ES2973007A1

ES2973007A1 - Probiotico oral

Info

Publication number: ES2973007A1
Application number: ES202430023A
Authority: ES
Inventors: Obrador Alejandro Mira; Planell Ana Adrados; Dieguez Miguel Carda; Miralles Manuel Porcar; Serrador Cristina Vilanova; Martinez Francisco Javier Pascual; Valero Helena Amalia Gimeno
Original assignee: Darwin Bioprospecting Excellence S L; Fundacion para el Fomento de la Investigacion Sanitaria y Biomedica de la Comunitat Valenciana FISABIO
Current assignee: Darwin Bioprospecting Excellence S L; Fundacion para el Fomento de la Investigacion Sanitaria y Biomedica de la Comunitat Valenciana FISABIO
Priority date: 2024-01-11
Filing date: 2024-01-11
Publication date: 2024-06-17
Also published as: ES2973007A8

Abstract

Probiótico oral. La presente invención se refiere a una cepa bacteriana de Streptococcus salivarius con propiedades de probiótico oral y una concentración mínima inhibitoria de al menos 500 ppm

Description

PROBIÓTICO ORAL

Campo de la técnica

La invención se refiere a cepas deStreptococcus salivariusy al uso de las mismas como probióticos orales para obtener aminoácidos esenciales.

Antecedentes

El ser humano necesita asimilar aminoácidos esenciales (AEs) a través de aportaciones externas, ya que nuestro cuerpo no es capaz de sintetizarlos, o lo hace a una tasa demasiado baja como para permitir un crecimiento y funcionalidad óptima. Estos AEs, tradicionalmente incorporados a través de la dieta, también son producidos por las bacterias que colonizan distintos nichos del cuerpo humano, siendo particularmente relevante la contribución por parte de las bacterias asociadas al aparato digestivo y más concretamente a la boca. Los AEs juegan un papel importante en la regulación del metabolismo y funciones del sistema inmune, a la vez que actúan como neurotransmisores o como precursores de los mismos entre otras funcionalidades. Una disminución de bacterias productoras debido a cambios en los hábitos alimenticios, el envejecimiento de la población o el excesivo uso de antibióticos puede tener un efecto negativo sobre la salud del ser humano. El uso de probióticos capaces de restaurar esa capacidad para la producción de aminoácidos puede suponer un apoyo en el tratamiento y prevención de enfermedades con gran impacto social y económico.

La alternativa al uso de probióticos orales para suplir las carencias de aminoácidos esenciales es la ingesta de aminoácidos en forma de suplemento alimenticio. El inconveniente que presenta esta estrategia es que la absorción de los AEs se limita al intestino, obviando la contribución de la cavidad oral a través de la permeabilidad de las mucosas. Por otro lado, las cantidades aportadas mediante suplementos suelen ser iguales o mayores a la dosis diaria recomendada y generalmente ingeridas en una única toma diaria, mientras que la síntesis por parte de un microorganismo es menor, aunque sostenida en el tiempo, incluyendo los periodos de ayunas.

Las cepas deStreptococcus salivariusobjeto de esta invención, son capaces de producir L-aminoácidos, tanto esenciales como no esenciales, y secretarlos al medio en forma libre. Esto supone que pueden ser inmediatamente incorporados al metabolismo humano por absorción directa en la cavidad oral, o transportados con la saliva hasta el intestino, donde se absorben junto con los aminoácidos liberados tras la lisis de las bacterias que tiene lugar en el estómago.

El documento EP1483366B1 divulga una cepa de S.salivariusdenominada M18, este no divulga el uso de la cepa como productora de AEs. Adicionalmente, las cepas de la presente invención muestran mejores capacidades como probiótico que dicha cepa.

Las cepas de S.salivariusque actualmente se comercializan como probióticos para la salud bucodental (M18 y K12), no tienen descrita la funcionalidad como productoras de aminoácidos esenciales.Streptococcus salivariusK12 se caracteriza por producir las bacteriocinassalivaricinaA2 ysalivaricinaB. Mientras que la cepa de referencia M18 produce cuatro bacteriocinas, salivaricinas A2, 9, MPS, and M que actúan contra la bacteria cariogénicaStreptococcus mutans.Además, produce dextranasas y ureasas, que ayudan a reducir la acumulación de placa dental y la acidificación causante de caries. En la presente invención adicionalmente mostramos mediante experimentos comparativos que las cepas del estado de la técnica presentan capacidades probióticas inferiores o incluso adversas con respecto a las cepas deS. salivariusobjeto de la invención, tales como una menor capacidad de producir AEs, una menor resistencia al flúor y una mayor capacidad acidogénica.

Descripción de la invención

La expresión "una cepa de la invención", tal y como se utiliza en el presente documento, es un término colectivo que hace referencia a cualquier cepa de S.salivariusdescrita en el presente documento y sus cepas derivadas.

Un objeto de la invención se refiere a una cepa probiótica oral deStreptococcus salivariusque:

(a) comprende un gen codificador del ARNr 16S que tiene >95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, 2 o 3;

(b) esStreptococcus salivariusCDWN00916 depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de acceso CECT 30898,

(c) esStreptococcus salivariusCDWN00918 depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de acceso CECT 30899, o bien

(d) esStreptococcus salivariusCDWN00921 depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de acceso CECT 30900, que presenta una concentración mínima inhibitoria al ion flúor de al menos 500 ppm

En una realización particular la identidad del ARNr 16S es al menos 96%, 97%, 98%, 99% o 100% con la secuencia de uno más de las SEQ ID NO: 1,2 o 3;

Una cepa bacteriana de la invención puede comprender un gen codificador de ARNr 16S que tenga >95% (es decir, igual o superior al 95%), >96%, >97%, >98%, >99% o 100% de identidad de secuencia con el gen codificador de ARNr 16S de S.salivanusCECT 30898 (SEQ ID NO: 1). Por ejemplo, el gen codificador del ARNr 16S puede tener >98,4%, >98,5, >98,6%, >98,7%, >98,8%, >99%, >99,1%, >99,2%, >99,3%, >99,4%, >99,5%, >99,6%, >99,7%, >99,8%, >99,9% o 100% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1. El gen codificador de ARNr 16S de la cepa bacteriana de la invención puede diferir de SEQ ID NO: 1 en 1, <2 (es decir, igual o inferior a 2), <3, <4, <5, <6, <7, <8, <9, <10, <15, <20, <25 o <29 bases. La cepa bacteriana puede ser una cepa de S.salivanus.

Una cepa bacteriana de la invención puede comprender un gen codificador de ARNr 16S que tenga >95% (es decir, igual o superior al 95%), >96%, >97%, >98%, >99% o 100% de identidad de secuencia con el gen codificador de ARNr 16S de S.salivanusCECT 30899 (SEQ ID NO: 2). Por ejemplo, el gen codificador del ARNr 16S puede tener >98,4%, >98,5, >98,6%, >98,7%, >98,8%, >99%, >99,1%, >99,2%, >99,3%, >99,4%, >99,5%, >99,6%, >99,7%, >99,8%, >99,9% o 100% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2. El gen codificador de ARNr 16S de la cepa bacteriana de la invención puede diferir de SEQ ID NO: 2 en 1, <2 (es decir, igual o inferior a 2), <3, <4, <5, <6, <7, <8, <9, <10, <15, <20, <25 o <29 bases. La cepa bacteriana puede ser una cepa de S.salivanus.

Una cepa bacteriana de la invención puede comprender un gen codificador de ARNr 16S que tenga >95% (es decir, igual o superior al 95%), >96%, >97%, >98%, >99% o 100% de identidad de secuencia con el gen codificador de ARNr 16S de S.salivanusCECT 30900 (SEQ ID NO: 3). Por ejemplo, el gen codificador del ARNr 16S puede tener >98,4%, >98,5, >98,6%, >98,7%, >98,8%, >99%, >99,1%, >99,2%, >99,3%, >99,4%, >99,5%, >99,6%, >99,7%, >99,8%, >99,9% o 100% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3. El gen codificador de ARNr 16S de la cepa bacteriana de la invención puede diferir de SEQ ID NO: 3 en 1, <2 (es decir, igual o inferior a 2), <3, <4, <5, <6, <7, <8, <9, <10, <15, <20, <25 o <29 bases. La cepa bacteriana puede ser una cepa de S.salivanus.

En una realización particular la identidad del ARNr 16S es de al menos 97%, 98%, 99% o 100% con una o más de las SEQ ID NO: 2 o 3;

(a) comprende un gen codificador del ARNr 16S que tiene >95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1,2 o 3;

(b) comprende un genoma que tiene >90% de identidad al genoma de S.salivarius,CDWN00916, CDWN00918, CDWN00921;

(d) esStreptococcus salivariusCDWN00921 depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de acceso CECT 30900,

que presenta una concentración mínima inhibitoria al ion flúor de al menos 500 ppm

Los genomas de las cepas CDWN00916, CDWN00918, CDWN00921son accesibles en la base de datos GenBank bajo número de acceso JAXKQD000000000; JAXKQE000000000 y JAXKLG000000000 respectivamente.

Una cepa bacteriana de la invención puede comprender un genoma que tenga >90% (es decir, igual o superior al 90%), >91%, >92%, >93%, >94%, >95%, >96%, >97%, >98%, >99%, >99. 1%, >99,2%, >99,3%, >99,4%, >99,5%, >99,6%, >99,7%, >99,8%, >99,9% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia del genoma de S.salivariusCDWN00916, Genbank ID JAXKQD000000000. Entendiéndose como el genoma de dicha cepa la totalidad de las secuencias o "contigs” que aparecen para GenBank: JAXKQD000000000.1

Una cepa bacteriana de la invención puede comprender un genoma que tenga >90% (es decir, igual o superior al 90%), >91%, >92%, >93%, >94%, >95%, >96%, >97%, >98%, >99%, >99. 1%, >99,2%, >99,3%, >99,4%, >99,5%, >99,6%, >99,7%, >99,8%, >99,9% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia del genoma de S.salivariusCDWN00918, Genbank ID JAXKQE000000000. Entendiéndose como el genoma de dicha cepa la totalidad de las secuencias o "contigs” que aparecen para GenBank: J JAXKQE000000000.1

Una cepa bacteriana de la invención puede comprender un genoma que tenga >90% (es decir, igual o superior al 90%), >91%, >92%, >93%, >94%, >95%, >96%, >97%, >98%, >99%, >99. 1%, >99,2%, >99,3%, >99,4%, >99,5%, >99,6%, >99,7%, >99,8%, >99,9% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia del genoma de S.salivanusCDWN00921, Genbank ID JAXKLG000000000. Entendiéndose como el genoma de dicha cepa la totalidad de las secuencias o "contigs” que aparecen para GenBank: JAXKLG000000000.1

En la presente memoria "probiótico oral” significa una o más cepas de S.salivanusbeneficiosos de uso oral, que no provienen de una muestra de tejido respiratorio, oral, o del tracto digestivo de un sujeto humano con patologías, preferentemente patologías inflamatorias y que entre sus características beneficiosas se encuentran su actividad antimicrobiana, efecto sobre el pH, capacidad de producción de aminoácidos esenciales y ayuda en la digestión de productos lácteos.

Las cepas de microorganismos de la presente invención sorprendentemente presentan la característica de tener una elevada resistencia al ion flúor. La resistencia de los probióticos orales al flúor es importante para evitar que su viabilidad no se vea afectada como consecuencia del cepillado dental o con el uso de colutorios. Sorprendentemente, las cepas de la invención presentan una mayor resistencia a compuestos derivados del flúor habitualmente presentes en productos de higiene oral en comparación con las cepas del estado de la técnica. Esto permite que los efectos beneficiosos orales duren más tiempo ya que no será necesario tomar otra dosis de probióticos tras, por ejemplo, el cepillado que puede eliminar otros probióticos de la cavidad bucal. La concentración habitual de flúor en pastas de dientes es de 1500 ppm, la saliva produce un efecto de dilución de 1/3 a 1/4 aproximadamente, lo que resulta en 500 ppm- 375 ppm aproximadamente Como se mostrará posteriormente, las cepas M18 y K12 presentan una Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de 375 ppm de fluoruro de sodio (NaF) mientras que la de las cepas de la presente invención es superior.

En una realización particular el ion flúor, es fluoruro de sodio

En una realización particular, las cepas de S.salivanusde la invención presentan una concentración mínima inhibitoria al ion flúor de al menos 250 o 251 o 252 o 253 o 254 o 255 o 256 o 257 o 258 o 259 o 260 o 261 o 262 o 263 o 264 o 265 o 266 o 267 o 268 o 269 o 270 o 271 o 272 o 273 o 274 o 275 o 276 o 277 o 278 o 279 o 280 o 281 o 282 o 283 o 284 o 285 o 286 o 287 o 288 o 289 o 290 o 291 o 292 o 293 o 294 o 295 o 296 o 297 o 298 o 299 o 300 o 301 o 302 o 303 o 304 o 305 o 306 o 307 o 308 o 309 o310 o 311 o 312o313o314 o 315 o 316 o 317 o 318o319o320 o 321 o 322 o 323 o 324 o 325 o 326 o 327 o 328 o 329 o 330 o 331 o 332 o 333 o 334 o 335 o 336 o 337 o 338 o 339 o 340 o 341 o 342 o 343 o 344 o 345 o 346 o 347 o 348 o 349 o 350 o 351 o 352 o 353 o 354 o 355 o 356 o 357 o 358 o 359 o 360 o 361 o 362 o 363 o 364 o 365 o 366 o 367 o 368 o 369 o 370 o 371 o 372 o 373 o 374 o 375 o 376 o 377 o 378 o 379 o 380 o 381 o 382 o 383 o 384 o 385 o 386 o 387 o 388 o 389 o 390 o 391 o 392 o 393 o 394 o 395 o 396 o 397 o 398 o 399 o 400 o 401 o 402 o 403 o 404 o 405 o 406 o 407 o 408 o 409 o 410O411 0412 o413o 414 o415o 416o417o418o419 o 420 o 421 o 422 o 423 o 424 o 425 o 426 o 427 o 428 o 429 o 430 o 431 o 432 o 433 o 434 o 435 o 436 o 437 o 438 o 439 o 440 o 441 o 442 o 443 o 444 o 445 o 446 o 447 o 448 o 449 o 450 o 451 o 452 o 453 o 454 o 455 o 456 o 457 o 458 o 459 o 460 o 461 o 462 o 463 o 464 o 465 o 466 o 467 o 468 o 469 o 470 o 471 o 472 o 473 o 474 o 475 o 476 o 477 o 478 o 479 o 480 o 481 o 482 o 483 o 484 o 485 o 486 o 487 o 488 o 489 o 490 o 491 o 492 o 493 o 494 o 495 o 496 o 497 o 498 o 499 o 500 o 501 o 502 o 503 o 504 o 505 o 506 o 507 o 508o509o510 0511 o 512 o 513 o 514o515o516o517 o 518 o519o 520 o 521 o 522 o 523 o 524 o 525 o 526 o 527 o 528 o 529 o 530 o 531 o 532 o 533 o 534 o 535 o 536 o 537 o 538 o 539 o 540 o 541 o 542 o 543 o 544 o 545 o 546 o 547 o 548 o 549 o 550 ppm de ion flúor .

En una realización particular, las cepas de S.salivariusde la invención presentan una concentración mínima inhibitoria al ion flúor es de al menos 550 ppm, preferentemente al menos 600 ppm, preferentemente al menos 700 ppm, preferentemente entre 700 y 1500 ppm en un experimentoin vitro,preferentemente de entre 800 y 1200 ppm, más preferentemente entre 850 y 1100 ppm o de entre 900 y 1000 ppm de NaF.

En otra realización particular, la CMI de las cepas de la invención es de al menos 600 ppm de NaF, preferentemente de al menos 700 ppm de NaF, más preferentemente de al menos 800 ppm de NaF y aún más preferentemente de al menos 900 ppm de NaF.

Como se ha indicado anteriormente, una elevada resistencia al ion flúor es una característica beneficiosa de un probiótico oral.

En una realización particular, la cepa de la invención presenta uno o más propiedades de probiótico oral además de la resistencia al flúor

Las “propiedades de probiótico oral” se seleccionan entre una o más de las siguientes: producción de aminoácidos esenciales, capacidad antimicrobiana frente a patógenos orales, una reducida capacidad acidogénica en comparación con las cepas del estado de la técnica, preferentemente las cepas M18 y K12 y ayuda en la digestión de productos lácteos.

En una realización particular, los AEs producidos por las cepas de la invención en mayor cantidad que las cepas del estado de la técnica son uno o más de los siguientes: histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptófano y valina.

En una realización particular, los aminoácidos esenciales son: isoleucina, leucina, triptófano, fenilalanina tirosina, treonina, valina y metionina cisteína.

En otra realización particular, los aminoácidos esenciales son: isoleucina, leucina, fenilalanina tirosina, treonina, y valina.

En otra realización particular, los aminoácidos esenciales son: leucina, valina y fenilalanina.

Una reducida actividad acidogénica de las bacterias orales es de gran importancia en el ámbito de la salud, ya que puede dar lugar a una acidificación que favorece el desarrollo de caries y promueve a su vez la proliferación de otros microorganismos acidogénicos y acidúricos, incluyendo especies comoStreptococcus mutansyLactobacillusspp., entre otros. Esto conduce a una fermentación rápida de los azúcares presentes en la dieta, lo cual resulta en una disminución del pH y en consecuencia a una desmineralización de los dientes, desencadenando caries. Como se verá a continuación, las cepas de la invención presentan una actividad acidogénica reducida en comparación con las cepas del estado de la técnica.

En general, el número de células de S.salivariusde la invención administradas al individuo oscilará desde aproximadamente 102 hasta 1015 unidades formadoras de colonias (UFC), preferiblemente desde alrededor de 103 hasta 1014 UFCs, más preferiblemente desde alrededor de 105 hasta 1012 UFCs, normalmente alrededor de 107 a 1010 UFCs por dosis. Esta dosis, puede comprender una o más de las cepas de la invención.

Como se mostrará en los ejemplos de realización, las cepas de la invención pueden mejorar la digestión de productos lácteos, derivados lácteos por parte de un sujeto ya que en el estudio del genoma de estas cepas se ha encontrado que presentan genes involucrados en el metabolismo de la lactosa y galactosa que no están presentes en otras cepas del estado de la técnica. Esta ventaja adicional sería de especial utilidad para sujetos intolerantes a la lactosa.

En una realización particular, las cepas de S.salivariusde la invención presentan en su genoma el gen EC 3.2.1.23 (B-galactosidasa) y/o el gen permeasa lactosa/ galactosa. Un experto en la materia entenderá que la secuencia de estos genes en el genoma de las cepas de S.salivariuspuede variar con respecto a la secuencia canónica reconocida para S.salivariuspero que en cualquier caso dará lugar a una proteína funcional que sea activa.

Un objeto adicional de la invención se refiere a una cepa deStreptococcus salivariusdepositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con número CECT 30898 o cepas derivadas de la misma, en donde dichas cepas derivadas tienen las mismas, mejores o inferiores propiedades de probiótico oral, que las cepas CECT 30898.

Esta cepa se depositó el 25 de julio de 2023 en la Colección Española de Cultivos Tipo, Calle Catedrático Agustín Escardino, 9, CP46980, Paterna (Valencia), España según las disposiciones del Tratado de Budapest.

En la presente invención la cepa CECT 30898 y CDWN00916 son términos intercambiables y se emplean indistintamente.

Las variantes de esta cepa se refieren a cepas que se derivan de CECT 30898, u obtenidas de CECT 30898, y pueden tener mutaciones en comparación conS. salivarius. Preferiblemente, la cepa derivada tiene las mismas, mejores o inferiores propiedades de probiótico oral que la cepa original CECT 30898. Preferiblemente, la cepa derivada de CECT 30898 tiene al menos el 80% o más, preferiblemente al menos el 90% o más, más preferiblemente al menos el 95% o más o incluso hasta el 100% o más del 100% de las propiedades de probiótico oral en comparación con la cepa CECT 30898 en condiciones iguales.

En una realización particular, el número de células de S.salivariusde la cepa CDWN00916 administradas al individuo será al menos aproximadamente 109 UFC, o aproximadamente 109 hasta 1012 unidades formadoras de colonias (UFC). esta dosis es suficiente para administrar a un sujeto la cantidad recomendada de aminoácidos esenciales diarios: Ile, Leu, Phe/Tyr, Thr, Val, Trp y Met/Cys

La presente invención también se refiere a una cepa deStreptococcus salivariusdepositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con número CECT 30899 o cepas derivadas de la misma, en donde dichas cepas derivadas tienen las mismas, mejores o inferiores propiedades de probiótico oral, que la cepa CECT 30899. Esta cepa se depositó el 25 de julio de 2023 en la Colección Española de Cultivos Tipo.

En la presente invención la cepa CECT 30899 y CDWN00918 son términos intercambiables y se emplean indistintamente.

Las variantes de esta cepa se refieren a cepas que se derivan de CECT 30899, u obtenidas de CECT 30899, y pueden tener mutaciones en comparación con S.salivarius,preferiblemente, la cepa derivada tiene las mismas, mejores o inferiores propiedades de probiótico oral que la cepa original CECT 30899. Preferiblemente, la cepa derivada de CECT 30899 tiene al menos el 80% o más, preferiblemente al menos el 90% o más, más preferiblemente al menos el 95% o más o incluso hasta el 100% o más del 100% de las propiedades de probiótico oral en comparación con la cepa CECT 30899 en condiciones iguales.

En una realización particular, el número de células de S.salivanusde la cepa CDWN00918 administradas al individuo será al menos aproximadamente 109 UFC, o aproximadamente 109 hasta 1011 unidades formadoras de colonias (UFC). esta dosis es suficiente para administrar a un sujeto la cantidad recomendada de aminoácidos esenciales diarios: Ile, Leu, Phe/Tyr, Thr y Val

La presente invención también se refiere a una cepa deStreptococcus salivanusdepositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con número CECT 30900 o cepas derivadas de la misma, en donde dichas cepas derivadas tienen las mismas, mejores o inferiores propiedades de probiótico oral, que la cepa CECT 30900. Esta cepa se depositó el 25 de julio de 2023 en la Colección Española de Cultivos Tipo.

En la presente invención la cepa CECT 30900 y CDWN00921 son términos intercambiables y se emplean indistintamente.

Las variantes de esta cepa se refieren a cepas que se derivan de CECT 30900, u obtenidas de CECT 30900, y pueden tener mutaciones en comparación conS. salivarius, preferiblemente, la cepa derivada tiene las mismas, mejores o inferiores propiedades de probiótico oral que la cepa original CECT 30900. Preferiblemente, la cepa derivada de CECT 30900 tiene al menos el 80% o más, preferiblemente al menos el 90% o más, más preferiblemente al menos el 95% o más o incluso hasta el 100% o más del 100% de las propiedades de probiótico oral en comparación con la cepa CECT 30900 en condiciones iguales.

En una realización particular, el número de células de S.salivariusde la cepa CDWN00921 administradas al individuo será al menos aproximadamente 107UFC, o aproximadamente 107 hasta 109 unidades formadoras de colonias (UFC). esta dosis es suficiente para administrar a un sujeto la cantidad recomendada de aminoácidos esenciales diarios: Ile, Leu, Phe/Tyr, Thr y Val

Las variantes o cepas derivadas de las cepas de la invención suelen conservar las propiedades de probiótico oral de su correspondiente cepa original.

Por todo lo anterior, las ventajas de las cepas de la presente invención son:

1. Aprovechamiento de las propiedades naturales de la microbiota comensal oral.

2. Debido a la capacidad de producción de aminoácidos esenciales, estas cepas suponen una estrategia de prevención para el desarrollo de patologías asociadas al déficit de dichos aminoácidos.

3. Producción y liberación de aminoácidos de forma mantenida en el tiempo, incluso en las horas de ayuno.

4. Las cepas también muestran actividad antimicrobiana, lo que supone un añadido beneficioso para salud bucodental al impedir el crecimiento de microorganismos patógenos bucales implicados en el desarrollo de ciertas patologías orales como caries y enfermedades periodontales.

5. Las cepas son más resistentes a compuestos fluorados que las del estado de la técnica, lo que permite que sean más resistentes a procesos de higiene bucal, incluyendo al cepillado con pastas dentífricas con flúor. Esto permite que las bacterias probióticas administradas no se vean afectadas por procesos de higiene bucal.

6. Las cepas presentan una menor capacidad acidogénica que las del estado de la técnica, lo que se traduce en una menor capacidad de inducción de caries dental.

Otro objeto adicional de la invención se refiere a extractos activos obtenidos a partir de cepas de S.salivanusde la invención descritas anteriormente. Estos extractos activos se pueden utilizar de forma similar en formulaciones y usos terapéuticos. Los extractos se pueden obtener siguiendo protocolos conocidos en la técnica, convenientemente mediante cultivo celular y centrifugación y/o microfiltración.

Este extracto es rico en aminoácidos esenciales, además de comprender otros compuestos con actividad antimicrobiana.

Otro objeto adicional de la invención se refiere a una formulación probiótica de administración oral que comprenda una o más de las cepas indicadas anteriormente, o extracto de la invención.

En una realización particular, la formulación probiótica comprende la misma cantidad de las cepas CDWN00916, CDWN00918 y CDWN00921.

En otra realización particular, la formulación probiótica comprende las cepas CDWN00916, CDWN00918 y CDWN00921, en una proporción de aproximadamente 1:2:1 a 1:3:1

En otra realización particular, la formulación probiótica comprende las cepas CDWN00918, CDWN00916 y CDWN00921, en una proporción de aproximadamente 1:2:1 a 1:3:1

En otra realización particular, la formulación probiótica comprende las cepas CDWN00916, CDWN00921 y CDWN0018, en una proporción de aproximadamente 1:2:1 a 1:3:1

En una realización adicional, la formulación probiótica de administración oral comprende:

al menos un vehículo, diluyente, y/o excipiente farmacéuticamente aceptable y/o

al menos un agente activo

Las formulaciones para administración oral pueden incluir polvos o gránulos, suspensiones o soluciones en agua o medios no acuosos, cápsulas, sobres o comprimidos. Pueden ser deseables espesantes, aromatizantes, diluyentes, emulsionantes, auxiliares de dispersión o aglutinantes.

Un "vehículo, diluyente y/o excipiente” significa un vehículo para el suministro de una cepa de S.salivanuso extracto de la invención al individuo, en el que el vehículo es compatible con la viabilidad de la célula bacteriana, o actividad del extracto. Los vehículos aceptables adecuados para uso en la administración de cepas de S.salivanusviables de la invención y extractos son bien conocidos por los expertos en la técnica. Los vehículos adecuados son generalmente inertes y pueden ser sólidos o líquidos.

Por "farmacéuticamente aceptable" se entiende un material que no es biológicamente o de otra manera indeseable, es decir, el material puede administrarse a un sujeto junto con el compuesto seleccionado sin causar ningún efecto biológico indeseable o interactuar de manera deletérea con cualquiera de los otros componentes de la composición farmacéutica en la que está contenido.

Los vehículos, diluyentes y/o excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, agua, disoluciones salinas tamponadas (por ejemplo, disolución salina tamponada con fosfato), medios de cultivo farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, Brain Heart Infusion (BHI), Tryptic Soy Agar (TSA), Blood Agar, etc.), u otras disoluciones que mantienen la viabilidad de la bacteria o la actividad del extracto.

Adicionalmente, tales vehículos farmacéuticamente aceptables pueden ser disoluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas. En la técnica se conoce bien una variedad de vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados para la administración oral de bacterias viables o liofilizadas. Los vehículos sólidos adecuados conocidos en la técnica incluyen, por ejemplo, carbonato de magnesio; estearato de magnesio; celulosas; talco; azúcares tales como fructosa, sacarosa, manitol, lactosa; almidones; harinas; y leche desnatada, y polvos comestibles similares, pero no se limitan a ellos. De forma similar, los vehículos para administración de extractos son bien conocidos.

Los diluyentes típicos, a título de ejemplo, son: almidones; lactosa; manitol; caolín; fosfato o sulfato de calcio; sales inorgánicas tales como cloruro de sodio; y azúcares o celulosas en polvo.

Las composiciones también pueden incluir excipientes tales como auxiliares para la compresión; resinas; cargas; aglutinantes; lubricantes; disolventes; agentes deslizantes; disgregantes; conservantes; tampones; saborizantes; colorantes; edulcorantes; y fragancias, según sea apropiado.

Los aglutinantes típicos incluyen almidón; gelatina; azúcares, tales como lactosa, fructosa, y glucosa; y similares. También, son convenientes las gomas naturales y sintéticas, incluyendo goma arábiga, alginatos; metilcelulosa; polivinilpirrolidona; tragacanto; y similares. Igualmente pueden servir como aglutinantes el polietilenglicol; la etilcelulosa; y ceras.

Los lubricantes para evitar la adhesión a la matriz durante la formación incluyen sólidos resbaladizos tales como talco, sílice, estearato de magnesio y de calcio, polietilenglicol, ácido esteárico, y aceites vegetales hidrogenados.

Los disgregantes son sustancias que se hinchan cuando se humedecen, para romper la pastilla y liberar la S.salivanuso el extracto. Los disgregantes incluyen almidones; arcillas; celulosas; alginas y gomas; más particularmente, almidones de maíz y de patata; metilcelulosa; agar; bentonita; celulosa maderera; resinas de intercambio catiónico; ácido algínico; goma guar; pulpa de cítrico; carboximetilcelulosa; esponja en polvo; y laurilsulfato de sodio.

En una realización particular, la cepa de la invención o la composición que la comprende se administra como alimento, bebida o nutracéutico. La/s cepa/s o extracto/s activos también se pueden administrar en forma de un colutorio, enjuague bucal, pasta de dientes, pulverización bucal, gárgaras, cápsula, pastilla para chupar, jarabe, hilo dental, goma de mascar, o comprimido masticable, entre otras presentaciones posibles.

En una realización, la materia alimentaria o bebida es un alimento o bebida a base de un producto lácteo, incluyendo, a título de ejemplo, yogur, queso, leche, leche en polvo, bizcochos de leche, y leches con sabores.

En una realización particular, la composición de administración oral de S.salivanuses una mezcla de cepas de S.salivanusliofilizadas con leche en polvo desnatada o similar, que se ha aromatizado para potenciar su sabor agradable. Preferentemente presentada como pastillas para chupar, comprimidos masticables, o cápsulas. Una pastilla para chupar según la invención comprende una cepa de S.salivanuso extracto de la invención, isomalta y EMDEX®. La pastilla para chupar se puede preparar mediante compresión directa, granulación en húmedo, o granulación en seco. Las pastillas para chupar se pueden revestir según la práctica farmacéutica bien conocida.

La composición probiótica puede contener adicionalmente nutrientes o conservantes para mantener la viabilidad de la/s bacteria/s en la formulación. Como se señala anteriormente, la formulación puede contener también agentes saborizantes, agentes colorantes, fragancias, u otros compuestos que aumentan el sabor agradable de la composición y/o potencian la aceptación del paciente sin comprometer la eficacia de la formulación. Los métodos para la preparación de formulaciones para administración oral son bien conocidos en la técnica.

En una realización particular, la composición de la invención puede comprender además uno o más agentes activos que pueden ser otra cepa de S.salivanusde las definidas previamente u otra diferente, o que no sean microorganismos como por ejemplo xilitol, fluoruro, miel de Manuka, y taninos.

En una realización particular, la formulación probiótica de administración oral comprende las cepas CDWN00916 y CDWN00921.

En otra realización particular, la composición probiótica comprende la cepa deS. salivanusCDWN00916 y CDWN00921 en una concentración adecuada de UFCs para obtener la cantidad necesaria de aminoácidos esenciales diaria de un individuo.

En una realización particular los aminoácidos esenciales son isoleucina, leucina, triptófano, fenilalanina tirosina, treonina, valina y metionina cisteína.

En otra realización particular, la formulación comprende también la cepa CDWN00918.

Un experto sabría determinar la cantidad necesaria de aminoácidos esenciales para un sujeto, según su peso y condiciones de salud, consultando por ejemplo el artículo Joint FAO/WHO/UNU Expert Consultation on Protein and Amino Acid Requirements in Human Nutrition (2002 : Geneva, Switzerland), Food and Agriculture Organization of the United Nations, World Health Organization & United Nations University. (2007). Protein and amino acid requirements in human nutrition: report of a joint FAO/WHO/UNU expert consultation, u otros documentos similares y de ahí determinar la concentración necesaria de UFCs de las cepas de S.salivanus.

En otra realización particular, la composición probiótica de administración oral de la invención comprende aproximadamente de 105 a 1012, preferiblemente 108 a 1010 UFCs de una o más de las cepas definidas anteriormente.

Otro objeto adicional de la invención se refiere al uso de una cepa anteriormente descrita o una composición de administración oral para la producción de aminoácidos esenciales.

En una realización particular, los aminoácidos esenciales son isoleucina, leucina, triptófano, fenilalanina tirosina, treonina, valina y metionina cisteína.

Esto es especialmente relevante en situaciones de déficit de aminoácidos esenciales, y también en situaciones donde se quiera reforzar la ingesta de aminoácidos esenciales adquiridos en la dieta.

Otro objeto adicional de la invención se refiere a una cepa de S.salivanusseleccionada entre CDWN00916, CDWN00918 y CDWN00921, o un extracto o una formulación que comprenda tal y como se ha definido anteriormente para su uso en la prevención o tratamiento de patologías orales.

En una realización particular las patologías orales se seleccionan entre caries y enfermedades periodontales.

Estas patologías orales pueden estar producidas total o parcialmente por microorganismos patógenos.

En el presente documento, el término "prevenir" se refiere a la administración de al menos una cepa o formulación probiótica de administración oral antes de la aparición de los síntomas clínicos de una enfermedad o afección con el fin de prevenir una manifestación física de las alteraciones asociadas a la enfermedad o afección. En el contexto de las caries dentales, el término "prevenir" se refiere a la administración de al menos una cepa o composición antes de la aparición de los síntomas clínicos de la caries dental, con el fin de prevenir la manifestación física de las patologías asociadas a la caries dental.

Los términos "tratamiento" y "tratar" se refieren al tratamiento médico de un sujeto con la intención de curar, mejorar, estabilizar o prevenir una enfermedad, condición patológica o trastorno. Este término incluye el tratamiento activo, es decir, el tratamiento dirigido específicamente a la mejora de una enfermedad, afección patológica o trastorno, y también incluye el tratamiento causal, es decir, el tratamiento dirigido a la eliminación de la causa de la enfermedad, afección patológica o trastorno asociado. Además, este término incluye el tratamiento paliativo, es decir, el tratamiento diseñado para aliviar los síntomas en lugar de curar la enfermedad, afección patológica o trastorno; el tratamiento preventivo, es decir, el tratamiento dirigido a minimizar o inhibir parcial o completamente el desarrollo de la enfermedad, afección patológica o trastorno asociados; y el tratamiento de apoyo, es decir, el tratamiento empleado para complementar otra terapia específica dirigida a la mejora de la enfermedad, afección patológica o trastorno asociados. Se entiende que el tratamiento, aunque esté destinado a curar, mejorar, estabilizar o prevenir una enfermedad, afección patológica o trastorno, no tiene por qué producir realmente la curación, mejora, estabilización o prevención. Los efectos del tratamiento pueden medirse o evaluarse como se describe en el presente documento y como se conoce en la técnica, según convenga para la enfermedad, afección patológica o trastorno de que se trate. Dichas mediciones y evaluaciones pueden realizarse en términos cualitativos y/o cuantitativos. Así, por ejemplo, las características o rasgos de una enfermedad, afección patológica o trastorno y/o los síntomas de una enfermedad, afección patológica o trastorno pueden reducirse a cualquier efecto o en cualquier cantidad. En el contexto de un sujeto que sufre una caries dental, los términos "tratamiento" y "tratar" se refieren a la gestión médica de un sujeto con la intención de curar, mejorar o estabilizar la caries dental. En el contexto de un sujeto en riesgo de desarrollar una caries dental, los términos "tratamiento" y "tratar" se refieren a la gestión médica de un sujeto con la intención de prevenir la caries dental.

En una realización particular, la caries está causada, al menos parcialmente, por microorganismos acidogénicos y/o acidúricos como por ejemploStreptococcus mutans, Scardovia wiggsiaey especies de la familiaLactobacillaceae.como, por ejemplo:Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus reuteri,Lactobacillus brevis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii,yLactobacillus bulgaricus.

Otro objeto adicional de la invención se refiere a una cepa de S.salivariusseleccionada entre CDWN00916, CDWN00918 y CDWN00921, o un extracto o una formulación que comprenda tal y como se ha definido anteriormente para su uso en la prevención o tratamiento de la disbiosis o desequilibrio de la microbiota oral.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "sujeto” incluye, entre otros, animales. El sujeto puede ser un vertebrado, más concretamente un mamífero (por ejemplo, un ser humano, un caballo, un cerdo, un conejo, un perro, una oveja, una cabra, un primate no humano, una vaca, un gato, una cobaya o un roedor). El término no denota una edad o sexo en particular. Por lo tanto, los sujetos adultos y recién nacidos, ya sean varones o hembras, están cubiertos por la presente invención. Un paciente es un sujeto afectado por una enfermedad o trastorno, preferentemente una caries dental.

En una realización particular, el sujeto es un humano adulto, esto es igual o mayor de 18 años de edad.

La expresión "dosis” se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificación unitaria para el sujeto, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material activo (S.salivariusviable o extracto activo de la misma), calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el diluyente, vehículo o excipiente requerido.

Las dosificaciones específicas pueden variar ampliamente según diversas variables individuales, incluyendo el tamaño, peso, edad, gravedad de la enfermedad (por ejemplo, la virulencia y/o número de S.mutansresidentes que provocan la caries dental) y sensibilidad a la terapia (por ejemplo, la susceptibilidad de la cavidad oral del individuo a la colonización o la disbiosis del microbioma nativo). Los métodos para determinar la ruta apropiada de administración y la dosis se pueden determinar por el dentista u otro médico.

Cada uno de los términos "que comprende”, "que consiste esencialmente en” y "que consiste en” puede sustituirse por cualquiera de los otros dos términos. Los términos "un” o "una” pueden referirse a uno o a una pluralidad de los elementos que modifican (por ejemplo, "un reactivo” puede significar uno o más reactivos), a menos que esté contextualmente claro que se describe uno de los elementos o más de uno. El término "aproximadamente”, tal como se utiliza aquí, se refiere a un valor dentro del 10% del parámetro subyacente (es decir, más o menos el 10%; por ejemplo, un peso de “aproximadamente 100 gramos” puede incluir un peso entre 90 gramos y 110 gramos). El uso del término "aproximadamente" al principio de un listado de valores modifica cada uno de los valores (por ejemplo, “aproximadamente 1, 2 y 3” se refiere a “aproximadamente 1, aproximadamente 2 y aproximadamente 3”). Cuando se describe un listado de valores, el listado incluye todos los valores intermedios y todos los valores fraccionarios de los mismos (por ejemplo, el listado de valores “80%, 85% o 90%” incluye el valor intermedio 86% y el valor fraccionario 86,4%). Cuando un listado de valores va seguido del término “o más”, el término “o más” se aplica a cada uno de los valores enumerados (por ejemplo, el listado de “80%, 90%, 95% o más” o “80%, 90% o 95% o más” se refiere a “80% o más, 90% o más, o 95% o más”). Cuando se describe un listado de valores, el listado incluye todos los rangos entre dos de los valores listados (por ejemplo, el listado de “80%, 90% o 95%” incluye rangos de “80% a 90%”, “80% a 95%” y “90% a 95%”). A continuación, se exponen algunos ejemplos de aplicación de la tecnología.

Breve descripción de las figuras

Figura 1Árbol filogenómico obtenido con el métodoMáximum Likelihood(ML) en base a las distancias de similitud genómicas obtenidas con la herramienta TYGS (https://tygs.dsmz.de/). En los nodos se muestran los valores debootstraptras 100 pseudoréplicas. Jan P Meier-Kolthoff, Joaquim Sardá Carbasse, Rosa L Peinado-Olarte, Markus Goker, TYGS and LPSN: a database tandem for fast and reliable genome-based classification and nomenclature of prokaryotes, Nucleic Acids Research, Volume 50, Issue D1,7 January 2022, Pages D801-D807, https://doi.org/10.1093/nar/gkab902. Las cepas NCTC 8616 y ATCC 7073 son la misma cepa

Figura 2: Concentración de aminoácidos esenciales medidos mediante Resonancia Magnética Nuclear (RMN) en sobrenadantes de las cepas CDWN00916, CDWN00918, CDWN00921 de S.salivariusy la cepa de referencia M18 a 37 °C durante 2 horas. Se representan valores promedios y desviación estándar de duplicados biológicos.

Figura 3:Concentración de aminoácidos (A) esenciales y (B) no esenciales medidos mediante UPLC en sobrenadantes de las cepas de S.salivariusCDWN00916, CDWN00918 y CDWN00921 y la cepa de referencia M18 1% (p/v) dextrosa y 1% sacarosa (p/v) a 37 °C en estático durante 6 horas. Se representan valores promedios y desviación estándar de duplicados biológicos.

Figura 4:Curvas de crecimiento de las cepas de S.salivariusCDWN00916, CDWN00918 y CDWN00921 y de las cepas de referencia K12 y M18. Las cepas se crecieron en BHI hasta fase estacionaria tras lo que se ajustó una OD600 inicial de 0.05 en medio BHI fresco suplementado con NaF a distintas concentraciones (0-125-250 500-1000 ppm, partes por millón). Se distribuyeron 200 ql de cada condición ensayada en duplicado en una microplaca de 96 pocillos y se procedió a medir la absorbancia del cultivo a 600 nm en un lector de placas TECAN Infinite® 200 PRO. Las mediciones se realizaron cada 30 min durante 6.5 h a 37°C. Se representan valores netos medios de O.D tras deducir el valor del blanco correspondiente, para cada cepa en las condiciones ensayadas según diseño experimental.

Figura 5:Concentración mínima inhibitoria (CMI) de las cepas de la invención CDWN00916, CDWN00918 y CDWN00921 y las cepas de referencia K12 y M18 frente a NaF suplementado en el medio BHI a 37 °C tras a 6h de incubación. Los datos representados son los valores netos medios de O.D a tiempo 6h para cada concentración de NaF ensayada, como descrito en la Figura 4.

Figura 6:Efecto de inhibición de los sobrenadantes de las tres cepas de S.salivariusde la invención sobre el crecimiento deStreptococcus mutansCECT 479T. Se representan valores netos medios de O.D de dos experimentos independientes.

Figura 7:Curva de crecimiento de las cepas de S.salivariusCDWN00916, CDWN00918 y CDWN00921 en medio MRS suplementado con 0.2% sacarosa (p/v) e incubando los cultivos a 37 °C en estático durante 48 horas. Para cuantificar el crecimiento bacteriano se registraron los valores de OD600.

Figura 8:Curva de crecimiento de las cepas de S.salivariusCDWN00916, CDWN00918 y CDWN00921 en medio MRS suplementado con 0.2% dextrosa (p/v) e incubando os cultivos a 37 °C en estático durante 48 horas. Para cuantificar el crecimiento bacteriano se registraron los valores de OD600.

Figura 9:Curva de crecimiento de las cepas de S.salivariusCDWN00916, CDWN00918 y CDWN00921 en medio MRS suplementado con 0.2% celobiosa (p/v) e incubando os cultivos a 37 °C en estático durante 48 horas. Para cuantificar el crecimiento bacteriano se registraron los valores de OD600.

Ejemplos de realización

1. Aislamiento e identificación de las cepas de la invención y evaluación de su capacidad de producción de aminoácidos esenciales

A partir del estudio del metabolismo microbiano se han identificado los genes clave y sus funciones metabólicas implicados en las rutas de biosíntesis de varios Aes descritos previamente. En la Tabla 1 se muestra la descripción de los genes clave implicados en las rutas de biosíntesis de Aes, así como la función de la/s proteína/s que codifican.

Tabla 1. Genes clave implicados en las rutas de biosíntesis de aminoácidos esenciales.

Teniendo en cuenta la presencia/ausencia de los genes clave previamente identificados en las rutas de biosíntesis, se cuantificóin silicola abundancia de estas rutas en bacterias orales en base al análisis de sus genomas (Tabla 2). Según los resultados obtenidos, el géneroStreptococcuses el que posee un mayor número de especies asociadas a ambientes orales con rutas de biosíntesis de Aes.

Tabla 2: Abundancia de los genes clave en las rutas de biosíntesis de varios aminoácidos esenciales en bacterias orales en base a análisisin silico.

Abundancia de los genes clave de la síntesis de triptófano, fenilalanina, lisina, histidina y metionina, en los géneros bacterianos más representativos que forman parte de la microbiota oral nativa. Las frecuencias se indican según: (+) Presente en especies no orales (o presentes en boca en proporción <0.1%); (++) Presente en especies orales o en muchas especies; (+++) Presente en muchas especies orales; (--) Ausente/no detectado en bases de datos.

En ese sentido, posteriormente se procedió a realizar un aislamiento selectivo de cepas deStreptococcuspotencialmente productoras de Aes. - que pertenezcan a especies que cuentan con aislados catalogados como GRAS. Brevemente, se recogieron muestras de 1 ml de saliva de individuos voluntarios en tubos Eppendorfs estériles. El muestreo se realizó a primera hora de la mañana en voluntarios sanos de 20 a 50 años, que no habían ingerido alimentos ni cepillado los dientes desde la noche anterior. Tras la recogida de muestras se realizaron diluciones seriadas en tampón PBS y se sembraron en el medio Mitis Salivarius Agar (Sigma-Aldrich 01337-500G-F), un medio selectivo y diferencial para el aislamiento deStreptococcus salivariusy S.mitis.Las placas Petri fueron incubadas a 37 °C, en condiciones óxicas durante 72 horas. Las cepas crecidas fueron purificadas utilizando el medio de cultivo MRS (la composición del medio MRS(de Man, Rogosa y Sharpe)fue la siguiente: extracto de levadura (2,5%), acetato de sodio (0.5%), MgS04 7 H2O (0.02%), MnS04 H2O (0.005%) y un azúcar al 0.2%.) e identificadas taxonómicamente mediante la secuenciación parcial del gen ribosomal 16S utilizando la metodología descrita en Latorre-Pérez, A., Gimeno-Valero, H., Tanner, K., Pascual, J., Vilanova, C., & Porcar, M. (2021). A round trip to the desert: in situ nanopore sequencing informs targeted bioprospecting. Frontiers in Microbiology, 12, 768240. Para conocer la afiliación taxonómica de los aislados y la especie filogenéticamente más cercana se utilizó la herramienta online EzBioCloud (https://www.ezbiocloud.net/). Entre otros microorganismos, se aislaron las cepas CDWN00916, CDWN00918 y CDWN00921 identificadas como miembros del géneroStreptococcusen base a la similitud del gen 16S rRNA. Posteriormente se obtuvo la secuencia genómica de las tres cepas siguiendo la metodología descrita en Vidal-Verdú, Á., Molina-Menor, E., Pascual, J., Peretó, J., & Porcar, M. (2023). Gillisia lutea sp. Nov., isolated from marine aluminium residues from the Mediterraneansea. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 73(8), 005957. A partir de las secuencias genómicas se analizó con mayor precisión la asignación taxonómica de las tres cepas en base al índice de similitud genómica ANIb (Average Nucleootide Identity) con la herramienta en base al índice genómico ANIb. Índice calculado con la herramienta JspeciesWS y se obtuvo un árbol filogenómico con la herramienta TYGS.

Con el fin de evaluar la inocuidad de las tres cepas, se analizóin silicoel perfil de factores de virulencia y de resistencia a antibióticos de uso clínico siguiendo las recomendaciones de la EFSA (2021) (European Food Safety Authority (EFSA). (2021). EFSA statement on the requirements for whole genome sequence analysis of microorganisms intentionally used in the food chain. EFSA Journal, 19(7), e06506.). Para la identificación de los factores de virulencia se utilizaron las herramientas PathogenFinder y Abricate con la base de datos VFDB 2022, mientras que para la detección de resistencias de antibióticos se utilizó la herramienta CARD utilizando el criterio "Perfect and Strict hits”. Los resultados se muestran en las tablas 3, 4 y 5.

La cepa de S.salivariusidentificada como ATCC 7073 o NCTC 8618 entre otras denominaciones, es una cepa bacteriana aislada a partir de sangre de un paciente con reumatismo articular agudo, y está descartado su uso como probiótico oral al haberse aislado de un sujeto con patologías. Otros nombres de esta cepa son los siguientes: DSM 20560, ATCC 7073, NCTC 8618, JCM 5707, BCRC 17388, CCM 4046, CCUG 11878, CCUG 17825, CCUG 50207, CECT 805, CIP 102503, HAMBI 1716, LMG 11489, NCFB 1779, NCIMB 701779.

Tabla 3. Especie filogenéticamente más cercanas a las tres cepas incluidas en la invención en base a la similitud del gen ribosomal 16S rRNA.

Tabla 4. Especie filogenéticamente más cercana a las tres cepas incluidas en la invención en base al índice genómico ANIb.

Indice calculado con la herramienta JspeciesWS: Richter M, Rosselló-Móra R, Glockner FO, and Peplies J (2015) JSpeciesWS: a web server for prokaryotic species circumscription based on pairwise genome comparison. Bioinformatics. 2015 Nov 16. pii: btv681 (https://jspecies.ribohost.com/jspeciesws/).

Tabla 5. Similitud genómica(%)entre las tres cepas incluidas en la invención en base al índice genómico ANIb. (JspeciesWS).

En base al estudio al gen 16S rRNA las tres cepas objeto de la invención, CDWN00916, CDWN00918 y CDWN00921 pertenecen al géneroStreptococcusy están filogenéticamente relacionadas con la especieStreptococcus salivariussubsp.Salivarius.Los valores obtenidos con el índice genómico ANIb confirmaron que las tres cepas pertenecen a la especieStreptococcus salivariusestando filogenéticamente más relacionadas a la subespecieStreptococcus salivariussubsp.Salivariusque aStreptococcus salivariussubsp.Thermophilus(Tablas 3, 4 y 5 y Figura 1). Sin embargo, puesto que el valor de ANIb se encuentra cerca del valor umbral el análisis bioinformático de los genomas confirma que ninguna de las tres cepas presenta ni genes codifican factores de virulencia ni de resistencia a antibióticos de uso clínico. La ausencia de factores de virulencia y de genes de resistencia en su genoma confirma que las tres cepas reivindicadas en la invención son inocuas para su utilización en humanos.

A continuación, se cuantificó la cantidad de aminoácidos esenciales (Aes) producidos y liberados al medio por las tres cepas incluidas en la invención. Para ello se procedió al cultivo de las cepas CDWN00916, CDWN00918 y CDWN00921 en medio mínimo en ausencia de aminoácidos, y se midió la concentración de aminoácidos libres en los sobrenadantes tras 2 horas de incubación mediante resonancia magnética nuclear (RMN). Es importante que el medio de cultivo no comprenda aminoácidos ya que se activan las rutas de biosíntesis, que están fuertemente reguladas por la presencia del metabolito. Además, la ausencia de aminoácidos permite poder cuantificar los que ha producido la cepa sin contaminación proveniente del medio de cultivo. En el estudio se incluyó la cepa de referencia del estado de la técnica M18 que se comercializa como probiótico oral (Figura 2). Las cepas se crecieron en medio líquido infusión corazóncerebro (BHI) en cultivo estático a 37°C hasta alcanzar fase estacionaria. Se midió la densidad óptica (O.D) del cultivo a una absorbancia de 600 nm y se ajustó a un valor, de O.D igual a 2 en un 1 ml. Se procedió al lavado del cultivo mediante la centrifugación a 4000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente, tras lo que se descartó el sobrenadante y se re-suspendió el pellet en 1 ml de tampón fosfato salino 1x estéril. Se volvió a centrifugar como descrito previamente y se re-suspendió el pellet en 1 ml de medio mínimo (12.8 g/L Na2HPO4-7H20, 3g/L KH2P04, 0.5 g/L NaCI, 1 g/L NH4CI, 2 mM MgSO4-7H20, 0.1 mM CaCI2-2H20) suplementado con 1% (p/v) dextrosa y 1% sacarosa (p/v)., tras lo cual se incubó en estático tras su incubación durante 2 horas en medio mínimo 1% (p/v) dextrosa y 1% sacarosa (p/v) a 37 °C durante 2 horas. Tras el periodo de incubación se centrifugó el cultivo a 13000 rpm durante 5 min a 4°C y se recuperó el sobrenadante que se mantuvo a -80°C hasta su análisis por RMN. Los metabolitos se analizaron con el programa ChenomX 8.6 y usando TSPd4 en el buffer como estándar interno (150mM fosfato potásico pH 7.4, 580.5 pM TSPd4, 10% D20, 0.05% azida sódica).

El uso de RMN como técnica analítica evita la necesidad de pre-procesar la muestra, aunque en contraposición es menos sensible que otras técnicas de análisis y requiere de concentraciones más elevadas del metabolito en el sobrenadante para su correcta identificación y cuantificación. Por ello, se realizó una optimización de las condiciones experimentales tal y como se ha descrito para una caracterización lo más completa posible del perfil de metabolitos de interés comercial secretados por los aislados seleccionados y el análisis por técnicas complementarias como la cromatografía líquida acoplada a masas (UPLC-QtoF-MS), tomando como referencia la cepa M18 e incubando las células de S.salivanuscon el medio mínimo de cultivo durante 6 horas (Figura 3). Las muestras se prepararon como descrito en la Figura 2. En resumen, se crecieron los cultivos hasta fase estacionaria y se ajustó una O.D a un valor igual a 2 en 1 ml. Se procedió al lavado del cultivo en tampón fosfato salino, tras lo que se re suspendió el pellet en 1 ml en medio mínimo suplementado con 1% (p/v) dextrosa y 1% sacarosa (p/v) a 37 °C en estático durante 6 horas. Tras el periodo de incubación se centrifugó el cultivo a 13000 rpm durante 5 min a 4°C y se recuperó el sobrenadante que se mantuvo a -80°C. Previo al análisis de los aminoácidos libres por UPLC, se realizó una precipitación de las proteínas presentes en la muestra con ACN (2:1, v/v), tras lo que se recuperó el sobrenadante y se concentró mediante un sistema de vacío SpeedVac. Las muestras se reconstituyeron en 0.3 mL de H2O 0.1 % ácido fórmico y se analizaron en una plataforma UPLC-QtoF-MS.

Tanto el análisis por RMN como por UPLC es un análisis rutinario para un experto en la materia y siempre que se empleen las mismas condiciones experimentales aquí descritas como por ejemplo el crecimiento de la cepa, mismo tipo de equipo, estándares...

A partir la concentración de Aes producidos por las cepas se calculó la cantidad de unidades formadoras de colonias (UFCs) de cada uno de los tres microorganismos que son necesarias ingerir diariamente para cubrir las necesidades de Aes de un adulto de 77 kg] (Tabla 6). El método para calcular la dosis diaria recomendada (DRI) se empleó el método descrito en Protein and amino acid requirements in human nutrition : joint FAO/WHO/UNU expert consultaron, 2007 (https://apps.who.int/iris/handle/10665/43411), concretamente a parir de los datos de la Tabla 23 de dicho informe. Los valores se calculan en base a la concentración de aminoácido detectado en el sobrenadante y al recuento de células viables a tiempo final de incubación (6h) para la misma muestra analizada. Se calcula cuanto aminoácido es producido por 1 CFU/1h y se extrapolan cuantas CFUs son necesarias para cubrir la DRI. Hay que tener en cuenta que en el caso de la fenilalanina y la tirosina, al igual que sucede con la metionina y la cisteína, se agrupan la DRI en un único valor, por tratarse de aminoácidos que se transforman fácilmente el uno en el otro.

Tabla 6. UFCs de S.salivariusnecesarias para cubrir las necesidades diarias de aminoácidos esenciales de un adulto de 77 kq.

Como se puede observar en la Tabla 6, la cepa de S.salivariusCDWN00921 es la que produce una mayor cantidad de Aes y por lo tanto se requiere de una menor dosis microrganismos para cubrir las necesidades diarias.

2. Ensayo de tolerancia al flúor: evaluación del crecimiento de las cepas de Streptococcus salivarius CDWN00916, CDWN00918, CDWN00921, y las cepas de referencia M18 y K12 en presencia de concentraciones crecientes de fluoruro de sodio (NaF)

En este ensayo, se evaluó la resistencia de las cepas bacterianas al fluoruro de sodio (NaF), un componente común en las pastas dentales utilizado para prevenir las caries. La capacidad de estas cepas para resistir el NaF les otorga una ventaja significativa al aumentar su tolerancia a los procedimientos de higiene bucal, lo que, a su vez, les permite colonizar la cavidad oral de manera más efectiva y prolongada. Este beneficio se refleja en la reducción potencial de la cantidad de cepas probióticas necesarias para su administración y/o en la disminución de la frecuencia de administración requerida.

Curvas de crecimiento y cálculo de la concentración mínima inhibitoria (MIC):

Las cepas se sembraron desde stock glicerinado en placas de BHI(Brain Heart Infusión Broth)(Oxoid) y se incubaron en aerobiosis a 37 °C durante 3 días, tras lo cual se procedió a inocular 10 ml de pre-cultivo líquido de BHI (Oxoid) con 1 UFC, incubado en estático y a 37 °C en aerobiosisovernight.Al día siguiente se midió la OD600 del pre cultivo se ajustó el inóculo a una OD600 inicial de 0,1 en BHI. Se prepararon soluciones de NaF (Sigma) correspondientes a 2000, 1000, 500 y 250 ppm en medio BHI. En una placa estéril de 96 pocillos de fondo plano se distribuyeron en duplicado, según el diseño experimental, 100 pl de cultivo y 100 pl del medio correspondiente, dando como resultado una OD600 inicial del cultivo de 0,05 y concentraciones de NaF de 1000, 500, 250, 125 y 0 ppm. Se incubó la placa en un lector de microplacas TECAN infinite® M Plex a 37 °Cy se tomaron lecturas de absorbancia a 600 nm cada 30 min hasta que los cultivos de forma generalizada alcanzaron la fase estacionaria a las 6.5 horas (Fig. 4) siguiendo un protocolo habitual en el área. Para el cálculo de la concentración mínima inhibitoria (MIC) se representaron los valores de absorbancia a las 6h para cada concentración testada de NaF (Fig. 5).

Estos datos confirman que las cepas de la presente invención (CDWN00916, CDWN00918 y CDWN00921) exhiben una notable resistencia al NaF, en contraste con las cepas convencionales del estado de la técnica (M18 y K12). Esto se traduce en una tasa de crecimiento sustancialmente mayor en presencia de flúor. Este aumento del crecimiento bacteriano se manifiesta incluso a concentraciones normales de exposición al flúor en la cavidad oral, como las que se encuentran en las pastas de dientes. Por el contrario, las cepas del estado de la técnica muestran un crecimiento más lento o incluso son incapaces de desarrollarse en estas condiciones. La concentración habitual en pastas de dientes de adultos es de 1500 ppm, la saliva produce un efecto de dilución de 1/3 a 1/4 aproximadamente, lo que resulta en 500 ppm- 375 ppm aproximadamente, concentración a la que las cepas de la invención todavía crecen mientras que ese es el valor de CMI para las cepas del estado de la técnica M18 y K12. Fig. 5

En consecuencia, se puede concluir que las cepas incluidas en la patente, CDWN00916, CDWN00918 y CDWN00921, presentan una mayor tolerancia al NaF en comparación con las cepas de referencia, facilitando su viabilidad en la cavidad oral humana.

3. Evaluación de actividad antimicrobiana de las cepas de Streptococcus salivarius CDWN00916, CDWN00918 y CDWN00921, y las cepas de referencia M18 y K12

Una característica beneficiosa en los microorganismos probióticos orales es su capacidad para producir biomoléculas con propiedades antimicrobianas, capaces de inhibir el desarrollo de microorganismos patógenos, entre los cuales se incluyen aquellos que desempeñan un papel crucial en la formación de caries, como, por ejemplo,Streptococcus mutans.La cepa de referencia M18 es un probiótico que produce bacteriocinas que actúan contra la bacteria cariogénica S.mutans.Además, produce enzimas dextranasas y ureasas, que ayudan a reducir la acumulación de placa dental y la acidificación.

En este contexto, se evaluó la capacidad de las cepas de la presente invención para presentar una capacidad de inhibición de patógenos orales igual o superior a la observada en las cepas de referencia del estado de la técnica.

Para llevar a cabo el estudio, se empleó un ensayo de inhibición del crecimiento en microplaca tal y como se describió en López-López A, Camelo-Castillo A, Ferrer MD, Simon-Soro Á, Mira A. Health-Associated Niche Inhabitants as Oral Probiotics: The Case of Streptococcus dentisani. Front Microbiol. 2017 Mar 10;8:379. Doi: 10.3389/fmicb.2017.00379. PMID: 28344574; PMCID: PMC5344910., que permite evaluar la capacidad de los sobrenadantes de las cepas para inhibir a la cepa patógena S.mutans CECT479(Figura 6).

Las cepas de la invención y la cepa de S.salivariusM18, se crecieron hasta fase estacionaria en BHI y se centrifugaron los cultivos a 4000 rpm 4 min a 4°C. El sobrenadante se pasó por un filtro de 0,2 pm y a continuación se procedió a concentrarlo en un rotavapor IKA RV8 a 10x. Se esterilizó el sobrenadante concentrado mediante filtración de 0,2 pm. A continuación se creció S.mutansCECT 479 (Cepa tipo) hasta fase estacionaria en BHI tras lo que se ajustó una OD600 inicial de 0.125 en medio BHI fresco. En una microplaca de 96 pocillos se distribuyeron 160 pl del cultivo/pocillo, a los que se añadieron 40 pl de sobrenadante concentrado 10x o BHI concentrado 10x a modo control, dando lugar a una O.D600 inicial del cultivo de 0.1 y una concentración final de los sobrenadantes y BHI de 2x en los pocillos correspondientes. Se procedió a medir la absorbancia del cultivo a 600 nm en un lector de placas TECAN Infinite® 200 PRO. Cada condición se ensayó en triplicado y las mediciones se realizaron cada 30 min durante 16h a 37°C.

Los resultados mostraron que la capacidad de inhibición de las tres cepas objeto de la presente invención es similar a la que presenta la cepa de referencia del estado de la técnica.

4. Evaluación de la actividad acidogénica de las cepas de Streptococcus salivarius CDWN00916, CDWN00918 y CDWN00921, y las cepas de referencia M18 y K12

El objetivo de este experimento fue cuantificar la actividad acidogénica de las cepas deStreptococcus salivariusde la invención utilizando azúcares típicamente consumidos en la dieta, en concreto sacarosa, dextrosa y celobiosa, en comparación de las cepas de referenciade Streptococcus salivariusM18 y K12. La actividad acidogénica de las bacterias no es deseable, ya que promueve el desarrollo de caries dentales.

Para evaluar la actividad acidogénica las cepas se crecieron en un medio de cultivo óptimo para el crecimiento deStreptococcus salivarius(medio MRS) al que se le añadió un azúcar al 0.2% (p/v) como única fuente de carbono y energía. Se ensayaron tres azúcares típicamente consumidos en la dieta, sacarosa, dextrosa y celobiosa. Por consiguiente, en total se prepararon tres variantes del medio, uno con cada tipo de azúcar ensayado.

Cada una de las cepas deStreptococcus salivariusde la invención se inoculó en cada uno de los tres medios MRS a una concentración final de inóculo equivalente a una OD600 de 0.1. La dinámica de crecimiento de las cepas con cada uno de los diferentes azúcares se evaluó midiendo la OD600 a intervalos de 30 minutos durante 24 horas (Figuras 7-9).

La actividad acidogénica de los microorganismos se evaluó cuantificando el pH de los medios de cultivo tras crecer las cepas bacterianas a 37 °C, en condiciones aerobias, en estático durante 48 horas. Para la medida del pH se utilizó el pH-metro PL-700PV.

Cada medida se obtuvo por duplicado. Además, se cuantificó la producción de ácido láctico de cada microorganismo en los tres medios de cultivo con el analizador Y15 (Biosystems) utilizando los Kits Multical (Ref 12818) y L-lactic Acid (Ref 12802) de BioSystems. La producción de ácido láctico en los medios de cultivo refleja el metabolismo fermentativo de los microorganismos. Tras cultivar a los microorganismos a 37 °C en estático durante 48 horas, se centrifugaron a 4700 rpm durante 3 minutos en una centrífuga Eppendorf Centrifuge 5910R, filtrando el sobrenadante con filtros de nitrocelulosa con un tamaño de poro de 0,2 pm previamente a la medición con el analizador Y15. Como control negativo se ensayó el medio de cultivo suplementado con el correspondiente azúcar y sin ningún microorganismo inoculado.

Entre las tres cepas deStreptococcus salivariusobjeto de la invención, la cepa CDWN00921 presenta el menor tiempo de generación, indistintamente del azúcar, alcanzando la fase estacionaria en menos tiempo que las demás. Por el contrario, la cepa CDWN00918 muestra el mayor tiempo de generación, sin embargo, alcanza una densidad celular equiparable a la de la cepa CDWN00921 en la fase estacionaria. La cepa CDWN00916 es la que alcanza la menor densidad celular tras el crecimiento (Figuras 7-9).

La cepa CDWN00918 es la que produce una menor acidificación del medio y menor cantidad de ácido láctico en comparación con las otras cepas deStreptococcus salivariusensayadas, incluyendo las cepas del estado de la técnica M18 y K12 (ver Tabla 4). Las cepas CDWN00916 y CDWN00921 tienen valores de acidificación y de producción de ácido láctico similares a los de las cepas del estado de la técnica utilizando los azúcares sacarosa y dextrosa. No obstante, con celobiosa, la cepa CDWN00916 presenta valores comparables a los de la cepa CDWN00918 y, por lo tanto, superiores a los de las cepas del estado de la técnica. Como es de esperar, se observa una correlación positiva entre el valor de pH del medio después del crecimiento y la concentración de ácido láctico producida. Estos resultados indican que la cepa CDWN00918 es menos acidogénica que las cepas del estado de la técnica y, por consiguiente, las que menos favorecen el crecimiento de bacterias patógenas implicadas en procesos cariogénicos, sin importar el azúcar que se prueba. En el caso de la celobiosa, la CDWN00916 también muestra una actividad acidogénica inferior a la de las del estado de la técnica (ver Tablas 4 y 5).

Tabla 4. Valores de acidificación (pH) de los medios tras 48h de incubación en los medios de cultivo con cada uno de los azucares

valores medios y su correspondiente desviación estándar (n=3).

Tabla 5. Valores de concentración de ácido láctico (g/l) producido por los microorganismos con cada uno de los azúcares ensayados tras 48h de incubación.

valores medios y su correspondiente desviación estándar (n=3).

5. Comparación entre los genomas de las cepas de la invención CDWN00916, CDWN00918 y CDWN00931 y la cepa NCTC 8618

Los genomas de las cepas CDWN00916 (Genbank ID JAXKQD000000000), CDWN00918 (Genbank ID JAXKQE000000000), CDWN00921 (Genbank ID JAXKLG000000000) y NCTC 8618 (ENA ID. LR134274.1), se anotaron con el servicio de Anotación del Genomas disponible BV-BRC (Olson, R. D., Assaf, R., Brettin, T., Conrad, N., Cucinell, C., Davis, J. J., ... & Stevens, R. L. (2023). Introducing the bacterial and viral bioinformatics resource center (BV-BRC): a resource combining PATRIC, IRD and ViPR. Nucleicacids research, 51(D1), D678-D689), utilizando la herramienta RAST (RASTtk) [Aziz, R. K. et al. The RAST Server: rapid annotations using subsystems technology. BMC genomics 9, 75 (2008)]. Posteriormente se analizó el pangenoma de las cepas utilizando la herramienta disponible en BV-BRCThe Protein Family Sorter (PFS)seleccionando la opciónPATRIC genus-specific families (PLfams).

se observó que los genes beta-galactosidasa (EC 3.2.1.23; PLF_1301_00011912) y permeasa lactosa/ galactosa (PLF_1301_00015661) están presentes en las tres cepas de la invención, pero ausentes en la cepa de referencia. Sorprendentemente, estos resultados sugieren una posible ventaja adicional de las cepas de la invención que es la mejora en la digestión de leche y productos lácteos lo que ayudaría a personas intolerantes a la lactosa.

Listado de secuencias

SEQ ID NO: 1Secuencia del gen ribosomal del 16S rRNA de la cepa CDWN00916

SEQ ID NO: 2Secuencia del gen ribosomal del 16S rRNA de la cepa CDWN00918

SEQ ID NO: 3Secuencia del gen ribosomal del 16S rRNA de la cepa CDWN00921

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una cepa probiótica oral deStreptococcus salivariusque:

2. La cepa según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que presenta una o más propiedades de probiótico oral seleccionadas entre: producción de aminoácidos esenciales y actividad antimicrobiana.

3. La cepa según la reivindicación anterior, en la que los aminoácidos esenciales se seleccionan entre uno o más de los siguientes: histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptófano y valina.

4. La cepa según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la resistencia al flúor comprende una CMI de al menos 550 ppm de ion flúor.

5. La cepa según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que se obtiene a partir de una muestra de tejido respiratorio u oral de un sujeto humano.

6. La cepa según la reivindicación anterior, en el que el sujeto no tiene una patología que afecten el uso probiótico de la cepa, por ejemplo, una patología inflamatoria.

7. La cepa deStreptococcus salivariussegún una cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 6, depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con número CECT 30899 o cepas derivadas de la misma, en donde dichas cepas derivadas tienen las mismas o inferiores propiedades de probiótico oral, que la cepa CECT 30899.

8. La cepa deStreptococcus salivariussegún una cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 6, depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con número CECT 30898 o cepas derivadas de la misma, en donde dichas cepas derivadas tienen las mismas o inferiores propiedades de probiótico oral, que la cepa CECT 30898.

9. La cepa deStreptococcus salivariussegún una cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 6, depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con número CECT 30900 o cepas derivadas de la misma, en donde dichas cepas derivadas tienen las mismas o inferiores propiedades de probiótico oral, que la cepa CECT 30900.

10. Un extracto activo obtenido a partir de una o más de las cepas definidas en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

11. Una formulación probiótica de administración oral que comprende una o más de las cepas definidas en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y/o el extracto activo de la reivindicación anterior.

12. La formulación según la reivindicación anterior que comprende:

al menos un agente activo.

13. La formulación según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores 11 a 12 donde el agente activo es al menos otra cepa diferente definida según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y/u otra cepa de S.salivarius.

14. La formulación según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores 11 a 13 que comprende la cepa deS. salivariusCECT 30898 y CECT 30900.

15. La formulación según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores 11 a 14, que se incluye en un alimento, bebida y/o nutracéutico.

16. La formulación según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores11 a 15, que comprende aproximadamente de 105 a 1012, preferiblemente 108 a 1010 UFC de una o más de las cepas definidas en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

17. La formulación según la reivindicación anterior, que comprende una concentración adecuada de UFCs a para obtener la cantidad necesaria de aminoácidos esenciales diarios para un sujeto.

18. Uso de una o más de las cepas definidas en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y/o la formulación definida en una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17 para la producción de aminoácidos esenciales

19. El uso según la reivindicación anterior, donde la producción de aminoácidos esenciales comprende la cantidad necesaria diaria de un sujeto.

20. Una cepa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o un extracto activo según la reivindicación 10, o una formulación según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17 para su uso en la prevención o tratamiento de una patología oral.

21. La cepa para su uso, según la reivindicación anterior, donde la patología oral se selecciona entre caries dental y enfermedad periodontal

22. La cepa para su uso, según la reivindicación anterior donde la caries dental está provocada al menos en parte por S.mutans.

23. Una cepa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o un extracto activo según la reivindicación 10, o una formulación según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17 para su uso en la prevención o tratamiento de la disbiosis o desequilibrio de la microbiota oral, incluyendo caries, periodontitis y halitosis.