USO DE TRANSTIRETINA COMO UN BIOMARCADOR PARA ADENOMA Y/O CARCINOMA COLORRECTAL; MÉTODO PARA DETECCIÓN Y SISTEMA DE PRUEBA La presente invención se relaciona con el campo de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal. El carcinoma colorrectal es el tercer carcinoma más frecuentemente diagnosticado y la segunda causa principal de muerte por carcinoma en Europa y en los Estados Unidos. En 1996, un cálculo de 133,500 nuevos casos de carcinoma colorrectal se diagnosticaron y aproximadamente 54,900 gente murió de esta enfermedad en los Estados Unidos. La incidencia de carcinoma colorrectal está aumentando mientras que el régimen de mortalidad de carcinoma colorrectal está disminuyendo. La incidencia de carcinoma colorrectal aumenta con la edad, empezando a alrededor de los 40 años de edad, y es superior en hombres que en mujeres (60.4 para hombres contra 40.9 para mujeres, por 100,000 al año) . En la mayoría de los pacientes, el desarrollo de carcinoma colorrectal sigue una progresión de múltiples pasos desde adenoma premaligna a malignidades invasoras que tienen la propensión para metástasis. Existe evidencia de que la reducción en morbidez y mortalidad de carcinoma colorrectal se puede lograr a través de detección y tratamiento de carcinomas colorrectales de etapa temprana e
identificación y eliminación de pólipos adenomatosos colorrectales, que son los precursores de carcinoma colorrectal . Las pruebas de tamizado colorrectal han mostrado que logran detección precisa de etapa temprana de carcinoma colorrectal en sus precursores, es decir, pólipos adenomatosos y/o áreas neoplásticas planas. Varias pruebas están disponibles como opciones para tamizado de carcinoma colorrectal. Las pruebas de tamizado abarcan prueba de sangre oculta fecal (FOBT), sigmoidoscopia flexible, FOBT combinado con sigmoidoscopla flexible y colonoscopla. Las diversas pruebas de tamizado difieren una de otra respecto a funcionamiento, efectividad, posible frecuencia de tamizado, complicaciones de prueba, costos y aceptación del paciente. El tamizado por la prueba de sangre oculta fecal se considera actualmente que es la estrategia de tamizado óptima en términos de costo-efectividad. La sangre oculta en heces se puede detectar por agentes químicos tales como guaiac, a través de hemeporfirina o métodos inmunológicos. La prueba de platina de guaiac Hemoccult (II) disponible de SrnithKline Diagnostics se usa muy ampliamente. Diversos factores técnicos afectan su funcionamiento clínico. Hemoccult tiene aproximadamente 50% de sensibilidad para carcinomas colorrectales y
alrededor de 98% de especificidad, sin embargo, la sensibilidad es baja para pólipos a alrededor de 10% (Simón JB. (1998) Gastroenterologist 6:66-78. Review). Otra desventaja importante de tamizado de sangre oculta es la baja precisión de predicción, solamente 10% de reacciones positivos prueban deberse a carcinoma colorrectal (Simón JB. (1998) Gastroenterologis 6:66-78, Review; Mandel JS y col. (1999) J. Nati. Cáncer Inst. 91:434-437; Hardcastle JD y col. (1996) Lancet 348:1472-1477; Kronborg O y col. (1996) Lancet 348:1467-71; Winawer SJ y col. (1997) Gastroenterology 112:594-642; Fletcher RH (1998) N. Engl. J. Med. 338:1153-1154). Además, una prueba de sangre oculta fecal solamente proporciona resultados después de progresión de la enfermedad a una cierta etapa. Seria deseable tener un sistema de prueba que permita la detección de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal en un punto anterior en tiempo. Las pruebas inmunológicas más recientemente desarrolladas generalmente tienen sensibilidad elevada, sin embargo, una baja especificidad que permanece un problema importante. Otros métodos, tales como pruebas genéticas de muestras de heces para oncógenos KRAS y para proteina p53, todavía no son efectivos en costo (Calistri D y col. (2003) Clin. Gastroenterol. Heptaol. 1:377-383, Schoen RE 82002)
Nat. Rev. Cáncer 2:65-70). La endoscopia (Kavanagh AM (1998) Cáncer Causes
Control 9:455-462), que utiliza ya sea el sigmoidoscopio flexible o el colonoscopio (Lieberman DA 81997) Gastroenterol. Clin. N. Am. 26: 71-83) es el medio más definitivo para detección, pero tiene limitaciones. El régimen negativo falso para lesiones neoplásticas planas se ha reconocido y permanece elevado (Kudo S (1997) Gastrointest. Endose. Clin. N. Am. 7:87-98). La colonoscopla permite el examen del colon con un régimen negativo falso bajo para lesiones polipoides de cuando menos 10 mm de diámetro. Debido a esta razón, los intervalos permitidos antes de nuevo examen son relativamente prolongados después de una determinación negativa (hasta diez años) o hasta cinco años después de polipectomia . Sin embargo, el cumplimiento del paciente con dicha recomendación para nuevo examen después de colonoscopla es bajo. Adicionalmente, una colonoscopia es costosa y molesta. En vista de los elevados costos de un examen generalizado y la aceptación limitada de una colonoscopia por la población este método de examen tiene una aplicación limitada. Las muestras de tejido aislado, que se recogen, se pueden probar para carcinoma colorrectal y sus
precursores, adenoma colorrectal, mediante diversos métodos. DE 197 11 111A describe un método que usa una determinación in vitro de bacterias de colon intraepiteliales, componentes y productos de reacción de la misma. Otro método que usa expresión de gene HERG en muestras de tejido se describe en DE 102 24 534. Un objeto de la invención es proporcionar medios que permiten una detección temprana de adenoma de colon y/o carcinoma de colon. Un objeto adicional es proporcionar un biomarcador que se puede usar en la detección de adenoma y/o carcinoma colorrectal. Otro objeto de la presente invención es proporcionar un sistema de prueba para detectar adenoma o carcinoma colorrectal que es efectivo en costo y se puede usar ampliamente. Además, el sistema de prueba debe ser fácil de manejar y más conveniente para el individuo que se va a examinar para adenoma y/o carcinoma colorrectal. Los objetos que están bajo la presente invención se resuelven mediante el uso de transtiretina como un biomarcador para la detección de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal en un individuo. La detección se puede llevar a cabo in vivo o in vitro. De conformidad con una modalidad preferida, la detección se lleva a cabo in
vitro. Los objetos se resuelven además mediante un método para detectar adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal que comprende los pasos: (a) proporcionar un material de muestra aislado que se ha tomado de un individuo, (b) determinar el nivel de transtiretina en el material de muestra aislado, (c) comparar el nivel determinado de transtiretina con un valor de referencia. Los objetos se resuelven además mediante un método para discriminar entre adenoma colorrectal y carcinoma colorrectal que comprende los pasos (a) proporcionar un material de muestra aislado que se ha tomado de un individuo, (b) determinar el nivel de transtiretina en el material de muestra aislado, (c) comparar el nivel determinado de transtiretina con un valor de referencia. Los objetos también se resuelven mediante un método para supervisar el curso de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal y/o el tratamiento de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal que comprende los pasos: (a) proporcionar un material de muestra aislado que
se ha tomado de un individuo, (b) determinar el nivel de transtiretina en el material de muestra aislado, (c) comparar el nivel determinado de transtiretina con un valor de referencia. Los objetos se resuelven también proporcionando un sistema de prueba para detectar adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal en un individuo que comprende: (a) un anticuerpo o un receptor que se liga a un epitope de transtiretina, (b) un soporte sólido que sustenta el anticuerpo o receptor, (c) un reactivo para detectar el enlace del epitope de transtiretina al anticuerpo o receptor. Los objetos se resuelven adicionalmente mediante la provisión de una disposición que comprende moléculas de detección para detectar el adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal en un individuo, que comprende como molécula de detección: (a) una sonda de ácido nucleico inmovilizada a un soporte sólido para ligarse a y detección de transtiretina que codifica mRNA, o (b) un anticuerpo inmovilizado a un soporte sólido para ligarse a y detección de un epitope de transtiretina, o
(c) un receptor inmovilizado a un soporte sólido para ligarse a y detección de un epitope de transtiretina. en donde de preferencia cada una de diferentes cantidades de moléculas de detección se inmovilizan al soporte sólido para aumentar la precisión de la cuantificación. Las modalidades preferidas se especifican en las reivindicaciones dependientes. De conformidad con la presente invención, el término "biomarcador" se intenta que designe una proteina o fragmento de proteina que es indicativo de la incidencia del adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal. Esto significa que el "biomarcador" se usa como un agente de detección o molécula de detección. El término "individuo" o "individuos" se pretende que designe a un mamífero. De preferencia, el mamífero es un ser humano tal como un paciente. El término "individuo sano" o "individuos sanos" se pretende que designen a individuos no enfermos de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal. Es decir, el término "individuo (s) sano(s)" solamente se usa con respecto a la condición patológica de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal y no excluye que el individuo sufra de enfermedades distintas al adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal.
El término "transtiretina" como se usa en la presente invención también comprende transtiretina truncada, fragmentos de transtiretina, transtiretina mutada, o transtiretina modificada. La modificación de "transtiretina" se puede deber a modificación enzimática o quimica. Además, el término "transtiretina" también se usa para designar formas monoméricas o multiméricas de transtiretina. Por ejemplo, el término "transtiretina" cubre especialmente la cadena de proteina monomérica que usualmente es parte de la transtiretina de proteina homotetramérica . El término "epitope" se pretende para designar cualquier elemento estructural de transtiretina que permite el enlace especifico de un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una proteina o estructura de péptido o un receptor. El proceso de aislar el material de muestra no es parte de la invención. Es decir, los métodos de la presente invención se llevan a cabo con material de muestra tal como un fluido corporal que ya se ha aislado. Es posible, por ejemplo, almacenar el material demuestra que se va a probar en un congelador y llevar a cabo los métodos de la presente invención en un punto en tiempo apropiado después de descongelar el material de muestra respectivo. Se ha descubierto sorprendentemente por los
presentes inventores que la transtiretina de proteina se puede usar como un biomarcador para la detección de adenoma y/o carcinoma colorrectal. La transtiretina también está designada como prealbúmina. La transtiretina es una proteina tetraméricfa que tiene un peso molecular de alrededor de 54 kDa que se sintetiza principalmente en el higado. La transtiretina está compuesta de cuatro cadenas de proteina de alrededor de 14 kDa que pueden ser idénticas. Es decir, la transtiretina se puede considerar como una proteina homo tetramérica. Funciona principalmente como una proteina de enlace para tiroxina, y como una proteina portadora para proteina de enlace retinal, que a su vez es la proteina de transporte para vitamina A (Schussler, GC Thyroid. (2000) , 20:372; Hamilton, JA y Benson, MD Cell of Life Sci. (2001) 58:1491-1521) . La transtiretina también se reporta que forma complejos de ?-proteIna amiloide. La agregación de p'-proteina amiloide está asociada con la deposición de amiloide en el cerebro, que es una particularidad patológica de mal de Alzheimer. La transtiretina se ha descrito además como un indicador del estado nutricional, puesto que los niveles de suero de transtiretina declinan con admisión de proteina inadecuada y durante inflamación aguda o crónica. Además,
la transtiretina es apropiada para supervisar el estado nutricional debido a su corta vida media de solamente 2-3 dias (Pleban WE, Conn. Med. 81989) 53:405-407; Bernstein LH e Ingenbleek Y, Clin. Chem. Lab. Med. 82002) 40:1344-1348). WO 02/059621 describe reactivos que regulan la transtiretina y reactivos que se ligan a productos de gene de transtiretina, jugando de esta manera un papel al impedir, mejorar o corregir obesidad y disfunciones relacionadas . Se ha mostrado por análisis SELDI
(desorción-/ionización láser mejorada superficial) que le cadena de proteína de transtiretina monomérica ocurre en plasma o suero humano cuando menos en dos variantes que tienen un peso molecular de 13.736 Da y 13,858 Da, respectivamente. Los diferentes pesos moleculares se piensa que se deben a diversas modificaciones post-translacionales tales como truncado, cisteinilación y/o glutacionilación. La transtiretina cisteinilada tiene un peso molecular de alrededor de 13.871 + 11 Da, y la transtiretina glutationilada tiene un peso molecular de alrededor de 14.069 + 5 Da. WO 037001182 describe la detección y aislamiento de transtiretina homocisteinilada de un fluido biológico y su uso como un marcador para diagnóstico de
homocisteinemia, hiperhomocisteinemia y enfermedades asociadas con la misma. En algunos estudios, la transtiretina se ha discutido como marcador de diagnóstico para carcinoma. Suresh y col. (J. Clin. Pathol. 81991) 44: 573-575) describió la transtiretina como un marcador útil en tumores carcinoides broncopulmonares puesto que 75% de los tumores carcinoides fueron positivos para transtiretina. En otro estudio, la transtiretina se discutió como marcador prognóstico en carcinoma ovárico epitelial (Mahlck y col., Gynecol. Obstet. Invest. (1994) 37: 135-140). Los inventores han encontrado ahora sorprendentemente que el nivel de transtiretina en un fluido corporal está correlacionado con la incidencia de adenoma y/o carcinoma colorrectal en un individuo. De conformidad con la presente invención, la transtiretina se puede medir en fluidos corporales tales como sangre, plasma de sangre, suero de sangre, médula de hueso, heces, fluido sinovial, fluido linfático, fluido cerebroespinal, esputo, orina, leche de madre, esperma, exudado y mezclas de los mismos. De preferencia, el fluido corporal se ha aislado antes de llevar a cabo los métodos de la presente invención. Los métodos de la invención se llevan a cabo de preferencia in vitro por un técnico de laboratorio.
De conformidad con una modalidad preferida de la invención, la transtiretina se mide en plasma de sangre o suero de sangre. El suero de sangre se puede obtener fácilmente tomando sangre de un individuo para ser médicamente examinado y separando el sobrenadante de la sangre coagulada. El nivel de transtiretina en el fluido corporal, de preferencia suero de sangre, disminuye con la formación progresiva de adenoma colorrectal. El adenoma colorrectal es un neoplasma benigno que se puede hacer maligno. Cuando se desarrolla cáncer colorrectal de adenoma colorrectal benigno, el nivel de transtiretina en fluidos corporales, de preferencia suero de sangre, disminuye adicionalmente. Después de la transformación de adenoma colorrectal en cáncer colorrectal, la condición patológica del individuo afligido se puede exacerbar adicionalmente por la formación de metástasis. La presente invención proporciona un biomarcador de etapa temprana que permite detectar la enfermedad neoplástica en una etapa temprana y todavía benigna. La detección temprana permite al médico eliminar a tiempo el adenoma colorrectal y aumentar dramáticamente la probabilidad de que la individuo sobreviva. Además, la presente invención permite supervisar el nivel de transtiretina en un fluido corporal tal como
suero de sangre durante un período de tiempo prolongado, tal como años. La supervisión de término prolongado permite diferenciar entre adenoma colorrectal y carcinoma colorrectal. El nivel de transtiretina se puede comprobar rutinariamente, por ejemplo, una o dos veces al año. Si una disminución del nivel de transtiretina se detecta, esto puede ser indicativo de adenoma colorrectal. Una disminución adicional del nivel de transtiretina puede entonces ser indicativo de la transformación en carcinoma colorrectal maligno. Además, el curso de la enfermedad y/o el tratamiento se puede supervisar. Si el nivel de transtiretina disminuye adicionalmente, por ejemplo después de remoción del adenoma colorrectal, esto puede ser indicativo de exacerbación de la condición patológica. Eso significa, el nivel de transtiretina es un parámetro clínico valioso para detectar y/o supervisar el adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal. El nivel de transtiretina en fluidos corporales disminuye muy temprano después de la incidencia de adenoma colorrectal. Por lo tanto, la transtiretina o el nivel de transtiretina es un parámetro clínico importante para permitir un diagnóstico temprano y, consecuentemente, un tratamiento temprano de la enfermedad.
El método de la invención para detección de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal comprende el paso de proporcionar un material de muestra aislado que se ha tomado de un individuo, luego determinar el nivel de transtiretina en el material de muestra aislado, y finalmente comparar el nivel determinado de transtiretina con un valor de referencia El valor de referencia se puede calcular como el nivel promedio de transtiretina determinado en una pluralidad de muestras aisladas de individuos sanos. Este valor de referencia se puede establecer como una escala que se considera como normal significando que la persona es sana. Una caída debajo de esta escala puede entonces ser indicativa de la condición patológica de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal. Esta escala de valor de referencia se puede establecer tomando un número estadísticamente relevante de muestras de fluido corporal, tal como muestras de suero, de individuos sanos como se hace para cualquier otra escala de parámetro médico, tal como, v.gr., azúcar en sangre. En otra modalidad de la presente invención, el valor de referencia puede ser un valor de referencia individual calculado co o el nivel promedio de transtiretina determinado en una pluralidad de muestras aisladas tomadas del individuo durante un período de
tiempo. Cuando se supervisa el nivel de transtiretina durante un período de tiempo prolongado, tal como meses o años, es posible establecer un nivel promedio individual. El nivel de transtiretina se puede medir, por ejemplo, de la misma muestra de suero de sangre cuando se mide azúcar en la sangre y se puede usar para establecer una curva de calibración individual que permite detectar específicamente cualquier disminución individual del nivel de transtiretina. En otro aspecto, la presente invención proporciona además un sistema de prueba para detectar adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal en un individuo. El sistema de prueba se basa ya sea en la especificidad de un anticuerpo o un receptor para ligarse a un epítope o un elemento estructural apropiado de transtiretina o un fragmento de transtiretina. Un receptor puede ser cualquier estructura capaz de ligarse específicamente a transtiretina. Un receptor puede ser cualquier estructura capaz de ligarse específicamente a transtiretina. El receptor puede ser, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fab o un f(ab')2 o cualquier otra proteína o estructura de péptido que sea capaz de ligarse especí icamente a transtiretina. El anticuerpo, fragmento de anticuerpo o receptor
se liga a un soporte sólido tal como, v.gr., una superficie plástica o cuentas que permiten el enlace y detección de transtiretina. Por ejemplo, una placa de microtítulo convencional se puede usar como una superficie de plástico. La detección del enlace de transtiretina se puede efectuar, por ejemplo, usando un anticuerpo secundario etiquetado con un grupo detectable. El grupo detectable puede ser, por ejemplo, un isótopo radioactivo o una enzima como peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina detectable añadiendo un substrato apropiado para producir, por ejemplo, un color o una señal de fluorescencia. El sistema de prueba puede ser un inmunoensayo tal como un inmunosorbentensayo enlazado a enzima (ELISA) o un inmunoensayo de radio (RÍA) . Sin embargo, cualquier otro sistema de prueba inmunológico usando la especificidad de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos se pueden usar tales como manchado Western o inmuno precipitación. La presente invención también proporciona una disposición que comprende moléculas de detección para detectar adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal en un individuo, en donde la molécula de detección puede ser una sonda de ácido nucleico inmovilizada en un soporte sólido para ligarse a y detectar una transtiretina que codifica mRNA, fragmentos, mutaciones, variantes o derivados de los mismos, o un anticuerpo inmovilizado en un
soporte sólido para ligarse a y detectar un epítope de transtiretina, o un receptor inmovilizado en un soporte sólido para ligarse a y detectar un epitope de transtiretina . La sonda de ácido nucleico puede ser cualquier oligonucléotido que ocurre naturalmente o sintético, así como cADN, cRNA y lo semejante. La disposición descrita se puede usar en un sistema de prueba de conformidad con la invención. La disposición puede ser una micro disposición o una macro disposición. El soporte puede ser un material polimérico tal como nylon o plástico o un material inorgánico tal como silicio, por ejemplo una oblea de silicio, o cerámica. De conformidad con una modalidad preferida, vidrio (Si02) se usa como material de soporte sólido. El vidrio puede ser una platina de vidrio o pastilla de vidrio. De conformidad con otra modalidad de la invención, el substrato de vidrio tiene una superficie atómicamente plana. Por ejemplo, la disposición puede estar comprendida de sondas de ácido nucleico inmovilizadas capaces de ligarse específicamente a mRNA de transtiretina que están presentes en un fluido corporal tal como suero. Otra modalidad preferida es producir cADN mediante transcripción de reversa de mRNA de transtiretina y para detectar específicamente la cantidad de cADN respectivo con
la disposición. La tecnología de disposición es conocida por la persona experta. Una cuantificación del mRNA o cADN medido, respectivamente, se puede efectuar mediante comparación de los valores medidos con una curva de calibración o norma de cantidades conocidas de mRNA o cADN de transtiretina. De preferencia, diferentes cantidades de moléculas de detección se inmovilizan cada una sobre el soporte sólido para permitir una cuantificación precisa del nivel de transtiretina. De conformidad con otra modalidad de la invención, el nivel de transtiretina se determina mediante espectroscopia de masa. La espectroscopia de masa permite detectar específicamente transtiretina o las cadenas de proteína monomérica de la misma a través de su peso molecular y cuantificar la cantidad de transtiretina muy fácilmente. La transtiretina es normalmente un homotetrámero que comprende cuatro cadenas de proteína cada una teniendo un peso molecular de alrededor de 14 kDa. Utilizando espectroscopia de masa, los inventores han detectado diversas variantes de las cadenas de proteína de transtiretina que tienen un peso molecular de, entre otros, 13,776 Da, 13,884 Da o 14,103 Da. Los inventores han descubierto que especialmente
el nivel de variantes moleculares de transtiretina que tienen un peso molecular de 13,776 Da y 1,3884 Da se disminuye en un fluido corporal tal como suero en caso de incidencia de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal. Cualquier método de ionización apropiado en el campo de espectroscopia de masa conocida en el ramo se puede emplear para ionizar la molécula de transtiretina, fragmentos, mutaciones, variantes o derivados de la misma. Los métodos de ionización comprenden impacto de electrones (El), ionización química (Cl), ionización de campo (FDI), ionización de electrodispersión (ESI), ionización de desorción de láser (LDI), ionización de desorción de láser ayudada por matriz (MALDI) y ionización de desorción de láser mejorada en superficie (SELDI). Cualquier método de detección apropiado en el campo de espectroscopia de masa conocido en el ramo se puede emplear para determinar la masa molecular de transtiretina, fragmentos, mutaciones, variantes o derivados de la misma. Los métodos de detección comprenden espectroscopia de cuadrupol (QMS) , espectroscopia de masa de transformación fourier (FT-MS) y espectroscopia de masa de tiempo de vuelo (GOF-MS) . De preferencia, la espectroscopia de masa es una ionización de desorción de láser mejorada en
superficie-tiempo de espectroscopia de vuelo de masa (SELDI-TOF-MS) . Antes de llevar a cabo un SELDI-TOF-MS, la transtiretina en la muestra aislada se inmoviliza de preferencia en una pastilla o soporte sólido con una superficie activada. La superficie activada comprende de preferencia anticuerpos de anti-transtiretina inmovilizados, tales como por ejemplo, anticuerpos de anti-transtiretina policlonales de conejo. Después del enlace de la transtiretina a los anticuerpos un análisis de tiempo de vuelo en un espectrómetro de masa SELDI-TOF se lleva a cabo, que entrega señales de intensidad para determinación del nivel de transtiretina. Además, la espectroscopia de masa permite detectar simultáneamente otras proteínas que pueden tener una importancia con respecto a la detección de adenoma colorrectal y/o cáncer colorrectal. En otra modalidad de la presente invención, la sensibilidad y/o especificidad de la detección de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal se mejora mediante detección de otra proteína en combinación con transtiretina. Otro biomarcador para adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal, el nivel que se pude determinar además del nivel de transtiretina, comprende una proteína o polipéptido que tiene un peso molecular de 8,960 Da. El
nivel de la proteína o polipéptido de 8,960 Da en un material de muestra se ha encontrado que aumenta en adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal cuando se compara con el perfil de esta proteína o polipéptido en muestras aisladas de individuos sanos. Por lo tanto, se prefiere determinar el nivel de la proteína que tiene un peso molecular de 8960 + 9 Da además del nivel de transtiretina en un fluido corporal tal como suero mediante espectroscopia de masa. La espectroscopia de masa es el método de elección para detectar y cuantificar el nivel de la proteína de 8960 +_ 9 Da. En otra modalidad de la presente invención, la sensibilidad y/o especificidad de la detección de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal se mejora mediante detección de CEA (antíteno carcinoembriónico) y/o CA 19-9 en combinación con transtiretina. CEA y CA 19-9 se analizaron ambos como indicadores de respuesta y factores de prognóstico en carcinoma colorrectal avanzado. En una modalidad adicional de la presente invención, la sensibilidad y/o especificidad de la detección de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal se mejora mediante detección de CA15-3, CA-125 y/o Her-2/neu en combinación con transtiretina. CA15-3 es un antígeno oncofetal, que se expresa mediante varios
carcinomas, y frecuentemente se mide con otros marcadores de tumor. Tanto CA15-3 como CA-125 con indicadores prognósticos, principalmente para cáncer de pecho, pero también en adición a metástasis viscerales. La amplificación de Her-2/neu en carcinoma de pecho está asociada con baja prognosis, intervalo corto libre de enfermedad y tiempo corto de sobrevivencia. Poco se conoce hasta ahora acerca del punto de inicio de amplificación y el progreso de Her-2/neu hasta ahora. Los métodos de la presente invención se pueden llevar a cabo en combinación con otros métodos de diagnóstico para detección de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal para aumentar la sensibilidad y/o especificidad total. De preferencia, los métodos de la presente invención se llevan a cabo como una detección temprana y/o método de supervisión. Si los resultados de los métodos de la presente invención deben indicar la incidencia de adenoma colorrectal y/o adenoma colorrectal, los exámenes adicionales tales como colonoscopía o una prueba de sangre oculta fecal (FOBT) se deben llevar a cabo. Los siguientes anticuerpos policlonales de anti-transtiretina se puede usar cuando se practica la invención: PC 066 disponible de The Binding Site Ltd., Birmingham, Inglaterra y A 0002, disponible de DAKO,
Hamburgo, Alemania. Las siguientes figuras y ejemplo se proporcionan para propósitos ilustrativos solamente. La invención no debe considerarse que está limitada a los siguientes ejemplos. Figuras La Figura 1 muestra un diagrama esquemático para fracciones y sacar perfil' de muestras de suero. La Figura 2 muestra un perfil de SELDI-TOF. La Figura 3 muestra una diferenciación de individuos sanos de los individuos de adenoma/carcinoma. La Figura 4 muestra perfiles de proteína de SELDI-TOF de fracciones de suero de tres individuos diferentes. La Figura 5 muestra capturo de inmunoafinidad
SELDI de transtiretina y sus derivados potenciales. La Figura 6 muestra la inmunoprecipitación con un anticuerpo de anti-transtiretina. Ejemplo Amenos que se manifieste de otra manera, todos los métodos se llevaron a cabo siguiendo el siguiente protocolo del fabricante de los sistemas analíticos Recolección de suero y fraccionación de suero. Se recogió e investigó suero de tres grupos de pacientes humanos.
El grupo 1 consistió de 30 pacientes que eran pacientes quirúrgicos tratados de enfermedades no cancerosas tales como hernia inguinal, piedras de vejiga o diverticulitis . Estos individuos del grupo 1 se tomaron como el grupo de individuos sanos, es decir, aquellos que no sufrieron de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal. El grupo 2 consistió de 29 pacientes, que fueron todos pacientes quirúrgicos tratados de tumores no definidos, que resultaron ser adenoma colorrectal benigno. El grupo 3 consistió de 28 pacientes, que fueron pacientes que tienen carcinoma colorrectal. Todos estos 28 pacientes sufrieron de la etapa TNM III (Tumor, Nodo, Metástasis etapalll) de carcinoma colorrectal. Las líneas de guía éticas y confianza de paciente se ha asegurado estrictamente y todos los pacientes proporcionaron consentimiento escrito para participar en este estudio. Todos los pacientes tuvieron preparaciones preoperativas comparables tales como tiempo de ayuno y premedicación. El suero de cada paciente se fraccionó mediante cromatografía de intercambio de anión (Serum Fractionation Kit/Q HyperD resina, Ciphergen Biosystems, Inc.), usando un acercamiento de automatización de formato de 96 pozos (Biomek2000, Ciphergen) , de conformidad con el protocolo
del fabricante, para reducir algo de la interferencia por la mayoría de proteínas abundantes. Como se muestra en la Figura 1, la fraccionación produjo 6 fracciones que contienen proteínas separadas aproximadamente sobre la base del valor pl de proteína. De ocho pacientes, todas las fracciones se probaron usando disposiciones de ProteinChip(R) de superficie cromatográfica de Ciphergen Biosystems, Inc. Las disposiciones proporcionan capacidad relativamente elevada y se ligan a una variedad grande de proteínas y péptidos para una amplia escala de aplicaciones de formación de perfil de proteína y mapeo de péptido. Las seis fracciones de suero de ocho pacientes se aplicaron a las siguientes tres disposiciones diferentes de proteína: SAX-2, una disposición de anión fuerte con funcionalidad de amina cuaternaria, IMAC, una disposición de captura de metal inmovilizado con una superficie de ácido nitriloacético y CM10, una disposición de intercambio de catión débil con funcionalidad de carboxilato. Dos fracciones que proporcionaron el número más elevado de crestas evaluables se seleccionaron (fracción 1, fracción
4) para un acercamiento de formación de perfil en una pastilla que mostró la variabilidad de datos más bajo
(disposición CM10) . Estas dos fracciones se midieron en todos los tres grupos usando Ciphergen ProteinChip(R) Array
CM 10. Preparación de disposición de Chiphergen ProteinChip(R) y análisis SELDI-TOF-MS Las disposiciones de proteína CM10 se procesaron en un bioprocesador (Ciphergen Biosystems, Inc.), de conformidad con el protocolo del fabricante. Las pastillas se equilibraron con tampón de enlace de CM10 (Ciphergen Biosystems, Inc.), durante 2x5 minutos y se incubaron subsecuentemente con las fracciones de suero que se habían diluido 1:10 en tampón de enlace de CM10. Después de 45 minutos, el material no ligado se separó y las pastillas se lavaron 3 veces con el tampón de enlace CM10 y 2 veces con agua. Después de secar a temperatura ambiente durante 10 minutos, 2 aplicaciones de 0.05 M de ácido sinapínico (1.0 ul) se añadieron y las pastillas se analizaron con Ciphergen Protein ChipReader (modelo PBSII). El protein ChipReader es un espectrómetro de masa de tiempo de vuelo. Los valores de masa e intensidades de señal para las proteínas detectadas se transfieren a un software, que se suministra por Ciphergen para análisis adicional en profundidad por el ProteinChip Data Analysis programa y Biomarker Wizard Program. Para reducir al mínimo la variabilidad de datos, se realizó medición dentro de dos días usando muestras de todos los grupos de pacientes distribuidos aleatoriamente
en las pastillas. Como un control convencional para normalización, suero normal estancado se usó paralelo con todas las mediciones. Los espectros de masa de proteínas se generaron usando un promedio de 195 disparos de láser a una intensidad de láser de 185. El detector de hizo funcionar a una sensibilidad de 7. Para adquisición de datos, la escala de tamaño de detección se estableció entre 2,000 y 40,000 Da. El láser se enfocó a 10,000 Da. Los datos se analizaron con el proteinChip Data Analysis program
(versión 3.1, Ciphergen Biosystems) y con el Biomarker
Wizard program (versión 3.1, Ciphergen Biosystems). Las intensidades de pico se normalizaron a la corriente de ion total. Resultados En este experimento, proteínas diferencialmente expresadas entre suero de pacientes sin carcinoma (Grupo 1) y suero de pacientes con adenoma colorrectal (Grupo 2) y carcinoma colorrectal (Grupo 3) se identificaron. Como se muestra en el Cuadro 1, seis crestas se pudieron identificar en la fracción 1 que mostraron los valores medios de intensidad de diferencias altamente significativos (p < 0.0000001) entre pacientes sanos (pacientes sin cáncer) , pacientes de adenoma colorrectal y
pacientes de carcinoma colorrectal. Como se muestra en el Cuadro 2, la fracción 4 proporcionó un juego adicional de biomarcadores potenciales que difirieron significativamente entre los tres grupos (p < 0.0000001). Cuadro 1: Biomarcadores seleccionados después de procesamiento de la fracción 1 de cada muestra de suero en pastillas Ciphergen. Se generaron los valores p con pruebas no paramétricas de la aplicación Biomarker Wizzard. N proporciona el nivel de transtiretina para "pacientes sanos", A para pacientes con adenoma colorrectal y Ca para pacientes con carcinoma colorrectal. StDev es la desviación convencional de la medición. M/Z Valor-P Medio- Desv. Medio Desv. Medio Desv. N Con.N A Con.A CA Con. Ca 5820 O . QQOOOOO 1.320 0.633 1.800 1.205 2.811 1.374 6121 0.0000000 5.074 1.895 5.884 1.936 8.116 3.237 6139 0.0000001 3.381 1.359 4.013 1.440 5.346 2.346 5916 0.0000002 41.119 13.267 47.122 14.205 58.580 14.654 8632 0.0000003 1.043 0.710 1.688 1.194 2.079 1.386 5931 0.0000004 20.077 8.925 23.771 8.881 20.289 12.146
Cuadro 2 : Biomarcadores seleccionados después de procesamiento de la fracción 4 de cada muestra de suero en pastillas Ciphergen. Los valores p se generaron con pruebas no paramétricas de la aplicación Biomarker Wizzard. N proporciona el nivel de transtiretina para pacientes
?sanos', a para pacientes con adenoma colorrectal y Ca para pacientes con carcinoma colorrectal. StDev es la desviación convencional de la medición. M/Z Valor-P Medio StDev Medio StDev Medio StDev N N A A CA CA 6850 <0.0000001 1.10 0.29 0.69 0.21 0.81 0.33
6885 <0.0000001 1.16 0.30 0.79 0.25 0.74 0.31
7055 <0.0000001 0.75 0.16 0.55 0.15 0.51 0.20
13770 <0.0000001 1.73 0.46 1.16 0.33 1.01 0.49 13900 <0, 0000001 3.66 0.88 2.59 0.81 2.30 1.04
14160 <0.0000001 1.93 0.44 1.47 0.41 1.27 0.48
4975 <0.0000001 0.31 0.15 0.49 0.26 0.72 0.48
6645 <0.0000001 9.41 2.44 6.05 2.03 6.86 3.19
14060 <0.0000001 3.40 0.83 2.56 0.80 2.23 0.89 6950 <0.0000001 2.45 0.74 1.79 0.75 1.69 0.79
51485 <0.0000001 0.15 0.03 0.14 0.02 0.18 0.04
22330 <0.0000001 0.37 0.04 0.42 0.05 3.49 0..43
5765 <0.0000001 0.86 0.22 1.00 0.37 1.35 0.45
28100 <0.0000001 2.82 0.76 2.11 0.70 1.79 0.73 5915 <0.0000001 0.59 0.18 0.61 0.14 0.88 0.33
17415 <0.0000001 0.83 0.30 0.62 0.25 0.52 0.22 Varias proteínas se probaron como biomarcadores sencillos y en combinación con otros marcadores usando el
Biomarker Pattern Software. Una proteína con un peso molecular de 13.770 Da (pl3.770) se encontró que discrimina
entre pacientes de adenoma/carcinoma y controles sanos proporcionando una sensibilidad de 75% y una especificidad de 90%. La Figura 2 muestra un perfil SELDI que demuestra al biomarcador. " La Figura 3 muestra la discriminación de pacientes sanos de pacientes de adenoma/carcinoma en un trazo disperso. Las intensidades del biomarcador teniendo un peso molecular de 13770 Da (pl3.370) son significativamente inferiores en el suero de pacientes con adenoma/cáncer que en pacientes sanos. La Figura 4 muestra perfiles de proteína SELDI-TOF de fracción de suero no. 4 de sanos, pacientes con adenoma y pacientes con cáncer. Como se puede ver la intensidad de cresta p.13.370 disminuye significativamente de pacientes sanos sobre pacientes con adenoma colorrectal a pacientes con cáncer colorrectal. En combinación con una segunda proteína marcadora (MW 8,960 Da, fracción no. 1), la separación de pacientes sanos de los pacientes con adenoma/carcinoma se mejoró significativamente. 30 pacientes sin adenoma/carcinoma (sanos) , 20 de 29 pacientes con adenoma colorrectal así como 20 de 28 pacientes con carcinoma colorrectal se separaron correctamente. Con esta combinación, se lograron una sensibilidad de 70% y una especificidad de 100%. Identificación de transtiretina
Usando pruebas de captura de inmunoafinidad e inmunoprecipitación, la proteína 13,770 Da se identificó como transtiretina. Captura de inmonoafinidad de pastilla de Proteína de transtiretina La captura de inmunoafinidad se realizó usando una Protein G Array (Ciphergen Biosystems, Inc.), siguiendo el protocolo del fabricante. El anticuerpo A0002 de anti-transtiretina policlonal de conejo (Dako, Hamburgo, Alemania), diluida a una concentración de 0.2 ug/ul en PBS. 2 ul por punto se aplicaron con pipeta en la disposición y subsecuentemente se incubaron durante 24 ha 4QC en una cámara humidificada. El anticuerpo no ligado se separó lavando con tampón de lavado (0.5% (v/v) Tritón X-100 en PBS. Después de secar, la disposición se insertó en un bioprocesador (Ciphergen Biosystems, Inc.), para incubación de muestra. Fracciones de 2 ul de suero que contienen cantidades elevadas y bajas de la proteína 13.770 Da
(pacientes con adenoma/carcinoma colorrectal contra pacientes sanos) se añadieron a la pastilla y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente en un agitador horizontal. Después de lavar con PBS y tampón HEPES, la disposición se secó al aire durante 10 minutos y se añadieron 0.6 ul de matriz de ácido sinapínico saturado a cada punto. La disposición se midió usando los siguientes
parámetros: la intensidad láser se ajustó a 185, la sensibilidad a 7. El régimen de tamaño de detección se ajustó a entre 200 y 200,000 Da, el láser se enfocó a 10,000 Da. Después de enlazarse a la disposición revestida con anticuerpo, cuadro crestas de proteína de diferente peso molecular (aproximadamente 13,761 Da, 13,914 Da, 14,102 Da y 14,292 Da) se habían identificado, sugiriendo que la transtiretina ocurre en diferentes variantes moleculares. La Figura 5 muestra una comparación de las intensidades de señal entre un paciente sano y un paciente con carcinoma. Finalmente, se llevó a cabo una inmunoprecipitación. 50 ul de suero de la fracción 4 de diferentes pacientes se incubaron con 15 ul (6.75 ug) del anticuerpo policlonal contra transtiretina durante 2 horas a 4°C. Se realizó un control negativo en la misma forma sin anticuerpo. 50 ul de agarosa de proteína A/G (pierce, Rockford, IL) se añadieron y se incubaron a 4°C durante la noche. Después de centrifugación a 3300 xg, los sobrenadantes se separaron y almacenaron separadamente. El granulo se suspendió nuevamente en 20 ul de tampón (9M urea, 2% Chaps, 50 mM Tris-HCL, pH 9) para separar la proteína de la agarosa de proteína A/G. El precipitado así como el sobrenadante se diluyeron 1:10 en tampón de enlace
CM10. Tres proteínas con diferentes pesos moleculares (13,776 Da, 13,884 Da, 14,103 DA) se inmunoprecipitaron con un anticuerpo de anti-transtiretina. De la Figura 6 se puede ver que en el sobrenadante, la cantidad de dos variantes (13.776 Da y 13.884 Da) fue significativamente reducida, mientras que la cantidad con la variante con el peso molecular más elevado (14,103 Da) permaneció sin cambiar. Esto muestra que las cadenas de proteína de transtiretina que tienen un peso molecular de alrededor de 13,776 Da y alrededor de 13,884 Da son biomarcadores importantes para la detección de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal.