JP2013253780A - うつ病の診断のためのデータの提供方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】非専門医では充分評価が難しかった被験者のうつ病の罹患状態を、客観的且つ高い精度で評価し、うつ病の早期発見、早期治療開始につながる新規のうつ病の診断のためのデータ提供方法を提供する。
【解決手段】血清中のIL−2レセプターアルファ、マクロファージ遊走阻止因子、アディポネクチン、脳由来神経栄養因子からなる群より選択される2つ以上の蛋白質の濃度を測定した後、これらの組合せによりうつ病の診断を行う。
【選択図】なし
【解決手段】血清中のIL−2レセプターアルファ、マクロファージ遊走阻止因子、アディポネクチン、脳由来神経栄養因子からなる群より選択される2つ以上の蛋白質の濃度を測定した後、これらの組合せによりうつ病の診断を行う。
【選択図】なし
Description
本発明は、うつ病の診断のためのデータの提供方法に関する。
うつ病の生涯罹患率は10%前後であり、国内で約100万人が罹患し、潜在患者はその数倍いると推定され、大きな社会問題となっている。また、世界中には、1億2千万人のうつ病患者がいると考えられているが、そのうち4分の3以上は満足な治療を受けていない(WHO)。うつ病は早期に適切な治療を開始すれば多くは回復する疾患であるが、客観的な精度の高い確立された診断法がなく、多くの患者の発見が遅れ、重篤化しているのが現状である。国内では、10年連続で毎年3万人以上(世界では約85万人)の自殺者が発生し、その6〜7割は自殺前にうつ病に陥っているといわれている。その人的・経済的損失は2兆7000億円と推計されており(2010年厚生労働省発表)、日本社会の発展を妨げる大きな要因となっており、世界的に見ても先進国、新興国とも同じ問題を抱えている。
うつ病の診断は、十分な専門知識と経験を有する精神科医や心療内科医による患者面接と診察に頼ってきた。精神科医や心療内科医がうつ病を診断するためには、病歴の聴取から始まり、心理行動面の症状の出現時期、出現の様子、社会生活上の支障の状況等を把握した上で、一般的身体状態及び神経学的状態に大きな異常のないことを確認し、世界保健機構(WHO)やアメリカ精神医学会による診断基準(ICD−10、DSM−IV、HAM−D等)と照合して診断を確定するのが一般的である。これには、熟練を要するとともに、患者との対話に相当の時間(少なくとも1時間程度)を割く必要がある。
一方、うつ病患者の多くは最初から専門医を受診せず、うつ病と気付かずに体の変調や不定愁訴に対する治療を求めて内科等の非専門医を受診しているのが現状である。ところが内科医等は、患者との対話に時間を割くことは難しく、客観的検査所見がなく、熟練を要するうつ病の診断を行うことは容易なことではない。そのため客観的且つ簡便で精度の高いうつ病の診断指標が求められている。WHOも、うつ病の診断や治療におけるプライマリーケアの重要性を指摘している。
うつ病の客観的指標とその臨床診断への応用を目指し、これまで様々な取り組みが行われた。現在、脳の活動状態を調べる手法と、血液等に存在する生体分子を調べる手法の二つに大別される。
脳の活動状態を調べる手法では、早くから脳波による手法の開発が進められたが、測定環境や背景要因が大きく影響し、現在ではほとんど研究されていない。一方、脳内の血流量(酸化ヘモグロビン量)を測定する近赤外分光法(NIRS)(非特許文献1)や単光子放射法(SPECT)(非特許文献2)の装置を用いたうつ病診断の研究が行われている。特にNIRSは、日本の先進医療制度の中で、うつ病診断の補助的装置として使用が始まっている。ただし、NIRS装置は高価(数千万円)であり、一般病院への普及は難しく、双極性障害と鑑別診断が可能といった特徴はあるが、大うつ病の診断精度自体は67%程度でそれほど高くはない。一般的に装置による診断法の普及は、教育を受けた専門技師の増員に年数を要するなどの理由で、血液検査(一般に4年で100%普及)と比較して圧倒的に遅い。
血液中などの生体分子を調べる方法では、国立精神・神経センターの研究グループが、質量分析装置による血漿中蛋白質分解産物の網羅的調査で、うつ病患者で特有に認められる200種程度のペプチド断片を見出した(特許文献1)。現状では、患者検体をその都度質量分析装置にかけて解析する必要があり簡便な手法とは言い難い。各々のペプチド断片に対する抗体を作製すれば、簡便な測定法が開発できる可能性があるが、多数のペプチド断片に対して特異性の高い抗体を得るのは難しく、実用的な診断法の開発までには、まだ相当の時間を要すると考えられる。
また、血液中のクレアチンキナーゼMM濃度が、健常者のうつ傾向と関連するとの報告がある(特許文献2)。健常者の抑うつ度のスコアーが高くなるほど、クレアチンキナーゼMMの濃度が低くなる傾向があるが、うつ病の発症時にクレアチンキナーゼMMが低くなることを示したデータはない。
一方、DNAチップによる遺伝子発現解析により、うつ病に関連する機能的候補遺伝子がいくつも見出されており、これらの遺伝子の発現解析を行うDNAチップによるうつ病の診断方法の報告がある(特許文献3)。診断精度は80%以上であり、有望な手法であるが、測定再現性や施設間差異、測定コストや測定時間、使用血液量の多さなどの課題があり、体外診断薬としての実用化にはまだ多くのハードルがある。
さらに、脳由来神経栄養因子(BDNF)を指標にしようとする試みがある。うつ病患者では海馬のBDNF量が低下しており(非特許文献3)、血液中のBDNF量が正常者に比べて減少しているとの報告(非特許文献4)や、逆に前駆体型BDNFが増加しているとの新聞報道がある。ただし、血液中BDNF量は個人差が大きく、BDNF単項目のみで充分な診断精度を得るのは困難である。また、前駆体型と成熟型のBDNFを区別して測定できるような測定系はまだ開発されていない。
また、血液中の様々なサイトカインが、うつ状態(傾向)やうつ病と関連して増減するとの報告は多くある。例えば、MIF(マクロファージ遊走阻害因子)については、うつ傾向のある健常者では、うつ傾向のない健常者と比べて40%高いとの報告がある(非特許文献5)。ただし、うつ病患者で、MIFが増加するといった報告はまだない。アディポネクチンは、脂肪細胞が特異的に分泌するサイトカイン(アディポサイトカイン)であり、内臓脂肪量との相関があることが指摘されているほか、うつ病との関係を報告した例がある(非特許文献6)。アディポネクチンは、多量体形成した高分子量型が、病態とより深く関わっていると考えられているが、うつ傾向の高い健常高齢者では、低分子量型に対する高分子量型の比率が高くなるとの報告がある(非特許文献7)。
このように、うつ傾向やうつ病とサイトカインの関連を指摘する報告は存在するものの、実際にうつ病の診断に実用的に用いられた例はまだ存在しない。血液中のサイトカインは大変微量であり、高い再現性で測定するためには、きわめて特異性の高い抗体を用いた微量測定系の使用が必要である。また、多くのサイトカインの血中濃度は、個人差が大きく、日内変動するものもある。例えばIL−2やIL−1β、TNF−α、IL−8、IL−10、IL−2Rα濃度は、うつ病で増加するとの報告と低下するとの報告の両方があり(非特許文献8、非特許文献9、非特許文献10)、用いる測定試薬キットの感度や特異性の問題、個人差や日内変動等の問題等によって、分析結果が異なっているものと考えられる。これは、サイトカインをうつ病の診断指標に利用しようとした場合の大きな問題点であり、個別のサイトカインを単独で用いる場合は、これまでうつ病の診断に有効な指標とはなり得なかった。
Suto et al. Biol. Psychiatry. 55, 501-511, 2004
Segawa et al. Psychiatry Res. 147, 135-143, 2006
Chen et al. Biol. Psychiatry. 50, 260-265, 2001
Shimizu et al., Biol. Psychiatry. 54, 70-75, 2003
Edwards et al. Brain, Behavior, and Immunity Apr 9, 2010
Lehto et al. Acta Psychiatrica scandinavica 121, 209-215, 2010
Narita et al. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry 32, 124-127, 2008
Dowlati et al. Biological Psychiatry 67, 446-457, 2010
Maes et al. Eur Psychiatry 10, 397-403, 1995
Eller et al. Medicina (Kaunas) 45, 971-977, 2009
本発明の目的は、非専門医では充分に評価が難しかった被験者のうつ病の罹患状態を、客観的且つ高い精度で評価し、うつ病の早期発見、早期治療開始につながる新規のうつ病の診断のためのデータの提供方法を提供することである。
本発明者等は、うつ病患者と健常者で、複数のサイトカイン関連因子の濃度を調査した結果、うつ病患者と健常者では、各サイトカインの濃度パターンが異なることを発見し、統計学的な解析手法を用いることで、2種類以上のサイトカイン関連因子の濃度を測定することで、臨床診断等への実用化が可能なレベルの診断精度(感度70%以上、特異度70%以上)が得られることを見出し、発明を完成した。
したがって、本発明は、下記のとおりである。
[1]血清中のIL−2レセプターアルファ、マクロファージ遊走阻止因子、アディポネクチン、脳由来神経栄養因子からなる群より選択される2つ以上の蛋白質の濃度を測定することを含む、うつ病の診断のためのデータの提供方法。
[2]うつ病が、大うつ病である、[1]に記載のデータの提供方法。
[3]うつ病の診断が、サポートベクターマシンによって判定される、[1]に記載のデータの提供方法。
[4]蛋白質が、IL−2レセプターアルファ、マクロファージ遊走阻止因子、アディポネクチン、脳由来神経栄養因子からなる群より選択される3つ以上であるか又はマクロファージ遊走阻止因子とIL−2レセプターアルファ、アディポネクチン若しくは脳由来神経栄養因子との組合せであり、うつ病の診断が、k近傍法によって判定される、[1]に記載のデータの提供方法。
[5]三量体マクロファージ遊走阻止因子を認識する抗体を含む、うつ病診断用組成物。
[6]三量体マクロファージ遊走阻止因子が、カイコによって発現されたものである、[5]に記載のうつ病診断用組成物。
[7]さらに、対照としてカイコによって発現された三量体マクロファージ遊走阻止因子を含む、[5]又は[6]に記載のうつ病診断用組成物。
[1]血清中のIL−2レセプターアルファ、マクロファージ遊走阻止因子、アディポネクチン、脳由来神経栄養因子からなる群より選択される2つ以上の蛋白質の濃度を測定することを含む、うつ病の診断のためのデータの提供方法。
[2]うつ病が、大うつ病である、[1]に記載のデータの提供方法。
[3]うつ病の診断が、サポートベクターマシンによって判定される、[1]に記載のデータの提供方法。
[4]蛋白質が、IL−2レセプターアルファ、マクロファージ遊走阻止因子、アディポネクチン、脳由来神経栄養因子からなる群より選択される3つ以上であるか又はマクロファージ遊走阻止因子とIL−2レセプターアルファ、アディポネクチン若しくは脳由来神経栄養因子との組合せであり、うつ病の診断が、k近傍法によって判定される、[1]に記載のデータの提供方法。
[5]三量体マクロファージ遊走阻止因子を認識する抗体を含む、うつ病診断用組成物。
[6]三量体マクロファージ遊走阻止因子が、カイコによって発現されたものである、[5]に記載のうつ病診断用組成物。
[7]さらに、対照としてカイコによって発現された三量体マクロファージ遊走阻止因子を含む、[5]又は[6]に記載のうつ病診断用組成物。
本発明の方法は、末梢血白血球を回収する必要のあるDNAチップや、特殊な高価な装置(NIRS等)を用いる方法と比べて、一般の臨床診断で日常的に用いられる少量の血液検体(血清等)を直接用い、より簡便且つ低コストでうつ病を評価可能である。既存の臨床検査センターや病院検査室のラインに容易に導入可能であり、地域の診療所から専門病院まで広く普及させることが可能である。診断精度に関しても、DNAチップ等と比較し何ら問題ない。
本発明によれば、従来十分な専門知識と経験を有する精神科医や心療内科医が、患者面接と診察により時間をかけて行ってきたうつ病の診断が、プライマリーケア医師のような非専門医においても、一般的な血液検査により客観的に高精度で簡便に行うことが可能になる。これにより、これまで見逃されてきたうつ病患者を早期発見し、専門医による治療を早期に開始することが可能となる。
うつ病を評価可能なDNAチップによる評価法と比べても、簡便且つ低コストであり、より少量の検体で短時間に評価が可能であることから実用性が高い。
本発明のうつ病評価方法は、体外診断薬(免疫血清学検査)としての製品化が可能であり、既存の臨床検査センターや病院検査室のラインに容易に導入可能であり、地域の診療所から専門病院まで広く普及させることが可能である。
本発明において、血清中のサイトカイン関連因子の濃度の測定方法は、従来公知の任意の方法を用いることができるが、好ましくは、ELISAまたは抗体アレイである。
本発明の測定値の評価方法は、従来公知の任意の方法を用いることができるが、好ましくは、k近傍法又はサポートベクターマシンである。
k近傍法では、はじめに学習用サンプルを全て取り込み、次に新たに追加されるサンプルの応答を適当な数(k)の近傍を分析し、追加されたサンプルのクラスを予測する。この手法は、予測のために与えられたベクトルの近傍にある既知の応答を用いて特徴ベクトルを調べる怠惰学習 (lazy learning) の一種である。
本発明において、得られたサイトカイン濃度データは、各サイトカインごとに検体群の中央値で除算された後、k近傍法にて解析された。このとき、カットオフp値=0.5、k値は各サイトカインセットごとに最も正答率が高い値を採用した。解析にはアジレント・テクノロジー株式会社の解析ソフトであるGeneSpringGX7.3を用いた。
サポートベクターマシンは、教師あり学習を用いる識別手法の一つである。ニューロンのモデルとして最も単純な線形しきい素子を用いて、2クラスのパターン識別器を構成する手法であり、訓練サンプル 集合から、「マージン最大化」という基準で線形しきい素子のパラメータを学習する。
サポートベクターマシンによる解析においても、k近傍法と同様に、得られたサイトカイン濃度データは、各サイトカインごとに検体群の中央値で除算された値を用いた。解析には統計解析環境R(http://cran.md.tsukuba.ac.jp/ より入手)の kernlab パッケージ(http://cran.md.tsukuba.ac.jp/bin/windows/contrib/2.10/kernlab_0.9−10.zip)のksvm関数を用い、カーネル関数を“rbfdot”(ガウシアン)とし、sigma=0.5で解析を行った。
k近傍法では、はじめに学習用サンプルを全て取り込み、次に新たに追加されるサンプルの応答を適当な数(k)の近傍を分析し、追加されたサンプルのクラスを予測する。この手法は、予測のために与えられたベクトルの近傍にある既知の応答を用いて特徴ベクトルを調べる怠惰学習 (lazy learning) の一種である。
本発明において、得られたサイトカイン濃度データは、各サイトカインごとに検体群の中央値で除算された後、k近傍法にて解析された。このとき、カットオフp値=0.5、k値は各サイトカインセットごとに最も正答率が高い値を採用した。解析にはアジレント・テクノロジー株式会社の解析ソフトであるGeneSpringGX7.3を用いた。
サポートベクターマシンは、教師あり学習を用いる識別手法の一つである。ニューロンのモデルとして最も単純な線形しきい素子を用いて、2クラスのパターン識別器を構成する手法であり、訓練サンプル 集合から、「マージン最大化」という基準で線形しきい素子のパラメータを学習する。
サポートベクターマシンによる解析においても、k近傍法と同様に、得られたサイトカイン濃度データは、各サイトカインごとに検体群の中央値で除算された値を用いた。解析には統計解析環境R(http://cran.md.tsukuba.ac.jp/ より入手)の kernlab パッケージ(http://cran.md.tsukuba.ac.jp/bin/windows/contrib/2.10/kernlab_0.9−10.zip)のksvm関数を用い、カーネル関数を“rbfdot”(ガウシアン)とし、sigma=0.5で解析を行った。
以下、実施例によって本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらには限定されない。
大うつ病を評価するための指標となる血清内蛋白質のスクリーニング
1.大うつ病患者
対象者は、防衛医科大学校病院(埼玉県所沢市)精神科受診者のうち、米国精神医学会の診断基準 DMS-IV(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders DSM-IV-TR,American Psychiatric Association,2000)により大うつ病(Mejor Depression)と診断され、HAM−D(Hamilton‘s Rating Scale for Depression,International Society for CNS Drug Development,2003)が16以上であり、かつ本評価法開発のための研究に参加することについて文章により説明し同意を得た者とした。同意を得られた各人から血液の採取を行った。防衛医科大学校病院におけるうつ病患者の構成は、男性が8人、女性が14人、不明12人の計34人である。平均年齢は56.5歳であり、最高齢が87歳、最年少が29歳であった。なお本研究は防衛医科大学病院倫理委員会の承認を得たうえで実施した。
1.大うつ病患者
対象者は、防衛医科大学校病院(埼玉県所沢市)精神科受診者のうち、米国精神医学会の診断基準 DMS-IV(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders DSM-IV-TR,American Psychiatric Association,2000)により大うつ病(Mejor Depression)と診断され、HAM−D(Hamilton‘s Rating Scale for Depression,International Society for CNS Drug Development,2003)が16以上であり、かつ本評価法開発のための研究に参加することについて文章により説明し同意を得た者とした。同意を得られた各人から血液の採取を行った。防衛医科大学校病院におけるうつ病患者の構成は、男性が8人、女性が14人、不明12人の計34人である。平均年齢は56.5歳であり、最高齢が87歳、最年少が29歳であった。なお本研究は防衛医科大学病院倫理委員会の承認を得たうえで実施した。
2.健常者
健常者は、A病院とB病院で従事する職員のうち、本評価法開発のための研究に参加することについて文章により説明し同意を得た44名から構成された。この44名の構成は、男性が19人、そして女性が25人であり、平均年齢は53.5歳であり、最高齢が74歳、最年少が27歳であった。この44名について、うつ病患者の場合と同様に、各人の血液サンプルを採取した。
健常者は、A病院とB病院で従事する職員のうち、本評価法開発のための研究に参加することについて文章により説明し同意を得た44名から構成された。この44名の構成は、男性が19人、そして女性が25人であり、平均年齢は53.5歳であり、最高齢が74歳、最年少が27歳であった。この44名について、うつ病患者の場合と同様に、各人の血液サンプルを採取した。
3.血清内蛋白質測定用抗体の作製とサンドイッチELISA系の構築
本発明において、血清中蛋白質の測定には、当業者において公知の方法である一般的なモノクローナル抗体作製手法に基づき作製した抗体を使用した。これらの抗体は、感作抗原となる蛋白質を通常の免疫方法に従って動物(マウス)に免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製した。
本発明において、血清中蛋白質の測定には、当業者において公知の方法である一般的なモノクローナル抗体作製手法に基づき作製した抗体を使用した。これらの抗体は、感作抗原となる蛋白質を通常の免疫方法に従って動物(マウス)に免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製した。
感作抗原として用いる蛋白質は、IL−2レセプターアルファ(IL−2Rα)、マクロファージ遊走阻止因子(MIF)、アディポネクチン、脳由来神経栄養因子(BDNF)とし、各蛋白質の遺伝子をクローニングし、カイコを宿主としたバキュロウイルス蛋白質生産系を使用し生産した。生産した蛋白質はアフィニティークロマトグラフィーやイオン交換クロマトグラフィーなどの公知の方法で精製し、感作抗原とした。
各蛋白質について得られた複数のモノクローナル抗体を組み合わせて用いることで、サンドイッチELISA測定系の構築を行った。
特に、上記の方法で今回取得した抗MIFモノクローナル抗体(以下、抗MIF#13−1抗体と記載)は、単量体に加え三量体のMIFと反応する特徴を持つ。
カイコを宿主としたバキュロウイルス蛋白質生産系で作製したc末strep−Tag融合型MIFの分子量を、ゲルろ過クロマトグラフィー法で測定したところ、図1に示すとおり約41kDaという結果を得た。これはc末strep−Tag融合型MIF単量体の分子量14.1kDa(理論値)の約3倍であった。さらに、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(還元条件下)によって推定される分子量は単量体とほぼ同等であり、さらに単量体MIF以外の蛋白質のバンドは見られなかった(図2)。また、超遠心分析法による分析によっても、三量体を形成していることを確認した。これらの結果から、カイコを宿主としたバキュロウイルス蛋白質生産系で作製したc末strep−Tag融合型MIFは三量体であると考えられる(以下、カイコ発現三量体MIFと記載)。
このカイコ発現三量体MIFと抗MIF#13−1抗体の親和性を、BIAcore X−100(GE Healthcare UK Ltd.,England)で測定した。その結果、カイコ発現三量体MIFに対する親和性はKD(M)=1.17×10−9であった。また、単量体MIFとして市販の大腸菌発現MIF(289MF(R&D Systems,USA))を用いて、この大腸菌発現MIFに対する親和性を測定した。その結果、KD(M)=3.64×10−9となり、抗MIF#13−1抗体は、単量体MIF、三量体MIFのいずれにも非常に高い親和性をもつことが示された。
さらに、カイコ発現三量体MIFと大腸菌発現単量体MIF(289MF(R&D Systems,USA))の希釈系(25000〜6.1pg/ml)を抗原として、サンドイッチELISA測定で抗MIF#13−1抗体と市販抗MIF抗体(MAB289抗体(R&D Systems,USA)の各抗原への反応性を比較した。比較する抗MIF#13−1抗体と市販抗MIF抗体は、ともに補足用抗体として使用した。二次抗体は同一の抗体(BAF289(R&D Systems,USA))を用いた。検出にはストレプトアビジンHRP(N−100(Endogen, Inc.,USA))とTMB基質(50−76−00(Kirkegaard & Perry Laboratries,Inc.,USA))を用い、検出波長450nmで吸光度を測定した。
抗MIF#13−1抗体は、カイコ発現三量体MIFと大腸菌発現単量体MIFのいずれにも良好な反応を示した。これはBIAcore X−100での親和性評価と良く一致する。一方、市販抗MIF抗体は大腸菌発現単量体MIFには反応するが、カイコ発現三量体MIFにはほとんど反応しなかった(図3)。
4.血清中蛋白質存在量の測定
大うつ病患者と健常者から、空腹時に医師または看護師が安静下に肘静脈より約5cc採血した。この血液サンプルは30分以上室温下で静置した後、2000gで遠心した上清を血清として回収した。これらの血清は測定に使用するまで摂氏マイナス80度の冷凍状態で保存された。
大うつ病患者と健常者から、空腹時に医師または看護師が安静下に肘静脈より約5cc採血した。この血液サンプルは30分以上室温下で静置した後、2000gで遠心した上清を血清として回収した。これらの血清は測定に使用するまで摂氏マイナス80度の冷凍状態で保存された。
上記で得た血清を用いて各蛋白質の血清中存在量を測定した。血清中の蛋白質の存在量は、3.で作製した血清内蛋白質測定用抗体を用いたサンドイッチELISA法により定量した。これらのサイトカインの測定結果を表1に示す。
5.うつ病患者と健常者の判定
はじめに、表1に示した4種類のマーカー蛋白質について、それぞれ1項目のみで判定可能であるかを検討するため、うつ病患者34名と健常者44名の測定値を用いて、Mann−Whitney有意差検定を行った。Mann−Whitney有意差検定には GraphPad Prism5.02(GraphPad Software, Inc.,CA,USA)を用い、有意水準はp < 0.05とした。4種類のマーカータンパク質の測定値の分布を図4に示す。
はじめに、表1に示した4種類のマーカー蛋白質について、それぞれ1項目のみで判定可能であるかを検討するため、うつ病患者34名と健常者44名の測定値を用いて、Mann−Whitney有意差検定を行った。Mann−Whitney有意差検定には GraphPad Prism5.02(GraphPad Software, Inc.,CA,USA)を用い、有意水準はp < 0.05とした。4種類のマーカータンパク質の測定値の分布を図4に示す。
その結果、図4に示すとおり、4種類のすべてのマーカーにおいてnot significant(ns)、すなわち有意差は見られず、うつ病患者と健常者を判別できる有効なカットオフ値を見出すことはできなかった。
5−1.k近傍法によるうつ病患者と健常者の判定
防衛医科大学病院で収集した大うつ病患者34名から採取した血清検体と、大うつ病患者と年齢・性別の分布がおよそ同じになるように健常者から44名を選んだ(表2)。これらの78名分の血清検体における、4種類のサイトカイン存在量データを用いて判別分析を行った。解析にはk近傍法を用いて、大うつ病患者と健常人の判別を行い、感度と特異性を求めた。
防衛医科大学病院で収集した大うつ病患者34名から採取した血清検体と、大うつ病患者と年齢・性別の分布がおよそ同じになるように健常者から44名を選んだ(表2)。これらの78名分の血清検体における、4種類のサイトカイン存在量データを用いて判別分析を行った。解析にはk近傍法を用いて、大うつ病患者と健常人の判別を行い、感度と特異性を求めた。
k近傍法による解析にはGeneSpring ver.7.3(アジレント・テクノロジー(株))を用い、GeneSpringの操作法(Agerent Technologies,Inc.2005)に示された方法に準拠して行った。
表1のサイトカインから、k近傍法により、大うつ病患者と健常人を判別するアルゴリズム(以下k近傍法判別アルゴリズムと記載)を設定した。
被験者に大うつ病患者か健常者か分からないようにランダムな測定番号を付与し、上記で設定したk近傍法判別アルゴリズム(カットオフp値=0.5)を用いて大うつ病患者と健常状態を判別した。
ブラインドしてあったサンプル名とk近傍法判別アルゴリズムにより判定した結果を照合すると、大うつ病患者34名のうち25名が大うつ病患者の判定となり、正答率(感度)は73.5%であった。誤答(健常判定)は5名で、残りの4名は判定不能であった。一方、健常者44名のうち35名が健常と判定され、正答率(特異度)は79.5%であった。誤答(うつ病判定)は5名で、残りの4名は判定不能であった。
5−2.サポートベクターマシンによるうつ病患者と健常者の判定
同様に、表1のサイトカインからサポートベクターマシンにより34名の大うつ病患者と44名の健常者を判別する血清判別用計算式を設定した。
同様に、表1のサイトカインからサポートベクターマシンにより34名の大うつ病患者と44名の健常者を判別する血清判別用計算式を設定した。
サポートベクターマシンによる解析は、統計解析環境R(http://cran.md.tsukuba.ac.jp/ より入手)の kernlab パッケージ(http://cran.md.tsukuba.ac.jp/bin/windows/contrib/2.10/kernlab_0.9−10.zip)の ksvm 関数を用い、カーネル関数を “rbfdot” (ガウシアン) とし、sigma = 0.5 で解析を行った。
被験者に、大うつ病患者か健常者か分からないようにランダムな測定番号を付与し、上記で設定した判別用計算式を用いて大うつ病患者と健常状態を判別した。
ブラインドしてあったサンプル名とサポートベクターマシンにより判定した結果を照合すると、大うつ病患者34名のうち31名が大うつ病患者の判定となり、正答率(感度)は91.2%であった。残りの3名は誤答であり、判定不能はなかった。一方、健常者44名のうち44名が健常と判定され、正答率(特異度)は100%であった。
表1に示した4種類の蛋白質の血清中の濃度によって、k近傍法またはサポートベクターマシンのどちらの判別方法を用いても、大うつ病患者と健常者をそれぞれ70%以上の正答率で判別することができた。従ってこの4種類の血清中の蛋白質は、被験者がうつ状態にあるか否かをスクリーニングするマーカー蛋白質として有用である。
判別に利用するマーカー蛋白質数を変動させた場合の判定結果の評価
表1に示した4種類のマーカー蛋白質を様々に組み合わせ、k近傍法を用いた大うつ病患者判定の正答率(感度)と健常者判定の正答率(特異度)を算出し、感度と特異度を加算して100%以上を診断可否の基準とした。
表1に示した4種類のマーカー蛋白質を様々に組み合わせ、k近傍法を用いた大うつ病患者判定の正答率(感度)と健常者判定の正答率(特異度)を算出し、感度と特異度を加算して100%以上を診断可否の基準とした。
これらのマーカーの組み合わせと診断可否の結果を表3に示す。
表1に示した4種類のマーカー蛋白質を様々に組み合わせ、サポートベクターマシンを用いた大うつ病患者判定の正答率(感度)と健常者判定の正答率(特異度)を算出し、感度と特異度を加算して100%以上を診断可否の基準とした。当該数値が大きいほど、診断精度が高いと考えられる。
これらのマーカーの組み合わせと診断可否の結果を表4に示す。
7.市販の抗体を使用した場合のうつ病患者と健常者の判別結果
一般に市販されているMIF測定サンドイッチELISA系(単量体のみ測定可能)としてR&D Systems社 MAB289抗体(補足用抗体)とBAF289(検出用抗体)を、IL−2Rαの測定には、実施例1の3.で作製した補足用抗体及び検出用抗体(片倉作製抗体)を用いて、実施例1の5.で示した健常者検体44名と大うつ病患者34名の血清中の蛋白質濃度を測定した。上記の抗体以外の試薬類も5.で使用したものと同じ材料を用い、測定手法や解析手法も5.に準じて行った。
一般に市販されているMIF測定サンドイッチELISA系(単量体のみ測定可能)としてR&D Systems社 MAB289抗体(補足用抗体)とBAF289(検出用抗体)を、IL−2Rαの測定には、実施例1の3.で作製した補足用抗体及び検出用抗体(片倉作製抗体)を用いて、実施例1の5.で示した健常者検体44名と大うつ病患者34名の血清中の蛋白質濃度を測定した。上記の抗体以外の試薬類も5.で使用したものと同じ材料を用い、測定手法や解析手法も5.に準じて行った。
血清中のMIFを市販抗体サンドイッチELISA系で測定した結果、一部の血清検体(8検体)で検出限界以下となり濃度の測定ができなかった。これらの検体は欠損値として処理し、うつ病患者と健常人をk近傍法にて判別した。その結果、大うつ病患者34名のうち19名が大うつ病患者の判定となり、正答率(感度)は55.9%であった。誤答(健常判定)は11名で、残りの4名は判定不能であった。一方、健常者44名のうち23名が健常と判定され、正答率(特異度)は52.3%であった。誤答(うつ病判定)は8名で、残りの13名は判定不能であった。
一方、血清中のMIF(三量体MIFを含む)を、抗MIF#13−1抗体(片倉作製抗体)を用いたサンドイッチELISA系で測定した場合は(血清中のIL−2Rαも片倉作製抗体を使用)、それぞれ78検体の全てで濃度測定が可能であった。また、うつ病患者と健常人をk近傍法で判別した結果は、上記実施例2の表3にも示したとおり、感度は41.2%、特異度は90.9%であった。
今回構築したサンドイッチELISA系(片倉作製抗体と記載)または市販サンドイッチELISA系(市販抗体と記載)を用いたときの判定比較を表5に示す。感度と特異度を加算した数値は、MIF及びIL−2Rαともに片倉作製抗体を用いた場合132.1であるので対し、MIFの測定に市販抗体を用いた場合は108.3であり、片倉作製抗体を用いるほうが、診断精度が高い結果となった。
本発明は、うつ病の評価のために有用である。
Claims (7)
- 血清中のIL−2レセプターアルファ、マクロファージ遊走阻止因子、アディポネクチン、脳由来神経栄養因子からなる群より選択される2つ以上の蛋白質の濃度を測定することを含む、うつ病の診断のためのデータの提供方法。
- うつ病が、大うつ病である、請求項1に記載のデータの提供方法。
- うつ病の診断が、サポートベクターマシンによって判定される、請求項1に記載のデータの提供方法。
- 蛋白質が、IL−2レセプターアルファ、マクロファージ遊走阻止因子、アディポネクチン、脳由来神経栄養因子からなる群より選択される3つ以上であるか又はマクロファージ遊走阻止因子とIL−2レセプターアルファ、アディポネクチン若しくは脳由来神経栄養因子との組合せであり、うつ病の診断が、k近傍法によって判定される、請求項1に記載のデータの提供方法。
- 三量体マクロファージ遊走阻止因子を認識する抗体を含む、うつ病診断用組成物。
- 三量体マクロファージ遊走阻止因子が、カイコによって発現されたものである、請求項5に記載のうつ病診断用組成物。
- さらに、対照としてカイコによって発現された三量体マクロファージ遊走阻止因子を含む、請求項5又は6に記載のうつ病診断用組成物。
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WO2015174544A1 (ja) * | 2014-05-16 | 2015-11-19 | 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター | 精神疾患判定マーカー |
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CA2252727A1 (en) * | 1998-11-03 | 2000-05-03 | Ridha Joober | Polyglutamine containing proteins and use thereof for diagnosis and treatment of cag repeat-linked neuropsychiatric disorders |
ATE376674T1 (de) * | 2004-08-13 | 2007-11-15 | Indivumed Gmbh | Verwendung von transthyretin als biomarker zum nachweis von kolorektalen adenomen; verfahren und nachweis-system |
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WO2015174544A1 (ja) * | 2014-05-16 | 2015-11-19 | 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター | 精神疾患判定マーカー |
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