MX2008011867A - Complemento nutrimental para medio de fermentacion alcoholica. - Google Patents

Abstract

La presente invención describe un complemento nutrimental para el medio de fermentación alcohólica a partir de primeras materias glucídicas, particularmente amiladas, que comprenden, y de preferencia que están constituidas, por un principio activo que proviene de una fermentación con un moho. Puede estar bajo la forma líquida o sólida.

Description

COMPLEMENTO NUTRIMENTAL PARA MEDIO DE FERMENTACION ALCOHOLICA DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con un complemento nutrimental que favorece la producción industrial de etanol por fermentación alcohólica siguiendo particularmente un procedimiento de sacarificación-fermentación simultáneas, a partir de una primera materia glucídica fermentable en etanol, particularmente después de sacarificación, tal como un primer materia amilada, en particular de cereales, particularmente el trigo, y de subproductos (cebadas, salvado) . La invención se relaciona igualmente con cebadas que proceden de este procedimiento y con un procedimiento de fabricación de levadura en aerobiosis. Se conoce producir etanol a partir de una primera materia amilada por un procedimiento enzimático que comprende una etapa de licuefacción del almidón para una alfa-amilasa que consiste en solubilizar e hidrolizar el almidón en dextrinas . Esta etapa es seguida clásicamente de una etapa de sacarificación por una glucoamilasa , llamada de esta manera amiloglucosidasa, que consiste en hidrolizar las dextrinas en glucosa. De esta manera, la cantidad de glucosa en final de la sacarificación es sensiblemente de 100% del equivalente de glucosa que corresponde al almidón de la materia amilada. Dicho de otra manera, todo el potencial en glucosa de la REF. : 196632 materia amilada usada se ha transformado en glucosa. La glucosa se fermenta de esta manera en el transcurso de una etapa de fermentación durante la cual se transforma en etanol por una levadura en las condiciones anaerobias. Un eje de investigación para mejorar este tipo de procedimiento enzimático consistió en intentar fusionar las etapas de fermentación y de sacarificación. De esta manera, los investigadores han probado realizar la fermentación y la sacarificación simultáneamente en el transcurso de una etapa única llamada "sacarificación-fermentación", en inglés "sacarificación y fermentación simultánea" o SSF. La cantidad de glucosa del medio al inicio de esta etapa única, es decir a la salida de la licuefacción, es, de esta manera, típicamente inferior a 3% del equivalente en glucosa que corresponde al almidón de la materia amilada. Igualmente, se han efectuado pruebas para limitar la duración de la etapa de sacarificación, de manera que la cantidad de glucosa a la salida de esta etapa sea inferior a 100% del equivalente de glucosa que corresponde al almidón de la materia amilada. De esta manera, la etapa de sacarificación es calificada de "pre-sacarificación" o de "sacarificación parcial". Como se verá más en detalle en la siguiente descripción, los procedimientos de fabricación de etanol que comprenden una etapa de sacarificación incompleta, ver el paso de la etapa de sacarificación, a continuación llamadas "procedimientos de sacarificación incompleta", implican obstáculos específicos. De esta manera, las soluciones técnicas adoptadas en el marco de los procedimientos convencionales con la sacarificación completa antes de la fermentación no pueden usarse a priori con estos procedimientos . En el marco de los procedimientos de sacarificación incompleta, se llama "medio de sacarificación-fermentación", un medio en donde se efectúa la fermentación y por lo menos una parte de la sacarificación. Existe una necesidad permanente de mejorar el rendimiento en etanol de los procedimientos de producción de etanol, particularmente de sacarificación incompleta. La presente invención tiene por objetivo responder a tal necesidad . De acuerdo con la invención, se logra este objetivo por medio de un complemento nutrimental por medio de sacarificación-fermentación en un procedimiento de fabricación de etanol para la fermentación a partir de una primer materia amilada que comprende, y de preferencia siendo constituido, por un principio activo que procede de una fermentación con un moho. Puede estar bajo la forma líquida o sólida . Como se verá más en detalle en la siguiente descripción, A la presencia de tal complemento nutrimental en un medio de sacarificación-fermentación se demuestra particularmente ventajosa por el crecimiento y la eficacia de la levadura. Resultó de un mejoramiento significativo del rendimiento del procedimiento de fabricación del etanol a partir de una primer materia amilada. De preferencia, el procedimiento de acuerdo con la invención comprende una, de preferencia aún más, de las siguientes características opcionales: - El complemento nutrimental es una mezcla, sólida o líquida, del principio activo y de por lo menos una enzima útil. La noción de enzima útil incluye particularmente una o enzimas que tienen una actividad enzimática, particularmente glucoamilásica , proteolítica o xilanásica y sus combinaciones. El principio activo presente en el complemento nutrimental de acuerdo con la invención está bajo la forma bruta, es decir, que comprende el sustrato desarrollado durante la fermentación con el moho, o extraído, es decir, que se aisla del sustrato. A menudo está en mezcla con enzimas adicionales. De preferencia, el sustrato es un salvado de trigo. - El principio activo se elige del grupo formado por ergosterol, N-acetilglucosamina , vitaminas, en particular vitamina B, ácidos nucleicos, ácidos aminados y, de preferencia, sus mezclas. Entre los ácidos aminados, se visualizan particularmente uno o varios, de preferencia el conjunto de los siguientes ácidos aminados: alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, valina, leucina, ácido glutámico. Entre las vitaminas, no observa la presencia de diferentes vitaminas B, por ejemplo, Bl, B2, B3, B6 e inositol, de la vitamina E, entre otras. El complemento nutrimental presente, durante su introducción en el medio de sacarificación-fermentación, particularmente a causa de una elección apropiada del moho, las siguientes actividades enzimáticas: glucoamilásica : por lo menos 500 UG, de preferencia 750 UG, de preferencia incluso 1500 UG por gramo de materia seca y/o de preferencia, · proteolitica : por lo menos 100 UP, de preferencia por lo menos 400 UP por gramo de materia seca y/o de preferencia, • xilanásica: por lo menos 100 UX, de preferencia por lo menos 400 UX por gramo de materia seca. El complemento nutrimental resulta de una fermentación, de preferencia en medio sólido, de un sustrato, de preferencia un salvado de trigo, con un moho, elegido particularmente entre las cepas de Aspergillus niger, de preferencia elegido entre las cepas ATCC 201202, ATCC 76060, ATCC 76061, MUCL 28815, MUCL 28816, NRRL 3112 o entre las cepas de Aspergillus orizae, elegido de preferencia entre las cepas ATCC 22788 y ATCC 42149. - El complemento nutrimental se obtiene por medio de un procedimiento de acuerdo con la invención que comprende las siguientes etapas: i) colocar salvado de trigo, ii) humidificar, acidificar a un pH comprendido entre 4 y 5, de preferencia con ácido nítrico (HN03) y tratar térmicamente el salvado de manera que se pasteuriza o esteriliza, siendo el tratamiento térmico de preferencia posterior a la humidificación, iii) inocular el salvado de trigo que resulta por una cepa de Aspergillus niger, elegida entre ATCC 201202, ATCC 76060, ATCC 76061, MUCL 28815, MUCL 28816, NRRL 3112 o entre las cepas de Aspergillus orizae, elegido entre ATCC 22788 y ATCC 42149. iv) hacer fermentar el salvado de trigo en el estado sólido en un reactor agitado periódicamente, a una temperatura de 28°C a 38°C, siendo la cantidad de humedad mantenida entre 45% y 65%, de preferencia entre 50% y 60% en peso, en las condiciones de aireación apropiadas para evitar una acumulación de dióxido de carbono permanente en el seno del salvado de trigo, hasta que el producto de fermentación presente los siguientes valores mínimos de actividades enzimáticas : · glucoamilásica : por lo menos 500 UG, de preferencia 720 UG, de preferencia incluso 1500 UG por gramo de materia seca y, de preferencia, • proteolitica : por lo menos 100 UP, de preferencia 400 UP por gramo de materia seca, ¦ xilanásica: por lo menos 100 UX, de preferencia 300 UX por gramo de materia seca. El complemento nutrimental es un complejo enzimático obtenido siguiendo un procedimiento descrito en US 2002 037342. La invención se relaciona igualmente con un procedimiento de fabricación de etanol a partir de una materia glucidica, particularmente amilada, que comprende, después de una etapa de licuefacción, una etapa de sacarificación después de una etapa de fermentación, o después de una etapa de licuefacción y a menudo de una etapa de pre-sacarificación, una etapa de sacarificación-fermentación en un medio de sacarificación-fermentación cuya cantidad de glucosa al inicio de la etapa de sacarificación-fermentación es a lo más igual a 95% del equivalente de glucosa que corresponde a la materia glucidica, particularmente de almidón de la materia amilada. El procedimiento de acuerdo con la invención es distinguible porque introduce en el medio de fermentación o de sacarificación-fermentación un complemento nutrimental de acuerdo con la invención. Esta introducción puede efectuarse directamente en el medio de fermentación o de sacarificación-fermentación o durante una etapa hacia arriba. De manera sorprendente, la presencia, en el medio de fermentación o de sacarificación-fermentación, de un complemento nutrimental de acuerdo con la invención, y en particular de un salvado de trigo fermentado con un moho, se demuestra particularmente favorable para aumentar la eficacia de la levadura. De esta manera, esta transforma una cantidad más importante de glucosa en etanol con una cinética más favorable. De preferencia, el procedimiento de acuerdo con la invención comprende una, y de preferencia aún más, de las siguientes características opcionales: La cantidad de glucosa al inicio de la etapa de sacarificación-fermentación es a lo más igual a 3%, de preferencia a 2%, de preferencia aún a lo más igual a 1%, del equivalente en glucosa que corresponde al almidón de la materia amilada. Dicho de otra manera, el procedimiento no comprende ni la etapa de sacarificación ni la etapa de pre-sacarificación. - El complemento nutrimental se introduce bajo la forma bruta, la cantidad del complemento nutrimental es superior o igual a 4 kg de materia seca, de preferencia de 14 kg de materia seca y/o inferior o igual a 60 kg de materia seca, de preferencia de 34 kg de materia seca, aún de preferencia inferior a 19 kg de materia seca por tonelada de almidón, de preferencia, aproximadamente 17 kg de materia seca por tonelada de almidón. - El complemento nutrimental se prepara por fermentación de un sustrato idéntico a la materia glucidica a la que se aplica el procedimiento de fabricación de etanol. La etapa de sacarificación-fermentación se realiza completamente en ausencia de un aporte de aire o de oxigeno (no de la fase aerobia propiamente dicho) . - La etapa de sacarificación-fermentación comprende una fase inicial aerobia. - Una levadura se usa como un agente de fermentación etanólica, particularmente una levadura del género Saccharomyces, en particular Saccharomyces cerevisiae . Más preferentemente, la levadura es funcional a concentraciones en etanol superiores a 95 g/1. - Durante el procedimiento, el complemento nutrimental constituye la principal fuente nutrimental para la levadura y/o la principal fuente de ergosterol y/o la principal fuente de nitrógeno y/o de ácidos aminados y/o de fósforo y/o de azufre y/o de vitaminas. De preferencia, constituye la única fuente de ergosterol y/o de nitrógeno y/o de ácidos aminados y/o de fósforo y/o de azufre y/o de vitaminas. El procedimiento de acuerdo con la invención permite aún fabricar cebadas de una calidad nutrimental remarcable. De esta manera, la invención se relaciona con cebadas que proceden de un procedimiento de fabricación de etanol de acuerdo con la invención y que comprende más de 5 g, de preferencia más de 20 g y/o menos de 100 g, de preferencia menos de 35 g, aún de preferencia de aproximadamente 30 g de ergosterol por tonelada de materias secas de cebadas. De preferencia, las cebadas comprenden aún más de 40%, de preferencia más de 50% de proteínas brutas, en porcentajes sobre la base de la materia seca. Como se verá en la siguiente descripción, tales cantidades en proteínas se hacen posibles por el consumo de una parte de las hemicelulosas y las fibras en el transcurso de la pre-fermentación o de la sacarificación-fermentación . Por último, la invención se relaciona de una manera general, con el uso de un complemento nutrimental de acuerdo con la invención para favorecer una fermentación alcohólica destinada para la fabricación de etanol o de una pre-fermentación destinada para la fabricación de una levadura. Otras características y ventajas de la presente invención aparecerán incluso a la claridad de la descripción que va a seguir y del examen de la figura anexa en donde la figura 1 representa un esquema de una parte de un procedimiento de fabricación de etanol de acuerdo con la invención . Los procedimientos de fabricación del etanol por fermentación de materias glucidicas, particularmente amilada, son bien conocidos por el hombre experimentado, y podrían ser adaptados para llegar a estar de acuerdo con la invención. De esta manera, la persona experimentada precisa, siendo el caso, algunos puntos de la siguiente descripción. El procedimiento descrito a continuación se relaciona con la fabricación de etanol a partir de trigo, pero puede aplicarse a cualquier tipo de materia amilada, en particular a cualquier extracto de cereales. De esta manera, las modalidades de realización descritas a continuación son sólo ejemplos y se podrían modificar, particularmente por sustitución de equivalentes técnicos, sin apartarse del marco de la invención. Un procedimiento de fabricación de etanol de trigo de acuerdo con la invención puede, a manera de ejemplo, comprender las siguientes etapas: a) una etapa de acondicionamiento de un trigo de manera que se prepara una molienda de almidón de trigo. b) una etapa de licuefacción del almidón, en particular en presencia de una alfa-amilasa, de manera que se hidroliza el almidón en dextrinas, c) opcionalmente una etapa de pre-sacarificación, en particular por un conjunto de enzimas, de manera que se hidrolizan las dextrinas en azúcares fermentables (glucosa, maltosa, matotriosa) y los constituyentes no amilados y d) una etapa de sacarificación-fermentación, en un medio ' de sacarificación-fermentación que contiene las dextrinas y/o los azúcares fermentables y una levadura, de manera que se produce etanol. Estas diferentes etapas se representan sobre la figura 1. La etapa a) consiste en preparar una molienda de almidón de trigo, por ejemplo, una harina, por acondicionamiento del trigo . La harina de trigo se mezcla de esta forma en un mezclador con agua, opcionalmente vinaza, ácido y una enzima de licuefacción, de manera que se forma un "mosto pastoso". El mosto pastoso contiene típicamente de 25 a 35% en masa de materias secas, de preferencia de 30 a 35%. El porcentaje de materias secas se determina para limitar las reservas energéticas conservando una fluidez satisfactoria. Por preocupación económica, el porcentaje de materia seca es el más elevado posible con el fin de limitar los costos de evaporación de las vinazas en la sucesión del procedimiento. La cantidad de harina aportada al mezclador se regula ya sea por un dosificador o por una banda pesada. De acuerdo con la enzima de licuefacción usada, el pH debe ajustarse con una solución de ácido, por ejemplo, ácido sulfúrico. De acuerdo con las enzimas usadas, clásicamente de las alfa-amilasas bacterianas, particularmente termoestables, una sal de calcio puede emplearse eventualmente. El caudal de ácido se regula por medio de una sonda de pH instalada sobre la mezcla de agua/vinazas antes del empastador. El pH puede variar de forma clásica entre 5 y 6.5, de acuerdo con las enzimas usadas. La licuefacción (etapa b) se realiza de esta manera a una temperatura comprendida entre 80°C y 95°C. El mosto empastado puede ser portado a esta temperatura por la vía de una inyección directa de vapor en el recipiente de licuefacción por tuberías o por un coquizador de chorro (jet-cooker) . En el segundo caso, el mosto empastado se porta durante algunos segundos a una temperatura comprendida entre 100°C y 150°C por medio de una inyección de vapor en una tubería antes de ser enfriado rápidamente entre 80°C y 95°C. Los recipientes de licuefacción pueden ser agitados. Las características preferidas de la etapa de licuefacción son las siguientes: • Temperatura: 80°C a 95°C • pH: 5.5-6.5 · Materia seca: 30% a 35% • Tiempo de residencia: 30 minutos a 2 horas. La etapa b) conduce a la hidrólisis del almidón en dextrinas . En caso de pre-sacarificación (etapa c) ) , el mosto licuado se enfría en los intercambiadores térmicos de tipo intercambiadores de placas o intercambiadores tubulares a una temperatura comprendida entre 50°C y 60°C. En algunos casos, una dilución del mosto licuado puede efectuarse con un diluyente tal como agua o vinazas de reciclado o las flegmasas que provienen de la destilería. En la etapa c) , etapa opcional, el mosto licuado se pone de preferencia en presencia de un complejo enzimático que presenta las actividades enzimáticas deseadas. Las cantidades de las enzimas de preferencia se sujetan al inicio del mosto entrante, a la concentración de glucosa producida y a la cantidad en almidón restante. El objetivo de esta sujeción es preparar una solución desprovista de almidón al final de la fermentación. Las características preferidas de la etapa c) de pre-sacarificación son las siguientes: - Temperatura: 50° a 60°C - pH: 4 a 5 Tiempo de residencia: hasta la obtención de la cantidad de glucosa buscada, en general inferior a 24 h. Los recipientes de pre-sacarificación se someten a una agitación mecánica que permite una buena homogeneización del mosto con el transcurso de la sacarificación y por sí misma, una puesta en contacto facilitada entre las enzimas y las dextrinas a hidrolizar. El uso del complejo enzimático que proviene de la fermentación de salvado de trigo por un moho permite de manera ventajosa reducir la viscosidad del mosto sacarificado y aumentar la concentración de nitrógeno en el mosto. De acuerdo con la invención, la sacarificación no se pretende hasta la hidrólisis total de las dextrinas en glucosa, pero se interrumpe mientras la hidrólisis es sólo parcial. De acuerdo con la invención, la tasa de glucosa al final de la etapa de pre-sacarificación es inferior de 95%, de preferencia inferior de 50%, aún de preferencia inferior a 5%. De esta manera, la hidrólisis se persigue durante la etapa de sacarificación-fermentación. Si el procedimiento de acuerdo con la invención no comprende una etapa de sacarificación parcial, o "pre-sacarificación" , la cantidad de glucosa al inicio de la etapa d) de sacarificación-fermentación es a lo más igual a 3%, de preferencia de 2%, aún de preferencia a lo más igual a 1%, del equivalente de glucosa que corresponde al almidón de la materia amilada. En la etapa d) , el mosto se pone en presencia de una levadura en el medio de sacarificación-fermentación. Se pone también en presencia de un complemento nutrimental de acuerdo con la invención. El orden de incorporación de la levadura y del complemento no tiene importancia . La mezcla se agita durante todo el conducto de la etapa d) . Todas las levaduras usadas para la producción de etanol pueden usarse, en particular las levaduras del género Saccharomyces . Habitualraente , la levadura se introduce en el medio de sacarificación-fermentación en las condiciones aerobias. Durante esta fase, la levadura lleva a cabo un cierto número de divisiones celulares. De esta manera, la levadura no transforma la glucosa en etanol, sino al contrario consume glucosa para su crecimiento. Para mejorar este crecimiento celular, se conoce aportar al medio de sacarificación-fermentación complementos nutrimentales. Además, con el propósito de limitar el crecimiento celular, cuyo consumo de glucosa aferente disminuye el rendimiento de producción de etanol, es preferible sembrar el medio de sacarificación-fermentación con una cantidad de levadura, tal que la producción de etanol por las levaduras permite obtener rápidamente concentraciones de etanol en el medio de cultivo que se oponen al crecimiento celular de la levadura. Siguiendo una primera modalidad, la etapa d) comienza en aerobiosa el tiempo necesario para una multiplicación suficiente de la levadura. El medio de sacarificación-fermentación se coloca después bajo condiciones anaerobias. La levadura transforma de esta manera la glucosa en etanol. Siguiendo una segunda modalidad, la etapa d) se realiza completamente en aerobiosa. La presencia del complemento nutrimental de acuerdo con la invención permite pasar de la fase inicial aerobia. Las características preferidas de la etapa d) se sacarificación-fermentación son las siguientes: - Temperatura: de 30°C a 35°C - pH : ajustado al comienzo de la etapa d) con ácido (por ejemplo, ácido sulfúrico) entre aproximadamente 3.5 y aproximadamente 5, de preferencia entre aproximadamente 3.8 y aproximadamente 5, de preferencia aún entre aproximadamente 4 y aproximadamente 5, mejor aún entre aproximadamente 4 y aproximadamente 4.5. - Después del ajuste del pH al inicio de la etapa d) , gracias al efecto amortiguador del complemento nutrimental, no se prevee la regulación del pH durante la continuación de la etapa d) . inoculo de levadura: aproximadamente 106 a aproximadamente 5.108 UFC de levadura (unidades de formación de colonias) por mL de medio de sacarificación-fermentación, de preferencia aproximadamente 107 UFC de levadura por mL de medio de sacarificación-fermentación. - 20% a 35%, particularmente 20% a 30% de S Tiempo de residencia: 20 horas a 72 horas, particularmente 20 horas a 60 horas. El tiempo de residencia aumenta con la MS .

El medio de sacarificación-fermentación de acuerdo con la invención contiene un complemento nutrimental de acuerdo con la invención. Este complemento puede introducirse directamente en el medio de sacarificación-fermentación o durante una etapa antes. De manera sorprendente, la adición en el medio de sacarificación-fermentación de tal complemento nutrimental, particularmente de un salvado de trigo fermentado con un moho, se presenta particularmente favorable para aumentar la eficacia de la levadura. Esta transforma asi una cantidad más importante de glucosa en etanol con una cinética más favorable. Además, el complemento nutrimental de acuerdo con la invención permite reducir la duración de la fase aerobia al inicio de la etapa de sacarificación-fermentación, incluso suprimirla. De manera ventajosa, se mejora el rendimiento. Ventajosamente aún, el complemento nutrimental de acuerdo con la invención permite disminuir la muerte celular con relación a un cultivo idéntico llevado a cabo en ausencia del complemento nutrimental. Por último, su presencia tiene un efecto amortiguador que evita tener que regular el pH. De acuerdo con la invención, de preferencia, el medio de sacarificación-fermentación contiene inicialmente, por 1,000 kg de almidón introducidos inicialmente, entre 2.5 y 35 kg de complemento nutrimental, particularmente salvado de trigo fermentado, en particular entre 8 y 10 kg de complemento nutrimental, particularmente salvado de trigo fermentado, por 1,000 kg de almidón. La presencia en el medio de sacarificación-fermentación del salvado de trigo fermentado permite, de esta manera, reducir considerablemente el tiempo de sacarificación-fermentación . Parecería que este complemento nutrimental aporta nutrimentos adaptados perfectamente a la levadura, en proporciones y bajo una forma óptima, en particular para los cultivos anaerobios. Sin ser apoyados por una teoría, los inventores explican estos resultados de la siguiente manera. Se descubre la presencia, en el complemento nutrimental usado de acuerdo con la invención, de ácidos aminados necesarios para la levadura. Estos ácidos aminados contribuirían de esta forma a la nutrición nitrogenada de la levadura de manera muy eficaz, particularmente mucho más eficaz que las simples sales de amonio usadas hasta aquí, reduciendo además la síntesis de subproductos fermentados tales como el glicerol y mejorando de hecho el rendimiento en etanol. La presencia de vitaminas en el complemento nutrimental de acuerdo con la invención permitiría de esta manera explicar una mejor eficacia de la levadura. Finalmente los inventores descubrieron que el complemento nutrimental de acuerdo con la invención contiene ergosterol y N-acetilglucosamina, que son constituyentes importantes de la levadura. Su presencia en el medio de sacarificación-fermentación ayuda al crecimiento y a un buen funcionamiento de la levadura en aerobiosa completa. En estas condiciones, en efecto su síntesis es imposible por la levadura. La presencia de ergosterol permite ventajosamente reducir, incluso suprimir la fase aerobia al inicio de la sacarificación-fermentación . Sin embargo, las pruebas de la tabla 1 a continuación han demostrado que la adición de los nutrimentos identificados no conduce a un medio de sacarificación-fermentación, permitiendo así la adición de un complemento nutrimental de acuerdo con la invención. De esta manera, es esta combinación del conjunto de los constituyentes de este complemento nutrimental, en las proporciones que resultan de la fermentación con un moho, y de preferencia su presentación bajo la forma de un salvado de trigo, que son el origen de los desempeños excepcionales obtenidos. El complemento nutrimental no puede presentar actividades enzimáticas particulares o actividades enzimáticas óptimas. De esta manera, son necesarias las adiciones enzimáticas. Sin embargo, de preferencia, el complemento nutrimental de acuerdo con la invención presenta igualmente actividades enzimáticas útiles en el marco del procedimiento de fabricación del etanol. En particular, es preferible que el complemento nutrimental presente una actividad glucoamilásica superior a 500 UG por gramo de materia seca. Incluso, de preferencia, el complemento nutrimental presenta una actividad proteolitica superior a 100 UP por gramo de materia seca y/o una actividad xilanásica de por lo menos 100 UX por gramo de materia seca. De esta manera, aunque el uso de otras enzimas tales como las enzimas purificadas o los complejos de enzimas purificadas sea visualizable, es preferible, de acuerdo con la invención, usar un complemento nutrimental fermentado en las condiciones que permiten presentar las actividades enzimáticas. De preferencia, este completo nutrimental se introduce de esta manera en le etapa d) , y/o siendo el caso, en la etapa c) como complejo enzimático. De preferencia, el complemento nutrimental es un salvado de trigo fermentado preparado o susceptible de ser obtenido siguiendo el procedimiento de acuerdo con la siguiente invención : i) colocar salvado de trigo, i) colocar salvado de trigo, ii) humidificar y tratar térmicamente el salvado de manera que se pasteuriza o esteriliza, siendo el tratamiento térmico de preferencia posterior a la humidificación, iü) inocular el salvado de trigo que resulta por una cepa de Aspergillus niger, elegida entre ATCC 201202, ATCC 76060, ATCC 76061, MUCL 28815, MUCL 28816, NRRL 3112, de preferencia entre ATCC 76061 y NRRL 3112, de preferencia aún la cepa ATCC 76061 o entre las cepas de Aspergillus orizae ATCC 22788 y ATCC 42149. iv) hacer fermentar el salvado de trigo en el estado sólido, de preferencia bajo la forma de una capa de más de 10 cm de espesor, en un reactor agitado periódicamente, a una temperatura de 28 °C a 38 °C, siendo la cantidad en humedad mantenida entre 45% y 65%, de preferencia entre 50% y 60% en peso, en las condiciones de aireación apropiadas para evitar una acumulación permanente de dióxido de carbono en el seno del salvado de trigo, hasta que el producto de fermentación presente los siguientes valores de actividades enzimáticas mínimas: glucoamilásica : por lo menos 500 UG, de preferencia 750 UG, de preferencia incluso 1500 UG por gramo de materia seca y/o de preferencia, • proteolítica : por lo menos 100 UP, de preferencia por lo menos 400 UP por gramo de materia seca y/o de preferencia, • xilanásica: por lo menos 100 UX, de preferencia por lo menos 400 UX por gramo de materia seca. En la etapa i), el salvado de trigo se elige de preferencia de manera que se tiene una proporción de por lo menos 40% en masa de partículas inferiores a 1 ram.

En la etapa ü), el salvado de trigo debe ser humidificado térmicamente con el propósito de pasteurizarlo o esterilizarlo. Es ventajoso que el tratamiento térmico no preceda la humidificación, porque se han observado resultados de fermentación mediocres en el caso en donde se trata térmicamente el salvado antes del humidificador . El tratamiento térmico puede consistir en un calentamiento, por ejemplo, en una autoclave. Un tratamiento en autoclave de 20 minutos entre 120 y 121°C se demuestra muy satisfactoriamente. También son convenientes condiciones menos severas de pasteurización a 105°C, durante 15 minutos en un estufa. Igualmente es posible operar el tratamiento térmico del salvado inyectando vapor de agua, lo que permite operar simultáneamente a la humidificación del salvado. De preferencia, se regula el pH, de preferencia con ácido nítrico, durante la humidificación en una gama de 4 a 5.5 con el propósito de mejorar el efecto pasteuri zante del tratamiento térmico y el arranque de la fermentación deseada. El uso de ácido nítrico es particularmente ventajoso, siendo usado igualmente el ácido nítrico como fuente de nitrógeno para el moho. Además de su función de esterilización, el tratamiento térmico tiene por efecto favorecer la gelatinización del almidón contenido en el salvado de trigo y, de esta manera, la disponibilidad de este sustrato para los champiñones Aspergillus niger y Aspergillus orizae, lo que permite fermentaciones más eficaces. La humidificación del salvado es importante porque la cantidad de agua influye sobre el desempeño de la fermentación. Se determina de manera que la cantidad de agua del salvado esté, al inicio de la etapa iv) de fermentación, en el intervalo 50-60%, de preferencia 50-55%, de la masa total del salvado y de agua. En la etapa iii), la inoculación del salvado de trigo puede practicarse con cualquier inoculo apropiado. La persona experimentada en la técnica conoce múltiples maneras de preparar un inoculo convenientes a partir de una cepa seleccionada. La dosis de inoculo es venta osamente de por lo menos 107 esporas/gramo de materia seca inicial. En la etapa iv) , la fermentación puede realizarse en cualquier reactor apropiado. Ejemplos de los reactores usados son los descritos en el articulo de A. DURAND et al., publicado en Agro-Food-Industry Hi-Tech (mayo-junio de 1997, páginas 39-42 ) . La fermentación debe llevarse a cabo hasta que la actividad glucoamilásica sea de por lo menos 500 UG, de preferencia de por lo menos 750 UG, de preferencia aún de por lo menos 1500 UG por gramo de materia seca de salvado, es decir normalmente durante un periodo de 1 a 3 días, de preferencia de 30 a 60 horas. Debajo de 1 día, la fermentación es muy incompleta. Al cabo de 3 días la fermentación se logra o casi se logra, de manera que no seria económico prolongarla más. La temperatura del medio se mantiene entre 28°C y 38°C, de preferencia entre 32°C y 36°C, lo que corresponde al dominio de actividad óptima conocido de las cepas usadas. De manera ventajosa, para este propósito, la temperatura del aire se regula entre 34°C y 38°C durante las primeras horas de la fermentación para favorecer la germinación de las esporas, después reducida entre 28°C y 32°C para el resto de la fermentación para contribuir a la regulación de la temperatura del medio. La cantidad de humedad del salvado de trigo está normalmente comprendida entre 50% y 60%. Sin embargo, la tasa de humedad puede descartarse de ± 5 unidades % del intervalo de 50-60% durante un periodo relativamente breve entre dos ajustes sucesivos de la tasa de humedad o al final de la fermentación. Conviene, en cualquier caso, no descender debajo de una tasa de humedad de 45%. La tasa de humedad del medio de cultivo tiende a bajar con el transcurso del cultivo por evaporación bajo el efecto del aumento de la temperatura generada por el crecimiento fúngico, siendo tal medio un mal conductor del calor. De esta manera, se debe mantener la cantidad de humedad durante la fermentación, por ejemplo, procediendo periódicamente con aportes de agua para compensar la parte de agua del medio. La calidad del agua usada juega también un papel no despreciable. Se puede usar un agua corriente de buena calidad o de agua destilada. El pH del medio de fermentación habitualmente no se regula. Como se explicó anteriormente, se ajusta de preferencia inicialmente entre 4 y 5. Si su valor de inicio está cerca de 6.0-6.4, el pH baja a 3.8-4.2, en el transcurso del cultivo, después se remonta al final. Este retorno en general se correlaciona con la fase de esporulacion del champiñón. El seguimiento de la evolución del pH constituye un buen indicador del estado del cultivo. El termentador debe airearse, de preferencia en forma continua, con el propósito de aportar el oxigeno necesario a la fermentación y evitar la acumulación excesiva de dióxido de carbono producido por la fermentación. Además, la aireación participa en el control de la temperatura y de la humedad del medio de cultivo. El aire es, de preferencia, sensiblemente saturado en agua para limitar la tendencia a la desecación del medio. Es difícil dar indicaciones cuantitativas sobre el caudal de la aireación, porque intervienen múltiples variables, en particular el tamaño y la geometría del reactor, la cantidad del salvado cargada, etc. Sin embargo, las pruebas simples de rutina permitirán, al hombre experimentado en la técnica determinar fácilmente un caudal de aireación conveniente en cada caso práctico, en general un caudal de aire de 1 a 2 m3/h por kg de materia seca y apropiado, la sobrepresión está de preferencia entre 0.5 y 1 bar. La carga de salvado en el termentador debe agitarse periódicamente, en el transcurso de la fermentación con la ayuda de medios de agitación tales como brazos agitadores, láminas o espátulas o de tornillos sinfín para evitar la formación de masas impermeables y para que la aireación afecte de la manera más homogénea posible toda la masa del salvado. De manera sorprendente, las cepas desarrolladas resisten la agitación. Sin embargo, hay que evitar una agitación demasiado vigorosa. El salvado de trigo fermentado usado en el procedimiento de acuerdo con la invención puede secarse o congelarse para su conservación, si se desea o enfriarse y usarse sin transformación suplementaria. El secado se realiza de preferencia a una temperatura moderada para no afectar la actividad enzimática. Un calentamiento en la estufa a 40°C se considera apropiado. A nivel industrial, de preferencia se ventila aire seco entre 35 y 45°C, de acuerdo con el moho usado. La congelación, de su lado, puede realizarse sobre el producto húmedo a baja temperatura, por ejemplo a -20°C. US 2002 037342 describe un complejo enzimático con actividades glucoamilásica , proteolítica y xilanásica obtenido por fermentación de salvado de trigo con cepas de Aspergillus . Este complejo puede usarse como complemento nutrimental de acuerdo con la invención. De una manera general, no se puede prever el efecto, en el marco de un procedimiento que comprende una etapa de sacarificación por lo menos una parte simultánea con la fermentación, de una enzima, o de una composición multienzimática cuyo uso es conocido en el marco de un procedimiento con etapas de sacarificación y de fermentación separadas. En particular, esto se verifica cuando la adición de una composición implica, como la composición de US 2002 037342, la incorporación de sustancias tales como hemicelulosas susceptibles de aumentar la viscosidad durante la fermentación. Este documento describe el uso de esta composición con el fin de mejorar las condiciones de la etapa de sacarificación. No sugiere de ninguna manera que podría presentar un interés con un procedimiento que no comprende una etapa de sacarificación o una etapa de pre-sacarificación. En efecto, las condiciones óptimas para la sacarificación y para la fermentación son muy diferentes. En particular, la sacarificación se efectúa comúnmente a aproximadamente 60°C, es decir, a una temperatura que no conviene a las levaduras usadas habitualmente durante la fermentación. De manera recíproca, como se ilustra por la tabla 7 de US 2002 037342, las enzimas de la composición de US 2002 037342 presentan una actividad enzimática óptima a las temperaturas de sacarificación, pero, de acuerdo con cualquier intento, presentarían una actividad enzimática degradada en caso de sacarificación-fermentación simultáneas.

Además, las enzimas de la composición de US 2002 037342 se conoce que disminuyen la viscosidad del medio de sacarificación a la temperatura de sacarificación (ver la tabla 8), pero la persona experimentada podría esperarse que esta disminución de viscosidad no se reproduce a la temperatura de fermentación, en cualquier caso en una medida que hace aceptable la viscosidad del medio de sacarificación-fermentación . De esta manera, la persona experimentada no habría intentado usar la composición de US 2002 037342 en un procedimiento de fabricación de etanol que no comprende la etapa de sacarificación, o de una etapa de pre-sacarificación . Aún menos que la supresión de la sacarificación, o una limitación de su duración, puede conducir a veces a un medio de sacarificación-fermentación contaminado de manera redhibitoria, salvo en tener que agregar grandes cantidades de agentes bacteriostáticos . En efecto, la temperatura de sacarificación permite una protección contra las contaminaciones bacterianas.

De esta manera, la invención se relaciona igualmente con el uso de un salvado de trigo obtenido de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente o de acuerdo con un salvado de trigo descrito en US 2002 037342 para favorecer la fermentación alcohólica en un medio de sacarificación-fermentación. De preferencia, más de 4 kg de este salvado se presentan en el medio de sacarificación-fermentación, al inicio de la etapa d) por 1,000 kg de almidón. De manera ventajosa, en la modalidad de realización preferida de la invención, el complemento nutrimental es un complejo multienzimático obtenido por fermentación de un salvado de trigo con un moho y: - constituye un medio de valorización de los salvados que proceden de la etapa a) de preparación de harina de trigo. aporta simultáneamente más enzimas útiles, simplificando asi el procedimiento, y es un excelente complemento nutrimental para la levadura . Para este último efecto, sin embargo, la cantidad másica de complejo multienzimático debe ser muchas más elevada que de acuerdo con la técnica anterior. La investigación actual tiende a fabricar complejos multienzimáticos cada vez más concentrados, con el propósito de limitar las cantidades másicas introducidas. Los procedimientos se simplifican. A contracorriente de esta tendencia, de esta manera, los inventores han descubierto que contrario con la incorporación de más de 4 kg de materia seca, y de preferencia más de 14 kg de materia seca, de preferencia aún de aproximadamente 19 kg de materia seca de salvado de trigo por tonelada de almidón de salida permite mejorar la eficacia global del procedimiento de fabricación del etanol. A la salida de la etapa d) , el mosto fermentado o "vino" que proviene de la sacarificación-fermentación, después del paso en un intercambiador de calor, alimenta colonias a destilar . Las vinazas que salen al pie de la colonia se envían al taller de separación de cebadas para clarificarse por los métodos clásicos, tipo centrifugación, con el propósito de separar las materias solubles de las materias insolubles. Las cebadas húmedas obtenidas seguido de esta etapa de separación están compuestas de aproximadamente 35% de materia seca, las vinazas clarificadas están compuestas de aproximadamente 7% a 10% de materia seca. Las vinazas clarificadas se concentran por evaporación al vacío para obtener un jarabe o "vinaza concentrada" con una tasa de materia seca próxima a 35%. El jarabe obtenido de esta manera puede mezclarse con las cebadas húmedas. La mezcla después se seca y se obtienen aproximadamente 350 kg de cebadas asi secadas por tonelada de trigo, siendo la tesa de materia seca de estas cebadas de aproximadamente 90%. Las cebadas obtenidas después del secado presentan características nutrimentales remarcables, en particular para el ganado, y son igualmente un objetivo de la invención. Los 350 kg de cebadas obtenidas de acuerdo con la invención comprenden en efecto entre 2 g y 35 g de ergosterol, de preferencia aproximadamente 10 g. Ahora bien el ergosterol es un precursor de la síntesis de la vitamina D2 y, de esta manera, presenta un interés para la salud así como un interés nutrimental para las levaduras, particularmente en anaerobiosis . Además, en el caso en donde el complemento nutrimental es un salvado de trigo fermentado de acuerdo con el procedimiento de la invención descrita anteriormente, las cebadas obtenidas contienen un excedente de proteínas. Los vapores de alcohol de las colonias se condensan en los intercambiadores de calor. El azeótropo recuperado a la cabeza de la columna se seca por los métodos clásicos, por ejemplo, usando tamices moleculares. El procedimiento de acuerdo con la invención permite obtener aproximadamente de 375 litros a 390 litros de etanol para una cantidad inicial de 1,000 kg de trigo. Esto es, de manera remarcable, hasta 91% de rendimiento estequiométrico de la transformación por fermentación de glucosa en etanol para un salvado que contiene aproximadamente 60% de almidón.

Sin ser apoyados por esta teoría, los inventores explican estos resultados para la sustitución de un aporte de nitrógeno exógeno, por ejemplo, bajo la forma de sulfato de amonio, por nitrógeno aminado libre. Esta sustitución reduce de manera ventajosa la síntesis de subproductos fermentados, en particular de glicerol y, de esta manera, aumenta el rendimiento . La invención se relaciona también con un procedimiento de fabricación de levadura en aerobiosa o "propagación de levadura", que puede usarse en particular en la pre-fermentación con el propósito de preparar una levadura desarrollada en un medio de fermentación o en un medio de sacarificación-fermentación de un procedimiento de fermentación alcohólica de glucosa en etanol. En este marco, la etapa de pre-fermentación, en general, tiene por objetivo aumentar la concentración de levadura en el medio de pre-fermentación de aproximadamente 106 - 107 por mL al mínimo de aproximadamente 108 UFC por mL de medio de pre-fermentación, de preferencia al mínimo de aproximadamente 5.108 UFC por mL de medio de pre-fermentación . La pre-fermentación se efectúa en pre-fermentadores en donde la temperatura se controla y se regula rigurosamente, por ejemplo, por un sistema de placas de enfriamiento en el que circula un liquido de enfriamiento al interior o al exterior de las cubas de pre-fermentación . Toda multiplicación de microorganismos entraña en efecto una elevación de la temperatura que puede llegar a ser inhibidora por la propagación de las levaduras. La temperatura en los pre-fermentadores se mantiene clásicamente entre 30°C y 35°C.

Un aporte de oxigeno, por ejemplo, bajo la forma de aire comprimido, es indispensable para la propagación de la levadura . Con el fin de favorecer el desarrollo de las levaduras, se conoce añadir al medio nutritivo: - nitrógeno aportado bajo las diversas formas, tales como urea, amoniaco, las sales de amonio, - fósforo aportado bajo las diversas formas, tales como el ácido fosfórico, los fosfatos, - azufre aportado bajo las diversas formas, tales como el ácido sulfúrico, los sulfatos, - minerales esenciales. De acuerdo con la técnica anterior, se añade igualmente al medio nutritivo del mosto que sale de la etapa de licuefacción, de sacarificación o de pre-sacarificación . Este mosto aporta de esta manera azúcares fermentables , pero conduce a una reducción del rendimiento global de la fermentación alcohólica. De esta manera, existe una necesidad para un procedimiento de fabricación de levadura en aerobiosa que pueda usarse en pre-fermentación con el propósito de preparar una levadura desarrollada en un medio de fermentación o en un medio de sacarificación-fermentación de un procedimiento de fermentación alcohólica de glucosa en etanol y que limitaría este bajo rendimiento. De acuerdo con la invención, se obtiene este objetivo agregando los pre-fermentadores por lo menos una parte de las vinazas clarificadas, es decir, obtenidas a la salida de la etapa de separación y/o de las vinazas concentradas obtenidas durante el desarrollo de un procedimiento de fabricación de etanol por fermentación alcohólica a partir de las primeras materias glucídicas, particularmente amiladas y/o de acuerdo con la invención. Las vinazas pueden resultar de un procedimiento de fabricación de etanol que comprende una etapa de sacarificación-fermentación o en el que las etapas de sacarificación y de fermentación se separan completamente. De preferencia, las vinazas resultan de un procedimiento de fabricación de etanol de acuerdo con la invención, en el que se ha introducido un complemento nutrimental de acuerdo con la invención. De esta manera, la invención se relaciona igualmente con un procedimiento de fabricación de etanol tal como se definió anteriormente, en el que se usa, para la fermentación etanólica, las levaduras obtenidas por un procedimiento de fabricación de levadura tal como se definió anteriormente, el cual usa vinazas que provienen del procedimiento de fabricación de etanol. El uso de vinazas que resultan de un procedimiento de fabricación de etanol de acuerdo con la invención, en el que un complemento nutrimental de acuerdo con la invención se ha introducido, para la producción de levadura en el seno de los pre-fermentadores , es particularmente ventajoso ya que permite separar la producción de etanol por las levaduras de una parte y el crecimiento celular de las levaduras por otra parte. En efecto, las vinazas que resultan de un procedimiento de fabricación de etanol de acuerdo con la invención constituyen un medio nutrimental que permite hacer crecer las levaduras hasta un nivel compatible con un sembrado elevado del medio de fermentación o de sacarificación-fermentación, lo que entraña un uso por las levaduras de los azúcares fermentables presentes en el medio de fermentación o de sacarificación-fermentación principalmente para la producción de etanol, y no para el crecimiento celular, como se ha señalado anteriormente. De esta manera, los azúcares fermentables que provienen del sustrato glucidico de salida se usan principalmente para la producción de etanol, mientras que son principalmente azúcares no fermentables que sirven para el crecimiento celular. El rendimiento global de la producción etanólica a partir del sustrato glucidico de salida se encuentra de esta forma mejorado con relación a las procedimientos en los que los azúcares fermentables se usan por las levaduras a la vez para la producción de etanol y para el crecimiento celular. Una modalidad de realización particular de tal procedimiento se describe en la figura 2. De preferencia, la mezcla nutritiva de pre- fermentación contiene vinazas y está exenta de productos intermediarios obtenidos durante el desarrollo de un procedimiento de fabricación de etanol por fermentación alcohólica a partir de primeras materias amiladas, en particular las vinazas no se mezclan con el mosto que procede de las etapas intermediarias de un procedimiento de fabricación de etanol por fermentación alcohólica a partir de primeras materias amiladas. Siguiendo otra modalidad preferida, el medio nutritivo de pre-fermentación se compone o comprende una mezcla de vinazas y de mosto licuado, ocasionalmente de agua. Siguiendo aún otra modalidad preferida, el medio nutritivo se pre-fermentación se compone o comprende una mezcla de vinazas y de complemento nutrimental de acuerdo con la invención, en particular salvado de trigo fermentado, ocasionalmente de agua. Por último se puede formar igualmente un medio nutritivo compuesto de, o que comprende el conjunto de los elementos citados antes.

El medio nutritivo de pre-fermentación de acuerdo con la invención contiene, de preferencia, una cantidad de materia seca tal que la agitación y/o la aireación del medio es suficiente para sostener una producción óptima de etanol, por ejemplo, de 15% a 20% de materia seca. Para el procedimiento de fabricación de levadura de acuerdo con la invención, el complemento nutrimental de acuerdo con la invención puede ser un salvado de trigo fermentado. Las vinazas provenientes del medio de fermentación o de sacarificación-fermentación presentan una composición, y particularmente una cantidad de azúcares usados para la levadura en aerobiosa, particularmente favorable para el desarrollo de la levadura en los pre-fermentadores . El medio de pre-fermentación puede ser completado por los elementos nutritivos exógenos como de glicerol o de soluciones de glicerol asi como por los hidrolizados obtenidos a partir de cebadas húmedas. Ventajosamente, esto permite economizar glucosa del mosto de acuerdo con la invención y, de esta manera, limitar la reducción del rendimiento. De preferencia, por lo menos una parte de las vinazas se recircula por incorporación en el medio nutritivo de pre-fermentación . Es igualmente preferible recircular las vinazas después de la concentración con el propósito de limitar la dilución del medio nutritivo del pre-fermentador .

De preferencia, las vinazas presentes en el medio nutritivo de pre-fermentación se sustituyen completamente en el mosto que sale de la etapa de licuefacción, de sacarificación o de pre-sacarificación . Sin embargo, esta sustitución sólo puede ser parcial. La adición de un complemento nutrimental de acuerdo con la invención, en particular de salvado de trigo fermentado permite igualmente mejorar la pre-fermentación, particularmente por enriquecimiento del medio nutritivo en: - nitrógeno, aportado bajo la forma de ácidos aminados, - fósforo, - azufre - vitaminas y minerales esenciales, - proteínas. Esta adición puede efectuarse directamente en el medio nutritivo de pre-fermentación, o después de mezclar con el mosto que sale de la etapa de licuefacción, siendo esta mezcla adicionada, después de una dilución eventual, en el pre-fermentador . El uso de las levaduras pre-fermentadas a partir de vinazas que proceden de un procedimiento de fabricación de etanol de acuerdo con la invención permite igualmente, de manera ventajosa, enriquecer considerablemente en proteínas las cebadas secadas obtenidas al final del procedimiento de fabricación de etanol de acuerdo con la invención. De esta manera, las cebadas pueden comprender más de 40% de proteínas y de preferencia por lo menos 50% de proteínas, sobre la base de la masa de materia seca. Las diversas actividades enzimáticas citadas en la descripción y las reivindicaciones se han medido por los siguientes métodos: Actividad glucoamilásica . La acción de una preparación de glucoamilasa (GA) sobre una solución de almidón soluble representa la liberación de azúcares reductores. Calentados a 100°C en presencia de ácido 3 , 4-dinitrosalicílico (DNS) , estas composiciones toman un color café medido en el espectrofotómetro (Kontron Instruments, Milán, Italia) a 540 nm. El medio de reacción contiene: - Solución de almidón a 1.5% en el caso de Aspergillus niger y a 2% en el caso de Aspergillus orizae 1000 µ? - Amortiguador citrato 0.1 M a pH 4.5 900 µ? - Solución enzimática: 100 µ?. La reacción se desarrolla durante 20 minutos a 60°C en el caso de Aspergillus niger, durante 5 minutos a 50°C en el caso de Aspergillus orizae. Se realizan tomas de 100 µ? del medio de reacción los 4 minutos en el caso de Aspergillus niger y todos los minutos en el caso de Aspergillus orizae, mezclados con 500 µ? de DNS y 400 µ? de amortiguador citrato a pH 4.5. La mezcla después se calienta 5 minutos a 100°C, se enfria rápidamente después se dosifica a 540 nm frente a un blanco de una mezcla de 500 µ? de DNS y de 500 µ? de amortiguador de citrato a pH 4.5. Estas condiciones de dosificación han sido establecidas después de haber estudiado la influencia de la temperatura y del pH sobre la actividad de las preparaciones de GA. El almidón soluble Merck (Darmstadt, Alemania) se ha empleado como el sustrato de esta hidrólisis enzimática. El DNS se prepara de acuerdo con el protocolo propuesto por P. Bernfeld, Methods in enzymology, 1, 149-158 (1955) que es el siguiente : ? Disolver previamente: o 10 g de ácido 3 , 5-dinitrosalicí lico, o 200 mL de sosa 2 molar o 200 mL de agua destilada. ? Adicionar después: o 300 g de tartrato doble de sodio potasio. ? Completar el volumen a 1 litro con agua destilada después de la disolución total. Una vez preparado, este reactivo debe conservarse al abrigo de la luz. Las curvas de contraste se han establecido con glucosa como producto de referencia para la dosificación de la actividad de glucoamilasa o para el seguimiento de las reacciones de licuefacción-sacarificación y con xilosa para medir la actividad de xilanasa. Una unidad de actividad glucoamilasa (UG) corresponde a la cantidad de enzima necesaria para la liberación de un micromol de extremidades reductoras por minuto en las condiciones de dosificación con la glucosa como referencia. La actividad glucoamilasa, calculada con la ayuda de la fórmula indicada abajo, se relaciona con la cantidad de materia seca inicial (MSI) : PxV y e?????? ferm ? A corresponde a la actividad GA expresada en UG-gMSI'1 (µ???? · min"1 ¦ gMSI"1) , ? P corresponde a la velocidad de liberación de equivalentes glucosa en mol-min"1, ? Venz representa el volumen de la solución de enzimas dosificada en mL, ? ferm es el volumen total de agua destilada usada para extraer la solución de enzimas en mL, ? Mferm, expresada en g de MSI, corresponde a la masa inicial de producto seco que ha sido extraído de la solución de enzimas.

Actividad proteasa Esta dosificación se ha realizado sobre azocaseína de acuerdo con el método de Béinon, descrito en la obra "Proteins Purification ethods - a Practical Approach", Harris E.L.V. y Angal, S (Editores), IRL-Press, Oxford University Press, 1-66 (1989). La degradación de este sustrato por las proteasas representa la liberación de los grupos azo que absorben en UV a 340 nm. La evolución de la absorbancia durante la cinética de hidrólisis de esta proteina indica la importancia de la reacción. El medio de reacción contiene: o Solución de azocaseina al 1%, pH 5.0: 1,000 µ? o Solución enzimática: 200 µ? La azocaseina (Sigma, Saint-Louis, Estados Unidos) se disuelve en un amortiguador acetato 0.1 mol -l"1 a pH 5.0. Se han dosificado las actividades de proteasas a este pH porque la azocaseina es insoluble en el amortiguador acetato a pH inferiores. La reacción enzimática se realiza a 60°C. Se realizan tomas cada 5 minutos durante 20 minutos y se mezclan con el ácido tricloroacético (TCA) al 5% para detener la reacción . Una unidad de actividad proteasa (UP) corresponde a la cantidad de enzimas necesarias para aumentar de 0.01 unidad A3 0nm por minuto, generada para la liberación de los grupos azo en las condiciones citadas anteriormente. Esta actividad, calculada de acuerdo con la fórmula indicada abajo, se relaciona con la materia seca inicial (UP-gMSI-1) o la actividad glucoamilasa (UP-UG ): ? A corresponde a la actividad de proteasa expresada en UP- gMSI"1, ? P corresponde a la velocidad de liberación de los grupos azo expresada en aumento de 0.01 unidad A34onm' min"1, ? V,enz representa el volumen de la solución de enzimas dosificada en mL, ? ferm es el volumen total de agua destilada usada para extraer la solución de enzimas en mL, ? Mferrr expresada en g de MS I , corresponde a la masa inicial de producto seco que ha sido extraído de la solución de enzimas.

Actividad xilanasa Para poner en evidencia esta actividad enzimática, se hacen agitar las preparaciones de GA sobre una solución de xilano soluble y se midieron los azúcares reductores liberados por el método al DN S . El medio de reacción está compuesto de: o Solución de xilano al 2%, pH 4.5: 1, 900 µ? o Solución enzimática: 100 µ? solución de xilano de alerce (Sigma al 1%) se prepara en amortiguador citrato 0.1M a pH 4.5 y la reacción se desarrolla a 60°C en el caso de Aspergillus niger y a 50°C en el caso de Aspergillus orizae. Se efectúan tomas de 200 µ? de medio de reacción cada 2 minutos durante 10 minutos y se mezclan con 500 µ? y 300 µ? de amortiguador citrato a pH 4.5. La mezcla se calienta después 5 minutos a 100°C, se enfria rápidamente después se dosifica a 540 nm frente a un blanco de una mezcla de 500 µ? de DNS y de 500 µ? de amortiguador citrato a pH 4.5. Una unidad de actividad de xilanasa (UX) corresponde a la cantidad de enzimas necesaria para la liberación de un micromol de azúcares reductores por minuto. Esta actividad se relaciona con la materia seca inicial (UX- gMSI"1) o con la actividad de glucoamilasa (UX-UG-1). Para calcular esta actividad, se ha retomado la fórmula definida para el cálculo de las actividades GA en la que: ? A corresponde a la actividad de xilanasa expresada en UX-g SI"1 ^mol-min^-gMSI-1) , ? P corresponde a la velocidad de liberación de equivalentes xilosa en µp???t???"1, ? Los otros términos de la fórmula no se modificaron. Las pruebas no limitantes siguientes se dan con el objetivo de ilustrar la invención, en particular la ventaja que procura el uso de un salvado de trigo fermentado de acuerdo con la invención en el caso de un procedimiento de sacarificación-fermentación simultáneas .

Ejemplo 1: Efecto de una complementación nitrogenada Se estudió de manera comparativa la cantidad de etanol producido en el transcurso de una etapa de sacarificación-fermentación introduciendo ya sea una preparación enzimática comercial (Spirizyme® Fuel), o la misma preparación enzimática con una complementación no limitante en nitrógeno, o un complemento nutrimental de acuerdo con la invención. En estas pruebas, los inventores prepararon 750 g de mosto de harina de trigo al 32% de materia seca en un reactor de 1 litro agitado. Después de 2 h de licuefacción a 85°C y pH 5.5, el mosto se reparte en 3 matraces de Erlenmeyer de 0.5 litros que contiene cada uno 200 g de mosto y se completa a la isoactividad glucoamilasa como sigue: » Matraz 1: Spirizyme® Fuel (solución de glucoamilasa purificada, Novozymes); » Matraz 2: Spirizyme® Fuel y complementación nitrogenada, es decir, fosfato y sulfato di-amónico: 3 g/1 de cada producto; » Matraz 3: salvado de trigo fermentado por una cepa de Aspergillus niger ATCC 76061, siguiendo el procedimiento descrito en US 2002 037 342. El pH inicial de los mostos en los tres matraces se ajustó a 4.5 y la temperatura a 32°C.

La incorporación de los productos nitrogenados en el matraz 2 genera una alcalinización del pH 6.2 que necesita un aporte suplementario de ácido clorhídrico concentrado para restablecer el pH inicial del mosto a 4.5 para la sacarificación-fermentación. Los mostos se siembran con 107 UFC de levadura por mL de mosto. La levadura usada en los ejemplos es Saccharomyces cerevisiae . La concentración máxima de glucosa teórica en el mosto es de 303 g/1 después de la hidrólisis enzimática total del almidón. Como se muestra en la tabla 1, la mejor producción de etanol se obtiene con el salvado de trigo fermentado en 72 horas. El uso de Spirizyme® Fuel, con un complemento nitrogenado sólo genera un máximo de 59% de etanol en 96 horas. En ausencia de la incorporación de nitrógeno, la producción de etanol es muy baja y se observa una concentración muy elevada en glucosa. De esta manera hay una ventaja significativa en usar el salvado de trigo fermentado para un moho para la producción de etanol de trigo, así como con la temperatura del reactor de sacarificación-fermentación simultáneas. La comparación con el Spirizyme Fuel indica que una complementacion no limitante en nitrógeno explica solamente de forma parcial el mejoramiento de los desempeños.

Tabla 1 Estas pruebas confirman la adecuación del salvado de trigo fermentado para la producción de etanol de trigo por un procedimiento de sacarificación-fermentación simultáneas.

Ejemplo 2: Efecto amortiguador del complemento nutrimental de acuerdo con la invención. Este ejemplo ilustra las ventajas del uso del complemento nutrimental de acuerdo con la invención para favorecer una sacarificación-fermentación alcohólica. Este ejemplo trata en particular del efecto amortiguador, del complemento nutrimental de acuerdo con la invención, sobre el medio de sacarificación-fermentación. En estas pruebas, los inventores prepararon 750 g de mosto de harina de trigo al 32% de materia seca en un reactor de 1 litro bajo agitación. Después de 1 h 30 de licuefacción a 85°C, a pH 5.5 y bajo agitación a 250 rpm, el mosto se reparte en 2 matraces de Erlenmeyer de 250 mL . Cada matraz contiene 100 g de mosto licuado al 32% de materia seca y 40 g de agua estéril para obtener un mosto al 23% de materia seca. Enseguida se adicionan en cada mosto: » Matraz 1: 0.5 g de salvado de trigo fermentado por una cepa de Aspergillus niger ATCC 76061, siguiendo el procedimiento descrito en US 2002 037 342; » Matraz 2: 16.7 µ? de Spirizyme® Fuel (solución de glucoamilasa purificada, Novozymes). El pH inicial de los mostos en los dos matraces se ajusta a 4. Los mostos se siembran con 5xl06 UFC de levaduras Ethanol Red® (Lesaffre) por mL de mosto. En el matraz 2, se adiciona nitrógeno exógeno, bajo la forma de amoniaco a una relación de 1 gramo de nitrógeno por kilogramo de trigo. Durante toda la duración de las pruebas, los mostos se mantienen a una temperatura de 30°C y bajo agitación a 100 rpm . La concentración deseada en etanol es de 87 g de etanol por litro de mosto (11% v/v), lo que corresponde a un rendimiento de conversión de almidón en etanol de 81%. La tabla 2 muestra la evolución de la concentración en etanol en el mosto y el pH del mosto en función de la duración de la sacarificación-fermentación. De la misma manera que la tabla 1, la tabla 2 ilustra que el uso de un complemento nutrimental de acuerdo con la invención en el medio de sacarificación-fermentación permite obtener una concentración más grande en etanol en una duración inferior que las enzimas convencionales a pesar de un aporte de nitrógeno exógeno. Además, la tabla 2 ilustra que la incorporación de amoníaco en el matraz 2 representa una disminución del pH alrededor de 2.8. Para obtener un mejor rendimiento en etanol, es importante que el pH del mosto permanezca entre 3.5 y 5. En efecto, la sacarificación-fermentación se realiza a aproximadamente 30°C, un pH muy elevado, particularmente superior a 5, entraña un riesgo de contaminación del mosto. Un valor del pH muy bajo, particularmente inferior de 3.5, entraña una disminución del rendimiento de la fermentación alcohólica . El uso de una preparación enzimática a la que se adiciona una fuente de nitrógeno exógeno en un medio de sacarificación-fermentación necesita un dispositivo de regulación del pH, de manera que se mantenga un valor de pH entre 3.5 y 4.5.

Tabla 2 El complemento nutrimental de acuerdo con la invención tiene un efecto amortiguador sobre el pH del mosto de sacarificación-fermentación y entonces, de manera ventajosa, permite eximir de un dispositivo de regulación del pH .

Ejemplo 3: Bio-estimulación Este ejemplo pone en evidencia el efecto de la bio-estimulación del complemento nutrimental de acuerdo con la invención. Las pruebas de este ejemplo ilustran que la complementación en nitrógeno y el efecto de la estabilización del pH del mosto alrededor de 4, sólo explican el mejoramiento parcialmente de los desempeños de la levadura para la producción de etanol durante su introducción en el medio de sacarificación-fermentación. En estas pruebas, los inventores prepararon mosto de harina de trigo al 32% de materia seca. Después de 1 h 30 de licuefacción a 85°C, a pH 5.5 y bajo agitación a 250 rpm, el mosto se reparte en 2 biorreactores de 4 litros. Cada biorreactor contiene 1.7 kg de mosto al 29.8% de materia seca. El mosto obtenido en cada biorreactor se obtiene mezclando el mosto al 32% de materia seca que procede de la licuefacción con vinazas al 27% de materia seca. Las vinazas usadas para diluir el mosto, son vinazas obtenidas a la salida de un procedimiento de fermentación alcohólica de trigo. Los 1.7 kg de mosto al 29.8% de materia seca se completan como sigue: » Biorreactor 1: 199 µ? de Spirizyme® Fuel (solución de glucoamilasa purificada, Novozymes) y 59 µ? de Viscozym heat® (Novozyme) (enzima deviscosifiante) ; » Biorreactor 2: 5.7 g de salvado de trigo fermentado por una cepa de Aspergillus niger ATCC 76061, siguiendo el procedimiento descrito en US 2002 037 342. El pH inicial de los mostos en los dos biorreactores se ha ajustado a 4.1 y la temperatura a 30°C, después los mostos se someten a una agitación a 100 rpm. Los mostos se siembran después con 5xl06 UFC de levaduras (Ethanol Red®, Lesaffre) por mL de mosto. El nitrógeno exógeno se ajusta en el biorreactor 1, de manera fraccionada, bajo la forma de amoniaco para llegar a una cantidad de 1 gramo de nitrógeno por kilogramo de trigo. Las vinazas que proceden del mosto de cereales fermentados contienen una cierta cantidad de fibras. Mezclándolas en el mosto, se obtiene un efecto amortiguador del pH del mosto. La concentración deseada en etanol es de 87 g de etanol por litro de mosto, lo que corresponde a un rendimiento de conversión de almidón en etanol de 81%. La tabla 3 muestra la evolución de la concentración en etanol en el mosto y el pH del mosto en función de la duración de la sacarificación-fermentación. El fraccionamiento del aporte en nitrógeno exógeno asi como el uso de las vinazas permite una estabilización del pH en el biorreactor 1 alrededor de 4. Como se muestra en la tabla 3, la concentración deseada en etanol es casi obtenida en 28 horas en el biorreactor con un complemento nutrimental de acuerdo con la invención, mientras que hay que esperar 44 horas para obtener una concentración equivalente en el biorreactor con la preparación enzimática. Además, al cabo de 68 horas, la concentración en etanol es siempre más elevada en el biorreactor con el complemento nutrimental de acuerdo con la invención en éste con la preparación enzimática. La tabla 3 ilustra la ventaja significativa del uso de un complemento nutrimental de acuerdo con la invención con relación a las preparaciones enzimáticas clásicas. Los resultados de estas pruebas indican que una complementación en nitrógeno y un control del pH sólo explican parcialmente los desempeños del complemento nutrimental de acuerdo con la invención . Estas pruebas ponen en evidencia un efecto de bio-estimulación de las levaduras ligado a la composición del complemento nutrimental de acuerdo con la invención.

Tabla 3 Concentración en etanol pH (g/D Duración SSF Salvado Spirizyme + Salvado Spirizyme + (h) fermentado NH3 + VW fermentado NH3 + VW 0 0 0 4.1 4.1 8 6.8 <4 4 4.1 20 69 35.5 3.9 3.75 Concentración en etanol PH (g/D Duración SSF Salvado Spirizyme + Salvado Spirizyme + (h) fermentado NH3 + VW fermentado NH3 + VW 24 73.5 48.8 4 3.8 28 82.5 58.5 4 3.9 44 85.6 82.6 4.1 3.8 48 93.6 88.9 4.1 3.85 68 97.1 91.3 4.2 4 Ejemplo 4: Fermentación aerobia de las vinazas Los inventores estudiaron de manera comparativa la evolución de la concentración del medio de pre-fermentación en levadura en función de la cantidad de materia seca del medio. Estas pruebas se efectuaron sobre 100 g de medio de pre-fermentación en los matraces de mamparas de 250 mL . Los medios de pre-fermentación se someten a termostato a 30°C, colocados bajo agitación a 130 rpm y se siembran con 2.5 x 107 levaduras (Ethanol Red®), por mL de medio. El pH inicial de los medios es de 4.2 a 4.4. Cada medio de pre-fermentación está compuesto como sigue, en porcentaje másico: » Matraz 1: 1.2% de vinaza a 28% de materia seca, y aproximadamente 98.8% de agua; » Matraz 2: 10% de vinaza a 28% de materia seca y aproximadamente 90% de agua; » Matraz 3: 20% de vinaza a 28% de materia seca y aproximadamente 80% de agua; » Matraz 4: 40% de vinaza a 28% de materia seca y aproximadamente 60% de agua; » Matraz 5: medio testigo (glucosa y extracto de levadura) . Los matraces se agitan de manera que se oxigena el medio y se permite la propagación de la levadura. Los inventores han medido la evolución de la concentración en levadura en cada medio de pre-fermentación .

Las composiciones de los medios en los matraces y las evoluciones de las concentraciones en levadura se recapitulan en la siguiente tabla 4 : Tabla 4 Enumeración ( levaduras/mL) Duración 1.2% de 10% de 20% de 40% de testigo del cultivo vinazas vinazas vinazas vinazas (h) 0 2.50E+07 2.50E+07 2.50E+07 2.50E+07 2.50E+07 5 3.30E+07 4.90E+07 1.54E+08 4.15E+08 4.90E+07 7 3.00E+07 2.50E+08 3.10E+08 4.50E+08 6.00E+07 Enumeración ( levaduras/mL) Duración 1.2% de 10% de 20% de 40% de testigo del cultivo vinazas vinazas vinazas vinazas (h) 24 3.30E+07 1.90E+08 3.50E+08 5.50E+08 2.00E+08 Como se muestra en la tabla 4, un medio de pre-fermentación compuesto de 40% en masa de vinaza al 28% en masa de materia seca, o un medio al 11.2% en masa de materia seca, permite una multiplicación de un factor 16.6 de la cantidad de levadura en 5 horas. A manera de comparación, el factor multiplicativo sobre el mismo periodo en el medio testigo es de aproximadamente 2. Después de 24 horas de cultivo aerobio, la concentración en levadura en el medio compuesto de 40% en masa de vinaza es mayor de 2.5 veces la concentración de levadura en el medio testigo . Sin ser apoyados por una teoría, los inventores explican estos resultados por la presencia en la materia seca de las vinazas de fuentes de carbono, además de glucosa, asimilables por la levadura. Los inventores han mostrado que la materia seca de vinazas contiene aproximadamente 10% de azúcares fermentables , esencialmente bajo la forma de glucosa o de almidón residual. La concentración inicial en levadura corresponde a aproximadamente 0.62 g de levadura por litro de medio, mientras que la concentración final corresponde a aproximadamente 13.8 g de levadura por litro de medio. De esta manera, se forman aproximadamente 13.2 g de levadura por litro de medio, lo que corresponde a un consumo de aproximadamente 26.4 g de glucosa. Asi pues, en el matraz no. 4 la concentración inicial en glucosa es de aproximadamente 11.2 g por litro de medio. La cantidad de levadura obtenida de esta manera está ligada con otra fuente de carbono que la glucosa, por ejemplo, la presencia de glicerol en las vinazas. . Ahora bien, la presente invención no se limita a las modalidades de realización descritas y representadas proporcionadas a manera de ejemplos ilustrativos y no limitantes . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Complemento nutrimental para medio de fermentación alcohólica a partir de primeras materias glucidicas, caracterizado porque comprende un principio activo, bajo la forma bruta o extraída, que procede de una fermentación con un moho. 2. Complemento nutrimental de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la primera materia glucídica es una primera materia amilada. 3. Complemento nutrimental de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque comprende un salvado de trigo fermentado con un moho. 4. Complemento nutrimental de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque presenta por lo menos una de las siguientes actividades enzimáticas: glucoamilásica : por lo menos 500 UG por gramo de materia seca, • proteolítica : por lo menos 100 UP por gramo de materia seca , • xilanásica: por lo menos 100 UX por gramo de materia seca . 5. Complemento nutrimental de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el principio activo se elige del grupo formado por el ergosterol, N-acetilglucosamina, vitaminas, ácidos nucleicos, ácidos aminados y sus mezclas. 6. Complemento nutrimental de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque se obtiene por fermentación de un salvado de trigo con un moho elegido entre las cepas de Aspergillus niger ATCC 201202, ATCC 76060, ATCC 76061, MUCL 28815, MUCL 28816, NRRL 3112 o entre las cepas de Aspergillus orizae ATCC 22788 y ATCC 42149. 7. Complemento nutrimental de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, susceptible de ser obtenido por medio de un procedimiento, caracterizado porque comprende las siguientes etapas: i) colocar salvado de trigo, ii) humidificar, acidificar a un pH comprendido entre 4 y 5 y tratar térmicamente el salvado de manera que se pasteuriza o esteriliza, iii) inocular el salvado de trigo que resulta por una cepa de Aspergillus niger, elegida entre ATCC 201202, ATCC 76060, ATCC 76061, MUCL 28815, MUCL 28816, NRRL 3112 o entre las cepas de Aspergillus orizae, elegido entre ATCC 22788 y ATCC 42149, iv) hacer fermentar el salvado de trigo en el estado sólido en un reactor agitado periódicamente, a una temperatura de 28°C a 38°C, siendo la cantidad de humedad mantenida entre 45% y 65% en peso, en las condiciones de aireación apropiadas para evitar una acumulación de dióxido de carbono permanente en el seno del salvado de trigo, hasta que el producto de fermentación presente los siguientes valores mínimos de actividades enzimáticas: glucoamilásica : por lo menos 500 UG por gramo de materia seca y, ocasionalmente, · proteolítica : por lo menos 100 UP por gramo de materia seca , • xilanásica: por lo menos 100 UX por gramo de materia seca . 8. Complemento nutrimental de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el tratamiento térmico en la etapa ii) es de preferencia posterior a la humidificación . 9. Complemento nutrimental de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la actividad glucoamilásica es de por lo menos 750 UG por gramo de materia seca. 10. Complemento nutrimental de conformidad con la reivindicación anterior, caracterizado porque la actividad glucoamilásica es de por lo menos 1500 UG por gramo de materia seca. 11. Complemento nutrimental de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende ergosterol, N-acetilglucosamina, vitaminas, ácidos nucleicos y ácidos aminados . 12. Complemento nutrimental de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende vitamina B. 13. Complemento nutrimental de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende uno o los ácidos aminados elegidos entre: alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, valina, leucina, ácido glutámico. 1 . Procedimiento de fabricación de etanol a partir de una materia glucidica, caracterizado porque comprende una etapa de fermentación en presencia de un complemento nutrimental de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores. 15. Procedimiento de fabricación de etanol de conformidad con la reivindicación 14, en la que la materia glucidica es una materia amilada, que comprende, después de una etapa de licuefacción y a menudo una etapa de pre-sacarificación, una etapa de sacarificación-fermentación en un medio de sacarificación-fermentación cuya cantidad en glucosa al inicio de la etapa de sacarificación-fermentación es a lo más igual a 95% del equivalente en glucosa que corresponde al almidón de la materia amilada, caracterizado porque se introduce el complemento nutrimental en el medio de sacarificación-fermentación . 16. Procedimiento de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la cantidad de glucosa al inicio de la etapa de sacarificación-fermentación es a lo más igual a 3% del equivalente en glucosa que corresponde al almidón de la materia amilada. 17. Procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 y 16, caracterizado porque el complemento nutrimental se introduce bajo la forma bruta, en la que la cantidad del complemento nutrimental es superior o igual a 4 kg de materia seca y/o inferior o igual a 60 kg de materia seca por tonelada de almidón. 18. Procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, caracterizado porque el complemento nutrimental constituye la fuente principal nutrimental para la levadura del medio de sacarificación-fermentación y/o la fuente principal de ergosterol y/o la fuente principal de nitrógeno y/o ácidos aminados y/o de fósforo y/o de azufre y/o de vitaminas. 19. Procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, caracterizado porque la sacarificación-fermentación se realiza completamente en ausencia de aporte de aire o de oxigeno. 20. Procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, caracterizado porque la sacarificación-fermentación comprende una fase inicial aerobia . 21. Procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, caracterizado porque la sacarificación-fermentación se lleva a cabo en las siguientes condiciones : - Temperatura: de 30°C a 35°C, - pH : ajustado al comienzo de la etapa de sacarificación-fermentación entre aproximadamente 3.5 y aproximadamente 5, inoculo de levadura: aproximadamente 106 a aproximadamente 5.108 UFC de levadura por mL de medio de sacarificación-fermentación, - 20% a 35% de MS, - tiempo de residencia: 20 horas a 72 horas. 22. Cebadas que proceden de un procedimiento de fabricación de etanol de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 21, caracterizadas porque comprenden más de 5 g de ergosterol por tonelada de materias secas de cebadas . 23. Cebadas de conformidad con la reivindicación 22, caracterizadas porque comprenden más de 40%, de preferencia más de 50% de proteínas brutas, en porcentajes sobre la base de materia seca. 24. Cebadas de conformidad con la reivindicación 22, caracterizadas porque comprenden más de 50% de proteínas brutas, en porcentajes sobre la base de materia seca. 25. Uso de un complemento nutrimental de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para favorecer una fermentación alcohólica o una pre-fermentación destinada a la fabricación de una levadura. 26. Procedimiento de fabricación de levadura en aerobiosa en un pre-fermentador , caracterizado porque se agrega en el pre-fermentador vinazas clarificadas y/o vinazas concentradas obtenidas durante el desarrollo de un procedimiento de fabricación de etanol por fermentación alcohólica a partir de primeras materias glucídicas. 27. Procedimiento de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque las vinazas se obtienen durante el desarrollo de un procedimiento de fabricación de etanol en el que se ha incorporado un complemento nutrimental de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13. 28. Procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26 y 27, caracterizado porque las vinazas se obtienen durante el desarrollo de un procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 21. 29. Procedimiento de fabricación de etanol de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 21, caracterizado porque se usa, para la fermentación etanólica, las levaduras obtenidas por un procedimiento de fabricación de levadura de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28, en el que el procedimiento usa vinazas que provienen del procedimiento de fabricación de etanol .