KR100212770B1 - 세균으로부터 이종성의 불용성 단백질의 추출방법 - Google Patents

세균으로부터 이종성의 불용성 단백질의 추출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 발효 브로쓰를 균질화시키고 균질화된 브로쓰를 원심분리하고 봉입체를 함유하는 펠렛으로부터 상층액을 제거함으로써 세균 숙주 단백질의 비가역적 불용성화를 피하면서 불용성 포유동물 단백질을 발현하는 형질전환된 세균으로부터 추출하는 것에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에서 균질화된 브로쓰의 pH를 원심분리전에 2.0으로 조절한다. 이후 산성화된 브로쓰를 원심분리하고 펠렛을 완층액중에 재현탁하고 재균질화시키고 봉입체를 원심분리로 분리한다.

Description

[발명의 명칭]
세균으로부터 이종성인 불용성 단백질의 추출방법
[배경기술]
포유동물 단백질을 코드하는 DNA 서열을 함유하는 벡터로 세균을 형질전환시키는 것은 통상적이다. 세균에 의한 포유동물 단백질의 발현은 세균내의 봉입체에 함유된 단백질을 고생산시킨다. 단백질을 수득하고 정제하기 위해 단백질-함유 봉입체를 세균으로부터 추출해야 한다.
과거에는 봉입체를 발효 브로쓰를 원심분리하고 상층액을 제거하고 세균 펠렛을 완충액중 재현탁시키고 균질화 또는 초음파처리와 같은 기계적인 기술로 세균 세포를 파쇄하거나 대안적으로 리소자임과 세제를 사용하여 파쇄함으로써 분리하였다. 이후 파쇄된 세균을 함유하는 혼합물을 원심분리하여 상층액 및 펠렛화된 봉입체를 수득한다. 봉입체 펠렛은 세균 세포 파쇄와 후속적인 원심분리후 수득되는 봉입체를 함유하는 펠렛이다. 그러나 이 과정은 초기 단계로서 살아있는 세균을 함유하는 발효 브로쓰의 원심분리를 포함한다. 종종, 대규모의 원심분리동안 살아있는 세균이 원심분리에 의해 방출되는 에러로졸내 주위 대기내로 방출될 수 있다.
미국 특허 제4,958,007호는 이 문제를 톨루엔 또는 산을 발효 브로쓰에 첨가함으로써 세포를 우선 불활성시킴으로써 해결하였다. 이후 브로쓰를 원심분리하고, 상층액을 제거하고 세균 펠렛을 완충액중 재현탁시키고 현탁액의 pH를 최종 pH가 6 내지 9가 되도록 조절한다. 대안적으로, 산성화된 발효 브로쓰의 pH를 6 내지 9로 조절한다. 세균 세포를 균질화로 파쇄시켜 세균으로부터 봉입체를 방출시킨다. 이 과정은 살아있는 세균가 원심분리동안 대기내로 방출되는 것을 방지한다. 그러나, 톨루엔이 세균을 불활성화시키기 위해 사용되는 경우, 본 과정은 톨루엔이 인화성이고 이의 증기가 폭발성이기 때문에 폭발방지실에서 수행되어야 한다. 또한, 산이 세균을 불활성화시키기 위해 사용되고 세균 펠렛을 완충액중 재현탁시키고 현탁액의 pH를 최종 pH가 6 내지 9가 되도록 조절하는 경우, 가용성 세균 단백질을 미리 불용화시켜야 예상외로 높은 수준의 세균 숙주 단백질을 함유하는 봉입체 펠렛을 생성한다.
그러므로, 모든 또는 대부분의 세균이 원심분리에 앞서 사멸되고 대부분의 숙주 세균 단백질이 용액중 잔류하고 주된 불용성 단백질이 세균이 발현한 이종성 단백질인 불용성의 재조합 단백질을 추출하는 개선된 방법이 필요하였다.
[발명의 요약]
본 발명은 발효 브로쓰중에 존재하는 이종성 단백질 발현 세균을 파쇄한 후 산 처리로 세균을 임의로 불활성화시킴으로써 이 필요성을 만족시킨다. 이후 살아있는 세균의 방출없이 원심분리를 수행할 수 있다. 이 세균 파쇄는 살아있는 세균의 수를 상당히 저하시키고 동시에 살아있는 세균을 함유하는 브로쓰의 방출을 최소화시키거나 방지시키는 밀폐 시스템중에서 수행할 수 있다. 본 발명의 방법은 순도가 증가된 이종성 단백질을 함유하는 봉입체, 즉 당업계 기술의 추출 방법에 의해 생성되는 것보다 불용화된 세균 단백질의 수준이 더욱 낮은 봉입체를 생성한다.
본 발명은 이종성 단백질을 발현하는 세균으로부터 이종성 단백질을 함유하는 봉입체를 추출하는 3가지 방법을 제공한다.
제1양태는 (a)발효 브로쓰중 이종성인 불용성 단백질을 발현하는 세균을 발효시키는 단계; (b)발효 브로쓰내에 함유된 세균을 파쇄시키는 단계; (c)발효 브로쓰를 원심분리하여 봉입체 펠렛 및 상층액을 수득하는 단계; 및 (d) 상층액을 제거하여 봉입체 펠렛을 수득하는 단계를 포함한다.
제2양태는 (a)발효 브로쓰중 이종성인 불용성 단백질을 발현하는 세균을 발효시키는 단계; (b)발효 브로쓰내에 함유된 세균을 파쇄시키는 단계; (c)0 내지 15의 온도에서 발효 브로쓰를 냉각시키거나 유지시키는 단계; (d)균질화된 발효 브로쓰에 산을 첨가하여 발효 브로쓰의 pH가 약 2.0이 되도록 하는 단계; (e)산성화된 발효 브로쓰를 0 내지 15의 온도에서 인큐베이션하여 임의의 잔류하는 파쇄되지 않은 세균을 사멸하는 단계; (f)발효 브로쓰를 원심분리하여 봉입체 펠렛 및 상층액을 수득하는 단계; (g)상층액을 봉입체 펠렛으로부터 제거하는 단계; (h)봉입체 펠렛을 완충액중에 현탁시켜 현탁액을 수득하는 단계; (i) pH 조절용액을 현탁액에 첨가하여 현탁액의 pH가 6 내지 9가 되도록 하는 단계; (j)단계(i)의 현탁액내에 함유된 현탁된 고체를 파쇄하는 단계; (k)현탁액을 원심분리하여 이종성 단백질을 함유하는 봉입체 펠렛 및 상층액을 생성하는 단계; 및 (1)상층액을 제거하여 이종성 단백질을 함유하는 분리된 봉입체 펠렛을 수득하는 단계를 포함한다.
제3양태는 (a)발효 브로쓰중 이종성인 불용성 단백질을 발현하는 세균을 발효시키는 단계; (b)발효 브로쓰내에 함유된 세균을 파쇄시키는 단계; (c)0 내지 15의 온도에서 발효 브로쓰를 냉각시키거나 유지시키는 단계; (d)발효 브로쓰에 질산을 첨가하여 발효 브로쓰의 pH가 약 2.0이 되도록하는 단계; (e)산성화된 발효 브로쓰를 0 내지 15의 온도에서 인큐베이션하여 세균을 사멸시키는 단계; (f)발효 브로쓰의 pH를 8.5로 상승시키는 단계; (g)브로쓰를 파쇄하는 단계; (h)파쇄된 브로쓰를 원심분리하여 봉입체의 봉입체 펠렛 및 상층액을 생성하는 단계; (i)상층액을 제거하여 이종성 단백질을 함유하는 분리된 봉입체 펠렛을 수득하는 단계를 포함한다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 본 발명의 방법에 의해 생성된 봉입체 및 본 발명이외의 방법에 의해 생성된 봉입체의 SDS-PAGE 겔을 도시한다.
[발명의 상세한 설명]
본원에서 인용된 모든 미국 특허가 참조문헌으로 본원에 삽입된다.
본 발명은 유전공학적으로 형질전화된 세균, 특히 이.콜라이에 의해 생성되는 불용성, 비세균성 단백질, 특히 포유동물 단백질을 추출하는 방법을 제공한다. 세균에서 발현되는 비세균성 단백질은 이종성 단백질로 언급된다. 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 형질전환된 세균은 이종성 단백질을 생산하도록 유전공학적으로 조작된 세균을 의미한다. 이러한 유전공학적 조작은 통상적으로 세균내로 발현 벡터를 삽입하는 것을 포함한다. 발현 벡터는 자가복제가 가능하고 세균 게놈중의 유전자에 비례하여 단백질 발현이 가능하다. 목적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 공지되어 있거나 기타 입수가능하다면 세균 발현 벡터의 작제는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어 문헌[참조: DeBoer., 미국 특허 제4,551,433호]은 세균 발현 벡터중 사용하기 위한 프로모터를 기술하고 있고; 문헌[참조: Goeddel et al., 미국 특허 제4,601,980호 및 Riggs, 미국 특허 제4,431,739호]는 이.콜라이 발현 시스템에 의한 포유동물 단백질의 생산을 기술하고 있고; 문헌[참조:Riggs 상기 참조, Ferretti et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 599 (1986), Sproat et al., Nucleic Acid Research 13: 2959 (1985) and Mullenbach et al., J. Biol. Chem 261: 719 (1986)]은 세균중 발현을 위한 합성 유전자를 작제하는 방법을 기술하고 있다. 많은 세균 발현 벡터가 시판되고 있고 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)(Rockville, Maryland)을 통해 입수가능하다.
이후 발현 벡터로 형질전환된 세균을 세균 배지중에서 이종성 단백질이 발현되도록 자극하는 조건하에서 성장시킨다. 형질전환된 세균을 함유하는 이 세균 배지를 발효 브로쓰로 부른다.
본 발명의 제1 양태에서, 이종성 단백질을 발현하는 형질전환된 세균, 바람직하게 형질전환된 이.콜라이 균주를 0 내지 25의 온도에서 표준 기술로 발효 브로쓰를 초음파처리하거나 균질화시킴으로써 파쇄시킨다. 일반적으로 전체 발효 브로쓰의 초음파처리 또는 균질화를 본질적으로 모든 세포가 파괴될 때까지 수행하여야 한다. 이는 후속적인 원심분리에 의한 가용성 단백질 및 봉입체로부터의 소 세포 단편을 제거시켜; 단백질의 최종 순도를 최대화시킨다.
초음파처리는 일반적으로 발효 브로쓰의 분석(10 내지 20ml) 규모로 함유하는 세균의 파쇄를 위해 사용된다. 더 큰 규모에서는 고압 균질화가 사용되어야 한다. 1/8 인치(3.2mm)의 끝이 가는 마이크로팁을 갖춘 Ultrasonic Processer Model No. W-85 (Heat-System-Ultrasonic, Inc.로부터 구입)을 사용하는 발효 브로쓰의 분석 용적(10 내지 20ml)에 있어서, 10ml 전체 브로쓰에 대해 50사용률, 1초 펄스에서 18분의 총 초음파 처리 시간(9분의 네트 초음파 처리)이 바람직하다.
균질화를 세균을 파쇄하기 위해 사용하는 경우, 발효 브로쓰를 수회 통과시키는 것이 바람직하다. 11,000파운드/평방인치(psi)의 MICROFLUIDIZER(Microfluidics M-110)을 통해 발효 브로쓰를 3회 통과시키는 것이 적합한 것으로 관찰되었다. MICROFLUIDIZER를 사용하는 초음파처리 또는 균질화 동안, 살아있는 세균을 방출하는 것이 방지되도록 시스템을 밀폐시키는 것이 바람직하다. 대규모 균질화기는 종종 밀폐된 시스템중에 장치된다.
초음파처리된 또는 균질화된 발효 브로쓰를 원심분리하여 봉입체를 함유하는 펠렛 및 상층액을 생성한다. 원심분리의 속도는 대부분의 봉입체가 침강하기에 충분하나 현탁액중 세포 단편의 대부분이 상층액중에 유지되기에 충분히 낮은 속도이어야 한다. 일반적으로 원심분리 속도는 약 10분정도동안 EPPENDORF미세원심분리 모델 번호 5402중 원추형 미세원심분리 튜브를 사용하여 5000 내지 10,000rpm, 바람직하게는 7000 내지 10,000rpm이어야 한다. 상층액을 제거하여 이종성 단백질을 함유하는 봉입체를 수득한다.
본 발명의 제2양태에서, 발효 브로쓰중 세균을 파쇄한 후, 브로쓰의 온도를 0 내지 15로 감소시킨다. 이후 0 내지 15온도에서 발효 브로쓰의 pH를 황산, 인산, 질산 또는 염산을 사용하여 약 2.0으로 저하시킨 후, 브로쓰를 임의의 잔류하는 세균을 죽이는 온도에서 통상적으로 약 1시간 동안 인큐베이션시킨다. 이는 단순한 균질화가 모든 세균을 죽이지 않기 때문에 중요하다. 바람직하게는 pH를 저하시키기 위해 사용되는 산이 인산 또는 질산이다. 이후 발효 브로쓰를 상술한 바와 같이 원심분리하고 상층액을 봉입체 펠렛을 분리하기 위해 제거한다. 봉입체 펠렛을 완충액중 재현탁시킨다. 펠렛을 재현탁시키기 위해 사용가능한 완충액의 예는 인산나트륨, 인산칼륨 및 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 하이드로클로라이드(TRIS)이다. 바람직한 완충액은 50mM TRIS, 5mM EDTA 및 50mM NaCl pH8.5(TEN 완충액)을 포함한다. 생성되는 현탁액의 최종 pH를 적합안 염기로 약 6.0 내지 약 9.0, 바람직하게는 8.5로 조절한다. pH 조절 단계에서 사용될 수 있는 적합한 염기의 예는 수산화나트륨, 수산화칼륨 등이다. pH를 상승시키기 위한 바람직한 염기 용액은 25w/v의 NaOH 용액이다.
이후 pH 조절된 용액을 재파쇄시켜 초음파처리 또는 균질화로 현탁액중 존재하는 고체를 분산시키고 후속적으로 원심분리한다. 최종적으로, 가용성 숙주 세균 단백질 및 세균 잔여물을 함유하는 상층액을 제거하고 불용성 포유동물 단백질을 함유하는 펠렛을 회수한다. 필요한 경우, 펠렛을 바람직하게 pH 약 8.5의 완충액으로 1회 또는 2회 세척할 수 있다. 산을 0 내지 15에서 첨가하는 것이 필수적이다. 모든 기타 추출작용은 0 내지 32에서 수행할 수 있다.
본 발명의 제3양태에서, 이종성인 불용성 단백질을 발현하는 세균을 발효 브로쓰중에서 발현시킨다. 발현 브로쓰중 세균을 상술한 바와 같이 초음파처리 또는 균질화시켜 파쇄시킨다. 이후 발효 브로쓰의 온도를 0 내지 15로 저하시키고 질산을 발효 브로쓰에 첨가하여 브로쓰의 pH를 약 2.0으로 저하시킨다. 이후 발효 브로쓰를 임의의 잔류하는 세균을 죽이기에 필요한만큼 긴 시간, 통상적으로 약 1시간 동안 0 내지 15에서 인큐베이션한다.
이후, 발효 브로쓰의 pH를 약 8.5로 상승시키고 임의의 잔류하는 세균을 포함하는 현탁된 고체를 균질화 또는 초음파처리로 재파쇄시킨다. 두 번째 파쇄후, 브로쓰를 원심분리시켜 상층액 및 봉입체 펠렛을 생성한다. 이후 상층액을 제거하여 불용성인 이종성 단백질을 함유하는 분리된 봉입체를 수득한다.
대규모 작업에서, 산 사멸 과정이 용이하게 세균을 본질적으로 100죽이기 때문에 실험 2 및 3의 산을 사용한 사멸 과정이 바람직하다. 이러한 목적을 달성하기 위해 필요한 다수의 균질화 방법으로 인해 균질화만을 사용하여 세균을 100죽이는 것이 비용면에서 효과적이지 않다.
봉입체를 분리한 후, 이종성 단백질을 폴딩되지 않게 한 후 재폴딩시키고 표준 생화학적 방법을 사용하여 정제시킨다[참조: Protein Purification, Deutscher et al., Ed. Academic Press, San Diego, CA, 1990].
하기 실시예는 본 발명을 상세히 설명한다. 당업자에게 물질의 변형 및 방법은 본 명세서의 목적 및 내용으로부터 벗어나지 않고 실행할 수 있음이 분명하다.
본 발명은 하기, 비제한적 실시예로 예시될 수 있다. 기타 구체적인 지적이 없는 경우, 고체 혼합물중 고체, 액체중 액체 및 액체중 고체에 대해 하기 주어진 퍼센트는 각각 wt/wt, vol/vol 및 wt/vol이다.
[실시예]
[실시예 1]
[본 발명의 제1양태]
본 실시예에서 사용된 사람 IL-10 발현 플라즈미드는 (a)사람 IL-10 코딩 영역의 뉴클레오타이드 서열[참조: Viera, P., et al., Proc. Natl. Sci. USA, 88: 1172(1991)]; (b)tac 프로모터,IL-10 코딩 영역의 뉴클레오타이드 서열의 5'-말단에 융합된 3'-말단[참조: Zurawski et al., J. Immunol., 137: 3554(1986)]; (c)rhIL-10 코딩 영역의 하단에 존재하는 전사 터미네이터를 포함하는 lpp 3' 코딩 및 비코딩 영역[참조: Ghrayeb, J. et al., EMBO, J., 3: 2437 (1984)]; (d)pBR322로부터의 테트라사이클린 내성 유전자[참조: Sutcliff, J. G., C. S. H. Sypmp. Quant. Biol. 135: 612 (1978)]; 및 (e)복제의 copTS열 유도 기원[참조: Hakkaart, M. J. J., et al., Mol. Gen. Genet. 183: 326 (1981) 및 Andreoli, P. M., et al., J. Bacteriol. 135: 612 (1978)]의 서열을 포함한다.
[발효]
상술한 플라즈미드를 갖는 이.콜라이 균주 K12의 배양물을 수성 발효 배지중에서 통기하에서 교반하면서 배양한다. 배지 1리터는 카사미노산(Difco) 30g, 효모 추출물(Difco) 20g, 인산이수소칼륨 5g, 글라이세롤 20g, MgSO4lg 및 테트라사이클린(Sigma) 10mg을 함유한다. pH를 25w/v NaOH로 7.0으로 조절하고 용해된 산소를 5psi 압력하에서 공기에 대하여 30 내지 100포화시켜 유지한다. 온도를 초기에 30로 조절한다. 배양물의 탁도가 54번 글린 필터를 갖는 클렛트 섬머선(Klett Summerson) 비색계로 측정되는 100 클렛트 단위에 도달하는 경우, 온도를 약 38로 상승시키고 배양물을 이후 12 내지 14시간 후 수확한다.
[추출]
전체 발효 브로쓰를 약 11,000psi 압력하에서 MICROFLUIDIZER M-110균질화기(Microfludics, Inc.)를 통해 3회 통과시켜 세포를 파쇄시킨다. 균질화기 및 생성물 용기를 얼음위에 두고 균질화된 현탁액의 온도를 0-15로 유지시킨다.
이후 발효 브로쓰의 온도를 4로 감소시키고 pH 7에서 약 1시간 동안 진탕시킨다. 이후 현탁액을 4에서 SORVAL 550 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 10글라이세롤, 0.062M 트리스-HCI pH6.8, 0.001브로모페놀 블루 및 5 -머캅토에탄올(신선하게 첨가됨)으로 이루어진다. 이후 10를 DAⅡCHⅠ미니 구배 겔(총 12개의 웰)중 각각의 웰에 로딩시킨다. 겔을 일정한 전류, 35mA/겔으로 전개 완충액중에서 전개시킨다. 겔의 바닥에 블루 염료가 도달하면 전류를 멈추고 겔을 상술한 라엠밀리의 방법에서와 같이 전개시킨다. 결과를 제1도의 레인1에서 나타낸다.
[실시예 2]
[본 발명의 제2양태]
IL-10 함유 봉입체를 하기를 제외하고는 실시예 1에서 서술된 바와 같이 제조한다. 발효 브로쓰를 실시예 1에서와 같이 균질화시킨 후, 브로쓰의 온도를 4로 감소시키고 브로쓰의 pH를 85w/w 인산을 첨가함으로써 2.0으로 저하시킨다. 이후 산성화된 현탁액을 4에서 약 1시간 동안 진탕시킨다. 이후 산성화된 현탁액을 4에서 SORVAL원심분리기(모델 RC5C)의 GS-3 해드에서 65분동안 8,000rpm에서 250ml 분취량으로 원심분리시킨다. 상층액을 버리고 봉입체 펠렛을 TEN 완충액을 갖는 원 발효 브로쓰 용적의 1/4에 재현탁시키고 완충액의 pH를 25NaOH 용액으로 8.5로 상승시킨다. 생성되는 현탁액을 MICROFLUIDIZER M-110을 통해 3회 통과시키고 상술한 바와 같이 SORVAL
생성되는 봉입체의 순도를 도면의 레인 2에서 SDS-PAGE로 나타낸다.
[실시예 3]
[본 발명의 제2양태]
IL-10 함유 봉입체를 하기를 제외하고는 실시예 2에서 서술된 바와 같이 제조한다. 9N HNO3용액을 인산 대신에 사용하여 발효 브로쓰의 pH를 2.0으로 감소시킨다.
생성되는 봉입체의 순도를 도면의 레인 3에서 SDS-PAGE로 나타낸다.
[실시예 4]
[본 발명의 제2양태]
IL-10 함유 봉입체를 하기를 제외하고는 실시예 2에서 서술된 바와 같이 제조한다. 9N H2SO4용액을 인산 대신에 사용하여 발효 브로쓰의 pH를 2.0으로 감소시킨다.
생성되는 봉입체의 순도를 도면의 레인 4에서 SDS-PAGE로 나타낸다.
[실시예 5]
[본 발명의 양태가 아님]
IL-10 함유 봉입체를 하기를 제외하고는 85w/w 인산을 사용하는 실시예 2에서와 같이 제조하고 균질활된 브로쓰를 산성화시킨다. 산성화된 현탁액을 1시간 동안 진탕시킨 후, 현탁액의 pH를 25w/v NaOH 용액으로 8.5로 상승시킨다. 현탁액을 MICROFLUIDIZER M-110을 통해 3회 통과시키고 4에서 SORVAL 원심분리기(모델 RC5C)의 GS-3 해드에서 65분동안 8,000rpm에서 250ml 분취량으로 원심분리한다. 상층액을 버리고 추출된 IL-10은 펠렛중 남는다.
생성되는 봉입체의 순도를 도면의 레인 5에서 SDS-PAGE로 나타낸다.
[실시예 6]
[제3양태]
IL-10 함유 봉입체를 하기를 제외하고는 실시예 5에서 서술된 바와 같이 제조한다. 9N HNO3용액을 사용하여 발효 브로쓰의 pH를 2.0으로 감소시킨다.
생성되는 봉입체의 순도를 도면의 레인 6에서 SDS-PAGE로 나타낸다.
[실시예 7]
[본 발명의 양태가 아님]
IL-10 함유 봉입체를 하기를 제외하고는 실시예 5에서 서술된 바와 같이 제조한다. 9N H2SO4용액을 사용하여 발효 브로쓰의 pH를 2.0으로 감소시킨다.
생성되는 봉입체의 순도를 SDS-PAGE로 도면의 레인 7에서 나타낸다.
[실시예 8]
[본 발명의 양태가 아님]
레인 8은 생성된 IL-10의 순도를 나타내고 국제출원번호 PCT/US94/01909에서 서술된 중국산 햄스터 난소세포로부터 정제한다. 순도를 20샘플을 각 웰에 로딩하는 것을 제외하고 실시예 1에서 서술된 바와 같이 도면의 SDS-PAGE로 측정한다.
[실시예 9]
[본 발명의 양태가 아님]
레인 9는 도면의 다른 레인중의 단백질의 분자량을 측정하기 위해 사용된 고분자량 표준 마커를 나타낸다.
[실시예 10]
[선행기술]
IL-10을 생성하는 세균을 실시예 1에서와 같이 발효시킨다. 발효가 완료된 경우, 발효 브로쓰의 pH를 9N HNO3로2.0으로 감소시키고 1시간 동안 교반한다. 브로쓰의 pH를 25w/v NaOH로 8.5로 상승시킨다. 생성되는 현탁액을 상술한 바와 같이 MICROFLUIDIZER M-110을 통해 3회 통과시키고 SORVAL
생성되는 봉입체의 순도를 도면의 레인 10에서 SDS-PAGE로 나타낸다.
[실시예 11]
[선행기술]
IL-10 함유 봉입체를 하기를 제외하고는 실시예 10에서 서술된 바와 같이 제조한다. 9N H2SO4용액을 사용하여 발효 브로쓰의 pH를 2.0으로 감소시킨다.
생성되는 봉입체의 순도를 도면의 레인 11에서 SDS-PAGE로 나타낸다.
[실시예 12]
[선행기술]
IL-10 함유 봉입체를 하기를 제외하고는 실시예 10에서 서술된 바와 같이 제조한다. 85w/w H3PO4용액을 사용하여 발효 브로쓰의 pH를 2.0으로 감소시킨다.
생성되는 봉입체의 순도를 도면의 레인 12에서 SDS-PAGE로 나타낸다.
[결론]
제1도는 매우 낮은 수준의 불순물, 예를 들어 낮은 수준의 불용성 숙주 단백질을 갖는 봉입체를 생산하는 본 발명의 양태의 놀라운 효과를 나타낸다. 레인1은 본 발명의 제1실시양태의 방법인 실시예 1 동안 추출된 IL-10을 함유하는 봉입체의 SDS-PAGE 겔이다. 세균을 함유하는 발효 브로쓰를 균질화시키고 원심분리시켜 분리된, 깨끗한 봉입체를 생성한다.
본 발명의 제2의 양태에 의해 생성된 봉입체의 순도를 제1도의 레인 2, 3 및 4에서 나타낸다. 레인 2, 3 및 4는 각각 균질화된 발효 브로쓰를 산성화시키고 0 내지 15의 온도에서 인큐베이션하고 원심분리하여 봉입체 펠렛 및 상층액을 생산하는 실시예 2, 3 및 4에 따라 생성된 봉입체이다. 펠렛을 완충액중 재현탁시키고; pH를 8.5로 상승시키고 현탁액을 균질화시킨다. 현탁액을 이후 재원심분리하고 봉입체 펠렛을 분리한다. 균질화된 브로쓰를 산성화시키기 위해 실시예 2(레인 2)는 인산을 사용하고, 실시예 3(레인 3)은 질산을 사용하고, 실시예 4는 황산을 사용한다. 제1도에서 분명히 예시된 바와 같이 본 발명의 제2실시양태의 방법은 고 순도의 봉입체를 생산한다.
실시예 6의 방법에 의해 생산된 레인 6은 본 발명의 제3양태의 방법에 따라 생성된 봉입체의 SDS-PAGE 겔을 나타낸다. 이 양태에서, 균질화된 발효 브로쓰의 pH를 질산으로 약 2.0으로 저하시키고 0 내지 15의 온도에서 약 1시간 동안 교반한다. 이후 브로쓰의 pH를 약 8.5로 상승시킨다. 이후 브로쓰를 재균질화시키고 원심분리하여 분리된 봉입체를 생성시킨다. 본 발명의 제3양태에 따라, 단지 질산만이 깨끗한 봉입체를 생성하는데 효과적이다. 인산(실시예 5, 레인 5) 또는 황산(실시예 7, 레인 7)을 질산대신 치환시키면 예상치않게 높은 수준의 불용성 세균 숙주 단백질을 함유하는 봉입체를 생산하였다.
레인 8은 중국산 햄스터 난소(CHO) 세포에 의해 생성되는 사람 IL-10의 SDS-PAGE 겔이다. 레인 9은 고분자량 표준의 SDS-PAGE 겔이다. 레인 10, 11 및 12는 각각 실시예 10, 11 및 12에서 서술된 바와 같은 선행기술에 따라 생성된 봉입체의 SDS-PAGE 겔로서 세균으로부터 이종성 단백질을 추출하는 선생 기술의 방법이 본 발명의 방법에 따라 추출된 봉입체보다 실질적으로 높은 수준의 숙주 단백질을 갖는 봉입체를 생산한다는 것을 보여준다.
요약하면, 본 발명의 모든 양태는 제1도의 레인 1, 2, 3, 4 및 6에 의해 예시된 바와 같은 깨끗한 봉입체를 생성하는 반면, 기타 방법에 의해 생성되는 봉입체는 예상치않게 높은 수준의 숙주 단백질을 갖는 봉입체를 생성한다.
본 발명은 상술된 특이적 실시양태로 서술되었지만 많은 변이, 변형 및 변화가 당업자에게는 가능하다. 모든 이러한 변이, 변형 및 변화는 본 발명의 기술적 사상 및 영역내에 속하며 청구의 범위에 의해서만 제한될 뿐이다.

Claims (2)

  1. (a) 발효 브로쓰에서 이종성 단백질을 발현하는 세균을 발효시키는 단계; (b) 발효 브로쓰내에 함유된 세균을 파쇄시키는 단계; (c) 0 내지 15의 온도에서 발효 브로쓰를 냉각시키거나 유지시키는 단계; (d) 발효 브로쓰에 산을 첨가하여 발효 브로쓰의 pH가 약 2.0이 되도록 하는 단계; (e)산성화된 발효 브로쓰를 0 내지 15의 온도에서 인큐베이션하여 잔류하는 파쇄되지 않은 세균을 사멸하는 단계; (f) 발효 브로쓰를 원심분리하여 봉입체 펠렛 및 상층액을 수득하는 단계; (g) 상층액을 봉입체 펠렛으로부터 제거하는 단계; (h) 봉입체 펠렛을 완충액중에 현탁시켜 현탁액을 수득하는 단계; (i) pH 조절용액을 현탁액에 첨가하여 현탁액의 pH가 6 내지 9가 되도록 하는 단계; (j ) 단계(i)의 현탁액내에 함유된 현탁된 고체를 파쇄하는 단계; (k) 현탁액을 원심분리하여 이종성 단백질을 함유하는 봉입체 펠렛 및 상층액을 생성하는 단계; 및 (1)상층액을 제거하여 이종성 단백질을 함유하는 분리된 봉입체를 수득하는 단계를 포함하여, 이종성 단백질을 발현하는 세균으로부터 이종성 단백질을 추출하는 방법.
  2. (a) 발효 브로쓰에서 이종성 단백질을 발현하는 세균을 발효시키는 단계; (b) 발효 브로쓰내에 함유된 세균을 파쇄시키는 단계; (c) 약 0 내지 15의 온도에서 발효 브로쓰를 냉각시키거나 유지시키는 단계; (d) 발효 브로쓰에 질산을 첨가하여 발효 브로쓰의 pH가 약 2.0이 되도록 하는 단계; (e) 산성화된 발효 브로쓰를 0 내지 15의 온도에서 인큐베이션하여 세균을 사멸하는 단계; (f) 발효 브로쓰의 pH를 8.5로 상승시키는 단계; (g) 브로쓰내에 함유된 고체를 파쇄하고 분산시키는 단계; (h) 발효 브로쓰를 원심분리하여 봉입체를 함유하는 봉입체 펠렛 및 상층액을 생성하는 단계; 및 (i) 상층액을 제거하여 이종성 단백질을 함유하는 분리된 봉입체를 수득하는 단계를 필수적으로 포함하여, 이종성 단백질을 발현하는 세균으로부터 이종성 단백질을 추출하는 방법.
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