KR20140130711A - 서열 비대칭형 변형 igg4 ２특이성 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 각각 적어도 가변 영역, 힌지 영역 및 CH1 도메인을 포함하는 2개의 중쇄 또는 중쇄 단편을 포함하는 비대칭형 항체로서,
제1 중쇄 또는 이의 단편은 클래스 IgG4이며,
a. CH1 도메인에서, 카밧 넘버링 시스템에 따라 넘버링할 경우, 127 위치의 사슬간 시스테인이 또다른 아미노산으로 치환되며;
b. 경우에 따라, 상부 힌지 영역에 위치한 아미노산들 중 1개 이상은 시스테인으로 치환되고,
제2 중쇄 또는 이의 단편은 이 사슬의 일부 또는 전부가 적어도 가변 영역 밖의 영역(예, 불변 영역)에서 상기 제1 중쇄와 상이한 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 항체, 이를 포함하는 제형, 상기 둘 모두의 치료적 용도, 및 상기 항체 및 제형의 제조 방법을 제공한다.

Description

서열 비대칭형 변형 IGG4 ２특이성 항체{SEQUENCE ASYMMETRIC MODIFIED IGG4 BISPECIFIC ANTIBODIES}
본 발명은 돌연변이된 IgG4 중쇄 또는 단편 및 상기 IgG4 사슬과는 별개인 제2 중쇄 또는 단편을 포함하는 대칭형 항체에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 대칭형 항체를 포함하는 조성물 및 치료에 있어서의 항체 및 이를 포함하는 조성물의 용도까지 연장된다. 추가의 측면에서, 본 발명은 항체 및 제형의 제조 방법 및 항체를 코딩하는 벡터와 이를 발현하는 숙주까지 연장된다.
재조합 단백질, 모노클로날 항체(mAb) 및 핵산 기재의 약물을 포함하는 생물의약품 산업은 급속하게 성장하고 있다. 항체 엔지니어링에 의해 항체 단편 또는 대안적인 포맷이 설계 및 생성되었다. 항체 기재의 단백질을 치료제로 선택할 때 생성 수율, 단백질 품질 및 보관 안정성과 같은 다른 측면과 함께 바람직한 분자 포맷이 고려된다.
모든 면역글로불린(Ig) 분자의 기본 구조는 2개의 동일한 중쇄(HC) 및 2개의 동일한 경쇄(LC)를 포함하며, 상기 중쇄와 상기 경쇄는 디술피드 결합에 의해 커플링된다. 각각의 LC는 가변 도메인(VL) 및 불변 도메인(CL)으로 이루어진다. HC를 기초로 하면, 하기 5가지의 주요 Ig 클래스가 인식된다: IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM. IgG에 있어서, HC는 1개의 가변 도메인(VH) 및 3개의 불변 도메인(CH1-3)으로 이루어진다. CH2 및 CH3 도메인은 이펙터 기능을 자극하는 데 책임이 있고 힌지(hinge) 영역에 의해 Fab 단편(VHVL 및 CHCL)에 연결된 분자의 Fc 부분을 형성하는데, 상기 힌지 영역은 IgG 분자에 가요성을 부여한다. 2개의 항원 인식 부위는 VL 및 VH 도메인의 말단에 위치한다. IgG는 하기의 4가지의 상이한 이소타입으로 추가로 세분화된다: IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4.
Fc 매개된 이펙터 기능, 즉, 항체 의존성 세포 독성(ADCC) 또는 보체 의존성 세포 독성(CDC)은 이소타입 의존성이다. 각각의 이소타입은 체내에서 특정 기능을 수행하도록 진화되었다. IgG1 이소타입은 그의 연장된 반감기, 향상된 ADCC 활성화 및 보체 활성화로 인하여 치료제로서 현재 가장 널리 사용되고 있다. 표적 및 요망되는 효과에 대하여 적절할 경우 다른 이소타입이 치료제로서 이용된다. 예를 들어, 표적 항원이 단순히 중화되고 이펙터 기능이 덜 중요한 경우, 대안적인 이소타입, 예컨대 IgG2 및 IgG4가 사용될 수 있다. 대안적으로, 재엔지니어링된 Fc/이펙터 기능을 갖는 IgG가 고려될 수 있다.
IgG2는 또한 최소의 회합 이펙터 기능을 갖지만, 이량체화되기 쉬운데, 상기 이량체화는 완전히 이해된 것은 아니다.
IgG4는 그의 이펙터 기능 유도의 상대적인 결여 때문에 여전히 유용한 이소타입이다. 그러나, IgG4는 일부의 고유한 실제적인 어려움, 즉, 그의 더욱 짧은 혈청중 반감기 및 "Fab-아암(arm) 교환"(동적 중쇄 교환 또는 중쇄 교환으로도 칭해짐)을 겪는 그의 능력을 또한 가지며, 여기서, 1개의 항체의 중쇄 및 그의 부착된 경쇄는 또다른 항체의 중쇄 및 그의 부착된 경쇄와 교환되어 2개의 중쇄 및 2개의 부착된 경쇄로 구성된 또다른 완전 항체를 형성한다(문헌[van der Neut Kolfschoten et al., 2007 Science 317, 1554-1557]).
생체내에서, Fab-아암 교환은, 상이한 가변 도메인으로 인하여, 특유한 표적 항원들을 동시 인게이지(co-engage)할 수 있는 2특이성 항체를 생성한다. 이는 2특이성이지만 기능적으로는 1가인 것으로 관찰된 큰 백분율의 순환 IgG4를 생성한다. (문헌[Schuurman,J., Van Ree,R., Perdok,G.J., Van Doorn,H.R., Tan,K.Y., Aalberse,R.C., 1999. Normal human immunoglobulin G4 can be bispecific: it has two different antigen-combining sites. Immunology 97, 693-698]).
시험관 내에서, IgG4 항체가 비환원 SDS-PAGE에 의해 분석될 경우, 상기 항체는 전형적으로 1개의 중쇄의 힌지 영역 내에서 중쇄내 디술피드 결합의 형성으로 인하여 중쇄간 디술피드 결합의 부재에 의해 야기되는 공유적 회합 중쇄-경쇄 단일 쌍을 각각이 포함하는 소위 "반분자"를 형성하는 것으로 관찰되었다. "반분자"의 중쇄는 그의 중쇄 쌍형성 파트너와 비공유적으로 회합될 수 있으며, 상기 회합은 CH3:CH3 도메인 상호작용에 의해 유지된다. 용액에 있어서, 실제로 그러한 '반분자'는 크기 배제 크로마토그래피와 같은 방법을 사용하여 관찰해 보면 완전한 크기인데, 이는 대략 150 kDa이지만, 비환원 SDS-PAGE에서는 75 kDa의 LC:HC 쌍(소위 "반분자")으로 이루어져 있다.
힌지에서 241 위치(카밧 넘버링(Kabat numbering) 시스템에 따라 넘버링됨)에서 Ser의 Pro로의 돌연변이는 비환원 SDS-PAGE에 의하면 이들 '반분자'의 출현을 감소시킨다(문헌[Angal,S. et al., 1993. A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human(IgG4) antibody as observed during SDS-PAGE analysis Mol Immunol 30, 105-108]). 게다가, 이러한 점 돌연변이는 IgG4의 콤팩트(compact) 구조에 영향을 주지 않음으로써 IgG4가 그의 감소된 보체 활성화 능력을 유지하게 한다.
S241P 돌연변이의 발견 후, IgG4 항체에서의 중쇄간 상호작용을 이해하고, IgG4 이펙터 기능을 감소시키고 구조적 안정성을 향상시키기 위하여 IgG4에 대한 추가의 돌연변이가 조사되었다. 문헌[Schuurman et al., Schuurman,J et al., 2001. The inter-heavy chain disulphide bonds of IgG4 are in equilibrium with intra-heavy chain disulphide bonds. Molecular Immunology 38, 1-8]에서, IgG4의 중쇄간 디술피드 결합의 관찰된 불안정성이 IgG4 돌연변이체를 이용하여 조사되었다. 돌연변이 M1에 있어서 중쇄-경쇄간(CL-CH1) 디술피드 결합에 연루된 Cys 131(EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 것 또는 카밧 넘버링 시스템에 따르면 Cys 127)은 세린으로 대체되었으며, 이 돌연변이체는 경쇄의 이량체 및 중쇄의 이량체를 형성함이 밝혀졌다. 돌연변이체 M2에 있어서 힌지에서의 중쇄간 디술피드 결합에 연루된 시스테인 226(EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링될 경우 226, 또는 카밧 넘버링 시스템에 따르면 239)은 세린으로 대체되었으며, 이 돌연변이체는 IgG4와 비교하여 더욱 안정한 중쇄간 결합을 가졌고 중쇄내 디술피드 결합의 형성을 방지함이 밝혀졌다.
항체의 힌지 영역에 존재하는 시스테인 잔기의 수의 변경은 이전에 조사되었다. 보드머(Bodmer) 등의 미국 특허 제5677425호에는 이펙터 또는 리포터 분자의 부착을 위한 시스테인 티올기의 사용을 용이하게 하기 위하여 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수가 증가될 수 있음이 개시되어 있다. 또한 미국 특허 제5677425호에는, 단일 디술피드 결합을 형성하는 것만이 필요하기 때문에 항체 분자들의 조립을 용이하게 하기 위하여 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수가 1개로 감소될 수 있음이 교시되어 있는데, 이는 힌지 영역을 또다른 힌지 영역에 또는 이펙터 또는 리포터 분자에 부착하기 위한 특정 표적을 제공한다.
대상체에 투여되는 IgG4 항체가 동적 중쇄 교환에 민감하여 "혼합 항체"를 형성한다면, 이 공정이 본 발명의 시험관내 항체의 제조를 위하여 본 발명에서 활용될 수 있다. 유리하게는, 이는 항체의 특성이 조작되게 한다.
치료제로서 사용하기 위한 새로운 항체를 제공할 필요성이 여전히 있다. 본 발명은 예를 들어 야생형 항체와 비교하여, 개선된 생물물리학적 특성을 비롯한 유리한 특성을 가질 수 있는 새로운 돌연변이 항체를 제공한다.
본 발명은 각각이 적어도 가변 영역, 힌지 영역 및 CH1 도메인을 포함하는 2개의 중쇄 또는 중쇄 단편을 포함하는 대칭형 혼합 항체를 제공하며,
여기서, 제1 중쇄 또는 이의 단편은 클래스 IgG4이며,
a) CH1 도메인 내의, 카밧 넘버링 시스템에 따라 넘버링할 경우 127 위치의 사슬간 시스테인이 또다른 아미노산으로 치환되며;
b) 경우에 따라, 상부 힌지 영역 내에 위치한 아미노산 중 1개 이상이 시스테인으로 치환되고,
제2 중쇄 또는 이의 단편은 모든 상기 사슬 중 일부가 적어도 가변 영역 밖의 영역에서 상기 제1 중쇄와 다른 아미노산 서열을 갖는다.
대안적인 측면에서 본 발명은 IgG4 중쇄 또는 중쇄 단편으로 이루어진 대칭형 혼합 항체에 관한 것으로서, 여기서, 상기 중쇄 또는 단편은이 가변 영역, 힌지 영역 및 CH1 도메인을 포함하고, 힌지는 IgG1 타입 힌지가 되도록 돌연변이된다.
각각이 적어도 가변 영역, 힌지 영역 및 CH1 도메인을 포함하는 제1 및 제2 중쇄 또는 중쇄 단편을 포함하는 대칭형 혼합 항체가 또한 제공되며, 여기서, 제1 중쇄 또는 이의 단편은 클래스 IgG4이고 IgG1 타입 힌지를 가지며, 제2 중쇄 또는 이의 단편은 적어도 가변 영역 밖의 영역 내에 상기 제1 중쇄와 다른 아미노산 서열을 갖는다.
일 실시 양태에서, 두 중쇄의 힌지 서열은 유사하거나 동일하다.
본 발명은 이것이 편리하고 쉽게 접근가능한 방법에 의해 항체 특성의 조작 및 제어를 허용하기 때문에 유리하다.
본 발명의 항체는 야생형 IgG4와 비교하여 감소된 중쇄 교환을 나타낼 수 있으며, 이는 생체내에서 야생형 IgG4와의 교환이 거의 없거나 전혀 없음을 나타내는 비대칭형(예컨대 2특이성 항체)을 제공하는데, 그 이유는 IgG4와 비교하여 그의 감소된 교환 성향 때문이며 또한 천연 순환 IgG4 항체와 비교하여 생체내에서 비대칭 혼합 항체의 상대적으로 낮은 농도 때문이다.
본 발명의 항체는 IgG4 야생형과 비교하여 생체내 농도보다 더 큰 농도, 예를 들어 0.5 mM 이상의 농도에서 감소된 중쇄 교환을 나타낼 수 있다. 본 발명의 항체는 야생형 IgG4와 비교하여 감소된 중쇄 교환을 나타내지만, 본 발명의 항체는 IgG1 야생형 및 IgG4 S241P와 비교하여, 소정의 정도의 중쇄 교환을 나타내는데, 이는 시험관내에서 (상이한 항원 특이성을 갖는 2가지 항체와 같은) 2가지 상이한 항체로부터 혼합 비대칭형(예컨대 2특이성 항체)을 생성하기에 충분하다.
따라서 일 실시 양태에서, 본 발명의 항체는 시험관내에서 5 mM GSH를 이용하여 교환될 수 있지만 0.5 mM GSH를 이용해서는 그렇게 될 수 없다. 후자는 생체내 교환 장벽을 더욱 가깝게 모방한다. 도 20은 Ab28(C127S Y229C)이 5 mM GSH에서 WT, S241G, S241A 또는 S241T와 교환되지만 0.5 mM에서는 그러하지 않다는 점에서 이를 예시한다.
따라서, 본 발명은 본원에 정의된 제1 중쇄 서열 또는 이의 단편을 포함하는 대칭형 항체를 취하는 단계, 및 시험관내에서 상기 항체를, 상기 제1 중쇄 서열과 다른 제2 중쇄 서열 또는 이의 단편을 포함하는 제2 대칭형 항체와 혼합하는 단계로서 상기 두 항체 사이의 중쇄 교환에 도움이 되는 조건 하에서의 단계, 및 경우에 따라, 이로부터 수득된 비대칭형 혼합 항체의 단리 단계를 포함하는, 비대칭형 혼합 항체의 제조 방법을 또한 제공한다. 일 실시 양태에서, 본 방법은 2특이성 항체를 제공하는데, 이는 2가지 항체를 혼합하는 단계를 포함하며, 여기서, 제1 항체 내의 가변 영역의 항원 특이성은 제2 항체 내의 가변 영역의 항원 특이성과 다르다.
일 실시 양태에서, 항체는 1가이다.
본 발명의 방법은 의도된 치료 용도에 대하여 맞춤식으로 되고 최적화된 최종 치료 분자가 제공되도록 항체의 특성이 완전히 조작되게 한다.
게다가, 본 발명에 따른 항체는 이것이 낮은 수준의 이펙터 기능을 갖고/갖거나 가교결합에 참여하지 않는다는 점에서 유리할 수 있다.
도 1a는 IgG1 야생형 및 IgG4 야생형의 인간 CH1 및 힌지 서열, 및 카파 경쇄 불변 서열을 나타내며, 여기서, 힌지 잔기에는 밑줄이 그어져 있다.
도 1b는 사슬간 CL-CH1 디술피드 결합을 형성하는 시스테인(밑줄이 그어져 있음)을 표시한, 인간 카파 경쇄 불변 서열;
사슬간 CL-CH1 디술피드 결합을 형성하는 시스테인 위치(IgG1의 경우 상부 힌지 내, 그리고 IgG 2, 3 및 4의 경우 N-말단 CH1 내)가 표시된(밑줄이 그어진), 인간 IgG 1, 2, 3 및 4 중쇄 N-말단 CH1 서열 및 힌지 영역 서열;
사슬간 CL-CH1 디술피드 결합을 형성하는, N-말단 CH1 서열 내의 시스테인 위치가 표시된(밑줄이 그어진), 인간 IgD 중쇄 N-말단 CH1 잔기 및 일부의 힌지 영역의 서열;
사슬간 CL-CH1 디술피드 결합을 형성하는, N-말단 CH1 서열 내의 시스테인 위치가 표시된(밑줄이 그어진), 인간 IgM 중쇄 N-말단 CH1, C-말단 CH1 잔기 및 선택된 N-말단 CH2 잔기; 및
밑줄이 그어진 잔기는 본 발명의 항체에서 하나 이상의 잔기가 시스테인으로 치환될 수 있는 위치를 지시하는, IgG3 및 IgG4의 상부 힌지, IgD의 힌지 및 IgM의 C-말단 CH1 및 CH2 내의 잔기를 나타낸다.
도 2a는 IgG1 야생형, IgG4 야생형의 상부 및 코어 힌지 잔기와 경쇄 내의 시스테인과 사슬간 디술피드 결합을 형성하는 CH1 시스테인 잔기(C127) 및 본 발명의 IgG4 항체에서 돌연변이가 도입된 위치를 나타낸다.
도 2b는 IgG3 야생형의 힌지 잔기와 경쇄 내의 시스테인과 사슬간 디술피드 결합을 형성하는 CH1 시스테인 잔기(C127) 및 본 발명의 IgG3 항체에서 1개 이상의 잔기가 시스테인으로 치환된 위치를 나타낸다.
도 2c는 IgM 야생형의 선택된 CH1 및 CH2 잔기와 경쇄 내의 시스테인과 사슬간 디술피드 결합을 형성하는 CH1 시스테인 잔기(C127) 및 본 발명의 IgM 항체에서 1개 이상의 잔기가 시스테인으로 치환된 위치를 나타낸다.
도 2d는 IgD 야생형의 힌지 잔기와 경쇄 내의 시스테인과 사슬간 디술피드 결합을 형성하는 CH1 시스테인 잔기(C128) 및 본 발명의 IgD 항체에서 1개 이상의 잔기가 시스테인으로 치환된 위치를 나타낸다.
도 3a는 본 발명에 따라 IgG4 항체 내에 도입된 돌연변이를 나타낸다.
도 3b는 도 3a에 나타낸 IgG4 항체의 돌연변이된 중쇄 내의 잔기의 위치 및 경쇄(LC) 내의 시스테인과 또는 또다른 돌연변이된 중쇄(HC)와 형성할 수 있는 예측된 디술피드 결합을 나타낸다. 시스테인이 LC 또는 HC 내의 시스테인과 결합할 수 있는 경우, 밑줄이 그어진 사슬은 예측된 우세한 디술피드 결합 배치이다.
도 4a는 본 발명에 따라 IgG4 항체 내에 도입된 돌연변이를 나타낸다.
도 4b는 도 4a에 나타낸 IgG4 항체 내의 시스테인 잔기의 위치 및 경쇄(LC) 또는 중쇄(HC) 내의 시스테인과 형성할 수 있는 예측된 디술피드 결합을 나타낸다. 시스테인이 LC 또는 HC 내의 시스테인과 결합할 수 있는 경우, 밑줄이 그어진 사슬은 예측된 우세한 디술피드 결합 배치이다.
도 5는 다양한 서열을 나타낸다.
도 6은 다양한 서열을 나타낸다.
도 7은 본 발명에 따른 항체의 웨스턴 블롯(Western Blot) 분석을 나타내며, 이때 상부 겔은 항-인간 Fc 항체를 이용한 결과를 나타내고, 하부 겔은 항-카파 항체를 이용한 결과를 나타낸다.
도 8은 본 발명에 따른 항체의 웨스턴 블롯 분석을 나타내며, 이때 상부 겔은 항-인간 Fc 항체를 이용한 결과를 나타내고, 하부 겔은 항-인간 카파 항체를 이용한 결과를 나타낸다.
도 9는 본 발명에 따른 항체의 웨스턴 블롯 분석을 나타내며, 이때 상부 겔은 항-인간 Fc 항체를 이용한 결과를 나타내고, 하부 겔은 항-인간 카파 항체를 이용한 결과를 나타낸다.
도 10은 본 발명에 따른 항체의 웨스턴 블롯 분석을 나타내며, 이때 상부 겔은 항-인간 Fc 항체를 이용한 결과를 나타내고, 하부 겔은 항-인간 카파 항체를 이용한 결과를 나타낸다.
도 11은 본 발명의 항체의 서모플루오르(Thermofluor) 분석 결과를 나타내며, 이는 Fab 및 CH2 도메인의 열안정성을 나타낸다.
도 12는 본 발명의 항체의 서모플루오르 분석 결과를 나타내며, 이는 Fab 및 CH2 도메인의 열안정성을 나타낸다.
도 13은 본 발명의 항체의 서모플루오르 분석 결과를 나타내며, 이는 Fab 및 CH2 도메인의 열안정성을 나타낸다.
도 14는 본 발명의 항체의 서모플루오르 분석 결과를 나타내며, 이는 Fab 및 CH2 도메인의 열안정성을 나타낸다.
도 15는 본 발명의 선택된 항체의 열안정성의 순위를 나타낸다.
도 16은 GSH의 2가지 농도에서의 16시간에서의 중쇄 교환을 나타내며, 여기서, 제1 항체는 IgG1 야생형, IgG4 야생형 및 다양한 돌연변이 항체로부터 선택되며, 제2 항체는 IgG4 야생형이다. 본 도면은 돌연변이체가 야생형 IgG4 항체보다 약간 더 적은 교환 및 IgG1 야생형 항체 및 IgG4 P 항체보다 유의하게 더 큰 교환을 가짐을 나타낸다. 이는, 교환을 이용하여 본 발명의 비대칭형 항체를 제조할 수 있다는 점에서 유리한데, 이는 생체내에서 야생형 IgG4 항체보다 교환을 겪는 민감성이 더 적다. 일부 예에서, 환원제, 예컨대 GSH의 농도를 증가시키면 관찰되는 교환의 양이 증가한다.
도 17은 241 위치에 대안적인 잔기를 갖는 타입 1 가변 영역을 포함하는 돌연변이체의, 타입 2 가변 영역과의 비대칭 교환의 분석을 나타낸다.
도 18은 상이한 S241 및 코어 힌지 시스테인 돌연변이체들과 함께 인큐베이션된, 타입 1 가변 영역을 갖는 IgG4 WT의, 타입 2 가변 영역과의 비대칭 교환의 분석을 나타낸다.
도 19는 상이한 S241 돌연변이체들, IgG4 C127S Y229C(Ab8)와 함께 인큐베이션된, 타입 1 가변 영역을 갖는 IgG4 S241P의, 타입 2 가변 영역과의 비대칭 교환의 분석을 나타낸다.
도 20은 상이한 S241 돌연변이체들 및 IgG4 WT와 함께 인큐베이션된, 타입 1 가변 영역을 갖는 IgG4 C127S Y229C(번호 : 28)의, 타입 2 가변 영역과의 비대칭 교환의 분석을 나타낸다.
도 21은 다수의 돌연변이체들과 함께 인큐베이션된, 타입 1 가변 영역을 갖는 이중 힌지 돌연변이체들의, 타입 2 가변 영역과의 비대칭 교환의 분석을 나타낸다.
서열의 간단한 설명
서열 번호 1은 IgG1 야생형 항체의 CH1 및 힌지 영역 서열을 나타낸다.
서열 번호 2는 IgG4 야생형 항체의 CH1 및 힌지 영역 서열을 나타낸다.
서열 번호 3은 인간 야생형 카파 경쇄의 불변 영역의 일부를 나타낸다.
서열 번호 4는 인간 IgG1 항체의 CH1 도메인의 N-말단 서열의 일부를 나타낸다.
서열 번호 5는 인간 IgG1 항체의 힌지 영역을 나타낸다.
서열 번호 6은 인간 IgG2 항체의 CH1 도메인의 N-말단 서열의 일부를 나타낸다.
서열 번호 7은 인간 IgG2 항체의 힌지 영역을 나타낸다.
서열 번호 8은 인간 IgG3 항체의 CH1 도메인의 N-말단 서열의 일부를 나타낸다.
서열 번호 9는 인간 IgG3 항체의 힌지 영역을 나타낸다.
서열 번호 10은 인간 IgG4 항체의 CH1 도메인의 N-말단 서열의 일부를 나타낸다.
서열 번호 11은 인간 IgG4 항체의 힌지 영역을 나타낸다.
서열 번호 12 내지 37은 각각 항체 6, 7, 8, 15, 16, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 44, 45, 46, 47, 2, 3, 48, 28P 및 44P의 CH1 도메인 및 힌지 영역 서열을 나타낸다.
서열 번호 38 내지 63은 각각 항체 6, 7, 8, 15, 16, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 44, 45, 46, 47, 2, 3, 48, 28P 및 44P의 CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인 서열을 나타낸다.
서열 번호 64는 야생형 IgG4 CH2 및 CH3 도메인 서열을 나타낸다.
서열 번호 65는 야생형 IgG4 CH2 및 야생형 IgG1 CH3 도메인 서열을 나타낸다.
서열 번호 66은 인간 야생형 카파 경쇄의 불변 영역 서열을 나타낸다.
서열 번호 67은 인간 IgD 항체의 CH1 도메인의 N-말단 서열의 일부를 나타낸다.
서열 번호 68은 인간 IgGD 항체의 힌지 영역의 일부를 나타낸다.
서열 번호 69는 인간 IgM 항체의 CH1 도메인의 N-말단 서열의 일부를 나타낸다.
서열 번호 70은 인간 IgM 항체의 CH1 도메인의 C-말단 서열의 일부를 나타낸다.
서열 번호 71은 인간 IgM 항체의 CH2 도메인의 일부를 나타낸다.
서열 번호 72 내지 295는 다양한 힌지 영역을 나타낸다.
서열 번호 296 내지 305는 각각 항체 1, 4, 5, 5P, 9, 10, 11, 12, 13 및 14의 CH1 도메인 및 힌지 영역 서열을 나타낸다.
서열 번호 306 내지 315는 각각 항체 1, 4, 5, 5P, 9, 10, 11, 12, 13 및 14의 CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인 서열을 나타낸다.
서열 번호 316 내지 322는 다양한 힌지 서열 및 이의 일부를 나타낸다.
본원에서 이용될 때, 비대칭형 항체는 2개의 중쇄 또는 이의 단편이 가변 영역 밖의 영역에서 부분적으로 또는 완전히 상이한 아미노산 서열, 예를 들어 관련 부분에 비해 98% 미만의 유사성, 예컨대 관련 부분에 비해 97, 96, 95% 미만의 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 일 실시 양태에서, 10개의 연속 아미노산의 영역에서 1, 2, 3, 4, 5개 아미노산이 상이하거나 부가된다. 또한 상기 아미노산 서열은 상이한 길이의 것일 수 있는데, 이는 필요에 의해서 상기 아미노산 서열이 상이해지게 한다. 중쇄의 일부는 유사하거나 동일한 서열을 가질 수 있으며, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역은 동일하거나 상이할 수 있다.
일 실시 양태에서, 본 발명의 항체에서의 중쇄 서열들은 예를 들어 사슬간 디술피드 결합, 예를 들어 상응하는 야생형 단편에 천연적으로 존재하는 결합 또는 사슬 내의 요망되는 위치에 존재하도록 유전자 엔지니어링된 결합을 통하여 공유 결합된다.
일 측면에서, 본 발명의 항체는 제1 중쇄 IgG4 서열 또는 단편이 IgG1 타입 힌지를 갖는 것을 특징으로 한다.
일 측면에서, 본 발명의 항체는 둘 모두의 중쇄 서열들 또는 단편들이 IgG1 타입 힌지를 갖는 것을 특징으로 한다.
야생형 IgG1의 상부 및 코어 힌지는 서열 EPKSCDKTHTCPPCP(서열 번호 316)를 갖는다.
야생형 IgG4의 상부 및 코어 힌지는 서열 ESKYGPPCPSCP(서열 번호 317)를 갖는다.
본원에서 이용될 때, IgG1 타입 힌지는 1개 이상, 예를 들어 1 내지 5개, 예컨대 1, 2 또는 3개의 아미노산이 IgG4 힌지 내에, 특히 EPKYGPP(서열 번호 318)와 CPSC 사이에 삽입되고/되거나 IgG4 힌지 내의 아미노산 YGPP 중 1개 이상이 대체되어 예를 들어 IgG1 힌지 내의 아미노산에 상응하도록 된, 특히 (IgG4 힌지 내의 YGPP로부터의) G가 C로 대체되거나 (IgG4 힌지 내의 YGPP로부터의) Y가 C 또는 S로 대체된 경우를 나타내는 것으로 의도된다.
따라서, 본 발명은 상부 힌지, 코어 및 하부 힌지를 갖는 제1 IgG4 중쇄를 포함하는 비대칭형 혼합 항체를 또한 제공하며, 그 안의 각각의 중쇄 또는 중쇄 내의 상기 상부 힌지 및 코어는 13 내지 17개 아미노산, 예컨대 15개 아미노산의 길이를 갖는다.
일 실시 양태에서, 제1 IgG4 중쇄를 갖는 비대칭형 혼합 항체는 15개 아미노산의 길이의 상부 힌지 및 코어를 갖는다.
일 실시 양태에서, 적어도 제1 중쇄의 상부 힌지 및 코어는 IgG4 힌지에서 발견되는 12개의 천연 아미노산 및 추가의 3개의 아미노산, 예를 들어 3개의 알라닌 잔기, 또는 3개의 글리신 잔기 또는 이들의 조합을 포함한다.
일 실시 양태에서, 힌지는 하기 서열 중 하나를 갖는다:
ESKYGPPAAACPSCP 서열 번호 72; ESKYGPPGGGCPSCP 서열 번호 73;
ESKYGPPTHTCPSCP 서열 번호 74; ESKYGDKTHTCPSCP 서열 번호 75;
EPSKYGPPAAACPSCP 서열 번호 76; EPSKYGPPGGGCPSCP 서열 번호 77;
EPSKYGPPTHTCPSCP 서열 번호 78; EPSKYGDKTHTCPSCP 서열 번호 79;
ESKSYGPPAAACPSCP 서열 번호 80; ESKSYGPPGGGCPSCP 서열 번호 81;
ESKSYGPPTHTCPSCP 서열 번호 82; ESKSYGDKTHTCPSCP 서열 번호 83;
ESKYGPPAAACPPCP 서열 번호 84; ESKYGPPGGGCPPCP 서열 번호 85;
ESKYGPPTHTCPPCP 서열 번호 86; ESKYGDKTHTCPPCP 서열 번호 87;
EPSKYGPPAAACPPCP 서열 번호 88; EPSKYGPPGGGCPPCP 서열 번호 89;
EPSKYGPPTHTCPPCP 서열 번호 90; EPSKYGDKTHTCPPCP 서열 번호 91;
ESKSYGPPAAACPPCP 서열 번호 92; ESKSYGPPGGGCPPCP 서열 번호 93;
ESKSYGPPTHTCPPCP 서열 번호 94; ESKSYGDKTHTCPPCP 서열 번호 95.
일 실시 양태에서, 본 발명의 적어도 제1 IgG4 중쇄 내의 상부 힌지 및 코어는 천연 IgG1 힌지, 즉, EPKSCDKTHTCPPC(서열 번호 96) 또는 이의 유도체, 예컨대 하기 서열로 이루어진다:
EPKSCDKAAACPPCP 서열 번호 97; EPKSCDKGGGCPPCP 서열 번호 98;
EPKSCDKTHTSPPCP 서열 번호 99; EPKSCDKTHTCPPSP 서열 번호 100;
EPKSCDKTHTSPPSP 서열 번호 101; EPKSCDKAAASPPCP 서열 번호 102;
EPKSCDKAAACPPSP 서열 번호 103; EPKSCDKAAASPPSP 서열 번호 104;
EPKSCDKGGGSPPCP 서열 번호 105; EPKSCDKGGGCPPSP 서열 번호 106;
EPKSCDKGGGSPPSP 서열 번호 107.
일반적으로, 본 비대칭형 혼합 항체의 중쇄 각각에서의 힌지 영역은 적어도 양립가능하다. 즉, 중쇄가 쌍을 형성할 때, 그 배치는 예를 들어 힌지 영역 내의 내부 스트레인(strain)으로 인하여 불안정하지 않다.
일 실시 양태에서, 각각의 중쇄의 힌지 영역은 본원에 개시된 힌지 서열로부터 독립적으로 선택되는 서열을 포함한다.
일 실시 양태에서, 중쇄 각각에서의 힌지는 유사하거나 동일하다. 이는 이것이 상기 두 사슬의 힌지 영역들의 양립불가능성을 최소화할 수 있다는 점에서 유리할 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 각각이 가변 영역, CH1 도메인 및 힌지 영역을 포함하는 2개의 IgG4 중쇄를 포함하는 비대칭형 혼합 항체를 제공하며, 여기서, 제1 중쇄에서
a. CH1 도메인 내의, 카밧 넘버링 시스템에 따라 넘버링할 경우 127 위치의 사슬간 시스테인은 또다른 아미노산으로 치환되며;
b. 그 안의 중쇄 또는 각각의 중쇄 내의 힌지는 12 내지 17개의 범위의, 예컨대 15개 아미노산의 길이를 갖고,
제2 중쇄의 일부 또는 전부는 적어도 가변 영역 밖의 영역에서 상기 제1 중쇄와 상이한 아미노산 서열을 갖는다.
적합한 힌지는 상기에 기술되어 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 각각이 CH1 도메인 및 힌지 영역을 포함하는 2개의 IgG4 중쇄를 포함하는 비대칭형 항체를 또한 제공하며, 여기서, 제1 중쇄에서
a. 카밧 넘버링 시스템에 따라 넘버링할 경우 127 위치의 시스테인은 또다른 아미노산으로 치환되며;
b. 카밧 넘버링 시스템에 따라 넘버링할 경우 239 위치의 시스테인 또는 242 위치의 시스테인은 또다른 아미노산으로 치환되고,
제2 중쇄의 일부 또는 전부는 적어도 가변 영역 밖의 영역에서 상기 제1 중쇄와 상이한 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 후자의 측면에 따른 일 실시 양태에서, 적어도 IgG4 중쇄는 힌지 내에 22개의 아미노산을 함유하며, 이는 예를 들어 상기에 기술된 바와 같다.
제2 중쇄 서열 및 단편은 임의의 항체 중쇄를 포함하는데, 이는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4(상기에 기술된 타입의 것을 포함함), IgD 및 IgM을 포함한다.
추가의 실시 양태에서, 본 발명은 각각이 CH1 도메인 및 힌지 영역을 포함하는 2개의 IgG3 중쇄를 포함하는 비대칭형 혼합 항체를 또한 제공하며, 여기서, 제1 중쇄에서
a. 경쇄 내의 시스테인과 사슬간 디술피드 결합을 형성하는 CH1 도메인 내의 시스테인은 또다른 아미노산으로 치환되며;
b. 상부 힌지 영역 내에 위치하는 아미노산들 중 1개 이상은 시스테인으로 치환되고,
제2 중쇄의 일부 또는 전부는 적어도 가변 영역 밖의 영역에서 상기 제1 중쇄와 상이한 아미노산 서열을 갖는다.
추가의 실시 양태에서, 본 발명은 각각이 CH1 도메인 및 CH2 도메인을 포함하는 2개의 IgM 중쇄를 추가로 포함하는 비대칭형 혼합 항체를 제공하며, 예를 들어, 여기서, 제1 중쇄에서
a. 경쇄 내의 시스테인과 사슬간 디술피드 결합을 형성하는 CH1 도메인 내의 시스테인은 또다른 아미노산으로 치환되며;
b. CH1 도메인 또는 CH2 도메인 내에 위치하는 아미노산들 중 1개 이상은 시스테인으로 치환되고,
제2 중쇄의 일부 또는 전부는 적어도 가변 영역 밖의 영역에서 상기 제1 중쇄와 상이한 아미노산 서열을 갖는다.
추가의 실시 양태에서, 본 발명은 예를 들어 각각이 CH1 도메인 및 힌지 영역을 포함하는 2개의 IgD 중쇄를 추가로 포함하는 비대칭형 혼합 항체를 제공하며, 여기서, 제1 중쇄에서
a. 경쇄 내의 시스테인과 사슬간 디술피드 결합을 형성하는 CH1 도메인 내의 시스테인은 또다른 아미노산으로 치환되며;
b. 힌지 영역 내에 위치하는 아미노산들 중 1개 이상은 시스테인으로 치환되고,
제2 중쇄의 일부 또는 전부는 적어도 가변 영역 밖의 영역에서 상기 제1 중쇄와 상이한 아미노산 서열을 갖는다.
이론에 구애되고자 함이 없이, IgG4 항체의 CH3 영역은 동적 교환 과정에서 그 역할을 하는 기능을 가질 것으로 의심된다. 따라서, 비IgG4 클래스 항체의 CH3 영역을 IgG4 항체로부터의 CH3 도메인으로 대체하면 돌연변이된 항체가 교환에 더욱 도움이 되게 할 수 있다.
일 실시 양태에서, 경쇄와 중쇄 사이의 사슬간 디술피드 결합의 형성에 자연적으로 연루된 상기 1개 이상의 시스테인(들)은 비시스테인 아미노산으로 대체되며, 이는 둘 모두가 본원에 참고로 포함된 국제 특허 공개 제WO2005/003170호 및 국제 특허 공개 제WO2005/003171호에 기술된 바와 같다.
일 실시 양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 단편 내의 인간 카파 경쇄는 본원에 참고로 포함된 국제 특허 공개 제2008/038024호에 기술된 바와 같이 잔기 171, 156, 202 또는 203 중 1개 이상이 대체된다.
당업자라면, 개선된 항체를 제공하기 위하여, IgG4 항체에 대하여 이루어진 돌연변이가 IgG4 항체와 동일한 디술피드 결합 배치를 갖는 다른 항체 이소타입 또는 클래스에 또한 적용될 수 있음을 인지한다. IgG4 항체와 동일한 디술피드 결합 배치를 갖는 항체의 구체예로는 IgG3 항체, IgM 항체 및 IgD 항체가 있다. 도 1b에 나타낸 바와 같이, IgG3 및 IgM은 CH1 도메인 내의 127 위치에 시스테인을 가지며, IgD는 CH1 도메인 내의 128 위치에 시스테인을 갖는데, 이는 경쇄 내의 시스테인과 사슬간 디술피드 결합을 형성하는, IgG4의 CH1 도메인 내의 C127과 등가이다. 또한, IgG3 및 IgD의 상부 힌지 영역과 IgM 내의 CH2 도메인의 N-말단 영역 및 CH1 도메인의 C-말단 영역은 IgG1의 상부 힌지 영역의 잔기와 등가인 시스테인 잔기를 함유하지 않는다는 것을 도 1b로부터 또한 알 수 있다. 따라서, 본 발명은 경쇄 내의 시스테인과 사슬간 디술피드 결합을 형성하는 CH1 도메인 내의 시스테인이 또다른 아미노산으로 치환되고 IgG1 또는 IgG4의 상부 힌지 영역과 구조적으로 유사한 위치에 있는 1개 이상의 아미노산이 시스테인으로 치환된 IgG3 항체, IgD 항체 및 IgM 항체를 추가로 제공한다. 이들 돌연변이된 중쇄는 예를 들어 본 발명에 따른 항체의 제2 중쇄로서 이용될 수 있다.
일 실시 양태에서, 본 발명에 따른 항체는 2개의 IgG4 클래스 중쇄를 포함한다.
일 실시 양태에서, 본 발명에 따른 항체는 2개의 경쇄를 추가로 포함한다.
일 실시 양태에서, 본 발명에 따른 항체는 2개의 가변 영역을 포함한다.
일 실시 양태에서, 2개의 가변 영역은 동일한 특이성을 가지며, 즉, 이들은 동일 항원에 대하여 특이적이다.
일 측면에서, 본 발명은 가변 영역들이 상이한 특이성을 갖는 비대칭형 혼합 항체, 즉, 2특이성 항체를 제공한다. 즉, 항체가 2개의 중쇄 가변 영역을 포함할 경우 각각의 가변 영역은 상이한 항원에 대하여 특이적이다.
일 실시 양태에서, 각각의 가변 영역은 독립적으로 표적 항원에 결합할 수 있다.
본 발명의 항체 포맷은 이것이 일상적인 항체 제조 방법에 의해 그리고 자연 발생 기작을 이용하여 쉽게 접근가능하다는 점에서 유리하다.
일 실시 양태에서, 하나 또는 둘 모두의 중쇄 C-말단은 예를 들어 중쇄의 가변 영역이 그에 대하여 특이적이지 않은 항원인 특유한 항원에 대하여 특이성을 갖는 도메인 항체에 융합된다.
본 발명에서 사용하기 위한 dAb 또는 단일 도메인 항체로도 공지된 단일 가변 도메인이 당업계에 공지된 방법을 이용하여 생성될 수 있으며, 이는 국제 특허 공개 제WO2005118642호, 문헌[Ward et al., 1989, Nature, 341, 544-546] 및 문헌[Holt et al., 2003, Trends in Biotechnology, 21, 484-490]에 개시된 것을 포함한다. 일 실시 양태에서, 본 발명에서 사용하기 위한 단일 도메인 항체는 중쇄 가변 도메인(VH) 또는 경쇄 도메인(VL)이다. 각각의 경쇄 도메인은 카파 또는 람다 서브그룹 중 어느 하나의 것일 수 있다. VH 및 VL 도메인의 단리 방법은 당업계에서 기술되어 있으며, 예를 들어 유럽 특허 제0368684호 및 워드(Ward) 등의 상기 문헌을 참조한다. 이러한 도메인은 임의의 적합한 종 또는 항체 출발 재료로부터 유래될 수 있다. 일 실시 양태에서, 단일 도메인 항체는 설치류, 인간 또는 다른 종으로부터 유래될 수 있다. 일 실시 양태에서, 단일 도메인 항체는 인간화된다.
일 실시 양태에서, 단일 도메인 항체는 예를 들어 국제 특허 공개 제WO2005/118642호, 문헌[Jesperset al., 2004, Nature Biotechnology, 22, 1161-1165] 및 문헌[Holt et al., 2003, Trends in Biotechnology, 21, 484-490]에 기술된 방법을 이용하여, 파지 디스플레이 라이브러리로부터 유래시킨다. 바람직하게는 이러한 단일 도메인 항체는 완전 인간 항체이지만, 다른 종으로부터 또한 유래될 수 있다. 일단 단리되면, 단일 도메인 항체의 서열은 단일 도메인 항체의 특성, 예를 들어 용해도를 개선시키도록 변형될 수 있음이 인지되는데, 이는 홀트(Holt) 등의 상기 문헌에 기술된 바와 같다.
일 실시 양태에서, 각각의 도메인의 항체는 VH 또는 VHH이다.
일 실시 양태에서, 하나가 각각의 중쇄에 융합된, 2개 도메인의 항체가 있으며, 여기서, 상기 2개 도메인 항체는 항원에 결합하는 VH/VL 쌍을 형성하는데, 상기 항체는 상기 항원에 대하여 동시 작동적으로 특이적이다.
일 실시 양태에서, 본 발명의 항체는 단리되며, 즉, 인체 또는 동물 신체 내에 위치하지 않는다.
"단백질" 및 "폴리펩티드"라는 용어는, 그 문맥이 달리 지시하지 않으면, 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. "펩티드"는 10개 이하의 아미노산을 나타내는 것으로 의도된다.
"폴리뉴클레오티드"라는 용어는, 그 문맥이 달리 지시하지 않으면, 유전자, DNA, cDNA, RNA, mRNA 등을 포함한다.
본원에 사용될 때, 본 명세서의 문맥에서 "포함하는"이라는 용어는 "함유하는" 것으로 해석되어야 한다.
본 발명의 문맥에서 "야생형"이라는 용어는 자연에서 나타날 수 있거나 환경으로부터 단리될 수 있는 항체를 의미하며, 이는 어떠한 유전자 엔지니어링된 돌연변이도 포함하지 않는다.
본원에서 치환 돌연변이체의 표기는 문자, 이어서 숫자, 이어서 문자로 이루어진다. 제1 문자는 야생형 단백질 내의 아미노산을 표기한다. 숫자는 아미노산 치환이 이루어지고 있는 아미노산 위치를 나타내며, 제2 문자는 야생형의 아미노산의 대체에 이용되는 아미노산을 표기한다.
항체 가변 및 불변 도메인 내의 잔기는 카밧 등에 의해 고안된 시스템에 따라 통상적으로 넘버링된다. 이 시스템은 문헌[Kabat et al ., 1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA](이하, "카밧 등의 상기 문헌")에 개시되어 있다.
카밧 잔기 표기가 항상 직접적으로 아미노산 잔기의 선형 넘버링과 부합되는 것은 아니다. 실제 선형 아미노산 서열은 프레임워크이든지 상보성 결정 영역(CDR)이든지 간에, 기본 가변 도메인 구조의 구조적 구성요소의 단축 또는 상기 구조적 구성요소 내로의 삽입에 상응하는 엄격한 카밧 넘버링보다 더 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 잔기의 올바른 카밧 넘버링은 주어진 항체의 서열 내의 상동성의 잔기들을 "표준" 카밧 넘버링 서열에 맞추어 정렬함으로써 주어진 항체에 대하여 결정될 수 있다.
대안적으로, 아미노산 잔기의 넘버링은 EU 인덱스 또는 EU 넘버링 시스템(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991)]에 또한 기술됨)에 의해 수행될 수 있다.
항체의 아미노산 잔기의 추가의 넘버링 시스템으로는 IMGT 넘버링 시스템이 있다(문헌[Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 29, 185-203(2005)]).
EU 넘버링 시스템 또는 IMGT 넘버링 시스템이 사용된다고 달리 지시된 경우를 제외하고는 본 명세서에서 카밧 넘버링 시스템이 사용된다.
4가지의 IgG 이소타입들 사이에서, 중쇄 및 경쇄에서의 사슬내 디술피드 결합 배치는 유사하며, 반면에 사슬간 디술피드 결합 배치는 각각의 이소타입에 있어서 독특하다(문헌[Wypych,J., Li,M., Guo,A., Zhang,Z., Martinez,T., Allen,M.J., Fodor,S., Kelner,D.N., Flynn,G.C., Liu,Y.D., Bondarenko,P.V., Ricci,M.S., Dillon,T.M., Balland,A., 2008. Human IgG2 antibodies display disulphide-mediated structural isoforms. J Biol Chem. 283, 16194-16205]에 개관됨).
도 1b에 나타낸 바와 같이, 4가지의 IgG 이소타입의 힌지 영역 서열들은 상이하다. 전 힌지 영역 또는 유전적 힌지 영역은 전형적으로 잔기 226 내지 251(카밧 넘버링 시스템을 바탕으로 하여 넘버링)로 이루어진다. 도 1b는 4가지의 IgG 이소타입의 힌지 영역의 상부, 코어 및 하부 섹션을 나타낸다. IgG1 이소타입에 있어서, 상부 힌지 영역은 잔기 226 내지 238이며, 코어 힌지 영역은 잔기 239 내지 243이며, 하부 힌지 영역은 잔기 244 내지 251이다. IgG4 이소타입에 있어서, 상부 힌지 영역은 잔기 226 내지 238이며, 코어 힌지 영역은 239 내지 243이며, 하부 힌지 영역은 잔기 244 내지 251이다.
따라서, IgG1 내의 상부 힌지, 코어 및 하부 힌지를 포함하는 힌지는 도 1a에 나타낸 바와 같이 23개 아미노산의 길이를 갖는다. 하부 힌지는 10개 아미노산이다. 코어는 5개 아미노산이며, 하부 힌지는 8개 아미노산이고, 예를 들어 도 1b를 참조한다.
IgG4의 상부 힌지, 코어 및 하부 힌지를 포함하는 힌지는 도 1a에 나타낸 바와 같이 20개 아미노산의 길이를 갖는다. 상부 힌지는 7개 아미노산이다. 코어는 5개 아미노산이며, 하부 힌지는 8개 아미노산이고, 예를 들어 도 1b를 참조한다.
본 발명에 따른 새로운 돌연변이 IgG4 항체는 IgG4 내의 사슬간 디술피드 결합 배치를 변형시킴으로써 개발되었으며, 구체적으로는 경쇄(LC)와 중쇄(HC) 사이의 CL-CH1 사슬간 디술피드 결합 배치가 변형되었다.
도 1b는 IgG 1-4 이소타입에 있어서 인간 IgG 중쇄 및 경쇄 서열의 섹션을 나타내며, 이는 CL-CH1 사슬간 디술피드 결합을 형성하는 시스테인 위치(밑줄이 그어져 있음)를 나타낸다. IgG1의 CL-CH1 사슬간 디술피드 결합은 힌지 영역 바로 앞의 HC의 C233(카밧 넘버링 시스템)과 LC C214(카밧 넘버링 시스템) 사이에서 형성된다. 이와는 대조적으로, IgG2, 3 및 4에 있어서 CH1-CL 디술피드 결합은 HC의 사슬내 디술피드 결합에 대하여 N-말단의 C127과 LC C214 사이에 형성된다. CL-CH1 디술피드 결합 형성에 연루된 시스테인 잔기를 둘러싸고 있는 LC 및 HC 서열이 도 1b에 예시 및 정렬되어 있다.
본 발명은 CL-CH1 디술피드 결합이 IgG4 항체의 특성에 영향을 주는데, 상기 특성은 항체의 열안정성, 구조적 안정성, 디술피드 이소형 이질성, 친화성 및 반분자 교환을 포함한다.
IgG4 돌연변이체는 127 위치의 CH1 내의 시스테인 잔기를 또다른 아미노산으로 치환함으로써 생성될 수 있으며, 이외에도, 상부 힌지 영역 내의 아미노산, 바람직하게는 카밧 넘버링 시스템에 따라 넘버링할 경우 IgG4의 227, 228, 229 및 230으로부터 선택되는 위치의 아미노산을 시스테인으로 치환함으로써 생성될 수 있다. 227, 228, 229 또는 230 위치는 IgG1 시스테인 233이 위치하는 등가의 구조적 위치에 있거나 그 근처에 있다.
각각의 중쇄는 IgG4 힌지 영역 내의 1개 또는 둘 모두의 시스테인 잔기 239 및 242를 또다른 아미노산으로 치환하는 것을 비롯한 추가의 돌연변이를 포함할 수 있다. 238 위치와 239 위치 사이에 3개의 아미노산에 의해 IgG4 상부 힌지 영역을 연장시켜 IgG1 힌지와 동일한 길이가 되게 하는 돌연변이가 일부 항체 중에 또한 포함될 수 있다. S241P 돌연변이가 일부 항체 내에 또한 도입되었다.
따라서 일 실시 양태에서, 또다른 아미노산이 시스테인 127을 치환하고, 경쇄의 시스테인이 227, 228, 229 또는 230 위치의 엔지니어링된 시스테인에 디술피드 결합을 통하여 연결된 IgG4 항체가 제공된다.
일 실시 양태에서, 상부 힌지 및 코어 영역은 하기 서열 중 1개로부터 선택된다:
ESKYGPPCPSCP 서열 번호 108; ESKYGDKCPSCP 서열 번호 109;
EPSKYGPPCPSCP 서열 번호 110; EPSKYGDKCPSCP 서열 번호 111;
ESKSYGPPCPSCP 서열 번호 112; ESKSYGDKCPSCP 서열 번호 113;
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ESKYGDKCPPCP 서열 번호 204; EPSKYGPPCPPCP 서열 번호 205;
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ESKSYGDKTHCPPCP 서열 번호 242; ESKYGPPHTCPPCP 서열 번호 243;
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EPSKYGDKHTCPPCP 서열 번호 246; ESKSYGPPHTCPPCP 서열 번호 247;
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ESKYGDKTCPPCP 서열 번호 250; EPSKYGPPTCPPCP 서열 번호 251;
EPSKYGDKTCPPCP 서열 번호 252; ESKSYGPPTCPPCP 서열 번호 253;
ESKSYGDKTCPPCP 서열 번호 254; ESKYGPPHCPPCP 서열 번호 255;
ESKYGDKHCPPCP 서열 번호 256; EPSKYGPPHCPPCP 서열 번호 257;
EPSKYGDKHCPPCP 서열 번호 258; ESKSYGPPHCPPCP 서열 번호 259;
ESKSYGDKHCPPCP 서열 번호 260; EPKSCDKTHTCPPCP 서열 번호 261;
EPKSCDKTHTCPSCP 서열 번호 262; ESKYCPPACPSCP 서열 번호 263;
ESKYCPPAACPSCP 서열 번호 264; ESKYCPPAAACPSCP 서열 번호 265;
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ESKYCPPSSSCPSCP 서열 번호 272; ESKYCPPTCPSCP 서열 번호 273;
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EPKSCPPCPSCP 서열 번호 284; ESKSCPPCPSCP 서열 번호 285;
EPKYCPPCPSCP 서열 번호 286; ECKYGPPCPSCP 서열 번호 287;
ECKYGPPSPSCP 서열 번호 288; ECKYGPPCPSSP 서열 번호 289;
ESCYGPPCPSCP 서열 번호 290; ESCYGPPSPSCP 서열 번호 291;
ESCYGPPCPSSP 서열 번호 292; ESKCGPPCPSCP 서열 번호 293;
ESKCGPPSPSCP 서열 번호 294; ESKCGPPCPSSP 서열 번호 295.
일 실시 양태에서, 하나 또는 둘 모두의 중쇄 서열 내의 코어 힌지 영역 또는 이의 단편은 CPPCP(서열 번호 322)를 갖는다.
이론에 구애되고자 함이 없이, 이 서열은 "생체내" 유형의 농도에서 항체 아암의 동적 교환을 차단할 가능성이 있다고 생각되며, 예를 들어 0.5 mM 미만의 환원제의 농도, 특히 대략 5 μM의 환원제의 농도가 생리학적으로 관련이 있는 것으로 생각된다(문헌[Zilmer et al., 2005 Drug Design Reviews vol. 2, no. 2, pp. 121-127, 2005].
이제 본 발명의 항체에 대한 돌연변이가 더욱 상세하게 기술된다. 아미노산의 대체 방법은 분자 생물학 분야에 공지되어 있다. 예를 들어 이러한 방법은, 합성 서열의 드 노보(de novo) 설계 또는 아미노산의 결실 및/또는 치환을 위한, PCR과 같은 방법을 이용한 부위 지정 돌연변이 유발을 포함한다.
도 2a는 본 발명의 항체 내에 돌연변이가 도입된 위치, IgG4 야생형 및 IgG1 야생형의 힌지 잔기를 나타낸다. 카밧 넘버링 시스템에 기초하여 넘버링한다.
본 발명에 따른 항체는 127(C127) 위치에 돌연변이를 포함하며, 여기서, 시스테인 잔기는 또다른 아미노산, 바람직하게는 티올기를 함유하지 않는 아미노산으로 대체된다. 치환 또는 대체라는 것은, 항체 중쇄에서 사슬간 시스테인 127이 보통 발견될 경우 그 자리에 또다른 아미노산이 있음을 의미한다. C127에서의 돌연변이는 127 위치의 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드들 중 1개, 2개 또는 3개에 대한 임의의 적합한 돌연변이일 수 있는데, 이는 그 아미노산 잔기를 시스테인으로부터 또다른 적합한 아미노산으로 변화시킨다. 적합한 아미노산의 예는 세린, 트레오닌, 알라닌, 글리신 또는 임의의 극성 아미노산을 포함한다. 특히 바람직한 아미노산은 세린이다.
127 위치의 시스테인을 또다른 아미노산으로 치환하면, 보통 야생형 IgG4 내의 경쇄 내의 시스테인과 디술피드 결합을 형성하는 CH1 도메인 내의 시스테인이 제거된다. 따라서, 사슬간 디술피드 결합을 통하여 경쇄 및 중쇄 쌍을 형성하기 위하여, 경쇄는 중쇄의 힌지 영역에 위치하는 시스테인과 디술피드 결합을 형성해야 한다.
본 발명의 제1 측면에서, 본 발명에 따른 항체는 카밧 넘버링 시스템에 따라 넘버링할 경우 227, 228, 229 및 230으로부터 선택되는 위치의 아미노산들 중 1개 이상이 시스테인으로 치환된 중쇄를 포함한다. 따라서, 본 발명에 따른 항체는 하기 돌연변이 중 1개 이상을 지닐 수 있다: S227C; K228C; Y229C; G230C.
바람직하게는 227, 228, 229 및 230으로부터 선택되는 단지 1개의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된다.
본 발명의 특히 바람직한 실시 양태는 돌연변이 Y229C 또는 G230C를 지닌다.
중쇄의 힌지 영역 내에, 227, 228, 229 및 230으로부터 선택되는 위치의 시스테인 잔기를 포함시키면, 중쇄와 경쇄 사이에 사슬간 디술피드 결합이 형성되는 새로운 위치가 제공된다.
추가의 돌연변이가 본 발명의 이 측면의 항체에 도입될 수 있다. 일 실시 양태에서, 중쇄 내의, 카밧 넘버링 시스템에 따라 넘버링할 경우의 239 위치의 시스테인(C239) 및/또는 242 위치의 시스테인(C242)은 또다른 아미노산, 바람직하게는 티올기를 함유하지 않는 아미노산으로 치환된다. 대체 또는 치환이라는 것은, 시스테인 239 및/또는 시스테인 242가 항체 중쇄에서 보통 발견될 경우 그 자리에 또다른 아미노산이 있음을 의미한다. C239 및/또는 C242에서의 돌연변이는 상기 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드들 중 1개, 2개 또는 3개에 대한 임의의 적합한 돌연변이일 수 있는데, 이는 상기 아미노산 잔기를 시스테인으로부터 또다른 적합한 아미노산으로 변화시킨다. 적합한 아미노산의 예는 세린, 트레오닌, 알라닌, 글리신 또는 임의의 극성 아미노산을 포함한다. 특히 바람직한 아미노산은 세린이다.
일 실시 양태에서, 중쇄 내의 239 위치의 시스테인은 또다른 아미노산으로 치환되며, 중쇄 내의 242 위치의 시스테인은 또다른 아미노산으로 치환된다. 이 실시 양태에서, C239 및 C242 둘 모두의 치환은 중쇄의 힌지 영역 내의 둘 모두의 시스테인 잔기를 제거하는데, 상기 둘 모두의 시스테인 잔기는 보통 중쇄간 디술피드 결합을 또다른 중쇄 내의 상응하는 시스테인과 형성한다. 생성된 반분자는 두 중쇄 사이의 비공유 결합을 통하여 완전 항체 분자를 형성할 수 있다.
대안적인 실시 양태에서, 중쇄 내의 239 위치의 시스테인은 또다른 아미노산으로 치환된다. 이 실시 양태에서, 242 위치의 시스테인은 또다른 아미노산으로 치환되지 않는다.
추가의 대안적인 실시 양태에서, 중쇄 내의 242 위치의 시스테인은 또다른 아미노산으로 치환된다. 이 실시 양태에서, 239 위치의 시스테인은 또다른 아미노산으로 치환되지 않는다.
C239 또는 C242 중 어느 하나의 치환은 또다른 중쇄 내의 시스테인과 중쇄간 디술피드 결합을 형성할 수 있는 중쇄 내의 하나의 시스테인을 남긴다. 이론에 구애됨이 없이, 힌지 영역 내의 1개의 시스테인의 치환, 특히 C239의 치환은 힌지 영역 내에서의 사슬내 디술피드 결합의 형성을 감소시키며, 따라서 항체 반분자의 형성을 감소시킬 수 있다고 생각된다.
본 발명의 일 실시 양태에서, 240 위치의 프롤린은 또다른 아미노산으로 치환될 수 있다.
본 발명의 일 실시 양태에서, 241 위치의 세린은 또다른 아미노산으로 치환될 수 있다.
227 위치의 세린이 시스테인으로 치환된 본 발명의 일 실시 양태에서, 항체는 바람직하게는 C239 및 C242 위치에서 돌연변이를 포함하지 않는다. 227 위치의 세린이 시스테인으로 치환된 또다른 실시 양태에서, 중쇄 내의 239 위치의 시스테인은 바람직하게는 또다른 아미노산으로 치환되지만, 242 위치의 시스테인은 또다른 아미노산으로 치환되지 않는다.
일 실시 양태에서, 본 발명의 항체는 아미노산 226-243 사이에 1개 이상의 아미노산이 삽입되도록 돌연변이된 IgG4 중쇄를 포함한다. 삽입된 아미노산의 수는 1 내지 10개, 1 내지 5개, 1 내지 3개일 수 있으며, 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산이 삽입된다. 아미노산은 바람직하게는 아미노산 238과 아미노산 239 사이에 삽입된다. 임의의 적합한 아미노산, 예컨대 알라닌, 글리신, 세린 또는 트레오닌 및 이들의 조합이 힌지 영역 내에 삽입될 수 있다. 바람직하게는 3개 알라닌(AAA), 3개 글리신(GGG), 3개 세린(SSS) 또는 3개 트레오닌(TTT) 또는 트레오닌, 히스티딘 및 또다른 트레오닌(THT)이 삽입된다. 힌지 영역 내에 3개의 아미노산이 삽입되도록 돌연변이된 IgG4 중쇄를 포함하는 본 발명의 항체는 향상된 안정성, 예를 들어 열안정성을 나타낸다고 여겨진다.
본 발명에 따른 항체 내에 도입될 수 있는 추가의 돌연변이로는 돌연변이 S241P가 있다. 이 돌연변이는 생물학적 관련 농도에서 반분자의 형성을 감소시키는 것으로 이전에 밝혀져 있었다(문헌[Angal,S. et al., 1993. A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human(IgG4) antibody. Mol Immunol 30, 105-108]). 놀랍게도, S241P 돌연변이를 포함하는 본 발명의 돌연변이 항체는 IgG4 P(S241P를 포함하는 IgG4)와 비교하여, 강한 환원 조건 하에서 시험관내에서 약간의 중쇄 교환을 나타낸다는 것이 밝혀졌다. 이는 시험관내에서 본 발명의 돌연변이 IgG4 항체로부터 2특이성 항체를 생성하는 것을 허용한다.
본 발명에 따른 항체는 힌지 영역 내에 1개 이상의 추가의 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체는 하기 돌연변이, S227P, Y229S, P237D 및 P238K 중 1개 이상을 추가로 포함할 수 있다.
일 실시 양태에서, 본 발명에 따른 항체는 잔기 226 내지 243의 IgG1 힌지 영역(상부 힌지 및 코어 힌지)을 효과적으로 포함한다. 따라서, 본 발명의 항체는 230 위치의 글리신이 시스테인으로 치환되고, 227 위치의 세린이 프롤린으로 치환되고, 229 위치의 타이로신이 세린으로 치환되고, 237 위치의 프롤린이 아스파르트산으로 치환되고, 238 위치의 프롤린이 라이신으로 치환되고, 아미노산 서열 트레오닌-히스티딘-트레오닌이 238 위치와 239 위치 사이에 삽입되고, 241 위치의 세린이 프롤린으로 치환된 힌지 영역을 포함한다. 이들 돌연변이는 도 2a에 나타낸 바와 같이, S227P, Y229S, G230C, P237D, P238KTHT 및 S241P로도 표기될 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 잔기 244 내지 251(APEFLGGP 서열 번호 321)의 IgG4 하부 힌지를 갖는다. 이론에 구애됨이 없이, IgG4 하부 힌지 영역은 IgG4 항체의 이펙터 기능의 결여에 기여하는 것으로 여겨진다.
본 발명의 제2 측면에서, 본 발명의 비대칭형 혼합 항체는 중쇄에서, 카밧 넘버링 시스템에 따라 넘버링할 경우 127 위치의 시스테인이 상기에 기술된 바와 같이 또다른 아미노산으로 치환되며, 239 위치의 시스테인 또는 242 위치의 시스테인이 또다른 아미노산으로 치환된 중쇄를 포함한다. 이러한 제2 측면에서, 227, 228, 229 및 230 위치의 잔기들 중 어느 것도 시스테인 잔기로 치환되지 않는다. 따라서,
적어도 가변 영역, 힌지 영역 및 CH1 도메인을 포함하는 2개의 중쇄를 포함하는 비대칭형 혼합 항체로서, 제1 중쇄 또는 이의 단편에 있어서 이것이 클래스 IgG4이고,
a. 카밧 넘버링 시스템에 따라 넘버링할 경우 127 위치의 사슬간 시스테인은 또다른 아미노산으로 치환되며;
b. 경우에 따라, 카밧 넘버링 시스템에 따라 넘버링할 경우 239 위치의 시스테인 또는 242 위치의 시스테인은 또다른 아미노산으로 치환되는 것을 특징으로 하는 항체가 제공되며,
여기서, 제2 중쇄 또는 이의 단편은 이것이 가변 영역 밖의 영역에서 상기 제1 중쇄와 다른 아미노산 서열을 가짐을 특징으로 한다.
본 발명의 제2 측면에서, 항체는 1개 이상의 추가의 돌연변이를 포함할 수 있다. 일 실시 양태에서, 항체는 적어도 제1 IgG4 중쇄를 포함하는데, 상기 중쇄는 아미노산 226-243 사이, 바람직하게는 아미노산 238과 아미노산 239 사이에 3개의 아미노산이 삽입되도록 돌연변이되며, 이는 상기에 기술된 바와 같다. 추가의 실시 양태에서, 항체는 돌연변이 S241P를 포함한다. 추가의 실시 양태에서, 항체는 하기 돌연변이 S227P, Y229S, P237D 및 P238K 중 1개 이상을 추가로 포함할 수 있다.
일 실시 양태에서, 본 발명은 (독립적으로 2개의 중쇄와 같이) 각각이 가변 영역, CH1 도메인 및 힌지를 포함하는 2개의 중쇄를 포함하는 비대칭형 혼합 항체를 제공하며, 각각의 중쇄는 하기 서열 중 1개로부터 선택되는 서열을 독립적으로 포함한다: 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 35, 서열 번호 36 및 서열 번호 37.
일 실시 양태에서, 본 발명의 비대칭형 혼합 항체는 (독립적으로 2개의 중쇄와 같이) 각각이 가변 영역, CH1 도메인 및 힌지를 포함하는 2개의 중쇄를 포함하며, 각각의 중쇄는 하기 서열 중 1개로부터 선택되는 서열을 독립적으로 포함한다: 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 2 3, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 2 9, 서열 번호 30, 서열 번호 3 1, 서열 번호 32 , 서열 번호 35, 서열 번호 36 및 서열 번호 37. 더 구체적으로, 본 발명의 비대칭형 혼합 항체는 (독립적으로 2개의 중쇄와 같이) 각각이 가변 영역, CH1 도메인 및 힌지를 포함하는 2개의 중쇄를 포함하며, 각각의 중쇄는 하기 서열 중 1개로부터 선택되는 서열을 독립적으로 포함한다: 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 3 5, 서열 번호 36 및 서열 번호 37.
따라서, 본 발명은 (독립적으로 2개의 중쇄와 같이) 각각이 가변 영역, CH1 도메인 및 힌지, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 2개의 중쇄를 포함하는 비대칭형 혼합 항체를 제공하는데, 이들 각각은 하기 서열 중 1개로부터 독립적으로 선택되는 서열을 포함한다: 서열 번호 38, 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 41, 서열 번호 42, 서열 번호 43, 서열 번호 4 4, 서열 번호 45, 서열 번호 46, 서열 번호 47, 서열 번호 4 8, 서열 번호 49, 서열 번호 50, 서열 번호 51, 서열 번호 5 2, 서열 번호 53, 서열 번호 54, 서열 번호 55, 서열 번호 5 6, 서열 번호 57, 서열 번호 58, 서열 번호 59, 서열 번호 60, 서열 번호 61, 서열 번호 62 및 서열 번호 63.
일 실시 양태에서, 본 발명의 비대칭형 혼합 항체는 각각이 가변 영역, CH1 도메인 및 힌지 영역을 포함하는 2개의 중쇄를 포함하며, 여기서, 각각의 중쇄는 독립적으로 서열 번호 36(항체 28P), 서열 번호 37(항체 44P) 또는 서열 번호 35(항체 48)의 서열을 포함한다.
일 실시 양태에서, 본 발명의 비대칭형 혼합 항체는 각각이 가변 영역, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 2개의 중쇄를 포함하며, 여기서, 각각의 중쇄는 독립적으로 서열 번호 62(항체 28P), 서열 번호 63(항체 44P) 또는 서열 번호 61(항체 48)의 서열을 포함한다.
상기 실시 양태 중 임의의 실시 양태에서, 항체의 제2 중쇄는 본원에 개시된 임의의 중쇄 서열로부터 선택될 수 있다.
하기 표 1에는 IgG4 야생형 서열과 비교하여 돌연변이가 도입된 예시적 항체가 열거되어 있다. 또한 표 1은 야생형 IgG1 및 IgG4 항체와 대조 항체를 포함한다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
일 실시 양태에서, 제1 IgG4 중쇄 서열은 제2 IgG4 중쇄 서열과 조합되며, 이들 각각은 표 2에 기술된 바와 같이 CH1 및 상부 힌지 돌연변이 및 코어 힌지 서열을 포함한다.
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
따라서, 본 발명은 각각이 적어도 가변 영역, 힌지 영역 및 CH1 도메인을 포함하는 2개의 중쇄를 포함하는 비대칭형 혼합 항체를 제공하며, 여기서, 제1 중쇄 및 제2 중쇄 서열은 표 2에 열거된 제1 및 제2 중쇄 서열 돌연변이의 조합으로부터 선택되는 IgG4 중쇄 서열이다.
본 비대칭형 혼합 항체는 제1 및 제2 중쇄를 포함할 수 있으며, 여기서, 각각의 중쇄 불변 서열은 상기에 기술된 바와 같이 힌지 영역 및 CH1 도메인에 대한 돌연변이를 포함하며, 각각의 중쇄 내의 힌지 영역 및 CH1 도메인에 대한 돌연변이는 상이하다. 대안적으로, 제1 중쇄 불변 서열은 상기에 기술된 바와 같이 힌지 영역 및 CH1 도메인에 대한 돌연변이를 포함할 수 있으며, 제2 중쇄 불변 서열은 S241P 돌연변이를 갖는 IgG4 야생형 또는 IgG4 야생형이다.
본 발명의 일 실시 양태에서, 비대칭형 혼합 항체는 2특이성 항체이며, 여기서, 각각의 중쇄는 상이한 가변 영역들을 갖는다. 바람직하게는 본 항체는 2개의 경쇄를 또한 포함하며, 여기서, 각각의 중쇄-경쇄 쌍(Fab)은 상이한 가변 영역들을 갖는다.
본원에서 이용될 때, "상이한 가변 영역들"은 상기 가변 영역들이 상이한 항원들에 대하여 특이성을 가짐을 나타내는 것으로 의도된다. 즉, 각각의 가변 영역이 특이적으로 되는 항원은 상이한 항원 또는 상이한 항원 부분, 예를 들어 상이한 에피토프이다.
본원에서 이용될 때, "특이적"이라는 것은 결합 도메인이, 이것이 특이적이지 않은 다른 항원보다 더욱 큰 친화도 및/또는 친화력으로(예를 들어, 10, 20, 50, 10 또는 1000배 더 큼) 표적 항원을 인식하였다는 사실을 나타낸다. 특이적 결합 영역이 임의의 비표적 항원에 결합하지 않기보다는 오히려 표적과의 상호작용이 동일 패밀리(family)의 단백질 중의 항원을 비롯한 항원들의 복합 혼합물로부터(특이적 결합 영역이 특이적으로 되는) 표적 항원을 정제하는 데 이것이 사용될 수 있도록 하는 것을 반드시 시사하는 것은 아니다.
일 실시 양태에서, 본 발명에 따른 항체는 단리된다.
본원에서 이용될 때, 단리된이라는 것은 항체가 인체로부터 단리되는 것, 예를 들어 재조합 기술에 의해 제조되고/되거나, 크로마토그래피와 같은 기술을 이용하여 정제되고/되거나 제약 제형 형태로 있다는 것을 나타내는 것으로 의도된다.
본원에서 사용될 때, '항체'라는 용어는 각각이 VH 도메인, CH1 도메인 및 힌지 영역을 포함하는 2개의 중쇄를 포함하는, 온전한(완전) 항체 및 기능적 활성 단편을 포함한다. 본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 적어도 1개의 경쇄를 포함한다. 따라서, 본 발명에서 "항체"라는 용어는 2가, 3가 또는 4가 항체, Fab'의 이량체 및 F(ab')2 단편과, 2개의 경쇄 및 중쇄 쌍을 포함하는 완전 항체를 포함한다.
당업계에 공지된 바와 같이, 전형적인 Fab' 분자는 중쇄가 가변 영역 VH , 불변 도메인 CH1 및 힌지 영역을 포함하고 경쇄가 가변 영역 VL 및 불변 도메인 CL을 포함하는 중쇄 및 경쇄 쌍을 포함한다.
일 실시 양태에서, 본 발명에 따른 Fab'의 이량체가 제공되며, 예를 들어 이량체화는 힌지를 통한 것일 수 있다.
일 실시 양태에서, 중쇄는 CH2 도메인 및 CH3 도메인과, 경우에 따라 CH4 도메인을 포함한다. 일 실시 양태에서, 항체는 각각이 본 발명의 제1 또는 제2 측면에서 상기에 정의된 바와 같은 2개의 중쇄를 포함한다. 또한 본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 2개의 경쇄를 포함하며, 상기 경쇄는 동일하거나 상이할 수 있다. 상기에 정의된 바와 같이 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 2특이성 항체를 제공하는 본 발명의 실시 양태에서, 상기 2개의 경쇄는 상이한 가변 영역을 가지며, 동일하거나 상이한 불변 영역을 가질 수 있다.
일 실시 양태에서, 이용되는 CH2 및 CH3 도메인 예를 들어 IgG4 항체의 응집체의 형성의 감소를 위하여 돌연변이될 수 있다. 타카하시(Takahashi) 등의 미국 특허 공개 제2008/0063635호에서는 저 pH에서의 응집체 형성의 저해를 위하여 CH3 도메인에서 409 위치의 아르기닌(EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링할 경우 409, 또는 카밧 넘버링 시스템에 따라 넘버링할 경우 440)이 라이신, 트레오닌, 메티오닌 또는 류신으로 치환된 IgG4 돌연변이체가 조사되었다. CDC 활성의 약화를 위하여 L235, D265, D270, K322, P329 및 P331(EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링할 경우 L235, D265, D270, K322, P329 및 P331, 또는 카밧 넘버링 시스템에 따라 넘버링할 경우 L248, D278, D283, K341, P348 및 P350)에서의 추가의 돌연변이가 또한 교시되어 있다. 반 데 윈켈(Van de Winkel) 등의 국제 특허 공개 제WO2008/145142호에는 힌지 영역에서 심지어 S228P(EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링할 경우 S228, 또는 카밧 넘버링 시스템에 따르면 S241)의 부재 하에서도 409 위치의 아르기닌 잔기, 405 위치의 Phe 잔기 또는 370 위치의 Lys(EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링할 경우 R409, F405 및 K370, 또는 카밧 넘버링 시스템에 따라 넘버링할 경우 R440, F436 및 K393)의 치환에 의해 Fab-아암 교환을 겪는 능력이 감소된 안정한 IgG4 항체가 개시되어 있다(본원에서 동적 중쇄 교환으로 나타냄).
일 실시 양태에서, 본 발명의 항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하는 완전 비대칭형 혼합 항체이며, 여기서, 각각의 중쇄는 카밧 넘버링 시스템에 따라 넘버링할 경우 127 위치의 시스테인이 또다른 아미노산으로 치환된 IgG4 CH1, IgG1 상부 및 중간 힌지 영역, IgG4 하부 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다.
전형적으로 IgG4 항체의 전 힌지 영역은 잔기 226 내지 251(카밧 넘버링 시스템을 기초로 하여 넘버링함)로 이루어진다. 그러나, 힌지 영역은 요구될 경우 축소되거나 연장될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 제1 측면에 따른 항체의 야생형의 아미노산은 227, 228, 229 또는 230 위치에서 시스테인 잔기로 치환되며, 힌지 영역은 227, 228, 229 또는 230 위치의 새로운 시스테인 잔기 후에 끝날 수 있다. 또한 본 발명에 따른 항체는 힌지 영역의 N-말단 및/또는 C-말단에 위치하는 1개 이상의 추가 아미노산을 포함할 수 있다. 게다가, 힌지의 특성, 예컨대 가요성에 영향을 줄 수 있는, 경쇄 사슬간 시스테인으로부터의 힌지 시스테인(들)의 거리, 힌지의 시스테인들 사이의 거리 및 힌지 내의 다른 아미노산의 조성과 같은 힌지의 다른 특성이 제어될 수 있으며, 예를 들어 글리신을 힌지 내에 포함시켜 회전 가요성을 증가시킬 수 있거나 프롤린을 포함시켜 가요성을 감소시킬 수 있다. 대안적으로, 하전되거나 소수성인 잔기들의 조합을 힌지 내에 포함시켜 다량체화 또는 정제 특성을 부여할 수 있다. 다른 변형된 힌지 영역은 전적으로 합성인 것일 수 있으며, 이는 길이, 조성 및 가요성과 같은 요망되는 특성을 보유하도록 설계될 수 있다.
본 발명에서 이용되는, 특히, 존재할 경우 Fc 도메인 내의 불변 영역 도메인은, 항체 이펙터 기능이 요구되지 않는 경우, 바람직하게는 IgG4 이소타입의 것이다. 따라서, 각각의 중쇄는 바람직하게는 IgG4 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하며, 이는 서열 번호 64에 나타낸 바와 같다.
Fc 불변 영역 도메인의 서열 변이체가 또한 사용될 수 있음이 인지된다.
일 실시 양태에서, 각각의 중쇄는 IgG4 CH2 및 CH3 도메인을 포함하며, 여기서, 409 위치(EU 넘버링)의 아르기닌은, 저 pH에서 응집체 형성을 저해하기 위하여 라이신, 트레오닌, 메티오닌 또는 류신으로 치환된다(타카하시(Takahashi) 등의 미국 특허 공개 제2008/0063635호). L235, D265, D270, K322, P331 및 P329(EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링함)에서의 돌연변이가 CDC 활성의 약화를 위하여 또한 교시되어 있다(타카하시 등의 미국 특허 공개 제2008/0063635호).
각각의 중쇄는 반 데 윈켈(Van de Winkel) 등의 국제 특허 공개 제WO2008/145142호에 교시된 바와 같이 돌연변이를 포함할 수 있는데, 상기 국제 특허 공개에는 409 위치의 아르기닌 잔기, 405 위치의 Phe 잔기 또는 370 위치의 Lys(EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링함)의 치환에 의해 Fab-아암 교환을 겪는 능력이 감소된 안정한 IgG4 항체가 개시되어 있다.
일 실시 양태에서, 각각의 중쇄는 IgG4 CH2 도메인 및 IgG1 CH3 도메인을 포함하며, 이는 서열 번호 65에 나타낸 바와 같다.
항체가 돌연변이된 IgG3, IgD 또는 IgM 항체인 본 발명의 실시 양태에서, 각각의 중쇄는 바람직하게는 CH2 도메인 및 CH3 도메인과, 경우에 따라 CH4 도메인을 포함한다. IgG3 항체에서, 각각의 중쇄는 바람직하게는 IgG3 CH2 도메인 및 IgG3 CH3 도메인을 포함한다. IgD 항체에서, 각각의 중쇄는 바람직하게는 IgD CH2 도메인 및 IgD CH3 도메인을 포함한다. IgM 항체에서, 각각의 중쇄는 바람직하게는 IgM CH2 도메인, IgM CH3 도메인 및 IgM CH4 도메인을 포함한다.
일 실시 양태에서, 항체는 모노클로날, 완전 인간, 인간화 또는 키메라 항체 단편이다. 일 실시 양태에서, 항체는 완전 인간 또는 인간화 항체이다.
모노클로날 항체는 당업계에 공지된 임의의 방법, 예컨대 하이브리도마(hybridoma) 기술(문헌[Kohler & Milstein, Nature, 1975, 256, 495-497]), 트리오마(trioma) 기술, 인간 B 세포 하이브리도마 기술(문헌[Kozbor et al ., Immunology Today, 1983, 4, 72]) 및 EBV 하이브리도마 기술(문헌[Cole et al ., "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985])에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에서 사용하기 위한 항체는 또한 예를 들어 문헌[Babcook, J. et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 1996, 93(15), 7843-7848], 국제 특허 공개 제WO 92/02551호, 국제 특허 공개 제WO2004/051268호 및 국제 특허 공개 제WO2004/106377호에 기술된 방법에 의해 특정 항체의 제조용으로 선택된 단일 림프구로부터 생성된 면역글로불린 가변 영역 cDNA의 클로닝 및 발현에 의해 단일 림프구 항체법을 이용하여 생성될 수 있다.
인간화 항체는 비인간 종으로부터의 1개 이상의 상보성 결정 영역(CDR) 및 인간 면역글로불린 분자로부터의 프레임워크 영역을 갖는, 비인간 종으로부터의 항체 분자로서, 이는 비인간 종으로부터의 1개 이상의 공여체 잔기를 임의로 포함한다(예를 들어, 미국 특허 제5,585,089호 참조).
또한 본 발명에서 사용하기 위한 항체는 당업계에 공지된 다양한 파지 디스플레이법을 이용하여 생성될 수 있으며, 이는 문헌[Brinkman et al., J. Immunol . Methods, 1995, 182, 41-50]; 문헌[Ames et al., J. Immunol . Methods, 1995, 184, 177-186]; 문헌[Kettleborough et al . Eur . J. Immunol., 1994, 24, 952-958]; 문헌[Persic et al., Gene, 1997 187, 9-18]; 및 문헌[Burton et al., Advances in Immunology, 1994, 57, 191-280]; 국제 특허 공개 제WO 90/02809호; 국제 특허 공개 제WO 91/10737호; 국제 특허 공개 제WO 92/01047호; 국제 특허 공개 제WO 92/18619호; 국제 특허 공개 제WO 93/11236호; 국제 특허 공개 제WO 95/15982호; 및 국제 특허 공개 제WO 95/20401호와; 미국 특허 제5,698,426호; 미국 특허 제5,223,409호; 미국 특허 제5,403,484호; 미국 특허 제5,580,717호; 미국 특허 제5,427,908호; 미국 특허 제5,750,753호; 미국 특허 제5,821,047호; 미국 특허 제5,571,698호; 미국 특허 제5,427,908호; 미국 특허 제5,516,637호; 미국 특허 제5,780,225호; 미국 특허 제5,658,727호; 미국 특허 제5,733,743호; 및 미국 특허 제5,969,108호에 개시된 것을 포함할 수 있다. 또한, 트랜스제닉 마우스, 또는 다른 포유류를 비롯한 다른 유기체를 사용하여 인간화 항체를 생성할 수 있다.
완전 인간 항체는 중쇄 및 경쇄 둘 모두의 가변 영역 및 불변 영역(존재할 경우)이 모두 인간 기원의 것이거나, 인간 기원의 서열과 실질적으로 동일한 항체인데, 상기 가변 영역 및 불변 영역은 반드시 동일 항체로부터의 것일 필요는 없다. 완전 인간 항체의 예는 예를 들어 상기에 기술된 파지 디스플레이법에 의해 생성된 항체, 및 쥐과 면역글로불린 가변 및/또는 불변 영역 유전자가 예를 들어 일상적인 말로 유럽 특허 제0546073 B1호, 미국 특허 제5,545,806호, 미국 특허 제5,569,825호, 미국 특허 제5,625,126호, 미국 특허 제5,633,425호, 미국 특허 제5,661,016호, 미국 특허 제5,770,429호, 유럽 특허 제0438474 B1호 및 유럽 특허 제0463151 B1호에 기술된 바와 같이, 그의 인간 상대에 의해 대체된, 마우스에 의해 생성된 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용하기 위한 항체 출발 재료는 항체 가변 및 불변 영역(들)을 코딩하는 DNA의 조작 및 재발현을 포함하는 재조합 DNA 기술의 사용에 의해 제조될 수 있다. 요망될 경우, 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 아미노산 또는 도메인을 변형시키거나, 부가하거나 결실시킬 수 있다. 가변 또는 불변 영역에 대한 임의의 변경이 본원에서 사용되는 '가변' 및 '불변' 영역이라는 용어에 여전히 포함된다.
항체 출발 재료는 예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 햄스터, 낙타, 라마, 염소 또는 인간을 비롯한 임의의 종으로부터 수득될 수 있다. 항체의 일부는 1가지 초과의 종으로부터 수득될 수 있으며, 예를 들어 항체는 키메라 항체일 수 있다. 일 실시예에서, 불변 영역은 하나의 종으로부터의 것이고 가변 영역은 또다른 것으로부터의 것이다. 항체 출발 재료는 또한 변형될 수 있다. 또다른 실시예에서, 항체의 가변 영역은 재조합 DNA 엔지니어링 기술을 이용하여 생성되었다. 이러한 엔지니어링된 버전은 예를 들어 천연 항체의 아미노산 서열 내에서의 도는 천연 항체의 아미노산 서열에 대한 삽입, 결실 또는 변화에 의해 천연 항체 가변 영역으로부터 생성된 것을 포함한다. 이러한 유형의 특별한 예는 적어도 1개의 CDR, 및 경우에 따라, 하나의 항체로부터의 1개 이상의 프레임워크 아미노산 및 제2 항체로부터의 가변 영역 도메인의 나머지를 함유하는 엔지니어링된 가변 영역 도메인을 포함한다. 이들 항체의 생성 및 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 보스(Boss) 등의 미국 특허 제4,816,397호; 카빌리(Cabilly) 등의 미국 특허 제6,331,415호; 셔라더(Shrader) 등의 국제 특허 공개 제WO 92/02551호; 문헌[Ward et al., 1989, Nature, 341, 544]; 문헌[Orlandi et al., 1989, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 86, 3833]; 문헌[Riechmann et al., 1988, Nature, 322, 323]; 문헌[Bird et al, 1988, Science, 242, 423]; 퀸(Queen) 등의 미국 특허 제5,585,089호; 아데어(Adair)의 국제 특허 공개 제WO91/09967호; 문헌[Mountain and Adair, 1992, Biotechnol. Genet. Eng. Rev, 10, 1-142]; 문헌[Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181] 참조).
일 실시 양태에서, 항체는 결합 도메인을 형성하는 가변 도메인 쌍을 포함하며, 이는 동계(cognate) 쌍이다. 본원에서 이용될 때, 동계 쌍은 가변 도메인의 천연 쌍을 나타내는 것으로 의도되며, 즉, 단일 항체 또는 항체 발현 세포로부터 단리된 것을 나타내는 것으로 의도된다.
가변 도메인은 최적화되고/되거나 인간화되었을 수 있다.
동계 쌍으로부터 유래된 최적화/인간화 가변 도메인은 최적화/인간화 후에 여전히 동계 쌍으로 간주된다.
따라서, 본 발명은 인간, 인간화 또는 키메라 분자까지 확장된다.
일 실시 양태에서, 본 분자는 표적 항원에 특이적으로 결합한다. 본원에서 이용될 때, 특이적으로 결합한다는 것은 표적 항원에 대하여 높은 친화도를 갖는 분자(표적 항원에 대하여 이것이 특이적임)를 나타내는 것으로 의도되는데, 상기 분자는 이것이 특이적이지 않은 항원에는 낮은 또는 훨씬 더 낮은 친화도로 결합한다(또는 전혀 결합하지 않는다). 친화도의 측정 방법은 당업계의 숙련자에게 공지되어 있으며, 비아코어(BIAcore)TM와 같은 분석법을 포함한다.
본 발명의 항체 분자는 적합하게는 높은 결합 친화도, 특히 나노몰 또는 피코몰의 친화도를 갖는다. 친화도는 비아코어TM를 비롯한 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 일 실시 양태에서, 본 발명의 분자는 약 100 pM의 또는 더 우수한 결합 친화도를 갖는다. 일 실시 양태에서, 본 발명의 분자는 약 50 pM의 또는 더 우수한 결합 친화도를 갖는다. 일 실시 양태에서, 본 발명의 분자는 약 40 pM의 또는 더 우수한 결합 친화도를 갖는다. 일 실시 양태에서, 본 발명의 분자는 약 30 pM의 또는 더 우수한 결합 친화도를 갖는다. 일 실시 양태에서, 본 발명의 분자는 완전 인간 또는 인간화 분자이며, 약 100 pM의 또는 더 우수한 결합 친화도를 갖는다.
본원에서 이용될 때, 자연 발생 도메인의 유도체는 자연 발생 서열 내의 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산이 대체되거나 결실되어, 예를 들어 바람직하지 않은 특성의 제거에 의한 것과 같이 도메인의 특성을 최적화하였지만 도메인의 특성화 특징(들)은 유지된 것을 나타내는 것으로 의도된다.
일 실시 양태에서, 본 발명의 항체 분자는 1개 이상의 알부민 결합 펩티드를 포함한다. 생체내에서, 상기 펩티드는 알부민에 결합하며, 이는 당해 분자의 반감기를 증가시킨다.
알부민 결합 펩티드는 당해 분자의 1개 이상의 가변 영역, 힌지 또는 C-말단으로부터 또는 당해 분자의 항원 결합 특성을 간섭하지 않는 임의의 위치로부터 첨부될 수 있다.
알부민 결합 펩티드의 예가 국제 특허 공개 제WO 2007/106120호에 제공되어 있다.
또한, 당업계의 숙련자라면, 항체가 다양한 번역후 변형을 겪을 수 있다는 것을 이해한다. 이들 변형의 유형 및 정도는 흔히 배양 조건 뿐만 아니라 분자를 발현하는 데 사용되는 숙주 세포주에도 의존한다. 이러한 변형은 글리코실화, 메티오닌 산화, 디케토피페라진 형성, 아스파르테이트 이성질체화 및 아스파라긴 탈아미드화의 변화를 포함할 수 있다. 빈번하게 변형시키면 카르복시펩티다아제의 작용으로 인해 카르복시 말단 염기성 잔기(예컨대 라이신 또는 아르기닌)가 손실된다(문헌[Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995]에 기술된 바와 같음).
원할 경우, 본 발명에서 사용하기 위한 분자는 1개 이상의 이펙터 분자(들)에 콘쥬게이션될 수 있다. 이펙터 분자는 단일 이펙터 분자, 또는 본 발명의 항체 분자에 부착될 수 있는 단일 모이어티(moiety)를 형성하도록 그렇게 연결된 2개 이상의 그러한 분자를 포함할 수 있음이 인지된다. 본 발명에 따른 항체가 이펙터 분자에 연결된 것을 수득하는 것이 요망될 경우, 이것은 표준 화학 또는 재조합 DNA 절차에 의해 제조될 수 있으며, 여기서, 항체는 이펙터 분자에 직접적으로 또는 커플링제를 통하여 연결된다. 이러한 이펙터 분자를 항체에 콘쥬게이션시키는 기술은 당업계에 공지되어 있다(문헌[Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., Robinson et al., eds., 1987, pp. 623-53]; 문헌[Thorpe et al., 1982 , Immunol. Rev., 62:119-58] 및 문헌[Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123] 참조). 특정한 화학적 절차는 예를 들어 국제 특허 공개 제WO 93/06231호, 국제 특허 공개 제WO 92/22583호, 국제 특허 공개 제WO 89/00195호, 국제 특허 공개 제WO 89/01476호 및 국제 특허 공개 제WO03031581호에 기술된 것을 포함한다. 대안적으로, 이펙터 분자가 단백질 또는 폴리펩티드일 경우, 연결은 예를 들어 국제 특허 공개 제WO 86/01533호 및 유럽 특허 제0392745호에 기술된 바와 같이 재조합 DNA 절차를 이용하여 성취될 수 있다.
본원에서 사용될 때, 이펙터 분자라는 용어는 예를 들어 항신생물제, 약물, 독소, 생물학적 활성 단백질, 예를 들어 효소, 다른 항체 또는 항체 단편, 합성 또는 자연 발생 중합체, 핵산 및 이의 단편, 예를 들어, DNA, RNA 및 이의 단편, 방사성 핵종, 특히 방사성 요오다이드, 방사성 동위 원소, 킬레이팅된 금속, 나노입자 및 리포터 그룹, 예컨대 형광 화합물 또는 NMR 또는 ESR 분광법에 의해 검출될 수 있는 화합물을 포함한다.
이펙터 분자의 예는 세포에 유해한(예를 들어, 세포를 사멸시키는) 임의의 에이전트를 비롯한 세포 독소 또는 세포 독성제를 포함할 수 있다. 예는 콤브레스타틴, 돌라스타틴, 에포틸론, 스타우로스포린, 마이탄시노이드, 스폰기스타틴, 리족신, 할리콘드린, 로리딘, 헤미아스테를린, 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀올, 및 퓨로마이신과 이들의 유사체 또는 동족체를 포함한다.
또한 이펙터 분자는 대사 길항 물질(예를 들어 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제(예를 들어 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 시클로토스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 백금(II)(DDP) 시스플라틴), 안트라시클린(예를 들어, 다우노루비신(이전에는 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예를 들어, 닥티노마이신(이전에는 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 안트라마이신(AMC), 칼리케아미신 또는 듀오카르마이신), 및 항유사분열제(예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다.
다른 이펙터 분자는 킬레이팅된 방사성 핵종, 예컨대 111In 및 90Y, Lu177, 비스무트213, 칼리포르늄252, 이리듐192 및 텅스텐188/레늄188; 또는 알킬포스포콜린, 토포이소머라아제 I 저해제, 탁소이드 및 수라민과 같은 그러나 이로 한정되는 것은 아닌 약물을 포함할 수 있다.
다른 이펙터 분자는 단백질, 펩티드 및 효소를 포함한다. 관심있는 효소는 단백질 분해 효소, 히드롤라아제, 라이아제, 이소머라아제, 트랜스퍼라아제를 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 관심있는 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드는 면역글로불린, 독소, 예컨대 아브린, 리신 A, 슈도모나스(pseudomonas) 외독소, 또는 디프테리아(diphtheria) 독소, 단백질, 예컨대 인슐린, 종양 괴사 인자, α-인터페론, β-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자 또는 조직 플라스미노겐 활성자, 혈전제 또는 혈관 신생 저해제, 예를 들어 안지오스타틴 또는 엔도스타틴, 또는 생물학적 응답 조절제, 예컨대 림포카인, 인터류킨-1(IL-1), 인터류킨-2(IL-2), 과립구 대식 세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 신경 성장 인자(NGF) 또는 다른 성장 인자 및 면역글로불린을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다.
다른 이펙터 분자는 예를 들어 진단에서 유용한 검출가능한 물질을 포함할 수 있다. 검출가능한 물질의 예는 다양한 효소, 보결 분자단, 형광 물질, 발광 물질, 생물 발광 물질, 방사능성 핵종, 양전자 방출 금속(양전자 방출 단층 촬영(tomography)에서 사용하기 위한 것임), 및 비방사능성 상자성 금속 이온을 포함한다. 일반적으로, 진단제로서 사용하기 위한 항체에 콘쥬게이션될 수 있는 금속 이온에 대해서는 미국 특허 제4,741,900호를 참조한다. 적합한 효소는 서양 고추냉이 퍼옥시다아제, 알칼리 포스파타아제, 베타-갈락토시다아제 또는 아세틸콜린에스테라아제를 포함하며; 적합한 보결 분자단은 스트렙타비딘, 아비딘 및 바이오틴을 포함하며; 적합한 형광 물질은 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 덴실 클로라이드 및 피코에리트린을 포함하며; 적합한 발광 물질은 루미놀을 포함하며; 적합한 생물 발광 물질은 루시퍼라아제, 루시페린, 및 아에쿠오린을 포함하며; 적합한 방사능성 핵종은 125I, 131I, 111In 및 99Tc를 포함한다.
또다른 실시예에서, 이펙터 분자는 행체내에서 항체의 반감기를 증가시키고/시키거나 항체의 면역원성을 감소시키고/시키거나 상피 장벽을 가로질러서 항체를 면역계로 전달하는 것을 향상시킬 수 있다. 이러한 유형의 적합한 이펙터 분자의 예는 중합체, 알부민, 알부민 결합 단백질 또는 알부민 결합 화합물, 예컨대 국제 특허 공개 제WO 05/117984호에 기술된 것을 포함한다.
이펙터 분자가 중합체일 경우, 이것은 일반적으로 합성 또는 자연 발생 중합체, 예를 들어, 경우에 따라 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리알킬렌, 폴리알케닐렌 또는 폴리옥시알킬렌 중합체 또는 분지형 또는 비분지형 다당류, 예를 들어 호모다당류 또는 헤테로다당류일 수 있다.
상기 합성 중합체 상에 존재할 수 있는 특정한 임의적 치환기는 1개 이상의 히드록시, 메틸 또는 메톡시기를 포함한다.
합성 중합체의 구체예는 경우에 따라 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리(에틸렌글리콜), 폴리(프로필렌글리콜), 폴리(비닐알코올) 또는 이들의 유도체, 특히, 경우에 따라 치환된 폴리(에틸렌글리콜), 예컨대 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 이의 유도체를 포함한다.
특정한 자연 발생 중합체는 락토스, 아밀로스, 덱스트란, 글리코겐 또는 이들의 유도체를 포함한다.
본원에서 사용될 때, "유도체"는 반응성 유도체, 예를 들어 티올 선택적 반응기, 예컨대 말레이미드 등을 포함하는 것으로 의도된다. 반응기는 직접적으로 또는 링커(linker) 절편을 통하여 중합체에 연결될 수 있다. 이러한 기의 잔사는 일부의 경우에 본 발명의 항체와 중합체 사이의 연결기로서 생성물의 일부를 형성한다는 것이 인지된다.
중합체의 크기는 원할 경우 달라질 수 있지만, 일반적으로 500 Da 내지 50000 Da, 예를 들어 5000 내지 40000 Da, 예컨대 20000 내지 40000 Da의 평균 분자량 범위이다. 특히 중합체 크기는 생성물의 의도된 용도, 예를 들어 종양과 같은 특정 조직에 국소화하거나 순환중 반감기를 연장시키는 능력을 기초로 하여 선택될 수 있다(개관에 대해서는 문헌[Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545] 참조). 따라서, 예를 들어, 생성물이 순환계를 떠나서 조직에 침투하는 것이 의도될 경우, 예를 들어 종양의 치료에서의 사용용으로 의도될 경우, 작은 분자량의 중합체, 예를 들어 분자량이 대략 5000 Da인 중합체를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 생성물이 순환계 중에 잔존하는 응용에 있어서, 더욱 큰 분자량의 중합체, 예를 들어 분자량의 범위가 20000 Da 내지 40000 Da인 것을 사용하는 것이 유리할 수 있다.
적합한 중합체는 폴리알킬렌 중합체, 예컨대 폴리(에틸렌글리콜) 또는 특히 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 이들의 유도체, 및 특히 분자량의 범위가 약 15000 Da 내지 약 40000 Da인 것을 포함한다.
일 실시예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 항체는 폴리(에틸렌글리콜)(PEG) 모이어티에 부착된다. 특별한 일 실시예에서, PEG 분자는 항체 내에 위치하는 임의의 이용가능한 아미노산 측쇄 또는 말단 아미노산 작용기, 예를 들어, 임의의 유리 아미노, 이미노, 티올, 히드록실 또는 카르복실기를 통하여 부착될 수 있다. 이러한 아미노산은 항체 내에 자연적으로 나타날 수 있거나 재조합 DNA 방법을 이용하여 항체 내로 엔지니어링될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,219,996호; 미국 특허 제5,667,425호; 국제 특허 공개 제WO 98/25971호 참조). 일 실시예에서, 본 발명의 분자는 변형 항체이며, 여기서, 상기 변형은 그의 중쇄의 C-말단에 1개 이상의 아미노산을 부가하여 이펙터 분자의 부착을 허용하는 것이다. 다수의 부위를 이용하여 2개 이상의 PEG 분자를 부착시킬 수 있다.
일 실시 양태에서, PEG 분자는 경쇄 내의 시스테인 171에 연결되며, 예를 들어, 본원에 참고로 포함된 국제 특허 공개 제WO2008/038024호를 참조한다.
적합하게는, PEG 분자는 항체 내에 위치하는 적어도 1개의 시스테인 잔기의 티올기를 통하여 공유 결합된다. 변형 항체에 부착된 각각의 중합체 분자는 항체 내에 위치하는 시스테인 잔기의 황 원자에 공유 결합될 수 있다. 공유 결합은 일반적으로 디술피드 결합, 또는 특히 황-탄소 결합이다. 티올기가 부착점으로서 사용되는 경우, 적절하게 활성화된 이펙터 분자, 예를 들어 티올 선택성 유도체, 예컨대 말레이미드 및 시스테인 유도체가 사용될 수 있다. 활성화된 중합체는 상기에 기술된 바와 같이 중합체 변형된 항체의 제조에서 출발 재료로서 사용될 수 있다. 활성화된 중합체는 α-할로카르복실산 또는 에스테르, 예를 들어 요오도아세트아미드, 이미드, 예를 들어 말레이미드, 비닐 설폰 또는 디술피드와 같이 티올 반응기를 함유하는 임의의 중합체일 수 있다. 이러한 출발 재료는(예를 들어, 이전에는 시어워터 폴리머즈 인크.(Shearwater Polymers Inc.)였던 넥타르(Nektar; 미국 앨라배마주 헌츠빌)로부터) 상업적으로 획득될 수 있거나, 통상적인 화학적 절차를 이용하여 상업적으로 입수가능한 출발 재료로부터 제조될 수 있다. 특정 PEG 분자는 20K 메톡시-PEG-아민(이전에 시어워터였던 넥타르; 랍 폴리머(Rapp Polymere); 및 선바이오(SunBio)로부터 획득가능함) 및 M-PEG-SPA(이전에 시어워터였던 넥타르로부터 획득가능함)를 포함한다.
본 발명은 본원에 개시된 항체 분자를 코딩하는 단리된 DNA를 또한 제공한다.
추가의 측면에서, 상기 DNA를 포함하는 벡터가 제공된다.
벡터를 구성할 수 있는 일반적인 방법, 형질감염 방법 및 배양 방법은 당업계의 숙련자에게 공지되어 있다. 이와 관련하여, 문헌["Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel(ed), Wiley Interscience, New York and the Maniatis Manual produced by Cold Spring Harbor Publishing]을 참조한다.
추가의 측면에서, 상기 벡터 및/또는 DNA를 포함하는 숙주 세포가 제공된다.
임의의 적합한 숙주 세포/벡터 시스템이 본 발명의 분자를 코딩하는 DNA 서열의 발현에 사용될 수 있다. 박테리아, 예를 들어 이. 콜라이(E. coli), 및 다른 미생물 시스템이 사용될 수 있거나, 진핵, 예를 들어 포유류 숙주 세포 발현 시스템이 또한 사용될 수 있다. 적합한 포유류 숙주 세포는 CHO, 골수종 또는 하이브리도마 세포를 포함한다.
또한 본 발명은 본원에 개시된 항체 분자의 제조 방법을 제공하며, 이는 본 발명의 벡터(및/또는 DNA)를 함유하는 숙주 세포를 본 발명의 항체 분자를 코딩하는 DNA로부터 단백질을 발현시키는 데 적합한 조건 하에서 배양하는 단계, 및 항체 분자를 단리하는 단계를 포함한다.
중쇄 및 경쇄 둘 모두를 포함하는 생성물의 제조에 있어서, 세포주를 2개의 벡터로 형질감염시킬 수 있는데, 제1 벡터는 경쇄 폴리펩티드를 코딩하며, 제2 벡터는 중쇄 폴리펩티드를 코딩한다. 대안적으로, 단일 벡터가 사용될 수 있으며, 이 벡터는 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함한다.
본 발명에 따른 항체 분자는 숙주 세포로부터 적합한 수준으로 발현되어서, 항체 분자가 상업적 프로세싱에 도움이 되게 한다.
본 항체는 임의의 표적 항원에 대하여 특이적일 수 있다. 항원은 세포 회합된 단백질, 예를 들어 박테리아 세포, 효모 세포, T 세포, 내피 세포 또는 종양 세포와 같은 세포 상의 세포 표면 단백질일 수 있거나, 이것은 가용성 단백질일 수 있다. 또한, 관심있는 항원은 질환 또는 감염 동안 상향조절되는 단백질과 같은 임의의 의학적으로 관련된 단백질, 예를 들어 수용체 및/또는 그의 상응하는 리간드일 수 있다. 세포 표면 단백질의 특정한 예는 유착 분자, 예를 들어 인테그린, 예컨대 β1 인테그린, 예를 들어 VLA-4, E-셀렉틴(selectin), P 셀렉틴 또는 L-셀렉틴, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD11a, CD11b, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD40L, CD45, CDW52, CD69, CD134(OX40), ICOS, BCMP7, CD137, CD27L, CDCP1, CSF1 또는 CSF1-수용체, DPCR1, DPCR1, 두둘린2(dudulin2), FLJ20584, FLJ40787, HEK2, KIAA0634, KIAA0659, KIAA1246, KIAA1455, LTBP2, LTK, MAL2, MRP2, 넥틴-유사2(nectin-like2), NKCC1, PTK7, RAIG1, TCAM1, SC6, BCMP101, BCMP84, BCMP11, DTD, 암태아성 항원(carcinoembryonic antigen; CEA), 인간 유지방 글로불린(HMFG1 및 2), MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 항원, KDR 및 VEGF, PD-1, DC-SIGN, TL1A, DR3, IL-7 수용체 A 및, 적절할 경우, 이들의 수용체를 포함한다.
가용성 항원은 인터류킨, 예컨대 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-14, IL-16 또는 IL-17, 예컨대 IL17A 및/또는 IL17F, 바이러스 항원, 예를 들어, 호흡기 세포융합 바이러스 또는 사이토메갈로바이러스 항원, 변역글로불린, 예컨대 IgE, 인터페론, 예컨대 인터페론 α, 인터페론 β 또는 인터페론 γ, 종양 괴사 인자 TNF(이전에는 종양 괴사 인자-α로 공지되고, 본원에서는 TNF 또는 TNF-α로 칭해짐), 종양 괴사 인자-β, 콜로니 자극 인자, 예컨대 G-CSF 또는 GM-CSF, 및 혈소판 유래 성장 인자, 예컨대 PDGF-α, 및 PDGF-β, WISP-1와, 적절할 경우 이들의 수용체를 포함한다. 다른 항원은 박테리아 세포 표면 항원, 박테리아 독소, 바이러스, 예컨대 인플루엔자, EBV, HepA, B 및 C, 생물 테러제(bioterrorism agent), 방사성 핵종 및 중금속, 및 뱀 및 거미 독 및 독소를 포함한다.
일 실시 양태에서, 항체는 관심있는 항원의 활성을 기능적으로 변경시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체는 상기 항원의 활성을 직접적으로 또는 간접적으로 중화시키거나, 길항시키거나 작동시킬 수 있다.
일 실시 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 비대칭형 혼합 항체의 제조 방법까지 확장되며, 본 방법은 본원에 정의된 제1 중쇄 서열 또는 이의 단편을 포함하는 대칭형 항체(즉, 둘 모두의 중쇄가 동일한/상이한 것)를 취하는 단계 및 시험관내에서 상기 항체를, 상기 제1 중쇄 서열과 상이한 제2 중쇄 서열 또는 이의 단편을 포함하는 제2 대칭형 항체와, 상기 두 항체 사이의 중쇄 교환에 도움이 되는 조건 하에서 혼합하는 단계, 및 경우에 따라, 비대칭형 혼합 항체를 단리하는 단계를 포함한다.
동적 환원에 도움이 되는 시험관내 조건은 환원 조건을 포함한다. 적합한 환원제는 GSH, 2-메르캅토에탄올, 2-메르캅토에틸아민, TBP, TCEP, 시스테인-HCl 및 DTT를 포함한다.
환원제의 적합한 농도는 0.01 내지 10 mM의 범위, 예컨대 0.5 내지 5 mM이다. 게다가, 환원은 레독스 완충제를 사용하여, 즉, 예를 들어 GSH:GSSG 및 Cys:diCys와 같은, 시약들의 산화된 변이체 및 환원된 변이체의 상이한 상대적인 비를 이용하여 성취될 수 있다.
적합한 조건은 0.5:5 내지 5:05의 범위, 예컨대 1:1 또는 1:2의 항체들의 비를 포함한다.
적합한 온도는 15 내지 40℃, 예컨대 37℃를 포함한다.
환원 조건은 호모이량체 및 헤테로이량체의 환원 안정성들 사이에 있도록 선택될 수 있다.
대안적인 실시 양태에서, 본 발명의 항체가 혼합 세포 배양물을 이용하여 제조되는 경우, 예를 들어 대략 50%의 교환이 일어난다. 이는 요망되는 2특이성의 1 내지 2 g/l의 영역에서 생성될 수 있다.
일 실시 양태에서, 본원에 기술된 방법으로부터 수득되거나 수득가능한 비대칭형 항체, 및 이를 포함하는 제형, 특히 치료에서 사용하기 위한 것이 제공된다.
본 발명의 항체 분자는 병리학적 상태의 치료 및/또는 예방에 유용하다.
따라서, 치료적 유효량의 본 발명에 따른 항체를 예를 들어 제약 제형으로 투여함으로써 치료에서 사용하기 위한 본 발명에 따른 항체가 제공된다. 일 실시 양태에서, 본 발명에 따른 항체는 예를 들어 흡입에 의해 폐에 국소적으로 투여된다.
본 발명에 의해 제공된 항체는 염증성 질환 및 장애, 면역 질환 및 장애, 섬유성 장애 및 암을 비롯한 질환 또는 장애의 치료에 유용하다.
"염증성 질환" 또는 "장애" 및 "면역 질환 또는 장애"라는 용어는 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 스틸병, 머클 웰스병, 건선, 크론병, 궤양성 대장염, 전신성 홍반성 루푸스(SLE), 천식, 알러지성 비염, 아토피성 피부염, 다발성 경화증, 맥관염, 제I형 진성 당뇨병, 이식 및 이식편 대 숙주 질환을 포함한다.
"섬유성 장애"라는 용어는 특발성 폐섬유증(IPF), 전신성 경화증(또는 경피증), 신장 섬유증, 당뇨성 신증, IgA 신증, 고혈압, 말기 신장 질환, 복막 섬유증(지속적 외래 복막 투석), 간경화증, 연령 관련 황반 변성(ARMD), 망막증, 심장 반응성 섬유증, 흉터, 켈로이드, 화상, 피부 궤양, 혈관 형성술, 관상 동맥 우회로 조성물, 관절성형술 및 백내장 수술을 포함한다.
"암"이라는 용어는 피부, 또는 더욱 일반적으로는 신체 기관의 라이닝, 예를 들어 유방, 난소, 전립선, 폐, 신장, 췌장, 위, 방광 또는 장에서 발견되는, 상피로부터 생긴 악성의 새로운 성장물을 포함한다. 암은 인접 조직 내로 침윤되어 원거리 기관, 예를 들어 뼈, 간, 폐 또는 뇌로 확산되는(전이되는) 경향이 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체를 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체 중 1가지 이상과 조합하여 포함하는 약학 조성물 또는 진단 조성물을 제공한다. 따라서, 의약의 제조에 있어서의 본 발명의 항체의 용도가 제공된다. 일반적으로 본 조성물은 살균, 약학 조성물의 일부로서 공급되는데, 상기 약학 조성물은 보통 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 아쥬반트를 추가로 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 항체를 첨가하여 이를 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체 중 1가지 이상과 함께 혼합하는 단계를 포함하는, 약학 조성물 또는 진단 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 항체는 약학 조성물 또는 진단 조성물 중의 유일한 활성 성분일 수 있거나, 다른 항체 성분, 예를 들어 항-TNF, 항-IL-1β, 항-T 세포,항-IFNγ 또는 항-LPS 항체, 또는 비항체 성분, 예컨대 잔틴을 포함하는 다른 활성 성분이 수반될 수 있다. 다른 적합한 활성 성분은 내성을 유도할 수 있는 항체, 예를 들어 항-CD3 또는 항-CD4 항체를 포함한다.
추가의 실시 양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 조성물은 추가의 제약적 활성제, 예를 들어 코르티코스테로이드(예컨대 플루티카손 프로피오네이트) 및/또는 베타-2-작동제(예컨대 살부타몰, 살메테롤 또는 포르모테롤), 도는 세포 성장 및 증식의 저해제(예컨대 라파마이신, 시클로포스프미드, 메토트렉세이트) 또는 대안적으로 CD28 및/또는 CD40 저해제와 조합되어 이용된다. 일 실시 양태에서, 저해제는 소분자이다. 또다른 실시 양태에서, 저해제는 표적에 특이적인 항체이다.
약학 조성물은 적합하게는 치료적 유효량의 본 발명의 항체를 포함한다. 본원에서 사용될 때, "치료적 유효량"이라는 용어는 표적화된 질환 또는 병태의 치료, 개선 또는 예방에 필요한, 또는 검출가능한 치료적 또는 예방적 효과를 나타내는 데 필요한 치료제의 양을 나타낸다. 치료적 유효량은 세포 배양 분석법에서 또는 동물 모델에서, 일반적으로 설치류, 토끼, 개, 돼지 또는 영장류에서 처음에 평가될 수 있다. 동물 모델은 또한 적절한 농도 범위 및 투여 경로의 결정에 사용될 수 있다. 그 후, 이러한 정보는 인간에 있어서 투여하기에 유용한 용량 및 경로의 결정에 사용될 수 있다.
인간 대상체에 있어서의 정확한 치료적 유효량은 질환 상태의 중증도, 대상체의 종합 건강, 대상체의 연령, 중량 및 성별, 다이어트, 투여 시간 및 빈도, 약물 조합(들), 반응 민감도 및 치료에 대한 내성/응답에 따라 달라진다. 이 양은 일상적인 실험에 의해 결정될 수 있으며, 임상의의 판단 이내이다. 일반적으로, 치료적 유효량은 0.01 mg/kg 내지 50 mg/kg, 예를 들어 0.1 mg/kg 내지 20 mg/kg이다. 약학 조성물은 용량당 소정량의 본 발명의 활성제를 함유하는 단위 용량 형태로 편리하게 제시될 수 있다.
조성물은 환자에게 개별적으로 투여될 수 있거나 다른 에이전트, 약물 또는 호르몬과 조합되어(예를 들어, 동시에, 순차적으로 또는 개별적으로) 투여될 수 있다.
본 발명의 항체가 투여되는 용량은 치료될 병태의 성질, 예를 들어 존재하는 질환/염증의 정도에 따라, 그리고 당해 분자가 기존의 병태를 치료하기 위하여 상요되는지 예방적으로 사용되는지에 따라 달라진다.
용량의 빈도는 항체의 반감기 및 그 효과의 지속 시간에 따라 달라진다. 항체가 짧은 반감기(예를 들어, 2 내지 10시간)를 가질 경우, 일일 하나 이상의 용량을 제공하는 것이 필요할 수 있다. 대안적으로, 항체가 긴 반감기(예를 들어, 2 내지 15일)를 가질 경우, 일일 1회, 주당 1회 또는 심지어 매 1개월 또는 2개월마다 1회의 투여량을 제공하는 것만이 필요할 수 있다.
약학적으로 허용가능한 담체는 그 자체는 이 조성물을 받는 개인에게 유해한 항체의 생성을 유도하지 않아야 하며, 독성이지 않아야 한다. 적합한 담체는 큰, 서서히 대사되는 거대분자, 예컨대 단백질, 폴리펩티드, 리포좀, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체성 아미노산, 아미노산 공중합체 및 불활성 바이러스 입자일 수 있다.
약학적으로 허용가능한 염, 예를 들어 무기산 염, 예컨대 염산염, 브롬화수소산염, 인산염, 황산염, 또는 유기산의 염, 예컨대 아세트산염, 프로피온산염, 말론산염 및 벤조산염이 사용될 수 있다.
치료 조성물 중 약학적으로 허용가능한 담체는 추가로 액체, 예컨대 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올을 함유할 수 있다. 추가로, 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충 물질이 이러한 조성물에 존재할 수 있다. 이러한 담체는 약학 조성물이 환자가 섭취하기 위한, 정제, 알약, 당의정, 캡슐, 리퀴드, 겔, 시럽, 슬러리 및 현탁액으로 제형화되게 할 수 있다.
적합한 투여 형태는 비경구 투여, 예를 들어 주사 또는 주입에 의한, 예를 들어 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여에 적합한 형태를 포함한다. 생성물이 주사 또는 주입용일 경우, 이것은 유성 또는 수성 비히클 중 현탁액, 용액 또는 에멀젼의 형태를 취할 수 있으며, 이것은 제형화제, 예켠대 현탁제, 보존제, 안정제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 분자는 적절한 살균 액체와 함께 사용하기 전에 재구성을 위하여 건조 형태일 수 있다.
일단 제형화되면, 본 발명의 조성물은 대상체에게 직접적으로 투여될 수 있다. 치료될 대상체는 동물일 수 있다. 그러나, 1가지 이상의 실시 양태에서, 조성물은 인간 대상체 투여용으로 수정된다.
적합하게는, 본 발명에 따른 제형에서, 최종 제형의 pH는 항체의 등전점 값과 유사하지 않으며, 예를 들어, 제형의 pH가 7이면, 8 내지 9 또는 그보다 더 높은 pI가 적절할 수 있다. 이론에 구애되고자 함이 없이, 이는 개선된 안정성을 갖는 최종 제형을 궁극적으로 제공할 수 있다고 생각되며, 예를 들어 항체는 용액 중에 잔존한다.
본 발명의 약학 조성물은 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 척추강내, 심실내, 경피적, 경피(예를 들어, 국제 특허 공개 제WO98/20734호 참조), 피하, 복강내, 비강내, 장, 국소, 설하, 질내 또는 직장 경로를 포함하지만 이로 한정되지 않는 다수의 경로에 의해 투여될 수 있다. 하이포스프레이(hypospray)가 본 발명의 약학 조성물의 투여에 또한 사용될 수 있다. 전형적으로, 치료 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서, 주사가능한 것으로서 제조될 수 있다. 주사 전 액체 비히클 중 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태가 또한 제조될 수 있다.
조성물의 직접적인 전달은 일반적으로 주사, 피하, 복강내, 정맥내 또는 근육내 전달에 의해 달성되거나, 조직의 간질 공간에 전달된다. 조성물은 또한 병변 내에 투여될 수 있다. 투여량 처리는 단회 용량 스케줄 또는 다회 용량 스케줄일 수 있다.
조성물 중 활성 성분은 항체임이 인지된다. 따라서, 이것은 위장관에서 분해되기 쉽다. 따라서, 조성물을 위장관을 이용한 경로에 의해 투여할 경우, 조성물은 항체를 분해로부터 보호하지만 일단 위장관으로부터 흡수되었으면 항체를 방출하는 에이전트를 함유할 필요가 있다.
약학적으로 허용가능한 담체에 대한 철저한 논의는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company, N.J. 1991)]에서 이용가능하다.
일 실시 양태에서, 제형은 흡입을 비롯한 국소 투여용 제형으로 제공된다.
적합한 흡입가능 제제는 흡입가능 분말, 분사 가스를 함유하는 계량 에어로졸 또는 분사 가스가 없는 흡입가능 용액을 포함한다. 활성 물질을 함유하는 본 발명에 따른 흡입가능 분말은 단지 전술한 활성 물질로 이루어지거나 전술한 활성 물질과 생리학상 허용되는 부형제의 혼합물로 이루어질 수 있다.
이들 흡입가능 분말은 단당류(예를 들어 글루코스 또는 아라비노스), 이당류(예를 들어 락토스, 사카로스, 말토스), 올리고당류 및 다당류(예를 들어, 덱스트란) 또는 이들과 서로와의 혼합물을 포함할 수 있다. 단당류 또는 이당류가 적합하게 사용되며, 락토스 또는 글루코스는 특히, 그러나 배타적이지는 않게, 그의 수화물 형태로 사용된다.
폐에서의 침착을 위한 입자는 10 마이크로미터 미만, 예컨대 1 내지 9 마이크로미터, 예를 들어 0.1 내지 5 ㎛, 특히 1 내지 5 ㎛의 입자 크기를 필요로 한다. 활성 성분(예컨대 항체)의 입자 크기가 일차적으로 중요하다.
흡입가능 에어로졸의 제조에 사용될 수 있는 분사 가스는 당업계에 공지되어 있다. 적합한 분사 가스는 탄화수소, 예컨대 n-프로판, n-부탄 또는 이소부탄 및 할로탄화수소, 예컨대 염소화 및/또는 플루오르화된, 메탄, 에탄, 프로판, 부탄, 시클로프로판 또는 시클로부탄의 유도체 중에서 선택된다. 전술한 분사 가스는 단독으로 또는 이들의 혼합물 형태로 사용될 수 있다.
특히 적합한 분사 가스는 TG 11, TG 12, TG 134a 및 TG227 중에서 선택되는 할로겐화 알칸 유도체이다. 전술한 할로겐화 탄화수소 중, TG134a(1,1,1,2-테트라플루오로에탄) 및 TG227(1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로프로판) 및 이들의 혼합물이 특히 적합하다.
분사 가스를 함유하는 흡입가능 에어로졸은 또한 다른 성분, 예컨대 공용매, 안정제, 표면 활성제(계면활성제), 산화방지제,윤활제 및 pH 조정 수단을 함유할 수 있다.
본 발명에 따른, 분사 가스를 함유하는 흡입가능 에어로졸은 5 중량% 이하의 활성 물질을 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 에어로졸은 예를 들어 0.002 내지 5 중량%, 0.01 내지 3 중량%, 0.015 내지 2 중량%, 0.1 내지 2 중량%, 0.5 내지 2 중량% 또는 0.5 내지 1 중량%의 활성 성분을 함유한다.
대안적으로, 폐에의 국소 투여는 또한 예를 들어 장치, 예컨대 분무기, 예를 들어 압축기에 연결된 분무기(예를 들어, 미국 버지니아주 리치몬드 소재의 파리 레스파이러토리 이큅먼트, 인크.(Pari Respiratory Equipment, Inc.)에 의해 제조된, 파리 마스터(Pari Master)® 압축기에 연결된 파리 LC-젯 플러스(Jet Plus)® 분무기)를 이용하여 액체 용액 또는 현탁액 제형의 투여에 의한 것일 수 있다.
본 발명의 항체는 용매 중에 분산되어, 예를 들어 용액 또는 현탁액의 형태로 전달될 수 있다. 이것은 적절한 생리학적 용액, 예를 들어 염수 또는 다른 약리학상 허용되는 용매 또는 완충액 중에 현탁될 수 있다. 당업계에 공지된 완충액은, 약 4.0 내지 5.0의 pH가 달성되도록, 1 mL의 물당 0.05 mg 내지 0.15 mg의 디소듐 에데테이트, 8.0 mg 내지 9.0 mg의 NaCl, 0.15 mg 내지 0.25 mg의 폴리소르베이트, 0.25 mg 내지 0.30 mg의 무수 시트르산, 및 0.45 mg 내지 0.55 mg의 시트르산나트륨을 함유할 수 있다. 현탁액은 예를 들어 동결건조 분자를 이용할 수 있다.
치료적 현탁액 또는 용액 제형은 1가지 이상의 부형제를 또한 함유할 수 있다. 부형제는 당업계에 공지되어 있으며, 완충제(예를 들어, 시트레이트 완충제, 포스페이트 완충제, 아세테이트 완충제 및 비카르보네이트 완충제), 아미노산, 우레아, 알코올, 아스코르브산, 인지질, 단백질(예를 들어, 혈청 알부민), EDTA, 염화나트륨, 리포좀, 만니톨, 소르비톨 및 글리세롤을 포함한다. 용액 또는 현탁액은 리포좀 또는 생분해성 미소구체 중에 캡슐화될 수 있다. 일반적으로 제형은 살균 제조 공정을 이용하여 실질적으로 살균 형태로 제공된다.
이는 제형에 사용되는 완충된 용매/용액의 여과, 살균 완충 용매 용액 중 이 분자의 무균적 현탁, 및 제형을 살균 용기 내에 분배함에 의한 생성 및 살균을 포함할 수 있는데, 이는 당업계의 숙련자에게 친숙한 방법에 의한 것이다.
본 발명에 따른 분무가능 제형은 예를 들어 포일 엔벨로프(envelope)에 패킹된 단회 용량 단위(예를 들어, 밀봉된 플라스틱 용기 또는 바이알)로서 제공될 수 있다. 각각의 바이알은 소정 부피, 예를 들어, 2 mL의 용매/용액 완충제 중에 단위 용량을 함유한다.
본 발명의 항체는 분무를 통하여 전달하기에 특히 적합한 것으로 생각된다.
본 명세서의 문맥에서 "포함하는"은 "함유하는"을 의미하는 것으로 의도된다.
기술적으로 적절할 경우, 본 발명의 실시 양태들이 조합될 수 있다.
"비대칭형" 및 "비대칭형 혼합"은 본원에서 상호교환가능하게 이용된다.
이제 본 발명을 하기 실시예를 참고로 하여 기술하며, 실시예는 단순히 예시적인 것으로서, 어떠한 방식으로든지 본 발명의 범주를 한정하는 것으로 파악되어서는 안된다.
실시예
1. IgG4 중쇄의 돌연변이 및 돌연변이된 IgG4 중쇄 단일 유전자 벡터의 생성
아미노산 돌연변이를 퀵체인지(Quickchange)® 라이트닝 멀티 사이트 디렉티드 뮤타제네시스(SDM) 키트 또는 퀵체인지® II DSM 키트(스트라타진(Stratagene)®으로부터 획득함)(각각, 카탈로그 번호 210516 및 200521)를 사용하여 수행하였으며, 제조업자의 지시에 따라 수행하였다.
돌연변이를 DNA 서열결정에 의해 확인하였다. 하기 표의 항체 1 내지 47의 IgG4 중쇄를 생성하였다:
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
제조한 다른 항체가 상기 표에 기술되어 있다.
항체 48의 중쇄(서열 번호 266)를 PCR 및 제한 효소 클로닝에 의해 생성하였다. PCR 생성물은 IgG1 상부 및 코어 힌지 영역 서열을 코딩하는 정방향 올리고 및 제한 부위 BglII 및 제한 효소 DraIII을 코딩하는 역방향 올리고에 의해 생성하였다. 그 후, PCR 단편을 상기 효소로 절단하고, 적절한 가변 영역을 함유하는 hG4 단일 유전자 벡터 내에 라이게이션시켰다.
2. 돌연변이된 IgG4 항체의 발현
모든 돌연변이 DNA를 CHOK1 세포 내에 형질감염시켰다. 세포(2x108개의 세포/ml)를 1 ml의 얼스 밸런스 솔트 솔루션(Earles Balance Salt Solution)(시그마(Sigma))에 재현탁시키고, 400 ㎍의 DNA(200 ㎍의 중쇄 DNA 및 200 ㎍의 카파 경쇄 DNA)와 혼합하였다. 800 ㎕의 분취물을 0.4 cm 큐벳(바이오라드(Biorad))으로 옮겼다. 500 ml 배양에 있어서, 6개의 큐벳을 하기 파라미터 하에서 전기천공하였다: 1 ms, 9.6 Amp; 10 ms, 0 Amp; 40 ms, 3.2 Amp. 형질감염된 세포를 24시간 동안 인큐베이션하고, 5% CO2의 가습 환경에서, 37℃에서 140 rpm에서 진탕시키고, 32℃에서 10 내지 13일 동안 형질감염 후 2일로부터 계속하였다. 형질감염 후 4일에, 1.6 ml의 1 M 부티르산나트륨을 배양물에 첨가하였다. 일단 세포가 40% 생존율 또는 13일까지 도달하였으면, 상청액을 수확하였다. 배양물을 4000 rpm에서 45분 동안 원심분리하였다. 상청액을 0.22 ㎛ 스테리컵(Stericup) 필터(밀리포어(Millipore))에 통과시켜 정제하였다.
3. 돌연변이된 IgG4 항체의 정제
상청액(200-500 ml)을 단백질 A 5 ml 하이트랩 맙셀렉트 슈어 컬럼(HiTrap MabSelect SuRe column)(영국 애머샴 소재의 지이 헬스케어(GE Healthcare))을 사용하여 정제하였다. 2 M 트리스(Tris)-HCl(pH 8.5)의 상청액 부피의 1/50을 첨가함으로써 샘플을 제조하였다. 샘플을 1 ml/min으로 컬럼 상에 로딩하였다. 컬럼을 PBS(pH 7.4)로 세척하였다. 샘플의 용출을 위하여, 0.1 M 시트르산나트륨(pH 3.4)을 1 ml/min으로 컬럼에 통과시키고, 0.5 ml 분획물을 수집하였다. 피크 분획물은 0.125 ml의 2 M 트리스-HCl(pH 8.5)을 각각에 첨가함으로써 중화시켰다. UV 검출을 280 nm로 설정하였다.
4. 정제된, 돌연변이된 IgG4 항체의 특성화
SDS PAGE 분석:
조 상청액을 1200 rpm에서 5 min 동안 원심분리하고, OCTET에서 정량화하였다. 항체 샘플(25-30 ng)은 적절한 양의 항체, 4x 로딩 완충제(인비트로겐(Invitrogen)) 및 2 ㎕의 100 mM NEM의 첨가에 의해 제조하였다. 20 ㎕의 총 부피를 dH2O를 사용하여 만들었다. 그 후, 샘플을 100℃에서 3 min 동안 비등시키고, 15웰 1.5 mm 4-20% 트리스-글리신 겔 상에 로딩하였다. 겔을 1x 탱크 완충제에서 1.5시간 동안 150 V에서 러닝시켰다. 항체를 8분 동안 이전시키도록 설정한 아이블롯(iBlot) 건식 이전 시스템을 사용하여 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. 상기 막을 진탕 플랫폼에서 PBS-TM 중에서 실온(RT)에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 토끼 항-인간 IgG Fc HRP 콘쥬게이션 항체(잭슨 이뮤노리서치(Jackson Immunoresearch)) 또는 염소 항-인간 카파 경쇄 HRP 콘쥬게이션 항체(베틸(Bethyl))와 함께, 실온에서 진탕시키면서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이것에 이어서, 각각을 PBS-T를 이용하여 5분간 4회 세척하였다. 블롯은 제조업자의 지시에 따라 금속 증강 DAB 기질 키트(피어스(Pierce))를 사용하여 나타나게 하였다.
면역 블롯 분석의 결과를 도 7, 8, 9 및 10에 나타낸다. 도 7 내지 10에서, H는 중쇄를 나타내고, L은 경쇄를 나타내고, H2L2는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 완전 항체 분자이고, HL은 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄를 포함하는 반분자이다.
도 7은 항체 15, 16, 6, 7, 8, 17, 18, 19, 5, 5P, 9, 10, 11, 1, 2, 3, 4, 12, 13 및 14에 대한 면역 블롯 분석을 나타낸다. 항체는, 힌지 돌연변이 C239S 및 C242S 둘 모두의 존재로 인하여 H2L2를 전혀 나타내지 않거나 매우 적게 나타내는 항체 4, 8 및 14를 제외하고서, 우수한 수준의 H2L2를 나타낸다는 것을 도 7로부터 알 수 있다. 그러나, 항체 4, 8 및 14는 중쇄들 사이의 비공유 결합에 의해 H2L2를 형성할 수 있다. 돌연변이 3도 H2L2를 거의 나타내지 않으며, 이 돌연변이체는 C239를 보유하지만, 아마도 C-말단 경쇄(LC) 시스테인과 힌지 C239 사이의 디술피드의 효율적인 형성으로 인하여, 힌지 내의 중쇄간 디술피드를 형성할 수 없다. 돌연변이 C239S를 포함하지만 C242S를 포함하지 않는 항체(항체 2, 6, 9 및 12)는 C239S도 포함하지 않고 C242S도 포함하지 않는 항체 또는 C242S를 포함하지만 C239S를 포함하지 않는 항체와 비교하여 HL 형성의 감소를 나타낸다는 것을 또한 알 수 있다. S241P 돌연변이를 포함하는 항체 5P 및 16도 HL 형성의 감소를 나타낸다. 돌연변이체 2와 돌연변이체 3의 비교는 중쇄와 디술피드 결합을 형성하도록 하는 경쇄의 C-말단 시스테인의 '도달' 정도를 나타내며, 경쇄 시스테인은 중쇄 내의 C242에 결합하는 것보다 더 효율적으로 C239에 결합하는 것으로 보인다.
도 8은 항체 15, 6, 7, 8, 28, 29, 30, 31, 17, 19, 32, 33, 33, 34, 35, 36, 37, 38 및 39에 대한 면역 블롯 분석을 나타낸다. 항체는, 힌지 영역 내에서의 돌연변이 C239S 및 C242S의 존재로 인하여 H2L2를 전혀 나타내지 않거나 매우 적게 나타내는 항체 8, 31, 35 및 39를 제외하고서, 우수한 수준의 H2L2를 나타내며, 따라서 디술피드 결합이 두 중쇄 사이에서 형성되지 않음을 것을 도 8로부터 알 수 있다. 그러나, 항체 8, 31, 35 및 39는 중쇄들 사이의 비공유 결합에 의해 H2L2를 형성할 수 있다. 돌연변이 C239S를 포함하지만 C242S를 포함하지 않는 항체(항체 6, 29, 33 및 37)는 C239S도 포함하지 않고 C242S도 포함하지 않는 항체 또는 C242S를 포함하지만 C239S를 포함하지 않는 항체와 비교하여 HL 형성의 감소를 나타낸다는 것을 또한 알 수 있다. 돌연변이체 15는 경쇄와 CH1 내의 G230C 사이의 디술피드 결합 및 중쇄간 디술피드를 형성할 수 있고, 이에 따라 완전히 조립된 그리고 디술피드 결합된 단백질이 생성된다. 더욱이, 돌연변이체 15(C127S G230C), 28(C127S Y229C), 32(C127S K228C) 및 36(C127S S227C)의 비교는 상부 힌지 내에 도입된 시스테인의 위치가 LC-HC간 디술피드 결합 형성을 개선시킴을 나타낸다. G230 및 Y229가 시스테인의 도입에 특히 바람직한 위치이다. 돌연변이체 28(C127S Y229C)은 낮은 수준의 HL 및 H2를 나타내며, 따라서 낮은 디술피드 결합 이질성을 갖는다.
도 9는 항체 15, 6, 7, 8, 44, 45, 46, 47, 17 및 19에 대한 면역 블롯 분석을 나타낸다. 항체는, 힌지 영역 내에서의 돌연변이 C239S 및 C242S의 존재로 인하여 H2L2를 전혀 나타내지 않거나 매우 적게 나타내는 항체 8 및 47을 제외하고서, 우수한 수준의 H2L2를 나타내며, 따라서 디술피드 결합이 두 중쇄 사이에서 형성되지 않음을 것을 도 9로부터 알 수 있다. 그러나, 항체 8 및 47은 중쇄들 사이의 비공유 결합에 의해 H2L2를 형성할 수 있다. 돌연변이 C239S를 포함하지만 C242S를 포함하지 않는 항체(항체 6 및 45)는 C239S도 포함하지 않고 C242S도 포함하지 않는 항체 또는 C242S를 포함하지만 C239S를 포함하지 않는 항체와 비교하여 HL 형성의 감소를 나타낸다는 것을 또한 알 수 있다. 특히, 돌연변이체 44는 상부 힌지 내의 3개 아미노산의 삽입이 HL 및 H2 형성을 또한 감소시킬 수 있음을 나타내며, 따라서 비견되는 돌연변이체 15보다 더 낮은 수준의 디술피드 이질성을 갖는다.
도 10은 항체 48, 17, 18 및 19에 대한 면역 블롯 분석을 나타낸다. 항체 48은 우수한 수준의 H2L2 및 매우 적은 HL을 나타냄을 도 10으로부터 알 수 있다. 돌연변이체 48은, 코어 힌지 S241P 돌연변이와 함께, IgG4 상부 힌지 서열 대신 IgG1 상부 힌지 서열 EPKSCDKTHT(서열 번호 319)를 함유한다. 따라서, 돌연변이체 48은 상부 및 코어 힌지 서열 EPKSCDKTHTCPPCP(서열 번호 320)을 갖는다. 돌연변이체 48은 야생형 IgG4 항체 17과 비교하여 더 낮은 수준의 디술피드 결합 이질성을 나타내고, IgG4 S241P 돌연변이체 18 및 야생형 IgG1 항체 19와 비교하여 대략 등가의 낮은 수준의 디술피드 결합 이질성을 나타낸다.
서모플루오르 분석법:
정제된 mAb의 열안정성을 사이프로(SYPRO)® 오렌지(Orange)를 사용하여 서모플루오르 분석법으로 분석하여 단백질의 열적 폴딩해제(unfolding) 과정을 모니터링하였다. 5 ㎕의 1 mg/ml의 mAb, 5 ㎕의 30x 염색제, 및 40 ㎕의 PBS를 함께 첨가하였다. 10 ㎕의 상기 믹스를 사중으로 384 PCR 광학 웰 플레이트에 분배하고, 7900HT 신속 실시간(Fast Real-Time) PCR 시스템(영국 워킹엄 소재의 애질런트 테크놀로지즈 유케이 리미티드(Agilent Technologies UK Ltd))에서 러닝시켰다. 이 PCR 시스템은 20℃ 내지 99℃로 설정한 정확한 온도 제어용 가열 장치를 포함하며; 충전된 커플링된 장치는 웰에서의 형광 변화들을 동시에 모니터링한다.
도 11, 12, 13, 14 및 15는 야생형 IgG1 및 IgG4 항체와 비교하여 IgG4 항체 돌연변이체의 열안정성 분석의 결과를 나타낸다.
돌연변이체 15를 야생형 IgG4(돌연변이체 17)와 비교하면, 변경된 디술피드 배치로 인하여 Fab Tm의 증가를 나타낸다. 돌연변이체 15와 돌연변이체 28의 비교는 G230C 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 15와 비교하여 Y229C 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 28에 있어서의 Fab Tm의 추가의 개선을 나타낸다. 돌연변이체 15와 돌연변이체 44의 비교는, G230C 돌연변이체의 Fab Tm이 상부 힌지 내의 3개 아미노산의 삽입에 의해 또한 추가로 증가될 수 있음을 나타낸다. 돌연변이체 17과 돌연변이체 18의 비교는, S241P 중간 힌지 돌연변이가, 심지어 이것이 HL 형성을 유의하게 삼소시키지 않음에도 불구하고, Fab Tm을 증가시키지 않음을 나타낸다. 또한, 돌연변이체 48은 야생형 IgG4(돌연변이체 17) 및 돌연변이체 15 둘 모두와 비교할 때 유의하게 개선된 Fab Tm을 나타낸다.
도 15는 본 발명에 따른 선택된 IgG4 돌연변이체의 열안정성의 전체 등급을 나타낸다. 돌연변이체 48, 44, 44P, 46, 45, 6, 29, 30, 28, 28P, 31, 8, 47 및 15 모두는 야생형 IgG4(돌연변이체 17) 및 야생형 IgG4 S241P(돌연변이체 18)과 비교하여 유의하게 더 높은 Fab Tm 값을 나타낸다.
5. Fab 아암 교환
a) 시험관내 중쇄 교환
각각이 상이한 항원 특이성을 갖는 제1 IgG4 항체 및 제2 IgG4 항체를 인산염 완충 염수(PBS)(mM 단위: 150의 NaCl, 10의 NaH2PO4; pH 7.4) 중 100 ㎍/ml의 총 농도로 1:2의 몰비로 혼합하였다. 디술피드 결합 감소를 허용하기 위하여, 샘플들에 환원 글루타티온(GSH; 시그마)을 0, 0.5 또는 5 mM의 최종 농도로 보충하였다. 실험의 시작시에(t = 0시간), 상기 혼합물의 분취물을 취하고,(잠재적으로 반응성인 티올기를 불활성화하기 위하여 10 mM의 최종 농도로 N-에틸말레이미드(NEM; 시그마)로 급랭시키고, 나머지 혼합물과 함께 37℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다(t = 16시간). 인큐베이션 후, t = 16시간의 샘플을 상기와 같이 급랭시켰다.
시험한 제1 및 제2 항체의 조합을 하기 표에 나타낸다:
Figure pct00010
Figure pct00011
상기 표에서의 항체 1과 항체 2 사이의 중쇄의 교환은 관련 항체들 각각으로부터의 중쇄를 갖는 비대칭형 항체를 제공한다.
b) 시험관내에서의 중쇄 교환의 검출 및 정량화
기능적 활성 2특이성 항체의 존재를 샌드위치 MSD 분석법을 이용하여 결정하였는데, 상기 분석법에서는 실시예 5 a)에서 제공된, 급랭시킨 반응 샘플을 PBS 중 1% BSA(PB)에 연속 희석시킨 것을 교반하면서(200 r.p.m) 실온에서 1시간 동안 PB 중 1 ㎍/ml의 바이오티닐화 항원 1(제1 항체의 항원)과 함께 사전 인큐베이션시킨 후 PB 사전 차단 스트렙타비딘 코팅 MSD 플레이트(메소 스케일 다이아그노스틱스(Meso Scale Diagnostics))로 옮겼다. 교반하면서 실온에서 1시간 인큐베이션한 후, 웰을 PBS/0.1% 트윈(Tween)-20으로 3회 세척한 후, PB 중 1 ㎍/ml의 술포 표지 항원 2(제2 항체의 항원)와 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 후, 플레이트를 상기와 같이 세척하였으며, 신호를 각각 제조업자의 리드(read) 완충제 및 이미지 섹터(Image Sector) 6000 기기를 이용하여 나타내고 측정하였다. 바이오티닐화 항원을 비바이오티닐화 대체물로 치환한 대조 평행 반응으로부터 수득한 배경 값들을 모든 신호로부터 제하였다. 3회 이상의 독립 실험으로부터의 이중 값을 모든 계산에서 사용하였다. MSD 신호가 높을수록, 일어난 중쇄 교환의 양이 더 많아진다.
도 16은 GSH의 두 농도에서의 16시간에서의 중쇄 교환을 나타내며, 여기서, 제1 항체는 IgG1 야생형, IgG4 야생형 및 다양한 돌연변이 항체로부터 선택되고, 제2 항체는 IgG4 야생형이다. 본 도면은 당해 돌연변이체가 야생형 IgG4 항체보다 더 적은 교환을 가지며, IgG1 야생형 항체보다 유의하게 더 큰 교환을 가짐을 나타낸다. 이는 교환을 이용하여 시험관내에서 본 발명의 비대칭형 항체를 제조할 수 있다는 점에서 유리한데, 상기 비대칭형 항체는 생체내에서 야생형 IgG4 항체보다 교환을 겪는 민감성이 더 적다. 일부 예에서, GSH와 같은 환원제의 농도를 증가시키면 관찰되는 교환의 양이 증가된다.
문헌[Labrijn 2011], 문헌[Lewis 2009], 문헌[Stubenrauch 2010], 문헌[Labrijn 2009]과 잘 일치하여, IgG4 코어-힌지 내의 S241P 돌연변이는 Fab 아암 교환의 방지를 위한 도구를 대표함이 나타났다(도 16). 또한, 본 발명의 돌연변이 2특이성 항체는, 혈장의 4 내지 6 μM의 생리학적 GSH 농도보다 100배 더 높은 0.5 mM GSH에서 나타난 것보다 더 적은 Fab 아암 교환을 보여줌을 또한 알 수 있다(문헌[Zilmer. et al, 2005. Drug Design Reviews]). 따라서, 2특이성 항체는 환원 조건 하에서 Fab 아암 교환에 의해 시험관내에서 생성될 수 있으며, 이는 그 후 IgG4 wt와 비교하여 생체내에서 Fab 아암 교환이 유의하게 감소되었다.
도 17은 241 위치의 글리신이 이 위치에 알라닌 또는 트레오닌 중 어느 하나를 갖는 IgG4 돌연변이체와 쉽게 교환될 수 있음을 나타낸다. 241 위치에 알라닌을 갖는 IgG4는 이 위치에 글리신을 갖는 돌연변이체보다 이 위치에 트레오닌을 갖는 돌연변이체와 약간 더 많이 교환된다. 이와 유사하게, 241 위치에 트레오닌을 갖는 IgG4 돌연변이체는, 대칭형 분석물과 비교하여 S241G와의 반응에서의 경우 감소된 교환 활성을 나타냈다. IgG4 S241A와의 교환은 대칭형 분석물과 유사하였다. 요약하면, 이는 IgG4 S241T가 IgG4 WT과 유사한 수준으로 교환되며 돌연변이체 S241A 및 S241G와 비교하여 더 많이 교환될 가능성이 있음을 시사한다.
항체 친화도:
표적 가용성 사이토카인에 대한 본 발명의 선택된 돌연변이 IgG4 항체의 친화도를 비아코어(BIAcore)TM에 의해 측정할 수 있다. 분석 포맷은 항-Fc 표면 상에 IgG를 포획하고, 이어서 가용성 사이토카인을 적정하는 것이다.
용어 "kd"(s -1)는 항체-항원 상호작용의 해리 속도 상수를 나타낸다. 상기 값은 koff 값으로도 나타낸다.
본원에서 사용될 때, 용어 "ka"(M -1 s -1)는 항체-항원 상호작용의 회합 속도 상수를 나타낸다.
본원에서 사용될 때, 용어 "KD"(M) 또는 "KD"(pM)는 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 나타낸다.
크기 배제( SEC ) HPLC 분석:
대략 50 ㎍의 정제된 항체를 S200 컬럼을 사용하여 HPLC에서 러닝시켰다. 항체 1 내지 19를 분석용으로 사용하였다. 이 결과는, 인간 IgG4 분자의 DSB 배치에 대한 변경에도 불구하고, 비공유적 회합 H2L2가 형성됨을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> UCB Pharma SA <120> Assymmetric Antibodies <130> G0163 WO01 <140> PCT/EP2013/053615 <141> 2013-02-22 <150> GB1203071.4 <151> 2012-02-22 <160> 322 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG1 wild type CH1 & hinge <220> <221> X <222> (1)..(1) <223> Absent or A <220> <221> X <222> (99)..(99) <223> Absent or E <400> 1 Xaa Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Xaa Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Gly Gly Pro 115 120 <210> 2 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 wild type CH1 & hinge <220> <221> X <222> (1)..(1) <223> Absent or A <220> <221> X <222> (99)..(99) <223> Absent or E <400> 2 Xaa Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Xaa Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro 115 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human wild-type kappa light chain <400> 3 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal sequence of the CH1 domain of a human IgG1 <400> 4 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 1 5 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Leu Gly Gly Pro 35 40 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal sequence of the CH1 domain of a human IgG4 <400> 10 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser 1 5 <210> 11 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hinge region of a human IgG4 <400> 11 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Leu Gly Gly Pro 20 <210> 12 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH1 domain and hinge region sequences of Ab 6 <220> <221> X <222> (1)..(1) <223> Absent or A <400> 12 Xaa Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 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Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 330 <210> 59 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH1 domain, hinge region, CH2 domain and CH3 domain sequences of antibodies 2 <220> <221> X <222> (1)..(1) <223> Absent or A <220> <221> X <222> (99)..(99) <223> Absent or E <400> 59 Xaa Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Xaa Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Ser Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 60 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH1 domain, hinge region, CH2 domain and CH3 domain sequences of antibodies 3 <220> <221> X <222> (1)..(1) <223> Absent or A <220> <221> X <222> (99)..(99) <223> Absent or E <400> 60 Xaa Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Xaa Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Ser Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 61 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH1 domain, hinge region, CH2 domain and CH3 domain sequences of antibodies 48 <220> <221> X <222> (1)..(1) <223> Absent or A <220> <221> X <222> (99)..(99) <223> Absent or E <400> 61 Xaa Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Xaa Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 330 <210> 62 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH1 domain, hinge region, CH2 domain and CH3 domain sequences of antibodies 28P <220> <221> X <222> (1)..(1) <223> Absent or A <220> <221> X <222> (99)..(99) <223> Absent or E <400> 62 Xaa Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Xaa Ser Lys Cys Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 63 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH1 domain, hinge region, CH2 domain and CH3 domain sequences of antibodies 44P <220> <221> X <222> (1)..(1) <223> Absent or A <220> <221> X <222> (99)..(99) <223> Absent or E <400> 63 Xaa Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Xaa Ser Lys Tyr Cys Pro Pro Ala Ala Ala Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 330 <210> 64 <211> 209 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> wild type IgG4 CH2 and CH3 <400> 64 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 1 5 10 15 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp 20 25 30 Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 35 40 45 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val 50 55 60 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 65 70 75 80 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys 85 90 95 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 100 105 110 Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 115 120 125 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 130 135 140 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 145 150 155 160 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys 165 170 175 Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 180 185 190 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 195 200 205 Lys <210> 65 <211> 209 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> wild type IgG4 CH2 and wild type IgG1 CH3 <400> 65 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 1 5 10 15 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp 20 25 30 Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 35 40 45 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val 50 55 60 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 65 70 75 80 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys 85 90 95 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 100 105 110 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 115 120 125 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 130 135 140 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 145 150 155 160 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 165 170 175 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 180 185 190 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 195 200 205 Lys <210> 66 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> constant region sequence of a human wild-type kappa light chain. <400> 66 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 1 5 10 15 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 35 40 45 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 67 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal sequence of the CH1 domain of a human IgD <400> 67 Ile Ile Ser Gly Cys Arg His Pro Lys 1 5 <210> 68 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> the hinge region of a human IgGD antibody <220> <221> X <222> (1)..(1) <223> Absent or E <400> 68 Xaa Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala Gln Pro Gln 1 5 10 15 Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg 20 25 30 Asn Thr <210> 69 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal sequence of the CH1 domain of a human IgM antibody. <400> 69 Leu Val Ser Cys Glu Asn Ser Pro Ser 1 5 <210> 70 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal sequence of the CH1 domain of a human IgM antibody. <400> 70 Glu Lys Asn Val Pro Leu Pro 1 5 <210> 71 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH2 domain of a human IgM antibody. <220> <221> X <222> (1)..(1) <223> Absent of V <400> 71 Xaa Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys Val Ser Val 1 5 10 <210> 72 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 hinge <400> 72 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Ala Ala Ala Cys Pro Ser Cys Pro 1 5 10 15 <210> 73 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 hinge <400> 73 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Gly Gly Gly Cys Pro Ser Cys Pro 1 5 10 15 <210> 74 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 hinge <400> 74 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Thr His Thr Cys Pro Ser Cys Pro 1 5 10 15 <210> 75 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 hinge <400> 75 Glu Ser Lys Tyr Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Ser Cys Pro 1 5 10 15 <210> 76 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 hinge <400> 76 Glu Pro Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Ala Ala Ala Cys Pro Ser Cys Pro 1 5 10 15 <210> 77 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 hinge <400> 77 Glu Pro Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Gly Gly Gly Cys Pro Ser Cys Pro 1 5 10 15 <210> 78 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 hinge <400> 78 Glu Pro Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Thr His Thr Cys Pro Ser Cys Pro 1 5 10 15 <210> 79 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 hinge <400> 79 Glu Pro Ser Lys Tyr Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Ser Cys Pro 1 5 10 15 <210> 80 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 hinge <400> 80 Glu Ser Lys Ser Tyr Gly Pro Pro Ala Ala Ala Cys Pro Ser Cys Pro 1 5 10 15 <210> 81 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 hinge <400> 81 Glu Ser Lys Ser Tyr Gly Pro Pro Gly Gly Gly Cys Pro Ser Cys Pro 1 5 10 15 <210> 82 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 hinge <400> 82 Glu Ser Lys Ser Tyr Gly Pro Pro Thr His Thr Cys Pro Ser Cys Pro 1 5 10 15 <210> 83 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 hinge <400> 83 Glu Ser Lys Ser Tyr Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Ser Cys Pro 1 5 10 15 <210> 84 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 hinge <400> 84 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Ala Ala Ala Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 85 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 hinge <400> 85 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Gly Gly Gly Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 86 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 hinge <400> 86 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 87 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 hinge <400> 87 Glu Ser Lys Tyr Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 88 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 hinge <400> 88 Glu Pro Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Ala Ala Ala Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 89 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 hinge <400> 89 Glu Pro Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Gly Gly Gly Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 90 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 hinge <400> 90 Glu Pro Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 91 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 hinge <400> 91 Glu Pro Ser Lys Tyr Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 92 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 hinge <400> 92 Glu Ser Lys Ser Tyr Gly Pro Pro Ala Ala Ala Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 93 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 hinge <400> 93 Glu Ser Lys Ser Tyr Gly Pro Pro Gly Gly Gly Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 94 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 hinge <400> 94 Glu Ser Lys Ser Tyr Gly Pro Pro Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 95 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 hinge <400> 95 Glu Ser Lys Ser Tyr Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 96 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hinge <400> 96 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 <210> 97 <211> 15 <212> PRT <213> 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Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Xaa Ser Lys Tyr Cys Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 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Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Xaa Ser Lys Tyr Cys Pro Pro Ser Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 311 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH1 domain, hinge region, CH2 domain and CH3 domain sequences of antibodies 10 <220> <221> X <222> (1)..(1) <223> Absent or A <220> <221> X <222> (99)..(99) <223> Absent or E <400> 311 Xaa Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Xaa Ser Lys Tyr Cys Pro Pro Cys Pro Ser Ser Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 312 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH1 domain, hinge region, CH2 domain and CH3 domain sequences of antibodies 11 <220> <221> X <222> (1)..(1) <223> Absent or A <220> <221> X <222> (99)..(99) <223> Absent or E <400> 312 Xaa Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Xaa Ser Lys Tyr Cys Pro Pro Ser Pro Ser Ser Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 313 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH1 domain, hinge region, CH2 domain and CH3 domain sequences of antibodies 12 <220> <221> X <222> (1)..(1) <223> Absent or A <220> <221> X <222> (99)..(99) <223> Absent or E <400> 313 Xaa Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Xaa Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Ser Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 314 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH1 domain, hinge region, CH2 domain and CH3 domain sequences of antibodies 13 <220> <221> X <222> (1)..(1) <223> Absent or A <220> <221> X <222> (99)..(99) <223> Absent or E <400> 314 Xaa Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Xaa Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Ser Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr 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Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Xaa Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Ser Pro Ser Ser Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 316 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> wild-type IgG1 upper and core hinge <400> 316 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 317 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> wild-type IgG4 upper and core hinge <400> 317 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro 1 5 10 <210> 318 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hinge <400> 318 Glu Pro Lys Tyr Gly Pro Pro 1 5 <210> 319 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG1 upper hinge <400> 319 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 1 5 10 <210> 320 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hinge <400> 320 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 321 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 lower hinge <400> 321 Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro 1 5 <210> 322 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hinge <400> 322 Cys Pro Pro Cys Pro 1 5

Claims (35)

  1. 각각, 적어도 가변 영역, 힌지(hinge) 영역 및 CH1 도메인을 포함하는 2개의 중쇄 또는 중쇄 단편을 포함하는 비대칭형 항체로서,
    제1 중쇄 또는 이의 단편은 클래스 IgG4이며,
    a. CH1 도메인에서, 카밧 넘버링(Kabat numbering) 시스템에 따라 넘버링할 경우, 127 위치의 사슬간 시스테인이 또다른 아미노산으로 치환되며;
    b. 경우에 따라, 상부 힌지 영역에 위치한 아미노산들 중 1개 이상은 시스테인으로 치환되고,
    제2 중쇄 또는 이의 단편은 이 사슬의 일부 또는 전부가 적어도 가변 영역 밖의 영역(예, 불변 영역)에서 상기 제1 중쇄와 상이한 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 비대칭형 항체.
  2. 각각, 적어도 가변 영역, 힌지 영역 및 CH1 도메인을 포함하는 제1 및 제2 중쇄 또는 중쇄 단편(들)을 포함하는 비대칭형 항체로서,
    제1 중쇄 또는 이의 단편은 클래스 IgG4이며 IgG1 타입 힌지를 갖고, 제2 중쇄 또는 이의 단편은 적어도 가변 영역 밖의 영역에서 상기 제1 중쇄와 상이한 아미노산 서열을 갖는 것인 비대칭형 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 중쇄의 상부 힌지 영역에 위치하는 1개 이상의 아미노산은 시스테인으로 치환되며, 카밧 넘버링 시스템에 따라 넘버링할 경우 227, 228, 229 및 230으로부터 선택되는 것인 비대칭형 항체.
  4. 제3항에 있어서, 카밧 넘버링 시스템에 따라 넘버링할 경우 230 위치의 글리신이 시스테인으로 치환되는 것인 비대칭형 항체.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 카밧 넘버링 시스템에 따라 넘버링할 경우 229 위치의 타이로신이 시스테인으로 치환되는 것인 비대칭형 항체.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 카밧 넘버링 시스템에 따라 넘버링할 경우 228 위치의 라이신이 시스테인으로 치환되는 것인 비대칭형 항체.
  7. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 카밧 넘버링 시스템에 따라 넘버링할 경우 227 위치의 세린이 시스테인으로 치환되는 것인 비대칭형 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 중쇄에서, 카밧 넘버링 시스템에 따라 넘버링할 경우 239 위치의 시스테인 및 242 위치의 시스테인이 또다른 아미노산으로 치환되는 것인 비대칭형 항체.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 중쇄에서, 카밧 넘버링 시스템에 따라 넘버링할 경우 239 위치의 시스테인이 또다른 아미노산으로 치환되는 것인 비대칭형 항체.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 중쇄에서, 카밧 넘버링 시스템에 따라 넘버링할 경우 242 위치의 시스테인이 또다른 아미노산으로 치환되는 것인 비대칭형 항체.
  11. 각각, 적어도 가변 영역, 힌지 영역 및 CH1 도메인을 포함하는 2개의 중쇄를 포함하는 비대칭형 항체로서,
    제1 중쇄 또는 이의 단편은 이것이 클래스 IgG4이며,
    a) 카밧 넘버링 시스템에 따라 넘버링할 경우 127 위치의 사슬간 시스테인이 또다른 아미노산으로 치환되며;
    b) 경우에 따라, 카밧 넘버링 시스템에 따라 넘버링할 경우 239 위치의 시스테인 또는 242 위치의 시스테인이 또다른 아미노산으로 치환되는 것을 특징으로 하며;
    제2 중쇄 또는 이의 단편은 이것이 가변 영역 밖의 영역에서 상기 제1 중쇄와 상이한 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 비대칭형 항체.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 중쇄의 239 위치의 시스테인 및/또는 242 위치의 시스테인이 비-티올 함유 아미노산으로 치환되는 것인 비대칭형 항체.
  13. 제12항에 있어서, 비-티올 함유 아미노산이 세린인 비대칭형 항체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 카밧 넘버에 따라 잔기 240 및/또는 241의 아미노산이 또다른 아미노로 대체되는 것인 비대칭형 항체.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 127 위치의 시스테인이 비-티올 함유 아미노산으로 치환되는 것인 비대칭형 항체.
  16. 제15항에 있어서, 비-티올 함유 아미노산이 세린인 비대칭형 항체.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄는, 카밧 넘버링 시스템에 따라 넘버링할 경우 아미노산 226-243 사이에 3개의 아미노산이 삽입되도록 돌연변이되는 것인 비대칭형 항체.
  18. 제17항에 있어서, 제1 중쇄는, 카밧 넘버링 시스템에 따라 넘버링할 경우 238 위치와 239 위치 사이에 3개의 아미노산이 삽입되도록 돌연변이되는 것인 비대칭형 항체.
  19. 제18항에 있어서, 3개의 알라닌이 카밧 넘버링 시스템에 따라 넘버링할 경우 제1 중쇄의 238 위치와 239 위치 사이에 삽입되는 것인 비대칭형 항체.
  20. 제18항에 있어서, 트레오닌, 히스티딘 및 추가의 트레오닌이 카밧 넘버링 시스템에 따라 넘버링할 경우 제1 중쇄의 238 위치와 239 위치 사이에 삽입되는 것인 비대칭형 항체.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 카밧 넘버링 시스템에 따라 넘버링할 경우 제1 중쇄의 241 위치의 세린이 프롤린으로 치환되는 것인 비대칭형 항체.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 중쇄에서, 230 위치의 글리신이 시스테인으로 치환되고, 227 위치의 세린이 프롤린으로 치환되고, 229 위치의 타이로신이 세린으로 치환되고, 237 위치의 프롤린이 아스파르트산으로 치환되고, 238 위치의 프롤린이 라이신으로 치환되고, 아미노산 서열 트레오닌-히스티딘-트레오닌이 238 위치와 239 위치 사이에 삽입되고, 241 위치의 세린이 프롤린으로 치환되는 것인 비대칭형 항체.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄들 또는 이의 단편들 중 1개 이상이 CH2 도메인 및/또는 CH3 도메인을 포함하는 것인 비대칭형 항체.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 중쇄는 가변 영역을 포함하며, 상기 2개의 가변 영역은 동일한 것인 비대칭형 항체.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 중쇄는 가변 영역을 포함하며, 이 둘은 상이한 것인 비대칭형 항체.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 2특이성인 비대칭형 항체.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 각 중쇄 또는 중쇄 단편의 힌지 영역은 상이하며, 예를 들어 상이한 아미노산 서열 및/또는 상이한 서열 길이인 비대칭형 항체.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 각 중쇄 또는 중쇄 단편의 힌지 영역은 동일하며, 예를 들어 동일한 아미노산 서열인 비대칭형 항체.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 또는 각각의 중쇄는 상부 힌지 영역 및 12 내지 17개의 아미노산 길이, 예를 들어 15개의 아미노산 길이의 코어 영역을 포함하는 것인 비대칭형 항체.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 중쇄는 클래스 IgG4 또는 클래스 IgG1, 예컨대 클래스 IgG4인 비대칭형 항체.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 정의된 항체를 코딩하는 서열을 포함하는 발현 벡터.
  32. 제31항에 정의된 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  33. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 비대칭형 항체.
  34. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 정의된 항체의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 질환 또는 장애의 치료 방법.
  35. (예를 들어 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 정의된) 항체의 제조 방법으로서,
    본원에 정의된 제1 중쇄 서열 또는 이의 단편을 포함하는 대칭형 항체를 취하는 단계, 및 시험관내에서 상기 항체와, 상기 제1 중쇄 서열과 다른 제2 중쇄 서열 또는 이의 단편을 포함하는 제2 대칭형 항체를, 상기 두 항체 사이의 중쇄 교환에 도움이 되는 조건 하에서 혼합하는 단계, 및 경우에 따라, 이로부터 수득한 비대칭형 혼합 항체를 단리하는 단계를 포함하는 것인 방법.
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