KR940002952B1

KR940002952B1 - 피리도[2,3-d]피리미딘 유도체의 제조방법

Info

Publication number: KR940002952B1
Application number: KR1019860700771A
Authority: KR
Inventors: 에드워드 씨. 테일러; 죠오지 피터 베어드스레이; 피터 쥬니어 해링톤; 스테펜 알. 플레처
Original assignee: 더 트러스티스 어브 프린스톤 유니버시티; 알렌 제이. 시니스갈리
Priority date: 1985-03-08
Filing date: 1986-02-24
Publication date: 1994-04-09
Also published as: PT82149B; PH23136A; CN1016174B; CN86101475A; SU1676449A3; IL78059A0; DK472186A; JPS62502535A; DE3689250T2; WO1986005181A1; DK168666B1; PT82149A; CA1276637C; JPH0822860B2; AU578813B2; HU196202B; IE63653B1; ES8704167A1; NZ215404A; KR870700067A

Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]

피리도[2,3-d]피리미딘 유도체의 제조방법

[발명의 상세한 설명]

[기술분야]

본 발명은 항종양제(Antineoplastic agents)인 N-(4-[2-(피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)알킬]벤조일)-L-글루탐산의 유도체와 이들의 제법 및 용도에 관한 것이다.

[배경기술]

폴산(Folic acid) 대사길항물질인 아미노프테린(Aminopterin)과 아메토프테린(Amethopterin) (10-메틸 아미노프테린 또는 메토트렉세이트로 공지됨)은 항종양제이다. 이들 화합물은 폴산의 대사성 유도체를 포함하는 효소 전환반응을 억제한다. 예를 들어, 아메토프테린은 2-데옥시우리딜레이트가 티미딜레이트 합성효소에 의해 티미딜레이트로 전환되는 과정에서 형성되는 디하이드로폴레이트로부터 테트라하이드로폴레이트를 재생시키는데 필요한 효소, 디하이드로폴레이트 환원효소의 작용을 억제한다.

폴산의 이밖의 유도체와 아미노프테린은 대사길항물질로서 합성 시험되어 왔다. 이들 화합물에는 통상 이미노기 또는 니트릴로기가 차지하는 분자내 위치를 각각 메틸렌 또는 메틸리덴기가 차지한 각종 "데아자"화합물이 있다. 이들 유도체는 각기 다른 대사길항물질 활성도를 갖고 있다. 10-데아자-이미노프테린은 그 활성이 높은데 반해서 (Sirotak 등, Cancer Treat. Rep., 1978, 62, 1047), 10-데아자폴산은 전혀 활성이 없다(Struck 등, J. Med. Chem., 1971, 14, 693). 5-데아자폴산은 세포독성이 약한데 반해서, 5-데아자아미노프테린은 아메토프테린과 유사한 활성을 갖는다(Taylor 등, J. Org, Chem., 1983, 48, 4852). 8, 10-디데아자폴산은 디하이드로폴레이트 환원효소 억제제로서 약간의 효과가 있으며(De Graw 등, "Chemistry and Biology of Pteridines", Elsevier, 1979, 229), 5, 8, 10-트리데아자폴산은 또한 생쥐 L1210 백혈병에 대해 약간의 활성이 있다(Oatis 등, J. Med. Chem., 1977, 20, 1393). 8-10-디데아자아미노프테린은 활성으로 보고되어 있으며(미합중국 특허 제4,460,591호), 또 5, 8, 10-트리데아자아미노프테린은 생쥐 L1210 백혈병에 대해 활성을 나타내었다(Yan 등, J. Heterocycl. Chem., 1979, 16, 541).

[발명의 개시]

본 발명은 다음 일반식(ⅠA)의 피리도[2,3-d]피리미딘 ; 다음 일반식(ⅠB)의 5, 6, 7, 8-테트라하이드로피리도[2,3-d]피리미딘 ; 이들의 토오토머 이성체 ; 와 이들의 약제학적으로 허용되는 알칼리금속, 알칼리토금속, 비독성금속, 암모늄 및 치환된 암모늄염에 관한 것이다.

상기식에서, R¹은 아미노 또는 하이드록시 ; R³은 수소, 메틸 또는 에틸 ; *로 표시된 탄소원자에 대한 배열은 L 배열이다.

본 발명은 또한 이같은 화합물을 제조하는 방법, 이들 제법에 유용한 중간체와 종양성장을 퇴치하기 위한 화합물의 사용 방법 및 그 조성물에 관한 것이다.

[발명의 최선의 실시 형태]

본 발명 화합물들은 다음과 같이 번호를 부여한 피리도[2,3-d]피리미딘 헤테로사이클 고리의 유도체들이다.

R¹이 하이드록시인 일반식(ⅠA) 및 (ⅠB)의 화합물들은 상응하는 3, 4-디하이드로-4-옥소 화합물과 토오토머 평형 상태로 존재한다.

편의상, 전 명세서를 통하여 4-하이드록시 형태로 도시하고 또 상응하는 명명법을 사용하였으나, 모든 경우에 이같은 표현에는 토오토머 3, 4-디하이드록시-4-케토 이성체도 포함된다는 점을 주지해야 할 것이다.

글루탐산 사슬에서 *표시된 탄소원자의 절대배열은 L로서, 알라닌에서 상응하는 알파 탄소원자의 절대 배열과 동일하다.

R³가 수소가 아닌 경우에는 제 2 의 키럴(chiral) 중심이 존재하게 됨으로써 d,L-및 ℓ,L-부분 입체 이성체가 생성된다. 이들 부분 입체 이성체는 크로마토그래피와 같은 방법으로 물리적으로 분리할 수 있다. 일반식(IB)의 5, 6, 7, 8-테트라하이드로 화합물인 경우에, 피리도[2,3-d]피리미딘 고리계의 6위치 탄소원자가 또한 키럴 중심이 되어, R³가 수소인 경우 d,L- 및, ℓ,L-부분 입체 이성체를, 또한 R³가 수소가 아닌 경우에는 d,ℓ, L-, d, d, L-, ℓ, ℓ, L- 및 ℓ, d, L-부분 입체 이성체를 생성시킨다. 전술한 이들 이성체 모두는 상기 방법에 따라 분리할 수 있으며 또한 본 발명 범위내에 포함된다.

본 발명은 예를 들어 나트륨, 칼륨, 리튬, 칼슘, 마그네슘, 알루미늄, 아연, 암모늄, 트리메틸암모늄, 트리에틸암모늄, 트리에탄올암모늄, 피리디늄, 치환된 피리디늄과 그 유사체와 같은 약제학적으로 허용되는 알칼리금속, 알칼리토금속, 비독성금속, 암모늄 및 치환된 암모늄염을 포함한다.

본 발명 화합물들은 폴산과 특히 폴산의 대사성 유도체를 사용하는 1개 또는 그 이상의 효소에 대해 기질(基質)로서의 효과를 갖는다. 대표적인 예로는 다음 혼합물을 들 수 있다.

화합물번호 1. N-(4-[2,-(2,4-디아미노피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)에틸]벤조일)-L-글루탐산.

화합물번호 2. N-(4-[2-(2-아미노-4-하이드록시피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)에틸]벤조일)-L-글루탐산.

화합물번호 3. N-(4-[2-(2,4-디아미노-5,6,7,8-테트라하이드로피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)에틸]벤조일)-L-글루탐산.

화합물번호 4. N-(4-[2-(2-아미노-4-하이드록시-5,6,7,8-테트라하이드로피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)에틸]벤조일)-L-글루탐산.

[표 1]

디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)의 억제작용

(Kaufman 등, "Methods in Enzymology", Jacobs and Wilcheck, Eds., Academic Press : New York, 1974, 272-281 페이지)

[표 2]

티미딜레이트 합성효소의 억제작용

(Wahha 등, J. Biol, Chem., 1961, 236, 611 페이지)

[표 3]

폴레이트 폴리글루타메이트 합성효소용 기질

부분적으로 정제한 생쥐 간장 FPGS[비활성=1.2n몰h^-1(단백질mg)와 함께 37℃에서 1기간 동안 배양함 ; 6배 농도에서 중복시험으로 완전 포화곡선이 수득됨-Moran 등의 Anal. Biochem., 1984, 146, 326 참조.

* 폴산에 대한 상대치임

+ 공개 수치임 : Moran 등의 Biochemistry, 1984, 23, 4580 참조.

[표 4]

조직배양에서 L1210쥐 백혈병 세포의 억제작용

(Foley 등의 Biochem, Pharmacol., 1967, 16, 658 참조)

[표 5]

10^-5의 L1210 백혈병 세포를 복막 주사한 것에 따른 생쥐(BDF₁) 수명의 증가(ILS) 화합물을 표시된 투여량으로 9일간 복강내 주사하였다.

특히 N-(4-[2-(2-아미노-4-하이드록시-5,6,7,8-테트라하이드로피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)에틸]벤조일)-L-글루탐산은 독특한 대사길항 물질이다. L-1210 백혈병에 대해 메토트렉세이트에 견줄만한 우수한 활성을 유지하는 한편, 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 이하의 폴레이트-관련 효소 표적에 대해 대체로 활성을 나타내지만 디하이드로폴레이트 환원효소의 억제제로서는 그 활성이 약하다. 이같은 결론은 메토트렉세이트 내성 세포에 대한 활성에 의해서도 지지될 수 있다.

[표 6]

메토트렉세이트-내성 L-1210 백혈병에 대한 효과 :

이들 화합물은 다음 일반식(Ⅱ)의 글루탐산 유도체를 가수분해 또는 가수소분해시킴으로써 제조할 수 있다 :

상기식에서, R¹및 R³는 앞에서 정의한 것과 동일하며 ; R⁴는

R⁵및 R⁶는 서로 동일하거나 또는 상이한 카르복실산 보호기이며 ; 또 R⁷은 수소 또는 아미노산 보호기이다.

본 발명에서 가수분해는 경우에 따라서는 메탄올, 에탄올, 테트라하이드로푸란, 디메틸포름아미드 및 그 유사체와 같은 수혼화성 유기용매 존재하에서, 예를 들어 알칼리금속 수산화물 수용액 ; 또는 트리플루오로 아세트산과 같은 산류 등의 산 수용액 또는 염기 수용액을 사용해서 통상 온도에서 진행시킬 수 있다. 염기를 사용하는 경우에, 생성물은 초기에 2 양이온성 글루타메이트 염으로 형성되며 또 아세트산 등으로 산성화시키는 등 pH를 조정해서 생성물을 쉽게 침전시킬 수가 있다. 수득 생성물은 일반적으로 고융점을 갖는 결정 또는 미세결정성 고체이다.

일반식(Ⅱ)의 글루탐산 중간체는 다음 일반식(Ⅲ)의 피리도[2,3-d]피리미딘 화합물을 수소화 반응시켜서 수득할 수 있다.

상기식에서, R¹, R³, R⁵, R⁶및 R⁷은 앞서 정의한 것과 같다.

이 수소화 반응은 비활성 용매중에서, 또 Pd/C, Pd/CaCO₃, PtO₂등과 같이 경우에 따라서는 탄소 또는 탄산칼슘과 같은 지지체상의 팔라듐 또는 산화백금과 같은 귀금속 또는 귀금속 산화물 등의 적당한 촉매 존재하에서 50 내지 100psi 압력으로 진행시킬 수 있다.

R₄가

일반식(Ⅱ)의 5,6,7,8-테트라하이드로피리도[2,3-d]피리미딘일 중간체는 R⁴가

인 일반식(Ⅱ)의 상응 화합물을 독립적으로 수소화 반응시켜 제조될 수 있다.

이와 다르게, 일반식(Ⅱ)의 5,6,7,8-테트라하이드로피리도[2,3-d]피리미딘일 중간체들은 수소화 반응시간을 증가시키고, 압력을 증가시키며 및/또는 온도를 승온시키는 등의 보다 격렬한 조건의 이용을 통한 일반식(Ⅲ)의 피리도[2,3-d]피리미딘 중간체의 수소화 반응으로 직접 제조할 수가 있다.

일반식(Ⅲ)의 중간체들은 몇가지 방법으로 제조될 수 있다. 본 발명의 1개 실시태양에서, 혼합 무수물의 형성, DCC 처리 또는 디페닐 클로로포스포네이트의 사용을 통한 카르복시산의 활성화와 같이, 펩티드 결합을 형성하기 위한 종래의 축합방법을 사용해서 다음 일반식(Ⅳ)의 벤조산 유도체를 다음 일반식(Ⅴ)의 보호 글루탐산 유도체와 커플링 반응시킨다.

이와는 달리, 다음 일반식(Ⅵ)의 알데히드(Taylor 등, J. Org, Chem., 1983, 48, 4852 참조)fmf N-메틸 피롤리돈 또는 디메틸포름아미드와 같은 용매중, 나트륨하이드리드 또는 이밖의 비친핵성 강염기 존재하에서 다음 일반식(Ⅶ)의 비티히 시약(Yan, J. Het. Chen., 1979, 16, 541)으로 커플링 반응시킬 수 있다.

또한 이의 역반응, 즉 다음 일반식(Ⅷ)의 비티히 시약과 카르복시기가 보호된 N-(4-포르밀-또는 4-알칼오일벤조일)-L-글루탐산의 반응을 이용할 수 있다.

일반식(Ⅳ)의 벤조산 유도체는 다음 일반식(Ⅸ)의 4-[1-(2-치환된-3-시아노-피리딘-5-일)알크-1-엔-2-일]벤조에이트를 구아니딘-t-부탄올 용액과 동일량의 나트륨 또는 칼륨-t-부톡사이드와 같은 알칼리금속 t-부톡사이드와 고리화 반응시켜서 제조할 수 있다.

상기식에서, R⁸은 아미노 또는 4-니트로페닐티오이다.

일반적으로, 벤조에이트 에스테르는 t-부틸에스테르이다. 이밖에 다른 알콕사이드-알코올 조합물을 또한 구아니딘 고리화 반응용으로 사용할 수가 있으나, 에스테르 전이 반응을 극소화하기 위한 주위를 행하여야만 한다. 이 고리화 반응의 생성물은 다음 일반식(Ⅹ)의 4-[1-(2,4-디아미노피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)알크-엔-2-일)벤조에이트이다.

일반식(Ⅹ)의 벤조에이트는 포름산 수용액과 같은 산으로 가수분해시켜서 R¹이 아미노이고, 또 R⁷이 수소인 일반식(Ⅳ)의 상응하는 벤조산 유도체를 수득할 수 있다. 일반식(Ⅳ)의 2,4-디아미노 화합물들은 염기로 처리해서 상응하는 2-아미노-4-하이드록시 화합물로 전환시킬 수 있다. 우선은 아세트아미노기로 전환시키는 것에 의해 2-아미노기를 보호하는 것이 바람직하다. 4-디메틸아미노피리딘과 같은 수소 수용체 존재하에서 아세트산 무수물로 처리하는 경우 2-아미노기의 아실화반응이 진행되어 벤조산 혼합 무수물이 형성되고, 후자를 염기로 가수분해시켜서 다음 일반식(Ⅳ)의 유리 벤조산 유도체를 생성시킨다. 이어 IN 수산화 나트륨과 같은 염기로 처리해서 상응하는 4-하이드록시 화합물을 제조한다.

중간체(Ⅸ)는 또한 비티히 시약을 사용해서 제조할 수가 있다. 따라서, [2-(4-니트로페닐티오)-3-시아노피리딘-5-일메틸)트리페닐메틸포스포늄 브로마이드는 Taylor등, J. Org. Chem., 1983, 48, 4852에 따라 2-메틸-3-에톡시아크로레인과 알파-시아노티오아세트아미드를 축합반응시켜서 3-시아노-5-메틸-2(1H)피리딘티온을 제조하고, 이 생성물을 4-니트로플루오로벤젠으로 처리해서 2-(4-니트로페닐티오)-3-시아노-5-메틸피리딘을 제조한 후, N-브로모숙신이미드로 브롬화 반응시켜서 2-(4-니트로페닐티오)-3-시아노-5-브로모메틸피리딘을 제조하고 또 트리페닐 포스핀을 첨가해서 수득할 수가 있다. 이 화합물은 이어 다음 일반식(XI)의 화합물과 커플링 반응시킬 수 있다.

상기식에서, R³는 앞에서 정의한 것과 동일하다.

아미노 및 카르복시산 보호기들은 Greene에 의해 "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, Inc., 1981에 또 McOmie에 의해 "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, 1983에 기술되어 있다.

일반식(IA) 및 (IB)의 화합물들은 단독으로 또는 혼합해서 과거에는 메토트렉세이트로서 치료해왔던 융모막암, 백혈병, 유방선(腺)암, 머리 및 목의 표피암, 비늘모양 또는 소형 세포 폐암 및 각종 임파 육종을 포함하는 종양을 치료하는데 사용할 수 있다. 이들 화합물은 또한 메토트렉세이트에 민감한 반응을 보이는 균상 식육증 및 마른버짐 등을 치료하는데 사용될 수 있다.

본 발명은 화합물들은 종양으로 고통을 받아 그 치료를 필요로하는 포유동물들에 단독으로 또는 항종양제, 스테로이드등과 조합되어 경구 또는 바람직하게는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적 투여 경로의 예로는 근육내, 척추강내, 정맥내 또는 동맥내 투여를 들 수가 있다. 일반적으로, 이들 약제는 메토트렉세이트와 동일한 방식으로 투여되지만, 그 작용 모우드가 상이하기 때문에, N-(4-[2-(2-아미노-4-하이드록시-5,6,7,8-테트라하이드로피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)에틸]벤조일)-L-글루탐산은 통상 메토트렉세이트에서 사용하였던 것보다 많은 투여량을 투여할 수 있으며 또 로이코보린(Leucovorin) 구제를 필요로 하지 않는다. 투여량은 특정 종양, 환자 상태와 반응 정도에 따라 결정해야하지만, 일반적으로 투여량은 약 10 내지 약 100mg/일의 양으로 5 내지 10일간 또는 1일 1회 250 내지 500mg 투여량으로 1 내지 10mg 약제를 포함하는 정제 및 캅셀을 들 수가 있다. 비경구 투여용으로 20 내지 100mg/ml양을 함유하는 등장 식염수 용액을 사용할 수가 있다.

다음 실시예들은 본 발명을 보다 상세하게 설명할 것이다. NMR 분석치에서 "s"는 단일선, "d"는 2중선, "t"는 3중선, "q"는 4중선, "m"은 다중선 또는 "br"은 넓은 피이크를 의미한다.

[실시예 1]

[3-(시아노-2-(4-니트로페닐티오)-5-피리딘일메틸]트리페닐포스포늄 브로마이드

A. 60.00g(0.221몰)의 3-시아노-2-(4-니트로페닐티오)-5-메틸피리딘, 39.37g(0.221몰)의 N-브로모숙신이미드, 3.0g의 밴조일 퍼옥사이드와 60ml 벤젠의 혼합물을 265-W 일광 램프로 조사시키면서 16시간 동안 환류가열하였다. 용매를 감압하에서 제거하고 또 잔유물을 1리터 물과 1리터 메틸렌 클로라이드의 혼합물과 함께 진탕하였다. 유기층을 분리해서 1리터 물로써 세척하고, 무수 황산마그네슘상에 건조시킨 후 여과하였다. 감압하 증발로 용매를 제거해서 3-시아노-2-(4-니트로페닐티오)-5-브로모메틸피리딘을 수득하였으며, 이는 추가로 정제하지 않고 다음 단계에서 그대로 사용될 수 있다.

B. 상기 A항에서 수득한 고체를 500ml 벤젠에 58.01g(0.221몰)의 트리페닐포스핀을 용해시킨 용액과 함께 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 여과해서 77.63g의 [3-시아노-2-(4-니트로페닐티오)-5-피리딘일메틸]트리페닐포스포늄 브로마이드를 수득하였다.

모액을 실온에서 6시간동안 교반해서 추가로 5.67g(합계 : 83.30g, 62%)을 수득하였다. 아세토니트릴 중에서 재결정 시겨서[3-시아노-2-(4-니트로페닐티오)-5-피리딘일메틸]트리페닐포스포늄 브로마이드를 담황색 결정으로 수득하였으며, 이를 재고형화시키면 융점이 200℃ 미만이나, 분해를 행하면 융점이 253 내지 256℃이었다.

C. 이와는 달리, 3-시아노-(2-(4-니트로페닐티오)-5-브로모메틸피리딘을 테트라하이드로푸란 중에서 트리-(n-부틸)포스핀과 10시간동안 방치하여 반응시켰다. 에테르 첨가후 형성된 고체를 여과수거하고, 또 테트라하이드로푸란 ; 에테르의 비율을 1 : 1로 한 용액으로 세척해서 [3-시아노-2-(4-니트로페닐티오)피리딘-5-일메틸]-트리-(n-부틸)포스포늄 브로마이드를 백색 고체로 수득하였다 ;

융점 175 내지 176℃ ;

NMR(CDCl₃, 80MHz) d 0.85-2.63(m, 27H), 4.76(d, 2H, J=15.4Hz), 7.74(d, 2H, J=9.0Hz), 8.26(d, 2H, J=9.0Hz), 8.55(brs, 1H), 8.79(brs, 1H) ;

IR(KBr) 2950, 2860, 2220, 1595, 1575, 1515, 1390, 1340, 1075 및 845cm^-1;

HRMS 471.2116(M⁺-HBr), C₂₅H₃₄N₃O₂계산치 PS471.2109.

[실시예 2]

3-시아노-2-(4-니트로페닐티오)-5-[2-(4-에톡시카르보닐페닐)에텐일]피리딘

A. 4.544g(7.42밀리몰)의 [3-시아노-2-(4-니트로페닐티오)-5-피리딘일메틸]트리페닐포스포늄 브로마이드, 0.751g(7.42밀리몰)의 트레에틸아민과 50ml 클로로포름 혼합물을 실온에서 15분간 교반하고 또 이어 1.322g(7.42밀리몰)의 4-에톡시카르보닐벤즈알데히드를 첨가하였다. 실온에서 96시간동안 교반한 후에 100ml 물을 첨가하고 혼합물을 여과한 후 유기층을 분리하여 100ml씩의 물로써 2회 세척하고 건조 여과하였다. 감압하에서 여과액을 증발시켜서 잔유물을 수득하고, 이를 실리카겔상에서 크로마토그래프 분리를 행하였다. 미반응 알데히드를 2 : 1의 석유에테르-벤젠 혼합액으로 용리시키는 한편, 표제 화합물, 즉 2-(4-니트로페닐티오)-3-시아노-5-(4-에톡시카르보닐스티릴)피리딘으로 명명되는 화합물을 벤젠으로 용리하였다. 이 벤젠 용출액을 증발시켜서 2.82g(88%)의 3-시아노-2-(4-니트로페닐티오)-5-[2-(4-에톡시카르보닐페닐)에텐일]피리딘을 담황색 고체로 수득하였다. 이 생성물을 고체로부터 100℃ 이하의 고무상 물질로 변형시키고, 또 이어 180 내지 220℃ 사이의 맑은 액체로 변형시켰다.

NMR(Me₂SO-d₆) 델타 1.34(t, 3H, J=6.3Hz), 4.32(q, 2H, J=6.3Hz), 6.73(d, 1H, J=13Hz), 6 99(d, 1H, J=13Hz), 7.27(d, 2H, J=9Hz), 7.74, 7.85, 7.94(dd, 2H, 2H), 8.26, 8.31(dd, 2H, 1H), 8.38(d, 1H, J=1.8Hz) ;

IR(KBr) 2220, 1707, 1605, 1597, 1575, 1512, 1344, 1295-1277, 1174cm^-1.

분석치 : C₂₃H₁₇N₃O₄S의

계산치 : C ; 64.08, H ; 3.97, N ; 9.74, S ; 7.43.

측정치 : C ; 63.82, H ; 4.01, N ; 9.51, S ; 7.38.

B. 4-에톡시-카르보닐벤즈알데히드 대신에 4-(3차-부톡시카르보닐)벤즈알데히드를 사용하고 상기방법에 따라 3-시아노-2-(4-니트로페닐티오)-5-(2-(4-3차 부톡시카르보닐페닐)에텐일]피리딘을 81% 수율로 제조하였다.

융점 : 불명확(시스-트랜스혼합물) ;

NMR(CDCl₃) 델타 1.62(s, 9H), 6.43(d, 1H, J=13Hz), 6.90(d, 1H, J=13Hz), 7.24(d, 2H, J=9Hz), 7.69(d, 2H, J=8.1Hz), 7.76(d, 1H, J=2.7Hz), 7.92(d, 2H, J=8.1Hz), 8.22(d, 2H, J=9Hz), 8.34(d, 1H, J=2.7Hz) ;

IR(KBr) 2220, 1707, 1600, 1577,1518, 1341, 1290, 1163cm^-1

분석치 : C₂₅H₂₁N₃O₄S의

계산치 : C ; 65.35, H ; 4.61, N ; 9.14, S ; 6.98.

측정치 : C ; 65.28, H ; 4.68, N ; 9.20, S ; 6.93.

4-알콕시카르보닐아세톤페논 또는 4-알콕시카르보닐프로피오페논을 4-에톡시카르보닐벤즈알데히드로 대치하는 유사한 방식에 따라 각각 상응하는 3-시아노-2-(4-니트로페닐티오)-5-[2-(4-니트로페닐티오)-5-[2-(4-알콕시카르보닐페닐)프로프-1-엔일]피리딘과 3-시아노-2-(4-니트로페닐티오)-5-[2-(4-알콕시카르보닐페닐)부트-1-엔일]피리딘 화합물을 수득하였다. 이들 방법은 다음과 같이 예시할 수 있다.

150ml 무수 에틸렌 클로라이드에 18.89g의 [3-시아노-2-(4-니트로페닐티오)-5-피리딘일메틸]-트리-(n-부틸포스포늄 브로마이드를 용해시킨 용액에 5.36ml의 1,5-디아자비사이클로[5,4,0]운데크-5-엔을 소량씩 수회로 나누어 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 질소기류하에서 15분간 교반한 후에, 7.53g의 4-(t-부톡시카르보닐) 아세토페논(3차-부틸 4-아세틸벤조에이트로도 명명함)을 첨가하였다. 이 혼합물을 환류하에서 72시간동안 가열하고 실온으로 냉각한 후 염화나트륨 포화용액으로 추출하였다. 추출액을 무수 황산나트륨상에서 건조시키고 또 이어 용리제로서 메틸렌 클로라이드를 사용하여 착색 실리카겔상에서 크로마토그래피 분리를 행하였다. 용출액을 감압하에서 농축시키고 또 잔유물을 에테르와 함께 파쇄하였다. 수득한 고체를 여과수거해서5.64g(35%)의 트랜스-3-시아노-2-[(4-니트로페닐티오)]-5-[2-(4-3차-부톡시카르보닐페닐)프로프-1-엔일]피리딘을 담황색 고체로서 수득하였다 :

융점 180 내지 181.5℃(벤젠-에테르) ;

NMR(CDCl₃, 250MHz) d 1.61(s, 9H), 2.29(d, 3H, J=1.23Hz), 6.70(brs, 1H), 7.52(d, 1H, J=8.62Hz), 7.74(d, 1H, J=8.84Hz), 7.92(d, 1H, J=2.09Hz), 8.00(d, 1H, J=8.62Hz), 8.27(d, 1H, J=8.84Hz), 8.53(d, 1H, J=2.09Hz) ;

IR(KBr) 3060, 2970, 2220, 1695, 1595, 1515, 1425, 1380, 1365, 1340, 1290, 1160, 1110, 1010 및 840cm^-1.

분석치 : C₂₆H₂₃N₃O₄S의

계산치 : C ; 65.94, H ; 4.90, N ; 8.87, S ; 6.77.

측정치 : C ; 66.88, H ; 4.64, N ; 8.51, S ; 6.77.

여과액을 감압하에서 농축하고 또 잔유물을 파쇄한 후 에테르로 여과세척해서 2.08g(13%)의 시스-3-시아노-2-(4-니트로페닐티오)-5-[2-(4-3차-부톡시카르보닐페닐)프로프-1-엔일]피리딘을 담황색 고체로서 수득하였다.

융점 126 내지 127℃(에틸아세테이트-핵산) ;

NMR(CDCl₃, 250MHz) d 1.60(s, 9H), 2.25(d, 3H, J=1.41Hz), 6.39(brs), 7.18(d, 1H, J=8.28Hz), 7.41(d, 1H, J=2.22Hz), 7.63(d, 1H, J=8.91Hz), 7.95(d, 1H, J=8.28Hz), 8.09(d, 1H, J=2.22Hz), 8.23(d, 1H, J=8.91Hz) ;

IR(KBr) 3110, 2970, 2225, 1720, 1520, 1345, 1165, 1105, 920 및 840cm^-1.

분석치 : C₃₆H₂₃N₃O₄S

계산치(%) : C ; 65.94, H ; 4.90, N ; 8.87, S ; 6.77

측정치(%) : C ; 65.92, H ; 4.81, N ; 8.62, S ; 6.56.

전술한 방법에서 사용된 4-(t-부톡시카르보닐)아세토페논은 다음과 같이 제조될 수 있다 :

30ml 무수벤젠에 1.64g의 4-아세틸벤조산을 현탁시킨 현탁액에 3.0ml의 새로이 증류시킨 티오닐클로라이드를 첨가하였다. 이 혼합물을 환류하에서 5시간동안 가열하였다. 이 반응혼합물을 실온으로 냉각시키고 또 용매를 감압하에서 제거하였다. 수득 잔유물을 5ml 무수 메틸렌 클로라이드에 용해시키고 또 이 용액을 1.11g 무수 3차-부탄올과 1.42g 무수 피리딘의 혼합물에 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 질소 기류하에서 15시간동안 교반한 후에 이 혼합물을 메틸렌클로라이드로 희석시키고 또 물로 추출하였다. 이 유기용액을 무수 황산나트륨상에서 건조시키고 또 용매를 감압하에서 제거하였다. 잔유물을 용리제로서 20% 에틸아세테이트-헥산 혼합물을 사용하는 실리카겔 칼럼상에서 크로마토그래피 분리를 행하였다. 칼럼으로부터 분리된 주요 분획은 2.01g(91%)의 4-(t-부톡시카르보닐)아세토페논을 백색 고체로 함유하고 있었다.

융점 56.5-57.5℃ ; NMR(CDCl₃80MHz) d 1.61(s, 9H), 2.63(s, 3H), 7.95(d, 2H, J=9.0Hz), 8.09(d, 2H, J=9.0Hz) ; IR(KBr) 2980, 2930, 1720, 1680, 1400, 1365, 1295, 1250, 1165, 1100, 845, 760 및 690cm^-1.

이와 다르게, 4-(t-부톡시카르보닐)아세토페논을 감압하에서 증류함으로써 분리할 수 있다. 비점 90 내지 100℃/0.1mm. 유사하게 4-(t-부톡시카르보닐)프로피오페논을 제조하고 또 이를 3-시아노-2-(4-니트로페닐티오)-5-[2-(4-3차-부톡시카르보닐페닐)부트-1-엔일]피리딘으로 전환시켰다.

[실시예 3]

2-아미노-3-시아노-5-[2-(4-에톡시카르보닐페닐)에틴일]피리딘

2.00g (4.64밀리몰)의 3-시아노-2-(4-니트로페닐티오)-5-[2-(4-에톡시카르보닐페닐)에텐일]피리딘, 1.553g(6.95밀리몰)의 브롬화제 2구리 및 50ml액체 암모니아의 현탁액을 압력관내, 실온에서 13일간 교반하였다. 암모니아를 증발시켜서 짙은색의 잔유물을 수득하였으며, 이를 용리제로서 메틸렌클로라이드를 사용하는 마그네슘 실리케이트상에서 크로마토그래피 분리를 행하였다. 용출액을 감압하에서 증발시키고 또 잔유물을 실리카겔상에서 크로마토그래피 분리를 행하였다. 미반응 출발물질을 벤젠으로 용리시키는 한편, 2-아미노-3-시아노-5-(4-에톡시카르보닐스티릴)피리딘으로 별도 명명되는 생성물 0,87g(64%)을 에틸아세테이트로 용리하고 또 에틸아세테이트 용매를 증발시켜서 담황색 고체를 수득하였다 :

융점 135 내지 141.5℃ ;

NMR(Me₂SO-d₆) 델타 1.39(t, 3H, J=6.3Hz), 4.38(q, 2H, J=6.3Hz), 6.67(m, 2H), 7.10(br, 2H), 7.45(d, 2H, J=9Hz), 7.71(d, 1H, J=3.6Hz), 7.97(d, 2H, J=9Hz), 8.11(d, 1H, J=3.6Hz) ;

IR(KBr) 3155, 2218, 1715, 1650-1645, 1593, 1491, 1277, 1100cm^-1.

분석치 : C₁₇H₁₅H₃O₂

계산치(%) : C ; 69.61, H ; 5.16, N ; 14.33.

측정치(%) : C ; 69.37, H ; 5.25, N ; 14.22.

전술한 제법에서, 동일 당량의 3-시아노-2-(4-니트로페닐티오)-5-[2-(4-3차-부톡시카르보닐페일)에텐일]피리딘으로 대치해줌으로써, 2-아미노-3-시아노-5-[2-(4-3차-부톡시카르보닐페닐)에텐일]피리딘을 수득하였으며, 이는 2-아미노-3-시아노-5-(4-t-부톡시카르보닐스티릴]피리딘으로 또한 명명할 수 있다 ; 수율 1.14g(84%)의 담황색 결정.

융점 190-195℃ ;

NMR(Me₂SO-d₆) 델타 1.57(s, 9H), 6.57-6.60(m, 2H), 7.00(br, 2H), 7.35(d, 2H, J=8.1Hz), 7.65(d, 1H, J=2.7Hz), 7.84(d, 2H, J=8.1Hz), 8.00(d, 1H, J=2.7Hz) ;

IR(KBr) 3460, 3360, 2215, 1707, 1623, 1480, 1300, 1287, 1158cm^-1.

분석치 : C₁₉H₁₉N₃O₂

계산치(%) : C ; 71.00, H ; 5.96, N ; 13.07

측정치(%) : C ; 70.83, H ; 6.03, N ; 12.83.

[실시예 4]

2-4-디아미노-6-[2-(4-3차-부톡시카르보닐페닐)에텐일]피리도[2,3-d]

피리미딘

0.433g(4.54밀리몰)의 구아니딘 하이드로클로라이드와 25ml의 무수 3차-부탄올에 용해한 0.114g의 나트륨으로부터 수득된 유기염기로서 4.54밀리몰 구아니딘 용액에 1.325g(4.12밀리몰)의 2-아미노-3-시아노-5-[2-(4-3차-부톡시페닐)에텐일]피리딘을 첨가하였다. 농적색 현탁액을 건조 질소하에서 8시간동안 환류 가열하였다. 이 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 또 여과하였다. 이 침전을 물, 아세톤 및 에테르로 연속해서 세척하고 또 이어 감압하에서 건조시켜서 0.911g(61%)의 표제 화합물을 담황색 고체로 수득하였으며, 이 표제 화합물은 또한 2,4-디아미노-6-(4-3차-부톡시카르보닐스티릴) 5-데아자프테리딘으로 명명할 수 있다. 융점＞350℃ ;

NMR(Me₂SO-d₆) 델타 1.55(s, 9H), 6.42(br, 2H), 6.73(m, 2H), 7.30-8.00(br, 2H), 7.35(d, 2H, J=9Hz), 7.81(d, 2H, J=9Hz), 8.34(m, 2H) ;

IR(KRr) 3320-3300, 3200-3140, 2970, 1718, 1626, 1610-1600, 1550, 1450-1445, 1288, 1167, 812cm^-1.

분석치 : C₂₀H₂₁N₅O₂

계산치(%) : C ; 66.10, H ; 5.82, N ; 19.27

실측치 : C ; 65.88, H ; 5.86, N ; 18.98.

[실시예 5]

2,4-디아미노-6-[2-(4-카르복시페닐)에텐일]피리도[2,3-d]피리미딘.

A. 1.27g의 2,4-디아미노-6-[2-(4-3차-부톡시카르보닐페닐)에텐일]피리도[2,3-d]피리미딘과 10ml의 88% 포름산 용액을 실온에서 교반하였다. 12시간후에 황식 고체가 형성되기 시작하였으며, 또 교반 4일후 반응 혼합물을 여과하였다. 수거된 고체를 물, 에탄올 및 아세톤으로 연속해서 잘 세척하고, 또 이어 감압하에서 건조시켜서 0.85g(79%)의 표제 화합물을 수득하였으며, 이는 또한 2,4-디아미노-6-(4-카르복시스티릴)-6-데아자프테리딘으로 명명될 수 있다 : 융점＞300℃

B. 이와는 달리, 20ml 니트로메탄에 염화수소를 포화시킨 용액에 0℃에서 0.48g의 2,4-디아미노-6-[2-(4-3차-부톡시카르보닐페닐)에텐일]피리도[2,3-d]피리미딘을 첨가하였다. 이 반응 혼합물은 신속히 점성으로되고 또 농황색으로 변하였으며, 수분간 교반한후 과립상 고체가 형성되었다. 교반 1시간 후에 50ml의 에테르를 첨가하였으며 또 침전물을 여과수거 하였다. 수거된 고체를 50ml의 10% 탄산나트륨 수용액에 용해시켰다. 이어 아세트산으로 산성화시켜서 황색 고체를 분리하고 이를 여과 수거한후 감압하에서 건조시켰다 ; 수율 0.31g(92%)의 2,4-디아미노-6-[2-(4-카르복시페닐)에텐일]피리도[2,3[d]피리미딘.

NMR(Me₂SO-d₆) 델타 6.75(s, 2H), 7.35, 7.85(AB q, 4H, J=9Hz), 8.38(s, 2H) ; IR(Nujol) 3400-2300, 3380, 3150, 1700, 1650, 1630, 1590cm^-1.

[실시예 6]

2,4-디아미노-6-[2-(4-3차-부톡시카르보닐페닐)프로프-1-엔일]피리도[2,3-d]피리미딘.

75ml 무수 3차-부탄올중에 1.93g의 구아니딘 하이드로클로라이드를 함유하는 현탁액에 질소기류하 50℃에서 0.50g의 나트륨 금속을 첨가하였다. 나트륨 모두가 용해된 후에 7.97g의 트랜스-3-시아노-2-(4-니트로페닐티오)-5-[2-(4-3차-부톡시카르보닐페닐)프로프-1-엔일]피리딘을 첨가하였다. 이 혼합물을 3시간동안 환류하에서 가열하고 실온으로 냉각시킨후 에테르로 희석시키고 또 여과하였다. 이 고체를 물과 아세톤으로 세척한후 감압하에서 건조시켜서 4.66g(73%)의 표제 화합물을 담황색 고체로 수득하였다 : 융점＞300℃ ;

NMR(DMSO-d₆, 80MHz), d 1.56(s, 9H), 2.23 및 2.29(brs, 3H), 6.57 및 6.99(brs, 1H), 7.25-8.73(m, 8H) ;

IR(KBr) 3340, 3130, 1710, 1640, 1608, 1540, 1450, 1365, 1340, 1290, 1165, 1110, 840 및 810cm^-1.

[실시예 7]

2,4-디아미노-6-[2-(4-카르복시페닐)프로프-1-엔일]피리도[2,3-d]피리미딘.

니트로메탄에 염화수소 가스를 포화시킨 용액 200ml에 4.58g의 2,4-디아미노-6-[2-(4-3차-부톡시카르보닐페닐)프로프-1-엔일]피리도[2,3-d]피리미딘을 함유하는 현탁액을 0℃에서 1시간 동안 교반하고 또 이어 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 에테르로 희석한후, 반응 혼합물을 여과하고, 또 수거된 고체를 물, 메탄올 및 아세톤으로 연속해서 세척한후 감압하에서 건조시켜서 3.90g(100%)의 2,4-디아미노-6-[2-(4-카르복시페닐)프로프-1-엔일]피리도[2,3-d]피리미딘을 수득하였다.

NMR(DMSO-d₆, 80MHz) d 2.31(brs, 3H), 6.77 및 7.07(brs, 1H), 7.74(d, 2H, J=8.5Hz), 7.98(d, 2H, J=8.5Hz), 8.26(d, 1H, J=2.0Hz), 8.74(d, 1H, J=2.0Hz).

[실시예 8]

2-아미노-4-하이드록시-6-[2-(4-카르복시페닐)에텐일]피리도[2,3-d]피리미딘.

A. 1N 수산화나트륨 수용액 30ml에 1.0g의 2,4-디아미노-6-[2-(4-카르복시페닐)에텐일]피리도[2,3-d]피리미딘을 가해준 현탁액을 질소기류하에서 3시간동안 환류가열하였다. 수득된 균질의 오렌지색 용액을 실온으로 냉각하고, 6ml 빙초산으로 산성화한후 수득된 황색 침전을 여과 수거하였다. 필터 케이크를 물, 메탄올, 아세톤 및 에테르로 연속해서 세척하고 또 이어 감압하에서 건조시켜서 0.88g(88%)의 표제화합물을 미세결절의 황색분말로 수거하였으며, 또한 이는 6-[2-(4-카르복시페닐)에텐일]-5-데아자프테린 또는 6-(4-카르복시스티릴)-5-데아자프테린으로 명명될 수 있다 ; 융점＞250℃ ;

NMR(TFA-dL 델타 6.8, 7.25(AB q, 2H, J=12Hz), 7.45, 8.2(AB q, 4H, J=9Hz), 8.55(s, 1H), 8.85(s, 1H) ; IR(Nujol) 3500-2500(br), 1670, 1625, 1600cm^-1.

B. 유사한 방식으로, 2,4-디아미노-6-[2-(4-카르복시페닐)프로프-1-엔일]피리도[2,3-d]피리미딘을 2-아미노-4-하이드록시-6-[2-(4-카르복시페닐)프로프-1-엔일]피리도[2,3-d]피리미딘으로 전환시켰다 ; 융점＞250℃ ;

NMR(DMSO-d₆, 80MHz) d 2.28 및 2.30(brs, 3H), 6.77 및 7.06(brs, 1H), 7.72(D, 2H, J=8.5Hz), 7.97(d, J=8.5Hz), 8.27(d, 1H, J=2.0Hz), 8.72(d, 1H, J=2.0Hz).

[실시예 9]

2-아세트아미도-4-하이드록시-6-[2-(4-아세톡시카르보닐페닐)에텐일 피리도[2,3-d]피리미딘.

0.05g의 4-디메틸아미노피리딘을 포함하는 20ml 아세트산 무수물에 0.88g의 2-아미노-4-하이드록시-6-[2-(4-카르복시페닐)에텐일]피리도[2,3-d]피리미딘을 가해준 현탁액을 질소기류하에서 120℃로 3시간동안 가열하였다. 이 반응 혼합물을 실온으로 냉각하였다. 에테르 50ml를 첨가하고 또 수득된 황색 고체를 여과수거해서 0.95g(84%)의 표제 화합물을 수득하였다 ; 융점＞300℃ ; IR(Nujol) 3350, 3150, 1800, 1670, 1600cm^-1.

[실시예 10]

2-아세트아미도-4-하이드록시-6-[2-(4-카르복시페닐)에텐일]피리도[2,3-d]피리미딘.

50ml물에 0.95g의 2-아세트아미도-4-하이드록시-6-[2-(4-아세톡시카르보닐페닐)에텐일]피리도[2,3-d]피리미딘을 가해준 현탁액에 균일용액이 수득될때까지 IN 수산화나트륨 수용액을 첨가하였다. 아세트산으로 산성화시켜서 황색침전을 형성하였으며, 이를 여과해서 수거하였다. 필터케이크를 물, 메탄올, 아세톤 및 에테르로 순차적으로 세척하였다. 잔유 고체를 DMF 중에서 재결정시켜서 0.65g(77%)의 표제 화합물을 미세결정질 황색 고체로 수득하였으며, 이는 또한 2-아세트아미도-6-(4-카르복시스티릴)-5-데아자-4(3H)-프테리디논으로 명명될 수 있다 : 융점＞300℃ ;

NMR(TFA-d₁) 델타 2.5(s, 3H), 6.85, 7.32(AB q, 2H, J=12Hz), 7.45, 8.18(AB q, 4H, J=9Hz), 8.65(s, 1H), 9.02(s, 1H) ;

IR(Nujol) 3300-2200(br), 1685, 1655, 1630, 1600, 1565cm^-1.

MS : C₁₈H₁₄N₄O₄

계산치(%) : 350

측정치(%) : m/e 350(기준), 308.

[실시예 11]

2-아세트아미도-4-하이드록시-6-[2-(4-카르복시페닐)프로프-1-엔일]피리도[2,3-d]피리미딘.

2-아미노-4-하이드록시-6-[2-(4-카르복시페닐)프로프-1-엔일]피리도[2,3-d]피리미딘을 실시예 9 및 10의 과정으로 처리함으로써 2-아세트아미도-4-하이드록시-6-[2-(4[카르복시페닐)프로프-1-엔일]피리도[2,3-d]피리미딘을 수득하였다 :

융점＞250℃ ; 전체수율 45% ;

NMR(CF₃CO₂D/DMSO-d₆, 80mHz) d 2.15(s, 3H), 2.22(s,3H), 6.72(brs, 1H), 7.45(d, 2H, J=8.4Hz), 7.92(d, 2H, J=8.4Hz), 8.65(d, 1H, J=2.0Hz), 8.98(d, 1H, J=2.0Hz).

[실시예 12]

디에틸 N-(4-[2,4-디아미노피리도[2,3-d[피리미딘-6-일)에텐일]벤조일)-L-글루타메이트.

A. 5℃로 냉각한 120ml N-메틸피롤리돈에 1.0g(0.0033몰)의 2,4-디아미노-6-[2-(4-카르복시페닐)에텐일]피리도[2,3-d]피리미딘과 1g의 N-메틸모르폴린을 용해시킨 용액에 1.4g(0.0048몰)의 디페닐 클로로포스포네이트를 소량씩 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 1시간동안 교반하고 또 추가로0.5ml의 N-메틸모르폴린을 첨가한후 이어 1.1g(0.0048몰)의 디에틸 L-글루타메이트 하이드로클로라이드를 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 실온에서 하룻밤 동안 교반하고 또 이어 용매를 감압하에서 제거하였다. 잔유 고체를 50ml 무수 에테르로 세척하고, 1N 수산화나트륨 수용액 100ml와 함께 파쇄하고 또 수득현탁액을 원심분리하였다. 수거한 고체를 3 : 1 클로로포름-메탄올 200ml에 용해시키고 또 플로리실(Florisil)로써 여과하였다. 이 여과액을 증발시켜서 소량으로 만들고, 10g의 플로리실을 첨가한후 수득된 함침 플로리실을 플로리실칼럼 상부에 첨가하고 또 이어 에틸아세테이트로 용리시킨 후 또 메탄올 함량을 증가시켜가면서 메탄올함유 에틸 아세테이트용액(9 : 1, 3 : 1 및 1 : 1)으로 연속해서 용리시켰다. 표제 화합물은 3 : 1 및 1 : 1 분획에서 수거되었다. 혼합 용출액을 증발시켜서 유리상 물질을 수득하였으며, 이를 에테르와 함께 파쇄하고 또 이어 여과수거하였다 : 수율 0.41g(26%), 융점 183-185℃ ;

NMR(Me₂SO-d₆/TFA) 델타 1.25-1.45(중첩 t, 6H, J=7Hz), 2.25-2.50(m, 2H), 2.5-2.8(m, 2H), 4.05-4.45(중첩 q, 4H, J=7Hz), 4.8-5.0(m, 1H), 6.8-7.2(AB q, 2H, J=16Hz), 7.4, 7.85(AB q, 4H, J=9Hz), 8.6(s, 1H), 9.05(S, 1H) ;

IR(Nujol) 3500-3000, 1730, 1635, 1605cm^-1.

MS : C₂₅H₂₈N₆O₅

계산치 : 492.

측정치 : m/e 492,290,94,84

B. 이와는 달리, Yan 등의 J. Het. Chem., 16, 541(1979)의 방법에 따라 트리페닐포스핀과 디에틸 4-브로모메틸벤조일글루타메이트(7.86g, 0.012몰)로부터 제조한 트리페닐포스포늄염을, 70ml 무수 N-메틸 피롤리돈에 0.4g(0.01몰)의 나트륨 하이드리드(60% 유중 현탁액)를 가한 슬러리에 10분간에 걸쳐서 소량씩 첨가하였다. 수득된 적색 반응 혼합물을 질소기류하의 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이 자체내 비티히 시약에 J. Org. Chem. 43, 2529(1978)에서의 Baldwin등의 방법으로 제조된 2.27g(0.012몰)의 2,4-디아미노-6-포르밀피리도[2,3-d]피리미딘을 첨가하였다. 수득된 슬러리를 질소기류하의 실온에서 3주간 교반하였다. 이 용매를 이어 감압하에서 증발시키고, 잔유 고체를 벤젠과 함께 파쇄해서 트리페닐포스핀 옥사이드를 제거하고 또 정제 고체를 여과수거하였다. 이 고체를 물에 재현탁시킨후 여과하고 또 수거된 고체를 1 : 2 클로로포름-메탄올 혼합액 200ml에 용해시켰다. 플로리실(10g)을 첨가하고, 이 혼합물을 증발건조시킨후 이 합침 플로리실 잔유물을 플로리실 칼럼 상부에 가하고 이어 메탄올의 양을 증가시켜가며 조제한 메탄올함유 에틸아세테이트 용액(9 : 1 내지 1 : 1)으로 용리하였다. 용리된 물질을 포함하는 분획을 혼합하고 또 이 분획은 2개의 생성물을 함유하는 것으로 밝혀졌다(TLC). 이 혼합물은 용출제로서 클로로포름과 메탄올을 이용하는 실리카겔상에서 재차 크로마토그래피 분리를 행하였다. 초기 분획은 포스포란이었으며 또 이 생성물을 그후 용리시켜서 본 실시예 A 공정에서 수득한 것과 동일한 형태의 물질을 1.7g(34.5%)의 수율로 수득하였다.

C. 2,4-디아미노-6-[2-(4-카르복시페닐)프로프-1-엔일]피리도[2,3-d]피리미딘을 사용하고 또 본실시예 A 공정에서의 제법에 따라 디에틸 N-(4-[2-(2,4-디아미노피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)프로프-1-엔일]벤조일)-L-글루타메이트를 수득할 수 있다.

이와는 달리, 2.2g(0.0074몰)의 디-3차-부틸 1-글루타메이트 하이드로클로라이드를 1.5g(0.0049몰)의 2,4-디아미노-6-[2,4-카르복시페닐)에텐일]피리도[2,3-d]피리미딘과 반응하도록 방치시켜서 디-3차-부틸 N-(4-[2-(2,4-디아미노피리도[2,3-]피리미딘-6-일)에텐일]벤조일)-L-글루타메이트를 1.3g(48%)의 수율로 수득하였다.

융점＞300℃,

NMR(CDCl₃/CD₃OD) 델타 1.47, 1.52(2s, 18H), 2.0-2.6(m, 4H), 4.5-7.0(m, 1H), 6.8(br, s, 2H), 7.35, 7.78(AB q, 4H, J=9Hz), 8.38(s, 1H), 8.5(s, 1H) ;

IR(Nujol) 3350, 3180, 1725, 1640, 1605cm^-1.

MS : C₂₉H₃₆N₆O₅

계산치(%) : 548

측정치(%) : m/e 548,446,290.

[실시예 13]

디에틸 N-(4-[2-(2-아세트아미도-4-하이드록시피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)에텐일]벤조일)-L-글루타메이트.

1.4ml의 N-메틸모르폴린을 포함하는 40ml의 N-메틸피롤리돈중에 1.5g(0.0043몰)의 2-아세트아미도-4-하이드록시-6-[2-(4-카르복시페닐)에텐일]피리도[2,3-d]피리미딘을 용해시킨 얼음 냉각 용액에 1.72g(0.0064몰)의 페닐 N-페닐포스포르아미도 클로리데이트를 1회에 첨가하였다. 수득 혼합물을 0℃에서 30분간 교반하였다. 이어 디에틸 L-글루타메이트 하이드로클로라이드(1.53g, 0.0064몰)을 첨가하고 또 이 반응 혼합물을 실온에서 하룻밤동안 교반하였다. 이 용매를 감압하에서 증발시키고 또 잔유 고체를 1N 탄산나트륨수용액 50ml와 함께 분쇄하였다. 이 혼합물을 여과하고 또 수거된 고체를 20ml 클로로포름에 용해하였다. 이 클로로포름용액을 무수 황산마그네슘 상에서 건조한후 여과하였다. 이 여과액을 증발건조시키고 또 실리카겔 상에서 크로마토그래피분리를 행하였다. 클로로포름-메탄올 혼합물(95 : 5)로서 용리시켜서 1.52g(66%)의 표제 화합물을 수득하였으며, 또 이 수득 화합물은 또한 디에틸 2-아세틸-5,10-디데아자-9,10-디데하이드로폴레이트로 별도 명명할 수 있다 : 융점＞250℃ ;

NMR(CDCl₃Me₂SO-d₆) 델타 1.15-1.45(2t, 6H, J=6Hz), 2.0-2.65(m, 4H), 2.3(s, 3H), 4.0-4.35(2q, 4H, J=6Hz), 4.5-4.75(m, 1H), 6.7, 6.9(AB q, 2H, J=15Hz), 7.33, 7.84(AB q, 4H, J=9Hz), 8.25-8.38(m, 2H), 8.62(d, 1H, J=2Hz), 11.5-12.5(br, 2H) ;

IR(Nujol) 3320, 3150, 1730, 1680, 1630, 1600cm^-1.

분석치 : C₂₇H₂₉N₅O₇

계산치(%) : C ; 60.56, H ; 5.42, N ; 13.08

측정치(%) : C ; 60.26, H ; 5.45, N ; 12.84.

[실시예 14]

디에틸 N-(4-[2-(2-아세트아미도-4-하이드록시피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)프로프-1-엔일]벤조일)-L-글루타메이트.

0.18g의 N-메틸모르폴린을 포함하는 50ml N-메틸피롤리디논에 0.2g의 2-아세트아미도-4-하이드록시-6-[2-(4-카르복시페닐)프로프-1-엔일]피리도[2,3-d]피리미딘을 용해시킨 용액에 0.22g의 페닐 N-페닐포스포르아미도클로리데이트를 한꺼번에 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 1시간동안 교반한후에 0.20g의 디에틸 L-글루타메이트를 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 하룻밤동안 교반하고, 용매를 감압하에서 제건한후 잔유물을 클로로포름과 함께 파쇄하였다. 이 혼합물을 여과하고 또 이 여과액을 감압하에서 증발시켰다. 이 잔유물을 용리제로서 5% 메탄올-클로로포름 혼합물을 사용하는 실리카겔 박층 크로마토그래피에 걸어주었다. 이같이 함으로써 74.6mg(25%)의 표제 화합물을 담황색 고체로 수득하였다.

NMR(CDCl₃, 250MHz) d 1.22(t, 3H, J=7.1Hz), 1.30(t, 3H, J=7.1Hz), 2.11-2.57(m, 10H), 4.14(q, 2H, J=7.1Hz), 4.24(q, 2H, J=7.1Hz), 4.75-4.83(m, 1H), 6.86(brs. 1H), 7.18(brs, 1H), 7.57(d, 2H, J=8.42Hz), 7.84(d, 2H, J=8.42Hz), 8.50(d, 1H, J=2.01Hz), 8.96(brs, 1H), 10.34(brs, 1H).

[실시예 15]

디에틸 N-(4-[2-(2,4-디아미노피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)에틸[벤조일)-L-글루타메이트.

40ml 트리플루오로아세트산에 0.9g의 디에틸 N-(4-[2-(2,4-디아미노피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)에텐일]벤조일)-L-글루타메이트를 용해한 용액을 촉매로서 2.5g의 Pd/C를 사용하여 55psi 수소압력하에서 24시간동안 수소화반응을 행하였다. 이 촉매를 셀라이트를 사용하여 여과하고 또 여과액을 증발시켰다. 잔유 고체를 이 촉매를 셀라이트를 사용하여 여과하고 또 여과액을 증발시켰다. 잔유 고체를 30ml의 2N 탄산나트륨 수용액으로 분쇄하고 또 이어 수세척을 행하였다. 수득고체를 실리카겔을 사용한 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다. 95 : 5dml 클로로포름-메탄올 용액으로 용리시켜서 소량(0.2g)의 테트라하이드로 유도체를 수득하는 한편, 이어 1 : 4 클로로포름-메탄올 용액으로 용리시켜서, 0.52g(58%)의 표제 화합물을 수득하였으며, 이는 또한 디에틸 N-[4-[2-(2,4-디아미노-5-데아자-6-프테리딜)에틸]벤조일]-L-글루타메이트로서 별도 명명될 수 있다 : 융점＞200℃ ;

NMR(Me₂SO-d₆) 델타 1.1-1.3(2t, 6H, J=7Hz), 1.8-2.6(m, 4H), 3.05(s, 4H), 3.1-3.8(br, 5H), 3.9-4.2(2q, 4H, J=7Hz), 4.3-4.5(m, 1H), 7.35, 7.85(AB q, 4H, J=9Hz), 8.6(br, s, 2H) :

IR(Nuuol) 3320, 3150, 1650cm^-1.

[실시예 16]

디에틸 N-(4-[2-(2,4-디아미노-5,6,7,8-테트라피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)에틸]벤조일)-L-글루타메이트.

수소화반응을 72시간동안 계속한 것을 제외하고는 실시예 15의 방법을 반복해줌으로써, 디에틸 N-[4-[2-(2,4-디아미노-5-데아자-5,6,7,8-테트라하이드로-6-프테리딜)에틸]벤조일)-L-글루타메이트로 별도 명명할 수 있는 표제 화합물을 조생성물로 수득하였으며, 이를 95 : 5 클로로포름-메탄올 용액을 사용하는 실리카겔 칼럼 크로마토그래피에 걸어주어서 0.42G(31%)의 생성물을 무색 미세결정질 고체로 수득하였다 : 융점＞250℃ ; NMR(Me₂SO-d₆) 델타 1.6, 1.8(2t, 6H, J=6Hz), 1.4-3.8(m, 13H), 4.1(2q, 4H, J=6Hz), 4.3-4.6(m, 1H), 6.8(s, 2H), 7.35, 7.85(AB q, 4H, J=9Hz), 8.7(d, 1H, J=9Hz) ;

IR(Nujol) 3350, 3150, 1730, 1630cm^-1.

MS : C₂₅H₃₄N₆O₅

계산치 : 498

측정치 : m/e 498,425,178,165(기준),150.

[실시예 17]

디에틸 N-(4-[2-(2-아세트아미도-4-하이드록시-5,6,7,8-테트라하이드로피리도[2,3-d]피리미딘-6-일에틸]벤조일)-L-글루타메이트.

300ml의 트리플루오로아세트산에 디에틸 N-(4-(2-아세트아미도-4-하이드록시피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)에텐일]벤조일)-L-글루타메이트를 용해한 용액을 1g의 5% Pd/C 존재하의 실온에서 55psi 수소압력으로 14시간동안 수소화 반응을 행하였다. 촉매를 여과하여 분리하고 여과액을 감압하에서 증발시킨후 잔유 고체를 100ml 클로로포름과 50ml의 2N 탄산나트륨 수용액으로 분배 분리를 행하였다. 유기층을 분리해서 무수 황산마그네슘상에서 건조시키고 또 용매를 증발제거시켜서 고무상 물질을 수득하고, 또 이를 실리카겔로서 크로마토그래피 분리를 행하였다. 97 : 3의 클로로포름-메탄올 용액으로 용리시켜서 0.25g(56%)의 디에틸 N-(4-[2-(2-아세트아미도-4-하이드록시피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)에틸]벤조일)-L-글루타메이트를 수득하였다 : 융점 215 내지 217℃ ;

NMR(CDCl₃) 델타 1.25, 1.34(2t, 6H, J=6Hz), 2.1-2.5(m, 4H), 2.55(s, 3H), 3.1(s, 4H), 4.15, 4.25(2q, 4H, J=6Hz), 4.6-4.96(m, 1H), 7.05(s, 1H), 7.25, 7.75(AB q, 4H, J=9Hz), 8.35(d, 1H, J=3Hz), 8.77(d, 1H, J=3Hz) ;

IR(Nujol) 3200, 3150, 1725, 1675, 1630, 1605cm^-1.

분석치 : C₂₇H₃₁N₅O₇

계산치(%) : C ; 60.32, H ; 5.81, N ; 13.03

측정치(%) : C ; 59.98, H ; 6.03, N ; 12.92.

95 : 5 클로로포름-메탄올 용액으로 추가 용리시켜서, 0.08g(18%)의 표제화합물을 수득하였으며, 이는 디에틸 2-아세틸-5,10-디데아자-5,6,7,8-테트라하이드로폴레이트로 별도로 명명될 수도 있다 : 융점＞200℃ ;

NMR(CDCl₃/Me₂SO-d₆) 델타 1.24, 1.28(2t, 6H, J=6Hz), 1.5-3.3(m, 13H), 2.18(s, 3H), 4.1, 4.18(2a, 4H, J=6Hz), 4.4-4.7(m, 1H), 6.2(s, 1H), 7.28, 7.85(AG q, 4H, J=9Hz), 8.4(d, 1H, J=8Hz) ;

IR(Nujol) 3320, 3250, 1730, 1630, 1575cm^-1.

분석치 : C₂₇H₃₅N₅O₇

계산치(%) : C ; 59.87, H ; 6.51, N ; 12.93

측정치(%) : C ; 59.66, H ; 6.71, N ; 12.77.

[실시예 18]

디에틸 N-(4-[2-(2-아세트아미도-4-하이드록시-5,6,7,8-테트라하이드로피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)프로필]벤조일)-L-글루타메이트.

30ml의 트리플루오로 아세트산 중에 84.4mg의 디에틸 N-(4-[2-(2-아세트아미도-4-하이드록시피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)프로프-1-엔일]벤조일)-1-글루타메이트를 용해한 용액을 0.42g의 5% Pd/C 존재하의 실온에서 55psi 수소압력으로 24시간동안 수소화 반응을 행하였다. 촉매를 여과 제거하고 또 여과액을 감압하에서 증발시켰다. 수득 잔유물을 클로로포름중에 용해시키고 또 중탄산나트륨 포화용액으로 추출하였다. 이 유기층을 무수 황산나트륨상에서 건조시키고 또 용매를 감압하에서 제거하였다. 이 잔유물을 이어 용리제로서 5% 메탄올-클로로포름 혼합물을 사용하느 박층 크로마토그래피에 걸어주었다. 제 1 분획의 용리후에, 19.6mg의 표제 화합물을 수득하였다.

NMR(CDCl₃, 250MHz), d 1.20-1.33(m, 중첩메틸, 9H), 2.45-3.36(m, 15H), 4.11(q, 2H, J=7.14Hz), 4.23(q, 2H, J=7.10Hz), 4.89(m, 1H), 5.44(brs, 1H), 7.24(d, 2H, J=7.54Hz), 7.72(d, 2H, J=7.54Hz), 9.77(brs, 1H), 11.26(brs, 1H).

[실시예 19]

N-(4-[2-(2,4-디아미노피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)에틸]벤조일)-L-글루탐산.

4.6ml의 0.5N 수산화나트륨 수용액을 포함하는 50ml 메탄올중에 0.38g의 디에틸 N-(4-[2-(2,4-디아미노피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)에틸]벤조일)-L-글루타메이트를 용해시킨 용액을 실온에서 72시간 동안 교반하였다. 아세트산 5ml를 첨가하고, 또 수득된 백색침전을 여과해서 수거하였다. 필터 케이크를 물, 에탄올 및 에테르로써 잘 세척하고, 또 감압하에서 건조시켜서 0.15g(44%)의 표제 화합물을 수득하였으며, 이는 또한 5,10-디데아나아미노프테린으로 명명될 수 있다 ; 융점＞250℃ ; NMR(TFA-d₁) 델타 2.2-2.7(m, 2H), 2.28 ; 2.7-2.95(m, 2H), 5.0-5.2(m, 1H), 7.35 및 7.85(ABq, RH, J=9Hz), 8.7(s, 1H), 9.1(s, 1H).

[실시예 20]

N-(4-[2-(2,4-디아미노-5,6,7,8-테트라하이드로피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)에틸]벤조일)-L-글루탐산.

실시예 19의 방법에 따라, 0.35g의 디에틸 N-(4-[2-(2,4-디아미노-5,6,7,8-테트라하이드로피도[2,3-d]피리미딘-6-일)에틸]벤조일)-L-글루타메이트를 가수분해시켜서 0.13g(42%)의 표제 화합물을 수득하였으며 이는 또한 5,10-디데아자-5,6,7,8-테트라하이드로아미노프테린으로 명명될 수 있다 ; 융점＞250℃

[실시예 21]

N-(4-[2-(2-아미노-4-하이드록시피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)에틸]벤조일)-L-글루탐산.

3ml의 1N 수산화나트륨 수용액을 포함하는 50ml 메탄올에 0.175g의 디에틸 N-(4-[2-(2-아세트아미도-4-하이드록시피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)에틸]벤조일)-L-글루타메이트를 용해시킨 균일 용액을 실온에서 72시간동안 교반하였다. 2ml 아세트산을 첨가하고 이어 원심분리시켜서 0.125g(86%)의 표제 화합물을 미세 결정질 무색 고체로 수득하였으며, 이는 또한 5,10-디데아자폴산으로 명명될 수 있다 ; 융점＞200℃ ; NMR(TFA-d₁) 델타 2,3-2.7(m, 2H), 2.7-3.0(m, 2H), 3.25(s, 5H), 4.9-5.25(m, 1H), 7.35, 7.85(AB q, 4H, J=9Hz), 8.50(s, 1H), 8.90(s, 1H).

[실시예 22]

N-(4-[2-(2-아미노-4-하이드록시-5,6,7,8-테트라하이드로피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)에틸]벤조일)-L-글루탐산.

디에틸 N-(4-[2-(2-아세트아미도-4-하이드록시-5,6,7,8-테트라하이드로피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)에틸]벤조일)-L-글루타메이트를 실시예 21에 기술한 것과 유사한 방식으로 가수분해시켜서 표제 화합물을 87% 수율로 수득하였으며, 이는 또한 5,10-디데아자 5,6,7,8-테트라하이드로폴산으로 명명될 수 있다 ; 융점＞250℃, NMR(TFA)델타 1.7-3.9(m, 13H), 5.0-5.25(m, 1H), 7.45, 7.85(ABq, 4H, J=9Hz). 유사하게, 디에틸 N-(4-[2-(2-아세트아미도-4-하이드록시피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)에텐일]벤조일)-L-글루타메이트로부터 N-(4-[2-(2-아미노-4-하이드록시피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)에텐일]벤조일)-L-글루탐산을 수득하였다 ; 융점＞200℃.

[실시예 23]

N-(4-[2-(2-아미노-4-하이드록시-5,6,7,8-테트라하이드로피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)프로필]벤조일)-L-글루탐산.

2ml 메탄올성 수산화나트륨용액에 17.5mg의 디에틸 N-(4-[2-(2-아세트아미도-4-하이드록시-5,6,7,8-테트라하이드로피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)프로필]벤조일)-L-글루타메이트를 용해시킨 균질 용액을 실온에서 72시간동안 방치하였다. 이어 대부분의 용매를 감압하에서 제거하고 또 이 혼합물을 물로 희석한 후 아세트산으로 산성으로 만들었다. 이 침전물을 여과수거하고 물로 세척한 후 감압하(0.1mmHg)에서 48시간동안 건조시켜서 9.7mg(67%)의 표제 화합물을 수득하였으며, 이는 또한 5,10-디데아자-10-메틸-5,6,7,8-테트라하이드로폴산으로 명명될 수도 있다 ; 융점＞250℃, NMR 델타 0.87-0.88(brs, 1H 각각), 1-28(m, 11H), 3.13(m, 1H), 4.59(m, 1H), 6.96(d, 2H, J=9Hz), 7.34(d, 2H, J=9Hz).

유사한 방법으로, N-(4-[1-(2-아미노-4-하이드록시-5,6,7,8-테트라하이드로피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)부트-2-일]벤조일)-L-글루탐산과 N-(4-[1-(2,4-디아미노-5,6,7,8-테트라하이드로피리도[2,3-d]피리미딘-6일)부트-2-일]벤조일)-L-글루탐산을 제조하였다.

[실시예 24]

전형적인 모델로서, 표시된 종양 세포들을 생쥐 겨드랑이 부위에 피하 이식하였다. 실시예 22의 첫번째 화합물을 복강내 투여한 후, 대조용 종양(식염수만 투여)의 길이 및 폭을 지시한 시간에 측정하고 또 시험 화합물을 투여한 동물의 측정치와 비교해서 억제율을 계산하였다.

* 5일 지연

+ 독성

급성독성시험

LY264618 이나트륨염을 젊은 성숙 암수 피셔 344 레트에 정맥주사하여 급성독성을 측정한다. 피셔 344 레트는 실험실에서 급성독성을 실험할때 가장 흔히 사용되는 레트종(계통)이다. 투여량(1000mg/kg)은 사람에게 투여되는 임상 최대 투여량인 25mg/kg의 40배량의 안전율을 나타낸다.

재료 및 방법

실험계획 및 인원 : R23488을 연구하기 위한 실험계획은 부록 A에 있다. 이 연구를 실행하는데 있어서의 책임자는 부록 B에 실려 있다.

실험계획, 원료 데이타 및 최종 레포트의 관리 : 이 연구에 대한 최종 레포트 및 원료 데이타는 엘리 릴리앤드 컴패니에 보관되어 있다.

시험 동물 : 인디애나주 인디애나폴리스에 소재하는 바란-스프라그 디우레이, 인ㅋ포레이티드사가 공급한 암수 F344/NHsd 레트에 약물을 투여하기 전에 세트로된 우리에 48시간 이상 동안 가두어 두어 시험동물이 우리, 사료 및 급수 조건에 익숙해지게 한다. 약 8주 내지 9주 정도 된 167.5±4.86g(평균 ±SD)중량의 수컷 10마리 및 132.5±5.40g의 중량의 암컷 10마리를 시험에 사용한다. 이 모든 동물을 임의로 처리 군으로 나눈다. 각 시험 동물에는 성별과 투여량 정도를 확인하기 위해 연구 번호 및 동물수로 된 각자의 확인번호가 배당된다. 이 확인번호는 우리에 부착된 카드로 표시한다. 또한 각 동물의 귀에는 동물수의 마지막 아라비아수로 표시를 한다.

동물 우리 및 취급 : 동물이 도착하자마자 이들을 성별에 따라 1개 군당 5마리로 나누어 와이어 마루와 Lexan

프론트가 구비된 통풍 스테인레스철 우리에 가둔다. 매주 3회 이상씩 교환되는 플라스틱 트레이 위로 우리를 매달아둔다. 투여한 후, 동물을 상술한 바와 같이 투여군 별로 가둔다.

동물을 22.2°±1.6℃의 실온 및 최소 상대 습도 30%에서 유지시킨다. 자동 타이머는 12시간씩 낮/밤 주기로 조절한다. 모든 시험 동물에는 일정하게 사료와 물을 공급한다. 사료는 퓨리나 서티파이드 로덴트 라보라토리 초우, 번호 5002이다. 각 우리에 달린 물병을 통하여 그린필드 수돗물을 공급한다.

시험 약품(부록 C) : 화합물 LY264618은 N-(4-(2-(2-아미노-3,4,5,6,7,8-헥사히드로-4-옥소피리도(2,3-D)피리미딘-6-일)에틸)벤조일)L-글루탐산으로 화학적으로 밝혀졌고 또 인디애나주 인디애나 폴리스에 소재하는 엘리 릴리 앤드 컴패니사로 부터 제조된다. LY264618의 이나트륨염을 본 연구에 사용한다. 시험약품(바이얼 로트 PPD01622)은 밀폐 용기중, 4℃에서 저장한다. 이 로트에 대한 분석적 특징은 부록 C에 나타낸다. 이 로트의 역가(LY264618으로서)는 바이얼당 101.7mg이고 ; 모든 투여량에 대해 계산하면 100mg/바이얼의 역가로 추정된다.

치료군 및 연구 과정 : 연구는 군당 5마리의 암컷 또는 수컷 레트로된 1개 처리군 및 1개 대조군으로 구성된다. 레트에 레트체중 kg당 1000mg의 LY264618을 1회 정맥주사한다. 대조군 동물에는 투여 시험 용액의 최대 부피(10ml/kg)에 해당되는 0.9% 염수를 1회 정맥주사한다. 처리시키기 전에 동물을 16시간 이상 동안 고정시킨 후, 투여하기 위해 공통 풀에서 임의로 선발한다. 1시간 후에 25게이지 5/8인치의 바늘이 부착된 유리 주사기를 사용하여 시험 용액 제제를 투여한다. 도입속도는 약 0.04ml/초이다. 이 연구는 2주일간 계속한다.

투여 용액의 제조 : 0.9% 염수중의 100mg의 LY264618/ml 용액으로 1회 투여량을 제조한다. 이 시험 용액은 20개 바이얼의 내용물(약 100mg/바이얼로 추정)을 빼내고, 0.9% 염수를 부가하며, 또 완전히 용해될 때까지 진탕시켜 제조한다. 진탕시킨 후, 0.9% 염수를 부가하여 정확한 농도(100mg/ml)를 수득한다. 제조한 즉시 및 투여가 완료될때까지, 시험용액은 자기 교반기상의 비이커내에 보관한다.

관찰 : 투여한 후 처음 7시간 동안은 약 1시간 간격으로 독성의 임상적 표시 및 기타 부수하는 발견을 기록하고 그후 2주일간의 관찰기간 동안은 하루에 한번씩 기록한다. 개별 체중을 기록하고 군별 평균 체중을 주당 산출한다. 이들 모든 시험 동물에 대하여 총괄적으로 병적인 이상을 조사한다. 이러한 과정은 일반적 신체조건 및 체외 개구부 뿐만 아니라 흉강 및 복강내의 조직과 기관을 전신적으로 평가하는 것을 포함한다.

결과

치사율(표 1) : 대조군 또는 화합물로 처리된 암수 레트군 모두에서 치사는 발견되지 않았다.

임상적 증후(표 2) : 대조군 또는 화합물로 처리된 암수 레트군에서 아무런 임상적 증후가 발견되지 않았다.

체중(표 1) : 대조군에 비하여 평균 체중 증가가 보통이다.

총괄적 독성 : 시험동물은 치사되지 않았고 해부시 아무런 비정상적 변화가 발견되지 않았다.

결론

체중(kg)당 이나트륨염인 1000mg의 LY264618을 피셔 344 레트에 정맥투여하는 것은 전혀 치사량 및 중독량으로 작용하지 않았다.

[표 1]

[표 2a]

[표 2b]

Claims

하기 일반식(Ⅱ)의 화합물을 가수분해 또는 가수소분해 반응시키는 것을 특징으로 하는 하기 일반식(Ⅰ)의 (S,S)-또는 (R,S)-피리도[2,3-d]피리미딘 유도체, 그의 혼합물 또는 약제로 허용되는 그의 염을 제조하는 방법 :

상기식에서, R¹은 수소 또는 아미노 보호기이고, 또 R²및 R³은 각각 수소 또는 카르복시 보호기이고, R¹, R²및 R³중의 적어도 한개의 수소가 아님.