KR900005319B1 - 은행엽에서 유효생리활성물질을 추출정제하는 방법 - Google Patents

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Description

은행엽에서 유효생리 활성물질을 추출정제하는 방법

제1도는 본 발명의 방법에 따라 실시예 2에서 제조된 혼합물에 대해 유효생리활성물질의 정량적 분석을 한 고속액체크로마토 그라피이고,

제2도는 종래방법에 따른 비교예에 의해 얻어진 목적물에 대해 유효생리활성물질의 정량적 분석을 한 고속액체크로마토그라피이며,

제3도는 본 발명에 따른 실시예 2 및 종래방법에 의한 비교예에서의 각 목적물에 대한 유효생리활성물질의 정성적 확인을 위한 박층크로마토그라피이며,

본 발명은 은행옆으로부터 유효생리활성물질을 추출 정제하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 용매추출후 산도를 조절하고 농축 정제하므로 비교적 간단한 방법으로도 고수율의 유효생리활성물질을 추출해내는 신규한 방법에 관한 것이다.

은행나무는 계통발생학적으로 볼 때 현존하는 가장 오래된 나무이며, 그 열매인 은행은 옛부터 약용, 식용으로 널리 이용되어 왔었다. 또한, 은행옆은 높은 산함량으로 인하여 살충작용을 발휘하기 때문에 은행나무에는 해충이 기생할 수가 없으며, 특히 박테리아, 바이러스, 곰팡이 등에 대해서 완전한 저항력을 가지고 있는바, 그렇기 때문에 은행나무가 장수하게 된 것으로 인식되고 있다.

한편, 이러한 은행나무에 대해서는 위와 같이 여타식물과 다른 특이한점 때문에 그 뿌리, 껍질, 씨, 열매, 은행엽 등에 대한 의약적 유용성에 대한 여러가지 화학적 연구조사가 계속되어 왔으며, 그 결과로 여러가지의 유효한 화합물들이 규명되었다.

구체적으로, 은행나무의 열매에는 페놀성 화합물계, 징코올(Ginkgol), 빌보볼(Bilobol), 징코올산(Ginkgolic acid)등이 함유되어 있으며, 은행나무의 씨에는 청산배당체(cyanogeneticglcosides), 아미노산등이 함유되어 있는 것으로서 밝혀져 있으며, 또 은행옆에는 방향족 화합물로서 특히 페놀합성물계, 플라보노이드 배당체, 플라보노이드 비배당체인 쿼세틴(Quercetic), 이소쿼세틴(Iso Quercetin), 캄프페롤(Kaempferol), 루테오린(Luteolin)등과, 터페노이드(Terpenoid) 화합물인 징코라이드(Ginkgolide A, B, C, M), 빌로발리드(Bilobalid)등이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다.

이와같이, 의약적 유용성면에서 볼 때 은행엽 부분은 여러 가지 유효활성물질이 다량 함유되어 있음을 알수 있는데, 이러한 은행엽으로부터의 추출액은 1965년 이래로 혈관 및 혈류장애의 치료에 사용되어 왔으며, 콜레스테롤 감소, 관상동맥의 확장, 혈액순환의 중진 및 혈압의 저항 감소작용에 현저한 효능을 나타내고, 관상성 심장질환의 협심증 및 고혈압증에 치료효과가 있는 것으로 밝혀져 있다.

그중에서도, 특히 은행엽에 하수오, 구등(鉤藤), 갈근, 택사를 혼합하여 복합제제로 제조하게 되면 심장 및 뇌혈관 계통의 질병치료에 좋은 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

한편, 상기와 같은 은행엽으로부터 유효생리활성물질을 추출정제하는 방법이 다수 공지되어 있는바, 예컨대 일본 특허공고 소 46-28092호에서는 은행엽을 물과 저급알코올의 혼합용매 또는 물과 저급케톤과의 혼합용매로 추출하고, 이 추출액을 물과 혼화되지 않은 지용성 유기용매로 다시 추출하여 생리활성물질을 분리해내는 방법이 기술되어 있다.

또, 일본특허공고 소 49-27323호에서는 은행엽을 함수지방족 케톤 또는 알코올로 추출하고, 이 추출액을 물과 혼합하지 않는 지용성 유기용매로 추출한 후 함수유기용제 추출액에 황산암모늄을 가한 다음, 이 용액을 메틸 에틸케톤으로 추출하여 생리활성물질을 얻어내는 기술이 개시되어 있다.

또한, 국내특허공고 제81-333호에서도 은행엽을 저지방족 케톤 또는 저 지방족 알코올 수용액으로 추출한 추출액을 물에 불용성인 유기용매로 다시 추출하여 원하는 생리활성물질을 분리해내는 방법이 기술되어 있다.

이와같이, 상기의 종래 방법들은 모두가 은행엽으로부터 물과 저급 알코올 또는 저급케톤과의 혼합용매를 사용하여 유효활성성분을 추출하여 왔다.

그러나, 상기와 같은 종래의 방법을 이용할 경우 그 추출액에 다량의 불순물이 혼입되기 때문에 이를 정제하기 위해서는 대단히 여러 단계의 공정을 거쳐서 생리활성물질을 추출정제해야 하는 문제가 있어서 공업적으로 매우 비경제적이었다.

따라서, 본 발명자들은 상기와 같은 종래의 방법에서의 문제점을 해소하기 위해 오랜 연구 끝에 은행엽으로부터 유효생리활성성분을 추출정제함에 있어서, 종래에 사용되지 아니하였던 조성의 혼합용매를 사용하여 추출하게되면 추출액에 불순물이 혼입되는 량이 크게 줄어들게 되어 간단한 조작으로도 순수한 생리활성물질을 고수율로 추출정제할 수 있다는 놀라운 사실을 발견하여 본발명을 완성하게 되었다.

즉, 본 발명의 목적은 은행엽으로부터 유효생리활성물질을 추출정제함에 있어서, 새로운 조성의 혼합용매을 사용하여 추출하고 pH조절후 농축, 정제하므로써 간단하고 경제적인 방법으로 고농도, 고수율의 생리활성물질을 추출정제하는 새로운 방법을 제공하는데 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다. 본 발명은 은행옆으로부터 용매추출에 의해 유효생리활성물질을 추출 정제함에 있어서, 건조은행엽을 저급알코올과 저급아세테이트 또는 저급알코올과 저급케톤의 혼합용매로 추출한 다음, 이 추출액을 증발시켜서 얻어진 잔류물을 저급알코올 수용액 또는 저급케톤 수용액에 용해시킨 후, 이를 산으로 pH 3~5, 바람직하기로는 pH 4로 조절하여 생성된 침전물을 여과하고, 다시 알카리로 pH 6~8로 조절한 다음, 농축시켜서 얻어진 농축잔사를 에틸알코올에 용해시키고 농축시키는 것을 그 특징으로 한다.

이과같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다. 본 발명에서 건조된 은행엽은 저급알코올과 저급 아세테이트 또는 저급알코올과 저급케톤의 혼합용매로 추출한 다음 농축 건조시키고, 여기에다 30~70%의 저급알코올 또는 저급케톤 수용액을 넣어 교반, 용해시킨후 산을 이용하여 pH 3~5, 더욱 좋기로는 pH 4가 되도록 조절하여 이때 생성된 침전물은 여과한다.

이렇게 얻어진 여액에 알카리를 가하여 pH가 6~8이 되도록 조절하고 농축시킨 다음에 얻어진 잔사를 에틸알코올에 용해시킨후 황산나트륨을 가하여 수분을 제거하고 이를 농축건조시켜서 은행엽의 유효생리활성추출물을 얻는다.

본 발명에 따라 상기와 같이 얻어진 은행엽추출물은 정제 및 액제등으로 제제화하여 경구용으로 사용할 수가 있게 된다.

한편, 본 발명에 따라 제조된 추출물을 더욱 정제하게 되면 주사용 제제로도 사용할 수가 있는바, 주사제로 정제하기 위해서는 상기 추출물중에서 주사용 약제의 안정성을 훼손하는 예컨데 폴리페놀, 단백질 성분, 지방산, 알칼로이드 등의 미지물질들을 제거할 필요가 있다.

따라서, 이 경우에는 상기 농축잔사를 에틸알코올에 용해시킨 후에 예컨대, 질산비스무스와 같은 비스무스화합물현탁액을 넣고 교반한 다음, 여기에다 예컨대 부틸알코올과 같은 물에 불용성인 저급알코올이나 저급아세테이트 또는 케톤류의 유기용매를 가하고, 여기서 분리된 상등액을 농축, 건조한 후 얻어진 잔류물을 다시 에틸 알코올 수용액에 용해시킨 다음, 이를 저온에서 방치하여 생성된 침전물을 여과하고 건조시키는 정제과정을 거치면서 주사용제제로 사용가능하게 된다.

이러한 추가정제 과정에서는 상기 상등액을 농축, 건조할 때 미량의 색소 및 지방물질등을 제거하기 위해 활성탄 또는 셀라이트 등의 흡착제를 넣고 혼합한 다음에 여과시키며, 그 여액을 농축, 건조시킨 분말상의 잔류물을 에틸알코올수용액에 용해시킬 때 저온에서 약 48시간 동안 방치시킨 후 침전을 제거하면 매우 순수하게 정제된 주사용 유효생리활성물질의 혼합물이 얻어지게 되는 것이다.

이와같은 본 발명에서 알카리용액의 중화에 사용되는 산으로서는 통상의 산인, 예컨대, 염산, 황산, 초산등의 무기산 또는 유기산이 사용될 수 있으며, 중화시킨 후에는 pH를 2~6, 바람직하게는 pH를 3~5, 더욱 좋기로는 pH4로 조절하여 생성되는 침전을 여과한다.

이때의 pH가 6이상이 되면 클로로필과 같은 불필요한 물질들이 분해되어 용해될 우려가 있고, 2이하이면 유효생리활성물질의 안정성에 문제가 발생될 수가 있다.

은행잎 엑기스에 함유되어 있는 유효생리활성 물질로는 플라보노이드 배당체와터페노이드 화합물임이 밝혀졌으며, 특히 플라보노이드 배당체중 캄프페롤 글리코람 노사이드 쿠마릭에스터(kaempferol-3-o-α-(6'"-p-coumaryl-glucosyl-β-1.4-rhamnoside))와 퀘세틴 글리코람노사이드 쿠마릭에스터 (Quercetin-3-o-α-(6'"-p-coumaryl-glucosyl-β-1.4-rhamnoside))화합물은 가장 중요한 유효생리활성물질로 알려져 있다(Arztezeitschrift Fur Naturheilverfahren, 22, 1981, 593-604).

따라서, 본 발명으로 얻어진 은행잎 액기스에는 이러한 두 유효생리혼합물질이 기존 방법에서 제조된 엑기스 보다 매우 높은 함량으로 존재하는 것으로 나타났다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 방법은 종래와는 달리 혼합용매로 추출한 후 재차 혼합용매수용액에 용해시키고, 이를 pH를 조절하여 불순물을 제거한 후 농축시키거나, 그후 비스무스혼합물을 이용하여 재차 정제하므로써 매우 간단하고도 경제적인 방법으로 은행엽으로부터 고순도의 유효생리활성물질을 추출정제할 수 있는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거 상세히 설명하면 다음과 같다.

[실시예 1]

잘게 분쇄한 건조은행입 100g을 부칠알콜-에틸아세테이트(3:1) 혼합용액 1l씩 3회 반복하여 80℃에서 약 8시간 동안 추출 여과하고 여액을 모아 증발농축시킨다.

잔사에 30% 에틸알콜수용액 1ℓ를 가하여 교반용해시킨후 NaCl 포화수용액 0.5l를 가하고 0.2몰 KH₂PO₄수용액으로 pH 약 4로 조정하고 교반하여 방치한다.

이때 생성되는 침전물을 여과하고 NaHCO₃포화수용액을 가하여 여액을 다시 pH 6~8로 만든 후 증발 농축시킨다. 잔사를 에칠알코올에 녹인 후 황산나트륨을 가하여 수분을 제거한 후 여과하고 여액을 농축 건조하면 약 9.5g의 건조분말을 얻는다. 이 혼합물을 정제, 액제 또는 당의정으로 사용가능하다.

[실시예 2]

은행엽 건조분말 100g을 메칠알콜-메칠에틸케톤(2:1) 혼합용애 1l에 넣고(3회 반복) 역류시키면서 약 9시간 동안 추출 여과하고 여액을 증발 농축시킨다.

잔사에 30% 아세톤수용액 1l을 가해 교반 용해시킨 후 NaCl 포화수용액 0.5l를 가한 후 황산암모늄을 가해 pH 4로 조정하고 교반하여 방치한다.

생성되는 침전물을 여과하고 묽은 NaOH 수용액을 가해 여액을 다시 pH 6~8로 만든 후 증발 농축시킨다. 잔사를 에칠알콜에 녹이고 황산나트륨을 가해 수분을 제거한 후 여과하고 여액을 농축 건조하면 약 11.2g의 고체 분말을 얻는다.

순수한 유효생리활성물질을 얻기 위해 상기 실시예 1과 2에서 얻어진 고체분말 5g씩 10g을 무수에칠알콜 200ml에 녹인 에칠알콜여액 200ml에 질산비스무스 현탁액 200ml를 가하고 교반한 다음, 부칠알콜로 맑아질때까지 분리하여 상등액을 모아서 황산나트륨을 가하여 탈수한다.

여기에 6g의 활성탄을 넣고 혼합 교반하여 여과한다. 여액을 농축 건조한 수 잔사를 50% 에칠알콜 수용액에 용해시키고 -2~-5℃의 저온을 유지하면서 48시간 방치한 후, 생성된 침전물을 여과하고 농축건조한면 약 2.4g의 순수한 유효생리활성물질의 혼합물을 얻는다. 이 혼합물은 주사용제제로 사용가능하다.

[참고예]

[질산비스무스현탁액 제조]

완전 탈염수 1l에 1N 질산수용액을 가하여 pH를 3으로 조정한 후 교반하면서 질산비스무스 결정을 녹여 포화용액을 만든다. 또는 묽은 초산수용액(pH 3)1l를 준비하여 교반하면서 질산비스무수 결정을 가하여 완전히 용해시켜 포화용액을 만든다.

[비교예]

건조 분쇄한 은행엽 100g을 60중량% 아세톤수용액 380ml로 55℃에서 환류 추출기중에서 5시간 추출하고 냉각한 후 100게이지 압력으로 압착여과한다.

그 용액을 사염화탄소 50ml, 40ml, 30ml로 추출하고 층별 분리한다. 상층액인 아세톤수용액에 황산암모늄 35g을 넣어 녹이고 이 용액에 메칠에틸케톤 35ml를 첨가한다.

혼합교반한 후 형성된 상층의 아세톤-메칠에칠케톤층을 분리하고 메칠에칠케톤층에 고체 황산암모늄 26g을 가한 후 교반한다. 고형물을 제거하고 여액을 감압 농축하여 건조 잔사함량 20~60중량%로 한다. 얻어진 농축액을 50중량% 에탄올로 희석하여 최종농도를 건조잔사 10%로 하며 입자경 0.3mm이하의 나이론-6 분말 1g을 넣은 후 교반한다.

교반후 고형물을 제거하고 여액을 감압 건조한다. 잔사를 에탄올 15ml에 용해하고 12시간 방치후 형성된 침전물을 제거하고 여액을 감압농축하여 활성물질 1.4g을 얻었다.

상기 실시예 2에서 얻어진 분말을 종래의 제조방법에 의한 상기 비교예에서 얻어진 물질과 함께 고속액체 크로마토그라피로 분석하면, 중요 유효생리활성물질인 캄프페롤 글리코람노사이드 쿠라릭에스터와 퀘세틴글리코람노사이드 쿠마릭에스터 화합물의 양을 정량적으로 분석할 수 있다.

○ 분석조건

컴럼: Water Nova Pak C₁₈

감지기: UV 254nm

용매: 물(70), 메탄올(30), 초산(5)

온도: 25℃

주입량: 10μl(mg/ml)

유속: 1ml/min

○ 분석결과

A:퀘세틴 글리코람노사이드 쿠마릭에스터

B:캄프페롤 글람노사이드 쿠마릭에스터

단위:혼합분말 1mg에 함유되어 있는 각 성분의 양(mg).

이렇게 분석한 결과는 제1도(실시예 2)와 제2도(비교예)의 고속액체크로마토그라피와 같다. 또한, 유효생리활성물질의 존재유무 및 불순물의 함유정도를 확인하는 정성적 방법으로서 실시예 2에서 얻어진 분말을 종래방법에 의한 상기 비교예에서 얻어진 물질과 함께 박층크로마토 그라피를 실시한다.

주 유효생리활성물질인 퀘세틴 글리코람노사이드 쿠마릭에스터(A)와 캄프페롤 글리코람노사이드 쿠마릭에스터(B) 화합물의 Rf값은 각각 0.68과 0.72로 나타난다 (제3도 참조).

이때 Rf값 0.3이하에서 나타나는 발색물질들은 불순물로 가능한 소량일수록 좋다.

○ 분석조건

전개박판: 실리카겔 60F(Merck사)

전개용매: 에틸아세테이트(3), 메틸에틸게톤(5), 개미산(1), 물(1)

발색시약: 바닐린 4g을 100ml의 5% 황산에탄올에 용해

확인: 1차~U.V.254nm

2차~발색시약 분무후 110℃에서 5분간 가열하면 갈색 반점이 나타남.

Claims (2)

1. 은행엽으로부터 유효생리활성물질을 추출정제함에 있어서, 건조은행엽을 저급알코올과 저급아세테이트 또는 저급알코올과 저급케톤의 혼합용매로 추출한 다음, 이 추출액을 증발시켜서 얻어진 잔류물을 저급알코올 수용액 또는 저급케톤 수용액에 용해시킨후, 이를 산으로 pH 4로 조절하여 생성된 침전물을 여과하고, 다시 알카리로 pH 6~8로 조절한 다음, 이를 농축시켜서 얻어진 농축잔사를 에틸알코올에 용해시키고 농축시키는 것을 특징으로 하는 은행엽에서 유효생리활성물질을 추출정제하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 농축후 얻어진 농축잔사를 에틸알코올에 용해시틴 다음에는, 추가정제 과정으로서 거기에다 비스무스화합물현탁액을 넣고 교반한 다음, 부틸알코올을 가하고, 여기서 분리된 상등액을 농축건조한 후 얻어진 잔유물을 다시 에틸알코올수용액에 용해시킨 다음, 이를 저온에서 방치하여 생성된 침전물을 여과하고 건조시키는 것을 특징으로 하는 은행엽에서 유효생리활성물질을 추출정제하는 방법.

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