EA033720B1 - МОДИФИЦИРОВАННЫЕ БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА IgG4 С АСИММЕТРИЧНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬЮ - Google Patents

МОДИФИЦИРОВАННЫЕ БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА IgG4 С АСИММЕТРИЧНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬЮ Download PDF

Info

Publication number
EA033720B1
EA033720B1 EA201491571A EA201491571A EA033720B1 EA 033720 B1 EA033720 B1 EA 033720B1 EA 201491571 A EA201491571 A EA 201491571A EA 201491571 A EA201491571 A EA 201491571A EA 033720 B1 EA033720 B1 EA 033720B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
heavy chain
seq
antibody
cysteine
igg4
Prior art date
Application number
EA201491571A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201491571A1 (ru
Inventor
David Paul Humphreys
Shirley Jane Peters
Original Assignee
Ucb Pharma Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ucb Pharma Sa filed Critical Ucb Pharma Sa
Publication of EA201491571A1 publication Critical patent/EA201491571A1/ru
Publication of EA033720B1 publication Critical patent/EA033720B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/12—Ophthalmic agents for cataracts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Abstract

Изобретение относится к асимметричному смешанному антителу, содержащему две тяжелые цепи или фрагмент тяжелой цепи, каждая из которых содержит по меньшей мере вариабельную область, шарнирную область и C1-домен, где первая тяжелая цепь или ее фрагмент принадлежит классу IgG4 и имеет a) цистеин межцепочечной связи в положении 127 при нумерации по системе нумерации Kabat в домене C1, замененный на другую аминокислоту; и b) необязательно одну или несколько из аминокислот, расположенных в верхней шарнирной области и замененных цистеином, и где вторая тяжелая цепь или ее фрагмент отличается тем, что часть или вся цепь отличается по аминокислотной последовательности от указанной первой тяжелой цепи по меньшей мере в области вне вариабельной области (например, в константной области), к составам, содержащим их, терапевтическому средству, в котором используются оба из указанных выше, и к способам получения антител и состава.

Description

Настоящее изобретение относится к асимметричным антителам, содержащим тяжелую цепь IgG4 или фрагмент, которая является мутантной, и вторую тяжелую цепь или фрагмент, которая отличается от указанной цепи IgG4. Также изобретение относится к композициям, содержащим указанные асимметричные антитела, и к применению антител и композиций, содержащих их, для лечения. В другом аспекте изобретение относится к способам получения антител и составов, векторов, кодирующих антитела, и хозяев, экспрессирующих их.
Биофармацевтическая промышленность, охватывающая рекомбинантные белки, моноклональные антитела (mAb) и лекарственные средства на основе нуклеиновых кислот, быстро растет. Инженерия антител привела к конструированию и получению фрагментов антител или альтернативных форматов.
Предпочтительный молекулярный формат, а также другие аспекты, такие как выход продукции, качество белка и стабильность при хранении, учитываются при выборе белка на основе антитела в качестве лекарственного средства.
Основная структура всех молекул иммуноглобулинов (Ig) содержит две идентичных тяжелых цепи (НС) и две идентичных легких цепи (LC), которые связаны дисульфидными связями. Каждая LC состоит из вариабельного (VL) и константного домена (CL). На основе НС различают пять основных классов Ig: IgG, IgA, IgD, IgE и IgM. В случае IgG НС состоит из одного вариабельного домена (VH) и трех константных доменов (СН1-3). Домены СН2 и СН3 формируют Fc-часть молекулы, которая ответственна за стимуляцию эффекторной функции и связана с Fab-фрагментом (VHVL и CHCL) шарнирной областью, которая сообщает молекуле IgG гибкость. На концах доменов VL и VH расположены два распознающих антиген участка. IgG далее подразделяют на 4 различных изотипа: IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.
Опосредуемые Fc эффекторные функции, т.е. антителозависимая цитотоксичность (ADCC) или комплементзависимая цитотоксичность (CDC), являются зависимыми от изотипа. Каждый изотип эволюционировал так, чтобы выполнять конкретную функцию в организме. В настоящее время изотип IgG1 наиболее широко используется в качестве терапевтического средства вследствие более длительного времени полужизни, усиленной активации ADCC и активации комплемента. Другие изотипы используют в качестве лекарственных средств в зависимости от мишени и желаемого эффекта. Например, когда антигены-мишени необходимо просто нейтрализовать и эффекторные функции менее важны, можно использовать альтернативные изотипы, такие как IgG2 и IgG4. Альтернативно могут быть предусмотрены IgG с модифицированной способами инженерии Fc/эффекторной функцией.
IgG2 также обладает минимальной связанной с ним эффекторной функцией, однако он склонен к димеризации, которая не полностью понятна.
IgG4 остается подходящим изотипом вследствие его относительной недостаточности индукции эффекторной функции. Однако использование IgG4 также имеет присущие некоторые ему практические затруднения, а именно более короткое время полужизни в сыворотке и способность претерпевать обмен Fab-плечами (также обозначаемый как динамический обмен тяжелыми цепями или обмен тяжелыми цепями), где происходит обмен тяжелой цепи и связанной с ней легкой цепи антитела с тяжелой цепью и связанной с ней легкой цепью другого антитела с образованием целого антитела, состоящего из двух тяжелых цепей и двух связанных с ними легких цепей (van der Neut Kolfschoten et al., 2007 Science 317, 1554-1557).
In vivo обмен Fab-плечами приводит к биспецифическим антителам, которые вследствие их различных вариабельных доменов могут связывать одновременно различные антигены-мишени. Это приводит к продукции большого процента циркулирующих IgG4, для которых выявлено, что они являются биспецифическими, но функционально одновалентными (Schuurman, J., Van Ree, R., Perdok, G.J., Van Doorn, H.R., Tan, K.Y., Aalberse, R.O., 1999. Normal human immunoglobulin G4 can be bispecific: it has two different antigen-combining sites. Immunology 97, 693-698).
In vitro, когда антитела IgG4 анализируют с помощью невосстанавливающего SDS-PAGE, наблюдают, что они образуют так называемые половинные молекулы, каждая из которых содержит одну ковалентно связанную пару тяжелая-легкая цепь, являющуюся результатом отсутствия дисульфидных связей, как правило, вследствие образования дисульфидных связей внутри тяжелой цепи в шарнирной области одной тяжелой цепи. Тяжелая цепь половинной молекулы может нековалентно связываться с тяжелой цепью, являющейся ее партнером в паре, причем связывание поддерживается взаимодействиями доменов СН3:СН3. С использованием способов, таких как эксклюзионная хроматография, в растворе такие половинные молекулы фактически наблюдают как полноразмерные, которые имеют размер приблизительно 150 кДа, однако на невосстанавливающем SDS-PAGE присутствуют пары ШНС массой 75 кДа (так называемая половинная молекула).
Мутация Ser на Pro в положении 241 (при нумерации по системе нумерации Kabat) в шарнирной области уменьшает появление этих половинных молекул при невосстанавливающем SDS-PAGE (Angal, S. et al., 1993. A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human (IgG4) antibody as observed during SDS-PAGE analysis, Mol Immunol 30, 105-108). Кроме того, эта точковая мутация не влияет на компактную структуру IgG4, тем самым, позволяя IgG4 сохранять его сниженную способность активировать комплемент.
После открытия мутации S241P исследовали дополнительные мутации IgG4 для понимания взаи
- 1 033720 модействия между тяжелыми цепями в антителах IgG4, снижения эффекторной функции IgG4 и усиления стабильности структуры. В Schuurman et al. (Schuurman, J et al., 2001. The inter-heavy chain disulphide bonds of IgG4 are in equilibrium with intra-heavy chain disulphide bonds. Molecular Immunology 38, 1-8), наблюдаемую нестабильность дисульфидных связей между цепями IgG4 исследовали с использованием мутантов IgG4. В мутанте M1 Cys 131 (при нумерации по системе нумерации EU или Cys 127 по системе нумерации Kabat), который вовлечен в дисульфидную связь между тяжелой цепью и легкой цепью (CLCH1), был заменен на серин, и было выявлено, что этот мутант приводил к образованию димеров легких цепей и димеров тяжелых цепей. В мутанте М2 цистеин 226 (226 при нумерации по системе нумерации EU или 239 по системе нумерации Kabat), который вовлечен в дисульфидную связь между тяжелыми цепями в шарнирной области, был заменен на серин, и было выявлено, что этот мутант обладает более стабильной связью между тяжелыми цепями по сравнению с IgG4 и препятствует образованию дисульфидной связи внутри тяжелой цепи.
Ранее исследовали изменение количества остатков цистеина, присутствующих в шарнирной области антител. В US 5677425, Bodmer et al., описано, что количество остатков цистеина в шарнирной области можно увеличивать для способствования использованию тиольных групп цистеина для связывания с эффекторными или репортерными молекулами. В US 5677425 также описано, что количество остатков цистеина в шарнирной области можно уменьшать до одного, чтобы способствовать сборке молекул антител, поскольку будет необходимо образовать только одну дисульфидную связь, которая обеспечит специфическую мишень для присоединения шарнирной области либо к другой шарнирной области, либо к эффекторной или репортерной молекуле.
Учитывая, что IgG4-антитела, вводимые индивидууму, являются чувствительными к динамическому обмену тяжелыми цепями с образованием смешанных антител, этот процесс можно использовать в рамках настоящего изобретения для получения антител in vitro по настоящему изобретению. Преимущественно это позволяет манипулирование характеристиками антител.
Все еще существует потребность в получении новых антител для применения в качестве лекарственного средства. Настоящее изобретение относится к новым мутантным антителам, которые могут обладать преимущественными свойствами, включая улучшенные биофизические свойства, например, по сравнению с антителами дикого типа.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к асимметричному смешанному антителу, содержащему две тяжелые цепи или фрагменты тяжелых цепей, каждая из которых содержит, по меньшей мере, вариабельную область, шарнирную область и домен СН1, где первая тяжелая цепь или ее фрагмент принадлежит классу IgG4 и имеет:
a) цистеин между цепями в положении 127 при нумерации по системе нумерации Kabat в домене СН1, замененный на другую аминокислоту; и
b) необязательно, одну или несколько аминокислот, расположенных в верхней шарнирной области и замененных на цистеин, где вторая тяжелая цепь или ее фрагмент характеризуется тем, что часть всей цепи имеет отличающуюся аминокислотную последовательность относительно указанной первой тяжелой цепи, по меньшей мере, в области вне вариабельной области.
В альтернативном аспекте настоящее изобретение относится к асимметричному смешанному антителу, содержащему тяжелую цепь IgG4 или фрагмент тяжелой цепи, где тяжелая цепь или фрагмент содержит вариабельную область, шарнирную область и домен СН1, где шарнирная область является мутантной так, что она представляет собой шарнирную область IgG1-типа.
Также предусматривается асимметричное смешанное антитело, содержащее первую и вторую тяжелые цепи или фрагменты тяжелой цепи, каждая из которых содержит, по меньшей мере, вариабельную область, шарнирную область и домен СН1, где первая тяжелая цепь или ее фрагмент принадлежит классу IgG4 и имеет шарнирную область IgG1-типа, и вторая тяжелая цепь или ее фрагмент обладает отличающейся аминокислотной последовательностью указанной первой тяжелой цепи, по меньшей мере, в области вне вариабельной области.
В одном из вариантов осуществления последовательности шарнирной области двух тяжелых цепей являются сходными или идентичными.
Настоящее изобретение является преимущественным, поскольку оно позволяет манипулирование и контроль над свойствами антител способами, которые являются удобными и свободно доступными.
Антитела по настоящему изобретению могут продемонстрировать пониженный обмен тяжелыми цепями по сравнению с IgG4 дикого типа, который обеспечивает асимметрию (как например, биспецифическое антитело), который демонстрирует небольшой обмен или отсутствие обмена с IgG4 дикого типа in vivo вследствие их сниженной подверженности к обмену по сравнению с IgG4 и также вследствие относительно низкой концентрации асимметричного смешанного антитела in vivo по сравнению с природными циркулирующими IgG4-антителами.
Антитела по настоящему изобретению могут продемонстрировать сниженный обмен тяжелыми цепями при концентрациях, превышающих концентрации in vivo, например при концентрациях 0,5 мМ или
- 2 033720 более по сравнению с IgG4 дикого типа. В то время как антитела по изобретению демонстрируют сниженный обмен тяжелыми цепями по сравнению с IgG4 дикого типа, они демонстрируют степень обмена тяжелыми цепями, по сравнению с IgG1 wt и IgG4 S241P, которая является достаточной для образования асимметричного смешанного антитела (такого как биспецифическое антитело) из двух отличающихся антител (таких как два антитела, обладающие различными антигенными специфичностями) in vitro.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления антитела по настоящему изобретению могут обмениваться in vitro с 5 мМ GSH, но не с 0,5 мМ GSH. Последний из этих случаев в большей степени имитирует барьер обмена in vivo. На фиг. 20 это иллюстрируется тем, что Ab28 (C127S Y229C) обменивается с WT, S241G S241A или S241T при 5 мМ GSH, но не при 0,5 мМ.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу получения асимметричного смешанного антитела, включающему стадии взятия симметричного антитела, содержащего первую последовательность тяжелой цепи или ее фрагмента, как определено в настоящем описании, и смешения указанного антитела in vitro со вторым симметричным антителом, содержащим вторую последовательность тяжелой цепи или ее фрагмента, которая отличается от указанной первой последовательности тяжелой цепи, в условиях, способствующих обмену тяжелыми цепями между двумя антителами, и, необязательно, выделения асимметричного смешанного антитела, полученного из них. В одном из вариантов осуществления способ, который включает смешение двух антител, обеспечивает биспецифическое антитело, где антигенная специфичность вариабельных областей в первом антителе отличается от антигенной специфичности вариабельных областей во втором антителе.
В одном из вариантов осуществления антитела являются одновалентными.
Способ по настоящему изобретению позволяет полностью манипулировать свойствами антитела, обеспечивая конечную терапевтическую молекулу, которая индивидуализирована и оптимизирована для предполагаемого терапевтического применения.
Кроме того, антитела по настоящему изобретению могут быть преимущественными в том, что они обладают более низкими уровнями эффекторной функции и/или не участвуют в перекрестном связывании.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1а представлены последовательности СН1 и шарнирной области человека IgG1 дикого типа и IgG4 дикого типа, где остатки шарнирной области подчеркнуты, и константная последовательность легкой цепи каппа.
На фиг. 1b представлены:
константная последовательность легкой цепи каппа человека, где указан цистеин (подчеркнут), который формирует дисульфидные связи между цепями CL-CH1;
последовательности N-концевых остатков СН1 и шарнирной области тяжелой цепи IgG1, 2, 3 и 4 человека, где указано (подчеркнуто) положение цистеина (в верхней шарнирной области для IgG1 и в Nконцевом СН1 для IgG2, 3 и 4), который формирует дисульфидную связь между цепями CL-CH1;
последовательности N-концевых остатков СН1 и часть шарнирной области тяжелой цепи IgD человека, где указано (подчеркнуто) положение цистеина в N-концевой последовательности СН1, который формирует дисульфидную связь между цепями CL-CH1;
N-концевые остатки СН1, С-концевые остатки СН1 тяжелой цепи IgM человека и отдельные Nконцевые остатки СН2, где указано (подчеркнуто) положение цистеина в N-концевой последовательности СН1, который формирует дисульфидную связь между цепями CL-CH1; и остатки в верхней шарнирной области IgG3 и IgG4, шарнирной области IgD и на С-конце СН1 и в СН2 IgM, где подчеркнутые остатки указывают на положения, где один или несколько остатков могут быть заменены на цистеин в антителах по настоящему изобретению.
На фиг. 2а представлен остаток цистеина СН1 (С127), который формирует межцепочечную дисульфидную связь с цистеином легкой цепи, и остатки верхней и центральной шарнирной области IgG1 дикого типа, IgG4 дикого типа, и положения, в которых в IgG4-антитела по настоящему изобретению внесены мутации.
На фиг. 2b представлен остаток цистеина СН1 (С127), который формирует межцепочечную дисульфидную связь с цистеином легкой цепи, и остатки шарнирной области IgG3 дикого типа и положения, где один или несколько остатков заменены на цистеин в IgG3-антителах по настоящему изобретению.
На фиг. 2с представлен остаток цистеина СН1 (С127), который формирует межцепочечную дисульфидную связь с цистеином легкой цепи, и отдельные остатки СН1 и СН2 IgM дикого типа и положения, где один или несколько остатков заменены на цистеин в IgM-антителах по настоящему изобретению.
На фиг. 2d представлен остаток цистеина СН1 (С128), который формирует межцепочечную дисульфидную связь с цистеином легкой цепи, и остатки шарнирной области IgD дикого типа и положения, где один или несколько остатков замещены цистеином в IgD-антителах по настоящему изобретению.
На фиг. 3a представлены мутации, внесенные в IgG4-антитела в соответствии с настоящим изобретением.
На фиг. 3b представлены положения остатков в мутантной тяжелой цепи IgG4-антител, представленной на фиг. 3 a, и предсказанная дисульфидная связь, которая может образовываться с цистеином ли- 3 033720 бо в легкой цепи (LC), либо в другой мутантной тяжелой цепи (НС). Когда цистеин может связываться с цистеином в LC или НС, подчеркнутая цепь представляет собой предсказанное преобладающее расположение дисульфидной связи.
На фиг. 4a представлены мутации, внесенные в IgG4-антитела в соответствии с настоящим изобретением.
На фиг. 4b представлены положения остатков цистеина в IgG4-антителах, представленных на фиг. 4а, и предсказанная дисульфидная связь, которая может образовываться с цистеином либо в легкой цепи (LC), либо в тяжелой цепи (НС). Когда цистеин может связываться с цистеином в LC или НС, подчеркнутая цепь представляет собой предсказанное преобладающее расположение дисульфидной связи.
На фиг. 5 представлены различные последовательности.
На фиг. 6 представлены различные последовательности.
На фиг. 7 представлен анализ с использованием вестерн-блоттинга антител в соответствии с настоящим изобретением, причем на верхнем геле представлены результаты использования антитела против Fc человека, а на нижнем геле представлены результаты использования антитела против каппа-цепи.
На фиг. 8 представлен анализ с использованием вестерн-блоттинга антител в соответствии с настоящим изобретением, причем на верхнем геле представлены результаты использования антитела против Fc человека, а на нижнем геле представлены результаты использования антитела против каппа-цепи человека.
На фиг. 9 представлен анализ с использованием вестерн-блоттинга антител в соответствии с настоящим изобретением, причем на верхнем геле представлены результаты использования антитела против Fc человека, а на нижнем геле представлены результаты использования антитела против каппа-цепи человека.
На фиг. 10 представлен анализ с использованием вестерн-блоттинга антител в соответствии с настоящим изобретением, причем на верхнем геле представлены результаты использования антитела против Fc человека, а на нижнем геле представлены результаты использования антитела против каппа-цепи человека.
На фиг. 11 представлены результаты анализа Thermofluor антител по настоящему изобретению, которые демонстрируют термостабильность доменов Fab и СН2.
На фиг. 12 представлены результаты анализа Thermofluor антител по настоящему изобретению, которые демонстрируют термостабильность доменов Fab и СН2.
На фиг. 13 представлены результаты анализа Thermofluor антител по настоящему изобретению, которые демонстрируют термостабильность доменов Fab и СН2.
На фиг. 14 представлены результаты анализа Thermofluor антител по настоящему изобретению, которые демонстрируют термостабильность доменов Fab и СН2.
На фиг. 15 представлено ранжирование величин термостабильности отдельных антител по настоящему изобретению.
На фиг. 16 представлен обмен тяжелыми цепями через 16 ч, где первое антитело выбрано из IgG1 дикого типа, IgG4 дикого типа и различных мутантных антитела, и второе антитело представляет собой IgG4 дикого типа при двух концентрациях GSH. На фигуре показано, что мутанты обладают несколько меньшим обменом, чем антитела IgG4 дикого типа, и значительно более высоким обменом, чем антитело IgG1 дикого типа и антитело IgG4 Р. Это является преимущественным, поскольку обмен можно использовать для получения асимметричных антител по настоящему изобретению, которые in vivo менее подвержены обмену, чем антитела IgG4 дикого типа. В некоторых условиях увеличение концентрации восстановителя, такого как GSH, увеличивает величину наблюдаемого обмена.
На фиг. 17 представлен анализ асимметричного обмена мутантов, содержащих вариабельные области 1 типа с альтернативными остатками в положении 241, и мутантов с вариабельными областями 2 типа.
На фиг. 18 представлен анализ асимметричного домена IgG4 WT с вариабельными областями 1 типа, инкубированного с различными мутантами S241, и центрального цистеина шарнирной области с вариабельными областями 2 типа.
На фиг. 19 представлен анализ асимметричного обмена IgG4 S241P с вариабельными областями 1 типа, инкубированного с различными мутантами S241, IgG4 C127S Y229C (Ab 28) с вариабельными областями 2 типа.
На фиг. 20 представлен анализ асимметричного обмена IgG4 C127S Y229C (номер 28) с вариабельными областями 1 типа, инкубированного с различными мутантами S241 и IgG4 WT с вариабельными областями 2 типа.
На фиг. 21 представлен анализ асимметричного обмена мутантов с двойной шарнирной областью с вариабельными областями 1 типа, инкубированных с множеством мутантов с вариабельными областями 2 типа.
Краткое описание последовательностей
В SEQ ID NO: 1 показана последовательность СН1 и шарнирной области IgG1-антитела дикого типа.
В SEQ ID NO: 2 показана последовательность СН1 и шарнирной области IgG4-антитела дикого ти
- 4 033720 па.
В SEQ ID NO: 3 показана часть константной области легкой цепи каппа человека дикого типа.
В SEQ ID NO: 4 показана часть N-концевой последовательности Он1-домена IgGi-антитела человека.
В SEQ ID NO: 5 показана шарнирная область IgGi-антитела человека.
В SEQ ID NO: 6 показана часть N-концевой последовательности Сн1-домена IgG2-антитела человека.
В SEQ ID NO: 7 показана шарнирная область IgG2-антитела человека.
В SEQ ID NO: 8 показана часть N-концевой последовательности Сн1-домена IgG3-антитела человека.
В SEQ ID NO: 9 показана шарнирная область IgG3-антитела человека.
В SEQ ID NO: 10 показана часть N-концевой последовательности домена СН1 IgG4-антитела человека.
В SEQ ID NO: i i показана шарнирная область IgG4-антитела человека.
В SEQ ID NO: 12-37 показаны последовательности Сн1-домена и шарнирной области антител 6, 7, 8, 15, 16, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 44, 45, 46, 47, 2, 3, 48, 28Р и 44Р соответственно.
В SEQ ID NO: 38-63 показаны последовательности домена СН1, шарнирной области, домена СН2 и домена СН3 антител 6, 7, 8, 15, 16, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 44, 45, 46, 47, 2, 3, 48, 28Р и 44Р соответственно.
В SEQ ID NO: 64 показаны последовательности доменов СН2 и СН3 IgG4 дикого типа.
В SEQ ID NO: 65 показаны последовательности доменов СН2 IgG4 дикого типа и СН3 IgG1 дикого типа.
В SEQ ID NO: 66 показана последовательность константной области легкой цепи каппа дикого типа человека.
В SEQ ID NO: 67 показана часть N-концевой последовательности домена СН1 IgD-антитела человека.
В SEQ ID NO: 68 показана часть шарнирной области IgD-антитела человека.
В SEQ ID NO: 69 показана часть N-концевой последовательности домена СН1 IgM-антитела человека.
В SEQ ID NO: 70 показана часть С-концевой последовательности Сн1-домена IgM-антитела человека.
В SEQ ID NO: 71 показана часть домена СН2 IgM-антитела человека.
В SEQ ID NO: 72-295 показаны различные шарнирные области.
В SEQ ID NO: 296-305 показаны последовательности домена СН1 и шарнирной области антител 1, 4, 5, 5Р, 9, 10, 11, 12, 13 и 14 соответственно.
В SEQ ID NO: 306-315 показаны последовательности домена СН1, шарнирной области, домена СН2 и домена СН3 антител 1, 4, 5, 5Р, 9, 10, 11, 12, 13 и 14 соответственно.
В SEQ ID NO: 316-322 показаны различные шарнирные последовательности и их части.
Подробное описание
Асимметричное антитело, как используют в настоящем описании, представляет собой антитело, где две тяжелые цепи или их фрагменты обладают аминокислотными последовательностями, которые частично или полностью отличаются в шарнирных областях вне вариабельных областей, например, обладают сходством менее 98% на протяжении соответствующего участка, такой как менее 97, 96, 95% на протяжении соответствующего участка. В одном из вариантов осуществления существует 1, 2, 3, 4, 5 аминокислот, отличающихся или добавленных в области из 10 последовательно расположенных аминокислот. Аминокислотные последовательности также могут иметь различные длины, которые неизбежно приведут к отличию аминокислотных последовательностей. Части тяжелых цепей могут иметь сходные или идентичные последовательности, например вариабельные области в тяжелой цепи могут быть одинаковыми или могут отличаться.
В одном из вариантов осуществления последовательности тяжелой цепи в антителах по настоящему изобретению ковалентно связаны, например, через межцепочечную дисульфидную связь, например связь, которая присутствует естественным образом в соответствующем фрагменте дикого типа, или связь, которая модифицирована способами генной инженерии так, чтобы она присутствовала в цепях в желаемом положении.
В одном аспекте антитела по настоящему изобретению характеризуются тем, что первая последовательность тяжелой цепи IgG4 или ее фрагмент имеет шарнирную область типа IgG1.
В одном аспекте антитела по настоящему изобретению характеризуются тем, что обе последовательности тяжелой цепи или их фрагменты имеют шарнирную область типа IgG1.
Верхняя и центральная шарнирные области IgG1 дикого типа имеют последовательность EP^CDKIBTCPPCP SEQ ID NO: 316.
Верхняя и центральная шарнирные области IgG4 дикого типа имеют последовательность ESKYGPPCPSCP SEQ ID NO: 317.
- 5 033720
Шарнирная область типа IgG1, используемая в рамках настоящего изобретения, относится к шарнирной области, где одна или несколько, например 1-5, как например, 1, 2 или 3 аминокислоты, встроены в шарнирную область IgG4, в частности, между EPKYGPP SEQ ID NO: 318 и CPSC, и/или одна или несколько из аминокислот YGPP в шарнирной области IgG4 заменены, например, чтобы они соответствовали аминокислоте в шарнирной области IgG1, в частности G (из YGPP в шарнирной области IgG4) заменен на С или где Y (из YGPP в шарнирной области IgG4) заменен на С или S.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к асимметричному смешанному антителу, содержащему первую тяжелую цепь IgG4 с верхней шарнирной областью, центральной и нижней шарнирными областями, и указанная верхняя и центральная шарнирные области в тяжелой цепи или каждой тяжелой цепи в нем имеют длину от 13 до 17, как например, 15 аминокислот.
В одном из вариантов осуществления асимметричное смешанное антитело с первой тяжелой цепью IgG4 имеет верхнюю шарнирную область и центральную шарнирную область длиной 15 аминокислот.
В одном из вариантов осуществления верхняя шарнирная область и центральная шарнирная область по меньшей мере первой тяжелой цепи содержат 12 природных аминокислот, встречающихся в шарнирной области IgG4, и дополнительные три аминокислоты, например, 3 остатка аланина, или 3 остатка глицина, или их комбинацию.
В одном из вариантов осуществления шарнирная область имеет одну из следующих последовательностей:
ID
ID
ID
N0:72;
N0:74;
N0:76;
ESKYGPPGGGCPSCP SEQ ID N0:73;
ESKYGDKTHTCPSCP SEQ ID N0:75;
EPSKYGPPGGGCPSCP SEQ ID N0:77;
ESKYGPPAAACPSCP SEQ
ESKYGPPTHTCPSCP SEQ
EPSKYGPPAAACPSCPSEQ
EPSKYGPPTHTCPSCP SEQ ID N0:78; EPSKYGDKTHTCPSCP SEQ ID N0:79;
ESKSYGPPAAACPSCPSEQ ID N0:80; ESKSYGPPGGGCPSCP SEQ ID N0:81;
ESKSYGPPTHTCPSCP SEQ ID N0:82; ESKSYGDKTHTCPSCP SEQ ID N0:83;
ESKYGPPAAACPPCP SEQ ID N0:84; ESKYGPPGGGCPPCP SEQ ID N0:85;
ESKYGPPTHTCPPCP SEQ ID N0:86; ESKYGDKTHTCPPCP SEQ ID N0:87;
EPSKYGPPAAACPPCP SEQ ID N0:88; EPSKYGPPGGGCPPCP SEQ ID N0:89
EPSKYGPPTHTCPPCP SEQ ID N0:90; EPSKYGDKTHTCPPCP SEQ ID N0:91
ESKSYGPPAAACPPCP SEQ ID NO:92; ESKSYGPPGGGCPPCP SEQ ID N0:93
ESKSYGPPTHTCPPCP SEQ ID NO:94; ESKSYGDKTHTCPPCP SEQ ID N0:95
В одном из вариантов осуществления верхняя шарнирная область и центральная шарнирная область по меньшей мере в первой тяжелой цепи IgG4 по изобретению состоит из природной шарнирной области IgG1, т.е. EPKSCDKTHTCPPC SEQ ID NO: 96, или ее производного, такого как
EPKSCDKAAACPPCP SEQ ID N0:97; EPKSCDKGGGCPPCP SEQ ID N0:98;
EPKSCDKTHTSPPCP SEQ ID N0:99; EPKSCDKTHTCPPSP SEQ ID ] N0:100;
EPKSCDKTHTSPPSP SEQ ID N0:101; EPKSCDKAAASPPCP SEQ ID N0:102
EPKSCDKAAACPPSP SEQ ID N0:103; EPKSCDKAAASPPSP SEQ ID N0:104
EPKSCDKGGGSPPCP SEQ ID N0:105; EPKSCDKGGGCPPSP SEQ ID N0:106
EPKSCDKGGGSPPSP SEQ ID N0:107.
Как правило, шарнирные области в каждой из тяжелых цепей асимметричного смешанного антитела, являются по меньшей мере, совместимыми. Иными словами, когда тяжелые цепи образуют пару, расположение не является стабильным, например, благодаря внутреннему напряжению в шарнирной области.
В одном из вариантов осуществления шарнирная область каждой тяжелой цепи содержит последовательность, независимо выбранную из последовательности шарнирной области, описанной в настоящем описании.
В одном из вариантов осуществления шарнирные области в каждой из тяжелых цепей являются сходными или идентичными. Это может быть преимущественным, поскольку это может минимизировать несовместимость шарнирных областей двух цепей.
В следующем аспекте изобретение относится к асимметричному смешанному антителу, содержащему две тяжелые цепи IgG4, каждая из которых содержит вариабельную область, домен СН1 и шарнирную область, где в первой тяжелой цепи:
a) межцепочечный цистеин в положении 127 при нумерации по системе нумерации Kabat в домене СН1 заменен на другую аминокислоту; и
b) шарнирная область в тяжелой цепи или каждой тяжелой цепи в нем имеет длину в диапазоне от 12 до 17, такую как 15 аминокислот;
где часть или вся вторая тяжелая цепь имеет отличающуюся аминокислотную последовательность относительно указанной первой тяжелой цепи по меньшей мере в одной области вне вариабельной области.
Подходящие шарнирные области описаны выше.
В следующем аспекте настоящее изобретение также относится к асимметричному антителу, содер
- 6 033720 жащему две тяжелые цепи IgG4, каждая из которых содержит домен СН1 и шарнирную область, где в первой тяжелой цепи:
a) цистеин в положении 127 при нумерации по системе нумерации Kabat заменен на другую аминокислоту; и
b) цистеин в положении 239 или цистеин в положении 242 при нумерации по системе нумерации Kabat заменен на другую аминокислоту;
где часть или вся вторая тяжелая цепь имеет отличающуюся аминокислотную последовательность относительно указанной первой тяжелой цепи по меньшей мере в одной области вне вариабельной области.
В одном из вариантов осуществления в соответствии с последним аспектом изобретения, по меньшей мере, тяжелая цепь IgG4 содержит 22 аминокислоты в шарнирной области, например, как описано выше.
Последовательности второй тяжелой цепи и ее фрагментов включают любую тяжелую цепь антитела, включая IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 (включая тип, описанный выше), IgD и IgM.
В следующем варианте осуществления настоящее изобретение также относится к асимметричному смешанному антителу, содержащему две тяжелые цепи IgG3, каждая из которых содержит домен СН1 и шарнирную область, например, где в первой тяжелой цепи:
a) цистеин в домене СН1, который образует межцепочечную дисульфидную связь с цистеином в легкой цепи, заменен на другую аминокислоту; и
b) одна или несколько аминокислот, расположенных в верхней шарнирной области, заменены на цистеин;
где часть или вся вторая тяжелая цепь отличается по аминокислотной последовательности относительно указанной первой тяжелой цепи по меньшей мере в одной области вне вариабельной области.
В следующем варианте осуществления настоящее изобретение относится к асимметричному смешанному антителу, дополнительно содержащему две тяжелые цепи IgM, каждая из которых содержит домен СН1 и домен СН2, например, где в первой тяжелой цепи:
a) цистеин в домене СН1, который образует межцепочечную дисульфидную связь с цистеином в легкой цепи, заменен на другую аминокислоту; и
b) одна или несколько из аминокислот, расположенных в домене СН1 или домене СН2, заменены на цистеин;
где часть или вся вторая тяжелая цепь отличается по аминокислотной последовательности относительно указанной первой тяжелой цепи, по меньшей мере, в области вне вариабельной области.
В следующем варианте осуществления настоящее изобретение относится к асимметричному смешанному антителу, дополнительно содержащему две тяжелые цепи IgD, например, каждая из которых содержит домен СН1 и шарнирную область, где в первой тяжелой цепи:
a) цистеин в домене СН1, который образует межцепочечную дисульфидную связь с цистеином в легкой цепи, заменен на другую аминокислоту; и
b) одна или несколько аминокислот, расположенных в шарнирной области, заменены на цистеин;
где часть или вся вторая тяжелая цепь имеет отличающуюся аминокислотную последовательность относительно указанной первой тяжелой цепи, по меньшей мере, в области вне вариабельной области.
Без связи с теорией полагают, что область СН3 IgG4-антител обладает функцией участия в динамическом процессе обмена. Таким образом, замена области СН3 в антителе не класса IgG4 на домен СН3 из IgG4-антитела может привести к тому, что мутантное антитело будет больше подвержено обмену.
В одном из вариантов осуществления один или несколько цистеин(ов), которые в природе вовлечены в образование межцепочечной дисульфидной связи между легкой цепью и тяжелой цепью, заменен на аминокислоту, не являющуюся цистеином, как описано в WO 2005/003170 и WO 2005/003171, обе из которых включены в настоящее описание в качестве ссылок.
В одном из вариантов осуществления легкая цепь каппа человека в антителе или его фрагменте в соответствии с настоящим изобретением имеет один или несколько из остатков 171, 156, 202 или 203, замененных, как описано в WO 2008/038024, включенной в настоящее описание в качестве ссылки.
Квалифицированному специалисту будет понятно, что мутации, внесенные в IgG4-антитело, также можно вносить в другие изотипы или классы антител, которые имеют такое же расположение дисульфидных связей, как и у IgG4-антитела, чтобы получить усовершенствованное антитело. Конкретные примеры антител, которые обладают таким же расположением дисульфидных связей, как и у IgG4антитела, представляют собой IgG3-антитела, IgM-антитела и IgD-антитела. Как показано на фиг. 1b, IgG3 и IgM имеют цистеин в положении 127 в домене СН1, и IgD имеет цистеин в положении 128 в домене СН1, который является эквивалентным С127 в домене СН1 IgG4, который формирует межцепочечную дисульфидную связь с цистеином в легкой цепи. Кроме того, также из фиг. 1b можно видеть, что верхние шарнирные области IgG3 и IgD и С-концевая область домена СН1 и N-концевая область домена СН2 в IgM не содержат остаток цистеина, который эквивалентен остаткам верхней шарнирной области IgG1. Таким образом, настоящее изобретение, кроме того, относится к IgG3-антителу, IgD-антителу и IgM-антителу, где цистеин в домене СН1, который формирует межцепочечную дисульфидную связь с
- 7 033720 цистеином в легкой цепи, заменен на другую аминокислоту, и где одна или несколько аминокислот, которые находятся в положении, структурно аналогичном верхней шарнирной области IgG1 или IgG4, заменены на цистеин. Эти мутантные тяжелые цепи можно использовать, например, в качестве второй тяжелой цепи антител по изобретению.
В одном из вариантов осуществления антитело по изобретению содержит две тяжелые цепи класса IgG4.
В одном из вариантов осуществления антитело по настоящему изобретению дополнительно содержит две легких цепи.
В одном из вариантов осуществления антитело по настоящему изобретению содержит две вариабельные области.
В одном из вариантов осуществления две вариабельные области имеют одинаковую специфичность, иными словами, они являются специфичными в отношении одного и того же антигена.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к асимметричному смешанному антителу, где вариабельные области обладают различной специфичностью, т.е. к биспецифическому антителу. Иными словами, когда антитело содержит две вариабельных области тяжелой цепи, каждая вариабельная область является специфичной к отличающемуся антигену.
В одном из вариантов осуществления каждая вариабельная область независимо может связывать антиген-мишень.
Настоящий формат антитела является преимущественным, поскольку он легко доступен с помощью общепринятых способов получения антител и с использованием природных механизмов.
В одном из вариантов осуществления один или оба С-конца тяжелой цепи слиты с доменным антителом, например, со специфичностью в отношении другого антигена, т.е. антигена, в отношении которого не являются специфичными вариабельные области тяжелых цепей.
Единичные вариабельные домены, также известные как однодоменные антитела или dAb для применения в рамках настоящего изобретения, можно получать с использованием способов, известных в данной области, и они включают антитела, описанные в WO 2005118642, Ward et al., 1989, Nature, 341, 544-546, и Holt et al., 2003, Trends in Biotechnology, 21, 484-490. В одном из вариантов осуществления однодоменное антитело для применения в рамках настоящего изобретения представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи (VH) или вариабельный домен легкой цепи (VL). Каждый домен легкой цепи может представлять собой домен либо подгруппы каппа, либо подгруппы лямбда. Способы выделения доменов VH и VL описаны в данной области, см., например, ЕР 0368684 и Ward et al., выше. Такие домены могут происходить из любого подходящего вида или исходной модели антитела. В одном из вариантов осуществления однодоменное антитело может происходить из грызуна, человека или другого вида. В одном из вариантов осуществления однодоменное антитело является гуманизированным.
В одном из вариантов осуществления однодоменное антитело получено из библиотеки фагового дисплея с использованием способов, описанных, например, в WO 2005/118642, Jespers et al., 2004, Nature Biotechnology, 22, 1161-1165 и Holt et al., 2003, Trends in Biotechnology, 21, 484-490. Предпочтительно такие однодоменные антитела являются полностью человеческими, однако могут происходить из других видов. Будет понятно, что последовательность однодоменного антитела после выделения можно модифицировать для улучшения характеристик однодоменного антитела, например растворимости, как описано в Holt et al., выше.
В одном из вариантов осуществления одно или каждое доменное антитело представляет собой VH или VHH.
В одном из вариантов осуществления существует два доменных антитела, каждое из которых является слитым с одной тяжелой цепью, где два доменных антитела формирует пару VH/VL, которая связывается с антигеном, в отношении которого они совместно являются специфичными.
В одном из вариантов осуществления антитело по изобретению является выделенным, иными словами, оно не находится в организме человека или животного.
Термины белок и полипептид используют в рамках настоящего изобретения взаимозаменяемо, если контекст не указывает на иное. Подразумевают, что пептид относится к 10 или менее аминокислотам.
Термины полинуклеотид включает ген, ДНК, кДНК, РНК, мРНК и т.д., если контекст не указывает на иное.
Как используют в рамках изобретения, термин содержащий в контексте настоящего описания следует интерпретировать как включающий.
Термин дикий тип в контексте настоящего изобретения означает антитело, которое встречается в природе или может быть выделено из окружающей среды, которое не содержит никакой внесенной способами генной инженерии мутации.
Обозначение мутанта с заменой в настоящем описании состоит из буквы, за которой следует номер, за которым следует буква. Первая буква обозначает аминокислоту в белке дикого типа. Номер относится к положению аминокислоты, где внесена аминокислотная замена, а вторая буква обозначает аминокислоту, которую используют для замены аминокислоты дикого типа.
- 8 033720
Остатки в вариабельных и константных доменах антител обычно нумеруют в соответствии с системой, разработанной Kabat et al. Эта система представлена в Kabat et al., 1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, США (далее Kabat et al. (выше)).
Обозначения остатков по Kabat не всегда прямо соответствуют линейной нумерации аминокислотных остатков. Фактическая линейная аминокислотная последовательность может содержать меньшее количество или дополнительные аминокислоты, чем в точной нумерации Kabat, что соответствует укорочению или вставке структурного компонента, либо каркасной области, либо определяющей комплементарность области (CDR) основной структуры вариабельного домена. Правильную нумерацию остатков по Kabat можно определять для данного антитела путем выравнивания гомологичных остатков в последовательности антитела со стандартной пронумерованной по Kabat последовательностью. Альтернативно нумерацию аминокислотных остатков можно проводить с помощью индекса EU или системы нумерации EU (также описанных в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)).
Следующей системой нумерации аминокислотных остатков в антителах является система нумерации IMGT (Lefranc, M.P. et al., Dev. Comp. Immunol., 29, 185-203 (2005)).
В настоящем описании используют систему нумерации Kabat, за исключением тех случаев, где указано, что используют систему нумерации EU или систему нумерации IMGT.
Между четырьмя изотипами IgG внутрицепочечное расположение дисульфидных связей в тяжелой цепи и легкой цепи является сходным, в то время как расположение межцепочечных дисульфидных связей является уникальным для каждого изотипа (рассмотрено Wypych, J., Li, M., Guo, A., Zhang, Z., Martinez, Т., Allen,M.J., Fodor, S., Keiner, D.N., Flynn, G.C, Liu, Y.D., Bondarenko, P.V., Ricci, M.S., Dillon, T.M., Balland, A., 2008. Human IgG2 antibodies display disulphide-mediated structural isoforms. J Biol Chem. 283, 16194-16205).
Как показано на фиг. 1b, последовательности шарнирной области четырех изотипов IgG различаются. Полная или генетическая шарнирная область, как правило, состоит из остатков 226-251 (нумерация на основе системы нумерации Kabat). На фиг. 1b представлены верхний, центральный и нижний отделы шарнирных областей четырех изотипов IgG. Для изотипа IgG1 верхняя шарнирная область представляет собой остатки 226-238, центральная шарнирная область представляет собой остатки 239-243, и нижняя шарнирная область представляет собой остатки 244-251. Для изотипа IgG4 верхняя шарнирная область представляет собой остатки 226-238, центральная шарнирная область представляет собой остатки 239243 и нижняя шарнирная область представляет собой остатки 244-251.
Таким образом, шарнирная область, содержащая верхнюю шарнирную область, центральную шарнирную область и нижнюю шарнирную область, в IgG1 имеет длину 23 аминокислоты, как показано на фиг. 1а. Верхняя шарнирная область представляет собой 10 аминокислот. Центральная шарнирная область представляет собой 5 аминокислот, и нижняя шарнирная область представляет собой 8 аминокислот (см., например, фиг. 1b).
Шарнирная область, содержащая верхнюю шарнирную область, центральную шарнирную область и нижнюю шарнирную область в IgG4, имеет длину 20 аминокислот, как показано на фиг. 1а. Верхняя шарнирная область представляет собой 7 аминокислот. Центральная шарнирная область представляет собой 5 аминокислот, и нижняя шарнирная область представляет собой 8 аминокислот (см., например, фиг. 1b).
Новые мутантные IgG4-антитела в соответствии с настоящим изобретением были разработаны путем модификации расположения межцепочечных дисульфидных связей в IgG4, в частности модифицированы расположения межцепочечных дисульфидных связей CL-CH1 между легкой цепью (LC) и тяжелой цепью (НС).
На фиг. 1b представлены отделы последовательностей тяжелой и легкой цепей IgG человека для 1-4 изотипов IgG, на которых указаны положения цистеина (подчеркнуты), которые формируют межцепочечные дисульфидные связи CL-CH1. Межцепочечная дисульфидная связь CL-CH1 в IgG1 образована между LC C214 (система нумерации Kabat) и С233 (система нумерации Kabat) в НС непосредственно перед шарнирной областью. Напротив, дисульфидная связь CH1-CL для IgG2, 3 и 4 образуется между LC С214 и С127, N-концевым относительно внутрицепочечной дисульфидной связи в НС. Последовательности LC и НС, окружающие остатки цистеина, вовлеченные в образование дисульфидной связи CL-CH1, представлены и выровнены на фиг. 1b.
В рамках настоящего изобретения проводили исследование того, как дисульфидная связь CL-CH1 влияет на свойства IgG4-антитела, включая термостабильность, структурную стабильность, гетерогенность дисульфидных связей изоформ, аффинность и обмен половинными молекулами в антителе.
Мутанты IgG4 можно получать путем замены остатка цистеина в положении 127 СН1 другой аминокислотой, а также путем замены одной или нескольких аминокислот в верхней шарнирной области, предпочтительно аминокислот в положениях, выбранных из 227, 228, 229 и 230, пронумерованных по системе нумерации Kabat для IgG4, на цистеин. Положения 227, 228, 229 или 230 находятся в или вблизи эквивалентного структурного положения, в котором расположен цистеин 233 IgG1.
Каждая тяжелая цепь может содержать дополнительные мутации, включающие замену одного или
- 9 033720 обоих из остатков цистеина 239 и 242 в шарнирной области IgG4 на другую аминокислоту. Также в некоторые антитела может быть включена мутация для удлинения верхней шарнирной области IgG4 на три аминокислоты между положениями 238 и 239 так, чтобы они имели ту же длину, что и шарнирная область IgG1. Также в некоторые антитела вносили мутацию S241P.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления предусматривается IgG4-антитело, в котором цистеин 127 заменен на другую аминокислоту, и цистеин легкой цепи связан через дисульфидную связь с модифицированным способом инженерии цистеином в положении 227, 228, 229 или 230.
В одном из вариантов осуществления верхняя шарнирная область и центральная шарнирная область выбраны из следующих последовательностей:
ESKYGPPCPSCP SEQ ID N0:108; ESKYGDKCPSCP SEQ ID N0:109;
EPSKYGPPCPSCP SEQ ID N0:110; EPSKYGDKCPSCP SEQ ID N0:111;
ESKSYGPPCPSCP SEQ ID N0:112; ESKSYGDKCPSCP SEQ ID N0:113;
ESKYGPPAACPSCP SEQ ID N0:114; ESKYGPPGGCPSCP SEQ ID N0:115;
ESKYGPPHTCPSCP SEQ ID N0:116; ESKYGDKHTCPSCP SEQ ID N0:117;
EPSKYGPPAACPSCP
SEQ
ID
N0:118;
EPSKYGPPGGCPSCP
SEQ
ID
N0:119;
EPSKYGPPHTCPSCP
SEQ
ID
N0:120;
EPSKYGDKHTCPSCP
SEQ
ID
N0:121;
ESKSYGPPAACPSCP
SEQ
ID
N0:122;
ESKSYGPPGGCPSCP
SEQ
ID
N0:123;
ESKSYGPPHTCPSCP
SEQ
ID
N0:124;
ESKSYGDKHTCPSCP
SEQ
ID
N0:125;
ESKYGPPACPSCP SEQ ID N0:126; ESKYGPPGCPSCP SEQ
ID N0:127;
ESKYGPPTTCPSCP SEQ ID N0:128; ESKYGDKTTCPSCP SEQ ID N0:129;
EPSKYGPPACPSCP SEQ ID N0:130; EPSKYGPPGCPSCP SEQ ID N0:131;
EPSKYGPPTTCPSCP SEQ ID N0:132; EPSKYGDKTTCPSCP SEQ ID N0:133;
ESKSYGPPACPSCP SEQ ID N0:134; ESKSYGPPGCPSCP SEQ ID N0:135;
ESKSYGPPTTCPSCP SEQ ID N0:136; ESKSYGDKTTCPSCP SEQ ID N0:137;
ESKYGPPTHCPSCP SEQ ID N0:138; ESKYGDKTHCPSCP SEQ ID N0:139;
EPSKYGPPTHCPSCP SEQ ID N0:140; EPSKYGDKTHCPSCP SEQ ID N0:141;
ESKSYGPPTHCPSCP SEQ ID N0:142; ESKSYGDKTHCPSCP SEQ ID N0:143;
ESKYGPPHTCPSCP SEQ ID N0:144; ESKYGDKHTCPSCP SEQ ID N0:145;
EPSKYGPPHTCPSCP SEQ ID N0:146; EPSKYGDKHTCPSCP
SEQ ID N0:147;
ESKSYGPPHTCPSCP SEQ ID N0:148; ESKSYGDKHTCPSCP
SEQ ID N0:149;
ESKYGPPTCPSCP SEQ ID N0:150; ESKYGDKTCPSCP SEQ
ID N0:151;
EPSKYGPPTCPSCP SEQ ID N0:152; EPSKYGDKTCPSCP SEQ ID N0:153;
ESKSYGPPTCPSCP SEQ ID N0:154; ESKSYGDKTCPSCP SEQ ID N0:155;
ESKYGPPHCPSCP SEQ ID N0:156; ESKYGDKHCPSCP SEQ ID N0:157;
EPSKYGPPHCPSCP SEQ ID N0:158; EPSKYGDKHCPSCP SEQ ID N0:159;
ESKSYGPPHCPSCP SEQ ID N0:160; ESKSYGDKHCPSCP SEQ ID N0:161;
EPKSCDKAACPPCP SEQ ID N0:162; EPKSCDKGGCPPCP SEQ ID N0:163;
EPKSCDKHTSPPCP SEQ ID N0:164; EPKSCDKHTCPPSP SEQ ID N0:165;
EPKSCDKHTSPPSP SEQ ID N0:166; EPKSCDKAASPPCP SEQ ID N0:167;
EPKSCDKAACPPSP SEQ ID N0:168; EPKSCDKAASPPSP SEQ ID N0:169;
EPKSCDKGGSPPCP SEQ ID N0:170; EPKSCDKGGCPPSP SEQ ID N0:171;
EPKSCDKGGSPPSP SEQ ID N0:172; EPKSCDKACPPCP SEQ ID N0:173;
- 10 033720
EPKSCDKGCPPCP SEQ ID N0:174; EPKSCDKTSPPCP SEQ ID N0:175
EPKSCDKTCPPSP SEQ ID N0:176; EPKSCDKTSPPSP SEQ ID N0:177
EPKSCDKASPPCP SEQ ID N0:178; EPKSCDKACPPSP SEQ ID N0:179
EPKSCDKASPPSP SEQ ID N0:180; EPKSCDKGSPPCP SEQ ID N0:181
EPKSCDKGCPPSP SEQ ID N0:182; EPKSCDKGSPPSP SEQ ID N0:183
EPKSCDKCPPCP SEQ ID N0:184; EPKSCDKCPPCP SEQ ID N0:185;
EPKSCDKSPPCP SEQ ID N0:186; EPKSCDKCPPSP SEQ ID N0:187;
EPKSCDKSPPSP SEQ ID N0:188; EPKSCDKSPPCP SEQ ID N0:189;
EPKSCDKCPPSP SEQ ID N0:190; EPKSCDKSPPSP SEQ ID N0:191;
EPKSCDKSPPCP SEQ ID N0:192; EPKSCDKCPPSP SEQ ID N0:193;
EPKSCDKSPPSP SEQ ID N0:194; EPKSCDKTTSPPCP SEQ : ID N0:195
N0:196;
EPKSCDKTTCPPSP
SEQ
ID
EPKSCDKTTSPPSP SEQ ID N0:197;
EPKSCDKTHSPPCP
SEQ
ID
N0:198;
EPKSCDKTHCPPSP SEQ ID N0:199;
EPKSCDKTHSPPSP
SEQ
ID
N0:200;
ESKYGPPCPPCP SEQ ID N0:201;
ESKYGPPCPPCP SEQ ID N0:202; ESKYGPPCPPCP SEQ ID N0:203
ESKYGDKCPPCP SEQ ID N0:204; EPSKYGPPCPPCPSEQ ID N0:205;
EPSKYGPPCPPCP SEQ ID N0:206; EPSKYGPPCPPCP SEQ ID N0:207
EPSKYGDKCPPCP SEQ ID N0:208; ESKSYGPPCPPCP SEQ ID N0:209
ESKSYGPPCPPCP SEQ ID N0:210; ESKSYGPPCPPCP SEQ ID N0:211
N0:212;
ESKYGPPAACPPCP SEQ ID N0:213
ESKSYGDKCPPCP
SEQ
ID
ESKYGPPGGCPPCP SEQ ID N0:214; ESKYGPPHTCPPCP SEQ ID N0:215;
ESKYGDKHTCPPCP SEQ ID N0:216; EPSKYGPPAACPPCP SEQ ID N0:217;
EPSKYGPPGGCPPCP SEQ ID N0:218; EPSKYGPPHTCPPCP SEQ ID N0:219
EPSKYGDKHTCPPCP SEQ ID N0:220; ESKSYGPPAACPPCP SEQ ID N0:221
ESKSYGPPGGCPPCP SEQ ID N0:222; ESKSYGPPHTCPPCP SEQ ID N0:223
ESKSYGDKHTCPPCP SEQ ID N0:224; ESKYGPPACPPCP SEQ ID ' N0:225;
ESKYGPPGCPPCP SEQ ID N0:226; ESKYGPPTTCPPCP SEQ ID N0:227;
ESKYGDKTTCPPCP SEQ ID N0:228; EPSKYGPPACPPCP SEQ ID N0:229;
EPSKYGPPGCPPCP SEQ ID N0:230; EPSKYGPPTTCPPCP
EPSKYGDKTTCPPCP SEQ ID N0:232; ESKSYGPPACPPCP
ESKSYGPPGCPPCP SEQ ID N0:234; ESKSYGPPTTCPPCP
ESKSYGDKTTCPPCP SEQ ID N0:236; ESKYGPPTHCPPCP
ESKYGDKTHCPPCP SEQ ID N0:238; EPSKYGPPTHCPPCP
SEQ ID N0:231
SEQ ID N0:233
SEQ ID N0:235
SEQ ID N0:237
SEQ ID N0:239
EPSKYGDKTHCPPCP SEQ ID N0:240; ESKSYGPPTHCPPCP SEQ ID N0:241;
ESKSYGDKTHCPPCP SEQ ID N0:242; ESKYGPPHTCPPCP SEQ ID N0:243;
ESKYGDKHTCPPCP SEQ EPSKYGDKHTCPPCP SEQ
ID
ID
N0:244;
N0:246;
EPSKYGPPHTCPPCP SEQ ID N0:245 ESKSYGPPHTCPPCP SEQ ID N0:247;
ESKSYGDKHTCPPCP SEQ
ID
N0:248;
ESKYGPPTCPPCP SEQ ID N0:249;
ESKYGDKTCPPCP SEQ ID N0:250; EPSKYGPPTCPPCP SEQ ID N0:251;
EPSKYGDKTCPPCP SEQ ID N0:252; ESKSYGPPTCPPCP SEQ ID N0:253;
ESKSYGDKTCPPCP SEQ ID N0:254; ESKYGPPHCPPCP SEQ ID N0:255;
ESKYGDKHCPPCP SEQ ID N0:256; EPSKYGPPHCPPCP SEQ ID N0:257;
EPSKYGDKHCPPCP SEQ ID N0:258; ESKSYGPPHCPPCP SEQ ID N0:259;
ESKSYGDKHCPPCP SEQ ID N0:260; EPKSCDKTHTCPPCP SEQ ID N0:261;
EPKSCDKTHTCPSCP SEQ ID N0:262; ESKYCPPACPSCP SEQ ID N0:263;
ESKYCPPAACPSCP SEQ ID N0:264; ESKYCPPAAACPSCP SEQ ID N0:265;
ESKYCPPAAASPSCP SEQ ID N0:266; ESKYCPPAAACPSSP SEQ ID N0:267;
ESKCGPPAAACPSCP SEQ ID N0:268; ESKYCPPAAAACPSCP SEQ ID N0:269;
ESKYCPPAAAAACPSCP SEQ ID N0:270; ESKYCPPGGGCPSCP SEQ ID N0:271;
ESKYCPPSSSCPSCP SEQ ID N0:272; ESKYCPPTCPSCP SEQ ID N0:273;
ESKYCPPTHCPSCP SEQ ID N0:274; ESKYCPPTHTCPSCP SEQ ID N0:275;
ESKYCPKTHTCPSCP SEQ ID N0:276; ESKYCDKTHTCPSCP SEQ
ID N0:277;
ESKYCDKTHCPSCP SEQ ID N0:278; ESKYCDKTCPSCP SEQ ID
N0:279;
ESKYCDKAAACPSCP SEQ
ID N0:280; ESKYCDKCPSCP SEQ ID
N0:281;
ID N0:283;
ID N0:282; EPKYCDKTHTCPSCP SEQ
ESKSCDKTHTCPSCP SEQ
EPKSCPPCPSCP SEQ ID N0:284; ESKSCPPCPSCP SEQ ID N0:285
EPKYCPPCPSCP SEQ ID N0:286; ECKYGPPCPSCP SEQ ID N0:287
ECKYGPPSPSCP SEQ ID N0:288; ECKYGPPCPSSP SEQ ID N0:289
ESCYGPPCPSCP SEQ ID N0:290; ESCYGPPSPSCP SEQ ID N0:291
ESCYGPPCPSSP SEQ ID N0:292; ESKCGPPCPSCP SEQ ID N0:293
ESKCGPPSPSCP SEQ ID N0:294; ESKCGPPCPSSP SEQ ID N0:295
- 11 033720
В одном из вариантов осуществления центральная шарнирная область в одной или обеих последовательностях тяжелой цепи или ее фрагментов имеет последовательность СРРСР SEQ ID NO: 322.
Без связи с теорией полагают, что эта последовательность, вероятно, блокирует динамический обмен плеч антитела при концентрациях, подобных концентрациям in vivo, например при концентрации восстановителя менее 0,5 мМ, в частности концентрации восстановителя порядка 5 мкМ считают физиологически значимыми (Zilmer et al., 2005, Drug Design Reviews vol. 2, no. 2, pp. 121-127, 2005).
Мутации антител по настоящему изобретению далее описаны подробно. Способы замены аминокислот хорошо известны в области молекулярной биологии. Такие способы включают, например, сайтнаправленный мутагенез с использованием способов, таких как ПЦР, для удаления и/или замены аминокислот или для конструирования синтетических последовательностей de novo.
На фиг. 2а представлены остатки шарнирной области IgG1 дикого типа, IgG4 дикого типа и положения, в которых в антителах по настоящему изобретения внесены мутации. Нумерация основана на системе нумерации Kabat.
Антитела в соответствии с настоящим изобретением содержат мутацию в положении 127 (С127), где остаток цистеина заменен на другую аминокислоту, предпочтительно аминокислоту, которая не содержит тиольную группу. Под заменой или замещением авторы настоящего изобретения подразумевают, что, когда обычно в природе встречается межцепочечный цистеин 127 в тяжелой цепи антитела, вместо него находится другая аминокислота. Мутация в положении С127 может представлять собой любую подходящую мутацию одного, двух или трех нуклеотидов, кодирующих аминокислоту в положении 127, которая заменяет аминокислотный остаток с цистеина на другую подходящую аминокислоту. Примеры подходящих аминокислот включают серин, треонин, аланин, глицин или любую полярную аминокислоту. Особенно предпочтительной аминокислотой является серин.
Замена цистеина в положении 127 другой аминокислотой удаляет цистеин из домена СН1, который обычно формирует дисульфидную связь с цистеином в легкой цепи IgG4 дикого типа. Таким образом, для формирования пары легкой цепи и тяжелой цепи посредством межцепочечной дисульфидной связи легкая цепь должна образовывать дисульфидную связь с цистеином, который расположен в шарнирной области тяжелой цепи.
В первом аспекте изобретения антитела в соответствии с настоящим изобретением содержат тяжелую цепь, где одна или несколько из аминокислот в положениях, выбранных из 227, 228, 229 и 230, пронумерованных по системе нумерации Kabat, заменена на цистеин. Таким образом, антитела в соответствии с настоящим изобретением могут содержать одну или несколько из следующих мутаций: S227C; K228Q Y229C; G230C.
Предпочтительно только один остаток, выбранный из 227, 228, 229 и 230, заменен на остаток цистеина.
Особенно предпочтительные антитела по настоящему изобретению содержат мутацию Y229C или G230C.
Включение остатка цистеина в положение, выбранное из 227, 228, 229 и 230, в шарнирной области тяжелой цепи обеспечивает новое положение для образования межцепочечной дисульфидной связи между тяжелой цепью и легкой цепью.
В антитела согласно этому аспекту настоящего изобретения можно вносить дополнительные мутации. В одном из вариантов осуществления цистеин в положении 239 (С239) и/или цистеин в положении 242 (С242), пронумерованные по системе нумерации Kabat, в тяжелой цепи заменены на другую аминокислоту, предпочтительно аминокислоту, которая не содержит тиольной группы. Под заменой или замещением авторы настоящего изобретения подразумевают, что, когда цистеин 239 и/или цистеин 242 обычно встречаются в тяжелой цепи антитела, вместо него находится другая аминокислота. Мутация в положениях С239 и/или С242 может представлять собой любую подходящую мутацию одного, двух или трех нуклеотидов, кодирующих аминокислоту, которая заменяет остаток аминокислоты с цистеина на другую подходящую аминокислоту. Примеры подходящих аминокислот включают серин, треонин, аланин, глицин или любую полярную аминокислоту. Особенно предпочтительной аминокислотой является серин.
В одном из вариантов осуществления цистеин в положении 239 тяжелой цепи заменен на другую аминокислоту и цистеин в положении 242 тяжелой цепи заменен на другую аминокислоту. В этом варианте осуществления замена как С239, так и С242 удаляет оба остатка цистеина в шарнирной области тяжелой цепи, которые обычно формируют дисульфидные связи между тяжелыми цепями с соответствующими остатками цистеина в другой тяжелой цепи. Полученные половинные молекулы могут образовывать целые молекулы антитела путем образования нековалентных связей между двумя тяжелыми цепями.
В альтернативном варианте осуществления цистеин в положении 239 тяжелой цепи заменен на другую аминокислоту. В этом варианте осуществления цистеин в положении 242 не заменен на другую аминокислоту.
В следующем альтернативном варианте осуществления цистеин в положении 242 тяжелой цепи заменен на другую аминокислоту. В этом варианте осуществления цистеин в положении 239 не заменен на
- 12 033720 другую аминокислоту.
Замена либо С239, либо С242, приводит к тому, что в тяжелой цепи остается один остаток цистеина, который способен образовывать дисульфидную связь между тяжелыми цепями с цистеином в другой тяжелой цепи. Без связи с теорией, полагают, что замена одного остатка цистеина в шарнирной области, в частности, замена С239, уменьшает образование внутрицепочечной дисульфидной связи в шарнирной области и, таким образом, может снижать образование молекул половинных антител.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения пролин в положении 240 может быть заменен на другую аминокислоту.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения серин в положении 241 может быть заменен на другую аминокислоту.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, где серин в положении 227 заменен на цистеин, антитело предпочтительно не содержит мутаций в положениях С239 и С242. В другом варианте осуществления, где серин в положении 227 заменен на цистеин, цистеин в положении 239 тяжелой цепи предпочтительно заменен на другую аминокислоту, однако цистеин в положении 242 не заменен на другую аминокислоту.
В одном из вариантов осуществления антитела по настоящему изобретению содержат тяжелую цепь IgG4, в которую внесена мутация для встраивания одной или нескольких аминокислот между аминокислотами 226-243. Количество встроенных аминокислот может составлять от 1 до 10, от 1 до 5, от 1 до 3, предпочтительно встраивают 1, 2, 3 или 4 аминокислоты. Аминокислоты предпочтительно встраивают между аминокислотами 238 и 239. В шарнирной области можно встраивать любые подходящие аминокислоты, такие как аланин, глицин, серин или треонин и их комбинации. Предпочтительно встраивают три остатка аланина (ААА), три остатка глицина (GGG), три остатка серина (SSS) или три остатка треонина (ТТТ) или треонин, гистидин и еще один треонин (ТНТ). Полагают, что антитела по настоящему изобретению, содержащие тяжелую цепь IgG4, в которую внесена мутация для встраивания трех аминокислот в шарнирной области, демонстрируют увеличенную стабильность, например термостабильность.
Следующей мутацией, которую вносят в антитела в соответствии с настоящим изобретением, является мутация S241P. Ранее было показано, что эта мутация уменьшает образование половинных молекул при биологически характерных концентрациях (Angal, S. et al., 1993. A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human (IgG4) antibody. Mol Immunol, 30, 105-108). Неожиданно было открыто, что мутантные антитела по настоящему изобретению, которые содержат мутацию S241P, демонстрируют некоторый обмен тяжелыми цепями in vitro в жестких восстанавливающих условиях по сравнению с IgG4 P (IgG4 с S241P). Это позволяет получение биспецифических антител in vitro из мутантных IgG4-антител по настоящему изобретению.
Антитела в соответствии с настоящим изобретением могут содержать одну или несколько дополнительных мутаций в шарнирной области. Например, антитела могут дополнительно содержать одну или несколько из следующих мутаций: S227P, Y229S, P237D и P238K.
В одном из вариантов осуществления антитело в соответствии с настоящим изобретением, по существу, содержит шарнирную область IgG1 в остатках 226-243 (верхняя шарнирная область и центральная шарнирная область). Таким образом, антитело по настоящему изобретению содержит шарнирную область, где глицин в положении 230 заменен на цистеин, серин в положении 227 заменен на пролин, тирозин в положении 229 заменен на серин, пролин в положении 237 заменен на аспарагиновую кислоту, пролин в положении 238 заменен на лизин, аминокислотная последовательность треонин-гистидинтреонин встроена между положениями 238 и 239, и серин в положении 241 заменен на пролин. Эти мутации также могут быть обозначены как S227P, Y229S, G230C, P237D, P238KTHT и S241P, как показано на фиг. 2а.
Антитело в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно имеет нижнюю шарнирную область IgG4 в остатках с 244 по 251 (APEFLGGP SEQ ID NO: 321). Без связи с теорией полагают, что нижняя шарнирная область IgG4 вносит вклад в отсутствие эффекторной функции IgG4-антитела.
Во втором аспекте настоящего изобретения асимметричное смешанное антитело по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь, где цистеин в положении 127 заменен на другую аминокислоту, как описано выше, и цистеин в положении 239 или цистеин в положении 242 при нумерации по системе нумерации Kabat в тяжелой цепи заменен на другую аминокислоту. В этом втором аспекте ни один из остатков в положениях 227, 228, 229 и 230 не замещен остатком цистеина. Таким образом, предусматривается:
асимметричное смешанное антитело, содержащее две тяжелые цепи, каждая из которых содержит, по меньшей мере, вариабельную область, шарнирную область и домен СН1, где первая тяжелая цепь или ее фрагмент характеризуется тем, что она принадлежат классу IgG4 и имеет:
a) межцепочечный цистеин в положении 127 при нумерации по системе нумерации Kabat заменен на другую аминокислоту; и
b) необязательно, цистеин в положении 239 или цистеин в положении 242 при нумерации по системе нумерации Kabat заменен на другую аминокислоту;
- 13 033720 где вторая тяжелая цепь или ее фрагмент характеризуется тем, что она обладает аминокислотной последовательностью, отличающейся от указанной первой тяжелой цепи в области вне вариабельной области.
Во втором аспекте настоящего изобретения антитело может содержать одну или несколько дополнительных мутаций. В одном из вариантов осуществления антитело содержит по меньшей мере первую тяжелую цепь IgG4, в которую внесена мутация для встраивания трех аминокислот между аминокислотами 226-243, предпочтительно между аминокислотами 238 и 239, как описано выше. В следующем варианте осуществления антитело содержит мутацию S241P. В следующем варианте осуществления антитело может дополнительно содержать одну или несколько из следующих мутаций: S227P, Y229S, P237D иP238K.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к асимметричному смешанному антителу, содержащему две тяжелые цепи, каждая из которых содержит вариабельную область, домен Сц1 и шарнирную область (такие как две тяжелые цепи независимо), причем каждая тяжелая цепь независимо содержит последовательность, выбранную из одной из следующих последовательностей: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 и SEQ ID NO: 37.
В одном из вариантов осуществления асимметричное смешанное антитело по настоящему изобретению содержит две тяжелые цепи, каждая из которых содержит вариабельную область, домен СН1 и шарнирную область (такие как две тяжелые цепи независимо), причем каждая тяжелая цепь независимо содержит последовательность, выбранную из одной из следующих последовательностей: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 и SEQ ID NO: 37. Более конкретно, асимметричное смешанное антитело по настоящему изобретению содержит две тяжелые цепи, каждая из которых содержит вариабельную область, домен СН1 и шарнирную область (такие как две тяжелые цепи независимо), каждая тяжелая цепь независимо содержит последовательность, выбранную из одной из следующих последовательностей: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 и SEQ ID NO: 37.
Таким образом, настоящее изобретение относится к асимметричному смешанному антителу, содержащему две тяжелые цепи, каждая из которых содержит вариабельный домен, домен СН1 и шарнирную область, домен СН2 и домен СН3 (такие как две тяжелые цепи независимо), каждая из которых содержит последовательность, независимо выбранную из одной из следующих последовательностей: SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62 и SEQ ID NO: 63.
В одном из вариантов осуществления асимметричное смешанное антитело по настоящему изобретению содержит две тяжелые цепи, каждая из которых содержит вариабельную область, домен СН1 и шарнирную область, где каждая тяжелая цепь независимо содержит SEQ ID NO: 36 (антитело 28Р), SEQ ID NO: 37 (антитело 44Р) или SEQ ID NO: 35 (антитело 48).
В одном из вариантов осуществления асимметричное смешанное антитело по настоящему изобретению содержит две тяжелые цепи, каждая из которых содержит вариабельную область, домен СН1, шарнирную область, домен СН2 и домен СН3, где каждая тяжелая цепь независимо содержит SEQ ID NO: 62 (антитело 28Р), SEQ ID NO: 63 (антитело 44Р) или SEQ ID NO: 61 (антитело 48).
В любом из описанных выше вариантов осуществления вторая тяжелая цепь антитела может быть выбрана из любой последовательности тяжелой цепи, описанной в настоящем описании.
В табл. 1 ниже приведены иллюстративные антитела с мутациями, которые были внесены, по сравнению с последовательностью IgG4 дикого типа. Также табл. 1 включает антитела IgG1 и IgG4 дикого типа и контрольные антитела.
- 14 033720
Таблица 1
Номер антитела Мутации тяжелой цепи (нумерация Rabat) Домен СН1 и шарнирная область SEQ ID N0: сн1, шарнирная область, Сн2 и Сн3 SEQ ID N0:
1 C127S 296 306
2 C127S, C239S 33 59
3 C127S, C242S 34 60
4 C127S, C242S, C239S 297 307
5 G230C 298 308
5Р G230C, S241P 299 309
6 C127S, G230C, C239S 12 38
7 C127S, G230C, C242S 13 39
8 C127S, G230C, C239S, C242S 14 40
9 G230C, C239S 300 310
10 G230C, C242S 301 311
11 G230C, C239S, C242S 302 312
12 C239S 303 313
13 C242S 304 314
14 C239S, C242S 305 315
15 C127S, G230C 15 41
16 C127S, G230C, S241P 16 42
17 IgG4 человека дикого типа 2 -
18 S241P - -
19 IgGl человека дикого типа 1 -
28 C127S Y229C 17 43
28Р C127S Y229C, S241P 36 62
29 C127S Y229C C239S 18 44
30 C127S Y229C C242S 19 45
31 C127S Y229C C239S C242S 20 46
32 C127S К228С 21 47
33 C127S К228С C239S 22 48
34 C127S К228С C242S 23 49
35 C127S К228С C239S C242S 24 50
36 C127S S227C 25 51
37 C127S S227C C239S 26 52
38 C127S S227C C242S 27 53
39 C127S S227C C239S C242S 28 54
44 C127S G230C Ρ238ΡΑΑΆ 29 55
44Р C127S G230C Ρ238ΡΑΑΆ, S241P 37 63
45 C127S G230C Ρ238ΡΑΑΆ C239S 30 56
46 C127S G230C Ρ238ΡΑΑΆ C242S 31 57
47 C127S G230C Ρ238ΡΑΑΆ C239S C242S 32 58
48 C127S, S227P, Y229S, G230C, P237D, Р238КТНТ, S241P 35 61
49 C127S G230C Р238РА
50 C127S G230C Ρ238ΡΑΆ S241P
51 C127S, G230C, Ρ238ΡΑΑΑΆ
52 C127S, G230C, Ρ238ΡΑΑΑΑΆ
55 C127S, G230C, Р238РТНТ
56 C127S, G230C, P237D, Р238КТНТ
57 C127S, G230C, P238PGGG
60 C127S, S227P, G230C
62 C127S, Y229S, G230C
64 C127S, S227P, Y229S, G230C
65 C127S, S227P, Y229S, G230C, P237D, Р238КТНТ
66 C127S, G230C, P237D, Р238КТН
67 C127S, G230C, P237D, Р238КТ
68 C127S, G230C, P237D, Р238К
69 C127S, G230C P237D, Р238КААА
71 C127S, S227P, G230C, P237D, Р238КТНТ
73 C127S, Y229S, G230C, P237D, Р238КТНТ
74 Центральная шарнирная область C127S Y229C, SPPCP
75 Центральная шарнирная область C127S G230C, CPPSP
76 Центральная шарнирная область C127S Y229C, CPPSP
77 Центральная шарнирная область C127S G230C, SPPCP
В одном из вариантов осуществления первую последовательность тяжелой цепи IgG4 комбинируют со второй последовательностью тяжелой цепи IgG4, каждая из которых содержит мутации в СН1 и верхней шарнирной области и последовательности центральной шарнирной области, как описано в табл. 2:
Таблица 2
ПЕРВАЯ ТЯЖЕЛАЯ ЦЕПЬ ВТОРАЯ ТЯЖЕЛАЯ ЦЕПЬ
C127S Y229C (АЬ 28) C127S Y229C S241P (Ab 28Р)
C127S Y229C S241P IgG4 WT
(Ab 28Р)
C127S Y229C (АЬ 28) IgG4 WT
C127S G230C (АЬ 15) C127S G230C S241P (Ab 16)
C127S G230C S241P IgG4 WT
(Ab 15Р)
C127S G230C (АЬ 15) IgG4 WT
C127S + шарнирная область IgGl (АЬ 48) C127S G230C (Ab 15)
C127S + шарнирная область IgGl (Ab 48) C127S G230C S241P (Ab 15P)
C127S + шарнирная область IgGl (7\Ъ 48) C127S Y229C (Ab 28)
C127S + шарнирная область IgGl (АЬ 48) C127S Y229C S241P (Ab 28P)
C127S + шарнирная C127S, S227P, Y229S, G230C, P237D,
область IgGl (АЬ 48) P238KTHT (Ab 65)
Центральная Центральная шарнирная область C127S
шарнирная область Y229C, CPPCP, или центральная шарнирная
C127S Y229C, SPPCP область, CPSCP
(АЬ 74) (Ab 28Р или 28)
Центральная Центральная шарнирная область C127S
шарнирная область Y229C, СРРСР, или центральная шарнирная
C127S Y229C, SPSCP область, CPSCP
(АЬ 29) (Ab 28Р или 28)
Центральная Центральная шарнирная область C127S
шарнирная область G230C, СРРСР, или центральная шарнирная
C127S G230C, SPSCP область, CPSCP
(АЬ 6) (АЬ 16 или 15)
Центральная Центральная шарнирная область C127S
шарнирная область G230C, СРРСР, или центральная шарнирная
C127S G230C, CPPSP область CPSCP
(АЬ 75) (АЬ 16 или 15)
Центральная Центральная шарнирная область C127S
шарнирная область Y229C, СРРСР, или центральная шарнирная
C127S G230C, CPPSP область, CPSCP
(АЬ75) (Ab 28Р или 28)
Центральная Центральная шарнирная область C127S
шарнирная область Y229C, СРРСР, или центральная шарнирная
C127S Y229C, CPPSP область CPSCP
(АЬ 76) (Ab 28Р или 28)
Центральная Центральная шарнирная область C127S
шарнирная область G230C, СРРСР, или центральная шарнирная
C127S Y229C, CPPSP область CPSCP
(АЬ 76) (Ab 16 или 15)
C127S G230C Р238РААА C127S G230C Р238РААА S241P (Ab 44Р)
(АЬ 44)
C127S G230C Р238РААА IgG4 WT Р238РААА
(АЬ 44)
- 16 033720
C127S G230C Р238РААА (АЬ 44) IgG4 WT
C127S G230C Р238РААА S241P (Ab 44Р) IgG4 WT
C127S + шарнирная область IgGl (АЬ 48) IgG4 WT
C127S, S227P, Y229S, G230C, P237D, Р238КТНТ (АЬ 65) IgG4 WT
IgG4 дикого типа (S241) S241G
S241A
S241D
S241E
S241K
S241T
S241P
C127C и Y229C
IgG4 S241G S241A
S241T
S241D
S241E
S241K
IgG4 S241T S241A
IgG4 дикого типа (S241) C239S
C242S
C239C и C242C
C127C и Y229C
IgG4 S241P IgG4 C127S и Y229C IgG4 С239С и С242С C127C и Y229C
S241G
S241A
S241T
S241D
S241E
S241K С239С и С242С S241G S241A S241T S241D S241E S241K С239С и С242С S241G S241A S241T S241D
S241K
S241E
С239С и С242С
C239S
C242S
Таким образом, настоящее изобретение относится к асимметричному смешанному антителу, содержащему две тяжелые цепи, каждая из которых содержит, по меньшей мере, вариабельную область, шарнирную область и домен СН1, где последовательности первой тяжелой цепи и второй тяжелой цепи представляют собой последовательности тяжелой цепи IgG4, выбранные из комбинаций мутаций последовательностей первой и второй тяжелых цепей, приведенных в табл. 2.
Асимметричное смешанное антитело может содержать первую и вторую тяжелые цепи, где каждая константная последовательность тяжелой цепи содержит мутации в домене СН1 и шарнирной области, как описано выше, и где мутации домена СН1 и шарнирной области в каждой тяжелой цепи различаются. Альтернативно, константные последовательности первой тяжелой цепи могут содержать мутации домена СН1 и шарнирной области, как описано выше, и константная последовательность второй тяжелой цепи представляет собой IgG4 дикого типа или IgG4 дикого типа с мутацией S241P.
- 17 033720
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения асимметричное смешанное антитело представляет собой биспецифическое антитело, где каждая тяжелая цепь имеет отличающиеся вариабельные области. Предпочтительно антитело также содержит две легких цепи, где каждая пара тяжелаялегкая цепь (Fab) имеет отличающиеся вариабельные области.
Подразумевают, что отличающиеся вариабельные области, как используют в настоящем описании, относятся к тому, что указанные вариабельные области обладают специфичностью к различным антигенам. Иными словами, антиген, к которому каждая вариабельная область является специфичной, представляет собой отличающийся антиген или часть антигена, например отличающийся эпитоп.
Специфический, как используют в настоящем описании, относится к тому факту, что связывающие домены распознают антиген-мишень с более высокой аффинностью и/авидностью, чем другие антигены, к которым они не являются специфичными (например, 10, 20, 50, 10 или 1000 более). Это необязательно подразумевает, что специфическая связывающая область не связывает какой-либо антиген, не являющийся мишенью, а скорее взаимодействие с мишенью является таким, что его можно использовать для очистки антигена-мишени (в отношении которого она является специфической) из комплексной смеси антигенов, включающей антигены того же семейства белков.
В одном из вариантов осуществления антитело по настоящему изобретению является выделенным.
Выделенный, как используют в настоящем описании, относится к антителу, которое является выделенным из организма человека, например получено рекомбинантными способами, очищено с использованием способа, такого как хроматография, и/или находится в фармацевтическом составе.
Термин антитело, как используют в рамках изобретения, включает интактные (целые) антитела и функционально активные фрагменты, которые содержат две тяжелые цепи, каждая из которых содержит домен VH, домен СН1 и шарнирную область. Антитело в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно содержит по меньшей мере одну легкую цепь. Таким образом, термин антитело в рамках настоящего изобретения охватывает двух-, трех- или четырехвалентные антитела, димер Fab'- и F(ab')2фрагментов и целые молекулы антител, содержащие две пары легких и тяжелых цепей.
Как хорошо известно в данной области, типичная молекула Fab' содержит пару тяжелой и легкой цепи, в которой тяжелая цепь содержит вариабельную область VH, константный домен СН1 и шарнирную область, и легкая цепь содержит вариабельную область VL и константный домен CL.
В одном из вариантов осуществления предусматривается димер Fab' по настоящему изобретению, например димеризация может происходить через шарнирную область.
В одном из вариантов осуществления тяжелая цепь содержит домен СН2 и домен СН3 и, необязательно, домен СН4. В одном из вариантов осуществления антитело содержит две тяжелые цепи, каждая из которых является такой, как определено выше в первом или втором аспекте настоящего изобретения. Антитела в соответствии с настоящим изобретением также предпочтительно содержат две легких цепи, которые могут быть одинаковыми или могут отличаться. В варианте осуществления настоящего изобретения, который относится к биспецифическому антителу, которое содержит две тяжелые цепи, как определено выше, и две легких цепи, две легких цепи имеют различные вариабельные области и могут иметь одинаковые или различные константные области.
В одном из вариантов осуществления в используемые домены СН2 и СН3 можно вносить мутации, например, для уменьшения образования агрегатов IgG4-антител. В US 2008/0063635, Takahashi et al., описано исследование мутанта IgG4, в котором аргинин в положении 409 (409 при нумерации по системе нумерации EU или 440 при нумерации по системе нумерации Kabat) в домене СН3 заменен на лизин, треонин, метионин или лейцин для ингибирования образования агрегата при низком значении рН. Также описаны дополнительные мутации в положениях L235, D265, D270, K322, P329 и P331 (L235, D265, D270, K322, P329 и P331 при нумерации по системе нумерации EU или L248, D278, D283, K341, P348 и P350 при нумерации по системе нумерации Kabat) для ослабления активности CDC. В WO 2008/145142 Van de Winkel et al. описаны стабильные IgG4-антитела, которые обладают сниженной способностью претерпевать обмен Fab-плечами (обозначаемый в настоящем описании как динамический обмен тяжелыми цепями) путем замены остатка аргинина в положении 409, остатка Phe в положении 405 или остатка Lys в положении 370 (R409, F405 и K370 при нумерации по системе нумерации EU или R440, F436 и K393 при нумерации по системе нумерации Kabat), даже в отсутствие мутации S228P (S228 при нумерации по системе нумерации EU или S241 по системе нумерации Kabat) в шарнирной области.
В одном из вариантов осуществления антитело по настоящему изобретению представляет собой целое асимметричное смешанное антитело, содержащее две легких цепи и две тяжелые цепи, где каждая тяжелая цепь содержит IgG4 CH1, где цистеин в положении 127 при нумерации по системе нумерации Kabat заменен на другую аминокислоту, верхнюю и среднюю шарнирные области IgG1, нижнюю шарнирную область IgG4, домен СН2 и домен СН3.
Полная шарнирная область IgG4-антитела, как правило, состоит из остатков 226-251 (нумерация на основе системы нумерации Kabat). Однако шарнирная область может быть укороченной или удлиненной при необходимости. Например, в антителах в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения аминокислота дикого типа заменена на остаток цистеина в положении 227, 228, 229 или 230, шарнирная область может оканчиваться после нового остатка цистеина в положении 227, 228, 229 или 230. Антитела
- 18 033720 в соответствии с настоящим изобретением также могут содержать одну или несколько дополнительных аминокислот, расположенных на N-конце и/или С-конце шарнирной области. Кроме того, можно контролировать другие характеристики шарнирной области, такие как расстояние остатков цистеина(ов) от межцепочечного цистеина легких цепей, расстояние между остатками цистеина шарнирной области, и состав других аминокислот в шарнирной области, которые могут влиять на свойства шарнирной области, такие как гибкость, например, остатки глицина можно включать в шарнирную область для увеличения гибкости при вращении, или остатки пролина можно включать для уменьшения гибкости. Альтернативно в шарнирную область можно включать заряженные или гидрофобные остатки для сообщения свойств мультимеризации или очистки. Другие модифицированные шарнирные области могут быть полностью синтетическими и могут быть сконструированы так, чтобы они обладали желаемыми свойствами, такими как длина, композиция и гибкость.
Домены константной области, в частности, в Fc-домене, когда он присутствует, используемые в рамках настоящего изобретения, предпочтительно представляют собой домены изотипа IgG4, где эффекторные функции антител не требуются. Таким образом, каждая тяжелая цепь предпочтительно содержит домен СН2 и домен СН3 IgG4, как показано в SEQ ID NO: 64.
Будет понятно, что также можно использовать варианты последовательности доменов константной области Fc.
В одном из вариантов осуществления каждая тяжелая цепь содержит домены СН2 и СН3 IgG4, где аргинин в положении 409 (нумерация EU) заменен на лизин, треонин, метионин или лейцин для ингибирования образования агрегата при низких значениях рН (US 2008/0063635 Takahashi et al.) Также описаны мутации L235, D265, D270, K322, P331 и P329 (при нумерации по системе нумерации EU) для ослабления активности CDC (US 2008/0063635 Takahashi et al.).
Каждая тяжелая цепь может содержать мутации, как описано в WO 2008/145142 Van de Winkel et al., где описаны стабильные IgG4-антитела, которые обладают сниженной способностью претерпевать обмен Fab-плечами посредством замены остатка аргинина в положении 409, остатка Phe в положении 405 или остатка Lys в положении 370 (при нумерации по системе нумерации EU).
В одном из вариантов осуществления каждая тяжелая цепь содержит домен СН2 IgG4 и домен СН3 IgG1, как показано в SEQ ID NO: 65.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, где антитело представляет собой мутантное антитело IgG3, IgD или IgM, каждая тяжелая цепь предпочтительно содержит домен СН2 и домен СН3 и, необязательно, домен СН4. В IgG3-антителе каждая тяжелая цепь предпочтительно содержит домен СН2 IgG3 и домен СН3 IgG3. В IgD-антителе каждая тяжелая цепь предпочтительно содержит домен СН2 IgD и домен СН3 IgD. В IgM-антителе каждая тяжелая цепь предпочтительно содержит домен СН2 IgM, домен СН3 IgM и домен СН4 IgM.
В одном из вариантов осуществления антитело представляет собой моноклональный, полностью человеческий, гуманизированный или химерный фрагмент антитела. В одном из вариантов осуществления антитело является полностью человеческим или гуманизированным.
Моноклональные антитела можно получать любым способом, известным в данной области, таким как способ гибридом (Kohler & Milstein, Nature, 1975, 256, 495-497), способ триом, способ В-клеточных гибридом человека (Kozbor et al., Immunology Today, 1983, 4, 72) и способ EBV-гибридомы (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985).
Антитела для применения в рамках изобретения также можно получать с использованием способов антител единичных лимфоцитов путем клонирования и экспрессии кДНК вариабельной области иммуноглобулина, полученной из единичных лимфоцитов, выбранных для продуцирования конкретных антител, например, способами, описанными Babcook, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93(15), 78437848, WO 92/02551, WO 2004/051268 и WO 2004/106377.
Гуманизированные антитела представляют собой молекулы антител из не являющегося человеком вида, имеющие одну или несколько определяющих комплементарность областей (CDR) из не являющегося человеком вида и каркасную область из молекулы иммуноглобулина человека, которая необязательно содержит один или несколько донорных остатков из не являющегося человеком вида (см., например, US 5585089).
Антитела для применения в настоящем изобретении также можно получать с использованием различных способов фагового дисплея, известных в данной области, и включают способы, описанные Brinkman et al., J. Immunol. Methods, 1995, 182, 41-50; Ames et al., J. Immunol. Methods, 1995, 184, 177-186; Kettleborough et al. Eur. J. Immunol., 1994, 24, 952-958; Persic et al., Gene, 1997 187, 9-18 и Burton et al., Advances in Immunology, 1994, 57, 191-280; WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401 и US 5698426; 5223409; 5403484; 5580717; 5427908; 5750753; 5821047; 5571698; 5427908; 5516637; 5780225; 5658727; 5733743 и 5969108. Также для получения гуманизированных антител можно использовать трансгенных мышей или другие организмы, включая других млекопитающих.
Полностью человеческие антитела представляют собой антитела, в которых все вариабельные области и константные области (когда они присутствуют) как тяжелой, так и легкой цепей происходят из
- 19 033720 человека или, по существу, идентичны последовательностям, происходящим из человека, не обязательно из того же антитела. Примеры полностью человеческих антител могут включать антитела, полученные, например, способами фагового дисплея, описанными выше, и антитела, продуцированные мышами, в которых гены вариабельной и/или константной области иммуноглобулинов мыши заменены их аналогами человека, например, как описано в общих терминах в ЕР 0546073 B1, US 5545806, US 5569825, US 5625126, US 5633425, US 5661016, US 5770429, EP 0438474 B1 и ЕР 0463151 B1.
Исходный материал для антител для применения в рамках настоящего изобретения можно получить с использованием способов рекомбинантных ДНК, вовлекающих манипулирование и повторную экспрессию ДНК, кодирующей вариабельную и константную область(и) антитела. Стандартные способы молекулярной биологии можно использовать для модификации, добавления или делеции аминокислот или доменов при желании. Тем не менее, любые изменения вариабельных или константных областей охватываются терминами вариабельные и константные, как используют в рамках изобретения.
Исходный материал антител можно получать из любого вида, включая, например, мышь, крысу, кролика, хомяка, верблюда, ламу, козу или человека. Части антитела можно получать из более чем одного вида, например, антитело может быть химерным. В одном примере константные области происходят из одного вида, и вариабельные области происходят из другого. Исходный материал антител также может быть модифицированным. В другом примере вариабельная область антитела создана с использованием рекомбинантных способов инженерии ДНК. Такие полученные способами инженерии версии включают версии, полученные, например, из природных вариабельных областей антител посредством вставок, делеций или замены одной или нескольких аминокислотных последовательностей природных антител.
Конкретные примеры этого типа включают модифицированные способами инженерии домены вариабельной области, содержащие по меньшей мере одну CDR и, необязательно, одну или несколько каркасных аминокислот из одного антитела и остальную часть вариабельной области домена из второго антитела. Способы получения и изготовления этих антител хорошо известны в данной области (см. например, Boss et al., US 4816397; Cabilly et al., US 6331415; Shrader et al., WO 92/02551; Ward et al., 1989, Nature, 341, 544; Orlandi et al., 1989, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 86, 3833; Riechmann et al., 1988, Nature, 322, 323; Bird et al., 1988, Science, 242, 423; Queen et al., US 5585089; Adair, WO 91/09967; Mountain and Adair, 1992, Biotechnol. Genet. Eng. Rev, 10, 1-142; Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165181).
В одном из вариантов осуществления антитело содержит пару вариабельных доменов, образующих связывающий домен, которая представляет собой когнатную пару. Как используют в настоящем описании, когнатная пара относится к природной паре вариабельных доменов, иными словами, выделенной из одного антитела или экспрессирующей антитело клетки.
Вариабельные домены могут быть оптимизированными и/или гуманизированными.
Оптимизированные/гуманизированные вариабельные домены, происходящие из когнатной пары, все еще считаются когнатной парой после оптимизации/гуманизации.
Таким образом, изобретение относится к молекулам человека, гуманизированным или химерным молекулам.
В одном из вариантов осуществления молекула специфически связывает антиген-мишень. Специфическое связывание, как используют в настоящем описании, относится к молекулам, обладающим высокой аффинностью в отношении антигена-мишени (к которому они являются специфичными) и которые связывают антигены, в отношении которых они не являются специфичными, с низкой или значительно более низкой аффинностью (или не связываются вовсе). Способы измерения аффинности известны специалистам в данной области и включают такие анализы, как BIAcore™.
Удобно, чтобы молекулы антитела по настоящему изобретению обладали высокой аффинностью связывания, в частности наномолярной или пикомолярной. Аффинность можно измерять с использованием любого подходящего способа, известного в данной области, включая BIAcore™. В одном из вариантов осуществления молекула по настоящему изобретению обладает аффинностью связывания приблизительно 100 пМ или лучше. В одном из вариантов осуществления молекула по настоящему изобретению обладает аффинностью связывания приблизительно 50 пМ или лучше. В одном из вариантов осуществления молекула по настоящему изобретению обладает аффинностью связывания приблизительно 40 пМ или лучше. В одном из вариантов осуществления молекула по настоящему изобретению обладает аффинностью связывания приблизительно 30 пМ или лучше. В одном из вариантов осуществления молекула по настоящему изобретению является полностью человеческой или гуманизированной и обладает аффинностью связывания приблизительно 100 пМ или лучше.
Производное природного домена, как используют в рамках настоящего изобретения, относится к случаю, когда одна, две, три, четыре или пять аминокислот в природной последовательности заменены или удалены, например, для оптимизации свойств домена, как например, путем удаления нежелательных свойств, но где характерный признак(и) домена сохранен.
В одном из вариантов осуществления молекулы антитела по настоящему изобретению содержат
- 20 033720 один или несколько связывающих альбумин пептидов. In vivo пептид связывает альбумин, который увеличивает время полужизни молекулы.
Связывающий альбумин пептид может быть присоединен к одной или нескольким вариабельным областям, шарнирной области или С-концу молекулы или любому положению, которое не препятствует антигенсвязывающим свойствам молекул.
Примеры связывающих альбумин пептидов предоставлены в WO 2007/106120.
Также специалисту в данной области будет понятно, что антитело может претерпевать множество посттрансляционных модификаций. Тип и степень этих модификаций часто зависят от линии клетокхозяев, используемой для экспрессии молекулы, а также от условий культивирования. Такие модификации могут включать варьирование гликозилирования, окисления метионина, образования дикетопиперазина, изомеризации аспартата и дезамидации аспарагина. Частой модификацией является утрата Сконцевого основного остатка (такого как лизин или аргинин) под действием карбоксипептидаз (как описано в Harris, R.J. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995).
Если желательно, молекулу для применения в рамках настоящего изобретения можно конъюгировать с одной или несколькими эффекторной молекулой(ами). Будет понятно, что эффекторная молекула может содержать одну эффекторную молекулу или две или более таких молекул, связанных таким образом, чтобы они образовывали одну часть, которая может быть связана с молекулой антитела по настоящему изобретению. Когда желательно получить антитело в соответствии с изобретением, связанное с эффекторной молекулой, его можно получать с помощью стандартных химических методик или методик рекомбинантных ДНК, в которых антитело связывают либо прямо, либо через связывающий агент с эффекторной молекулой. Способы конъюгации таких эффекторных молекул с антителом хорошо известны в данной области (см., Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., Robinson et al., eds., 1987, pp. 623-53; Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev., 62:119-58 и Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123). Конкретные химические методики включают, например, методики, описанные в WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195, WO 89/01476 и WO 03031581. Альтернативно, когда эффекторная молекула представляет собой белок или полипептид, связывание можно осуществлять с использованием методик рекомбинантных ДНК, например, как описано в WO 86/01533 и ЕР 0392745.
Термин эффекторная молекула, как используют в рамках изобретения, включает, например, средства против злокачественной опухоли, лекарственные средства, токсины, биологически активные белки, например ферменты, другие антитела или фрагменты антител, синтетические или природные полимеры, нуклеиновые кислоты и их фрагменты, например ДНК, РНК и их фрагменты, радионуклиды, в частности радиоактивный иод, радиоизотопы, хелатированные металлы, наночастицы и репортерные группы, такие как флуоресцентные соединения или соединения, которые можно обнаруживать с помощью ЯМР- или ESR-спектроскопии.
Примеры эффекторных молекул могут включать цитотоксины или цитотоксические средства, включая любое средство, которое является вредоносным (например, уничтожает) для клеток. Примеры включают комбретастатины, доластатины, эпотилоны, стауроспорин, майтанзиноиды, спонгистатины, ризоксин, халихондрины, роридины, гемиастерлины, таксол, цитохалазин В, грамицидин D, бромид этидия, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрацин дион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, татракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин и их аналоги или гомологи.
Эффекторные молекулы также включают, но ими не ограничиваются, антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-фторурацил декарбазин), алкилирующие средства (например, мехлорэтамин, тиотепа, хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (BSNU) и ломустин (CCNU), циклофосфамид, бусульфан, дибромманнит, стрептозотоцин, митомицин С и цисдихлордиаминплатина (II) (DDP) цисплатин), антрациклины (например, даунорубицин (ранее дауномицин) и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномицин (ранее актиномицин), блеомицин, митрамицин, антрамицин (АМС), калихеамицины или дуокармицины), и антимитотические средства (например, винкристин и винбластин).
Другие эффекторные молекулы могут включать хелатированные радионуклиды, такие как 'In и Ύ, Lu , висмут , калифорний , иридий и вольфрам /рений ; или лекарственные средства, такие как, но не ограничиваясь ими, алкилфосфохолины, ингибиторы топоизомеразы I, таксоиды и сурамин.
Другие эффекторные молекулы включают белки, пептиды и ферменты. Представляющие интерес ферменты включают, но не ограничиваются ими, протеолитические ферменты, гидролазы, лиазы, изомеразы, трансферазы. Представляющие интерес белки, полипептиды и пептиды включают, но не ограничиваются ими, иммуноглобулины, токсины, такие как абрин, рицин А, экзотоксин pseudomonas, или дифтерийный токсин, белок, такой как инсулин, фактор некроза опухоли, α-интерферон, β-интерферон, фактор роста нервов, тромбоцитарный фактор роста или тканевой активатор плазминогена, тромботический агент или антитромботический агент, например ангиостатин или эндостатин, или модификатор биологического ответа, такой как лимфокин, интерлейкин-1 (IL-1), интерлейкин-2 (IL-2), гранулоцитарномакрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), фактор роста нервов (NGF) или другие факторы роста и иммуноглобулины.
- 21 033720
Другие эффекторные молекулы могут включать поддающиеся обнаружению вещества, подходящие, например, для диагностики. Примеры поддающихся обнаружению веществ включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы, биолюминесцентные материалы, радионуклиды, позитронно-активные металлы (для применения в позитронноэмиссионной томографии) и нерадиоактивные парамагнитные ионы металлов (см., главным образом, патент США № 4741900 для ионов металлов, которые можно конъюгировать с антителами для применения в качестве диагностических средств). Подходящие ферменты включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, бета-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; подходящие простетические группы включают стрептавидин, авидин и биотин; подходящие флуоресцентные материалы включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеин изотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламин флуоресцеин, дансилхлорид и фикоэритрин; подходящие люминесцентные материалы включают люминол; пригодные биолюминесцентные материалы включают люциферазу, люциферин и экворин; и подходящие радионуклиды включают 125I, 131I, 111In и 99Tc.
В другом примере эффекторная молекула может увеличивать время полужизни антитела in vivo, и/или снижать иммуногенность антитела, и/или усиливать доставку антитела через эпителиальный барьер в иммунную систему. Примеры подходящих эффекторных молекул этого типа включают полимеры, альбумин, связывающие альбумин белки или связывающие альбумин соединения, такие как соединения, описанные в WO 05/117984.
Когда эффекторная молекула представляет собой полимер, она, как правило, может представлять собой синтетический или природный полимер, например необязательно замещенный прямой или разветвленный полиалкиленовый, полиалкениленовый или полиоксиалкиленовый полимер, или разветвленный или неразветвленный полисахарид, например гомо- или гетерополисахарид.
Конкретные необязательные заместители, которые могут присутствовать на упомянутых выше синтетических полимерах, включают одну или несколько гидрокси, метильных или метоксигрупп.
Конкретные примеры синтетических полимеров включают необязательно замещенный прямой или разветвленный поли(этиленгликоль), поли(пропиленгликоль), поливиниловый спирт или их производные, особенно необязательно замещенный поли(этиленгликоль), такой как метоксиполи(этиленгликоль) или его производные.
Конкретные природные полимеры включают лактозу, амилозу, декстран, гликоген или их производные.
Производные, как используют в рамках изобретения, включают реактивные производные, например тиолселективные реактивные группы, такие как малеинимиды и т.п. Реакционную группу можно связывать с полимером прямо или через линкерный сегмент. Будет понятно, что остаток такой группы в некоторых случаях будет формировать часть продукта в качестве линкерной группы между антителом по изобретению и полимером.
Размер полимера можно варьировать, если желательно, однако, как правило, он имеет диапазон средней молекулярной массы от 500 до 50000 Да, например от 5000 до 40000 Да, как например, от 20000 до 40000 Да. В частности, размер полимера можно выбирать исходя из предполагаемого применения продукта, например, способности локализоваться в определенных тканях, таких как опухоли, или продления половинного времени циркуляции (для обзора см. Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545). Таким образом, например, когда предполагается, что продукт покинет циркуляцию и проникнет в ткань, например, для применения для лечения опухоли, может быть преимущественным использование низкомолекулярного полимера, например, с молекулярной массой приблизительно 5000 Да. Для применений, где продукт остается в кровотоке, может быть преимущественным использование более высокомолекулярного полимера, например, имеющего молекулярную массу в диапазоне от 20000 до 40000 Да.
Подходящие полимеры включают полиалкиленовый полимер, такой как поли(этиленгликоль) или, особенно, метоксиполи(этиленгликоль) или его производное, и особенно с молекулярной массой в диапазоне от приблизительно 15000 до приблизительно 40000 Да.
В одном примере антитело для применения в рамках настоящего изобретения связано с частями поли(этиленгликоля) (PEG) . В одном конкретном примере молекулы PEG могут быть связаны через любую доступную боковую цепь аминокислоты или концевую функциональную группу аминокислоты, расположенную в антителе, например любую свободную амино, имино, тиольную, гидроксильную или карбоксильную группу. Такие аминокислоты могут встречаться естественным образом в антителе или они могут быть встроены способами инженерии в антитело с использованием способов рекомбинантных ДНК (см., например, US 5219996; US 5667425; WO 98/25971). В одном примере молекула по настоящему изобретению представляет собой модифицированное антитело, где модификация представляет собой вставку на С-конце тяжелой цепи одной или нескольких аминокислот, чтобы обеспечить присоединение эффекторной молекулы. Для присоединения двух или более молекул PEG можно использовать множество участков.
В одном из вариантов осуществления молекула PEG связана с цистеином 171 в легкой цепи, например, см. WO 2008/038024, включенную в настоящее описание в качестве ссылки.
- 22 033720
Удобно, чтобы молекулы PEG были ковалентно связаны через тиольную группу по меньшей мере одного остатка цистеина, расположенного в антителе. Каждая молекула полимера, связанная с модифицированным антителом, может быть ковалентно связана с атомом серы остатка цистеина, расположенного в антителе. Ковалентная связь, как правило, представляет собой дисульфидную связь или, в частности, связь сера-углерод. Когда тиольную группу используют в качестве точки присоединения соответствующим образом активированных эффекторных молекул, можно использовать, например, тиолселективные производные, такие как малеинимиды и производные цистеина. В качестве исходного материала для получения модифицированного полимером антитела, как описано выше, можно использовать активированный полимер. Активированный полимер может представлять собой любой полимер, содержащий тиольную реакционноспособную группу, такую как α-галогенкарбоновая кислота или сложный эфир, например иодацетамид, имид, например малеинимид, винилсульфон или дисульфид. Такие исходные материалы можно получать из коммерческих источников (например, от Nektar, ранее Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, США) или их можно получать из коммерчески доступных исходных материалов с использованием общепринятых химических методик. Конкретные молекулы PEG включают 20K метоксиPEG-амин (получаемый от Nektar, ранее Shearwater; Rapp Polymere; и SunBio) и M-PEG-SPA (получаемый от Nektar, ранее Shearwater).
Настоящее изобретение также относится к выделенной ДНК, кодирующей молекулу антитела, описанную в настоящем описании.
В следующем аспекте предусматривается вектор, содержащий указанную ДНК.
Общие способы, посредством которых можно конструировать векторы, способы трансфекции и способы культивирования хорошо известны специалистам в данной области. В этом отношении приводится ссылка на Current Protocols in Molecular Biology, 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York and the Maniatis Manual produced by Cold Spring Harbor Publishing.
В следующем аспекте предусматривается клетка-хозяин, содержащая указанный вектор и/или ДНК.
Для экспрессии последовательностей ДНК, кодирующих молекулу по настоящему изобретению, можно использовать любую подходящую клетку-хозяина/векторную систему. Можно использовать бактериальные, например Е. coli, и другие микробные системы или также можно использовать системы для экспрессии в эукариотической клетке-хозяине, например клетке млекопитающих. Подходящие клеткихозяева млекопитающих включают СНО, клетки миеломы или гибридомные клетки.
Настоящее изобретение также относится к способу получения молекулы антитела, как описано в настоящем описании, включающему культивирование клетки-хозяина, содержащей вектор (и/или ДНК) по настоящему изобретению, в условиях, пригодных для направления экспрессии белка с ДНК, кодирующей молекулу антитела по настоящему изобретению, и выделение молекулы антитела.
Для получения продуктов, содержащих как тяжелые, так и легкие цепи, клеточную линию можно трансфицировать двумя векторами, причем первый вектор кодирует полипептид легкой цепи и второй вектор кодирует полипептид тяжелой цепи. Альтернативно можно использовать один вектор, причем вектор включает последовательности, кодирующие полипептиды легкой цепи и тяжелой цепи.
Молекулы антител по настоящему изобретению экспрессируются на подходящих уровнях из клеток-хозяев, что делает их подходящими для коммерческой обработки.
Антитело может быть специфичным в отношении любого антитела-мишени. Антиген может представлять собой связанный с клеткой белок, например белок клеточной поверхности на клетках, таких как бактериальные клетки, клетки дрожжей, Т-клетки, эндотелиальные клетки или опухолевые клетки, или он может представлять собой растворимый белок. Представляющие интерес антигены также могут представлять собой любой имеющий медицинское значение белок, такой как белки, активируемые во время заболевания или инфекции, например рецепторы и/или их соответствующие лиганды. Конкретные примеры белков клеточной поверхности включают молекулы адгезии, например интегрины, такие как β1интегрины, например VLA-4, Е-селектин, Р-селектин или L-селектин, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD11a, CD11b, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD40L, CD45, CDW52, CD69, CD134 (ОХ40), ICOS, BCMP7, CD137, CD27L, CDCP1, CSF1 или CSF1-рецептор, DPCR1, DPCR1, dudulin2, FLJ20584, FLJ40787, HEK2, KIAA0634, KIAA0659, KIAA1246, KIAA1455, LTBP2, LTK, MAL2, MRP2, нектинподобный 2, NKCC1, PTK7, RAIG1, TCAM1, SC6, BCMP101, BCMP84, BCMP11, DTD, карциноэмбриональный антиген (CEA), глобулин молочного жира человека (HMFG1 и 2), антигены МНС класса I и МНС класса II, KDR и VEGF, PD-1, DC-SIGN, TL1A, DR3, рецептор A IL-7, и когда это целесообразно, их рецепторы.
Растворимые антигены включают интерлейкины, такие как IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL12, IL-13, IL-14, IL-16 или IL-17, такие как IL17A и/или IL17F, вирусные антигены, например антигены респираторного синцитиального вируса или цитомегаловируса, иммуноглобулины, такие как IgE, интерфероны, такие как интерферон α, интерферон β или интерферон γ, фактор некроза опухоли TNF (ранее известный как фактор некроза опухоли-α и обозначаемый в настоящем описании как TNF или TNFa), фактор некроза опухоли-β, колониестимулирующие факторы, такие как G-CSF или GM-CSF, и тромбоцитарные факторы роста, такие как PDGF-α и PDGF-β, WISP-1 и, когда это целесообразно, их рецепто
- 23 033720 ры. Другие антигены включают бактериальные антигены клеточной поверхности, бактериальные токсины, вирусы, такие как вирус гриппа, EBV, НерА, В и С, агенты биологического оружия, радионуклиды и тяжелые металлы и яды и токсины змей и пауков.
В одном из вариантов осуществления антитело можно использовать для функционального изменения активности представляющего интерес антигена. Например, антитело может нейтрализовывать, осуществлять антагонизм или осуществлять агонизм активности указанного антигена, прямо или непрямо.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу получения асимметричного смешанного антитела по настоящему изобретению, включающему стадии взятия симметричного антитела (т.е. антитело, где обе тяжелых цепи являются одинаковыми/идентичными), содержащего первую последовательность тяжелой цепи или ее фрагмент, как определено в настоящем описании, и смешение указанного антитела in vitro со вторым симметричным антителом, содержащим вторую последовательность тяжелой цепи или ее фрагмент, которая отличается от указанной первой последовательности тяжелой цепи в условиях, способствующих обмену тяжелыми цепями между двумя антителами, и, необязательно, выделение асимметричного смешанного антитела.
Условия in vitro, способствующие динамическому обмену, включают восстанавливающие условия. Подходящие восстановители включают GSH, 2-меркаптоэтанол, 2-меркаптоэтиламин, ТВР, ТСЕР, цистеин-HCl и DTT.
Подходящие концентрации восстановителей находятся в диапазоне 0,01-10 мМ, таком как от 0,5 до 5 мМ. Кроме того, восстановление можно осуществлять с использованием окислительновосстановительных буферов, иными словами, различных относительных соотношений окисленных и восстановленных вариантов реагентов, таких как, например, GSH:GSSG и Cysun-Cys.
Подходящие условия включают соотношения антител, которые находятся в диапазоне от 0,5:5 до 5:05, таком как 1:1 или 1:2.
Подходящие температуры включают от 15 до 40°С, такие как 37°С.
Восстанавливающие условия можно выбирать так, чтобы они находились между восстановительной стабильностью гомодимеров и гетеродимеров.
В альтернативном варианте осуществления антитела по изобретению получают с использованием смешанной клеточной культуры, например, происходит ~50% обмен. Это может приводить приблизительно к 1-2 г/л желаемого биспецифического антитела.
В одном из вариантов осуществления предусматривается асимметричное антитело, полученное или получаемое способом, описанным в настоящем описании, и состав, содержащий его, в частности, для применения для лечения.
Молекулы антитела по настоящему изобретению подходят для лечения и/или профилактики патологического состояния.
Таким образом, предусматривается антитело в соответствии с настоящим изобретением для применения для лечения путем введения его терапевтически эффективного количества, например, в фармацевтическом составе. В одном из вариантов осуществления антитело по изобретению вводят местно в легкие, например, путем ингаляции.
Антитела, предусматриваемые в рамках настоящего изобретения, являются подходящими для лечения заболеваний или нарушений, включающих воспалительные заболевания и нарушения, иммунные заболевание и нарушения, фиброзные нарушения и злокачественные опухоли.
Термин воспалительное заболевание или нарушение и иммунное заболевание или нарушение включает ревматоидный артрит, псориатический артрит, болезнь Стилла, болезнь Макла-Уэлса, псориаз, болезнь Крона, язвенный колит, SLE (системная красная волчанка), астму, аллергический ринит, атопический дерматит, рассеянный склероз, васкулит, сахарный диабет типа I, трансплантацию и реакцию трансплантат против хозяина.
Термин фибротическое нарушение включает идиопатический фиброз легких (IPF), системный склероз (или склеродермию), фиброз почек, диабетическую нефропатию, IgA-нефропатию, гипертензию, заболевание почек конечной стадии, перитонеальный фиброз (непрерывный амбулаторный перитонеальный диализ), цирроз печени, связанную со старением дегенерацию желтого пятна (ARMD), ретинопатию, реактивный фиброз сердца, образование рубца, келоиды, ожоги, изъязвления кожи, ангиопластику, хирургическую операцию коронарного шунтирования, артропластику и хирургическую операцию по удалению катаракты.
Термин злокачественная опухоль включает злокачественное новообразование, которое возникает из эпителия, находится в коже или, более часто, в выстилках органов организма, например молочной железы, яичника, предстательной железы, легкого, почки, поджелудочной железы, желудка, мочевого пузыря или кишечника. Злокачественные опухоли имеют тенденцию инфильтрировать в соседнюю ткань и распространяться (метастазировать) в отдаленные органы, например в кость, печень, легкое или головной мозг.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической или диагностической композиции, содержащей антитело по настоящему изобретению в комбинации с одним или несколькими из фармацевтически приемлемых эксципиентов, разбавителей или носителей. Таким образом, предусматривается
- 24 033720 применение антитела по изобретению для получения лекарственного средства. Композиция обычно предоставляют в качестве части стерильной фармацевтической композиции, которая обычно включает фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению, кроме того, может содержать фармацевтически приемлемый адъювант.
Настоящее изобретение также относится к способу получения фармацевтической или диагностической композиции, включающему добавление или смешение антитела по настоящему изобретению с одним или несколькими из фармацевтически приемлемого эксципиента, разбавителя или носителя.
Антитело по изобретению может представлять собой единственный активный ингредиент в фармацевтической или диагностической композиции или оно может быть дополнено другими активными ингредиентами, включая другие ингредиенты в виде антител, например антитела против TNF, против ΓΕ-1β, против T-клеток, против IFNy или против LPS, или ингредиенты не в виде антител, такие как ксантины. Другие подходящие активные ингредиенты включают антитела, способные индуцировать толерантность, например антитела против CD3 или антитела против CD4.
В следующем варианте осуществления антитело или композицию по изобретению используют в комбинации с другим фармацевтически активным средством, например кортикостероидом (таким как флукатизона пропионат) и/или бета-2-агонистом (таким как сальбутамол, сальметерол или формотерол), или ингибиторами роста и пролиферации клеток (такими как рапамицин, циклофосфамид, метотрексат), или альтернативным ингибитором CD28 и/или CD40. В одном из вариантов осуществления ингибитор является низкомолекулярным. В другом варианте осуществления ингибитор представляет собой антитело, специфичное к мишени.
Удобно, чтобы фармацевтические композиции содержали терапевтически эффективное количество антитела по изобретению. Термин терапевтически эффективное количество, как используют в рамках изобретения, относится к количеству лекарственного средства, требуемому для лечения, смягчения или предупреждения заданного заболевания или состояния, или для проявления поддающегося обнаружению терапевтического или профилактического эффекта. Терапевтически эффективное количество можно оценивать первоначально либо в анализах культур клеток, либо в моделях на животных, обычно у грызунов, кроликов, собак, свиней и приматов. Также для определения соответствующего диапазона концентраций и пути введения можно использовать модель на животных. Затем такую информацию можно использовать для определения подходящих доз и путей введения у человека.
Точное терапевтически эффективное количество для человека будет зависеть от тяжести болезненного состояния, общего состояния здоровья индивидуума, возраста, массы тела и пола индивидуума, рациона, времени и частоты введений, комбинации(ий) лекарственных средств, реакций чувствительности и устойчивости/ответа на терапию. Это количество можно определять с помощью стандартного экспериментирования и его определение осуществляется по мнению лечащего врача. Как правило, терапевтически эффективное количество составляет от 0,01 до 50 мг/кг, например от 0,1 до 20 мг/кг. Фармацевтические композиции удобно представлять в единичных дозированных формах, содержащих заданное количество активного вещества по изобретению на дозу.
Композиции можно вводить пациенту по отдельности или их можно вводить в комбинации (например, одновременно, последовательно или по отдельности) с веществами, лекарственными средствами или гормонами.
Доза, в которой вводят антитело по настоящему изобретению, зависит от природы состояния, подвергаемого лечению, например степени имеющегося заболевания/состояния, и от того, используют ли молекулу профилактически или для лечения существующего состояния.
Частота дозирования зависит от времени полужизни антитела и длительности его эффекта. Если антитело обладает коротким временем полужизни (например, 2-10 ч), может быть необходимым введение одной или нескольких доз в сутки. Альтернативно, если антитело обладает длительным временем полужизни (например, 2-15 суток), может быть необходимым введение дозировки один раз в сутки, один раз в неделю или даже один раз в 1 или 2 месяца.
Фармацевтически приемлемый носитель сам по себе не должен индуцировать продукцию антител, вредоносных для индивидуума, которому вводят композицию, и он не должен быть токсичным. Подходящие носители могут представлять собой крупные медленно метаболизирующиеся макромолекулы, такие как белки, полипептиды, липосомы, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и неактивные вирусные частицы.
Можно использовать фармацевтически приемлемые соли, например соли минеральных кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты и сульфаты, или соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты и бензоаты.
Фармацевтически приемлемые носители в терапевтических композициях, кроме того, могут содержать жидкости, такие как вода, солевой раствор, глицерин и этанол. Кроме того, в таких композициях могут присутствовать вспомогательные вещества, такие как смачивающие вещества, или эмульгаторы, или рН-буферные вещества. Такие носители позволяют составление фармацевтических композиций в качестве таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей и суспензий для прогла
- 25 033720 тывания пациентом.
Подходящие формы для введения включают формы, подходящие для парентерального введения, например путем инъекции или инфузии, например путем болюсной инъекции и непрерывной инфузии. Когда продукт предназначен для инъекции или инфузии, он может иметь форму суспензии, раствора или эмульсии в масляном или водном носителе, и он может содержать средства для составления, такие как суспендирующие средства, консерванты, стабилизирующие и/или диспергирующие средства. Альтернативно молекула по изобретению может быть в сухой форме для восстановления перед применением соответствующей стерильной жидкостью.
После составления композиции по изобретению можно вводить прямо индивидууму. Индивидуумами, подвергаемыми лечению, могут быть животные. Однако в одном или нескольких вариантах осуществления композиции адаптированы для введения человеку.
В составах по настоящему изобретению является подходящим, чтобы значение рН конечного состава не было сходным со значением изоэлектрической точки антитела, например, если рН состава меньше 7, тогда может быть пригодной pI 8-9 или выше. Без связи с теорией полагают, что это может в конечном итоге обеспечить конечный состав с увеличенной стабильностью, например, антитело остается в растворе.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить любым путем, включая, но ими не ограничиваясь, пероральный, внутривенный, внутримышечный, внутриартериальный, интрамедуллярный, интратекальный, внутрижелудочковый, трансдермальный, чрескожный (например, см. WO 98/20734), подкожный, внутрибрюшинный, интраназальный, энтеральный, местный, сублингвальный, интравагинальный или ректальный пути. Также для введения фармацевтических композиций по изобретению можно использовать безыгольные шприцы. Как правило, терапевтические композиции можно получать в качестве инъецируемых составов, либо в качестве жидких растворов, либо в качестве суспензий. Также можно получать твердые формы, подходящие для растворения или суспендирования в жидких носителях перед инъекцией.
Прямую доставку композиций, как правило, проводят путем инъекции, подкожно, внутрибрюшинно, внутривенно или внутримышечно, или доставку осуществляют в интерстициальное пространство ткани. Также композиции можно вводить в очаг повреждения. Введение дозы можно осуществляют по схеме с однократной дозой или по схеме с многократными дозами.
Будет понятно, что активный ингредиент в композиции представляет собой антитело. Само по себе оно является чувствительным к деградации в желудочно-кишечном тракте. Таким образом, если композицию вводят через желудочно-кишечный тракт, то композиция должна содержать средства, которые защищают антитела от деградации, но которые высвобождают антитело после всасывания из желудочнокишечного тракта.
Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых носителей доступно в Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991).
В одном из вариантов осуществления предусматривается состав в качестве состава для местного введения, в том числе путем ингаляции.
Подходящие ингалируемые препараты включают ингалируемые порошки, аэрозоли в отмеренной дозе, содержащие газ-пропеллент, или ингалируемые растворы, свободные от газов-пропеллентов. Ингалируемые порошки по изобретению, содержащие активное вещество, могут состоять только из упомянутых выше активных веществ или смесей упомянутых выше активных веществ с физиологически приемлемым эксципиентом.
Эти ингалируемые порошки могут включать моносахариды (например, глюкоза или арабиноза), дисахариды (например, лактоза, сахароза, мальтоза), олиго- и полисахариды (например, декстраны), полиспирты (например, сорбит, маннит, ксилит), соли (например, хлорид натрия, карбонат кальция) или их смеси друг с другом. Подходящим является использование моно- или дисахаридов, использование лактозы или глюкозы, в частности, но не исключительно, в форме их гидратов.
Для частиц для депонирования в легких требуется размер частиц менее 10 мкм, такой как 1-9 мкм, например от 0,1 до 5 мкм, в частности от 1 до 5 мкм. Размер частиц активного ингредиента (такого как антитело) имеет первостепенную важность.
Г азы-пропелленты, которые можно использовать для получения ингалируемых аэрозолей, известны в данной области. Подходящие газы-пропелленты выбраны из углеводородов, таких как н-пропан, нбутан или изобутан и галогенуглеводороды, такие как хлорированные и/или фторированные производные метана, этана, пропана, бутана, циклопропана или циклобутана. Упомянутые выше газыпропелленты можно использовать сами по себе или в качестве их смесей.
Особенно подходящими газами-пропеллентами являются галогенированные производные алканов, выбранные из TG11, TG12, TG134а и TG227. Из упомянутых выше галогенированных углеводородов TG134a (1,1,1,2-тетрафторэтан) и TG227 (1,1,1,2,3,3,3-гептафторпропан) и их смеси являются особенно подходящими.
Содержащие газы-пропелленты ингалируемые аэрозоли также могут содержать другие ингредиенты, такие как сорастворители, стабилизаторы, сурфактанты (поверхностно-активные вещества), антиок
- 26 033720 сиданты, смазывающие вещества и средства для коррекции рН. Все эти ингредиенты известны в данной области.
Содержащие газ-пропеллент ингалируемые аэрозоли по изобретению могут содержать вплоть до 5 мас.% активного вещества. Аэрозоли по изобретению содержат, например, от 0,002 до 5 мас.%, от 0,01 до 3 мас.%, от 0,015 до 2 мас.%, от 0,1 до 2 мас.%, от 0,5 до 2 мас.% или от 0,5 до 1 мас.% активного ингредиента.
Альтернативно местное введение в легкие также можно осуществлять путем введения жидкого раствора или суспензионного состава, например, с использованием устройства, такого как небулайзер, например небулайзер, подсоединенный к компрессору (например, небулайзер Pari LC-Jet Plus(R), подсоединенный к компрессору Pari Master(R), изготовленному Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Va.).
Антитело по изобретению можно доставлять диспергированным в растворителе, например, в форме раствора или суспензии. Его можно суспендировать в соответствующем физиологическом растворе, например солевом растворе или другом фармакологически приемлемом растворителе или забуференном растворе. Забуференные растворы, известные в данной области, могут содержать от 0,05 до 0,15 мг эдетата динатрия, от 8,0 до 9,0 мг NaCl, от 0,15 до 0,25 мг полисорбата, от 0,25 до 0,30 мг безводной лимонной кислоты и от 0,45 до 0,55 мг цитрата натрия на 1 мл воды, так чтобы достигалось значение рН приблизительно от 4,0 до 5,0. В суспензии можно использовать, например, лиофилизированные молекулы.
Терапевтические суспензии или составы растворов также могут содержать один или несколько эксципиентов. Эксципиенты хорошо известны в данной области и включают буферы (например, цитратный буфер, фосфатный буфер, ацетатный буфер и бикарбонатный буфер), аминокислоты, мочевину, спирты, аскорбиновую кислоту, фосфолипиды, белки (например, сывороточный альбумин), EDTA, хлорид натрия, липосомы, маннит, сорбит и глицерин. Растворы или суспензии могут быть инкапсулированы в липосомы или биодеградируемые микросферы.
Состав, главным образом, может быть предоставлен, по существу, в стерильной форме с использованием стерильных процессов изготовления.
Это может включать получение и стерилизацию путем фильтрации забуференного растворителя/раствора, используемого для составления, асептическое суспендирование молекулы в стерильном забуференном растворе растворителя и распределение состава в стерильную тару способами, известными специалистам в данной области.
Распыляемый состав по настоящему изобретению может быть предоставлен, например, в качестве единичных доз (например, запаянные пластиковые контейнеры или флаконы), упакованных в обертки из фольги. Каждый флакон содержит единичную дозу в объеме, например, 2 мл, буферного растворителя/раствора.
Полагают, что антитело по настоящему изобретению является особенно подходящим для доставки путем распыления.
Содержащий в контексте настоящего описания означает включающий.
Когда это технически приемлемо, варианты осуществления изобретения можно комбинировать.
Асимметричный и асимметричный смешанный используют в настоящем описании взаимозаменяемо.
Далее изобретение описано с помощью следующих примеров, которые являются только иллюстративными и ни в коем случае не должны истолковываться как ограничивающие объем настоящего изобретения.
Примеры
1. Мутагенез тяжелой цепи IqG4 и получение векторов с единичным мутантным геном тяжелой цепи IqG4.
Аминокислотные мутации вносили с использованием набора Quickchange® Lightening Multi Site Directed Mutagenesis (SDM) kit или набора Quickchange® II DSM kit (приобретенные в Stratagene®) (каталожные номера 210516 и 200521 соответственно) в соответствии с инструкциями изготовителя.
Мутации подтверждали секвенированием ДНК. Получали тяжелые цепи IgG4 для антител 1-47, представленных в следующей таблице
- 27 033720
Номер антитела Мутации тяжелой цепи (Нумерация Kabat) Домен СН1 и шарнирная область, SEQ ID N0: Сн1 г шарнирная область, Сн2 и Сн3, SEQ ID N0:
1 C127S 296 306
2 C127S, C239S 33 59
3 C127S, C242S 34 60
4 C127S, C242S, C239S 297 307
5 G230C 298 308
5Р G230C, S241P 299 309
6 C127S, G230C, C239S 12 38
7 C127S, G230C, C242S 13 39
8 C127S, G230C, C239S, C242S 14 40
9 G230C, C239S 300 310
10 G230C, C242S 301 311
11 G230C, C239S, C242S 302 312
12 C239S 303 313
13 C242S 304 314
15 C127S, G230C 15 41
16 C127S, G230C, S241P 16 42
17 IgG4 человека дикого типа 2 -
18 S241P - -
19 IgGl человека дикого типа 1 -
28 C127S Y229C 17 43
28Р C127S Y229C, S241P 36 62
29 C127S Y229C C239S 18 44
30 C127S Y229C C242S 19 45
31 C127S Y229C C239S C242S 20 46
32 C127S К228С 21 47
33 C127S К228С C239S 22 48
34 C127S К228С C242S 23 49
35 C127S К228С C239S C242S 24 50
36 C127S S227C 25 51
37 C127S S227C C239S 26 52
38 C127S S227C C242S 27 53
39 C127S S227C C239S C242S 28 54
44 C127S G230C Ρ238ΡΑΑΆ 29 55
44Р C127S G230C Ρ238ΡΑΆΑ, S241P 37 63
45 C127S G230C Ρ238ΡΑΑΆ C239S 30 56
46 C127S G230C Ρ238ΡΑΑΆ C242S 31 57
47 C127S G230C Ρ238ΡΑΆΑ C239S C242S 32 58
48 C127S, S227P, Y229S, G230C, P237D, Р238КТНТ, S241P 35 61
49 C127S G230C Р238РА
50 C127S G230C Ρ238ΡΑΆ S241P
51 C127S, G230C, Ρ238ΡΑΆΆΑ
52 C127S, G230C, Р238РААААА
55 C127S, G230C, Р238РТНТ
56 C127S, G230C, P237D, Р238КТНТ
57 C127S, G230C, P238PGGG
60 C127S, S227P, G230C
62 C127S, Y229S, G230C
64 C127S, S227P, Y229S, G230C
65 C127S, S227P, Y229S, G230C, P237D, Р238КТНТ
66 C127S, G230C, P237D, Р238КТН
67 C127S, G230C, P237D, Р238КТ
68 C127S, G230C, P237D, Р238К
69 C127S, G230C P237D, Р238КААА
71 C127S, S227P, G230C, P237D, Р238КТНТ
73 C127S, Y229S, G230C, P237D, Р238КТНТ
- 28 033720
Другие полученные антитела описаны в таблице выше.
Тяжелую цепь антитела 48 (последовательность ID NO: 266) получали способом ПЦР и клонированием ферментов рестрикции. Продукт ПЦР получали с помощью прямого олигонуклеотида, кодирующего последовательность верхней и центральной шарнирной области IgG1 и участок рестрикции BglII, и обратного олигонуклеотида, кодирующего фермент рестрикции DraIII. Затем фрагмент ПЦР расщепляли с помощью упомянутых выше ферментов и лигировали в вектор с единичным геном hG4, содержащий соответствующую вариабельную область.
2. Экспрессия мутантных IgG4-антител.
Все мутантные ДНК трансфицировали в клетки CHOK1. Клетки (2х108 клеток/мл) ресуспендировали в 1 мл солевого раствора Earles Balance (Sigma) и смешивали с 400 мкг ДНК (200 мкг ДНК тяжелой цепи и 200 мкг ДНК легкой цепи каппа). Аликвоты объемом 800 мкл переносили в 0,4-см кюветы (Biorad). Для культуры объемом 500 мл шесть кювет подвергали электропорации при следующих параметрах: 1 мс, 9,6 А; 10 мс, 0 А; 40 мс, 3,2 А. Трансфицированные клетки инкубировали в течение 24 ч при встряхивании при 140 об/мин в увлажненной среде с 5% СО2 при 37°С и, начиная с 2 суток после трансфекции, продолжали инкубировать при 32°С в течение 10-13 суток. На 4 сутки после трансфекции к культуре добавляли 1,6 мл 1 М бутирата натрия. После достижения клетками 40% жизнеспособности и вплоть до 13 суток супернатант собирали. Культуры центрифугировали в течение 45 мин при 4000 об/мин. Супернатант пропускали через 0,22-мкМ фильтр Stericup (Millipore) для очистки.
3. Очистка мутантных IgG4-антител.
Супернатанты (200-500 мл) очищали с использованием 5-мл колонки HiTrap MabSelect SuRe с белком A (GE Healthcare, Amersham, Великобритания). Образцы получали путем добавления 1/50 от объема супернатанта 2 М Tris-HCl pH 8,5. Образцы загружали в колонку при 1 мл/мин. Колонку промывали посредством PBS, рН 7,4. Для элюирования образцов 0,1 М цитрат натрия, рН 3,4, пропускали через колонку при 1 мл/мин и фракции объемом 0,5 мл собирали. Пиковые фракции нейтрализовывали добавлением 0,125 мл 2 М Tris-HCl, pH 8,5, в каждую фракцию. УФ-детекцию проводили при 280 нм.
4. Охарактеризация очищенных мутантных IgG4-антител.
Анализ SDS PAGE.
Неочищенный супернатант центрифугировали при 1200 об/мин в течение 5 мин и количественно определяли на OCTET. Образцы антител (25-30 нг) получали добавлением соответствующих количеств антитела, 4х буфера для загрузки (Invitrogen) и 2 мкл 100 мМ NEM. Доводили до общего объема 20 мкл с использованием dH2O. Затем образцы кипятили в течение 3 мин при 100°С и наносили на 1,5-мм гель с 4-20% Tris-глицином с 15 лунками. Разделение на гелях проводили при 150 В в течение 1,5 ч в 1х буфере Tank. Антитела переносили на нитроцеллюлозную мембрану с использованием системы для сухого переноса iBlot, настроенной на перенос в течение 8 мин. Мембрану инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре (к.т.) в PBS-TM на вращающейся платформе, а затем проводили инкубацию с конъюгированным с HRP антителом кролика против Fc IgG человека (Jackson Immunoresearch) или конъюгированным с HRP антителом козы против легкой цепи каппа человека (Bethyl) в течение 1 ч при встряхивании при к.т. После этого следовало 3 промывания по 5 мин в каждом случае с помощью PBS-T. Блоты проявляли с использованием набора усиленного металлом субстрата DAB в соответствии с инструкциями изготовителя (Pierce).
Результаты анализа с использованием иммуноблоттинга представлены на фиг. 7, 8, 9 и 10. На фиг. 7-10 Н означает тяжелую цепь и L означает легкую цепь, H2L2 представляет собой молекулу целого антитела, содержащую две тяжелые цепи и две легких цепи, и HL представляет собой половинную молекулу, содержащую одну тяжелую цепь и одну легкую цепь.
На фиг. 7 представлен анализ с использованием иммуноблоттинга для антител 15, 16, 6, 7, 8, 17, 18, 19, 5, 5Р, 9, 10, 11, 1, 2, 3, 4, 12, 13 и 14. На фиг. 7 можно видеть, что антитела демонстрируют высокий уровень H2L2, за исключением антител 4, 8 и 14, которые демонстрируют отсутствие или очень мало H2L2 вследствие присутствия обеих мутаций в шарнирной области C239S и C242S. Однако антитела 4, 8 и 14 могут образовывать H2L2 посредством образования нековалентных связей между тяжелыми цепями. Мутант 3 также демонстрирует мало H2L2, в этом мутанте сохранен С239, однако он неспособен образовывать дисульфидные связи между тяжелыми цепями в шарнирной области, предварительно вследствие эффективного образования дисульфидной связи между С-концевым цистеином легкой цепи (LC) и С239 шарнирной области. Также можно видеть, что антитела, которые содержат мутацию C239S, но не C242S (антитела 2, 6, 9 и 12), демонстрируют сниженное образование HL по сравнению с антителами, которые не содержат ни C239S, ни C242S, или антителами, которые содержат C242S, но не C239S. Антитела 5Р и 16, которые содержат мутацию S241P, также демонстрируют сниженное образование HL. Сравнение мутантов 2 и 3 демонстрирует степень вытягивания С-концевого цистеина легкой цепи для образования дисульфидной связи с тяжелой цепью, оказалось, что цистеин легкой цепи более эффективно связывается с С239, чем с С242, в тяжелой цепи.
На фиг. 8 представлен анализ с использованием иммуноблоттинга для антител 15, 6, 7, 8, 28, 29, 30, 31, 17, 19, 32, 33, 33, 34, 35, 36, 37, 38 и 39. На фиг. 8 можно видеть, что антитела демонстрируют высо
- 29 033720 кий уровень H2L2, за исключением антител 8, 31, 35 и 39, которые демонстрируют отсутствие или очень мало H2L2 вследствие присутствия мутаций C239S и C242S в шарнирной области и, таким образом, отсутствия образования дисульфидных связей между двумя тяжелыми цепями. Однако антитела 8, 31, 35 и 39 могут образовывать H2L2 путем образования нековалентных связей между тяжелыми цепями. Также можно видеть, что антитела, которые содержат мутацию C239S, но не C242S (антитела 6, 29, 33 и 37), демонстрируют сниженное образование HL по сравнению с антителами, которые не содержат ни C239S, ни C242S, или с антителами, которые содержат C242S, но не C239S. Мутант 15 способен образовывать дисульфидную связь между легкой цепью и G230C в СН1 и дисульфидные связи между тяжелыми цепями, что, таким образом, приводит к полностью собранному и связанному дисульфидной связью белку. Более того, сравнение мутантов 15(C127S G230C), 28(C127S Y229C), 32(C127S K228C) и 36(C127S S227C) демонстрирует, что положение внесенного цистеина в верхней шарнирной области увеличивает образование дисульфидных связей между LC-HC. G230 и Y229 являются особенно предпочтительными положениями для внесения цистеина. Мутант 28 (C127S Y229C) демонстрирует низкий уровень HL и Н2 и, таким образом, обладает низкой гетерогенностью дисульфидных связей.
На фиг. 9 представлен анализ с использованием иммуноблоттинга для антител 15, 6, 7, 8, 44, 45, 46, 47, 17 и 19. На фиг. 9 можно видеть, что антитела обладают высоким уровнем H2L2, за исключением 8 и 47, которые демонстрируют отсутствие или очень мало H2L2 вследствие присутствия мутаций C239S и C242S в шарнирной области, и, таким образом, между двумя тяжелыми цепями не образуется дисульфидных связей. Однако антитела 8 и 47 могут образовывать H2L2 путем образования нековалентных связей между тяжелыми цепями. Можно видеть, что антитела, которые содержат мутацию C239S, но не C242S (антитела 6 и 45), демонстрируют сниженное образование HL по сравнению с антителами, которые не содержат ни C239S, ни C242S, или антителами, которые содержат C242S, но не C239S. В частности, мутант 44 демонстрирует, что вставка трех аминокислот в верхней шарнирной области также может снижать образование HL и Н2 и, таким образом, обладает более низкими уровнями гетерогенности дисульфидной связи, чем сравнимый мутант 15.
На фиг. 10 представлен анализ с использованием иммуноблоттинга для антител 48, 17, 18 и 19. На фиг. 10 можно видеть, что антитело 48 демонстрирует высокий уровень H2L2 и очень мало HL. Мутант 48 содержит последовательность верхней шарнирной области IgG1 EPKSCDKTHT SEQ ID NO: 319 вместо последовательности верхней шарнирной области IgG4 вместе с мутацией центральной шарнирной области S241P. Таким образом, мутант 48 имеет последовательность верхней и центральной шарнирной области EPKSCDKTHTCPPCP SEQ ID NO: 320. Мутант 48 демонстрирует более низкие уровни гетерогенности дисульфидных связей по сравнению с антителом IgG4 дикого типа 17 и приблизительно эквивалентные низкие уровни гетерогенности дисульфидной связи по сравнению с мутантом S241P IgG4 18 и антителом IgG1 дикого типа 19.
Анализ Thermofluor.
Термостабильность очищенных mAb анализировали в анализе Thermofluor с использованием SYPRO® Orange для мониторинга процесса термического разворачивания белков. Добавляли вместе 5 мкл mAb при 1 мг/мл, 5 мкл 30х красителя и 40 мкл PBS. 10 мкл смеси распределяли в четырех экземплярах в 384-луночный оптический планшет для ПЦР и анализировали на системе 7900НТ Fast Real-Time PCR System (Agilent Technologies UK Ltd, Wokingham UK). Эта система ПЦР содержит устройство для нагревания для точного контроля температуры, установленной на 20-99°С; полупроводниковая светочувствительная матрица одновременно проводит мониторинг изменений флуоресценции в лунках.
На фиг. 11, 12, 13, 14 и 15 представлены результаты анализа термостабильности мутантов антитела IgG4 по сравнению с антителами IgG1 и IgG4 дикого типа.
Сравнение мутанта 15 с IgG4 дикого типа (мутант 17) демонстрирует увеличение Tm Fab вследствие измененного расположения дисульфидных связей. Сравнение мутанта 15 и 28 демонстрирует дополнительное увеличение Tm Fab для мутанта 28, содержащего мутацию Y229C, по сравнению с мутантом 15, содержащим мутацию G230C. Сравнение мутанта 15 и 44 демонстрирует, что Tm Fab мутанта G230C можно далее увеличивать путем встраивания трех аминокислот в верхнюю шарнирную область. Сравнение мутантов 17 и 18 демонстрирует, что мутация средней шарнирной области S241P не увеличивает Tm Fab, даже несмотря на то, что она значительно уменьшает образование HL. Мутант 48 также демонстрирует значительно увеличенную Tm Fab по сравнению как с IgG4 дикого типа (мутант 17), так и с мутантом 15.
На фиг. 15 представлено общее ранжирование термостабильностей выбранных мутантов IgG4 в соответствии с настоящим изобретением. Все из мутантов 48, 44, 44Р, 46, 45, 6, 29, 30, 28, 28Р, 31, 8, 47 и 15 демонстрируют значительно более высокие величины Tm Fab по сравнению с IgG4 дикого типа (мутант 17) и S241P IgG4 дикого типа (мутант 18).
5. Обмен Fab-плечами.
а) Обмен тяжелыми цепями in vitro.
Первое IgG4-антитело и второе IgG4-антитело, каждое из которых обладает различной специфичностью к антигену, смешивали в молярном соотношении 1:1 в общей концентрации 100 мкг/мл в фос
- 30 033720 фатно-солевом буфере (PBS) (в мМ: 150 NaCl, 10 NaH2PO4; pH 7,4). Для обеспечения восстановления дисульфидной связи образцы добавляли восстановленным глутатионом (GSH; Sigma) до конечной концентрации 0, 0,5 или 5 мМ. В начале эксперимента (t=0 ч) отбирали аликвоту смеси, гасили ее Nэтилмалеимидом (NEM; Sigma) до конечной концентрации 10 мМ (для инактивации потенциально реакционноспособных тиольных групп) и инкубировали с остальной смесью в течение 16 ч при 37°С (t=16 ч). После инкубации образец при t=16 ч гасили, как описано выше.
Комбинации первого и второго исследованных антител представлены в следующей таблице:
Антитело 1 Антитело 1 (мутации по сравнению с IgG4 дикого типа) Антитело 2
IgGl wt (дикий тип) - IgG4 wt (дикий тип)
IgG4 wt (дикий тип) - IgG4 wt (дикий тип)
IgG4 Р S241P IgG4 wt (дикий тип)
мутант IgG4 28 C127S Y229C IgG4 wt (дикий тип)
мутант IgG4 28 Р C127S Y229C S241P IgG4 wt (дикий тип)
мутант IgG4 44 C127S G230C Р238РААА IgG4 wt (дикий тип)
мутант IgG4 44Р C127S G230C IgG4 wt (дикий тип)
Р238РААА, S241P
мутант IgG4 48 C127S, S227P, Y229S, IgG4 wt (дикий тип)
G230C, P237D,
Р238КТНТ, S241P
мутант IgG4 65 C127S, S227P, Y229S, IgG4 wt (дикий тип)
G230C, P237D,
Р238КТНТ
IgG4 IgG4 дикого типа S241G
IgG4 (S241) S241A
IgG4 S241T
IgG4 S241P
IgG4 С127С и Y229C
IgG4 IgG4 S241G S241A
IgG4 S241T
IgG4 IgG4 S241T S241A
IgG4 IgG4 дикого типа C239S
IgG4 (S241) C242S
IgG4 С239С и С242С
IgG4 С127С и Y229C
IgG4 IgG4 S241P С127С и Y229C
IgG4 S241G
IgG4 S241A
IgG4 S241T
IgG4 С239С и С242С
IgG4 IgG4 C127S и Y229C S241G
IgG4 S241A
IgG4 S241T
IgG4 С239С и С242С
IgG4 IgG4 С239С и С242С S241G
IgG4 S241A
IgG4 S241T
IgG4 С239С и С242С
IgG4 C239S
IgG4 C242S
Обмен тяжелыми цепями между антителами 1 и 2 в таблице выше обеспечивает асимметричные антитела с тяжелой цепью из каждого из соответствующих антител.
b) Выявление и количественное определение обмена тяжелыми цепями in vitro.
Присутствие функционально активных биспецифических антител определяли с использованием сэндвич-анализа MSD, реакционные образцы после гашения, полученные согласно примеру 5 а), подвергнутые серийному разведению в 1% BSA в PBS (PB), предварительно инкубировали с 1 мкг/мл биотинилированного антигена 1 (антиген первого антитела) в РВ в течение 1 ч при к.т. при встряхивании (200 об/мин), а затем переносили в предварительно блокированные покрытые стрептавидином планшеты для MSD с РВ (Meso Scale Diagnostics). После инкубации в течение 1 ч при к.т. при встряхивании лунки промывали три раза посредством PBS/0,1% Tween-20, а затем инкубировали с 1 мкг/мл сульфомеченого антигена 2 (антиген второго антитела) в РВ. После инкубации планшеты промывали, как описано выше,
- 31 033720 и сигналы выявляли и измеряли с использованием коммерческого буфера для считывания и устройства Image Sector 6000 соответственно. Фоновые величины, полученные в контрольных параллельных реакциях, в которых биотинилированный антиген был заменен небиотинилированной альтернативой, вычитали из величин всех сигналов. Для всех вычислений использовали дублированные величины по меньшей мере из 3 независимых экспериментов. Чем более высоким является сигнал MSD, тем более высоким является уровень обмена тяжелыми цепями, который произошел.
На фиг. 16 представлен обмен тяжелыми цепями через 16 ч, где первое антитело выбрано из IgG1 дикого типа, IgG4 дикого типа и различных мутантных антител и второе антитело представляет собой IgG4 дикого типа при двух концентрациях GSH. На фигурах показано, что мутанты имеют меньший обмен, чем антитела IgG4 дикого типа, и значительно больший обмен, чем антитело IgG1 дикого типа. Это является преимущественным, поскольку обмен можно использовать для получения асимметричных антител по настоящему изобретению in vitro, которые in vivo обладают меньшей подверженностью обмену, чем антитела IgG4 дикого типа. В некоторых случаях увеличение концентрации восстановителя, такого как GSH, увеличивает величину наблюдаемого обмена.
В полном соответствии с литературой (Labrijn 2011, Lewis 2009, Stubenrauch 2010, Labrijn 2009) авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что мутация S241P в центральной шарнирной области IgG4 является инструментом для предупреждения обмена Fab-плечами (фиг. 16). Также можно видеть, что мутантные биспецифические антитела по настоящему изобретению демонстрируют меньший обмен Fab-плечами, чем было показано при 0,5 мМ GSH, что в 100 раз превышает физиологическую концентрацию GSH 4-6 мкМ в плазме (Zilmer. et al, 2005. Drug Design Reviews). Таким образом, можно получать биспецифические антитела in vitro путем обмена Fab-плечами в восстанавливающих условиях, которые могут иметь значительно сниженный обмен Fab-плечами in vivo по сравнению с IgG4 wt.
На фиг. 17 показано, что мутант с глицином в положении 241 может без труда обмениваться с мутантами IgG4 либо с аланином, либо с треонином, в этом положении. IgG4 с аланином в положении 241 обменивается в некоторой степени в большей степени с мутантом с треонином в этом положении, чем с мутантом с глицином в этом положении. Аналогично мутант IgG4 с треонином в положении 241 продемонстрировал сниженную активность в реакции с S241G по сравнению с симметричным анализом. Обмен с S241A IgG4 был сходным с симметричным анализом. В общем, это указывает на то, что IgG4 S241T обменивается на сходных уровнях с IgG4 WT и обменивается с большей вероятностью по сравнению с мутантами S241A и S241G.
Аффинность антитела.
Аффинность выбранных мутантных IgG4-антител по настоящему изобретению в отношении растворимого цитокина-мишени можно измерять с помощью BIAiacore™. Формат анализа представляет собой улавливание IgG на поверхности с антителом против Fc с последующим титрованием растворимого цитокина.
Термин kd (c-1) относится к константе скорости диссоциации для взаимодействия антителоантиген. Указанную величину также обозначают как величина koff.
Термин ka (М-1 с-1), как используют в рамках изобретения, относится к константе скорости ассоциации для взаимодействия антитело-антиген.
Термин KD (M) или KD (пМ), как используют в рамках изобретения, относится к равновесной константе диссоциации для взаимодействия антитело-антиген.
Анализ с использованием эксклюзионной (SEC) ВЭЖХ.
Приблизительно 50 мкг очищенного антитела анализировали с помощью ВЭЖХ с использованием колонки S200. Для анализа использовали Ab 1-19. Этот результат показывает, что связанный нековалентными связями H2L2 образуется несмотря на изменения расположения DSB в молекуле IgG4 человека.

Claims (35)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Асимметричное антитело, обладающее способностью снижать обмен Fab-плечами по сравнению с IgG4 дикого типа, содержащее две тяжелые цепи или два их фрагмента, каждая из которых содержит, по меньшей мере, вариабельную область, шарнирную область и домен СН1, где первая тяжелая цепь или ее фрагмент принадлежит классу IgG4; причем в указанном антителе:
    a) цистеин межцепочечной связи в положении 127 по системе нумерации Кэбат в домене СН1 заменен на аминокислоту, не содержащую тиол;
    b) одна или несколько аминокислот, расположенных в верхней шарнирной области, заменены на цистеин, вторая тяжелая цепь или ее фрагмент отличается по аминокислотной последовательности от указанной первой тяжелой цепи, по меньшей мере, в участке, находящемся вне вариабельной области; и одна или несколько аминокислот в верхней шарнирной области первой тяжелой цепи в положениях 227, 228, 229 и 230 по системе нумерации Кэбат заменены на цистеин.
    - 32 033720
  2. 2. Асимметричное антитело по п.1, где участок, находящийся вне вариабельной области, представляет собой константную область.
  3. 3. Асимметричное антитело по п.1 или 2, где глицин в положении 230 по системе нумерации Кэбат заменен на цистеин.
  4. 4. Асимметричное антитело по любому из пп.1-3, где тирозин в положении 229 по системе нумерации Кэбат заменен на цистеин.
  5. 5. Асимметричное антитело по любому из пп.1-4, где лизин в положении 228 по системе нумерации Кэбат заменен на цистеин.
  6. 6. Асимметричное антитело по любому из пп.1-5, где серин в положении 227 по системе нумерации Кэбат заменен на цистеин.
  7. 7. Асимметричное антитело по любому из пп.1-6, где цистеин в положении 239 и цистеин в положении 242 по системе нумерации Кэбат в первой тяжелой цепи заменены на аминокислоту, не содержащую тиол.
  8. 8. Асимметричное антитело по любому из пп.1-6, где цистеин в положении 239 по системе нумерации Кэбат в первой тяжелой цепи заменен на аминокислоту, не содержащую тиол.
  9. 9. Асимметричное антитело по любому из пп.1-6, где цистеин в положении 242 по системе нумерации Кэбат в первой тяжелой цепи заменен на аминокислоту, не содержащую тиол.
  10. 10. Асимметричное антитело, обладающее способностью снижать обмен Fab-плечами по сравнению с IgG4 дикого типа, содержащее две тяжелые цепи, каждая из которых содержит, по меньшей мере, вариабельную область, шарнирную область и домен СН1, где первая тяжелая цепь или ее фрагмент отличается тем, что принадлежит классу IgG4 и имеет:
    a) цистеин межцепочечной связи в положении 127 по системе нумерации Кэбат, замененный на аминокислоту, не содержащую тиол;
    b) цистеин в положении 239 или цистеин в положении 242 по системе нумерации Кэбат, замененный на аминокислоту, не содержащую тиол; и вторая тяжелая цепь или ее фрагмент отличается по аминокислотной последовательности от указанной первой тяжелой цепи, по меньшей мере, в участке, находящемся вне вариабельной области.
  11. 11. Асимметричное антитело по любому из пп.1-10, где аминокислота, не содержащая тиол, представляет собой серин.
  12. 12. Асимметричное антитело по любому из предшествующих пунктов, где аминокислота в положении остатка 241 по системе нумерации Кэбат заменена на пролин.
  13. 13. Асимметричное антитело по п.12, где аминокислота, не содержащая тиол, представляет собой серин.
  14. 14. Асимметричное антитело по любому из предшествующих пунктов, где три аминокислоты в первой тяжелой цепи вставлены между аминокислотами 226-243 по системе нумерации Кэбат.
  15. 15. Асимметричное антитело по п.14, где три аминокислоты в первой тяжелой цепи вставлены между положениями 238 и 239 по системе нумерации Кэбат.
  16. 16. Асимметричное антитело по п.15, где между положениями 238 и 239 по системе нумерации Кэбат вставлены три остатка аланина.
  17. 17. Асимметричное антитело по п.15, где между положениями 238 и 239 первой тяжелой цепи по системе нумерации Кэбат встроены треонин, гистидин и еще один треонин.
  18. 18. Асимметричное антитело по любому из предшествующих пунктов, где серин в положении 241 первой тяжелой цепи по системе нумерации Кэбат заменен на пролин.
  19. 19. Асимметричное антитело по любому из предшествующих пунктов, где в первой тяжелой цепи глицин в положении 230 заменен на цистеин, серин в положении 227 заменен на пролин, тирозин в положении 229 заменен на серин, пролин в положении 237 заменен на аспарагиновую кислоту, пролин в положении 238 заменен на лизин, аминокислотная последовательность треонин-гистидин-треонин встроена между положениями 238 и 239 и серин в положении 241 заменен на пролин.
  20. 20. Асимметричное антитело по любому из предшествующих пунктов, где одна или несколько тяжелых цепей или их фрагментов содержат домен СН2 и/или домен СН3.
  21. 21. Асимметричное антитело по любому из предшествующих пунктов, где каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область и две вариабельные области являются идентичными.
  22. 22. Асимметричное антитело по любому из предшествующих пунктов, где каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область и обе эти области различны.
  23. 23. Асимметричное антитело по любому из предшествующих пунктов, где антитело является биспецифическим.
  24. 24. Асимметричное антитело по любому из предшествующих пунктов, где шарнирная область в
    - 33 033720 первой тяжелой цепи или фрагменте тяжелой цепи отличается от шарнирной области во второй тяжелой цепи или фрагменте тяжелой цепи.
  25. 25. Асимметричное антитело по любому из предшествующих пунктов, где шарнирная область в каждой тяжелой цепи или фрагменте тяжелой цепи отличается по аминокислотной последовательности и/или по длине.
  26. 26. Асимметричное антитело по любому из пп.1-23, где шарнирная область в первой тяжелой цепи или фрагменте тяжелой цепи идентична шарнирной области во второй тяжелой цепи или фрагменте тяжелой цепи.
  27. 27. Асимметричное антитело по любому из пп.1-23, где шарнирная область в каждой тяжелой цепи или фрагменте тяжелой цепи имеет одну и ту же аминокислотную последовательность.
  28. 28. Асимметричное антитело по любому из пп.1-27, где одна тяжелая цепь или каждая тяжелая цепь содержит верхнюю шарнирную область и центральную область длиной от 12 до 17 аминокислот.
  29. 29. Асимметричное антитело по п.28, где одна тяжелая цепь или каждая тяжелая цепь содержит верхнюю шарнирную область и центральную шарнирную область длиной 15 аминокислот.
  30. 30. Асимметричное антитело по любому из предшествующих пунктов, где вторая тяжелая цепь принадлежит классу IgG4 или классу IgG1.
  31. 31. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотидную последовательность, которая кодирует антитело по любому из пп.1-30.
  32. 32. Клетка-хозяин для получения ассиметричного антитела по любому из пп.1-30, содержащая вектор по п.31.
  33. 33. Применение антитела по любому из пп.1-30 для лечения заболевания или нарушения, в патологический механизм которых вовлечены антигены, которые связываются антителом по любому из пп.130.
  34. 34. Применение по п.33, где заболевание или нарушение выбрано из группы, состоящей из ревматоидного артрита, псориатического артрита, болезни Стилла, болезни Макла-Уэлса, псориаза, болезни Крона, язвенного колита, SLE (системной красной волчанки), астмы, аллергического ринита, атопического дерматита, рассеянного склероза, васкулита, сахарного диабета I типа, трансплантации и реакции трансплантат против хозяина, идиопатического фиброза легких (IPF), системного склероза (или склеродермии), фиброза почек, диабетической нефропатии, IgA-нефропатии, гипертензии, заболевания почек конечной стадии, перитонеального фиброза (непрерывный амбулаторный перитонеальный диализ), цирроза печени, связанной со старением дегенерации желтого пятна (ARMD), ретинопатии, реактивного фиброза сердца, образования рубца, келоидов, ожогов, изъязвлений кожи, ангиопластики, хирургической операции коронарного шунтирования, артропластики и хирургической операции по удалению катаракты, злокачественной опухоли молочной железы, яичника, предстательной железы, легкого, почки, поджелудочной железы, желудка, мочевого пузыря, кишечника, кости, печени и головного мозга.
  35. 35. Способ получения антитела по любому из пп.1-30, включающий стадии:
    обеспечения симметричным антителом, содержащим первую тяжелую цепь или ее фрагмент, принадлежащие классу IgG4, и имеющим:
    a) цистеин межцепочечной связи в положении 127 по системе нумерации Кэбат в домене СН1, замененный на аминокислоту, не содержащую тиол;
    b) одну или несколько аминокислот, расположенных в верхней шарнирной области и замененных на цистеин; и одну или несколько аминокислот, расположенных в верхней шарнирной области первого антитела в положениях 227, 228, 229 и 230 по системе нумерации Кэбат и замененных на цистеин; и смешивания указанного антитела in vitro со вторым симметричным антителом, содержащим вторую тяжелую цепь или ее фрагмент, которая отличается по аминокислотной последовательности от указанной первой тяжелой цепи, по меньшей мере, в участке, находящемся вне вариабельной области, в восстанавливающих условиях в присутствии подходящего восстанавливающего реагента, такого как GSH, 2-меркаптоэтанол, 2-меркаптоэтиламин, ТВР, ТСЕР, цистеин-HCl и DTT или окислительновосстановительный буфер, и выделение асимметричного антитела, полученного в результате указанного смешивания;
    причем концентрация восстанавливающего агента составляет 0,01-10 мМ.
EA201491571A 2012-02-22 2013-02-22 МОДИФИЦИРОВАННЫЕ БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА IgG4 С АСИММЕТРИЧНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬЮ EA033720B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1203071.4A GB201203071D0 (en) 2012-02-22 2012-02-22 Biological products
PCT/EP2013/053615 WO2013124451A1 (en) 2012-02-22 2013-02-22 Sequence symmetric modified igg4 bispecific antibodies

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201491571A1 EA201491571A1 (ru) 2015-02-27
EA033720B1 true EA033720B1 (ru) 2019-11-20

Family

ID=45940034

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201491571A EA033720B1 (ru) 2012-02-22 2013-02-22 МОДИФИЦИРОВАННЫЕ БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА IgG4 С АСИММЕТРИЧНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬЮ

Country Status (16)

Country Link
US (1) US9902768B2 (ru)
EP (2) EP3670531A1 (ru)
JP (3) JP6308953B2 (ru)
KR (2) KR102077332B1 (ru)
CN (1) CN104245729B (ru)
AU (2) AU2013224004B2 (ru)
CA (1) CA2865261A1 (ru)
DK (1) DK2817333T3 (ru)
EA (1) EA033720B1 (ru)
ES (1) ES2773123T3 (ru)
GB (1) GB201203071D0 (ru)
HK (1) HK1202565A1 (ru)
IL (2) IL234107B (ru)
MX (1) MX356301B (ru)
SG (1) SG11201404900YA (ru)
WO (1) WO2013124451A1 (ru)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201014033D0 (en) * 2010-08-20 2010-10-06 Ucb Pharma Sa Biological products
MY166429A (en) 2010-11-17 2018-06-26 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Multi-specific antigen-binding molecule having alternative function to function of blood coagulation factor viii
GB201203071D0 (en) 2012-02-22 2012-04-04 Ucb Pharma Sa Biological products
GB201203051D0 (en) * 2012-02-22 2012-04-04 Ucb Pharma Sa Biological products
KR101895634B1 (ko) * 2013-05-31 2018-09-05 한미약품 주식회사 변이된 힌지 영역을 포함하는 IgG4 Fc 단편
GB201414823D0 (en) * 2014-08-20 2014-10-01 Argen X Bv Multispecific antibodies
WO2016118577A1 (en) * 2015-01-22 2016-07-28 Medimmune, Llc Thymosin-beta-four fusion proteins
TWI691512B (zh) 2015-02-20 2020-04-21 日商橘生藥品工業股份有限公司 Ｆｃ融合高親和性ＩｇＥ受體α鏈
SG10201912593VA (en) 2015-07-23 2020-02-27 Boehringer Ingelheim Int Compound targeting il-23a and b-cell activating factor (baff) and uses thereof
CN115960230A (zh) 2015-08-07 2023-04-14 伊麦吉纳博公司 靶向分子的抗原结合构建体
WO2017110980A1 (ja) * 2015-12-25 2017-06-29 中外製薬株式会社 増強された活性を有する抗体及びその改変方法
CA3011248A1 (en) 2016-02-09 2017-08-17 Bracco Suisse Sa A recombinant chimeric protein for selectins targeting
RU2771330C2 (ru) * 2016-10-06 2022-04-29 Глаксосмитклайн Интеллекчуал Проперти Дивелопмент Лимитед Антитела со сниженным связыванием с технологическими примесями
WO2018081448A1 (en) 2016-10-26 2018-05-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Modified immunoglobulin hinge regions to reduce hemagglutination
WO2018147960A1 (en) 2017-02-08 2018-08-16 Imaginab, Inc. Extension sequences for diabodies
US11634495B2 (en) 2017-04-07 2023-04-25 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG Methods of activating CD32b/c comprising administering an antibody that binds BDCA-2 (CD303)
CA3064321A1 (en) * 2017-05-25 2018-11-29 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies comprising modified heavy constant regions
EP3641802A1 (en) 2017-06-22 2020-04-29 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of fibrosis with agents capable of inhibiting the activation of mucosal-associated invariant t (mait) cells
BR112020005834A2 (pt) 2017-09-29 2020-09-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha molécula multiespecífica de ligação ao antígeno tendo atividade de substituição de função de cofator do fator viii de coagulação sanguínea (fviii), e formulação farmacêutica contendo a referida molécula como ingrediente ativo
MX2021008121A (es) 2019-01-03 2021-12-10 Inst Nat Sante Rech Med Metodos y composiciones farmaceuticas para mejorar las respuestas inmunitarias dependientes de celulas t cd8+ en sujetos que sufren de cancer.
BR112021019571A2 (pt) * 2019-04-19 2021-12-07 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Receptor quimérico que reconhece o sítio de modificação do anticorpo
WO2021009263A1 (en) 2019-07-16 2021-01-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antibodies having specificity for cd38 and uses thereof
JP7394207B2 (ja) * 2019-07-18 2023-12-07 ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド 新規な中間体製造による持続型薬物結合体の製造方法
JP2023519602A (ja) * 2020-03-31 2023-05-11 メディミューン，エルエルシー 安定化ＩｇＧ４抗体及びその使用
CN114106180B (zh) * 2021-12-13 2023-07-28 中国药科大学 一种单克隆抗体及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5677425A (en) * 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
EP2409990A1 (en) * 2009-03-19 2012-01-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant

Family Cites Families (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4741900A (en) 1982-11-16 1988-05-03 Cytogen Corporation Antibody-metal ion complexes
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
DK336987D0 (da) 1987-07-01 1987-07-01 Novo Industri As Immobiliseringsmetode
GB8719042D0 (en) 1987-08-12 1987-09-16 Parker D Conjugate compounds
GB8720833D0 (en) 1987-09-04 1987-10-14 Celltech Ltd Recombinant dna product
JP3771253B2 (ja) 1988-09-02 2006-04-26 ダイアックス コープ． 新規な結合タンパク質の生成と選択
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
AU634186B2 (en) 1988-11-11 1993-02-18 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
GB8907617D0 (en) 1989-04-05 1989-05-17 Celltech Ltd Drug delivery system
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
WO1991010737A1 (en) 1990-01-11 1991-07-25 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
WO1991010741A1 (en) 1990-01-12 1991-07-25 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
EP0542810A1 (en) 1990-08-02 1993-05-26 B.R. Centre Limited Methods for the production of proteins with a desired function
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
EP0564531B1 (en) 1990-12-03 1998-03-25 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
EP0580737B1 (en) 1991-04-10 2004-06-16 The Scripps Research Institute Heterodimeric receptor libraries using phagemids
GB9112536D0 (en) 1991-06-11 1991-07-31 Celltech Ltd Chemical compounds
GB9120467D0 (en) 1991-09-26 1991-11-06 Celltech Ltd Anti-hmfg antibodies and process for their production
ES2227512T3 (es) 1991-12-02 2005-04-01 Medical Research Council Produccion de anticuerpos contra auto-antigenos a partir de repertorios de segmentos de anticuerpos fijados en un fago.
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
WO1995015982A2 (en) 1993-12-08 1995-06-15 Genzyme Corporation Process for generating specific antibodies
PT1231268E (pt) 1994-01-31 2005-11-30 Univ Boston Bancos de anticorpos policlonais
FR2716640B1 (fr) 1994-02-28 1996-05-03 Procedes Machines Speciales Dispositif de centrage et de blocage d'une pièce en vue de son rodage à l'aide d'un rodoir à expansion.
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
GB9625640D0 (en) 1996-12-10 1997-01-29 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
US20060228364A1 (en) 1999-12-24 2006-10-12 Genentech, Inc. Serum albumin binding peptides for tumor targeting
WO2004003019A2 (en) * 2002-06-28 2004-01-08 Domantis Limited Immunoglobin single variant antigen-binding domains and dual-specific constructs
US6908963B2 (en) 2001-10-09 2005-06-21 Nektar Therapeutics Al, Corporation Thioester polymer derivatives and method of modifying the N-terminus of a polypeptide therewith
EP1570267B1 (en) 2002-12-03 2011-10-12 UCB Pharma, S.A. Assay for identifying antibody producing cells
GB0312481D0 (en) 2003-05-30 2003-07-09 Celltech R&D Ltd Antibodies
GB0315450D0 (en) 2003-07-01 2003-08-06 Celltech R&D Ltd Biological products
GB0315457D0 (en) 2003-07-01 2003-08-06 Celltech R&D Ltd Biological products
GB0412181D0 (en) 2004-06-01 2004-06-30 Celltech R&D Ltd Biological products
KR20120133403A (ko) 2004-06-01 2012-12-10 도만티스 리미티드 증강된 혈청 반감기를 가지는 이특이성 융합 항체
US8911726B2 (en) 2004-09-22 2014-12-16 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Stabilized human Igg4 antibodies
GB0619291D0 (en) 2006-09-29 2006-11-08 Ucb Sa Altered antibodies
JP6071165B2 (ja) 2007-05-31 2017-02-01 ゲンマブ エー／エス 安定なＩｇＧ４抗体
SG10201605394SA (en) 2007-09-26 2016-08-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Modified Antibody Constant Region
AU2009324092A1 (en) * 2008-12-03 2011-06-23 Genmab A/S Antibody variants having modifications in the constant region
JP5889181B2 (ja) * 2010-03-04 2016-03-22 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
CA2806252C (en) * 2010-07-29 2019-05-14 Xencor, Inc. Antibodies with modified isoelectric points
GB201014033D0 (en) * 2010-08-20 2010-10-06 Ucb Pharma Sa Biological products
PT2794905T (pt) * 2011-12-20 2020-06-30 Medimmune Llc Polipéptidos modificados para estrutura de anticorpos bispecíficos
GB201203051D0 (en) * 2012-02-22 2012-04-04 Ucb Pharma Sa Biological products
GB201203071D0 (en) 2012-02-22 2012-04-04 Ucb Pharma Sa Biological products

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5677425A (en) * 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
EP2409990A1 (en) * 2009-03-19 2012-01-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AALBERSE R.C. ET AL.: "IgG4 breaking the rules.", IMMUNOLOGY, WILEY-BLACKWELL PUBLISHING LTD., GB, vol. 105, no. 1, 1 January 2002 (2002-01-01), GB, pages 9 - 19, XP002987706, ISSN: 0019-2805, DOI: 10.1046/j.0019-2805.2001.01341.x *
BLOOM J W, ET AL: "Intrachain disulfide bond in the core hinge region of human IgG4", PROTEIN SCIENCE, WILEY, US, vol. 6, no. 2, 1 January 1997 (1997-01-01), US, pages 407 - 415, XP002329379, ISSN: 0961-8368 *
KOLFSCHOTEN MARIJN VAN DER NEUT; SCHUURMAN JANINE; LOSEN MARIO; BLEEKER WIM K; MARTINEZ-MARTINEZ PILAR; VERMEULEN ELLEN; DEN BLEKE: "Anti-inflammatory activity of human IgG4 antibodies by dynamic Fab arm exchange", SCIENCE, AMERICAN ASSOCIATION FOR THE ADVANCEMENT OF SCIENCE, US, vol. 317, no. 5844, 1 September 2007 (2007-09-01), US, pages 1554 - 1557, XP009104480, ISSN: 0036-8075, DOI: 10.1126/science.1144603 *
SCHUURMAN J, ET AL: "The inter-heavy chain disulfide bonds of IgG4 are in equilibrium with intra-chain disulfide bonds", MOLECULAR IMMUNOLOGY., PERGAMON, GB, vol. 38, no. 1, 1 January 2001 (2001-01-01), GB, pages 1 - 8, XP002329378, ISSN: 0161-5890, DOI: 10.1016/S0161-5890(01)00050-5 *

Also Published As

Publication number Publication date
DK2817333T3 (da) 2020-03-16
CN104245729B (zh) 2018-11-16
JP6308953B2 (ja) 2018-04-11
IL234107A0 (en) 2014-09-30
JP2015514684A (ja) 2015-05-21
IL234107B (en) 2019-12-31
JP2020090514A (ja) 2020-06-11
MX2014010021A (es) 2014-12-05
SG11201404900YA (en) 2014-11-27
AU2013224004A1 (en) 2014-09-18
KR20140130711A (ko) 2014-11-11
EP2817333A1 (en) 2014-12-31
US20150017169A1 (en) 2015-01-15
CA2865261A1 (en) 2013-08-29
CN104245729A (zh) 2014-12-24
AU2018201233B2 (en) 2019-06-06
HK1202565A1 (en) 2015-10-02
WO2013124451A1 (en) 2013-08-29
EA201491571A1 (ru) 2015-02-27
MX356301B (es) 2018-05-23
EP3670531A1 (en) 2020-06-24
GB201203071D0 (en) 2012-04-04
EP2817333B1 (en) 2020-01-08
JP2018127465A (ja) 2018-08-16
IL267225A (en) 2019-08-29
ES2773123T3 (es) 2020-07-09
AU2018201233A1 (en) 2018-03-15
AU2013224004B2 (en) 2017-11-23
KR102077332B1 (ko) 2020-02-17
US9902768B2 (en) 2018-02-27
KR20200018707A (ko) 2020-02-19
IL267225B (en) 2020-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11059911B2 (en) Sequence symmetric modified IgG4 bispecific antibodies
AU2018201233B2 (en) Sequence symmetric modified IgG4 bispecific antibodies
US20200157204A1 (en) Antibodies of the Class IGG4

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM