posição 229 é substituída com serina, a prolina na posição 237 é substituída com ácido aspártico, a prolina na posição 238 é substituída com lisina, a sequência de aminoácido treonina- histidina-treonina é inserida entre as posições 238 e 239 e a serina na posição 241 é substituída com prolina.

16. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada compreende um domínio de CH2 e um domínio de CH3.

17. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende duas cadeias pesadas e como definidas em qualquer uma das reivindicações precedentes.

18. Anticorpo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que as cadeias pesadas são idênticas.

19. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada ou cada cadeia pesada compreende uma região da dobradiça superior e região de núcleo de 12 a 17 aminoácidos de comprimento.

20. Anticorpo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a região da dobradiça superior e do núcleo é de 15 aminoácidos de comprimento.

21. Anticorpo como definido de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 20 para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio.

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