KR960012066B1 - 치료용 리보자임 조성물, 발현벡터 및 그 제조방법 - Google Patents

치료용 리보자임 조성물, 발현벡터 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

내용없음

Description

치료용 리보자임 조성물, 발현벡터 및 그 제조방법
제1도는 HDV 구조의 개략도로서, HBsAg로 구성된 외막(빗금친 부분)은 헤파드나 바이러스(B형 간염바이러스)로부터 유래한 것이고, 내부에는 셀프 어닐링(se1f-annealing)된 원형 RNA와 델타 항원(HDAg)을 포함하고 있다.
제2도는 HVB에 의한 감염 및 복제 그리고 상호감염(coinfection) 및 복제의 개략도이고,
제3도는 자기절단(autocleavage)활성이 있는 델타 간염바이러스 유전자 염기서열의 110(662-771)개의 뉴클레오티드들이 형성하는 RNA 2차 구조도로서 화살표는 절단위치를 나타내고 스템(stem)의 하반부(뉴클레오티드 708-771)는 상기 분자의 추정되는 효소를 의미하는데 반하여 스템의 상반부(뉴클레오티드 662-707)는 자기절단 RNA의 추정되는 기질을 의미하는 것으로서 일예로 제시한 2차구조는 주커(Zuker)의 동적 프로그래밍 법칙(dynamic programming rule)과 티노코(Tinoco)에너지 법칙을 사용하여 유도하였다.
본 발명은 염기서열 중 특히 델타 간염(hepatitis delta) 바이러스로부터 유도된 것으로서 단백질을 코딩(coding)하거나 리보자임 활성을 갖는 RNA 염기서열의 유전공학분야에 관한 것이다.
표적세표(target cells)에 대한 치료용 리보자임 및/또는 mRNA 염기서열을 전달해주는 벡터(vector)를 구성하는 것은 어렵다. 미국특허출원 제07/411,713호에 레트로바이러스(retrovirus)에서 수득한 벡터가 개시되어 있는데, 이 벡터는 mRNA를 절단하여 바이러스 감염을 제한시킬 수 있는 치료용 리보자임을 전달하는 수단으로 묘사되어 있다.
일실시예로서 델타 간염바이러스 RNA로부터 얻은 리보자임은 T-세포(T-cell)에 특정적으로 감염하는 레트로바이러스와 조합되어 후천선 면역결핍증 바이러스(HIV)에 의해 감염된 세포의 RNA들을 특정적으로 절단시키는 수단으로 개시되어 있다. 또한, 미국 특허출원 제07/411,713호에는 델타 바이러스의 RNA게놈(genome)이 한 세포에서 다른 세포로 특정 유전자를 전달해주는 이른바 벡터로서 사용되는 개략적인 방법이 설명되어 있다.
지난 5년간 있었던 분자생물학의 기초적인 분야에서의 발견들은 RNA가 예전에 예측하지 못했던 일련의 독특한 능력들과 생물학적 활성을 지니고 있음을 세상에 알리게 되었다. 이 새로운 발견에서 가장 중요한 것은 RNA가 정보 전달체로 뿐만아니라 효소로서도 작용할 수 있다는 것이다.
1982년 이래, RNA성 병원체에 의해 야기되는 몇가지 예기치 못한 질병들이 출현하였는데, 치명적인 후천성 면역결핍증(AIDS)과 비로이드(viroid)형 RNA 병원체에 의해 발병되는 급성간염 중 특히 전염성이 강한 델타간염이 그 대표적 예이다. 이들 혈액전달성 질병들은 RNA 수준에서 만연되어 있다가 환자의 세포에서 그 징후를 나타내는데, 현재까지 수백만명의 혈액속에 존재하고 있다. 한편, DNA 재조합 방법과 DNA 수준에서의 간섭(intervene)기술에 의존한 종래의 바이오테크놀로지 분야에서는 이러한 질병들을 적절히 퇴치하는 방법들의 개발이 느리게 진행되고 있었다.
(B형 간염바이러스(HBV))
HBV는 간에 지속적인 비세포병리학적 감염을 유발하는 DNA 함유-바이러스들 중 하나로 범 세계적으로 발견되는 인간감염성 바이러스이며, 만성 보균자 형태로 인간들사이에 영속적으로 보유된다. 세계인구의 6∼7%인 3이명 정도가 보균자인 것으로 추산되며, 그 감염율은 세계적으로 일정하지 않다. 즉, HBV의 분포는 지역마다 다른데, 북미와 서유럽지역에서는 감염율이 가장 낮아 전체인구의 0.1∼0.5% 정도에서만 바이러스가 발견되고 동남아시아와 아프리카의 사하라 아래지역에서는 감염율이 가장 높아 전체인구의 5∼20%정도가 감염되어 있다. 이러한 경사진 분포도는 간세포암종의 분포도와 일치하는데 이는 만성 HBV감염과 악성종양과의 상관관계를 설명하는 강력한 역학적 증거를 제시해준다.
B형 간염은 인간의 간세포암종을 포함한 만성 간질환의 가장 일반적인 원인이기 때문에 의학적으로 매우 중요하다. 감염된 간세포는 계속적으로 바이러스 입자를 배출시켜 혈액내에 이들을 높은 수준까지 축적시킨다.
상기 입자에는 두가지 형태가 있다 :
(i) 핵산을 갖지 않고 여분의 바이러스성 피막 단백질(HBsAg)로 구성된 비감염성 입자(혈액중의 농도 : 1013입자수/ml)
(ii) 주요 바이러스성 피막 단백질을 포함하는 외막에 둘러싸인 27nm 뉴클레오캡시드 코어(nucleocapsid core, HBcAg)로 구성된 감염성 DNA-함유 입자(Dane 입자)
DNA 게놈은 원형이며, 부분적으로 단일 가닥(single strand)인 약 3000 뉴클레오티드로서 불완전한 (+) 가닥(plus strand)을 지니고 있다. 상기 불완전한 (+) 가닥은 상기 비리온(virion)내에서 DNA 중합 효소와 복합체를 형성하는데 시험관내의 적절한 조건하에서는 완전한 (-) 가닥을 주형(template)으로 이용하여 (+) 가닥을 연장시킬 수 있다.
이러한 형태학적이고 구조적인 특징들은 B형 간염바이러스를 다른 DNA-함유 바이러스들로부터 구별되게 한다.
B형 간염바이러스의 복제 주기는 다른 DNA-함유 바이러스와는 현저하게 다르며, RNA-함유 레트로바이러스와의 밀접한 상관관계를 암시하고 있다. B형 간염바이러스의 중요하고도 비정상적인 특징은 DNA 게놈의 복제시 중간체(intermediate)로서 게놈의 RNA 복제물을 이용한다는 점이다. 감염된 DNA 게놈은 RNA 잔사를 위한 주형으로 사용되는 두 가닥의 DNA로 전환된다. 다중 RNA 전사체(multiple RNA transcripts)들이 각각의 감염된 게놈으로부터 합성되는데 이들 RNA들은 정보전달기능 또는 DNA 복제기능을 지닌다. 후자는 프리게놈(pregenome)이라고 불리는데 이는 코팅 및 세포로부터의 탈출전에 뉴클레오캡시드 코어로 조합되고 DNA로 역전사되기 때문에, 프로제니 DNA 게놈(progeny DNA genome)의 전구물질(precursor)이다. 따라서 각각의 성숙한 비리온은 RNA 프로게놈의 DNA 복제물 하나와 DNA 중합효소 하나를 포함하게 된다.
합성되는 첫번째 DNA는 (-) 가닥의 극성이고 바이러스 유전자 지도의 특정 위치에서 합성이 개시된다. 매우 작은 초기 DNA(-) 가닥(30 뉴클레오티드 미만)은 단백질과 공유결합으로 연결되어 (-) 가닥의 DNA 합성시에는 프라이머(primer)의 역할을 수행한다.
최종산물이 RNA-DNA 하이브리드가 아니고, 전체가 단일 가닥인 DNA가 되도록 (-) 가닥의 DNA의 성장과 동시에 상기 프리게놈은 분해된다. (+) 가닥의 DNA는 (-) 가닥의 완성 이후에만 관찰되는데, (-) 가닥의 5' 끝에 인접한 특정 위치에서 합성이 개시된다.
코팅과 뉴클레오캡시드 코어의 탈출의 전제로 (+) 가닥의 완전한 합성이 요구되지 않기 때문에 대부분의 세포외 비리온들은 그들의 게놈안에 불완전한 (+) 가닥과 단일 가닥으로 이루어진 커다란 갭(gap)이 존재하게 된다.
(델타 간염을 유발하는 병원체 : 델타 간염바이러스(HDV))
델타 간염병원체의 존재는 1977년 이탈리아의 마리오 리제토가 만성 B형 간염환자의 간생체검사에서 가공할만한 새로운 항원으로서 델타 간염항원을 처음으로 발견하여 입증되었다. 상기 항원을 보유하고 있는 보균자의 경우에는 심각한 만성 간염과 간경변의 높은 이환율(罹患率)을 나타내었다. 또한 상기 항원은 상당수의 급성간염과도 관련이 있는 것으로 나타났다. 침팬지의 유전연구를 통하여 결합이 있는 바이러스 병원체는 델타간염과 관련이 있고 그 병원제는 복제를 하기 위해서 HBV 또는 다른 헤파드나(hepadna) 바이러스를 필요로 함을 알 수 있었다. HDV는 효과적으로 복제증식되고, 헬퍼(helper)의 복제를 억압하여 헤파드나 바이러스에 비례하는 보다 높은 적정 농도의 HDV를 유도할 수 있음이 이후 밝혀졌다.
HDV는 이제 전세계 모든 지역의 HBV 보균자들사이에서 발생되는 풍토병으로 알려지게 되었고, 여기서 HDV는 HBV 보균자들의 초감염(超感染, super-infection)의 결과 또는 급성 공동감염으로 발생한다. 감염의 결과는 HBV와 관련한 환자의 이전상태에 좌우되는 것으로 보인다. HBV에 걸리지 않은 사람이 HBV와 HDV에 동시감염되는 것이 이미 만성 HBV 감염자의 초감염에 비해 분명히 덜 위험하다. 후자의 경우, 간의 손상범위가 확산되는 것은 급성간염에 있어 사망이라는 중대한 위험을 수반한다. 중앙아프리카와 남미의 일부 지방의 HDV 전염병들이 후자의 예이다. 상기 바이러스는 남부유럽, 중동, 아프리카의 일부, 남미, 남태평양제도에서 발견된다. 흥미로운 것은 동양인의 경우는 그 지역에서 HBV가 널리 확산되었음에도 불구하고 HDV 감염이 다소간 드물다는 것이다.
HDV의 전파는 HBV와 유사한 전파경로 즉, 비경구(菲經口)적이며 점액을 통한 감염경로를 통하여 이루어진다. 따라서 풍토병이 아닌 경우의 감염위험집단은 HBV와 유사한 감염경로에 의해 감염되는데, 이들 집단은 빈도순으로 정맥주사에 의한 약물중독자, 혈액제제의 수혈자, 남성동성연애자들을 포함한다.
감염된 혈청에서 직경이 약 35∼37nm 가량되는 HDV 입자들은 42nm의 Dane 입자들과 HBV에서 유래한 22nm의 표면항원의 일부들과 구별된다. HDV 비리온은 B형간염의 표면항원(HBsAg)이 함침된 외막을 갖는다. 상기 복합체는 델타 간염항원(HDAg)과 l.7kb의 단일 가닥의 RNA를 캡시드화(encapsidate)하고 있다.
HDV RNA 게놈에 관한 분자단위의 연구는 상기 게놈이 다른 알려진 동물바이러스와는 달리 원형의 구조임을 밝혔는데, HDV RNA는 분자내에서 염기쌍을 형성하여 게놈 구조가 접혀질 수 있고, 이것에 의해 가지없는 막대형상의 구조를 취할 수 있다. HDV에 대한 재조합 프로우브(probe)의 생성은 상기 게놈의 세포내 복제에 대한 연구를 가능하게 하였다. HDV 복제는 헬퍼 헤파드나 바이러스(helper hepadna virus)의 복제와는 달리 역전사가 수반되지 않는다. HDV 게놈 복제는 게놈 RNA를 안티게놈 RNA (antigenomic RNA)로 불리는 상보적인 RNA로 복제되는 과정을 포함하는데, 이 상보적인 RNA는 이후 게놈 RNA의 합성을 위한 주형으로 작용한다. 감염된 세포내에서 게놈 RNA는 안티게놈 RNA 보다 대략 5∼20배 정도 과량으로 존재한다. HDV 게놈 RNA는 감염된 간에서 전체 간 RNA의 1% 정도까지(이는 간세포 당 평균 300,000개의 복제물에 해당) 축적될 수 있다.
요약하면, HDV 게놈복제의 여러가지 면은 HDV 바이러스를 다른 동물바이러스와 구별되게 하는데, 그 특징은 다음과 같다.
HDV 비리온 게놈은 약 1700 뉴클레오티드의 단일가닥의 RNA임 ;
게놈 RNA의 적어도 96%는 원형구조임 ;
상기 게놈 RNA는 염기쌍을 형성함으로써 그 자체로 접혀져 가지없는 구조를 형성할 수 있는 능력이 있음 ;
세포안에는 게놈 RNA 뿐만아니라 비교적 적은 양이긴 하지만 안티게놈 RNA로 불리는 상보적인 RNA가 존재함 ;
세포내 게놈 및 안티게놈 RNA의 대부분은 단위게놈 길이를 지닌 단량체임 ;
이들 단량체의 대부분은 원형구조를 지니고 있음 ;
다양한 길이의 게놈 및 안티게놈 RNA는 단량체 RNA에 비해 상대적으로 낮은 수준으로 세포내에 존재함.
첸(Chen)등이 Proc. Natl. Acad, Sci. USA 83 : 8774-8778(1986)에 보고한 바와 같은 최신의 증거는 식물성 비로이드의 롤링-서클(rolling-circle)형 복제모델이 HDV에도 적용가능함을 보여주고 있다. 이러한 복제방식은 우선 원형의 프로제니 단량체(progeny monomer)를 생산하기 위한 RNA 절단과 이음(ligation)이 요구되는데, 이 반응들은 HDV RNA 경우, 단백질 부재하의 시험관내에서 수행될 수 있다. 몇 군데의 연구소에서 특정 염기서열의 RNA 촉매로서 리보자임 활성들이 HDV 게놈 및 안티게놈(센스)가닥내에서 존재하고 있음을 알아내었다. 자기절단(autocleavage)은 각각의 가닥 및 접합단편(junction fragment)의 특정 위치에서 일어나는네, 이는 비루소이드(virusoid) 자기절단에서처럼 사이클릭 -2', 3'-모노포스페이트와 5'-히드록실 말단을 생성하게 된다. 또한 델타 RNA의 절단지점 근처에 있는 l10개 또는 그 미만의 뉴클레오티드 단편들은 다른 리보자임과 비교해 볼때 보다 빠른 속도와 비교적 낮은 Mg2+농도에서 스스로의 촉매작용으로 절단된다.
(리보자임의 배경)
RNA 사슬의 절단 및/또는 이음에 관여하는 것으로 현재까지 알려진 리보자임은 5개 부류로 대별된다. 흔히 리보자임은 RNA 기질에 작용하는 RNA 효소로 정의된다. 1982년 케흐(Cech)와 그 동료들(Cell, 31: 147-157)은 전구물질 rRNA에서 완전한 rRNA로 전환되는 과정에서 단세포 진핵생물인 테트라히메나(tetrahymena)의 리보솜 RNA의 전구물질이 상기 RNA 염기서열의 특정 요소의 촉매작용으로 절단제거되는 과정을 규명하여 리보장임의 존재를 입증하였다. 제거되는 염기서열(이른바 간섭서열 또는 인트론(intron))은 클래스 I (Class I)인트론 리보자임 활성이 있는 것으로 알려져 있는 수많은 예들 중의 하나이다. 이와 유사한 클래스 II 인트론 리보자임 매카니즘이 최근에 발견되었는데 여기에는 수많은 효모의 미토콘드리아 RNA들의 절단과 이음이 관련되어 있다(Nature, 324 : 429-433). 케흐와 그의 동료들은 유니버시티 페이턴트사에 의한 PCT/US 887/03161(1988. 6. 16. WO 88/04300으로 공개됨. )에서 클래스 I리보자임의 시험관내의 적용을 기술하였다. 그러나 세포나 환자의 치료에 있어서 이들의 적용가능성은 여전히 불투명하다.
1983년에 발견된 리보자임의 3번째 부류는 트랜스(trans)로 작용하는 첫번째 리보자임으로 밝혀졌는데 이때, 트랜스란 리보자임이 어느 하나의 RNA 사슬로 존재할 때 절단되는 기질은 제2의 분리된 RNA 사슬인 경우를 말한다. Ml RNA로 불리는 이 리보자임은 1983년 알트만과 그의 동료들에 의해 대장균의 모든 tRNA들의 5' 말단을 완전하게 형성시키는 절단과 관련있는 것으로 특징지어졌다. tRNA 합성과 관련되는 유사 RNA 리보자임은 사람의 셀라인(cell line)을 포함하여 모든 세포에서 발견되었다.
나머지 두가지의 리보자임 부류는 비로이드형 병원체 또는 VLP라 불리는 자기 복제형 RNA 집단의 복제 주기와 관련되어 있다. 식물성 비로이드, 식물성 바이러스의 RNA 부수체(satellite) 및 상기 델타 병원체는 모두 VLP 집단의 구성원들이다. 1984년 브랜치와 로버트슨(Science, 223 : 450-455)은 이들 병원체들의 복제주기 전략에 대해 발표하였으며, 잇따라 및군데 연구소에서 실험으로 입증되었다. 이러한 롤링-서클형 복제 전략에서 가장 중요한 점은 복제를 수행하는 VLP가 그 자신의 단위정보 길이보다 더 긴 복제물을 만들고 이후 리보자임의 활성에 의해 단량체크기로 절단되어 VLP 그 자체의 RNA로 조립된다는 사실이다. VLP 리보자임의 한 부류는 약 30개의 뉴클레오티드로 구성되는 작은 구조적 도메인으로 정의되는 헤머헤드(hammerhead)라 불린다. 유렌백(Nature 328, 596-600, 1987)과 포오스터와 시몬스(Cell 50, 9-16, 1987)는 이 리보자임 부류에 의한 절단의 요건들을 명확히 하였다. 또한, 다양한 예들과 잠재적인 이용법들은 하셀로프, 저라크 및 제닝스에 의해서 PCT/AU 88/00478 (Commonwealth scientific and Industrial Research Organization, 1989년 6월 29일에 발표됨)에 설명되어 있다.
또한, 상기 델타 병원체 RNA는 롤링-서클 메카니즘에 의해 복제되며, 이때 리보자임은 다양한 길이를 갖는 게놈 및 안티게놈 RNA를 단량체로 절단하는데 중요한 역할을 한다. 샤민 등은 J. Virol., 62, 2674-2679(1988) 에서, 브랜치 등은 Science, 243, 649-652(1989) 에서 그리고 우와 라이는 Science 243, 652-655(1989)에서 상기 델타가닥들 양자의 리보자임 절단부위와 이들 절단부위들을 포함하는 도메인을 결정하였다. 미국 출원번호 제07/411,713호에는 이들 리보자임 요소들의 특성들이 요약되어 있고 항-바이러스 치료법에서의 이들의 사용이 기술되어 있다.
본 발명의 목적은 목표리보자임과 일체화된 치료용 실재물을 세포에 전달하기 위한 방법들과 조성물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 세포내에서의 발현을 위하여 간세포와 같은 세포에 특정 단백질을 코딩하는 유전자들을 전달하는 방법들과 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 한가지의 목적은 델타 간염바이러스 또는 다른 바이러스들에 기초한 방법들과 조성물을 제조하는데 있는데, 이들 바이러스의 복제주기는 스스로 제한되거나 또는 제한되도록 가공될 수 있다.
벡타로서의 델타의 용도는 본 발명에서 확장되는데, 다음과 같은 분야들로 확장된다.
한 실시예에서 자기복제능력이 있는 델타 RNA 게놈은 단백질용 mRNA를 부호화하거나 목표 리보자임을 위한 추가정보를 운반하는데, 이들 정보는 델타의 감염성을 이용하여 간세포에 특정적으로 운반될 수 있고, 또는 변형된 표면단백질을 지닌 잡종 델타 바이러스 병원체를 이용하여 다른 세포들에 전달될 수 있다.
다른 실시예에서 상기 델타 벡터는 스스로 복제를 제한할 수 있도록 만들어져서 목제정보를 전달하는 델타벡터의 역할은 감염시 나타나는 자신의 무제한적인 복제특성과는 구별된다. 목표 RNA는 절단되는 부위나 그 근처의 염기서열들과 특정적으로 상호작용하는 델타 염기서열 부근의 염기서열들이다.
이들 실시예들은 B형 간염과 후천성 면역결핍증 바이러스(HIV) 감염과 같은 바이러스 질환들을 치료하는데 특히 유용하다.
리보자임은 델타 바이러스 RNA의 생활사의 중요한 일부이고 여기에 기술된 바와 같이 델타 RNA 벡타를 이용하는 여러 치료방법들 중의 하나를 제시하고 있지만, 여기에 개시된 방법들과 벡터들의 주요한 주제는 델타 RNA가 치료정보(리보자임 RNA나 단백질형태임)를 간세포나 다른 세포에 전달해 주기 위하여 스스로 복제를 제한하는 벡터로서 사용될 수 있다는 점이며, 또한 이 덱타벡터들은 처치된 환자의 세포내의 염색체 DNA를 바꾸거나 개입시키지 않고 RNA 수준에서 이 모든 것들을 수행할 수 있다는 점이다.
델타 바이러스 RNA 벡터들은 병원체안의 특정 RNA 염기서열을 목표로 할 뿐만아니라 자체 증식을 위해서도 요구되는 리보자임을 운반하도록 구성되어 있다. 여기서 강조되어야 할 점은 mRNA와 리보자임을 적정한 목표에 전달해주고, 또한 델타의 자기복제능력을 이용하여 가장 효과적인 치료를 위해 필요한 정보를 증폭시키는 벡타로서의 델타 바이러스의 역할이다. 정보는 최소한 1100개 염기를 포함하는 기본 게놈에 추가되어 1679개의 표준 염기길이 보다 길 수 있는데 이러한 벡터에 의해 목표 리보자임이나 mRNA용 주형이 표적세포에 전달될 수 있다. 여기에서 RNA는 증식되고/되거나 특정 표적 RNA 염기서열에 트랜스로 작용한다. 후자의 경우, 목포 염기서열(targeting sequences)은 상기 델타게놈에 추가되고 복합 RNA는 입자로 포장되어 간세포나 다른 세포에 적절히 도입된다. 확장된 델타게놈 RNA는 정상적인 델타복제주기에 필요한 두개의 리보자임에 더하여 하나 또는 그 이상의 추가 리보자임을 포함하도록 구성된다. 추가 리보자임은 어떤 중요한 RNA 구조를 방해하지 않는 게놈의 일정 위치에 자리잡고, 처치되는 상기 바이러스의 표적 염기서열이 발견되었을때에 한하여 트랜스로 절단한다.
아래에서 상세히 기술될 실시예를 먼저 요약하면 다음과 같다.
(1) 리보자임 활성을 지니고 있으며 HBV mRNA를 목표로 하고 있는 델타 바이러스 RNA를 간으로 전달하는 단계 ;
(2) 특정 간단백질 또는 기타 다른 단백질용 mRNA를 운반하는 델타 바이러스 RNA를 간으로 전달하는 단계 ;
(3) 간이나 그외의 조직 전달용 델타 바이러스입자의 생산을 위하여 세포라인 패키징을 구축하는 단계 ;
(4) RNA로서의 정보의 증식은 허용되나, 감염성 병원체로서의 전파는 제한되도록 사용되는 델타-베이스 RNA 벡터를 자기복제-제한적(self-limiting)으로 하는 단계 ;
(5) T세포와 같은 간세포이외의 세포를 목표로 하도록 변형된 표면단백질을 지니고 있는 잡종 델타 벡터를 구성하는 단계 ; 및
(6) 델타 벡터의 대용이며 자기복제-제한적인 리보자임 운반체로서 사용되기 위하여 엔브(env)유전자 및/또는 다른 유전자 조각을 떼어낸 자기복제-제한적인 레트로바이러스 벡터를 구성하는 단계로 구성된다.
이 새로운 벡터들은 다양한 질병을 치료할 수 있는 치료수단을 제공하는데, 특정 단백질의 발현 결핍 또는 결함이 원인이 되어 일어나는 질병 뿐만아니라 특히 바이러스성 질환의 치료에 유용하다. 예를 들어 델타벡터에 의해 감염될 수 있는 간세포내에서 델타 바이러스 입자의 표면단백질을 제공하는 B형 간염 헬퍼 바이러스의 생장과 복제의 패턴은 변형된 델타간염벡터를 이용한 항바이러스 치료에 특히 민감하게 한다. 상기 치료의 목표로서 특히 적당한 다른 바이러스로는 후천성 면역결핍증 바이러스(HIV)이며, 상기 변형된 델타형 벡타를 사용하여 HIV 게놈자체와 HIV 단백질을 코딩하는 결정적인 RNA를 절단시킴으로써 불활성화시킨다. 특히, 상기 델타 벡터를 사용하여 소망하는 단백질을 코딩하는 RNA를 간에 특정적으로 감염전달시켜 다양한 질병들이 치료될 수 있다. 예를 들어, 응고인자(coagulation factors)와 같은 간단백질 또는 인슐린과 같은 간이외의 조직의 단백질을 코딩하는 유전자들은 변형된 델타 벡터를 사용하여 간세포로 전달될 수 있다.
서로 다른 지역에서 분리된 다양한 HDV 염기서열들이 존재하는데 이들은 매우 가벼운 증상부터 중증까지의 다양한 병원성 스펙트럼을 보인다 예를 들어, 급성간염이 전혀 나타나지 않는 경우(Jacobson, I. M., et al., J. Hepatology, 5 188-191(1985))인 태평양 지역(멜보른)에서 분리된 변종과는 대조적으로 지중해지역(나폴리)으로부터 분리된 변종은 전체 환자의 50%가 급성간염을 나타낸다(Sherlock, S. and Thomas, H.C. J. Hepatology, 3 419-423(1986)). 병원성이 약한 변종의 사용은 숙주에 최소한의 피해를 주는 바이러스 벡터를 보증해준다.
이하, 본 발명을 한정하지 아니하는 실시예를 참조하여 본 발명을 상세히 설명하고자 한다.
리보자임 활성을 지니고 있으며 HBV mRNA를 목표로 하고 있는 델타 바이러스 RNA를 간으로 전달
B형 간염 바이러스(HIV)의 감염은 전 세계에 걸쳐 흔하며, 종종 극심한 질병의 증세와 때때로 죽음까지도 유발한다. 제1도에 도시된 바와 같이 HDV 비리온의 외막은 그 외부에 B형 간염표면항원(HBsAg)을 지니는데, 이는 바이러스 입자를 간세포로 향하게 한다. 내부에는 스스로 염기쌍을 이루고 있는 원형 RNA와 델타항원(HDAg)이 들어 있다. 제2도는 HBV에 의한 감염과 복제 그리고 HDV에 의한 공동감염과 복제의 개략도이다. 그러므로 델타 바이러스의 특정한 조준능력은 HBsAg mRNA 또는 다른 HBV 단백질을 코딩하는 mRNA에 조준된 활성 리보자임을 HBV로 감염된 간세포에 전달하는데 사용될 수 있다.
미국특허출원 제07/411,713호에 기술된 바와 같이, HDV RNA는 게놈가닥의 685/686 위치 그리고 안티 게놈가닥의 900/901 위치에서 자기절단되는 리보자임 활성을 지니고 있는데, 이는 둘다 HDV 복제를 위하여 필요하다. 게놈 RNA의 110 염기부분은 스스로 절단되는 능력이 있다. 자외선 크로스링크(ultraviolet cross-linking)연구의 성과로 입증된 상기 염기서열의 가상적 구조는 제3도는 도시된 바와 같이 기질부와 효소부 양자를 포함하는 공간적 배열을 지닌 페쇄구조로서 뉴클레오티드 685와 686 사이에 절단위치가 있다. 상기 구조는 기질적 성질을 지닌 반쪽(662-707)과 효소적 성질을 지닌 나머지 반쪽 (708-771)으로 대별된다.
특정 HBV RNA 염기서열에 조준된 리보자임 활성을 지닌 상기 구조의 한 형태에서 상기 효소부의 스템 부분(stem portion)은 예를 들어, 상기 HBV RNA에 대해 상보적인 15 뉴클레오티드 길이의 안내용 염기서열에 의해 대체된다. 상기 위치는 기질부의 루프(loop)에서 특히 절단위치 주위에서 염기서열의 제한적인 유사성이 유지되도록 선택된다. 리보자임 활성을 지닌 상기 구조의 다른 형태는 부분적인 3차적 RNA : RNA 상보작용 또는 RNA의 효소적 특성과 기질적 특성을 인식하는 단백질에 의하여 절단위치를 조준한다. 다음, 이러한 구조들은 적절한 구조적 상호작용에 의하여 특정된 위치에서 상기 HBV RNA를 절단할 수있다.
유전공학적으로 재조합된 추가의 리보자임 염기서열은 HDV 복제를 방해하지 않는다면 하나이상의 위치에서 HDV RNA에 삽입될 수 있다. 클로닝 공정은 상기 HDV 게놈 전체에 상응하는 cDNA 염기서열상에서 수행되는데, PCR(polymerase chain reaction) 공법을 이용하여 특정위치에서 안티-HDV 리보자임 단편을 HDV cDNA로 클로닝한다. 적절한 델타 벡터를 구성하는 한가지 방법에서는 HDV cDNA의 연속된 트리머(trimer)가 만들어진 후 진핵생물에서 발현하는 벡터 플라스미드인 SV40의 초기유전자 프로모터(promoter)의 다운스트림(downstream)으로 삽입되어 클론화된다. 다음, 상기 플라스미드는 간세포에 주입된다. 생성된 RNA는 상기 델타 바이러스 RNA의 트리머로 이는 자기복제가능한 단량체의 델타 RNA로 가공된다. SV40 프로모터는 상기 RNA 트리머의 최초생산을 위해 필요하고 이후 RNA는 자기 복제가 가능하다. 적절한 델타 벡터를 구성하는 제2의 방법에서는 T7 또는 SP6 프로모터의 통제하에 있고 델타염기서열을 지니는 재조합된 DNA 삽입물은 박테리오파아지 T7 또는 SP6 RNA 중합효소에 의해 시험관내에서 전사될 수 있고, 생성된 RNA는 리포펙션(lipofection) 또는 유사한 방법에 의해 세포로 도입될 수 있다.
이러한 델타 RNA는 HBsAg를 발현시키는 특별한 세포라인을 이용하여 HBsAg를 갖는 비리온내에 포장된다. 유전공학적으로 제조합된 델타 바이러스가 HBV에 감염된 환자의 혈류내로 도입될 때, 상기 델타 바이러스는 특정적으로 간세포를 감염시킨다. 일단 간세포내에서 상기 델타 바이러스가 복제되어 게놈단위로 많은 복제물이 생산되며, 이는 HBsAg mRNA나 다른 HBV mRNA 또는 리보자임 활성에 의해 특징되는 HBV 프리게놈 RNA(HBV pregenome RNA)를 절단하여 HBV 게놈을 불활성화시킨다.
델타감염 바이러스의 게놈의 염기서열의 상단부분은 내부적인 상보성을 지닌다. 이러하 특성때문에 델타의 안티게놈 가닥의 리보자임 영역은 게놈가닥의 리보자임영역의 염기서열과 유사하다. 그러나, 안티게놈가닥에서 절단은 685와 686 위치 대신 900과 901 뉴클레오티드 사이에서 일어난다. 리보자임 절단부위 주위의 안티게놈 가닥의 예측되는 2차 구조는 상응하는 스텝 루프 구조를 지닌 게놈가닥의 2차구조(제3도 참조)와 매우 유사하다. 이 구조는 게놈가닥의 경우처럼 효소부와 기질부를 생성하도록 재조합될 수 있는데 이는 트랜스(trans)로 작용하는 리보자임으로 기능할 수 있다. 또한 델타 벡터는 HBV 또는 그 외의 RNA 분자를 절단시키기 위하여 게놈가닥에 있는 리보자임 활성 뿐만아니라 안티게놈 리보자임 활성을 이용하며 이를 위해 유전공학적으로 재조합될 수 있다.
(실시예 2)
단백질을 코딩하는 염기서열의 특정한 전달에 사용되는 RNA 벡터로서 델타 바이러스 병원체의 이용사례
전술한 바와 같이 델타 바이러스는 바이러스 피막의 유일한 구성성분인 HBsAg의 존재때문에 간에 대해 특정한 친화력을 갖는데, 이는 아마도 항원에 대한 간세포상의 특정 수용체와의 상호작용에 기인하는 것으로 추정된다. 따라서, 단백질을 코딩하는 유전자(간세포에서만 차별적으로 발현됨. )는 그 단백질의 세포내 발현을 위한 개시코돈(start codon)과 정지코돈(stop codon)과 함께 삽입될 수 있다. 델타의 안티게놈 가닥은 몇개의 유전자판독단위(open reading frame, ORFs)를 갖는데, 상기 델타항원을 코딩하는 ORF5만이 감염된 간세포에서 단백질로 해독된다. 따라서 단백질을 코딩하는 염기서열은 간세포를 목표로 하는 발현벡터의 구성을 위하여 이러한 해독부호들의 통제하에서 삽입된다.
표준 델타 바이러스에서 발견되는 1,679개 뉴클레오티드와 대조되는 2,942개 뉴클레오티드의 게놈을 갖는 델타변종의 분리는 여분의 단백질코딩 염기서열을 델타 바이러스 RNA로 삽입시킬 수 있는 가능성을 보여 준다.
생체내 바람직한 응용으로, 알콜 탈수소화효소와 같은 간단백질 또는 항혈우병성 인자와 같은 혈액응고 단백질이 결핍된 환자에게 적당한 델타 바이러스 RNA 벡터를 주입시켜 결핍되거나 또는 없는 상기 단백질을 늘려주거나 대체시킬 수 있다. 또한 인슐린과 같은 간이의의 단백질용 염기서열을 운반하는 델타 벡터 역시 간세포로 도입되는 전체적으로 특정 단백질을 방출하는 것이 가능하다.
(실시예 3)
간이나 그 외의 조직을 조준하는 델타 바이러스 입자를 생산하기 위한 패키징 세포라인의 개발
실시예 1과 그 변형에 기술된 바와 같이 바이러스성 또는 세포성 mRNA에 조준된 리보자임 활성을 갖든지 실시예 2에 기술된 바와 같은 단백질생산을 위해 해독되는 RNA를 갖든지간에 유전공학적으로 재조합된 델타 바이러스 RNA들을 목표정보를 특정조직에 전달하는 약제 운반체로 사용되기 전에 비리온으로 포장되어야 한다. 델타 RNA를 HBsAg로 피막된 비리온으로 포장하기 위해서는 SV40 프로모터의 통제하에 있는 재조합된 델타 cDNA 트리머(trimer)가 구성되고, 이는 대량의 HBsAg를 발현시키는 간세포 또는 다른 세포라인에 주입되어야 한다. 그러한 세포라인은 포유동물에서 기원한 것(예를 들면, HepG2) 또는 효모에서 기원한 것일 수 있는데 이들은 SV40 프로모터, 백시니아 바이러스 프로모터, 또는 다른 적절한 프로모터의 통제하에 있는 HBsAg 유전자의 주입으로 쉽게 구성될 수 있다. SV40 프로모터를 운반하는 셔를벡터 플라스미드는 파르마시아(Pharmacia)에서 구입할 수 있다.
대량의 HBsAg를 발현하는 클론은 선택되고 배양액에 배양된다. 유전공학적으로 제조합된 델타 cDNA 트리머 또는 적당한 RNA 복제물은 이들 세포라인으로 바로 주입되거나 리포펙트(lipofect)된다. 이때 복제되는 델타 유전자는 비로온내에 패키지되어 HBsAg 단백질로 둘러싸인 RNA : 델타-항원 복합체를 형성하게 된다. 이들 비리온은 감염된 세포들의 세포막으로부터 발아되어 빠져나오고, 이는 세포배약액의 상등액으로부터 수집분리되어 차후 감염을 위해 사용될 수 있다. 재조합된 델타의 리보자임 활성이 HBsAg mRNA에 조준되어 있을때, 상기 리보자임의 파괴능력이상의 HBsAg RNA를 과량 생산하는 세포라인은 상기 변형된 바이러스의 생산을 위해 사용된다.
실시예 5에서 기술되는 잡종 델타 벡터의 생산을 위해서는 상기 델타 바이러스 벡터의 특정 표면항원을 생산하는 세포라인이 사용되어야 한다. 예를 들면, 유사(Pseudo)-HIV 비리온에 잡종 델타 바이러스 RNA를 포장하기 위해서는 상기 변형된 델타 바이러스 cDNA는 HIV의 외막 당단백질을 발현시키는 세포라인으로 주입되어야 한다. 생성된 잡종 델타비리온은 HIV 피막단백질로 둘러싸이고, 원형(原形) HlV-1와 동일한 방법으로 CD4+세포를 특정적으로 조준할 수 있다.
(실시예 4)
RNA로서의 정보의 증식은 허용되나, 감염성 병원체로서의 전파는 제한되는 자기복제-제한적인 델타-베이스 RNA 벡터의 개발
항-바이러스 약제의 성공여부는 그것의 병원체 바이러스를 파괴하는 능력과 숙주에 대한 피해를 얼마나 최소화시킬 수 있는가에 달려있다. 그러한 목적으로 자기보제-제한적인 바이러스가 만들어졌다. 이러한 성과는 델타 바이러스의 경우에 가능한데, 델타 바이러스는 그 복제가 헬퍼바이러스에 의존적이기 때문이다 (제2도 참조). 비록 델타 바이러스 RNA는 어떠한 세포에서도 그 복제가 가능하지만 HBV에 의해 제공되는 표면항원의 도움없이는 감염성 입자를 형성하지 못한다. 이는 감염성 델타 바이러스 입자가 왜 HBV에 감염된 한자에서만 생성될 수 있는지에 대한 대답이 된다. 실시예 2에서 상술한 바와 같이, HBV 표면항원 mRNA 및/또는 코어항원 mRNA 또는 HBV 프리게놈 RNA를 조준하고 있는 리보자임을 지닌 재조합된 델타 바이러스 벡터는 HBV에 감염된 환자에 간에 주입되고, 벡터의 항-HBV 리보자임 활성 덕에 상기 HBV를 파괴할 수 있다. 상기 과정에 의하여 HDV는 감염성 델타 입자를 더 많이 생산하는데 필요한 HBsAg를 스스로 빼앗는 결과를 낳는다. 결국, 모든 HBV RNA가 파괴되면 델타 바이러스는 더 이상 감염성 입자를 생산할 수 없게 되고 따라서 그것의 전파는 제한된다. 또한 이러한 자기복제-제한적인 구조는 일반적으로 비루성 혈증과 독성효과도 제한한다.
(실시예 5)
간세포이외의 세포에 전달될 수 있도록 변형된 표면단백질을 지니고 있는 잡종 델타 벡터의 개발
비록 델타 바이러스는 비리온 표면상의 HBsAg 덕택에 리보자임과 mRNA 염기서열을 간세포에 톡정적으로 전달할 수 있는 우수한 벡터이지만, 변형되지 않은 형태로는 그 밖의 다른 세포에 치료제를 전담할 수 없는 단점이 있다. 따라서 이러한 한계를 극복하기 위하여 간세포 이외의 다른 세포에도 특이성을 갖는 변형된 델타 벡터를 만들어야 한다.
델타 바이러스 RNA는 안티게놈 가닥상에서 27kd의 단백질인 델타항원(HDAg)을 부호화하고 있는 델타의 게놈 RNA는 상기 항원에 의해 둘러 싸인 후 HBsAg에 의해 막이 입혀짐으로써 감염성 HDV 입자를 형성한다(제1도 참조). 델타항원의 아미노기 말단부위는 델타 RNA에 강하게 결합되어 있고, 델타항원의 카르복실기 말단부위는 헬퍼 HBV에 의해 제공되는 HBsAg 외막 단백질에 결합되어 있다.
HIV와 같은 레트로 바이러스 RNA는 델타 바이러스처럼 단백질에 의해 둘러싸인 후 바이러스입자가 발아될 수 있는(즉, 세포 밖으로 빠져 나올 수 있는) 외막으로 두럴싸이게 된다. 상기 개그(gag) 단백질은 델타항원처럼 레트로 바이러스성이다. 델타항원의 카르복실기 말단에 상응하는 델타 RNA가 HIV의 개그 단백질을 부호화하는 RNA 염기서열로 대체될때, 그 산물은 델타항원-개그 단백질의 잡종으로서 이는 상기 델타항원의 아미노기 말단 덕택에 델타 RNA에 결합될 수 있다. 실시예 3에서와 같이 HIV 외막 단백질을 발현시키는 세포라인에서 상기 델타 RNA가 복제될때, 상기 잡종단백질에 의해서 둘러싸인 RNA는 그 외막이 HIV 단백질로 구성된 비리온 내로 포장된다. 이러한 잡종델타 바이러스 입자들은 HIV 당단백질 외막의 특성에 의하여 CD4+세포에 대한 특이성의 지니게 된다.
만일 이러한 델타 바이러스 게놈이 실시예 1에 기술된 바와 같이 HIV의 엔브(env) 또는 개그(gag) mRNA를 조준하고 있는 리보자임을 지니고 있을 뿐만아니라 HIV에 이미 감염된 T세포에 주입하기 위하여 사용된다면, 상기 잡종델타 바이러스는 T세포위에 있는 CD4 분자들을 인지하여 T세포들을 감염시킬 것이다. 상기 델타 RNA는 복제될 것이고, HlV-특이성을 지닌 리보자임은 HIV 염기서열을 파괴할 것이다. 상기 델타벡터는 입자로 조입되고 전파되기에 충분한 HIV 엔브단백질을 남아있는 한, 새로운 감염성 입자를 형성할 것이다. 이와 유사하게 잡종벡터는 생체외에는 세포라인의 스템세포(stem cell)를 감염시킬 수 있는데, 이후 이것은 부분적으로 절개된 환자의 자기 골수이식에 사용되어 HIV 염기서열을 조준하는 리보자임의 존재 덕택에 HIV에 저항력이 지니고 있는 T세포 집단을 형성할 수 있다.
상기 기술은 델타항원의 아미노기 말단과 선정된 다른 바이러스의 표면항원을 갖는 다양안 잡종델타항원을 만드는데 채택되어 전환된 세포특이성을 지닌 유사(pseudo)비리온의 생산을 가능케 한다.
(실시예 6)
목표리보자임을 전달하는 자기보제-제한적인 리트로 바이러스 벡터의 개발
또한 레트로 바이러스 벡터는 다양한 세포 유형들에 대한 항-바이러스 리보자임을 전달하기 위해서도 사용될 수 있다. 그러나 불행하게도, 인간을 숙주로 하고 있는 레트로 바이스들중 극히 제한된 수의 바이러스만이 제한된 수의 세포 유형들에 특이성을 보이는 것으로 알려져 있다. 본 실시예에서는 불완전한 (결함이 있는) 바이러스가 리보자임용 벡터로 사용된다. 즉, 본 실시예에서는 HlV mRNA를 조준하는 리보자임을 지닌 결함있는 HIV 벡터가 사용되는 것이다. 상기 벡터는 CD4+세포를 조준할 수 있으나 감염성 비리온을 생산할 수 없는 특징이 있다.
일 실시예에서 HIV에 감염된 세포를 조준하고 있는 레트로 바이러스 벡터는 엔브유전자의 100-200 뉴클레오티드를 제거하고 여기에 HlV RNA의 엔브유전자 지역 또는 다른 지역(예를 들면, 개그 유전자지역)을 조준하는 목표리보자임으로 대체시킴으로써 제작된다. 유전공학적으로 재조합된 HlV RNA는 HIV 당단백질을 발현시키는 세포라인에서 포장된다. 생성된 바이러스 입자는 배양액의 상등액에서 분리되어 HlV로 감염된 환자에 감염시키는데 사용된다. 리보자임을 지닌 상기 결함있는 HIV 바이러스 입자는 CD4+세포들을 조준할 수 있는데, 여기서 바이러스 입자들은 엔도사이토시스(endocytosis)되고 피막이 벗겨진다. 다음, 이들 입자들은 항-HIV 리보자임을 복제하고 발현시킨 HIV RNA 입자들을 불활성화시킨다. 한편, 상기 변형된 HIV 입자들은 전체 비리온 형성에 필요한 외막 당단백질이 제공되는 경우에만 감염성 입자들을 형성할 수 있다.
이러한 일반적인 방법은 그외의 레트로 바이러스와 레트로 바이러스가 아닌 가능한 다른 바이러스에 적용하여 원시 바이러스를 파괴하는 리보자임을 운반하고 결함있는 즉, 자기복제-제한적인 바이러스를 생산할 수 있다. 상기 방법들과 목표리보자임 활성을 갖는 목표벡터의 변형과 변조들은 전술한 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백한 사항이므로 종속항의 범위에 포함된다.

Claims (48)

  1. 비-델타감염 바이러스 RNA 염기서열을 세포로 전달하는 벡터에 있어서, 상기 세포내에서 상기 벡터를 복제할 수 있는 간염델타 바이러스 RNA 요소들과 상기 벡터의 복제를 방해하지 않도록 델타감염 바이러스 RNA 염기서열에 부착위치된 비-델타감염 바이러스 RNA 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 비-델타감염 바이러스 RNA는 685번 염기에 인접하고 리보자임 활성을 지닌 델타감염 바이러스 RNA 염기서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 상기 비-델타감염 바이러스 RNA는 안티게놈의 900번 염기에 인접하고 리보자임 활성을 지닌 간염델타 바이러스 RNA 염기서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  4. 제1항에 있어서, 상기 벡터를 복제할 수 있는 간염델타 바이러스 RNA는 상기 비-델다감염 바이러스 RNA를 특정 RNA에 조준하기 위한 염기서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  5. 제1항에 있어서, 상기 비-델타감염 바이러스 RNA는 효소 활성을 지닌 식물성 비로이드형 병원체에서 유래한 해버헤드 리보자임의 뉴클레오티드들을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  6. 제1항에 있어서, HBsAg 유전자를 전사하기 위하여 프로모터의 통제하에 있으며 HBsAg를 부호화하고 있는 DNA를 가진 세포라인네의 벡터.
  7. 제6항에 있어서, 상기 세포는 간세포인 것을 특징으로 하는 벡터.
  8. 제1항에 있어서, CD4+세포라인내에 있으며, HlV 단백질을 부호화하고 있는 DNA를 가진 벡터.
  9. 제1항에 있어서, 상기 비-델타감염 바이러스 RNA 염기서열은 리보자임 활성을 지니며, 이는 리보자임 활성에 의하여 염기서열을 절단하도록 비-델타감염바이러스 RNA 염기서열을 조준하고 있어 결국에는 효소, 호르몬, 보조인자, 항체 및 생장인자로 구성된 군으로부터 선택된 단백질을 부호화하는 암유전자, 종양억제유전자, 바이러스 유전자 및 세포성 mRNA로 구성된 군으로부터 선택된 RNA를 불활성화하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  10. 제1항에 있어서, 델타감염 바이러스 단백질과 조합된 비-델타감염 바이러스 단백질을 부호화하는 잡종염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  11. 비-델타감염 바이러스 RNA 염기서열을 세포로 전달하는 벡터의 제조방법에 있어서, 세포내에서 벡터를 복제할 수 있고 비-델타감염 바이러스 RNA 염기서열이 부착되며 간염델타 바이러스 RNA 염기서열로 전사되는 cDNA를 제공하는 단계를 포함하는 벡터의 제조방법으로서 상기 비-델타감염 바이러스 RNA 염기서열은 상기 벡터의 복제를 방해하지 않도록 위치되는 것을 특징으로 하는 벡터의 제조방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 비-델타감염 바이러스 RNA는 685번 염기에 인접하고 리보자임 활성을 지닌 델타감염 바이러스 RNA 염기서열 또는 안티게놈의 900번 염기에 인접하고 리보자임 활성을 지닌 델타간염 바이러스 RNA 염기서열을 포함하여, 또한 효소활성을 극대화시키기 위하여 뉴클레오티드 염기서열을 변형하는 것을 특징으로 하는 벡터의 제조방법.
  13. 제12항에 있어서, 비-델타감염 바이러스 RNA 염기서열을 제2분자내의 특정 RNA에 특정적으로 조준시키는 염기서열을 벡터내에 제공하는 단계를 포함하는 더 포함하는 벡터의 제공방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 목표염기서열은 절단되는 바이러스 게놈의 염기서열에 근거하여 합성됨을 것을 특징으로 하는 벡터의 제조방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 바이러스 게놈은 B형 간염바이러스임을 것을 특징으로 하는 벡터의 제조방법.
  16. 제14항에 있어서, 델타감염 바이러스에 상보적인 바이러스 염기서열을 중합효소연쇄반응(PCR)에 의하여 콜론닝하는 것을 특징으로 하는 벡터의 제조방법.
  17. 제11항에 있어서, 상기 델타감염 바이러스 염기서열은 연속적인 트리머인 것을 특징으로 하는 벡터의 제조방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 트리머는 진핵생물에서 발현되는 벡터의 초기유전자 프로모터(promoter)의 다운스트림(downstream)으로 삽입되어 클로닝되는 것을 특징으로 하는 벡터의 제조방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 벡터와 프로머터 바이러스는 SV40인 것을 특징으로 하는 벡터의 제조방법.
  20. 제11항에 있어서, 상기 델타감염 바이러스 염기서열을 부호화하는 단위길이 보다 긴 DNA 삽입물을 구성하는 것을 특징으로 하는 벡터의 제조방법.
  21. 제20항에 있어서, 특정세포에 의거 인지되는 특정표면항원을 발현시키는 세포라인으로 상기 델타감염 바이러스 구성체를 포함하는 단계를 더 포함하는 벡터의 제조방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 구성체는 세포속에 주입감염되는 것을 특징으로 하는 벡터의 제조방법.
  23. 제21항에 있어서, 특정세포에 의거 인지되는 특정표면항원을 발현시키는 세포라인으로 생체외에서 합성된 단위길이 보다 긴 델타 RNA를 리포펙트(lipofected)시키는 것을 특징으로 하는 벡터의 제조방법.
  24. 제21항에 있어서, 상기 특정 표면항원은 HBsAg이고, 상기 특정세포는 간세포인 것을 특징으로 하는 벡터의 제조방법.
  25. 제21항에 있어서, 상기 특정표면항원은 HIV 외막 당단백질이며, 상기 특정세포는 세포표면상에 CD4 항원을 발현시키는 것을 특징으로 하는 벡터의 제조방법.
  26. 제21항에 있어서, 상기 감염된 세포의 막으로부터 빠져나오는 포장된 델타 바이러스 RNA 복합체를 수집하는 단계를 더 포함하는 벡터의 제조방법.
  27. 제16항에 있어서, 단위길이 보다 긴 델타 염기서열은 원핵생물에서 발현하는 벡터의 박테리오파아지 RNA 중합효소 프로모터(promoter)의 다운스트림(downstream)으로 삽입되어 클론닝되는 것을 특징으로 하는 벡터의 제조방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 벡터는 박테리아 플라스미드로부터 유래하고 상기 프로모터는 T7과 ST6로 구성된 군으로부터 선택된 박테리오파아지로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 벡터의 제조방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 벡터는 PBR322와 PUC로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 벡터의 제조방법.
  30. 제13항에 있어서, 조준된 염기서열이 결합될 때에만 트랜스로 절단작용하는 결정적인 RNA 구조를 방해하지 않도록 정상적인 델타 복제를 위한 염기서열들로 적어도 하나 이상의 추가리보자임을 위치시키는 단계를 더 포함하는 벡터의 제조방법.
  31. 세포내에서 발현되는 단백질을 부호화하는 염기서열과 델타감염 바이러스의 ORF5(유전자판독단위) 개시코돈의 5'에 위치한 델타감염 바이러스 해독통제 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포내 단백질발현벡터.
  32. 제31항에 있어서, 특정세포에 의해 인지되는 특정표면항원으로 포장되는 세포내 단백질발현벡터.
  33. 제32항에 있어서, 상기 세포가 간세포임을 특징으로 하는 세포내 단백질발현벡터.
  34. 제33항에 있어서, 상기 단백질을 부호화하는 염기서열은 간, 췌장, 비장, 위, 장 및 뇌로 구성된 군으로부터 선택된 기관에서 발현되는 단백질을 부호화하는 것을 특징으로 하는 세포내 단백질발현벡터.
  35. 제34항에 있어서, 상기 단백질을 부호화하는 염기서열은 혈액응고단백질, 효소, 호르몬, 보조인자, 항제, 생장인자, 암유전자 및 종양억제유전자로 구성된 군으로부터 선택된 단백질을 부호화하는 것을 특징으로 하는 세포내 단백질발현벡터.
  36. 델타감염 바이러스 벡터를 포함하는 세포라인으로서 상기 세포라인은 특정피막단백질을 발현시켜 포장된 바이러스 벡터가 감염시 특정 세포표면수용체와 상호작용하도록 것을 특징으로 하는 세포라인.
  37. 제36항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 프로모터, 해독개시 및 정지 신호, 그리고 특정 바이러스 피막단백질을 부호화하는 염기서열을 포함하는 겻을 특징으로 하는 세포라인.
  38. 제37항에 있어서, 상기 프로모터는 SV40 프로모터, 백시니아 바이러스 프로모터, B형 간염 프로모터 및 델타 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포라인.
  39. 제36항에 있어서, 상기 특정 바이러스 피막단백질은 HBsAg인 것을 특징으로 하는 세포라인.
  40. 제36항에 있어서, 상기 특정 바이러스 피막단백질은 HIV 외막 당단백질인 것을 특징으로 하는 세포라인.
  41. 헬퍼(helper)없이는 감염성 비리온을 생산할 수 없는 레트로바이러스, 리보자임 활성을 갖는 RNA 염기서열, 그리고 바이러스 복제를 위해 필수적인 단백질-코딩 염기서열을 조준하는 RNA 염기서열을 포함하고 있는 결합있는 레트로바이러스 벡터의 제조방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 벡터는 간세포를 조준하고 있으며 상기 필수적인 단백질은 B형 바이러스 단백질인 것을 특징으로 하는 결함있는 레트로바이러스 벡터의 제조방법.
  43. 제41항에 있어서, 상기 벡터는 CD4+세포를 조준하고 있으며 상기 필수적인 단백질은 후전성면역결핍증바이러스 단백질인 것을 특징으로 하는 결함있는 레트로바이러스 벡터의 제조방법.
  44. 제41항에 있어서, 상기 조준된 HIV의 엔브(env) 단백질을 부호화하고 상기 결함있는 레트로바이러스 벡터의 복제는 엔브단백질 합성의 억제에 의해 자기복제-제한적인 것을 특징으로 하는 결함있는 레트로바이러스 벡터의 제조방법.
  45. 헬퍼(helper)없이는 감염성 비리온을 생산할 수 없는 레트로바이러스, 리보자임 활성을 갖는 RNA 염기서열, 그리고 바이러스 복제를 위해 필수적인 단백질-코딩 염기서열을 조준하는 RNA 염기서열을 포함하고 있는 결함있는 레트로바이러스 벡터.
  46. 제45항에 있어서, 상기 필수적인 단백질은 B형 간염바이러스 단백질임을 특징으로 하는 결함있는 레트로바이러스 벡터.
  47. 제46항에 있어서, 상기 필수적인 단백질은 후천성면역결핍증 바이러스 단백질임을 특징으로 하는 결함있는 레트로바이러스 벡터.
  48. 제45항에 있어서, 상기 조준된 RNA는 HIV의 엔브단백질을 부호화하고 상기 결합되는 레트로바이러스 벡터의 복제는 엔브단백질 합성의 억제에 의해 자기복제-제한적인 것을 특징으로 하는 결함있는 레트로바이러스 벡터.
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