KR930002886B1 - 재조합 폴리펩티드의 분리방법 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

재조합 폴리펩티드의 분리방법
제 1 도는 세균 세포를 분해하는 디스팩스-리액터(Dispax-Reactor)3-6/6형 균질화기의 횡단면도.
본 발명은 세균세포를 pH 2.0 내지 4.0의 수성산 존재하에서 기계적으로 분해하여, 재조합방법에 의해 제조된 폴리펩티드를 분리하는 방법에 관한 것이다.
유럽 특허원(EP-A) 제0, 052, 861호에는 재조합 방식에 의해 생성된 인터페론, 특히 알파 인터페론(IFN-α)을 분리하기 위해 세균세포를 분해하는 화학적 방법이 기술되어 있으며, 이 방법은 하기와 같은 단계로 이루어짐을 특징으로 한다.
1. 유전공학적으로 생성된 인터페론을 함유하고 있는 세균 현탁액, 특히 대장균(E.coli) 현탁액을 무기산으로 pH를 2.0 내지 2.5로 조정하여 세균을 사멸시킨다.
2. 죽은 세균세포를 분리한다.
3. 얻어진 산성의 바이오매스(biomass)를 완충액, 예를 들면 트리스(2-아미노-2-히드록시메틸-1, 3-프로판 디올)과 염화나트륨의 완충액에 재현탁시키고, 수산화나트륨용액으로 pH를 7.3으로 조정하여, 세균세포벽을 파괴한다.
4. 세균 세포를 분리한 후, 용액내에 남아있는 인터페론을 공지의 방법으로 분리하고 정제한다.
인터페론과 같은 폴리펩티드는 기계적인 영향하에서 불안정하다는 것도 역시 공지되어 있다[Proceedings of the Society for experimental Biology and Medicine 146, 249-253(1974) 참조]. 그러나 이러한 종류의 기계적인 영향은, 세균세포의 기계적인 파괴도중에 생성되는 전단력의 결과로도 초래된다. 이와 같은 이유로 인해 지금까지는, 유전공학적으로 생성된 인터페론같은 폴리펩티드를 분리하기 위해 세균 세포를 분해시켜 폴리펩티드를 고율로 수득할 수 있는 기계적인 방법은 알려져 있지 않았다.
따라서 본 발명의 목적은 세균 세포를 기계적으로 분해시켜, 재조합 방식에 의해 생성된 폴리펩티드를 세균세포로부터 추출하는 개선된 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따르면, 재조합 방식에 의해 생성된, 산-안정성 인터페론 등의 폴리펩티드를 함유하는 세균을 공지된 방법에 의해 무기산으로 사멸시키고 분리한 후 [예를 들어 "Sterilisation, Desinfektion, Konservierung, Chemotherapie-Verfahren, WirKstoffe, Prufungsverfahren" by Dr. K. H. WallauBer and Prof. Dr. H. Schmidt, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1967, pages 145-161 참조], 얻어진 바이오 매스를 무기산(예를 들어 묽은 염산) 또는 수성 알카노산(예를 들어 아세트산 또는 프로피온산) 같은 pH2.0 내지 4.0의 수성산에 재현탁시키고, 균질화기(homogeniser), 바람직하게는 울트라-투락스형(Ultra-Turrax type)의 균질화기를 사용하는 등의 방법으로 발생시킨 전단력에 의해 세균세포벽을 기계적으로 파괴시킨 다음, 생성된 현탁액을 중화시키고 세균의 파편을 제거한 후 용액중에 남아 있는 폴리펩티드를 공지된 방법으로 분리 정제 함으로서 상기의 목적을 달성하였다.
재조합 방식에 의해 생성된, 산-안정성 인터페론(예를 들면 IFM-α(arg)같은 알파-인터페론)을 분리하기 위해, 본 발명에 다른 공정은 특히 pH2.5 내지 3.5에서, 바람직하게는 pH 2.5의 묽은 염산 또는 1%아세트산중에서 유리하게 수행된다.
또한 어떤 경우에 있어서는 폴리에틸렌이민 등의 침전제를 0.1 내지 0.5%의 농도로 균질화 단계이후 및 중화단계 이전에 가하는 것이 유리할 수도 있다.
세균 세포벽를 용해시키는데 충분한 균질화기의 속도 및 시간은 바이오매스의 밀도에 따라 결정된다. 전형적인 바이오매스의 밀도는 약 1.03 내지 약 1.05이다. 균질화기의 속도는 전형적으로 약 5000 내지 10,000rpm이고, 세균 세포벽을 용해시키는 시간은 약 1분 내지 약 10분이 된다. 따라서 예를 들어 바이오매스의 밀도가 1.04일때, 균질화기의 속도는 바람직하게는 약 7000 내지 8000rpm이고 시간은 약 2분이 된다.
가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 공정이 실험실 규모일때는 이카-울트라-투랙스 티 45(IKA-Ultra-Turrax T45)를 사용하고, 좀더 대규모일때는 디스팩스-리액터 3-6/6(Dispax Reactor 3-6/6)를 사용하여 수행되는 것인데, 상기 두가지 장치는 모두 Janke 및 Kunkel KG(D-7813 Staufen)에 의하여 제조된 것이다.
울트라-투랙스 티 45는, 내부에 하나의 날개를 홈이 파인 바퀴주위로 고속 회전시킴으로서 세균 세포를 고도의 난류장 속에서 파괴시키는 분산장치이다. 세균세포를 파괴시키기 위해서 본 장치는 균질화시킬 매질과 함께 비이커속에 방치하고, 매질을 펌프효과에 의해 순환시킨다. 이 장치의 속도는 약 5,000 내지 약 10,000rpm이고 약 1 내지 10분의 시간이 경과한 후 세포의 파괴가 일어난다.
대조적으로 디스팩스-리액터 3-6/6균질화기는 자동조절되는 3단계 울트라-투랙스로서 세균세포 전량이 동일한 유속으로 균질화실을 통과하도록 되어 있다. 결과적으로 균일하게 세분된 균질화한 세균 제제가 수득된다. 본 디스팩스-리액터의 회전 속도는 3,000 내지 8,000rpm이고 원료 공급압력은 출구에서 약 2바아 정도이다. 사용된 바이오매스가 약 50리터인 경우에 이를 분해시키는데 소요되는 시간은 약 1 내지 10분이다.
제 1 도는 디스팩스-리액터 3-6/6형 균질화기의 횡단면을 도시한 것이다. 제 1 도에서 F는 균질화시킬 물질의 공급실을 나타내고, E는 추진축 H의 슬라이딩식 환상 마개이며; G는 추진축의 주베어링(bearing)을 나타낸다. 추진축 H상에는 일렬로 세개의 원통형 회전자 C가 배열되어 있으며, 이것은 균질화기틀의 내벽에 부착된 상응하게 배열된 고정자 D와 서로 맞물려 있다. 추진축 H의 말단에는 배출구 A로 돌출된 워엄 콘베이어(Warm conveyer) B가 부착되어 있다. 고정자를 냉각시키기 위해, 고정자 주위에 냉각수의 통로가 되는 유입구 L과 배출구 K를 갖는 냉각실이 있다. 주베어링 상의 슬라이딩식 환상 마개에 수유입구 J를 통해, 바람직하게는 가압(예를 들면 1.5bar)하에서 냉각수를 공급한다. 원통형 회전자는 2중 또는 3중이나 다중 드럼(drum)으로 구성될 수 있는데, 드럼의 벽은 고정자의 상응하는 반대편 드럼의 벽 사이로 돌출되어 있다. 워엄 콘베이어 B에 의해 추진된 균질화시킬 액체는 회전자와 고정자 사이의 틈으로 끌려들어가서, 회전자의 고속 회전의 결과 생성된 전단력에 의해 세균 세포벽이 파괴되고, 이렇게 해서 균질화된 물질은 배출구 A를 통해 균질화기 밖으로 나간다.
원칙적으로 본 공정은 문헌[Biochemical Engineering, page 358ff(Second Edition, Academic Press 1973)]에 기술되어 있는 것과 같은 기타의 공지된 기계적 세포 분해방법으로도 수행될 수 있다. 그러나 그 방식으로는 수율이 낮은 반면에 울트라 투랙스 티 45나 디스팩스-리액터 3-6/6을 사용하는 본 발명에 따른 공정에 의하면 유입되는 바이오매스를 기준으로 하여 예를 들면 인터페론이, 선행기술에 비해 높은 수율로 수득되는데 이는 전술한 선행기술에 의해서는 예측할 수 없었던 것이다.
하기의 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하는 것이다.
[실시예 1]
인간 인터페론 알파 2를 함유하는 대장균 클로 HB 101/pER 33(유럽 특허원 제0, 115, 613호 참조)의 세균 현탄액을 무기산으로 pH를 2.0 내지 2.5로 조정하여 세균을 사멸시킨다. 죽은 세균 세포를 현탄액으로부터 분리하여 -20℃에서 동결시킨다.
배치 A의 동결인 바이오매스 20kg을 8℃에서 1% 아세트산 250ℓ에 현탁시킨다. 바이오매스가 완전히 녹은 후에 3단계 균질화기(디스팩스-리액터 3-6/6)로 분산시킨다. 미세하게 분산된 용해질에 침전 보조제로서 0.1%폴리에틸렌 이민을 가한다. 다음에 5N수산화나트륨 용액으로 pH를 7.5로 조절한다. 2시간동안 추출한 후 침출된 바이오매스를 플레이트 분리기(Westfalia)를 사용하여 분당 1.5ℓ의 유속으로 분리한다. 등명한 액으로부터 시료를 채취하여 인터페론 및 단백질 함량을 측정한다.
수율 : 바이오매스 g당 46.9×106I.U.
인터페론 수율에 미치는 균질화기의 영향을 평가할 수 있도록, 현탁된 바이오매스 500ml를 분산시키기전에 분리하여 유럽 특허원 제0, 052, 861호에 따라 균질화 단계없이 추출한다. 3N 수산화나트륨 용액으로 pH를 7.3으로 조정한다. 1시간동안 추출한후, 실험실용 원심분리기를 사용하여 침출된 바이오매스로부터 용해질을 분리한다. 전술한 대로, 상등액으로부터 시료를 채취하여 인터페론 및 단백질 함량을 측정한다.
유럽 특허원 제0, 052, 861호에 따른 수율 : 바이오매스 g당 25.3×106I.U.
[실시예 2]
배치 B의 바이오매스를 사용하여 실시예 1과 유사하게 제조한다.
수율 : 바이오매스 g당 21.3×106I.U.
유럽특허원 제0, 052, 861호에 따른 수율 : 바이오매스 g당 9.7×106I.U.
[실시예 3]
배치 C의 바이오매스를 사용하여 실시예 1과 유사하게 제조한다.
수율 : 바이오매스 g당 13.8×106I.U.
유럽특허원 제0, 052, 861호에 따른 수율 : 바이오매스 g당 5.1×106I.U.
[실시예 4]
배치 BC 24의 바이오매스 1000g을 pH2.5의 묽은 염산(37% 염산 4ml에 물을 가해 10,000ml로 하여 조제) 10,000ml에 녹인 후 이카 울트라-투랙스 티 45를 사용하여 분산시켜 실시예 1과 유사하게 제조한다.
수율 : 바이오매스 g당 50×106I.U.

Claims (8)

  1. 유전공학적으로 생성된 폴리팹티드를 함유하는 세균 세포를 pH 2.0 내지 4.0의 수성산에 현탁시키고 균질화기를 사용하여 발생시킨 전단력에 의해 기계적으로 파괴시킨 다음에, 생성된 현탄액중에 존재하는 폴리펩티드를 분리 및 정제함을 특징으로 하여, 재조합 방법에 의해 생성된 폴리펩티드를 세균세포로부터 분리하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 세균세포로 재조합 방법에 의해 생성된 산-안정성 인터페론을 함유하는 세균세포를 사용하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 세균세포로 재조합 방법에 의해 생성된 알파-인터페론을 함유하는 세균세포를 사용하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 세균세포로 재조합 방법에 의해 생성된 IFN-α2(arg)를 함유하는 세균세포를 사용하는 방법.
  5. 제 2 항 내지 제 4 항중 어느 하나에 있어서, pH 2.5 내지 3.5에서 수행하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 사용되는 균질화기가 울트라-투랙스형(Ultra-Turrax type), 바람직하게는 디스팩스-리액터 3-6/6(Dispax-Reactor 3-6/6)의 균질화기인 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 사용되는 산이 아세트산 또는 프로피온산과 같은 알카노산인 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 사용되는 수성산이 1% 아세트산인 방법.
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5196323A (en) * 1985-04-27 1993-03-23 Boehringer Ingelheim International Gmbh Process for preparing and purifying alpha-interferon
US4675387A (en) * 1985-07-26 1987-06-23 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for extracting protein with organic acid
US4734362A (en) * 1986-02-03 1988-03-29 Cambridge Bioscience Corporation Process for purifying recombinant proteins, and products thereof
US5831022A (en) * 1986-02-18 1998-11-03 Hoffmann-La Roche Inc. Purification of recombinant human IL-1α
US4801686A (en) * 1986-09-04 1989-01-31 Immunex Corporation Purification of recombinant interleukin-1
US5179199A (en) * 1986-10-20 1993-01-12 Genzyme Corporation Protein purification
US4912200A (en) * 1987-05-11 1990-03-27 Schering Corporation Extraction of granulocyte macrophage colony stimulating factor from bacteria
US4958007A (en) * 1988-05-17 1990-09-18 Schering-Plough Corp. Extraction of human interleukin-4- from bacteria
EP1539798B1 (en) 2002-09-06 2010-11-24 Genentech, Inc. Process for protein extraction
JP4779537B2 (ja) * 2005-09-28 2011-09-28 パナソニック株式会社 電気掃除機

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1432039A (en) * 1972-11-10 1976-04-14 Dai Nippon Sugar Mfg Co Ltd Method of treating microorganisms
JPS5530834A (en) * 1978-08-25 1980-03-04 Nec Corp Method of forming ohmic contact in semiconductor pellet
US4315852A (en) * 1980-11-26 1982-02-16 Schering Corporation Extraction of interferon from bacteria
JPS57118798A (en) * 1980-11-26 1982-07-23 Schering Plough Corp Obtaining of interferon solution
IT1167610B (it) * 1982-01-19 1987-05-13 Cetus Corp Interfreron ibrido multiclasse, composizione farmaceutica che lo contiene e procedimento di produzione
WO1984002129A1 (en) * 1982-11-22 1984-06-07 Takeda Chemical Industries Ltd Human immune interferon protein and process for its preparation

Also Published As

Publication number Publication date
EP0173924A3 (en) 1988-02-03
JPS6170984A (ja) 1986-04-11
HUT39471A (en) 1986-09-29
JPH078238B2 (ja) 1995-02-01
ES8608038A1 (es) 1986-06-01
DK165748B (da) 1993-01-11
IE852141L (en) 1986-03-01
FI853324A0 (fi) 1985-08-30
IE58521B1 (en) 1993-10-06
FI85979C (fi) 1992-06-25
FI85979B (fi) 1992-03-13
IL76264A (en) 1990-02-09
DK396685D0 (da) 1985-08-30
DK165748C (da) 1993-06-14
HU193806B (en) 1987-12-28
ZA856640B (en) 1987-05-27
ES546528A0 (es) 1986-06-01
DE3432196A1 (de) 1986-03-06
IL76264A0 (en) 1986-01-31
EP0173924A2 (de) 1986-03-12
FI853324L (fi) 1986-03-02
DK396685A (da) 1986-03-02
ATE49231T1 (de) 1990-01-15
KR860002571A (ko) 1986-04-26
EP0173924B1 (de) 1990-01-03
DE3575162D1 (de) 1990-02-08

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