ES2773123T3

ES2773123T3 - Anticuerpos biespecíficos IgG4 modificados asimétricos

Info

Publication number: ES2773123T3
Application number: ES13707824T
Authority: ES
Inventors: David Paul Humphreys; Shirley Jane Peters
Original assignee: UCB Biopharma SRL
Current assignee: UCB Biopharma SRL
Priority date: 2012-02-22
Filing date: 2013-02-22
Publication date: 2020-07-09
Anticipated expiration: 2033-02-22
Also published as: DK2817333T3; CN104245729B; JP6308953B2; IL234107A0; JP2015514684A; IL234107B; JP2020090514A; MX2014010021A; SG11201404900YA; AU2013224004A1; KR20140130711A; EP2817333A1; US20150017169A1; CA2865261A1; CN104245729A; AU2018201233B2; HK1202565A1; WO2013124451A1; EA201491571A1; MX356301B

Abstract

Un anticuerpo asimétrico biespecífico que in vivo tiene menos susceptibilidad al intercambio que los anticuerpos IgG4 de tipo salvaje, comprendiendo dicho anticuerpo: i. dos cadenas ligeras y ii. dos cadenas pesadas o fragmentos de cadenas pesadas, cada uno de los cuales comprende al menos una región variable, una región bisagra y un dominio CH1, en donde una primera cadena pesada o fragmento de la misma es una clase IgG4 y tiene: a. la cisteína entre cadenas en la posición 127, numerada según el sistema de numeración de Kabat, en el dominio CH1 está sustituida con un aminoácido que no contiene tiol; y b. uno de los aminoácidos posicionados en la región bisagra superior seleccionada entre S227, K228, Y229 y G230 se sustituye con cisteína, y en donde la segunda cadena pesada o fragmento de la misma es IgG4 de tipo salvaje o IgG4 de tipo salvaje con una mutación S241G o S241A, y en donde cada cadena pesada tiene una región variable diferente.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos biespecíficos IgG4 modificados asimétricos

La presente descripción se refiere a anticuerpos asimétricos que comprenden una cadena o fragmento pesado de IgG4 que está mutado y una segunda cadena o fragmento pesado que es distinto de dicha cadena de IgG4. La descripción también se extiende a composiciones que comprenden dichos anticuerpos asimétricos y al uso de los anticuerpos y composiciones que los comprenden para el tratamiento. En un aspecto adicional, la descripción se extiende a métodos para preparar los anticuerpos y formulaciones, y a vectores que codifican los anticuerpos y huéspedes que los expresan.

La industria biofarmacéutica que abarca proteínas recombinantes, anticuerpos monoclonales (mAbs) y fármacos basados en ácido nucleico está creciendo rápidamente. La ingeniería de anticuerpos ha dado como resultado el diseño y la producción de fragmentos de anticuerpos o formatos alternativos. El formato molecular preferido junto con otros aspectos tales como el rendimiento de producción, la calidad de la proteína y la estabilidad de almacenamiento se tienen en cuenta al seleccionar una proteína basada en anticuerpos como agente terapéutico.

La estructura básica de todas las moléculas de inmunoglobulina (Ig) comprende dos cadenas pesadas (HC) idénticas y dos cadenas ligeras (LC) idénticas que están unidas por enlaces disulfuro. Cada LC consta de una variable (V^l) y dominio constante (C^l) Basado en el HC, se reconocen cinco clases principales de Ig: IgG, IgA, IgD, IgE e IgM. Para IgG, el HC consiste en un dominio variable (V^h) y tres dominios constantes (C^h1-3). Los dominios C^h2 y C^h3 forman la parte Fc de la molécula que es responsable de estimular la función efectora y está vinculada al fragmento Fab (V^hV^ly C^hC^l) por una región bisagra que confiere flexibilidad a la molécula de IgG. Dos sitios de reconocimiento de antígeno se encuentran en los extremos de la V^ly V^hdominios. La IgG se subdivide en 4 isotipos diferentes: IgG 1, IgG2, IgG3 e IgG4.

Las funciones efectoras mediadas por Fc, es decir, la citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC) o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) dependen del isotipo. Cada isotipo ha evolucionado para realizar una función específica dentro del cuerpo. El isotipo IgG1 es actualmente el más utilizado como terapéutico debido a su vida media prolongada, activación de ADCC mejorada y activación de complemento. Se emplean otros isotipos como agentes terapéuticos según la diana y el efecto deseado. Por ejemplo, cuando los antígenos diana simplemente se neutralizan y las funciones efectoras son menos importantes, se pueden usar isotipos alternativos tales como IgG2 e IgG4. Alternativamente, se puede considerar la IgG con la función Fc/efector rediseñada genéticamente.

La IgG2 también tiene una función efectora mínima asociada pero es propensa a la dimerización que no se entiende completamente.

La IgG4 sigue siendo un isotipo útil debido a su relativa falta de inducción de la función efectora. Sin embargo, el uso de la IgG4 también tiene algunas dificultades prácticas inherentes, a saber, su vida media en suero más corta y su capacidad para experimentar el "intercambio del brazo Fab" (también denominado intercambio dinámico de cadena pesada o intercambio de cadena pesada), en donde la cadena pesada y su la cadena ligera unida de un anticuerpo se intercambia con la cadena pesada y su cadena ligera unida de otro anticuerpo para formar un anticuerpo completo compuesto por dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras unidas (van der Neut Kolfschoten et al., 2007 Science 317, 1554-1557).

El intercambio del brazo Fab in vivo da como resultado anticuerpos biespecíficos que, debido a sus diferentes dominios variables, pueden co-comprometer antígenos diana distintos. Esto produce un gran porcentaje de IgG4 circulante que se ha observado que es biespecífica, pero funcionalmente monovalente. (Schuurman, J., Van Ree, R., Perdok, G.J., Van Doorn, H.R., Tan, K.Y., Aalberse, R.C., 1999. Normal human immunoglobulin G4 can be bispecific: it has two different antigen-combining sites. Immunology 97, 693-698).

Cuando los anticuerpos IgG4 se analizan in vitro mediante SDS-PAGE no reductora, se ha observado que forman las llamadas “semimoléculas”, cada una de las cuales comprende un único par de cadenas pesadas y ligeras asociadas covalentemente, causado por la ausencia de enlaces disulfuro entre cadenas pesadas típicamente debido a la formación de enlaces disulfuro en el interior de la cadena pesada dentro de la región de bisagra de una cadena pesada. La cadena pesada de una "semimolécula" puede asociarse no covalentemente con su pareja emparejada de cadena pesada, manteniendo la asociación mediante interacciones de dominio C^h3:C^h3. En disolución, tales “semimoléculas” se observan realmente utilizando métodos tales como la cromatografía de exclusión de tamaño para que sea de tamaño completo, es decir, aproximadamente 150 kDa, pero en SDS-PAGE no reductora se componen de pares LC:HC de 75 kDa (las llamadas "semimoléculas").

Una mutación Ser a Pro en la posición 241 (numerada según el sistema de numeración de Kabat) en la bisagra reduce la apariencia de estas “semimoléculas” al no reducir la SDS-PAGE (Angal,S. et al., 1993. A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human (IgG4) antibody as observed during SDS-PAGE analysis Mol Immunol 30, 105-108). Además, esta mutación puntual no influye en la estructura compacta de la IgG4, lo que permite que la IgG4 conserve su capacidad reducida para activar el complemento.

Tras el descubrimiento de la mutación S241P, se han investigado más mutaciones de IgG4 para comprender la interacción entre cadenas pesadas en los anticuerpos IgG4, reducir la función efectora de IgG4 y mejorar la estabilidad estructural. En Schuurman et al. (Schuurman,J et al., 2001. The inter-heavy chain disulphide bonds of IgG4 are in equilibrium with intra-heavy chain disulphide bonds. Molecular Immunology 38, 1-8), se investigó la inestabilidad observada de los enlaces disulfuro de cadena pesada entre IgG4 utilizando mutantes IgG4. En el mutante M1 Cys 131 (numerado según el sistema de numeración EU o Cys 127 según el sistema de numeración de Kabat), que está involucrado en enlace disulfuro entre cadenas pesada-ligera (C^l-C^h1), fue reemplazado por serina y se encontró que este mutante dio como resultado la formación de dímeros de cadenas ligeras y dímeros de cadenas pesadas. En el mutante M2, la cisteína 226 (numerada 226 según el sistema de numeración EU o 239 según el sistema de numeración de Kabat), que está involucrada en un enlace disulfuro entre cadenas pesadas en la bisagra, fue reemplazada por serina y se descubrió que este mutante tenía un enlace entre cadenas pesadas más estable en comparación con IgG4 y evita la formación de un enlace disulfuro en la cadena pesada.

La alteración del número de residuos de cisteína presentes en la región bisagra de los anticuerpos ha sido investigada previamente. El documento US 5677425 Bodmer et al. describe que el número de residuos de cisteína en la región bisagra se puede aumentar para facilitar el uso de los grupos tiol de cisteína para unir moléculas efectoras o informadoras. El documento US 5677425 también enseña que el número de residuos de cisteína en la región bisagra puede reducirse a uno para facilitar el ensamblaje de las moléculas de anticuerpos, ya que solo será necesario formar un enlace disulfuro único, que proporcionará una diana específica para unir la región bisagra ya sea a otra región bisagra o a una molécula efectora o indicadora.

Dado que los anticuerpos IgG4 administrados a un sujeto son susceptibles al intercambio dinámico de la cadena pesada para formar "anticuerpos mixtos", este proceso puede ser explotado para preparar in vitro los anticuerpos de la presente descripción. Ventajosamente, esto permite manipular las características de los anticuerpos.

Todavía existe la necesidad de proporcionar nuevos anticuerpos para uso como terapéutico. La presente invención proporciona nuevos anticuerpos mutados que pueden tener propiedades ventajosas que incluyen propiedades biofísicas mejoradas, por ejemplo en comparación con los anticuerpos de tipo salvaje.

Sumario de la invención

La presente descripción proporciona un anticuerpo asimétrico biespecífico que in vivo tiene menos susceptibilidad al intercambio que los anticuerpos IgG4 de tipo salvaje, comprendiendo dicho anticuerpo:

i. dos cadenas ligeras y

ii. dos cadenas pesadas o fragmentos de cadenas pesadas, cada uno de los cuales comprende al menos una región variable, una región bisagra y un dominio C^h1, en el que una primera cadena pesada o fragmento de la misma es una clase IgG4 y tiene:

a. la cisteína entre cadenas en la posición 127, numerada según el sistema de numeración de Kabat, en el dominio C^h1 está sustituida con un aminoácido que no contiene tiol; y

b. uno de los aminoácidos posicionados en la región bisagra superior seleccionada entre S227, K228, Y229 y G230 se sustituye con cisteína, y

en donde la segunda cadena pesada o fragmento de la misma es IgG4 de tipo salvaje o IgG4 de tipo salvaje con una mutación S241G o S241A, y

en donde cada cadena pesada tiene una región variable diferente.

En una realización, la secuencia bisagra de las dos cadenas pesadas es similar o idéntica.

La presente descripción es ventajosa porque permite la manipulación y el control de las propiedades del anticuerpo por métodos que son convenientes y fácilmente accesibles.

Los anticuerpos de la presente invención pueden demostrar un intercambio reducido de la cadena pesada en comparación con la IgG4 de tipo salvaje, que proporciona uno asimétrico (tal como un anticuerpo biespecífico) que demuestra poco o ningún intercambio con la IgG4 de tipo salvaje in vivo debido a su reducida propensión al intercambio en comparación con la IgG4 y también debido a la concentración relativamente baja de un anticuerpo mixto asimétrico in vivo en comparación con los anticuerpos IgG4 circulantes naturales.

Los anticuerpos de la presente invención pueden demostrar un intercambio de cambio pesado reducido a concentraciones mayores que las concentraciones in vivo, por ejemplo concentraciones de 0,5 mM o mayores en comparación con la IgG4 de tipo salvaje. Si bien los anticuerpos de la invención demuestran un intercambio reducido de la cadena pesada en comparación con la IgG4 de tipo salvaje, sí demuestran un grado de intercambio de la cadena pesada, en comparación con IgG1 WT e IgG4 S241P, que es suficiente para crear una mezcla asimétrica (como un anticuerpo biespecífico) de dos anticuerpos diferentes (como dos anticuerpos que tienen especificidades de antígeno diferentes) in vitro.

Por lo tanto, en una realización, los anticuerpos de la presente descripción pueden intercambiarse in vitro con GSH 5 mM pero no con GSH 0,5 mM. Este último imita más de cerca la barrera de intercambio in vivo. La Fig. 20 ilustra esto porque Ab28 (C127S Y229C) intercambia con WT, S241G S241A o S241T a 5 mM GSH, pero no a 0,5 mM.

Por consiguiente, la presente invención también proporciona un método para generar un anticuerpo mixto asimétrico, que comprende las etapas de tomar un anticuerpo simétrico que comprende una primera secuencia de cadena pesada o un fragmento de la misma como se define en la presente memoria y mezclar dicho anticuerpo in vitro con un segundo anticuerpo simétrico que comprende una segunda secuencia de cadena pesada o un fragmento de la misma que es diferente a dicha primera secuencia de cadena pesada, bajo condiciones que conducen al intercambio de cadena pesada entre los dos anticuerpos, y opcionalmente al aislamiento del anticuerpo mixto asimétrico obtenido a partir de él. El método también proporciona un anticuerpo biespecífico, dicho método comprende mezclar dos anticuerpos, en donde la especificidad de antígeno de las regiones variables en el primer anticuerpo es diferente a la especificidad de antígeno de las regiones variables en el segundo anticuerpo.

El método de la presente descripción permite que las propiedades del anticuerpo se manipulen completamente para proporcionar una molécula terapéutica final que se personaliza y optimiza para el uso terapéutico pretendido.

Además, los anticuerpos según la presente descripción pueden ser ventajosos porque tienen niveles bajos de función efectora.

Breve descripción de las figuras

Figura 1a muestra el C^h1 humano y las secuencias bisagra IgG 1 de tipo salvaje y IgG4 de tipo salvaje de, en donde los residuos bisagra están subrayados, y la secuencia constante de la cadena ligera kappa. Figura 1b muestra:

la secuencia constante de la cadena ligera kappa humana que indica la cisteína (subrayada) que forma el enlace disulfuro C^l-C^h1 entre cadenas;

los residuos de C^h1 N-terminales de la cadena pesada de la IgG 1,2, 3 y 4 humana y las secuencias de la región bisagra en donde la posición de la cisteína (en la bisagra superior para IgG 1 y en C^h1 N-terminal para IgG 2, 3 y 4) está indicada (subrayado) lo que forma el enlace disulfuro C ^l-C^h1 entre cadenas;

los residuos de C^h1 N-terminales de la cadena pesada de la IgD humana y parte de las secuencias de la región bisagra en donde la posición de cisteína en la secuencia de C^h1 N-terminal está indicada (subrayada) lo que forma el enlace disulfuro C ^l-C^h1 entre cadenas;

los residuos C^h1 N-terminales, C^h1 C-terminales de la cadena pesada de la IgM humana, y los residuos C^h2 N-terminales seleccionados en donde la posición de cisteína en la C^h1 N-terminal está indicado (subrayado) lo que forma el enlace disulfuro C^l-C^h1 entre cadenas; y

los residuos en la bisagra superior de IgG3 e IgG4, la bisagra de IgD y en la C^h1 C-terminal y la C^h2 de IgM donde los residuos subrayados indican posiciones donde uno o más residuos pueden estar sustituidos con cisteína en los anticuerpos de la presente invención.

Figura 2a muestra el residuo de cisteína de C^h1 (C127) que forma el enlace disulfuro entre cadenas con una cisteína en la cadena ligera y residuos de la bisagra superior y central de la IgG 1 de tipo salvaje, IgG4 de tipo salvaje y las posiciones donde se han introducido mutaciones en los anticuerpos IgG4 de la presente invención.

Figura 2b muestra el residuo de cisteína de C^h1 (C127) que forma el enlace disulfuro entre cadenas con una cisteína en la cadena ligera y residuos de la bisagra de la IgG3 de tipo salvaje y las posiciones donde uno o más residuos están sustituidos con cisteína en los anticuerpos IgG3 de la presente invención. Figura 2c muestra el residuo de cisteína de C^h1 (C127) que forma el enlace disulfuro entre cadenas con una cisteína en la cadena ligera y los residuos de C^h1 y C^h2 seleccionados de la IgM de tipo salvaje y las posiciones donde uno o más residuos están sustituidos con cisteína en los anticuerpos IgM de la presente invención.

Figura 2d muestra el residuo de cisteína de C^h1 (C128) que forma el enlace disulfuro entre cadenas con una cisteína en la cadena ligera y residuos de la bisagra de la IgD tipo salvaje de y las posiciones donde uno o más residuos están sustituidos con cisteína en los anticuerpos IgD de la presente invención. Figura 3a muestra las mutaciones introducidas en los anticuerpos IgG4 según la presente invención.

Figura 3b muestra las posiciones de los residuos en la cadena pesada mutada de los anticuerpos IgG4 que se muestran en la Figura 3a y el enlace disulfuro predicho que puede formarse con una cisteína en la cadena ligera (LC) o con otra cadena pesada mutada (HC). Cuando la cisteína puede unirse con una cisteína en la LC o HC, la cadena subrayada es la disposición del enlace de disulfuro predominante prevista.

Figura 4a muestra las mutaciones introducidas en los anticuerpos IgG4 según la presente invención.

Figura 4b muestra las posiciones de los residuos de cisteína en los anticuerpos IgG4 que se muestran en la Figura 4a y el enlace disulfuro predicho que puede formarse con una cisteína en la cadena ligera (LC) o en la cadena pesada (HC). Cuando la cisteína puede unirse con una cisteína en la LC o HC, la cadena subrayada es la disposición del enlace de disulfuro predominante prevista.

Figura 5 muestra varias secuencias

Figura 6 muestra varias secuencias

Figura 7 muestra el análisis de inmunotransferencia de anticuerpos según la presente invención con el gel superior mostrando los resultados usando un anticuerpo Fc antihumano y el gel inferior mostrando los resultados usando un anticuerpo anti-Kappa.

Figura 8 muestra el análisis de inmunotransferencia de anticuerpos según la presente invención con el gel superior mostrando los resultados usando un anticuerpo Fc antihumano y el gel inferior mostrando los resultados usando un anticuerpo Kappa antihumano.

Figura 9 muestra el análisis de inmunotransferencia de anticuerpos según la presente invención con el gel superior mostrando los resultados usando un anticuerpo Fc antihumano y el gel inferior mostrando los resultados usando un anticuerpo Kappa antihumano.

Figura 10 muestra el análisis de inmunotransferencia de un anticuerpo según la presente invención con el gel superior mostrando los resultados usando un anticuerpo Fc antihumano y el gel inferior mostrando los resultados usando un anticuerpo Kappa antihumano.

Figura 11 muestra los resultados de un análisis de termoflúor de anticuerpos de la presente invención que muestra la termoestabilidad de los dominios Fab y C^h2.

Figura 12 muestra los resultados de un análisis de termoflúor de anticuerpos de la presente invención que muestra la termoestabilidad de los dominios Fab y C^h2.

Figura 13 muestra los resultados de un análisis de termoflúor de anticuerpos de la presente invención que muestra la termoestabilidad de los dominios Fab y C^h2.

Figura 14 muestra los resultados de un análisis de termoflúor de anticuerpos de la presente invención que muestra la termoestabilidad de los dominios Fab y C^h2.

Figura 15 muestra la clasificación de las termoestabilidades de anticuerpos seleccionados de la presente invención.

Figura 16 muestra el intercambio de la cadena pesada a las 16 horas en donde el primer anticuerpo se selecciona de IgG1 de tipo salvaje, IgG4 de tipo salvaje y varios anticuerpos mutantes y el segundo anticuerpo es IgG4 de tipo salvaje a dos concentraciones de GSH. Las figuras muestran que los mutantes tienen un poco menos de intercambio que los anticuerpos IgG4 de tipo salvaje y un intercambio significativamente mayor que el anticuerpo IgG1 de tipo salvaje y el anticuerpo IgG4 P. Esto es ventajoso porque el intercambio se puede usar para preparar los anticuerpos asimétricos de la presente descripción, que in vivo tienen menos susceptibilidad al intercambio que los anticuerpos IgG4 de tipo salvaje. En algunos casos, aumentar la concentración del agente reductor, como GSH, aumenta la cantidad de intercambio observado.

Figura 17 Análisis de intercambio asimétrico de mutantes que comprenden regiones variables de tipo 1 con residuos alternativos en la posición 241 con regiones variables de tipo 2.

Figura 18 Análisis de intercambio asimétrico de IgG4 WT con regiones variables de tipo 1 incubadas con diferentes mutantes S241 y cisteína de bisagra central con regiones variables tipo 2.

Figura 19 Análisis de intercambio asimétrico de IgG4 S241P con regiones variables de tipo 1 incubadas con diferentes mutantes S241, IgG4 C127S Y229C (Ab 28) con regiones variables de tipo 2 Figura 20 Análisis de intercambio asimétrico de IgG4 C127S Y229C (número 28) con regiones variables de tipo 1 incubadas con diferentes mutantes S241 e IgG4 WT con regiones variables de tipo 2 Figura 21 Análisis de intercambio asimétrico de mutantes de doble bisagra con regiones variables de tipo 1 incubadas con múltiples mutantes con regiones variables de tipo 2.

Breve descripción de las secuencias

SEQ ID NO: 1 muestra la secuencia de C^h1 y de la región bisagra de un anticuerpo IgG1 de tipo salvaje.

SEQ ID NO: 2 muestra la secuencia de C^h1 y de la región bisagra de un anticuerpo IgG4 de tipo salvaje.

SEQ ID NO: 3 muestra una parte de la región constante de una cadena ligera kappa de tipo salvaje humana.

SEQ ID NO: 4 muestra una parte de la secuencia N-terminal del dominio C^h1 de un anticuerpo IgG1 humano.

SEQ ID NO: 5 muestra la región bisagra de un anticuerpo IgG1 humano.

SEQ ID NO: 6 muestra una parte de la secuencia N-terminal del dominio C^h1 de un anticuerpo IgG2 humano.

SEQ ID NO: 7 muestra la región bisagra de un anticuerpo IgG2 humano.

SEQ ID NO: 8 muestra una parte de la secuencia N-terminal del dominio C^h1 de un anticuerpo IgG3 humano.

SEQ ID NO: 9 muestra la región bisagra de un anticuerpo IgG3 humano.

SEQ ID NO: 10 muestra una parte de la secuencia N-terminal del dominio C^h1 de un anticuerpo IgG4 humano. SEQ ID NO: 11 muestra la región bisagra de un anticuerpo IgG4 humano.

SEC ID NO: 12 a 37 muestran las secuencias del dominio C^h1 y de la región bisagra de los anticuerpos 6, 7, 8, 15, 16, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ,44 , 45, 46, 47, 2, 3, 48, 28P y 44P respectivamente.

SEQ ID NO: 38 a 63 muestran las secuencias del dominio C^h1, de la región bisagra, del dominio C^h2 y del dominio C^h3 de los anticuerpos 6, 7, 8, 15, 16, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 44, 45, 46, 47, 2, 3, 48, 28P y 44P respectivamente.

SEQ ID NO: 64 muestra las secuencias de los dominios C^h2 y C^h3 de la IgG4 de tipo salvaje.

SEQ ID NO: 65 muestra las secuencias de los dominios C^h2 de la IgG4 de tipo salvaje y C^h3 de la IgG1 de tipo salvaje. SEQ ID NO: 66 muestra la secuencia de región constante de una cadena ligera kappa de tipo salvaje humano. SEQ ID NO: 67 muestra una parte de la secuencia N-terminal del dominio C^h1 de un anticuerpo IgD humano.

SEQ ID NO: 68 muestra una parte de la región bisagra de un anticuerpo IgGD humano.

SEQ ID NO: 69 muestra una parte de la secuencia N-terminal del dominio C^h1 de un anticuerpo IgM humano.

SEQ ID NO: 70 muestra una parte de la secuencia C-terminal del dominio C^h1 de un anticuerpo IgM humano.

SEQ ID NO: 71 muestra una parte del dominio C^h2 de un anticuerpo IgM humano.

SEQ ID NO: 72 a 295 muestran varias regiones bisagra.

SEQ ID NO: 296 a 305 muestran las secuencias del dominio C^h1 y de la región bisagra de los anticuerpos 1,4, 5, 5P, 9, 10, 11, 12, 13 y 14 respectivamente.

SEQ ID NO: 306 a 315 muestran las secuencias del dominio C^h1, de la región bisagra, del dominio C^h2 y del dominio C^h3 de los anticuerpos 1,4, 5, 5P, 9, 10, 11, 12, 13 y 14 respectivamente.

SEQ ID NO: 316-322 muestran varias secuencias de bisagras y partes de las mismas.

Descripción detallada

Un anticuerpo asimétrico como se emplea en la presente memoria es un anticuerpo donde las dos cadenas pesadas o fragmentos de las mismas tienen secuencias de aminoácidos que son parcial o completamente diferentes en las regiones fuera de las regiones variables, por ejemplo, que tienen una similitud menor al 98% sobre la porción relevante, tal menos de 97, 96 95% sobre la porción relevante. En una realización, hay 1, 2, 3, 4, 5 aminoácidos diferentes o añadidos en una región de 10 aminoácidos consecutivos. Las secuencias de aminoácidos también pueden tener longitudes diferentes que, por necesidad, darán como resultado una diferencia en la secuencia de aminoácidos. Partes de las cadenas pesadas pueden tener secuencias similares o idénticas.

En una realización, las secuencias de cadena pesada en los anticuerpos de la presente descripción están unidas covalentemente, por ejemplo, a través de un enlace disulfuro entre cadenas, por ejemplo, un enlace que está presente naturalmente en el fragmento de tipo salvaje correspondiente o un enlace que ha sido diseñado genéticamente para estar presente en la ubicación deseada en las cadenas.

La bisagra superior y central de la IgG1 de tipo salvaje tiene la secuencia EPKSCDKTHTCPPCP SEQ ID NO: 316. La bisagra superior y central de la IgG4 de tipo salvaje tiene la secuencia ESKYGPPCPSCP SEQ ID NO: 317. La bisagra de tipo IgG1 como se emplea en la presente memoria pretende referirse a en donde uno o más, por ejemplo 1 a 5, tales como 1,2 o 3 aminoácidos se insertan en la bisagra IgG4, en particular entre la SEC ID NO: de EPKYGPP: 318 y CPSC y/o uno o más de los aminoácidos YGPP en la bisagra IgG4 se reemplazan, por ejemplo, para corresponder a un aminoácido en la bisagra IgG1, en particular G (de YGPP en la bisagra IgG4) se reemplaza con C o donde Y (de YGPP en la bisagra IgG4) se reemplaza con C o S.

Por lo tanto, la presente invención también proporciona un anticuerpo mixto asimétrico que comprende una primera cadena pesada de IgG4 con una bisagra superior, central y bisagra inferior, y dicha bisagra superior y central en la cadena pesada o cada cadena pesada en la misma es 13 a 17, tal como 15 aminoácidos de longitud.

En una realización, el anticuerpo mixto asimétrico con una primera cadena pesada de IgG4 tiene una bisagra superior y una central de 15 aminoácidos de longitud.

En una realización, la bisagra superior y la central de al menos la primera cadena pesada comprende los 12 aminoácidos naturales encontrados en una bisagra IgG4 y otros tres aminoácidos, por ejemplo 3 residuos de alanina, o 3 residuos de glicina o una combinación de los mismos.

En una realización, la bisagra tiene una de las siguientes secuencias:

Las moléculas se pueden hacer con una bisagra superior y central en al menos la primera cadena pesada de IgG4 de la descripción que consiste en una bisagra de IgG1 natural, es decir, EPKSCDKTHTCPPC SEQ ID NO: 96 o un derivado de la misma como:

Generalmente, la región bisagra en cada una de las cadenas pesadas del anticuerpo mixto asimétrico será al menos compatible. Es decir, cuando se combinan cadenas pesadas, la disposición no será inestable, por ejemplo, debido a la tensión interna en la región bisagra.

En una realización, la región bisagra de cada cadena pesada comprende una secuencia seleccionada independientemente de una secuencia de la bisagra descrita en la presente memoria.

En una realización, la bisagra en cada una de las cadenas pesadas es similar o idéntica. Esto puede ser ventajoso porque puede minimizar la incompatibilidad de las regiones bisagra de las dos cadenas.

La descripción proporciona un anticuerpo mixto asimétrico que comprende dos cadenas pesadas de IgG4, cada una de las cuales comprende una región variable, un dominio C^h1 y una región de bisagra, en donde en la primera cadena pesada:

a. la cisteína entre cadenas en la posición 127, numerada según el sistema de numeración de Kabat, en el dominio C^h1 está sustituida con otro aminoácido; y

b. la bisagra en la cadena pesada o cada cadena pesada en el mismo está en el intervalo de 12 a 17, como 15 aminoácidos de longitud

en donde parte o la totalidad de la segunda cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos diferente a dicha primera cadena pesada en al menos la región fuera de la región variable.

Las bisagras adecuadas se describen anteriormente.

La presente descripción también proporciona un anticuerpo asimétrico que comprende dos cadenas pesadas de IgG4 que cada una comprende un dominio C^H1 y una región bisagra, en donde en la primera cadena pesada:

a. la cisteína en la posición 127, numerada según el sistema de numeración de Kabat, se sustituye con otro aminoácido; y

b. la cisteína en la posición 239 o la cisteína en la posición 242, numeradas según el sistema de numeración de Kabat, se sustituyen con otro aminoácido

En una realización según el último aspecto de la descripción, al menos la cadena pesada de IgG4 contiene 22 aminoácidos en la bisagra, por ejemplo como se describió anteriormente.

La presente descripción también proporciona un anticuerpo mixto asimétrico que comprende dos cadenas pesadas de IgG3 que cada una comprende un dominio C^h1 y una región bisagra, por ejemplo en donde en la primera cadena pesada:

a. la cisteína en el dominio C^h1 que forma un enlace disulfuro entre cadenas con una cisteína en una cadena ligera está sustituido con otro aminoácido; y

b. uno o más de los aminoácidos colocados en la región bisagra superior están sustituidos con cisteína. en donde parte o la totalidad de la segunda cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos diferente a dicha primera cadena pesada en al menos la región fuera de la región variable.

La presente descripción proporciona un anticuerpo mixto asimétrico que comprende además dos cadenas pesadas de IgM que cada una comprende una C^H1 dominio y un dominio C^H2, por ejemplo en donde en la primera cadena pesada:

b. uno o más de los aminoácidos posicionados en dominio C^h1 o el dominio C^h2 está sustituido con cisteína; en donde parte o la totalidad de la segunda cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos diferente a dicha primera cadena pesada en al menos la región fuera de la región variable.

La presente descripción proporciona un anticuerpo mixto asimétrico que comprende además dos cadenas pesadas de IgD, por ejemplo, cada una de las cuales comprende un dominio C^h1 y una región de bisagra, en donde en la primera cadena pesada:

a. la cisteína en el dominio C^h1 que forma un enlace disulfuro entre cadenas con una cisteína en una cadena ligera está sustituida con otro aminoácido; y

b. uno o más de los aminoácidos colocados en la región bisagra se sustituyen con cisteína

Si bien no desea estar obligado por la teoría, se sospecha que la región C^h3 de los anticuerpos IgG4 tiene una función que desempeñar en el proceso de intercambio dinámico. Por lo tanto, reemplazo de la región C^h3 de un anticuerpo de clase no IgG4 con un dominio C^h3 de un anticuerpo IgG4 puede hacer que el anticuerpo mutado sea más propicio para el intercambio.

En una realización, la una o más cisteína(s) que estaría(n) naturalmente involucrada(s) en la formación de un enlace disulfuro entre cadenas entre la cadena ligera y la cadena pesada se reemplaza por un aminoácido no cisteína, como se describe en los documentos WO2005/003170 y WO2005/003171.

En una realización, la cadena ligera kappa humana en un anticuerpo o fragmento según la presente descripción tiene uno o más de los residuos 171, 156, 202 o 203 reemplazados como se describe en el documento WO2008/038024.

El experto en la técnica apreciará que las mutaciones hechas al anticuerpo IgG4 también pueden aplicarse a otros isotipos o clases de anticuerpos que tienen la misma disposición de enlaces disulfuro que un anticuerpo IgG4 para proporcionar un anticuerpo mejorado. Ejemplos específicos de anticuerpos que tienen la misma disposición de enlace disulfuro que un anticuerpo IgG4 son anticuerpos IgG3, anticuerpos IgM y anticuerpos IgD. Como se muestra en la Figura 1b, las IgG3 e IgM tienen una cisteína en la posición 127 en el dominio C^h1 e IgD tiene una cisteína en la posición 128 en el dominio C^h1 que es equivalente al C127 en el dominio C^h1 de IgG4 que forma un enlace disulfuro entre cadenas con una cisteína en la cadena ligera. Además, también se puede ver en la Figura 1b que las regiones de la bisagra superior de IgG3 e IgD y la región C-terminal del dominio C^h1 y la región N-terminal del dominio C^h2 en IgM no contiene un residuo de cisteína que sea equivalente a los residuos de la región bisagra superior de IgG1.

El anticuerpo según la descripción comprende dos cadenas pesadas de clase IgG4.

El anticuerpo según la presente descripción comprende además dos cadenas ligeras.

El anticuerpo según la presente descripción comprende dos regiones variables.

La presente descripción proporciona un anticuerpo mixto asimétrico en donde las regiones variables tienen una especificidad diferente, es decir, un anticuerpo biespecífico. Es decir, donde el anticuerpo comprende dos regiones variables de la cadena pesada, cada región variable es específica para un antígeno diferente.

En una realización, cada región variable puede unirse independientemente al antígeno diana.

El presente formato de anticuerpo es ventajoso porque es fácilmente accesible desde los métodos de producción de anticuerpos de rutina y utilizando mecanismos de origen natural.

En una realización, el uno o ambos C-terminales de la cadena pesada se fusionan con un anticuerpo de dominio, por ejemplo con especificidad para un antígeno distinto, que es un antígeno al que las regiones variables de las cadenas pesadas no son específicas.

Los dominios variables únicos también conocidos como anticuerpos de dominio único o dAbs para uso en la presente invención pueden generarse usando métodos conocidos en la técnica e incluyen los descritos en el documento WO2005/118642, Ward et al., 1989, Nature, 341, 544-546 y Holt et al., 2003, Trends in Biotechnology, 21,484-490. En una realización, un anticuerpo de dominio único para uso en la presente invención es un dominio variable de cadena pesada (VH) o un dominio de cadena ligera (VL). Cada dominio de cadena ligera puede ser del subgrupo kappa o lambda. Los métodos para aislar dominios VH y VL se han descrito en la técnica, ver por ejemplo en el documento EP0368684 y Ward et al., supra. Dichos dominios pueden derivarse de cualquier especie adecuada o material de partida de anticuerpos. En una realización, el anticuerpo de dominio único puede derivarse de un roedor, un ser humano u otra especie. En una realización, el anticuerpo de dominio único se humaniza.

En una realización, el anticuerpo de dominio único se deriva de una biblioteca de presentación de fagos, usando los métodos descritos en, por ejemplo, el documento WO2005/118642, Jespers et al., 2004, Nature Biotechnology, 22, 1161-1165 y Holt et al., 2003, Trends in Biotechnology , 21,484-490. Preferiblemente, tales anticuerpos de dominio único son completamente humanos, pero también pueden derivarse de otras especies. Se apreciará que la secuencia del anticuerpo de dominio único una vez aislada puede modificarse para mejorar las características del anticuerpo de dominio único, por ejemplo la solubilidad, como se describe en Holt et al., supra.

En una realización, el anticuerpo de cada dominio es un VH o VHH.

En una realización, hay dos anticuerpos de dominio, uno fusionado con cada cadena pesada, en donde los dos anticuerpos de dominio forman un emparejamiento VH/VL que se une al antígeno para el cual son cooperativos específicos.

En una realización, el anticuerpo de la descripción está aislado, es decir, no está ubicado en un cuerpo humano o animal.

Los términos "proteína" y "polipéptido" se usan indistintamente en la presente memoria, a menos que el contexto indique lo contrario. El término "péptido" se refiere a 10 o menos aminoácidos.

Los términos "polinucleótido" incluyen un gen, ADN, ADNc, ARN, ARNm, etc. a menos que el contexto indique lo contrario.

Como se usa en la presente memoria, el término "que comprende" en el contexto de la presente memoria descriptiva debe interpretarse como "que incluye".

El término "tipo salvaje" en el contexto de la presente invención significa un anticuerpo, ya que puede aparecer en la naturaleza o puede aislarse del medio ambiente, que no comprende ninguna mutación genéticamente modificada.

La designación de un mutante de sustitución en la presente memoria consiste en una letra seguida de un número seguido de una letra. La primera letra designa el aminoácido en la proteína de tipo salvaje. El número se refiere a la posición del aminoácido donde se está haciendo la sustitución de aminoácidos, y la segunda letra designa el aminoácido que se usa para reemplazar el aminoácido de tipo salvaje.

Los residuos en dominios variables y constantes de anticuerpos se numeran convencionalmente según un sistema ideado por Kabat et al. Este sistema se establece en Kabat et al., 1987, en Sequences of Proteins of Immunological Interest, Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE. UU., NIH, EE. UU. (en adelante "Kabat et al. (supra)").

Las designaciones de residuos de Kabat no siempre se corresponden directamente con la numeración lineal de los residuos de aminoácidos. La secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos aminoácidos o más que en la estricta numeración de Kabat correspondiente a un acortamiento o inserción en un componente estructural, ya sea el armazón o región determinante de complementariedad (CDR), de la estructura básica de dominio variable. La numeración correcta de Kabat de los residuos puede determinarse para un anticuerpo dado mediante la alineación de los residuos de homología en la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada de Kabat "estándar".

Alternativamente, la numeración de los residuos de aminoácidos puede realizarse mediante el índice de la UE o el sistema de numeración EU (también descrito en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Servicio de Salud Pública, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD. (1991)).

Otro sistema de numeración de residuos de aminoácidos en los anticuerpos es el sistema de numeración IMGT (Lefranc, M.-P. y col., Dev. Comp. Immunol., 29, 185-203 (2005)).

El sistema de numeración de Kabat se usa en la presente memoria descriptiva, excepto cuando se indique lo contrario que se usa el sistema de numeración EU o el sistema de numeración IMGT.

Entre los cuatro isotipos de IgG, las disposiciones de enlaces disulfuro dentro de cadena en la cadena pesada y ligera son similares, mientras que las disposiciones de enlaces de disulfuro entre cadenas son únicos para cada isotipo [Revisado por (Wypych, J., Li, M., Guo, A., Zhang, Z., Martinez, T., Allen, MJ, Fodor, S., Kelner, d N, Flynn, GC, Liu, YD, Bondarenko, PV, Ricci, Ms , Dillon, t M, Balland, A., 2008. Human IgG2 antibodies display disulphide-mediated structural isoforms. J Biol Chem. 283, 16194-16205)].

Como se muestra en la Figura 1 b, las secuencias de la región bisagra de los cuatro isotipos de IgG difieren. La región bisagra completa o genética generalmente consiste en los residuos 226 a 251 (numeración basada en el sistema de numeración de Kabat). La Figura 1b muestra las secciones superior, central e inferior de las regiones bisagra de los cuatro isotipos de IgG. Para el isotipo IgG1, la región bisagra superior son los residuos 226 a 238, la región bisagra central son los residuos 239 a 243 y la región bisagra inferior son los residuos 244 a 251. Para el isotipo IgG4, la región bisagra superior son los residuos 226 a 238, la región bisagra central son los residuos 239 a 243 y la región bisagra inferior son los residuos 244 a 251.

Por lo tanto, la bisagra que comprende la bisagra superior, la bisagra central e inferior en una IgG 1 tiene 23 aminoácidos de longitud como se muestra en la Figura 1 a. La bisagra superior tiene 10 aminoácidos. La central tiene 5 aminoácidos y la bisagra inferior tiene 8, véase, por ejemplo, la Figura 1b.

La bisagra que comprende la bisagra superior, la bisagra central e inferior en una IgG4 tiene 20 aminoácidos de longitud como se muestra en la Figura 1a. La bisagra superior tiene 7 aminoácidos. La central tiene 5 aminoácidos y la bisagra inferior tiene 8, véase, por ejemplo, la Figura 1b.

Los nuevos anticuerpos IgG4 mutantes según la presente invención se han desarrollado modificando las disposiciones de enlace disulfuro entre cadenas dentro de IgG4, específicamente se ha modificado la disposición de enlace disulfuro entre cadenas C^l-C^h1 entre la cadena ligera (LC) y la cadena pesada (HC).

La Figura 1b muestra secciones de las secuencias de cadena pesada y ligera de la IgG humana para los isotipos IgG 1-4 que indican las posiciones de cisteína (subrayadas) que forman los enlaces disulfuro entre cadenas C^l-C^h1. El enlace disulfuro entre C^l-C^h1 de IgG1 se forma entre el LC C214 (sistema de numeración de Kabat) y C233 (sistema de numeración de Kabat) de la HC justo antes de la región bisagra. En contraste, el enlace disulfuro C^h1 -C^lpara IgG2, 3 y 4 se forma entre el LC C214 y C127 N-terminal al enlace disulfuro en la cadena de la HC. Las secuencias LC y HC que rodean los residuos de cisteína implicados en la formación de enlaces disulfuro C^l-C^h1 se muestra y alinea en la Figura 1b.

La presente invención ha investigado cómo el enlace disulfuro C^l-C^h1 afecta las propiedades de un anticuerpo IgG4, incluida la termoestabilidad, la estabilidad estructural, la heterogeneidad de la isoforma disulfuro, la afinidad y el intercambio de la semimolécula del anticuerpo.

Se pueden generar mutantes de IgG4 mediante la sustitución del residuo de cisteína en C^h1 en la posición 127 con otro aminoácido, así como sustituyendo uno o más de los aminoácidos en la región bisagra superior, preferiblemente aminoácidos en las posiciones seleccionadas de 227, 228, 229 y 230, numeradas según el sistema de numeración de Kabat de IgG4, con cisteína. Las posiciones 227, 228, 229 o 230 están en o cerca de la posición estructural equivalente en la que está situada la cisteína 233 de IgG1.

Cada cadena pesada puede comprender mutaciones adicionales que incluyen la sustitución de uno o ambos residuos de cisteína 239 y 242 en la región bisagra de IgG4 con otro aminoácido. Una mutación para alargar la región bisagra superior de IgG4 en tres aminoácidos entre las posiciones 238 y 239 para que tenga la misma longitud que la bisagra de IgG1 también se puede incluir en algunos anticuerpos. La mutación S241P también se introdujo en algunos anticuerpos.

Se proporciona un anticuerpo IgG4 en el que la cisteína 127 se sustituye por otro aminoácido y la cisteína de la cadena ligera se une mediante un enlace disulfuro a una cisteína modificada en las posiciones 227, 228, 229 o 230.

En una realización, la bisagra superior y la región central se seleccionan de una de las siguientes secuencias 108 a 295.

En una realización, la región central de la bisagra en una o ambas secuencias de cadena pesada o fragmentos de la misma tiene la secuencia CPPCP SEQ ID NO: 322.

Si bien no desea limitarse a la teoría, se cree que es probable que esta secuencia bloquee el intercambio dinámico de los brazos de anticuerpos a concentraciones de tipo "in vivo", por ejemplo, la concentración de reductor de menos de 0,5 mM, en particular las concentraciones de reductor en el orden de 5 uM se consideran fisiológicamente relevantes (Zilmer et al., 2005 Drug Design Reviews vol. 2, n.° 2, págs. 121 -127, 2005).

Las mutaciones a los anticuerpos de la presente invención se describirán ahora con más detalle. Los métodos para reemplazar aminoácidos son bien conocidos en la técnica de la biología molecular. Dichos métodos incluyen, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio utilizando métodos tales como PCR para eliminar y/o sustituir aminoácidos o diseño de novo de secuencias sintéticas.

La Figura 2a muestra residuos de la bisagra de tipo salvaje IgG1, IgG4 de tipo salvaje y las posiciones donde se han introducido mutaciones en los anticuerpos de la presente invención. Numeración basada en el sistema de numeración de Kabat.

Los anticuerpos según la presente invención comprenden una mutación en la posición 127 (C127), en donde el residuo de cisteína se reemplaza por otro aminoácido, preferiblemente un aminoácido que no contiene un grupo tiol. Por reemplazar o sustituir queremos decir que donde se encontraría normalmente la cisteína 127 entre cadenas en la cadena pesada del anticuerpo, otro aminoácido está en su lugar. La mutación en C127 puede ser cualquier mutación adecuada a uno, dos o tres de los nucleótidos que codifican el aminoácido en la posición 127 que cambia el residuo de aminoácido de cisteína a otro aminoácido adecuado. Ejemplos de aminoácidos adecuados incluyen serina, treonina, alanina, glicina o cualquier aminoácido polar. Un aminoácido particularmente preferido es la serina.

La sustitución de la cisteína en la posición 127 con otro aminoácido elimina la cisteína en el dominio C^h1 que normalmente forma un enlace disulfuro con una cisteína en la cadena ligera en la IgG4 de tipo salvaje. Por lo tanto, para formar un emparejamiento de cadena ligera y cadena pesada a través de un enlace disulfuro entre cadenas, la cadena ligera debe formar un enlace disulfuro con una cisteína que se coloca en la región bisagra de la cadena pesada.

Los anticuerpos según la presente invención comprenden una cadena pesada en donde uno o más de los aminoácidos en las posiciones seleccionadas de 227, 228, 229 y 230, numerados según el sistema de numeración de Kabat, se sustituyen con cisteína. Por consiguiente, los anticuerpos según la presente invención pueden portar una o más de las siguientes mutaciones: S227C; K228C; Y229C; G230C.

Preferiblemente, solo un residuo seleccionado de 227, 228, 229 y 230 está sustituido con un residuo de cisteína.

Los anticuerpos particularmente preferidos de la presente invención portan la mutación Y229C o G230C.

La inclusión de un residuo de cisteína en una posición seleccionada de 227, 228, 229 y 230, en la región bisagra de la cadena pesada proporciona una nueva posición para que se forme un enlace disulfuro entre cadenas entre la cadena pesada y la cadena ligera.

Se pueden introducir mutaciones adicionales a los anticuerpos de este aspecto de la presente invención. En una realización, la cisteína en la posición 239 (C239) y/o la cisteína en la posición 242 (C242), numeradas según el sistema de numeración de Kabat, en la cadena pesada se sustituyen con otro aminoácido, preferiblemente un aminoácido que no contiene un grupo tiol. Por reemplazar o sustituir queremos decir que donde la cisteína 239 y/o la cisteína 242 normalmente se encontrarían en la cadena pesada del anticuerpo, otro aminoácido está en su lugar. La mutación en C239 y/o C242 puede ser cualquier mutación adecuada a uno, dos o tres de los nucleótidos que codifican el aminoácido que cambia el residuo de aminoácido de cisteína a otro aminoácido adecuado. Ejemplos de aminoácidos adecuados incluyen serina, treonina, alanina, glicina o cualquier aminoácido polar. Un aminoácido particularmente preferido es la serina.

En una realización, la cisteína en la posición 239 en la cadena pesada está sustituida con otro aminoácido y la cisteína en la posición 242 en la cadena pesada está sustituida con otro aminoácido. En esta realización, la sustitución de C239 y C242 elimina ambos residuos de cisteína en la región bisagra de la cadena pesada que normalmente forman enlaces disulfuro entre cadenas pesadas con las cisteínas correspondientes en otra cadena pesada. Las semimoléculas resultantes pueden formar moléculas de anticuerpo completas a través de enlaces no covalentes entre dos cadenas pesadas.

En una realización alternativa, la cisteína en la posición 239 en la cadena pesada está sustituida con otro aminoácido. En esta realización, la cisteína en la posición 242 no está sustituida con otro aminoácido.

En una realización alternativa adicional, la cisteína en la posición 242 en la cadena pesada está sustituida con otro aminoácido. En esta realización, la cisteína en la posición 239 no está sustituida con otro aminoácido.

La sustitución de C239 o C242 deja una cisteína en la cadena pesada que es capaz de formar un enlace disulfuro entre cadenas pesadas con una cisteína en otra cadena pesada. Sin limitarse a la teoría, se cree que la sustitución de una cisteína en la región bisagra, particularmente la sustitución de C239, reduce la formación de un enlace disulfuro en la cadena en la región bisagra y, por lo tanto, puede reducir la formación de moléculas de semi-anticuerpo.

En una realización de la presente invención, la prolina en la posición 240 puede estar sustituida con otro aminoácido.

En una realización de la presente invención, la serina en la posición 241 puede estar sustituida con otro aminoácido.

En una realización de la presente invención, en donde la serina en la posición 227 está sustituida con una cisteína, el anticuerpo preferiblemente no comprende mutaciones en las posiciones C239 y C242. En otra realización, en donde la serina en la posición 227 está sustituida con una cisteína, la cisteína en la posición 239 en la cadena pesada está sustituida preferiblemente con otro aminoácido pero la cisteína en la posición 242 no está sustituida con otro aminoácido.

En una realización, los anticuerpos de la presente invención comprenden una cadena pesada de IgG4 que está mutada para insertar uno o más aminoácidos entre los aminoácidos 226-243. El número de aminoácidos insertados puede ser 1 a 10, 1 a 5, 1 a 3, preferiblemente se insertan 1,2, 3 o 4 aminoácidos. Los aminoácidos se insertan preferiblemente entre los aminoácidos 238 y 239. Se puede insertar cualquier aminoácido adecuado en la región bisagra, tal como alaninas, glicinas, serinas o treoninas y combinaciones de las mismas. Preferiblemente, se insertan tres alaninas (AAA), tres glicinas (GGG), tres serinas (SSS) o tres treoninas (TTT) o una treonina, histidina y otra treonina (THT). Se cree que los anticuerpos de la presente invención que comprenden una cadena pesada de IgG4 que ha sido mutada para insertar tres aminoácidos en la región bisagra muestran una estabilidad mejorada, por ejemplo, termoestabilidad.

Una mutación adicional que puede introducirse en los anticuerpos según la presente invención es la mutación S241P. Se ha demostrado previamente que esta mutación reduce la formación de semimoléculas a concentraciones biológicamente relevantes (Angal, S. et al., 1993. A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human (IgG4) antibody. Mol Immunol 30, 105-108) Se ha encontrado sorprendentemente que los anticuerpos mutantes de la presente invención que comprenden la mutación S241P demuestran algún intercambio de cadena pesada in vitro bajo condiciones reductoras fuertes en comparación con IgG4 P (IgG4 con S241P). Esto permite la creación de anticuerpos biespecíficos in vitro a partir de anticuerpos mutantes IgG4 de la presente invención.

Los anticuerpos según la presente invención pueden comprender una o más mutaciones adicionales en la región bisagra. Por ejemplo, los anticuerpos pueden comprender además una o más de las siguientes mutaciones S227P, Y229S, P237Dy P238K.

En una realización, el anticuerpo según la presente invención comprende efectivamente una región bisagra IgG1 del residuo 226 a 243 (bisagra superior y bisagra central). Por consiguiente, el anticuerpo de la presente invención comprende una región bisagra en donde la glicina en la posición 230 está sustituida con cisteína, la serina en la posición 227 está sustituida con prolina, la tirosina en la posición 229 está sustituida con serina, la prolina en la posición 237 está sustituida con ácido aspártico, la prolina en la posición 238 se sustituye con lisina, la secuencia de aminoácidos treonina-histidina-treonina se inserta entre las posiciones 238 y 239 y la serina en la posición 241 se sustituye con prolina. Estas mutaciones también se pueden escribir como S227P, y 229S, G230C, P237D, P238KTHT y S241P, como se muestra en la Figura 2a.

El anticuerpo según la presente invención preferiblemente tiene una bisagra inferior de IgG4 del residuo 244 a 251 (APEFLGGP SEQ ID NO: 321). Sin estar limitado por la teoría, se cree que la región bisagra inferior de IgG4 contribuye a la falta de función efectora de un anticuerpo IgG4.

En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo mixto asimétrico que comprende dos cadenas pesadas que comprenden cada una, una región variable, un dominio C^h1 y una bisagra (tal como dos cadenas pesadas independientemente), cada cadena pesada comprende independientemente una secuencia seleccionada de una de las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 37.

En una realización, el anticuerpo mixto asimétrico de la presente invención comprende dos cadenas pesadas que comprenden cada una una región variable, un dominio C^H1 y una bisagra (tal como dos cadenas pesadas independientemente), cada cadena pesada comprende independientemente una secuencia seleccionada de una de las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 37. Más específicamente, el anticuerpo mixto asimétrico de la presente invención comprende dos cadenas pesadas que comprenden cada una, una región variable, un dominio C^h1 y una bisagra (tal como dos cadenas pesadas independientemente), cada cadena pesada comprende independientemente una secuencia seleccionada de una de las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 37.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un anticuerpo mixto asimétrico con dos cadenas pesadas, cada una de las cuales comprende un dominio variable, un dominio C^H1 y una bisagra, un dominio C^H2 y un dominio C^H3 (tal como dos cadenas pesadas independientemente), cada una de las cuales comprende una secuencia seleccionada independientemente de una de las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62 y SEQ ID NO : 63.

En una realización, el anticuerpo mixto asimétrico de la presente invención comprende dos cadenas pesadas que comprenden cada una, una región variable, un dominio C^h1 y una región bisagra, en donde cada cadena pesada comprende independientemente la SEC ID NO: 36 (anticuerpo 28P), la SEC ID NO: 37 (anticuerpo 44P) o la SEQ ID NO: 35 (anticuerpo 48).

En una realización, un anticuerpo mixto asimétrico de la presente invención comprende dos cadenas pesadas que comprenden cada una, una región variable, un dominio C^h1, una región bisagra, ua dominio C^h2 y un dominio C^h3 en donde cada cadena pesada comprende independientemente la SEQ ID NO: 62 (anticuerpo 28P), la SEC ID N.°: 63 (anticuerpo 44P) o la SEQ ID NO: 61 (anticuerpo 48).

En cualquiera de las realizaciones anteriores, la segunda cadena pesada del anticuerpo puede seleccionarse de cualquier secuencia de cadena pesada descrita en la presente memoria.

La Tabla 1 a continuación enumera ejemplos de anticuerpos con mutaciones que se han introducido en comparación con la secuencia de tipo salvaje IgG4. La Tabla 1 también incluye anticuerpos IgG1 e IgG4 de tipo salvaje y anticuerpos de control.

Tabla 1:

En una realización, una primera secuencia de cadena pesada de IgG4 se combina con una segunda secuencia de cadena pesada de IgG4 que comprende cada una C^h1 y mutaciones de la bisagra superior y secuencias de la bisagra central como se describe en la Tabla 2:

Tabla 2

Por consiguiente, la presente descripción proporciona un anticuerpo mixto asimétrico que comprende dos cadenas pesadas que comprenden cada una al menos una región variable, una región de bisagra y un dominio C^h1 , en donde una primera cadena pesada y una segunda secuencia de cadena pesada son secuencias de cadena pesada de IgG4 seleccionadas de las combinaciones de mutaciones de secuencia de la primera y segunda cadena pesada enumeradas en la Tabla 2.

El anticuerpo mixto asimétrico puede comprender una primera y segunda cadena pesada, en donde cada secuencia constante de la cadena pesada comprende mutaciones en el dominio C^H1 y la región bisagra como se describe anteriormente, y en donde las mutaciones al dominio C^h1 y la región de bisagra en cada cadena pesada son diferentes. Alternativamente, las primeras secuencias constantes de la cadena pesada pueden comprender mutaciones en el dominio C^h1 y la región bisagra como se describe anteriormente y la secuencia constante de la segunda cadena pesada es IgG4 de tipo salvaje o IgG4 de tipo salvaje con mutación S241P.

La presente invención proporciona un anticuerpo biespecífico mixto asimétrico, en donde cada cadena pesada tiene diferentes regiones variables. El anticuerpo también comprende preferiblemente dos cadenas ligeras, en donde cada par de cadena pesada-ligera (Fab) tiene diferentes regiones variables.

"Regiones variables diferentes" como se emplea en la presente memoria pretende referirse a en donde dichas regiones variables tienen especificidad para diferentes antígenos. Es decir que el antígeno al que es específica cada región variable es un antígeno diferente o una parte diferente de un antígeno, por ejemplo, un epítopo diferente.

"Específico", como se emplea en la presente memoria, se refiere al hecho de que los dominios de unión reconocieron un antígeno diana con mayor afinidad y avidez que otros antígenos a los que no es específico (por ejemplo, 10, 20, 50, 10 o 1000). No implica necesariamente que la región de unión específica no se una a ningún antígeno no diana, sino que la interacción con la diana es tal que puede usarse para purificar el antígeno diana (para el cual es específico) de una mezcla compleja de antígenos , incluyendo los antígenos en la misma familia de proteínas.

En una realización, el anticuerpo según la presente descripción está aislado.

Aislado como se usa en la presente memoria pretende referirse a un anticuerpo que está aislado del cuerpo humano, por ejemplo: preparado mediante técnicas recombinantes, purificado utilizando una técnica tal como cromatografía, y/o en una formulación farmacéutica.

El término “anticuerpo” como se usa en la presente memoria incluye anticuerpos intactos (completos) y fragmentos funcionalmente activos que comprenden dos cadenas pesadas que comprenden cada una un dominio V^h, un dominio C^h1 y una región bisagra. En consecuencia, el término "anticuerpo" en la presente invención cubre anticuerpos bi, tri o tetravalente, un dímero de Fab’ y fragmentos F(ab’)2 y moléculas de anticuerpos completos que comprenden dos pares de cadenas ligeras y pesadas.

Como es bien conocido en la técnica, una molécula Fab’ típica comprende un par de cadenas pesadas y ligeras en el que la cadena pesada comprende una región variable V^h, un dominio constante C^h1 y una región de bisagra y la cadena ligera comprende una región variable VL y un dominio constante C^l.

En una realización, la cadena pesada comprende un dominio C^h2 y un dominio C^h3 y opcionalmente un dominio C^h4. En una realización, el anticuerpo comprende dos cadenas pesadas, cada una de las cuales es como se definió anteriormente en el primer o segundo aspecto de la presente invención. Los anticuerpos según la presente invención también comprenden preferiblemente dos cadenas ligeras, que pueden ser iguales o diferentes. En la realización de la presente invención que proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende dos cadenas pesadas, como se definió anteriormente, y dos cadenas ligeras, las dos cadenas ligeras tienen regiones variables diferentes y pueden tener regiones constantes iguales o diferentes.

En una realización, los dominios C^h2 y C^h3 empleados pueden mutar, por ejemplo, para reducir la formación de agregados de anticuerpos IgG4. El US2008/0063635 de Takahashi et al. ha investigado un mutante de IgG4 en el que la arginina en la posición 409 (numerada 409 según el sistema de numeración EU o numerada 440 según el sistema de numeración de Kabat) en el dominio C^h3 se sustituye con lisina, treonina, metionina o leucina para inhibir la formación de agregados a pH bajo. Mutaciones adicionales en L235, D265, D270, K322, P329 y P331 (L235, D265, D270, K322, P329 y P331 numeradas según el sistema de numeración EU o L248, D278, D283, K341, P348 y P350 numeradas según el sistema de numeración de Kabat) también se enseñan para atenuar la actividad de los CDC. El documento WO2008/145142 de Van de Winkel et al. describe anticuerpos IgG4 estables que tienen una capacidad reducida para experimentar "intercambio de brazo Fab" (denominado en la presente memoria intercambio dinámico de cadena pesada) mediante la sustitución del residuo de arginina en la posición 409, el residuo de Phe en la posición 405 o la Lys en la posición 370 (R409, F405 y K370 numerados según el sistema de numeración EU o R440, F436 y K393 numerados según el sistema de numeración de Kabat) incluso en ausencia de la mutación S228P (S228 numerada según el sistema de numeración EU o S241 según el sistema de numeración de Kabat) en la región bisagra.

En una realización, el anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo mixto asimétrico completo que comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, en donde cada cadena pesada comprende un C^h1 de IgG4 en donde la cisteína en la posición 127, numerada según el sistema de numeración de Kabat se sustituye con otro aminoácido, una región de bisagra superior e intermedia IgG1, una región de bisagra inferior IgG4, un dominio C^h2 y un dominio C^h3.

La región de bisagra completa de un anticuerpo IgG4 típicamente consiste en los residuos 226 a 251 (numeración basada en el sistema de numeración de Kabat). Sin embargo, la región de bisagra se puede acortar o alargar según sea necesario. Por ejemplo, los anticuerpos según el primer aspecto de la presente invención, el aminoácido de tipo salvaje se sustituye con un residuo de cisteína en la posición 227, 228, 229 o 230, la región bisagra puede terminar después del nuevo residuo de cisteína en la posición 227, 228, 229 o 230. Los anticuerpos según la presente invención también pueden comprender uno o más aminoácidos situados en el extremo N-terminal y/o C-terminal de la región bisagra. Además, se pueden controlar otras características de la bisagra, tales como la distancia de la(s) cisteína(s) de la bisagra de la cadena ligera de la cisteína entre cadenas, distancia entre las cisteínas de la bisagra y la composición de otros aminoácidos en la bisagra que pueden afectar las propiedades de la bisagra, como la flexibilidad, por ejemplo, las glicinas pueden incorporarse en la bisagra para aumentar la flexibilidad de rotación o prolina para reducir la flexibilidad. Alternativamente, se pueden incorporar combinaciones de residuos cargados o hidrófobos en la bisagra para conferir propiedades de multimerización o purificación. Otras regiones bisagra modificadas pueden ser completamente sintéticas y pueden diseñarse para poseer propiedades deseadas tales como longitud, composición y flexibilidad.

Cada cadena pesada comprende preferiblemente un dominio C^h2 de IgG4 y un dominio C^h3, como se muestra en la SEQ ID NO: 64.

Se apreciará que también se pueden usar variantes de secuencia de los dominios de la región constante de Fc.

En una realización, cada cadena pesada comprende los dominios C^h2 y C^h3 de IgG4 en donde la arginina en la posición 409 (numeración EU) se sustituye con lisina, treonina, metionina o leucina para inhibir la formación de agregados a pH bajo (documento US2008/0063635 de Takahashi et al.) También se enseñan mutaciones en L235, D265, D270, K322, P331 y P329 (numeradas según el sistema de numeración EU) para atenuar la actividad de los CDC (documento US2008/0063635 de Takahashi et al.).

Cada cadena pesada puede comprender las mutaciones como se enseña en el documento WO2008/145142 de Van de Winkel y col. que describe anticuerpos IgG4 estables que tienen una capacidad reducida para experimentar el intercambio de brazo Fab mediante la sustitución del residuo de arginina en la posición 409, el residuo de Phe en la posición 405 o la Lys en la posición 370 (numerados según el sistema de numeración EU).

En una realización, cada cadena pesada comprende un dominio C^h2 de IgG4 y un dominio C^h3 de IgG1, como se muestra en la SEQ ID NO: 65.

En una realización, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo monoclonal, completamente humano, humanizado o quimérico. En una realización, el anticuerpo es completamente humano o humanizado.

Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar mediante cualquier método conocido en la técnica, como la técnica de hibridoma (Kohler y Milstein, Nature, 1975, 256, 495-497), la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de células B humanas (Kozbor et al., Immunology Today, 1983, 4, 72) y la técnica EBV-hibridoma (Cole et al., "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", págs. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985).

Los anticuerpos para uso en la invención también pueden generarse usando métodos de anticuerpos de linfocitos individuales clonando y expresando ADNc de región variable de inmunoglobulina generados a partir de linfocitos individuales seleccionados para la producción de anticuerpos específicos mediante, por ejemplo, los métodos descritos por Babcook, J. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 1996, 93 (15), 7843-7848, documentos WO92/02551, WO2004/051268 y WO2004/106377.

Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpos de especies no humanas que tienen una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de las especies no humanas y una región armazón de una molécula de inmunoglobulina humana que opcionalmente comprende uno o más residuos de donantes de la especie no humana ( véase, por ejemplo, el documento US 5,585,089).

Los anticuerpos para uso en la presente invención también pueden generarse usando diversos métodos de presentación de fagos conocidos en la técnica e incluyen los descritos por Brinkman et al., J. Immunol. Methods, 1995, 182, 41-50; Ames et al., J. Immunol. Methods, 1995, 184, 177-186; Kettleborough et al. Eur. J. Immunol., 1994, 24, 952-958; Persic et al., Gene, 1997187, 9-18; y Burton et al., Advances in Immunology, 1994, 57, 191 -280; documentos WO90/02809; WO91/10737; WO92/01047; WO92/18619; WO93/11236; WO95/15982; y WO95/20401; y documentos US5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743; y 5,969,108. Además, pueden usarse ratones transgénicos u otros organismos, incluidos otros mamíferos, para generar anticuerpos humanizados.

Los anticuerpos completamente humanos son aquellos en los que las regiones variables y las regiones constantes (donde están presentes) de las cadenas pesada y ligera son todas de origen humano, o sustancialmente idénticas a las secuencias de origen humano, no necesariamente del mismo anticuerpo. Ejemplos de anticuerpos completamente humanos pueden incluir anticuerpos producidos, por ejemplo, mediante los métodos de presentación de fagos descritos anteriormente y anticuerpos producidos por ratones en los que los genes de la región variable y/o constante de inmunoglobulina murina han sido reemplazados por sus contrapartes humanas, por ejemplo, como se describe en términos generales en los documentos EP0546073B1, US5,545,806, US5,569,825, Us 5,625,126, US5,633,425, US5,661,016, US5,770,429, EP0438474B1 y EP0463151B1.

El material de partida de anticuerpos para uso en la presente invención puede prepararse mediante el uso de técnicas de ADN recombinante que implican la manipulación y la reexpresión de ADN que codifica la(s) región(es) variable(s) y constante(s) del anticuerpo. Se pueden usar técnicas estándar de biología molecular para modificar, añadir o eliminar aminoácidos o dominios según se desee. Cualquier alteración en las regiones variables o constantes todavía está abarcada por los términos regiones “variables” y “constantes” como se usa en la presente memoria.

El material de partida del anticuerpo se puede obtener de cualquier especie que incluye, por ejemplo, ratón, rata, conejo, hámster, camello, llama, cabra o humano. Se pueden obtener partes del anticuerpo de más de una especie, por ejemplo, el anticuerpo puede ser quimérico. En un ejemplo, las regiones constantes son de una especie y las regiones variables de otra. El material de partida del anticuerpo también puede modificarse. En otro ejemplo, la región variable del anticuerpo se ha creado utilizando técnicas de ingeniería de ADN recombinante. Dichas versiones diseñadas incluyen aquellas creadas, por ejemplo, a partir de regiones variables de anticuerpos naturales mediante inserciones, deleciones o cambios en las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos naturales. Los ejemplos particulares de este tipo incluyen aquellos dominios de región variable diseñados que contienen al menos una CDR y, opcionalmente, uno o más aminoácidos armazón de un anticuerpo y el resto del dominio de región variable de un segundo anticuerpo. Los métodos para crear y fabricar estos anticuerpos son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Boss et al., documento US4,816,397; Cabilly et al., documento US6,331,415; Shrader et al., documento WO92/02551; Ward et al., 1989, Nature, 341, 544; Orlandi et al., 1989, Proc.Natl.Acad.Sci. EE. UU., 86, 3833; Riechmann et al., 1988, Nature, 322, 323; Bird et al, 1988, Science, 242, 423; Queen et al., US 5,585,089; Adair, documento WO91/09967; Mountain and Adair, 1992, Biotechnol. Genet. Eng. Rev, 10, 1-142; Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181).

En una realización, el anticuerpo comprende un par de dominio variable que forma un dominio de unión que es un par afín. El par afín como se emplea en la presente memoria pretende referirse a un par natural de dominios variables, es decir, aislado de un único anticuerpo o célula que expresa anticuerpos.

Los dominios variables pueden haber sido optimizados y/o humanizados.

Los dominios variables optimizados/humanizados derivados de un par afín aún se considerarán un par afín después de la optimización/humanización.

Así, la invención se extiende a moléculas humanas, humanizadas o quiméricas.

En una realización, la molécula se une específicamente a un antígeno diana. Específicamente se une como se emplea en la presente memoria pretende referirse a moléculas que tienen una alta afinidad por un antígeno diana (para el cual es específico) y que se une a antígenos para los que no es específico con una afinidad baja o mucho menor (o nada en absoluto).

Las moléculas de anticuerpo de la presente invención tienen adecuadamente una alta afinidad de unión, en particular, nanomolar o picomolar. La afinidad se puede medir utilizando cualquier método adecuado conocido en la técnica, que incluye BIAcore™. En una realización, la molécula de la presente invención tiene una afinidad de unión de aproximadamente 100 pM o mejor. En una realización, la molécula de la presente invención tiene una afinidad de unión de aproximadamente 50 pM o mejor. En una realización, la molécula de la presente invención tiene una afinidad de unión de aproximadamente 40 pM o mejor. En una realización, la molécula de la presente invención tiene una afinidad de unión de aproximadamente 30 pM o mejor. En una realización, la molécula de la presente invención es completamente humana o humanizada y tiene una afinidad de unión de aproximadamente 100 pM o mejor.

Un derivado de un dominio de origen natural como se emplea en la presente memoria pretende referirse a donde uno, dos, tres, cuatro o cinco aminoácidos en una secuencia de origen natural se han reemplazado o eliminado, por ejemplo para optimizar las propiedades del dominio, como por ejemplo eliminando propiedades indeseables pero en donde se conservan la(s) característica(s) de caracterización del dominio.

En una realización, las moléculas de anticuerpo de la presente invención comprenden uno o más péptidos de unión a albúmina. El péptido se une a la albúmina in vivo, lo que aumenta la vida media de la molécula.

El péptido de unión a la albúmina puede agregarse desde una o más regiones variables, una bisagra o C-terminal de la molécula o cualquier ubicación que no interfiera con las propiedades de unión al antígeno de las moléculas.

Se proporcionan ejemplos de péptidos de unión a albúmina en el documento WO2007/106120.

Un experto en la técnica también entenderá que el anticuerpo puede sufrir una variedad de modificaciones postraduccionales. El tipo y el alcance de estas modificaciones a menudo dependen de la línea celular huésped utilizada para expresar la molécula, así como las condiciones de cultivo. Dichas modificaciones pueden incluir variaciones en la glicosilación, oxidación de metionina, formación de dicetopiperazina, isomerización de aspartato y desamidación de asparagina. Una modificación frecuente es la pérdida de un residuo básico carboxi-terminal (tal como lisina o arginina) debido a la acción de las carboxipeptidasas (como se describe en Harris, RJ. Journal of Chromatography 705: 129-134, 1995).

Si se desea, una molécula para uso en la presente invención puede conjugarse con una o más molécula(s) efectora(s). Se apreciará que la molécula efectora puede comprender una molécula efectora única o dos o más de tales moléculas unidas de manera que formen un resto único que puede unirse a la molécula de anticuerpo de la presente invención. Cuando se desee obtener un anticuerpo según la invención unido a una molécula efectora, esto puede prepararse mediante procedimientos de ADN químico o recombinante estándar en los que el anticuerpo se une directamente o mediante un agente de acoplamiento a la molécula efectora. Las técnicas para conjugar tales moléculas efectoras con un anticuerpo son bien conocidas en la técnica (véase, Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2a Ed., Robinson et al., eds., 1987, pp. 623-53; Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev., 62: 119-58 y Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123). Los procedimientos químicos particulares incluyen, por ejemplo, los descritos en los documentos WO93/06231, WO92/22583, WO89/00195, WO89/01476 y WO03/031581. Alternativamente, cuando la molécula efectora es una proteína o polipéptido, el enlace se puede lograr usando procedimientos de ADN recombinante, por ejemplo, como se describe en los documentos WO86/01533 y EP0392745.

El término molécula efectora como se usa en la presente memoria incluye, por ejemplo, agentes antineoplásicos, fármacos, toxinas, proteínas biológicamente activas, por ejemplo enzimas, otros anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, polímeros sintéticos o de origen natural, ácidos nucleicos y fragmentos de los mismos, por ejemplo ADN, ARN y fragmentos de los mismos, radionúclidos, particularmente radioyoduro, radioisótopos, metales quelados, nanopartículas y grupos indicadores tales como compuestos fluorescentes o compuestos que pueden detectarse mediante espectroscopía RMN o ESR.

Ejemplos de moléculas efectoras pueden incluir citotoxinas o agentes citotóxicos que incluyen cualquier agente que sea perjudicial (por ejemplo mata) para las células. Los ejemplos incluyen combrestatinas, dolastatinas, epotilonas, estaurosporina, maitansinoides, espongistatinas, rizoxina, halicondrinas, roridinas, hemiasterlinas, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposida, tenoposida, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina y análogos u homólogos de los mismos.

Las moléculas efectoras también incluyen, pero no se limitan a, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo mecloretamina, tioepa, clorambucilo, melfalan, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfano, dibromomannitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatinino), antraciclinas (por ejemplo, aunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (por ejemplo dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina, antramicina (AMC), calicheamicinas o duocarmicinas) y agentes antimitóticos (por ejemplo vincristina y vinblastina).

Otras moléculas efectoras pueden incluir radionucleidos quelados tales como ^{1 1 1}In e ⁹⁰Y Lu¹⁷⁷, Bismuto²¹³, Californio²⁵², Iridio¹⁹²y Tungsteno¹⁸⁸/Renio¹⁸⁸; o fármacos tales como, pero sin limitarse a, alquilfosfocolinas, inhibidores de topoisomerasa I, taxoides y suramina.

Otras moléculas efectoras incluyen proteínas, péptidos y enzimas. Las enzimas de interés incluyen, pero no se limitan a, enzimas proteolíticas, hidrolasas, liasas, isomerasas, transferasas. Las proteínas, polipéptidos y péptidos de interés incluyen, pero no se limitan a, inmunoglobulinas, toxinas tales como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas o toxina de difteria, una proteína tal como insulina, factor de necrosis tumoral, a-interferón, p-interferón, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas o activador de plasminógeno tisular, un agente trombótico o un agente antiangiogénico, por ejemplo angiostatina o endostatina, o un modificador de la respuesta biológica tal como una linfocina, interleucina-1 (IL-1), interleucina-2 (IL-2), factor estimulante de colonias de macrófagos de granulocitos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G -CSF), factor de crecimiento nervioso (NGF) u otro factor de crecimiento e inmunoglobulinas.

Otras moléculas efectoras pueden incluir sustancias detectables útiles, por ejemplo, en el diagnóstico. Ejemplos de sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, nucleidos radiactivos, metales emisores de positrones (para uso en tomografía por emisión de positrones) e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos. Véase generalmente el documento US4,741,900 para iones metálicos que pueden conjugarse con anticuerpos para uso como diagnóstico. Las enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina, avidina y biotina; materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo y ficoeritrina; materiales luminiscentes adecuados incluyen luminol; materiales bioluminiscentes adecuados incluyen luciferasa, luciferina y aequorina; y los nucleidos radiactivos adecuados incluyen ¹²⁵1^{13 1}1^{1 1 1}In y ⁹⁹Tc

En otro ejemplo, la molécula efectora puede aumentar la vida media del anticuerpo in vivo, y/o reducir la inmunogenicidad del anticuerpo y/o mejorar la administración de un anticuerpo a través de una barrera epitelial al sistema inmune. Ejemplos de moléculas efectoras adecuadas de este tipo incluyen polímeros, albúmina, proteínas de unión a albúmina o compuestos de unión a albúmina tales como los descritos en el documento WO05/117984.

Cuando la molécula efectora es un polímero, en general puede ser un polímero sintético o de origen natural, por ejemplo, un polialquileno, polialquenileno o polioxialquileno de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido o un polisacárido ramificado o no ramificado, por ejemplo un homo- o hetero- polisacárido.

Los sustituyentes opcionales específicos que pueden estar presentes en los polímeros sintéticos mencionados anteriormente incluyen uno o más grupos hidroxi, metilo o metoxi.

Ejemplos específicos de polímeros sintéticos incluyen poli(etilenglicol) de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido, poli(propilenglicol) poli(alcohol vinílico) o derivados del mismo, especialmente poli(etilenglicol) opcionalmente sustituido, como metoxipoliol(etilenglicol) o derivados del mismo.

Los polímeros de origen natural específicos incluyen lactosa, amilosa, dextrano, glucógeno o derivados de los mismos.

"Derivados", como se usa en la presente memoria, pretende incluir derivados reactivos, por ejemplo grupos reactivos selectivos de tiol tales como maleimidas y similares. El grupo reactivo puede estar unido directamente o a través de un segmento conector al polímero. Se apreciará que el residuo de dicho grupo formará en algunos casos parte del producto como el grupo enlazante entre el anticuerpo de la descripción y el polímero.

El tamaño del polímero puede variar según se desee, pero generalmente estará en un intervalo de peso molecular promedio de 500Da a 50000Da, por ejemplo de 5000 a 40000Da, tal como de 20000 a 40000Da. El tamaño del polímero puede seleccionarse en particular sobre la base del uso previsto del producto, por ejemplo, la capacidad de localizar ciertos tejidos como tumores o extender la vida media circulante (para una revisión, véase Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545). Así, por ejemplo, cuando el producto está destinado a salir de la circulación y penetrar en el tejido, por ejemplo para uso en el tratamiento de un tumor, puede ser ventajoso usar un polímero de peso molecular pequeño, por ejemplo, con un peso molecular de alrededor de 5000Da. Para aplicaciones donde el producto permanece en la circulación, puede ser ventajoso usar un polímero de mayor peso molecular, por ejemplo que tenga un peso molecular en el intervalo de 20000Da a 40000Da.

Los polímeros adecuados incluyen un polímero de polialquileno, tal como un poli(etilenglicol) o, especialmente, un metoxipoliol(etilenglicol) o un derivado del mismo, y especialmente con un peso molecular en el intervalo de aproximadamente 15000Da a aproximadamente 40000Da.

En un ejemplo, un anticuerpo para uso en la presente invención está unido a restos de poli(etilenglicol) (PEG). En un ejemplo particular, las moléculas de PEG se pueden unir a través de cualquier grupo funcional de aminoácidos de cadena lateral o terminal de aminoácidos disponible ubicado en el anticuerpo, por ejemplo, cualquier grupo amino, imino, tiol, hidroxilo o carboxilo libre. Dichos aminoácidos pueden aparecer naturalmente en el anticuerpo o pueden manipularse en el anticuerpo utilizando métodos de ADN recombinante (véanse, por ejemplo, los documentos US5,219,996; US5,667,425; WO98/25971) En un ejemplo, la molécula de la presente invención es un anticuerpo modificado en donde la modificación es la adición (al extremo C-terminal de su cadena pesada) de uno o más aminoácidos para permitir la unión de una molécula efectora. Se pueden usar múltiples sitios para unir dos o más moléculas de PEG.

En una realización, una molécula de PEG está unida a una cisteína 171 en la cadena ligera, por ejemplo, véase el documento WO2008/038024.

Adecuadamente, las moléculas de PEG están unidas covalentemente a través de un grupo tiol de al menos un residuo de cisteína ubicado en el anticuerpo. Cada molécula de polímero unida al anticuerpo modificado puede estar unida covalentemente al átomo de azufre de un residuo de cisteína ubicado en el anticuerpo. El enlace covalente generalmente será un enlace disulfuro o, en particular, un enlace azufre-carbono. Cuando se usa un grupo tiol como el punto de unión de moléculas efectoras activadas apropiadamente, por ejemplo, se pueden usar derivados selectivos de tiol tales como maleimidas y derivados de cisteína. Se puede usar un polímero activado como material de partida en la preparación de anticuerpo modificado con polímero como se describe anteriormente. El polímero activado puede ser cualquier polímero que contenga un grupo reactivo tiol tal como un ácido o éster a-halocarboxílico, por ejemplo, yodoacetamida, una imida, por ejemplo, maleimida, una vinilsulfona o un disulfuro. Dichos materiales de partida pueden obtenerse comercialmente (por ejemplo, de Nektar, anteriormente Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, EE. UU.) o pueden prepararse a partir de materiales de partida disponibles comercialmente usando procedimientos químicos convencionales. Las moléculas de PEG particulares incluyen 20K metoxi-PEG-amina (obtenible de Nektar, anteriormente Shearwater; Rapp Polymere; y SunBio) y M-PEG-SPA (obtenible de Nektar, anteriormente Shearwater).

La presente descripción también proporciona ADN aislado que codifica una molécula de anticuerpo descrita en la presente memoria.

En otro aspecto, se proporciona un vector que comprende dicho ADN.

Los métodos generales mediante los cuales se pueden construir los vectores, los métodos de transfección y los métodos de cultivo son bien conocidos por los expertos en la técnica. A este respecto, se hace referencia a "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, Nueva York y Maniatis Manual producido por Cold Spring Harbor Publishing.

En un aspecto adicional, se proporciona una célula huésped que comprende dicho vector y/o ADN.

Se puede usar cualquier sistema de célula huésped/vector adecuado para la expresión de las secuencias de ADN que codifican la molécula de la presente invención. Bacteriana, por ejemplo E. coli, y pueden usarse otros sistemas microbianos o eucariotas, por ejemplo, también pueden usarse sistemas de expresión en células huésped de mamíferos. Las células huésped de mamífero adecuadas incluyen células CHO, mieloma o hibridoma.

La presente invención también proporciona un proceso para la producción de una molécula de anticuerpo como se describe en la presente memoria que comprende cultivar una célula huésped que contiene un vector (y/o ADN) de la presente invención en condiciones adecuadas para conducir a la expresión de proteína a partir de ADN que codifica una molécula de anticuerpo de la presente invención, y aislar una molécula de anticuerpo.

Para la producción de productos que comprenden cadenas pesadas y ligeras, la línea celular puede transfectarse con dos vectores, un primer vector que codifica un polipéptido de cadena ligera y un segundo vector que codifica un polipéptido de cadena pesada. Alternativamente, se puede usar un solo vector, el vector que incluye secuencias que codifican polipéptidos de cadena ligera y cadena pesada.

Las moléculas de anticuerpo según la presente descripción se expresan a niveles adecuados de células huésped que las hacen propicias para el procesamiento comercial.

El anticuerpo puede ser específico para cualquier antígeno diana. El antígeno puede ser una proteína asociada a la célula, por ejemplo, una proteína de la superficie celular en células tales como células bacterianas, células de levadura, células T, células endoteliales o células tumorales, o puede ser una proteína soluble. Los antígenos de interés también pueden ser cualquier proteína médicamente relevante, tal como las proteínas reguladas durante la enfermedad o infección, por ejemplo, los receptores y/o sus ligandos correspondientes. Los ejemplos particulares de proteínas de la superficie celular incluyen moléculas de adhesión, por ejemplo, integrinas tales como las integrinas p1, por ejemplo, VLA-4, E-selectina, P-selectina o L-selectina, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD11a, CD11b, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD40L, CD45, CDW52, CD69, CD134 (OX40), ICOS, BCMP7, CD137, CD27L, CDCP1, CSF1 o receptor de CSF1, DPCR1, DPCR1, dudulina2, FLJ20584, FLJ40787, HEK2, KIAA0634, KIAA0659, KIAA1246, KIAA1455, LTBP2, LTK, MAL2, MRP2, nectina tipo 2, NKCC1, PTK7, RAIG1, TCAM1, SC6, BCMP101, BCMP84, BCMP11, DTD,, antígeno carcinoembrionario (CEA), globulina grasa de leche humana (HMFG1 y 2), antígenos MHC clase I y Mh C clase II, KDR y VEGF, PD-1, DC-SIGN, TL1A, DR3, receptor A de IL-7 y, en su caso, receptores de los mismos.

Los antígenos solubles incluyen interleucinas tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-14, IL-16 o IL-17, como IL17A y/o IL17F, antígenos virales, por ejemplo, virus sincitial respiratorio o antígenos de citomegalovirus, inmunoglobulinas, tal como IgE, interferones tales como interferón a, interferón p o interferón y, factor de necrosis tumoral TNF (anteriormente conocido como factor a de necrosis tumoral (denominado TNF o TNFa), factor p de necrosis tumoral, factores estimulantes de colonias tales como G-CSF o GM-CSF y factores de crecimiento derivados de plaquetas tales como PDGF-a y PDGF-p, WISP-1 y, en su caso, receptores de los mismos. Otros antígenos incluyen antígenos bacterianos de la superficie celular, toxinas bacterianas, virus como influenza, EBV, HepA, B y C, agentes de bioterrorismo, radionucleidos y metales pesados, y venenos y toxinas de serpientes y arañas.

En una realización, el anticuerpo puede usarse para alterar funcionalmente la actividad del antígeno de interés. Por ejemplo, el anticuerpo puede neutralizar, antagonizar o agonizar la actividad de dicho antígeno, directa o indirectamente.

En una realización, la presente descripción se extiende a un método para generar un anticuerpo mixto asimétrico según la presente descripción que comprende las etapas de tomar un anticuerpo simétrico (es decir, uno donde ambas cadenas pesadas son iguales/idénticas) que comprende una primera secuencia de cadena pesada o un fragmento de la misma como se define en la presente memoria y mezclar dicho anticuerpo in vitro con un segundo anticuerpo simétrico que comprende una segunda secuencia de cadena pesada o un fragmento de la misma que es diferente a dicha primera secuencia de cadena pesada, en condiciones propicias para el intercambio de cadena pesada entre los dos anticuerpos, y opcionalmente aislamiento del anticuerpo mixto asimétrico.

Las condiciones in vitro propicias para el intercambio dinámico incluyen condiciones reductoras. Los agentes reductores adecuados incluyen GSH, 2-mercaptoetanol, 2-mercaptoetilamina, TBP, TCEP, cisteína-HCl y DTT.

Las concentraciones adecuadas de los agentes reductores están en el intervalo de 0,01 a 10 mM tal como 0,5 a 5 mM. Además, la reducción puede lograrse utilizando tampones redox, es decir, diferentes relaciones relativas de variantes oxidadas y reducidas de reactivos como, tales como, por ejemplo: GSH: GSSG y Cys: diCys

Las condiciones adecuadas incluyen relaciones de anticuerpos en el intervalo de 0,5: 5 a 5:05, como 1:1 o 1:2.

Las temperaturas adecuadas incluyen 15 a 40 °C, como 37 °C.

Las condiciones reductoras pueden seleccionarse para estar entre las estabilidades reductoras de los homodímeros y los heterodímeros.

En una realización alternativa, los anticuerpos de la descripción se preparan empleando un cultivo celular mixto, por ejemplo, se produce un intercambio de ~50%. Esto puede producir en la región de 1-2 g/l del biespecífico deseado.

También se proporciona un anticuerpo asimétrico obtenido u obtenible a partir de un método descrito en la presente memoria y una formulación que comprende el mismo, en particular para uso en el tratamiento.

Las moléculas de anticuerpo de la presente invención son útiles en el tratamiento y/o profilaxis de una afección patológica.

Por lo tanto, se proporciona un anticuerpo según la presente invención para uso en el tratamiento, administrando una cantidad terapéuticamente efectiva del mismo, por ejemplo en una formulación farmacéutica. En una realización, el anticuerpo según la invención se administra tópicamente a los pulmones, por ejemplo por inhalación.

Los anticuerpos proporcionados por la presente invención son útiles en el tratamiento de enfermedades o trastornos que incluyen enfermedades y trastornos inflamatorios, enfermedades y trastornos inmunes, trastornos fibróticos y cánceres.

El término "enfermedad inflamatoria" o "trastorno" y "enfermedad o trastorno inmunitario" incluye artritis reumatoide, artritis psoriásica, enfermedad de Still, enfermedad de Muckle Wells, psoriasis, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, LES (lupus eritematoso sistémico), asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, esclerosis múltiple, vasculitis, diabetes mellitus tipo I, trasplante y enfermedad de injerto contra huésped.

El término "trastorno fibrótico" incluye fibrosis pulmonar idiopática (FPI), esclerosis sistémica (o esclerodermia), fibrosis renal, nefropatía diabética, nefropatía por IgA, hipertensión, enfermedad renal en etapa terminal, fibrosis peritoneal (diálisis peritoneal ambulatoria continua), cirrosis hepática, degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), retinopatía, fibrosis reactiva cardíaca, cicatrización, queloides, quemaduras, úlceras cutáneas, angioplastia, cirugía de derivación coronaria, artroplastia y cirugía de cataratas.

El término "cáncer" incluye un nuevo crecimiento maligno que surge del epitelio, que se encuentra en la piel o, más comúnmente, en el revestimiento de los órganos del cuerpo, por ejemplo: mama, ovario, próstata, pulmón, riñón, páncreas, estómago, vejiga o intestino. Los cánceres tienden a infiltrarse en el tejido adyacente y propagarse (hacer metástasis) a órganos distantes, por ejemplo: a los huesos, el hígado, los pulmones o el cerebro.

La presente descripción también proporciona una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende un anticuerpo de la presente invención en combinación con uno o más de un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Por consiguiente, se proporciona el uso de un anticuerpo de la invención para la fabricación de un medicamento. La composición generalmente se suministrará como parte de una composición farmacéutica estéril que normalmente incluirá un vehículo farmacéuticamente aceptable. Una composición farmacéutica de la presente invención puede comprender adicionalmente un adyuvante farmacéuticamente aceptable.

La presente invención también proporciona un proceso para la preparación de una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende añadir y mezclar el anticuerpo de la presente invención junto con uno o más de un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

El anticuerpo de la descripción puede ser el único ingrediente activo en la composición farmacéutica o de diagnóstico o puede estar acompañado por otros ingredientes activos que incluyen otros ingredientes de anticuerpos, por ejemplo anti-TNF, anti-IL-1 p, anti-células T, anti-IFNy o anticuerpos anti-LPS, o ingredientes no anticuerpos tales como xantinas. Otros ingredientes activos adecuados incluyen anticuerpos capaces de inducir tolerancia, por ejemplo, anticuerpos anti-CD3 o anti-CD4.

En una realización adicional, el anticuerpo o composición según la descripción se emplea en combinación con un agente farmacéuticamente activo adicional, por ejemplo un corticosteroide (tal como propionato de fluticasona) y/o un agonista beta-2 (tal como salbutamol, salmeterol o formoterol) o inhibidores del crecimiento y la proliferación celular (como la rapamicina, ciclofosfmida, metotrexato) o un inhibidor alternativo de CD28 y/o CD40. En una realización, el inhibidor es una molécula pequeña. En otra realización, el inhibidor es un anticuerpo específico para la diana.

Las composiciones farmacéuticas comprenden adecuadamente una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo de la invención. El término "cantidad terapéuticamente efectiva" como se usa en la presente memoria se refiere a una cantidad de un agente terapéutico necesario para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o afección dirigida, o para exhibir un efecto terapéutico o preventivo detectable. La cantidad terapéuticamente efectiva puede estimarse inicialmente en ensayos de cultivo celular o en modelos animales, generalmente en roedores, conejos, perros, cerdos o primates. El modelo animal también puede usarse para determinar el intervalo de concentración apropiado y la ruta de administración. Dicha información puede usarse después para determinar dosis y rutas útiles para la administración en seres humanos.

La cantidad terapéuticamente efectiva precisa para un sujeto humano dependerá de la gravedad del estado de la enfermedad, la salud general del sujeto, la edad, el peso y el género del sujeto, la dieta, el tiempo y la frecuencia de administración, la(s) combinación(es) de fármacos, sensibilidades a la reacción y tolerancia/respuesta a la terapia. Esta cantidad puede determinarse mediante experimentación de rutina y está a criterio del clínico. Generalmente, una cantidad terapéuticamente efectiva será de 0,01 mg/kg a 50 mg/kg, por ejemplo, 0,1 mg/kg a 20 mg/kg. Las composiciones farmacéuticas pueden presentarse convenientemente en formas de dosis unitarias que contienen una cantidad predeterminada de un agente activo de la invención por dosis.

Las composiciones pueden administrarse individualmente a un paciente o pueden administrarse en combinación (por ejemplo simultáneamente, secuencialmente o por separado) con otros agentes, fármacos u hormonas.

La dosis a la que se administra un anticuerpo de la presente invención depende de la naturaleza de la afección a tratar, por ejemplo, el alcance de la enfermedad/inflamación presente y de si la molécula se está utilizando profilácticamente o para tratar una afección existente.

La frecuencia de la dosis dependerá de la vida media del anticuerpo y la duración de su efecto. Si el anticuerpo tiene una vida media corta (por ejemplo, 2 a 10 horas), puede ser necesario administrar una o más dosis por día. Alternativamente, si el anticuerpo tiene una vida media larga (por ejemplo, de 2 a 15 días), puede ser necesario administrar una dosis una vez al día, una vez a la semana o incluso una vez cada 1 o 2 meses.

El vehículo farmacéuticamente aceptable no debe inducir por sí mismo la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composición y no debe ser tóxico. Los vehículos adecuados pueden ser macromoléculas grandes, metabolizadas lentamente, tales como proteínas, polipéptidos, liposomas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas virales inactivas.

Se pueden usar sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo sales de ácidos minerales, tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos y sulfatos, o sales de ácidos orgánicos, tales como acetatos, propionatos, malonatos y benzoatos.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables en composiciones terapéuticas pueden contener adicionalmente líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Adicionalmente, sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes o sustancias tamponadoras del pH, pueden estar presentes en tales composiciones. Dichos vehículos permiten que las composiciones farmacéuticas se formulen como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, lechadas y suspensiones, para la ingestión por el paciente.

Las formas adecuadas para la administración incluyen formas adecuadas para la administración parenteral, por ejemplo, por inyección o infusión, por ejemplo, por inyección en bolo o infusión continua. Cuando el producto es para inyección o infusión, puede tomar la forma de una suspensión, disolución o emulsión en un vehículo aceitoso o acuoso y puede contener agentes de formulación, como agentes de suspensión, conservantes, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, la molécula de la descripción puede estar en forma seca, para reconstitución antes de su uso con un líquido estéril apropiado.

Una vez formuladas, las composiciones de la invención pueden administrarse directamente al sujeto. Los sujetos a tratar pueden ser animales. Sin embargo, en una o más realizaciones, las composiciones están adaptadas para la administración a sujetos humanos.

Adecuadamente en formulaciones según la presente descripción, el pH de la formulación final no es similar al valor del punto isoeléctrico del anticuerpo, por ejemplo, si el pH de la formulación es 7, entonces un pI de 8-9 o superior puede ser apropiado Si bien no desea limitarse a la teoría, se cree que esto puede proporcionar una formulación final con una estabilidad mejorada, por ejemplo, el anticuerpo permanece en disolución.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden administrarse por cualquier número de rutas que incluyen, pero no se limitan a, oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutánea (por ejemplo, véase el documento WO98/20734), subcutánea, intraperitoneal, intranasal, enteral, tópica, sublingual, intravaginal o rectal. Las hiposprays también se pueden usar para administrar las composiciones farmacéuticas de la invención. Típicamente, las composiciones terapéuticas pueden prepararse como inyectables, como disoluciones o suspensiones líquidas. También se pueden preparar formas sólidas adecuadas para disolución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección.

El suministro directo de las composiciones generalmente se logrará mediante inyección, subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular, o se administrará al espacio intersticial de un tejido. Las composiciones también se pueden administrar en una lesión. El tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis única o un programa de dosis múltiple.

Se apreciará que el ingrediente activo en la composición será un anticuerpo. Como tal, será susceptible a la degradación en el tracto gastrointestinal. Por lo tanto, si la composición se va a administrar por una ruta que utiliza el tracto gastrointestinal, la composición necesitará contener agentes que protejan al anticuerpo de la degradación pero que liberen el anticuerpo una vez que haya sido absorbido por el tracto gastrointestinal.

Una discusión exhaustiva de los vehículos farmacéuticamente aceptables está disponible en Remington”s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991).

En una realización, la formulación se proporciona como una formulación para administraciones tópicas que incluyen inhalación.

Las preparaciones inhalables adecuadas incluyen polvos inhalables, aerosoles dosificadores que contienen gases propulsores o disoluciones inhalables libres de gases propulsores. Los polvos inhalables según la descripción que contiene la sustancia activa pueden consistir únicamente en las sustancias activas mencionadas anteriormente o en una mezcla de las sustancias activas mencionadas anteriormente con un excipiente fisiológicamente aceptable.

Estos polvos inhalables pueden incluir monosacáridos (por ejemplo, glucosa o arabinosa), disacáridos (por ejemplo, lactosa, sacarosa, maltosa), oligo- y polisacáridos (por ejemplo, dextranos), polialcoholes (por ejemplo, sorbitol, manitol, xilitol), sales (por ejemplo, cloruro de sodio, carbonato de calcio) o mezclas de estos entre sí. Los mono- o disacáridos se usan adecuadamente, el uso de lactosa o glucosa, particularmente pero no exclusivamente en forma de sus hidratos.

Las partículas para la deposición en el pulmón requieren un tamaño de partícula inferior a 10 mieras, como 1-9 mieras, por ejemplo, de 0,1 a 5 pm, en particular de 1 a 5 pm. El tamaño de partícula del ingrediente activo (como el anticuerpo) es de importancia primordial.

Los gases propulsores que pueden usarse para preparar los aerosoles inhalables son conocidos en la técnica. Los gases propulsores adecuados se seleccionan entre hidrocarburos tales como n-propano, n-butano o isobutano y halohidrocarburos tales como derivados clorados y/o fluorados de metano, etano, propano, butano, ciclopropano o ciclobutano. Los gases propulsores mencionados anteriormente pueden usarse solos o en mezclas de los mismos.

Los gases propulsores particularmente adecuados son los derivados de alcanos halogenados seleccionados entre TG 11, TG 12, TG 134a y TG227. De los hidrocarburos halogenados mencionados anteriormente, TG134a (1,1,1,2-tetrafluoroetano) y TG227 (1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano) y las mezclas de los mismos son particularmente adecuados.

Los aerosoles inhalables que contienen gas propulsor también pueden contener otros ingredientes como codisolventes, estabilizadores, agentes tensioactivos (tensioactivos), antioxidantes, lubricantes y medios para ajustar el pH. Todos estos ingredientes son conocidos en la técnica.

Los aerosoles inhalables que contienen gas propulsor según la invención pueden contener hasta 5% en peso de sustancia activa. Los aerosoles según la invención contienen, por ejemplo, 0,002 a 5% en peso, 0,01 a 3% en peso, 0. 015 a 2% en peso, 0,1 a 2% en peso, 0,5 a 2% en peso o 0,5 a 1% en peso del ingrediente activo

Alternativamente, las administraciones tópicas al pulmón también pueden ser mediante la administración de una disolución líquida o formulación de suspensión, por ejemplo empleando un dispositivo como un nebulizador, por ejemplo, un nebulizador conectado a un compresor (por ejemplo, el nebulizador Pari LC-Jet Plus (R) conectado a un compresor Pari Master (R) fabricado por Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Virginia).

El anticuerpo de la invención puede administrarse disperso en un disolvente, por ejemplo, en forma de una disolución o una suspensión. Se puede suspender en una disolución fisiológica apropiada, por ejemplo, solución salina u otro disolvente farmacológicamente aceptable o una disolución tamponada. Las disoluciones tamponadas conocidas en la técnica pueden contener 0,05 mg a 0,15 mg de edetato disódico, 8,0 mg a 9,0 mg de NaCl, 0,15 mg a 0,25 mg de polisorbato, 0,25 mg a 0,30 mg de ácido cítrico anhidro y 0,45 mg a 0,55 mg de citrato de sodio por 1 ml de agua para alcanzar un pH de aproximadamente 4,0 a 5,0. Una suspensión puede emplear, por ejemplo, una molécula liofilizada.

Las suspensiones terapéuticas o formulaciones en disolución también pueden contener uno o más excipientes. Los excipientes son bien conocidos en la técnica e incluyen tampones (por ejemplo, tampón citrato, tampón fosfato, tampón acetato y tampón bicarbonato), aminoácidos, urea, alcoholes, ácido ascórbico, fosfolípidos, proteínas (por ejemplo, albúmina sérica), EDTA, cloruro de sodio, liposomas, manitol, sorbitol y glicerol. Las disoluciones o suspensiones pueden encapsularse en liposomas o microesferas biodegradables. La formulación generalmente se proporcionará en una forma sustancialmente estéril empleando procesos de fabricación estériles.

Esto puede incluir la producción y esterilización por filtración del disolvente/disolución tamponada utilizada para la formulación, la suspensión aséptica de la molécula en la disolución de disolvente tamponada estéril y la dispensación de la formulación en recipientes estériles por métodos familiares para los expertos en la técnica.

La formulación nebulizable según la presente descripción puede proporcionarse, por ejemplo, como unidades de dosis única (por ejemplo, envases de plástico sellados o viales) empaquetados en envoltorios de aluminio. Cada vial contiene una dosis unitaria en un volumen, por ejemplo, 2 ml, de disolvente/disolución tampón.

Se cree que el anticuerpo de la presente descripción es particularmente adecuado para la administración por nebulización.

Que comprende en el contexto de la presente memoria descriptiva pretende incluir el significado.

Donde se pueden combinar realizaciones técnicamente apropiadas de la invención.

"Asimétrico" y "asimétrico mixto" se emplean indistintamente en la presente memoria.

La invención se describirá ahora con referencia a los siguientes ejemplos, que son meramente ilustrativos y de ningún modo deben interpretarse como limitantes del alcance de la presente invención.

Ejemplos

1. Mutagénesis de la cadena pesada de IgG4 y generación de vectores de genes individuales de cadena pesada de IgG4 mutada.

Las mutaciones de aminoácidos se realizaron utilizando el kit Quickchange® Lightening Multi Site Directed Mutagenesis (SDM) o el kit Quickchange® II DSM (obtenido de Stratagene®) (números de catálogo 210516 y 200521 respectivamente) y se realizaron según las instrucciones del fabricante.

Las mutaciones se verificaron por secuenciación de ADN. Se produjeron las cadenas pesadas de IgG4 de los anticuerpos 1 a 47 en la siguiente tabla:

Otros anticuerpos preparados se describen en la tabla anterior.

La cadena pesada del anticuerpo 48 (ID de secuencia NO: 266) se generó por PCR y clonación con enzimas de restricción. El producto de PCR se generó mediante un oligo directo que codifica la secuencia de la región bisagra superior y central de IgG1 y un sitio de restricción BglII y un oligo inverso que codifica la enzima de restricción DraIII. El fragmento de PCR se digirió después con las enzimas mencionadas anteriormente y se ligó al vector de gen único hG4 que contenía la región variable apropiada.

2. Expresión de los anticuerpos IgG4 mutados

Todo el ADN mutante se transfectó en células CHOK1. Las celdas (2x108 células/ml) se resuspendieron en 1 ml de solución salina Earles Balance (Sigma) y se mezclaron con 400 gg de ADN (200 gg de ADN de cadena pesada y 200 gg de ADN de cadena ligera kappa). Se transfirieron alícuotas de 800 gl a cubetas de 0,4 cm (Biorad). Para un cultivo de 500 ml, se electroporaron seis cubetas bajo los siguientes parámetros: 1 ms, 9,6 amperios; 10 ms, 0 amperios; 40 ms, 3,2 amperios. Las células transfectadas se incubaron durante 24 horas, agitando a 140 rpm en un ambiente humidificado al 5% de CO2 a 37 °C y continuó desde el día 2 después de la transfección a 32 °C durante 10-13 días.

El día 4 después de la transfección, se añadieron 1,6 ml de butirato de sodio 1 M al cultivo. Una vez que las células alcanzaron un 40% de viabilidad o hasta el día 13, se recogió el sobrenadante. Los cultivos se centrifugaron durante 45 minutos a 4000 rpm. El sobrenadante se puso a través de un filtro Stericup 0,22 pM (Millipore) para purificarlo.

3. Purificación de anticuerpos IgG4 mutados

Los sobrenadantes (200-500 ml) se purificaron usando una columna HiTrap MabSelect SuRe de proteína A 5 ml (GE Healthcare, Amersham, Reino Unido). Las muestras se prepararon añadiendo 1 /50a del volumen sobrenadante de Tris-HCl 2 M pH 8,5. Las muestras se cargaron en la columna a 1 ml/min. La columna se lavó con PBS a pH 7,4. Para eluir las muestras, se pasó citrato de sodio 0,1 M, pH 3,4 a través de la columna a 1 ml/min y se recogieron fracciones de 0,5 ml. Las fracciones pico se neutralizaron añadiendo 0,125 ml de Tris-HCl 2 M a pH 8,5 a cada una. La detección UV se ajustó a 280 nm.

4. Caracterización de anticuerpos IgG4 mutados purificados.

Análisis SDS PAGE:

El sobrenadante bruto se centrifugó a 1200 rpm durante 5 minutos y se cuantificó en el OCTET. Las muestras de anticuerpos (25-30 ng) se prepararon añadiendo las cantidades apropiadas de anticuerpo, 4x Loading Buffer (Invitrogen) y 2 pl 100mM NEM. Se preparó un volumen total de 20 pl usando dH2O. Las muestras se hirvieron durante 3 minutos a 100 °C y se cargaron en un gel de Tris-Glicina al 4-20% de 15 pocillos de 1,5 mm. Los geles se corrieron a 150 V durante 1,5 horas en un tanque de tampón 1x. Los anticuerpos se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa usando el sistema de transferencia en seco iBlot configurado para transferir durante 8 minutos. La membrana se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente (RT) en PBS-TM en una plataforma de agitación, seguido de incubación con un anticuerpo conjugado IgG Fc HRP de conejo antihumano (Jackson Immunoresearch) o anticuerpo conjugado HRP de cadena ligera Kappa antihumano de cabra (Bethyl) durante 1 hora, agitando a temperatura ambiente. Esto fue seguido por 3 lavados de 5 minutos cada uno con PBS-T. Las transferencias se revelaron usando un kit de sustrato DAB mejorado con metal según las instrucciones del fabricante (Pierce).

Los resultados del análisis de inmunotransferencia se muestran en las Figuras 7, 8, 9 y 10. En la Figura 7-10, H representa la cadena pesada y L para la cadena ligera, H2L2 es una molécula de anticuerpo completa que comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras y HL es una semimolécula que comprende una cadena pesada y una cadena ligera.

La Figura 7 muestra el análisis de inmunotransferencia para los anticuerpos 15, 16, 6, 7, 8, 17, 18, 19, 5, 5P, 9, 10, 11, 1,2, 3, 4, 12, 13 y 14. Se puede ver en la Figura 7 que los anticuerpos muestran un buen nivel de H2L2, excepto los anticuerpos 4, 8 y 14 que muestran muy poco o nada de H2L2 debido a la presencia de ambas mutaciones de la bisagra C239S y C242S. Sin embargo, los anticuerpos 4, 8 y 14 pueden formar H2L2 por enlaces no covalentes entre las cadenas pesadas. El mutante 3 también muestra poco H2L2, este mutante retiene C239 pero no puede formar disulfuros entre cadenas pesadas en la bisagra, presumiblemente debido a la formación eficiente de un disulfuro entre la cisteína C-terminal de la cadena ligera (LC) y la C239 de la bisagra. También se puede ver que los anticuerpos que comprenden la mutación C239S pero no C242S (anticuerpos 2, 6, 9 y 12) muestran una formación reducida de HL en comparación con anticuerpos que no comprenden ni C239S ni C242S o anticuerpos que comprenden C242S pero no C239S. Los anticuerpos 5P y 16 que comprenden la mutación S241P también muestran una formación reducida de HL. Una comparación de los mutantes 2 y 3 muestra la extensión del “alcance” de la cisteína C-terminal de la cadena ligera para formar un enlace disulfuro con la cadena pesada, parece que la cisteína de la cadena ligera se une más eficientemente a C239 que a C242 en la cadena pesada.

La Figura 8 muestra el análisis de inmunotransferencia para los anticuerpos 15, 6, 7, 8, 28, 29, 30, 31, 17, 19, 32, 33, 33, 34, 35, 36, 37, 38 y 39. Se puede ver en la Figura 8 que los anticuerpos muestran un buen nivel de H2L2, excepto los anticuerpos 8, 31,35 y 39 que muestran muy poco o nada de H2L2 debido a la presencia de mutaciones C239S y C242S en la región bisagra y, por lo tanto, no se forman enlaces disulfuro entre dos cadenas pesadas. Sin embargo, los anticuerpos 8, 31,35 y 39 pueden formar H2L2 por enlaces no covalentes entre las cadenas pesadas. También se puede ver que los anticuerpos que comprenden la mutación C239S pero no C242S (anticuerpos 6, 29, 33 y 37) muestran una formación reducida de HL en comparación con anticuerpos que no comprenden ni C239S ni C242S o anticuerpos que comprenden C242S pero no C239S. El mutante 15 puede formar un enlace disulfuro entre la cadena ligera y G230C en el C^h1 y disulfuros entre cadenas pesadas, lo que da como resultado una proteína completamente ensamblada y unida por disulfuro. Además, una comparación de los mutantes 15 (C127S G230C), 28 (C127s Y229C), 32 (C127S K228C) y 36 (C127S S227C) muestra que la posición de la cisteína introducida en la bisagra superior mejora la formación de enlaces disulfuro entre LC-HC. G230 e Y229 son posiciones particularmente preferidas para introducir una cisteína. El mutante 28 (C127S Y229C) muestra un bajo nivel de HL y H2 y, por lo tanto, tiene una baja heterogeneidad del enlace disulfuro.

La Figura 9 muestra el análisis de inmunotransferencia para los anticuerpos 15, 6, 7, 8, 44, 45, 46, 47, 17 y 19. Se puede ver en la Figura 9 que los anticuerpos muestran un buen nivel de H2L2 excepto los anticuerpos 8 y 47 que muestran muy poco o nada de H2L2 debido a la presencia de mutaciones C239S y C242S en la región bisagra y, por lo tanto, no se forman enlaces disulfuro entre dos cadenas pesadas. Sin embargo, los anticuerpos 8 y 47 pueden formar H2L2 por enlaces no covalentes entre las cadenas pesadas. También se puede ver que los anticuerpos que comprenden la mutación C239S pero no C242S (anticuerpos 6 y 45) muestran una formación reducida de HL en comparación con los anticuerpos que no comprenden ni C239S ni C242S o anticuerpos que comprenden C242S pero no C239S. En particular, el mutante 44 muestra que la inserción de tres aminoácidos en la bisagra superior también puede reducir la formación de HL y H2 y, por lo tanto, tiene niveles más bajos de heterogeneidad de disulfuro que el mutante comparable 15.

La Figura 10 muestra el análisis de inmunotransferencia para los anticuerpos 48, 17, 18 y 19. Se puede ver en la Figura 10 que el anticuerpo 48 muestra un buen nivel de H2L2 y muy poca HL. El mutante 48 contiene la secuencia de la bisagra superior de IgG1 EPKSCDKTHT SEQ ID NO: 319 en lugar de la secuencia de la bisagra superior de IgG4 junto con una mutación S241P de la bisagra central. Por lo tanto, el mutante 48 tiene la secuencia de bisagra superior y central EPKSCDKTHTCPPCP SEQ ID NO: 320. El mutante 48 muestra niveles más bajos de heterogeneidad del enlace disulfuro en comparación con el anticuerpo IgG4 de tipo salvaje 17 y niveles bajos aproximadamente equivalentes de heterogeneidad del enlace disulfuro en comparación con el mutante S241P de IgG4 18 y el anticuerpo IgG1 de tipo salvaje 19.

Ensayo de termoflúor:

Las termoestabilidades de los mAbs purificados se analizaron en un ensayo de termoflúor utilizando SYPRO® Orange para controlar el proceso de despliegue térmico de las proteínas. Se añadieron juntos 5 pl de mAb a 1 mg/ml, 5 pl de 30xdye y 40 pl de PBS. Se dispensaron diez pl de la mezcla por cuadruplicado a una placa de pocillo óptico de 384 PCR y se ejecutó en el sistema de PCR en tiempo real 7900HT (Agilent Technologies UK Ltd, Wokingham UK). Este sistema de PCR contiene un dispositivo de calentamiento para un control preciso de la temperatura establecido entre 20 °C y 99 °C; un dispositivo acoplado cargado monitorea simultáneamente los cambios de fluorescencia en los pocillos.

Las Figuras 11, 12, 13, 14 y 15 muestran los resultados del análisis de termoestabilidad de los mutantes de anticuerpos IgG4 en comparación con los anticuerpos IgG1 e IgG4 de tipo salvaje.

Una comparación de mutante 15 con IgG4 de tipo salvaje (mutante 17) muestra y aumenta la Fab Tm debido a la disposición alterada del disulfuro. Una comparación de los mutantes 15 y 28 muestra una mejora adicional en Fab Tm para el mutante 28 que comprende la mutación Y229C en comparación con el mutante 15 que comprende la mutación G230C. Una comparación de los mutantes 15 y 44 muestra que la Fab Tm de un mutante G230C puede incrementarse aún más mediante la inserción de tres aminoácidos en la bisagra superior. La comparación de los mutantes 17 y 18 muestra que la mutación de la bisagra media S241P no aumenta la Fab Tm a pesar de que reduce significativamente la formación de HL. El mutante 48 también muestra una Fab Tm significativamente mejorada en comparación con IgG4 de tipo salvaje (mutante 17) y mutante 15. La figura 15 muestra la clasificación general de las termoestabilidades de mutantes de IgG4 seleccionados según la presente invención. Los mutantes 48, 44, 44P, 46, 45, 6, 29, 30, 28, 28P, 31, 8, 47 y 15 muestran valores de Fab Tm significativamente más altos en comparación con el IgG4 de tipo salvaje (mutante 17) y S241P de IgG4 de tipo salvaje (mutante 18).

5. Intercambio de brazos Fab

a) Intercambio de cadena pesada in vitro

Se mezclaron un primer anticuerpo IgG4 y un segundo anticuerpo IgG4, cada uno con diferentes especificidades de antígeno, en una relación molar 1:2 a una concentración total de 100 ug/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (en mM: 150 NaCl, 10 NaH2PO4; pH 7,4). Para permitir la reducción del enlace disulfuro, las muestras se complementaron con glutatión reducido (GSH; Sigma) a una concentración final de 0, 0,5 o 5 mM. Al comienzo del experimento (t = 0 horas) se tomó una alícuota de la mezcla, se inactivó con N-etilmaleimida (NEM; Sigma) a una concentración final de 10 mM (para inactivar grupos tiol potencialmente reactivos) y se incubó junto con el resto de la mezcla durante 16 horas a 37 °C (t = 16 horas). Después de la incubación, la muestra t = 16 horas se inactivó como anteriormente.

Las combinaciones de primer y segundo anticuerpos probados se muestran en la siguiente tabla:

El intercambio de cadenas pesadas entre los anticuerpos 1 y 2 en la tabla anterior proporciona anticuerpos asimétricos con una cadena pesada de cada uno de los anticuerpos relevantes.

b) Detección y cuantificación del intercambio de la cadena pesada in vitro.

La presencia de anticuerpos biespecíficos funcionalmente activos se determinó usando un ensayo MSD de tipo sándwich en el que las muestras de reacción inactivadas (proporcionadas en el Ejemplo 5 a), se diluyeron en serie en BSA al 1% en PBS (PB), se incubaron previamente con 1 ug/ml de antígeno biotinilado 1 (antígeno del primer anticuerpo) en PB durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación (200 rpm) antes de ser transferido a placas de MSD recubiertas con estreptavidina prebloqueadas con PB (Meso Scale Diagnostics). Después de 1 h de incubación a temperatura ambiente con agitación, los pocillos se lavaron tres veces con PBS/Tween-20 al 0,1% antes de incubarse con 1 ug/ml de antígeno 2 marcado con sulfo (antígeno del segundo anticuerpo) en PB. Después de la incubación, las placas se lavaron como se indicó anteriormente y las señales se revelaron y se midieron utilizando el tampón de lectura de los fabricantes y el instrumento imagen Sector 6000, respectivamente. Los valores de fondo obtenidos de las reacciones paralelas de control en las que el antígeno biotinilado fue sustituido por una alternativa no biotinilada, se sustrajeron de todas las señales. Se utilizaron valores duplicados de al menos 3 experimentos independientes en todos los cálculos. Cuanto mayor es la señal de MSD, mayor es la cantidad de intercambio de cadena pesada que se ha producido.

La Figura 16 muestra el intercambio de la cadena pesada a las 16 horas en donde el primer anticuerpo se selecciona de IgG1 de tipo salvaje, IgG4 de tipo salvaje y varios anticuerpos mutantes y el segundo anticuerpo es IgG4 de tipo salvaje a dos concentraciones de GSH. Las figuras muestran que los mutantes tienen menos intercambio que los anticuerpos IgG4 de tipo salvaje y un intercambio significativamente mayor que el anticuerpo IgG1 de tipo salvaje. Esto es ventajoso porque el intercambio puede usarse para preparar los anticuerpos asimétricos de la presente descripción in vitro, los cuales tienen menos susceptibilidad in vivo al intercambio que los anticuerpos IgG4 de tipo salvaje. En algunos casos, aumentar la concentración del agente reductor, como GSH, aumenta la cantidad de intercambio observado.

Según la bibliografía (Labrijn 2011, Lewis 2009, Stubenrauch 2010, Labrijn 2009), mostramos que la mutación S241P en la bisagra central IgG4 representa una herramienta para prevenir el intercambio de del brazo Fab (Figura 16). También se puede ver que los anticuerpos biespecíficos mutantes de la presente invención demostrarían menos intercambio de brazo Fab que el que se ha demostrado a GSH 0,5 mM, que es 100 veces mayor que la concentración plasmática fisiológica de GSH 4-6 uM (Zilmer et al, 2005. Drug Design Reviews). En consecuencia, se pueden crear anticuerpos biespecíficos in vitro por intercambio de brazo Fab en condiciones reductoras, lo que habría reducido entonces significativamente el intercambio de brazo Fab in vivo en comparación con el peso de IgG4.

La Figura 17 muestra que una glicina en la posición 241 puede intercambiar fácilmente con mutantes IgG4 con una alanina o treonina en esta posición. Una IgG4 con una alanina en la posición 241 intercambiará algo más con un mutante con una treonina en esta posición que un mutante con una glicina en esta posición. De manera similar, un mutante IgG4 con una treonina en la posición 241 mostró una actividad intercambiada reducida si se producía una reacción con S241G en comparación con un ensayo simétrico. El intercambio con S241A de IgG4 fue similar al ensayo simétrico. En resumen, esto sugiere que S241T de IgG4 intercambia a niveles similares a IgG4 WT y es más probable que intercambie en comparación con los mutantes S241A y S241G.

Afinidad de anticuerpos:

La afinidad de los anticuerpos IgG4 mutantes seleccionados de la presente invención a la citocina soluble diana se puede medir con BIAiacore™. El formato del ensayo es la captura de las IgG en una superficie anti-Fc seguido de la titulación de citocinas solubles.

El término ''k^d'' (s^{- 1}), se refiere a la constante de velocidad de disociación de la interacción anticuerpo-antígeno. Dicho valor también se conoce como el valor k^off.

El término "k^a" (M^-1s^{- 1}), como se usa en la presente memoria, se refiere a la constante de velocidad de asociación de la interacción anticuerpo-antígeno.

El término "K^d" (M) o" K^d"(pM), como se usa en la presente memoria, se refiere a la constante de equilibrio de disociación de la interacción anticuerpo-antígeno.

Análisis HPLC de exclusión por tamaño (SEC):

Aproximadamente 50 pg de anticuerpo purificado se ejecutó en la HPLC usando una columna. Se utilizaron S200 Abs 1 a 19 para el análisis. Este resultado muestra que el H2L2 asociado no covalentemente se forma a pesar de las alteraciones en las disposiciones de DSB de una molécula de IgG4 humana.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo asimétrico biespecífico que in vivo tiene menos susceptibilidad al intercambio que los anticuerpos IgG4 de tipo salvaje, comprendiendo dicho anticuerpo:

i. dos cadenas ligeras y

ii. dos cadenas pesadas o fragmentos de cadenas pesadas, cada uno de los cuales comprende al menos una región variable, una región bisagra y un dominio C^h1, en donde una primera cadena pesada o fragmento de la misma es una clase IgG4 y tiene:

en donde cada cadena pesada tiene una región variable diferente.

2. El anticuerpo asimétrico biespecífico según la reivindicación 1, en donde la cisteína en la posición 239 y la cisteína en la posición 242, numeradas según el sistema de numeración de Kabat, en la primera cadena pesada se sustituyen con un aminoácido que no contiene tiol.

3. El anticuerpo asimétrico biespecífico según la reivindicación 1, en donde la cisteína en la posición 239, numerada según el sistema de numeración de Kabat, en la primera cadena pesada está sustituida con un aminoácido que no contiene tiol.

4. El anticuerpo asimétrico biespecífico según la reivindicación 1, donde la cisteína en la posición 242, numerada según el sistema de numeración de Kabat, en la primera cadena pesada está sustituida con un aminoácido que no contiene tiol.

5. El anticuerpo asimétrico biespecífico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el aminoácido que no contiene tiol es serina.

6. El anticuerpo asimétrico biespecífico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde un aminoácido en el residuo 240 y/o 241 según el número de Kabat se reemplaza por otro aminoácido.

7. El anticuerpo asimétrico biespecífico según cualquier reivindicación precedente, en donde la cisteína en la posición 127 está sustituida por serina.

8. El anticuerpo asimétrico biespecífico según cualquier reivindicación precedente, en donde la cadena pesada está mutada para insertar tres aminoácidos entre los aminoácidos 226-243, numerados según el sistema de numeración de Kabat.

9. El anticuerpo asimétrico biespecífico según la reivindicación 8, en donde la primera cadena pesada está mutada para insertar tres aminoácidos entre las posiciones 238 y 239, numerados según el sistema de numeración de Kabat.

10. El anticuerpo asimétrico biespecífico según la reivindicación 9, en donde se insertan tres alaninas entre las posiciones 238 y 239, de la primera cadena pesada numerada según el sistema de numeración de Kabat.

11. El anticuerpo asimétrico biespecífico según la reivindicación 9, en donde una treonina, una histidina y una treonina adicional se insertan entre las posiciones 238 y 239, de la primera cadena pesada numerada según el sistema de numeración de Kabat.

12. El anticuerpo asimétrico biespecífico según cualquier reivindicación precedente, en donde la serina en la posición 241, de la primera cadena pesada numerada según el sistema de numeración de Kabat, se sustituye con prolina.

13. El anticuerpo asimétrico biespecífico según cualquier reivindicación precedente, en donde en la primera cadena pesada la glicina en la posición 230 está sustituida con cisteína, la serina en la posición 227 está sustituida con prolina, la tirosina en la posición 229 está sustituida con serina, la prolina en la posición 237 está sustituido con ácido aspártico, la prolina en la posición 238 está sustituida con lisina, la secuencia de aminoácidos treonina-histidina-treonina se inserta entre las posiciones 238 y 239 y la serina en la posición 241 está sustituida con prolina.

14. El anticuerpo asimétrico biespecífico según cualquier reivindicación precedente, en donde una o más de las cadenas pesadas o fragmentos de las mismas comprenden un dominio C^H2 y/o un dominio C^H3.

15. El anticuerpo asimétrico biespecífico según cualquier reivindicación precedente, en donde cada cadena ligera comprende una región variable y las dos regiones variables son iguales o diferentes.

16. El anticuerpo asimétrico biespecífico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde la cadena pesada o cada cadena pesada comprende una región bisagra superior y una región central de 12 a 17 aminoácidos de longitud, por ejemplo 15 aminoácidos de longitud.

17. Un vector de expresión que comprende una secuencia que codifica un anticuerpo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.

18. Una célula huésped que comprende un vector como se define en la reivindicación 17.

19. Un anticuerpo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 para uso en el tratamiento de un trastorno de enfermedad.

20. Un método para generar un anticuerpo, como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, que comprende las etapas de tomar un anticuerpo simétrico que comprende una primera secuencia de cadena pesada o un fragmento de la misma como se define en la presente memoria y mezclar dicho anticuerpo in vitro con un segundo anticuerpo simétrico que comprende una segunda secuencia de cadena pesada o un fragmento de la misma que es diferente a dicha primera secuencia de cadena pesada en al menos la región fuera de la región variable, en condiciones propicias para el intercambio de cadena pesada entre los dos anticuerpos, y opcionalmente el aislamiento del anticuerpo mixto asimétrico obtenido a partir del mismo.