CN108018297A - AnChi基因、AnChi几丁质酶及其在降解几丁质方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种高效几丁质酶的制备方法及应用，首先涉及一种编码几丁质酶的基因和与之对应的几丁质酶，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其对发酵工业废弃物黑曲霉菌丝体水解具有更高的催化活性。通过构建枯草芽孢杆菌表达系统，使得制备AnChi的成本显著下降，提高了应用范围和生产能力。

Description

AnChi基因、AnChi几丁质酶及其在降解几丁质方面的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种AnChi基因、高效几丁质酶、其表达系统及在酶法降解几丁质生产N-乙酰葡萄糖胺中的应用。

背景技术

N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)是一种葡萄糖衍生物，常以β-1,4糖苷键连接成高聚物存在于多种生物的结构成分中。因其具有多种生物活性，如修复关节损伤，治疗肠胃炎以及皮肤美白等，广泛应用于食品化妆品添加剂中。

工业制备N-乙酰葡萄糖胺的方法可分为三类：化学合成，生物合成以及酶法降解几丁质。化学合成存在收率低，产物有毒性，生产过程污染环境等缺点，目前已经逐步淘汰；生物合成利用微生物代谢过程生产，其收率稳定，绿色环保，是目前最主要的生产方式。

酶法降解几丁质生产N-乙酰葡萄糖胺是利用几丁质酶作为催化剂，催化几丁质降解，是近年来出现的极具吸引力的方法，其原料来源广泛，产品收率高，生物活性好，生产过程更加环保。几丁质是一种天然高分子聚合物，广泛存在于甲壳纲动物的外壳，昆虫外骨骼以及真菌细胞壁中。生产N-乙酰葡萄糖胺所用的几丁质原料一般来自于虾蟹壳，其几丁质结晶度较高，来源具有季节性，产品适用人群受限(海鲜过敏以及宗教信仰)。另一类原料是真菌细胞壁，其几丁质含量达到15％，结晶度低，有利于酶的水解。黑曲霉(Aspergillusniger)是一种工业发酵中常用的丝状真菌，每年有近34万吨的菌丝体副产物产生，其几丁质含量可达20％。黑曲霉菌丝体是一种安全的原料，其安全性通过FDA美国食品安全性指标认证。因此，黑曲霉菌丝体是一种可靠的生产N-乙酰葡萄糖胺的原料。

酶法生产面临的一大问题是酶的生产纯化成本过高，降低获得高产能高纯度的几丁质酶的成本是工艺设计中非常重要的环节。工业生产最早使用的是通过野生菌种产生的几丁质酶，及表达量低，粗酶液中含有次级代谢产物，影响产品的质量。随着基因工程技术的发展，使用工程菌重组表达的几丁质酶逐渐替代了野生菌生产，其表达量大，效率高。目前工程菌一般有三种，大肠杆菌，酵母和枯草芽孢杆菌。大肠杆菌多为胞内或周质空间表达，对酶进行分离时需要破壁处理，过程中释放大量内毒素，既提高了生产成本，又降低了产品的安全性。酵母作为真菌表达系统，其表达效率较低。

黑曲霉菌丝体中几丁质含量较高，但其与蛋白质和葡聚糖交联成致密的结构，常用的几丁质酶难以对其进行有效的降解。作为一种廉价的工业废料，寻找更适合降解黑曲霉菌丝体的几丁质酶，实现对菌丝体的高效利用，变废为宝是值得关注的问题。

发明内容

为了解决上述问题，本发明寻找并获得了更适合降解黑曲霉菌丝体的AnChi基因、几丁质酶，能够降解工业黑曲霉菌丝体中的几丁质，可获得较高浓度的壳二糖，具有较高的收率，具有很好的工业化应用前景。

首先，本发明公开一种高效几丁质酶AnChi基因，其核苷酸序列为如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，本发明公开了利用上述的AnChi基因编码的几丁质酶AnChi，所述几丁质酶AnChi的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步的，本发明还公开了利用上述技术方案中所述的AnChi基因在降解几丁质方面的应用。而对于基因的应用类发明，主要分为对基因的重组、表达以及生产等诸多方面。

进一步的，本发明所述的应用，是构建含有所述高效几丁质酶AnChi基因的重组质粒。

进一步的，所述重组质粒为将上文所述AnChi基因插入载体的多克隆位点得到的，所述载体选自pDG1663、pDG1661、pDG1662、pDG1730、pDL或pDK，本发明实施例中使用了载体pDG1663，并很好的验证了其有效性。

进一步的，本发明所述的应用，还包括构建含有上文所述几丁质酶AnChi基因的重组菌。

进一步的，所述重组菌是将所述含有所述高效几丁质酶AnChi基因的重组质粒转化枯草芽孢杆菌KO7、WB600、WB700或WB800中得到的。本发明实施例中使用了枯草芽孢杆菌KO7，并很好的验证了其有效性。

进一步的，本发明还公开了利用上述技术方案中所述的重组菌在高效表达异源几丁质酶方面的应用。

进一步的，上文所述的重组菌在高效表达异源几丁质酶方面的应用，具体是通过发酵上文所述的含有几丁质酶AnChi基因的重组菌得以实现，具体发酵条件为：培养基为LB液体培养基，37℃，200-220rpm震荡培养20-24h。

进一步的，所述的应用，先发酵上文所述的含有几丁质酶AnChi基因的重组菌，获得AnChi的粗酶液，直接使用粗酶液或浓缩后的粗酶液降解黑曲霉菌丝体中的几丁质，可获得较高浓度的壳二糖，具有较高的收率，所述黑曲霉菌丝体为工业柠檬酸发酵常用菌株黑曲霉的细胞壁，几丁质含量丰富，是工业发酵的废弃物。根据本发明实施例的实验数据分析，本发明所使用的枯草芽孢杆菌时期特异性分泌表达黑曲霉饥饿诱导的几丁质酶AnChi，当其酶用量为0.1U，底物浓度为10mg/mL，40℃，pH＝6.0的条件下，经过90h的反应，收率可达到78.52％。在工业化大批量应用前景下，所述的几丁质酶AnChi的酶用量与底物浓度之间的对应关系，可以根据实际需求进行等比例扩大，即：几丁质酶AnChi的酶用量与底物浓度比为0.1-0.2U酶：10-20mg/mL底物，优选为几丁质酶AnChi的酶用量与底物浓度比为0.1U酶：10mg/mL底物。

有益效果：

以工业发酵产生的黑曲霉菌丝体为几丁质原料，来源稳定，价格低廉，安全性通过FDA认证。通过枯草芽孢杆菌时期特异性分泌表达黑曲霉饥饿诱导的几丁质酶AnChi，过程不使用诱导剂，抗生素，同时避免了破壁的过程，降低了几丁质酶的生产成本。使用粗酶液催化水解黑曲霉菌丝体中的几丁质，相比SmChiA提高了72.25％，比商品化几丁质酶提高了54.82％。

附图说明

图1是使用大肠杆菌表达的几丁质酶AnChi经过纯化后的SDS-PAGE结果。

图2是几丁质酶AnChi不同温度活力对比图，图中横坐标表示温度，纵坐标表示反应产生的还原糖浓度。

图3是几丁质酶AnChi不同pH活力对比图，图中横坐标表示pH，纵坐标表示反应产生的还原糖浓度。

图4是几丁质酶AnChi与其它几丁质酶水解菌丝体效率对比结果图，图中横坐标表示时间，纵坐标表示还原糖浓度。

图5是使用枯草芽孢杆菌表达的几丁质酶AnChi粗酶液水解菌丝体的水解效果图。图中横坐标表示时间，纵坐标轴左边表示产物收率，右边表示反应产生的还原糖浓度。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思进行等同替换或改变均属于本发明保护范畴。

为了方便表述，在以下实施例中，“mM”表示mmol/L；“μM”表示“μmol/L”；大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(购自Takara)；枯草芽孢杆菌KO7(购自BGSC)灭菌的条件为121℃，20min。

实施例1

AnChi的重组表达与酶学性质表征

1.AnChi在大肠杆菌中重组表达与分离纯化

几丁质酶AnChi的基因通过PCR得到两端分别与质粒PET-28a含有15bp重叠序列的扩增产物，所用引物为AnChi-F/AnChi-R，如表一所示。将所得片段(核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示)连接至质粒PET-28a，酶切位点为NcoI和NotI，测序确定其序列正确性，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，得到质粒PET-28a-AnChi。

质粒PET-28a-AnChi通过热激法转化至大肠杆菌BL21(DE3)。

挑取转化子至5mL LB培养基，37℃过夜活化，按1％的比例接种至200mL LB培养基中，37℃培养至OD600＝0.3，加入终浓度05mM的IPTG，16℃培养12h，17000g离心3min，收集菌体。菌体使用高压匀浆法破碎释放目的蛋白，使用金属螯合层析纯化，得到重组表达的AnChi，其SDS-PAGE结果如图1所示；图示内容显示纯化后的蛋白样品在43kDa处有一条单一条带，其纯度足以用于表征其酶学性质。

2.还原糖浓度的测定

还原糖使用铁氰化钾法进行测定

(1)标准曲线的绘制

将几丁二糖标准品稀释为不同浓度(0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.8、2.4、3.0mM)的样品，取60μL样品，加入180μL铁氰化钾溶液(Na2CO3 0.5M，铁氰化钾2g/L)，沸水浴15分钟，离心3分钟，取200μL加入96孔板，测定其在405nm下的吸光值A405。得到吸光值与浓度对应的标准曲线。

(2)样品中还原糖的测定

取待测样品60μL，加入180μL铁氰化钾溶液，沸水浴15分钟，离心3分钟，取200μL加入96孔板，测定其在405nm下的吸光值A₄₀₅，根据标准曲线换算得到对应的还原糖浓度。3.几丁质酶AnChi的最适温度与最适pH

最适温度与最适pH通过比较不同温度和pH下AnChi催化几丁质水解产生的还原糖量决定。

(1)最适温度

在1.5mL离心管中加入10mg/mL的α-几丁质，3μM AnChi，其余用磷酸盐缓冲液(NaH₂PO₄20mM,pH＝6.0)补足至200μL。反应体系在不同温度(20,30,40,50,60℃)下孵育12h，使用铁氰化钾法测定上清中的还原糖浓度，结果如图2所示，图示内容显示，在其他反应条件相同的情况下，AnChi在60℃的活性最低，只生成了约0.2mM的还原糖，在40℃时活性最高，生成约1.1mM还原糖，因此其最适温度为40℃。

(2)最适pH

在1.5mL离心管中加入10mg/mL的α-几丁质，3μM AnChi，其余用不同pH的BR缓冲液(H₃PO₄ 40mM,CH₃COOH 40mM,H₃BO₃ 40mM,用NaOH分别调至pH＝4,5,6,7,8,9)补足至200μL。反应体系在30℃孵育12h，使用铁氰化钾法测定上清中的还原糖浓度，结果如图3所示，图示内容显示在其它反应条件相同的情况下，AnChi在pH＝5-7之间生成的还原糖超过1mM,具有较高的活性，并且在pH＝6.0时生成的还原糖浓度最高，因此其最适pH为6.0。

4.几丁质酶AnChi与其它几丁质酶水解菌丝体的对比实验

在1.5mL离心管中加入10mg/mL的黑曲霉菌丝体，0.2mg/mL的AnChi，SmChiA和商品化几丁质酶，，其余用磷酸盐缓冲液(NaH2PO4 20mM pH＝6.0)补足至200μL，反应体系在40℃分别孵育不同时间，使用铁氰化钾法测定上清中的还原糖浓度，结果如图4所示，图示内容显示在相同条件下，AnChi相比于来自粘质沙雷氏菌的几丁质酶SmChiA和商品化几丁质酶(来自天蓝色链霉菌)具有更高的水解速率和更好的持续水解能力，在反应8h后生成了约1.8mM还原糖，比SmChiA多72.25％，比商品化几丁质酶多出54.82％。因此，AnChi对于水解黑曲霉菌丝中的几丁质具有明显的优势。

实施例2

1.枯草芽孢杆菌表达系统的构建与AnChi的制备

几丁质酶AnChi与启动子P_ylb的基因分别通过PCR得到含有15bp重叠序列的扩增产物，所用引物分别为AnChi-F’/AnChi-R’和P_ylb-F/P_ylb-R，如表1所示。再以扩增产物为模板,使用引物P_ylb-F/AnChi-R’PCR扩增得到基因P_ylb-AnChi,将所得基因(核苷酸序列为SEQ IDNO.1)连接至pMD18-T载体，测序确定其序列正确性，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。之后将基因连接至整合型载体pDG1663，酶切位点为HindⅢ和EcoRⅠ，获得质粒pDG1663-P_ylb-AnChi。

重组质粒pDG1663-P_ylb-AnChi使用Spizizen法转化至枯草芽孢杆菌KO7。

表1

挑取枯草芽孢杆菌KO7的转化子接种至5mL LB培养基，37℃，200rpm培养10h，扩培至100mL LB培养基中，接种量2％，37℃，220rpm培养24h，17000g离心3min，收集上清，得到AnChi粗酶液。

2.酶活定义

在1.5mL离心管中加入3mg/mL的乙二醇几丁质，6μL的粗酶液，用磷酸盐缓冲液(NaH₂PO₄ 20mM pH＝6.0)补足至60μL，40℃孵育1h，使用铁氰化钾法测定还原糖浓度。酶活定义为使反应体系中每分钟产生1μM还原糖所需加入的酶量为1U。

3.黑曲霉菌丝体水解实验

在1.5mL离心管中加入10mg/mL的黑曲霉菌丝体，0.1U的粗酶液，其余用磷酸盐缓冲液(NaH₂PO₄ 20mM pH＝6.0)补足至200μL。反应设置三组平行与一组对照实验，对照组将反应体系沸水浴10min后，与实验组在40℃条件下孵育，使用铁氰化钾法测定上清中还原糖含量，结果如图5所示，在加入AnChi粗酶液为0.1U的条件下，水解黑曲霉菌丝体产生的还原糖量在90h内保持接近线性的速度增长，此时反应生成的还原糖达到3.7mM，转化率达到78.52％，说明该酶在此反应体系中的稳定性较好。

序列表

<110> 大连理工大学

<120> AnChi基因、AnChi几丁质酶及其在降解几丁质方面的应用

<130> 2013

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1182

<212> DNA

<213> AnChi核苷酸序列

<400> 1

accagcgcgg aatacaagtc cattgcttac tttgttaact gggcaattta cggcaggaac 60

cacaatcccc aggacatccc catcgataaa ctgacccaca tcctctacgc gttcgccaac 120

gtccgcgcca acggcgaagt ctacctttcc gatccatggt ccgacatcga taagcgcttt 180

cctggtgatt catggagtga taccggaaac aacgtttacg gatgtgttaa gcaacttaat 240

ctcttaaagc agaagaatcg taatctcaag gtgcttctat cgatcggagg ctggacatac 300

tcgagcaatt ttgtgacacc agcgagtaca gatcaaggca ggaagacttt cgcttcttcg 360

gctgtcaagt tgctggccga cttgggcttt gatggattag atattgattg ggagtaccct 420

gccaatgaag cccaggctac agacatggtt ctactcctac gcgagatccg agaggaacta 480

gacgaatacg gccgcgaaca cggcaacgga acccatttcc tcctaagcat agccacctca 540

gcaggtccct caaaatacaa taccctccac atatccagta tgaacctcta cctcgacttc 600

tggaacctaa tggcctacga ctacgccggc agctgggatg caactgcagg acaccaggcc 660

aacctctacc cattacggga tgaccctgtc tcaaccccct tcaacacgga tcaagccatc 720

tccgcgtacc tgaccgccgg tgttcccgcc cataaactca ttctcggtat gccgctctat 780

gggcgcgcct tcacaaacac cgacggaccg ggcaagccgt ttaatggtgt tggtcaggga 840

agctgggaga atggggtctg ggactacaaa gcgcttcctc ctgcaggggc tagtgtttct 900

gagttgagaa gtattggtgc gagctactcg tatgatgctg gcaaaaagac gatgattagt 960

tatgataccc ctgctgttgc gaggcagaag gcggattata tcagaagtaa aggtctcggg 1020

ggtgcgatgt ggtgggagac ttctggggac aaggtgggag tggagagttt gatttctacg 1080

gtcgtggatt cactaggtgg tattggcgct ctggataagt cggtcaatca cctggagtat 1140

cccgagtcgc agtatgacaa tgtgaagaag gggttccatt ga 1182

<210> 2

<211> 1182

<212> protein

<213> AnChi氨基酸序列

<400> 2

TSAEYKSIAY FVNWAIYGRN HNPQDIPIDK LTHILYAFAN VRANGEVYLS DPWSDIDKRF 60

PGDSWSDTGN NVYGCVKQLN LLKQKNRNLK VLLSIGGWTY SSNFVTPAST DQGRKTFASS 120

AVKLLADLGF DGLDIDWEYP ANEAQATDMV LLLREIREEL DEYGREHGNG THFLLSIATS 180

AGPSKYNTLH ISSMNLYLDF WNLMAYDYAG SWDATAGHQA NLYPLRDDPV STPFNTDQAI 240

SAYLTAGVPA HKLILGMPLY GRAFTNTDGP GKPFNGVGQG SWENGVWDYK ALPPAGASVS 300

ELRSIGASYS YDAGKKTMIS YDTPAVARQK ADYIRSKGLG GAMWWETSGD KVGVESLIST 360

VVDSLGGIGA LDKSVNHLEY PESQYDNVKK GFH 393

<210> 3

<211> 1434

<212> DNA

<213> Pylb-AnChi核苷酸序列

<400> 3

acttctcaaa gatcccatgt gcttaaaatt aaagtttaaa tatttggatt ttttaaataa 60

agcgtttaca atatatgtag aaacaacaaa gggggagatt tgtttgacaa aggtagaacg 120

tcccaattaa aggaggaagg atcaatgatt caaaaacgaa agcggacagt ttcgttcaga 180

cttgtgctta tgtgcacgct gttatttgtc agtttgccga ttacaaaaac atcagccgta 240

ggatcctcta gaaccagcgc ggaatacaag tccattgctt actttgttaa ctgggcaatt 300

tacggcagga accacaatcc ccaggacatc cccatcgata aactgaccca catcctctac 360

gcgttcgcca acgtccgcgc caacggcgaa gtctaccttt ccgatccatg gtccgacatc 420

gataagcgct ttcctggtga ttcatggagt gataccggaa acaacgttta cggatgtgtt 480

aagcaactta atctcttaaa gcagaagaat cgtaatctca aggtgcttct atcgatcgga 540

ggctggacat actcgagcaa ttttgtgaca ccagcgagta cagatcaagg caggaagact 600

ttcgcttctt cggctgtcaa gttgctggcc gacttgggct ttgatggatt agatattgat 660

tgggagtacc ctgccaatga agcccaggct acagacatgg ttctactcct acgcgagatc 720

cgagaggaac tagacgaata cggccgcgaa cacggcaacg gaacccattt cctcctaagc 780

atagccacct cagcaggtcc ctcaaaatac aataccctcc acatatccag tatgaacctc 840

tacctcgact tctggaacct aatggcctac gactacgccg gcagctggga tgcaactgca 900

ggacaccagg ccaacctcta cccattacgg gatgaccctg tctcaacccc cttcaacacg 960

gatcaagcca tctccgcgta cctgaccgcc ggtgttcccg cccataaact cattctcggt 1020

atgccgctct atgggcgcgc cttcacaaac accgacggac cgggcaagcc gtttaatggt 1080

gttggtcagg gaagctggga gaatggggtc tgggactaca aagcgcttcc tcctgcaggg 1140

gctagtgttt ctgagttgag aagtattggt gcgagctact cgtatgatgc tggcaaaaag 1200

acgatgatta gttatgatac ccctgctgtt gcgaggcaga aggcggatta tatcagaagt 1260

aaaggtctcg ggggtgcgat gtggtgggag acttctgggg acaaggtggg agtggagagt 1320

ttgatttcta cggtcgtgga ttcactaggt ggtattggcg ctctggataa gtcggtcaat 1380

cacctggagt atcccgagtc gcagtatgac aatgtgaaga aggggttcca ttga 1434

<210> 4

<211> 429

<212> protein

<213> AnChi氨基酸序列

<400> 4

MIQKRKRTVS FRLVLMCTLL FVSLPITKTS AVGSSRTSAE YKSIAYFVNW AIYGRNHNPQ 60

DIPIDKLTHI LYAFANVRAN GEVYLSDPWS DIDKRFPGDS WSDTGNNVYG CVKQLNLLKQ 120

KNRNLKVLLS IGGWTYSSNF VTPASTDQGR KTFASSAVKL LADLGFDGLD IDWEYPANEA 180

QATDMVLLLR EIREELDEYG REHGNGTHFL LSIATSAGPS KYNTLHISSM NLYLDFWNLM 240

AYDYAGSWDA TAGHQANLYP LRDDPVSTPF NTDQAISAYL TAGVPAHKLI LGMPLYGRAF 300

TNTDGPGKPF NGVGQGSWEN GVWDYKALPP AGASVSELRS IGASYSYDAG KKTMISYDTP 360

AVARQKADYI RSKGLGGAMW WETSGDKVGV ESLISTVVDS LGGIGALDKS VNHLEYPESQ 420

YDNVKKGFH 429

Claims (10)

1.一种高效几丁质酶AnChi基因，其核苷酸序列为如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的基因编码的几丁质酶，其特征在于：所述几丁质酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1所述的AnChi基因在降解几丁质方面的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：构建含有权利要求1所述高效几丁质酶AnChi基因的重组质粒。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述重组质粒为将权利要求1所述基因插入载体的多克隆位点得到的，所述载体选自pDG1663、pDG1661、pDG1662、pDG1730、pDL或pDK。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：构建含有权利要求1所述基因的重组菌。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述重组菌是将权利要求5所述重组质粒转化枯草芽孢杆菌KO7、WB600、WB700或WB800中得到的。

8.权利要求6所述的重组菌在高效表达异源几丁质酶方面的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：通过发酵方式，获得含有权利要求2所述的几丁质酶AnChi的粗酶液，直接使用粗酶液或浓缩后的粗酶液降解黑曲霉菌丝体中的几丁质。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：几丁质酶AnChi的酶用量与底物浓度比为0.1-0.2U酶：10-20mg/mL底物。