JPH022359A - 改変殺虫蛋白 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、鱗翅目昆虫であるコナガおよびハスモンヨト
ウに対して強い殺虫活性を示すバチラス・チュリンゲン
シス・アイザワイｆＰＬ株の改変殺虫蛋白遺伝子を含み
これを大腸菌等の微生物菌体内で発現させる発現プラス
ミド、該プラスミドを保持しバチラス・チュリンゲンシ
ス・アイザワイＩＰＬ株の改変殺虫蛋白を生産する微生
物および該微生物を培養することを特徴とする改変殺虫
蛋白の製造方法に関する。

■來及■ バチラス・チュリンゲンシス株は、鞭毛抗原やエステラ
ーゼ型などにより２９亜種に分類されており、各々の菌
株は特異的、かつそれぞれ異なる殺虫活性を示すことが
知られている。

バチラス・チュリンゲンシスの各種菌株は、胞子形成期
に殺虫蛋白からなる１〜２μｍにおよぶ結晶を形成し、
この結晶蛋白を摂取した昆虫は、摂食活動を停止し、腸
管破裂等ののち、死に至る。

−Ｃにバチラス・チュリンゲンシス株の１３０〜１４０
ＫＤａ殺虫蛋白は標的昆虫の腸管プロテアーゼにより部
分分解され、６０ＫＤａ或いはそれよりやや分子量の大
きな６２〜６４ＫＤａの殺虫活性断片へ変換する。この
腸管プロテアーゼはトリプシン様蛋白分解活性を持って
おり、アルギニン残基やリジン残基などの特異的なアミ
ノ酸をＬｙ２識し、そのカルボキシル側を切断すると考
えられ、殺虫活性断片の形成、さらにはその分解に関与
しており、殺虫蛋白の活性に大きな影響を与えているこ
とが明らかになっている。

解′すべき課題および課題片　の手段 本発明者らは、公知の菌バチラス・チュリンゲンシス・
アイザワイＩＰＬ株の生産する殺虫蛋白（以下ＢＴ殺虫
蛋白と称する）の殺虫活性を向上させ、殺虫剤として有
効利用することを目的として鋭意研究した結果、殺虫蛋
白遺伝子の特定部位を改変し、発現ベクターに接続後、
微生物へ導入することにより、改変殺虫蛋白を生産する
微生物を製造し、この微生物を培養することによりバチ
ラス・チュリンゲンシス・アイザワイＩＰＬ株の改変殺
虫蛋白を大量に生産する方法を見出し、本発明を完成し
た。

本発明の改変殺虫蛋白遺伝子は、ＢＴ殺虫蛋白の腸管プ
ロテアーゼに対する怒受性を変化させ、該改変殺虫蛋白
を摂取した昆虫体内で多量の殺虫活性断片が生成される
ように改変した殺虫蛋白の遺伝子である。

本改変殺虫蛋白遺伝子は、腸管プロテアーゼ活性の高い
害虫においては、その体内で一定時間当たりに存在する
殺虫活性断片量を高めるべく、ＢＴ殺虫蛋白のアミノ酸
配列のうち腸管プロテアーゼが認識し作用する部位を改
変する、即ち、腸管プロテアーゼが認識し作用するアミ
ノ酸残基に突然変異を導入し、改変することにより創製
される。

腸管プロテアーゼは、トリプシン様蛋白分解活性を存し
ており、主として、その作用により、殺虫活性断片が形
成される。トリプシンが認識し作用するアミノ酸残基と
しては、アルギニン残基、リジン残基があげられる。腸
管プロテアーゼは、さらにキモトリプシン様蛋白分解活
性を保持しており、チロシン、トリプトファン、フェニ
ルアラニン残基などの芳香族アミノ酸残基のカルボキシ
ル側を切断することが知られている。これらの芳香族ア
ミノ酸残基を改変した場合、アルギニン、リジン残基を
改変した場合に比べ、殺虫活性の上昇への影響は少ない
が、これらのアミノ酸残基も腸管プロテアーゼが認識し
作用するアミノ酸残基に含まれる。

上記のアミノ酸残基のうち少なくとも１つのアミノ酸残
基を、天然のバチラス・チュリンゲンシス・アイザワイ
ＩＰＬ株の殺虫蛋白に存在する、該アミノ酸残基以外の
アミノ酸残基に改変する。アルギニンあるいはりジン残
基を改変する場合は、アルギニンおよびリジンの両残基
以外のアミノ酸残基に改変するのが好ましい。さらに好
ましくは、後述の実施例にて用いたグルタミン残基に改
変する。すなわち、例えば、リジン残基を改変する場合
、リジン残基以外のアミノ酸残基（アルギニン残基を含
む）に改変できるが、好ましくは、アルギニンおよびリ
ジン残基以外のアミノ酸残基に、さらに好ましくは、グ
ルタミン残基に改変する。

改変は、殺虫蛋白のアミノ酸配列において、上記の腸管
プロテアーゼが認識し作用するアミノ酸残基のうち、少
なくとも１箇所を改変することにより行なう。アミノ酸
残基の改変は、例えば、特定のアミノ酸残基を改変すべ
く合成されたオリゴヌクレオチドと殺虫蛋白遺伝子領域
に相当する１本鎖ＤＮＡをアニール後、２本鎖とし、複
製することにより可能である。

以下、改変の一例をより詳細に説明する。

ＢＴ殺虫蛋白遺伝子を常法に従いファージベクター、例
えばファージベクターＭ１３に組み込み、大腸菌等の宿
主を用いて組換えベクターを作製する。この時、改変蛋
白遺伝子の選択に有利なように、例えばウラシル含有組
換え体ファージ等を作製するのが好ましい。一方、特定
のアミノ酸残基を改変すべく、該アミノ酸残基を、その
他のアミノ酸残基に置換した改変蛋白を想定し、該改変
蛋白のうち、改変部位の前後の塩基配列（好ましくは２
０〜３０塩基配列）に相補的なオリゴヌクレオチドを合
成する。前記の組換え体ファージ１本鎖Ｄ　Ｎ　Ａを合
成オリゴヌクレオチドとアニーリングし、さらにポリメ
ラーゼ及びリガーゼ反応により２本鎖ＤＮＡとした後、
大腸菌等の宿主にトランスフヱクションして、改変蛋白
遺伝子含有組換えＤＮＡを得る。ここで、上述のウラシ
ル含有組換え体ファージ等の選択に有利なファージを用
いなかった場合はハイブリダイゼーション等の方法によ
り改変蛋白遺伝子含有組換えＤＮＡを選択できる。大腸
菌等の宿主を用いてこれを複製し、複製型２本鎖ＤＮＡ
を調製することにより、本改変は行われる。上述の改変
法の他、例えば、１本鎖ファージＤＮＡに代り、プラス
ミドＤＮＡ断片を熱処理後、合成オリゴヌクレオチドと
アニーリングさせる、所謂Ｍｏｒｉｎａｇａらの方法（
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２，６３６−６３９（１
９８４）に代表される原理的に同様の他の改変方法を用
いても改変は可能である。

改変の対象となるＢＴ殺虫蛋白は、標的昆虫の腸管プロ
テアーゼにより部分分解され、殺虫活性断片へ変換する
バチラス・チュリンゲンシス［ＰＬ株の生産する殺虫蛋
白であり、該殺虫蛋白としては、例えば、本発明者らが
その遺伝子をクローン化し、同遺伝子の構造遺伝子部分
の塩基配列を決定し、殺虫蛋白の１次構造を解明したバ
チラス・チュリンゲンシス・アイザワイＩ　Ｐ　ＬｋＴ
株ノ１３０ＫＤａ殺虫蛋白があげられる（特開昭６２１
００２９２）。

ＢＴ殺虫蛋白遺伝子は、ＢＴ殺虫蛋白をコードする遺伝
子であれば、染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、合成り
ＮＡ由来等のいずれでもよく、例えば、アイザワイＩＰ
Ｌ株の全プラスミドＤＮＡ或いは全染色体ＤＮＡから遺
伝子ライブラリーを作製し、適当なプローブ、例えば本
閑の類縁株であるバチラス・チュリンゲンシス・ＨＤ−
１グイベル株の殺虫蛋白遺伝子の既知塩基配列から作製
した合成オリゴヌクレオチドをプローブとして用い、こ
のライブラリーをスクリーニングすることにより、得る
ことができる。又、ＢＴ殺虫蛋白遺伝子含有プラスミド
等から制限酵素等を用いて得ることも可能である。例え
ば、１３０ＫＤａ殺虫蛋白遺伝子は、発現プラスミドＰ
ＡＨ８より得られる（特開昭６２−１８１７８４　）　
。

本発明の改変殺虫蛋白遺伝子の好ましい例として、バチ
ラス・チュリンゲンシス・アイザワイ■ＰＬＮ［１７株
の１３０ＫＤａ殺虫蛋白（特開昭６２１００２９２）の
アミノ酸配列において、第６１９番目のアミノ酸残基（
Ａｒｇ）、第６２２番目のアミノ酸残基（Ｌｙｓ）及び
第６３７番目のアミノ酸残基（Ｌｙｓ）のうち少なくと
も１つのアミノ酸残基をアルギニンおよびリジン残基以
外のアミノ酸残基に改変した殺虫活性を有する改変殺虫
蛋白の遺伝子があげられる（但し、塩基番号１〜３の塩
基がコードするメチオニン残基を第１番目のアミノ酸残
基とする）。その具体例は、第２図或いは第３図記載の
塩基配列或いはアミノ酸配列で特定される遺伝子である
。よく知られているように多くのアミノ酸についてはそ
れをコードするＤＮＡ塩基配列は複数存在する。その塩
基配列は一義的に決まらず多数の可能性がありうる。

本発明者により明らかにされたバチラス・チュリンゲン
シス・アイザワイＴＰＬ株の改変殺虫蛋白のアミノ配配
列をコードする遺伝子の場合も、そのＤＮＡ塩基配列は
、多数の可能性があり、本発明の改変殺虫遺伝子の塩基
配列のみに限定されるものではなく、同一のアミノ酸配
列をコードする他のＤＮＡ塩基配列を含むものである。

又、腸管プロテアーゼ活性の弱い害虫或いは腸管プロテ
アーゼ活性が変化したことによりＢＴ蛋白耐性となった
害虫に対しては、その体内で一定時間当たりに存在する
殺虫活性断片量を高めるべく、ＢＴ殺虫蛋白に新たにト
リプシン或いは腸管プロテアーゼが認識し作用するアミ
ノ酸残基を導入するような改変も有効である。

本発明のバチラス・チュリンゲンシス・アイザワイＩＰ
Ｌ株の改変殺虫蛋白遺伝子を適当な発現ベクター、例え
ば、Ｌａｃプロモーターを保持する発現ベクターｐＵｃ
１Ｂ（ファルマシア社）、大腸菌の強力プロモーターで
あるＴａｃプロモーターとｒｒｎＢリポソームＲＮＡの
ターミネータ−を保持する発現ベクターｐＫＫ２２３−
４、Ｔｒｐプロモーターを保持する発現ベクターｐＤＲ
７２０（ファルマシア社）、誘導可能な発現ベクターｐ
ＰＬ−Ｌａｍｂｄａ　（ファルマシア社）等に接続する
ことにより大腸菌等の微生物菌体内でバチラス・チュリ
ンゲンシス・アイザワイＩＰＬ株の改変殺虫蛋白を生産
させる発現ベクターを構築することができる。

本発明の改変殺虫蛋白遺伝子を保持する発現ベクターを
大腸菌〔例えば、大腸菌ＪＭ１０３株、ＪＭ１０９株（
ファルマシア社）等の宿主微生物へ導入することにより
菌体内で改変殺虫蛋白を生産する微生物を得ることがで
きる。

この様にして製造された形質転換微生物を適当な培地、
条件で培養することにより改変殺虫蛋白を大量生産する
ことが可能である。この場合、培養初期に誘導剤イソプ
ロピルチオガラクトシド等を添加することにより改変殺
虫蛋白の生産を有利に行うことができる。

培養後の改変殺虫蛋白の単離は、例えば、菌体を超音波
で破砕し、遠心分離することにより改変殺虫蛋白から成
る凝集体を容易に濃縮、回収することにより行うことが
できる。

また、大腸菌の宿主−ベクター系のみならず、枯草菌、
酵母、シュウトモナス菌、放線菌あるいは旦、土、菌等
の宿主−ベクター系も利用可能であり、それぞれの宿主
−ベクター系の特徴を生かした改変殺虫蛋白の大量生産
が行える。

さらに、改変殺虫蛋白遺伝子を植物用発現ベクター、例
えばカリフラワーモザイクウィルスの３５８プロモータ
ーおよびツバリン合成酵素遺伝子ターミネータ−を保持
するベクターに組み込み、アゲロバクチリアを用いる方
法に代表される遺伝子導入法により植物体に導入し、改
変殺虫蛋白を生産する植物体を得ることも可能である。

以下に実施例を挙げ本発明をさらに詳細に説明する。本
発明は、以下の実施例のみに限定されるものではなく、
本発明の技術分野における通常の変更をすることができ
る。

実施例 組換え体ファージ５Ｋ２Ｕ２の　製 ステップ１：ＤＮＡ断片の切り出し バチラス・チュリンゲンシス・アイザワイＩＰＬＮｏ．
７株（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１１５０）の１３０ＫＤａ殺
虫蛋白遺伝子を含む発現プラスミドｐＡＨ８（特開昭６
２−１８１７８４）の５ａｃｌｘ上」」断片をＭｌ、３
ｍｐ１９ファージにクローン化した。まず、５μｇのプ
ラスミドｐＡＨ８に５ユニツトの制限酵素Ｓａ且■　（
宝酒造）と５ユニツトの制限酵素Ｋｐｎｌ（宝酒造）を
加え、２０μｆのＬｏｗ反応液（ｌｏｍＭ）リス−塩酸
（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ　　ＭｇＣ１ｚ　Ｉ　１ｍＭ
ジチオスレイトール）中で３７°Ｃ１時間反応後、反応
液を０．１／７ｇ／ｄの臭化エチジウムを含む０．８％
の低融点アガロースゲル（ベセスダ・リサーチ・ラボラ
トリ−社製）に供し、アガロース電気泳動を行った。泳
動後、紫外線ランプ下で、０．８ｋｂのＳａ　ｃ　Ｉ−
Ｋｐｎ　ｌＤＮＡ断片に相当するゲル部分を切り出し、
試験管にとり、６５°Ｃで５分間加熱した。融解したゲ
ルに２倍量のＴＥ緩衝液（］ＯｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ
８，０）。

０．５ｍＭ　　ＥＤＴＡ）を加え、ＴＥ１１衝液で飽和
したフェノールを加えて、フェノール抽出を行った。１
０．０００ｒｐｍで５分間遠心し、上層を分取した後、
１／４０量の４Ｍ　　ＮａＣ１および２倍量のエタノー
ルを加えて、−８０’Ｃに１０分間放置することにより
ＤＮＡをエタノール沈澱した後、１０．００Ｏｒｐｍで
１０分間遠心し、ＤＮＡを回収し、１０μｌの蒸留水に
懸濁した。

ステップ２：ベクターの調製 ３／／ｇのファージベクターＭ１３ｍｐ１９（宝酒造）
に３ユニツトの制限酵素５ａｃｌ（宝酒造）および３ユ
ニツトの制限酵素ｘ１且１　（宝酒造）を加え、２０μ
２のＬｏｗ反応液（１０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，５
）、Ｉ　ＯｍＭ　　ＭｇＣ１ｚ。

ＩｍＭ　　ジチオスレイトール）中で３７°Ｃで１時間
反応した。反応後、反応液に等量のフェノール・クロロ
ホルム（１：１）混液を加え、混合し１０．０００ｒｐ
ｍで５分間遠心後、上澄を分取した。つぎに、２倍量の
冷エタノールを加えて、８０’Ｃに１５分間放置した後
、　　１０．００Ｏｒｐｍで１０分間遠心し、ＤＮＡを
回収し、ｌＯμｌの蒸留水に懸濁した。

ステップ３：Ｍｌ換え体ファージ５Ｋ２Ｕ２の作製ステ
ップ１およびステップ２で調製した５ａｃＩｘ上」」断
片およびファージベクターＭ１３ｍＰ１９をそれぞれ０
．　５μｇずつ混合し、全容１０μ２とした。さらに、
ライゲージジンキットＡ液４０μ２およびＢ液５μ！（
いずれも宝酒造より入手）を加え、全容を５５μｌとし
、１６℃で２時間反応した。１０μｌの反応液を１００
μｌの大腸菌ＪＭ１０９株コンピーテントセル（宝酒造
）に加え、水中に３０分間放置した後、４２°Ｃで４５
秒間インキュベートした。水中に１〜２分間放置したあ
と、０．９ｍｌのＹＴ培地（１２あたり１８ｇトリプト
ン（デイフコ社）、５ｇイーストエキストラクト（デイ
フコ社）、５ｇＮａＣｌを含む培地、ｐＨ７，５）を加
える。

別途、３．５ｍのソフトアガー（１００ｍの蒸留水あた
り、０．８ｇ）リプトン、０．５ｇイーストエキストラ
クト、０．５ｇＮａＣｌを含みＰＨ７，５としたあと、
最終０．６％になるよう寒天（デイフコ社）を加えたも
の）を４６°Ｃに保温し、これに前もってＡ。。＝１．
０まで培養した大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造）を２００μ
！加える。さらに先の反応液を１０μＰ加え、混合後、
ＹＴブレー）　（ＹＴ培地に最終濃度１．２％の寒天を
含むもの）に広げた。室温に１５分間放置後３７°Ｃで
１晩インキユベートすることによりプラークを得た。　
　２ＸＹＴ培地（２倍濃度のＹＴ培地）１００ｍに対し
、宿主菌ＪＭ１０９株の前培養液１成を加え、その１．
５ｄを滅菌チューブにとり生じたプラークをツマヨウジ
で上記チューブに移し、３７°Ｃで５時間培養する。　
　ミクロ遠心機で１０゜０００ｒｐｍで５分間遠心し上
澄をファージ液とした。

ウラシル含有Ｓ　Ｋ　２　ｔＪ　２フア一ジ１本１３￥
ＤＮＡの皿臀 ＹＴ培地２０ｄに宿主大腸菌ＢＷ３１３株（ｄＵＴＰａ
ｓｅ欠１貝、ウラシル−Ｎ−グリコシダーゼ欠損変異株
（イー・コーライ・ジェネテイック・ストンク（米国エ
ール大学内）より入手））の前培養液を０．２社植菌し
、ＯＤ５．。が０．４のとき７．ＯＯＯｒｐｍで１０分
遠心し、上清を除く。菌体をＹＴ培地で１回洗浄した後
、ウリジン０．２５ｍｇ／Ｎを含むＹＴ培地２０ｍ１に
懸濁する。５分間３７°Ｃで振とうした後、ステップ３
で調製した５Ｋ２Ｕ２フアージ液を０．４成を加え、３
７”Ｃで１晩培養後、１２．００Ｏｒｐｍで５分間遠心
し上澄をファージ液とした。全く同様の操作をもう一度
くり返した後、ファージ液を得、これをウラシル含有５
Ｋ２Ｕ２フアージ液とした。　次に、１．５ｄのウラシ
ル含有５Ｋ２Ｕ２フアージをエッペンドルフ管に移して
１０．ＯＱＱｒｐｍ、５分間遠心し、上澄を別のエッペ
ンドルフ管に移した。　　２０％ポリエチレングリコー
ル６．０００　（和光）　　２．５Ｍ　　ＮａＣｌ溶液
を２００μｌ加えて、１５分間室温に放置した。　　１
０．００Ｏｒｐｍで２分間遠心し、上清を除いた。ＴＥ
−緩衝液を１００μ！加えてベレツトを溶解し、ＴＥ−
緩衝液−飽和フエノール５０μｆを加えて、約１０秒振
とうする。約１０分放置し、再び振とうする。１０．Ｏ
ＯＯｒｐｍで５分間遠心し、水層をエッペンドルフ管に
移す。

３Ｍ酢酸ナトリウム液１０μ尼を加えて混和した後、２
５０μｌの冷エタノールを加えて混和し、７０°Ｃで５
分間放置する。１０．ＯＯＯｒｐｍで５分間遠心して上
清を除き、沈澱に水冷した８０％エタノール１ｄを加え
て再遠心する。上清を除いて減圧乾燥し、ＴＥ−緩衝液
５０μ２を加えて沈澱を熔解し、−２０°Ｃで保存する
。

合成オリゴヌクレオチドのＡ　（１） バチラス・チュリンゲンシス・アイザワイＩＰＬ７株の
１３０ＫＤａ殺虫蛋白の６１９番目のアルギニン残基を
グルタミン残基に改変するためオリゴヌクレオチドを合
成した０合成したオリゴヌクレオチドの配列は、以下の
ｊ】っである。

５　°−ＣＣＴ丁ＴＴＧＴＧＣＴＴＧＴＴＣＴＡＡＡＴ
ＣＡＴ　　３（下線は改変部位を示す） アプライド、バイオシステム社のＤＮＡ合成合成デモデ
ル３日０ＡいてＤＮＡオリゴマーを合成した後、ＤＮＡ
補集バイアルに２７％水酸化アンモニウムを１−加え、
５５℃で５時間加熱し、＋４縮器にかけ乾固させた。乾
固後１００μｌの０．０１Ｍトリエチルアミン−酢酸（
ＴＥＡＡ）（ｐ　Ｈ７，２）に溶解し、逆相ＨＰＬＣカ
ラムＣ１Ｂにかけ、アセトニトリル−０，１Ｍ　　ＴＥ
ＡＡ　（ｐＨ７，２）の溶媒系で溶出を行った。２６０
ｎｍの吸収ピーク画分を分取し、乾固後１００μ２のア
セトニトリルで調製した８０％酢酸を加え、１５分間放
置した。１５分経過後、淡オレンジ色を呈したら乾固し
、Ｏ，ＯＬＭ　　ＴＥＡＡ　（ｐＨ７，２）１００μ尼
を加えさらに酢酸エチルを１００μ！加え混合した。酢
酸エチル相をすて、ジエチルエーテル１００μＦを加え
、同様の操作を２回行い、乾固した。０．ＯＩＭ　　Ｔ
ＥＡＡ（ＰＨ７゜２）で溶解し、再びＨＰＬＣにより２
６０ｎｍ吸収ピーク画分を分取し、乾固後、１０ｍＭ）
リス塩酸（ｐＨ７，５）、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ　（ＴＥ
）溶液に溶解した０次にオリゴヌクレオチドの５″末端
のりん酸化を行った。約５００ｐｍｏｌの合成オリゴヌ
クレオチド１０μ２に　Ｔ４ポリヌクレオチドカイネー
ス（宝酒造）１μ！（１０ユニツト相当）、１ｍＭ　　
ＡＴＰ　　１．５μｆｆｉ０．１Ｍジチオスレイトール
５μｌおよび蒸留水３２．５μｌを加え、全容５０μ２
のカイネース反応液（５０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，
６）。

１０ｍＭ　　ＭｇＣ１ｇ　）中で３７°Ｃ１特間反応し
た。反応後、６５°Ｃで１０分間熱処理し、りん酸化オ
リゴヌクレオチドを調製した。

合成オリゴヌクレオチドの合成（２） バチラス・チュリンゲンシス・アイザワイＩＰＬ７株の
１３０ＫＤａ殺虫蛋白の６１９番目のアルギニン残基お
よび６２２番目のりジン残基を各々グルタミン残基に改
変するためオリゴヌクレオチドａ４５−に＋を合成した
。合成したオリゴヌクレオチドの配列は、以下の通りで
ある。

５−ＣＴＣＡＴＴＣＡＣＣＧＣＣＴＴＧＴＴＧＴＧＣＴ
ＴＧＴＴＣＴＡＡＡＴＣＡＴＡＴＴ−３’（下線は改変
部位を示す） 次いで、バチラス・チュリンゲンシス・アイザワイＩＰ
ＬＴ株の１３０ＫＤａ殺虫蛋白の６３７番目のりジン残
基をグルタミン残基に改変するためオリゴヌクレオチド
に−２を合成した。合成したオリゴヌクレオチドの配列
は、以下の通りであ５“−ＴＣＡＣＡＴＣＴＧＴＴＴＧ
ＴＡＡＣＣＣＧＡＴＴＴＧ−３”（下線は改変部位を示
す） 以下、上記と同様の方法でアンモニア処理、）ＩＰＬＣ
カラムクロマトグラフィー、カイネース反応を行い、リ
ン酸化オリゴヌクレオチドａ４５−ｋｌおよびリン酸化
オリゴヌクレオチドに−２を得た。

変異体ファージの調製 先に調製したウラシル含有５Ｋ２Ｕ２フアージ１本鎮Ｄ
ＮＡ約１μｇに対し、前述の査底主ユＪヌクレオチドの
合　（１）で合成したりん酸化オリゴヌクレオチド、及
び合成オリゴヌクレオチドの合成（２）で合成した２種
のりん酸化オリゴヌクレオチドを各々１０ｐｍｏ＋相当
加え、全容１４μ歪のアニーリング反応液（１０ｍＭｌ
−リス−塩酸（ｐＨ７，５）、８ｍＭ　　ＭｇＣ１，１
００ｍＭ　　ＮａＣｌ）中で６５°Ｃ５分間インキュベ
ート後、１５０ｄの６５°Ｃ湯浴中で室温まで放置した
。つぎにこの反応液に１μｌの１０ｍＭ　　ｄＮＴＰ、
２ｕｌの１０ｍＭ　　ＡＴＰ、２ｐｌの１００ｍＭ　　
ＤＴＴ、０．２ｕｌのクレノー断片（宝酒造、バイオラ
ボ社）および１μｒのＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）を
加え、３７°Ｃで２時間インキュベートした。この反応
混液に２５０μｌの大腸［ＪＭ１０９コンビ−テントセ
ル（宝酒造）を加え、水中に４０分間装いたのち、４２
°Ｃで２分間熱処理した。常法に従い、大腸菌ＪＭ１０
９株を指示菌としてソフトアガーを用いて、ＹＴプレー
トに広げた。３７°Ｃで１晩インキユベートし、プラー
クを得た。

便宜上、合　オリゴヌクレオチドの合成（１）で合成し
たりん酸化オリゴヌクレオチドを加えたファージにより
生じたプラークをプラーク（１）、合成オリゴヌクレオ
チドの合成（２）で合成したりん酸化オリゴヌクレオチ
ドを加えたファージにより生じたプラークをプラーク（
２）と名付けた。

・　　ファージの確認 ＹＴ培地１００磁に対し、ｌ−の大腸菌ＪＭＩ　０９株
の終夜培養液を加え、１．　５ｍＱづつ培養管にとる。

プラーク（２）をツマヨウジを使って培養管に移し、３
７°Ｃで５時間インキュベートする。

培養後、菌液を１２．００Ｏｒ　ｐ　ｍ、１０分間遠心
し、その上澄みを分取する。２０％ポリエチレングリコ
ール６０００．２．５Ｍ　ＮａＣｌを１３５μｆｆｉ加
え、混合後、室温に１５分間放置する。　１２＋００Ｏ
ｒ　ｐ　ｍ、　５分間遠心後、沈澱画分を得る。　ＴＥ
緩衝液１００μ２に溶解後、５０μｌのＴＥ飽和フェノ
ールによるフェノール抽出を行い、さらに１２．００Ｏ
ｒ　ｐ　ｍ、５分間遠心し、上澄みを分取した。ｌＯμ
！の３Ｍ　Ｎａ０Ａｃおよび２５０Ｉｌｆのエタノール
を加え、混合し、−８０°Ｃで２０分間エタノール沈澱
を行う。遠心により沈澱を集めた後、冷エタノールで洗
浄し、再度遠心にり沈澱を得、ドライ・アップ後、３０
μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。得られた１本鎖ファージ
ＤＮＡを用いて、ダイデオキシ法（Ｍｅｓｓｉｎｇ、　
Ｊ、　（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ　ｓ　１０１　、ｐｐ２０−７８）により、
塩基配列の決定を行い、上記の変異が導入されているこ
とを確認した。

組換え体プラスミド　ＴＡ４５の　築 ２ＸＹＴ培地１００ｄに対し、大腸菌ＪＭＩＯ９株の前
培養液を１ｍ加え、その１，５成を滅菌チューブにとり
、先に生じたプラーク（１）をツマヨウジで上記チュー
ブに移し、３７°Ｃで５時間培養した。前述の方法と同
様に遠心上清をファージ液として回収した。次に２ＸＹ
Ｔ培地１００ｄに対し大腸菌ＪＭ１０９株の前培養液を
１成加え、その５．０ｍｌに対し、ファージ液を２００
μｌ加え、３７°Ｃで一夜培養を行った。１０，０００
ｒｐｍ、５分間の遠心により集菌し、Ｂｉｒｎｂ。

ｉｍらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅ
５７，１５１３−２３．１９７９）に従い２本鎖の複製
型１１ＦＤＮＡを調製した。

得られた変異体ファージのＲＦＤＮＡの約３μｇに対し
、３ユニツトの制限酵素５ａｃｌおよび３ユニ、トの制
限酵素Ｋｐｎｌを加え、２０μ２のＬｏｗ反応液（１０
ｍＭ）リス−塩酸（ＰＨ７，５）、１０ｍＭ　　ＭｇＣ
Ｉｚ、１ｍＭジチオスレイトール〕中で３７°Ｃ１時間
反応後、反応液を０．１ｇｇ／−の臭化エチジウムを含
む０．８％の低融点アガロースゲルに供し、アガロース
電気泳動を行った。　　先に示した方法により０．８ｋ
ｂのＳ　ａ　ｃ　Ｉ　−ＫＬ上且　Ｄ　Ｎ　Ａ断片に相
当するゲル部分を切り出し、フェノール抽出およびエタ
ノール沈澱操作によりＤＮＡを回収し、１ＯｕＱの茎留
水に懸濁した。

つぎに、発現プラスミドｐＴＢ］（特廓昭６２１８１７
８４）のプラスミドＤＮＡを組換え体大腸菌ＪＭ１０３
／ｐＴＢ１からＢｉｒｎｂｏｉｍとＤｏｌｙの方法（Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ　　７，１５１３　
２３．１９７９）により調型し、その約３μｇに対し、
５ユニントの制限酵素５ａｃｌおよび５ユニツトの制限
酵素起上」」を加え、３０μ２のＬｏｗ反応液（前述）
中で３７　”Ｃ１時間反応後、上記と同様に低融点アガ
ロースの電気泳動にかけ旦土且１−に１且ｌの大きい方
のＤＮＡ断片を単離し、フェノール抽出、エタノール沈
澱を行い、ＤＮＡを回収し、２０μｆの蒸留水に懸濁し
た。

このようにして得た約１μｇのｐＴＢＬの５ａｃｌ−に
ヱ」」断片と先に８周製した約ｌμｇの０，８ＫｂＳａ
ｃｌ−基エエＩ断片を混合し、全容１０μ２とし、ＤＮ
Ａライゲーションキット（宝酒造）Ａ液４０μ！および
Ｂ液５μ！を加えて混合し、１６°Ｃで１時間反応した
。

次に、Ｃｏｈｅｎらの方法（Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　Ｉ。

Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ、６９　（＋９７２）２１
１０−２１１４）に従い大腸菌ＪＭ１０３株のコンビ−
テントセルを調製した。調製したＪＭＩ０３株のコンビ
−テントセル１００μｌに対して、先のライゲーション
反応液を５μｌ加えて、常法に従い形質転換を行った。

得られたアンピシリン耐性コロニーを変異体ＴＡ４５と
命名し、セル内に保持されたプラスミドをＰＴＡ４５と
命名した。

組　え　プラスミド　ＡＤＣ３の プラーク（１）の代りにプラーク（２）を用いた以外は
上記と同様の方法に従い、大腸菌ＪＭＩＯ３株の形質転
換を行った。得られたアンピシリン耐性コロニーを変異
体ＡＤＣ３と命名し、セル内に保持されたプラスミドを
ｐＡＤＣ３と命名した。

大腸菌での改変殺虫蛋白の 得られた大腸菌組換え体ＪＭ１０３／ｐＴＡ４５及びＪ
Ｍ１０３／ｐＡＤＣ３が生産するバチラス・チュリンゲ
ンシス・アイザワイＩＰＬ株の改変殺虫蛋白の同定及び
分析を以下の如く行った。大腸菌ＪＭＩ　０３／ＰＴＡ
４５株及びＪＭ１０３／ＰＡＤＣ３株を各々最終濃度５
０μｇ／ｙｄｌのアンピシリンを含むしプロス液体培地
〔１１ｌの蒸留水に対し１０ｇのトリプトン（デイフコ
社）、５ｇのイーストエキストラクト（デイフコ社）、
５ｇのＮａＣｌ、Ｉｇのグルコースを含む、ＰＨ７゜５
の培地〕中で３７゛Ｃで１５時間培養する。

０．３ｄの培養液を分取し、遠心操作（１０，Ｏｏｏｒ
ｐｍ、２分間）により集菌し、１００μ乏のサンプル緩
衝液（６２，５ｍＭトリス−塩酸。

２％（Ｗ／Ｗ）　　ドデシル硫酸ナトリウム、５％（ｖ
／ｖ）２−メルカプトエタノール、１０％（Ｖ／Ｖ）グ
リセロール、０．０１％（Ｗ／Ｖ）ブロムフェノールブ
ルー）に懸濁後、１００℃で５分間熱処理した。１０．
０００ｒｐｍで５分間遠心し上澄を分取した後、その２
０μｌをＬａｅｍｍｌｉの方法（ＮａＬｕｒｅ　　２２
７，６８０−６８５．１９７０）に従って５ＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動にかけた。泳動後、ゲルを
クマジーブリリアントブルーで染色し、脱気乾燥してろ
紙に固定した。その結果、発現プラスミドｐＴＡ４５を
含む大腸菌では、分子１１３０ＫＤａの改変殺虫蛋白バ
ンドが検出された。ゲル上の蛋白バンドをデンシトメー
ターで測定したところ、大腸菌ＪＭ１０３／ｐＴＡ４５
株は全菌体蛋白あたり約３０％の改変殺虫蛋白を生産し
ていた。

又、大腸菌ＪＭ１０３／ｐＡＤＣ３株は全菌体蛋白あた
り約３５％の改変殺虫蛋白を生産していた。

従って、大腸菌組換え体ＪＭＩ　Ｏ３／ｐＴＡ４５及び
ＪＭＩ　０３／ｐＡＤＣ３株は、バチラス・チェリンゲ
ンシス・アイザワイＩＰＬ株の改変殺虫蛋白を効率よく
生産していることが明らかとなった。

大腸菌で生産された改変殺虫蛋白の調製法大腸閉組換え
体ＪＭＩ　Ｏ３／ｐＴＡ４５株及びＪＭ１０３／ｐＡＤ
Ｃ３株をＬブロス液体培地中で一夜培養した後、その０
．１ｍｌを１０ａ＋ｆｉのＬプロス培地に移し、３７°
Ｃで２０時間培養した。培養液５ｄを分取し、６．００
Ｏｒｐｍ、５分間遠心して、菌を集め、−８０“Ｃで凍
結させた後、室温で融解させた。この操作を２回くり返
した後、２ｄのＴＥ緩衝液に懸濁し、３０秒づつ５回の
超音波処理を行った。つぎに、この粗抽出液を７゜００
０ｒｐｍで５分間遠心し沈澱を集めた５ｌｉｌ製した沈
澱画分を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分
析したところ、含まれる全蛋白の少なくとも９０％が殺
虫蛋白であった。従って、上記調製法を用いることによ
り、容易にかつ効率よく殺虫蛋白を調製できることが明
らかとなった。

なお、この調製法は、大量の培養液についても有効であ
ることを確認している。

腸閉で生産された　　　　　白の 前述の方法により、大腸菌組換え体ＪＭ１０３／ｐＴＡ
４５株及びＪＭｌ　０３／ｐＡＤＣ３株から改変ＢＴ殺
虫蛋白を調製した。１０ｇの鱗翅目幼虫用の人工飼料を
準備し、これに各濃度に調製した殺虫蛋白液を０．５ｍ
ｌ加えた。よく混合後、円板プレートに均一に広げたの
ち、ハスモンヨトウ（Ｓ　ａｄｏ　ｔｅｒａ　Ｌｉｔｕ
ｔａ）の３令幼虫を１０頭、放飼した。２５°Ｃに放置
後、３日後の死亡虫数を測定した。対照としては、野性
型として、大腸菌組換え体ＪＭ１０３／ＰＴＢＩ　（特
開昭６２−１８１７８４）から調製した１３０ＫＤａ殺
虫蛋白液、ネガティフ、コントロールとしては蒸留水を
用いた。その結果、ＴＡ４５改変蛋白について、６゜Ｏ
μｇ１ｍｌの蛋白濃度では、ＴＡ４５改変蛋白は３３．
３％の死生率を示したのに対し、野性型は１３．３％の
死生率であった。同様に、４００μｇ　／　ｍｌおよび
１，０００μｇ／ｒｔｒｌの蛋白濃度でも、それぞれ、
死生率が各々１６．７％対１０．０％および５０％０％
対４０ＴＡ４５改変殺虫蛋白は有意に野性型殺虫蛋白よ
り高い殺虫活性を示した。

また、両殺虫蛋白のＬＤ５０値の比をとると、１゜４３
倍となり、改変蛋白の活性が高いことが示された。

又１，６．　Ｄ　Ｃ３改変蛋白について、２００１１ｇ
／Ｉｎｌ１の蛋白濃度では、ＡＤＣ３改変蛋白は４０．
０％の死生率を示したのに対し、野性型は１３．３％の
死生率であった。同様に、４００μｇ／ｍＬ６００ｕｇ
／ｍｌおよび８００ｕｇ／ｍｌ！の蛋白濃度で２も、そ
れぞれ、死生率が各々６０．０％対４０゜０％、９３．
３％対６３．３％および９６．７％対７６．７％とＡＤ
Ｃ３改変殺虫蛋白は有意に野性型殺虫蛋白より高い殺虫
活性を示した。また、両殺虫蛋白のＬＤ５０値の比をと
ると、２．４７倍となり、改変蛋白の活性が高いことが
示された。

【図面の簡単な説明】

第１図は改変殺虫蛋白の発現プラスミドの創製を示す。 第２図は改変殺虫蛋白ＴＡ４５をコードする遺伝子の塩
基配列および塩基配列から推定されるアミノ酸配列を示
している。塩基配列中、塩基番号１番目から３４６５番
目までの領域が殺虫蛋白遺伝子の構造遺伝子をコードす
る領域である。アミノ酸配列中、６１９番目のＡｒｇ残
基が、Ｇｉｎ残基に変換している。 第３図は改変殺虫蛋白ＡＤＣ３をコードする遺伝子の塩
基配列および塩基配列から推定されるアミノ酸配列を示
している。塩基配列中、塩基番号１番目から３４６５番
目までの領域が殺虫蛋白遺伝子の構造遺伝子をコードす
る領域である。アミノ酸配列中、６１９番目のＡｒｇ残
基、６２２番目のＬｙｓ残基、６３７番目のＬｙｓ残基
が、各々Ｇｉｎ残基に変換している。 第４図は、大腸菌組換え体ＪＭＩ　Ｏ３／ＰＴＡ４５で
生産された改変殺虫蛋白の５ＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動パターンのデンシトメータースキャンを示
している。 第５図は、大腸菌組換え体ＪＭ１０３／ｐＡＤＣ３で生
産された改変殺虫蛋白の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動パターンのデンシトメータースキャンを示し
ている。 完 第１図（その２） Ｓａｃ　＋ ｐｎｌ 第５図 第４ 図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）バチラス・チュリンゲンシス・アイザワイＩＰＬ
   株の殺虫蛋白のアミノ酸配列において、腸管プロテアー
   ゼが認識し作用するアミノ酸残基のうち少なくとも１つ
   のアミノ酸残基を、天然のバチラス・チュリンゲンシス
   ・アイザワイＩＰＬ株の殺虫蛋白に存在する、該アミノ
   酸残基以外のアミノ酸残基に改変した殺虫活性を有する
   改変殺虫蛋白の遺伝子（２）バチラス・チュリンゲンシ
   ス・アイザワイＩＰＬ株の殺虫蛋白のアミノ酸配列にお
   いて、アルギニン残基およびリジン残基のうち少なくと
   も１つのアミノ酸残基を、アルギニン残基およびリジン
   残基以外の天然のバチラス・チュリンゲンシス・アイザ
   ワイＩＰＬ株の殺虫蛋白に存在するアミノ酸残基に改変
   した殺虫活性を有する請求項１記載の改変殺虫蛋白の遺
   伝子 （３）バチラス・チュリンゲンシス・アイザワイＩＰＬ
   Ｎｏ．７株の１３０ＫＤａ殺虫蛋白のアミノ酸配列にお
   いて、第６１９番目のアミノ酸残基、第６２２番目のア
   ミノ酸残基及び第６３７番目のアミノ酸残基のうち少な
   くとも１つのアミノ酸残基を、アルギニン残基およびリ
   ジン残基以外の天然のバチラス・チュリンゲンシス・ア
   イザワイＩＰＬ株の殺虫蛋白に存在するアミノ酸残基に
   改変した殺虫活性を有する請求項２記載の改変殺虫蛋白
   の遺伝子 （４）第２図に記載のアミノ酸配列或いは第３図に記載
   のアミノ酸配列で特定される請求項３記載の遺伝子 （５）第２図に記載の塩基配列或いは第３図に記載の塩
   基配列で特定される請求項３記載の遺伝子（６）請求項
   １、請求項２、請求項３、請求項４又は請求項５記載の
   改変殺虫蛋白遺伝子を含みこれを微生物菌体内で発現さ
   せる発現プラスミド（７）発現プラスミドｐＴＡ４５ （８）発現プラスミドｐＡＤＣ３ （９）請求項６、請求項７又は請求項８記載の発現プラ
   スミドにより形質転換され、改変殺虫蛋白を生産する微
   生物 （１０）請求項９記載の微生物を培養し、該微生物の産
   生する改変殺虫蛋白を回収することを特徴とする改変殺
   虫蛋白の製造方法 （１１）バチラス・チュリンゲンシス・アイザワイＩＰ
   Ｌ株の殺虫蛋白のアミノ酸配列において、腸管プロテア
   ーゼが認識し作用するアミノ酸残基のうち少なくとも１
   つのアミノ酸残基を、天然のバチラス・チュリンゲンシ
   ス・アイザワイＩＰＬ株の殺虫蛋白に存在する、該アミ
   ノ酸残基以外のアミノ酸残基に改変した殺虫活性を有す
   る改変殺虫蛋白 （１２）バチラス・チュリンゲンシス・アイザワイＩＰ
   Ｌ株の殺虫蛋白のアミノ酸配列において、アルギニン残
   基およびリジン残基のうち少なくとも１つのアミノ酸残
   基を、アルギニン残基およびリジン残基以外の天然のバ
   チラス・チュリンゲンシス・アイザワイＩＰＬ株の殺虫
   蛋白に存在するアミノ酸残基に改変した殺虫活性を有す
   る請求項１１記載の改変殺虫蛋白 （１３）バチラス・チュリンゲンシス・アイザワイＩＰ
   ＬＮｏ．７株の１３０ＫＤａ殺虫蛋白のアミノ酸配列に
   おいて、第６１９番目のアミノ酸残基、第６２２番目の
   アミノ酸残基及び第６３７番目のアミノ酸残基のうち少
   なくとも１つのアミノ酸残基をアルギニン残基およびリ
   ジン残基以外の天然のバチラス・チュリンゲンシス・ア
   イザワイＩＰＬ株の殺虫蛋白に存在するアミノ酸残基に
   改変した殺虫活性を有する請求項１２記載の改変殺虫蛋
   白 （１４）第２図に記載のアミノ酸配列或いは第３図に記
   載のアミノ酸配列で特定される請求項１３記載の改変殺
   虫蛋白