JP2004357620A - キチン分解酵素 - Google Patents
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Abstract
【課題】人体に安全な微生物に由来し、酸性条件及び高温条件において高い活性を有するキチナーゼを開発し提供すること。
【解決手段】アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）の培養物から分離精製される、キチン分解酵素。
【選択図】 なし
【解決手段】アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）の培養物から分離精製される、キチン分解酵素。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）の培養物から分離精製されるキチン分解酵素に関する。また、該キチン分解酵素をコードするＤＮＡおよび該キチン分解酵素の製造方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
〔１〕キチン分解酵素
キチン分解酵素（＝キチナーゼ）は、パパイヤやイチジク等の植物及び微生物等から得られる酵素であり、キチン・キトサンの工業的利用において非常に重要な役割を果たしている。
【０００３】
これまで、細菌由来のキチナーゼとしては、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（非特許文献１参照）、サイトファーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）属、アクロモバクター・ヒテロプティカム（Ａｃｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｈｙｔｅｒｏｐｔｉｃｕｍ：非特許文献２参照）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属及びミクロコッカス・コルポゲネス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｌｐｏｇｅｎｅｓ）（非特許文献２参照）の生産するキチナーゼ並びに、アルテロモナス・エスピー（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）の生産するキチナーゼＡ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｄ１３７６２）等が知られている。
【０００４】
また、放線菌の生産するキチナーゼとしては、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、ノカルディオプシス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ）属及びアクチノミセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）属の生産するキチナーゼが知られている（非特許文献３）。
【０００５】
糸状菌の生産するキチナーゼとしては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属及びペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属の生産するキチナーゼが知られている。
【０００６】
さらに、アスペルギルス属の生産する酵素としては、アスペルギルス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ：非特許文献４参照）、アスペルギルス・カンディドス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃａｎｄｉｄｕｓ：非特許文献５参照）及びアスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ：非特許文献６および７参照）の生産するキチナーゼが知られている。また、味噌やしょうゆ、日本酒の生産等、食品製造・加工において幅広く使用されているアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）に関しては、キチナーゼをコードすると考えられる遺伝子について学会発表があったとの報告（非特許文献８参照）がある。
【０００７】
また、酵母の生産する酵素としては、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の生産するキチナーゼを例示することができ、好適にはサッカロミセス・セレヴィシエの生産するキチナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｍ７４０７０）及びＯＲＦ Ｄ９４８１．７（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｕ２８３７３）である。
【０００８】
〔２〕キチン・キトサン
キチン（β−１，４−ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン）は天然に非常に多く存在する多糖であり、主としてカニ・エビ等の甲殻類およびイカ軟甲から工業的規模で抽出され生産されている。
【０００９】
キトサン（β−１，４−ポリグルコサミン）は、キチンを濃アルカリ水で処理することにより得られる、アミノ基を有する高分子多糖であり、さまざまな生理活性を有することが知られている（非特許文献９参照。）。なかでも、キトサンは天然物由来物質としては強力な抗菌作用を有し、かつ安全性が合成抗菌剤と比較して非常に高い（非特許文献１０参照。）ことが知られている。
【００１０】
特に、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｍｅｔｈｉｃｈｉｌｉｎ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（以下、「ＭＲＳＡ」と記す）を含むスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（非特許文献１１乃至非特許文献１２参照）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（非特許文献１３参照）、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（非特許文献１４および非特許文献１５参照）等の細菌に対して効果があることが知られている。
【００１１】
〔３〕キトサンの処理と問題点
カニ・エビ等の甲殻類やイカ軟甲から抽出されたキチンを濃アルカリ処理することによって製造されたキトサンは、分子量１００万以上の高分子多糖であり、酸性条件では水に溶けるが、中性あるいはアルカリ性の条件では水に溶けない。そして、水に溶けない状態では、キトサンの生理活性は十分に発揮できない。
【００１２】
また、甲殻類を含む食品材料を加工する際、これら高分子多糖が原因で非常に粘度が高い状態になってしまい、その後の処理に手間がかかるという問題もあった。
【００１３】
キトサンの生理活性を十分に発揮させ、かつ、食品加工等の処理を効率化するには、キトサンの水に対する溶解性を増す必要がある。そのため、（ｉ）高分子キトサンの誘導体化（非特許文献１６）あるいは、（ｉｉ）低分子化する、といった試みがなされている。
【００１４】
しかし、誘導体化には問題がある。キトサンを誘導体化することにより、天然物とは異なる構造となる可能性がある。その結果、誘導体化されたキトサンが、天然型のキトサンとは異なる性質を有するようになったり、使用に際しては安全性試験データ等が必要になったりする等の問題である。また、誘導体化反応に使用した有機溶媒の除去、処理が生産コストを引き上げるという問題もある。
【００１５】
そこで、一般的に、水に対する溶解性を上げるためには、誘導体化する方法ではなく、低分子化が望ましいと考えられている。低分子化をしても、キトサンが有する抗菌活性は失われない。事実、キトサンが有する抗菌活性は、分子量が１００万以上の高分子キトサンだけではなく、低分子キトサンでも発揮されることが知られている（非特許文献１７）。
【００１６】
しかし、一方で、分子量が１万以下のキトサンには、皮膚刺激性等の副作用があることが報告されていることから（特許文献１）、あまり低分子化し過ぎるのは好ましくなく、分子量１万以上の低分子キトサンの製造方法が検討されている。
【００１７】
〔４〕低分子キトサンの製造法
低分子キトサンの製造方法としては、化学的あるいは酵素的手法による高分子キトサンの加水分解が検討されてきた。
【００１８】
化学的製造方法としては、高分子キトサンを、（ｉ）過酢酸等の酸化剤で処理する方法（特許文献２および特許文献３）、（ｉｉ）超音波処理する方法（非特許文献１８）、（ｉｉｉ）塩酸処理する方法（特許文献４）等が挙げられる。
【００１９】
しかし、酸化剤で処理する方法では分子量５００−３０，０００のキトサンが大量に生成することが知られているものの、その中での分子量１万以上のキトサンの割合は定かではない。
【００２０】
また、超音波で処理する方法では装置の大型化が困難であり、大量製造に不向きであると考えられる。さらに塩酸を用いる方法では、キトサンの塩酸塩以外の塩、例えば酢酸塩あるいは乳酸塩等の低分子キトサンを純粋に得ることは極めて困難である。
【００２１】
一方、酵素的製造方法としては、キトサナーゼを用いる方法（特許文献５および特許文献６）、キチナーゼを用いる方法（非特許文献１９）などが挙げられ、いずれの方法においても、分子量１００万以上の高分子キトサンを酸性条件下水に可溶化し、酵素反応を行わせる。
【００２２】
【特許文献１】
特開２０００−１６９３２７号公報
【特許文献２】
特許第３０７６２１２号公報
【特許文献３】
特開平５−６５３６８号公報
【特許文献４】
特開２００３−１２８７０５号公報
【特許文献５】
特許第２７６３１１２号公報
【特許文献６】
特開平１１−３２２８０９号公報
【非特許文献１】
ヴェルドカンプ（Ｖｅｌｄｋａｍｐ， Ｈ．）「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」１９５２年、１６９巻、ｐ．５００
【非特許文献２】
キャンプベルら（Ｃａｍｐｂｅｌｌ， Ｊｒ．， Ｌ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．）「ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」１９５１年、５巻、ｐ．８９４
【非特許文献３】
中神照太ら「工技院醗酵研究所報告」１９６６年、３０巻、ｐ．１９
【非特許文献４】
タカヤら（Ｔａｋａｙａ， Ｎ．， ｅｔ ａｌ．）「（バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ））１９９８年、６２巻、ｐ．６０
【非特許文献５】
シェリフら（Ｓｈｅｒｉｆ， Ａ． Ａ．， ｅｔ ａｌ．）「（アプライド・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））１９９１年、３５巻、ｐ．２２８
【非特許文献６】
エスコットら（Ｅｓｃｏｔｔ， Ｇ． Ｍ．， ｅｔ ａｌ．）「（マイクロバイオロジー（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ））１９９８年、１４４巻、ｐ．１５７５
【非特許文献７】
キシャら（Ｘｉａ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ．）「（ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ））２００１年、２６８巻、ｐ．４０７９
【非特許文献８】
「キチン・キトサン研究」２００２年、第８巻、第２号、ｐ．２３８−２３９
【非特許文献９】
「キチン・キトサンハンドブック」、１９９５年、技報堂、ｐ．３０２−３７６
【非特許文献１０】
「キチン・キトサンの活用法」、１９９８年、財界特別増刊第４６巻２８号、ｐ．１０６−１１１
【非特許文献１１】
「加工技術」１９９８年、３３巻、ｐ．５１２−５１５
【非特許文献１２】
「加工技術」１９９８年、３３巻、ｐ．５３０−５３２
【非特許文献１３】
トクラら（Ｔｏｋｕｒａ， Ｓ ｅｔ ａｌ．）「マクロモレキュラー・シンポジア（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｍｐｏｓｉａ）」１９９７年、１２０巻、ｐ．１−９
【非特許文献１４】
ロークら（Ｌｏｋｅ， ＷＫ ｅｔ ａｌ．）「ジャーナル・オブ・バイオメディシナル・マテリアルズ・リサーチ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」２０００年、５３巻、ｐ．８−１７
【非特許文献１５】
キムら（Ｋｉｍ， Ｈ． Ｊ． ｅｔ ａｌ．）「ジャーナル・オブ・バイオマテリアルズ・サイエンス、ポリマー・エディション（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｅｄｉｔｉｏｎ）１９９９年、１０巻、ｐ．５４３−５６
【非特許文献１６】
「キチン・キトサンの活用法」財界特別増刊第４６巻２８号、１９９８年、ｐ．７８−８１
【非特許文献１７】
「日本農芸化学会誌７４巻大会講演要旨集」講演番号２Ｅ１８３α、２０００年
【非特許文献１８】
「キチン・キトサン研究」１９９９年、５巻、ｐ．７５−７９
【非特許文献１９】
「日本農芸化学会誌７４巻大会公演要旨集」講演番号２Ｆ３１３α、２０００年
【００２３】
【発明が解決しようとする課題】
上述のように、酵素的製造方法においては、酵素反応が酸性条件下で行なわれるので、酸性域で高い活性を有するとともに、安定性が高い酵素を使用することが望ましい。また、高分子キトサンの水溶液は常温では非常に高い粘度を有しており、可能な限り高い温度で酵素反応を行うことで粘度を減弱させ、反応効率の向上を図ることが望ましいことから、高温条件において高い活性を有する酵素を使用することが望ましい。加えて、食品加工や化粧品等に用いる場合、特にキチナーゼ産生微生物等、キチナーゼの由来に関して人体に安全なものが望ましい。
【００２４】
したがって、人体に安全な微生物に由来し、酸性条件及び高温条件において高い活性を有するキチナーゼを開発し提供することは、この技術分野において非常に関心の高い事項であった。
【００２５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、安全性に優れ、酸性域で高い活性を有するとともに安定性が高く、さらに耐熱性にすぐれた酵素を見出すべく鋭意検討を行い、いわゆる“コウジカビ”の一種として食品の製造等に有用である、アスペルギルス・ニガー由来のキチン分解酵素を精製し、該タンパク質をコードするＤＮＡをクローニングし、本発明を完成するに至った。
【００２６】
すなわち、本発明は、
（１） アスペルギルス・ニガーの培養物から分離精製されるキチン分解酵素。
【００２７】
（２） アスペルギルス・ニガーがアスペルギルス・ニガー ＳＡＮＫ １３６０３株である（１）記載のキチン分解酵素。
【００２８】
（３） 配列番号１の部分アミノ酸配列を有することを特徴とする、（１）または（２）に記載のキチン分解酵素。
【００２９】
（４） 以下の性質：
１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法にて分子量約４０，０００を示す；
２）等電点電気泳動法にて等電点ｐＩが約３．５を示す；
３）３０％アセチル化キトサン（粘度１００〜３００ｃｐｓ）を、ｐＨ３．０乃至ｐＨ１１．０にて加水分解する；
４）グリコールキチンを、ｐＨ３．０乃至ｐＨ１１．５にて加水分解する；
５）０℃乃至８０℃で３）記載の加水分解活性を発揮する；
６）５０℃以下の温度で安定である；
７）ｐＨ４．０乃至ｐＨ１１．０のｐＨ条件下で安定である；
を有する上記（１）乃至（３）のいずれか１つに記載のキチン分解酵素。
【００３０】
（５） 下記ａ）〜ｄ）：
ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
ｂ）配列番号２のヌクレオチド番号２３３乃至１４２６に示されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質；
ｃ）ａ）またはｂ）に記載のアミノ酸配列において、一つまたは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、キチン分解活性を有することを特徴とするタンパク質；
ｄ）ａ）またはｂ）に記載のアミノ酸配列を含むことからなるタンパク質、
のいずれか一つに記載のタンパク質である、キチン分解酵素。
【００３１】
（６） 下記のａ）〜ｅ）：
ａ）配列番号２のヌクレオチド番号２３３乃至１４２６に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
ｂ）上記ａ）に記載のＤＮＡと９０％以上のヌクレオチド配列相同性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、キチン分解活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とするＤＮＡ；
ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ；
ｄ）配列番号２のヌクレオチド番号２３３乃至１４２６に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるＤＮＡ、
のいずれか一つに記載のＤＮＡ。
【００３２】
（７） （６）に記載のＤＮＡにコードされるタンパク質である、キチン分解酵素。
【００３３】
（８） 下記のａ）及びｂ）：
ａ）３０％アセチル化キトサン（粘度１００〜３００ｃｐｓ）を、ｐＨ３．５乃至ｐＨ１０．５、０℃乃至８０℃の条件にて加水分解する活性；
ｂ）グリコールキチンを、ｐＨ４．０乃至ｐＨ１０．５にて加水分解する活性、
に示される活性を有することを特徴とする、（５）または（７）に記載のキチン分解酵素。
【００３４】
（９） 下記工程：
１）アスペルギルス・ニガーを、キチン分解酵素を産生する条件下で培養する工程、及び
２）１）の培養産物からキチン分解酵素を分離・精製する工程、
を含む、キチン分解酵素の製造方法。
【００３５】
（１０）アスペルギルス・ニガーを、オートミール及び／又は小麦ふすまを含有する培地を用いて培養する工程を含む、（９）に記載の方法。
【００３６】
（１１） アスペルギルス・ニガーが、アスペルギルス・ニガー ＳＡＮＫ １３６０３株である、（９）又は（１０）に記載の方法、及び
【００３７】
（１２） （９）〜（１１）に記載の方法により製造されるキチン分解酵素
に関する。
【００３８】
なお、上記（７）の６）及び７）に記載の、「安定である」とは、当該酵素が、約８０％以上の残存活性（相対値）を有することをいう。これら上記６）、７）に相当する以下の記載についても同じである。
【００３９】
本発明は、低分子キトサンを製造するために有用な糸状菌である、アスペルギルス・ニガー由来のキチナーゼに関する。
この明細書において、キチナーゼとは、キチン及び／又は部分アセチル化キトサンを加水分解する活性を有する酵素をいう。キチンを加水分解するとＮ−アセチルグルコサミンとそのオリゴ糖が生成する。この「キチン又は部分アセチル化キトサンを加水分解する活性」を「キチン分解活性」と定義する。
【００４０】
また、この明細書においては、「キチン」と「部分アセチル化キトサン」とは特に区別せず、キチンとは、部分アセチル化キトサンのうち、アセチル化の割合が高いものであると理解され、本明細書においては、特に区別しない限り、「部分アセチル化キトサン」は、キチンをも含むと理解されなければならない。
また、本発明において、キチン分解酵素とキチナーゼはいずれも上記キチン分解活性を有する酵素を指し、同義語として用いる。
【００４１】
本発明のキチナーゼには、キチナーゼを生産する微生物の培養物中のキチン分解活性を有するタンパク質が含まれる。このようなキチナーゼの例としては、アスペルギルス・ニガー由来のキチナーゼが挙げられる。より好適なものは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＳＡＮＫ １３６０３株由来のキチナーゼである。
【００４２】
また、本発明のキチナーゼの別の例としては、配列番号１に示されるアミノ酸配列を全て含み、かつ、キチン分解活性を有するタンパク質を挙げることができる。該タンパク質は、内部アミノ酸配列としてこれらの全てを含むものであればよい。
【００４３】
また、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において、１若しくは数個の部位に、１若しくは数個のアミノ酸残基が、置換、欠失、挿入および／または付加されたタンパク質も、キチン分解活性を有する限り、本発明に含まれる。
【００４４】
また、本発明のキチナーゼの別の例としては、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を挙げることができる。また、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むことからなるタンパク質であっても、キチン分解活性を有する限り本発明に含まれる。
【００４５】
さらに、本発明のキチナーゼの別の例としては、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ末端のα−アミノ基が修飾されているタンパク質が挙げられる。また、このようなタンパク質を含むことからなるタンパク質も、キチン分解活性を有する限り本発明に含まれる。
【００４６】
本発明のキチナーゼとして好適なものは、アスペルギルス・ニガー ＳＡＮＫ１３６０３株由来のキチナーゼ、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質および配列番号３に記載のアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ末端のα−アミノ基が修飾されているタンパク質が挙げられるが、より好適なものは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＳＡＮＫ １３６０３株由来のキチナーゼおよび配列番号３に記載のアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ末端のα−アミノ基が修飾されているタンパク質である。
【００４７】
本発明において、「本発明のＤＮＡ」とは、本発明のキチナーゼをコードするＤＮＡをいう。ＤＮＡとしては、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、人工的に改変されたＤＮＡ、化学的に合成されたＤＮＡなど、どのような形態をとっていてもよい。
【００４８】
本発明のＤＮＡの例としては、配列番号２のヌクレオチド番号２３３から１４２６に示されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡである。
【００４９】
本発明のＤＮＡの別の例としては、配列番号２のヌクレオチド番号２３３から１４２６に示されるヌクレオチド配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上のヌクレオチド配列相同性を有するＤＮＡが挙げられる。このようなＤＮＡとしては、自然界で発見される変異型ＤＮＡ、人為的に改変した変異型ＤＮＡ、異種生物由来の相同ＤＮＡなどが含まれる。
【００５０】
また、本発明のＤＮＡのさらに他の例としては、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。なお、所望のアミノ酸に対応するコドンは、その選択も任意でよく、例えば利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して常法に従い決定できる。（Ｇｒａｎｔｈａｍ， Ｒ． ｅｔ ａｌ． （１９８１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ９， １４３−１７４）。
【００５１】
さらに、これらヌクレオチド配列のコドンの一部改変は、常法に従い、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用した、部位特異的変異導入法（ｓｉｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ／Ｍａｒｋ， Ｄ． Ｆ． ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１， ５６６２−５６６６）などに従うことができる。
【００５２】
なお、配列番号２のヌクレオチド番号２３３から１４２６に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡを含むことからなるＤＮＡも、キチン分解活性を有するタンパク質をコードする領域を含む限り、本発明に含まれるものである。
【００５３】
また、本発明のキチナーゼには、本発明のＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質を挙げることができる。また、本発明のキチナーゼにおいて、１若しくは数個のアミノ酸を欠失させた改変体を作製するためには、エキソヌクレアーゼＢａｌ３１等を用いてＤＮＡを末端から削る方法（岸本 利光ら“続生化学実験講座１・遺伝子研究法ＩＩ”３３５−３５４）、カセット変異法（岸本 利光、“新生化学実験講座２・核酸ＩＩＩ 組換えＤＮＡ技術”２４２−２５１）などに従うことができる。
【００５４】
このように、本発明のＤＮＡを元に遺伝子工学的手法により得られるタンパク質であっても、キチン分解活性を有する限り本発明に含まれる。
【００５５】
このようなキチナーゼは、必ずしも配列番号３に記載のアミノ酸配列の全てを有するものである必要はなく、例えばその部分配列からなるタンパク質であっても、該タンパク質がキチン分解活性を示す限り、本発明のキチナーゼに包含される。さらに、このようなキチナーゼをコードするＤＮＡも本発明に含まれる。
【００５６】
本発明に用いるキチナーゼは、キチナーゼ生産菌から精製したもの、粗精製したもの、菌体の破砕液の他、菌体の培養上清をそのまま用いたものでも良い。
【００５７】
ここで、キチナーゼ生産菌とは、キチナーゼ生産能を本質的に先天的に有する微生物をいい、キチナーゼを菌体内に蓄積する微生物や、菌体外に分泌する微生物等を含む。
【００５８】
本発明に用いるキチナーゼ生産菌としては、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）を挙げることができ、好ましくはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＳＡＮＫ １３６０３株を挙げることができる。
【００５９】
キチン分解酵素を産生する条件について以下に記載する。
キチナーゼ生産菌を培養する際には、培地中に炭素源、窒素源の他に粉末キチン、粉末キトサン、コロイダルキチン、コロイダルキトサン、オートミール、酵母細胞壁、小麦ふすま等を添加して培養するのが好ましい。キチナーゼ生産菌の培養終了後に遠心分離を行ない、菌体を除いた培養上清をそのまま粗酵素液として用いることができる。また、粗酵素液をイオン交換クロマトグラフィー等によって粗精製したり、精製したりしたものを用いることもできる。
【００６０】
キチナーゼ生産菌の培養は、通常の培養装置、培地を用いて行なうことができる。培養は液体培養、固体培養等の方法を適宜選択できる。液体培養の場合はフラスコ培養や発酵槽を用いた培養を行なうことができ、培養開始後は培地の追加のないバッチ培養法や培養中に適宜培地を添加していく流加培養法を用いることができる。培地には炭素源、窒素源を添加し、必要に応じてビタミン、微量金属等を添加することができる。
【００６１】
炭素源としては、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース等の単糖類、マルトース、セロビオース、イソマルトース、ラクトース、スクロース等の二糖類、デンプン等の多糖類、マルトエキストラクト等を挙げることができるがキチナーゼ生産菌が生育する限りこれらに限定されない。
【００６２】
窒素源としてはアンモニア、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム等の無機窒素、イースト・エクストラクト、マルトエクストラクト、コーンスティープリカー、ペプトン等の有機窒素が用いられるがキチナーゼ生産菌が生育する限りこれらに限定されない。
【００６３】
また、キチナーゼ生産菌のキチナーゼの生産量を増やすために、培地中に粉末キチン、粉末キトサン、コロイダルキチン、コロイダルキトサン、オートミール、酵母細胞壁、小麦ふすま等を添加することもできる。
【００６４】
ここで、本発明者は、特にアスペルギルス・ニガーを用いる場合、オートミール及び／又は小麦ふすまを含有する培地で培養することにより、キチナーゼ生産量が飛躍的に上昇することを見出した。
【００６５】
通常、基質分解酵素を産生する微生物から当該酵素を得ようとする場合、基質を添加した培地中で微生物を培養する方法が採用される。
しかしながら、従来、糸状菌を用いる場合、キチン質を基質として添加した培地を用いる通常の培養方法ではすぐに生育障害が起こり、キチナーゼが得られないか、又は、ごくわずかしか得られなかった。
【００６６】
ところが、本発明者らは偶然にも、アスペルギルス・ニガーを用いた培養系において、オートミール及び／又は小麦ふすまを含有する培地を用いた場合に、キチナーゼの生産量が飛躍的に上昇することを見出したのである。
【００６７】
これらの培地中の組成物量は適宜選択することができる。培養温度、ｐＨ、通気攪拌量はキチナーゼ生産に適するように適宜選択することができる。ただし、オートミール及び／又は小麦ふすまを用いる場合、その濃度（両者を用いる場合にはその合計の濃度）は、好ましくは０．０５〜１０％（ｗ／ｖ）であり、さらに好ましくは０．１〜５．０％、最も好ましくは０．３〜１．０％の範囲である。
【００６８】
本発明に用いるキチナーゼとしては、アスペルギルス・ニガー由来のキチナーゼを用いることができ、好ましくはアスペルギルス・ニガーＳＡＮＫ １３６０３株由来のキチナーゼを用いることができる。
【００６９】
キチナーゼは、これらキチナーゼ生産菌自身が生産するものでもよいし、その変異体または修飾体が生産するものであってもよく、更に、これらキチナーゼ生産菌のキチナーゼをコードする遺伝子を宿主に導入して得られた形質転換体から生産される組換えタンパク質であってもよい。
【００７０】
キチナーゼ生産菌の入手
本発明の酵素の製造法において用いられるアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する菌株としては、例えばアスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ Ｔｉｅｇｈ．）ＳＡＮＫ １３６０３株を挙げることができる。ＳＡＮＫ １３６０３株は茨城県つくば市において採集した土壌より分離したものである。
【００７１】
ＳＡＮＫ １３６０３株をクリックとピットの文献（Ｋｌｉｃｈ Ｍ． Ａ． ＆ Ｐｉｔｔ Ｊ． Ｉ． １９８８． Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｃｏｍｍｏｎ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｔｅｌｅｏｍｏｒｐｈｓ． ＣＳＩＲＯ， Ｎｏｒｔｈ Ｒｙｄｅ）に従い、３種類の培地（ＣＹＡ培地，ＭＥＡ培地， ＣＹ２０Ｓ培地）に接種して、菌学的性状を観察した。
【００７２】
色調の表示は「メチューン・ハンドブック・オブ・カラー」（Ｋｏｒｎｅｒｕｐ Ａ． ＆ Ｗａｎｓｃｈｅｒ Ｊ． Ｈ． １９７８． Ｍｅｔｈｕｅｎ ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｃｏｌｏｕｒ（３ｒｄ． ｅｄｉｔｉｏｎ）． Ｅｒｙｅ Ｍｅｔｈｕｅｎ， Ｌｏｎｄｏｎ）に従った。
３種類の培地（ＣＹＡ培地，ＭＥＡ培地，ＣＹ２０Ｓ培地）の組成は以下の通りである。
【００７３】
ＣＹＡ培地｛ザペックイーストアガー（Ｃｚａｐｅｋ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ Ａｇａｒ）培地｝（Ｋ２ＨＰＯ４ １．０ｇ，＊ザペック濃縮液１０ｍｌ，イーストエキス ５ｇ，スクロース ３０ｇ，寒天 １５ｇ，蒸留水 １０００ｍｌ）
【００７４】
＊ザペック濃縮液（ＮａＮＯ３ ３０ｇ，ＫＣｌ ５ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ５ｇ，ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．１ｇ，ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．１ｇ，ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．０５ｇ 蒸留水 １００ｍｌ）
【００７５】
ＭＥＡ培地｛モルトエキスアガー（Ｍａｌｔ Ｅｘｔｒａｃｔ Ａｇａｒ）培地｝（モルトエキス２０ｇ，ペプトン １ｇ，グルコース ２０ｇ，寒天 ２０ｇ，蒸留水 １０００ｍｌ）
【００７６】
ＣＹ２０Ｓ培地｛２０％シュークロースザペックイーストアガー（Ｃｚａｐｅｋ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ Ａｇａｒ ｗｉｔｈ ２０％ Ｓｕｃｒｏｓｅ）培地｝（Ｋ２ＨＰＯ４ １．０ｇ，＊ザペック濃縮液 １０ｍｌ，イーストエキス ５ｇ，シュークロース ２００ｇ，寒天 １５ｇ，蒸留水 １０００ｍｌ）
【００７７】
菌学的性状
ＣＹＡ培地上でのコロニーは、２５℃、７日の培養で直径２７−３１ｍｍである。コロニーは綿毛状である。分生子形成はコロニー中心部で旺盛、放射状に溝を有し、分生子形成部は黒色である。菌糸は白色乃至淡黄色である。菌核、浸出液や可溶性色素は観察されない。裏面はイエロイッシュホワイト（３Ａ２）を呈する。ＭＥＡ培地上でのコロニーは、２５℃、７日の培養で直径３８−４５ｍｍである。コロニーは綿毛状である。菌糸は白色乃至黄色である。分生子形成は中心部で旺盛であり、分生子形成部は黒色である。裏面はペールイエロー（３Ａ３）を呈する。
【００７８】
ＣＹ２０Ｓ培地上でのコロニーは、２５℃、７日の培養で直径３２−３６ｍｍである。コロニーはＣＹＡ培地上のコロニーに似る。裏面はパステルイエロー（３Ａ４）を呈する。ＣＹＡ培地３７℃でのコロニーは、７日の培養で直径４４−４８ｍｍである。分生子形成は旺盛で菌糸は目立たない。
【００７９】
分生子頭は放射状。分生子柄は５５０−７００×１０−２３μｍ、平滑で厚壁、無色である。頂のうは幅２５−５５μｍ、ほぼ球形で全体にメトレを形成する。メトレは６−１６×３．５−５μｍ。フィアライドは５−１０×３−４μｍである。分生子は直径３．５−５μｍ、球形で、微細な粗面乃至粗面である。
【００８０】
以上の菌学的性状より、本菌に該当する菌を検索したところ、クリックとピットの文献（Ｋｌｉｃｈ Ｍ． Ａ． ＆ Ｐｉｔｔ Ｊ． Ｉ． １９８８． Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｃｏｍｍｏｎ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｔｅｌｅｏｍｏｒｐｈｓ． ＣＳＩＲＯ， Ｎｏｒｔｈ Ｒｙｄｅ）、ジアンらの文献（Ｔｚｅａｎ Ｓ． Ｓ． ｅｔ ａｌ． １９９０． Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｅｌｅｍｏｒｐｈｓ ｆｒｏｍ Ｔａｉｗａｎ． Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｈｓｉｎｃｈｕ）、クリックの文献（Ｋｌｉｃｈ Ｍ． Ａ． ２００２． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ． Ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ， Ｕｔｒｅｃｈｔ）に記載されているアスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ Ｔｉｅｇｈ．）の性状に、各培地上での生育が遅い点を除きほぼ一致した。よって本菌株をアスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ Ｔｉｅｇｈ．）と同定した。
【００８１】
尚、ＳＡＮＫ １３６０３株は、アスペルギルス ニガー ＳＡＮＫ １３６０３株として、平成１５年５月３０日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−８３８９が付された。
【００８２】
周知の通り、糸状菌は自然界において、または人工的な操作（例えば、紫外線照射、放射線照射、化学薬品処理等）により、変異を起こしやすく、本発明のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＳＡＮＫ １３６０３株もその点は同じである。
【００８３】
本発明にいうアスペルギルス・ニガーＳＡＮＫ １３６０３株はその全ての変異株を包含する。また、これらの変異株の中には、遺伝的方法、たとえば組み換え、形質導入、形質転換等によりえられたものも含有される。即ち、キチナーゼを生産するアスペルギルス・ニガーＳＡＮＫ １３６０３株、それらの変異株およびそれらと明確に区別されない菌株は全てアスペルギルス・ニガーＳＡＮＫ １３６０３株に包含される。
【００８４】
また、本発明のキチナーゼは、ベクターに本発明のＤＮＡが挿入された組換えプラスミドで宿主細胞を形質転換し、該形質転換された細胞の培養産物から得る事もできる。このように適当なベクターに本発明のＤＮＡが挿入された組換えプラスミドも本発明に含まれる。
【００８５】
このような目的に用いるベクターとしては、一般に知られているさまざまなベクターを用いることができる。好適なものとしては、原核細胞用ベクター、真核細胞用ベクター、哺乳動物由来の細胞用ベクターなどが挙げられるが、これに限定されない。このような組換えプラスミドにより、他の原核生物、または真核生物の宿主細胞を形質転換させることができる。
【００８６】
さらに、適当なプロモーター配列および／または形質発現に関わる配列を有するベクターを用いるか、もしくはそのような配列を導入することにより、発現ベクターとすることで、それぞれの宿主において遺伝子を発現させることが可能である。このような発現ベクターは、本発明の組換えプラスミドの好適な態様である。
【００８７】
本発明の組換えプラスミドを、各種細胞に導入することにより、宿主細胞を得ることができる。このような細胞は、プラスミドを導入することができる細胞であれば原核細胞であっても真核細胞であってもよい。
【００８８】
原核細胞の宿主としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）や枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが挙げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で形質転換させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリコンすなわち複製起点と、調節配列を含んでいるプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させる。また、ベクターとしては、形質転換細胞に表現形質（表現型）の選択性を付与することができる配列を有するものが好ましい。
【００８９】
例えば、大腸菌としてはＫ１２株などがよく用いられ、ベクターとしては、一般にｐＢＲ３２２やｐＵＣ系のプラスミドが用いられるが、これらに限定されず、公知の各種菌株、およびベクターがいずれも使用できる。
【００９０】
プロモーターとしては、大腸菌においては、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラクトース（ｌａｃ）プロモーター、トリプトファン・ラクトース（ｔａｃ）プロモーター、リポプロテイン（ｌｐｐ）プロモーター、ポリペプチド鎖伸張因子Ｔｕ（ｔｕｆＢ）プロモーター等が挙げられ、どのプロモーターも本発明のキチナーゼの産生に使用することができる。
【００９１】
枯草菌としては、例えば２０７−２５株が好ましく、ベクターとしてはｐＴＵＢ２２８（Ｏｈｍｕｒａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ９５， ８７−９３）などが用いられるが、これに限定されるものではない。
【００９２】
プロモーターとしては、枯草菌のα−アミラーゼのシグナルペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を連結することにより、菌体外での分泌発現も可能となる。
【００９３】
真核細胞の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、酵母などの細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、哺乳動物由来の細胞、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ， Ｙ． （１９８１） Ｃｅｌｌ ２３， １７５−１８２、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５０）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Ｕｒｌａｕｂ， Ｇ． ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ， Ｌ． Ａ． （１９８０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７， ４１２６−４２２０）等がよく用いられているが、これらに限定されない。
【００９４】
脊椎動物細胞の発現プロモーターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列等を有するものを使用でき、さらにこれは必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクターの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． （１９８１） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １， ８５４−８６４）等が挙げられるが、これに限定されない。
【００９５】
宿主細胞として、ＣＯＳ細胞を用いる場合を例に挙げると、発現ベクターとしては、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自立増殖が可能であり、さらに、転写プロモーター、転写終結シグナル、およびＲＮＡスプライス部位を具えたものを用いることができる。該発現ベクターは、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ， Ｈ． ａｎｄ Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ， Ｇ． （１９８３） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， １１， １２９５−１３０８）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ， Ｆ． Ｌ． ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ， Ａ． Ｊ． （１９７３） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２， ４５６−４５７）、および電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ， Ｅ． ｅｔ ａｌ． （１９８２） ＥＭＢＯ Ｊ． １， ８４１−８４５）などによりＣＯＳ細胞に取り込ませることができ、かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、発現ベクターと共に、抗生物質Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現し得るベクター、例えばｐＲＳＶｎｅｏ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． （１９８９）： ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ” Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ＮＹ）やｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ， Ｐ． Ｊ． ａｎｄ Ｂｅｒｇ， Ｐ． （１９８２） Ｊ． Ｍｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． １， ３２７−３４１）などをコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、本発明のキチナーゼを安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。
【００９６】
昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、鱗翅類ヤガ科のＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞由来株化細胞（Ｓｆ−９またはＳｆ−２１）やＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵細胞由来 Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞（Ｗｉｃｋｈａｍ， Ｔ． Ｊ． ｅｔ ａｌ， （１９９２） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ． Ｉ： ３９１−３９６）などが宿主細胞としてよく用いられ、バキュロウイルストランスファーベクターとしてはオートグラファ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）のポリヘドリンタンパク質のプロモーターを利用したｐＶＬ１３９２／１３９３がよく用いられる（Ｋｉｄｄ， Ｉ． Ｍ． ａｎｄ Ｖ．Ｃ． Ｅｍｅｒｙ （１９９３） Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４２， １３７−１５９）。
【００９７】
この他にも、バキュロウイルスのＰ１０や同塩基性タンパク質のプロモーターを利用したベクターも使用できる。さらに、ＡｃＮＰＶのエンベロープ表面タンパク質ＧＰ６７の分泌シグナル配列を目的タンパク質のＮ末端側に繋げることにより、組換えタンパク質を分泌タンパク質として発現させることも可能である（Ｚｈｅ−ｍｅｉ Ｗａｎｇ， ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ３７９， １６７−１７４）。
【００９８】
真核微生物を宿主細胞とした発現系としては、酵母が一般によく知られており、その中でもサッカロミセス属酵母、例えばパン酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅや石油酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓが好ましい。該酵母などの真核微生物の発現ベクターとしては、例えば、アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター（Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ， Ｊ． Ｌ． ａｎｄ Ｈａｌｌ， Ｂ． Ｄ． （１９８２） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５７， ３０１８−３０２５）や酸性フォスファターゼ遺伝子のプロモーター（Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ， Ａ． ｅｔ ａｌ． （１９８３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０， １−５）などを好ましく利用できる。
【００９９】
また、分泌型タンパク質として発現させる場合には、分泌シグナル配列と宿主細胞の持つ内在性プロテアーゼあるいは既知のプロテアーゼの切断部位をＮ末端側に持つ組換え体として発現することも可能である。例えば、トリプシン型セリンプロテアーゼのヒトマスト細胞トリプターゼを石油酵母で発現させた系では、Ｎ末端側に酵母のαファクターの分泌シグナル配列と石油酵母の持つＫＥＸ２プロテアーゼの切断部位をつなぎ発現させることにより、活性型トリプターゼが培地中に分泌されることが知られている（Ａｎｄｒｅｗ， Ｌ． Ｎｉｌｅｓ，ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２８， １２５−１３１）。
【０１００】
上記のようにして得られる形質転換体は、常法に従い培養することができ、該培養により細胞内、または細胞外に本発明のキチナーゼが産生される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば、上記ＣＯＳ細胞であれば、ＲＰＭＩ１６４０培地やダルベッコ改変イーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」という）などの培地に、必要に応じウシ胎児血清などの血清成分を添加したものを使用できる。
【０１０１】
培養条件としては、ＣＯ２濃度は０乃至５０％の範囲であればよく、好適には１乃至１０％でありより好適には５％である。培養温度は０乃至９９℃であればよく、好適には２０乃至５０℃であり、より好適には３５乃至４０℃である。
【０１０２】
上記培養により形質転換体の細胞内または細胞外に組換えタンパク質として産生される本発明のキチナーゼは、培養産物中から、そのタンパク質の物理化学的性質、化学的性質、生化学的性質（酵素活性など）等を利用した各種の分離操作（「生化学データブックＩＩ」、１１７５−１２５９項、第１版第１刷、１９８０年６月２３日株式会社東京化学同人発行；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｖｏｌ． ２５， Ｎｏ．２５， ｐ８２７４−８２７７ （１９８６）； Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １６３， ｐ３１３−３２１ （１９８７）等参照）により分離、精製することができる。
【０１０３】
該方法としては、具体的には、例えば通常の再構成処理、タンパク沈殿剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧ショック法、凍結融解法、超音波破砕、限外ろ過、ゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、それらの組み合わせ等を例示できる。上記により、高収率で所望の組換えタンパク質を工業的規模で製造できる。また、発現させる組換えタンパク質に６残基からなるヒスチジンを繋げることにより、ニッケルアフィニティーカラムで効率的に精製することができる。上記方法を組み合わせることにより容易に高収率、高純度で本発明のキチナーゼを大量に製造できる。
以上のような方法により製造されたキチナーゼも本発明の好適な例としてあげる事ができる。
【０１０４】
部分アセチル化キトサンとは、キトサンのアミノ基の一部がアセチル化されているものをいい、キチンをアルカリで脱アセチル化することによって製造することができる。部分アセチル化キトサンのアセチル化度はアルカリ濃度、反応時間等により制御することができる。また、分子量が１００万以上のものを特に高分子部分アセチル化キトサンと呼ぶ。分子量１００万以上の高分子部分アセチル化キトサンとしては、例えば、エビ・カニ由来の３０％、２０％、１０％アセチル化キトサン（商品名 キトサン７Ｂ、８Ｂ、９Ｂ（いずれも加ト吉（株）製））を用いることができるが、これらに限定されない。エビ、カニに含まれる天然のキチンは、よりアセチル化度が高い高分子部分アセチル化キトサンであり、これらも部分アセチル化キトサンとして用いることができる。
【０１０５】
キチナーゼの加水分解活性は、Ｓｃｈａｌｅｓ変法（Ｉｍｏｔｏ， Ｔ． ａｎｄ Ｙａｇａｓｈｉｔａ， Ｋ．， Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ３５， １１５４（１９７１））に従って測定できる。
グリコールキチンは、Ｒ． Ｓｅｎｚｙｕ ａｎｄ Ｓ． Ｏｋｉｍａｓｕ， Ｎｉｐｐｏｎ Ｎｏｇｅｉｋａｇａｋｕ Ｋａｉｓｈｉ， ２３， ４３２ （１９５０）に記載されている方法によって製造することができる。
【０１０６】
キチナーゼ生産菌から得られたキチナーゼの具体的な性質について以下に示すが、本発明のキチナーゼの有する性質はこれらに限定されるものではない。
【０１０７】
アスペルギルス・ニガーＳＡＮＫ １３６０３株により生産され、精製されたキチナーゼは、以下の性質を有する。
１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法にて分子量約４０，０００を示す。
２）等電点電気泳動法にて等電点ｐＩが約３．５を示す。
３）キトサン７Ｂ（加ト吉（株）製）を、ｐＨ３．０乃至ｐＨ１１．０にて加水分解する。
４）グリコールキチンを、ｐＨ３．０乃至ｐＨ１１．５にて加水分解する。
５）８０℃以下で３）記載の加水分解活性を発揮する。
６）３）記載の加水分解活性の最適ｐＨはｐＨ５．０である。
７）４）記載の加水分解活性の最適ｐＨはｐＨ９．０である。
８）３）記載の加水分解活性の最適温度はｐＨ５．０では７０℃である。
９）５０℃以下の温度で安定である。
１０）ｐＨ４．０乃至ｐＨ１１．０のｐＨ条件下で安定である。
１１）キトサン７Ｂに対する酵素のｐＨ５．０、温度３７℃における１０分間の加水分解活性を、相対値として表１に示す。
【０１０８】
表中、キトサン１０Ｂは１％アセチル化キチン、キトサン９Ｂは１０％アセチル化キチン、キトサン８Ｂは２０％アセチル化キチン、キトサン７Ｂは３０％アセチル化キチンである（いずれも加ト吉（株）製）。ＣＭ−セルロースは、カルボキシメチルセルロースナトリウムである（和光純薬社製）。グリコールキチンは、前述の方法により調製する。
【０１０９】
【表１】
【０１１０】
表１から、この酵素は、ｐＨ５．０においてはグリコールキチンよりもアセチル化度が２０〜３０％の部分アセチル化キトサン（キトサン８Ｂ、７Ｂ）に対する加水分解活性が高く、アセチル化度が１％以下のキトサン（キトサン１０Ｂ）に対する加水分解活性がほとんどないことがわかる。カルボキシメチルセルロースナトリウムに対する加水分解活性はない。
【０１１１】
１２）下記に示す部分アミノ酸配列を有する。配列は、Ｎ末端側から記す。
Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｌａ （配列番号１）
１３）タンパクのＮ末端アミノ酸が修飾されている。
【０１１２】
以上のことから、本発明のキチナーゼの有する性質としては以下のようなものが挙げられるが、これに限定されるものではない。
１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法にて分子量約４０，０００を示す。
２）等電点電気泳動法にて等電点ｐＩが約３．５を示す。
３）キトサン７Ｂを、ｐＨ３．０乃至ｐＨ１１．０にて加水分解する。
４）グリコールキチンを、ｐＨ３．０乃至ｐＨ１１．５にて加水分解する；
５）０℃乃至８０℃で３）記載の加水分解活性を発揮する；
６）５０℃以下の温度で安定である；
７）ｐＨ４．０乃至ｐＨ１１．０のｐＨ条件下で安定である。
【０１１３】
また、本発明のキチナーゼを製造する方法も本発明に含まれる。
アスペルギルス・ニガーＳＡＮＫ １３６０３株を初めとするキチナーゼ産生微生物を培地で培養することにより、キチナーゼを生産することができる。例えば、０．１〜５．０％マルトエクストラクト（Ｄｉｆｃｏ（株）製）及び０．１〜１．０％イーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ（株）製）に加えて、
０．０５〜１．０％キチン、
０．０５〜１．０％キトサン、
０．０５〜１０％オートミール
０．０５〜１０％酵母細胞壁、及び／又は
０．０５〜１０％小麦ふすま
の培地で、１６〜４５℃で１〜１５日間、１００〜２５０ｒｍｐで振とう培養する。
【０１１４】
本発明のキチナーゼは、扱いにくい試料をより扱い易くする為にも有効に用いる事ができる。従来、甲殻類などを含む試料を、粉砕する，すり潰す、ミキサーにかけるなどの加工をした場合、粘度が非常に高くなり、扱いにくかった。これは、これら甲殻類に大量に含まれる高分子多糖（主成分は高分子部分アセチル化キトサン）が原因であった。たとえば、このような食品加工の過程に、本発明のキチナーゼを加えて反応させ、その液性成分中の高分子部分アセチル化キトサンを分解し、その液性成分中に高分子部分アセチル化キトサンを実質的に含まない、扱い易い試料を製造することが可能であり、キチナーゼを用いた扱い易い試料の製造方法も本発明に含まれる。
【０１１５】
このような製造方法に用いる原材料としては、高分子部分アセチル化キトサンを含む試料であれば特に限定されないが、好ましくは、甲殻類を含む試料であり，より好ましくはエビおよびカニのいずれか一つまたは両方を含む試料である。
【０１１６】
原材料とキチナーゼの反応条件としては上記のキトサン分解活性を発揮する条件を適用することができる。反応時間は１０分以上であって、試料の粘度が低い状態になる時間であれば特に限定されないが、好ましくは１０分間から１０日間程度であり、より好ましくは１日間から５日間程度である。また、このような方法によって製造された試料も本発明に含まれる。
【０１１７】
「その液性成分中に高分子部分アセチル化キトサンを実質的に含まない」とは、試料に高分子部分アセチル化キトサンが含有される事によりもたらされる、高い粘性が減少または消失した状態を指し、厳密に濃度として０％であることを指さないが、好ましくは高分子部分アセチル化キトサンの含有量が２０％以下であり、より好ましくは１０％以下であり、さらに好ましくは５％以下であり、最適には０％である。
【０１１８】
以下に、実施例及び試験例を挙げるが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【０１１９】
【実施例】
実施例１．アスペルギルス・ニガーＳＡＮＫ １３６０３株からのキチナーゼの精製
１）粗酵素液の調製
滅菌した表２の組成の培地１００ｍｌが入っている５００ｍｌ容の三角フラスコ（種フラスコ）にアスペルギルス・ニガーＳＡＮＫ １３６０３株の菌体を接種し、２６℃にて８日間、１７０ｒｐｍの振とう培養を行った。
【０１２０】
【表２】
【０１２１】
培養終了後、４℃、１０，０００×Ｇにて１０分間の遠心分離を行った。得られた上清を粗酵素液とした。
【０１２２】
２）酵素活性測定法
キチナーゼの加水分解活性は以下のようにして測定した。
▲１▼部分アセチル化キトサンの加水分解反応
キトサン７Ｂ（３０％アセチル化キトサン、加ト吉（株）製）１２５ｍｇに水５０ｍｌおよび１Ｎ塩酸４００μｌを加え、粉末キトサンを完全に溶解させた。キトサン８Ｂ（２０％アセチル化キトサン、加ト吉（株）製）、キトサン９Ｂ（１０％アセチル化キトサン、加ト吉（株）製）、キトサン１０Ｂ（ほぼ完全な脱アセチル化キトサン、加ト吉（株）製）も同様にして完全に水溶液とした。これらのキトサン水溶液９６μｌ、４００ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１５０μｌおよび水２４４μｌの混合液に酵素液１００μｌを加え撹拌して均一にし、３７℃で保温して１０分間酵素反応を行った。
【０１２３】
▲２▼シェールズ変法による遊離還元糖の定量
フェリシアン化カリウム１００ｍｇを０．５Ｎ炭酸ナトリウム水溶液２００ｍｌに溶かした溶液８００μｌを酵素反応液に加えて反応を停止させた後、１００℃で１５分間保温した。氷冷後、沈殿物を遠心分離し上清の４２０ｎｍにおける吸光度を測定した。酵素反応１分間当たり１μｍｏｌのアセチルグルコサミンを生成する酵素活性を１単位とした。
【０１２４】
３）精製酵素液の調製
１）で得られた粗酵素液５００ｍｌを１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）４，０００ｍｌに対して１２時間ずつ５回透析した。これを、予め１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥトヨパール（東ソー（株）製）カラム（直径２．２ｃｍ×長さ２０ｃｍ）に添加し、吸着させた。１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で該カラムを十分洗浄した後、１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）６００ｍｌ中に０乃至０．４Ｍの塩化ナトリウムの直線的濃度勾配を作製して該カラムに吸着した成分を溶出させた。キチン分解活性は塩化ナトリウム濃度が０．２０Ｍ乃至０．２５Ｍの画分（７５ｍｌ）に溶出された。これを粗精製酵素画分とした。
【０１２５】
得られた活性画分７５ ｍｌを１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）４，０００ｍｌに対して１２時間ずつ３回透析した後、予め１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＭｏｎｏＱ（ファルマシア社製）カラム（直径７ｍｍ×長さ５ｃｍ）に添加し、吸着させた。該カラムを１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で十分洗浄した後、１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）２５０ｍｌ中に０乃至０．３Ｍの塩化ナトリウムの直線的濃度勾配を作製して該カラムに吸着した成分を溶出させた。キチン分解活性は塩化ナトリウム濃度が０．１Ｍ乃至０．１１５Ｍの画分（１０ｍｌ）に溶出された。
この画分を精製酵素溶液とした。
【０１２６】
５）精製酵素の分子量測定
１２．５％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法（Ｌａｅｍｍｌｉ， Ｕ．Ｋ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２２７， ６８０（１９７０）参照）により、精製酵素の分子量を求めた。標準タンパク質として次のものを用いた：ａ．ホスホリラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）、分子量９４，０００：ｂ．アルブミン（ａｌｂｕｍｉｎ）、分子量６７，０００：ｃ．オバルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）、分子量４３０００：ｄ．カルボニック・アンヒドラーゼ（ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ）、分子量３０，０００：ｅ．トリプシン・インヒビター（ｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、分子量２０，１００：ｆ．α−ラクタルブミン（α−ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ）、分子量１４，４００。
精製酵素は分子量約４０，０００の単一バンドを示した。
【０１２７】
６）精製酵素の等電点
精製酵素を等電点電気泳動（日本生化学会編「生化学実験講座１ タンパク質の化学Ｉ 分離精製、東京化学同人刊（１９７６年）」２６２乃至３１２頁参照）に供した。精製酵素の等電点は約ｐＩ３．５であった。
【０１２８】
７）部分アミノ酸配列の決定
精製した酵素溶液を約１ｍｇ／ｍｌ程度まで限外濾過膜（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製 ＵＬＴＲＡ ＦＩＬＴＥＲ ＵＮＩＴ ＵＳＹ−１、分子量分画１万）を用いて濃縮した。濃縮酵素液４００μｌにＤｅｎａｔｕｒｅ ｂｕｆｆｅｒ（６Ｍ塩酸グアニジン、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ炭酸水素アンモニウムｐＨ ７．８）４００μｌおよび５０ｍＭ ジチオスレイトール ８μｌを加え、９５℃で１０分間反応させた。室温まで冷却後、反応液にＤｅｎａｔｕｒｅ ｂｕｆｆｅｒ溶液に溶解した５０ｍＭ ヨードアセトアミド４０μｌを加え、暗所室温で１時間反応させた。この溶液をＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ Ｍｉｎｉ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｕｎｉｔｓ Ｐｌｕｓ Ｆｌｏａｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製、分子量分画１万）で水１Ｌに対して透析した。得られた溶液にトリプシン（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）８μｌを加え、３７℃で７時間酵素反応させた。反応液をＳＭＡＲＴ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）にかけて分解アミノ酸のピークを分離した。分離条件を以下に示す。
【０１２９】
カラム：Ｎｏｍｕｒａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ３００ ＣＤＳ−ＨＧ−５ （１ｍｍ×１５０ｍｍ）
Ａ ｂｕｆｆｅｒ：０．１％ＴＦＡ／Ｗａｔｅｒ
Ｂ ｂｕｆｆｅｒ：０．１％ＴＦＡ／Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌ
グラジエント：１０→７０％Ｂ ２％／ｍｌ
Ｆｌｏｗ：５０μｌ／分
【０１３０】
分離した分解アミノ酸のうち、ピーク（Ｂ ｂｕｆｆｅｒ濃度４８％程度）を分取し、これについてアミノ酸配列解析装置（Ｐｒｏｃｉｓｅ ｃＬＣ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）でアミノ酸配列を解析した。その結果得られた部分アミノ酸配列をアミノ末端側から記す。
【０１３１】
Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｌａ（配列番号１）。
【０１３２】
実施例２．アスペルギルス・ニガー由来のキチナーゼをコードするＤＮＡの同定
２−１）アスペルギルス・ニガーの全ＲＮＡの精製
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＳＡＮＫ １３６０３株を液体培地（１％ マルト エクストラクト、０．５％ イースト エクストラクト、０．５％ Ｇｌｕｃｏｓｅ）２０ｍｌで３０℃、３日間前培養した。その後、液体培地（１％ マルト エクストラクト、０．５％ イースト エクストラクト、０．５％ スクロース）に１％植菌し、３０℃で５日間培養した。培養した菌体を吸引集菌し、−８０℃で冷やした乳鉢（オートクレーブ滅菌済）に移した。液体窒素を加えながら、乳棒で菌体を破砕し、粉末状にした。完全に粉末状になった菌体をＲｎｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ （キアゲン社製）を用いて全ＲＮＡの精製を行った。８５ｎｇ／μｌの濃度のものが５０μｌ得られた。
【０１３３】
２−２）アスペルギルス・ニガー由来二本鎖ｃＤＮＡライブラリーの作製
アスペルギルス・ニガーのｃＤＮＡライブラリーは、ＳＭＡＲＴ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （クロンテック社製）を用いて作製した。具体的には２−１）で精製したＲＮＡを鋳型として逆転写酵素で一本鎖ｃＤＮＡを作った後、ＰＣＲにより二本鎖ｃＤＮＡライブラリーを構築した。
【０１３４】
２−３）キチナーゼ遺伝子配列の解読
２−２）で得たｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｅｘ ＴａｑＴＭ（タカラバイオ社製）を使用してＰＣＲをおこなった。このときに使用したプライマーは、５’−ＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＧＧＣＣＡＴＴＡＣ−３’および５’−ＧＧＣＡＴＡＧＴＣＧＴＡＧＧＣＣＡＴＣＡＡＡＴＴＧ−３’の組み合わせで５’側の遺伝子配列を増幅した。また、３’側の配列は５’−ＡＴＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＡＴ−３’および５’−ＧＣＣＡＴＴＴＡＣＧＧＧＣＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＴＣ−３’の組み合わせで増幅した。ＰＣＲサイクルは、９４℃・５分、（９４℃・３０秒、５０℃・３０秒、７２℃・２分）×３０、７２℃・５分、４℃で増幅した。５′側の遺伝子配列約８５０ｂ．ｐ．、３′側の遺伝子配列約１，３００ｂ．ｐ．の長さのＤＮＡが増幅された。
【０１３５】
各々のＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動をおこなった後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔａｒｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）で精製した。精製物をＴＯＰＯＴＭＴＡクローニングキット（インビトロジェン社製）を用いてベクターに連結し、形質転換をおこなった。形質転換した大腸菌を３７℃、一晩寒天培地（ＬＢ／Ａｇａｒ（和光純薬製））上で培養した後、生育したコロニーを３７℃、一晩液体培地（ＬＢｂｒｏｔｈ（和光純薬製））で培養した。増殖した大腸菌からプラスミドをＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、ＤＮＡ配列解析をおこなった。ＤＮＡ配列解析の結果を配列番号２に示した。また、ＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号３に示した。
【０１３６】
試験例１．アスペルギルス・ニガー ＳＡＮＫ １３６０３株由来のキチナーゼの精製酵素液の諸性質
実施例１．３）で得られた精製酵素液について、活性測定を行なった。
１）ｐＨ活性
キトサン７Ｂ溶液９６μｌ、４００ｍＭ緩衝液１５０μｌおよび水２４４μｌの混合液に、酵素液１００μｌを加え撹拌して均一にし、３７℃で１０分間酵素反応を行った。酵素反応後の遊離還元糖の定量は実施例１ ２）記載の方法にしたがった。緩衝液は次のものを用いた：ｐＨ２．８乃至ｐＨ６．０の場合、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液：ｐＨ ６．０乃至ｐＨ８．２の場合、リン酸１水素２ナトリウム−リン酸２水素１ナトリウム緩衝液：ｐＨ７．７乃至ｐＨ９．３の場合、トリス−塩酸緩衝液：ｐＨ９．５乃至ｐＨ１１．０の場合、炭酸１水素２ナトリウム−炭酸２水素１ナトリウム緩衝液：ｐＨ１１．０乃至ｐＨ１２．４の場合、リン酸１水素２ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液。最も活性が高かったｐＨ条件での加水分解活性を１００％とし、各ｐＨにおける酵素の加水分解活性を相対値として図１に記載した。至適ｐＨはｐＨ５．０付近であった。グリコールキチンを基質として用いたときにも、同様の条件でｐＨ活性を測定した。結果を図２に示した。至適ｐＨはｐＨ９．０付近であった。
【０１３７】
２）温度活性
ｐＨ５．０の条件下において、種々の温度で加水分解活性を測定した。５分間予熱した実施例１で作製したキトサン７Ｂ溶液９６μｌ、４００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１５０μｌおよび水２４４μｌの混合液に、酵素液１００μｌを加え撹拌して均一にし、１０分間酵素反応を行った。酵素反応後の遊離還元糖の定量は実施例１にしたがった。最も高い活性を示した温度条件で測定された加水分解活性を１００％とし、各温度における加水分解活性を相対値として図３にまとめた。
【０１３８】
３）温度安定性
精製酵素溶液を種々の温度で３０分間処理した後、その残存加水分解活性を測定した。あらかじめ処理温度に保持した４００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１８０μｌおよび水３６μｌに、精製酵素液２４μｌを加え撹拌して均一にし、３０分間保温した。実施例１で作製したキトサン７Ｂ溶液９６μｌに加温処理した酵素液２００μｌを加え、３７℃で１５分間酵素反応を行った。遊離還元糖の定量は実施例１にしたがった。無処理（０℃保温）群の酵素および緩衝液の混合液が有する加水分解活性を１００％とし、各温度における加水分解活性を相対値として図４にまとめた。
【０１３９】
４）ｐＨ安定性
精製酵素液３７．５μｌに、以下に述べる各ｐＨの４００ｍＭ緩衝液１２．５μｌを添加し、３７℃にて１時間保温した。緩衝液は次のものを用いた：ｐＨ３．２乃至ｐＨ６．４の場合、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液：ｐＨ６．４乃至ｐＨ８．２の場合、リン酸１水素２ナトリウム−リン酸２水素１ナトリウム緩衝液：ｐＨ７．６乃至ｐＨ９．１の場合、トリス−塩酸緩衝液：ｐＨ９．２乃至ｐＨ１０．６の場合、炭酸１水素２ナトリウム−炭酸２水素１ナトリウム緩衝液：ｐＨ１１．３乃至ｐＨ１２．２の場合、リン酸１水素２ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液。４００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１５０μｌ、水２０４μｌおよび実施例１ ２）記載の方法で作製したキトサン７Ｂ溶液９６μｌの混合液に、加温した酵素混合液に水３２５μｌを加えた溶液のうち１５０μｌを加え撹拌して均一にし、３７℃で１０分間酵素反応を行った。遊離還元糖の定量は実施例１にしたがった。無処理（０℃保温）群の酵素および緩衝液の混合液が有する加水分解活性を１００％とし、各ｐＨにおける加水分解活性を相対値として図５にまとめた。
【０１４０】
５）精製酵素の基質選択性
次に、ｐＨ５．０における基質選択性を測定した。実施例１の３）で調製した精製酵素液を用いた。０．２５％ ｗｔ／ｖの基質溶液９６μｌおよび４００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）および水２４４μｌの混合液に酵素液１００μｌを加え撹拌して均一にし反応を開始し、３７℃で保温して１０分間酵素反応を行った。酵素反応後の遊離還元糖の定量は実施例１の２）記載の方法により行った。最大活性を示す基質を用いたときの加水分解活性を１００％としたときの、相対活性を表３に示す。
【０１４１】
【表３】
【０１４２】
表３に示す通り、精製酵素はキトサン７Ｂに対して最も加水分解活性が高く、アセチル化度が小さくなるにつれて加水分解活性は低下した。また、セルロース加水分解活性は見られなかった。
【０１４３】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明のキチナーゼを用いる事により、高分子部分アセチル化キトサンを酸性条件下比較的高い温度において加水分解することが可能になった。更に本発明のキチナーゼはアスペルギルス・ニガー由来であり、食品加工上使用に耐えうる安全性を有している。
【０１４４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】キトサン７Ｂを反応基質としたときのアスペルギルス・ニガー ＳＡＮＫ １３６０３株由来の精製キチナーゼの活性とｐＨとの関係を示す図である。
【図２】グリコールキチンを反応基質としたときのアスペルギルス・ニガー ＳＡＮＫ１３６０３株由来の精製キチナーゼの活性とｐＨとの関係を示す図である。
【図３】アスペルギルス・ニガー ＳＡＮＫ １３６０３株由来の精製キチナーゼの活性と温度との関係を示す図である。
【図４】アスペルギルス・ニガー ＳＡＮＫ １３６０３株由来の精製キチナーゼの温度安定性を示す図である。
【図５】アスペルギルス・ニガー ＳＡＮＫ １３６０３株由来の精製キチナーゼのｐＨ安定性を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）の培養物から分離精製されるキチン分解酵素に関する。また、該キチン分解酵素をコードするＤＮＡおよび該キチン分解酵素の製造方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
〔１〕キチン分解酵素
キチン分解酵素（＝キチナーゼ）は、パパイヤやイチジク等の植物及び微生物等から得られる酵素であり、キチン・キトサンの工業的利用において非常に重要な役割を果たしている。
【０００３】
これまで、細菌由来のキチナーゼとしては、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（非特許文献１参照）、サイトファーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）属、アクロモバクター・ヒテロプティカム（Ａｃｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｈｙｔｅｒｏｐｔｉｃｕｍ：非特許文献２参照）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属及びミクロコッカス・コルポゲネス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｌｐｏｇｅｎｅｓ）（非特許文献２参照）の生産するキチナーゼ並びに、アルテロモナス・エスピー（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）の生産するキチナーゼＡ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｄ１３７６２）等が知られている。
【０００４】
また、放線菌の生産するキチナーゼとしては、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、ノカルディオプシス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ）属及びアクチノミセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）属の生産するキチナーゼが知られている（非特許文献３）。
【０００５】
糸状菌の生産するキチナーゼとしては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属及びペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属の生産するキチナーゼが知られている。
【０００６】
さらに、アスペルギルス属の生産する酵素としては、アスペルギルス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ：非特許文献４参照）、アスペルギルス・カンディドス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃａｎｄｉｄｕｓ：非特許文献５参照）及びアスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ：非特許文献６および７参照）の生産するキチナーゼが知られている。また、味噌やしょうゆ、日本酒の生産等、食品製造・加工において幅広く使用されているアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）に関しては、キチナーゼをコードすると考えられる遺伝子について学会発表があったとの報告（非特許文献８参照）がある。
【０００７】
また、酵母の生産する酵素としては、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の生産するキチナーゼを例示することができ、好適にはサッカロミセス・セレヴィシエの生産するキチナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｍ７４０７０）及びＯＲＦ Ｄ９４８１．７（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｕ２８３７３）である。
【０００８】
〔２〕キチン・キトサン
キチン（β−１，４−ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン）は天然に非常に多く存在する多糖であり、主としてカニ・エビ等の甲殻類およびイカ軟甲から工業的規模で抽出され生産されている。
【０００９】
キトサン（β−１，４−ポリグルコサミン）は、キチンを濃アルカリ水で処理することにより得られる、アミノ基を有する高分子多糖であり、さまざまな生理活性を有することが知られている（非特許文献９参照。）。なかでも、キトサンは天然物由来物質としては強力な抗菌作用を有し、かつ安全性が合成抗菌剤と比較して非常に高い（非特許文献１０参照。）ことが知られている。
【００１０】
特に、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｍｅｔｈｉｃｈｉｌｉｎ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（以下、「ＭＲＳＡ」と記す）を含むスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（非特許文献１１乃至非特許文献１２参照）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（非特許文献１３参照）、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（非特許文献１４および非特許文献１５参照）等の細菌に対して効果があることが知られている。
【００１１】
〔３〕キトサンの処理と問題点
カニ・エビ等の甲殻類やイカ軟甲から抽出されたキチンを濃アルカリ処理することによって製造されたキトサンは、分子量１００万以上の高分子多糖であり、酸性条件では水に溶けるが、中性あるいはアルカリ性の条件では水に溶けない。そして、水に溶けない状態では、キトサンの生理活性は十分に発揮できない。
【００１２】
また、甲殻類を含む食品材料を加工する際、これら高分子多糖が原因で非常に粘度が高い状態になってしまい、その後の処理に手間がかかるという問題もあった。
【００１３】
キトサンの生理活性を十分に発揮させ、かつ、食品加工等の処理を効率化するには、キトサンの水に対する溶解性を増す必要がある。そのため、（ｉ）高分子キトサンの誘導体化（非特許文献１６）あるいは、（ｉｉ）低分子化する、といった試みがなされている。
【００１４】
しかし、誘導体化には問題がある。キトサンを誘導体化することにより、天然物とは異なる構造となる可能性がある。その結果、誘導体化されたキトサンが、天然型のキトサンとは異なる性質を有するようになったり、使用に際しては安全性試験データ等が必要になったりする等の問題である。また、誘導体化反応に使用した有機溶媒の除去、処理が生産コストを引き上げるという問題もある。
【００１５】
そこで、一般的に、水に対する溶解性を上げるためには、誘導体化する方法ではなく、低分子化が望ましいと考えられている。低分子化をしても、キトサンが有する抗菌活性は失われない。事実、キトサンが有する抗菌活性は、分子量が１００万以上の高分子キトサンだけではなく、低分子キトサンでも発揮されることが知られている（非特許文献１７）。
【００１６】
しかし、一方で、分子量が１万以下のキトサンには、皮膚刺激性等の副作用があることが報告されていることから（特許文献１）、あまり低分子化し過ぎるのは好ましくなく、分子量１万以上の低分子キトサンの製造方法が検討されている。
【００１７】
〔４〕低分子キトサンの製造法
低分子キトサンの製造方法としては、化学的あるいは酵素的手法による高分子キトサンの加水分解が検討されてきた。
【００１８】
化学的製造方法としては、高分子キトサンを、（ｉ）過酢酸等の酸化剤で処理する方法（特許文献２および特許文献３）、（ｉｉ）超音波処理する方法（非特許文献１８）、（ｉｉｉ）塩酸処理する方法（特許文献４）等が挙げられる。
【００１９】
しかし、酸化剤で処理する方法では分子量５００−３０，０００のキトサンが大量に生成することが知られているものの、その中での分子量１万以上のキトサンの割合は定かではない。
【００２０】
また、超音波で処理する方法では装置の大型化が困難であり、大量製造に不向きであると考えられる。さらに塩酸を用いる方法では、キトサンの塩酸塩以外の塩、例えば酢酸塩あるいは乳酸塩等の低分子キトサンを純粋に得ることは極めて困難である。
【００２１】
一方、酵素的製造方法としては、キトサナーゼを用いる方法（特許文献５および特許文献６）、キチナーゼを用いる方法（非特許文献１９）などが挙げられ、いずれの方法においても、分子量１００万以上の高分子キトサンを酸性条件下水に可溶化し、酵素反応を行わせる。
【００２２】
【特許文献１】
特開２０００−１６９３２７号公報
【特許文献２】
特許第３０７６２１２号公報
【特許文献３】
特開平５−６５３６８号公報
【特許文献４】
特開２００３−１２８７０５号公報
【特許文献５】
特許第２７６３１１２号公報
【特許文献６】
特開平１１−３２２８０９号公報
【非特許文献１】
ヴェルドカンプ（Ｖｅｌｄｋａｍｐ， Ｈ．）「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」１９５２年、１６９巻、ｐ．５００
【非特許文献２】
キャンプベルら（Ｃａｍｐｂｅｌｌ， Ｊｒ．， Ｌ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．）「ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」１９５１年、５巻、ｐ．８９４
【非特許文献３】
中神照太ら「工技院醗酵研究所報告」１９６６年、３０巻、ｐ．１９
【非特許文献４】
タカヤら（Ｔａｋａｙａ， Ｎ．， ｅｔ ａｌ．）「（バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ））１９９８年、６２巻、ｐ．６０
【非特許文献５】
シェリフら（Ｓｈｅｒｉｆ， Ａ． Ａ．， ｅｔ ａｌ．）「（アプライド・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））１９９１年、３５巻、ｐ．２２８
【非特許文献６】
エスコットら（Ｅｓｃｏｔｔ， Ｇ． Ｍ．， ｅｔ ａｌ．）「（マイクロバイオロジー（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ））１９９８年、１４４巻、ｐ．１５７５
【非特許文献７】
キシャら（Ｘｉａ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ．）「（ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ））２００１年、２６８巻、ｐ．４０７９
【非特許文献８】
「キチン・キトサン研究」２００２年、第８巻、第２号、ｐ．２３８−２３９
【非特許文献９】
「キチン・キトサンハンドブック」、１９９５年、技報堂、ｐ．３０２−３７６
【非特許文献１０】
「キチン・キトサンの活用法」、１９９８年、財界特別増刊第４６巻２８号、ｐ．１０６−１１１
【非特許文献１１】
「加工技術」１９９８年、３３巻、ｐ．５１２−５１５
【非特許文献１２】
「加工技術」１９９８年、３３巻、ｐ．５３０−５３２
【非特許文献１３】
トクラら（Ｔｏｋｕｒａ， Ｓ ｅｔ ａｌ．）「マクロモレキュラー・シンポジア（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｍｐｏｓｉａ）」１９９７年、１２０巻、ｐ．１−９
【非特許文献１４】
ロークら（Ｌｏｋｅ， ＷＫ ｅｔ ａｌ．）「ジャーナル・オブ・バイオメディシナル・マテリアルズ・リサーチ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」２０００年、５３巻、ｐ．８−１７
【非特許文献１５】
キムら（Ｋｉｍ， Ｈ． Ｊ． ｅｔ ａｌ．）「ジャーナル・オブ・バイオマテリアルズ・サイエンス、ポリマー・エディション（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｅｄｉｔｉｏｎ）１９９９年、１０巻、ｐ．５４３−５６
【非特許文献１６】
「キチン・キトサンの活用法」財界特別増刊第４６巻２８号、１９９８年、ｐ．７８−８１
【非特許文献１７】
「日本農芸化学会誌７４巻大会講演要旨集」講演番号２Ｅ１８３α、２０００年
【非特許文献１８】
「キチン・キトサン研究」１９９９年、５巻、ｐ．７５−７９
【非特許文献１９】
「日本農芸化学会誌７４巻大会公演要旨集」講演番号２Ｆ３１３α、２０００年
【００２３】
【発明が解決しようとする課題】
上述のように、酵素的製造方法においては、酵素反応が酸性条件下で行なわれるので、酸性域で高い活性を有するとともに、安定性が高い酵素を使用することが望ましい。また、高分子キトサンの水溶液は常温では非常に高い粘度を有しており、可能な限り高い温度で酵素反応を行うことで粘度を減弱させ、反応効率の向上を図ることが望ましいことから、高温条件において高い活性を有する酵素を使用することが望ましい。加えて、食品加工や化粧品等に用いる場合、特にキチナーゼ産生微生物等、キチナーゼの由来に関して人体に安全なものが望ましい。
【００２４】
したがって、人体に安全な微生物に由来し、酸性条件及び高温条件において高い活性を有するキチナーゼを開発し提供することは、この技術分野において非常に関心の高い事項であった。
【００２５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、安全性に優れ、酸性域で高い活性を有するとともに安定性が高く、さらに耐熱性にすぐれた酵素を見出すべく鋭意検討を行い、いわゆる“コウジカビ”の一種として食品の製造等に有用である、アスペルギルス・ニガー由来のキチン分解酵素を精製し、該タンパク質をコードするＤＮＡをクローニングし、本発明を完成するに至った。
【００２６】
すなわち、本発明は、
（１） アスペルギルス・ニガーの培養物から分離精製されるキチン分解酵素。
【００２７】
（２） アスペルギルス・ニガーがアスペルギルス・ニガー ＳＡＮＫ １３６０３株である（１）記載のキチン分解酵素。
【００２８】
（３） 配列番号１の部分アミノ酸配列を有することを特徴とする、（１）または（２）に記載のキチン分解酵素。
【００２９】
（４） 以下の性質：
１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法にて分子量約４０，０００を示す；
２）等電点電気泳動法にて等電点ｐＩが約３．５を示す；
３）３０％アセチル化キトサン（粘度１００〜３００ｃｐｓ）を、ｐＨ３．０乃至ｐＨ１１．０にて加水分解する；
４）グリコールキチンを、ｐＨ３．０乃至ｐＨ１１．５にて加水分解する；
５）０℃乃至８０℃で３）記載の加水分解活性を発揮する；
６）５０℃以下の温度で安定である；
７）ｐＨ４．０乃至ｐＨ１１．０のｐＨ条件下で安定である；
を有する上記（１）乃至（３）のいずれか１つに記載のキチン分解酵素。
【００３０】
（５） 下記ａ）〜ｄ）：
ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
ｂ）配列番号２のヌクレオチド番号２３３乃至１４２６に示されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質；
ｃ）ａ）またはｂ）に記載のアミノ酸配列において、一つまたは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、キチン分解活性を有することを特徴とするタンパク質；
ｄ）ａ）またはｂ）に記載のアミノ酸配列を含むことからなるタンパク質、
のいずれか一つに記載のタンパク質である、キチン分解酵素。
【００３１】
（６） 下記のａ）〜ｅ）：
ａ）配列番号２のヌクレオチド番号２３３乃至１４２６に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
ｂ）上記ａ）に記載のＤＮＡと９０％以上のヌクレオチド配列相同性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、キチン分解活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とするＤＮＡ；
ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ；
ｄ）配列番号２のヌクレオチド番号２３３乃至１４２６に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるＤＮＡ、
のいずれか一つに記載のＤＮＡ。
【００３２】
（７） （６）に記載のＤＮＡにコードされるタンパク質である、キチン分解酵素。
【００３３】
（８） 下記のａ）及びｂ）：
ａ）３０％アセチル化キトサン（粘度１００〜３００ｃｐｓ）を、ｐＨ３．５乃至ｐＨ１０．５、０℃乃至８０℃の条件にて加水分解する活性；
ｂ）グリコールキチンを、ｐＨ４．０乃至ｐＨ１０．５にて加水分解する活性、
に示される活性を有することを特徴とする、（５）または（７）に記載のキチン分解酵素。
【００３４】
（９） 下記工程：
１）アスペルギルス・ニガーを、キチン分解酵素を産生する条件下で培養する工程、及び
２）１）の培養産物からキチン分解酵素を分離・精製する工程、
を含む、キチン分解酵素の製造方法。
【００３５】
（１０）アスペルギルス・ニガーを、オートミール及び／又は小麦ふすまを含有する培地を用いて培養する工程を含む、（９）に記載の方法。
【００３６】
（１１） アスペルギルス・ニガーが、アスペルギルス・ニガー ＳＡＮＫ １３６０３株である、（９）又は（１０）に記載の方法、及び
【００３７】
（１２） （９）〜（１１）に記載の方法により製造されるキチン分解酵素
に関する。
【００３８】
なお、上記（７）の６）及び７）に記載の、「安定である」とは、当該酵素が、約８０％以上の残存活性（相対値）を有することをいう。これら上記６）、７）に相当する以下の記載についても同じである。
【００３９】
本発明は、低分子キトサンを製造するために有用な糸状菌である、アスペルギルス・ニガー由来のキチナーゼに関する。
この明細書において、キチナーゼとは、キチン及び／又は部分アセチル化キトサンを加水分解する活性を有する酵素をいう。キチンを加水分解するとＮ−アセチルグルコサミンとそのオリゴ糖が生成する。この「キチン又は部分アセチル化キトサンを加水分解する活性」を「キチン分解活性」と定義する。
【００４０】
また、この明細書においては、「キチン」と「部分アセチル化キトサン」とは特に区別せず、キチンとは、部分アセチル化キトサンのうち、アセチル化の割合が高いものであると理解され、本明細書においては、特に区別しない限り、「部分アセチル化キトサン」は、キチンをも含むと理解されなければならない。
また、本発明において、キチン分解酵素とキチナーゼはいずれも上記キチン分解活性を有する酵素を指し、同義語として用いる。
【００４１】
本発明のキチナーゼには、キチナーゼを生産する微生物の培養物中のキチン分解活性を有するタンパク質が含まれる。このようなキチナーゼの例としては、アスペルギルス・ニガー由来のキチナーゼが挙げられる。より好適なものは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＳＡＮＫ １３６０３株由来のキチナーゼである。
【００４２】
また、本発明のキチナーゼの別の例としては、配列番号１に示されるアミノ酸配列を全て含み、かつ、キチン分解活性を有するタンパク質を挙げることができる。該タンパク質は、内部アミノ酸配列としてこれらの全てを含むものであればよい。
【００４３】
また、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において、１若しくは数個の部位に、１若しくは数個のアミノ酸残基が、置換、欠失、挿入および／または付加されたタンパク質も、キチン分解活性を有する限り、本発明に含まれる。
【００４４】
また、本発明のキチナーゼの別の例としては、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を挙げることができる。また、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むことからなるタンパク質であっても、キチン分解活性を有する限り本発明に含まれる。
【００４５】
さらに、本発明のキチナーゼの別の例としては、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ末端のα−アミノ基が修飾されているタンパク質が挙げられる。また、このようなタンパク質を含むことからなるタンパク質も、キチン分解活性を有する限り本発明に含まれる。
【００４６】
本発明のキチナーゼとして好適なものは、アスペルギルス・ニガー ＳＡＮＫ１３６０３株由来のキチナーゼ、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質および配列番号３に記載のアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ末端のα−アミノ基が修飾されているタンパク質が挙げられるが、より好適なものは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＳＡＮＫ １３６０３株由来のキチナーゼおよび配列番号３に記載のアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ末端のα−アミノ基が修飾されているタンパク質である。
【００４７】
本発明において、「本発明のＤＮＡ」とは、本発明のキチナーゼをコードするＤＮＡをいう。ＤＮＡとしては、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、人工的に改変されたＤＮＡ、化学的に合成されたＤＮＡなど、どのような形態をとっていてもよい。
【００４８】
本発明のＤＮＡの例としては、配列番号２のヌクレオチド番号２３３から１４２６に示されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡである。
【００４９】
本発明のＤＮＡの別の例としては、配列番号２のヌクレオチド番号２３３から１４２６に示されるヌクレオチド配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上のヌクレオチド配列相同性を有するＤＮＡが挙げられる。このようなＤＮＡとしては、自然界で発見される変異型ＤＮＡ、人為的に改変した変異型ＤＮＡ、異種生物由来の相同ＤＮＡなどが含まれる。
【００５０】
また、本発明のＤＮＡのさらに他の例としては、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。なお、所望のアミノ酸に対応するコドンは、その選択も任意でよく、例えば利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して常法に従い決定できる。（Ｇｒａｎｔｈａｍ， Ｒ． ｅｔ ａｌ． （１９８１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ９， １４３−１７４）。
【００５１】
さらに、これらヌクレオチド配列のコドンの一部改変は、常法に従い、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用した、部位特異的変異導入法（ｓｉｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ／Ｍａｒｋ， Ｄ． Ｆ． ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１， ５６６２−５６６６）などに従うことができる。
【００５２】
なお、配列番号２のヌクレオチド番号２３３から１４２６に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡを含むことからなるＤＮＡも、キチン分解活性を有するタンパク質をコードする領域を含む限り、本発明に含まれるものである。
【００５３】
また、本発明のキチナーゼには、本発明のＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質を挙げることができる。また、本発明のキチナーゼにおいて、１若しくは数個のアミノ酸を欠失させた改変体を作製するためには、エキソヌクレアーゼＢａｌ３１等を用いてＤＮＡを末端から削る方法（岸本 利光ら“続生化学実験講座１・遺伝子研究法ＩＩ”３３５−３５４）、カセット変異法（岸本 利光、“新生化学実験講座２・核酸ＩＩＩ 組換えＤＮＡ技術”２４２−２５１）などに従うことができる。
【００５４】
このように、本発明のＤＮＡを元に遺伝子工学的手法により得られるタンパク質であっても、キチン分解活性を有する限り本発明に含まれる。
【００５５】
このようなキチナーゼは、必ずしも配列番号３に記載のアミノ酸配列の全てを有するものである必要はなく、例えばその部分配列からなるタンパク質であっても、該タンパク質がキチン分解活性を示す限り、本発明のキチナーゼに包含される。さらに、このようなキチナーゼをコードするＤＮＡも本発明に含まれる。
【００５６】
本発明に用いるキチナーゼは、キチナーゼ生産菌から精製したもの、粗精製したもの、菌体の破砕液の他、菌体の培養上清をそのまま用いたものでも良い。
【００５７】
ここで、キチナーゼ生産菌とは、キチナーゼ生産能を本質的に先天的に有する微生物をいい、キチナーゼを菌体内に蓄積する微生物や、菌体外に分泌する微生物等を含む。
【００５８】
本発明に用いるキチナーゼ生産菌としては、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）を挙げることができ、好ましくはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＳＡＮＫ １３６０３株を挙げることができる。
【００５９】
キチン分解酵素を産生する条件について以下に記載する。
キチナーゼ生産菌を培養する際には、培地中に炭素源、窒素源の他に粉末キチン、粉末キトサン、コロイダルキチン、コロイダルキトサン、オートミール、酵母細胞壁、小麦ふすま等を添加して培養するのが好ましい。キチナーゼ生産菌の培養終了後に遠心分離を行ない、菌体を除いた培養上清をそのまま粗酵素液として用いることができる。また、粗酵素液をイオン交換クロマトグラフィー等によって粗精製したり、精製したりしたものを用いることもできる。
【００６０】
キチナーゼ生産菌の培養は、通常の培養装置、培地を用いて行なうことができる。培養は液体培養、固体培養等の方法を適宜選択できる。液体培養の場合はフラスコ培養や発酵槽を用いた培養を行なうことができ、培養開始後は培地の追加のないバッチ培養法や培養中に適宜培地を添加していく流加培養法を用いることができる。培地には炭素源、窒素源を添加し、必要に応じてビタミン、微量金属等を添加することができる。
【００６１】
炭素源としては、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース等の単糖類、マルトース、セロビオース、イソマルトース、ラクトース、スクロース等の二糖類、デンプン等の多糖類、マルトエキストラクト等を挙げることができるがキチナーゼ生産菌が生育する限りこれらに限定されない。
【００６２】
窒素源としてはアンモニア、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム等の無機窒素、イースト・エクストラクト、マルトエクストラクト、コーンスティープリカー、ペプトン等の有機窒素が用いられるがキチナーゼ生産菌が生育する限りこれらに限定されない。
【００６３】
また、キチナーゼ生産菌のキチナーゼの生産量を増やすために、培地中に粉末キチン、粉末キトサン、コロイダルキチン、コロイダルキトサン、オートミール、酵母細胞壁、小麦ふすま等を添加することもできる。
【００６４】
ここで、本発明者は、特にアスペルギルス・ニガーを用いる場合、オートミール及び／又は小麦ふすまを含有する培地で培養することにより、キチナーゼ生産量が飛躍的に上昇することを見出した。
【００６５】
通常、基質分解酵素を産生する微生物から当該酵素を得ようとする場合、基質を添加した培地中で微生物を培養する方法が採用される。
しかしながら、従来、糸状菌を用いる場合、キチン質を基質として添加した培地を用いる通常の培養方法ではすぐに生育障害が起こり、キチナーゼが得られないか、又は、ごくわずかしか得られなかった。
【００６６】
ところが、本発明者らは偶然にも、アスペルギルス・ニガーを用いた培養系において、オートミール及び／又は小麦ふすまを含有する培地を用いた場合に、キチナーゼの生産量が飛躍的に上昇することを見出したのである。
【００６７】
これらの培地中の組成物量は適宜選択することができる。培養温度、ｐＨ、通気攪拌量はキチナーゼ生産に適するように適宜選択することができる。ただし、オートミール及び／又は小麦ふすまを用いる場合、その濃度（両者を用いる場合にはその合計の濃度）は、好ましくは０．０５〜１０％（ｗ／ｖ）であり、さらに好ましくは０．１〜５．０％、最も好ましくは０．３〜１．０％の範囲である。
【００６８】
本発明に用いるキチナーゼとしては、アスペルギルス・ニガー由来のキチナーゼを用いることができ、好ましくはアスペルギルス・ニガーＳＡＮＫ １３６０３株由来のキチナーゼを用いることができる。
【００６９】
キチナーゼは、これらキチナーゼ生産菌自身が生産するものでもよいし、その変異体または修飾体が生産するものであってもよく、更に、これらキチナーゼ生産菌のキチナーゼをコードする遺伝子を宿主に導入して得られた形質転換体から生産される組換えタンパク質であってもよい。
【００７０】
キチナーゼ生産菌の入手
本発明の酵素の製造法において用いられるアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する菌株としては、例えばアスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ Ｔｉｅｇｈ．）ＳＡＮＫ １３６０３株を挙げることができる。ＳＡＮＫ １３６０３株は茨城県つくば市において採集した土壌より分離したものである。
【００７１】
ＳＡＮＫ １３６０３株をクリックとピットの文献（Ｋｌｉｃｈ Ｍ． Ａ． ＆ Ｐｉｔｔ Ｊ． Ｉ． １９８８． Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｃｏｍｍｏｎ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｔｅｌｅｏｍｏｒｐｈｓ． ＣＳＩＲＯ， Ｎｏｒｔｈ Ｒｙｄｅ）に従い、３種類の培地（ＣＹＡ培地，ＭＥＡ培地， ＣＹ２０Ｓ培地）に接種して、菌学的性状を観察した。
【００７２】
色調の表示は「メチューン・ハンドブック・オブ・カラー」（Ｋｏｒｎｅｒｕｐ Ａ． ＆ Ｗａｎｓｃｈｅｒ Ｊ． Ｈ． １９７８． Ｍｅｔｈｕｅｎ ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｃｏｌｏｕｒ（３ｒｄ． ｅｄｉｔｉｏｎ）． Ｅｒｙｅ Ｍｅｔｈｕｅｎ， Ｌｏｎｄｏｎ）に従った。
３種類の培地（ＣＹＡ培地，ＭＥＡ培地，ＣＹ２０Ｓ培地）の組成は以下の通りである。
【００７３】
ＣＹＡ培地｛ザペックイーストアガー（Ｃｚａｐｅｋ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ Ａｇａｒ）培地｝（Ｋ２ＨＰＯ４ １．０ｇ，＊ザペック濃縮液１０ｍｌ，イーストエキス ５ｇ，スクロース ３０ｇ，寒天 １５ｇ，蒸留水 １０００ｍｌ）
【００７４】
＊ザペック濃縮液（ＮａＮＯ３ ３０ｇ，ＫＣｌ ５ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ５ｇ，ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．１ｇ，ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．１ｇ，ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．０５ｇ 蒸留水 １００ｍｌ）
【００７５】
ＭＥＡ培地｛モルトエキスアガー（Ｍａｌｔ Ｅｘｔｒａｃｔ Ａｇａｒ）培地｝（モルトエキス２０ｇ，ペプトン １ｇ，グルコース ２０ｇ，寒天 ２０ｇ，蒸留水 １０００ｍｌ）
【００７６】
ＣＹ２０Ｓ培地｛２０％シュークロースザペックイーストアガー（Ｃｚａｐｅｋ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ Ａｇａｒ ｗｉｔｈ ２０％ Ｓｕｃｒｏｓｅ）培地｝（Ｋ２ＨＰＯ４ １．０ｇ，＊ザペック濃縮液 １０ｍｌ，イーストエキス ５ｇ，シュークロース ２００ｇ，寒天 １５ｇ，蒸留水 １０００ｍｌ）
【００７７】
菌学的性状
ＣＹＡ培地上でのコロニーは、２５℃、７日の培養で直径２７−３１ｍｍである。コロニーは綿毛状である。分生子形成はコロニー中心部で旺盛、放射状に溝を有し、分生子形成部は黒色である。菌糸は白色乃至淡黄色である。菌核、浸出液や可溶性色素は観察されない。裏面はイエロイッシュホワイト（３Ａ２）を呈する。ＭＥＡ培地上でのコロニーは、２５℃、７日の培養で直径３８−４５ｍｍである。コロニーは綿毛状である。菌糸は白色乃至黄色である。分生子形成は中心部で旺盛であり、分生子形成部は黒色である。裏面はペールイエロー（３Ａ３）を呈する。
【００７８】
ＣＹ２０Ｓ培地上でのコロニーは、２５℃、７日の培養で直径３２−３６ｍｍである。コロニーはＣＹＡ培地上のコロニーに似る。裏面はパステルイエロー（３Ａ４）を呈する。ＣＹＡ培地３７℃でのコロニーは、７日の培養で直径４４−４８ｍｍである。分生子形成は旺盛で菌糸は目立たない。
【００７９】
分生子頭は放射状。分生子柄は５５０−７００×１０−２３μｍ、平滑で厚壁、無色である。頂のうは幅２５−５５μｍ、ほぼ球形で全体にメトレを形成する。メトレは６−１６×３．５−５μｍ。フィアライドは５−１０×３−４μｍである。分生子は直径３．５−５μｍ、球形で、微細な粗面乃至粗面である。
【００８０】
以上の菌学的性状より、本菌に該当する菌を検索したところ、クリックとピットの文献（Ｋｌｉｃｈ Ｍ． Ａ． ＆ Ｐｉｔｔ Ｊ． Ｉ． １９８８． Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｃｏｍｍｏｎ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｔｅｌｅｏｍｏｒｐｈｓ． ＣＳＩＲＯ， Ｎｏｒｔｈ Ｒｙｄｅ）、ジアンらの文献（Ｔｚｅａｎ Ｓ． Ｓ． ｅｔ ａｌ． １９９０． Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｅｌｅｍｏｒｐｈｓ ｆｒｏｍ Ｔａｉｗａｎ． Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｈｓｉｎｃｈｕ）、クリックの文献（Ｋｌｉｃｈ Ｍ． Ａ． ２００２． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ． Ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ， Ｕｔｒｅｃｈｔ）に記載されているアスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ Ｔｉｅｇｈ．）の性状に、各培地上での生育が遅い点を除きほぼ一致した。よって本菌株をアスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ Ｔｉｅｇｈ．）と同定した。
【００８１】
尚、ＳＡＮＫ １３６０３株は、アスペルギルス ニガー ＳＡＮＫ １３６０３株として、平成１５年５月３０日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−８３８９が付された。
【００８２】
周知の通り、糸状菌は自然界において、または人工的な操作（例えば、紫外線照射、放射線照射、化学薬品処理等）により、変異を起こしやすく、本発明のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＳＡＮＫ １３６０３株もその点は同じである。
【００８３】
本発明にいうアスペルギルス・ニガーＳＡＮＫ １３６０３株はその全ての変異株を包含する。また、これらの変異株の中には、遺伝的方法、たとえば組み換え、形質導入、形質転換等によりえられたものも含有される。即ち、キチナーゼを生産するアスペルギルス・ニガーＳＡＮＫ １３６０３株、それらの変異株およびそれらと明確に区別されない菌株は全てアスペルギルス・ニガーＳＡＮＫ １３６０３株に包含される。
【００８４】
また、本発明のキチナーゼは、ベクターに本発明のＤＮＡが挿入された組換えプラスミドで宿主細胞を形質転換し、該形質転換された細胞の培養産物から得る事もできる。このように適当なベクターに本発明のＤＮＡが挿入された組換えプラスミドも本発明に含まれる。
【００８５】
このような目的に用いるベクターとしては、一般に知られているさまざまなベクターを用いることができる。好適なものとしては、原核細胞用ベクター、真核細胞用ベクター、哺乳動物由来の細胞用ベクターなどが挙げられるが、これに限定されない。このような組換えプラスミドにより、他の原核生物、または真核生物の宿主細胞を形質転換させることができる。
【００８６】
さらに、適当なプロモーター配列および／または形質発現に関わる配列を有するベクターを用いるか、もしくはそのような配列を導入することにより、発現ベクターとすることで、それぞれの宿主において遺伝子を発現させることが可能である。このような発現ベクターは、本発明の組換えプラスミドの好適な態様である。
【００８７】
本発明の組換えプラスミドを、各種細胞に導入することにより、宿主細胞を得ることができる。このような細胞は、プラスミドを導入することができる細胞であれば原核細胞であっても真核細胞であってもよい。
【００８８】
原核細胞の宿主としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）や枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが挙げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で形質転換させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリコンすなわち複製起点と、調節配列を含んでいるプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させる。また、ベクターとしては、形質転換細胞に表現形質（表現型）の選択性を付与することができる配列を有するものが好ましい。
【００８９】
例えば、大腸菌としてはＫ１２株などがよく用いられ、ベクターとしては、一般にｐＢＲ３２２やｐＵＣ系のプラスミドが用いられるが、これらに限定されず、公知の各種菌株、およびベクターがいずれも使用できる。
【００９０】
プロモーターとしては、大腸菌においては、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラクトース（ｌａｃ）プロモーター、トリプトファン・ラクトース（ｔａｃ）プロモーター、リポプロテイン（ｌｐｐ）プロモーター、ポリペプチド鎖伸張因子Ｔｕ（ｔｕｆＢ）プロモーター等が挙げられ、どのプロモーターも本発明のキチナーゼの産生に使用することができる。
【００９１】
枯草菌としては、例えば２０７−２５株が好ましく、ベクターとしてはｐＴＵＢ２２８（Ｏｈｍｕｒａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ９５， ８７−９３）などが用いられるが、これに限定されるものではない。
【００９２】
プロモーターとしては、枯草菌のα−アミラーゼのシグナルペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を連結することにより、菌体外での分泌発現も可能となる。
【００９３】
真核細胞の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、酵母などの細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、哺乳動物由来の細胞、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ， Ｙ． （１９８１） Ｃｅｌｌ ２３， １７５−１８２、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５０）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Ｕｒｌａｕｂ， Ｇ． ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ， Ｌ． Ａ． （１９８０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７， ４１２６−４２２０）等がよく用いられているが、これらに限定されない。
【００９４】
脊椎動物細胞の発現プロモーターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列等を有するものを使用でき、さらにこれは必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクターの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． （１９８１） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １， ８５４−８６４）等が挙げられるが、これに限定されない。
【００９５】
宿主細胞として、ＣＯＳ細胞を用いる場合を例に挙げると、発現ベクターとしては、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自立増殖が可能であり、さらに、転写プロモーター、転写終結シグナル、およびＲＮＡスプライス部位を具えたものを用いることができる。該発現ベクターは、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ， Ｈ． ａｎｄ Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ， Ｇ． （１９８３） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， １１， １２９５−１３０８）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ， Ｆ． Ｌ． ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ， Ａ． Ｊ． （１９７３） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２， ４５６−４５７）、および電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ， Ｅ． ｅｔ ａｌ． （１９８２） ＥＭＢＯ Ｊ． １， ８４１−８４５）などによりＣＯＳ細胞に取り込ませることができ、かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、発現ベクターと共に、抗生物質Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現し得るベクター、例えばｐＲＳＶｎｅｏ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． （１９８９）： ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ” Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ＮＹ）やｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ， Ｐ． Ｊ． ａｎｄ Ｂｅｒｇ， Ｐ． （１９８２） Ｊ． Ｍｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． １， ３２７−３４１）などをコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、本発明のキチナーゼを安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。
【００９６】
昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、鱗翅類ヤガ科のＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞由来株化細胞（Ｓｆ−９またはＳｆ−２１）やＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵細胞由来 Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞（Ｗｉｃｋｈａｍ， Ｔ． Ｊ． ｅｔ ａｌ， （１９９２） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ． Ｉ： ３９１−３９６）などが宿主細胞としてよく用いられ、バキュロウイルストランスファーベクターとしてはオートグラファ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）のポリヘドリンタンパク質のプロモーターを利用したｐＶＬ１３９２／１３９３がよく用いられる（Ｋｉｄｄ， Ｉ． Ｍ． ａｎｄ Ｖ．Ｃ． Ｅｍｅｒｙ （１９９３） Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４２， １３７−１５９）。
【００９７】
この他にも、バキュロウイルスのＰ１０や同塩基性タンパク質のプロモーターを利用したベクターも使用できる。さらに、ＡｃＮＰＶのエンベロープ表面タンパク質ＧＰ６７の分泌シグナル配列を目的タンパク質のＮ末端側に繋げることにより、組換えタンパク質を分泌タンパク質として発現させることも可能である（Ｚｈｅ−ｍｅｉ Ｗａｎｇ， ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ３７９， １６７−１７４）。
【００９８】
真核微生物を宿主細胞とした発現系としては、酵母が一般によく知られており、その中でもサッカロミセス属酵母、例えばパン酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅや石油酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓが好ましい。該酵母などの真核微生物の発現ベクターとしては、例えば、アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター（Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ， Ｊ． Ｌ． ａｎｄ Ｈａｌｌ， Ｂ． Ｄ． （１９８２） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５７， ３０１８−３０２５）や酸性フォスファターゼ遺伝子のプロモーター（Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ， Ａ． ｅｔ ａｌ． （１９８３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０， １−５）などを好ましく利用できる。
【００９９】
また、分泌型タンパク質として発現させる場合には、分泌シグナル配列と宿主細胞の持つ内在性プロテアーゼあるいは既知のプロテアーゼの切断部位をＮ末端側に持つ組換え体として発現することも可能である。例えば、トリプシン型セリンプロテアーゼのヒトマスト細胞トリプターゼを石油酵母で発現させた系では、Ｎ末端側に酵母のαファクターの分泌シグナル配列と石油酵母の持つＫＥＸ２プロテアーゼの切断部位をつなぎ発現させることにより、活性型トリプターゼが培地中に分泌されることが知られている（Ａｎｄｒｅｗ， Ｌ． Ｎｉｌｅｓ，ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２８， １２５−１３１）。
【０１００】
上記のようにして得られる形質転換体は、常法に従い培養することができ、該培養により細胞内、または細胞外に本発明のキチナーゼが産生される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば、上記ＣＯＳ細胞であれば、ＲＰＭＩ１６４０培地やダルベッコ改変イーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」という）などの培地に、必要に応じウシ胎児血清などの血清成分を添加したものを使用できる。
【０１０１】
培養条件としては、ＣＯ２濃度は０乃至５０％の範囲であればよく、好適には１乃至１０％でありより好適には５％である。培養温度は０乃至９９℃であればよく、好適には２０乃至５０℃であり、より好適には３５乃至４０℃である。
【０１０２】
上記培養により形質転換体の細胞内または細胞外に組換えタンパク質として産生される本発明のキチナーゼは、培養産物中から、そのタンパク質の物理化学的性質、化学的性質、生化学的性質（酵素活性など）等を利用した各種の分離操作（「生化学データブックＩＩ」、１１７５−１２５９項、第１版第１刷、１９８０年６月２３日株式会社東京化学同人発行；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｖｏｌ． ２５， Ｎｏ．２５， ｐ８２７４−８２７７ （１９８６）； Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １６３， ｐ３１３−３２１ （１９８７）等参照）により分離、精製することができる。
【０１０３】
該方法としては、具体的には、例えば通常の再構成処理、タンパク沈殿剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧ショック法、凍結融解法、超音波破砕、限外ろ過、ゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、それらの組み合わせ等を例示できる。上記により、高収率で所望の組換えタンパク質を工業的規模で製造できる。また、発現させる組換えタンパク質に６残基からなるヒスチジンを繋げることにより、ニッケルアフィニティーカラムで効率的に精製することができる。上記方法を組み合わせることにより容易に高収率、高純度で本発明のキチナーゼを大量に製造できる。
以上のような方法により製造されたキチナーゼも本発明の好適な例としてあげる事ができる。
【０１０４】
部分アセチル化キトサンとは、キトサンのアミノ基の一部がアセチル化されているものをいい、キチンをアルカリで脱アセチル化することによって製造することができる。部分アセチル化キトサンのアセチル化度はアルカリ濃度、反応時間等により制御することができる。また、分子量が１００万以上のものを特に高分子部分アセチル化キトサンと呼ぶ。分子量１００万以上の高分子部分アセチル化キトサンとしては、例えば、エビ・カニ由来の３０％、２０％、１０％アセチル化キトサン（商品名 キトサン７Ｂ、８Ｂ、９Ｂ（いずれも加ト吉（株）製））を用いることができるが、これらに限定されない。エビ、カニに含まれる天然のキチンは、よりアセチル化度が高い高分子部分アセチル化キトサンであり、これらも部分アセチル化キトサンとして用いることができる。
【０１０５】
キチナーゼの加水分解活性は、Ｓｃｈａｌｅｓ変法（Ｉｍｏｔｏ， Ｔ． ａｎｄ Ｙａｇａｓｈｉｔａ， Ｋ．， Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ３５， １１５４（１９７１））に従って測定できる。
グリコールキチンは、Ｒ． Ｓｅｎｚｙｕ ａｎｄ Ｓ． Ｏｋｉｍａｓｕ， Ｎｉｐｐｏｎ Ｎｏｇｅｉｋａｇａｋｕ Ｋａｉｓｈｉ， ２３， ４３２ （１９５０）に記載されている方法によって製造することができる。
【０１０６】
キチナーゼ生産菌から得られたキチナーゼの具体的な性質について以下に示すが、本発明のキチナーゼの有する性質はこれらに限定されるものではない。
【０１０７】
アスペルギルス・ニガーＳＡＮＫ １３６０３株により生産され、精製されたキチナーゼは、以下の性質を有する。
１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法にて分子量約４０，０００を示す。
２）等電点電気泳動法にて等電点ｐＩが約３．５を示す。
３）キトサン７Ｂ（加ト吉（株）製）を、ｐＨ３．０乃至ｐＨ１１．０にて加水分解する。
４）グリコールキチンを、ｐＨ３．０乃至ｐＨ１１．５にて加水分解する。
５）８０℃以下で３）記載の加水分解活性を発揮する。
６）３）記載の加水分解活性の最適ｐＨはｐＨ５．０である。
７）４）記載の加水分解活性の最適ｐＨはｐＨ９．０である。
８）３）記載の加水分解活性の最適温度はｐＨ５．０では７０℃である。
９）５０℃以下の温度で安定である。
１０）ｐＨ４．０乃至ｐＨ１１．０のｐＨ条件下で安定である。
１１）キトサン７Ｂに対する酵素のｐＨ５．０、温度３７℃における１０分間の加水分解活性を、相対値として表１に示す。
【０１０８】
表中、キトサン１０Ｂは１％アセチル化キチン、キトサン９Ｂは１０％アセチル化キチン、キトサン８Ｂは２０％アセチル化キチン、キトサン７Ｂは３０％アセチル化キチンである（いずれも加ト吉（株）製）。ＣＭ−セルロースは、カルボキシメチルセルロースナトリウムである（和光純薬社製）。グリコールキチンは、前述の方法により調製する。
【０１０９】
【表１】
表１から、この酵素は、ｐＨ５．０においてはグリコールキチンよりもアセチル化度が２０〜３０％の部分アセチル化キトサン（キトサン８Ｂ、７Ｂ）に対する加水分解活性が高く、アセチル化度が１％以下のキトサン（キトサン１０Ｂ）に対する加水分解活性がほとんどないことがわかる。カルボキシメチルセルロースナトリウムに対する加水分解活性はない。
【０１１１】
１２）下記に示す部分アミノ酸配列を有する。配列は、Ｎ末端側から記す。
Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｌａ （配列番号１）
１３）タンパクのＮ末端アミノ酸が修飾されている。
【０１１２】
以上のことから、本発明のキチナーゼの有する性質としては以下のようなものが挙げられるが、これに限定されるものではない。
１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法にて分子量約４０，０００を示す。
２）等電点電気泳動法にて等電点ｐＩが約３．５を示す。
３）キトサン７Ｂを、ｐＨ３．０乃至ｐＨ１１．０にて加水分解する。
４）グリコールキチンを、ｐＨ３．０乃至ｐＨ１１．５にて加水分解する；
５）０℃乃至８０℃で３）記載の加水分解活性を発揮する；
６）５０℃以下の温度で安定である；
７）ｐＨ４．０乃至ｐＨ１１．０のｐＨ条件下で安定である。
【０１１３】
また、本発明のキチナーゼを製造する方法も本発明に含まれる。
アスペルギルス・ニガーＳＡＮＫ １３６０３株を初めとするキチナーゼ産生微生物を培地で培養することにより、キチナーゼを生産することができる。例えば、０．１〜５．０％マルトエクストラクト（Ｄｉｆｃｏ（株）製）及び０．１〜１．０％イーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ（株）製）に加えて、
０．０５〜１．０％キチン、
０．０５〜１．０％キトサン、
０．０５〜１０％オートミール
０．０５〜１０％酵母細胞壁、及び／又は
０．０５〜１０％小麦ふすま
の培地で、１６〜４５℃で１〜１５日間、１００〜２５０ｒｍｐで振とう培養する。
【０１１４】
本発明のキチナーゼは、扱いにくい試料をより扱い易くする為にも有効に用いる事ができる。従来、甲殻類などを含む試料を、粉砕する，すり潰す、ミキサーにかけるなどの加工をした場合、粘度が非常に高くなり、扱いにくかった。これは、これら甲殻類に大量に含まれる高分子多糖（主成分は高分子部分アセチル化キトサン）が原因であった。たとえば、このような食品加工の過程に、本発明のキチナーゼを加えて反応させ、その液性成分中の高分子部分アセチル化キトサンを分解し、その液性成分中に高分子部分アセチル化キトサンを実質的に含まない、扱い易い試料を製造することが可能であり、キチナーゼを用いた扱い易い試料の製造方法も本発明に含まれる。
【０１１５】
このような製造方法に用いる原材料としては、高分子部分アセチル化キトサンを含む試料であれば特に限定されないが、好ましくは、甲殻類を含む試料であり，より好ましくはエビおよびカニのいずれか一つまたは両方を含む試料である。
【０１１６】
原材料とキチナーゼの反応条件としては上記のキトサン分解活性を発揮する条件を適用することができる。反応時間は１０分以上であって、試料の粘度が低い状態になる時間であれば特に限定されないが、好ましくは１０分間から１０日間程度であり、より好ましくは１日間から５日間程度である。また、このような方法によって製造された試料も本発明に含まれる。
【０１１７】
「その液性成分中に高分子部分アセチル化キトサンを実質的に含まない」とは、試料に高分子部分アセチル化キトサンが含有される事によりもたらされる、高い粘性が減少または消失した状態を指し、厳密に濃度として０％であることを指さないが、好ましくは高分子部分アセチル化キトサンの含有量が２０％以下であり、より好ましくは１０％以下であり、さらに好ましくは５％以下であり、最適には０％である。
【０１１８】
以下に、実施例及び試験例を挙げるが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【０１１９】
【実施例】
実施例１．アスペルギルス・ニガーＳＡＮＫ １３６０３株からのキチナーゼの精製
１）粗酵素液の調製
滅菌した表２の組成の培地１００ｍｌが入っている５００ｍｌ容の三角フラスコ（種フラスコ）にアスペルギルス・ニガーＳＡＮＫ １３６０３株の菌体を接種し、２６℃にて８日間、１７０ｒｐｍの振とう培養を行った。
【０１２０】
【表２】
培養終了後、４℃、１０，０００×Ｇにて１０分間の遠心分離を行った。得られた上清を粗酵素液とした。
【０１２２】
２）酵素活性測定法
キチナーゼの加水分解活性は以下のようにして測定した。
▲１▼部分アセチル化キトサンの加水分解反応
キトサン７Ｂ（３０％アセチル化キトサン、加ト吉（株）製）１２５ｍｇに水５０ｍｌおよび１Ｎ塩酸４００μｌを加え、粉末キトサンを完全に溶解させた。キトサン８Ｂ（２０％アセチル化キトサン、加ト吉（株）製）、キトサン９Ｂ（１０％アセチル化キトサン、加ト吉（株）製）、キトサン１０Ｂ（ほぼ完全な脱アセチル化キトサン、加ト吉（株）製）も同様にして完全に水溶液とした。これらのキトサン水溶液９６μｌ、４００ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１５０μｌおよび水２４４μｌの混合液に酵素液１００μｌを加え撹拌して均一にし、３７℃で保温して１０分間酵素反応を行った。
【０１２３】
▲２▼シェールズ変法による遊離還元糖の定量
フェリシアン化カリウム１００ｍｇを０．５Ｎ炭酸ナトリウム水溶液２００ｍｌに溶かした溶液８００μｌを酵素反応液に加えて反応を停止させた後、１００℃で１５分間保温した。氷冷後、沈殿物を遠心分離し上清の４２０ｎｍにおける吸光度を測定した。酵素反応１分間当たり１μｍｏｌのアセチルグルコサミンを生成する酵素活性を１単位とした。
【０１２４】
３）精製酵素液の調製
１）で得られた粗酵素液５００ｍｌを１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）４，０００ｍｌに対して１２時間ずつ５回透析した。これを、予め１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥトヨパール（東ソー（株）製）カラム（直径２．２ｃｍ×長さ２０ｃｍ）に添加し、吸着させた。１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で該カラムを十分洗浄した後、１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）６００ｍｌ中に０乃至０．４Ｍの塩化ナトリウムの直線的濃度勾配を作製して該カラムに吸着した成分を溶出させた。キチン分解活性は塩化ナトリウム濃度が０．２０Ｍ乃至０．２５Ｍの画分（７５ｍｌ）に溶出された。これを粗精製酵素画分とした。
【０１２５】
得られた活性画分７５ ｍｌを１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）４，０００ｍｌに対して１２時間ずつ３回透析した後、予め１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＭｏｎｏＱ（ファルマシア社製）カラム（直径７ｍｍ×長さ５ｃｍ）に添加し、吸着させた。該カラムを１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で十分洗浄した後、１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）２５０ｍｌ中に０乃至０．３Ｍの塩化ナトリウムの直線的濃度勾配を作製して該カラムに吸着した成分を溶出させた。キチン分解活性は塩化ナトリウム濃度が０．１Ｍ乃至０．１１５Ｍの画分（１０ｍｌ）に溶出された。
この画分を精製酵素溶液とした。
【０１２６】
５）精製酵素の分子量測定
１２．５％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法（Ｌａｅｍｍｌｉ， Ｕ．Ｋ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２２７， ６８０（１９７０）参照）により、精製酵素の分子量を求めた。標準タンパク質として次のものを用いた：ａ．ホスホリラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）、分子量９４，０００：ｂ．アルブミン（ａｌｂｕｍｉｎ）、分子量６７，０００：ｃ．オバルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）、分子量４３０００：ｄ．カルボニック・アンヒドラーゼ（ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ）、分子量３０，０００：ｅ．トリプシン・インヒビター（ｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、分子量２０，１００：ｆ．α−ラクタルブミン（α−ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ）、分子量１４，４００。
精製酵素は分子量約４０，０００の単一バンドを示した。
【０１２７】
６）精製酵素の等電点
精製酵素を等電点電気泳動（日本生化学会編「生化学実験講座１ タンパク質の化学Ｉ 分離精製、東京化学同人刊（１９７６年）」２６２乃至３１２頁参照）に供した。精製酵素の等電点は約ｐＩ３．５であった。
【０１２８】
７）部分アミノ酸配列の決定
精製した酵素溶液を約１ｍｇ／ｍｌ程度まで限外濾過膜（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製 ＵＬＴＲＡ ＦＩＬＴＥＲ ＵＮＩＴ ＵＳＹ−１、分子量分画１万）を用いて濃縮した。濃縮酵素液４００μｌにＤｅｎａｔｕｒｅ ｂｕｆｆｅｒ（６Ｍ塩酸グアニジン、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ炭酸水素アンモニウムｐＨ ７．８）４００μｌおよび５０ｍＭ ジチオスレイトール ８μｌを加え、９５℃で１０分間反応させた。室温まで冷却後、反応液にＤｅｎａｔｕｒｅ ｂｕｆｆｅｒ溶液に溶解した５０ｍＭ ヨードアセトアミド４０μｌを加え、暗所室温で１時間反応させた。この溶液をＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ Ｍｉｎｉ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｕｎｉｔｓ Ｐｌｕｓ Ｆｌｏａｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製、分子量分画１万）で水１Ｌに対して透析した。得られた溶液にトリプシン（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）８μｌを加え、３７℃で７時間酵素反応させた。反応液をＳＭＡＲＴ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）にかけて分解アミノ酸のピークを分離した。分離条件を以下に示す。
【０１２９】
カラム：Ｎｏｍｕｒａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ３００ ＣＤＳ−ＨＧ−５ （１ｍｍ×１５０ｍｍ）
Ａ ｂｕｆｆｅｒ：０．１％ＴＦＡ／Ｗａｔｅｒ
Ｂ ｂｕｆｆｅｒ：０．１％ＴＦＡ／Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌ
グラジエント：１０→７０％Ｂ ２％／ｍｌ
Ｆｌｏｗ：５０μｌ／分
【０１３０】
分離した分解アミノ酸のうち、ピーク（Ｂ ｂｕｆｆｅｒ濃度４８％程度）を分取し、これについてアミノ酸配列解析装置（Ｐｒｏｃｉｓｅ ｃＬＣ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）でアミノ酸配列を解析した。その結果得られた部分アミノ酸配列をアミノ末端側から記す。
【０１３１】
Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｌａ（配列番号１）。
【０１３２】
実施例２．アスペルギルス・ニガー由来のキチナーゼをコードするＤＮＡの同定
２−１）アスペルギルス・ニガーの全ＲＮＡの精製
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＳＡＮＫ １３６０３株を液体培地（１％ マルト エクストラクト、０．５％ イースト エクストラクト、０．５％ Ｇｌｕｃｏｓｅ）２０ｍｌで３０℃、３日間前培養した。その後、液体培地（１％ マルト エクストラクト、０．５％ イースト エクストラクト、０．５％ スクロース）に１％植菌し、３０℃で５日間培養した。培養した菌体を吸引集菌し、−８０℃で冷やした乳鉢（オートクレーブ滅菌済）に移した。液体窒素を加えながら、乳棒で菌体を破砕し、粉末状にした。完全に粉末状になった菌体をＲｎｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ （キアゲン社製）を用いて全ＲＮＡの精製を行った。８５ｎｇ／μｌの濃度のものが５０μｌ得られた。
【０１３３】
２−２）アスペルギルス・ニガー由来二本鎖ｃＤＮＡライブラリーの作製
アスペルギルス・ニガーのｃＤＮＡライブラリーは、ＳＭＡＲＴ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （クロンテック社製）を用いて作製した。具体的には２−１）で精製したＲＮＡを鋳型として逆転写酵素で一本鎖ｃＤＮＡを作った後、ＰＣＲにより二本鎖ｃＤＮＡライブラリーを構築した。
【０１３４】
２−３）キチナーゼ遺伝子配列の解読
２−２）で得たｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｅｘ ＴａｑＴＭ（タカラバイオ社製）を使用してＰＣＲをおこなった。このときに使用したプライマーは、５’−ＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＧＧＣＣＡＴＴＡＣ−３’および５’−ＧＧＣＡＴＡＧＴＣＧＴＡＧＧＣＣＡＴＣＡＡＡＴＴＧ−３’の組み合わせで５’側の遺伝子配列を増幅した。また、３’側の配列は５’−ＡＴＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＡＴ−３’および５’−ＧＣＣＡＴＴＴＡＣＧＧＧＣＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＴＣ−３’の組み合わせで増幅した。ＰＣＲサイクルは、９４℃・５分、（９４℃・３０秒、５０℃・３０秒、７２℃・２分）×３０、７２℃・５分、４℃で増幅した。５′側の遺伝子配列約８５０ｂ．ｐ．、３′側の遺伝子配列約１，３００ｂ．ｐ．の長さのＤＮＡが増幅された。
【０１３５】
各々のＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動をおこなった後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔａｒｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）で精製した。精製物をＴＯＰＯＴＭＴＡクローニングキット（インビトロジェン社製）を用いてベクターに連結し、形質転換をおこなった。形質転換した大腸菌を３７℃、一晩寒天培地（ＬＢ／Ａｇａｒ（和光純薬製））上で培養した後、生育したコロニーを３７℃、一晩液体培地（ＬＢｂｒｏｔｈ（和光純薬製））で培養した。増殖した大腸菌からプラスミドをＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、ＤＮＡ配列解析をおこなった。ＤＮＡ配列解析の結果を配列番号２に示した。また、ＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号３に示した。
【０１３６】
試験例１．アスペルギルス・ニガー ＳＡＮＫ １３６０３株由来のキチナーゼの精製酵素液の諸性質
実施例１．３）で得られた精製酵素液について、活性測定を行なった。
１）ｐＨ活性
キトサン７Ｂ溶液９６μｌ、４００ｍＭ緩衝液１５０μｌおよび水２４４μｌの混合液に、酵素液１００μｌを加え撹拌して均一にし、３７℃で１０分間酵素反応を行った。酵素反応後の遊離還元糖の定量は実施例１ ２）記載の方法にしたがった。緩衝液は次のものを用いた：ｐＨ２．８乃至ｐＨ６．０の場合、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液：ｐＨ ６．０乃至ｐＨ８．２の場合、リン酸１水素２ナトリウム−リン酸２水素１ナトリウム緩衝液：ｐＨ７．７乃至ｐＨ９．３の場合、トリス−塩酸緩衝液：ｐＨ９．５乃至ｐＨ１１．０の場合、炭酸１水素２ナトリウム−炭酸２水素１ナトリウム緩衝液：ｐＨ１１．０乃至ｐＨ１２．４の場合、リン酸１水素２ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液。最も活性が高かったｐＨ条件での加水分解活性を１００％とし、各ｐＨにおける酵素の加水分解活性を相対値として図１に記載した。至適ｐＨはｐＨ５．０付近であった。グリコールキチンを基質として用いたときにも、同様の条件でｐＨ活性を測定した。結果を図２に示した。至適ｐＨはｐＨ９．０付近であった。
【０１３７】
２）温度活性
ｐＨ５．０の条件下において、種々の温度で加水分解活性を測定した。５分間予熱した実施例１で作製したキトサン７Ｂ溶液９６μｌ、４００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１５０μｌおよび水２４４μｌの混合液に、酵素液１００μｌを加え撹拌して均一にし、１０分間酵素反応を行った。酵素反応後の遊離還元糖の定量は実施例１にしたがった。最も高い活性を示した温度条件で測定された加水分解活性を１００％とし、各温度における加水分解活性を相対値として図３にまとめた。
【０１３８】
３）温度安定性
精製酵素溶液を種々の温度で３０分間処理した後、その残存加水分解活性を測定した。あらかじめ処理温度に保持した４００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１８０μｌおよび水３６μｌに、精製酵素液２４μｌを加え撹拌して均一にし、３０分間保温した。実施例１で作製したキトサン７Ｂ溶液９６μｌに加温処理した酵素液２００μｌを加え、３７℃で１５分間酵素反応を行った。遊離還元糖の定量は実施例１にしたがった。無処理（０℃保温）群の酵素および緩衝液の混合液が有する加水分解活性を１００％とし、各温度における加水分解活性を相対値として図４にまとめた。
【０１３９】
４）ｐＨ安定性
精製酵素液３７．５μｌに、以下に述べる各ｐＨの４００ｍＭ緩衝液１２．５μｌを添加し、３７℃にて１時間保温した。緩衝液は次のものを用いた：ｐＨ３．２乃至ｐＨ６．４の場合、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液：ｐＨ６．４乃至ｐＨ８．２の場合、リン酸１水素２ナトリウム−リン酸２水素１ナトリウム緩衝液：ｐＨ７．６乃至ｐＨ９．１の場合、トリス−塩酸緩衝液：ｐＨ９．２乃至ｐＨ１０．６の場合、炭酸１水素２ナトリウム−炭酸２水素１ナトリウム緩衝液：ｐＨ１１．３乃至ｐＨ１２．２の場合、リン酸１水素２ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液。４００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１５０μｌ、水２０４μｌおよび実施例１ ２）記載の方法で作製したキトサン７Ｂ溶液９６μｌの混合液に、加温した酵素混合液に水３２５μｌを加えた溶液のうち１５０μｌを加え撹拌して均一にし、３７℃で１０分間酵素反応を行った。遊離還元糖の定量は実施例１にしたがった。無処理（０℃保温）群の酵素および緩衝液の混合液が有する加水分解活性を１００％とし、各ｐＨにおける加水分解活性を相対値として図５にまとめた。
【０１４０】
５）精製酵素の基質選択性
次に、ｐＨ５．０における基質選択性を測定した。実施例１の３）で調製した精製酵素液を用いた。０．２５％ ｗｔ／ｖの基質溶液９６μｌおよび４００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）および水２４４μｌの混合液に酵素液１００μｌを加え撹拌して均一にし反応を開始し、３７℃で保温して１０分間酵素反応を行った。酵素反応後の遊離還元糖の定量は実施例１の２）記載の方法により行った。最大活性を示す基質を用いたときの加水分解活性を１００％としたときの、相対活性を表３に示す。
【０１４１】
【表３】
表３に示す通り、精製酵素はキトサン７Ｂに対して最も加水分解活性が高く、アセチル化度が小さくなるにつれて加水分解活性は低下した。また、セルロース加水分解活性は見られなかった。
【０１４３】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明のキチナーゼを用いる事により、高分子部分アセチル化キトサンを酸性条件下比較的高い温度において加水分解することが可能になった。更に本発明のキチナーゼはアスペルギルス・ニガー由来であり、食品加工上使用に耐えうる安全性を有している。
【０１４４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】キトサン７Ｂを反応基質としたときのアスペルギルス・ニガー ＳＡＮＫ １３６０３株由来の精製キチナーゼの活性とｐＨとの関係を示す図である。
【図２】グリコールキチンを反応基質としたときのアスペルギルス・ニガー ＳＡＮＫ１３６０３株由来の精製キチナーゼの活性とｐＨとの関係を示す図である。
【図３】アスペルギルス・ニガー ＳＡＮＫ １３６０３株由来の精製キチナーゼの活性と温度との関係を示す図である。
【図４】アスペルギルス・ニガー ＳＡＮＫ １３６０３株由来の精製キチナーゼの温度安定性を示す図である。
【図５】アスペルギルス・ニガー ＳＡＮＫ １３６０３株由来の精製キチナーゼのｐＨ安定性を示す図である。
Claims (12)
- アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）の培養物から分離精製される、キチン分解酵素。
- アスペルギルス・ニガーが、アスペルギルス・ニガー ＳＡＮＫ １３６０３株である、請求項１記載のキチン分解酵素。
- 配列番号１に示されたアミノ酸配列を含む、請求項１または請求項２に記載のキチン分解酵素。
- 以下の性質：
１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法にて分子量約４０，０００を示す；
２）等電点電気泳動法にて等電点ｐＩが約３．５を示す；
３）３０％アセチル化キトサン（粘度１００〜３００ｃｐｓ）を、ｐＨ３．０乃至ｐＨ１１．０にて加水分解する；
４）グリコールキチンを、ｐＨ３．０乃至ｐＨ１１．５にて加水分解する；
５）０℃乃至８０℃で３）記載の加水分解活性を発揮する；
６）５０℃以下の温度で安定である；及び
７）ｐＨ４．０乃至ｐＨ１１．０のｐＨ条件下で安定である；
を示す、請求項１〜３のいずれか１項記載のキチン分解酵素。 - 下記のａ）〜ｄ）：
ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
ｂ）配列番号２のヌクレオチド番号２３３乃至１４２６に示されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質；
ｃ）ａ）またはｂ）に記載のアミノ酸配列において、一つまたは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、キチン分解活性を有することを特徴とするタンパク質；
ｄ）ａ）またはｂ）に記載のアミノ酸配列を含むことからなるタンパク質；
のいずれか一つに記載のタンパク質である、キチン分解酵素。 - 下記ａ）〜ｄ）：
ａ）配列番号２のヌクレオチド番号２３３乃至１４２６に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
ｂ）上記ａ）に記載のＤＮＡと９０％以上のヌクレオチド配列相同性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、キチン分解活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とするＤＮＡ；
ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ；
ｄ）配列番号２のヌクレオチド番号２３３乃至１４２６に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるＤＮＡ
のいずれか一つに記載のＤＮＡ。 - 請求項６に記載のＤＮＡにコードされるタンパク質である、キチン分解酵素。
- 下記の活性：
ａ）３０％アセチル化キトサン（粘度１００〜３００ｃｐｓ）を、ｐＨ３．０乃至ｐＨ１１．０、０℃乃至８０℃の条件にて加水分解する活性；及び
ｂ）グリコールキチンを、ｐＨ３．０乃至ｐＨ１１．５にて加水分解する活性、
を有することを特徴とする、請求項５または請求項７に記載のキチン解酵素。 - 下記工程：
１）アスペルギルス・ニガーを、キチン分解酵素を産生する条件下で培養する工程、及び
２）１）の培養産物からキチン分解酵素を分離・精製する工程、
を含む、キチン分解酵素の製造方法。 - アスペルギルス・ニガーを、オートミール及び／又は小麦ふすまを含有する培地を用いて培養する工程を含む、請求項９に記載の方法。
- アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）がアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＳＡＮＫ １３６０３株である、請求項９又は１０記載の方法。
- 請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法により製造される、キチン分解酵素。
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|---|---|---|---|---|
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| EP2746407A1 (en) * | 2012-12-18 | 2014-06-25 | EADS Deutschland GmbH | Novel Aspergillus sp. strain NBIMCC 8735 and method of producing chitinase utilizing the same |
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-
2003
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