JP2831473B2 - 細菌からの異種の不溶性タンパク質の抽出 - Google Patents
細菌からの異種の不溶性タンパク質の抽出Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 哺乳動物タンパク質をコードするDNA配列を含有する
ベクターでの細菌の形質転換は一般的である。細菌によ
る哺乳動物タンパク質の発現の結果、細菌中の封入体内
に含まれるタンパク質を高産生し得る。このタンパク質
を得、そして精製するために、タンパク質含有封入体を
細菌から抽出しなければならない。
ベクターでの細菌の形質転換は一般的である。細菌によ
る哺乳動物タンパク質の発現の結果、細菌中の封入体内
に含まれるタンパク質を高産生し得る。このタンパク質
を得、そして精製するために、タンパク質含有封入体を
細菌から抽出しなければならない。
従来、封入体は発酵ブロスを遠心分離する工程、上清
液を除去する工程、緩衝液中に細菌ペレットを再懸濁す
る工程、およびホモジナイズ処理または超音波処理のよ
うな機械的技術によって、あるいはリゾチーム添加界面
活性剤の使用によって細菌細胞を破砕する工程により単
離されてきた。次いで、破砕細胞を含む混合物を遠心分
離することで、上清液およびペレット化した封入体を生
じる。封入体ペレットは、細菌細胞破砕およびその後の
遠心分離の後に得られる封入体を含有するペレットであ
る。次いで、破砕した細菌を含有する混合物を遠心分離
し、上清液およびペレット化した封入体を得る。封入体
ペレットは、細菌細胞破砕およびその後の遠心分離の後
に得られる封入体を含有するペレットである。しかし、
この手順は生存細菌を含有する発酵ブロスを遠心分離す
る工程を初期工程として包含する。しばしば、大規模な
遠心分離の間、生存細菌は遠心分離によって流出される
エアロゾール中で周囲の大気中へ流出し得る。
液を除去する工程、緩衝液中に細菌ペレットを再懸濁す
る工程、およびホモジナイズ処理または超音波処理のよ
うな機械的技術によって、あるいはリゾチーム添加界面
活性剤の使用によって細菌細胞を破砕する工程により単
離されてきた。次いで、破砕細胞を含む混合物を遠心分
離することで、上清液およびペレット化した封入体を生
じる。封入体ペレットは、細菌細胞破砕およびその後の
遠心分離の後に得られる封入体を含有するペレットであ
る。次いで、破砕した細菌を含有する混合物を遠心分離
し、上清液およびペレット化した封入体を得る。封入体
ペレットは、細菌細胞破砕およびその後の遠心分離の後
に得られる封入体を含有するペレットである。しかし、
この手順は生存細菌を含有する発酵ブロスを遠心分離す
る工程を初期工程として包含する。しばしば、大規模な
遠心分離の間、生存細菌は遠心分離によって流出される
エアロゾール中で周囲の大気中へ流出し得る。
米国特許第4,958,007号は、発酵ブロスにトルエンま
たは酸のいずれかを加えることによって細胞を最初に不
活性化することによりこの問題を解決する。次いでこの
ブロスを遠心分離し、上清液を除去し、そして細菌ペレ
ットを緩衝液中に再懸濁させる。そしてこの懸濁液のpH
を最終pHが６〜９の間になるように調整する。あるい
は、この酸性にした発酵ブロスのpHを６〜９に調整す
る。次いで、この細菌細胞をホモジナイズ処理により破
砕して、細胞から封入体を遊離させる。このプロセスは
遠心分離の間の、生存細菌の大気中への流出を排除す
る；しかしトルエンを用いて細菌を不活性化する場合、
トルエンは可燃性であり、そしてその蒸気は引火性であ
るので、このプロセスは耐爆発室内で行わなければなら
ない。さらに、酸を細菌を不活性化するために用い、そ
して細菌ペレットを緩衝液中に再懸濁し、そしてこの懸
濁液のpHを最終pHが６〜９の間になるように調整する場
合、以前は可溶性であった細菌タンパク質が不溶化さ
れ、受容し得ない高レベルの細菌宿主タンパク質を含む
封入体ペレットを生じる。
たは酸のいずれかを加えることによって細胞を最初に不
活性化することによりこの問題を解決する。次いでこの
ブロスを遠心分離し、上清液を除去し、そして細菌ペレ
ットを緩衝液中に再懸濁させる。そしてこの懸濁液のpH
を最終pHが６〜９の間になるように調整する。あるい
は、この酸性にした発酵ブロスのpHを６〜９に調整す
る。次いで、この細菌細胞をホモジナイズ処理により破
砕して、細胞から封入体を遊離させる。このプロセスは
遠心分離の間の、生存細菌の大気中への流出を排除す
る；しかしトルエンを用いて細菌を不活性化する場合、
トルエンは可燃性であり、そしてその蒸気は引火性であ
るので、このプロセスは耐爆発室内で行わなければなら
ない。さらに、酸を細菌を不活性化するために用い、そ
して細菌ペレットを緩衝液中に再懸濁し、そしてこの懸
濁液のpHを最終pHが６〜９の間になるように調整する場
合、以前は可溶性であった細菌タンパク質が不溶化さ
れ、受容し得ない高レベルの細菌宿主タンパク質を含む
封入体ペレットを生じる。
従って、改良プロセスについては不溶性の組換えタン
パク質を抽出することが必要である。このプロセスで
は、全てのまたはほとんどの細菌が遠心分離の前に死滅
され、ほとんどの宿主細菌タンパク質は溶液中に残存
し、そして優勢な不溶性タンパク質は細菌で発現された
異種タンパク質である。
パク質を抽出することが必要である。このプロセスで
は、全てのまたはほとんどの細菌が遠心分離の前に死滅
され、ほとんどの宿主細菌タンパク質は溶液中に残存
し、そして優勢な不溶性タンパク質は細菌で発現された
異種タンパク質である。
発明の要旨 本発明は、細菌が発酵ブロス中にいまだ存在する間に
異種タンパク質を発現する細菌を破砕し、続いて酸処理
によって細菌を必要に応じて不活性化することによりこ
の必要性を満たす。次いで、生存細菌が流出することな
く遠心分離を行い得る。この細菌破砕は、生存細菌数を
有意に低減し、そして同時に、生存細菌を含有するブロ
スの流出を最小にするかまたは防止するために閉鎖系で
行い得る。本発明の方法は、精製度が増加した異種タン
パク質を含む封入体（すなわち先行技術分野の抽出手順
によって産生されるよりも低レベルの不溶性の細菌タン
パク質を有する封入体）を産生する。
異種タンパク質を発現する細菌を破砕し、続いて酸処理
によって細菌を必要に応じて不活性化することによりこ
の必要性を満たす。次いで、生存細菌が流出することな
く遠心分離を行い得る。この細菌破砕は、生存細菌数を
有意に低減し、そして同時に、生存細菌を含有するブロ
スの流出を最小にするかまたは防止するために閉鎖系で
行い得る。本発明の方法は、精製度が増加した異種タン
パク質を含む封入体（すなわち先行技術分野の抽出手順
によって産生されるよりも低レベルの不溶性の細菌タン
パク質を有する封入体）を産生する。
本発明は、異種タンパク質を発現する細菌から異種タ
ンパク質を含有する封入体を抽出する３つの方法を提供
する。
ンパク質を含有する封入体を抽出する３つの方法を提供
する。
第一の実施態様は以下の工程を包含する： （ａ）発酵ブロス中で異種の不溶性タンパク質を発現す
る細菌を発酵させる工程； （ｂ）発酵ブロス内に含まれる細菌を破砕する工程； （ｃ）発酵ブロスを遠心分離して、封入体ペレットおよ
び上清液を得る工程；および、 （ｄ）上清液を除去して、封入体ペレットを得る工程。
る細菌を発酵させる工程； （ｂ）発酵ブロス内に含まれる細菌を破砕する工程； （ｃ）発酵ブロスを遠心分離して、封入体ペレットおよ
び上清液を得る工程；および、 （ｄ）上清液を除去して、封入体ペレットを得る工程。
本発明の第二の実施態様は以下の工程を包含する： （ａ）発酵ブロス中で異種の不溶性タンパク質を発現す
る細菌を発酵させる工程； （ｂ）発酵ブロス内に含まれる該細菌を破砕する工程； （ｃ）発酵ブロスを０〜15℃の温度に冷却または維持す
る工程； （ｄ）ホモジナイズ処理した発酵ブロスに酸を加えて、
発酵ブロスが約2.0のpHを得る工程； （ｅ）該酸性にした発酵ブロスを、０〜15℃の間の温度
でインキュベートして、あらゆる残存する未破砕細菌を
死滅させる工程； （ｆ）発酵ブロスを遠心分離して、封入体ペレットおよ
び上清液を得る工程； （ｇ）上清液を封入体ペレットから除去する工程； （ｈ）緩衝液中に封入体ペレットを懸濁して、懸濁液を
得る工程； （ｉ）懸濁液にpH調整液を加えて、懸濁液が６〜９の間
のpHを得る工程； （ｊ）工程（ｉ）の懸濁液中に含まれる懸濁固形物を破
砕する工程； （ｋ）懸濁液を遠心分離して、異種タンパク質を含有す
る封入体ペレットおよび上清液を産生する工程；およ
び、 （ｌ）上清液を除去して、異種タンパク質を含有する単
離された封入体を得る工程。
る細菌を発酵させる工程； （ｂ）発酵ブロス内に含まれる該細菌を破砕する工程； （ｃ）発酵ブロスを０〜15℃の温度に冷却または維持す
る工程； （ｄ）ホモジナイズ処理した発酵ブロスに酸を加えて、
発酵ブロスが約2.0のpHを得る工程； （ｅ）該酸性にした発酵ブロスを、０〜15℃の間の温度
でインキュベートして、あらゆる残存する未破砕細菌を
死滅させる工程； （ｆ）発酵ブロスを遠心分離して、封入体ペレットおよ
び上清液を得る工程； （ｇ）上清液を封入体ペレットから除去する工程； （ｈ）緩衝液中に封入体ペレットを懸濁して、懸濁液を
得る工程； （ｉ）懸濁液にpH調整液を加えて、懸濁液が６〜９の間
のpHを得る工程； （ｊ）工程（ｉ）の懸濁液中に含まれる懸濁固形物を破
砕する工程； （ｋ）懸濁液を遠心分離して、異種タンパク質を含有す
る封入体ペレットおよび上清液を産生する工程；およ
び、 （ｌ）上清液を除去して、異種タンパク質を含有する単
離された封入体を得る工程。
本発明の第三の実施態様は以下の工程を包含する： （ａ）発酵ブロス中で異種の不溶性タンパク質を発現す
る細菌を発酵させる工程； （ｂ）発酵ブロス内に含まれる細菌を破砕する工程； （ｃ）発酵ブロスを０〜15℃の温度に冷却または維持す
る工程； （ｄ）発酵ブロスに硝酸を加えて、ブロスが約2.0のpH
を得る工程； （ｅ）該酸性にした発酵ブロスを、約０〜15℃の間の温
度でインキュベートして、細菌を死滅させる工程； （ｆ）約8.5にブロスのpHを上昇させる工程； （ｇ）ブロスを破砕する工程； （ｈ）破砕したブロスを遠心分離して、封入体の封入体
ペレットおよび上清液を産生する工程；および、 （ｉ）上清液を除去して、異種タンパク質を含有する単
離された封入体を得る工程。
る細菌を発酵させる工程； （ｂ）発酵ブロス内に含まれる細菌を破砕する工程； （ｃ）発酵ブロスを０〜15℃の温度に冷却または維持す
る工程； （ｄ）発酵ブロスに硝酸を加えて、ブロスが約2.0のpH
を得る工程； （ｅ）該酸性にした発酵ブロスを、約０〜15℃の間の温
度でインキュベートして、細菌を死滅させる工程； （ｆ）約8.5にブロスのpHを上昇させる工程； （ｇ）ブロスを破砕する工程； （ｈ）破砕したブロスを遠心分離して、封入体の封入体
ペレットおよび上清液を産生する工程；および、 （ｉ）上清液を除去して、異種タンパク質を含有する単
離された封入体を得る工程。
図面の簡単な説明 図は、本発明の方法により産生された封入体および本
発明以外の方法により産生された封入体のSDS−PAGEゲ
ルである。
発明以外の方法により産生された封入体のSDS−PAGEゲ
ルである。
発明の詳細な説明 本明細書中に引用された全ての米国特許は参考として
その全体が本明細書中に援用される。
その全体が本明細書中に援用される。
本発明は、不溶性の非細菌タンパク質（特に、遺伝子
形質転換された細菌（特にE.coli.）により産生される
哺乳動物タンパク質）を抽出するための方法を提供す
る。細菌中に発現される非細菌タンパク質は異種タンパ
ク質と称される。本明細書に用いられるように、用語
「形質転換細菌」は異種タンパク質を産生するように遺
伝子操作された細菌を意味する。このような遺伝子操作
は、通常、細菌への発現ベクターの導入を伴う。発現ベ
クターは、細菌ゲノム中の遺伝子に関して自律的な複製
およびタンパク質発現をし得る。細菌発現ベクターの構
築は、当該分野で周知であり、所望のタンパク質をコー
ドする該ヌクレオチド配列を提供することは公知である
が、そうでなければ入手可能である。例えば、米国特許
第4,551,433号においてDeBoerは細菌発現ベクターに用
いるためのプロモーターを開示している；米国特許第4,
601,980号においてGoeddelらは、ならびに米国特許第4,
431,739号においてRiggsは、E.coli.発現系による哺乳
動物タンパク質の産生を開示している；ならびに、Rigg
s、前出、Ferrettiら、Proc.Natl.Acad.Sci.83:599（19
86）、Sproatら、Nucleic Acid Research 13:2959（198
5）、およびMullenbachら、J.Biol.Chem.261:719（198
6）は、細菌における発現用の合成遺伝子の構築法を開
示している。多くの細菌発現ベクターは、市販されてお
り、およびアメリンタイプカルチャーコレクション（AT
CC）,Rockville,Marylandを通して入手可能である。
形質転換された細菌（特にE.coli.）により産生される
哺乳動物タンパク質）を抽出するための方法を提供す
る。細菌中に発現される非細菌タンパク質は異種タンパ
ク質と称される。本明細書に用いられるように、用語
「形質転換細菌」は異種タンパク質を産生するように遺
伝子操作された細菌を意味する。このような遺伝子操作
は、通常、細菌への発現ベクターの導入を伴う。発現ベ
クターは、細菌ゲノム中の遺伝子に関して自律的な複製
およびタンパク質発現をし得る。細菌発現ベクターの構
築は、当該分野で周知であり、所望のタンパク質をコー
ドする該ヌクレオチド配列を提供することは公知である
が、そうでなければ入手可能である。例えば、米国特許
第4,551,433号においてDeBoerは細菌発現ベクターに用
いるためのプロモーターを開示している；米国特許第4,
601,980号においてGoeddelらは、ならびに米国特許第4,
431,739号においてRiggsは、E.coli.発現系による哺乳
動物タンパク質の産生を開示している；ならびに、Rigg
s、前出、Ferrettiら、Proc.Natl.Acad.Sci.83:599（19
86）、Sproatら、Nucleic Acid Research 13:2959（198
5）、およびMullenbachら、J.Biol.Chem.261:719（198
6）は、細菌における発現用の合成遺伝子の構築法を開
示している。多くの細菌発現ベクターは、市販されてお
り、およびアメリンタイプカルチャーコレクション（AT
CC）,Rockville,Marylandを通して入手可能である。
次いで、発現ベクターで形質転換された細菌は、発現
される異種タンパク質を刺激する条件下で、細菌培地中
で増殖される。形質転換細菌を含有するこの細菌培地を
発酵ブロスと呼ぶ。
される異種タンパク質を刺激する条件下で、細菌培地中
で増殖される。形質転換細菌を含有するこの細菌培地を
発酵ブロスと呼ぶ。
本発明の第一の実施態様では、異種タンパク質を発現
する形質転換細胞（好ましくは形質転換E.coli株）は、
０℃から25℃の間の温度で標準的な技術により発酵ブロ
スを超音波処理またはホモジナイズ処理することによっ
て破砕する。一般に、全発酵ブロスの超音波処理または
ホモジナイズ処理は、本質的に全ての細胞が死滅される
まで続行するべきである。これは、続く遠心分離による
封入体からの可溶性タンパク質および小さな細胞フラグ
メントの効果的な除去を可能にする；従って、それはタ
ンパク質の最終の純度を最大にする。
する形質転換細胞（好ましくは形質転換E.coli株）は、
０℃から25℃の間の温度で標準的な技術により発酵ブロ
スを超音波処理またはホモジナイズ処理することによっ
て破砕する。一般に、全発酵ブロスの超音波処理または
ホモジナイズ処理は、本質的に全ての細胞が死滅される
まで続行するべきである。これは、続く遠心分離による
封入体からの可溶性タンパク質および小さな細胞フラグ
メントの効果的な除去を可能にする；従って、それはタ
ンパク質の最終の純度を最大にする。
超音波処理は一般に、分析スケール容量（10〜20ml）
の発酵ブロス中に含まれる細菌の破砕のために用いられ
る。より大規模なスケールでは、高圧のホモジナイズ処
理を用いるべきである。1/8インチ（3.2mm）の先細のマ
イクロチップを有するHeat−Systems−Ultrasonic社のU
ltrasonic Processorモデル番号Ｗ−85を用いる分析容
量（10〜20ml）の発酵ブロスについては、50％のサイク
ル（duty cycle）で18分間の全超音波処理時間、10mlの
全ブロスの１秒パルス（正味の超音波処理は９分間）が
好ましい。
の発酵ブロス中に含まれる細菌の破砕のために用いられ
る。より大規模なスケールでは、高圧のホモジナイズ処
理を用いるべきである。1/8インチ（3.2mm）の先細のマ
イクロチップを有するHeat−Systems−Ultrasonic社のU
ltrasonic Processorモデル番号Ｗ−85を用いる分析容
量（10〜20ml）の発酵ブロスについては、50％のサイク
ル（duty cycle）で18分間の全超音波処理時間、10mlの
全ブロスの１秒パルス（正味の超音波処理は９分間）が
好ましい。
ホモジナイズ処理を細菌を破砕するために用いる場
合、発酵ブロスの多数の通過が好ましい。平方インチ
（psi）あたり11,000ポンドでMICROFLUIDIZER （Micro
fluidics M−110）に発酵ブロスを３回通過させること
で十分であることが観察された。MICROFLUIDIZER を用
いる超音波処理およびホモジナイズ処理の間、生存細菌
の流出を防止するように系を閉鎖することが好ましい。
大規模なホモジナイザーは、しばしば、閉鎖系で設定さ
れる。
合、発酵ブロスの多数の通過が好ましい。平方インチ
（psi）あたり11,000ポンドでMICROFLUIDIZER （Micro
fluidics M−110）に発酵ブロスを３回通過させること
で十分であることが観察された。MICROFLUIDIZER を用
いる超音波処理およびホモジナイズ処理の間、生存細菌
の流出を防止するように系を閉鎖することが好ましい。
大規模なホモジナイザーは、しばしば、閉鎖系で設定さ
れる。
次いで、超音波処理またはホモジナイザ処理した発酵
ブロスを遠心分離して、ペレットおよび上清液を含有す
る封入体を産生する。遠心分離の速度はほとんどの封入
体を沈降するのに十分であるべきであるが、懸濁液中の
ほとんどの細胞フラグメントを上清液中に維持するのに
十分な低速度であるべきである。一般に、遠心分離は、
EPPENDORF マイクロ遠心機モデル番号5402において１
インチおよび1/2インチのコニカルマイクロ遠心チュー
ブを用いて、約5000rpmから10,000rpm、好ましくは7000
〜10,000rpmで、約10分程度であるべきである。次い
で、上清液を除去して異種タンパク質を含有する封入体
を得る。
ブロスを遠心分離して、ペレットおよび上清液を含有す
る封入体を産生する。遠心分離の速度はほとんどの封入
体を沈降するのに十分であるべきであるが、懸濁液中の
ほとんどの細胞フラグメントを上清液中に維持するのに
十分な低速度であるべきである。一般に、遠心分離は、
EPPENDORF マイクロ遠心機モデル番号5402において１
インチおよび1/2インチのコニカルマイクロ遠心チュー
ブを用いて、約5000rpmから10,000rpm、好ましくは7000
〜10,000rpmで、約10分程度であるべきである。次い
で、上清液を除去して異種タンパク質を含有する封入体
を得る。
本発明の第二の実施態様では、発酵ブロス中の細菌を
破砕した後、ブロスの温度を０〜15℃に低下させる。次
いで、発酵ブロスのpHを、硫酸、リン酸、硝酸、または
塩酸を用いて約０〜15℃の温度で約2.0に低下させ、次
いでブロスをあらゆる残存細菌を死滅させるために、代
表的には約１時間、その温度でインキュベートする。簡
単なホモジナイズ処理では全ての細菌が死滅させないた
めこれは重要である。好ましくは、pHを低下させるため
に用いる酸はリン酸または硝酸のいずれかである。次い
で、発酵ブロスを上記のように遠心分離し、そして上清
液を除去して封入体ペレットを単離する。次いで、該封
入体ペレットを緩衝液中に再懸濁する。該ペレットを再
懸濁するのに用い得る緩衝液の例は、リン酸ナトリウ
ム、リン酸カリウムおよびトリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン塩酸（TRIS）である。好ましい緩衝液は、
50mM TRIS、5mM EDTAおよび50mM NaCl pH8.5（TEN緩衝
液）から構成される。得られた懸濁液の最終pHを、適切
な塩基で約6.0から約9.0の間、好ましくは8.5のpHに調
整する。pH調整工程で用いられ得る適切な塩基の例は、
水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどである。pHを上
昇させる好ましい塩基溶液は、NaOHの25％w/v溶液であ
る。
破砕した後、ブロスの温度を０〜15℃に低下させる。次
いで、発酵ブロスのpHを、硫酸、リン酸、硝酸、または
塩酸を用いて約０〜15℃の温度で約2.0に低下させ、次
いでブロスをあらゆる残存細菌を死滅させるために、代
表的には約１時間、その温度でインキュベートする。簡
単なホモジナイズ処理では全ての細菌が死滅させないた
めこれは重要である。好ましくは、pHを低下させるため
に用いる酸はリン酸または硝酸のいずれかである。次い
で、発酵ブロスを上記のように遠心分離し、そして上清
液を除去して封入体ペレットを単離する。次いで、該封
入体ペレットを緩衝液中に再懸濁する。該ペレットを再
懸濁するのに用い得る緩衝液の例は、リン酸ナトリウ
ム、リン酸カリウムおよびトリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン塩酸（TRIS）である。好ましい緩衝液は、
50mM TRIS、5mM EDTAおよび50mM NaCl pH8.5（TEN緩衝
液）から構成される。得られた懸濁液の最終pHを、適切
な塩基で約6.0から約9.0の間、好ましくは8.5のpHに調
整する。pH調整工程で用いられ得る適切な塩基の例は、
水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどである。pHを上
昇させる好ましい塩基溶液は、NaOHの25％w/v溶液であ
る。
次いで、pH調整した懸濁液を再び破砕して、超音波処
理またはホモジナイズ処理により懸濁液中に存在する固
形物を分散させ、続いてそれを遠心分離する。最後に、
可溶性の宿主細菌タンパク質および細胞片を含む上清液
を除去し、不溶性の哺乳動物タンパク質を含むペレット
を回収する。必要であれば、ペレットを１度または２
度、好ましくは約8.5のpH緩衝液中で洗浄し得る。酸添
加は０℃と15℃との間で行うことが重要である。全ての
他の抽出操作は、０℃と32℃との間で行い得る。
理またはホモジナイズ処理により懸濁液中に存在する固
形物を分散させ、続いてそれを遠心分離する。最後に、
可溶性の宿主細菌タンパク質および細胞片を含む上清液
を除去し、不溶性の哺乳動物タンパク質を含むペレット
を回収する。必要であれば、ペレットを１度または２
度、好ましくは約8.5のpH緩衝液中で洗浄し得る。酸添
加は０℃と15℃との間で行うことが重要である。全ての
他の抽出操作は、０℃と32℃との間で行い得る。
本発明の第三の実施態様では、異種の不溶性タンパク
質を発現する細菌は発酵ブロス中で発酵させる。発酵ブ
ロス中の細菌を上記のように超音波処理またはホモジナ
イズ処理により破砕する。次いで発酵ブロスの温度を０
〜15℃に低下させ、そして硝酸を発酵ブロスに加えて該
ブロスのpHを約2.0に低下させる。次いで、発酵ブロス
を０〜15℃であらゆる残存細菌を死滅させるために必要
の時間、代表的には約１時間インキュベートする。
質を発現する細菌は発酵ブロス中で発酵させる。発酵ブ
ロス中の細菌を上記のように超音波処理またはホモジナ
イズ処理により破砕する。次いで発酵ブロスの温度を０
〜15℃に低下させ、そして硝酸を発酵ブロスに加えて該
ブロスのpHを約2.0に低下させる。次いで、発酵ブロス
を０〜15℃であらゆる残存細菌を死滅させるために必要
の時間、代表的には約１時間インキュベートする。
次いで、該発酵ブロスのpHを約8.5に上昇させ、そし
てあらゆる残存細菌を含む懸濁液された固形物をホモジ
ナイズ処理または超音波処理により再び破砕する。この
第二の破砕後、ブロスを遠心分離し、上清液および封入
体ペレットを生成する。次いで上清液を除去し、不溶性
の異種タンパク質を含有する単離された封入体を得る。
てあらゆる残存細菌を含む懸濁液された固形物をホモジ
ナイズ処理または超音波処理により再び破砕する。この
第二の破砕後、ブロスを遠心分離し、上清液および封入
体ペレットを生成する。次いで上清液を除去し、不溶性
の異種タンパク質を含有する単離された封入体を得る。
大規模な操作では、実施態様２および３の酸によって
死滅させる手順を使用することが好ましい。なぜなら酸
によって死滅させる手順は本質的に100％の細菌を容易
に死滅させるからである。この目的を達成するために、
多くのホモジナイズ処理試行が必要とされるので、ホモ
ジナイズ処理のみを用いて100％の細菌を死滅させるこ
とは、コスト的に有効ではない。
死滅させる手順を使用することが好ましい。なぜなら酸
によって死滅させる手順は本質的に100％の細菌を容易
に死滅させるからである。この目的を達成するために、
多くのホモジナイズ処理試行が必要とされるので、ホモ
ジナイズ処理のみを用いて100％の細菌を死滅させるこ
とは、コスト的に有効ではない。
封入体を単離した後、次いで異種タンパク質は標準的
な生化学的方法を用いてほどかれ（untolded）得、再び
折り畳まれ得、そして精製され得る。例えば、Guide to
Protein Purification,Deutscherら編（Academic Pres
s、San Diego、CA、1990）を参照のこと。
な生化学的方法を用いてほどかれ（untolded）得、再び
折り畳まれ得、そして精製され得る。例えば、Guide to
Protein Purification,Deutscherら編（Academic Pres
s、San Diego、CA、1990）を参照のこと。
以下の実施例は本発明を詳細に記載する。材料および
方法の改変が本開示の目的および意図から逸脱すること
なく実施され得ることは、当業者に明らかである。
方法の改変が本開示の目的および意図から逸脱すること
なく実施され得ることは、当業者に明らかである。
本発明は以下の限定されない実施例により例示され得
る。特に記載しない限り、以下に示す固体混合物中の固
形物、液体中の液体、および液体中の固形物の割合は、
それぞれwt/wt、vol/vol、およびwt/volに基づく。
る。特に記載しない限り、以下に示す固体混合物中の固
形物、液体中の液体、および液体中の固形物の割合は、
それぞれwt/wt、vol/vol、およびwt/volに基づく。
実施例１ （本発明の実施態様１） 本実施例で用いたヒトIL−10発現プラスミドは以下の
配列を含む： （ａ）ヒトIL−10コード領域のヌクレオチド配列、Vier
a,P.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:1172（1991）； （ｂ）３′末端がIL−10コード領域のヌクレオチド配列
の５′末端に融合された、tacプロモーター、Zurawski
ら、J.Immunol.,137:3554（1986）； （ｃ）rhIL−10コード領域の下流に存在する転写ターミ
ネーターを含むlpp 3′コード領域および非コード領
域、Ghrayeb,J.ら、EMBO.J.,3:2437（1984）； （ｄ）pBR322由来のテトラサイクリン耐性遺伝子、Sutc
liff,J.G.,C.S.H.Sypmp.Quant.Biol.135:612（1978）； （ｅ）copTS熱誘導性複製起点、Hakkaart,M.J.J.ら、Mo
l.Gen.Genet.183:326（1981）およびAndreoli,P.M.ら、
J.Bacteriol.135:612（1978）。
配列を含む： （ａ）ヒトIL−10コード領域のヌクレオチド配列、Vier
a,P.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:1172（1991）； （ｂ）３′末端がIL−10コード領域のヌクレオチド配列
の５′末端に融合された、tacプロモーター、Zurawski
ら、J.Immunol.,137:3554（1986）； （ｃ）rhIL−10コード領域の下流に存在する転写ターミ
ネーターを含むlpp 3′コード領域および非コード領
域、Ghrayeb,J.ら、EMBO.J.,3:2437（1984）； （ｄ）pBR322由来のテトラサイクリン耐性遺伝子、Sutc
liff,J.G.,C.S.H.Sypmp.Quant.Biol.135:612（1978）； （ｅ）copTS熱誘導性複製起点、Hakkaart,M.J.J.ら、Mo
l.Gen.Genet.183:326（1981）およびAndreoli,P.M.ら、
J.Bacteriol.135:612（1978）。
発酵 上記のプラスミドを有する（harboring）E.coli.株K1
2の培養を、水性発酵培地中で通気下および振盪下で行
った。各１リットルの培地は、30gのカザミノ酸（Difc
o）、20gの酵母抽出物（Difco）、5gのリン酸二水素カ
リウム、20gのグリセロール、1gのMgSO4および10mgのテ
トラサイクリン（Sigma）を含有する。pHを25％w/vのNa
OHで7.0に調節し、そして溶解した酸素を、5psi圧下の
空気に関して30〜100％飽和の間で維持した。温度を初
めに、30℃に調節した。培養物の濁度が、No.54グリー
ンフィルターを有するKlett Summerson比色計で測定し
て約100Klettユニットに達した場合、温度を約38℃に上
昇させ、そして該培養物を、その後12〜14時間で採取し
た。
2の培養を、水性発酵培地中で通気下および振盪下で行
った。各１リットルの培地は、30gのカザミノ酸（Difc
o）、20gの酵母抽出物（Difco）、5gのリン酸二水素カ
リウム、20gのグリセロール、1gのMgSO4および10mgのテ
トラサイクリン（Sigma）を含有する。pHを25％w/vのNa
OHで7.0に調節し、そして溶解した酸素を、5psi圧下の
空気に関して30〜100％飽和の間で維持した。温度を初
めに、30℃に調節した。培養物の濁度が、No.54グリー
ンフィルターを有するKlett Summerson比色計で測定し
て約100Klettユニットに達した場合、温度を約38℃に上
昇させ、そして該培養物を、その後12〜14時間で採取し
た。
抽出 全発酵ブロスを約11,000psi圧下、MICROFLUIDIZER M
−110 ホモジナイザー（Microfludics,Inc.）に３回通
過させて、細胞を破砕した。ホモジナイズ処理した懸濁
液の温度が０〜15℃の間を保持するようにホモジナイザ
ーおよび生成物用容器を氷上に維持した。
−110 ホモジナイザー（Microfludics,Inc.）に３回通
過させて、細胞を破砕した。ホモジナイズ処理した懸濁
液の温度が０〜15℃の間を保持するようにホモジナイザ
ーおよび生成物用容器を氷上に維持した。
次いで、発酵ブロスの温度を４℃に低下させ、約１時
間、pH7で振盪した。次いで、該懸濁液を250mlのアリコ
ート中、8,000rpmで65分間、SORVAL 遠心機（RC5Cモデ
ル）のGS−３ヘッドにおいて、４℃で遠心分離した。上
清液をは捨て、抽出したIL−10はペレットに残存した。
得られた封入体の純度は、図１のレーン１において、ド
デシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
（SDS−PAGE）、Laemmli,U.K.、Nature、277:680（197
0）により示す。この工程に従って、封入体を、1cm光路
において、元のブロスの15 OD550に等しい濃度で緩衝液
中に再懸濁した。緩衝液は2.3％ドデシル硫酸ナトリウ
ム（SDS）、10％グリセロール、0.062M Tris−HCl pH6.
8、0.001％フロモフェノールブルー、および５％βメル
カプトエタノール（用時添加）から構成された。次い
で、DAIICHIミニ勾配ゲル（全12ウエル）の各ウエルに1
0μｌを載せた。ゲルを、泳動緩衝液中、35mA/ゲルの定
電流下で泳動した。ブルーの色素がゲルの底に達したら
電流を止め、ゲルをLaemmli、上記に記載されるように
呈色させた。結果を図のレーン１に示す。
間、pH7で振盪した。次いで、該懸濁液を250mlのアリコ
ート中、8,000rpmで65分間、SORVAL 遠心機（RC5Cモデ
ル）のGS−３ヘッドにおいて、４℃で遠心分離した。上
清液をは捨て、抽出したIL−10はペレットに残存した。
得られた封入体の純度は、図１のレーン１において、ド
デシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
（SDS−PAGE）、Laemmli,U.K.、Nature、277:680（197
0）により示す。この工程に従って、封入体を、1cm光路
において、元のブロスの15 OD550に等しい濃度で緩衝液
中に再懸濁した。緩衝液は2.3％ドデシル硫酸ナトリウ
ム（SDS）、10％グリセロール、0.062M Tris−HCl pH6.
8、0.001％フロモフェノールブルー、および５％βメル
カプトエタノール（用時添加）から構成された。次い
で、DAIICHIミニ勾配ゲル（全12ウエル）の各ウエルに1
0μｌを載せた。ゲルを、泳動緩衝液中、35mA/ゲルの定
電流下で泳動した。ブルーの色素がゲルの底に達したら
電流を止め、ゲルをLaemmli、上記に記載されるように
呈色させた。結果を図のレーン１に示す。
実施例２ （本発明の実施態様２） IL−10含有封入体を、以下に示すこと以外は実施例１
に記載したように調製した。実施例１のように発酵ブロ
スをホモジナイズ処理した後、ブロスの温度を４℃に低
下させ、そしてブロスのpHを、85％w:wリン酸を加える
ことにより2.0に低下させた。次いで、酸性にした懸濁
液を約１時間４℃で振盪した。次いで酸性にした懸濁液
を250mlアリコート中、8,000rpmで、65分間、SORVAL
遠心機（RC5Cモデル）のGS−３ヘッドにおいて、４℃で
遠心分離した。上清液は捨て、封入体ペレットを元の発
酵ブロス容量の1/4にTEN緩衝液で再懸濁し、そして緩衝
液のpHを25％NaOH溶液で8.5に上昇させた。得られた懸
濁液をMICROFLUIDIZER M−110 に、３回通過させ、そ
して上記のようにSORVAL遠心機のGS−３ヘッドにおいて
遠心分離した。上清液は捨て、抽出したIL−10はペレッ
ト中に残存した。
に記載したように調製した。実施例１のように発酵ブロ
スをホモジナイズ処理した後、ブロスの温度を４℃に低
下させ、そしてブロスのpHを、85％w:wリン酸を加える
ことにより2.0に低下させた。次いで、酸性にした懸濁
液を約１時間４℃で振盪した。次いで酸性にした懸濁液
を250mlアリコート中、8,000rpmで、65分間、SORVAL
遠心機（RC5Cモデル）のGS−３ヘッドにおいて、４℃で
遠心分離した。上清液は捨て、封入体ペレットを元の発
酵ブロス容量の1/4にTEN緩衝液で再懸濁し、そして緩衝
液のpHを25％NaOH溶液で8.5に上昇させた。得られた懸
濁液をMICROFLUIDIZER M−110 に、３回通過させ、そ
して上記のようにSORVAL遠心機のGS−３ヘッドにおいて
遠心分離した。上清液は捨て、抽出したIL−10はペレッ
ト中に残存した。
得られた封入体の純度を、図のレーン２にSDS−PAGE
により示す。
により示す。
実施例３ （本発明の実施態様２） IL−10含有封入体を、以下に示すこと以外は、実施例
２に記載したように調製した。9N HNO3溶液をリン酸の
代わりに用いて発酵ブロスのpHを2.0に低下させた。
２に記載したように調製した。9N HNO3溶液をリン酸の
代わりに用いて発酵ブロスのpHを2.0に低下させた。
得られた封入体の純度を、図のレーン３にSDS−PAGE
により示す。
により示す。
実施例４ （本発明の実施態様２） IL−10含有封入体を、以下に示すこと以外は、実施例
２に記載したように調製した。9N H2SO4溶液をリン酸の
代わりに用いて発酵ブロスのpHを2.0に低下させた。
２に記載したように調製した。9N H2SO4溶液をリン酸の
代わりに用いて発酵ブロスのpHを2.0に低下させた。
得られた封入体の純度を、図のレーン４にSDS−PAGE
により示す。
により示す。
実施例５ （本発明の実施態様ではない） IL−10含有封入体を、以下に示すこと以外は、ホモジ
ナイズ処理したブロスを酸性にするために85％w/wリン
酸を用いて、実施例２に記載したように調製した。酸性
にした懸濁液を約１時間振盪した後、懸濁液のpHを25％
w/v NaOH溶液で8.5に上昇させた。懸濁液をMICROFLUIDI
ZER M−110 に、３回通過させ、250mlアリコート中、
8,000rpmで、65分間、SORVAL 遠心機（RC5Cモデル）の
GS−３ヘッドにおいて、４℃で遠心分離した。上清液を
捨て、抽出したIL−10はペレットに残存した。
ナイズ処理したブロスを酸性にするために85％w/wリン
酸を用いて、実施例２に記載したように調製した。酸性
にした懸濁液を約１時間振盪した後、懸濁液のpHを25％
w/v NaOH溶液で8.5に上昇させた。懸濁液をMICROFLUIDI
ZER M−110 に、３回通過させ、250mlアリコート中、
8,000rpmで、65分間、SORVAL 遠心機（RC5Cモデル）の
GS−３ヘッドにおいて、４℃で遠心分離した。上清液を
捨て、抽出したIL−10はペレットに残存した。
得られた封入体の純度を、図のレーン５にSDS−PAGE
により示す。
により示す。
実施例６ （実施態様３） IL−10含有封入体を、以下に示すこと以外は、実施例
５に記載したように調製した。9N HNO3溶液を用いて、
発酵ブロスのpHを2.0に低下させた。
５に記載したように調製した。9N HNO3溶液を用いて、
発酵ブロスのpHを2.0に低下させた。
得られた封入体の純度を、図のレーン６にSDS−PAGE
により示す。
により示す。
実施例７ （本発明の実施態様ではない） IL−10含有封入体を以下に示すこと以外は実施例５に
記載したように調製した。9N H2SO4溶液を用いて発酵ブ
ロスのpHを2.0に低下させた。
記載したように調製した。9N H2SO4溶液を用いて発酵ブ
ロスのpHを2.0に低下させた。
得られた封入体の純度を、図のレーン７にSDS−PAGE
により示す。
により示す。
実施例８ （本発明の実施態様ではない） レーン８は、国際特許出願PCT/US94/01909に記載され
たチャイニーズハムスター卵巣から産生され、精製され
たIL−10の純度を示す。その純度は、20μｌのサンプル
をウエルに載せた以外は実施例１に記載されたように図
のSDS−PAGEにより決定した。
たチャイニーズハムスター卵巣から産生され、精製され
たIL−10の純度を示す。その純度は、20μｌのサンプル
をウエルに載せた以外は実施例１に記載されたように図
のSDS−PAGEにより決定した。
実施例９ （本発明の実施態様ではない） レーン９は、図の他のレーンのタンパク質の分子量を
評価するために用いられる高分子量標準マーカーを示
す。
評価するために用いられる高分子量標準マーカーを示
す。
実施例10 （先行技術） IL−10を産生する細菌を、実施例１のように発酵させ
た。発酵が完了した時、発酵ブロスのpHを9N HNO3で2.0
に低下させ、そして１時間振盪した。ブロスのpHを25％
w/v NaOHで8.5に上昇させた。得られた懸濁液をMICROFL
UIDIZER M−110 に３回通し、SORVAL 遠心機のGS−３
ヘッド中において上記のように遠心分離した。上清液は
捨て、抽出したIL−10はペレットに残存した。
た。発酵が完了した時、発酵ブロスのpHを9N HNO3で2.0
に低下させ、そして１時間振盪した。ブロスのpHを25％
w/v NaOHで8.5に上昇させた。得られた懸濁液をMICROFL
UIDIZER M−110 に３回通し、SORVAL 遠心機のGS−３
ヘッド中において上記のように遠心分離した。上清液は
捨て、抽出したIL−10はペレットに残存した。
得られた封入体の純度を、図のレーン10にSDS−PAGE
により示す。
により示す。
実施例11 （先行技術） IL−10含有封入体を以下に示すこと以外は実施例10に
記載したように調製した。9N H2SO4溶液を用いて発酵ブ
ロスのpHを2.0に低下させた。
記載したように調製した。9N H2SO4溶液を用いて発酵ブ
ロスのpHを2.0に低下させた。
得られた封入体の純度を、図のレーン11にSDS−PAGE
により示す。
により示す。
実施例12 （先行技術） IL−10含有封入体を、以下に示すこと以外は実施例10
に記載したように調製した。85％w/wH3PO4を用いて発酵
ブロスのpHを2.0に低下させた。
に記載したように調製した。85％w/wH3PO4を用いて発酵
ブロスのpHを2.0に低下させた。
得られた封入体の純度を、図のレーン12にSDS−PAGE
により示す。
により示す。
結論 図１は、低レベルの不純物（すなわち低レベルの不溶
性の宿主タンパク質）を有する封入体を産生する本発明
の実施態様の驚くべき能力を例示する。第一のレーン
は、本発明の第一の実施態様の方法である実施例１で抽
出したIL−10を含む封入体のSDS−PAGEゲルである。細
菌含有発酵ブロスをホモジナイズ処理および遠心分離を
して、単離した純粋な封入体を産生した。
性の宿主タンパク質）を有する封入体を産生する本発明
の実施態様の驚くべき能力を例示する。第一のレーン
は、本発明の第一の実施態様の方法である実施例１で抽
出したIL−10を含む封入体のSDS−PAGEゲルである。細
菌含有発酵ブロスをホモジナイズ処理および遠心分離を
して、単離した純粋な封入体を産生した。
本発明の第二の実施態様により産生された封入体の純
度を、図１のレーン２、３および４に例示する。レーン
２、３、および４は、それぞれ、実施例２、３および４
（ここでは、ホモジナイズ処理した発酵ブロスを酸性に
し、０〜15℃の間の温度でインキュベートし、遠心分離
して封入体ペレットおよび上清液を産生した）に従って
産生された封入体である。ペレットを緩衝液中に再懸濁
する;pHを8.5に上昇させ、そして懸濁液をホモジナイズ
処理した。次いで、懸濁液を再び遠心分離し、そして封
入体ペレットを単離した。実施例２（レーン２）はリン
酸を用い、実施例３（レーン３）は硝酸を用い、および
実施例４は硫酸を用いてホモジナイズ処理したブロスを
酸性にした。図１に明確に例示するように、本発明の第
二の実施態様のプロセスは、高度な純度を有する封入体
を産生する。
度を、図１のレーン２、３および４に例示する。レーン
２、３、および４は、それぞれ、実施例２、３および４
（ここでは、ホモジナイズ処理した発酵ブロスを酸性に
し、０〜15℃の間の温度でインキュベートし、遠心分離
して封入体ペレットおよび上清液を産生した）に従って
産生された封入体である。ペレットを緩衝液中に再懸濁
する;pHを8.5に上昇させ、そして懸濁液をホモジナイズ
処理した。次いで、懸濁液を再び遠心分離し、そして封
入体ペレットを単離した。実施例２（レーン２）はリン
酸を用い、実施例３（レーン３）は硝酸を用い、および
実施例４は硫酸を用いてホモジナイズ処理したブロスを
酸性にした。図１に明確に例示するように、本発明の第
二の実施態様のプロセスは、高度な純度を有する封入体
を産生する。
レーン６（実施例６のプロセスにより産生された）
は、本発明の第三の実施態様のプロセスに従って産生さ
れた封入体のSDS−PAGEゲルを示す。この実施態様で
は、ホモジナイズ処理された発酵ブロスのpHを硝酸で約
2.0に低下させ、そして約１時間０〜15℃の間の温度で
振盪した。次いで、ブロスのpHを約8.5に上昇させた。
次いで、ブロスを再びホモジナイズ処理し、そして遠心
分離して単離された封入体を産生した。本発明の第三の
実施態様に従って、硝酸のみが純粋な封入体を産生する
のに有効であった。リン酸（実施例５、レーン５）また
は硝酸（実施例７、レーン７）のいずれかが硝酸に置き
換えられる場合、受容し得ない高レベルの不溶性の細菌
宿主タンパク質を含有する封入体が産生された。
は、本発明の第三の実施態様のプロセスに従って産生さ
れた封入体のSDS−PAGEゲルを示す。この実施態様で
は、ホモジナイズ処理された発酵ブロスのpHを硝酸で約
2.0に低下させ、そして約１時間０〜15℃の間の温度で
振盪した。次いで、ブロスのpHを約8.5に上昇させた。
次いで、ブロスを再びホモジナイズ処理し、そして遠心
分離して単離された封入体を産生した。本発明の第三の
実施態様に従って、硝酸のみが純粋な封入体を産生する
のに有効であった。リン酸（実施例５、レーン５）また
は硝酸（実施例７、レーン７）のいずれかが硝酸に置き
換えられる場合、受容し得ない高レベルの不溶性の細菌
宿主タンパク質を含有する封入体が産生された。
レーン８はチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞
により産生されたヒトIL−10のSDS−PAGEである。レー
ン９は高分子量標準のSDS−PAGEゲルである。レーン1
0、11および12は、それぞれ実施例10、11および12に記
載された先行技術の方法に従って産生された封入体のSD
S−PAGEを示し、細菌から異種タンパク質を抽出する先
行技術の方法が本発明のプロセスに従って抽出された封
入体より実質的に高レベルの宿主タンパク質を有する封
入体を産生することを示す。
により産生されたヒトIL−10のSDS−PAGEである。レー
ン９は高分子量標準のSDS−PAGEゲルである。レーン1
0、11および12は、それぞれ実施例10、11および12に記
載された先行技術の方法に従って産生された封入体のSD
S−PAGEを示し、細菌から異種タンパク質を抽出する先
行技術の方法が本発明のプロセスに従って抽出された封
入体より実質的に高レベルの宿主タンパク質を有する封
入体を産生することを示す。
要約すると、本発明の全ての実施態様は、図１のレー
ン１、２、３、４および６により例示されるように純粋
な封入体を産生する。一方、他の方法により産生された
封入体は、受容し得ない高レベルの宿主タンパク質を有
する封入体を生じる。
ン１、２、３、４および６により例示されるように純粋
な封入体を産生する。一方、他の方法により産生された
封入体は、受容し得ない高レベルの宿主タンパク質を有
する封入体を生じる。
本発明は上記の特定の実施態様と関連して記載してき
たが、それらの多くの代替、修飾および変形は当業者に
明かである。全てのこのような、代替、修飾および変形
は本発明の主旨および範囲内にあることが意図され、本
発明は請求の範囲によってのみ限定される。
たが、それらの多くの代替、修飾および変形は当業者に
明かである。全てのこのような、代替、修飾および変形
は本発明の主旨および範囲内にあることが意図され、本
発明は請求の範囲によってのみ限定される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 コンドン， ラッセル アメリカ合衆国 ニュージャージー 08901−2828， ニュー ブランズウィ ック バルドウィン ストリート 33 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 21/00 C12N 15/00
Claims (2)
- 【請求項１】以下の工程を包含する異種タンパク質を発
現する細菌から該異種タンパク質を抽出する方法： （ａ）発酵ブロス中で該細菌を発酵させる工程； （ｂ）該発酵ブロスに含まれる該細菌を破砕する工程； （ｃ）約０〜15℃の間の温度に該発酵ブロスを冷却また
は維持する工程 （ｄ）該発酵ブロスに酸を加えて、該発酵ブロスが約2.
0のpHを得る工程； （ｅ）該酸性にした発酵ブロスを０〜15℃の間の温度で
インキュベートして、あらゆる残存する未破砕細菌を死
滅させる工程； （ｆ）該発酵ブロスを遠心分離して、封入体ペレットお
よび上清液を得る工程； （ｇ）該上清液を該封入体ペレットから除去する工程； （ｈ）緩衝液中に該封入体ペレットを懸濁して、懸濁液
を得る工程； （ｉ）該懸濁液にpH調整溶液を加えて、該懸濁液が６〜
９の間のpHを得る工程； （ｊ）工程（ｉ）の懸濁液中に含まれる懸濁された固形
物を破砕する工程； （ｋ）該懸濁液を遠心分離して、該異種タンパク質を含
有する封入体ペレットおよび上清液を産生する工程；お
よび、 （ｌ）上清液を除去して、異種タンパク質を含有する単
離された封入体を得る工程。 - 【請求項２】以下の工程を本質的に包含する異種タンパ
ク質を発現する細菌から該異種タンパク質を抽出する方
法： （ａ）発酵ブロス中で該細菌を発酵させる工程； （ｂ）該発酵ブロス内に含まれる該細菌を破砕する工
程； （ｃ）該発酵ブロスを約０〜15℃の間の温度に冷却また
は維持する工程； （ｅ）該発酵ブロスに硝酸を加えて、該発酵ブロスが約
2.0のpHを得る工程； （ｆ）該酸性にした発酵ブロスを０〜15℃の間の温度で
インキュベートして、該細菌を死滅させる工程； （ｇ）約8.5に該ブロスのpHを上昇させる工程； （ｈ）該ブロス中に含まれる固形物を破砕し、そして分
散させる工程； （ｉ）該発酵ブロスを遠心分離して、上清液および封入
体を含む封入体ペレットを産生する工程；および、 （ｊ）該上清液を除去して、該異種タンパク質を含有す
る単離された封入体を得る工程。
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