BRPI0708800A2 - complemento nutricional para meio de fermentaÇço alcoàlica, processo de fabricaÇço de etanol, leveduras provenientes de um processo de fabricaÇço do etanol, utlizaÇço de um complemento nutricional e processo de fabricaÇço de fermento em aerobiose em um prÉ-fermentador - Google Patents

Abstract

COMPLEMENTO NUTRICIONAL PARA MEIO DE FERMENTAÇçO ALCOàLICA, PROCESSO DE FABRICAÇçO DE ETANOL, LEVEDURAS PROVENIENTES DE UM PROCESSO DE FABRICAÇçO DO ETANOL, UTILIZAÇçO DE UM COMPLEMENTO NUTRICIONAL E PROCESSO DE FABRICAÇçO DE FERMENTO EM AEROBIOSE EM UM PRÉ-FERMENTADOR. Complemento nutricional para meio de fermentação alcoólica a partir de matérias-primas glicídicas, notadamente amidadas, comportando, e de preferência sendo constituídas, por um princípio ativo proveniente de uma fermentação com um bolor. Pode ser sob forma líquida ou sólida.

Description

"COMPLEMENTO NUTRICIONAL PARA MEIO DE FERMENTAÇÃOALCOÓLICA, PROCESSO DE FABRICAÇÃO DE ETANOL,LEVEDURAS PROVENIENTES DE UM PROCESSO DE FABRICAÇÃODO ETANOL, UTILIZAÇÃO DE UM COMPLEMENTO NUTRICIONALE PROCESSO DE FABRICAÇÃO DE FERMENTO EM AEROBIOSE EMUM PRÉ-FERMENTADOR"

A invenção se refere a um complemento nutricional quefavorece a produção industrial de etanol por fermentação alcoólica segundonotadamente um processo de sacarificação-fermentação simultâneas, a partirde matéria prima glicídica fermentável em etanol, eventualmente apóssacarificação, tal como uma matéria prima amidada, em particular de cereais,notadamente o trigo, e de co-produtos (leveduras, farelo). A invenção serefere igualmente a leveduras de cerveja provenientes deste processo e a umprocesso de fabricação de fermento em aerobiose.

Sabe-se produzir o etanol a partir de uma matéria primaamidada por um processo enzimático que compreende uma etapa deliquefação do amido por uma alfa-amilase que visa solubilizar e hidrolisar oamido em dextrinas. Esta etapa é seguida classicamente por uma etapa desacarificação por um glicoamilase, também denominada amiloglicosidase,visando hidrolisar as dextrinas em glicose. O teor em glicose em fim desacarificação é, então, sensivelmente de 100% do equivalente em glicose quecorresponde ao amido da referida matéria amidada. Em outros termos, todo opotencial em glicose da matéria amidada utilizada foi transformado emglicose.

A glicose é, então, fermentada durante uma etapa defermentação durante a qual é transformada em etanol por um fermento emcondições anaeróbias.

Um eixo de pesquisa para melhorar este tipo de processoenzimático consistiu em tentar fusionar as etapas de fermentação e desacarificação. Os pesquisadores tentaram, assim, realizar a fermentação e asacarificação simultaneamente durante uma etapa única denominada«sacarificação-fermentação», em inglês «simultaneous saccharification andfermentation» ou SSF. O teor em glicose do meio ao início desta etapa única,ou seja na saída de liquefação, é, então, tipicamente inferior a 3% doequivalente em glicose que corresponde ao amido da referida matériaamidada.

Ensaios foram efetuados igualmente para limitar a duração daetapa de sacarificação de modo que o teor em glicose na saída desta etapa sejainferior a 100% do equivalente em glicose que corresponde ao amido dareferida matéria amidada. A etapa de sacarificação é, então, qualificada «présacarificação» ou «sacarificação parcial».

Como se verá mais detalhadamente na seqüência da descrição,os processos de fabricação de etanol que comportam uma etapa de sacarificação incompleta, até não etapa de sacarificação, abaixo denominados«processos com sacarificação incompleta», implicam restrições específicas.Soluções técnicas adotadas no quadro de processos convencionais comsacarificação completa antes de fermentação não podem conseqüentementeser utilizadas a priori com estes processos.

No quadro dos processos com sacarificação incompleta,denomina-se «meio de sacarificação-fermentação», um meio onde se efetuama fermentação e pelo menos uma parte da sacarificação.

Existe uma necessidade permanente de melhorar o rendimentoem etanol dos processos de produção de etanol, notadamente a sacarificaçãoincompleta.

A presente invenção tem por objeto responder a estanecessidade.

De acordo com a invenção, atinge-se este objetivo através deum complemento nutricional por meio de sacarificação-fermentação em umprocesso de fabricação de etanol por fermentação a partir de uma matériaprima amidada que comporta, e de preferência, sendo constituída, por umprincípio ativo proveniente de uma fermentação com um bolor. Pode ser sobforma líquida ou sólida.

Como se verá mais em detalhe na seqüência da descrição, apresença de tal complemento nutricional em um meio de sacarificação-fermentação se revelou particularmente vantajosa para o crescimento e aeficácia do fermento. Resultou uma melhoria significativa do rendimento doprocesso de fabricação do etanol a partir de uma matéria prima amidada.

De preferência, o processo de acordo com a invençãocomporta uma, e de preferência ainda várias, características opcionaisseguintes:

• O complemento nutricional é uma mistura, sólida ou líquida,do princípio ativo e de pelo menos uma enzima útil. A noção de enzima útilinclui notadamente uma ou várias enzimas que têm uma atividade amilásica,notadamente glicoamilásica, proteolítica ou xilanásica, e suas combinações.

• O princípio ativo presente no complemento nutricional deacordo com a invenção está sob forma bruta, ou seja, comportando o substratoempregado durante a fermentação com o referido bolor, ou extrato, ou sejaque é isolado do substrato. Ele é, eventualmente, em mistura com enzimasadicionais. De preferência, o substrato é um farelo de trigo.

• O princípio ativo é escolhido no grupo formado peloergosterol, a N acetilglicosamina, as vitaminas, em particular vitamina B, osácidos nucléicos, os ácidos aminados e, de preferência, suas misturas. Dentreos ácidos aminados, visa-se notadamente um ou vários, de preferência oconjunto dos ácidos aminados seguintes: alanina, arginina, asparagina, ácidoaspártico, valina, leucina, ácido glutâmico. Dentre as vitaminas, nota-se apresença de diferentes vitaminas B, por exemplo B1, B2, B3, B6 e inositol, davitamina E, entre outras.• O complemento nutricional apresenta, durante sua introduçãono meio de sacarificação-fermentação, notadamente em função de umaescolha apropriada do bolor, as seguintes atividades enzimáticas:

- glicoamilásica: pelo menos 500 UG5 de preferência 750 UG,de preferência ainda 1500 UG por grama de matéria seca, e/ou de preferência,

- proteolítica: pelo menos 100 UP, de preferência pelo menos400 UP por grama de matéria seca, e/ou, de preferência,

- xilanásica: pelo menos 100 UX, de preferência pelo menos400 UX por grama de matéria seca.

O complemento nutricional resulta de uma fermentação, depreferência, em meio sólido, de um substrato, de preferência um farelo detrigo, com um bolor, notadamente escolhido dentre as cepas de Aspergillusniger, de preferência escolhido dentre as cepas ATCC 201202, ATCC 76060,ATCC 76061, MUCL 28815, MUCL 28816, NRRL 3112 ou dentre as cepasde Aspergillus orizae, de preferência escolhida dentre as cepas ATCC 22788 eATCC 42149.

• O complemento nutricional é obtido através de um processode acordo com a invenção que compreende as seguintes etapas:

i) pegar o farelo de trigo,

ii) umedecer, acidificar com um pH compreendido entre 4 e 5,de preferência com o ácido nítrico (HNO3) e tratar termicamente o referidofarelo de forma a pasteurizá-lo ou esterilizá-lo, o tratamento térmico sendo, depreferência, posterior a umidificação,

iii) inocular o farelo de trigo resultante por uma cepa deAspergillus niger, escolhida dentre ATCC 201202, ATCC 76060, ATCC76061, MUCL 28815, MUCL 28816, NRRL 3112, ou por uma cepa deAspergillus orizae escolhida dentre ATCC 22788 e ATCC 42149,

iv) fazer fermentar o farelo de trigo no estado sólido em umreator agitado periodicamente, a uma temperatura de 28°C a 38°C, o teor emumidade mantido entre 45% e 65%, de preferência entre 50% e 60% em peso,nas condições de aeração próprias a evitar uma acumulação de dióxido decarbono permanente no farelo de trigo, até que o produto de fermentaçãoapresente os valores mínimos seguintes de atividades enzimáticas:

• glicoamilásica: pelo menos 500 UG, de preferência 750 UG,de preferência ainda 1500 UG por grama de matéria seca e, de preferência,

• proteolítica: pelo menos 100 UP, de preferência 400 UP porgrama de matéria seca,

• xilanásica: pelo menos 100 UX, de preferência 300 UX porgrama de matéria seca.

• O complemento nutricional é um complexo enzimáticoobtido de acordo com um processo descrito em US 2002 037342.

A invenção se refere igualmente a um processo de fabricaçãode etanol a partir de uma matéria glicídica, notadamente amidada,comportando, após uma etapa de liquefação, uma etapa de sacarificação edepois uma etapa de fermentação, ou após uma etapa de liquefação eeventualmente uma etapa de pré-sacarificação, uma etapa de sacarificação-fermentação em um meio de sacarificação-fermentação cujo teor em glicoseno início da etapa de sacarificação-fermentação é, no máximo, igual a 95% doequivalente em glicose que corresponde à matéria glicídica, notadamente aoamido da referida matéria amidada. O processo de acordo com a invenção énotável pelo fato de que se introduz no meio de fermentação ou sacarificação-fermentação um complemento nutricional de acordo com a invenção. Estaintrodução pode ser efetuada diretamente no meio de fermentação ou desacarificação-fermentação, ou durante uma etapa a montante.

De maneira surpreendente, a presença, no meio defermentação ou de sacarificação-fermentação, de um complemento nutricionalde acordo com a invenção, e em particular de um farelo de trigo fermentadocom um bolor, se revelou particularmente favorável para aumentar a eficáciado fermento. Esta última transforma então uma quantidade maior de glicoseem etanol com uma cinética mais favorável.

De preferência, o processo de acordo com a invençãocomporta uma, e de preferência ainda várias, características opcionaisseguintes:

• O teor em glicose no início da etapa de sacarificação-fermentação é no máximo igual a 3%, de preferência a 2%, de preferênciaainda no máximo igual a 1%, do equivalente em glicose que corresponde aoamido da referida matéria amidada. Em outros termos, o processo nãocomporta nem etapa de sacarificação nem etapa de pré-sacarificação.

• O complemento nutricional introduzido sob forma bruta, aquantidade do referido complemento nutricional é superior ou igual a 4 kg dematéria seca, de preferência a 14 kg de matéria seca e/ou inferior ou igual a60 kg de matéria seca, de preferência a 34 kg de matéria seca, de preferênciaainda inferior a 19 kg de matéria seca por tonelada de amido, de preferênciade cerca de 17 kg de matéria seca por tonelada de amido.

• O complemento nutricional é preparado por fermentação deum substrato idêntico à matéria glicídica a qual é aplicada o processo defabricação de etanol.

• A etapa de sacarificação-fermentação é realizadainteiramente em ausência de aporte de ar ou de oxigênio (nada de fase aeróbiapropriamente dita).

• A etapa de sacarificação-fermentação comporta uma faseinicial aeróbia.

• Um fermento é utilizado como agente de fermentaçãoetanólica, notadamente um fermento do tipo Saccharomyces, em particularSaccharomyees eerevisiae. Mais preferencialmente, o fermento é funcionalcom concentrações de etanol superiores a 95 g/l.

• Durante o processo, o referido complemento nutricionalconstitui a principal fonte nutricional para o fermento e/ou a principal fonte deergosterol e/ou a principal fonte de nitrogênio e/ou de ácidos aminados e/oude fósforo e/ou de enxofre e/ou de vitaminas. De preferência, ele constitui aúnica fonte de ergosterol e/ou de nitrogênio e/ou de ácidos aminados e/ou defósforo e/ou de enxofre e/ou de vitaminas.

O processo de acordo com a invenção permite ainda fabricarleveduras de cerveja de uma qualidade nutritiva notável. A invenção se refereconseqüentemente ainda a leveduras de cerveja provenientes de um processode fabricação de etanol de acordo com a invenção e comportando mais de 5 g,de preferência mais de 20 g e/ou menos de 100 g, de preferência menos de 35g, de preferência ainda cerca de 30 g de ergosterol por tonelada de matériassecas leveduras de cerveja.

De preferência, as referidas leveduras de cerveja comportamainda mais de 40%, de preferência mais de 50% de proteínas brutas, emporcentagens com base na matéria seca. Como se verá na seqüência dadescrição, tais teores em proteínas são tornados possíveis pelo consumo deuma parte de hemiceluloses e fibras durante a pré-fermentação ou asacarificação-fermentação.

A invenção se refere por fim, geralmente, à utilização de umcomplemento nutricional de acordo com a invenção para favorecer umafermentação alcoólica destinada à fabricação de etanol ou uma pré-fermentação destinada à fabricação de um fermento.

Outras características e vantagens da presente invençãoaparecerão ainda à luz da descrição que se seguirá e ao exame do desenhoanexado onde a figura 1 representa um esquema de uma parte de um processode fabricação de etanol de acordo com a invenção.

Processos de fabricação de etanol por fermentação de matériaglicídicos, notadamente amidada são bem conhecidos do especialista, epoderão ser adaptados para se tornarem conforme a invenção. O especialista éconseqüentemente capaz de precisar, dependendo do caso, certos pontos dadescrição seguinte.

O processo descrito abaixo se refere à fabricação de etanol apartir de trigo, mas pode ser aplicável a qualquer tipo de matéria amidada, emparticular a qualquer extrato de cereais. Os modos de realização descritosabaixo são, conseqüentemente, apenas exemplos e poderiam ser modificados,notadamente por substituição de equivalentes técnicos, sem sair do quadro dainvenção.

Um processo de fabricação de etanol de trigo de acordo com ainvenção pode, por exemplo, comportar as seguintes etapas:

a) uma etapa de condicionamento de um trigo de maneira apreparar uma trituração de amido de trigo,

b) uma etapa de liquefação do amido, em particular napresença de uma alfa-amilase, de maneira a hidrolisar o amido em dextrinas,

c) opcionalmente uma etapa de pré-sacarificação, emparticular por um conjunto de enzimas, de maneira a hidrolisar as dextrinasem açúcares fermentáveis (glicose, maltose, maltotriose) e os constituintesnão amidados e

d) uma etapa de sacarificação-fermentação, em um meio desacarificação-fermentação que contém as dextrinas e/ou os referidos açúcaresfermentáveis e um fermento, de maneira a produzir o etanol.

Estas diferentes etapas são representadas na figura 1.

A etapa a) consiste em preparar uma trituração de amido detrigo, por exemplo uma farinha, por condicionamento do referido trigo.

A farinha de trigo é, então, misturada em um misturador com aágua, opcionalmente o vinagre, o ácido e uma enzima de liquefação, demaneira a formar «um mosto espesso».

O mosto espesso contém tipicamente de 25 a 35% em massade matérias secas, de preferência de 30 a 35%. A porcentagem de matériassecas é determinada para limitar as despesas energéticas conservando aomesmo tempo uma fluidez satisfatória. Por preocupação econômica, aporcentagem de matéria seca é a mais elevada possível a fim de limitar oscustos da evaporação de vinagres na seqüência do processo. A quantidade defarinha trazida ao misturador é controlada seja por um dosador, seja por umafaixa de pesagem.

De acordo com a enzima de liquefação utilizada, o pH deve serajustado com uma solução de ácido, e.g. ácido sulfurico. De acordo com asenzimas utilizadas, classicamente de alfa-amilases bacterianas, notadamentetermoestáveis, um sal de cálcio pode ser eventualmente empregado. A vazãode ácido é controlada através de uma sonda de pH instalada sobre a misturaágua/vinagres antes do empastador. O pH pode classicamente variar entre 5 e6,5, de acordo com as enzimas utilizadas.

A liquefação (etapa b)) é, então, realizada a uma temperaturacompreendida entre 80°C e 95°C. O mosto espesso pode ser levado a estatemperatura por meio de uma injeção direta de vapor na bacia de liquefaçãopor tubulações ou por um jet-cooker. No segundo caso, o mosto espesso élevado durante alguns segundos a uma temperatura compreendida entre IOO0Ce 15O0C através de uma injeção de vapor em uma tubulação antes de serresinado rapidamente entre 80°C e 95°C. As bacias de liquefação podem seragitadas.

As características preferidas da etapa de liquefação são asseguintes:

Temperatura: 80°C a 90°CpH: 5,5-6,5

Matéria seca: 30% a 35%

Tempo de permanência: 30 minutos a 2 horas.

A etapa b) conduz à hidrólise do amido em dextrinas.

No caso de pré-sacarificação (etapa c)), o mosto liqüefeito éresfriado nas trocas térmicas de tipo trocadores com placas ou trocadorestubulares a uma temperatura compreendida entre 50°C e 60°C.

Em certos casos, uma diluição do mosto liqüefeito pode serefetuada com um diluente tal como a água ou vinagres de reciclagem ou asflegmassas que provêm da destilaria.

Na etapa c), etapa opcional, o mosto liqüefeito de preferência écolocado na presença de um complexo enzimático que apresenta as atividadesenzimáticas desejadas.

As vazões de enzimas são, de preferência, submetidas à vazãode mosto que entra, à concentração em glicose produzida e ao teor de amidorestante. O objetivo desta dependência é preparar uma solução desprovida deamido ao fim de fermentação.

As características preferidas da etapa c) de pré-sacarificaçãosão as seguintes:

Temperatura: 50° a 60°C

pH: 4 a 5

Tempo de permanência: até a obtenção do teor em glicoseprocurado, geralmente inferior a 24 h.

As bacias de pré-sacarificação são submetidas a uma agitaçãomecânica que permite uma boa homogeneização do mosto ao longo desacarificação e por aí mesmo uma colocação em contato facilitada entre asenzimas e as dextrinas a hidrolisar.

A utilização do complexo enzimático proveniente dafermentação de farelo de trigo por um bolor permite vantajosamente reduzir aviscosidade do mosto sacarificado e aumentar a concentração de nitrogênio noreferido mosto.

De acordo com a invenção, a sacarificação não prossegue até ahidrólise total das dextrinas em glicose, mas interrompida no momento emque a hidrólise é apenas parcial. De acordo com a invenção a taxa de glicoseno fim da etapa de pré-sacarificação é inferior a 95%, de preferência, inferiora 50%, de preferência, ainda inferior a 5%. A hidrólise prossegueconseqüentemente durante a etapa de sacarificação-fermentação.

Se o processo de acordo com a invenção não comporta umaetapa de sacarificação parcial, ou «pré-sacarificação», o teor em glicose noinício da etapa d) de sacarificação-fermentação é no máximo igual a 3%, depreferência a 2%, de preferência, ainda no máximo igual a 1%, do equivalenteem glicose que corresponde ao amido da referida matéria amidada.

Na etapa d), o mosto é colocado na presença de um fermento no meio de sacarificação-fermentação.

Também é colocado na presença de um complementonutricional de acordo com a invenção. A ordem de incorporação do fermentoe do complemento não tem importância.

O conjunto é agitado durante toda a condução da etapa d).

Todos os fermentos utilizados para a produção de etanolpodem ser utilizados, em particular fermentos do tipo Saccharomyces.Habitualmente, o fermento é introduzido no meio de sacarificação-fermentação em condições aeróbias. Durante esta fase, o fermento realizadiversas divisões celulares. O fermento não transforma então a glicose emetanol, mas pelo contrário consome glicose para seu crescimento. Paramelhorar este crescimento celular, sabe-se trazer ao meio de sacarificação-fermentação complementos nutritivos. Além disso, a fim de limitar ocrescimento celular, cujo consumo de glicose aferente diminui o rendimentode produção de etanol, é preferível semear o meio de sacarificação-fermentação com uma quantidade de fermento tal que a produção de etanolpelos fermentos permite rapidamente atingir concentrações de etanol no meiode cultura que se opõe ao crescimento celular do fermento.

De acordo com uma primeira modalidade, a etapa d) começaem aerobiose o tempo necessário a uma multiplicação suficiente do fermento.O meio de sacarificação-fermentação é em seguida colocadosob condições anaeróbicas. O fermento transforma então a glicose em etanol.

De acordo com uma segunda modalidade, a etapa d) éconduzida inteiramente em anaerobiose. A presença do complementonutricional de acordo com a invenção permite passar da fase inicial aeróbia.

As características preferidas da etapa d) de sacarificação-fermentação são as seguintes:

Temperatura: de 3O0C a 35°C

pH: ajustado no início da etapa d) com o ácido (e.g. ácidosulfurico) entre 3,5 e cerca de 5, de preferência entre 3,8 e cerca de 5, depreferência ainda entre 4 e cerca de 5, melhor ainda entre 4 e cerca de 4,5.

após ajustamento do pH no início da etapa d), graças ao efeitotampão do complemento nutricional, não se prevê regulação do pH durante aseqüência da etapa d)

inoculação de fermento: cerca de IO6 a cerca de 5.IO8 UPC defermento (unidades que formam colônias) por ml de meio de sacarificação-fermentação, de preferência de cerca de IO7 UFC de fermento por ml de meiode sacarificação-fermentação.

20% a 35%, notadamente 20% a 30% de MSTempo de permanência: 20 horas a 72 horas, notadamente 20horas a 60 horas. O tempo de permanência aumenta com a MS.

O meio de sacarificação-fermentação de acordo com ainvenção contém um complemento nutricional de acordo com a invenção.

Este complemento pode ser introduzido diretamente no meio de sacarificação-fermentação ou durante uma etapa a montante. De maneira surpreendente, aadição no meio de sacarificação-fermentação de tal complemento nutricional,notadamente de um farelo de trigo fermentado com um bolor, se revelouparticularmente favorável para aumentar a eficácia do fermento. Estatransforma então uma quantidade maior de glicose em etanol com umacinética mais favorável. Além disso, o complemento nutricional de acordocom a invenção permite reduzir a duração da fase aeróbia no início da etapade sacarificação-fermentação, ou mesmo suprimi-la. Vantajosamente, orendimento é melhorado. Vantajosamente ainda, o complemento nutricionalde acordo com a invenção permite diminuir a mortalidade celular em relaçãoa uma cultura idêntica conduzida na ausência do complemento nutricional.Por último, sua presença tem um efeito tampão que evita dever regular o pH.

De acordo com a invenção, de preferência, o meio desacarificação-fermentação contém inicialmente, para 1.000 kg de amidointroduzidos inicialmente, entre 2,5 kg e 35 kg de complemento nutricional,notadamente farelo de trigo fermentado, em particular entre 8 e 10 kg decomplemento nutricional, notadamente farelo de trigo fermentado, para 1.000kg de amido.

A presença no meio de sacarificação-fermentação do farelo detrigo fermentado permite conseqüentemente reduzir consideravelmente otempo de sacarificação-fermentação.

Pareceria que este complemento nutricional traz nutrientesperfeitamente adaptados ao fermento, em proporções e sob uma forma ótima,em particular para as culturas anaeróbias

Sem estar vinculado por uma teoria, os inventores explicamestes resultados da seguinte maneira. Eles descobriram a presença, nocomplemento nutricional utilizado de acordo com a invenção, de ácidosaminados necessários para o fermento. Estes ácidos aminados contribuiriamassim para a nutrição nitrogenada do fermento de maneira muito eficaz,notadamente muito mais eficaz do que os simples sais de amônio utilizadosaté agora, reduzindo além disso a síntese de co-produtos de fermentados taiscomo o glicerol e melhorando de fato o rendimento em etanol.

A presença de vitaminas no complemento nutricional deacordo com a invenção permitiria também explicar uma melhor eficácia dofermento.

Por último os inventores descobriram que o complementonutricional de acordo com a invenção contém o ergosterol e a N-acetilglicosamina, que são constituintes importantes do fermento. Suapresença no meio de sacarificação-fermentação ajuda ao crescimento e aobom funcionamento do fermento anaerobiose completo. Nestas condições, suasíntese é com efeito impossível pelo fermento. A presença de ergosterolpermite então vantajosamente reduzir, até suprimir a fase aeróbia no início dasacarificação-fermentação.

Os ensaios da tabela 1 abaixo no entanto demonstraram que aadição dos nutrimentos identificados não conduz a um meio de sacarificação-fermentação tão eficiente quanto a adição de um complemento nutricional deacordo com a invenção. E então efetivamente a combinação do conjunto dosconstituintes deste complemento nutricional, nas proporções que resultam dafermentação com um bolor, e de preferência sua apresentação sob a forma deum farelo de trigo, que são a origem dos desempenhos excepcionais obtidos.

O complemento nutricional pode não apresentar atividadesenzimáticas particulares ou atividades enzimáticas ótimas. Adiçõesenzimáticas são então necessárias.

De preferência no entanto, o complemento nutricional deacordo com a invenção apresenta igualmente atividades enzimáticas úteis noquadro do processo de fabricação do etanol. Em particular, é preferível que ocomplemento nutricional apresente uma atividade glicoamilásica superior a500 UG por grama de matéria seca. De preferência ainda o complementonutricional apresenta uma Atividade de proteolítica superior a 100 UP porgrama de matéria seca e/ou uma Atividade de xilanásica de pelo menos 100UX por grama de matéria seca.

Assim, embora a utilização de outras enzimas tais comoenzimas purificadas ou complexos de enzimas purificadas seja possível, épreferível, de acordo com a invenção, utilizar um complemento nutricionalfermentado em condições que lhe permitam apresentar as referidas atividadesenzimáticas. De preferência, este complemento nutricional é, então,introduzido na etapa d), e/ou se for caso, na etapa c), como complexoenzimático.

De preferência, o complemento nutricional é um farelo detrigo fermentado preparado ou susceptível de ser obtido segundo o processode acordo com a invenção seguinte:

i) pegar o farelo de trigo,

ii) umedecer e tratar termicamente o referido farelo de forma apasteurizá-lo ou esterilizá-lo, o tratamento térmico de preferência posterior aumidificação,

iii) inocular o farelo de trigo resultante por uma cepa deAspergillus niger, escolhida dentre ATCC 201202, ATCC 76060, ATCC76061, MUCL 28815, MUCL 28816, NRRL 3112, de preferência dentreATCC 76061 e NRRL 3112, de preferência ainda a cepa ATCC 76061 oudentre as cepas de Aspergillus orizae ATCC 22788 e ATCC 42149.

iv) fazer fermentar o farelo de trigo no estado sólido, depreferência sob forma de uma camada de mais de 10 cm de espessura, em umreator agitado periodicamente, a uma temperatura de 28°C a 38°C, o teor emumidade sendo mantido entre 45% e 65%, de preferência entre 50% e 60%em peso, em condições de aeração próprias a evitar uma acumulaçãopermanente de dióxido de carbono no farelo de trigo, até que o produto defermentação apresente os valores de atividades enzimáticos mínimosseguintes:

• glicoamilásica: pelo menos 500 UG, de preferência 750 UG,de preferência ainda 1500 UG por grama de matéria seca e, de preferência,

• proteolítica: pelo menos 100 UP, de preferência 400 UP porgrama de matéria seca, e de preferência ainda,• xilanásica: pelo menos 100 UX, de preferência 400 UX porgrama de matéria seca.

Na etapa i), o farelo de trigo é escolhido de preferência demaneira a ter uma proporção de pelo menos 40% em massa de partículasinferiores a 1 mm.

Na etapa ii), o farelo de trigo deve ser umedecido e tratadotermicamente para pasteurizá-lo ou esterilizá-lo. É vantajoso que o tratamentotérmico não preceda a umidificação, pois se observou resultados defermentação medíocres se se trata termicamente o farelo antes de umedecê-lo.

O tratamento térmico pode consistir em um aquecimento porexemplo em uma autoclave. Tratamento em autoclave de 20 minutos entre120 e 121°C se revelou muito satisfatório. Condições menos severas depasteurização a 105°C, durante 15 minutos em estufa também convém. Éigualmente possível operar o tratamento térmico do farelo e ali injetar o vaporde água, o que permite operar simultaneamente à umidificação do farelo.

De preferência, se regula o pH, de preferência com o ácidonítrico, durante a umidificação em uma gama de 4 a 5,5 a fim de melhorar oefeito pasteurizante do tratamento térmico e provocar a fermentação desejada.A utilização de ácido nítrica é particularmente vantajosa, o ácido nítrico sendoutilizado igualmente como fonte de nitrogênio para o bolor.

Para além de sua função de esterilização, o tratamento térmicotem por efeito favorecer a gelatinização do amido contido no farelo de trigo e,conseqüentemente a disponibilidade deste substrato para os cogumelosAspergillus niger e Aspergillus orizae, o que permite fermentações maiseficazes.

A umidificação do farelo é importante pois o teor de águainfluencia o desempenho da fermentação. Ela é determinada de modo que oteor de água do farelo esteja, no início da etapa iv) de fermentação, na gama50-60%, de preferência 50-55%, da massa total do farelo e da água.Na etapa iii), a inoculação do farelo de trigo pode ser praticadacom qualquer inoculação apropriada. O especialista conhece múltiplasmaneiras de preparar uma inoculação conveniente a partir de uma cepaselecionada. A dose de inoculação é vantajosamente de pelo menos IO7esporos/ grama de matéria seca inicial.

Na etapa iv), a fermentação pode ser conduzida em qualquerreator apropriado. Exemplos de reatores utilizáveis são esses descritos noartigo de A. DURAND et Coll. publicado em Agro-Food-Industry Hi-Tech(Maio-Junho de 1997, páginas 39-42).

A fermentação deve ser conduzida até que a atividadeglicoamilásica seja de pelo menos 500 UG5 de preferência de pelo menos 750UG5 de preferência ainda de pelo menos 1500 UG por grama de matéria secade farelo, ou seja normalmente durante um período de 1 a 3 dias, depreferência de 30 a 60 horas. Abaixo de 1 dia, a fermentação está demasiadaincompleta. Ao final de 3 dias a fermentação é finalizada ou quase finalizadade modo que seria não econômico prolongá-la além.

A temperatura do meio é mantida entre 28°C e 38°C, depreferência entre 32°C e 36°C, o que corresponde ao domínio de atividadeótima conhecido das cepas utilizadas. Vantajosamente, para esse efeito, atemperatura do ar é regulada entre 34°C e 38°C durante as primeiras horas dafermentação para favorecer a germinação de esporos, e depois reduzida entre28°C e 32°C para o resto da fermentação para contribuir à regulação datemperatura do meio.

O teor em umidade do farelo de trigo é compreendidonormalmente entre 50% e 60%. A taxa de umidade pode no entanto se afastar+/- de 5 unidades % do intervalo de 50-60% durante relativamente um breveperíodo entre dois ajustamentos sucessivos da taxa de umidade ou ao fim defermentação. Convém, em todo caso, não descer abaixo de uma taxa umidadede 45%. A taxa de umidade do meio de cultura tende a se reduzir durante acultura por evaporação sob o efeito do aumento de temperatura gerado pelocrescimento do fungo, o referido meio sendo um mal condutor de calor. Deve-se conseqüentemente manter o teor em umidade durante a fermentação, porexemplo procedendo periodicamente a aportes de água para compensar aperda de água do meio. A qualidade de água utilizada desempenha tambémum papel não negligenciável. Pode-se utilizar uma água corrente de boaqualidade ou a água destilada.

O pH do meio de fermentação habitualmente não é controlado.Como explicado precedentemente ele é, de preferência, ajustado inicialmenteentre 4 e 5.

Se seu valor de partida é próximo de 6,0-6,4, o pH é reduzidoa 3,8-4,2, ao longo da cultura, e depois sobe no fim. Este retorno é correlatogeralmente com a fase de esporulação do cogumelo. O acompanhamento daevolução do pH constitui um bom indicador do estado da cultura.

O fermentador deve ser arejado, de preferência continuamente,a fim de trazer o oxigênio necessário para a fermentação e evitar aacumulação excessiva de dióxido de carbono produzida pela fermentação.Além disso, a ventilação participa no controle da temperatura e da umidadedo meio de cultura. O ar é, de preferência, saturado sensivelmente em águapara limitar a tendência ao ressecamento drenagem do meio. É difícil darindicações quantitativas sobre a vazão de ventilação, pois múltiplas variáveis,em particular a dimensão e a geometria do reator, a quantidade do farelocarregada, etc., intervém. Simples ensaios de rotina permitirão, no entanto, aoespecialista determinar facilmente uma vazão de ventilação conveniente emcada caso prático, geralmente uma vazão de ar de 1 a 2 m3/h por kg dematéria seca é apropriado, a sobrepressão é, de preferência, entre 0,5 e 1 bar.

A carga de farelo no fermentador deve periodicamente seragitado, durante a fermentação através de meios de agitação tais como braçosagitadores, lâminas ou espátulas, ou parafusos sem fim para evitar a formaçãode massas impermeáveis e para que a ventilação atinja da maneira maishomogênea possível toda a massa de farelo. De maneira surpreendente, ascepas empregadas se opõem à agitação. É necessário, no entanto, evitar umaagitação demasiado vigorosa.

O farelo de trigo fermentado utilizado no processo de acordocom a invenção pode ser secado ou congelado com vistas a sua conservação,se desejado ou resfriado e utilizado sem transformação suplementar.

A secagem é, de preferência, realizada a uma temperaturamoderada para não afetar a atividade enzimática. Um aquecimento em estufaa 40°C se revelou apropriado. A nível industrial, de preferência ventila-se arseco entre 35 e 45°C, de acordo com o bolor utilizado. O congelamento, porseu lado, pode ser realizado sobre o produto úmido à baixa temperatura, porexemplo à -20°C.

US 2002 037342 divulga um complexo enzimático comatividades glicoamilásica, proteolítica e xilanásica obtido por fermentação defarelo de trigo com cepas de Aspergillus. Este complexo pode ser utilizadocomo complemento nutricional de acordo com a invenção.

De uma maneira geral, não se pode prever o efeito, no quadrode um processo que comporta uma etapa de sacarificação pelo menos emparte simultânea com a fermentação, de uma enzima, ou de uma composiçãomultienzimática cuja utilização é conhecida no quadro de um processo cometapas de sacarificação e de fermentação separadas. Isto é, em particular,verificado quando a adição de uma composição implica, como a composiçãode US 2002 037342, a incorporação de substâncias tais como hemicelulosessusceptíveis de aumentar a viscosidade durante a fermentação.

Este documento descreve a utilização desta composição a fimde melhorar as condições da etapa de sacarificação. Ele não sugere de modonenhum que ela possa apresentar um interesse com um processo que nãocomporte etapa de sacarificação, ou apenas uma etapa de pré-sacarificação.(pág. 16, linha 19)

Com efeito, as condições ótimas para a sacarificação e para afermentação são muito diferentes. Em particular, a sacarificação se efetuacorrentemente a cerca de 60°C, ou seja, a uma temperatura que não convémaos fermentos habitualmente utilizados durante a fermentação.Reciprocamente, como ilustrado pela tabela 7 de US 2002 037342, as enzimasda composição US 2002 037342 apresentam uma atividade enzimática ótimaàs temperaturas de sacarificação, mas, de acordo com qualquer expectativa,apresentariam uma atividade enzimática degradada no caso de sacarificação-fermentação simultânea.

Além disso, as enzimas da composição US 2002 037342 sãoconhecidas por diminuir a viscosidade do meio de sacarificação à temperaturade sacarificação (ver tabela 8), mas o especialista poderia esperar que estadiminuição de viscosidade não se reproduzisse à temperatura de fermentação,em todos casos em uma medida que torna aceitável a viscosidade do meio desacarificação-fermentação.

O especialista não teria, então, tentado utilizar a composiçãode US 2002 037342 em um processo de fabricação de etanol que nãocomporta etapa de sacarificação, ou apenas uma etapa de pré-sacarificação.Menos ainda a supressão da sacarificação, ou uma limitação de sua duração,pode às vezes conduzir a um meio de sacarificação-fermentação contaminadode maneira redibitório, exceto quando dever acrescentar grandes quantidadesde agentes bacterioestáticos. Com efeito, a temperatura sacarificação permiteuma proteção contra as contaminações bacterianas.

A invenção se refere, então, do mesmo modo à utilização deum farelo de trigo obtido de acordo com o processo descrito previamente oude acordo com o farelo de trigo descrito em US 2002 037342 para favorecer afermentação alcoólica em um meio de sacarificação-fermentação. Depreferência, mais de 4 kg deste farelo estão presentes no meio desacarificação-fermentação, no início da etapa d) para 1.000 kg de amido.

Vantajosamente, no modo de realização preferido da invenção,o complemento nutricional é um complexo multienzimático obtido porfermentação de um farelo de trigo com um bolor e:

constitui um meio de valorização de farelos provenientes daetapa a) de preparação da farinha de trigo,

traz simultaneamente várias enzimas úteis, simplificandoassim o processo, e

é um excelente complemento nutricional para o fermento.

Neste último efeito, a quantidade mássica de complexomultienzimático deve no entanto ser muito mais elevada do que de acordocom a técnica anterior.

A pesquisa atual tende a fabricar complexos multienzimáticoscada vez mais concentrados, a fim de limitar as quantidades mássicasintroduzidas. Os processos são simplificados.

Na contra-corrente desta tendência, os inventoresconseqüentemente descobriram que ao contrário da incorporação de mais de 4kg de matéria seca, e de preferência de mais de 14 kg de matéria seca, depreferência ainda de cerca de 19 kg de matéria seca de farelo de trigofermentado por tonelada de amido de partida permite melhorar a eficáciaglobal do processo de fabricação do etanol.

Na saída da etapa d), o mosto fermentado ou «vinho» queprovém da sacarificação-fermentação, após passagem em um trocadortérmico, alimenta colunas a destilar.

Os vinagres que saem ao pé da coluna são enviados para aoficina de separação de leveduras de cerveja para serem clarificados pormétodos clássicos, tipo centrifugação, a fim de separar matérias solúveis dematérias insolúveis.

As leveduras de cerveja úmidas obtidas após esta etapa deseparação são compostas de cerca de 35% de matéria seca, os vinagresclarificados são compostos de cerca de 7% a 10% de matéria seca.

Os vinagres clarificados são concentrados por evaporação novácuo para obter um xarope ou «vinagre concentrados» com uma taxa dematéria seca próxima de 35%.

O xarope obtido pode então ser misturado às leveduras decerveja úmidas. A mistura é, em seguida, secadas e obtém-se cerca de 350 kgde leveduras de cerveja assim secados por tonelada de trigo, a taxa de matériaseca dessas leveduras de cerveja sendo de cerca de 90%.

As leveduras de cerveja obtidas após secagem apresentamcaracterísticas nutricionais notáveis, em particular para o gado, e sãoigualmente um objeto da invenção. Os 350 kg de leveduras de cerveja obtidasde acordo com a invenção comportam com efeito entre 2 g e 35 g deergosterol, de preferência de cerca de 10 g. Ora o ergosterol é um precursor dasíntese da vitamina D2 e apresenta conseqüentemente um interesse para asaúde assim como um interesse nutricional para os fermentos, notadamenteem anaerobiose.

Além disso, no caso do complemento nutricional for um farelode trigo fermentado de acordo com o processo segundo a invenção descritaacima, as leveduras de cerveja obtidas contêm um excesso de proteínas.

Os vapores de álcool de colunas são condensados nostrocadores térmicos. O azeotropo recuperado na cabeça de coluna é secadopor métodos clássicos, por exemplo utilizando peneiras moleculares.

O processo de acordo com a invenção permite obter cerca de375 litros a 390 litros de etanol para uma quantidade inicial 1.000 kg de trigo.Quer, de maneira notável, até 91% do rendimento estequiométrico datransformação por fermentação da glicose em etanol para um trigo quecontém cerca de 60% de amido.

Sem estarem ligados por esta teoria, os inventores explicamestes resultados pela substituição de um aporte de nitrogênio exógeno, porexemplo, sob a forma de sulfato de amônio, por nitrogênio aminado livre.Esta substituição reduz vantajosamente a síntese de co-produtos fermentares,em particular de glicerol e conseqüentemente aumenta o rendimento.

A invenção se refere também a um processo de fabricação defermento em aerobiose, ou «propagação de fermento», podendo em particularser utilizado em pré-fermentação a fim de preparar um fermento empregadoem um meio de fermentação ou um meio de sacarificação-fermentação de umprocesso de fermentação alcoólica da glicose em etanol.

Neste tabela, a etapa de pré-fermentação tem geralmente porobjetivo aumentar a concentração em fermento no meio de pré-fermentaçãode cerca de IO6 - IO7 UFC por ml no mínimo de cerca de IO8 UFC por ml demeio de pré-fermentação, de preferência no mínimo de cerca de 5.IO8 UFCpor ml de meio de pré fermentação.

A pré-fermentação é efetuada em pré-fermentadores onde atemperatura é rigorosamente controlada e regulada, por exemplo, por umsistema de placas de resfriamento no qual circula um líquido de resfriamentodentro ou fora das cubas de pré-fermentação. Qualquer multiplicação demicro-organismos provoca com efeito uma elevação de temperatura que podese tornar inibidora para a propagação de fermentos. A temperatura nos pré-fermentadores é mantida classicamente entre 30°C e 35°C.

Um aporte de oxigênio, por exemplo, sob a forma de arcomprimido, é um indispensável para a propagação do fermento.

A fim de favorecer o desenvolvimento dos fermentos, sabe-seacrescentar no meio nutritivo:

nitrogênio trazido sob formas diversas tal como a uréia, oamoníaco, os sais de amônio,

fósforo trazido sob formas diversas tais como o ácidofosfórico, os fosfatos,enxofre trazido sob formas diversas tais como o ácidosulfórico, os sulfatos,

minerais essenciais.

De acordo com a técnica anterior, acrescenta-se igualmente aomeio nutritivo mosto que sai da etapa de liquefação, de sacarificação ou depré-sacarificação. Este mosto traz assim açúcares fermentáveis mas conduz auma baixa do rendimento global da fermentação alcoólica. Existeconseqüentemente uma necessidade para um processo de fabricação defermento em aerobiose que pode ser utilizado em pré-fermentação a fim depreparar um fermento empregado em um meio de fermentação ou em ummeio de sacarificação-fermentação de um processo de fermentação alcoólicada glicose em etanol e que limitaria esta baixa de rendimento.

De acordo com a invenção, se atinge este objetivoacrescentando nos pré-fermentadores pelo menos uma parte de vinagresclarificados, ou seja obtidos da etapa de separação, e/ou de vinagresconcentrados obtidos durante o emprego de um processo de fabricação deetanol por fermentação alcoólica a partir de matérias primas glicídicas,notadamente amidadas e/ou de acordo com a invenção.

Os vinagres podem resultar de um processo de fabricação deetanol que comporta uma etapa de sacarificação-fermentação ou no qual asetapas de sacarificação e de fermentação são completamente separadas.

De preferência, os vinagres resultam de um processo defabricação de etanol de acordo com a invenção, no qual um complementonutricional de acordo com a invenção foi introduzido.

Assim, a invenção se refere igualmente a um processo defabricação de etanol tal como foi definido acima, no qual se utiliza, para afermentação etanólica, fermentos obtidos por um processo de fabricação defermento tal como foi definido acima, o qual processo utiliza vinagres queprovêm do referido processo de fabricação de etanol.A utilização de vinagres que resultam de um processo defabricação de etanol de acordo com a invenção, no qual complementonutricional de acordo com a invenção foi introduzido, para a produção defermento nos pré-fermentadores, é particularmente um vantajoso dado queisto permite dissociar a produção de etanol pelos fermentos por um lado e ocrescimento celular de fermentos por outro lado. Com efeito, os vinagresresultantes de um processo de fabricação de etanol de acordo com a invençãoconstituem um meio nutricional que permite fazer crescer os fermentos até aum nível compatível com uma semeadura elevada do meio de fermentação oude sacarificação-fermentação, o que provoca uma utilização pelos fermentosde açúcares fermentáveis presentes no meio de fermentação ou desacarificação-fermentação principalmente para a produção de etanol, e nãopara o crescimento celular, como foi assinalado precedentemente. Assim, osaçúcares fermentáveis que provêm do substrato glicídico de partida sãoprincipalmente utilizados para a produção de etanol, enquanto sãoprincipalmente açúcares não fermentáveis que servem ao crescimento celular.

O rendimento global de produção etanólica a partir do substrato glicídico departida se encontra conseqüentemente melhorado em relação aos processosnos quais os açúcares fermentáveis são utilizados pelos fermentos ao mesmotempo para a produção de etanol e para o crescimento celular.

Um modo de realização particular de tal processo é descrito nafigura 2.

De preferência, a mistura nutritiva de pré-fermentação contémvinagres e é isenta de produtos intermédios obtidos durante o emprego de umprocesso de fabricação de etanol por fermentação alcoólica a partir dematérias primas amidadas, em particular os vinagres não são misturados commosto proveniente das etapas intermédias de um processo de fabricação deetanol por fermentação alcoólica a partir de matérias primas amidadas.

De acordo com outra modalidade preferida, o meio nutritivode pré-fermentação se compõe ou compreende uma mistura de vinagres e demosto liqüefeito, eventualmente da água.

De acordo ainda com outra modalidade preferida, o meionutritivo de pré-fermentação se compõe ou compreende de uma mistura devinagres e de complemento nutricional de acordo com a invenção, emparticular farelo de trigo fermentado, eventualmente da água.

Por último pode-se igualmente formar um meio nutritivocomposto ou que compreende o conjunto de elementos pré-citados.

O meio nutritivo de pré-fermentação de acordo com ainvenção contém de preferência uma quantidade de matéria seca tal como aagitação e/ou a aeração do meio é suficiente para sustentar uma produçãoótima de etanol, por exemplo, de 15% a 20% de matéria seca.

Para o processo de fabricação de fermento de acordo com ainvenção, o complemento nutricional de acordo com a invenção pode ser umfarelo de trigo fermentado. Os vinagres provenientes do meio de fermentaçãoou de sacarificação-fermentação apresentam uma composição, e notadamenteum teor em açúcares utilizáveis pelo fermento em aerobiose, particularmentefavorável ao desenvolvimento do fermento nos pré-fermentadores. O meio depré-fermentação pode ser completado pelos elementos nutritivos exógenoscomo o glicerol ou soluções de glicerol assim como hidrolisantes obtidos apartir de leveduras de cerveja úmidas. Isto permite, vantajosamente,economizar glicose do mosto de acordo com a invenção e conseqüentementelimitar a referida baixa de rendimento.

De preferência pelo menos uma parte de vinagres é recicladapor incorporação no meio nutritivo de pré-fermentação. É igualmentepreferível reciclar vinagres após concentração a fim de limitar a diluição domeio nutritivo do fermentador.

De preferência, os vinagres presentes no meio nutritivo de pré-fermentação substituem completamente o mosto que sai da etapa deliquefação, de sacarificação ou de pré-sacarificação. Esta substituição pode noentanto ser apenas parcial.

A adição de um complemento nutricional de acordo com ainvenção, em particular de farelo de trigo fermentado permite igualmentemelhorar a pré-fermentação, notadamente por enriquecimento do meionutritivo em:

- nitrogênio, trazido sob a forma de ácidos aminados,

- fósforo,

- enxofre,

- vitaminas e minerais essenciais,

- proteínas.

Esta adição pode ser efetuada diretamente no meio nutritivo depré-fermentação, ou após mistura com mosto que sai da etapa de liquefação,esta mistura sendo acrescentada, após uma eventual diluição, no fermentador.

A utilização de fermentos pré-fermentados a partir de vinagresprovenientes de um processo de fabricação de etanol de acordo com ainvenção permite igualmente, de modo vantajoso, enriquecerconsideravelmente em proteínas as leveduras de cerveja secadas obtidas nofim do processo de fabricação de etanol de acordo com a invenção. Asreferidas leveduras de cerveja podem então comportar mais de 40% deproteínas e de preferência pelo menos 50% de proteínas, com base na massade matéria seca.

As diversas atividades enzimáticas citadas na descrição e asreivindicações foram medidas pelos seguintes processos:

Atividade glicoamilásica.

A ação de uma preparação de glicoamilase (GA) sobre umasolução de amido solúvel provoca a liberação de açúcares redutores.

Aquecidos a IOO0C na presença de ácido 3,5-dinitrossalicílico (DNS), estascomposições ganham uma coloração parda medida ao espectrofotômetro(Kontron Instrumentos, Milão, Itália) a 540 nm.O meio reacional contém:

Solução de amido a 1,5% no caso de Aspergillus niger e a 2%

A reação se desenrola durante 20 minutos a 60°C no caso doAspergillus niger, durante 5 minutos a 50°C no caso do Aspergillus orizae.Retiradas de 100 μl de meio reacional são realizadas a cada 4 minutos no casodo Aspergillus niger e todos os minutos no caso do Aspergillus orizae,misturados com 500 μl de DNS e 400 μΐ de tampão citrato com pH 4,5. Oconjunto é, em seguida, aquecido 5 minutos a 100°C, resfriado rapidamente edepois dosado a 540 nm face a um branco de uma mistura de 500 μl deDNS e 500 μl de tampão citrato com pH 4,5.

Estas condições de dosagem foram estabelecidas após ter-seestudado a influência da temperatura e do pH sobre a atividade daspreparações de GA. O amido solúvel Merck (Darmstadt, Alemanha) foiempregado como substrato desta hidrólise enzimática. O DNS é preparado deacordo com o protocolo proposto por P. Bernfeld, Methods in enzymology, 1,149-158 (1955) que é o seguinte:

♦ Dissolver previamente:

o 10 g de ácido 3,5-dinitrosalicílico,

o 200 ml de soda 2 molares

o 200 ml de água destilada.

♦ Acrescentar em seguida:

o 300 g tartrato duplo de sódio potássio.

♦ Completar o volume com 1 litro com a água destilada apósdissolução total.

Uma vez preparado, este reagente deve ser conservado aono caso de Aspergillus orizae

1000 μl

900 μl

100 μl

Tampão citrato de 0,1 M com pH 4,5

Solução enzimática:abrigo da luz. As curvas de padronização foram estabelecidas com a glicosecomo produto de referência para a dosagem da atividade glicoamilase ou parao acompanhamento de reações de liquefação-sacarificação, e com xilose paramedir a Atividade de xilanase.

Uma unidade de atividade glicoamilase (UG) corresponde àquantidade de enzima necessária para a liberação de um micromol deextremidades redutoras por minuto nas condições da dosagem com a glicosecomo referência. A atividade glicoamilase, calculada com ajuda da fórmulaindicada abaixo, é trazida à quantidade de matéria seca inicial (MSI):

<formula>formula see original document page 30</formula>

enz ferm

♦A corresponde à atividade GA expressa em UG.gMSI"1

(μmol.min^-1gMSI^-1),

♦ P corresponde à velocidade de liberação de equivalentesglicose em μmol.min^-1,

♦ Venz representa o volume da solução de enzimas dosada emml,

♦ Vferm é o volume total de água destilada utilizado para extraira solução de enzimas em ml,

♦ Mferm, expresso em g de MSI, corresponde à massa inicial deproduto seco da qual foi extraída a solução de enzimas.

Atividade de protease

Esta dosagem foi desenvolvida sobre a azocaseína de acordocom o método de Béinon, descrito na obra «Proteins Purification Methods - aPractical Approach», Harris E.L.V. e Angal, S (Editores), IRL-Press, OxfordUniversity Press, 1-66 (1989). A degradação deste substrato de proteasesprovoca a liberação de grupamentos azo que absorvem no UV a 340 nm. Aevolução da absorção durante a cinética de hidrólise desta proteína indica aimportância da reação.

O meio reacional contém:o Solução de azocaseína a 1%, pH 5,0: 1.000 μl

o Solução enzimática: 200 μl

A azocaseína (Sigma, Sanit-Louis, Estados Unidos) édissolvida em um tampão acetato 0,1 mol.l"1 com pH 5,0. Dosaram-se asatividades proteases a este pH pois a azocaseína é insolúvel no tampão acetatocom pH inferiores. A reação enzimática é realizada a 60°C. Retiradas sãorealizadas a cada 5 minutos durante 20 minutos e misturadas com o ácidotricloroacético (TCA) com 5% para parar a reação.

Uma unidade de Atividade de protease (UP) corresponde àquantidade de enzimas necessária ao aumento de 0,01 unidade A340nm porminuto, gerado pela liberação de grupos azo nas condições citadasprecedentemente. Esta atividade, calculada de acordo com a fórmula indicadaabaixo, é trazida à matéria seca inicial (UP.gMSI"1) ou à atividadeglicoamilase (UP.UG"1):

<formula>formula see original document page 31</formula>

♦ A corresponde à Atividade de protease expressa emUP.gMSI1,

♦ P corresponde à velocidade de liberação de grupamentos azoexpressa em aumento de 0,01 unidade A340nm min"1,

♦ Venz representa o volume da solução de enzimas dosada em ml,

♦ Vferm é o volume total de água destilada utilizado para extraira solução de enzimas em ml,

♦ Mferm, expresso em g de MSI, corresponde à massa inicial deproduto seco da qual foi extraída a solução de enzimas.

Atividade de xilanase

Para evidenciar esta atividade enzimática, fez-se agir aspreparações de GA sobre uma solução de xilano solúvel e mediu os açúcaresredutores liberados pelo método ao DNS.O meio reacional é composto de:

o Solução de xilano a 2%, pH 4,5: 1900 μl

o Solução enzimática: 100 μl

A solução xilano de meleze (Sigma a 1%) é preparada notampão citrato 0,1 M com pH 4,5 e a reação se desenrola a 60°C no caso doAspergillus niger e 50°C no caso do Aspergillus orizae. Retiradas de 200 μlde meio reacional são efetuadas a cada 2 minutos durante 10 minutos, emisturadas com 500 μl de DNS e 300 μl de tampão citrato com pH 4,5. Oconjunto é em seguida aquecido 5 minutos a 100°C, resfriado rapidamente edepois dosado a 540 nm em face a um branco de uma mistura de 500 μl deDNS e 500 μl de tampão citrato com pH 4,5.

Uma unidade de Atividade de xilanase (UX) corresponde àquantidade de enzimas necessária para a liberação de um micromol deaçúcares redutores por minuto. Esta atividade é trazida à matéria seca inicial(UX.gMS"1) ou a atividade glicoamilase (UX.UG" ). Para calcular estaatividade, tomamos a fórmula definida para o cálculo das atividades GA naqual:

♦ A corresponde à Atividade de xilanase expressa emUX.gMSI"1 (pmoLmin^gMSr1),

♦ P corresponde à velocidade de liberação de equivalentesxilose em μmol.min"1,

♦ Os outros termos da fórmula não são modificados.

Os ensaios não limitativos seguintes são dados com o objetivode ilustrar a invenção, em particular a vantagem que procura a utilização deum farelo de trigo fermentado de acordo com a invenção no caso de umprocesso de sacarificação-fermentação simultâneos.

Exemplo 1: Efeito de uma complementação azotado

Estudou-se de maneira comparativa a quantidade de etanolproduzida durante uma etapa de sacarificação-fermentação introduzindo sejauma preparação enzimática comercial (Spirizyme® Fuel), seja a mesmapreparação enzimática com uma complementação não limitante emnitrogênio, seja um complemento nutricional de acordo com a invenção.

Nestes ensaios, os inventores prepararam 750 g de mosto defarinha de trigo a 32% de matéria seca em um reator de 1 litro agitado. Após 2h de liquefação a 85°C e pH 5,5, o mosto é repartido em 3 frascos deErlenmeyer de 0,5 litro que contém cada um 200 g de mosto e completado aisoatividade glicoamilase como segue:

< Frasco 1: Spirizyme® Fuel (solução de glicoamilasepurificada, de Novozimas);

< Frasco 2: Spirizyme® Fuel e complementação azotada, ouseja, fosfato e sulfato di-amoníaco: 3 g/l de cada produto;

< Frasco 3: farelo de trigo fermentado por uma cepa deAspergillus niger ATCC 76061, de acordo com o processo descrito US 2002037.342.

O pH inicial dos mostos nos três frascos foi ajustado a 4,5 e atemperatura a 32°C.

A incorporação dos produtos azotados no frasco 2 gera umaalcalinização do pH 6,2 que necessita um aporte suplementar de ácidoclorídrico concentrado para trazer o pH inicial do mosto a 4,5 para asacarificação-fermentação. Os mostos são semeados com IO7 UFC defermento por ml de mosto. O fermento utilizado nos exemplos éSaccharomyces eerevisiae.

A concentração máxima em glicose teórica no mosto é de 303g/l após hidrólise enzimática total do amido.

Como se mostra na tabela 1, a melhor produção de etanol éobtida com o farelo de trigo fermentado em 72 horas. A utilização deSpirizyme® Fuel, mesmo com um complemento azotado gera no máximo59% de etanol em 96 horas. Na ausência de incorporação de nitrogênio, aprodução de etanol é muito fraca e observamos uma concentração muitoelevada em glicose.

Há conseqüentemente uma vantagem significativa em utilizaro farelo de trigo fermentado por um bolor para a produção de etanol de trigo,mesmo a temperatura do reator de sacarificação-fermentação simultâneos. Acomparação com o Spirizyme Fuel indica que uma complementação nãolimitante em nitrogênio explica apenas parcialmente a melhoria dosdesempenhos.

Tabela 1

<table>table see original document page 34</column></row><table>

Estes ensaios confirmam a adequação do farelo de trigofermentado para a produção de etanol de trigo por um processo desacarificação-fermentação simultâneos.

Exemplo 2: Efeito tampão do complemento nutricional deacordo com a invenção.

Este exemplo ilustra as vantagens da utilização docomplemento nutricional de acordo com a invenção para favorecersacarificação-fermentação alcoólica. Este exemplo traz em particular sobre oefeito tampão, complemento nutricional de acordo com a invenção, sobre omeio de sacarificação-fermentação.

Nestes ensaios, os inventores prepararam 750 g de mosto defarinha de trigo a 32% de matéria seca em um reator de 1 litro sob agitação.Após 1 h 30 de liquefação a 85°C, com pH 5,5 e sob agitação a 250 rpm, omosto é repartido em 2 frascos de Erlenmeyer de 250 ml. Cada frasco contém100 g de mosto liqüefeito a 32% de matéria seca e 40 g de água estéril paraobter um mosto a 23% de matéria seca. Em seguida acrescenta-se em cadamosto:

< Frasco 1: 0,5 g de farelo de trigo fermentado por uma cepade Aspergillus niger ATCC 76061, de acordo com o processo descrito em US2002 037 342;

< Frasco 2: 16,7 μΐ de Spirizyme® Fuel (solução deglicoamilase purificada, Novozimas).

O pH inicial de mostos nos dois frascos é ajustado a 4. Osmostos são semeados com 5x106 UFC de fermentos Etanol Red® (Lesaffre)por ml de mosto.

No frasco 2, acrescenta nitrogênio exógeno, sob a forma deamoníaco até 1 grama de nitrogênio por quilograma de trigo.

Durante toda a duração dos ensaios os mostos são mantidos auma temperatura de 30°C e sob agitação a 100 rpm.

A concentração desejada de etanol é de 87 g de etanol por litrode mosto (11% v/v), o que corresponde a um rendimento de conversão amidoem etanol de 81%.

A tabela 2 mostra a evolução da concentração de etanol nomosto e o pH do mosto em função da duração da sacarificação-fermentação.

Da mesma maneira que a tabela 1, a tabela 2 ilustra que autilização de um complemento nutricional de acordo com a invenção no meiode sacarificação-fermentação permite obter uma maior concentração de etanolem uma duração inferior que as enzimas convencionais apesar de um aportede nitrogênio exógeno.

Além disso, a tabela 2 ilustra que a incorporação de amoníacono frasco 2 provoca uma baixa do pH em torno de 2,8.Para obter um melhor rendimento de etanol, é importante queo pH do mosto permaneça entre 3,5 e 5. Com efeito, a sacarificação-fermentação sendo realizada a cerca de 3 0°C, um pH muito elevado,notadamente superior a 5, provoca um risco de contaminação do mosto. Umvalor de pH demasiado baixo, notadamente inferior a 3,5, provoca uma baixade rendimento da fermentação alcoólica.

A utilização de uma preparação enzimática à qual éacrescentada uma fonte de nitrogênio exógena em um meio de sacarifícação-fermentação necessita um dispositivo de regulação do pH, de maneira amanter um valor de pH entre 3,5 e 4,5.

Tabela 2

<table>table see original document page 36</column></row><table>

O complemento nutricional de acordo com a invenção tem umefeito tampão para o pH do mosto de sacarificação-fermentação econseqüentemente, vantajosamente permite se livrar de um dispositivo deregulação do pH.

Exemplo 3: Bioestimulação

Este exemplo destaca o efeito de bioestimulação docomplemento nutricional de acordo com a invenção. Os ensaios desteexemplo ilustram que a complementação de nitrogênio e o efeito deestabilização do pH do mosto em torno de 4, explicam apenas parcialmente amelhoria dos desempenhos do fermento para a produção de etanol durante suaintrodução no meio de sacarificação-fermentação.

Nestes ensaios, os inventores prepararam mosto de farinha detrigo a 32% de matéria seca. Após 1 h 30 de liquefação a 85°C, com pH 5,5 esob agitação a 250 rpm, o mosto é repartido em 2 biorreatores de 4 litros.Cada biorreator contém 1,7 kg de mosto a 29,8% de matéria seca. O mostoobtido em cada biorreator é obtido misturando o mosto a 32% de matéria secaproveniente da liquefação com vinagres a 27% de matéria seca.

Os vinagres utilizados para diluir o mosto, são vinagresobtidos de um processo de fermentação alcoólica de trigo.

Os 1,7 kg de mosto a 29,8% de matéria seca são completadosdo seguinte modo:

< Biorreator 1: 199 μl de Spirizyme® Fuel (solução deglicoamilase purificada, de Novozimas) e 59 μl de Viscozym Wheat®(Novozyme) (enzima desviscosificante);

< Biorreator 2: 5,7 g de farelo de trigo fermentado por umacepa de Aspergillus niger ATCC 76061, de acordo com o processo descritoem US 2002 037.342.

OpH inicial de mostos nos dois biorreatores foi ajustado a 4,1e a temperatura a 30°C, e depois os mostos são submetidos a uma agitação à 100 rpm.

Os mostos são semeados seguidamente com 5x10^6 UFC defermentos (Ethanol Red®, Lesaffre), por ml de mosto.

O nitrogênio exógeno é acrescentado no biorreator 1, demaneira fracionada, sob forma de amoníaco para chegar a um teor de 1 gramade nitrogênio por quilograma de trigo.

Os vinagres provenientes de mosto de cereais fermentadoscontêm certa quantidade de fibras. Misturando-o ao mosto, obtém-se umefeito tampão do pH do mosto.

A concentração desejada em etanol é de 87 g de etanol porlitro de mosto, o que corresponde a um rendimento de conversão do amido deetanol de 81%.

A tabela 3 mostra a evolução da concentração em etanol nomosto e o pH do mosto em função da duração da sacarificação-fermentação.

O fracionamento do aporte de nitrogênio exógeno bem como autilização de vinagres permite uma estabilização do pH no biorreator 1 emtorno de 4.

Como se mostra na tabela 3, a concentração desejada de etanolé quase atingida em 28 horas no biorreator com um complemento nutricionalde acordo com a invenção enquanto que é necessário esperar 44 horas paraatingir uma concentração equivalente no biorreator com a preparaçãoenzimática. Além disso, ao término de 68 horas a concentração de etanol ésempre mais elevada no biorreator com o complemento nutricional de acordocom a invenção do que neste com a preparação enzimática.

A tabela 3 ilustra a vantagem significativa da utilização de umcomplemento nutricional de acordo com a invenção em relação àspreparações enzimáticas clássicas. Os resultados destes ensaios indicam queuma complementação de nitrogênio e um controle de pH explicam apenasparcialmente os desempenhos do complemento nutricional de acordo com ainvenção.

Estes ensaios destacam um efeito de bioestimulação defermentos ligado à composição do complemento nutricional de acordo com ainvenção.

Tabela 3

<table>table see original document page 38</column></row><table>

Exemplo 4: Fermentação aeróbia de vinagres

Os inventores estudaram de forma comparativa a evolução daconcentração do meio de pré-fermentação em fermento em função do teor emmatéria seca do referido meio.

Estes ensaios foram efetuados em 100 g de meio de pré-fermentação em frascos com painel acústico de 250 ml. Os meios de pré-fermentação são termostatatizados a 30°C, colocados sob agitação a 130 rpme semeados com 2,5 χ IO7 fermentos (Ethanol Red®), por ml de meio. O pHinicial dos meios é de 4,2 a 4,4

Cada meio de pré-fermentação é composto como se segue, emporcentagem mássica:

< Frasco 1:1, 2% vinagre a 28% de matéria de seco, e cercade 98,8% de água;

< Frasco 2: 10% vinagre a 28% de matéria de seco, e cerca de90% de água;

< Frasco 3: 20% vinagre a 28% de matéria de seco, e cerca de80% de água;

< Frasco 4: 40% vinagre a 28% de matéria de seco, e cerca de60% de água;

< Frasco 5: meio de controle (glicose e extrato de fermento).

Os frascos são agitados de maneira a oxigenar o meio epermitir a propagação do fermento.

Os inventores mediram a evolução da concentração emfermento em cada meio de pré-fermentação.

As composições dos meios nos frascos e as evoluções dasconcentrações em fermento são recapituladas na tabela 4 seguinte:

Tabela 4

<table>table see original document page 39</column></row><table>Como se vê na tabela 4, um meio de pré-fermentaçãocomposto com 40% em massa de vinagre a 28% em massa de matéria seca,ou seja, um meio com 11, 2% em massa de matéria seca, permite umamultiplicação de um fator 16,6 da quantidade de fermento em 5 horas. Atítulo de comparação, o fator multiplicativo sobre o mesmo período no meiode controle é de cerca de 2.

Após 24 horas de cultura aeróbia, a concentração em fermentono meio composto de 40% em massa de vinagre é mais de 2,5 vezes aconcentração de fermento no meio de controle.

Sem estar ligados a uma teoria, os inventores explicam estesresultados pela presença na matéria seca de vinagres de fontes de carbono,além da glicose, assimiláveis pelo fermento. Os inventores mostraram que amatéria seca de vinagres contém cerca de 10% de açúcares fermentáveis,essencialmente sob forma de glicose ou amido residual. A concentraçãoinicial em fermento corresponde à cerca de 0,62 g de fermento por litro demeio, enquanto que a concentração final corresponde à cerca de 13,8 g defermento por litro de meio. Conseqüentemente formou-se cerca de 13,2 g defermento por litro de meio, o que corresponde a um consumo de cerca de 26,4g de glicose. Ora no frasco n° 4 a concentração inicial em glicose é de cercade 11,2 g por litro de meio. A quantidade de fermento obtida éconseqüentemente ligada a uma outra fonte de carbono que não a glicose, porexemplo, a presença de glicerol nos vinagres.

Naturalmente, a presente invenção não se limita aos modos de realizaçãodescritos e representados fornecidos a título de exemplos ilustrativos e nãolimitativos.

Claims (29)

1. Complemento nutricional para meio de fermentaçãoalcoólica a partir de matérias-primas glicídicas, caracterizado pelo fato de quecomporta um princípio ativo, sob forma bruta ou extraída, proveniente de umafermentação com um bolor.

2. Complemento nutricional de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a matéria-prima glicídica é uma matéria-primaamidada.

3. Complemento nutricional de acordo com a reivindicação 1ou 2, caracterizado pelo fato de que comporta um farelo de trigo fermentadocom um bolor.

4. Complemento nutricional de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que apresenta pelo menos umadas atividades enzimáticas seguintes:glicoamilásica: pelo menos 500 UG, por grama de matériaseca,• proteolítica: pelo menos 100 UP por grama de matéria seca,• xilanásica: pelo menos 100 UX por grama de matéria seca.

5. Complemento nutricional de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o princípio ativo éescolhido no grupo formado pelo ergosterol, a N acetilglicosamina, asvitaminas, os ácidos nucléicos, os aminoácidos e suas misturas.

6. Complemento nutricional de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que é obtido por fermentaçãode um farelo de trigo com um bolor escolhido dentre as cepas de Aspergillusniger ATCC 201202, ATCC 76060, ATCC 76061, MUCL 28815, MUCL-28816, NRRL 3112 ou dentre as cepas de Aspergillus orizae ATCC 22788 eATCC 42149.

7. Complemento nutricional de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que é suscetível de serobtido através de um processo que compreende as seguintes etapas:i) pegar o farelo de trigo,ii) umedecer, acidificar com um pH compreendido entre 4 e 5e tratar termicamente o referido farelo de forma a pasteurizá-lo ou esterilizálo,iii) inocular o farelo de trigo resultante por uma cepa deAspergillus niger, escolhida dentre ATCC 201202, ATCC 76060, ATCC-76061, MUCL 28815, MUCL 28816, NRRL 3112, ou por uma cepa deAspergillus orizae escolhida dentre ATCC 22788 e ATCC 42149,iv) fazer fermentar o farelo de trigo no estado sólido em umreator agitado periodicamente, a uma temperatura de 28°C a 38°C, o teor emumidade sendo mantido entre 45% e 65% em peso, nas condições de aeraçãopróprias para evitar uma acumulação de dióxido de carbono permanente nofarelo de trigo, até que o produto de fermentação apresente os valoresmínimos seguidos de atividades enzimáticas:• glicoamilásica: pelo menos 500 UG UG por grama dematéria seca e, eventualmente,• proteolítica: pelo menos 100 UP por grama de matéria seca, xilanásica: pelo menos 100 UX por grama de matéria seca.

8. Complemento nutricional de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato de que o tratamento térmico na etapa ii) épreferivelmente posterior à umidificação.

9. Complemento nutricional de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a atividadeglicoamilásica é de pelo menos 750 UG por grama de matéria seca.

10. Complemento nutricional de acordo com a reivindicaçãoprecedente, caracterizado pelo fato de que a atividade glicoamilásica é de pelomenos 1500 UG por grama de matéria seca.

11. Complemento nutricional de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende oergosterol, o a N-acetilglicosamina, as vitaminas, os ácidos nucléicos e osaminoácidos.

12. Complemento nutricional de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende avitamina B.

13. Complemento nutricional de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende um ouvários aminoácidos escolhidos dentre: alanina, arginina, asparagina, ácidoaspártico, valina, leucina, ácido glutâmico.

14. Processo de fabricação de etanol a partir de uma matériaglicídica, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa defermentação na presença de um complemento nutricional de acordo comqualquer uma das reivindicações precedentes.

15. Processo de fabricação de etanol de acordo com areivindicação 14, no qual matéria glicídica é uma matéria amidada,comportando, após uma etapa de liquefação e eventualmente uma etapa depré-sacarificação, uma etapa de sacarificação-fermentação em um meio desacarificação-fermentação cujo teor em glicose no início da etapa desacarificação-fermentação é no máximo igual a 95% do equivalente emglicose que corresponde ao amido da referida matéria amidada, caracterizadopelo fato de que se introduz o complemento nutricional no meio desacarificação-fermentação.

16. Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizadopelo fato de que o teor em glicose no início da etapa de sacarificação-fermentação é no máximo igual a 3% do equivalente em glicose quecorresponde ao amido da referida matéria amidada.

17. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações- 15 e 16, o complemento nutricional sendo introduzido sob forma bruta,caracterizado pelo fato de que a quantidade do complemento nutricional ésuperior ou igual a 4 Kg de matéria seca e/ou inferior ou igual a 60 Kg dematéria seca por tonelada de amido.

18. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, caracterizado pelo fato de que o referido complemento nutricionalconstitui a principal fonte nutricional para o fermento do meio desacarificação-fermentação e/ou a principal fonte de ergosterol e/ou a principalfonte de nitrogênio e/ou aminoácidos e/ou de fósforo e/ou de enxofre e/ou devitaminas.

19. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 18, caracterizado pelo fato de que a sacarificação-fermentação érealizada inteiramente na ausência de aporte de ar ou de oxigênio.

20. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 18, caracterizado pelo fato de que a sacarificação-fermentação comportauma fase inicial aeróbia.

21. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 20, caracterizado pelo fato de que a sacarificação-fermentação éconduzida nas seguintes condições:- temperatura: de 30°C a 35°C,- pH: ajustada no início da etapa de sacarificação-fermentaçãoentre cerca de 3,5 e cerca de 5,- inoculação de fermento: cerca de 10^6 à cerca de 5.10^8 UFCde fermento por ml de meio de sacarificação-fermentação,- 20% a 35% de MS,- tempo de permanência: 20 horas às 72 horas.

22. Leveduras provenientes de um processo de fabricação deetanol de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 21 caracterizadaspelo fato de que comportam mais de 5 g de ergosterol por tonelada dematérias secas de leveduras .

23. Leveduras de acordo com a reivindicação 22 caracterizadaspelo fato de que comportam mais de 40%, preferivelmente, mais de 50% deproteínas brutas, em porcentagens com base na matéria seca.

24. Leveduras de acordo com a reivindicação 22 caracterizadaspelo fato de que comportam mais de 50% de proteínas brutas, emporcentagens com base na matéria seca.

25. Utilização de um complemento nutricional de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 13 caracterizada pelo fato de que é parafavorecer uma fermentação alcoólica ou uma pré-fermentação destinada àfabricação de um fermento.

26. Processo de fabricação de fermento em aerobiose em umpré-fermentador, caracterizado pelo fato de que se acrescenta no referido pré-fermentador, vinagres clarificados e/ou vinagres concentrados obtidos durantea execução de um processo de fabricação de etanol por fermentação alcoólicaa partir de matérias-primas glicídica.

27. Processo de acordo com a reivindicação 26, caracterizadopelo fato de que os vinagres são obtidos durante a execução de um processode fabricação de etanol no qual foi incorporado um complemento nutricionalde acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13.

28. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações-26 e 27, caracterizado pelo fato de que os vinagres são obtidos durante aexecução de um processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 14a 21.

29. Processo de fabricação de etanol de acordo com qualqueruma das reivindicações 14 a 21, caracterizado pelo fato de que se utiliza, paraa fermentação etanólica, fermentos obtidos por um processo de fabricação defermento de acordo com uma das reivindicações 26 a 28, no qual o processoutiliza vinagres que provêm do referido processo de fabricação de etanol.