KR900005318B1 - 은행엽에서 유효생리활성물질을 추출 정제하는 방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

은행엽에서 유효생리활성물질을 추출 정제하는 방법

제1도는 본 발명의 방법에 따라 실시예 2에서 혼합물에 대해 유효생리활성물질의 정량적 분석을 한 고속액체 크로마토그라피이고,

제2도는 종래방법에 따른 비교예에 의해 얻어진 목적물에 대해 유효생리활성물질의 정량적 분석을 한 고속액체 크로마토그라피이며,

제3도는 본 발명에 따른 실시예 2 및 종래방법에 의한 비교예에서의 각 목적물에 대한 유효생리활성물질의 정성적 확인을 위한 박층 크로마토그라피이다.

본 발명은 은행옆으로부터 유효생리활성물질을 추출 정제하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 알칼리추출후 분리하고 정제하므로서 비교적 간단한 방법으로도 고수율의 유효생리활성물질을 추출해내는 신규한 방법에 관한 것이다.

은행나무는 계통발생학적으로 볼 때 현존하는 가장 오래된 나무이며, 그 열매인 은행은 옛부터 약용, 식용으로 널리 이용되어 왔었다. 또한, 은행잎은 높은 산함량으로 인하여 살충작용을 발휘하기 때문에 은행나무에는 해충이 기생할 수가 없으며, 특히 박테리아, 바이러스, 곰팡이 등에 대해서 완전한 저항력을 가지고 있는바, 그렇기 때문에 은행나무가 장수하게 된 것으로 인식되고 있다.

한편, 이러한 은행나무에 대해서는 위와같이여타식물과 다른 특이한점 때문에 그 뿌리, 껍질, 씨, 열매, 은행잎 등에 대한 의약적 유용성에 대한 여러 가지 화학적 연구조사가 계속되어 왔으며, 그 결과로 여러 가지의 유효한 화합물들이 규명되었다.

구체적으로, 은행나무의 열매에는 페놀성 화합물계, 징코올(Ginkgol), 빌보볼(Bilobol), 징코올산(Ginkgolicacid)등이 함유되어 잇으며, 은행나무의 씨에는 청산배당체(cyanogeneticglcosides), 아미노산등이 함유되어 있는 것으로서 밝혀져 있으며, 또 은행옆에는 방향족 화합물로서 특히 페놀합성물계, 플라보노이드 배당체, 플라보노이드 비배당체인 쿼세틴(Quercetic), 이소쿼세틴(Iso Quercetin), 캄프페롤(Kaempferol), 루테오린(Luteolin)등과, 터페노이드(Terpenoid) 화합물인 징코라이드(Ginkgolide A, B, C, M), 빌로발리드(Bilobalid)등이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다.

이와같이, 의약적 유용성면에서 볼때 은행엽 부분은 여러 가지 유효활성물질이 다량 함유되어 있음을 알수 있는데, 이러한 은행엽으로부터의 추출액은 1965년 이래로 혈관 및 혈류장애의 치료에 사용되어 왔으며, 콜레스테롤 감소, 관상동맥의 확장, 혈액순환의 중진 및 혈압의 저항 감소작용에 현저한 효능을 나타내고, 관상성 심장질환의 협심증 및 고혈압증에 치료효과가 있는 것으로 밝혀져 있다.

그중에서도, 특히 은행엽에 하수오, 구등(鉤藤), 갈근, 택사를 혼합하여 복합제제로 제조하게 되면 심장 및 뇌혈관 계통의 질병치료에 좋은 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

한편, 상기와 같은 은행엽으로부터 유효생리활성물질을 추출 정제하는 방법이 다수 공지되어 있는바, 예컨대 일본 특허공고 소 46-28091호에서는 은행엽을 물과 저급 알코올의 혼합용매 또는 물과 저급 케톤과의 혼합용매로 추출하고, 이추출액을 물과 혼합되지 않은 지용성 유기용매로 다시 추출하여 생리활성물질을 분리해내는 방법이 기술되어 있다.

또, 일본특허공고 소 49-27323호에서는 은행엽을 함수지방족 케톤 또는 알코올로 추출하고, 이 추출액을 물과 혼화하지 않는 지용성 유기용매로 추출한 후 함수유기용제 추출액에 황산암모늄을 가한 다음, 이 용액을 메틸 에틸케톤으로 추출하여 생리활성물질을 얻어내는 기술이 개시되어 있다.

또한, 국내특허공고 제81-333호에서도 은행엽을 저 지방족 케톤 또는 저 지방족 알코올수용액으로 추출한 추출액을 물에 불용성인 유기용매로 다시 추출하여 원하는 생리활성물질을 분리해내는 방법이 기술되어 있다.

이와 같이, 상기의 종래 방법들은 모두가 은행엽으로부터 물과 저급 알코올 또는 저급 케톤과의 혼합용매를 사용하여 유효활성성분을 추출하여 왔다.

그러나, 상기와 같은 종래의 방법을 이용할 경우 그 추출액에 다량의 불순물이 혼입되기 때문에 이를 정제하기 위해서는 대단히 여러 단계의 공정을 거쳐서 생리활성물질을 추출 정제 해야 하는 문제가 있어서 공업적으로 매우 비경제적이었다.

따라서, 본 발명자들은 상기와 같은 종래의 방법에서의 문제점을 해소하기 위해 오랜 연구 끝에 은행엽으로부터 유효생리활성성분을 추출 정제함에 있어서, 알카리수용액으로 추출한 후 저급 알코올과 저급 아세테이트 또는 저급 케톤과의 혼합용매로 다시 추출하게 되면 추출액에 불순물이 혼입되는 량이 크게 줄어들게 되어 간단한 조작으로도 순수한 생리활성물질을 고수율로 추출 정제할 수 있다는 놀라운 사실을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

즉, 본 발명의 목적은 은행엽으로부터 유효생리활성물질을 추출정제함에 있어서, 알카리수용액으로 추출하고 새로운 조성의 혼합용매을 사용하여 분리하고 특수정제칼럼을 통해 정제하므로써 간단하고 경제적인 방법으로 고농도, 고수율의 생리활성물질을 추출 정제하는 새로운 방법을 제공하는데 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 은행옆으로부터 유효생리활성물질을 추출 정제함에 있어서, 건조은행엽을 20~50℃의 온도에서 알카리용액으로 추출하고, 이 추출액을 pH 2~5로 조절한후 생성된 침전물을 여과해낸 다음, 그 여액에다 저급 알코올과 초산에틸 또는 저급 케톤과의 혼합용매를 가하여 다시 추출하고나서, 이 추출액을 농축시며서 얻어진 잔유물을 저급 알코올에 용해시키고, 알카리로 pH 6~8로 조절한 다음 그 여액을 농축시켜서됨을 특징으로 하는 은행엽에서 유효생리활성물질을 추출 정제하는 방법이다.

이과 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에서 건조된 은행엽은 알카리성 수용액에 넣고 20~50℃의 온도에서 추출 여과한 다음, 그 여액을 다시 약산으로 pH 2~5로, 바람직하게는 3~4로 조절하여 방치한 후 침전물을 제거한다. 여기에다 저급 알코올과 저급 초산에틸 또는 저급 케톤과의 혼합용매를 넣고 교반시킨 다음 층분리한다. 이렇게 분리된 유기 용매층은 농축, 건조시킨 후 저급 알코올 특히, 에틸알코올에 용해시키고 알카리로 pH를 6~8로 조절한 후 황산나트륨을 가하여 수분을 제거하고 방치하여서 용해된 부분만을 회수한다음, 이를 감압, 건조시키면 은행엽의 유효생리활성물질을 분말상으로 얻을수 있게 된다.

본 발명에 따라 상기와 같이 얻어진 분말은 특히 액제, 정제 또는 당의정으로 제조하여 경구투여용에 매우 적합하다.

한편, 상기와 같이 본 발명의 방법에 따라 제조된 분말은 더욱 정제하기 위해 후처리를 할수 있는데, 상기 제조된 분말을 에틸알코올용액에 용해시킨 후 특수하게 제조된 정제칼럼을 통과시키고 나서, 그 여액을 감압, 건조시키게 되면 불순물인 단백질, 폴리페놀, 알칼로이드 등이 함유되어 있지 않은 매우 순수한 유효생리활성물질의 혼합물을 얻을 수가 있다. 이렇게 더욱 정제된 유효생리활성물질은 주사용제제로도 사용 가능하다.

상기와 같은 본 발명의 정제칼럼에 사용되는 충전재로는 셀룰로오스, 젤라틴, 알루미나, 중탄산나트륨, 중탄산칼륨, 전분, 일부민중에서 선택된 2종 이상의 혼합물을 사용하는 것이 좋으며, 특히 세룰로오스: 젤라틴 또는 알부민:중탄산나트륨 또는 중탄산칼륨:알루미나를 약 3:3:2:2의 중량비로 순서대로 충전시킨 정제칼럼을 사용하는 것이 가장 좋다.

상기와 같은 본 발명에서의 추출은 20~50℃의 온도에서 행하는 것이 추출물질의 안정성의 면에서 좋으며, 30~40℃의 온도에서 추출하는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 본 발명에서 추출시 또는 pH 조절시 사용되는 알카리로서는 가성소다, 가성카리, 수산화암모늄, 수산화칼슘등을 사용할 수 있으며, 이러한 알카리의 사용 농도는 0.1~5N, 더욱바람직하게는 0.2~2N의 농도로 사용하는 것이 좋다.

은행잎 엑기스에 함유되어 있는 유효생리활성 물질로는 플라보노이드 배당체와 터페노이드 화합물임이 밝혀졌으며, 특히 플라보노이드 배당체중 캄프페롤 글리코람노사이드 쿠마릭에스터(kaempferol-3-o-α-6"'-p-coumaryl-glucosyl-β-1.4-rhamnoside))와 퀘세틴 글리코람노사이드 가장 중요한 유효생리활성물질로 알려져 있다.

(Arztezeitschrift Fur Naturheilverfahren, 22, 1981, 593-604).

따라서, 본 발명으로 얻어진 은행잎 액기스에는 이러한 두 유효생리혼합물질이 기존 방법에서 제조된 엑기스 보다 매우 높은 함량으로 존재하는 것으로 나타났다.

상술한 바와 같이, 본 발명은 종래와는 달리 일정온도에서 알카리 추출과정과 pH 조절 및 혼합용매에 의한 2차 분리과정을 거친 다음 특수정제칼럼을 통과시켜 정제함으로써, 간단하고 경제적인 방법으로 은행엽으로부터 고순도의 유효생리활성물질을 추출 정제해낼 수 있게 된다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거 상세히 설명하면 다음과 같다.

[실시예 1]

잘게 분쇄한 건조 은행엽 100g을 0.5 노르말 암모니아수용액 1l에 넣고 약 35℃에서 약 7시간씩 3회 추출한 후 여과한다. 여액에 NaCl 포화용액 1.5l를 가하고 묽은 황산수용액으로 적정 중화한 후 pH 4로 조정하여 생성되는 침전물을 여과한다.

여액에 부칠알콜-에필아세테이트(2:1)혼합용액을 가하여 혼합 교반하고 유기용매층이 맑아질때까지 반복 분리하여 유기용매층을 모으고 감압 농축한다. 농축잔사를 에칠알콜(99.5%)에 완전히 용해시킨 후 묽은 수산화나트륨수용액으로 pH 6~8로 조정한 후 황산나트륨을 가하여 수분을 제거하고 여과한다. 여액을 농축, 건조하면 약 12g의 고체분말을 얻는다. 이 고체분말은 액제, 정제 또는 당의정에 사용 가능하다.

[실시예 2]

은행엽 건조분말 100g을 수산화칼슘 포화수용액 1l에 넣고 약 35℃에서 5시간씩 3회 추출한 후 여과한다. 여액에 NaCl 포화용액 1.5l를 가하고 묽은 염산수용액으로 적정 중화한 후 pH 약 3으로 조정하여 생성되는 침전물을 여과한다. 여액에 이소프로필알콜-디메칠케톤(1:1)혼합용액을 가하여 혼합교반 후 유기용매층이 맑을때까지 반복 분리하여 감압 농축한다. 농축잔사를 에칠알콜에 완전히 용해시킨후 묽은 수산화나트륨용액으로 pH 6~8로 조정한 후 황산나트륨을 가하여 수분을 제거하고 여과한다. 여액을 농축하면 약 12.5g의 고체분말을 얻을수 있다.

순수한 유효생리활성물질을 얻기 위해 상기 실시예 1과 실시예 2에서 얻어진 고체분말 5g씩 총 10g을 무수알콜 100ml에 녹인 용액을 아래와 같이 특수하게 제조된 정제컬럼에 넣고 에탄올 400ml를 정제칼럼에 통과시켜서 그 통과된 용액을 증발 농축하면 순수한 유효생리활성물질 혼합물을 약 2.5g 얻을수 있다. 이 혼합물은 주사용제제로 사용 가능하다.

[정제칼럼의 제조]

필터가 부착된 직경 3cm, 높이 40cm 원통칼럼을 미리 장착한 후 셀라이트를 깔고 셀룰로오스, 젤라틴 또는 알부민, 중탄산나트륨 또는 중탄산칼륨, 알루미나를 3:3:2:2(중량비)의 비율로 순서대로 넣은 후 셀라이트를 깔고 여지를 놓은 후 400㎖ 사염화탄소를 흘려보낸다음 200㎖ 무수 에칠알코을 통과시켜 특수정제칼럼을 준비한다.

[비교예]

건조 분쇄한 은행엽 100g을 60중량% 아세톤수용액 380㎖로 55℃에서 환류 추출기중에서 5시간 추출하고 냉각한 후 100게이지 압력으로 압착여과한다.

그 용액을 사염화탄소 50㎖, 40㎖, 30㎖로 추출하고 층별 분리한다. 상층액인 아세톤수용액에 황산암모늄 35g을 넣어 녹이고 이 용액에 메칠에틸케톤 35㎖를 첨가한다.

혼합교반한 후 형성된 상층의 아세톤-메칠에칠케톤층을 분리하고 메칠에칠케톤층에 고체 황산암모늄 26g을 가한 후 교반한다. 고형물을 제거하고 여액을 감압 농축하여 건조 잔사함량 20~60중량%로 한다. 얻어진 농축액을 50중량% 에탄올로 희석하여 최종농도를 건조잔사 10%로 하며 입자경 0.3mm이하의 나이론-6 분말 1g을 넣은 후 교반한다.

교반후 고형물을 제거하고 여액을 감압 건조한다. 잔사를 에탄올 15㎖에 용해하고 12시간 방치후 형성된 침전물을 제거하고 여액을 감압 농축하여 활성물질 1.4g을 얻었다.

상기 실시예 2에서 얻어진 분말을 종래의 제조방법에 의한 상기 비교예에서 얻어진 물질과 함께 고속액체 크로마토그라피로 분석하면, 중요 유효생리활성물질인 캄프페롤 글리코람노사이드 쿠라릭에스터와 퀘세틴글리코람노사이드 쿠마릭에스터 화합물의 양을 정량적으로 분석할 수 있다.

○분석조건

컴럼: Water Nova Pak C₁₈

감지기: UV 254㎚

용매: 물(70), 메탄올(30), 초산(5)

온도: 25℃

주입량: 10㎕(㎎/㎖)

유속: 1㎖/min

○분석결과

A:퀘세틴 글리코람노사이드 쿠마릭에스터

B:캄프페롤 글람노사이드 쿠마릭에스터

단위:혼합분말 1mg에 함유되어 있는 각 성분의 양(mg).

이렇게 분석한 결과는 제1도(실시예 2)와 제2도(비교예)의 고속액체크로마토그라피와 같다. 또한, 유효생리활성물질의 존재유무 및 불순물의 함유정도를 확인하는 정성적 방법으로서 실시예 2에서 얻어진 분말을 종래방법에 의한 상기 비교예에서 얻어진 물질과 함께 박층크로마토 그라피를 실시한다.

주 유효생리활성물질인 퀘세틴 글리코람노사이드 쿠마릭에스터(A)와 캄프페롤 글리코람노사이드 쿠마릭에스터(B) 화합물의 Rf값은 각각 0.68과 0.72로 나타난다 (제3도 참조).

이때 Rf값 0.3이하에서 나타나는 발색물질들은 불순물로 가능한 소량일수록 좋다.

○분석조건

전개박판: 실리카겔 60F(Merck사)

전개용매: 에틸아세테이트(3), 메틸에틸게톤(5), 개미산(1), 물(1)

발색시약: 바닐린 4g을 100㎖의 5% 황산에탄올에 용해

확인: 1차~U.V.254㎚

2차~발색시약 분무후 110℃에서 5분간 가열하면 갈색 반점이 나타남.

[실시예 3]

잘게 분쇄한 은행엽 100g을 벤젠-사염화탄소(1:1)혼합용액 0.6l에 넣고 약 70~90℃에서 역류시키면서 3회 추출여과한다. 여과한 은행엽을 감압건조한 후 0.1 노르말 가성소오다수용액 0.7l에 넣고 약 35℃에서 약 6시간씩 3회 추출한 후 여과한다. 여액에 NaCl 포화용액 1l를 가하고 묽은 염산수용액으로 적정 중화한 후 pH 약 3으로 조정하여 생성되는 침전물을 여과한다. 여액에 부칠알콜-디메칠케톤(2:1)혼합용액을 가하여 유기용매층이 맑아질때까지 완전히 추출한 후 모아서 감압 농축한다.

농축잔사를 에칠알콜에 완전히 용해시킨 후 0.2몰 Na₂HPO₄수용액으로 pH 6~8으로 조정하고, 황산나트륨을 가하여 교반한 후 수분을 제거하고 여과한다. 여액을 농축, 건조하면 약 11.0g의 고체분말을 얻는다. 이 분말은 액제, 정제 또는 당의정으로 사용 가능하다.

상기 실시예 2에서 제조된 것과 동일한 특수정제칼럼을 이용하여 상기 고체분말 이전의 여액을 통과시킨후 농축 건조하면 순수한 유효생시활성물질 2.2g을 얻을 수 있다. 이 혼합물은 주사용제로도 사용 가능하다.

이와 같이 제조된 목적화합물을 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 정량분석 및 정성분석을 실시해본 결과 상기 실시예 2와 매우 비슷한 결과를 얻었다.

Claims (3)

1. 은행엽으로부터 유효생리활성물질을 추출 정제함에 있어서, 건조은행엽을 20~50℃의 온도에서 알칼리 용액으로 추출하고, 이 추출액을 pH 3~4로 조절한 후 생성된 침전물을 여과해낸 다음, 그 여액에다 저급 알코올과 초산에틸 또는 저급 케톤과의 혼합용매를 가하여 다시 추출하고나서, 이 추출액을 농축시켜서 얻어진 잔유물을 저급 알코올에 용해시키고, 알카리로 pH 6~8로 조절한 다음, 그 여액을 농축시켜서 됨을 특징으로 하는 은행엽에서 유효생리활성물질을 추출정제하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 알칼리 pH 조절한 용액의 여액은 충전재로서 셀룰로오스:젤라틴 또는 알부민:중탄산나트륨 또는 중탄산칼륨:알루미나가 3:3:2:2 의 중량비로 사용되어 순서대로 충전된 정제칼럼을 통과하여서 정제된 것을 특징으로 하는 은행엽에서 유효생리활성물질을 추출정제하는 방법.
3. 제 1항에 있어서, 상기 알카리로서 가성소다, 가성카리, 수산화암모늄 밍 수산화칼슘중에서 선택된 것을 사용하는 것을 특징으로 하는 은행엽으로부터 유효생리활성물질의 추충 정제 방법.

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