CN101014861A - C3a及其衍生物作为结肠直肠腺瘤/或结肠直肠癌的生物标志的用途；使用同样生物标志的诊断方法和测试系统 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的方法，其包括以下步骤：a)提供取自个体的分离的样品材料，b)确定在所述的分离的样品材料中C3a或其衍生物的水平，c)比较确定的C3a或其衍生物的水平和一个或多个参考值。本发明还涉及区分结肠直肠腺瘤和结肠直肠癌的方法；以及监测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的过程，和/或结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的治疗的方法。此外，本发明涉及用于这些方法中的测试系统和阵列。此外，本发明涉及C3a作为检测个体中结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的生物标志的用途。另外，本发明涉及确定化合物在治疗结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌中是否有效的方法。
Description
本发明涉及检测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的领域。
在世界范围内，结肠直肠癌是第三大常见(9.4％)的癌。在2003年内，全世界诊断出了将近945000个新的结肠直肠癌病例并且大约492000个人死于该疾病。结肠直肠癌的发病率在增加而结肠直肠癌的死亡率在降低。结肠直肠癌的发病率随着年龄增加，开始于大约40岁，并且男性的发病率比女性高(每年每100000人中，男性为40.6而女性为30.6)(世界癌症报告(World cancer report)，2003，Ed.BW.Stewart和P.Kleihues.IARC Press，Lyon)。
在大多数患者中，结肠直肠癌的发展经历了多级进展，从癌变前的腺瘤到具有转移倾向的侵染性恶性肿瘤。有证据表明，降低结肠直肠癌的发病率和死亡率可以通过检测和治疗早期结肠直肠癌以及鉴定并除去作为结肠直肠癌前体的结肠直肠腺瘤性息肉来实现。
目前已经表明只有侵入性结肠直肠筛选测试如结肠镜检查法能够实现对早期结肠直肠癌及其前体(即腺瘤性息肉和/或扁平的瘤区域)的检测。多种测试可作为用于结肠直肠癌筛选的选择。该筛选测试包括粪便潜血试验(FOBT)、软乙状结肠镜检查法、FOBT和软乙状结肠镜检查与结肠镜检查法的组合。各种筛选测试在施行、效力、可能的筛选频率、测试复杂性、成本和患者的接受上是不同的。
在成本-效力方面，现在认为用粪便潜血试验筛选是最好的筛选方法。通过血红素卟啉(hemeporphyrin)或免疫方法，用化学剂如愈创树脂检测粪便中的潜血。获自SmithKline Diagnostics的愈创树脂载玻片测试潜血检测试纸(Hemoccult)(II)使用最广泛。
多种技术因素影响了它的临床施行。对于结肠直肠癌，潜血检测试纸具有大约50％的灵敏度以及98％的特异性，但是其对于息肉的灵敏度却很低，大约为10％(Simon JB.(1998)Gastroenterologist 6：66-78.Review)。潜血筛选的另一个大缺点是预测的精确性很差，只有10％的阳性反应证明是由于结肠直肠癌(Simon JB.(1998)Gastroenterologist 6：66-78.Review；Mandel JS等人(1999)J.Natl.Cancer Inst.91：434-437；Hardcastle JD等人(1996)Lancet 348：1472-1477；Kronborg O等人(1996)Lancet348：1467-71；Winawer SJ等人(1997)Gastroenterology 112：594-642；Fletcher RH(1998)N.Engl.J.Med.338：1153-1154)。
此外，粪便潜血检测实验只有在疾病发展到某些阶段后才能提供结果。希望有允许在更早的时间检测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的测试系统。
最近开发的免疫测试通常具有高灵敏度，但是其较差的特异性仍是严要的问题。其他方法如对粪便样品KRAS癌基因和p53蛋白质的遗传测试还不是成本有效的，并且灵敏度低(Calistri D等人(2003)Clin.Gastroenterol.Hepatol.1：377-383；Schoen RE(2002)Nat.Rev.Cancer2：65-70)。
内窥镜检查法(Kavanagh AM(1998)Cancer Causes Control9：455-462)(使用软乙状结肠镜或结肠镜)(Lieberman DA(1997)Gastroenterol.Clin.N.Am.26：71-83)是最确定的检测方法，但是具有局限性。
已认识到对于扁平瘤病变的假阴性率，并且其保持较高(Kudo S(1997)Gastrointest.Endosc.Clin.N.Am.7：87-98.)。结肠镜检查法允许对直径为至少10mm的息肉状病变进行结肠检查，具有低的假阴性率。因为此原因，在阴性评估或息肉切除后至复查前可有相对较长的间隔，其中阴性评估后间隔高达10年，息肉切除后间隔高达5年。
但是，在结肠镜检查后听从此类复查建议的患者很少。此外，结肠镜检查昂贵而麻烦。考虑到普遍检查的高成本和人们对结肠镜检查的接受性，此类检查方法具有有限的应用。
通过多种方法可以对收集的分离组织样品进行结肠直肠癌检测并对其前体，结肠直肠腺瘤进行测试。DE 197 11 111A公开了体外确定上皮内结肠细菌、其成分及反应产物的方法。使用组织样品中HERG基因表达的另一种方法公开在DE 102 24 534中。
血液样品中CEA-(癌胚抗原)-水平已经用来检测结肠癌。但是CEA水平并非在结肠癌中特异性升高，已经表明其还在患有其他恶性疾病(例如胃、胰、乳房和肺的癌)以及患有多种非恶性病症(例如酒精肝疾病、炎性肠疾病、严重烟瘾、慢性支气管炎和胰腺炎)的患者中升高。(PosnerMR，Mayer RJ：The use of serologic tumor markers in gastro intestinalmalignancies.Hematol Oncol Clin North Am 8：533，1994)。此外，在结肠腺瘤中CEA水平不升高。
本发明的目的是提供可用于结肠腺瘤和/或结肠癌早期检测的方法。
另一个目的是提供通过非侵入方法，可用于选择性和特异性检测结肠腺瘤和/或结肠癌的方法。
另一个目的是提供可用于结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌检测中的生物标志。
本发明的另一个目的是提供成本有效并可广泛使用的检测结肠直肠腺瘤或结肠直肠癌的测试系统。
此外，该测试系统应当是易于操作的，并且对于待检测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的个体来说是更加方便的。
本发明另一个的目的是提供用于确定化合物在治疗结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌中是否有效的筛选系统。
本发明的主要目的是通过使用C3a或其衍生物作为在个体中检测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的生物标志来解决的。检测可以在体内和体外进行。根据优选的实施方案，检测在体外进行。
该目的另外通过检测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的方法来解决，其包括下列步骤：
a)提供取自个体的分离的样品材料，
b)确定所述分离的样品材料中C3a或其衍生物的水平，
c)比较确定的C3a或其衍生物的水平和一个或多个参考值。
该目的另外通过区分结肠直肠腺瘤和结肠直肠癌的方法来解决，其包括下列步骤：
a)提供取自个体的分离的样品材料，
b)确定所述分离的样品材料中C3a或其衍生物的水平，
c)比较确定的C3a或其衍生物的水平和一个或多个参考值。
该目的另外通过监控结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的发展和/或过程和/或治疗的方法来解决，其包括下列步骤：
a)提供取自个体的分离的样品材料，
b)确定所述分离的样品材料中C3a或其衍生物的水平，
c)比较确定的C3a或其衍生物的水平和一个或多个参考值。
在优选的实施方案中，调控手术或治疗方法的效力来决定是否完全除去结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌。在另一个实施方案中，调控用一种或多种化学物质、抗体、反义RNA、辐射例如X射线，或其组合对结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌患者的治疗，从而调控治疗的效力。
该目的也可通过提供用于在个体样品中检测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的测试系统来解决，该测试系统包括：
a)结合到C3a或其衍生物的表位的抗体或受体，
b)支持所述的抗体或受体的固相支持物，
c)检测所述C3a或其衍生物的表位与所述抗体或受体的结合的试剂。
该目的另外通过提供阵列来解决，所述阵列包含用于在个体中检测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的检测分子，该解决方法包含下列作为检测分子：
a)固定到固相支持物上的核酸探针，所述核酸探针用于结合和检测编码C3a或其衍生物的mRNA，和/或结合和检测C3a蛋白质或其衍生物，或
b)固定到固相支持物上用于结合和检测C3a或其衍生物表位的抗体，或
c)固定到固相支持物上用于结合和检测C3a或其衍生物表位的受体，
其中每种不同量的检测分子优选固定到固相支持物上，以增加量化的精确性。
核酸探针例如选自单链或双链DNA或RNA、适配体及其组合。适配体是单链的寡核苷酸，其采取了特异性的、序列依赖的形状，并且高特异性和亲和性的结合蛋白质靶标。使用SELEX方法鉴定适配体(Tuerk C.和Gold L.(1990)Science 249：505-510；Ellington AD和Szostak JW.(1990)Nature 346：818-822)。
该目的另外通过确定化合物在治疗结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌中是否有效的方法来解决，其包括下列步骤：
a)用化合物治疗结肠直肠腺瘤或结肠直肠癌，
b)在所述患者的样品材料中确定C3a或其衍生物的水平，并且
c)比较确定的C3a或其衍生物的水平和一个或多个参考值。
优选的实施方案在从属权利要求中详细说明。
根据本发明，术语“样品材料”也称作“样品”。
根据本发明，术语“生物标志”意指结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌发病的蛋白质或蛋白质片段或核酸。这意指“生物标志”用作检测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的方法。
术语“个体”意指哺乳动物。优选的，哺乳动物是例如作为患者的人。
术语“健康个体”意指未患结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的个体。那就是说，术语“健康个体”仅用在结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的病理情况方面，但是不排除患有除结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌之外的其他疾病的个体。
术语“其衍生物”意指在DNA、mRNA或蛋白质水平上的任何修饰，包括例如截短的基因、所述基因的片段、突变的基因或修饰的基因。术语“基因”包括核酸序列，如DNA、RNA、mRNA或者蛋白质序列或寡肽序列或肽序列。衍生物可以是作为基因缺失、置换或插入的结果的修饰。基因修饰可以是天然存在的基因变异的结果。术语“天然存在的基因变异”是指不是基因工程结果的修饰。基因修饰可以是作为加工体内和/或降解产物中基因或基因产物的结果。蛋白质水平的修饰可以是由于体内的酶促修饰或化学修饰。例如修饰可以是糖基化或磷酸化或法尼基化。优选的，衍生物编码或包括未修饰蛋白质的至少5个氨基酸、更优选包括10个氨基酸，最优选包括20个氨基酸。在一个实施方案中，衍生物编码各自蛋白质的至少一个表位。
本发明中所使用的术语“C3a或其衍生物”还包括截短的C3a、C3a的片段、突变的C3a、修饰的C3a或前体C3(图1，SEQ ID No.1)或C3的片段。在一个实施方案中，衍生物和序列SEQ-ID-No.2(图2A，SEQ IDNo.2)的蛋白质序列同一性为80％、优选为90％，更优选为98％。“C3a”的修饰可以是酶促修饰或化学修饰。具体地，术语C3a或其衍生物特别包括截短的C3a蛋白质，其优选具有范围在8,950±25Da内的分子量，更优选具有范围在8,950±20Da内的分子量。在优选的实施方案中，截短的C3a蛋白质具有8,939Da的分子量。优选的，C3a蛋白质没有C端精氨酸并且其任选具有范围在8,950±20Da内的分子量。在一个实施方案中，C3a衍生物是C3a-desArg(图2B，SEQ ID No.3)。在一个实施方案中，C3a衍生物是通过肥大细胞-类胰凝乳蛋白酶切割C3a得到的。在另一个实施方案中，C3a是通过C3转变酶切割C3得到的。
C3a属于过敏毒素类。C3a、C4a和C5a是补体系统的丝氨酸蛋白酶的蛋白水解产物。C3a(SEQ-ID-No.2)衍生自补体激活过程中血液补体系统的第三个成分(C3)(SEQ-ID-NO.1)。C3a是具有局部效力的激素。C3a中大约40％的氨基酸残基包括在螺旋构象中。血清过敏毒素参与多种细胞免疫应答，并且是有效的促炎剂。C3a产物有效作用于血管壁、平滑肌的收缩和血管通透性的增加上。C3a中的C端精氨酸对其生物活性非常重要。过敏毒素受到在几秒内移除羧基端精氨酸的羧基肽酶N(过敏毒素灭活剂)的调控。此机制将完整的过敏毒素转变为活性较低的C3a-desArg形式(SEQ ID No.3)。
术语“表位”意指允许抗体、抗体片段、蛋白质、肽结构或者受体特异性结合于蛋白质或肽的任何结构元件，或者任何蛋白质结构。
本发明的方法用样品材料如已经从人体分离的体液或组织样品来进行。随后将样品材料分级分离和/或纯化。例如，可以将待测样品材料储存在冷冻设备中，并且在适当的时间点解冻各个样品材料后进行本发明的方法。
本发明人惊讶的发现蛋白质C3a或其衍生物可用作检测结肠直肠腺瘤/或结肠直肠癌的生物标志。发明人现在已经惊讶的发现体液中蛋白质C3a或其衍生物的水平在患有结肠直肠腺瘤/或结肠直肠癌的个体中升高。此外，体液中蛋白质C3a或其衍生物水平可以用来将健康人从患有结肠直肠腺瘤/或结肠直肠癌的人中区分出来，并且将患有结肠直肠腺瘤的人从患有结肠直肠癌的人中区分出来。
根据本发明，样品材料可以是组织、细胞或体液。优选的样品材料是体液，例如血液、血浆、血清、骨髓、粪便、滑液、淋巴液、脑脊液、唾液、尿、母乳、精液、溢沁物及其混合物。在优选的实施方案中，体液用阴离子交换层析分级分离。例如C3a蛋白质在pH9.0下洗脱。例如运甲状腺素蛋白(p13,776)在pH 4.0下洗脱。
优选的，体液在进行本发明的方法前已经分离。本发明的方法优选是由实验室技术人员在体外进行。
根据本发明优选的实施方案，C3a在血浆或血清中测量。可以通过从待医学检查的个体中取得血液，并且从凝固血中分离上清液来容易的得到血清。
体液(优选是血清)中C3a或其衍生物的水平随着结肠直肠腺瘤的渐进形成而更高。结肠直肠腺瘤是可以变成恶性的良性肿瘤。当从良性结肠直肠腺瘤发展为结肠直肠癌时，体液(优选是血清)中C3a或其衍生物的水平进一步升高。
在结肠直肠腺瘤转化成结肠直肠癌后，患病个体的病理情况会通过转移的形成而进一步恶化。
本发明提供了可用于检测在早期并且仍处于良性期的瘤疾病、早期或良性期和/或肿瘤早期的瘤疾病的早期生物标志。早期检测能够使医生及时移除结肠直肠腺瘤并且显著增加个体存活的几率。
此外，本发明可用于长时期(例如几年)监测体液如血清中C3a或其衍生物的水平。
长期监示可用于区分健康个体和结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌。可以常规(如一年一次或两次)检测C3a或其衍生物的水平。如果检测到了C3a或其衍生物水平增加，这就指示了结肠直肠腺瘤和/或早期结肠直肠癌。之后C3a或其衍生物水平的进一步增加指示转化为恶性结肠直肠癌。
此外，可以监测疾病和/或治疗的过程。如果C3a或其衍生物的水平进一步增加，例如在移除结肠直肠腺瘤后，即这指示了病理情况的恶化。
这意味着C3a或其衍生物的水平是检测和/或监测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的重要的临床参数。在结肠直肠腺瘤发病后体液中的C3a或其衍生物的水平就升高。因此，C3a或其衍生物水平是可用于疾病的早期诊断以及随后的早期治疗的重要的临床参数。在优选的实施方案中，具有升高的C3a或其衍生物水平的患者随后用结肠镜检查法来检查。
用于检测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的本发明方法包括以下步骤：提供取自个体的分离的样品材料，之后确定在分离的样品材料中C3a或其衍生物的水平，并且最终比较确定的C3a或其衍生物的水平和一个或多个参考值。在一个实施方案中，可以在取自个体的分离的样品材料中另外检测一个或多个其他的生物标志，确定生物标志的水平并将其和一个或多个不同的参考值对比。
参考值可计算为在健康个体或患有结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的个体的多个分离的样品中确定的C3a或其衍生物的平均水平。可以将该参考值设立为认为是健康个体，或患有结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌个体的标准值的范围。然后，范围内的特定值可以指示健康情况或结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的病理情况。可以按照建立任何其他医学参数如血糖范围的方法，通过取得健康个体体液样品(如血清样品)的统计相关数来建立参考值的这个范围。优选的，计算出称作阴性对照和阳性对照1的2个参考值。阴性对照的参考值从健康个体中计算出来，并且阳性对照的参考值从患有结肠直肠腺瘤或结肠直肠癌的个体中计算出来。更优选的，计算出称作阴性对照、阳性对照1和阳性对照2的三个参考值。阳性对照1可以从患有结肠直肠癌的个体中计算出来，并且阳性对照2可以从患有结肠直肠腺瘤的个体中计算出来。
在本发明的另一个实施方案中，参考值可以是个体参考值，所述个体参考值计算为一定时期内，取自个体的多个分离的样品中所确定的C3a或其衍生物的平均水平。
当长时期(如几月或几年)监控C3a或其衍生物水平时，可以建立个体平均水平。例如可以从与测量血糖相同的血清样品中测量C3a或其衍生物的水平，并且使用它来建立用于特异性检测任何个体C3a或其衍生物水平增加的个体校准曲线。
其他生物标志的参考值也可以按照为C3a所描述的同样的方式计算。C3a或其他生物标志的平均水平可以是平均数水平或中值水平。
在本发明的另一方面，还提供了检测个体的分离的样品材料中结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的测试系统。此测试系统是基于抗体或受体特异性结合到C3a或其衍生物或其片段的表位或适当的结构元件的特异性。受体可以是能特异性结合到C3a或其衍生物的任何结构。受体可以是，例如抗体片段如Fab或F(ab’)2片段，或能够特异性结合到C3a或其衍生物的任何其他蛋白质或肽结构。
将抗体、抗体片段或受体结合到固相支持物如塑料表面或小珠上，以允许结合和检测C3a或其衍生物。例如，常规微量滴定板可以用作塑料表面。例如通过使用可检测基团标记的二级抗体来实现对C3a或其衍生物结合的检测。可检测基团可以是例如放射性同位素，或者通过添加适当的底物以产生例如颜色或荧光信号来检测的酶，如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
测试系统可以是免疫测定，如酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA)或发光免疫测定(LIA)。但是也可以使用任何其他的使用抗体或抗体片段特异性的免疫测试系统，如Western印迹或免疫沉淀法。
本发明还提供了包含用于检测个体中结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的检测分子的阵列，其中检测分子可以是固定到固相支持物的核酸探针，所述核酸探针用于结合和检测编码C3a、片段、突变、变体或其衍生物的mRNA，或固定到固相支持物用于结合和检测C3a或其衍生物表位的抗体，或者固定到固相支持物用于结合和检测C3a或其衍生物表位的受体。优选的，阵列另外包括作为检测结肠直肠腺瘤和结肠直肠癌的生物标志的检测分子。
核酸探针可以是任何天然存在或合成的寡核苷酸或化学修饰的寡核苷酸，以及cDNA、cRNA、适配体等。
备选的，本发明还包括逆阵列，其包含固定到固相支持物上的患者样品，所述患者样品可以被上述定义的检测分子检测。
优选的，阵列包含固定到固相表面可识别的位置上的检测分子。
本发明所用的术语“阵列”指的是组合或排列，而不必是规律的排列。阵列优选包含至少2套、更优选包含5套不同的检测分子或患者样品。优选的，本发明的阵列至少包含50套检测分子或患者样品，更优选包含至少100套检测分子或患者样品。根据本发明的另一个实施方案，本发明的阵列至少包含500套检测分子或患者样品。检测分子可以是例如核酸探针或抗体或受体。
描述的阵列可以用于本发明的测试系统。阵列可以是微阵列或巨阵列。
将检测分子固定到固相表面或支持体或固相支持物表面。然后通过杂交从患者样品制备的核酸探针，或者通过将阵列与从患者样品制备的蛋白质探针接触，来筛选此阵列或微阵列。
支持体可以是聚合材料如尼龙或塑料或者无机材料如硅，例如硅片或陶瓷。根据优选的实施方案，玻璃(SiO2)可用作固相支持物材料。玻璃可以是玻璃载玻片或玻璃芯片。根据本发明的另一个实施方案，玻璃底物具有原子平面。
例如，阵列可以包含能特异性结合到C3a或其衍生物的mRNA的固定的核酸探针，或者特异性结合存在于体液(如血清)中的C3a蛋白质或其衍生物的抗体。另一个优选的实施方案是通过编码C3a的mRNA或编码C3a衍生物的mRNA的逆转录来产生cDNA，并且用所述的阵列特异性检测各自cDNA的量。该阵列技术是技术人员已知的。可以通过对比所测量的值与已知量的C3a或其衍生物的mRNA或cDNA或蛋白质的标准曲线或校准曲线，分别量化所测量的mRNA或cDNA或蛋白质。
优选的，将每种不同量的检测分子固定在固相支持物上，以用于对C3a或其衍生物水平的精确量化。
根据本发明的另一个实施方案，通过质谱分析来确定C3a或其衍生物的水平。
根据C3a或其衍生物的分子量，质谱分析可用于特异性的检测C3a或其衍生物，并且非常容易的量化C3a或其衍生物的量。
本领域已知的质谱分析中的任何适当的离子化方法可以用来离子化C3a或其衍生物分子、片段、突变、变体或其衍生物。离子化方法包括电子碰撞(EI)、化学电离(CI)、场致离子化(FDI)、电喷射离子化(ESI)、激光解吸离子化(LDI)、基质辅助激光解吸离子化(MALDI)和表面增强激光解吸/电离(SELDI)。
本领域已知的质谱分析中的任何适当检测方法可以用来确定C3a或其衍生物的分子量。检测方法包括四级质谱分析(QMS)、傅里叶变换质谱分析(FT-MS)和飞行时间质谱分析(TOF-MS)。
优选的，质谱分析是表面增强激光解吸电离-飞行时间-质谱分析(SELDI-TOF-MS)。在进行SELDI-TOF-MS之前，优选将分离的样品中的C3a或其衍生物固定到具有活化表面的芯片或固相支持物上。活化表面优选包括固定的抗C3a或其衍生物的抗体，如兔多克隆抗体。在C3a或其衍生物结合到抗体上后，在SELDI-TOF质谱仪中进行飞行时间分析，它给出了用于确定C3a或其衍生物水平的强度信号。
此外，质谱分析可用于同时检测与结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌检测相关的其他蛋白质。
在本发明的实施方案中，可以通过另外检测其他生物标志来增强结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌检测的灵敏度和/或特异性。具体地，在一个实施方案中，通过检测另一个蛋白质或核酸与C3a或其衍生物的组合来增强结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌检测的灵敏度和/或特异性。
优选的，通过检测C3a及其衍生物与运甲状腺素蛋白及其衍生物的组合来增加本发明方法、阵列、测试系统和用途的灵敏度和特异性。
本发明所用的术语“运甲状腺素蛋白或其衍生物”还包括截短的运甲状腺素蛋白、运甲状腺素蛋白的片段、突变的运甲状腺素蛋白或修饰的运甲状腺素蛋白。“运甲状腺素蛋白”的修饰可以是由于酶促修饰或化学修饰。此外，术语“运甲状腺素蛋白”还用来表示运甲状腺素蛋白的单体形式或多聚体形式。例如，术语“运甲状腺素蛋白”特别包涵通常作为同型四聚体蛋白质运甲状腺素蛋白的一部分的单体蛋白质链。
运甲状腺素蛋白还可以称作前白蛋白。运甲状腺素蛋白是分子量为大约54,000Da，主要在肝脏中合成的四聚体蛋白质。运甲状腺素蛋白通常是包含了四条蛋白质链(每条具有分子量为大约14,000Da)的同型四聚体。使用质谱分析，发明人已经检测出了具有分子量为13,776Da、13,884Da或14,103Da等的运甲状腺素蛋白蛋白质链的多个变体。发明人已经发现，在结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌发病的情况下，体液(如血清)中具有分子量为13,776Da和13,884Da的运甲状腺素蛋白分子变体的水平尤其降低。
在本发明的另一实施方案中，通过另外检测p53、CEA(癌胚抗原)和/或CA 19-9、CA15-3、Kras、突变的E-钙黏着蛋白、β-联蛋白或其衍生物与C3a或其衍生物的组合来增强结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌检测的灵敏度和/或特异性。
在本发明另一实施方案中，通过另外检测在DNA错配基因(例如MSH2、MSH3、MLH1、PMS1、PMS2、MSH6)中的突变、例如MHL1或MSH2之类的微卫星不稳定性、SNP(单核苷酸多态性)或C-反应蛋白血浆浓度来增强检测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的灵敏度和/或特异性。
在本发明的另一实施方案中，通过检测CA15-3、CA-125和/或Her-2/neu与C3a或其衍生物的组合来任选增强结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌检测的灵敏度和/或特异性。CA15-3是癌胚抗原，在多种癌中表达，并且通常及其他肿瘤标记一起测量。CA 15-3和CA-125主要是乳腺癌(但是也有内脏转移)的前兆指示物。乳腺癌中的Her-2/neu的扩增与不良预后、短的无瘤间隔和短的存活时间相关。至今，关于Her-2/neu的扩增起始点和进展知之甚少。
在优选的实施方案中，通过生物标志C3a与运甲状腺素蛋白或其衍生物组合来检测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌。这可以使得结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的检测具有增加的灵敏度和/或特异性。此外，由于检测方法是非侵入性的，患者很好的接受该检测方法。
按照下列定义灵敏度和特异性：
灵敏度是真正阳性患者的数量(％)相对于所有患者数量(100％)。患者是具有结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的个体。
特异性是真正阴性个体的数量(％)相对于所有健康个体的数量(100％)。
备选的，灵敏度和特异性可以按照下列公式定义：
诊断
+ -
测试 + TP FP
- FN TN
TP：真正阳性(测试阳性，诊断正确)；
FP：假阳性(测试阳性，诊断不正确)；
TN：真正阴性(测试阴性，诊断正确)；
FN：假阴性(测试阴性，诊断不正确)；
灵敏度按照下列公式计算：
TP/(TP+FN)
而特异性按照下列公式计算：
TN/(TN+FP)
对选自健康个体、结肠直肠腺瘤患者和/或结肠直肠癌患者的多个分离的样品，计算选自TP、FP、TN、FN的每个分析组的结果。TP、FP、TN、FN涉及分别与真正阳性、假阳性、真正阴性、假阴性状况相关的个体的数量。
本发明的方法可以和检测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的其他诊断方法组合进行，以整体增加灵敏度和/或特异性。C3a的检测可用于结肠直肠腺瘤的极早期检测并且可以因此用作极早期标记。
优选的，本发明的方法作为早期检测和/或监测方法进行。如果本发明方法的结果要指示结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠腺瘤的发病，那么应当进行其他的检查，如结肠镜检查。
当进行本发明时，可以使用下列多克隆抗运甲状腺素蛋白抗体和C3a抗体：
·抗运甲状腺素蛋白：来自The Binding Site Ltd.，Birmingham，英格兰的PC 066和来自DAKO，Hamburg，德国的A 0002。
·抗C3a-desArg：可用于Quidel immunoassay(Quidel Corporation，10165 McKellar Court，San Diego，CA 92121，美国)。
本发明还提供了确定化合物在治疗结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌中是否有效的方法。
用于确定化合物在治疗结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌中是否有效的方法包括下列步骤：
a)用化合物治疗结肠直肠腺瘤或结肠直肠癌，
b)确定所述患者的样品材料中C3a或其衍生物的水平，
c)比较确定的C3a或其衍生物的水平和一个或多个参考值。
本申请所用术语“患者”包括人以及非人类，如动物。动物优选选自啮齿动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠，以及其他动物如豚鼠、兔、野兔、狗和猪。
为了研究目的，这些动物可用以特异性诱导某些疾病状态，所述疾病例如结肠直肠腺瘤和结肠直肠癌。所述疾病状态的诱导可例如通过处理动物(例如用已知的放射性物质或化学物质来诱导结肠直肠癌或结肠直肠腺瘤疾病状态)来实现。疾病状态还可以使用病毒转染系统来诱导。还可以使用遗传修饰的动物(其中的一个或多个特定的基因功能被改变)，或敲除动物如基因敲除小鼠(其中缺失了特定的基因功能)。
“化合物”可以是一个或多个化学物质、抗体、蛋白质、肽、反义mRNA、小分子药物或其组合。化合物还可以被辐射例如X射线所替代，或者可以使用化合物和辐射的组合。
可以通过上面描述的检测技术确定在所述患者的样品材料中，C3a或其衍生物的水平。
下列附图和实施例仅用于说明目的。本发明不解释为受到下列实施例的限制。
附图
图1显示了C3蛋白质的序列。
图2显示了(A)C3a蛋白质序列和(B)C3a-desArg蛋白质序列。
图3显示了血清样品的分级分离和分布的示意图。
图4显示了使用ELISA对C3a-desArg的量化。将来自非癌(n＝28)、腺瘤(n＝28)和结肠直肠癌患者(n＝28)的血清样品在Quidel C3a EnzymeImmunoassay中平行测定。(A＝腺瘤组、N＝健康对照组、T＝癌组)
图5显示了通过A)ELISA和B)SELDI-TOF MS对C3a-desArg的分析。在腺瘤和癌组中的平均C3a-desAg浓度显著高于非癌对照组。(A＝腺瘤组、N＝健康对照组、T＝癌组)
图6显示了通过A)径向免疫扩散和B)SELDI-TOF MS分析对运甲状腺素蛋白的量化。腺瘤和癌组中的平均运甲状腺素蛋白的浓度显著低于非癌对照组。此外，按照径向免疫扩散所测量的，在癌组中平均运甲状腺素蛋白的浓度显著低于腺瘤组。(A＝腺瘤组、N＝健康对照组、T＝癌组)
图7显示了SELDI-TOF MS和免疫测定数据的相关性。用ELISA分析C3a-desArg(A)，用径向免疫扩散分析运甲状腺素蛋白(B)。
实施例
除非另外说明，所有方法按照分析系统厂商的方法进行。
血清收集和血清分级分离
收集和研究了来自三组人类患者的血清。
组1由28位患者组成，他们是手术治疗了非癌疾病，如腹股沟疝、胆囊结石或憩室炎的患者。组1的这些个体作为健康个体组，即未有患结肠直肠腺瘤和/结肠直肠癌的那些。
组2由28位患者组成，他们都是手术治疗了不确定肿瘤(经证实是良性结肠直肠腺瘤)的患者。
组3由28位患者组成，他们是具有结肠直肠肿瘤的患者。所有的这28位患者患有TNM III期(肿瘤(T)、结节(N)、转移(M)III期)结肠直肠癌。
已经严格确定了道德方针和患者的机密性，并且所有的患者书面同意参与此研究。所有患者进行了相似的手术前准备，如禁食时间和手术时用药。
根据厂商说明，通过阴离子交换层析(血清分级分离试剂盒/QHyperD树脂，Ciphergen Biosystems，Inc.)，使用96孔形式的自动化方法(Biomek2000，Ciphergen)分级分离来自每个患者的血清，以减少最丰富蛋白质的一些干涉。如在图3所示，分级分离产生了6个级分，其含有基于蛋白质pI值的粗糙分离蛋白质。C3A-desArg蛋白质(p8,960Da)在pH9.0洗涤溶液(具有0,1％OGP(辛基-β-D-吡喃葡糖苷)的50 mMTris-HCl，pH 9.0)下随级分1洗脱下来(根据Ciphergen Biosystems Inc.expression difference mapping kit-serum fractionation cat.no K100-0007所定义的条件)。运甲状腺素蛋白(p13,776)在pH4.0(具有0.1％OGP的100mM乙酸钠，pH 4.0)下随着级分4洗脱下来(根据CiphergenBiosystems Inc.expression difference mapping Kit-serum fractionation cat.no K100-0007所定义的条件)。
SELDI-TOF-MS分析
根据厂商的方案，将CM10蛋白质阵列在生物处理器(CiphergenBiosystems，Inc.)中处理。用CM10结合缓冲液(Ciphergen Biosystems，Inc.)将芯片平衡2×5分钟，随后用血清级分(在CM10结合缓冲液中1∶10稀释)温育芯片。45分钟后移除未结合的材料，将芯片用CM10结合缓冲液洗涤3次并用水洗涤2次。在室温下干燥10分钟后，2次加入0.05M的芥子酸(1.0μl)并且用Ciphergen Protein ChipReader(模型PBSII)分析芯片。
Protein ChipReader是飞行时间质谱仪。将所检测蛋白质的质量值和信号强度转移到Ciphergen提供的软件中。所述软件通过ProteinChipData Analysis Program和Biomarker Wizard Program进一步深入分析。
为了使数据变异性最小化，在2天内，使用随机分布在芯片上的来自所有患者组的样品进行测量。作为标准化的标准对照，集中的正常血清用作于所有测量的平行。
通过使用激光强度为185的195个激光喷射的均数，产生蛋白质的质谱。探测器在灵敏度为7下运行。为了获得数据，设定检测大小范围是2,000Da和40,000Da。将激光聚焦在10,000Da。用ProteinChip Data AnalysisProgram(版本3.1，Ciphergen Biosystems)及Biomarker Wizard Program(版本3.1，Ciphergen Biosystems)分析数据。将峰强度标准化为总离子电流。应当注意的是，在测量和测量之间所测量的分子量可以不同，并且它可以取决于所使用的质谱仪器的特定性质。C3desArg所测量的分子量可以在8,950±25Da的范围内。
C3a ELISA分析
为了量化血清中C3a-desArg片段，使用Quidel的酶免疫测定(QuidelCorporation，10165 McKellar Court，San Diego，CA 92121，美国)。根据厂商的说明进行ELISA。
试剂盒中包含的微量滴定带用对人C3a-desArg特异性的单克隆抗体(包括在Quidel的免疫测定中)包被。1∶500稀释样品并且在18-25℃下温育一小时。在此温育过程中，样品中的C3a-desArg将结合到单克隆抗体上。冲洗去未结合的天然C3后，使用过氧化物酶缀合的兔抗C3a检测结合的C3a-desArg。通过洗涤步骤将过度的缀合移除，并且使用过氧化物酶反应和标准曲线量化血清样品中C3a-desArg的量。
用于量化运甲状腺素蛋白的径向免疫扩散
在临床服务实验室中进行径向免疫扩散测定(Tina-QuantPrealbumin assay，Immunoturbidometric assay for the determination ofprealbumin，Roche diagnostics GmbH，Mannheim，德国，目录号11660519)。将血清加到在凝胶基质中切出的含有均一浓度单特异性抗体的圆拄孔中。置于孔中的抗原径向扩散，产生了沉淀素环。可以在过夜温育后的任何时间或终点数出沉淀素环。通过对比样品产生的沉淀素环和已知浓度的标准品产生的沉淀素环的直径，测定结果。
数据的统计计算
对于三个患者组，通过C&RT(CART)算法，在决策树分析的基础上计算出临界值(Breiman，L.，Friedman，J.H.，Olshen，R.A.，& Stone，C.J.(1984).Classification and regression trees.Monterey，CA：Wadsworth &Brooks/Cole Advanced Books & Software)。已经计算出了临界值以选择和确定不同分析组之间的限制值(limiting value)。用STATSOFT INC的STATISTICA软件，版本7.1进行计算，用Data-Miner Modulsubprogramm Standard Classification Trees(CAndRT)(StatSoft，Inc.(2005).STATISTICA(数据分析软件系统)，版本7.1.www.statsoft.com)进行决策树分析。
在平均值和标准差的基础上计算统计数据。另外，附图显示了平均值±95的置信区间，说明在此区间中有95％的可能性找到预测患者的真正平均值。用T检验进行统计计算。在p值p＜0,05时，认为检验是显著的。盒状图的触须线表示标准差。
实施例1
在此实验中，按照上述描述，通过ELISA(Quidel C3a酶免疫测定)和SELDI-TOF MS分析平行鉴定了来自非癌患者(组1，n＝28位患者)血清与来自结肠直肠腺瘤(组2，n＝28位患者)和结肠直肠癌(组3，n＝28位患者)患者的血清之间C3a-desArg的表达。
实施例2
用同样的患者群，按照上述描述，通过径向免疫扩散和通过SELDI-TOF MS分析量化运甲状腺素蛋白的表达。
结果和统计计算
如图4所示，三组间C3a-desArg[ng/ml]的浓度强度显著不同。从健康个体到结肠直肠腺瘤患者到结肠直肠癌患者，C3a-desArg水平增加。
表1显示了在84个血清样品中，C3a-desArg[ng/ml]和运甲状腺素蛋白[g/l]的血清水平分布，使用 SELDI-TOF MS和免疫测定(C3a-desArg-ELISA、运甲状腺素蛋白免疫扩散)确认。测定了每组中的28个血清样品。
表1
| 变量 | 方法 | 均数±标准差N | 均数±标准差A | 均数±标准差T | 均数±标准差A+T | p值N vs.A | p值Nvs.T | p值N vs.A+T | p值A vs.T |
| 运甲状腺素蛋白 | 免疫扩散 | 0.250±0.043 | 0.191±0.035 | 0.154±0.056 | 0.172±0.05 | 0.000001 | 0.000001 | 0.000001 | 0.0046 |
| 运甲状腺素蛋白MG13,776Da | SELDI | 1.728±0.462 | 1.123±0.287 | 0.996±0.497 | 1.060±0.407 | 0.000001 | 0.000001 | 0.000001 | 0.247 |
| C3A-desArg | ELISA | 863.51±678.93 | 1871.12±1090.62 | 2513.33±2060.46 | 2192.23±1665.25 | 0.00011 | 0.000179 | 0.000117 | 0.150 |
| C3a-desArgMG 8,960Da | SELDI | 0.5724±0.387 | 1.363±1.012 | 1.552±1.271 | 1.458±1.143 | 0.00030 | 0.000268 | 0.00015 | 0.541 |
和非癌对照组相比，在腺瘤和癌患者中ELISA所测量的C3a-desArg的血清浓度明显更高(图5A)。根据这些数据，可以从癌患者中区分健康个体。此外，区分健康个体和腺瘤患者也是可能的。该结果和SELDI-TOFMS分析得到的数据(图5B)非常类似。在图7中，显示了两种方法(SELDI-TOF MS和ELISA)的散点图，证明了每位患者SELDI-TOF MS所测量的p8,960的强度和ELISA所测量的C3a-desArg的浓度之间有较好的相关性(图7A；r＝0,7)，并且在每位患者的SELDI-TOF MS所测量的p13,776的强度和ELISA所测量的运甲状腺素蛋白的浓度之间有较好的相关性(图7B，r＝0.81)。这表明结果不依赖于分析方法。
通过SELDI-TOF MS分析产生运甲状腺素蛋白数据(图6B)并且用径向免疫扩散确定了此数据(图6A)。在具有结肠直肠癌患者中，运甲状腺素蛋白显著低于非癌患者。此外，腺瘤患者血清中运甲状腺素蛋白的浓度也显著低于正常血清。
表2显示了分别用SELDI-TOF MS和ELISA测量的C3a-desArg的灵敏度和特异性的比较，其用来区分健康对照和腺瘤/肿瘤患者。
表2
C3a-desArg(健康对照对比腺瘤+肿瘤患者)
| ELISA | |
| 灵敏度 | 75％ |
| 特异性 | 78％ |
表3显示了分别用SELDI-TOF MS和径向免疫扩散测量的运甲状腺素蛋白的灵敏度和特异性的比较，其用来区分健康对照和腺瘤/肿瘤患者。
表3
运甲状腺素蛋白(健康对照对比腺瘤+肿瘤患者)
| SELDI-TOF MS | 径向免疫扩散 | |
| 灵敏度 | 75％ | 88％ |
| 特异性 | 90％ | 70％ |
表4显示了两种生物标志(C3a-desArg/运甲状腺素蛋白)组合的灵敏度和特异性的比较。通过免疫测定测量C3a-desArg和运甲状腺素蛋白来区分健康对照和腺瘤/肿瘤患者。括号中显示了运甲状腺素蛋白(TTR)和C3a-desArg的临界值。
表4
C3a-desArg和运甲状腺素蛋白的组合(健康对照对比腺瘤+肿瘤患者)
| SELDI-TOF MS | 径向免疫扩散/ELISA(TTR＜0.22和C3a-desArg＞1000) | |
| 灵敏度 | 70％ | 67％ |
| 特异性 | 100％ | 89％ |
表5显示了C3a-desArg作为单独生物标志的灵敏度和特异性。用ELISA测量C3a-desArg的水平来区分健康对照和腺瘤和/或肿瘤患者。在括号中显示了临界值。
表5
C3a-desArg
| 正常对比腺瘤 | 正常对比肿瘤 | 正常对比腺瘤+肿瘤 | |
| 灵敏度 | 79％(＜/＞990) | 61％(＜/＞1786) | 75％(＜/＞990) |
| 特异性 | 78％ | 93％ | 78％ |
表6显示了运甲状腺素蛋白作为单独生物标志的灵敏度和特异性。用径向免疫扩散测量运甲状腺素蛋白的水平来区分健康对照和腺瘤和/或肿瘤患者。在括号中显示了临界值。
表6
运甲状腺素蛋白
| 正常对比腺瘤 | 正常对比肿瘤 | 正常对比腺瘤+肿瘤 | |
| 灵敏度 | 86％(＜/＞0.225) | 61％(＜/＞0.165) | 88％(＜/＞0.22) |
| 特异性 | 68％ | 100％ | 70％ |
表7显示了C3a-desArg和运甲状腺素蛋白(TTR)组合的灵敏度和特异性。运甲状腺素蛋白和C3a-desArg的水平分别用ELISA和径向免疫扩散来测量。在括号中显示了临界值。
表7
运甲状腺素蛋白(TTR)和C3a-desArg的组合
| 正常对比腺瘤 | |
| 灵敏度 | 97％(＜/＞0.225 TTR)和(＜/＞1974 C3a-desArg) |
| 特异性 | 70％ |
这些数据显示了C3a(任选与运甲状腺素蛋白组合)是用于检测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的优秀生物标志。与已知的生物标志CEA和CA 19-9相比，它可以区分健康个体和腺瘤患者。C3a测试的灵敏度和特异性很高，可用于腺瘤的早期特异性检测且不用结肠镜检查。具体的，生物标志C3a和运甲状腺素蛋白的组合可用于检测腺瘤，具有极好的灵敏度和较高的特异性。
Claims (26)
1.一种检测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的方法，其包括以下步骤：
a)提供取自个体的分离的样品材料，
b)确定所述分离的样品材料中C3a或其衍生物的水平，
c)比较确定的C3a或其衍生物的水平和一个或多个参考值。
2.一种区分结肠直肠腺瘤和结肠直肠癌的方法，其包括以下步骤：
a)提供取自个体的分离的样品材料，
b)确定所述分离的样品材料中C3a或其衍生物的水平，
c)比较确定的C3a或其衍生物的水平和一个或多个参考值。
3.一种监测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的发展和/或过程和/或治疗的方法，其包括以下步骤：
a)提供取自个体的分离的样品材料，
b)确定所述分离样品材料中C3a或其衍生物的水平，
c)比较确定的C3a或其衍生物的水平和一个或多个参考值。
4.根据权利要求1到3中任一项的方法，其中与健康个体的样品材料相比，所述取自结肠直肠腺瘤或结肠直肠癌患者的样品材料中的C3a或其衍生物的水平较高。
5.根据权利要求1到4中任一项的方法，其中在第一样品材料中C3a或其衍生物水平的第一次增加指示了结肠直肠腺瘤，并且其中在第二样品材料中C3a或其衍生物水平的第二次增加指示了结肠直肠癌，所述第二样品材料在所述第一样品材料之后的时间点分离自所述个体，条件是所述的第二次增加大于所述的第一次增加。
6.根据权利要求1到5中任一项的方法，其中步骤(b)中，在所述分离的样品材料中测定用于检测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的一个或多个其他生物标志，并且其中在步骤(c)中，确定的所述生物标志的水平与一个或多个各自的参考值比较。
7.根据权利要求1到6中任一项的方法，其中至少一种用于检测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的其他生物标志任选选自运甲状腺素蛋白、p53、CEA、CA 19-9、CA 15-3、CA-125、Kras、β-联蛋白、Her-2/neu、C-反应蛋白血浆浓度及其衍生物，以及
E-钙黏着蛋白、MSH2、MSH3、MLH1、PMS1、PMS2、MSH6基因中的突变，以及
MHL1或MSH2的微卫星不稳定性，以及
SNP及其组合。
8.根据权利要求1到7中任一项的方法，其中C3a和/或其衍生物的参考值以及任选的其他生物标志和/或其衍生物的参考值计算为各个个体组的多个分离样品中C3a和/或其衍生物，以及任选的其他生物标志和/或其衍生物的平均水平，其中个体组是健康个体、结肠直肠腺瘤患者和/或结肠直肠癌患者。
9.根据权利要求1到7中任一项的方法，其中参考值是个体参考值，所述个体参考值计算为一定时期内，取自所述个体的多个分离的样品材料中所确定的C3a和/或其衍生物以及任选其他生物标志和/或其衍生物的平均水平。
10.根据前述权利要求中任一项的方法，其中分离的样品材料是体液并且任选选自血液、血浆、血清、骨髓、粪便、滑液、淋巴液、脑脊液、唾液、尿、母乳、精液、溢沁物及其混合物。
11.根据前述权利要求中任一项的方法，其中在DNA、mRNA和/或蛋白质水平上确定所述的样品材料中C3a和/或其衍生物，以及任选其他生物标志的水平。
12.根据前述权利要求中任一项的方法，其中通过核酸杂交技术、免疫方法或蛋白质组技术，和/或质谱分析确定所述的样品材料中C3a和/或其衍生物以及任选的其他生物标志的水平。
13.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法及其他结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的诊断方法组合进行以增加灵敏度和/或特异性。
14.C3a或其衍生物作为检测个体或个体的分离的样品中结肠直肠腺瘤和/或结肠癌的生物标志的用途。
15.根据权利要求14的用途，其用于在个体分离的样品中早期检测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌。
16.根据权利要求14或15中任一项的用途，其与一个或多个其他结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的生物标志组合以增加灵敏度和/或特异性。
17.根据权利要求16的用途，其中至少一种其他生物标志任选选自运甲状腺素蛋白、p53、CEA、CA19-9、CA15-3、CA-125、Kras、β-联蛋白、Her-2/neu、C-反应蛋白血浆浓度及其衍生物，以及
E-钙黏着蛋白、MSH2、MSH3、MLH1、PMS1、PMS2、MSH6基因中的突变，以及
MHL1或MSH2的微卫星不稳定性，以及
SNP及其组合。
18.检测个体的分离的样品材料中结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的测试系统，其包括：
a)结合C3a或其衍生物表位的抗体或受体，
b)支持所述的抗体或受体的固相支持物
c)检测所述C3a或其衍生物表位与所述抗体或受体结合的试剂。
19.根据权利要求18的测试系统，其中所述的测试系统包含用于检测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的一个或多个其他生物标志的一个或多个抗体或受体。
20.根据权利要求19的测试系统，其中至少一种其他生物标志任选选自运甲状腺素蛋白、p53、CEA、CA 19-9、CA 15-3、CA-125、Kras、β-联蛋白、Her-2/neu、C-反应蛋白血浆浓度及其衍生物，以及
E-钙黏着蛋白、MSH2、MSH3、MLH1、PMS1、PMS2、MSH6基因中的突变，以及
MHL1或MSH2的微卫星不稳定性，以及
SNP及其组合。
21.一种包含用于在个体中检测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的检测分子的阵列，其包含下列检测分子：
a)固定到固相支持物上的核酸探针，所述核酸探针用于结合和检测编码C3a或其衍生物的mRNA，或
b)固定到固相支持物上的抗体，所述抗体用于结合和检测C3a或其衍生物的表位，或
c)固定到固相支持物上的受体，所述受体用于结合和检测C3a或其衍生物的表位，
其中每种不同量的检测分子优选固定到固相支持物上以增加量化的精确性。
22.根据权利要求21的阵列，其中所述的测试系统包含用于检测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的一个或多个其他生物标志的一个或多个抗体或受体。
23.根据权利要求22的阵列，其中至少一种其他生物标志任选选自运甲状腺素蛋白、p53、CEA、CA 19-9、CA 15-3、CA-125、Kras、β-联蛋白、Her-2/neu、C-反应蛋白血浆浓度及其衍生物，以及
E-钙黏着蛋白、MSH2、MSH3、MLH1、PMS1、PMS2、MSH6基因中的突变，以及
MHL1或MSH2的微卫星不稳定性，以及
SNP及其组合。
24.一种确定化合物在治疗结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌中是否有效的方法，其包括以下步骤：
a)用化合物治疗结肠直肠腺瘤或结肠直肠癌患者，
b)确定所述患者的样品材料中C3a或其衍生物的水平，以及
c)比较确定的C3a或其衍生物的水平和一个或多个参考值。
25.根据权利要求24的方法，其中在步骤b)中确定其他生物标志的水平，并在步骤c)中与一个或多个各自的参考值比较。
26.根据权利要求25的方法，其中至少一种其他生物标志任选选自运甲状腺素蛋白、p53、CEA、CA 19-9、CA 15-3、CA-125、Kras、β-联蛋白、Her-2/neu、C-反应蛋白血浆浓度及其衍生物，以及
E-钙黏着蛋白、MSH2、MSH3、MLH1、PMS1、PMS2、MSH6基因中的突变，以及
MHL1或MSH2的微卫星不稳定性，以及
SNP及其组合。
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