ES2295907T3 - Uso de transtiretina como biomarcador para ademona colorrectal; metodo para la deteccion y sistema de ensayo. - Google Patents
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Abstract
Un método para detectar adenoma colorrectal, que comprende las etapas de: a) proporcionar un material de muestra aislado que se ha tomado de un individuo, b) determinar el nivel de transtiretina en dicho material de muestra aislado, c) comparar el nivel determinado de transtiretina con un valor de referencia.
Description
Uso de transtiretina como biomarcador para
adenoma colorrectal; método para la detección y sistema de
ensayo.
La presente invención se refiere al campo de la
detección de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal.
El carcinoma colorrectal es el tercer carcinoma
más frecuentemente diagnosticado y la segunda causa principal de
muerte por carcinoma en Europa y en los Estados Unidos. En 1996, se
diagnosticaron unos 133.500 nuevos casos estimados de carcinoma
colorrectal y aproximadamente 54.900 personas murieron de esta
enfermedad en los Estados Unidos. La incidencia de carcinoma
colorrectal está creciendo, aunque el índice de mortalidad de
carcinoma colorrectal está disminuyendo. La incidencia de carcinoma
colorrectal aumenta con la edad, comenzando a aproximadamente 40
años de edad, y es más elevada en hombres que en mujeres (60,4 para
hombres frente a 40,9 para mujeres, por 100.000 por año).
En la mayoría de los pacientes, el desarrollo de
carcinoma colorrectal sigue un progreso de múltiples etapas desde
adenoma premaligno hasta malignidades invasivas que tienen
propensión a metástasis. Hay evidencias de que la reducción en la
morbilidad y mortalidad por carcinoma colorrectal puede conseguirse
a través de la detección y tratamiento de carcinomas colorrectales
en fase temprana y la identificación y retirada de pólipos
adenomatosos colorrectales, que son lo precursores de carcinoma
colorrectal.
Los ensayos de exploración colorrectal han
demostrado conseguir una detección precisa de carcinoma colorrectal
en fase temprana en sus precursores, es decir, pólipos adenomatosos
y/o áreas neoplásicas planas. Están disponibles varios ensayos como
opciones para exploración de carcinoma colorrectal. Los ensayos de
exploración abarcan el ensayo de sangre oculta en heces (FOBT),
sigmoidoscopia flexible, FOBT combinado con sigmoidoscopia flexible
y colonoscopia. Los diversos ensayos de exploración difieren entre
sí con respecto al funcionamiento, la eficacia, frecuencia de
exploración posible, complicaciones de ensayo, costes y aceptación
del paciente.
La exploración por el ensayo de sangre oculta en
heces se considera actualmente la estrategia de exploración óptima
en términos de rentabilidad. La sangre oculta en deposiciones puede
detectarse por agentes químicos tales como guayaco, a través de
hemoporfirina o métodos inmunológicos. El ensayo en portaobjetos de
guayaco Hemoccult (II) disponible en SmithKline Diagnostics es el
más ampliamente usado.
Diversos factores técnicos afectan a su
rendimiento clínico. Hemoccult tiene aproximadamente un 50% de
sensibilidad para carcinomas colorrectales y aproximadamente un 98%
de especificidad, sin embargo, la sensibilidad es baja para
pólipos, a aproximadamente el 10% (Simon JB. (1998)
Gastroenterologist 6:66-78. Revisión). Otro
inconveniente importante de la exploración de sangre oculta es la
poca precisión de la predicción, solamente el 10% de las reacciones
positivas demuestran deberse a carcinoma colorrectal (Simon JB.
(1998) Gastroenterologist 6:66-78. Revisión; Mandel
JS et al. (1999) J. Natl. Cancer Inst.
91:434-437; Hardcastle JD et al. (1996)
Lancet 348: 1472-1477; Kronborg O et al.
(1996) Lancet 348:1467-71; Winawer SJ et al.
(1997) Gastroenterology 112:594-642; Fletcher RH
(1998) N. Engl. J. Med. 338:1153-1154).
Además, un ensayo de sangre oculta en heces
solamente proporciona resultados después del progreso de la
enfermedad hasta una cierta fase. Sería deseable tener un sistema
de ensayo que permita la detección de adenoma colorrectal y/o
carcinoma colorrectal en el punto más temprano en el tiempo.
Ensayos inmunológicos más recientemente
desarrollados generalmente tienen elevada sensibilidad, sin embargo,
la mala especificidad sigue siendo un problema importante. Otros
métodos, tales como ensayos genéticos de muestras fecales para
oncogenes KRAS y para la proteína p53 no son aún rentables (Calistri
D et al. (2003) Clin. Gastroenterol. Hepatol.
1:377-383; Schoen RE (2002) Nat. Rev. Cancer
2:65-70).
La endoscopia (Kavanagh AM (1998) Cancer Causes
Control 9:455-462), usando el sigmoidoscopio
flexible o el colonoscopio (Lieberman DA (1997) Gastroenterol. Clin.
N. Am. 26: 71-83), es el medio más definitivo de
detección, pero tiene limitaciones.
Se ha reconocido el índice de falso negativo
para lesiones neoplásicas planas y sigue siendo elevado (Kudo S
(1997) Gastrointest. Endosc. Clin. N. Am. 7:87-98.).
La colonoscopia permite el examen del colon con un bajo índice de
falso negativo para lesiones polipoides de al menos 10 mm de
diámetro. Por esta razón, los intervalos permitidos antes del
re-examen son relativamente largos después de una
evaluación negativa (hasta diez años) o hasta cinco años después de
la polipectomía.
Sin embargo, la conformidad del paciente con
dicha recomendación para el re-examen después de la
colonoscopia es poca. Además, una colonoscopia es costosa e
incómoda. En vista de los elevados costes de un examen generalizado
y la aceptación limitada de una colonoscopia por la población, este
método de examen tiene una aplicación limitada.
Las muestras tisulares aisladas, que se recogen,
pueden ensayarse para carcinoma colorrectal y sus precursores,
adenoma colorrectal, por diversos métodos. El documento DE 197 11
111A describe un método que usa una determinación in vitro
de bacterias colónicas intraepiteliales, componentes y productos de
reacción de las mismas. En el documento DE 102 24 534 se describe
otro método que usa la expresión del gen HERG en muestras
titulares.
Un objeto de la invención es proporcionar un
medio que permita una detección temprana de adenoma de colon.
Un objeto adicional es proporcionar un
biomarcador que pueda usarse en la detección de adenoma
colorrectal.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar un sistema de ensayo para detectar adenoma colorrectal
que sea rentable y pueda usarse ampliamente.
Además, el sistema de ensayo debe ser fácil de
manejar y más cómodo para el individuo a examinar para adenoma
colorrectal.
Los objetos subyacentes de la presente invención
se resuelven por el uso de transtiretina como biomarcador para la
detección de adenoma colorrectal en un individuo. La detección puede
realizarse in vivo e in vitro. Según una realización
preferida, la detección se realiza in vitro.
Los objetos se resuelven adicionalmente por un
método para detectar adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal,
que comprende las etapas de:
a) proporcionar un material de muestra aislado
que se ha tomado de un individuo,
b) determinar el nivel de transtiretina en dicho
material de muestra aislado,
c) comparar el nivel determinado de
transtiretina con un valor de referencia.
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Los objetos se resuelven adicionalmente por un
método para discriminar entre adenoma colorrectal y carcinoma
colorrectal, que comprende las etapas de:
a) proporcionar un material de muestra aislado
que se ha tomado de un individuo,
b) determinar el nivel de transtiretina en dicho
material de muestra aislado,
c) comparar el nivel determinado de
transtiretina con un valor de referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Los objetos también se resuelven por un método
para controlar el transcurso de adenoma colorrectal y/o el
tratamiento de adenoma colorrectal, que comprende las etapas de:
a) proporcionar un material de muestra aislado
que se ha tomado de un individuo,
b) determinar el nivel de transtiretina en dicho
material de muestra aislado,
c) comparar el nivel determinado de
transtiretina con un valor de referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Los objetos se resuelven también proporcionando
un sistema de ensayo para detectar adenoma colorrectal y/o carcinoma
colorrectal en un individuo, que comprende:
a) un anticuerpo o un receptor que se une a un
epítopo de transtiretina,
b) un soporte sólido que soporta dicho
anticuerpo o receptor,
c) un reactivo para detectar la unión de dicho
epítopo de transtiretina a dicho anticuerpo o receptor.
\vskip1.000000\baselineskip
Los objetos se resuelven además proporcionando
una serie que comprende moléculas de detección para detectar adenoma
colorrectal y/o carcinoma colorrectal en un individuo, que comprende
como molécula de detección:
a) una sonda de ácido nucleico inmovilizada a un
soporte sólido para la unión a y detección de ARNm que codifica
transtiretina, o
b) un anticuerpo inmovilizado a un soporte
sólido para la unión a y detección de un epítopo de transtiretina,
o
c) un receptor inmovilizado a un soporte sólido
para la unión a y detección de un epítopo de transtiretina,
donde preferiblemente cada cantidad diferente de
moléculas de detección se inmoviliza en el soporte sólido para
aumentar la precisión de la cuantificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se especifican realizaciones preferidas en las
reivindicaciones dependientes.
Según la presente invención se entiende que el
término "biomarcador" indica una proteína o fragmento proteico
que es indicativo de la incidencia del adenoma colorrectal y/o
carcinoma colorrectal. Eso significa que el "biomarcador" se
usa como agente de detección o molécula de detección.
Se entiende que el término "individuo" o
"individuos" indica un mamífero. Preferiblemente, el mamífero
es un ser humano tal como un paciente.
Se entiende que la expresión "individuo
sano" o "individuos sanos" indica individuo(s) no
enfermo(s) de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal.
Hay que decir que la expresión "individuo(s)
sano(s)" se usa solamente con respecto a la afección
patológica de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal y no
excluye que el individuo padezca enfermedades diferentes a adenoma
colorrectal y/o carcinoma colorrectal.
El término "transtiretina" como se usa en
la presente invención también comprende transtiretina truncada,
fragmentos de transtiretina, transtiretina mutada, o transtiretina
modificada. La modificación de "transtiretina" puede deberse a
modificación enzimática o química. Además, el término
"transtiretina" también se usa para indicar formas monoméricas
o multiméricas de transtiretina. Por ejemplo, el término
"transtiretina" cubre especialmente la cadena proteica
monomérica que habitualmente es parte de la proteína homotetramérica
transtiretina.
Se entiende que el término "epítopo" indica
cualquier elemento estructural de transtiretina que permita la unión
específica de un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una
estructura proteica o peptídica o un receptor.
El proceso de aislar el material de muestra no
es parte de la invención. Hay que decir que los métodos de la
presente invención se realizan con material de muestra tal como un
fluido corporal que ya se ha aislado. Es posible, por ejemplo,
almacenar el material de muestra a ensayar en un congelador y
realizar los métodos de la presente invención en un punto apropiado
en el tiempo después de descongelar el material de muestra
respectivo.
Se ha descubierto sorprendentemente en la
presente invención que la proteína transtiretina puede usarse como
un biomarcador para la detección de adenoma colorrectal.
La transtiretina también se nombra como
prealbúmina. La transtiretina es una proteína tetramérica que tiene
un peso molecular de aproximadamente 54 kDa que se sintetiza
principalmente en el hígado. La transtiretina está compuesta por
cuatro cadenas proteicas de aproximadamente 14 kDa que pueden ser
idénticas. Hay que decir que la transtiretina puede considerarse
como una proteína homotetramérica. Funciona principalmente como una
proteína de unión para tiroxina, y como una proteína de transporte
para la proteína de unión retinal, que a su vez es la proteína de
transporte para la vitamina A (Schussler, GC Thyroid. (2000),
10:372; Hamilton, JA y Benson, MD Cell of Life Sci. (2001)
58:1491-1521).
También se ha informado de que la transtiretina
forma complejos con la proteína \beta amiloide. La agregación de
la proteína \beta amiloide está asociada con la deposición de
amiloide en el cerebro, que es una característica patológica de la
enfermedad de Alzheimer.
La transtiretina se ha descrito adicionalmente
como un indicador del estado nutricional, ya que los niveles
séricos de transtiretina disminuyen con la ingesta inadecuada de
proteínas y durante inflamación aguda o crónica. Además, la
transtiretina es adecuada para controlar el estado nutricional a
causa de su corta vida media de solamente 2-3 días
(Pleban WE, Conn. Med. (1989) 53: 405-407; Bernstein
LH e Ingenbleek Y, Clin. Chem. Lab. Med. (2002)
40:1344-1348).
El documento WO 02/059621 describe reactivos que
regulan la transtiretina y reactivos que se unen a productos
génicos de transtiretina, desempeñando de este modo un papel en la
prevención, mejora o corrección de la obesidad y disfunciones
relacionadas.
Se ha demostrado por análisis SELDI
(desorción/ionización por láser de superficie potenciada) que la
cadena monomérica de la proteína transtiretina existe en plasma o
suero humano al menos en dos variantes que tienen un peso molecular
de 13.736 Da y 13.858 Da, respectivamente.
Se cree que los diferentes pesos moleculares se
deben a diversas modificaciones post-traduccionales
tales como truncamiento, cisteinilación, y/o glutationilación. La
transtiretina cisteinilada tiene un peso molecular de
aproximadamente 13.871 \pm 11 Da, y la transtiretina
glutationilada tiene un peso molecular de aproximadamente 14.069
\pm 5 Da.
El documento WO 03/001182 describe la detección
y aislamiento de transtiretina homocisteinilada de un fluido
biológico y su uso como marcador para el diagnóstico de
homocisteinemia, hiperhomocisteinemia y enfermedades asociadas con
las mismas.
En algunos estudios, se ha analizado la
transtiretina como marcador de diagnóstico para carcinoma. Suresh
et al. (J. Clin. Pathol. (1991) 44: 573-575)
describieron la transtiretina como un marcador útil en tumores
carcinoides broncopulmonares ya que el 75% de los tumores
carcinoides eran positivos para transtiretina. En otro estudio, se
analizó la transtiretina como marcador de pronóstico en carcinoma
epitelial de ovario (Mahlck et al., Gynecol. Obstet. Invest.
(1994) 37: 135-140).
Se ha descubierto sorprendentemente en esta
invención que el nivel de transtiretina en un fluido corporal se
correlaciona con la incidencia de adenoma colorrectal en un
individuo.
Según la presente invención, la transtiretina
puede medirse en fluidos corporales tales como sangre, plasma
sanguíneo, suero sanguíneo, médula ósea, deposiciones, fluido
sinovial, fluido linfático, fluido cefalorraquídeo, esputo, orina,
leche materna, esperma, exudado y mezclas de los mismos.
Preferiblemente, el fluido corporal se ha
asilado antes de realizar los métodos de la presente invención. Los
métodos de la invención se realizan preferiblemente in vitro
por un técnico en un laboratorio.
De acuerdo con una realización preferida de la
invención, la transtiretina se mide en plasma sanguíneo o suero
sanguíneo. El suero sanguíneo puede obtenerse fácilmente tomando
sangre de un individuo a examinar médicamente y separando el
sobrenadante de la sangre coagulada.
El nivel de transtiretina en el fluido corporal,
preferiblemente suero sanguíneo, disminuye con la formación
progresiva de adenoma colorrectal. El adenoma colorrectal es un
neoplasma benigno que puede llegar a ser maligno. Cuando se
desarrolla cáncer colorrectal a partir de un adenoma colorrectal
benigno, el nivel de transtiretina en fluidos corporales,
preferiblemente suero sanguíneo, disminuye adicionalmente.
Después de la transformación de adenoma
colorrectal en cáncer colorrectal, el estado patológico del
individuo afectado puede exacerbarse adicionalmente por la formación
de metástasis.
La presente invención proporciona un biomarcador
de fase temprana que permite detectar la enfermedad neoplásica en
una fase temprana y aún benigna. La detección temprana posibilita
que el médico retire a tiempo el adenoma colorrectal y aumente
drásticamente la posibilidad de supervivencia del individuo.
Además, la presente invención permite controlar
el nivel de transtiretina en un fluido corporal tal como suero
sanguíneo en un periodo prolongado de tiempo, tal como años.
El control a largo plazo permite diferenciar
entre adenoma colorrectal y carcinoma colorrectal. El nivel de
transtiretina puede comprobarse de forma rutinaria, por ejemplo, una
o dos veces al año. Si se detecta una disminución del nivel de
transtiretina esto puede ser indicativo de adenoma colorrectal. Una
disminución adicional del nivel de transtiretina puede entonces ser
indicativa de la transformación en carcinoma colorrectal
maligno.
Además, puede controlarse el transcurso de la
enfermedad y/o el tratamiento. Si el nivel de transtiretina
disminuye adicionalmente, por ejemplo, después de la retirada del
adenoma colorrectal, esto puede ser indicativo de exacerbación de la
afección patológica.
Es decir, el nivel de transtiretina es un
parámetro clínico valioso para detectar y/o controlar el adenoma
colorrectal y/o carcinoma colorrectal. El nivel de transtiretina en
fluidos corporales disminuye muy pronto después de la incidencia de
adenoma colorrectal. Por lo tanto, la transtiretina o el nivel de
transtiretina es un parámetro clínico importante para permitir un
diagnóstico temprano y, por consiguiente, un tratamiento temprano de
la enfermedad.
El método de la invención para la detección de
adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal comprende la etapa de
proporcionar un material de muestra aislado que se ha tomado de un
individuo, después determinar el nivel de transtiretina en el
material de muestra aislado, y finalmente comparar el nivel
determinado de transtiretina con un valor de referencia.
El valor de referencia puede calcularse como el
nivel promedio de transtiretina determinado en una pluralidad de
muestras aisladas de individuos sanos. Este valor de referencia
puede establecerse como un intervalo a considerar como normal lo
que significa que la persona está sana. Una disminución por debajo
de este intervalo puede entonces ser indicativa del estado
patológico del adenoma colorrectal. Este intervalo de valor de
referencia puede establecerse tomando una cantidad estadísticamente
relevante de muestras de fluido corporal, tales como muestras
séricas, de individuos sanos como se hace para cualquier otro
intervalo de parámetro médico tal como, por ejemplo, azúcar en
sangre.
En otra realización de la presente invención, el
valor de referencia puede ser un valor de referencia individual
calculado como el nivel promedio de transtiretina determinado en una
pluralidad de muestras aisladas tomadas del individuo durante un
periodo de tiempo.
Cuando se controla el nivel de transtiretina en
un periodo prolongado de tiempo, tal como meses o años, es posible
establecer un nivel promedio individual. El nivel de transtiretina
puede medirse, por ejemplo, a partir de la misma muestra de suero
sanguíneo cuando se mide el azúcar en sangre y puede usarse para
establecer una curva de calibrado individual que permita detectar
específicamente cualquier disminución individual del nivel de
transtiretina.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona adicionalmente un sistema de ensayo para detectar
adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal en un individuo. El
sistema de ensayo se basa en la especificidad de un anticuerpo o un
receptor para unirse a un epítopo o un elemento estructural adecuado
de transtiretina o un fragmento de transtiretina. Un receptor puede
ser cualquier estructura capaz de unirse específicamente a
transtiretina. El receptor puede ser, por ejemplo, un fragmento de
anticuerpo tal como un fragmento Fab o F(ab')_{2} o
cualquier otra estructura proteica o peptídica que sea capaz de
unirse específicamente a transtiretina.
El anticuerpo, fragmento de anticuerpo o
receptor se une a un soporte sólido tal como, por ejemplo, una
superficie de plástico o perlas para permitir la unión y detección
de transtiretina. Por ejemplo, puede usarse una placa de
microtitulación convencional como superficie de plástico. La
detección de la unión de transtiretina puede realizarse, por
ejemplo, usando un anticuerpo secundario marcado con un grupo
detectable. El grupo detectable puede ser, por ejemplo, un isótopo
radiactivo o una enzima como peroxidasa de rábano rusticano o
fosfatasa alcalina detectable añadiendo un sustrato adecuado para
producir, por ejemplo, un color o una señal fluorescente.
El sistema de ensayo puede ser un inmunoensayo
tal como un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o un
radioinmunoensayo (RIA). Sin embargo, puede usarse cualquier otro
sistema de ensayo inmunológico que use la especificidad de
anticuerpos o fragmentos de anticuerpos tal como transferencia de
Western o inmunoprecipi-
tación.
tación.
La presente invención también proporciona una
serie que comprende moléculas de detección para detectar adenoma
colorrectal y/o carcinoma colorrectal en un individuo, donde la
molécula de detección puede ser una sonda de ácido nucleico
inmovilizada en un soporte sólido para la unión a y detección de
ARNm que codifica transtiretina, fragmentos, mutaciones, variantes
o derivados de la misma, o un anticuerpo inmovilizado en un soporte
sólido para la unión a y detección de un epítopo de transtiretina,
o un receptor inmovilizado en un soporte sólido para la unión a y
detección de un epítopo de transtiretina.
La sonda de ácido nucleico puede ser cualquier
oligonucleótido de origen natural o sintético, así como ADNc, ARNc y
similares.
La serie descrita puede usarse en un sistema de
ensayo de acuerdo con la invención. La serie puede ser una
microserie o una macroserie. El soporte puede ser un material
polimérico tal como nylon o plástico o un material inorgánico tal
como silicio, por ejemplo una pastilla de silicio, o cerámica. Según
una realización preferida, se usa vidrio (SiO_{2}) como material
de soporte sólido. El vidrio puede un portaobjetos de vidrio o chip
de vidrio. Según otra realización de la invención, el sustrato de
vidrio tiene una superficie atómicamente plana.
Por ejemplo, la serie puede estar compuesta de
sondas de ácido nucleico inmovilizadas capaces de unirse
específicamente a ARNm de transtiretina que está presente en un
fluido corporal tal como suero. Otra realización preferida es
producir ADNc por transcripción inversa de ARNm de transtiretina y
detectar específicamente la cantidad de ADNc respectivo con dicha
serie. La tecnología de series es conocida para los especialistas en
la técnica. Puede realizarse una cuantificación del ARNm o ADNc
medido, respectivamente, por comparación de los valores medidos con
una curva patrón o de calibrado de cantidades conocidas de ARNm o
ADNc de transtiretina.
Preferiblemente, se inmovilizan diferentes
cantidades de moléculas de detección cada una sobre el soporte
sólido para permitir una cuantificación precisa del nivel de
transtiretina.
Según otra realización de la invención, el nivel
de transtiretina se determina por espectroscopía de masas.
La espectroscopía de masas permite detectar
específicamente la transtiretina o las cadenas proteicas monoméricas
de la misma por su peso molecular y cuantificar la cantidad de
transtiretina muy fácilmente.
La transtiretina normalmente es un homotetrámero
que comprende cuatro cadenas proteicas que tienen cada una un peso
molecular de aproximadamente 14 kDa.
Usando la espectroscopía de masas se han
detectado varias variantes de las cadenas proteicas de transtiretina
que tienen un peso molecular de, entre otros, 13.776 Da, 13.884 Da o
14.103 Da.
Se ha descubierto en esta invención que
especialmente el nivel de variantes moleculares de transtiretina que
tienen un peso molecular de 13.776 Da y 13.884 Da está disminuido
en un fluido corporal tal como suero en caso de incidencia de
adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal.
Puede emplearse cualquier método de ionización
adecuado en el campo de espectroscopía de masas conocido en la
técnica para ionizar la molécula de transtiretina, fragmentos,
mutaciones, variantes o derivados de la misma. Los métodos de
ionización comprenden impacto de electrones (EI), ionización química
(CI), ionización de campo (FDI), ionización por electronebulización
(ESI), ionización por desorción por láser (LDI), ionización por
desorción por láser asistida por matriz (MALDI) e ionización por
desorción por láser de superficie potenciada (SELDI).
Puede emplearse cualquier método de detección
adecuado en el campo de espectroscopía de masas conocido en la
técnica para determinar la masa molecular de transtiretina,
fragmentos, mutaciones, variantes o derivados de la misma. Los
métodos de detección comprenden espectroscopía de masas tipo
cuadrupolo (QMS), espectroscopía de masas por transformada de
fourier (FT-MS) y espectroscopía de masas de tiempo
de vuelo (TOF-MS).
Preferiblemente, la espectroscopía de masas es
una espectroscopía de masas de tiempo de vuelo por ionización por
desorción por láser de superficie potenciada
(SELDI-TOF-MS). Antes de realizar
una SELDI-TOF-MS, la transtiretina
en la muestra aislada preferiblemente se inmoviliza en un chip o
soporte sólido con una superficie activada. La superficie activada
comprende preferiblemente anticuerpos
anti-transtiretina inmovilizados tales como, por
ejemplo, anticuerpos policlonales de conejo
anti-transtiretina. Después de unirse la
transtiretina a los anticuerpos, se realiza un análisis de tiempo
de vuelo en un espectrómetro de masas SELDI-TOF, que
produce señales de intensidad para la determinación del nivel de
transtiretina.
Además, la espectroscopía de masas permite
detectar simultáneamente otras proteínas que pueden tener una
importancia con respecto a la detección de adenoma colorrectal y/o
cáncer colorrectal.
En otra realización de la presente invención se
potencia la sensibilidad y/o especificidad de la detección de
adenoma colorrectal por detección de otra proteína en combinación
con transtiretina.
Otro biomarcador para adenoma colorrectal y/o
carcinoma colorrectal, cuyo nivel puede determinarse además del
nivel de transtiretina, comprende una proteína o polipéptido que
tiene un peso molecular de 8.960 Da. Se ha descubierto que el nivel
de dicha proteína o polipéptido de 8.960 Da en un material de
muestra aumenta en adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal
cuando se compara con el nivel de esta proteína o polipéptido en
muestras aisladas de individuos sanos.
Por lo tanto, se prefiere determinar el nivel de
dicha proteína que tiene un peso molecular de 8.960 \pm 9 Da
además del nivel de transtiretina en un fluido corporal, tal como
suero, por espectroscopía de masas. La espectroscopía de masas es
el método de elección para detectar y cuantificar el nivel de dicha
proteína de 8.960 \pm 9 Da.
En otra realización de la presente invención la
sensibilidad y/o especificidad de la detección de adenoma
colorrectal se potencia por la detección de CEA (antígeno
carcinoembrionario) y/o CA 19-9 en combinación con
transtiretina. CEA y CA 19-9 se analizaron ambos
como indicadores de respuesta y factores de pronóstico en carcinoma
colorrectal avanzado.
En una realización adicional de la presente
invención la sensibilidad y/o especificidad de la detección de
adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal se potencia por la
detección de CA15-3, CA-125 y/o
Her-2/neu en combinación con transtiretina.
CA15-3 es un antígeno oncofetal, que se expresa por
varios carcinomas, y a menudo se mide con otros marcadores
tumorales. Tanto CA15-3 como CA-125
son indicadores de pronóstico, principalmente para cáncer de mama,
pero también además de metástasis viscerales. La amplificación de
Her-2/neu en carcinoma de mama está asociada con un
mal pronóstico, corto intervalo sin enfermedad y corto tiempo de
supervivencia. Se sabe poco hasta ahora acerca del punto de inicio
de la amplificación y el progreso de Her-2/neu hasta
ahora.
Los métodos de la presente invención pueden
realizarse en combinación con otros métodos de diagnóstico para la
detección de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal para
aumentar la sensibilidad y/o especificidad global.
Preferiblemente, los métodos de la presente
invención se realizan como un método de detección y/o control
temprano. Si los resultados de los métodos de la presente invención
indican la incidencia de adenoma colorrectal, deben realizarse
exámenes adicionales tales como colonoscopia o un ensayo de sangre
oculta en heces (FOBT).
Pueden usarse los siguientes anticuerpos
policlonales anti-transtiretina cuando se practica
la invención: PC 066 disponible en The Binding Site Ltd.,
Birmingham, Inglaterra y A 0002, disponible en DAKO, Hamburgo,
Alemania.
Las siguientes figuras y ejemplo se dan para
propósitos ilustrativos solamente. La invención no debe entenderse
limitada a los siguientes ejemplos.
La Fig. 1 muestra un diagrama esquemático para
fraccionar y perfilar muestras séricas.
La Fig. 2 muestra un perfil
SELDI-TOF.
La Fig. 3 muestra una diferenciación de
individuos sanos de individuos con adenoma/carcinoma.
La Fig. 4 muestra perfiles proteicos
SELDI-TOF de fracciones séricas de tres individuos
diferentes.
La Fig. 5 muestra captura por inmunoafinidad
SELDI de transtiretina y sus derivados potenciales.
La Fig. 6 muestra la inmunoprecipitación con un
anticuerpo anti-transtiretina.
\newpage
Ejemplo
A menos que se indique otra cosa todos los
métodos se realizaron siguiendo el protocolo del fabricante de los
sistemas analíticos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se recogió el suero de tres grupos de pacientes
humanos y se investigó.
El grupo 1 constaba de 30 pacientes que eran
pacientes quirúrgicos tratados para enfermedades no cancerosas tales
como hernia inguinal, piedras en la vesícula biliar o
diverticulitis. Estos individuos del grupo 1 se tomaron como el
grupo de individuos sanos, es decir, aquellos que no padecían
adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal.
El grupo 2 constaba de 29 pacientes, que eran
todos pacientes quirúrgicos tratados para tumores indefinidos, que
resultaron ser adenoma colorrectal benigno.
El grupo 3 constaba de 28 pacientes, que eran
pacientes que tenían carcinoma colorrectal. Todos estos 28 pacientes
padecían carcinoma colorrectal TNM de fase III (Tumor,
Nódulos, Metástasis de fase III).
Se han asegurado estrictamente las directrices
éticas y la confidencialidad del paciente y todos los pacientes
dieron su consentimiento escrito para participar en este estudio.
Todos los pacientes tenían preparaciones preoperatorias comparables
tales como tiempo de ayuno y premedicación.
Se fraccionó el suero de cada paciente por
cromatografía de intercambio aniónico (Kit de Fraccionamiento de
Suero/resina Q HyperD, Ciphergen Biosystems, Inc.) usando un
procedimiento automatizado con formato de 96 pocillos (Biomek2000,
Ciphergen), de acuerdo con el protocolo del fabricante, para reducir
algo de la interferencia por las proteínas más abundantes. Como se
muestra en la Fig. 1, el fraccionamiento produjo 6 fracciones que
contenían proteínas separadas aproximadamente en base al valor pI de
la proteína.
De ocho pacientes, se ensayaron todas las
fracciones usando series de superficie cromatográfica ProteinChip®
de Ciphergen Biosystems, Inc.. Las series proporcionan capacidad
relativamente elevada y se unen a una gran diversidad de proteínas
y péptidos para un amplio intervalo de aplicaciones de perfilado y
mapeado de proteínas. Las seis fracciones séricas de ocho pacientes
se aplicaron a las siguientes tres series proteicas diferentes:
SAX-2, una serie aniónica fuerte con funcionalidad
amina cuaternaria, IMAC, una serie de captura metálica inmovilizada
con una superficie de ácido nitriloacético y CM10, una serie de
intercambio catiónico débil con funcionalidad carboxilato. Se
seleccionaron dos fracciones que daban la mayor cantidad de picos
evaluables (fracción 1, fracción 4) para un enfoque de perfilado en
un chip que mostró la variabilidad de datos más baja (serie CM10).
Estas dos fracciones se midieron en los tres grupos usando la Serie
de Ciphergen ProteinChip® CM 10.
\vskip1.000000\baselineskip
Las series proteicas CM10 se procesaron en
bioprocesador (Ciphergen Biosystems, Inc.) de acuerdo con el
protocolo del fabricante. Los chips se equilibraron con tampón de
unión a CM10 (Ciphergen Biosystems, Inc.) durante 2x5 minutos y
posteriormente se incubaron con las fracciones séricas que se habían
diluido 1:10 en tampón de unión a CM10. Después de 45 minutos, se
retiró el material no unido y los chips se lavaron 3 veces con
tampón de unión a CM10 y 2 veces con agua. Después de secar a
temperatura ambiente durante 10 minutos, se añadieron 2
aplicaciones de ácido sinapínico 0,05 M (1,0 \mul) y los chips se
analizaron con el Ciphergen Protein ChipReader (modelo PBSII).
El Protein ChipReader es un espectrómetro de
masas de tiempo de vuelo. Los valores de masa y las intensidades de
señal para las proteínas detectadas se transfieren a un software,
que se suministra por Ciphergen para un análisis en profundidad
adicional por el ProteinChip Data Analysis Program y el Biomarker
Wizard Program.
Para minimizar la variabilidad de los datos, la
medición se realizó en dos días usando muestras de todos los grupos
de pacientes distribuidas aleatoriamente en los chips. Como control
patrón para la normalización, se usó suero normal combinado en
paralelo a todas las mediciones.
Los espectros de masas de las proteínas se
generaron usando un promedio de 195 rayos láser a una intensidad de
láser de 185. El detector se hizo funcionar a una sensibilidad de 7.
Para la adquisición de datos, el intervalo de tamaño de detección se
estableció entre 2.000 y 40.000 Da.
El láser se orientó a 10.000 Da. Los datos se
analizaron con el ProteinChip Data Analysis Program (versión 3.1,
Ciphergen Biosystems) y con el Biomarker Wizard Program (versión
3.1, Ciphergen Biosystems). Las intensidades de pico se normalizaron
a la corriente de iones total.
En este experimento, se identificaron proteínas
expresadas de forma diferencial entre suero de pacientes sin
carcinoma (Grupo 1) y suero de pacientes con adenoma colorrectal
(Grupo 2) y carcinoma colorrectal (Grupo 3). Como se muestra en la
Tabla 1, pudieron identificarse seis picos en la fracción 1 que
mostró los valores medios de intensidad de diferencias altamente
significativas (p \leq 0,0000001) entre pacientes sanos (pacientes
sin cáncer), pacientes con adenoma colorrectal y pacientes con
carcinoma colorrectal. Como se muestra en la Tabla 2, la fracción 4
proporcionó un conjunto adicional de biomarcadores potenciales que
difería significativamente entre los tres grupos (p \leq
0,0000001).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Se ensayaron varias proteínas como biomarcadores
individuales y en combinación con otros marcadores usando el
Biomarker Pattern Software. Se encontró una proteína con un peso
molecular de 13.770 Da (p13.770) para discriminar entre pacientes
con adenoma/carcinoma y controles sanos que da una sensibilidad del
75% y una especificidad del 90%.
La Fig. 2 muestra un perfil SELDI que demuestra
el biomarcador. La Fig. 3 muestra la discriminación de pacientes
sanos de pacientes con adenoma/carcinoma en un diagrama de
dispersión. Las intensidades del biomarcador que tiene un peso
molecular de 13.770 Da (p13.370) son significativamente inferiores
en el suero de pacientes con adenoma/cáncer que en pacientes
sanos.
La Fig. 4 muestra los perfiles proteicos
SELDI-TOF de la fracción sérica Nº 4 de pacientes
sanos, pacientes con adenoma y pacientes con cáncer. Como se puede
observar, la intensidad del pico p13.370 disminuye desde los
pacientes sanos sobre los pacientes con adenoma colorrectal hasta
los pacientes con cáncer colorrectal.
En combinación con una segunda proteína
marcadora (PM 8.960 Da, fracción Nº 1), se mejoró significativamente
la separación de pacientes sanos de pacientes con
adenoma/carcinoma. Se separaron correctamente 30 pacientes sin
adenoma/carcinoma (sanos), 20 de 29 pacientes con adenoma
colorrectal así como 20 de 28 pacientes con carcinoma colorrectal.
Con esta combinación, se consiguió una sensibilidad del 70% y una
especificidad del 100%.
\vskip1.000000\baselineskip
Usando ensayos de captura por inmunoafinidad y
de inmunoprecipitación, se identificó la proteína de 13.770 Da como
transtiretina.
\vskip1.000000\baselineskip
La captura por inmunoafinidad se realizó usando
una Serie de Proteína G (Ciphergen Biosystems, Inc.) siguiendo el
protocolo del fabricante. Se pipeteó un anticuerpo policlonal de
conejo anti-transtiretina A0002 (Dako, Hamburgo,
Alemania), diluido a una concentración de 0,2 \mug/\mul en PBS.
Se pipetearon 2 \mul por punto en la serie y posteriormente se
incubó durante 24 h a 4ºC en una cámara humidificada. El anticuerpo
no unido se retiró lavando con tampón de lavado (0,5% (v/v) triton
X-100 en PBS). Después de secar, la serie se insertó
en un bioprocesador (Ciphergen Biosystems, Inc.) para la incubación
de la muestra. Se añadieron 2 \mul de fracciones séricas que
contenían elevadas y bajas cantidades de la proteína de 13.770 Da
(pacientes con adenoma colorrectal/carcinoma frente a pacientes
sanos) al chip y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente en
un agitador horizontal. Después de lavar con PBS y tampón HEPES, la
serie se secó al aire durante 10 minutos y se añadieron 0,6 \mul
de matriz de ácido sinapínico saturado a cada punto. La serie se
midió usando los siguientes parámetros: la intensidad del láser se
estableció a 185, la sensibilidad a 7. El intervalo de tamaño de
detección se estableció a entre 200 y 200.000 Da, el láser se
orientó a 10.000 Da.
Después de unirse a la serie recubierta con
anticuerpo, se identificaron cuatro picos de proteína de diferente
peso molecular (aproximadamente 13.761 Da, 13.914 Da, 14.102 Da y
14.292 Da), que sugiere que existe transtiretina en diferentes
variantes moleculares. La Figura 5 muestra una comparación de las
intensidades de señal entre un paciente sano y un paciente con
carcinoma.
Finalmente, se realizó una inmunoprecipitación.
Se incubaron 50 \mul de suero de la fracción 4 de diferentes
pacientes con 15 \mul (6,75 \mug) del anticuerpo policlonal
contra transtiretina durante 2 horas a 4ºC. Se realizó un control
negativo del mismo modo sin anticuerpo. Se añadieron 50 \mul de
agarosa-proteína A/G (Pierce, Rockford, IL) y se
incubaron a 4ºC durante una noche. Después de centrifugación a 3.300
xg, se retiraron los sobrenadantes y se almacenaron por separado.
El sedimento se resuspendió en 20 \mul de tampón (urea 9 M, Chaps
al 2%, Tris-HCl 50 mM, pH 9) para desprender las
proteínas de la agarosa-proteína A/G. El precipitado
así como el sobrenadante se diluyeron 1:10 en tampón de unión a
CM10. Se inmunoprecipitaron tres proteínas con diferentes pesos
moleculares (13.776 Da, 13.884 Da, 14.103 Da) con un anticuerpo
anti-transtiretina. A partir de la Figura 6 puede
observarse que en el sobrenadante, la cantidad de dos variantes
(13.776 Da y 13.884 Da) se redujo significativamente, mientras que
la cantidad de la variante con el peso molecular mayor (14.103 Da)
permaneció inalterada.
Esto muestra que las cadenas proteicas de
transtiretina que tienen un peso molecular de aproximadamente 13.776
Da y aproximadamente 13.884 Da son biomarcadores importantes para la
detección de adenoma colorrectal.
Claims (28)
1. Un método para detectar adenoma colorrectal,
que comprende las etapas de:
a) proporcionar un material de muestra aislado
que se ha tomado de un individuo,
b) determinar el nivel de transtiretina en dicho
material de muestra aislado,
c) comparar el nivel determinado de
transtiretina con un valor de referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un método para discriminar entre adenoma
colorrectal y carcinoma colorrectal, que comprende las etapas
de:
a) proporcionar un material de muestra aislado
que se ha tomado de un individuo,
b) determinar el nivel de transtiretina en dicho
material de muestra aislado,
c) comparar el nivel determinado de
transtiretina con un valor de referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Un método para controlar el transcurso de
adenoma colorrectal y/o el tratamiento de adenoma colorrectal, que
comprende las etapas de:
a) proporcionar un material de muestra aislado
que se ha tomado de un individuo,
b) determinar el nivel de transtiretina en dicho
material de muestra aislado,
c) comparar el nivel determinado de
transtiretina con un valor de referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
4. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, en el que el nivel de transtiretina de
dicho material de muestra está disminuido en comparación con un
material de muestra de un individuo sano.
5. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 2 a 4, en el que una primera disminución del
nivel de transtiretina en un primer material de muestra es
indicativo de adenoma colorrectal y en el que una segunda
disminución del nivel de transtiretina en un segundo material de
muestra, aislado de dichos individual en un punto posterior en el
tiempo que el primer material de muestra, es indicativo de carcinoma
colorrectal, con la condición de que dicha segunda disminución sea
más fuerte que dicha primera disminución.
6. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, en el que el valor de referencia se
calcula como el nivel promedio de transtiretina determinado en una
pluralidad de muestras aisladas de individuos
sanos.
sanos.
7. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, en el que el valor de referencia es un
valor de referencia individual calculado como el nivel promedio de
transtiretina determinado en una pluralidad de muestra aisladas
tomadas de dicho individuo durante un periodo de tiempo.
8. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7, en el que la transtiretina está
compuesta por una o cuatro cadenas proteicas, que pueden ser
idénticas o diferentes entre sí.
9. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 8, en el que la transtiretina está
truncada, modificada y/o mutada.
10. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 9, en el que el material de muestra aislado
es un fluido corporal.
11. El método de acuerdo con la reivindicación
10, en el que el fluido corporal se selecciona entre el grupo
compuesto por sangre, plasma sanguíneo, suero, médula ósea,
deposiciones, fluido sinovial, fluido linfático, fluido
cefalorraquídeo, esputo, orina, leche materna, esperma, exudado y
mezclas de los mismos.
12. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que el nivel de
transtiretina en dicho material de muestra se determina por
espectroscopía de masas.
13. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 12, en el que se determina adicionalmente
el nivel de antígeno carcinoembrionario (CEA) en dicho material de
muestra y en el que el nivel de dicho antígeno carcinoembrionario
(CEA) está aumentado en dicho material de muestra por adenoma
colorrectal.
14. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 13, en el que se determina adicionalmente
el nivel de CA 19-9 en dicho material de muestra y
en el que el nivel de dicho CA 19-9 está aumentado
en dicho material de muestra por adenoma colorrectal.
15. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 14, en el que se determina adicionalmente
el nivel de una proteína o polipéptido que tiene un peso molecular
de 8.960 \pm 9 Da y en el que el nivel de dicha proteína o
polipéptido de 8.960 \pm 9 Da está aumentado en dicho material de
muestra por adenoma colorrectal.
16. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 11, en el que el nivel de transtiretina en
dicho material de muestra se determina por un inmunoensayo,
preferiblemente por ELISA o RIA.
17. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 11, en el que el nivel de transtiretina en
dicho material de muestra se determina determinando el nivel de ARNm
que codifica transtiretina en dicho material de muestra.
18. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que el método se realiza en
combinación con otros métodos de diagnóstico para adenoma
colorrectal para aumentar la sensibilidad y/o especificidad.
19. Un uso de transtiretina como biomarcador
para la detección de adenoma colorrectal en un individuo.
20. El uso de acuerdo con la reivindicación 19
para una detección temprana de adenoma colorrectal.
21. El uso de acuerdo con la reivindicación 19 ó
20, en el que la transtiretina está truncada, modificada y/o
mutada.
22. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 19 a 21, en combinación con uno o más biomarcadores
adicionales para adenoma colorrectal para aumentar la sensibilidad
y/o especificidad.
23. El uso de acuerdo con la reivindicación 22,
en el que dicho al menos un biomarcador adicional comprende antígeno
carcinoembrionario (CEA), cuyo nivel en dicho material de muestra
está aumentado por adenoma colorrectal.
24. El uso de acuerdo con la reivindicación 22,
en el que dicho al menos un biomarcador adicional comprende CA
19-9, cuyo nivel en dicho material de muestra está
aumentado por adenoma colorrectal.
25. El uso de acuerdo con la reivindicación 22,
en el que dicho al menos un biomarcador adicional tiene un peso
molecular de 8.960 \pm 9 Da, cuyo nivel en dicho material de
muestra está aumentado por adenoma colorrectal.
26. Un uso de transtiretina como biomarcador
para discriminar entre adenoma colorrectal y carcinoma colorrectal
en un individuo.
27. El uso de acuerdo con la reivindicación 26,
en el que la transtiretina está truncada, modificada y/o mutada.
28. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 26 ó 27, en combinación con uno o más biomarcadores
adicionales para adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal para
aumentar la sensibilidad y/o especificidad.
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