HUT76377A - Extraction of heterologous insoluble proteins from bacteria - Google Patents
Extraction of heterologous insoluble proteins from bacteria Download PDFInfo
- Publication number
- HUT76377A HUT76377A HU9603539A HU9603539A HUT76377A HU T76377 A HUT76377 A HU T76377A HU 9603539 A HU9603539 A HU 9603539A HU 9603539 A HU9603539 A HU 9603539A HU T76377 A HUT76377 A HU T76377A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- fermentation broth
- bacteria
- heterologous
- suspension
- heterologous protein
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5428—IL-10
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/948—Microorganisms using viruses or cell lines
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/82—Proteins from microorganisms
- Y10S530/825—Bacteria
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Electric Ovens (AREA)
Description
Nemzetközi Szabadalmi Iroda
H-l062 Budapest, Andrássy út 113. ('
Telefon: 34-24-950, Fax: 34-24-323 . (_A
Heterológ oldhatatlan proteinek kivonása baktériumokból
SCHERING CORPORATION, KENILWORTH, NJ, US
Feltalálók:
ALROY Yair, ZHU Jingdong, CONDON Russell,
PARSIPPANY, NJ, US WESTflELD, NJ, US NEW BRUNSWICK, NJ, US
A bejelentés napja: 1995.06.19.
Elsőbbsége: 1994.06.22., 08/263,961 US
A nemzetközi bejelentés száma: PCT/US95/07129
A nemzetközi közzététel száma: WO 95/35368
A találmány tárgya eljárás heterológ proteinek baktériumokból való kivonására.
A baktériumoknak emlős proteineket kódoló DNS-szekvenciákat tartalmazó vektorokkal történő transzformálása mára mindennapos gyakorlattá vált. Az emlős proteinek baktériumok által való kifejezése nagy termelékenységgel eredményezheti a proteineket, amelyek a baktériumokban lévő zárványtestek belsejében helyezkednek el. A protein kinyeréséhez és tisztításához a proteint tartalmazó zárványtesteket ki kell vonni a baktériumokból .
A korábbi eljárások szerint a zárványtesteket úgy izolálták, hogy a fermentlét centrifugálták, a felülúszó folyadékot eltávolították, a bakteriális üledéket pufferban szuszpendál·ták, majd mechanikus módszerekkel, például homogenizálással vagy ultrahangos kezeléssel, illetve alternatív módon lizozim és felületaktív anyagok alkalmazásával elroncsolták a bakteriális sejteket. Az elroncsolt sejteket tartalmazó keveréket ezt követően centrifugálták, és így egy felülúszó folyadékot és üledékként zárványtesteket nyertek. A zárványtest-üledék tartalmazza a bakteriális sejtek elroncsolása és az ezt követő centrifugálás után nyert zárványtesteket. Ennek az eljárásnak a kezdeti lépése egy élő baktériumokat tartalmazó fermentlé centrifugálása. A nagy mennyiségekkel végzett centrifugálás során a centrifugálás eredményeként kijutó aeroszolban gyakran élő baktériumok kerülhettek a külső környezetbe.
A 4 958 007 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás egy olyan megoldást kínál a probléma megoldására, amelynek során először toluolt vagy savat adnak a fermentléhez. A fermentlét ezután centrifugálják, a felülúszó folyadékot eltávolítják, a bakteriális üledéket egy pufferban szuszpendálják, majd a szuszpenzió pH-ját 6-9 közötti végső pH-értékre állítják be. Alternatív módon a megsavanyított fermentlé pH-ját állítják be 6 és 9 közötti értékre. Ezt követően a bakteriális sejteket homogenizálással elroncsolva felszabadítják a sejtekből a zárványtesteket. Ez az eljárás kizárja annak a lehetőségét, hogy a centrifugálás során élő baktériumok kerülhessenek a külső környezetbe. Ugyanakkor viszont, ha toluolt alkalmaznak a baktóriumok inaktiválására, az eljárást robbanásbiztos helyiségben kell végrehajtani, mivel a toluol gyúlékony, és gőzei robbanásveszélyesek. Másrészt, ha savat használnak a baktériumok inaktiválásához, majd a bakteriális üledéket pufferban szuszpendálják, és a szuszpenzió pH-ját 6-9 közötti végső pH-értékre állítják be, a korábban oldható bakteriális proteinek oldhatatlanná válnak, és így olyan zárványtest-üledékeket nyernek, amelyek elfogadhatatlanul nagy mennyiségben tartalmaznak bakteriális gazdaproteineket.
Jelentős igény van tehát az oldhatatlan, rekombináns proteineknek egy olyan javított kivonási eljárására, amelynek során a centrifugálás előtt az összes vagy a legtöbb baktériumot elpusztítjuk, a gazda bakteriális proteinek legtöbbje oldatban marad, és a túlsúlyban lévő oldhatatlan protein a bakteriálisán kifejezett heterológ protein.
Ennek az igénynek tesz eleget a jelen találmány szerinti megoldás, amelynek során a heterológ proteint kifejező baktériumokat akkor roncsoljuk el, amikor a baktériumok még a fermentlében vannak jelen, majd adott esetben savas kezeléssel inaktiváljuk a baktériumokat. Ezt követően élő baktériumok kibocsátása nélkül hajthatjuk végre a centrifugálást. A bakteriális roncsolás lényegesen csökkenti az életképes baktériumok számát, ugyanakkor a roncsolás zárt rendszerben végezhető, amelynek eredményeként minimálisra csökkenthető vagy megakadályozható az élő baktériumokat tartalmazó fermentlé szabaddá válása. A találmány szerinti eljárások eredményeként fokozott tisztaságú heterológ proteint tartalmazó zárványtesteket nyerünk, azaz olyan zárványtesteket, amelyek a technika állása szerinti kivonási eljárások útján előállított zárványtestekben levőnél kisebb mennyiségekben tartalmaznak oldhatatlan bakteriális proteint .
A jelen találmány három eljárást kínál a heterológ proteint tartalmazó zárványtesteknek a heterológ proteint kifejező baktériumokból való kivonására.
Az első megoldásnak megfelelő eljárás a következő lépésekből áll:
(a) heterológ oldhatatlan proteint kifejező baktériumokat fermentlében fermentálunk;
(b) a fermentlében lévő baktériumokat elroncsoljuk;
(c) a fermentlét centrifugáljuk, és így zárványtest-üledéket és egy felülúszó folyadékot nyerünk; és (d) a felülúszó folyadékot eltávolítva egy zárványtest-üledékhez jutunk.
A második megoldásnak megfelelő eljárás a következő lépésekből áll:
(a) heterológ oldhatatlan proteint kifejező baktériumokat fermentlében fermentálunk;
(b) a fermentlében lévő baktériumokat elroncsoljuk;
(c) a fermentlevet 0-15 °C hőmérsékletre hűtjük, vagy ezen a hőmérsékleten tartjuk;
(d) a homogenizált fermentléhez savat adva a fermentlé pHját körülbelül 2,0-re állítjuk bérié) a megsavanyított fermentlevet 0-15 °C közötti hőmérsékleten inkubálva elöljük a visszamaradt elroncsolatlan baktériumokat;
(f) a fermentlevet centrifugáljuk, és így zárványtest-üledéket és egy felülúszó folyadékot nyerünk;
(g) a zárványtest-üledékről eltávolítjuk a felülúszó folyadékot;
(h) a zárványtest-üledéket egy pufferban szuszpendálva egy szuszpenziót nyerünk;
(i) a szuszpenzióhoz egy pH-beállító oldatot adva a szuszpenzió pH-ját 6-9 közötti értékre állítjuk be;
(j) az (i) lépés szerinti szuszpenzióban lévő szuszpendált szilárd anyagot feltárjuk;
(k) a szuszpenziót centrifugáljuk, és így egy, a heterológ proteint tartalmazó zárványtest-üledéket, valamint egy felülúszó folyadékot kapunk; és (l) a felülúszó folyadékot eltávolítva a heterológ proteint tartalmazó izolált zárványtesteket nyerünk.
A harmadik megoldásnak megfelelő eljárás a következő lépé-
sekből áll:
(a) heterológ oldhatatlan proteint kifejező baktériumokat fermentlében fermentálunk;
(b) a fermentlében lévő baktériumokat elroncsoljuk;
(c) a fermentlét 0-15 °C hőmérsékletre hűtjük, vagy ezen a hőmérsékleten tartjuk;
(d) a fermentléhez salétromsavat adva a fermentlé pH-ját körülbelül 2,0-re állítjuk be;
(e) a megsavanyított fermentlét 0-15 °C közötti hőmérsékleten inkubálva elöljük a baktériumokat;
I (f) a fermentlé pH-ját körülbelül 8,5-re növeljük;
(g) a fermentlét feltárjuk;
(h) a feltárt fermentlét centrifugáljuk, és így egy zárványtest-üledéket, valamint egy felülúszó folyadékot kapunk; és (i) a felülúszó folyadékot eltávolítva heterológ proteint tartalmazó izolált zárványtesteket nyerünk.
Az 1. ábra a találmány szerinti eljárással előállított zárványtestek, valamint a találmány szerinti eljárástól eltérő, egyéb módszerekkel előállított zárványtestek SDS-PAGE gélelektroforézisének eredményét mutatja be.
A jelen találmány eljárásokat kínál genetikailag transzformáit baktériumok, különösen E. coli által termelt oldhatatlan, nem-bakteriális protein, különösen emlős protein kivonására. A baktériumok által kifejezett nem-bakteriális proteineket másként heterológ proteineknek nevezzük. A jelen leírásban alkalmazott transzformált baktériumok kifejezés olyan baktériumokra vonatkozik, amelyeket géntechnológiai úton hozunk létre
egy heterológ protein termelésére. Ilyen géntechnológiai művelet általában egy expressziós vektornak egy baktériumba való bevitelét jelenti. Az expressziós vektor alkalmas a bakteriális genomban lévő génekhez képest autonóm replikációra és proteinexpresszióra. A bakteriális expressziós vektorok felépítése jól ismert a szakterületen, feltéve, hogy a kívánt proteint kódoló nukleotidszekvencia is ismert vagy másképp hozzáférhető. Például a 4 551 433 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban bakteriális expressziós vektorokban történő felhasználásra szolgáló promótereket ismertetnek. A 4 601 980 és a 4 431 739 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban emlős proteineknek E. coli expressziós rendszerekkel történő termelését írják le. A baktériumokban történő kifejezéshez szükséges szintetikus gének felépítését ismertetik a következő szabadalmi, illetve szakirodalmi dokumentumokban:
431 739 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; Ferretti et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 599 (1986); Sproat et al., Nucleic Acid Research, 13, 2959 (1985); és
Mullenbach et al., J. Biol. Chem., 261, 719 (1986). Számos bakteriális expressziós vektor beszerezhető a kereskedelemből és a következő gyűjteményen keresztül: American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, Amerikai Egyesült Államok.
Az expressziós vektorral transzformált baktériumokat egy baktérium táptalajban olyan körülmények között tenyésztjük, amely körülmények stimulálják a heterológ protein kifejeződését. Ezt a transzformált bakrétiumokat tartalmazó bakteriális táptalajt nevezzük fermentlének.
A találmány szerinti első megoldás értelmében a heterológ proteint kifejező transzformált baktériumokat, előnyösen egy transzformált E. coli törzset, elroncsoljuk oly módon, hogy a fermentlét 0°C és 25°C közötti hőmérséklet-tartományban ultrahanggal kezeljük, vagy standard módszerekkel homogenizáljuk. A teljes fermentlé ultrahanggal végzett kezelését vagy homogenizálását általában addig folytatjuk, amíg lényegében az összes sejt széttöredezik. Ez lehetőséget nyújt arra, hogy az ezt követő centrifugálással hatékonyan eltávolítsuk az oldható proteineket és a zárványtestből származó kis sejtfragmentumokat. Ily módon a proteinek legnagyobb végső tisztaságát érhetjük el.
Az ultrahanggal végzett kezelést általában a fermentlé analitikai mennyiségeiben (10-20 ml) lévő baktériumok roncsolására alkalmazzuk. Nagyobb mennyiségek esetén nagynyomású homogenizálást célszerű használni. A fermentlé analitikai mennyiségeinek (10-20 ml) egy 3,2 mm-es (1/8 hüvelykes) kúpos heggyel rendelkező, W-85 modellszámú Ultrasonic Processor (Heat-Systems-Ultrasonic, Inc.) alkalmazásával végzett kezelése során előnyösen 50 %-os kihasználás mellett 18 perces teljes kezelési időt, 1 másodperces impulzust (9 perces tiszta kezelési időt) alkalmazunk 10 ml teljes fermentlére vonatkoztatva.
Amennyiben homogenizálást alkalmazunk a baktériumok elroncsolásához, a fermentlé többszöri átbocsájtása az előnyös. Megfigyeléseink szerint a megfelelő eredmény eléréséhez háromszor kell a fermentlét 75,8 MPa (11 000 psi) nyomással átjuttatni egy MICROFLUIDIZER®-en (Microfluidics M-110). Annak érdekében, hogy megakadályozzuk az élő baktériumok kikerülését, az ultrahanggal végzett kezelés vagy a MICROFLUIDIZER alkalmazásával végzett homogenizálás ideje alatt a rendszert előnyösen lezárjuk. A nagy mennyiségek feldolgozására szolgáló homogenizátorokat gyakran eleve zárt rendszerben állítják össze.
Az ultrahanggal kezelt vagy homogenizált fermentlét ezt követően centrifugáljuk, és így egy zárványtest-tartalmú üledéket és egy felülúszó folyadékot kapunk. A centrifugálás sebességének egyrészt elég nagynak kell lennie ahhoz, hogy a zárványtestek legtöbbje kiülepedjen, másrészt viszont elég kicsinek kell lennie ahhoz, hogy a szuszpenzióban lévő sejtfragmentumok legtöbbje a felülúszó folyadékban maradjon. A centrifugálást általában egy 5402. modellszámú EPPENDORF® mikrocentrifugában, 3,8 cm-es (másfél hüvelykes) kúpos mikrocentrifugacső alkalmazásával, körülbelül 5000 és körülbelül 10 000 fordulat/perc, előnyösen 7000 - 10 000 fordulat/perc közötti sebesség mellett 10 percen keresztül, illetve ezzel ekvivalens körülmények között hajtjuk végre. Ezt követően eltávolítjuk a felülúszó folyadékot, és így heterológ proteint tartalmazó zárványtesteket nyerünk.
A találmány szerinti második megoldás szerint a fermentlében lévő baktériumok elroncsolása után a fermentlé hőmérsékletét 0-15 °C-ra csökkentjük. Ezt követően a fermentlé pH-ját 0-15 °C hőmérsékleten kénsav, foszforsav, salétromsav vagy sósav hozzáadásával körülbelül 2,0-re csökkentjük, majd a fermentlét a visszamaradt baktériumok elölése érdekében ezen a hőmérsékleten, rendszerint körülbelül egy órán keresztül inkubáljuk. Ez a művelet igen lényeges, mivel az egyszerű homogenizá« · • · · · · • · · · · ··· ··· · «·····
- 10 lás nem pusztítja el az összes baktériumot. A pH értékének csökkentésére alkalmazott sav előnyösen foszforsav vagy salétromsav. Ezt követően a fermentlét a fentiekben ismertetetteknek megfelelően centrifugáljuk, majd a zárványtest-üledék izolálása érdekében a felülúszó folyadékot eltávolítjuk. A zárványtest-üledéket egy pufferban szuszpendáljuk. Az üledék szuszpendálására alkalmazható pufferok például a nátrium-foszfát-, a kálium-foszfát- és a 2-amino-2-(hidroxi-metil)-1,3-propándiol(TRIS-) pufferok. Az egyik előnyös puffer a következő komponensekből áll: 50 mM TRIS, 5 mM EDTA és 50 mM nátrium-klorid, pH 8,5 (TEN puffer). Az így nyert szuszpenzió végső pH-ját egy alkalmas bázissal körülbelül 6,0 és körülbelül 9,0 közötti, előnyösen 8,5-es értékre állítjuk be. A pH-beállítási lépésben felhasználható alkalmas bázisok közé tartozik a nátrium-hidroxid, a kálium-hidroxid stb. A pH értékének növelésére bázisoldatként előnyösen 25 vegyes%-os nátrium-hidroxid-oldatot alkalmazunk.
A beállított pH-jú szuszpenziót ezt követően ultrahanggal végzett kezeléssel vagy homogenizálással ismételten roncsoljuk, és így a szuszpenzióban lévő szilárd anyagokat diszpergáljuk, majd a keveréket centrifugáljuk. Végül eltávolítjuk az oldható gazda bakteriális proteineket és sejttöredékeket tartalmazó felülúszó folyadékot, és kinyerjük az oldhatatlan emlős proteint tartalmazó üledéket. Szükség esetén az üledéket előnyösen körülbelül 8,5 pH-jú pufferban egyszer vagy kétszer moshatjuk. Alapvető fontosságú, hogy a sav hozzáadását 0°C és 15°C közötti hőmérséklet-tartományban hajtsuk végre. Az összes többi
- 11 kivonási műveletet 0°C és 32°C közötti hőmérsékleten végezhetjük.
A találmány szerinti harmadik megoldás értelmében a heterológ oldhatatlan proteint kifejező baktériumokat egy fermentlében fermentáljuk. A fermentlében lévő baktériumokat ultrahanggal végzett kezeléssel vagy homogenizálással a fentiekben ismertetetteknek megfelelően elroncsoljuk. Ezt követően a fermentlé hőmérsékletét 0-15 °C közötti értékre csökkentjük, majd a fermentléhez salétromsavat adva a fermentlé pH-ját körülbelül 2,0-re állítjuk be. A fermentlét a visszamaradt összes baktérium elpusztításához elegendő ideig, rendszerint egy órán keresztül 0-15 °C közötti hőmérsékleten inkubáljuk.
A fermentlé pH-ját ezután körülbelül 8,5-re növeljük, majd a visszamaradt baktériumokat tartalmazó szuszpendált szilárd anyagokat ultrahanggal végzett kezeléssel vagy homogenizálással ismételten feltárjuk. A második feltárás után a fermentlét centrifugáljuk, és így egy felülúszó folyadékot és egy zárványtest-üledéket kapunk. Ezt követően a felülúszó folyadékot eltávolítjuk, amelynek eredményeként az oldhatatlan heterológ proteint tartalmazó izolált zárványtesteket nyerjük.
Nagy mennyiségekkel végzett műveletek esetén előnyösen a második és harmadik megoldás szerinti savas elölési eljárást alkalmazzuk, mivel a savas eljárással gyakorlatilag a baktériumok 100 %-a elölhető. A baktériumok 100 %-ának az elöléséhez önmagában a homogenizálásnak az alkalmazása a költségek szempontjából nem megfelelő, tekintettel arra, hogy az említett cél eléréshez többszöri homogenizálásra van szükség.
• · · · · • · · · · ··· ··· · «· ····
- 12 A zárványtestek izolálása után a heterológ proteint standard biokémiai módszerek alkalmazásával kibonthatjuk, visszahajtogathatjuk és tisztíthatjuk. Lásd például: Guide to Protein Purification, Deutscher et al. Ed. [Academic Press, San
Diego, CA, USA (1990)].
A következő példákban a találmány szerinti megoldás részleteit ismertetjük. Az ezen a területen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy a gyakorlati megvalósítás során az anyagokban és az eljárásokban számos módosítás végezhető anélkül, hogy a találmány szerinti megoldás lényegétől és céljaitól eltérnénk.
A találmány szerinti megoldást az alábbi, nem korlátozó jellegű példákkal illusztrálhatjuk. Amennyiben másképpen nem jelöljük, a szilárd keverékekben lévő szilárd anyagokra, a folyadékelegyekben lévő folyadékokra, valamint a folyadékokban lévő szilárd anyagokra megadott százalékos értékek vonatkoztatási alapjai — az előbbi sorrendnek megfelelően — tömeg/tömeg, térfogat/térfogat, valamint tömeg/térfogat, azaz tömeg%, térfogat%, valamint vegyes%.
1. példa (A találmány szerinti első eljárás)
Az ebben a példában alkalmazott humán IL-10 expressziós plazmid a következő szekvenciákat tartalmazta:
(a) a humán IL-10 kódoló szakasz nukleotidszekvenciája: Viera, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 1172 (1991) ;
(b) a tac promoter, amelynek 3' vége az IL-10 kódoló szakasz • · · · • · ·· ···· · • · · · · • · · · · ··· ··· · ·· ····
- 13 nukleotidszekvenciájának 5' végéhez van kapcsolva:
Zurawski et al., J. Immunol., 137, 3554 (1986);
(c) az Ipp 3' kódoló és nem-kódoló szakaszok, köztük az rhlL-10 kódoló szakasz után elhelyezkedő transzkripciós terminátor: Ghrayeb, J. et al., EMBO J. , _3< 2437 (1984) ;
(d) a pBR322-ből származó tetraciklin-rezisztens gén: Sutcliff, J. G., C.S.H. Symp. Quant. Biol., 135, 612 (1978);
TS (e) a cop termoindukalhato replikációs origó: Hakkaart, M.
J. J. et al., Mól. Gén. Gént., 183, 326 (1981); és
Andreoli, Ρ. M. et al., J. Bacteriol., 135, 612 (1978).
t
Fermentáció
Egy, a fentiekben ismertetett plazmidot hordozó E. coli
K12 törzs tenyészetét levegőztetés és keverés közben egy vizes fermentációs közegben tenyésztettük. A táptalaj literenként 30 g kazaminosavat (Difco), 20 g élesztőkivonatot (Difco), 5 g kálium-dihidrogén-foszfátot, 20 g glicerint, 1 g magnézium—szulfátot és 10 mg tetraciklint (Sigma) tartalmazott. A pH-t 25 vegyes%-os nátrium-hidroxid-oldattal 7,0-re állítottuk be, és az oldott oxigént 34,5 kPa (5 psi) nyomású levegővel 30-100 %os telítettség között tartottuk. A hőmérsékletet kezdetben 30 °C-ra állítottuk be. Amikor a tenyészet zavarossága egy 54.
számú zöld szűrővel ellátott Klett Summerson koloriméterrel mérve körülbelül 100 Klett egységes értéket ért el, a hőmérsékletet körülbelül 38 °C-ra emeltük, majd 12-14 órával később a tenyészetet feldolgoztuk.
Kivonás
A sejtek elroncsolása érdekében a teljes fermentlét körül• · ·♦ ·
belül 75,8 MPa (11 000 psi) nyomással háromszor átjuttattuk egy MICROFLUIDIZER M-110® homogenizátoron. A homogenizátort és terméktartályokat jégen tartva a homogenizált szuszpenzió hőmérsékletét 0-15 °C közötti hőmérsékleten tartottuk.
Ezt követően a fermentlé hőmérsékletét 4 °C-ra csökkentettük, és pH 7-en körülbelül egy órán keresztül kevertettük. A szuszpenziót 250 ml-es részletekben egy GS-3 fejjel ellátott SORVAL® centrifugában (RC5C modell) 8000 fordulat/perc sebességgel 65 percen keresztül 4 °C hőmérsékleten centrifugáltuk. A felülúszót félretettük, míg a kivont IL-10 az üledékben maradt. Az így nyert zárványtestek tisztaságát nátrium-dodecil-szulfát/poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS-PAGE) [Laemmli, U.
K., Natúré, 277, 680 (1970)] ellenőriztük, amelynek eredményét az 1. ábra 1. oszlopában mutatjuk be. Az eljárásnak megfelelően a zárványtesteket egy megfelelő pufferban olyan koncentrációban szuszpendáltuk, amely 1 cm-es fényút esetén az eredeti fermentlé 15 OD55q értékével volt ekvivalens. A puffer a következő komponenseket tartalmazta: 2,3 % nátrium-dodecil-szulfát (SDS), % glicerin, 0,062 M Tris—HCI (pH 6,8), 0,001 % brómfenolkék és 5 % β-merkapto-etanol (frissen hozzáadva). 10 μΙ-t adtunk egy DAIICHI mini gradiens gél minden egyes vájatába (összesen 12 vájat). A gélt egy futtató pufferban 35 mA/gél állandó áramerősség mellett elektroforetizáltuk. Amikor a kék festék elérte a gél alját, az áramot kikapcsoltuk, majd a gélt a Laemmli által leírtaknak megfelelően előhívtuk. Az eredmény az 1. ábra 1. oszlopában látható.
• · ·· »
- 15 2. példa (A találmány szerinti második eljárás) IL-10-tartalmú zárványtesteket állítottunk elő az 1. példában ismertetetteknek megfelelően, kivéve a következő eltéréseket. A fermentlének az 1. példa szerinti homogenizálása után a fermentlé hőmérsékletét 4°C—ra csökkentettük, majd 85 tömeg%os foszforsavoldat hozzáadásával a fermentlé pH-ját 2,0-re állítottuk be. A megsavanyított szuszpenziót körülbelül egy órán keresztül 4°C hőmérsékleten kevertettük. Ezt követően a megsavanyított szuszpenziót 250 ml-es részletekben egy GS-3 fejjel ellátott SORVAL® centrifugában (RC5C modell) 8000 fordulat/perc sebességgel 65 percen keresztül 4°C hőmérsékleten centrifugáltuk. A felülúszót félretettük, míg a zárványtest-üledéket TEN pufferrel az eredeti fermentlé térfogatának 1/4 részére szuszpendáltuk, és a puffer pH-ját 25 %-os nátrium-hidroxid-oldattal
8,5-re növeltük. Az így nyert szuszpenziót háromszor átjuttattuk egy MICROFLUIDIZER M-110® homogenizátoron, majd centrifugáltuk, annak megfelelően, ahogyan azt a fentiekben ismertettük. A felülúszót félretettük, míg a kivont IL-10 az üledékben maradt vissza.
Az így nyert zárványtestek tisztaságát SDS-PAGE útján ellenőriztük; az eredményt az 1. ábra 2. oszlopa mutatja be.
3. példa (A találmány szerinti második eljárás) IL-10-tartalmú zárványtesteket állítottunk elő a 2. példában ismertetetteknek megfelelően, kivéve a következő eltérést.
··· ·
- 16 A fermentlé pH-jának 2,0-re csökkentéséhez foszforsav helyett 9
M salétromsavoldatot alkalmaztunk.
Az így nyert zárványtestek tisztaságát SDS-PAGE útján ellenőriztük; az eredményt az 1. ábra 3. oszlopa mutatja be.
4. példa (A találmány szerinti második eljárás) IL-10-tartalmú zárványtesteket állítottunk elő a 2. példában ismertetetteknek megfelelően, kivéve a következő eltérést. A fermentlé pH-jának 2,0-re csökkentéséhez foszforsav helyett 4,5 M kénsavoldatot alkalmaztunk.
Az így nyert zárványtestek tisztaságát SDS-PAGE útján ellenőriztük; az eredményt az 1. ábra 4. oszlopa mutatja be.
5. példa (Nem találmány szerinti eljárás)
A homogenizált fermentlé megsavanyításához 85 tömeg%-os foszforsavoldatot alkalmazva IL-10-tartalmú zárványtesteket állítottunk elő a 2. példában ismertetetteknek megfelelően, kivéve a következő eltérést. A megsavanyított szuszpenzió egyórás keverése után a szuszpenzió pH-ját 25 vegyes%-os nátrium-hidroxid-oldat hozzáadásával 8,5-re növeltük. A szuszpenziót háromszor átjuttattuk egy MICROFLUIDIZER M-110® homogenizátoron, majd 250 ml-es részletekben egy GS-3 fejjel ellátott SORVAL® centrifugában (RC5C modell) 8000 fordulat/perc sebességgel 65 percen keresztül 4°C hőmérsékleten centrifugáltuk. A felülúszót félretettük, míg a kivont IL-10 az üledékben maradt vissza.
• ·· »
- 17 Az így nyert zárványtestek tisztaságát SDS-PAGE útján ellenőriztük; az eredményt az 1. ábra 5. oszlopa mutatja be.
6. példa (A találmány szerinti harmadik eljárás) IL-10-tartalmú zárványtesteket állítottunk elő az 5. példában ismertetetteknek megfelelően, kivéve a következő eltérést. A fermentlé pH-jának 2,0-re csökkentéséhez 9 M salétromsavoldatot alkalmaztunk.
Az így nyert zárványtestek tisztaságát SDS-PAGE útján ellenőriztük; az eredményt az 1. ábra 6. oszlopa mutatja be.
7. példa (Nem találmány szerinti eljárás)
IL-10-tartalmú zárványtesteket állítottunk elő az 5. példában ismertetetteknek megfelelően, kivéve a következő eltérést. A fermentlé pH-jának 2,0-re csökkentéséhez 4,5 M kénsavoldatot alkalmaztunk.
Az így nyert zárványtestek tisztaságát SDS-PAGE útján ellenőriztük; az eredményt az 1. ábra 7. oszlopa mutatja be.
8. példa (Nem találmány szerinti eljárás)
Az 1. ábra 8. oszlopa a PCT/US94/01909. számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben ismertetett eljárással, kínai hörcsög petefészkekből előállított és tisztított IL-10 tisztaságát mutatja be. A tisztaságot az 1. példában ismertetetteknek megfe- 18 lelően SDS-PAGE alkalmazásával határoztuk meg, kivéve azt, hogy a vájatba 20 μΐ-es mintát töltöttünk.
9. példa (Nem találmány szerinti eljárás)
Az 1. ábra 9. oszlopa egy, az ábra egyéb oszlopaiban szereplő proteinek molekulatömegének hozzávetőleges meghatározásához alkalmazott nagy molekulatömegű standard markert mutat.
10. példa (A technika állásához tartozó eljárás)
Az IL-10-et termelő baktériumokat az 1. példában ismertetetteknek megfelelően fermentáltuk. Amikor a fermentáció befejeződött, a fermentlé pH-ját 9 M salétromsavoldattal 2,0-re csökkentettük, majd a megsavanyított ferméntlét egy órán keresztül kevertettük. A fermentlé pH-ját 25 vegyes%-os nátriumhidroxid-oldat hozzáadásával 8,5-re növeltük. Az így nyert szuszpenziót háromszor átjuttattuk egy MICROFLUIDIZER M-110® homogenizátoron, majd egy GS-3 fejjel ellátott SORVAL centrifugában a fentieknek megfelelően centrifugáltuk. A felülúszót félretettük, míg a kivont IL-10 az üledékben maradt vissza.
Az így nyert zárványtestek tisztaságát SDS-PAGE útján ellenőriztük; az eredményt az 1. ábra 10. oszlopa mutatja be.
11. példa (A technika állásához tartozó eljárás) IL-10-tartalmú zárványtesteket állítottunk elő a 10. pél- 19 -
dában ismertetetteknek megfelelően, kivéve a következő eltérést. A fermentlé pH-jának 2,0-re csökkentéséhez 4,5 M kénsavoldatot alkalmaztunk.
Az így nyert zárványtestek tisztaságát SDS-PAGE útján ellenőriztük; az eredményt az 1. ábra 11. oszlopa mutatja be.
12. példa (A technika állásához tartozó eljárás)
IL-10-tartalmú zárványtesteket állítottunk elő a 10. példában ismertetetteknek megfelelően, kivéve a következő eltérést. A fermentlé pH-jának 2,0-re csökkentéséhez 85 tömeg%-os foszforsavoldatot alkalmaztunk.
Az így nyert zárványtestek tisztaságát SDS-PAGE útján ellenőriztük; az eredményt az 1. ábra 12. oszlopa mutatja be.
Következtetések
Az 1. ábra alapján megállapítható, hogy a találmány szerinti eljárások meglepően alkalmasak olyan zárványtestek előállítására, amelyek szennyező anyagokat, azaz oldható gazdaproteineket csak kis mennyiségekben tartalmaznak. Az 1. oszlop a találmány szerinti első eljárásnak megfelelő 1. példa során kivont IL-10-et tartalmazó zárványtestek SDS-PAGE géljét ábrázolja. Az izolált, tiszta zárványtestek előállításához a baktériumokat tartalmazó fermentlét homogenizáltuk és centrifugáltuk.
A találmány szerinti második eljárással előállított zárványtestek tisztaságát az 1. ábra 2., 3. és 4. oszlopa mutatja be. A 2. 3. és 4. oszlop — az előbbi sorrendnek megfelelően —
- 20 a 2., 3. és 4. példa szerint előállított zárványtesteknek felel meg, amely példákban a homogenizált fermentlét megsavanyítottuk, 0-15 °C közötti hőmérsékleten inkubáltuk, majd egy zárványtest-üledék és egy felülúszó folyadék előállításához centrifugáltuk. Az üledéket egy megfelelő pufferban szuszpendáltuk, a pH-t 8,5-re emeltük, majd a szuszpenziót homogenizáltuk. Ezt követően a szuszpenziót ismételten centrifugáltuk, majd a zárványtest-üledéket izoláltuk. A homogenizált fermentlé megsavanyításához a 2. példában (2. oszlop) foszforsavat, a 3. példában (3. oszlop) salétromsavat, míg a 4. példában (4. oszlop) kénsavat alkalmaztunk. Amint azt az 1. ábra egyértelműen mutatja, a találmány szerinti második eljárással igen nagy tisztaságú zárványtesteket állítottunk elő.
A 6. példa szerinti eljárással előállított terméknek megfelelő 6. oszlop a találmány szerinti harmadik eljárásnak megfelelően előállított zárványtestek SDS-PAGE géljét mutatja be. Ebben a megoldásban a homogenizált fermentlé pH-ját salétromsavval körülbelül 2,0-re csökkentettük, majd a keveréket körülbelül egy órán keresztül 0 °C és 15 °C közötti hőmérséklet-tartományban kevertettük. Ezt követően a fermentlé pH-ját körülbelül 8,5-re emeltük. A fermentlét ismételten homogenizáltuk, majd az izolált zárványtestek előállítása érdekében centrifugáltuk. A találmány szerinti harmadik eljárás szerint csak a salétromsav bizonyult hatékonynak a tiszta zárványtestek előállításához. Amennyiben a salétromsav helyett az 5. példában (5. oszlop) foszforsavat vagy a 7. példában (7. oszlop) kénsavat használtunk, olyan zárványtestek alakultak ki, amelyek el«·
- 21 fogadhatatlanul nagy mennyiségekben tartalmaztak oldhatatlan bakteriális gazdaproteineket.
Az 1. ábra 8. oszlopa a kínai hörcsög petefészek (Chinese Hamster Ovary; CHO) sejtek által termelt humán IL-10 SDS-PAGE géljét mutatja be. A 9. oszlop egy nagy molekulatömegű standard SDS-PAGE géljét ábrázolja. A 10., 11. és 12. oszlop — az előbbi sorrendnek megfelelően — a 10., 11. és 12. példában ismertetett, a technika állásához tartozó eljárásokkal előállított zárványtestek SDS-PAGE géljét mutatja be. Jól látható, hogy a heterológ proteinek baktériumokból történő kivonására szolgáló, a technika állásához tartozó eljárások olyan zárványtesteket eredményeznek, amelyek lényegesen nagyobb mennyiségekben tartalmaznak gazdaproteineket, mint a találmány szerinti eljárásokkal kivont zárványtestek.
Összefoglalva, az 1. ábra 1., 2., 3., 4. és 6. oszlopa alapján megállapítható, hogy a találmány szerinti eljárások mindegyike nagyobb tisztaságú zárványtestek előállítását teszi lehetővé, míg az egyéb módszerekkel előállított zárványtestek elfogadhatatlanul nagy mennyiségben tartalmaznak gazdaproteint.
Jóllehet a fentiekben a találmányt csak egyedi megoldásokon keresztül ismertettük, az ezen a területen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy az említett megoldásokban számos alternatíva, módosítás és változtatás hajtható végre. Az ilyen jellegű alternatívák, módosítások és változtatások is a találmánynak a mellékelt szabadalmi igénypontok által meghatározott oltalmi körébe tartoznak.
Claims (6)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás egy heterológ proteinnek a heterológ proteint kifejező baktériumokból való kivonására, azzal jellemezve, hogy az eljárás a következő lépésekből áll:(a) heterológ oldhatatlan proteint kifejező baktériumokat fermentlében fermentálunk;(b) a fermentlében lévő baktériumokat elroncsoljuk;(c) a fermentlét centrifugáljuk, és így zárványtest-üledéket és egy felülúszó folyadékot nyerünk; és k(d) a felülúszó folyadékot eltávolítva egy zárványtest-üledéket kapunk.
- 2. Eljárás egy heterológ proteinnek a heterológ proteint kifejező baktériumokból való kivonására, azzal jellemezve, hogy az eljárás a következő lépésekből áll:(a) heterológ oldhatatlan proteint kifejező baktériumokat fermentlében fermentálunk;(b) a fermentlében lévő baktériumokat elroncsoljuk;(c) a fermentlét 0-15 °C hőmérsékletre hűtjük, vagy ezen a hőmérsékleten tartjuk;(d) a homogenizált fermentléhez savat adva a fermentlé pHját körülbelül 2,0-re állítjuk be;(e) a megsavanyított fermentlét 0-15 °C közötti hőmérsékleten inkubálva elöljük a visszamaradt elroncsolatlan baktériumokat;(f) a fermentlét centrifugáljuk, és így zárványtest-üledéket és egy felülúszó folyadékot nyerünk;- 23 (g) a zárványtest-üledékről eltávolítjuk a felülúszó folyadékot;(h) a zárványtest-üledéket egy pufferban szuszpendálva egy szuszpenziót nyerünk;(i) a szuszpenzióhoz egy pH-beállító oldatot adva a szuszpenzió pH-ját 6-9 közötti értékre állítjuk be;(j) az (i) lépés szerinti szuszpenzióban lévő szuszpendált szilárd anyagot feltárjuk;(k) a szuszpenziót centrifugáljuk, és így egy, a heterológ proteint tartalmazó zárványtest-üledéket, valamint egy felülúszó folyadékot kapunk elő; és (l) a felülúszó folyadékot eltávolítva a heterológ proteint tartalmazó izolált zárványtesteket nyerjük.
- 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy a megsavanyított fermentlét 0-25 °C hőmérsékleten tartjuk.
- 4. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (d) lépés szerinti megsavanyított fermentlét a centrifugálás előtt körülbelül egy órán keresztül 0 °C és 15 °C közötti hőmérséklet-tartományban inkubáljuk.
- 5. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a savat a következők közül választjuk ki: foszforsav, salétromsav, hidrogén-klorid és kénsav.
- 6. Eljárás egy heterológ proteinnek a heterológ proteint kifejező baktériumokból való kivonására, azzal jellemezve, hogy az eljárás a következő lépésekből áll·:(a) heterológ oldhatatlan proteint kifejező baktériumokat ···· • · · · · • · · · · ··· ··» · ···»- 24 fermentlében fermentálunk;(b) a fermentlében lévő baktériumokat elroncsoljuk;(c) a fermentlét 0-15 °C hőmérsékletre hűtjük, vagy ezen a hőmérsékleten tartjuk;(d) a fermentléhez salétromsavat adva a fermentlé pH-ját körülbelül 2,0-re állítjuk be;(e) a megsavanyított fermentlét 0-15 °C közötti hőmérsékleten inkubálva elöljük a baktériumokat;(f) a fermentlé pH-ját körülbelül 8,5-re növeljük;(g) a fermentlét feltárjuk;(h) a feltárt fermentlét centrifugáljuk, és így egy zárványtest-üledéket, valamint egy felülúszó folyadékot kapunk; és (i) a felülúszó folyadékot eltávolítva heterológ proteint tartalmazó izolált zárványtesteket nyerünk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/263,961 US5437986A (en) | 1994-06-22 | 1994-06-22 | Extraction of heterologous insoluble proteins from bacteria |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9603539D0 HU9603539D0 (en) | 1997-02-28 |
| HUT76377A true HUT76377A (en) | 1997-08-28 |
Family
ID=23003982
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9603539A HUT76377A (en) | 1994-06-22 | 1995-06-19 | Extraction of heterologous insoluble proteins from bacteria |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5437986A (hu) |
| EP (1) | EP0759982A1 (hu) |
| JP (1) | JP2831473B2 (hu) |
| KR (1) | KR100212770B1 (hu) |
| AU (1) | AU690709B2 (hu) |
| BR (1) | BR9508096A (hu) |
| CA (1) | CA2192184C (hu) |
| FI (1) | FI965109A (hu) |
| HU (1) | HUT76377A (hu) |
| MX (1) | MX9606318A (hu) |
| NZ (1) | NZ288825A (hu) |
| WO (1) | WO1995035368A1 (hu) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL213561B1 (pl) * | 2004-01-09 | 2013-03-29 | Inst Biotechnologii I Antybiotykow | Sposób otrzymywania plazmidu, plazmid oraz zastosowania |
| ES2799431T3 (es) * | 2010-03-31 | 2020-12-17 | Amsilk Gmbh | Separación de proteínas objetivo insolubles |
| WO2013019604A2 (en) * | 2011-07-29 | 2013-02-07 | Georgia State University Research Foundation, Inc. | Protein production method |
| ITMI20131276A1 (it) * | 2013-07-30 | 2015-01-31 | Bio On S R L | Processo per recuperare e purificare poliidrossialcanoati da una coltura cellulare |
| US11104877B2 (en) | 2018-05-21 | 2021-08-31 | Jupeng Bio, Inc. | Composition for obtaining protein-rich nutrient supplements from bacterial fermentation process |
| KR102312897B1 (ko) * | 2021-02-26 | 2021-10-15 | 에스케이바이오사이언스(주) | 목적 단백질의 고수율 정제방법 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4512922A (en) * | 1982-12-22 | 1985-04-23 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
| US4518526A (en) * | 1982-12-22 | 1985-05-21 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
| GR79124B (hu) * | 1982-12-22 | 1984-10-02 | Genentech Inc | |
| CA1267615A (en) * | 1984-08-27 | 1990-04-10 | Dan Hadary | Method for recovering purified growth hormones from genetically engineered microorganisms |
| US4748234A (en) * | 1985-06-26 | 1988-05-31 | Cetus Corporation | Process for recovering refractile bodies containing heterologous proteins from microbial hosts |
| US5248769A (en) * | 1985-06-26 | 1993-09-28 | Cetus Oncology Corporation | Process for recovering refractile bodies containing heterologous proteins from microbial hosts |
| US4656255A (en) * | 1985-09-09 | 1987-04-07 | International Minerals & Chemical Corp. | Protein recovery |
| US4801536A (en) * | 1985-10-11 | 1989-01-31 | Genetics Institute, Inc. | Method for producing heterologous proteins |
| US4689401A (en) * | 1986-03-06 | 1987-08-25 | Cetus Corporation | Method of recovering microbially produced recombinant ricin toxin a chain |
| US4958007A (en) * | 1988-05-17 | 1990-09-18 | Schering-Plough Corp. | Extraction of human interleukin-4- from bacteria |
-
1994
- 1994-06-22 US US08/263,961 patent/US5437986A/en not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-06-19 KR KR1019960707299A patent/KR100212770B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1995-06-19 WO PCT/US1995/007129 patent/WO1995035368A1/en not_active Application Discontinuation
- 1995-06-19 EP EP95923717A patent/EP0759982A1/en not_active Withdrawn
- 1995-06-19 MX MX9606318A patent/MX9606318A/es unknown
- 1995-06-19 HU HU9603539A patent/HUT76377A/hu unknown
- 1995-06-19 NZ NZ288825A patent/NZ288825A/en unknown
- 1995-06-19 AU AU28175/95A patent/AU690709B2/en not_active Ceased
- 1995-06-19 BR BR9508096A patent/BR9508096A/pt not_active Application Discontinuation
- 1995-06-19 JP JP8502295A patent/JP2831473B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-19 CA CA002192184A patent/CA2192184C/en not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-12-19 FI FI965109A patent/FI965109A/fi unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR19980057993A (ko) | 1998-09-25 |
| EP0759982A1 (en) | 1997-03-05 |
| FI965109A0 (fi) | 1996-12-19 |
| JP2831473B2 (ja) | 1998-12-02 |
| WO1995035368A1 (en) | 1995-12-28 |
| AU2817595A (en) | 1996-01-15 |
| KR100212770B1 (ko) | 1999-08-02 |
| CA2192184A1 (en) | 1995-12-28 |
| CA2192184C (en) | 2000-04-18 |
| HU9603539D0 (en) | 1997-02-28 |
| US5437986A (en) | 1995-08-01 |
| NZ288825A (en) | 1998-08-26 |
| AU690709B2 (en) | 1998-04-30 |
| BR9508096A (pt) | 1997-08-12 |
| JPH09508024A (ja) | 1997-08-19 |
| FI965109A (fi) | 1996-12-19 |
| MX9606318A (es) | 1997-05-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4315852A (en) | Extraction of interferon from bacteria | |
| Shapiro et al. | Synthesis and structure of Caulobacter crescentus flagella | |
| US4348477A (en) | Method for preparing a recombinant DNA phage | |
| JP2005224248A (ja) | 細胞成分を単離する方法、装置及び試薬 | |
| US4364863A (en) | Extraction of interferon from bacteria | |
| CA2687542C (en) | Vector for expression of heterologous protein and methods for extracting recombinant protein and for purifying isolated recombinant insulin | |
| HUT76377A (en) | Extraction of heterologous insoluble proteins from bacteria | |
| CN113302303A (zh) | 经修饰的丝状真菌宿主细胞 | |
| Furfine et al. | Transfection of the Giardia lamblia double-stranded RNA virus into Giardia lamblia by electroporation of a single-stranded RNA copy of the viral genome | |
| EP0342892B1 (en) | Extraction of human interleukin-4 from bacteria | |
| NO820943L (no) | Fremgangsmaate ved gjenvinning av produkter produsert av vertsorganismer. | |
| CN108220317B (zh) | 一种重组表达质粒及其制备方法、用途 | |
| CN112076313A (zh) | 一种口蹄疫亚单位疫苗及其制备方法和应用 | |
| EP0291294B1 (en) | Extraction of granulocyte macrophage colony stimulating factor from bacteria | |
| CN1156481A (zh) | 从细菌中提取异源不溶性蛋白质 | |
| US4415660A (en) | Method of making a cloning vector | |
| CN116769814B (zh) | 一种大肠杆菌益生菌t7表达系统及其应用 | |
| JPS58501406A (ja) | エシエリヒア・コリ−における蛋白合成発現の高揚 | |
| CN113388585B (zh) | 一种噬菌体高滴度培养方法与应用 | |
| SU1439124A1 (ru) | Способ выделени бактериальной ДНК | |
| US4332901A (en) | Cloning vector | |
| CN113913449A (zh) | 引物及其敲除金葡菌基因的应用 | |
| JPH0229316B2 (hu) | ||
| JPH022359A (ja) | 改変殺虫蛋白 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFD9 | Temporary prot. cancelled due to non-payment of fee |