MX2007001254A - Uso de c3a y derivados del mismo como un bioformador para adenoma colorrectal y/o carcinoma; metodo para deteccion y sistema de prueba. - Google Patents

Abstract

La presente invencion esta dirigida a un metodo para detectar adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal que comprende los pasos: a) proporcionar un material de muestra aislada que se ha tomado de un individuo, b) determinar el nivel de C3a o un derivado del mismo en el material de muestra aislado, c) comparar el nivel determinado de C3a o un derivado del mismo con uno o mas valores de referencia. La invencion esta dirigida a demas a un metodo para discriminar entre adenoma colorrectal y carcinoma colorrectal asi como a un metodo para supervisar el curso de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal y/o el tratamiento de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal. Ademas, la invencion esta dirigida a un sistema de prueba y una disposicion para uso en estos metodos. Ademas, la invencion esta dirigida al uso de C3a como un biomarcador para una deteccion de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal en un individuo. Ademas, la invencion esta dirigida a un metodo para determinar si un compuesto es efectivo en el tratamiento de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal.

Description

USO DE C3a Y DERIVADOS DEL MISMO COMO UN BIOFORMADOR PARA ADENOMA COLORRECTAL Y/O CARCINOMA; MÉTODO PARA DETECCIÓN Y SISTEMA DE PRUEBA La presente invención se relaciona con el campo de detección de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal. El carcinoma colorrectal es el tercer carcinoma más frecuentemente diagnosticado (9.4%) mundialmente. En 2003 casi 945,000 nuevos casos de carcinoma colorrectal se diagnosticaron mundialmente y aproximadamente 491,000 personas murieron de esta enfermedad. La incidencia de carcinoma colorrectal está aumentado, mientras el régimen de mortalidad de carcinoma colorrectal está disminuyendo. La incidencia de carcinoma colorrectal aumenta con la edad, empezando a alrededor de 40 años de edad, y es superior para hombres que para mujeres (40.6 para hombres contra 30.6 para mujeres, por 100,000 al año). (World cáncer report, 2003, Ed. BW. Stewart y P. Kleihues, IARC Press, Lyon) . En la mayoría de los pacientes, el desarrollo de carcinoma colorrectal sigue una progresión de múltiples pasos desde adenoma premaligna a malignidades invasivas que tienen la propensión para metástasis. Existe evidente de que la reducción en morbidez y mortalidad por carcinoma colorrectal se puede lograr a través de detección y tratamiento de carcinomas colorrectales de etapa temprana e identificación y eliminación de pólipos adenomatosos colorrectales, que son precursores de carcinoma colorrectal . Hasta ahora, solamente pruebas de tamizado colorrectal invasivo tales como clonoscopía han mostrado lograr detección de carcinoma colorrectal de etapa temprana y sus precursores, es decir, pólipos adenomatosos y/o áreas neoplásticas planas. Diversas pruebas están disponibles como opciones para tamizado de carcinoma colorrectal. Las pruebas de tamizado abarcan prueba de sangre oculta fecal (FOBT), sigmidoscopía flexible, FOBT combinado con sigmoidoscopía flexible y colonoscopía. Las diversas pruebas de tamizado difieren entre sí respecto a funcionamiento, efectividad, posible frecuencia de tamizado, complicaciones de prueba, costos y aceptación por pacientes . El tamizado por la prueba de sangre oculta fecal se considera actualmente que es la estrategia de tamizado óptima en términos de costo-efectividad. La sangre oculta en heces se puede detectar mediante agentes químicos tales como guaiaca, a través de hemeporfirina o métodos inmunológicos. La prueba de platina guaiaca Hemoccult (II) disponible de SmithKIine Diagnostics se usa muy ampliamente.

Diversos factores técnicos afectan su funcionamiento clínico. Hemoccult tiene alrededor de 50% de sensibilidad para carcinomas colorrectales y alrededor de 98% de especificidad, sin embargo, la sensibilidad es baja para pólipos, a alrededor de 10% (Simón JB. (1998) Gastroenterologist 6:66-78. Review). Otra desventaja importante de tamizado de sangre oculta es la baja precisión de predicción, solamente 10% de reacciones positivas prueban ser debidas a carcinoma colorrectal (Simón JB. (1998) Gastroenterologist 6:66-78. Review; Mandel JS y col., (1999) J. Nati. Cáncer Inst. 91:434-437; Hardcastle JD y col. (1996) Lancet 348:1472-1477; Kronborg O y col. (1996) Lancet 348:1467-71; Winawer SJ y col. (1997) Gastroenterology 112:594-642; Fletcher RH (1988) N. Engl. J. Med. 338:1153-1154). Además, una prueba de sangre oculta fecal solamente proporciona resultados después de la progresión de la enfermedad a una cierta etapa. Sería deseable tener un sistema de prueba que permite la detección de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal en un punto más temprano en tiempo. Pruebas inmonológicas más recientemente desarrolladas generalmente tienen sensibilidad elevada, sin embargo, una baja especificidad que permanece un problema importante. Otros métodos, tales como pruebas genéticas de muestras de heces para oncógenos KRAS y para proteína p53 todavía no son efectivas en costo y tienen una baja sensibilidad (Calistri D y col. (2003) Clin. Gastroenterol. Hepatol. 1:377-383; Schoen RE (2002) Nat. Rev. Cáncer 2:65-70). La endoscopía (Kavanagh AM (1998) C ncer Causes Control 9:455-462), que utiliza sigmoidoscopio flexible o el colonoscopio (Lieberman DA 81997) Gastroenterol. Clin. N. Am. 26: 71-83), es el medio de detección más definitivo, pero tiene limitaciones. El régimen negativo falso para lesiones neoplásticas panas se ha reconocido y permanece elevado (Kudo S (1997) Gastrointest. Endose. Clin. N. Am. 7:87-98). La colonoscopía permite el examen del colon con un régimen negativo falso bajo para lesiones polipoides de cuando menos 10 mm de diámetro. Debido a esta razón, los intervalos permitidos antes de nuevo examen son relativamente largos después de una determinación negativa (hasta diez años) o hasta cinco años después de polipectomía. Sin embargo, el cumplimiento del paciente con dicha recomendación para nuevo examen después de colonoscopía es bajo. Además, una colonoscopía es costosa y molesta. En vista de los elevados costos de un examen generalizado y la aceptación limitada de una colonoscopía por la población este método de examen tiene una aplicación limitada. Las muestras de tejido aisladas, que se recogen, se pueden probar para carcinoma colorrectal y su precursor, adenoma colorrectal, mediante varios métodos. DE 197 11 111A describe un método que usa una determinación in vitro de bacteria de colon intraepitelial, componentes y productos de reacción del mismo. Otro método que usa expresión de gene HERG en muestras de tejido se describe en DE 102 24 534. Niveles de CEA- (antígeno carcinoembriónico) en muestras de sangre se han usado para detectar carcinoma de colon. Sin embargo, los niveles de CEA no son específicamente elevados en carcinoma de colon y se ha mostrado que son elevados también en pacientes con otras enfermedades malignas (v.gr., cánceres del estómago, páncreas, pecho, y pulmón) y con varias condiciones no malignas (v.gr., enfermedad de hígado alcohólico, enfermedad de intestino inflamatorio, fumado pesado de cigarrillo, bronquitis crónica y pancreatitis) . (Posner MR, Mayer RJ: El uso de marcadores de tumor serológico en enfermedades gastrointestinales. Hemtal Oncol Clin North Am 8:533, 1994). Además, los niveles-CEA no son elevados en adenomas de colon. Un objeto de la invención es proporcionar medios que permiten una detección temprana de adenoma de colon y/o carcinoma de colon. Un objeto adicional es proporcionar medios para permitir una detección selectiva y específica de adenoma de colon y/o carcinoma de colon por un método no invasivo. Un método adicional es proporcionar un biomarcador que se puede usar en la detección de adenoma colorrectal y/o carcinoma. Otro objeto de la presente invención es proporcionar un sistema de prueba para detectar adenoma o carcinoma colorrectal que es efectivo en costo y se puede usar ampliamente. Además, el sistema de prueba debe ser fácil de manejar y más conveniente para el individuo que se va a examinar para adenoma y/o carcinoma colorrectal. Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un sistema de tamizado para determinar si un compuesto es efectivo en el tratamiento de adenoma y/o carcinoma colorrectal. Los objetos bajo la presente invención se resuelven mediante el uso de C3a o un derivado del mismo como un biomarcador para la detección de adenoma colorrectal y l carcinoma colorrectal en un individuo. La detección se puede llevar a cabo in vivo e in vitro. De acuerdo con una modalidad preferida, la detección se lleva a cabo in vitro. Los objetos se resuelven además mediante un método para detectar adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal que comprende los pasos: a) proporcionar un material de muestra aislado que se ha tomado de un individuo b) determinar el nivel de C3a o un derivado del mismo en el material de muestra aislado, c) comparar el nivel determinado de C3a o un derivado del mismo con uno o más valores de referencia. Los objetos se resuelven además mediante un método para discriminar entre adenoma colorrectal y carcinoma colorrectal que comprende los pasos: a) proporcionar un material de muestra aislado que se ha tomado de un individuo, b) determinar el nivel de C3a o un derivado del mismo en un material de muestra aislado, c) comparar el nivel determinado de C3a o un derivado del mismo con uno o más valores de referencia. Los objetos también se resuelven mediante un método para supervisar el desarrollo y/o el curso y/o el tratamiento de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal que comprende los pasos: (a) proporcionar un material de muestra aislado que se ha tomado de un individuo, (b) determinar el nivel de C3a o un derivado del mismo en el material de muestra aislado, (c) comparar el nivel determinado de C3a o derivado del mismo con uno o más valores de referencia. En una modalidad preferida, la efectividad de un procedimiento quirúrgico o terapéutico se controla a fin de decidir si el adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal se elimina completamente. En otra modalidad, la terapia de un paciente de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal con una o más substancias químicas, anticuerpos, antisentido-RNA, radiación v.gr., rayos X o combinaciones de los mismos se control a fin de controlar la efectividad del tratamiento. Los objetos se resuelven también proporcionando un sistema de prueba para detectar adenoma colorrectal y/o cáncer colorrectal en una muestra de un individuo que comprende: (a) un anticuerpo o un receptor que se liga a un epítope de C3a o un derivado del mismo, (b) un soporte sólido que sustenta el anticuerpo o receptor, (c) un reactivo para detectar el enlace del epítope de C3a o un derivado del mismo al anticuerpo o receptor. Los objetos se resuelven adicionalmente mediante la provisión de una disposición que comprende moléculas de detección para detectar un adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal en un individuo que comprende como molécula de detección: (a) una sonda de ácido nucleico inmovilizada a un soporte sólido para ligarse a un mRNA de detección que codifica C3a o un derivado del mismo y/o para ligarse a y detectar proteínas de C3a o derivados del mismo, o (b) un anticuerpo inmovilizado a un soporte sólido para ligarse a y detectar un epítope de C3a o un derivado del mismo, o (c) un receptor inmovilizado a un soporte sólido para ligarse a y detectar un epítope de C3a o un derivado del mismo, en donde de preferencia cada una de cantidades diferentes de moléculas se inmovilizan al soporte sólido para aumentar la precisión de la cuantificación. La sonda de ácido nucleico, por ejemplo, se selecciona del grupo que consiste de ADN o RNA de una sola hebra o hebra doble, aptámeros y combinaciones de los mismos. Los aptámeros son oligonucleótidos de una sola hebra que asumen una forma específica, dependiente de secuencia y se ligan a blancos de proteína con elevada especificidad y afinidad. Los aptámeros se identifican usando el proceso SELEX (Tuerk C y Gold L. (1990) Science 249: 505-510, Ellington AD y Szostak JW. (1990) Nature 346: 818-822). Los objetos se resuelven además mediante un método para determinar si un compuesto es efectivo en el tratamiento de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal que comprende los pasos de: (a) tratamiento de un paciente de adenoma colorrectal o carcinoma colorrectal con un compuesto, (b) determinar el nivel de C3a o un derivado del mismo en un material de muestra del paciente, y (c) comparar el nivel determinado de C3a o un derivado del mismo con uno o más valores de referencia. Las modalidades preferidas se especifican en reivindicaciones dependientes. De conformidad con la presente invención, el término "material de muestra" también se designa como "muestra" . De acuerdo con la presente invención, el término "biomarcador" se intenta que designe una proteína o fragmento de proteína o un ácido nucleico que es indicativo para la incidencia del adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal. Eso significa que el "biomarcador" se utiliza como un medio para detectar adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal. El término "individuo" o "individuos" se pretende para designar a un mamífero, de preferencia, el mamífero es un ser humano tal como un paciente. El término "individuo sano" o "individuos sanos" se intenta que designe individuo (s) no enfermos de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal. Es decir, el término "individuo (s) sanos" se usa solamente con respecto a la condición patológica de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal y no excluye que el individuo sufra de enfermedades distintas al adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal . El término "derivado del mismo" intenta describir cualquier modificación en ADN, mRNA o nivel de proteína que comprende, v.gr., el gene truncado, fragmentos del gene, un gene mutado, o gene modificado. El término "gene" incluye secuencias de ácido nucleico, tales como ADN, RNA, mRNA o secuencias de proteína o secuencias de oligopéptido o secuencias de péptido. El derivado puede ser una modificación que es un resultado de una misión, substitución o inserción del gene. La modificación de gene puede ser un resultado de la variabilidad del gene que ocurre naturalmente. El término "variabilidad del gene que ocurre naturalmente" significa modificaciones que no son un resultado de ingeniería genética. La modificación de gene puede ser un resultado del procesamiento del gene o producto de gene dentro del cuerpo y/o un producto de degradación. La modificación sobre nivel de proteína se puede deber a modificación enzimática o química dentro del cuerpo. Por ejemplo, la modificación puede ser una glicosilación o fosforilación o farnesilación. De preferencia, el derivado' codifica o comprende cuando menos 5 aminoácidos, más preferentemente 10 aminoácidos, más preferentemente 20 aminoácidos de la proteína no modificada. En una modalidad, el derivado codifica cuando menos un epítope de la proteína respectiva. El término "C3a o un derivado del mismo" como se usa en la presente invención comprende también C3a truncado, fragmentos de C3a, C3a mutado, C3a modificado o el precursor C3 (Figura 1, SEQ ID No. 1) o fragmentos de C3. En una modalidad, el derivado tiene una identidad de secuencia de proteína de 80%, de preferencia 90%k más preferentemente 98% con la secuencia SEQ-ID-No. 2 (Figura 2A, SEQ ID No. 2) . La modificación de "C3a" se puede deber a modificación enzimática o química. En particular, el término C3a o derivado del mismo comprende especialmente la proteína C3a truncada, de preferencia teniendo un peso molecular en la escala de 8,950 + 20 Da. En una modalidad preferida, la proteína-C3a truncada tiene un peso molecular de 8,939 Da. De preferencia, la proteína C3a no tiene Arginina C-terminal y opcionalmente un peso molecular en la escala de 8,950 +_ 20 Da. En una modalidad, el derivado de C3a es C3a-desArg (Figura 2B, SEQ ID No. 3) . En una modalidad el derivado de C3a se obtiene mediante separación de C3a mediante mastcélula-quimasa. En otra modalidad, el C3a se obtiene mediante separación de C3 mediante C3-convertasa . C3a pertenece al grupo de anafilatoxinas. C3a, C4a y C5a son productos proteolíticos de proteasas de serina del sistema de complemento. C3a (SEQ-ID-No. 2) se deriva del tercer componente (C3) (SEQ-ID-NO.1) del sistema de complemento de sangre durante la activación de complemento. C3a es una hormona con efectividad local. Aproximadamente 40% de los residuos de aminoácido en C3a están involucrados en una conformación helicoidal. Las anafilatoxinas de suero están involucradas en una variedad de respuestas inmunes celulares, así como son agentes proinflamatorios potentes. C3a produce efectos poderosos en paredes de vasos sanguíneos, contracción de músculo suave y un aumento de permeabilidad vascular. La arginina C-terminal en C3a es de importancia fundamental para su actividad biológica. Las anfilatoxinas se regulan mediante carboxipeptidasa N (inactivador de anafilatoxina) , que elimina dentro de segundos la arginina carboxiterminal . Este mecanismo convierte la anfilatoxina intacta en una forma de C3a-desArg (SEQ ID No. 3) menos activa. El término "epítope" se intenta para designar cualquier elemento estructural de una proteína o péptido o cualquier estructura proteinácea que permite el enlace específico de un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una proteína o estructura de péptido o un receptor. Los métodos de la presente invención se llevan a cabo con material de muestra tal como un fluido corporal o muestra de tejido que ya se ha aislado del cuerpo humano. Subsecuentemente el material de muestra se puede fraccionar y/o purificar. Por ejemplo, es posible almacenar el material de muestra que se va a probar en un congelador y llevar a cabo los métodos de la presente invención en un punto en tiempo apropiado después de descongelar el material de muestra respectivo. Se ha descubierto sorprendentemente por los presentes inventores que la proteína C3a o un derivado del mismo se puede usar como un biomarcador para la detección de adenoma colorrectal y/o carcinoma. Los inventores han encontrado ahora sorprendentemente que el nivel de proteína C3a o un derivado de la misma en un fluido corporal es elevado en individuos que tienen adenoma y/o carcinoma colorrectal. Además, el nivel de proteína C3a o un derivado de la misma en un fluido corporal se puede usar para distinguir a gente saludable de gente que tiene adenoma y/o carcinoma colorrectal así como gente que tiene adenoma colorrectal de gente que tiene carcinoma colorrectal. De acuerdo con la presente invención, el material de muestra puede ser tejido, células o un fluido corporal. De preferencia el material de muestra es un fluido corporal tal como sangre, plasma de sangre, suero de sangre, médula de hueso, heces, fluido sinovial, fluido linfático, fluido cerebroespinal, esputo, orina, leche de madre, esperma, exudado y mezclas de los mismos. En una modalidad preferida, los fluidos corporales se fraccionan con cromatografía de intercambio de anión. La proteína C3a por ejemplo, se eluye a pH 9.0. La proteína transtiretina (pl3,776) por ejemplo se eluye a pH 4.0. De preferencia, el fluido corporal se ha aislado antes de llevar a cabo los métodos de la presente invención. Los métodos de la invención se llevan a cabo de preferencia in vitro por un técnico de laboratorio. De conformidad con una modalidad preferida de la invención, C3a se mide en plasma de sangre o suero de sangre. El suero de sangre se puede obtener fácilmente tomando sangre de un individuo que se va a examinar médicamente y separando el sobrenadante de la sangre coagulada . El nivel de C3a o un derivado del mismo en el fluido corporal, de preferencia suero de sangre, es superior con la formación progresiva de adenoma colorrectal. El adenoma colorrectal es un neoplasma benigno que se puede hacer maligno. Cuando se desarrolla cáncer colorrectal de adenoma colorrectal benigno, el nivel de C3a o un derivado del mismo en los fluidos corporales, de preferencia suero de sangre, se eleva adicionalmente. Después de la transformación de adenoma colorrectal en cáncer colorrectal, la condición patológica del individuo afligido se puede exacerbar adicionalmente por formación de metástasis. La presente invención proporciona un biomarcador de etapa temprana que permite detectar la enfermedad neoplástica en una etapa temprana y todavía benigna, la enfermedad neoplástica en una etapa temprana o etapa benigna y/o etapas de tumor tempranos. La detección temprana permite al médico eliminar a tiempo el adenoma colorrectal y aumentar dramáticamente la oportunidad del individuo de sobrevivir. Además, la presente invención permite supervisar el nivel de C3a o un derivado del mismo en un fluido corporal tal como suero de sangre durante un período de tiempo prolongado, tal como años.

La supervisión de término prolongado permite diferenciar entre individuos sanos y adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal. El nivel de C3a o un derivado del mismo se puede comprobar rutinariamente, por ejemplo, una o dos veces al año. Si un aumento del nivel de C3a o un derivado del mismo se detecta, esto puede ser indicativo de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal temprano. Un aumento adicional del nivel de C3a o un derivado del mismo puede ser indicativo de la transformación en carcinoma colorrectal maligno. Además, el curso de la enfermedad y/o el tratamiento se pueden supervisar. Si el nivel de C3a o un derivado del mismo aumenta adicionalmente, por ejemplo después de remoción del adenoma colorrectal, esto puede ser indicativo de exacerbación de la condición patológica. Eso significa, el nivel de C3a o un derivado del mismo es un parámetro clínico valioso para detectar y/o supervisar adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal. El nivel de C3a o un derivado del mismo en fluidos corporales es superior después de incidencia de adenoma colorrectal. Por lo tanto, el nivel de C3a o un derivado del mismo es un parámetro clínico importante para permitir un diagnóstico temprano y, consecuentemente, un tratamiento temprano de la enfermedad. En una modalidad preferida, los pacientes con niveles elevados de C3a.o derivados del mismo se examinan subsecuentemente mediante colonoscopía. El método de la invención para detección de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal comprende el paso de proporcionar un material de muestra aislado que se ha tomado de un individuo, luego determinar el nivel de C3a o un derivado del mismo en el material de muestra aislado, y finalmente comparar el nivel determinado de C3a o un derivado del mismo con uno o más valores de referencia. En una modalidad, uno o más biomarcadores adicionales se detectan adicionalmente en un material de muestra aislado que se ha tomado de un individuo, el nivel de los biomarcadores se determina y compara con uno o más valores de referencia respectivos. El valor de referencia se puede calcular como el nivel promedio de C3a o un derivado del mismo determinado en una pluralidad de muestras aisladas de individuos sanos o individuos que sufren de adenoma colorrectal , y/o carcinoma colorrectal. Este valor de referencia se puede establecer como una escala que se debe considerar como normal, significando que la persona está sana o sufre de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal. Un valor específico dentro de una escala que puede ser indicativa para condición sana o la condición patológica de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal. Esta escala de valor de referencia se puede establecer tomando un número relevante estadísticamente de muestras de fluido corporal, tal como muestras de suero, de individuos sanos como se hace para cualquier otra escala de parámetro médico, tal como, v.gr., azúcar en sangre. De preferencia, dos valores de referencia se calculan que se designan como control negativo y control positivo 1. El valor de referencia del control negativo se calcula de individuos sanos y el control positivo se calcula de individuos que sufren de adenoma colorrectal o carcinoma colorrectal. Más preferentemente, se calculan tres valores de referencia que se designan como control negativo, control positivo 1 y control positivo 2. El control positivo 1 puede ser calculado de individuos que sufren de carcinoma colorrectal y el control positivo 2 se puede calcular de individuos que sufren de adenoma colorrectal. En otra modalidad de la presente invención, los valores de referencia pueden ser valores de referencia individuales calculados como el nivel promedio de C3a o un derivado del mismo determinado en una pluralidad de muestras aisladas tomadas del individuo durante un período de tiempo. Cuando se supervisa el nivel de C3a o un derivado del mismo durante un período prolongado de tiempo, tal como meses o años, es posible establecer un nivel promedio individual. El nivel de C3a o un derivado del mismo se puede medir, por ejemplo, de la misma muestra de suero de sangre cuando se mide el azúcar en sangre y se puede usar para establecer una curva de calibración individual que permite detectar específicamente cualquier aumento individual del nivel de C3a o un derivado del mismo. El valor de referencia para biomarcadores adicionales también se puede calcular de la misma forma como se describe para C3a. Los niveles promedio de C3a o biomarcadores adicionales puede ser el nivel promedio o medio. En otro aspecto la presente invención proporciona además un sistema de prueba para detectar adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal en un material de muestra aislada de un individuo. El sistema de prueba está basado ya sea en la especificidad de un anticuerpo o un receptor para ligarse específicamente a un epítope o un elemento estructural apropiado de C3a o un derivado del mismo o un fragmento del mismo. Un receptor puede ser cualquier estructura capaz de ligarse específicamente a C3a o un derivado del mismo. El receptor puede ser, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo tal como un Fab o un fragmento F(ab')2 o cualquier otra proteína o estructura de péptido que sea capaz de ligarse específicamente a C3a o un derivado del mismo. El anticuerpo, fragmento de anticuerpo o receptor está ligado a un soporte sólido tal como, v.gr., una superficie plástica o cuentas para permitir el enlace y detección de C3a o un derivado del mismo. Por ejemplo, una plata de microtítulo convencional se puede usar como una superficie plástica. La detección del enlace de C3a o un derivado del mismo se puede efectuar, por ejemplo, usando un anticuerpo secundario etiquetado con un grupo detectable. El grupo detectable puede ser, por ejemplo, un isótopo radioactivo o una enzima como peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina detectable añadiendo un substrato apropiado para producir, por ejemplo, un color o una señal de fluorescencia. El sistema de prueba puede ser un inmunoensayo tal como un inmunosorbentensayo enlazado con enzima (ELISA) o un inmunoensayo de radio (RÍA) o inmunoensayo de luminiscencia (LIA) . Sin embargo, cualquier otro sistema de prueba inmunológico que utilice la especificidad de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos se puede usar tal como el manchado Western o inmuno precipitación. La presente invención también proporciona una disposición que comprende moléculas de detección para detectar adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal en un individuo, en donde la molécula de detección puede ser una sonda de ácido nucleico inmovilizada sobre un soporte sólido para ligarse a y detectar mRNA que codifica C3a, fragmentos, mutaciones, variantes o derivados del mismo, o un anticuerpo inmovilizado sobre un soporte sólido para ligarse a y detectar un epítope de C3a o un derivado del mismo, o un receptor inmovilizado en un soporte sólido para ligarse a y detectar un epítope de C3a o un derivado del mismo. De preferencia, la disposición comprende moléculas de detección adicionales que son biomarcadores para detectar adenoma colorrectal y carcinoma colorrectal. La sonda de ácido nucleico puede ser cualquier oligonucleótido que ocurre natural o sintético u oligonucleótidos químicamente modificados, así como cADN, cRNA, adaptámero y lo semejante. Alternativamente, la presente invención también comprende una disposición inversa que comprende muestras de paciente inmovilizadas en un soporte sólido que se puede detectar por las moléculas de detección arriba definidas. De preferencia la disposición comprende moléculas de detección que se inmovilizan a una superficie sólida en posiciones identificables. El término "disposición" como se usa en la presente invención se refiere a un agrupamiento o una disposición, sin ser necesariamente una disposición regular. Una disposición comprende de preferencia cuando menos 2, más preferentemente 5 juegos diferentes de moléculas de detección o muestras de paciente. De preferencia, la disposición de la presente invención comprende cuando menos 50 juegos de moléculas de detección o muestras de paciente, se prefiere además cuando menos 100 juegos de moléculas de detección o muestras de paciente. De conformidad con otra modalidad de la invención, la disposición de la presente invención comprende cuando menos 500 juegos de moléculas de detección o muestras de paciente. La molécula de detección puede ser, por ejemplo, una sonda de ácido nucleico o un anticuerpo o un receptor. La disposición descrita se puede usar en un sistema de prueba de conformidad con la invención. La disposición puede ser una micro disposición o una macro disposición. Las moléculas de detección se inmovilizan a una superficie o soporte sólido o superficie de soporte sólido. Esta disposición o microdisposición luego se tamiza hibridizando sondas de ácido nucleico preparadas de muestras de paciente o poniendo en contacto la disposición con sondas proteináceas preparadas de muestras de paciente. El soporte puede ser un material polimérico tal como nylon o plástico o un material inorgánico tal como silicio, por ejemplo una oblea de silicio, o cerámica. De conformidad con una modalidad preferida, se usa vidrio (Si02) como un material de soporte sólido. El vidrio puede ser una platina de vidrio o pastilla de vidrio. De conformidad con otra modalidad de la invención, el substrato de vidrio tiene una superficie atómicamente plana. Por ejemplo, la disposición puede estar comprendida de sondas de ácido nucleico capaces de ligarse específicamente a mRNA de C3a o un derivado del mismo o anticuerpos ligados específicamente a proteína C3a o derivados de la misma estando presentes en un fluido corporal tal como suero. Otra modalidad preferida es producir cADN mediante transcripción de reversa de mRNA que codifica C3a o de mRNA que codifica un derivado de C3a y para detectar específicamente la cantidad de cADN respectivo con la disposición. La tecnología de disposición es conocida por la persona experta. Una cuantificación del mRNA o cADN o proteínas medidas, respectivamente, se puede efectuar mediante comparación de los valores medidos con una norma o curva de calibración de cantidades conocidas de C3a o un derivado del mismo mRNA o cADN o proteínas. De preferencia, cantidades diferentes de moléculas de detección se inmovilizan cada una en el soporte sólido para permitir una cuantificación precisa del nivel de C3a o un derivado del mismo. De conformidad con otra modalidad de la invención, el nivel de C3a o un derivado del mismo se determina mediante espectroscopia de masa. La espectroscopia de masa permite detectar específicamente C3a o un derivado del mismo a través de su peso molecular y cuantificar la cantidad de C3a o un derivado del mismo muy fácilmente. Cualquier método de ionización apropiado en el campo de espectroscopia de masa conocido en el ramo se puede emplear para ionizar el C3a o un derivado del mismo, molécula, fragmentos, mutaciones, variantes o derivados de los mismos. Los métodos de ionización comprenden impacto electrónico (El), ionización química (Cl), ionización de campo (FDI), ' ionización de electrodispersión (ESI), ionización de desorción láser (LDI), ionización de desorción láser ayudada por matriz (MALDI) y ionización de desorción de láser mejorada en superficie (SELDI) . Cualquier método de detección apropiado en el campo de espectroscopia de masa conocido en el ramo se puede emplear para determinar la masa molecular de C3a o un derivado del mismo. Los métodos de detección comprenden espectroscopia de masa quadrupol (QMS) , espectroscopia de masa de transformación fourier (FT-MS) , y espectroscopia de masa de tiempo de vuelo (TOF-MS) . De preferencia, la espectroscopia de masa es una espectroscopia de masa de ionización de desorción de láser mejorada en superficie-tiempo de vuelo (SELDI-TOF-MS) .

Antes de llevar a cabo un SELDI-TOF-MS, el C3a o un derivado del mismo en la muestra aislada se inmoviliza de preferencia en una pastilla o soporte sólido con una superficie activada. La superficie activada comprende de preferencia anticuerpos inmovilizados contra anti-C3a o un derivado del mismo, tal como por ejemplo, anticuerpos policlonales de conejo. Después del enlace del C3a o un derivado del mismo a los anticuerpos, se lleva a cabo un análisis de tiempo de vuelo en un espectrómetro de masa SELDI-TOF, que entrega señales de intensidad para determinación del nivel de C3a o un derivado del mismo. Además, la espectroscopia de masa permite detectar simultáneamente otras proteínas que pueden tener una importancia con respecto a la detección de adenoma colorrectal y/o cáncer colorrectal. En una modalidad de la presente invención, la sensibilidad y/o especificidad de la detección de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal se mejora mediante detección adicionalmente de un biomarcador adicional. En particular, en una modalidad, la sensibilidad y/o especificidad de la detección de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal se mejora mediante detección de otra proteína o ácido nucleico en combinación con C3a o un derivado del mismo. De preferencia, la sensibilidad y especificidad de los métodos, disposiciones, sistemas de prueba y usos de conformidad con la presente invención se aumentan mediante la combinación de detectar C3a y derivados del mismo con transtiretina y derivados de la misma. El término "transtiretina o un derivado de la misma" como se usa en la presente invención también comprende transtiretina truncada, fragmentos de transtiretina, transtiretina mutada, o transtiretina modificada. La modificación de "transtiretina" se puede deber a modificación enzimática o química. Además, el término "transtiretina" también se usa para designar formas monoméricas o multiméricas de transtiretina. Por ejemplo, el término "transtiretina" cubre especialmente la cadena de proteína monomérica que usualmente es parte de la transtiretina de proteína homotetramérica. La transtiretina también se designa co o prealbúmina. La transtiretina es una proteína tetramérica que tiene un peso molecular de alrededor de 54,000 Da que se sintetiza principalmente en el hígado. La transtiretina es normalmente un homotetrámero que comprende cuatro cadenas de proteína, cada una teniendo un peso molecular de alrededor de 14,000 Da. Usando espectroscopia de masa los inventores han detectado diversas variantes de las cadenas de proteína de transtiretina que tienen un peso molecular de, entre otros, 13,776 Da, 13,884 Da, o 14,103 Da. Los inventores han encontrado que especialmente el nivel de variantes moleculares de transtiretina que tienen un peso molecular de 13,776 Da y 13,884 Da se disminuye en un fluido corporal tal como suero en caso de incidencia de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal. En una modalidad adicional de la presente invención, la sensibilidad y/o especificidad de la detección de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal se mejora mediante detección adicionalmente de p53, CEA (antígeno carcinoembriónico) y/o CA 19-9, CA 15-3, Kras, E-cadherina mutada, ?-Catenina o derivados de los mismos en combinación con C3a o un derivado del mismo. En una modalidad adicional de la presente invención, la sensibilidad y/o especificidad de la detección de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal se puede mejorar mediante detección adicionalmente de mutaciones en genes de falta de coincidencia de ADN, v.gr., MSH2, MSH3, MLH1, PMS1, PMS2, MSHß, inestabilidad de microsatélite de v.gr., MHL1 o MSH2, SNPs (polimorfismo de nucleótido sencillo) o concentraciones de plasma de proteína C-reactiva. En una modalidad adicional de la presente invención, la sensibilidad y/o especificidad de la detección de adenoma colorrectal y/o carcinoma, colorrectal se mejora opcionalmente mediante detección de CA15-3, CA-125 y/o Her-2/neu en combinación con C3a o un derivado del mismo. Cal5-3 es un antígeno oncofetal, que se expresa mediante varios carcinomas, y frecuentemente se mide con otros marcadores de tumor. Ambos CA15-3 y CA-125 son indicadores prognósticos, principalmente para cáncer de pecho, pero también en adición a metástasis visceral. La amplificación de Her-2/neu en carcinoma de pecho está asociada con baja prognosis, intervalo libre de enfermedad corto y tiempo corto de sobre vivencia. Poco se sabe hasta ahora acerca del punto de partida de amplificación y el progreso de Her-2/neu hasta ahora. En una modalidad preferida, el adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal se detectan mediante la combinación de los biomarcadores C3a y transtiretina o derivados de los mismos. Esto permite la detección de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal con una sensibilidad y/o especificidad aumentada. Además, el método de detección es bien aceptado por los pacientes, puesto que el método de detección es no invasor. La sensibilidad y especificidad se definen como sigue: La sensibilidad es el número de pacientes positivos verdaderos (%) con respecto al número de todos los pacientes (100%) . Los pacientes son individuos que tienen adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal.

La especificidad es el número de individuos negativos verdaderos (%) con respecto al número de todos los individuos sanos (100%) . La sensibilidad y especificidad se pueden definir alternativamente mediante las siguientes fórmulas diagnóstico + prueba + TP FP FN TN TP: positivo verdadero (prueba positiva, diagnóstico correcto; FP: Positivo falso (prueba positiva, diagnóstico incorrecto) ; TN: Negativo verdadero (prueba negativa, diagnóstico correcto) ; FN: Negativo falso (prueba negativo, diagnóstico incorrecto) ; La sensibilidad se calcula mediante la siguiente fórmula: TP/ (TP + FN) y la especificidad se calcula mediante la siguiente fórmula TN/(TN + FP) El resultado de cada grupo de análisis, que se selecciona de TP, FP, TN, FN, se calcula para una pluralidad de muestras aisladas seleccionadas del grupo que consiste de individuos sanos, pacientes de adenoma colorrectal y/o pacientes de carcinoma colorrectal. TP, FP, TN, FN se relaciona con el número de individuos que están correlacionados con el estado positivo verdadero, positivo falso, negativo verdadero, negativo falso, respectivamente. Los métodos de la presente invención se pueden llevar a cabo en combinación con otros métodos de diagnóstico para detección de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal para aumentar la sensibilidad y/o especificidad total. La detección de C3a permite una detección muy temprana de adenoma colorrectal y, por lo tanto, se puede usar como un marcador muy temprano. De preferencia, los métodos de la presente invención se llevan a cabo como una detección temprana y/o método de supervisión. Si los resultados de los métodos de la presente invención indican la incidencia de adenoma colorrectal y/o adenoma colorrectal, exámenes adicionales tales como colonoscopía deben llevarse a cabo. Los siguientes anticuerpos anti-transtiretina. policlonales y anticuerpos de C3a se pueden usar cuando se practica la invención: • Anti-transtiretina: PC 066 disponible de The Binding Site Ltd., Birmingham, Inglaterra y A 0002, disponible de DAKO, Hamburgo, Alemania.

• Anti-C3z-desArg: disponible con el inmunoensayo Quidel (Quidel Corporation, 10165 McKellar Court, San Diego, CA 92121, EUA) . La presente invención proporciona además un método para determinar si un compuesto es efectivo en el tratamiento de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal . El método para determinar si un compuesto es efectivo en el tratamiento de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal comprende los pasos de: (a) tratar un paciente con adenoma colorrectal o carcinoma colorrectal con un compuesto (b) determinar el nivel de C3a o un derivado del mismo en un material de muestra del paciente (c) comparar el nivel determinado de C3a o un derivado del mismo con uno o más valores de referencia. El término "paciente" como se usa en la presente solicitud cubre a humanos así como seres no humanos tales como animales. Los animales se seleccionan de preferencia del grupo que consiste en roedores, v.gr., ratón, rata, hámster, y otros animales, v.gr., cobayo, conejo, liebre, perro y cerdo. Estos animales se pueden usar para inducir específicamente ciertos estados de enfermedad, como adenoma colorrectal y carcinoma colorrectal, para propósitos de investigación. La inducción de dichos estados de enfermedad, por ejemplo, se pueden efectuar mediante tratamiento de los animales, por ejemplo, con substancias radioactivas o químicas conocidas por inducir estado de enfermedad de cáncer colorrectal o adenoma colorrectal. Los estados de enfermedad también se pueden inducir usando sistemas de transfección viral. También es posible usar animales genéticamente modificados, en los que una o más funciones de gene específicas se han alterado, o animales noqueados tales como ratones noqueados en los que se ha omitido una función de gene específica. El "compuesto" puede ser una o más substancias químicas, un anticuerpo, proteína, péptido, antisentido, mRNA, droga molecular pequeña, o combinaciones de los mismos. El compuesto también se puede reemplazar por irradiación, v.gr., rayos X, o combinaciones de compuestos y radiación se pueden usar. El nivel de C3a o un derivado del mismo en un material de muestra del paciente se puede determinar por las técnicas de detección arriba descritas. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan para propósitos ilustrativos solamente. La invención no debe considerarse que está limitada a los siguientes ejemplos.

Figuras La Figura 1 muestra la secuencia de proteína C3. La Figura 2 (muestra (A) la secuencia de proteína C3a y (B) la secuencia de proteína C3a-desArg. La Figura 3 muestra un diagrama esquemático para fraccionar y hacer perfil de muestras de suero. La Figura 4 muestra la cuantificación de C3a-desArg utilizando un ELISA. Muestras de suero de no cáncer (n=28), adenoma (n=28) y pacientes de cáncer. colorrectal (n=28) se ensayaron en duplicado en el inmunoensayo Quidel de Enzima C3a. (A == grupo de adenoma, N = grupo de control sano, T =grupo de cáncer) . La Figura 5 muestra el análisis de C3a-desArg mediante A) ELISA y B) SELDI-TOF MS . Las concentraciones medias de C3a-desArg son significativamente superiores en el grupo de adenoma y cáncer comparadas con el grupo de control no canceroso. (A = grupo de adenoma, N = grupo de control sano, T = grupo de cáncer) . La Figura 6 muestra la cuantificación de transtiretina mediante A) inmunodifusión radial y B) análisis SELDI-TOF MS. Las concentraciones medias de transtiretina son significativamente inferiores en el grupo de adenoma y cáncer comparadas con el grupo de control no canceroso. Además, las concentraciones de transtiretina medias son significativamente inferiores en el grupo de cáncer comparadas con el grupo de adenoma como se mide mediante inmunodifusión radial. (A = grupo de adenoma, N = grupo de control sano, T = grupo de cáncer) . La Figura 7 muestra la correlación entre SELDI-TOFMS y datos de inmunoensayo. C3a-desArg (A) se analizó mediante ELISA, transtiretina (B) mediante inmunodifusión radial. E emplos A menos que se manifieste de otra manera, todos los métodos se llevaron a cabo siguiendo el protocolo del fabricante de los sistemas analíticos. Recolección de Suero y fraccionación de suero Se recogieron e investigaron suero de tres grupos de pacientes humanos. El Grupo 1 consistió de 28 pacientes que fueron pacientes quirúrgicos tratados por enfermedades no cancerosas tales como hernia inguinal, piedras de vejiga y diverticulitis. Estos individuos del grupo 1 se tomaron como el grupo de individuos sanos, es decir, aquellos que no sufrieron de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal. El grupo 2 consistió de 28 pacientes, que fueron todos pacientes quirúrgicos tratados por tumores no definidos, que resultaron ser adenoma colorrectal benigna. El grupo 3 consistió de 28 pacientes, que fueron pacientes que tienen carcinoma colorrectal. Todos estos 28 pacientes sufrieron de la etapa III de TNM (Tumor, Nodo, Metástasis etapa III) de carcinoma colorrectal. Las líneas de guía éticas y la confidencialidad de paciente se han asegurado estrictamente y todos los pacientes dieron consentimiento por escrito de participar en este estudio. Todos los pacientes tuvieron preparaciones preoperativas comparables tales como tiempo de ayuda y medicación el momento de cirugía. El suero de cada paciente se fraccionó mediante cromatografía de intercambio de anión (Serum Fractionation Kit/Q HyperD resin, Ciphergen Biosystems, Inc.), usando un acercamiento de automación de formato de 96 pozos (Biomek2000, Ciphergen) , de conformidad con el protocolo del fabricante, para reducir algo de la interferencia por las proteínas más abundantes. Como se muestra en la Figura 3, la fraccionación produjo 6 fracciones que contienen proteínas separadas aproximadamente sobre la base de valor pl de proteína. La proteína C3a-desArg (p8,960 Da) se eluyó con fracción 1 a pH 9.0 de solución de lavado (50 mM Tirs-HCI con 0.1% OGP (0ctil-?-D-glucopi9ranosida, pH 9.0) (de conformidad con las condiciones definidas por Ciphergen Biosystems Inc., juego de mapeo de diferencia de expresión-fracción de suero cat. no. K100-0007). La proteína de transtiretina (p 13,776 Da se eluyó con fracción 4 a pH 4.0 (100 mM de acetato de sodio con 0.1% de OGP, condiciones de pH 4.0 (de conformidad con las condiciones definidas por Ciphergen Biosystems Inc., juego de mapeo de diferencia de expresión-fracción de suero cat. no. K100-0007) . Análisis de SELDI-TOF-MS Disposiciones de proteína CM10 se procesaron en un bioprocesador (Ciphergen Biosystems, Inc.), de conformidad con el protocolo del fabricante. Pastillas se equilibraron con tampón de enlace de CM10 (Ciphergen Biosystems, Inc.), durante 2x5 minutos y se incubaron subsecuentemente con las fracciones de suero (que se había diluido 1:10 en tampón de enlace CM10) . Después de 45 minutos el material no ligado se eliminó y las pastillas se lavaron 3 veces con tampón de enlace CM10 y 2 veces con agua. Después de secar a temperatura ambiente durante 10 minutos, se añadieron 2 aplicaciones de 0.05 M de ácido sinapínico (1.0 ul) y las pastillas se analizaron con el Ciphergen Protein ChipReader (modelo PBSII). El Protein ChipReader es un espectrómetro de masa de tiempo de vuelo. Los valores de masa e intensidades de señal para las proteínas detectadas se transfieren a un software, que se suministra por Ciphergen para análisis en profundidad adicional por el ProteinChip Data Analysis Program y Biomarker Wizard Program. Para reducir al mínimo la variabilidad de datos, la medición se realizó dentro de dos días usando muestras de todos los grupos de pacientes distribuidos aleatoriamente en las pastillas. Como un control de norma para normalización, se usó suero normal repartido paralelo a todas las mediciones. Los espectros de masa de proteínas se generaron usando un promedio de 195 disparos láser a una intensidad de láser de 185. El detector se corrió a una sensibilidad de 7. Para adquisición de datos, la escala de tamaño de detección se ajustó entre 2,000 y 40,000 Da. El láser se enfocó a 10,000 Da. Los datos se analizaron con el proteinChip Data Analysis Program (versión 3.1, Ciphergen Biosystems) y con el Biomarker Wizard Program (versión 3.1, Ciphergen Biosystems) . Las intensidades de pico se normalizaron a la corriente de ion total. Se debe observar que los pesos moleculares medidos pueden variar de medición a medición y pueden depender de los específicos del espectroscopio de masa usado. El peso molecular medido de C3desArg puede estar dentro de la escala de 8,950 + 25 Da. Análisis ELISA de C3a Para la cuantificación del fragmento C3a-desArg en suero se usó un inmunoensayo de enzima de Quidel (Quidel Corporation 10165 McKellar Court, San Diego, CA 92121, EUA) . El ELISA se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las tiras de microtítulo incluidas en el equipo se revisten con un anticuerpo monoclonal (incluido en el inmunoensayo de Quidel) específico para C3a-desArg humano. Las muestras se diluyeron 1:500 y se incubaron durante una hora a 18-25°C. Durante esta incubación, C3a-desArg en la muestra se ligará al anticuerpo monoclonal. Después de enjuagar el C3 nativo no ligado, se usó anti-C3a de ratón conjugada con peroxidasa para la detección de C3a-desArg ligado. El exceso de conjugado se eliminó a través de un paso de lavado, y la cantidad de C3a-desArg en la muestra de suero se cuantificó usando la reacción de peroxidasa y una curva normal. Inmunodifusión radial para la cuantificación de Transtiretina En ensayo de inmunodifusión radial (ensayo Tina-Quant Prealbumin, ensayo Inmunoturbidométrico para la determinación de prealbúmina, Roche diagnostics GmbH, Mannheim Alemania, Cat. -No. 11660519) se realizó en un laboratorio de servicio clínico. El suero se aplicó a un corte de pozo cilindrico en una matriz de gel que contiene una concentración uniforme de anticuerpos monoespecífieos. El antígeno colocado en el pozo se difunde radialmente, produciendo un anillo de precipitina. Los anillos de precipitina se pueden leer en cualquier momento después de incubación durante la noche, o punto final. Los resultados se cuantificaron comparando el diámetro del anillo de precipitan producido por la muestra con los anillos de precipitina producidos por normas de concentraciones conocidas. Evaluación estadística de los datos Para los tres grupos de pacientes se calcularon valores cortados mediante el algoritmo C&RT(CART) sobre la base de análisis de decisión-árbol (Breiman, L., Friedman, J. H., Olshen, R. A. & Stone, C. J. (1984). Árboles de clasificación y regresión, Monterey, CA: Wadworth & Brooks/Cole Advanced Books & Software) . Los valores cortados se habían calculado a fin de seleccionar y especificar los valores de límite entre los diferentes grupos de análisis. La evaluación se había realizado con Software STATISTICA Vs 7.1 de STATSOFT INC., el análisis de árbol-decisión se realiza con subprograma Data-Miner Modul, Standard Classification Trees (CAndRT) ( StatSoft, Inc. 82005). STATISTICA (sistema de software de ana'lisis de datos), versión 7.1, www.statsoft.com.). Los datos estadísticos se evaluaron sobre la base en el valor medio y desviación convencional. Demás, las Figuras muestran un intervalo de confidencia de medio +_ 95, indicando para encontrar los verdaderos valores medios de grupos de pacientes prospecto con 95% de probabilidad dentro de este intervalo. La evaluación estadística se realiza mediante la Prueba-T. Las pruebas se consideran como significativas a valores de p, p< 0.05. Los filamentos de trazos de caja muestran la desviación convencional . Ejemplo 1 En este experimento, la expresión de C3a-desArg entre suero de pacientes de no carcinoma (Grupo 1, n=28 pacientes) y el suero de pacientes con adenoma colorrectal (Grupo 2, n=28 pacientes) y carcinoma colorrectal (Grupo 3, n=28 pacientes) se identificaron en duplicado mediante ELISA (Quidel C3a inmunoensayo de Enzima y por análisis SELDI-TOF MS como se describe arriba Ejemplo 2 La expresión de transtiretina se cuantificó mediante inmunodifusión Radial y mediante análisis SELDI-TOF MS como se describe arriba con los mismos pacientes colectivos. Resultados y evaluación estadística. Como se muestra en la Figura 4, la intensidad de la concentración de C3a-desÁrg [ng/ml] difiere significativamente entre los tres grupos. El nivel de C3a-desArg aumenta de individuos sanos sobre los pacientes de adenoma colorrectal a pacientes de carcinoma colorrectal . El Cuadro 1 muestra la distribución de niveles de suero de C3a-desArg [ng/ml] , y transtiretina [g/1] entre 84 muestras de suero usando SELDI-TOF MS e inmunoensayos (C3a-desArg-ELISA, inmunodifusión de transtiretina) para validación. 28 muestras de suero en cada grupo se midieron. Cuadro 1 (lado izquierdo) Variable Método Medio +_ Medio + Medio +_ Medio +_ Desv. Desv. Desv. Desv. Conv. Conv. Conv. Conv. N T A+T Transti- Inmonodi- 0.250 + 0.191 + 0.154 + 0.172 + retina fusión 0.043 0.035 0.056 0.05 Transti- SELDI 1.728 + 1.123 + 0.996 + 1.060 + retina 0.462 0.287 0.497 0.407 MG 13,776 Da C3a- ELISA 863.51 + 1871.12 + 2513.33 + 2192.23 + desArg 678.93 1090.62 2060.46 1665.25 C3a- SELDI 0.5724 + 1.363 + 1.552 + 1,458 + desArg 0.387 1.012 1.271 1.143 MG 8, 960 Da Cuadro 1 (lado derecho) Variable Método p-Valor p-Valor N p-Valor p-Valor N vs. A vs. T N vs. A+T A vs. T Transti- Inmuno- 0.00000.1 0.000001 0.000001 0.0046 retina difusión Transti- SELDI 0.00000.1 0.000001 0.000001 0.247 retina MG 13,776 Da C3a-desArg ELISA 0.00011 0.000179 0.000117 0.150 C3a-desArg SELDI 0.00030 0.000268 0.00015 0.541 MG 8,960 Da Las concentraciones de suero de C3a-desArg medidas por ELISA fueron significativamente superiores en pacientes de adenoma y carcinoma comparados con el grupo de control no canceroso (Figura 7A) . De conformidad con estos datos, fue posible una discriminación de individuos sanos de los pacientes con cáncer. Además, también fue posible una discriminación entre los individuos sanos y los pacientes de adenoma. Los resultados fueron muy similares a los datos logrados por el análisis SELDI-TOF MS (Figura 5B) . En la Figura 7, el trazo de difusión de ambos métodos (SELDI-TOF MS y ELISA) se muestra, demostrando una buena correlación (Figura 7A; r = 0.7) entre la intensidad de p8,960 medida por SELDI-TOF MS y la concentración de C3a-desArg medida por ELISA de cada paciente así como una buena correlación (Figura 7B, 4=0.81) entre la intensidad de pl3,776 medida por SELDI-TOF MS y la concentración de transtiretina medida por ELISA de cada paciente. Esto indica que los resultados son independientes del método de análisis. Los datos de transtiretina se generaron mediante análisis SELDI-TOF MS (Figura 6B) y se confirmaron mediante inmunodifusión radial (Figura 6A) . Entre los pacientes con cáncer colorrectal la transtiretina fue significativamente inferior comparada con los pacientes sin cáncer. Además, las concentraciones de transtiretina en suero de pacientes con adenoma es todavía significativamente inferior que en suero normal . El Cuadro 2 muestra la comparación de sensibilidad y especificidad de C3a-desArg, medida mediante SELDI-TOF MS y ELISA, respectivamente, para la discriminación entre controles sanos y pacientes con adenoma/tumor. Cuadro 2 C3a-desArg (controles sanos contra pacientes con Adenoma + Tumor) ELISA Sensibilidad 75% Especificidad 78% El Cuadro 3 muestra la comparación de sensibilidad y especificidad de transtiretina, medida mediante SELDI-TOF MS e inmunodifusión radial, respectivamente, para la discriminación entre controles sanos y pacientes con adenoma/tumor. Cuadro 3 Transtiretina (controles sanos contra pacientes con Adenoma+Tumor SELDI-TOF MS Inmunodifussión radial Sensibilidad 75% 88% Especificidad 90% 70% El Cuadro 4 muestra la comparación de sensibilidad y especificidad de ambos biomarcadores (C3a-desArg/transtiretina) en combinación. C3a-desArg y transtiretina se midieron mediante inmunoensayo para la discriminación entre controles sanos y pacientes con Adenoma/Tumor. Los valores de corte para transtiretina (TTR) y C3a-desArg se muestra entre corchetes. Cuadro 4 Combinación de C3a-desArg y transtiretina (controles sanos contra pacientes con AdenomatTumor) SELDI-TOF MS Inmunodifusión radialU/ELISA (TTR <0.22 y C3a-desArg >1000) Sensibilidad 70% 67% Especificidad 100% 89% El Cuadro 5 muestra la sensibilidad y especificidad de C3a-desArg como único biomarcador. Los niveles de C3a-desArg se midieron mediante ELISA para la discriminación entre controles sanos y pacientes con adenoma y/o tumor. Los valores de corte se muestran entre corchetes. Cuadro 5 C3a-desArg Normal vs. Normal vs. Normal vs. Adenoma Tumor Adenoma + Tumor Sensibilidad 79% 61% 75% ( < / > 990 ) (</> 1786 ] (</> 990) Especificidad 78% 93% 78% El Cuadro 6 muestra la sensibilidad y especificidad de transtiretina como biomarcador único. Los niveles de transtiretina se midieron mediante inmunodifusión radial para la discriminación entre controles sanos y pacientes con adenoma y/o tumor. Los valores de corte se muestran entre paréntesis. Cuadro 6 Transtiretina Normal vs. Normal vs. Normal vs. Adenoma Tumor AdenomatTumor Sensibilidad 86% 61% 88% (</> 0.225) (</> 0.65) (</> 0.22) Especificidad 68% 100% 70% El Cuadro 7 muestra la sensibilidad y especificidad de C3a-desArg y transtiretina (TTR) en combinación. Los niveles de transtiretina y C3a-desArg se midieron mediante ELISA e inmunodifusión radial, respectivamente. Los valores de corte se muestran entre paréntesis Cuadro 7 Combinación de Transtiretina (TTR) y C3a-desArg.

Normal vs . Adenoma Sensibilidad 97% (</> 0.225 TTR) Y (</> 1974 C3a-desArg) Especificidad 70% Estos datos muestran que C3a, opcionalmente en combinación con transtiretina, es (son) un excelente biomarcador para la detección de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal. En contraste con biomarcadores ya conocidos CEA y CA 19-9 es posible discriminar entre individuos sanos y pacientes con adenoma. La sensibilidad y especificidad de la prueba de C3a es elevada y permite una detección específica temprana de adenomas sin una colonoscopía. En particular, la combinación de los biomarcadores C3a y transtiretina permite la detección de adenomas con una excelente sensibilidad y especificidad elevada.

Claims (26)

1. REIVINDICACIONES 1.- Un método para detectar adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal, que comprende los pasos: (a) proporcionar un material de muestra aislada que se ha tomado de un individuo, (b) determinar el nivel de C3a o un derivado del mismo en el material de muestra aislada, (c) comparar el nivel determinado de C3a o un derivado del mismo con uno o más valores de referencia.
2. 2.- Un método para discriminar entre adenoma colorrectal y carcinoma colorrectal que comprende los pasos: (a) proporcionar un material de muestra aislado que se ha tomado de un individuo, (b) determinar el nivel de C3a o un derivado del mismo en el material de muestra aislado, (c) comparar el nivel determinado de C3a o un derivado del mismo con uno o más valores de referencia.
3. 3.- Un método para supervisar el desarrollo y/o el curso y/o el tratamiento de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal que comprende los pasos: (a) proporcionar un material de muestra aislado que se ha tomado de un individuo, (b) determinar el nivel de C3a o un derivado del mismo en el material de muestra aislado, (c) comparar el nivel determinado de C3a o un derivado del mismo con uno o más valores de referencia.
4. 4.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el nivel de C3a o un derivado del mismo en el material de muestra tomado de un paciente de adenoma colorrectal o carcinoma colorrectal es superior comparado con un material de muestra de un individuo sano.
5. 5.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde un primer aumento del nivel de C3a o un derivado del mismo en un primera material de muestra es indicativo de adenoma colorrectal y en donde un segundo aumento del nivel de C3a o un derivado del mismo en un segundo material de muestra, aislado del individuo en un punto posterior en tiempo que el primer material de muestra, es indicativo de carcinoma colorrectal, con la condición de que el segundo aumento sea más fuerte que el primer aumento.
6. 6.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde en el paso (b) uno o más biomarcadores adicionales para detectar adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal se determinan en el material de muestra aislado y en donde en el paso (c) el nivel determinado de los biomarcadores se compara con uno o más valores de referencia respectivos.
7. 7.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde cuando menos un biomarcador adicional para detectar adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal se selecciona opcionalmente del grupo que consiste de transtiretina, p53, CEA, CA 19-9, CA 15-3, CA-125, Kras, jff-Catenina, her-2/neu, plasma de proteína C-reactiva y derivados de los mismos, y mutaciones de genes de E-cadherina, MSH2, MSH3, MLH1, PMS1, PMS2, MSH6 e inestabilidad de microsatélite de MHLl o MSH2 y SNPs y combinaciones de los mismos.
8. 8.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde los valores de referencia de C3a y/o derivados del mismo y opcionalmente los valores de referencia de los biomarcadores adicionales y/o derivados de los mismos se calculan como el nivel promedio de C3a y/o un derivado del mismo y opcionalmente biomarcadores adicionales y/o derivados de los mismos en una pluralidad de muestras aisladas de un grupo respectivo de individuos, en donde el grupo de individuos son individuos sanos, pacientes de adenoma colorrectal y/o pacientes con carcinoma colorrectal.
9. 9.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el valor de referencia es el valor de referencia individual calculado como el nivel promedio de C3a y/o un derivado del mismo y opcionalmente de biomarcadores adicionales y/o derivados de los mismos determinado en una pluralidad de material de muestra aislado tomado del individuo durante un período de tiempo.
10. 10.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el material de muestra aislado es un fluido corporal y se selecciona opcionalmente del grupo que consiste en sangre, plasma de sangre, suero, médula de hueso, heces, fluido sinovial, fluido linfático, fluido cerebro espinal, esputo, orina, leche de madre, esperma, exudado y mezclas de los mismos.
11. 11.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el nivel de C3a y/o un derivado del mismo y opcionalmente de biomarcadores adicionales en el material de muestra se determina en ADN, mRNA y/o nivel de proteína.
12. 12.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el nivel de C3a y/o un derivado del mismo y opcionalmente de biomarcadores adicionales en el material de muestra se determina mediante una técnica de hibridización de ácido nucleico, métodos inmunológicos y técnica de proteómicos, y/o espectroscopia de masa.
13. 13.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el método de lleva a cabo en combinación con otros métodos de diagnóstico para adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal para aumentar la sensibilidad y/o especificidad .
14. 14.- Un uso de C3a o un derivado del mismo como un biomarcador para detección de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal en un individuo o una muestra aislada en un individuo.
15. 15.- El uso de conformidad con la reivindicación 14, para una detección temprana de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal en una muestra aislada de un individuo.
16. 16.- El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 o 15, en combinación con uno o más biomarcadores adicionales para adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal para aumentar la sensibilidad y/o especificidad.
17. 17.- El uso de conformidad con la reivindicación 16, en donde cuando menos un biomarcador adicional se selecciona opcionalmente del grupo que consiste en transtiretina, p53, CEA, CA 19-9, CA'l5-3, CA-125, Kras, ?-Catenina, her-2/neu, plasma de proteína C-reactiva y derivados de los mismos; y mutaciones de genes de E-cadherina, MSH2, MSH3, MLH1, PMS1, PMS2, MSH6; y inestabilidad de microsatélite de MHLl o MSH2 y SNPs y combinaciones de los mismos.
18. 18.- Un sistema de prueba para detectar adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal en un material de muestra aislado de un individuo, que comprende: (a) un anticuerpo o un receptor que se liga a un epítope de C3a o un derivado del mismo, (b) un soporte sólido que soporte el anticuerpo o receptor, (c) un reactivo para detectar el enlace del epítope de C3a o un derivado del mismo al anticuerpo o receptor.
19. 19.- El sistema de prueba de conformidad con la reivindicación 18, en donde el sistema de prueba comprende uno o más anticuerpos o receptores para detección de uno o más biomarcadores adicionales para adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal.
20. 20.- El sistema de prueba de conformidad con la reivindicación 19, en donde cuando menos un biomarcador adicional se selecciona opcionalmente del grupo que consiste en transtiretina, p53, CEA, CA 19-9, CA 15-3, CA-125, Kras, ?-Catenina, Her-2/neu, plasma de proteína C-reactivo y derivados de los mismos; y mutaciones de genes de E-cadherina, MSH2, MSH3, MLH1, PMS1, PMS2, MSH6; e inestabilidad de microsatélite de MHLl o MSH2 y SNPs y combinaciones de los mismos.
21. 21.- Una disposición que comprende moléculas de detección para detectar adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal en un individuo, que comprende como molécula de detección: (a) una sonda de ácido nucleico inmovilizada a un soporte sólido para ligarse a y detectar mRNA que codifica C3a o un derivado del mismo, o (b) un anticuerpo inmovilizado sobre un soporte sólido para ligarse a y detectar un epítope de C3a o un derivado del mismo, o (c) un receptor inmovilizado a un soporte sólido para ligarse a y detectar un epítope de C3a o un derivado del mismo, en donde de preferencia cada una de cantidades diferentes de moléculas de detección se inmovilizan a un soporte sólido para aumentar la precisión de la cuantificación.
22. 22.- La disposición de conformidad con la reivindicación 21, en donde el sistema de prueba comprende uno o más anticuerpos o receptores para detección de uno o más biomarcadores adicionales para adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal.
23. 23.- La disposición de conformidad con la reivindicación 22, en donde cuando menos un biomarcador adicional se selecciona opcionalmente del grupo que consiste en transtiretina, p53, CEA, CA 19-9, CA 15-3, Ca-125, Kras, jff-Catenina, Her-2/neu, plasma de proteína C-reactivo y derivados de los mismos; y mutaciones en genes de E-cadherina, MSH2, MSH3, MLHl, PMSl, PMS2, MSH6; e inestabilidad de microsatélite de MHLl o MSH2 y SNPs y combinaciones de los mismos.
24. 24.- Un método para determinar si un compuesto es efectivo en el tratamiento de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal que comprende los pasos: (a) tratar a un paciente de adenoma colorrectal o carcinoma colorrectal con un compuesto, (b) determinar el nivel de C3a o un derivado del mismo en un material de muestra del paciente, y (c) comparar el nivel determinado de C3a o un derivado del mismo con uno o más valores de referencia.
25. 25.- Un método de conformidad con la reivindicación 24, en donde en el paso b) , el nivel de un biomarcador adicional se determina y se compara en el paso c) con uno o más valores de referencia respectivos.
26. 26.- Un método de conformidad con la reivindicación 25, en donde cuando menos un biomarcador adicional se selecciona opcionalmente del grupo que consiste en transtiretina, p52, CEA, CA 19-9, CA 15-3, CA-125, Kras, jff-Catenina, Her-2/neu, plasma de proteína C-reactivo y derivados de los mismos; y mutaciones en genes de E-cadherina, MSH2, MSH3, MLHl, PMSl, PMS2, MSH6; e inestabilidad de microsatélite de MHLl o MSH2 y SNPs y combinaciones de los mismos.