JPS6170984A - 組換え操作によつて製造されたペプチドを単離するための細菌細胞の機械的破壊方法 - Google Patents
組換え操作によつて製造されたペプチドを単離するための細菌細胞の機械的破壊方法Info
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- JPS6170984A JPS6170984A JP60191818A JP19181885A JPS6170984A JP S6170984 A JPS6170984 A JP S6170984A JP 60191818 A JP60191818 A JP 60191818A JP 19181885 A JP19181885 A JP 19181885A JP S6170984 A JPS6170984 A JP S6170984A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ヨーロッパ特許第A−0.052.861号には、粗換
え操作によって製造されたインターフェロン、とくにI
FN−αを単離するために細菌細胞を化学的に破壊する
方法が記載されている。その方法は以下の工程を特徴と
するものである。
え操作によって製造されたインターフェロン、とくにI
FN−αを単離するために細菌細胞を化学的に破壊する
方法が記載されている。その方法は以下の工程を特徴と
するものである。
(1) 遺伝子工学によって製造されたIFNを含有
する細菌の懸濁液、とくに大腸菌懸濁液を、無機酸によ
ってDH2,0〜2.5に調整し、ll1l菌を死滅さ
せる。
する細菌の懸濁液、とくに大腸菌懸濁液を、無機酸によ
ってDH2,0〜2.5に調整し、ll1l菌を死滅さ
せる。
(2) 死滅した細菌の細胞を除去する。
(3) 得られたバイオマスを緩衝液、たとえばトリ
ス(2−アミノ−2−ヒドロキシメチル−1゜3−プロ
パンジオール)十食塩中に再m濁し、水酸化ナトリウム
溶液でEIH7,3に調整して細菌の細胞壁を破壊する
。
ス(2−アミノ−2−ヒドロキシメチル−1゜3−プロ
パンジオール)十食塩中に再m濁し、水酸化ナトリウム
溶液でEIH7,3に調整して細菌の細胞壁を破壊する
。
(4) 細菌細胞を除去したのち、溶液中に含まれて
いるインターフェロンを分離し、公知方法でさらに精製
する。
いるインターフェロンを分離し、公知方法でさらに精製
する。
インターフェロンのようなポリペプチドが機械的影響下
に置いたとき、不安定であることも知られている(プロ
シーデイングズ・オブ・ザ・ソサイアテイ・フォア・エ
クスベリメンタル・バイオロジー・アンド・メデイシン
(Proc、 SOC,Exp。
に置いたとき、不安定であることも知られている(プロ
シーデイングズ・オブ・ザ・ソサイアテイ・フォア・エ
クスベリメンタル・バイオロジー・アンド・メデイシン
(Proc、 SOC,Exp。
Biol、 Hed、) 、第146巻、249〜25
3頁参照〕。しかも、このような機械的影響が、細菌細
胞め機械的破壊時に発生するfJJ断力の結果として生
じる。このような理由から、遺伝子工学によって形成さ
れたポリペプチド、たとえばインターフェロンを単離す
る方法として、このポリペプチドを高収率に単離できる
細菌111胞壁の機械的破壊はこれまで知られていなか
った。
3頁参照〕。しかも、このような機械的影響が、細菌細
胞め機械的破壊時に発生するfJJ断力の結果として生
じる。このような理由から、遺伝子工学によって形成さ
れたポリペプチド、たとえばインターフェロンを単離す
る方法として、このポリペプチドを高収率に単離できる
細菌111胞壁の機械的破壊はこれまで知られていなか
った。
したがって、本発明の目的は、組換え操作によって製造
されたポリペプチドを細菌細胞の機械的破壊によってa
菌lll胞から抽出する改良方法の探究にあった。
されたポリペプチドを細菌細胞の機械的破壊によってa
菌lll胞から抽出する改良方法の探究にあった。
本発明は、この目的が、組換え操作によって得られたポ
リペプチド、たとえば酸安定性インターフェロンを含有
する細菌を無機酸を用い公知方法で死滅させ〔たとえば
、ワルロイサーほか(に。
リペプチド、たとえば酸安定性インターフェロンを含有
する細菌を無機酸を用い公知方法で死滅させ〔たとえば
、ワルロイサーほか(に。
H,Wallausser & H,5cha+idt
) :殺菌、湯舟、貯蔵、化学療法一方法、活性物質
、試験方法(5teri I 1sation、 0e
sinrektion、にonscrv;eruna。
) :殺菌、湯舟、貯蔵、化学療法一方法、活性物質
、試験方法(5teri I 1sation、 0e
sinrektion、にonscrv;eruna。
Chemotherapie−Verfahren、
WirkstoHe。
WirkstoHe。
Prufungsverfahren ) 、ゲオルり
・テイーメ争フエルラーク(Geora Th1ea+
e Verlag) 、シュトウトガルト(Stutt
lllart ) 、1967年、145〜161頁参
照〕、これを分離したのち、得られたバイオマスをρ8
2.0〜4.0の酸の水溶液、たとえば希jJA酸のよ
うな無機酸または酢酸もしくはプロピオン酸のようなア
ルカン酸の水溶液に再懸濁し、細菌の細胞壁を発生させ
た剪断力により、たとえばホモゲナイザー好ましくはウ
ルトラータラツクス(Llltra−Turrax)型
ホモゲナイザーを用いて機械的に破壊し、ついで得られ
た懸濁液を中和したのち、細胞層を除去し、溶液中に存
在するポリペプチドを分離し、公知方法でさらに精製す
ることにより達成されることを発見し、完成されたもの
である。
・テイーメ争フエルラーク(Geora Th1ea+
e Verlag) 、シュトウトガルト(Stutt
lllart ) 、1967年、145〜161頁参
照〕、これを分離したのち、得られたバイオマスをρ8
2.0〜4.0の酸の水溶液、たとえば希jJA酸のよ
うな無機酸または酢酸もしくはプロピオン酸のようなア
ルカン酸の水溶液に再懸濁し、細菌の細胞壁を発生させ
た剪断力により、たとえばホモゲナイザー好ましくはウ
ルトラータラツクス(Llltra−Turrax)型
ホモゲナイザーを用いて機械的に破壊し、ついで得られ
た懸濁液を中和したのち、細胞層を除去し、溶液中に存
在するポリペプチドを分離し、公知方法でさらに精製す
ることにより達成されることを発見し、完成されたもの
である。
組換え操作によって製造された酸安定性インターフェロ
ン、たとえばIFN−α(artJ)のようなα−イン
ターフエロンを単離するためには、本発明の方法をDH
2,5〜3.5、好ましくはpH2,5の希塩酸中また
は1%酢酸中で行うのがとくに有利である。
ン、たとえばIFN−α(artJ)のようなα−イン
ターフエロンを単離するためには、本発明の方法をDH
2,5〜3.5、好ましくはpH2,5の希塩酸中また
は1%酢酸中で行うのがとくに有利である。
細菌細胞壁を溶解するのに十分なホモゲナイザーの速度
および時間の長さはバイオマスの密度による。代表的な
バイオマス密度は約1.03〜約1.05である。細菌
細胞壁を溶解するには代表的にはホモゲイザーの速度は
約5000〜約10000 r、piで、かつ時間は約
1分〜約10分間である。而して、たとえば、バイオマ
ス密度1.04の場合、ホモゲイザーの速度は望ましく
は約7000〜8000rpIllで、時間は約2分間
である。
および時間の長さはバイオマスの密度による。代表的な
バイオマス密度は約1.03〜約1.05である。細菌
細胞壁を溶解するには代表的にはホモゲイザーの速度は
約5000〜約10000 r、piで、かつ時間は約
1分〜約10分間である。而して、たとえば、バイオマ
ス密度1.04の場合、ホモゲイザーの速度は望ましく
は約7000〜8000rpIllで、時間は約2分間
である。
また、場合によっては、沈殿剤たとえばポリエチレンイ
ミンを0.1〜0.5%の濃度で、ホモゲネーション侵
、中和前に添加するのが有利である。
ミンを0.1〜0.5%の濃度で、ホモゲネーション侵
、中和前に添加するのが有利である。
本発明の方法は、何よりも、実験室的規模の場合はIK
A−ウルトラータラツクス(U−1tra−Turra
x) T 45を用いて、大規模の場合にはディスパッ
クス・リアクター(口1spax Reactor)
3−6/6を用いて実施するのが好ましい〔いずれもヤ
ング・ラント・クンケル・ケージ−(Janke &に
unkelにG 、D−7831スタウフエン(Sta
ufen )製)。
A−ウルトラータラツクス(U−1tra−Turra
x) T 45を用いて、大規模の場合にはディスパッ
クス・リアクター(口1spax Reactor)
3−6/6を用いて実施するのが好ましい〔いずれもヤ
ング・ラント・クンケル・ケージ−(Janke &に
unkelにG 、D−7831スタウフエン(Sta
ufen )製)。
ウルトラ・タラツクスT45は分散装置で、羽根が環状
に配置されたスロットに対して高速で回転し、この著し
い乱流領域でバクテリアの細胞が押しつぶされる。バク
テリアの細胞を破壊するためには、ホモジナイズするメ
ジウムをとったビーカー内にこの装置を保持し、ポンプ
作用でメジウムを循環させる。
に配置されたスロットに対して高速で回転し、この著し
い乱流領域でバクテリアの細胞が押しつぶされる。バク
テリアの細胞を破壊するためには、ホモジナイズするメ
ジウムをとったビーカー内にこの装置を保持し、ポンプ
作用でメジウムを循環させる。
この装置の速度は約5000〜約i ooo。
rpmであり、約1〜10分後に溶解が完了する。
これに対し、ディスパックス・リアクター3−6/6ホ
モジナイザーは、自動誘導式の三段ウルトラ・タラツク
スであり、バクテリア細胞はすべて、一定の流速でホモ
ジナイズ空を通過させられる。その結果、均一に粉砕、
ホモジナイズされたバクテリアのプレバレージョンが得
られる。このディスパックス・リアクターの回転速度は
3.000〜8.OOOrpm F、供給圧カバ排出口
部で大きくて約2バールである。
モジナイザーは、自動誘導式の三段ウルトラ・タラツク
スであり、バクテリア細胞はすべて、一定の流速でホモ
ジナイズ空を通過させられる。その結果、均一に粉砕、
ホモジナイズされたバクテリアのプレバレージョンが得
られる。このディスパックス・リアクターの回転速度は
3.000〜8.OOOrpm F、供給圧カバ排出口
部で大きくて約2バールである。
約501の使用バイオマスを完全に溶解する時間は約1
〜10分間である。
〜10分間である。
第1図にディスパックス・リアクター3−6/6型ホモ
ジナイザ一全体の横断面を示す。図中、Fはホモジナイ
ズする材料供給室であり、Eは駆動シャフトH上スライ
ディング環状シールであり、Gはこの駆動シャフトの主
要ベアリングである。
ジナイザ一全体の横断面を示す。図中、Fはホモジナイ
ズする材料供給室であり、Eは駆動シャフトH上スライ
ディング環状シールであり、Gはこの駆動シャフトの主
要ベアリングである。
駆動シャフト上には3個の円筒状ローターCが一列に配
置され−1これは、ホモジプイず−の外被壁内側に固定
され、相当する形状に作られた静止翼りとたがいにかみ
合っている。駆動シャフトの末端にはらせん状コンベヤ
ーBが固定され、これは排出口部Aに突出している。静
止翼を冷却するためには、冷却水の通路として導入口り
と排出口Kをもら、静止翼の周囲に拡がる冷却空が設け
られている。主要ベアリング上のスライディング環状シ
ールには、水導入口Jから冷却水が、好ましくは加圧下
たとえば1.5バールで供給される。円筒状のローター
は、二重ドラムもしくは三重ドラムまたは多重ドラムと
して構築され、ドラムの壁部は相当する静止翼の相対す
るドラム壁内の隙間に突出している。らせん状コンベヤ
ー8が駆動されると、ホモジナイズされる液体がロータ
ーと静止翼の間の隙間を通って流れ、ローターの高速回
転の結果、生じた剪断力によってバクテリアの細胞壁が
破壊され、ホモジナイズされた物質は排出口部Aを通っ
てホモジナイザー外に出る。
置され−1これは、ホモジプイず−の外被壁内側に固定
され、相当する形状に作られた静止翼りとたがいにかみ
合っている。駆動シャフトの末端にはらせん状コンベヤ
ーBが固定され、これは排出口部Aに突出している。静
止翼を冷却するためには、冷却水の通路として導入口り
と排出口Kをもら、静止翼の周囲に拡がる冷却空が設け
られている。主要ベアリング上のスライディング環状シ
ールには、水導入口Jから冷却水が、好ましくは加圧下
たとえば1.5バールで供給される。円筒状のローター
は、二重ドラムもしくは三重ドラムまたは多重ドラムと
して構築され、ドラムの壁部は相当する静止翼の相対す
るドラム壁内の隙間に突出している。らせん状コンベヤ
ー8が駆動されると、ホモジナイズされる液体がロータ
ーと静止翼の間の隙間を通って流れ、ローターの高速回
転の結果、生じた剪断力によってバクテリアの細胞壁が
破壊され、ホモジナイズされた物質は排出口部Aを通っ
てホモジナイザー外に出る。
原理的には、この方法は、細胞崩壊用の他の公知の機械
的方法、たとえば、生化学技術(Biochemica
l Engineering ) 358 f f頁(
第2版、アカデミツクプレス(Academic Pr
ess)1973)に記載された方法でも実施できる。
的方法、たとえば、生化学技術(Biochemica
l Engineering ) 358 f f頁(
第2版、アカデミツクプレス(Academic Pr
ess)1973)に記載された方法でも実施できる。
しかしながら、収率は低く、本発明の方法により、ウル
トラ・タラツクスT45またはディスパックス・リアク
ター3−6/6を使用ずれば、供給したバイオマスに対
して、これまで知られた方法によるよりも高い収率で、
たとえばインターフェロンが得られる。これは、これま
で報告されている従来技術からは、全く予期できないも
のであった。
トラ・タラツクスT45またはディスパックス・リアク
ター3−6/6を使用ずれば、供給したバイオマスに対
して、これまで知られた方法によるよりも高い収率で、
たとえばインターフェロンが得られる。これは、これま
で報告されている従来技術からは、全く予期できないも
のであった。
次に、本発明を実施例によってさらに詳細に説明するが
、これはいかなる意味でも、本発明を限定するものでは
ない。
、これはいかなる意味でも、本発明を限定するものでは
ない。
し
ヒトインターフェロンα−2を含有する大腸菌クローン
HB101/pER33(ヨーロッパ特許出願箱A−0
,115,613号参照)のバクテリア懸濁液のpHを
無機酸で2.0〜2.5に調整し、バクテリアを死滅さ
せる。バクテリアの死滅細胞を懸濁液から分離し、−2
0℃で低温凍結する。
HB101/pER33(ヨーロッパ特許出願箱A−0
,115,613号参照)のバクテリア懸濁液のpHを
無機酸で2.0〜2.5に調整し、バクテリアを死滅さ
せる。バクテリアの死滅細胞を懸濁液から分離し、−2
0℃で低温凍結する。
低温凍結したバイオマス20Kg、バッチAを8℃で1
%酢fli2501に懸濁した。バイオマスが完全に融
解したのち、三段ホモジナイズ−(ディスパックス3−
6/6)で分散させた。完全に分散された分解液に0.
1%ポリエチレンイミンを沈殿補助剤として加えた。つ
いで、5N水酸化ナトリウム溶液を用いてpHを7.5
に調整した。2時間抽出したのち、浸出されたバイオマ
スを、プレートセパレーター〔ウエストファリア(We
stfalia ) )を用い通過速度1.51/分で
分離した。澄明な液体からサンプルを採取し、インター
フェロンおよび蛋白質の含量の定量試験を行った。収f
fi:46.9x1061.U、/バイオマス1g。
%酢fli2501に懸濁した。バイオマスが完全に融
解したのち、三段ホモジナイズ−(ディスパックス3−
6/6)で分散させた。完全に分散された分解液に0.
1%ポリエチレンイミンを沈殿補助剤として加えた。つ
いで、5N水酸化ナトリウム溶液を用いてpHを7.5
に調整した。2時間抽出したのち、浸出されたバイオマ
スを、プレートセパレーター〔ウエストファリア(We
stfalia ) )を用い通過速度1.51/分で
分離した。澄明な液体からサンプルを採取し、インター
フェロンおよび蛋白質の含量の定量試験を行った。収f
fi:46.9x1061.U、/バイオマス1g。
ホモジナイザーのインターフェロ収量に対する影響を評
価するため、懸濁したバイオマスを分散前に採取し、ヨ
ーロッパ特許出願用A−0,052,861号に従って
、ホモジネーション工程を行わずに抽出した。3N水酸
化ナトリウム溶液でl)Hを7.3に調整した。1時間
抽出したのち、実験室的遠心分離によって浸出バイオマ
スから分解液を分離した。上述したと同様にして、上澄
液からサンプルを採取し、インターフェロンおよび蛋白
質含量の定量試験を行った。
価するため、懸濁したバイオマスを分散前に採取し、ヨ
ーロッパ特許出願用A−0,052,861号に従って
、ホモジネーション工程を行わずに抽出した。3N水酸
化ナトリウム溶液でl)Hを7.3に調整した。1時間
抽出したのち、実験室的遠心分離によって浸出バイオマ
スから分解液を分離した。上述したと同様にして、上澄
液からサンプルを採取し、インターフェロンおよび蛋白
質含量の定量試験を行った。
ヨーロッパ特許出願用A−0,052,861号に従っ
た場合の収量:25.3x1061.U。
た場合の収量:25.3x1061.U。
/バイオマス1g。
例2
バッチBのバイオマスを用い、例1と同様に処理した。
[ffi:21.3X1061.LJ、/バイオマスg
ヨーロッパ特許出願用A−0,052,861号に従っ
た場合の収量:9.7x1061.U。
た場合の収量:9.7x1061.U。
/バイオマス1g。
例3
バッチCのバイオマスを用い、例1と同様に処理した。
収E: 13.8X1061 、U、/バイオマス1g
ヨーロッパ特許出願用A−0,052,861号に従っ
た場合の収量:5.1x1061.U。
た場合の収量:5.1x1061.U。
/バイオマス1g。
バッチBG24のバイオマス1.000gを用い、これ
を希塩酸(pH2,5: 37%塩酸4mを水で10,
0OOdとした)10.000d中にとり、IKAウル
トラ・タラツクスT45を用いて分散させ、例1と同様
に処理した。
を希塩酸(pH2,5: 37%塩酸4mを水で10,
0OOdとした)10.000d中にとり、IKAウル
トラ・タラツクスT45を用いて分散させ、例1と同様
に処理した。
収ffi:50X1061.U、/バイオ?ス19
第1図は、本発明によるバクテリア細胞の機械的破壊に
使用できる装置の一例、ディスパックス・リアクター(
Dispax−Reactor) 3−6 / 6型の
ホモジナイザーの断面図を示し、A:供給液体の排出口
部、B:らせん状コンベヤー、C:円筒状ローター、D
=静止翼、Eニスライディング環状シール、F:供給液
体導入部、G:主要ベアリング、H:駆動シャフト、J
:冷却用水導入口、KおよびL:静止翼用冷却水のそれ
ぞれ導入口、排出口である。
使用できる装置の一例、ディスパックス・リアクター(
Dispax−Reactor) 3−6 / 6型の
ホモジナイザーの断面図を示し、A:供給液体の排出口
部、B:らせん状コンベヤー、C:円筒状ローター、D
=静止翼、Eニスライディング環状シール、F:供給液
体導入部、G:主要ベアリング、H:駆動シャフト、J
:冷却用水導入口、KおよびL:静止翼用冷却水のそれ
ぞれ導入口、排出口である。
Claims (10)
- (1)遺伝子工学によつて製造されたポリペプチドを含
有する細菌細胞をpH2.0〜4.0の酸の水溶液に懸
濁して機械的に破壊し、ついで得られた懸濁液中に存在
するポリペプチドを分離し、公知方法でさらに精製する
ことを特徴とする、組換え操作によつて製造されたポリ
ペプチドの単離方法 - (2)組換え操作によつて製造された酸安定性インター
フエロンを含有する細菌細胞を使用する特許請求の範囲
第1項記載の方法 - (3)組換え操作によつて製造されたα−インターフエ
ロンを含有する細菌細胞を使用する特許請求の範囲第1
項記載の方法 - (4)組換え操作によつて製造されたIFN−α2(a
rg)を含有する細菌細胞を使用する特許請求の範囲第
1項記載の方法 - (5)pH2.5〜3.5において実施する特許請求の
範囲第2項から第4項までのいずれかに記載の方法 - (6)細菌細胞は発生させた剪断力によつて破壊する特
許請求の範囲第1項から第5項までのいずれかに記載の
方法 - (7)細菌細胞はホモゲナイザーを用いて破壊する特許
請求の範囲第1項から第6項までのいずれかに記載の方
法 - (8)使用するホモゲナイザーは、ウルトラ−タラツク
ス(Ultra−Turrax)型のホモゲナイザー、
好ましくはデイスパツクス−リアクター(Dispax
−Reactor)3−6/6である特許請求の範囲第
7項記載の方法 - (9)使用する酸は、無機酸、または酢酸もしくはプロ
ピオン酸のようなアルカン酸である特許請求の範囲第1
項から第8項までのいずれかに記載の方法 - (10)使用する酸の水溶液は、希塩酸(pH2.5)
または1%酢酸である特許請求の範囲第1項から第9項
までのいずれかに記載の方法
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE3432196.9 | 1984-09-01 | ||
DE19843432196 DE3432196A1 (de) | 1984-09-01 | 1984-09-01 | Neues mechanisches aufschlussverfahren von bakterienzellen zur isolierung von rekombinant hergestellten peptiden |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6170984A true JPS6170984A (ja) | 1986-04-11 |
JPH078238B2 JPH078238B2 (ja) | 1995-02-01 |
Family
ID=6244436
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP60191818A Expired - Lifetime JPH078238B2 (ja) | 1984-09-01 | 1985-08-30 | 組換え操作によつて製造されたペプチドを単離するための細菌細胞の機械的破壊方法 |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0173924B1 (ja) |
JP (1) | JPH078238B2 (ja) |
KR (1) | KR930002886B1 (ja) |
AT (1) | ATE49231T1 (ja) |
DE (2) | DE3432196A1 (ja) |
DK (1) | DK165748C (ja) |
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