MX2013001656A - Composicion probiotica para la salud bucal. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona una composición que comprende una cantidad eficaz de Lactobacillus plantarurn CECT 7481 y Lactobacillus brevis CECT 7480. Las cepas presentan varias propiedades funcionales que las hacen adecuadas para su uso en la mejora de la salud bucal. Tales propiedades incluyen no solo buenas propiedades antagonistas contra patógenos bucales, sino también la capacidad de colonizar la cavidad bucal y un bajo perfil de acidificación. La invención también proporciona el uso de la composición como probiótico y/o como medicamento para aplicaciones de salud bucal así como productos que contengan la composición.

Description

COMPOSICION PROBIOTICA PARA LA SALUD BUCAL Campo de la Invención La presente invención se refiere a los campos de la medicina, la microbiología y la nutrición y, particularmente, a una nueva combinación de cepas probióticas de Lactobacillus y composiciones útiles en el campo de la salud bucal.

Antecedentes de la Invención Las enfermedades relacionadas con la placa dental, particularmente la gingivitis, la periodontitis y la caries, representan la mayor parte de enfermedades bucales a nivel mundial .

Las enfermedades periodontales (gingivitis y periodontitis) están principalmente causadas por infecciones de bacterias gramnegativas anaerobias específicas, lo que lleva a la destrucción inicial del te ido conectivo blando, y subsecuentemente, a la disrupción del hueso alveolar subyacente y el ligamento que sostiene los dientes. Las bacterias de la especie Porphyro onas gingivalis se han propuesto como principal agente etiológico en el desarrollo y la progresión de la periodontitis. Otras especies que también contribuyen a la inflamación gingival son Treponema denticola, Prevotella denticola y Fusobacteríu nucleatum. En base a las encuestas de la Organización Mundial de la Salud, la mayoría de niños presentan signos de gingivitis, y entre ~" Ref. 238719 los adultos las etapas iniciales de la enfermedad periodontal son altamente prevalentes . Por ejemplo, en Europa, se estima que el 15-35% de la población adulta padece esta enfermedad multifactorial .

La caries dental (también conocida como deterioro dental) es una enfermedad donde procesos bacterianos dañan la estructura dura del diente. Steptococcus m tans es uno de los pocos microorganismos especializados equipado con receptores que ayudan a una mayor adhesión a la superficie del diente, siendo por lo tanto un colonizador primario de la superficie dental y el mayor contribuyente a la caries . El crecimiento y el metabolismo de esta especie pionera crea un ambiente ácido en la boca que provoca que el esmalte dental altamente mineralizado sea vulnerable al deterioro.

Además de lo anterior, se cree que hay otro trastorno bucal que podría afectar a una gran proporción de la población: la halitosis. También conocida como mal aliento, la halitosis está causada por una cantidad de compuestos volátiles que derivan de la degradación bacteriana de los aminoácidos que contienen azufre. Las bacterias implicadas (principalmente Fusobacteriu nucleatum, Porphyromonas gingivalis, Porphyromonas intermedia y Treponema denticola) se localizan en áreas estancadas de la cavidad bucal, tales como la parte dorsal de la superficie de la lengua, los huecos periodontales y las áreas inter-proximales . Esta afección tiene un impacto significativo, personal y socialmente, para aquellos que lo padecen, y se estima que es el tercer motivo más frecuente de búsqueda de ayuda dental, seguido del deterioro dental y la enfermedad periodontal .

Las bacterias bucales forman una película (placa dental) en todos los tejidos duros y blandos, lo que se considera el principal agente etiológico de afecciones patológicas de la boca. La acumulación de bacterias dentro del película, propiciada por un mantenimiento pobre de la salud bucal, predispone a un cambio alogénico en la comunidad microbiana, conllevando el inicio de la inflamación periodontal y la formación de la caries, y contribuyendo a la halitosis .

Las levaduras, y particularmente, Candida albicans, también pueden causar patologías en la cavidad bucal. Las personas mayores son vulnerables a la infección por Candida provocada por enfermedades crónicas, medicación, higiene bucal pobre, flujo salivar reducido, o deficiencias en el sistema inmune. Pese a que la colonización por Candida puede ser asintomática, un crecimiento elevado conlleva usualmente candidiasis local, con varios tipos de lesiones y síntomas en la mucosa .

Modificar el potencial patógeno de la microbiota dentro de la cavidad bucal podría ser una estrategia interesante para combatir estas patologías. En esta dirección, la introducción de lactobacilos probióticos para reemplazar parcialmente microorganismos patógenos es una manera prometedora de controlar las infecciones bucales . No obstante, en comparación con las afecciones gastrointestinales, el uso de probióticos para aplicaciones de salud bucal ha sido escasamente estudiado. Actualmente, se comercializan muy pocos productos comerciales que contengan probióticos y que incorporen tales aplicaciones para la salud.

Uno de estos productos es Prodentis® de BioGaia.

Prodentis es una goma de mascar que contiene la cepa probiótica L. reuteri ATCC 55730 y ha demostrado reducir la gingivitis en un estudio clínico (Twetman S, et al. "Short-term effect of chewing gums containing probiotic LactOjbacillus_reuteri on the levéis of inflammatory mediators in gingival cervicular fluid". Acta- Odontol Scand, 2009, vol. 67, p. 19-24) . Se ha descrito que la misma cepa, L. reuteri ATCC 55730, ejerce una fuerte actividad antagonista frente al cariogénico Streptococcus mutans (Caglar E, et al. "Salivary mutans streptococci and lactobacilli levéis after ingestión of the probiotic bacterium Lactobacíllus_reuteri ATCC 55730 by straws or tablets" . Acta Odontol Scand, 2009, vol. 64, p. 314-318) . No obstante, se sabe poco sobre el impacto de L. reuteri ATCC 55730 sobre otros patógenos bucales. Además, L. reuteri se ha aislado del intestino, no de la cavidad bucal, y no se sabe si esta cepa tiene la capacidad de formar película, o en su lugar coloniza el medio para tener un efecto más duradero. Se ha demostrado que la capacidad de Lactobacillus sp. de adherirse a superficies cubiertas de saliva en un modelo que imita las condiciones de la cavidad bucal varía considerablemente (Stamatova I, et al. nIn vitro evaluation of yoghurt starter lactobacilli and Lactobacillus rhamnosus GG adhesión to saliva-coated surfaces" . Oral Microbiol Immunol, 2009, vol . 24, p. 218-223).

Streptococcus salivarius K12 es otro probiótico comercial pensado para ser utilizado en la cavidad bucal. S. salivarius K12 se aisló de la saliva de niños sanos y se ha visto que presenta actividad antimicrobiana in vitro contra varias bacterias implicadas en la etiología de la halitosis (Burton JP, et al. "Preliminary study of the effect of probiotic Streptococcus salivarius K12 on oral malodor parameters" . J Appl Microbiol, 2006, vol. 100, p. 754-764). No obstante, los efectos beneficiosos de esta cepa se limitan a la mejora de los síntomas de la halitosis.

Los probióticos tienen, en consecuencia, potencial para proporcionar efectos beneficiosos para la cavidad bucal, siempre y cuando se identifiquen cepas probióticas adecuadas. Con este propósito, es necesario considerar los potenciales beneficios para el hospedador, pero también la seguridad de la cepa, así como los posibles efectos adversos en la cavidad bucal. Estos últimos adquieren una especial relevancia cuando se contempla el uso bucal de lactobacilos , dado' que se ha descrito que ciertos lactobacilos son cariogénicos debido a un elevado potencial acidogénico que favorece la degradación de los tejidos duros tales como el esmalte y la dentina.

Pese a los avances en el campo de los probióticos bucales, en base a lo anterior está claro que se necesitan nuevas cepas probióticas las cuales, teniendo un amplio espectro de beneficios en la cavidad bucal, no presenten efectos adversos.

Breve Descripción de la Invención Los inventores han aislado nuevas cepas de la microbiota bucal humana. Estas cepas, Lactojbac llus plantarum CECT 7481 y Lactobacillus brevis CECT 7480, presentan varias propiedades funcionales que las hacen apropiadas para su uso en la mejora de la salud bucal. Tales propiedades incluyen no sólo unas buenas propiedades antagónicas contra patógenos bucales, sino también la capacidad de colonizar la cavidad bucal y un bajo perfil de acidificación. Como se discute a continuación, también se ha encontrado que, cuando ambas cepas se utilizan en una combinación única, los beneficios para la cavidad bucal son remarcables .

Así, en un primer aspecto la presente invención proporciona una composición que comprende Lactobacillus plantarum CECT 7481 y Lactobacillus brevis CECT 7480.

Queda claro que usando las cepas seleccionadas como material de partida, un experto en la materia puede rutinariamente, por mutagénesis convencional o técnicas de re-aislamiento, obtener otros mutantes o derivados de éstos que mantengan o mejoren las características relevantes descritas y las ventajas de las cepas que forman la composición de la invención. Estos mutantes o derivados pueden ser modificados genéticamente o aparecer de manera natural. El experto en. la materia decidirá sobre el método adecuado a emplear para determinar las actividades funcionales de las cepas. En los ejemplos a continuación se muestran posibles métodos para medir estas actividades.

En consecuencia, por nLactobacillus plantarum CECT 7481" se entiende la cepa Lactobacillus plantarum depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo bajo el número de registro CECT 7481, así como un microorganismo mutante o derivado que haya sido obtenido por técnicas conocidas en el estado de la técnica utilizando como material de partida la cepa depositada, donde el mutante o derivado conserva al menos una de las características y ventajas relevantes de Lactobacillus plantarum CECT 7481 descritas. Por "Lactobacillus brevis CECT 7480" se entiende una cepa de Lactobacillus brevis depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo bajo el número de registro CECT 7480, así como un microorganismo mutante o derivado que haya sido obtenido por técnicas conocidas en el estado de la técnica utilizando como material de partida la cepa depositada, donde el mutante o derivado conserva al menos una de las características y ventajas relevantes de la cepa Lactobacillus brevis CECT 7480.

Las cepas de la presente invención tienen la ventaja de ser particularmente útiles como probióticos .

El término "probiótico" se conoce en el estado de la técnica como un microorganismo que, cuando es administrado en las cantidades adecuadas, confiere un beneficio para la salud al hospedador. Un microorganismo probiótico debe satisfacer varios requisitos relacionados con la falta de toxicidad, viabilidad, adhesión y efectos beneficiosos. Estas propiedades probióticas son dependientes de la cepa, incluso entre bacterias de la misma especie. En consecuencia, es importante encontrar aquellas cepas que presentan un rendimiento mejor en todos los requisitos probióticos.

Preferiblemente, las cepas de la invención son útiles como probióticos bucales, por ejemplo probióticos que mejoran la salud bucal. Se ha visto que Lactobacillus plantarum CECT 7481 y Lactobacillus brevis CECT 7480 presentan una actividad inhibitoria significativa contra un amplio número de patógenos de la cavidad bucal que están involucrados en el desarrollo de patologías bucales, tales como la gingivitis, periodontitis , caries y halitosis ,· mientras que presentan un antagonismo mínimo contra cepas comensales de la flora bucal humana. Además, estas dos cepas no muestran actividad inhibitoria entre ellas, permitiendo en consecuencia su uso combinado en una única fórmula. Adicionalmente, como puede verse en los siguientes ejemplos, la combinación de estas cepas en una única fórmula (p.ej. la composición de la invención) tiene la ventaja de presentar una elevada actividad antagonista contra patógenos bucales en comparación con la actividad de las cepas individuales utilizadas por separado. Por lo tanto, las cepas de la invención presentan una actividad cooperativa contra patógenos bucales y son especialmente útiles usadas de forma combinada.

Antagonizando microorganismos que están implicados en condiciones patológicas de la cavidad bucal, tales como Streptococcus mutans, Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, Prevotella denticola y Fusobacterium nucleatum, estas cepas tienen el efecto de alterar el perfil microbiológico bucal por un perfil saludable, beneficiando así las condiciones de salud bucal.

No obstante, la capacidad singular de las cepas bacterianas de antagonizar patógenos bucales, no es suficiente para asegurar un efecto probiótico en la cavidad bucal. Las cepas de la composición de la invención son buenos probióticos bucales ya que, además de una fuerte capacidad antagonista, presentan una buena capacidad de colonizar la cavidad bucal. Como puede verse a continuación en el ejemplo 7 Lactobacillus plantarum CECT 7481 y Lactobacillus brevis CECT 7480 son capaces de crecer en presencia de lisozimas y peróxido de hidrógeno. Ventajosamente, estas cepas también tienen una buena capacidad de adherirse a tejidos bucales.

Además, las cepas de la invención tienen la ventaja de presentar una elevada capacidad de formar agregados. Esto es importante porque permite a las cepas inhibir o reducir la placa dental interfiriendo con la formación de película de patógenos . Se sabe que las cepas probióticas de bacterias acidolácticas con capacidad de agregación pueden inhibir o reducir la formación de placa dental por bacterias patógenas, la cual es el resultado de la agregación de bacterias patógenas entre ellas y también entre otros microorganismos. Como se ha mencionado antes, el película formado por patógenos bucales en tejidos duros y blandos se considera un agente etiológico importante en condiciones patológicas de la boca, lo que conlleva el inicio de la inflamación periodontal, formación de caries y halitosis. La formación de agregados por las bacterias de la invención se incrementa cuando ambas cepas se combinan en una composición, lo que significa que las bacterias son más efectivas desplazando bacterias patógenas cuando se combinan en un única fórmula.

Sorprendentemente, los inventores también encontraron que las cepas CECT 7481 y CECT 7480 presentan un perfil de acidificación particularmente bajo. Las especies de Lactobacillus, como la mayoría de bacterias acidolácticas , se caracterizan por una elevada producción de ácidos volátiles como resultado de la fermentación de azúcares de la dieta humana. No obstante, las propiedades acidogénicas de estas bacterias pueden ser un efecto secundario en la cavidad bucal, ya que aumenta el riesgo de caries. De hecho, muchos lactobacilos han sido considerados cariogénicos . En consecuencia, la reducida producción de ácidos mostrada por las cepas de Lactobacillus que constituyen la composición de la invención las hace particularmente adecuadas para aplicaciones de salud en la cavidad bucal.

Por encima de las propiedades beneficiosas comentadas previamente, las cepas de la invención tienen la ventaja de no producir o hacerlo en bajas cantidades muy bajas de compuestos malolientes, tales como compuestos volátiles de azufre, ácido valérico, ácido butírico y putrescina. Esto también es relevante cuando se aplica la composición de la invención en la cavidad bucal .

Adicionalmente, como corresponde a las cepas usadas como probióticos, las cepas que forman la invención pertenecen a especies bacterianas que tienen el estatus de "Presunción Calificada de Seguridad" (QPS, por sus siglas en. inglés) , como se define por la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA, por sus siglas en inglés) . Además, los inventores han encontrado que estas cepas no presentan ninguna resistencia significativa a antibióticos de importancia humana y/o veterinaria (ampicilina, gentamicina, estreptomicina, eritromicina, tetraciclina, clindamicina, y cloranfenicol) , descartando asi el riesgo de una potencial transferencia de resistencia a antibióticos a especies patógenas .

Teniendo en cuenta lo anterior, las cepas de la invención tienen un mejor rendimiento para todos los parámetros relevantes como probiótico bucal cuando se compara con cepas comerciales que son conocidas en el estado de la técnica como probióticos bucales . Como se muestra en los ejemplo a continuación, las nuevas cepas son más resistentes a las condiciones bucales, tienen una mayor capacidad de formar agregados, una mayor (y más amplia) actividad antagonista, una mejor adhesión y/o perfil de acidificación inferior que Streptococcus salivarus K12 y Lactobacillus reuteri ATTC 55730 y Lactobacillus brevis CD2. Los protocolos para determinar cada una de las propiedades de la invención se incluyen más abajo. Adicionalmente, la combinación de ambas cepas de la invención en una única composición resulta generalmente en un rendimiento cooperativo de las cepas en funcionalidades relevantes. En consecuencia, una composición que comprenda ambas cepas es particularmente apropiada para ser usada como un probiótico bucal .

Al ejercer varios efectos beneficiosos en el hospedador humano, la composición del primer aspecto de la invención es útil como medicamento. Particularmente, cuando se administra la composición que comprende Lactobacillus plantarum CECT 7481 and Lactobacillus brevis CECT 7480, es útil para la prevención y/o tratamiento de patologías de las cavidad bucal y, preferiblemente, para la prevención y/o el tratamiento de patologías causadas por patógenos de la cavidad bucal .

Todo parece indicar que los efectos beneficiosos de las cepas que forman la composición de la invención son el resultado de la mejora del perfil microbiológico de la cavidad bucal a favor de una flora bucal más saludable. El crecimiento en la cavidad bucal de estas bacterias beneficiosas induce una presión ambiental que inhibe el crecimiento de microorganismos patógenos comunes y/o oportunistas. Esta presión ambiental deriva de la competición por la adhesión a sitios y nutrientes, la producción de compuestos antimicrobianos y el desplazamiento de patógenos por la agregación de bacterias probióticas .

Otro aspecto a tener en cuenta es la capacidad de las bacterias probióticas de modular la respuesta inmune. Los mecanismos por los cuales los probióticos modulan la inmunidad han sido ampliamente estudiados en estructuras gastrointestinales. Las especies probióticas han mostrado su capacidad de alterar el balance de citoquinas pro- inflamatorias y antiinflamatorias secretadas por las células epiteliales. Los probióticos también regulan la respuesta inmune mejorando la inmunidad innata y modulando la inflamación producida por patógenos a través de vías de señalización reguladas por receptores de "tipo troll" . La mejora de la respuesta inmune local, así como las respuestas inmune sistémicas por probióticos pueden ofrecer nuevas oportunidades para los probióticos en la prevención de infecciones en las superficies de las mucosas periféricas, tales como los de la cavidad bucal .

En consecuencia, en un tercer aspecto, la invención proporciona una composición que comprende las cepas de la invención para su uso como medicamento.

En un cuarto aspecto, la invención proporciona una composición como se define en el primer aspecto de la invención para su uso en la prevención y/o tratamiento de un patología de la cavidad bucal causada por patógenos bucales en un animal, incluyendo un humano. Alternativamente, este aspecto puede ser formulado como el uso de una composición como se define en el primer aspecto de la invención para la fabricación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de una patología de la cavidad bucal causada por patógenos bucales en un animal, incluyendo un humano.

La invención también proporciona un método para la prevención y/o tratamiento de una patología de la cavidad bucal causada por patógenos bucales en un animal, incluyendo un humano, que comprende la administración a el animal que lo necesite de una composición como se define en el primer aspecto de la invención.

El término "patología de la cavidad bucal causada por patógenos bucales" es utilizado aquí en su más amplio significado como un trastorno o anormalidad que puede encontrarse en la cavidad bucal que ha sido causado por un patógeno bucal tales como bacterias, virus y levaduras. Tal patología puede ser una condición patológica seria así como una condición trivial o un malestar. De manera ilustrativa caries, gingivitis, periodontitis , candidiasis, herpes y úlceras, así como halitosis, manchas dentales, sensibilidad dental, entre otros son ejemplos no limitantes de "patologías de la cavidad bucal causadas por un patógeno bucal" .

En una modalidad del cuarto aspecto de la invención, la composición es usada para el tratamiento y/o la prevención de una patología relacionada con la placa dental. Preferiblemente, la patología relacionada con la placa dental se selecciona del grupo que consiste en caries, sensibilidad dental, gingivitis y periodontitis.

En otra modalidad del cuarto aspecto de la invención la composición se usa para el tratamiento y/o prevención de la halitosis.

En una modalidad adicional del cuarto aspecto de la invención la composición se utiliza para el tratamiento y/o la prevención de la candidiasis.

La composición de acuerdo con la invención que comprende las cepas de la invención puede ser formulada como un producto comestible, cosmético o farmacéutico. La composición puede comprender, además de las cepas de la invención, uno o más agentes activos adicionales y/o excipientes cosméticamente aceptables (en el caso de una composición cosmética) , excipientes farmacéuticamente aceptables (en el caso de una composición farmacéutica) o ingredientes comestibles adecuados (en el caso de una composición comestible) . En una modalidad particular de la invención, la composición de la invención comprende además uno o más agentes activos. Preferiblemente, el agente o los agentes activos adicionales son otras bacterias probióticas que no sean antagonistas a las cepas que forman la composición de la invención. Más preferiblemente, el agente o los agentes activos adicionales son adecuados para tratar y/o prevenir halitosis, caries, sensibilidad dental y/o enfermedades periodontales . Dependiendo de la formulación, las cepas pueden ser añadidas como bacterias purificadas, como un cultivo bacteriano, como parte de un cultivo bacteriano, como parte de un cultivo que ha sido post-tratado, y solas o en combinación con vehículos o ingredientes adecuados. También podrían añadirse prebióticos.

La composición puede estar en forma sólida, líquida o gaseosa y entre otros, en forma de polvos, comprimidos, preparaciones en forma de película, soluciones, aerosoles, granulados, pastillas, pildoras, suspensiones, emulsiones, cápsulas, jarabes, líquidos, elixires, extractos, tinturas o extractos fluidos o en una forma que sea particularmente adecuada para la administración oral.

En otros aspectos, la invención proporciona una composición farmacéutica que contiene la composición de la invención, junto con cantidades adecuadas de excipientes farmacéuticamente aceptables. A este respecto, el producto farmacéutico puede prepararse en cualquier forma adecuada que no afecte negativamente a la biodisponibilidad de las cepas que forman la composición de la invención. La selección de los excipientes y de los métodos más apropiados para la formulación a la vista del propósito particular de la composición está dentro del alcance de los expertos en la materia de la tecnología farmacéutica.

La expresión "farmacéuticamente aceptable", como se usa aquí, se refiere a compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que son, dentro del alcance del buen juicio médico, adecuados para su uso en contacto con los tejidos de un sujeto (humano o animal no humano) sin una toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación excesivos, en proporción a una relación beneficio/riesgo razonable. Cada vehículo, excipiente, etc. también debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación. Pueden encontrarse vehículos, excipientes, etc. adecuados en los textos farmacéuticos convencionales .

Otro aspecto de la invención proporciona una composición cosmética que contiene la composición de invención en combinación con excipientes cosméticamente aceptables. En la prevención y/o tratamiento de patologías bucales causadas por bacterias patológicas, la composición de la invención es útil para el alivio y/o prevención de los síntomas producidos por estas patologías. Los síntomas incluyen, pero no están limitados a, mal aliento y manchas dentales.

El término "cosméticamente aceptable" hace referencia a compuestos, materias, composiciones, y/o formas de dosificación que son, dentro del alcance del buen juicio médico, adecuados para ser usados en contacto con la piel humana sin toxicidad, incompatibilidad, inestabilidad o respuesta alérgica, entre otros. Cada vehículo, excipiente, etc. "cosméticamente aceptable" también debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con otros ingredientes de la formulación cosmética. Pueden encontrarse vehículos, excipientes, etc. adecuados para la formulación cosmética en los textos convencionales.

Las cepas de la invención también pueden incluirse en una diversidad de productos comestibles, tales como productos lácteos, un yogur, una cuajada, un queso (por ejemplo tipo quark, cremoso, procesado, blando y duro) , una leche fermentada, una leche en polvo, un producto fermentado a base de leche, un helado, un producto a base de cereal fermentado, un polvo a base de leche, una bebida, un aliño y un alimento para mascotas . El término "producto comestible" se usa aquí en su sentido más amplio, incluyendo cualquier tipo de producto en cualquier forma de presentación que puede ser ingerido por un animal, pero excluyendo productos cosméticos, farmacéuticos y veterinarios. Son ejemplos de otros productos comestibles los productos cárnicos (por ejemplo, paté de hígado, salchichas tipo frankfurt y embutidos de salami o pastas de carne) , pastas de chocolate, rellenos (por ejemplo, trufa, crema) y escarchados, chocolate, dulces (por ejemplo caramelo, glaseados, fondants o toffee) , productos horneados (tartas, pasteles) , salsas y sopas, zumos de frutas y blanqueadores de café. También se incluyen en el alcance de la invención forrajes para alimentación animal. Las composiciones de la invención también podrían usarse como ingrediente en otros productos alimenticios. Los alimentos funcionales y las fórmulas infantiles son productos comestibles particularmente interesantes.

Por consiguiente, en otro aspecto de la invención, se proporciona un producto comestible que contiene la composición de la invención junto con otros ingredientes comestibles .

El término "ingrediente comestible" hace referencia a ingredientes aptos para ser consumidos, por ejemplo como alimento por un animal, preferiblemente pero no de manera limitada a un humano, ganado o animales de compañía.

Habitualmente , las composiciones de bacterias probióticas como la descrita en la presente invención, son consideradas complementos alimenticios. Los complementos alimenticios, también conocidos como suplementos alimenticios o suplementos nutricionales , proporcionan ingredientes beneficiosos que no son habitualmente ingeridos en una dieta normal. Muchos complementos alimenticios son considerados productos para la alimentación, pero en ocasiones son definidos como fármacos, productos naturales saludables, o productos nutracéuticos . Los complementos alimenticios se venden habitualmente fuera del mercado regulado, es decir, sin prescripción. En una modalidad preferida la composición de la invención es un complemento alimenticio.

Si la composición de acuerdo con la invención se usa como complemento alimenticio, puede administrarse como tal, puede mezclarse con un líquido bebible, tal como agua, yogur, leche o zumo de frutas, o puede mezclarse con alimentos sólidos o líquidos. En este contexto, el complemento alimenticio puede estar en forma de comprimidos, pildoras, cápsulas, gránulos, polvos, suspensiones, sobres, pastillas, dulces, barritas, jarabes y formas de administración correspondientes, habitualmente en forma de una dosis unitaria. Preferentemente, la composición de la invención se administra en forma de comprimidos, pastillas, capsulas o polvos, fabricados en procedimientos convencionales de preparación de complementos alimenticios.

Como se puede deducir de lo anterior, los productos que comprendan la composición están destinados a su uso para aplicaciones de la salud bucal, bien para la prevención de patologías bucales, bien para el alivio de los síntomas derivados de estas patologías. Por consiguiente, otro aspecto de la presente invención proporciona un producto de cuidado bucal que comprende la composición como se menciona con anterioridad, conjuntamente con excipientes farmacéuticos, excipientes cosméticamente aceptables u otros ingredientes comestibles .

En el sentido de la presente invención, bien puede ser que la composición sea un producto bucal, que en su uso común no se traga intencionadamente para la administración sistemática de los agentes terapéuticos convencionales, sino que se retiene en la cavidad bucal durante un tiempo suficiente para estar sustancialmente en contacto con las superficies dentales y/o tejidos bucales para finalidades de actividad bucal. Ejemplos no limitantes de tales productos son pasta de dientes, dentífricos, polvos dentales, geles bucales tópicos, enjuagues bucales, productos para dentaduras postizas, esprays bucales, gomas de mascar, hilo dental y cintas dentales. La composición bucal puede ser una una composición bucal de una fase o puede ser una combinación de dos o más composiciones bucales.

En una modalidad, el producto de cuidado bucal es una goma de mascar, una pasta dentífrica o comprimidos de dispersión oral. Preferiblemente, los productos de higiene dental son pastillas o comprimidos de dispersión oral.

Los productos de cuidado bucal de la presente invención pueden también comprender otros agentes bucalmente activos, tales como blanqueadores dentales, incluyendo agentes oxidantes tales como peróxidos, perboratos, percarbonatos , peroxiácidos , persulfatos, cloritos metálicos, y sus combinaciones. Las sustancias modificadoras del color de los dientes también pueden considerarse como agentes activos para el cuidado bucal útiles en la presente invención. Los productos de cuidado bucal pueden adicionalmente comprender compuestos aromáticos como el mentol .

Las cepas que forman la composición de la invención están preferiblemente en forma de células viables. No obstante, las cepas de la invención también pueden estar en forma de células no viables tales como cultivos inactivados o composiciones que contengan factores beneficiosos producidos por Lactobacillus plantarum CECT 7481 y Lactobacillus brevis CECT 7480. Pueden incluirse microorganismos inactivados térmicamente o microorganismos inactivados por exposición a un pH alterado, sonicación, radiación o sometidos a presión. Con un producto de células no viables la preparación es más simple, las células pueden ser incorporadas fácilmente en un producto comercial y las condiciones de almacenamiento son mucho menos limitadas que con células viables.

Cuando se usan en la forma de la composición de la invención, las cepas pueden estar en cualquier relación de concentración adecuada para el uso deseado. Por ejemplo, las bacterias pueden estar en una relación de concentración que comprenda entre 3:1 y 1:3 {Lactobacillus plantarum CECT 7481 : Lactobacillus brevis CECT 7480) . Además, las cepas de la invención se incluyen en la composición en una cantidad eficaz para el uso requerido.

El término "cantidad eficaz" como se usa aquí es la cantidad de unidades formadoras de colonias (cfu, por sus siglas en inglés) para cada cepa en la composición que es suficientemente elevada para modificar significativamente de manera positiva la condición a tratar pero suficientemente baja para para evitar efectos secundarios serios (en una relación beneficio/riesgo razonable) , dentro del alcance del buen juicio médico. Una cantidad eficaz del microorganismo probiótico será determinada por un experto en la materia y variará dependiendo de la finalidad a conseguir, la edad y las condiciones físicas del paciente a ser tratado, la severidad de la patología implicada, y la formulación final. Por ejemplo, en productos de salud bucal, la cepa o cepas de la presente invención están presentes en una cantidad de entre 105 cfu/g a 1012 cfu/g aproximadamente, preferiblemente en una cantidad entre 107 cfu/g to 1011 cfu/g aproximadamente. El término "unidad formadora de colonias" ("cfu") se define como número de células bacterianas determinado por los recuentos microbiológicos en placas de agar. En una modalidad particular, la composición de la invención es un producto de cuidado bucal que comprende entre 107-1010 cfu/g.

Los complementos alimenticios contienen habitualmente cepas probióticas en una cantidad que oscila entre las 105 y las 1012 cfu/g. En una modalidad particular, la composición de la invención es un complemento alimenticio que comprende entre 107-1010 cfu/g.

Las cepas de la invención se producen por cultivo de las bacterias en un medio adecuado y en condiciones adecuadas. Las cepas pueden cultivarse en solitario para formar un cultivo puro, o como un cultivo mixto junto con otros microorganismos, o por cultivo de bacterias de diferentes tipos por separado y después combinando las mismas en las proporciones deseadas. Después del cultivo, la suspensión celular se recupera y se usa como tal o es tratada de la forma deseada, por ejemplo, por concentración o liofilización, para emplearse después en la preparación de productos farmacéuticos o comestibles. A veces la preparación probiótica está sujeta a un procedimiento de inmovilización o encapsulación para mejorar la vida útil. En el estado de la técnica se conocen varias técnicas para la inmovilización o encapsulación de bacterias. En una modalidad particular, las cepas que forman parte de una composición de la invención son incorporadas a un producto de cuidado bucal como bacteria encapsulada.

Como será evidente para un experto en la materia, el Lactobacillus plantarum CECT 7481 y el Lactobacillus brevis CECT 7480 son efectivos no solo cuando son combinados en una única composición, pero también cuando son usados por si solos, o en dos composiciones diferentes administradas simultáneamente, secuencialmente o de manera separada en un cierto periodo de tiempo. Además, el experto en la materia entenderá que una de las cepas puede ser prescrita para ser usada conjuntamente con otra cepa para la salud bucal para la prevención o el tratamiento de patologías bucales, particularmente patologías que son producidas por patógenos orales, más preferiblemente patologías relacionadas con la placa dental y/o la halitosis y/o la candidiasis.

En consecuencia, otro aspecto de la invención proporciona Lactobacillus plantarum CECT 7481.

Finalmente, otro aspecto de la invención proporciona Lactobacillus brevis CECT 7480.

Las cepas de la invención se describen aquí por primera vez y por lo tanto son nuevas. Como se muestra en la FIG 1, ambas cepas, Lactobacillus plantarum CECT 7481 y Lactobacillus brevis CECT 748.0, tienen diferentes patrones de electroforesis en gel de campo pulsante que cepas de lactobacilos comerciales estrechamente relacionadas, tales como Lactobacillus plantarum 299v, Lactobacillus plantarum VSL#3, Lactobacillus casei VSL#3 y Lactobacillus casei DN 114.001.

Algunos documentos del estado de la técnica describen composiciones que comprenden cepas de Lactobacillus plantarum y Lactobacillus brevis. No obstante, la composición de la invención es nueva con respecto a las composiciones .

En particular, KR100780030 describe una leche de soja fermentada que comprende cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum. Las cepas descritas se aislan del kimchi, una comida típica de Corea que consiste en vegetales fermentados. Por el contrario, las cepas de la invención fueron aisladas a partir de saliva de niños de una región en vías de desarrollo de Sudamérica, donde no se consume kimchi. Por lo tanto, las cepas de L. brevis y L. plantarum de la invención tienen un origen completamente diferente, lo que significa que ni Lactobacillus plantarum CECT 7481 ni Lactobacillus brevis CECT 7480 son las mismas que las cepas coreanas a las que se hace referencia.

Otra solicitud de patente coreana, KR100866504, describe un ginseng rojo fermentado con Lactobacillus plantarum P2 (número de depósito de microorganismo KCTC11391BP) y/o Lactobacillus brevis M2 (número de depósito de microorganismo KCTC11390BP) . Estas cepas se aislan del ginseng. De nuevo, las cepas coreanas descritas tienen un origen completamente diferente que las cepas de la invención, ya que fueron aisladas de una planta que no se consume en regiones en vías de desarrollo de Sudamérica. Esto hace imposible que Lactobacillus plantarum CECT 7481 o Lactobacillus brevis CECT 7480 sean las mismas que las cepas coreanas a las que se hace referencia.

Las solicitudes internacionales de patente WO2005/082157 y WO02/39825, describen nuevamente combinaciones de cepas de L. plantarum y L. jbrevis. La cepa L. brevis LBR01 descrita en la composición de O2005/082157 fue aislada de pepinillos encurtidos en mostaza de Taiwan. El L. brevis C21 descrito en las composiciones de WO 02/39825 se aisló de un tofu de Mongolia. Al igual que antes, de acuerdo al origen completamente diferente de estas cepas de L. brevis es imposible que sean la misma cepa que la de la presente invención. Además, las cepas L. brevis LBR01 y L. brevis C21 descritas no parecen estar accesibles al público.

Adicionalmente, WO 2006/080035 describe una composición ginecológica que contiene Lactobacillus brevis CD2 y una cepa de Lactobacillus plantaru no especificada, junto con una cepa de L. salivarius. No obstante, la cepa L. brevis CD2 es diferente del Lactobacillus brevis CECT 7480. Como se muestra en la TABLA 4, cuando se combina la cepa Lactobacillus plantarum CECT 7481 con L. brevis CD2 se observa un efecto antagonista con respecto a la capacidad de formar agregados. Por el contrario la combinación de Lactobacillus plantarum CECT con Lactobacillus brevis CECT 7480 conlleva una mayor capacidad de formar agregados. Adicionalmente, se ha demostrado que la cepa L. brevis de la invención tiene un perfil de acidificación significativamente más bajo en comparación con la cepa comercial L. brevis CD2 (ver TABLA 5) . Por lo tanto, Lactobacillus brevis CECT 7480 no solo es diferente a L. brevis CD2 , sino que támbién son más adecuadas para aplicaciones de salud bucal. En conjunto, teniendo efectos diferentes, la combinación de la invención es diferente a la descrita en WO 2006/080035.

Finalmente, WO 02/018542 menciona que las cepas de Lactobacillus encontradas frecuentemente en el queso cheddar incluyen L. brevis and L. plantarum y la solicitud de patente FR2448865 (página 10, lineas 11-17) describe una composición que contiene L. plantarum a la cual puede añadirse L. brevis. No obstante, estos documentos no describen una composición que contenga una cepa de L. brevis específica y una cepa de L. plantarum específica. Por lo tanto, la composición de la invención que comprende una cepa de L. brevis específica, es decir Lactobacillus brevis CECT 7480, y una cepa de L. plantarum específica, es decir Lactobacillus plantarum CECT 7481, es nueva.

A lo largo de la descripción y reivindicaciones, la palabra "comprende" y sus variaciones no pretenden excluir otras características, aditivos, componentes o etapas técnicas. Objetos, ventajas y características adicionales de la invención se harán evidentes para los expertos en la materia tras el examen de la descripción o pueden aprenderse mediante la práctica de la invención. Además, la presente invención abarca todas las combinaciones posibles de modalidades particulares y preferidas descritas en la presente invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo ilustrativo, y sin intención de estar limitados a la presente invención.

Breve Descripción de las Figuras FIGS. 1A-1D. Patrones de electroforesis de campo pulsante de ADN genómico digerido con Sfi-I (A, B) y Sma-I (C, D) de: 1, Lactobacillus plantarum CECT 7481 (F2096) ; 2, Lactobacillus plantarum 299V; 3, Lactoiiacillus plantarum VSL#3; 4, Lactobacillus brevis CECT 7480 (13141); 5, Lactobacillus casei VSL#3; 6, Lactobacillus casei DN 114.001. M es usado como marcador molecular.

Descripción Detallada de la Invención EJEMPLOS Las siguientes secciones describen la caracterización de las cepas de la invención y sus características probióticas específicas en relación a aplicaciones de salud bucal . 1. Aislamiento de microorganismos Las nuevas cepas F2096 y 12141 se aislaron de la saliva de niños de 0-5 años de una región tropical en vías de desarrollo de Sudamérica. La saliva se disolvió en tampón PBS (pH 7,4), se alicuotó y sembró en agar MRS (Man Rogosa Sharp, Sigma-Aldrich Chem, Spain) suplementado con 10 pg/ml de vancomicina (SIGMA) . Las cepas se cultivaron en condiciones microaerófilicas (5% C02) a 37 °C. Una vez crecidas, las cepas se guardaron por liofilización en PBS 0. IX con un 15% de polvo de leche desnatada.

Las cepas F2096 y 13141 fueron identificadas como Lactobacillus plantarum y Lactobacillus brevis, respectivamente (ver sección 2 a continuación) . Ambas cepas fueron depositadas en la Colección Española de Cultivos. Tipo (Universidad de Valencia, Campus de Burjassot, Edif. de Investigación, 46100 Burjassot, Valencia, España) . Se depositó el Lactobacillus plantarum (cepa F2096) el 21.01.2009 con número de acceso 7481. Se depositó el Lactobacillus brevis (cepa 13141) el 18.02.2009 con un número acceso 7480. Las dos cepas depositadas son viables y mantienen todas las características relativas a su depósito.

De aquí en adelante, la cepa F2096 corresponde a Lactobacillus plantarum CETC 7481 y la cepa 13141 a Lactobacillus brevis CECT 7480.

Pediococcus acidilactici F2019 (en adelante denominada P. acidilactici) , Lactobacillus paracasei 13152 (en adelante denominada L. paracasei) y Pediococcus pentosaceus 154 (en adelante denominada P. pentosaceus) fueron aisladas de la saliva como se ha explicado anteriormente. El Streptococcus salivarius K12 fue aislado a partir del producto comercial BLIS ?12F en TBS (caldo de soja con tripticasa) y cultivado en condiciones aeróbicas a 37 °C. El Lactobacillus reuteri ATCC 55730 se aisló del producto comercial Reuteri Drops", Lactobacillus plantarum_299v de Poviva18, Lactobacillus brevis CD2 de Inersan", Lactobacillus plantarum VSL#3 y Lactobacillus casei VSL#3 de VSL#3'S, y Lactobacillus casei DN 114.001 de Actimel*. Todas estas últimas cepas se aislaron en MRS, y se cultivaron a 37 °C con un 5% de C02. Las cepas potencialmente patógenas Porphyromonas gingivalis CIP 103683, Fusobacterium nucleatum CIP 104988, Treponema denticola CIP 103917 y Prevotella denticola CIP 104478T se obtuvieron del Instituto Pasteur, y se cultivaron de acuerdo a las instrucciones del proveedor. El Streptococcus mutans de origen clínico se cultivó en Agar Corazón-Cerebro a 37 °C y 5% de C02. La identificación de las cepas se realizó por secuenciación. 2. Caracterización taxonómica de las cepas 2.1. Identificación genética de género y especie.

A) Métodos Las cepas de la invención se cultivaron durante la noche en medio MRS (pH 6,4) a 37 °C en una atmósfera que contenía un 5% de C02. Las bacterias se recuperaron, se lavaron y resuspendieron en tampón de pre-lisis (480 µ? de EDTA 50 mM pH 8.0; 120 µ? de lisozima 10 mg/ml) , y fueron posteriormente incubadas a 37 °C durante 60 minutos. El ADN se extrajo usando un kit de purificación genómica Wizard (Promega) . Tras la centrifugación de las bacterias pre-tratadas a 14000 g durante 2 minutos para eliminar el sobrenadante, se siguió el protocolo de Promega. Brevemente, las bacterias fueron resuspendidas en Solución de Lisis Nucleica y se incubaron a 80 °C durante 5 minutos, después se enfriaron a temperatura ambiente. Los lisados celulares se incubaron en una solución de RNasa a 37° C durante 60 minutos y las proteínas se precipitaron añadiendo Solución de Precipitación Protéica y vorteando a alta velocidad. Las muestras se enfriaron y centrifugaron a 15000 g durante 3 minutos . Los sobrenadantes que contenían el ADN se transfirieron a tubos de microcentrífuga de 1,5 mi limpios y se mezclaron por inversión con 600 µ? de isopropanol. El ADN se recuperó por centrifugación a 15000 g durante 2 minutos y vertiendo cuidadosamente el sobrenadante. Las muestras de ADN se lavaron con 600 µ? de etanol 70% invirtiendo suavemente el tubo varias veces. El etanol se eliminó por aspiración, después de centrifugar a 15000 g durante 2 minutos. Finalmente, la pelotilla de ADN se resuspendió en 100 µ? de Solución de Rehidratación incubando a 65 °C durante lh. Las muestras se almacenaron a 2-8 °C.

El 16S ARNr fue amplificado por PCR usando los cebadores universales Eub27f y Eubl492R, que producen un fragmento cercano a la secuencia completa de 16S (más de 1000 nucleótidos) (TABLA 1) . Después, el ADN obtenido de esta manera se lavó usando el kit Quiaquick (Quiagene) .

Para cada muestra se realizaron cuatro reacciones consecutivas de secuenciación en un Genetic Analyzer 3130 (Applied Biosystems) utilizando un kit BigDye v.3.1, utilizando los cebadores que se muestran en la TABLA l. La recogida de datos y cromatogramas se realizó utilizando el software DNA Sequence Analysis v.5.2. (Applied Biosystems) y se revisó por análisis visual con Chromas (Technelysium Pty Ltd.) y BioEdit (Ibis Biosciences) .

La identificación del género se realizó mediante la herramienta Ribosomal Datábase Project ( ang Q, et al., "Naive Bayesian Classifier for Rapid Assignment of rR A Sequences into the New Bacterial Taxonomy" , Appl Environ Microbiol, 2007, vol . 73, p. 5261-5267) . La identificación de la especie se realizó por comparación de la secuencia obtenida con secuencias 16S de organismos conocidos a partir de las bases de datos RefSeq (htt : //www. ncbi . nlm. nih. gov/RefSeq/) mediante un BLASTN, y del Ribosomal Datábase Project (http://rdp.cme.msu.edu/, J.R. Colé et al^_, "The Ribosomal Datábase Project (RDP-II) : introducing myRDP space and quality controlled public data", Nucí. Acids Res.j_ 2007, vol. 35, p. 169-172) .

TABLA 1. Cebadores usados para la amplificación y secuenciación del gen 16S Etapa Cebador Orientación Secuencia 5' -» 3 ' Eub27f directa GAGTTTGATCCTGGCTCAG (SEQ ID NO: 1) Amplifi¬ Eubl492r inversa TACGGYTACCTTGTTACGACTT cación (SEQ ID NO: 2) 27f directa AGAGTTTGATCCTGGCTCAG (SEQ ID NO; : 3) 357f directa CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCC SecuenGCCCCCGCCCCCCTACGGGAGGCAGCAG ciación (SEQ ID NO: 4) 907r inversa CCGTCAATTCCTTTGAGTTT (SEQ ID NO: : 5) 1492r inversa GGTTACCTTGTTACGACTT (SEQ ID NO: 6) B) Resultados La herramienta RDP (Ribosimal Dat base Project) identificó la cepa F2096 como perteneciente a la especie Lactobacillus plantarum y la cepa 13141 perteneciente a la especie Lactobacillus plantarum. 2.2. Genotipado de las cepas A) Métodos La caracterización se realizó por digestión genómica y electroforesis de campo pulsante. Las cepas F2096 y 13141 fueron sometidas a un protocolo descrito previamente (Rodas AM, et al. "Polyphasic study of wine Lactobacillus strains: taxonomic implications " , Int J Syst Evol Microbiol, 2005, vol. 55, p. 197-207). Las cepas comerciales Lactobacillus plantarum 299V, Lactobacillus plantarum VSL#3 , Lactobacillus casei VSL#3 y Lactobacillus casei DN 114.001 también fueron incluidas en el ensayo como cepas control. Todas las cepas fueron cultivadas en placas de agar MRS e incubadas a 37 °C, 5% de C02 durante 18h. Las células fueron recuperadas y lavadas 3 veces en 8 mi de PET (Tris 10 mM pH 7,6, NaCl 1 M) , y posteriormente centrifugadas 10 min a 6000 rpm. Las pelotillas fueron resuspendidos en 700 µL de tampón de lisis (Tris 6 mM, NaCl 1 M, EDTA 0,1 M, SLS 0,5%, ácido deoxicólico 0,2 %; 1 mg/ml de lisozima; 40 U/ml de mutanolisina; 20 (g/ml RNasa) . A las células resuspendidas se añadió un volumen igual de agarosa de bajo punto de fusión al 1,6% (FMC BioProducts, Rockland, ME, USA) y se permitió la solidificación a 4 °C durante lh. Los insertos fueron transferidos a 2 mi de tampón de lisis II (EDTA 0,5 M pH 9,2, 1% N-lauril sarcosina y 1 mg/ml pronasa) e incubados a 50 °C durante 48 h. A continuación se lavaron los insertos a temperatura ambiente con tampón TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM pH 8,0) . La digestión total del ADN se realizó mediante enzimas de restricción Sfi-I y Sma-I (Roche Diagnostics) .

La electroforesis de campo pulsante se realizó utilizando un kit CHEFF DRIII (BioRad Laboratories) . Los insertos se cargaron en un gel de agarosa al 1% (SeaKem ME agarose, FMC BioProducts, ME, USA) . La TABLA 2 describe las condiciones de electroforesis para cada enzima. Los marcadores de peso molecular de ADN fueron Lambda ladder PFG Marker y Low Range PFG Marker (New England Biolabs) . Después de la electroforesis , las cepas fueron marcadas con bromuro de etidio y usando luz UV GelDoc System (BioRad) .

TABLA 2. Condiciones de electroforesis para del ADN genómico de las cepas F2096 y 13141 hidrolizado con Sfi-I y Enzima Bloque Pulso Inicial Pulso final Tiempo (seg) (seg) (horas) Sfi-I 1 2 10 10 2 15 25 6 Sma-I 1 0,5 5 16 B) Resultados Como se muestra en la FIG. 1, los patrones de hidrólisis con Sfi-I y Sma-I por electroforesis de campo pulsante para la cepa F2096 fueron diferentes de los de las cepas comerciales Lactobacillus plantarum 299v y Lactobacillus plantarum VSL#3, mientras que los patrones de hidrólisis de 13141 fueron diferentes de la cepas comerciales estrechamente relacionadas de Lactobacillus casei. Por lo tanto, se puede concluir que las cepas F2096 y 13141 son nuevas . 3. Capacidad de antagonizar patógenos A) Métodos Con la finalidad de evaluar si las cepas F2096 y 13141 presentan capacidad antagonista, se siguió el protocolo de Campbell utilizando placas de agar sembradas con bacterias patógenas en medio Oxoid. Los patógenos utilizados para el estudio fueron seleccionados entre los comúnmente presentes en la cavidad bucal humana (ver TABLA 1) . Resumidamente, F2096, 13141 y P. acidilactici , otra bacteria aislada de la saliva humana, fueron cultivadas durante la noche, cada una en las condiciones específicas comentadas con anterioridad. Tras la incubación, los cultivos se estandarizaron a 108 cfu/ml y se prepararon los siguientes cultivos combinados: F2096 + 13141, F2096 + P. acidilactici, y 13141 + P. acidilactici. Los cultivos combinados contenían una misma cantidad de cada una de las cepas que lo constituían y la misma concentración de bacterias total que los cultivos de las cepas por separado, por ejemplo 108 cfu/ml. Un volumen fijo de cada cultivo de las cepas por separado y los cultivos combinados se sembraron uniformemente y cultivaron hasta la confluencia a temperaturas apropiadas en una incubadora con un 5% de C02. Después, las secciones de cilindros de tamaño uniforme de las placas de agar confluyentes se situaron cara a cara sobre las placas de patógenos y se incubaron durante la noche a 37 °C.

Al día siguiente, se midieron las zonas de inhibición situando las placas de agar sobre una regla plana. Las propiedades antagonistas de las cepas se midieron como la actividad inhibitoria del crecimiento (GIA, por sus siglas en inglés) , que se calculó sustrayendo el diámetro del cilindro (CD, por sus siglas en inglés) del diámetro de la zona de inhibición (IZD, por sus siglas en inglés) y dividiendo esta diferencia entre dos siguiendo la fórmula GIA= (IZD-CD) / 2. Las capacidades inhibitorias de las cepas de esta invención fueron comparadas con las cepas probióticas bucales comerciales Streptococcus salivarius K12 y Lactobacillus reuteri ATCC 55730.

B) Resultados Las actividades inhibitorias del crecimiento de las cepas F2096 e 13141 se muestran en la TABLA 3. Los resultados son el promedio de experimentos realizados por triplicado .

TABLA 3. Actividad inhibitoria del crecimiento contra patógenos bucales P.

F. nucleatum T. denticola P. denticola S. mutans F I gingivalis 2096 3141 F2096 1 4 4,5 NI 2 NI 13141 NI 7 1 0,5 2 NI - F2096 + 1,5 9 4,5 1 4 - 13141 F2096 + 0,5 1 4 NI 1· - P . aci di -lact i ci 13141+ NI 5 0,5 NI NI - P . acidi -l act i ci S . NI NI 1 0.5 1 -sal ivari us L . reu teri NI 0,5 NI 0, 75 1 - NI, no inhibición Como puede observarse en estos resultados, F2096 y 13141 tienen un amplio patrón de inhibición contra patógenos bucales. Esto es especialmente relevante para P. gingivalis, dado que un estudio preliminar mostró que la actividad antagonista contra patógenos es poco común (resultados no mostrados) . Además, cabe mencionar que la combinación de F2096 y 13141 en un cultivo combinado presenta una actividad antagonista superior contra patógenos bucales en comparación con la actividad de las bacterias usadas por separado como cultivos individuales -cabe destacar que la concentración de cada cepa en los cultivos combinados es la mitad que la usada en los cultivos individuales, en consecuencia la actividad efecto antagonista en combinación es superior a la suma del efecto individual de estas cepas-. Este efecto sinérgico no tiene lugar cuando cada cepa es combinada con otra cepa colonizadora de la cavidad bucal, P. acidilactici . Por lo tanto, las cepas de la invención muestran actividad sinérgica contra patógenos bucales y son especialmente útiles cuando se utilizan en una misma fórmula.

Cuando se comparan los probióticos comerciales Streptococcus salivarius K12 y Lactobacillus reuteri ATCC 55730, las cepas de la invención tienen una capacidad antagonista significativamente superior. Finalmente, F2096 e 13141 presentaron un antagonismo mínimo entre ellas o cepas comensales comunes de la flora bucal humana. 4. Formación de agregados A) Métodos La capacidad de formar agregados fue evaluada monitorizando la disminución de la densidad óptica a 620 nm de cultivos durante la noche debido a la formación de agregados y precipitación. El valor de la capacidad agregatoria porcentual (%AC) se obtuvo usando la siguiente fórmula: %AC= (1- (ODtf/ODt0) /100 , donde ODtf y ODt0 son las densidades ópticas a tiempo final e inicial, respectivamente. La OD a tiempo inicial se ajustó de manera que todos los cultivos contenían un número equivalente de cfu/ml . Los cultivos combinados se prepararon mezclando una cantidad apropiada de las cepas individuales para obtener las cfu/ml totales deseadas que contuviesen un 50% de cada cepa.

B) Resultados La capacidad de formar agregados es importante para cepas probioticas con aplicaciones para la salud bucal porque permite que las bacterias inhiban o reduzcan la placa dental interfiriendo con la formación de película de patógenos.

Los valores promedio de la capacidad agregatoria para las nuevas cepas y su combinación entre ellas o con P. acidilactici o L. brevis CD2 en comparación a las cepas control se muestran en la TABLA 4. Los resultados demuestran claramente que las nuevas cepas aisladas mostraron una capacidad de agregación muy buena, significativamente superior que los controles comerciales S. salivarius K12 y L. reuteri ATTC 55730. Además, la formación de agregados por las cepas de la invención incrementa cuando las dos cepas se combinan en un cultivo mixto, lo que significa que las bacterias son más efectivas desplazando las bacterias patógenas cuando se combinan en una única composición. Sin embargo, esta cooperación no es presente cuando las cepas de la invención son combinadas por separado con otras cepas con una buena capacidad de agregación, tales como P. acidilactici y L. brevis CD2. Adicionalmente , cuando se combinan las cepas de la invención con L. j revis CD2, se observa un efecto antagonista, lo que significa que las cepas de la invención son menos efectivas desplazando bacterias patógenas cuando se combinan con L. hrevis CD2.

TABLA 4. Capacidad de agregación (%) Cepa Capacidad de agregación F2096 56, 00 13141 22, 73 F2096 + 13141 64, 73 F2096 + P. acidilactici 55, 50 13141 + P. acidilactici 23,30 L. brevis CD2 24, 70 F2096 + L. brevis CD2 36,31 13141 + L. brevis CD2 28, 50 S. salivarius 16, 67 L. reuteri 0,00 5. Producción de ácido A) Métodos Se evaluó la capacidad de las nuevas cepas para producir ácido cuando son cultivadas en medio de cultivo suplementado con diferentes azúcares presentes en la dieta humana. Las cepas se cultivaron 18 h a 37 °C y un 5% de C02 en el siguiente medio: MRS y medio mínimo suplementado con un 4% de glucosa, 4% de fructosa, 4% de lactosa o 4% de sacarosa. El medio mínimo contenía 2 g/L de agua peptonada, 2 g/L de extracto de levadura, 0,1 g/L de NaCl, 0,04 g/L de K2HP04, 0,04 g/L de KH2P04, 0,01 g/L de MgS04*7H20, 0,01 g/L de CaCl2*6H20, 2 g/L de NaHC03, 0,05 g/L de hemina (disuelta en unas pocas gotas de NaOH lmol/L) , 0,5 g/L de cisteína HC1, 0,5 g/L de sales biliares, 2 g/L de T een 80, y 10 µ? de vitamina Kl (todos los componentes se obtuvieron en Sigma-Aldrich Chera, España) . Se ajustaron los cultivos a pH 7 con HCl . El pH y el número de células viables (cfu/ml) se determinó al final del tiempo de incubación. El valor de producción de ácido para cada medio de cultivo se obtuvo mediante la siguiente fórmula: valor PA= pH * log (cfu/ml) B) Resultados De acuerdo con la fórmula representada previamente, los valores bajos corresponden a bacterias altamente acidogénicas . Una producción elevada de ácido es un efecto secundario indeseado para los probióticos bucales, ya que promueve la formación de caries. El valor de producción de ácido para F2096 y 13141 y varias cepas control de probióticos cultivadas con diferentes azúcares puede observarse en la TABLA 5, junto con los valores obtenidos para cepas comerciales. MM indica medio mínimo.

TABLA 5. Producción de ácido Cepa MRS MM+Gluc MM+Fruc MM+Lac MM+Sac F2096 32, 7 30, 34 28, 56 31,45 31,67 13141 42, 04 48,28 45, 24 58,24 59, 12 L. brevis CD2 26,45 31, 24 24, 24 21,45 24, 20 S. sa.liva.rius 41,37 29,69 31,31 28, 03 29,85 L. reuteri 36, 75 49, 19 45,67 34, 01 57,39 L. paracasei 27,38 19, 53 8,21 5, 98 20, 52 P. pentosaceus 24, 7 11, 34 13,23 12,56 17,45 P. acidilactici 22, 6 15, 61 11, 10 16, 45 22, 14 Los resultados demuestran que el crecimiento de las cepas F2096 y 13141 en diferentes azúcares conlleva una producción de ácido remarcablemente pobre en comparación con otras cepas bacterianas que han sido aisladas de la cavidad bucal, como L. paracasei, P. pentosaceus y P. acidilactici . Las cepas de la invención son también menos acidogénicas que las cepas probióticas bucales comerciales S. salivarius K12. Adicionalmente , la cepa 13141 tiene un perfil de acidificación inferior en comparación a L. reuteri ATTC 55730, el cual es conocido por ser un particularmente poco acidogénico y se comercializa como un probiótico anti-cariogénico. También vale la pena destacar que la cepa de L. brevis 13141 de la invención tiene un perfil de acidificación significativamente inferior en comparación a L. brevis CD2. En consecuencia, las cepas F2096 y 13141 tienen un perfil de acidificación bajo, siendo por lo tanto especialmente adecuadas para aplicaciones de salud bucal. 6. Producción de compuestos volátiles malolientes A) Métodos La producción de compuestos volátiles malolientes por parte de las nuevas cepas se determinó por medio de una evaluación sensorial cuando se cultivaron en un medio parecido a la dieta humana. Resumidamente, las cepas se cultivaron en un medio que contenía glucosa (0,5% p/v) , fructosa (0,5% p/v), extracto de levadura (1% p/v), extracto de carne (1% p/v) , células eucariotas (200 células/ml) y pectina (0,5% p/v) durante 48h a 37°C y un 5% de C02. Se asignó un valor de producción de mal olor a las cepas entre 1 y 5, donde 1 es ausencia de mal olor y 5 olor muy desagradable .

B) Resultados La producción de compuestos de malolientes es muy indeseable para un probiótico bucal. Sin embargo, las cepas de la invención no produjeron ningún olor desagradable cuando se cultivaron en un medio de cultivo parecido a la dieta humana .

TABLA 6. Producción de olores desagradables Cepa Valor de mal olor F2096 2 13141 2 3. 2 salivarius L. reuteri 3 7. Supervivencia en condiciones bucales A) Métodos La supervivencia de las cepas en la cavidad bucal se estudió sometiéndolas a condiciones de estrés bucal. 5*107 cfu de cada cepa bacteriana se inoculó en placas de cultivo de 96 pocilios en 200 µ? de medio MRS , en el caso de F2096, 13141 y L. reuteri ATCC 55730, o Caldo de Soja Tríptico (TSB, Oxoid) en el caso de S. salivarius K12. Los cultivos se suplementaron con concentraciones fisiológicas de lisozima (Sigma-Aldrich Chem, España) o peróxido de hidrógeno peróxido (Sigma-Aldrich Chem, España) . Las placas fueron incubadas a 37°C y un 5% de C0 durante seis horas.

El crecimiento bacteriano fue cuantificado midiendo la densidad óptica a 620 nm. El valor de crecimiento bacteriano se obtuvo por comparación con el crecimiento conseguido por la misma cepa en medio MRS estándar sin suplementar .

B) Resultados El valor de supervivencia global porcentual (% SV) se calculó como sigue: % SV = [ (ODtf-ODt0 (sin suplemento)) / (ODtf-ODto (sin suplemento)).]* 100, donde OD es la densidad óptica, y tf y tO son el tiempo final y el tiempo inicial, respectivamente. Los siguientes valores son el promedio de los resultados por triplicado: TABLA 7. Supervivencia a las condiciones bucales MRS/TSB MRS/TSB MRS/TSB Cepa Lisozima 2xl05 U/ml H202 lmM H202 2 , 5mM F2096 44,41 98,78 62,60 13141 0, 58 42,06 84,28 S. salivarius 0,50 18,89 28,78 L. reuteri -17,46 31,32 -8,03 Las nuevas cepas F2096 y 13141 mostraron una resistencia al estrés bucal mejor que las cepas comerciales S. salivarius K12 y L. reuteri ATCC 55730. 8. Capacidad de adherencia a los tejidos bucales A) Métodos Se realizó un ensayo de adhesión in vitro de F2096, 13141 y cepas control comerciales a lengua de cerdo, células Caco-2 (para simular la encía) y perlas de hidroxiapatita (HA) (para simular los dientes) . Cada cepa fue incubada overnight con ??µ?/ml 5- [3H] timidina (1,0 Ci/ml, Amersham Biosciences, Reino Unido) . Las preparaciones fueron centrifugadas y las pelotillas se resuspendieron en tampón PBS a una concentración de 108 cfu/ml. La señales de tritio incorporado a los microorganismos se calcula a partir de la señal inicial de tritio y la señal del sobrenadante en un lector de centelleo (Wallac 1410) . El ratio entre este número (señal incorporada a la biomasa) y el número total de microorganismos en los cultivos resulta en cpm/cfu (señal/bacteria) .

La determinación de la adhesión se realizó mediante la adición de 3,3 mi de 108 cfu de cada cepa marcada radioactivamente a fragmentos de 1.05*0,5 cm de lengua de cerdo o células Caco-2 pre-incubadas o 50 mg de perlas HA (80 \xm de diámetro) en placas ELISA. Después de 45 minutos, los sobrenadantes se eliminaron cuidadosamente. Las perlas HA (junto con las células adheridas) se recuperaron por centrifugación. La lengua o las células Caco-2 junto con las bacterias adheridas se separaron de los pocilios ELISA rascando. Finalmente, se lisaron las bacterias recuperadas para calcular la radioactividad específica (cpm/cfu).

Todos los ensayos se realizaron por triplicado y los resultados se expresaron como número de bacterias adheridas por cm2. Dado que S. salivarLus presentó mejores resultados para la mayoría de las propiedades investigadas (ver resultados anteriores) , esta cepa fue utilizada como cepa control para el ensayo de adhesión.

B) Resultados TABLA 8. Adhesión a tejidos bucales Cepa Lengua Caco-2 Perlas HA (cfu/cm2) (cfu/cm2) (cfu/cm2) F2096 8,84E+06 l,00E+06 2,30E+06 13141 2,70E+06 3,78E+04 5,51E+05 S. l,72E+06 8,83E+04 2,34E+05 salivarius Estos resultados demuestran que las cepas F2096 y 13141 tienen una mejor capacidad de adhesión a tejidos en comparación con la cepa probiótica bucal S. salivarius K12. La capacidad de adherirse a los tejidos bucales es una característica relevante para las cepas para ser usadas como probióticos dado que proporciona a estas bacterias una ventaja competitiva cuando compiten por sitios de adhesión contra patógenos y favorece la permanencia en la cavidad bucal. Como resultado, las cepas que presentan una buena adhesión a los tejidos bucales contribuyen a desplazar los patógenos de la cavidad bucal y promueven una flora bucal más saludable. 9. Susceptibilidad a antibióticos A) Métodos La susceptibilidad de las cepas F2096 e 12141 se estudió siguiendo la guía técnica proporcionada por la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) ("Update of the criteria used in the assessment of bacterial resistance to antibiotics of human or veterinary importance" . The EFSA Journal, 2008, vol . 732, p. 1-15). Las condiciones de cultivo de las cepas fueron las siguientes: crecimiento en la superficie de placas de agar MRS conteniendo las concentraciones de antibióticos recomendadas por la EFSA a 37 °C y 5% C02.

B) Resultados El crecimiento de las cepas probióticas se presenta en la TABLA 9. Las concentraciones para cada antibiótico a ser ensayado en base a las recomendaciones de la EFSA se proporcionan en mg/ml . La EFSA no especifica unos valores indicados de concentraciones de antibióticos para la especie L. brevis, por lo tanto, la resistencia a antibióticos en la cepa 13141 de L. brevis se ensayó usando las concentraciones recomendadas para lactobacilos heterofermentativos estrictos grupo al cual pertenece la especie.

Los resultados indican que F2096 e 12141 no presentan resistencia a antibióticos. Son por lo tanto adecuadas para el consumo humano.

TABLA 9. Resistencia a antibióticos de las cepas F2096 y 13141.

ConcenCrecimie Concentración Crecimiento tración nto de EFSA para de EFSA para F2096 lacobacillos 13141 L. heterofermentativ plantarum os estrictos Ampicilina 2 ninguno 2 ninguno Gentamicina 16 ninguno 16 ninguno Kanamicina 64 ninguno 16 ninguno Estreptomicina n . r . ninguno 64 ninguno Eritromicina 1 ninguno 1 ninguno Clindamicina 1 ninguno 1 ninguno Quinuspristina 4 ninguno 4 ninguno /Dalfopristina Tetraciclina 32 ninguno 8 ninguno Cloramfenicol 8 ninguno 4 ninguno n.r., no recomendado por la EFSA REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Twetman S, et al. "Short-term effect of chewing containing probiotic Lactobacillus reuteri on the levéis of inflammatory mediators in gingival crevicular fluid" . Acta Odontol Scand, 2009, vol . 67, p. 19-24.

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Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (16)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. La composición caracterizada porque comprende Lactobacillus plantarum CECT 7481 y Lactobacillus brevis CECT 7480.

2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, para usarse como probiótico.

3. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, para usarse como medicamento.

4. Composición de conformidad con las reivindicaciones 1-3, para usarse en la prevención y/o tratamiento de una patología de la cavidad bucal causada por patógenos bucales en un animal, incluyendo un humano.

5. Composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la patologxa de la cavidad bucal es una patología relacionada con la placa dental.

6. Composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la patología de la placa dental se selecciona del grupo que consiste en gingivitis, periodontitis , caries y sensibilidad dental.

7. Composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la patología de la cavidad bucal es la halitosis .

8. Composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la patología de la cavidad bucal es la candidiasis .

9. Composición farmacéutica caracterizada porque comprende la composición de conformidad con la reivindicación 1, junto con excipientes f rmacéuticamente aceptables.

10. Composición comestible caracterizada porque comprende la composición de conformidad con la reivindicación 1, junto con otros ingredientes comestibles.

11. Composición comestible de conformidad con la reivindicación 10 o una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque es un complemento alimenticio.

12. Composición cosmética caracterizada porque comprende la composición de conformidad con la reivindicación 1, junto con excipientes cosméticamente aceptables.

13. Producto de cuidado bucal caracterizado porque comprende una cantidad eficaz de la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 9 o del producto comestible de conformidad con la reivindicación 10 o de la composición cosmética de conformidad con la reivindicación 12.

14. Producto de cuidado bucal de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque es una goma de mascar, una pasta de dientes, un espray bucal, una pastilla o una tableta oral dispersable.

15. Lactobacillus plantarum CECT 7481.

16. Lactobacillus brevis CECT 7480.