KR860000893B1 - 단세포 단백질의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

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Description

단세포 단백질의 제조방법
본 발명은 단세포 단백질 제조 및 신규의 효모균주에 관한 것이다. 단백질에 대한 세계적인 부족을 완화하고자 하는 노력 가운데 각종 함탄소(含炭素)기질에 각종 미생물 몇가지를 성장시켜 단세포 단백질(SCP : single cell protein)을 얻는 생합성(生合成) 공정이 여러가지가 있다. 탄소에너지를 가진 기질은 비교적 저렴한 가격으로 균일하고도 안정성이 있는 것으로 용이하게 확보할 수 있는 것이어야 한다. 석유 탄화수소를 탄소 에너지원으로 사용해오고 있지만 수용성이 부족하고 미생물 전환을 촉진하는데 필요한 분자산소를 너무 많이 소요한다는 점에서 실제적인 난관에 봉착하고 있는 것이다. 산소와 탄화수소 유도체가 비교적 수용성이 있으므로 해서 발효 수용액중에서나 미생물 전환 성장 과정에서 필요로 하는 분자산소의 량이 상당히 감소된 상태에서도 취급이 용이하기 때문에 공급물로 사용하는데 대하여 기타 여러가지 방법이 집중되고 있는 것이다.
그러나 단세포 단백질 공정을 실제로 상업규모화하는데 있어서 제한 인자로는 비교적 적절한 세포 밀도로 발효물을 조절할 필요성이 있다는 것인데 소요되는 기질에 대해서 건조세포의 수득율은 중간정도일 뿐이고 단세포 단백질 물질을 적당량 회수하기 위한 다량의 전체 발효 유출액을 조절할 필요성도 있다. 다량의 발효유출 수용액을 취급한다는 것은 원심분리나 세척 및 건조단계 등에서 단세포 단백질 제품의 농도를 복합적으로 만든다. 일반적으로 효모에서 얻을 수 있는 함량에 비하여 세포중의 조단백질이 함량이 다소 크기 때문에 과거에 있었던 몇가지 공정은 세균 배양을 하는데 치중하고 있었다. 그러나 효모는 광범위하게 확보가 가능하고 비교적 배양이 간단히 된다. 효모세포는 일반적으로 세균세포에 비하여 약간 크기 때문에 효모세포는 발효유출액으로부터 훨씬 쉽게 분리되는 경향이 있다. 세포수득율을 증가시키고 특히 큰 세포밀도에서 조작을 할 수 있는 수단과 방법을 찾아 내는 것이 극히 바람직한 것이다. 예를 들자면 용적이 상당히 작은 발효유출액의 량을 취급하는 것은 파이프와 펌프의 크기를 작게할 수도 있고 멸균조건이 감소된 채로 보충수의 공급량도 작게할 수 있으며 응고와 분리공정에 필요한 장치크기와 취급에 대한 조건도 간단하게 할 수 있다는 점에서 크게 경비절감이 되는 것이다.
본 발명은 발효조중의 발효물에 무기염의 농도를 크게한 배지(培地)를 첨가하여 효모배양을 시키는 연속호기성 발효공정을 실행할 수 있도록 하므로서 일반적으로 얻을 수 없는 극히 고도의 세포밀도에서 발효조중에서 발효물의 활동이 가능하도록 하고 효모 단세포 단백질 제품을 높은 수득율로 제조할 수 있게 한방법에 관한 것이다. 세포밀도는 효소용적 당의 건조상태의 중량으로 세포의 농도를 나타낸 것이다. 발효물이란 것은 세포를 포함하여 발효액의 전용적을 뜻하는 것이다. 보통 세포밀도는 g/ℓ로 나타낸다. 수득율은 발효물에 공급되는 탄소에너지원, 즉 기질의 주어진 소모중량에 대하여 생성되는 세포의 량을 중량으로 나타낸 것인데 보통 1g에 대한 g수로 나타낸다.
본 발명에 의한 방법을 사용하여 얻을 수 있는 고도의 세포밀도는 단세포 단백질 제조경비를 균형되게 함과 아울러 경비절감을 상당히 할 수 있도록 하는 것이다. 여러가지 예에 있어서 원심분리 같은 수단을 사용하여 단세포 단백질 생성물을 농축시킬 필요가 거의 없거나 생략할 수도 있다. 필요에 따라 세포 생성물을 세척장치에서 세척하여 잔존하며 소모되지 않은 염을 제거하여 직접 분무건조기 같은 건조장치로 보낼 수도 있다. 세척액중에서 세포속으로 결합되지 않은 잔존무기염 대부분이 함유되어 있는데 이것을 발효조로 재순환시킨다. 따라서 물을 발효단계로 들여보내는 조건을 상당히 감소시키게 되는데, 중요한 점으로 폐기를 필요로 하는 폐수가 거의 없거나 전혀 없다는 점이다. 또한 필요에 따라서 잔존염을 포함한 전 발효물을 건조시킬 수도 있다. 이제까지 나온 바와 같이 효모 배양물로 부터 단세포 단백질 물질을 제조하는 연속공정에서는 발효물 1ℓ당 약 20-25g의 세포정도로 비교적 낮은 함량의 효모세포를 가진 발효 유출물이 나온다. 그러나 본 발명에 의한 발효 공정에서는 발효물 1ℓ당 약 100g정도로 비교적 극히 높은 함량으로 효모세포가 나온다. 효모세포의 수득율이 높은 것과 아울러 발효물중의 세포밀도가 크다는 것은 특히 연속공정 조건하에서 효과적이며 능률적인 제조를 할 수 있다는 것을 뜻한다.
본 발명에 의하여 연속적인 호기성 수성 발효 조건하에 분자 산소를 함유하는 기체, 동화작용이 있는 질소원, 배양용 무기염을 유효량 사용하고 필요에 따라서는 바이오틴이나 티아민등의 비타민 같은 배양용 유기질을 추가하여 기질로서의 적당한 탄소 에너지원상에 효모를 성장시킨다.
본 발명에 의한 공정에 있어서 다음에 나오는 바와 같이 무기염을 고농도로 첨가하여 수득율도 크게 하면서 고도의 세포밀도에서 발효공정을 실시하는 것이다.
본 발명은 필수적으로 발효물중에(비교적) 고농도의 무기염을 가하여 성장속도를 크게한 세포의 강제공급에 장점이 있다. 물론 발효물의 상등액중의 무기염의 농도는 그 자체가 비교적 낮은 상태로 있는데, 그이유로서는 세포가 성장 및 재생산 도중에 염을 소모하기 때문이다. 따라서 상등액과 세포중의 염의 농도는 극히높아진다.
[발효조건]
수성의 무기염 배지, 탄소 에너지 공급물질, 분자산소, 동화작용이 있는 질소 및 효모 미생물중 한가지 이상의 특수종으로 된 성장배지중에서 배양을 실시한다. 본 발명에 의한 공정에 있어서 고농도의 무기염을 발효물에 공급하며 발효물중에서는 농도를 높게하여 유지한다. 공급 배지중의 선정된 무기질 배양물을 적정비율로 하여 적당량을 공급하여 미생물 성장을 적절히 할 수 있게 하고 미생물 전환과정에서 세포에 의해 탄소 및 에너지원의 동화작용을 극대화시키며 발효배지중에서 세포밀도를 최대로 함과 동시에 최대의 세포 수득율을 얻을 수도 있다. 발효물의 조성이 광범위하게 변화하는 데, 사용되는 효모와 기질에 따라 일부 좌우될 수도 있지만 본 발명에 의한 발효물(액체와 세포)중의 무기질 함량은 종래의 것보다 비교적 높다. 다음에 나오는 표에 나타난 바와 같이 발효물에 있는 각종 원소의 농도범위가 최소치, 보편적인 범위 및 적정범위에 대해 나와 있는데 농도를 각 요소에 대해 나타냈고 전부 또는 일부가 가용성 이온의 형태로 존재하거나 인(P)같은 것의 경우에서는 인산염 같은 몇가지 형태로 결합된 양상으로 존재하고 있음을 알 수 있다. 각 원소의 량을 발효물 1ℓ당 그람수 또는 밀리그람수로 나타내었다.
[발효물 1ℓ당 원소의 중량]
Figure kpo00001
유황은 황산염의 형태로 사용하는 것이 바람직하다. 필요로하는 금속중 몇가지를 황산염의 형태로 첨가하므로서 일반적으로 유황의 최소농도를 초과하도록 하는 것이 좋다. 표에 나온 원소 전부 또는 일부를 황산염으로 하여 사용할 수 있다. 편리한 것으로는 마그네슘, 칼슘, 철, 아연, 구리 및 망간을 황산염 또는 염화물 형태로 사용하거나 황산염 또는 염화물로 그 자체가 변환되는 화합물의 형태로 사용한다. 칼륨은 황산염, 염화물 또는 인산염으로 하여 사용하거나 그 자체가 황산염, 염화물 또는 인산염으로 변환되는 화합물의 형태로 하여 사용하는 것이 좋다. 인은 인산의 형태로 하여 사용하거나 인산염, 차아인산염 또는 아인산염등(예 : 칼륨염 또는 암모늄염)의 형태로 하거나 그 자체가 염으로 전환이 되는 화합물의 형태로 하여 사용하는 것이 좋다. 최소한 흔적량으로 존재할 수 있는 기타 원소 가운데는 나트륨과 코발트(할로겐화물 또는 황산염) 몰리브덴(예 : 몰리브덴산), 붕소(예 : 붕산염), 셀렌(예 : 아셀렌산염 또는 셀렌산염) 또는 요오드(예 : 요오드화물) 등이 있다. 대표적인 고세포밀도 발효에 있어서 발효물은 용적으로 약 절반정도의 상등액 배지와 약 절반 정도의 세포로 구성된다. 그러나 이들 절반용적을 가지는 세포중에는 최소한 발효물중의 무기염 함량의 약 2/3 정도가 함유된다.
[효모]
본 발명에 의한 공정에서는 수성 발효조건하에서 함탄소기질에서 성장하기가 적당한 효모를 배양한다. 적절한 효모로서는 캔디다(Candida), 한세눌라(Hansenula), 토루롭시스(Torulopsis), 사카로미세스(Saccharomyces), 피치아(Pichis), 데바리오미세스(Debaryomyes) 및 브레타노미세스(Brettanomyces)등의 속(屬)으로 부터 나오는 종(種)이 포함된다. 현재 적합한 속에 들어가는 것으로는 캔디다(Candida), 한세눌라(Hansenula), 토루롭시스(Torulopsis), 피치아(Pichia) 및 사카로미세스(Saccharomyces)가 있다.
적합한 종에 대한 예를 보면 다음과 같다.
브레타노미세스 페트로필륨(Brettanomyces petrophilium)
캔디다 보이디니(Candida boidinii)
캔디다 리폴리티카(Candida lipolytica)
캔디다 미코데르마(Candida mycoderma)
캔디다 유틸리스(Candida utilis)
캔디다 스텔라토이데아(Candida stellatoidea)
캔디다 로부스타(Candida robusta)
캔디다 클라우세니(Candida claussenii)
캔디다 루고사(Candida rugosa)
캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)
데바리오미세스 한세니(Debaryomyces hansenii)
한세눌라 미누타(Hansenula minuta)
한세눌라 사투르누스(Hansenula saturnus)
한세눌라 칼리포니카(Hansenula californica)
한세눌라 마키이(Hansenula mrakii)
한세눌라 실비콜라(Hansenula silvicola)
한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)
한세눌라 위커하미이(Hansenula wickerhamii)
한세눌라 캅술라타(Hansenula capsulata)
한세눌라 글루코지마(Hansenula glucozyma)
한세눌라 헨리시이(Hansenula henricii)
한세눌라 논페르멘탄스(Hansenula nonfermentans)
한세눌라 필로덴드라(Hansenula philodendra)
피치아 파리노사(Pichia farinosa)
피치아 폴리모르파(Pichia polymorpha)
피치아 멤브라네파시엔스(Pichia membranaefaciens)
피치아 피누스(Pichia pinus)
피치아 파스토리스(Pichia pastoris)
피치아 트레할로필라(Pichia trehalophila)
사카로미세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)
사카로미세스 프라질리스(Saccharomyces fragilis)
사카로미세스 로세이(Saccharomyces rosei)
사카로미세스 아시디파시엔스(Saccharomyces acidifaciens)
사카로미세스 엘러간스(Saccharomyces elegans)
사카로미세스 로욱시이(Saccharomyces rouxii)
사카로미세스 락티스(Saccharomyces lactis)
토루롭시스 소노렌시스(Torulopsis sonorensis)
토루롭시스 캔디다(Torulopsis candida)
토루롭시스 볼미이(Torulopsis bolmii)
토루롭시스 베르사틸리스(Torulopsis versatilis)
토루롭시스 글라브라타(Torulopsis glabrata)
토루롭시스 몰리쉬아나(Torulopsis molishiana)
토루롭시스 네모덴드라(Torulopsis nemodendra)
토루롭시스 니트라토필라(Torulopsis nitratophila)
토루롭시스 피누스(Torulopsis pinus)
필요하다면 두가지 이상의 효모종을 혼합한 것을 사용할 수 있다. 사용되는 특수 효모는 사용되는 함탄소 기질에 따라 일부 좌우되는데, 그 이유는 상이한 효모를 사용하면 최적한 성장을 하기 위해서 다소 상이한 기질을 필요로 할 때가 있다는 것이기 때문이다. 예를 들자면 위에 나온 종에 속하는 몇가지 특수한 균주, 예로서 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)같은 것은 메탄올에서는 성장을 하지 않는다. 현재 적절한 것으로는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)와 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)인데, 이들은 산소화 탄화수소 공급물, 특히 메탄올 같은 저급알코올에서 적절히 성장한다. 또한 현재 적절히 사용되는 것으로는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)(배양 21-2) NRRL Y-11431, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)(배양 21-1) NRRL Y-11430, 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) NRRL Y-11170 및 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)(배양 21-3) NRRL Y-11432가 있는데 이들 균주는 수득율이 크고 고세포밀도에서 단세포 단백질 물질을 제조할 때 사용하기에 특히 적합한 것들이다. 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)(배양 21-2) NRRL Y-11431과 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)(배양 21-1) NRRL Y-11430의 균주의 특징은 특히 이들 종에 대해서 특이한 것으로 보고 있는데, 그 이유는 시험을 해본 4가지 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 배양물 가운데서 불과 두 가지만 메탄올에서 성장하기 때문이다. 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)(배양 21-2) NRRL Y-11431, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)(배양 21-1) NRRL Y-11430 및 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)(배양 21-3) NRRL Y-11432 들도 신규의 것으로 독특한 것이라고 생각된다. 탄소에너지 기질로서는 각종 탄수화물을 포함하여 탄화수소 산소화 탄화수소등과 같은 효모기질로서 적합한 탄소에너지원인 것이면 어느 것이나 사용할 수 있다. 특수한 효모는 각종 기질에 대한 선택에 있어서 다양성을 가지고 있다.
수성 발효조건에 적합한 것으로 근래 사용되는 기질로서는 수용성 화합물인 탄소-산소-수소로된 화합물이다.
"산소화 탄화수소"란 말은 본 발명에서는 사용할 수 있는 화합물의 총괄적 용어이며 기질공급원에 국한된 용어인 것은 아니다. 본 발명에서 산소화 탄화수소에 속하는 것으로는 수용성 탄수화물, 알코올, 케톤, 에스테르, 산, 알데히드 및 이들의 혼합물인데, 이들은 일반적으로 1분자 당 1-20개의 탄소원자를 가진 것으로서 수용성이 큰 것들이다. 보통 훨씬 적합한 산소화 탄화수소에 속하는 것으로는 1분자당 탄소원자수가약 10개 정도까지이며, 수용성이 큰 것들 또는 수용성 탄수화물이었다. 탄수화물의 예를 볼 것 같으면 글루코오스, 프룩토오스, 갈락토오스, 락토오스, 수크로오스, 전분, 덱스트린 등과 이들의 혼합물이 있다. 산소화 탄화수소에 대한 다른 예를 볼것 같으면 메탄올, 에탄올, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 1-프로판올, 2-프로판올, 글리세롤, 1-부탄올, 2-부탄올, 3-메틸-1-부탄올, 1-펜탄올, 2-헥산올, 1,7-헵탄디올, 1-옥탄올, 2-데칸올, 1-헥사데칸올, 1-에이코산올, 아세톤, 2-부타논, 4-메틸-2-펜타논, 2-데카논, 3-펜타데카논, 2-에이코사논, 포름알데히드, 아세트 알데히드, 프로피온 알데피드, 부티르 알데히드, 헥사날, 7-메틸옥타날, 테트라데카날, 에이코사날, 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 글루타르산, 5-메틸헥산산, 아젤라산, 도데칸산, 에코산산, 포름산메틸, 아세트산메틸, 아세트산 에틸, 부티르산 프로필, 헥산산 이소프로필, 5-메틸옥탄산 헥실, 도데칸산 옥틸 및 이들의 혼합물이 있다.
단세포 단백질 세포로부터 잔존기질을 제거하기가 곤란할 때가 있기 때문에 편의성은 거의 없겠지만 본발명에서는 1분자당 10-20개의 탄소원자를 가진 n-파라핀을 사용할 수도 있다. 일반적으로 효모는 1분자당 탄소원자수가 10개 이하인 파라핀을 동화하지는 않는다. 이러한 것에 속하는 것으로는 대표적으로 데칸, 운데칸, 도데칸, 트리데칸, 테트라데칸, 펜타데칸, 헥사데칸, 옥사데칸, 에이코산등과 이들의 혼합물이 있다. 현재 적합한 것으로는 탄소원자수가 1-4개인 수용성 알코올, 탄소원자수가 2-4개인 수용성산 및 수용성탄수화물이 있다. 또한 적합한 것으로는 수용성의 1가의 지방족 히드로카르빌 알코올이 있다. 여기서 알아두어야 할 것은 2-메틸-1프로판올은 어떤 효모에 대해서는 사용할 수가 없으며 이러한 효모와 발효를 시킴에 있어서 이 알코올을 피해야 한다는 것이다. 가장 사용하기가 좋은 것은 탄소원자수가 1-4개인 알코올(2-메틸-1-프로판올 제외)로서 메탄올과 에탄올이 가장 다른 것에 비해 적절하며, 이중에서도 메탄올은 비교적 가격이 저렴한 공급물이기 때문에 가장 적합한 것이다. 석유 가스를 산화시켜 사용해도 되고(메탄, 에탄)등의 산화 생성물과 알데히드, 케톤, 산등은 물론이고 알코올과 석유 정제 및 화학가공단지, 즉 석유화학단지에서 생산되는 각종 석유정제 물로부터 적절한 탄화수소 성분을 뽑아 내어 첨가하여 혼합물을 만들어 수용성물질로 하여 발효공정에 사용할 수 있다. 상등액중의 염은 성장하는 재생 세포에 의하여 포착되는 량이많기 때문에 비교적 낮은 농도를 가진다. 세포에 있는 무기염중 어떤 것은 결합된 유기형태를 하기 때문에 공급이나 사용하지 않아도 된다. 물론 발효물중의 무기질 분석을 하여 총무기질 함량을 알아야 한다. 무기염외에도 비타민(유기질 성장인자)을 종래의 방법대로 발효물중에 사용할 수 있는데 이 경우에 있어서는 이들은 특수한 효모의 번식에 필요한 것이다. 예를 들자면 적절한 번식에 사용되는 많은 효모들은 바이오틴이나 티아민 중에서 어느 한가지 또는 모두를 필요로 하거나 효모추출물 같은 이들 비타민을 함유하는 기타 배지성분을 필요로 하는 것으로 볼 수 있다.
따라서 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) 같은 효모의 경우를 보면 수성의 무기질 배지 1ℓ당 약 0.04-0.8mg의 바이오틴과 수성의 무기질 배지 1ℓ당 약 4-80mg의 염산티아민을 사용할 필요가 있다. 또한 효모 추출물 같은 것을 사용하여 바이오틴과 티아민의 전부 또는 일부를 공급할 수 있다. 어느 나라에서나 정제 처리공정에서 보통 생각하는 것처럼 물을 수성의 호기성 발효공정용으로 성장인자를 첨가하는 무기질 배지를 제조함에 있어서 잔존 염소량을 함유하는 물을 사용하면 성장인자를 효능이 없게 하는 경향이 있고, 특히 바이오틴이나 티아민 같은 비타민을 효능이 없게 하며, 이러한 발효계에 있어서 잔존 염소를 함유하는 물로부터 만든 무기질 배지를 사용할 때 염소를 제거한 후 성장인자를 첨가하면 성장인자의 탈활성화 혹은 손실을 피할 수 있다. 따라서 잔존염소를 함유하는 물을 처리하여 흔적량의 잔존염소를 제거하므로서 비타민 상실을 피할 수 있는 방법이 개발된 것이다. 이제까지 불필요한 량의 잔존 염소를 함유하는 물을 발효공정에 사용함에 있어서 배양기(培養基)로부터 분리된 것으로서 비타민을 발효조에 첨가하면 염소에 의한 비타민의 비활성화가 됨이없이 비타민을 사용할 수 있음을 확인한 것이다. 따라서 무기질 배양기에서 흔적량의 염소를 함유하는 물을 사용할 수 있으므로 해서 경비가 많이 소요되거나 시간소모적인 방법으로 흔적량의 잔존염소를 함유한 물을 예비처리할 필요가 없게 된 것이다.
발효시에 비타민을 분리하여 첨가하는 방법은 비타민과 전탄소 에너지 기질도중 최소한 일부를 혼합한 후 이 물질들을 발효조로 배출시키면 편리하게 실시할 수 있게 된다. 만일 비타민과 탄소에너지 기질의 혼합물을 사용한 경우에는 비타민의 초기 희석에 사용되는 물중에는 흔적량의 잔존염소가 없는 탈염수와 같은 물로 만들어 메탄올을 물속에 존재하도록 한 탄소기질과 혼합하기전에 조기 상실이 되지않게 해야 한다. 필요하다면 메탄올 같은 수용성 탄소 기질 약 20vol.%와 물을 혼합한 후 여기에다 비타민을 용해시켜 발효조로 공급할 수도 있다. 이 방법에서는 잔존 염소를 먼저 제거할 필요는 없지만 비타민은 완전히 보존이 되는 것이다. 보다 적절한 예를 볼것 같으면 발효조에 비타민을 분리하여 첨가할 때는 위에 나온 바와 같이 탄소에너지 기질중 최소한 일부와 비타민의 혼합물에다 미량의 무기염을 첨가하여 만든 용액을 다시 첨가하면 된다. 첨가되는 무기염은 위에 나온 바와같이 코발트, 몰리브덴, 붕소, 셀렌, 요오드, 망간, 구리, 아연및 철이다. 위의 예를 사용하면 무기염 배지용으로 사용되는 물속에 있는 미량의 염소가 제기하는 비타민의 비활성화 문제도 피할 수 있을 뿐만 아니라 발효공정에서 나타나는 기타 문제도 피할 수 있게 된다. 무기염 배지를 처리하는데 사용되는 가열 멸균장치 중에서 침전물이 생성되는 문제도 있는데, 이것은 자주 세척을 하여 주면 된다. 일차무기 배양염과의 혼합물중에 미량의 무기염이 있게 하면 가열 멸균장치 중에 곤란한 침전물이 생성되게 한다. 따라서 무기염 배지 용액중에 미량의 무기염을 포함시키지 않는 대신 비타민과 탄소 에너지 기질중 최소한 일부와의 혼합물 중에 미량의 무기염이 들어가게 되면 두 가지의 극히 곤란한 문제점을 해결할 수 있게 된다. 이에서 나온 바와같이 미량의 무기염과 탄소에너지 기질중 최소한 일부와 비타민으로 혼합물을 만드는 데 사용되는 물은 미량의 잔존 염소라도 함유되지 않는 것이라야 좋다. 비타민과 탄소에너지 기질중 일부 미량의 무기질로 된 혼합물을 필요에 따라 여과하여 멸균한다.
그러나 이 혼합물과 주 탄소에너지 기질을 발효조로 공급하기 전에 혼합하여 여과한 후 발효조로 보내는 것이 좋다. 발효 그 자체는 미생물종의 번식을 조장하는데 효과적인 산소분압으로 발효물을 유지하기 위해 공기나 산소가 많은 공기 또는 상당히 순수한 분자 산소와 같은 분자 산소를 함유하는 가스가 공급하는 분자 산소를 필요로 하는 호기성 공정이다. 산소화 탄화수소 기질을 사용하므로서 미성물 성장에 필요한 전산소량을 파라핀을 사용할 경우의 소요량 보다 감소시키게 된다. 따라서 기질의 동화와 그에 따른 미생물성장은 일부가 연소 과정이므로 적정량의 분자산소를 공급하여 성장시키도록 해야한다.
발효물에 대한 분자산소의 공급속도는 효모의 성장이 산소 부족으로 제한을 받지 않을 정도가 되어야한다. 발효조의 설계는 배양물에 산소를 전달할 수있는 능력에 따라 광범위하게 달라진다. 전체적인 통기 속도가 상당한 범위에 걸쳐 달라지더라도 산소 전달에 극히 효율이 좋은 발효조의 경우에서는 통기(通氣)속도는 일반적으로 1분당 발효조내에 있는 액체용적당 분자산소를 함유한 가스의 0.5-8 용적 정도이며, 약 1-6용적(적용압력과 25℃에 대한 것임)으로 하는 것이 좋다. 이러한 량은 반응기로 공급되는 정상적인 산소함량을 가진 공기에 대한 것으로서 순수한 분자산소로 나타내자면 각각의 범위는 약 0.7-1.7용적이고 약 0.2-1.3용적(적용 압력과 25℃에 대한 것임)으로 하는 것이 좋다. 미생물 발효단계에 사용되는 압력은 여러 가지이다. 대표적인 압력은 장치와 조작경비에 대하여 얻을수 있는 산소의 용해도가 평형을 이루는 조건에서 0-150psig 정도이고, 0-60psig로 하는 것이 좋으며 훨씬 좋은 것은 대기압보다 최소한 약간 상회하는 것이 좋다. 대기압보다 훨씬 크게 하면 수성발효물중에 용해된 산소농도를 크게해 주게 되고 세포성장속도를 크게해 준다는 점에서 장점이 있다. 이와 동시에 고압에서는 장치와 조작경비가 증가된다는 점에서 위의 장점은 상쇄되어 버린다. 발효온도를 다소 변화시킬 수 있지만 일반적으로 약 25°-65℃로 하며, 약 28°-50℃정도로 하는 것이 보통 좋은 편이다. 효모 배양물인 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)(배양 21-2) NRRL Y-11431과 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)(배양 21-1) NRRL Y-11430은 일반적으로 발효물 온도를 약 30℃로 하는 것이 좋다. 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) NRRL Y-1170과 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)(배양 21-3) NRRL Y-11432는 발효물 온도를 약 38°-40℃정도로 하는 것이 좋다. 효모는 동화작용이 가능한 질소원을 필요로 한다.
동화작용이 있는 질소는 함질소 화합물이나 효모 미생물에 의해 대사활용에 적합한 형태의 질소를 방출할 수 있는 화합물에 의해 공급된다. 단백질 가수분해물 같은 유기질소 공급화합물을 기술적으로 활용할 수는 있지만 보통 암모니아, 수산화암모늄, 요소 및 각종 압모늄염(예 : 인산암모늄, 황산암모늄, 피로인산암모늄 등) 같은 가격이 보다 저렴한 함질소 화합물을 사용한다. 암모니아가스 그 자체는 대규모 조업에 사용하기 편리하며, 수성 미생물 발효물 속으로 적당량을 기포 주입하므로서 사용한다. 동시에 이러한 암모니아도 pH조절작용을 한다. 미생물 발효물액의 pH 범위는 3-7 정도이어야 하며, 보통 약 3.5-5.5의 범위로 하는것이 좋다. pH 범위에 의한 미생물의 선정정도는 어느 정도 사용되는 배지와 특수한 미생물에 따라 달라지기 때문에 배지의 변화에 따라 다소 변화가 있으며 이것은 종래의 방법으로 쉽게 측정할 수 있다.
발효조중에서의 발효물의 평균 체류시간은 상당히 변화하며 이것은 사용되는 효모배양물과 발효온도에 따라서도 일부 달라진다. 평균 체류시간은 약 2-30분 정도로 하는것이 보통이고 4-14시간 정도로 하면 좋다. 위에 나온 탄소 에너지기질, 특히 메탄올이나 포름알데히드 같은 것의 농도가 극히 크면 만족스러운 미생물 성장에 장애가 되며 심지어는 발효시에 미생물에 독작용을 하게 된다. 따라서 기질의 농도를 비교적크게 하지 않도록 하므로서 최대 허용 수준에서 발효물중의 기질농도를 유지하도록 해야 한다. 저급 알코올을 사용하는 경우에 있어서 발효물에 대한 이러한 기준은 일반적으로 약 0.001-5vol.%로 하며 0.01-0.05vol.%정도가 좋다. 한편으로 알데히드의 경우에는 이것이 독성이 있기 때문에 위의 값에 대해
Figure kpo00002
수준으로 하여 주므로서 미생물의 성장속도를 저해하거나 정지되게 하는 일이 없도록 해야 한다.
탄소 및 에너지 공급물질중에 미생물에 악영향을 줄 수 있을 정도의 량으로 알데히드가 함유되면 먼저 기질을 함질소화합물, 특히 암모니아, 수산화암모늄 또는 기타 활성이 있는 암모늄 화합물을 알데히드 1몰에 대해 약 0.01-10몰의 비율로 적당량 사용하여 처리하므로서 이러한 악영향을 제거할 수 있다. 이렇게 하여 처리한 기질은 탄소 에너지 공급원이 될 뿐만 아니라 필요로 하는 최소한 일부의 동화작용성의 질소를 함유하기도 하는 것이다. 편리한 것으로서 함탄소 기질을 제한인자로서 조절하여 함탄소 기질이 효모세포로 전환이 양호하게 되게 함과 아울러 미전환 기질이 상당량 있는 효모세포가 오염되는 것을 방지하도록 함으로서 발효를 실시한다. 후자의 경우는 잔존하는 미량성분을 쉽게 세척하여 버릴 수 있기 때문에 수용성 기질에서 나타나는 문제점은 아니다.
그러나 고급 n-파라핀과 같은 비수용성 기질의 경우에서는 적당한 용매를 사용하는 세척단계에 의하여 잔존 탄화수소를 제거하는 것과 같은 생성물 처리 단계를 추가로 필요로 한다는 문제점이 있게 된다. 균일한 품질을 가진 생성물을 쉽게 조절할 수 있고 쉽게 제조할 수 있으며 또한 모든 장치를 가장 경제적으로 활용할 수 있다는 이유로 해서 연속 조작이 훨씬 좋은 것이다. 연속공정에 있어서 기질로서의 탄소 및 에너지공급물질, 무기질 배지용액, 동화작용성의 질소 공급물질 및 분자 산소를 함유하는 가스를 발효조에 있는 발효물로 연속으로 가하면서 발효물을 연속으로 배출하도록 한 것이다. 첨가되는 탄소에너지 기질 대 첨가되는 무기질 배지와의 용적비는 광범위하게 달라질 수 있는데, 이것은 함탄소 기질의 특성에 따라서도 일부 달라지지만 약 1 : 9 - 6 : 4의 범위로 하는 것이 일반적이고 약 2 : 8-5 : 5의 범위로 하는 것이 좋다.
필요에 따라서 탄소 에너지 공급물질의 일부 또는 전부와 암모니아 같은 동화작용성의 질소공급물질을 무기질 배지에 첨가한 후 발효조로 보낸다. 고세포밀도 발효에 있어서 더욱 편리한 점은 알코올 약 40vol.% 대 무기염 배지 60vol.%의 공급비율을 사용하는 것이다. 반응기로 도입되는 각 공급액을 일정속도로 조절하거나 조절측정장치에 응답하도록 하여 탄소 및 에너지 기질의 농도, pH, 용존산소, 발효조에서 배출되는 가스중의 산소 또는 이산화탄소, 광투과도로 측정가능한 세포밀도 등을 조절하는 것이 좋다. 각종 물질의 공급속도를 달리하여 주어 탄소 및 에너지 공급물질의 효율적인 활용과 일치되고 가능한한 세포성장 속도를 신속히 하며 가능한한 기질공급에 대한 효모세포의 수들율을 높일 수 있도록 한다.
따라서 본 발명에 의한 방법을 사용하면 특수한 기질에 따라 일부 달라지겠지만 공급되는 기질 100g당 약 30-110g의 수득율로 효모세포를 얻을 수 있다. 약 250℉(121℃)의 증기를 사용하여 최소한 약 15분간 모든 장치, 반응기 또는 발효장치, 용기, 배관시설, 부수된는 순환 또는 냉각장치 등을 멸균하는 것이 가장좋다. 멸균된 반응기를 분자 산소와 함탄소 기질을 포함하여 필요로 하는 모든 배양물질 존재하에 특정한 미생물 배양물로 접종시킨다. 사용되는 발효조의 형식은 기포충전이 된 발효조에서의 조작이 적절하다고 할지라도 본 발명에 의한 발효공정의 실시에 있어서 중요성이 있는 것은 아니다. 생성된 기포를 유지하고 조장하도록 설계한 발효조를 사용하면 높은 세포밀도와 큰 성장속도를 유지하는 데 필요한 산소전달을 크게 할 수 있는 공정에서 이점을 가질 수 있다. 발효를 시작할 때에 수성의 무기배지, 적당한 농도를 가진 탄소 공급물질, 동화작용성의 질소, 필요에 따라 미량의 성분 및 효모의 출발종균을 멸균시킨 발효조에 넣고 산소와 기타 공급물을 적당한 유속으로 서서히 가한다. 필요하다면 초기의 발효기질로서는 글루코오스를 사용하여 메탄올로의 변화가 서서히 일어남과 아울러 세포밀도가 증가되게 할 수도 있다. 초기에 발효조에 다량의 염배지를 가하여 즉시 조업을 시작할 수 있게 하는 것이 보통이지만 고농도의 무기염을 가지는 수성 무기질배지를 발효물에 공급하여 수성발효물 중에서 무기염의 함량을 작게하여 시작하고 고농도의 무기염으로 증가되게할 수 있다.
초기에 잠시 지체 시간이 보통 나타난 후 종균이 충분히 세포를 증식시켜 사용되는 염과 기질을 완전히흡수하게 된다.
[제품 회수]
본 발명에 의한 고세포밀도 공정에 따라 제조된 효모 세포를 원심분리나 여과등 종래의 방법으로 발효 혼합물 유출액으로 부터 회수한다. 만일 필요하다면 세포의 생성물도 종래의 방법을 사용하여 잔존하는 무세포의 상등액 으로부터 회수한다. 무세포 유출물을 아세톤 또는 메탄올 혹은 에탄올 같은 저급알코올로 처리하여 세포 외적으로 생성된 중합물질을 침전시키는 예도있다. 용매추출법이나 염기추출법을 사용하여 무세포 유출물을 처리하므로서 색소, 비타민 또는 배양공정중에서 생성된 유기산을 회수할 수도 있다. 이러한 중간처리 공정을 사용하던지 않던지간에 무세포 유출물을 보충수의 일부로서나 보충수 전체로 하여 발효조로 순환시켜 주므로서 폐기물 처리문제를 피할 수 있다. 미생물 세포는 보통 열이나 화학적인 수단에 의해 죽어버리는데 이것을 발효조유출물로부터 세포를 분리하기전 후에 실시한다. 효모세포는 인간뿐만 아니라 동물에 있어서 단백질 공급원이다. 인간이 사용할 수 있는 것으로 하자면 세포를 필요한 정도로 처리하여 핵산의량을 감소시켜 버리지만 동물사료용으로 하자면 이러한 처리를 할 필요가 없다.
본 발명에 있어서 세포밀도 범위를 발효혼합물 1ℓ당 건조상태로 효모세포를 약 60-160g정도, 가능하면 약 70-150g정도로 한 고세포 밀도 조작법을 사용하면 수득율이 커진다. 필요하다면 원심분리법이나 기타 분리법 사용하여 발효 혼합물로 부터 세포를 회수할 수 있다. 또한 농축된 세포를 물로 혼합하는 식의 세척을한 후 원심분리 등으로 분리하거나 원심분리 전이나 분리도중 물을 첨가하여 무기질 배지중의 세포를 제거하고 분리된 무기질 배지를 함유한 세척액을 물 및 무기질 배지 보충물로 하여 발효조로 순환시켜 폐기물 처리문제를 줄이거나 피할 수 있도록 할 수 있다. 회수된 세포를 단순히 건조만 시켜서 앞으로도 사용할 수 있는 건조물로 만든다. 필요에 따라서는 전체적으로 고세포 밀도의 발효조 유출물을 건조시켜 전체를 건조된 세포와 각종 염을 함유한 잔존하는 수용성 물질로 된 제품으로 만드는데 이렇게 하여 만든 전건조 제품을 고단백-고염분 특성을 가진 동물사료로 사용하기가 극히 좋다.
[실시예]
다음에 나오는 실시예는 본 발명에 의한 공정을 사용하는 방법을 나타낸 것인데, 여기에 나오는 특정량의 물질이나 특수한 형식의 공급물, 특수한 효모종 또는 효모균에 대해서는 본 발명에 대한 제한적인 것이 아닌 단순한 설명에 불과한 것이다.
[실시예 1]
연속적인 호기성 발효공정조건하에서 실시함에 있어서 메탄올과 무기염배지 용액의 용적비를 30.15 : 69.85로 하여 피치아 파스토리스 배양 21-2 NRRL Y-11431 효모로 접종한 발효조로 각각 공급하는데 예비 조절 내지 기질을 전혀 사용하지 않는다. 4ℓ용량의 발효조에서 2ℓ의 액체용적을 가지도록 하고 자동적으로 pH 온도 및 수준조절을 할 수 있도록 한 것을 사용한다. 회전속도가 1000-2000rpm인 두 개의 임펠러를 사용하여 교반을 한다. 대기압하에서 30℃의 공기로 포화시킨 발효혼합물중에 용해되는 산소에 대하여 약 20%에 상당하는 용존산소의 량을 유지할 수 있을 정도의 충분한 산소와 함께 보충되는 공기의 1분당의 량에 대하여 발효물 용적당 1-1.5 용적(대기압정도에서 약 25℃에 대한 것임)으로 하여 통기속도로 한다. 수산화암모늄액(농수산화암모늄 2용적부와 탈염수 2용적부로 된 것)을 발효혼합물의 pH를 3.5정도로 유지할수 있는 속도로 첨가한다. 용액 1ℓ에 대하여 85% H3PO412.5㎖, 85% KOH 2.5g, KCl 8.5g, MgSO4.7H2O 7.0g, CaCl2.2H2O 1.5g, 미량의 무기질 용액 A 25㎖, 미량의 무기질용액 B 25㎖, 바이오린과 염산티아민의 용액 10㎖, 소포체(MaZU DF-37C) 약 0.08㎖, 및 충분한 량의 탈염수를 가하고 혼합하여 용액전체를 1ℓ를 만들어 무기염 배지액으로 사용한다. 미량의 무기질 용액 A는 용액 1ℓ에 대하여 FeCl3.6H2O 4.8g, ZnSO4.7H2O 2.0g, H3BO30.02g, Na2MoO4.2H2O 0.20%, MnSO4.H2O 0.30g, KI 0.08g, CuSO4.5H2O 0.06g, 농황산 3㎖ 및 충분한 량의 탈염수를 가하고 혼합하여 용액전체를 1ℓ로 만든 것이다.
미량의 무기질용액 B는 용액 1ℓ에 대하여 FeCl3.6H2O 2.0g, ZnSO4.7H2O 2.0g, MnSO4.H2O 0.3g, CuSO4.5H2O 0.6g 농황산 2㎖ 및 충분한 량의 탈염수를 가하고 혼합하여 용액전체를 1ℓ로 만든 것이다. 바이오틴-염산 티아민 용액은 바이오틴 2mg, 염산티아민 200mg 및 탈염수 50㎖를 혼합하여 만든 것이다.
발효조건은 온도 약 30℃와 대기압정도의 압력에서 체류시간을 7.0시간으로 하여 실시한다. 원심분리에 의해 발효유출물로 부터 효모 세포를 분리하고 수중에 현탁시킨 후 다시 원심분리시키는 방법으로 세척한후 100℃에서 하루밤 건조시켜 중량을 단다.
제조된 효모세포의 수득율은 건조상태기준으로 메탄올 공급물 100g당 42.3g이었고 세포밀도는 유출물 1ℓ당 100.7g의 세포함량을 가진 것이었다.
[실시예 2]
메탄올 대수산화암모늄액의 용적비를 40.8 : 59.2로 함으로써 무기염 배지액의 조성을 다소 달리하여 실시예 1에 나온 방법을 따라 다시 발효를 시킨다. 이 경우에 있어서 pH 조절용으로서의 수산화암모늄액은 농수산화암모늄 3용적부와 탈염수 1용적부로 하여 만든 것이고 발효체류 시간을 8.35시간으로 한다.
본 실시예에서 사용되는 무기염 배지액은 용액 1ℓ에 대해서 85% H3PO420.0㎖, 85% KOH 4.0g, KCl 12.0g, MgSO4.7H2O 10.4g, CaCl2.2H2O 2.4g 실시예 1에 나온 미량의 무기질 용액 A 40㎖, 실시예 1에 나온 미량의 무기질 용액 B 40㎖, 실시예 1에 나온 바이오틴과 염산티아민으로된 용액 16㎖, 소포제 약 0.08㎖ 및 충분한 량의 탈염수를 가하고 혼합하여 용액전체를 1ℓ로 만든 것이다. 실시예 1에서와 같이 발효 유출물로부터 효모세포를 분리하여 세척한 후 건조시킨다. 제조된 효모세포의 수득율은 건조상태 기준으로 메탄올 공급물 100g당 41.4g이었고 세포밀도는 유출물 1ℓ당 133.3g의 세포함량을 가진 것이었다.
[실시예 3]
실시예 1에서와 같이 발효조내에서 연속호기성 발효공정을 실시하는데, 이 경우에 있어서 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) 배양 21-3 NRRL Y-11432 효모종으로 접종시킨 발효조를 사용한다. 발효조에다 전체용액 1ℓ당 메탄올을 300㎖ 함유토록한 메탄올과 무기염배지액의 혼합물을 가한다. 대기압하에서 38℃의 공기로 포화시킨 발효혼합물 중에 용해되는 산소에 대하여 약 20%에 상당하는 용존산소의 량을 유지할 수 있을 정도의 충분한 산소와 함께 보충되는 공기의 1분당의 량에 대하여 발효물용적당 2용적(대기압정도에서 약 25℃에 대한 것임)을 발효조속을 통과시키므로서 교반된 발효혼합물을 통기시킨다.
수산화암모늄액(농수산화암모늄 2용적부와 탈염수 1용적부로 만든 것임)을 발효혼합물의 pH를 3.7-4.1로 유지할 수 있을 정도의 속도로 가한다.
메탄올과 무기염배지액의 혼합물은 용액 1ℓ에 대하여 메탄올 300㎖, 85% H3PO46㎖, KCl 3g, MgSO4.7H2O 4.5g, CaCl2.2H2O 0.6g, NaCl 0.3g 실시예 1에서 나온 미량의 무기질용액 A 10㎖, 실시예 1에서 나온 미량의 무기질용액 B 10㎖, 실시예 1에서 나온 바이오틴과 염산티아민의 용액 4㎖, 소포제 4방울 및 충분한 량의 탈염수를 가하고 혼합하여 용액전체를 1ℓ로 만든 것이다.
발효는 약 38℃의 온도와 대기압정도에서 체류시간을 5.66시간으로 하여 실시한다.
실시예 1에서와 같이 발효 유출물로부터 효모세포를 분리하여 세척한 후 건조시킨다. 제조된 효모 세포의 수득율은 건조상태 기준으로 메탄올 공급물 100g당 31.0g이었고 세포밀도는 유출물 1ℓ, 73.3g의 세포를 함유한 것이었다.
[실시예 4]
연속적인 호기성발효 공정에 있어서 용적비를 36.9 : 63.1로 하여 메탄올과 무기질 배지액을 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 배양 21-2 NRRL Y-11430 효모종으로 접종시킨 발효조로 각각 공급한다. 발효조는 약 600ℓ정도의 액체 용적을 가지며 자동적으로 pH, 온도 및 수준 조절을 할 수 있으며 흡출관이 장치된 1500㎖ 용량의 기포충전이 된 것을 사용한다. 흡출관 아래쪽에 회전수가 750rpm인 터어빈을 장치하여 교반을 시킨다. 통기속도는 1분당 발효조내에 있는 발효물의 용적당 1.6용적의 공기(약 38psig 및 25℃의것임)를 사용한다. 발효 혼합물의 pH를 약 3.5로 유지할 수 있을 정도의 속도로 무수 암모니아를 첨가한다.
일차 무기염 배지액은 용액 1ℓ에 대하여 75% H3PO412.2㎖, KCl 6.0g, MgSO4.7H2O 6.0g, CaCl2.2H2O 0.8g, 85% KOH 2.0g 미량의 무기질용액 C 2.0㎖, 바이오틴과 염산티아민과의 용액 0.8㎖ 및 수도물을 가하고 혼합하여 용액전체를 1ℓ로 만든 것이다. 이때 사용하는 수도물은 충분한 량의 티오황산나트륨을 가하여 존재하는 유리염소와 반응시켜 처리한 것을 사용한다.
미량의 무기질용액 C는 용액 1ℓ에 대하여 FeCl3.6H2O 65g, ZnSO4.7H2O 18g, MnSO4.H2O 5.0g, CuSO4.5H2O 6.0g, 농황산 2.0㎖ 및 충분한 량의 탈염수를 가하고 혼합하여 용액전체를 1ℓ로 만든 것이다. 바이오틴과 염산티아민과의 용액은 바이오틴 0.4g과 염산티아민 40g을 탈염수 1ℓ에 가하고 혼합하여 만든 것이다.
발효는 온도 30℃와 압력 38 psig에서 체류시간을 12.7시간으로 하여 실시한다.
원심분리에 의하여 발효유출물로 부터 효모세포를 분리하고 수중에 현탁시켜 재차 원심분리시켜 세척하여 100℃에서 하루밤 동안 건조시킨 후 중량을 단다.
제조된 효모 세포의 수득율은 건조 상태기준으로 메탄올 공급물 100g당 37g이었고 세포밀도는 유출물 1ℓ당 110.3g의 세포를 함유한 것이었다.
[실시예 5]
연속적인 호기성 발효공정에 있어서 메탄올과 무기염 배지액의 용적비를 40 : 60으로 하여 피치아 파스토리스 배양 21-1 NRRL Y-11430 효모종으로 접종시킨 발효조로 각각 공급한다. 액체용적이 약 610ℓ정도이고 자동적으로 pH, 온도 및 수준조절을 할 수 있는 1500㎖ 용량의 기포충전이 된 발효조를 사용한다. 회전속도가 1000rpm인 종래의 패들식(paddle-type) 터어빈 두대를 이용하여 교반한다. 1분당 발효조 내의 발효물 용적당 4용적의 공기(압력 : 약 38psig, 온도 : 약 25℃)를 사용하여 통기속도로 한다. 발효혼합물의 pH를 약 3.5정도로 유지할 수 있는 속도로 무수 암모니아를 첨가한다. 무기염 배지액은 수도물 1ℓ에 대하여 75% H3PO415.86㎖, K2SO49.53g, MgSO4.7H2O 7.8g, CaCl2.2H2O 0.6g 및 85% KOH 2.6g을 가하고 혼합하여 제조한 것이다. 메탄올 1ℓ당 10㎖의 속도로 메탄올속에 통하여 미량의 무기질용액과 바이오틴을 별도로 공급한다.
미량의 무기질용액과 바이오틴을 미량의 무기질용액 D 780㎖ ; 물 20㎖, 메탄올 200㎖ 및 바이오틴 0.032g을 혼합하여 만든 것이다. 미량의 무기질용액 D는 용액 1ℓ에 대하여 FeSO4.7H2O 65g, ZnSO4.7H2O 20g, MnSO4.H2O. 3.0g, CuSO4.5H2O 6.0g, 농황산 5.0㎖ 및 충분한 량의 탈염수를 가하고 혼합하여 용액전체를 1ℓ로 만든 것이다.
시간당 31.5ℓ의 속도로 무기질 배지액을 공급하여 메탄올은 시간당 21ℓ의 속도로 공급한다. 발효는 온도 30℃와 압력 38psig 및 체류시간을 11.6시간으로 하여 실시한다.
분석용으로 사용하기 위하여 원심분리에 의해 발효유출물로부터 효모세포를 분리하고 물속에 현탁시켜 재차 원심분리하여 세척하고 100℃에서 하루밤 동안 건조한 후 중량을 단다.
제조된 효모세포의 수득율은 건조 상태기준으로 메탄올 공급물 100g당 40.6g이었고 세포밀도는 유출물 1ℓ당 128.4g의 세포를 함유한 것이었다.
세포와 용존하는 고체를 포함하여 발효물중의 전체 고형분함량(발효조에서 나온 유출물중)은 134.7g/ℓ이었다. 발효조에서 나오는 유출물을 저온 살균 기속을 직접 통과시켜 효모를 죽이고 분무기로 보낸다.
[실시예 6]
연속적인 호기성 발효공정에 있어서 메탄올과 무기염 배지액의 용적비를 29 : 71로 하여 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) NRRL Y-11170 효모종으로 접종시킨 발효조로 각각 공급한다. 액체용액이 약 560ℓ정도이고 자동적으로 pH, 온도 및 수준 조절을 할 수 있으며 흡출관이 장치된 1500ℓ 용량의 기포충전이 된 발효조를 사용한다. 흡출관아래에 장치된 회전수가 810rpm인 터어빈을 사용하여 교반을 한다. 1분당 발효조내의 발효용적당 약 5용적의 공기(압력 : 약 38psig, 온도 : 약 25℃)를 사용하여 통기속도로 한다. 발효혼합물의 pH를 약 3.5정도로 유지할 수 있는 속도로 무수 암모니아를 가한다.
무기염 배지액은 75% H3PO410.38㎖, KCl 4.29g, MgSO4.7H2O 6.44g, CaCl2.2H2O 0.86g, NCl 0.43g, 미량의 무기질용액 C 3.0㎖ 및 바이오틴과 염산티아민의 용액 0.64㎖를 1000㎖의 수도물에 가하고 혼합한 것으로서, 이때 사용되는 수도물은 충분한 량의 티오 황산 나트륨을 가하여 존재하는 유리염소와 반응시켜 처리한 것을 사용한다.
발효는 온도 39-40℃와 압력 38psig 및 체류시간을 7.6시간으로 하여 실시한다. 분석용으로 사용하기 위하여 원심분리에 의해 발효유출물로부터 효모세포를 분리하고 물속에 현탁시켜 재차 원심분리하고 세척하고 100℃에서 하루밤 건조시킨 후 중량을 단다. 제조된 효모세포의 수득율은 건조상태 기준으로 메탄올 공급물 100g당 33.3g이었고 세포밀도는 유출물 1ℓ당 76.2g의 세포를 함유한 것이었다.
[신규효모]
성장이 신속하고 생산속도가 큰 효모를 발견했다는 것이 분명히 유익한 점이다.
본 발명에 의한 세가지의 특히 특이한 효모배양물들, 즉 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)(배양 21-2) 공탁번호 NRRL Y-11431, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)(배양 21-1) 공탁번호 NRRL Y-11430 및 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)(배양 21-3) 공탁번호 NRRL Y-11432은 극히 바람직하고도 유용한 성질을 가진 것이다.
이들 특이한 효모 배양물들은 산소화 탄화수소 공급물, 특히 저급 알코올중에서도 메탄올 또는 에탄올에 대해서 극히 생산성이 높게 효과적으로 성장을 한다. 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)종의 배양물중에서 어떤 것들은 메탄올에 대해서만 성장을 하지 못하므로 신규의 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)에 대해서 특기할 만한 가치가 있는 것이다.
이들 특이한 종들은 다음와 같다.
Figure kpo00003
공탁번호 NRRL Y-11431, NRRL Y-11430 및 NRRL Y-11432는 본 발명인들이 미국 농무성산하기관인 공탁소(Agricultural Research Service, Northern Regional, Research Laboratory, Peoria, Illinois, 61640)에 신규의 효모 배양물 21-2, 21-1 및 21-3을 공탁해 두었다는 사실을 보아서도 입증이 된다. 이배양물을 공탁할 때는 각 배양물을 두가지 사면한천(agar slant) 배양물속에 보관하며 위에 나온 바와 같이 각각의 NRRL균주 지정을 공탁소로 부터 통보받은 바 있다. 따라서 공탁이 되어 있는 본 발명에 의한 배양물로부터나 또는 이를 공탁물로 부터 제시되는 배양시료는 본 발명에 의한 종(種)으로 부터 만든 균주인 것이다.
본 발명에 의한 공정에 있어서 한가지 특징은 수성의 호기성 배양 조건하에서 미생물의 새로운 균주 또는 배양물에 속하는 산소화 탄화수소를 동화시키는 미생물 세포를 배양할 수 있다는 점이다.
이들 균주는 다음과 같이 분류한다.
Figure kpo00004
신규의 특이한 미생물은 다음에 나오는 바와 같은 특성을 가진다.
Figure kpo00005
Figure kpo00006
Figure kpo00007
DNA에서(구아닌+시토신)의 함량 40%
+=양성, -=음성, W/L=잠재반응에 대해 약함, (가)=수치가 표시할 수 없음.
경우 평균값을 결정할 수 없음.
물론, 모든 미생물에 있어서와 같이 어떤 특성은 배지와 특정한 조건에 따라 다소의 변화가 있을수 있다. 각 실시예에서 나온 배지 처방을 사용하여 본 발명에 의한 신규의 효모종을 배양할 수 있는데 메탄올을 함유하는 기질이외의 것에서 성장을 할 경우도 있다.
이러한 신규의 효모배양물은 앞서나온 바와 같이 고도의 염으로 된 배지에서 사용할 수 있을 뿐만 아니라 다음과 같이 배지를 사용하여 종래의 발효조건하에서도 사용할 수 있다.
[배지 1M-1]
Figure kpo00008
멸균 메탄올(나)을 가하여 0.5-1.0vol%로 만듬.
(가) 아래의 처방참조.
(나) 사용하기 직전에 첨가.
[미량의 무기질 용액]
Figure kpo00009
[실시예 7]
캔디다 유틸리스(톨루라)(Candida Utilis(Torula))효모의 호기성 배양은 연속적 무균 공정내의 벤치상부 발효조에서 수행한다. 발효조를 처음에 살균한후 배지 2ℓ를 넣고 에탄올을 첨가하여 최종농도가 0.5%(v/v)가 되게하고 암모니아로 pH가 3.5-4.0가 되게 맞춘다. 플라스크내의 성장한 접종물을 발효조에 첨가하고 뱃치내 32℃에서 여러번의 분열사이클을 통해 성장시킨다. 알코올이 모두 소비되면 살균한 에탄올을 배양물이 완전히 이용될 수 있는 속도로-보통 이것은 용존 산소 반응에 의해 감시된다-첨가한다. 총 300㎖의 에탄올을 배양 용기에 첨가한 후 살균한 무기물 및 알코올을 발효조에 첨가한다. 연속적 공정시의 발효조 용량은 1.8-2.0ℓ로 유지시킨다. 산소가 있는 공기를 주입하고 용해된 산소의 농도는 포화공기의 약 10%로 유지시킨다. 연속 상태는 배지의 희석 속도를 조절함으로 성취할 수 있다.
에탄올 기질은 항상 제한 영양소이다. 발효시 온도는 32±1℃로 유지시킨다. 세포 농도는 주입물내의 에탄올 농도 및 세포질량 수율에 따라 120-140g/ℓ 범위이다. 연속 상태 조건에 도달한 후, 발효 육즙의 샘플을 회수하고 원심분리하고 세척하고 건조함으로 세포질량 수율을 결정한다. 몇몇 결과는 표 2에 기재했다.
성취된 가장 빠른 성장속도는 체류시간 3.4시간이었다. 수율(78-82%)은 관례적 저세포밀도 공정에(표 2 4째줄) 보고된 것과 거의 같았으나 실험실 규모에서 고세포 밀도 공정을 이용한 것의 생산물(33g/ℓ/h)은 관례적 방법에 보고된 것(10g/ℓ/h) 보다 3배 이상이다.
[표 2]
Figure kpo00010
a : 선행 기술(관례적 방법)
[실시예 8]
클루이베로마이세스 프라질리스(Kluyveromyces fragilis) 균주는 미국 농무성 산하 기관인 공탁소(USDA Northern Regional Research Laboratories, Peoria, Illinois) 및 미국 형배양 수집소(American Type Culture Collection, Rockville Maryland)로 부터 얻을 수 있다. 효모는 YM 사면 한천 및 한천 평판에 유지시킨다.
YM 평판으로부터 분리된 단일 군락을 250㎖들이 엘렌메이어(Erlenmeyer) 플라스크내의 1.2%유장 투과성 고형물(Express Foods, Louisville, Kentucky)로 충전된 최소 배지 100㎖에 주입한다. 배지는 다음 성분(g/ℓ) : KH2PO4, 5.0 : (NH4)2SO4, 3.0 : MgSO4·7H2O, 0.5 : CaCl2·2H2O, 0.1 : FeSO4·7H2O, 0.15 : CuSO4·5H2O, 0.0125 ; ZnSO4·7H2O, 0.095 ; MnSO4·H2O, 0.0063 ; Na2MoO4·2H2O, 0.0038 및 CaCl2·6H2O 0.0005을 포함한다. 플라스크를 New Brunswick G-25 교반기상 37℃에서 항온처리한다. 벤치 상부 발효주입물을 밤새 배양한다(16-24시간). 벤치 상부 발효조는 주문하여 만든 4ℓ발효조이다. 고세포밀도 공정을 위해서 처음에 73% H3PO42.1㎖/ℓ ; H2SO41.2㎖/ℓ ; 나이아신 3.1mg/ℓ ; D-판토테인산 1.0mg/ℓ ; 유장투과성 고형물 100g/ℓ 및 미량의 무기질용액 1.5㎖/ℓ를 포함하는 살균 배지 2ℓ를 발효조에 넣는다. 미량의 무기질 용액은 다음의 무기질(g/ℓ) ; FeSO4·7H2O, 60 ; CuSO4·5H2O, 5 ; ZnSO4·7H2O, 25 ; MnSO4·H2O, 2 ; Na2MoO4·2H2O, 1 ; 및 CoCl2·6H2O, 0.2를 포함한다.
접종물을 밤새 배양시킨 후, 발효조를 모든 락토오스가 소비될 때까지 13-16시간동안 pH 4.6 37℃에서 호기적으로 작동시킨다. 살균한 공급물을 배양물이 공급물에 포함된 락토오스를 완전히 소비할 수 있는 속도로 계속적으로 첨가한다. 이것은 보통 용존 산소 반응에 의해 감시된다. 락토오스 함량은 이온 크로마토그라피에의해 결정한다. 계속적 공급물은 75% H3PO4(6.2㎖/ℓ), H2SO4(3.7㎖/ℓ), D-판토테인산(3.1mg/ℓ), 나이아신(9.3mg/ℓ), 및 미량의 무기질 용액(4.4㎖/ℓ)으로 강화된 30%유장 투과성 고형분(건조 투과성 분말 또는 농축액 투과물)을 포함하다. 식품등급 소포제 FG-10
Figure kpo00011
(Michigan Midland Dow Chemical)을 사용하여 기포를 조절한다. 발효조의 기체가 없는 액체를 발효조 육즙을 계속적으로 회수함으로 1.8-2.01로 유지 시킨다. 산소가 있는 공기를 주입하고 용존 산소의 농도는 포화공기의 20-30%로 유지한다. 연속 상태는 일정한 희석 속도에서 세포 질량에 변화가 없을 때 성취된다. 암모니아 기체를 질소원 뿐만 아니라 pH 조절을 위해 사용한다. 락토오스, 유장당은 항상 제한 영양소이다.
농축 유장 투과물을 기질로 사용함으로, 식품등급 효모(클루이베로마이세스 프라질리스 ; Kluyveromyces fragilis)가 발효조에서 매우 높은 세포 밀도(총 육즙 건조무게가 140g/ℓ가 넘는다)로 계속적으로 성장하게 한다. 유장 투과물내의 높은 회분 함량은 세포 성장을 저해하지 않는다. 세포 질량 수율은 공급물 내의 6-30% 유장 투과성 고형물로 pH 3.9-5.1 범위, 온도 31-37℃에서 대략 일정하게 유지된다. 희석 속도(0.1-0.3h-1)는 세포 질량 수율에 아무런 효과도 주지 않는다. 38℃보다 높은 온도는 수율을 감소시킨다. 고세포 밀도 발효 육즙을 원심분리 및 세척을 하지 않고 직접 건조시켜서 직접 건조 생성물의 성분을 결정한다. 분석하면 생성물이 수용가능한 단백질 및 무기질 성분을 갖는다는 것이 나타난다. 생성물의 아미노산 프로필, 비타민 함량 및 지방산 성분은 단백질 생성물의 질을 나타낸다.

Claims (1)

  1. 고세포 밀도 조건하에서, 동화될 수 있는 질소원, 보충수, 산소, 수성의 무기염 배지, 하나 또는 그이상의 탄수화물, 즉 글로코오스, 푸룩토오스, 갈락토오스, 락토오스, 수크로오스, 전분 및 덱스트린, 수용성 알코올, 케톤, 알데히드, 산 또는 한 분자당 탄소원자가 1-20인 에스테르, 또는 한분자당 탄소원자가 10-20인 노르말 파라핀인, 탄소와 에너지 기질 유효량 및 효율적인 호기성 효모 배양 발효조건을 사용하는 수성의 무기염 발효물로부터의 단세포 단백질 제조방법에 있어서, 수성의 발효 조건하에서 성장하기에 적당한 적어도 한가지 효모종을 배양하고 ; 수성의 무기염 배지를 수성의 발효물 1ℓ당 최소한 P-1.9g, K-1g, Mg-0.15g, Ca-0.06g, S-0.1g, Fe-6mg, Zn-2mg, Cu-0.6mg, 및 Mn-0.6mg의 원소를 유지시키기에 충분한 속도로 수성의 발효물에 첨가하여, 상기 수성의 발효물에 있어서 수성의 발효물 1ℓ당 건조기준 상태에서 최소한 60-160g의 세포밀도를 유지시키고, 결과 생성된 미생물을 단세포 단백질 물질로 회수하는 것으로 구성된 방법.
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Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4439525A (en) * 1981-09-09 1984-03-27 Phillips Petroleum Company High methionine content Pichia pastoris yeasts
US4596778A (en) * 1983-07-06 1986-06-24 Phillips Petroleum Company Single cell protein from sulfur energy sources
US4601986A (en) * 1983-07-29 1986-07-22 Phillips Petroleum Company Protein product of reduced nucleic acid content and low allergenicity
US4595659A (en) * 1983-10-20 1986-06-17 Kraft, Inc. Fermentation production of ascorbic acid from L-galactonic substrate
GB2151635B (en) * 1983-12-08 1988-01-13 Ici Plc Production of single cell protein and sucrose
AU583978B2 (en) * 1986-03-10 1989-05-11 Phillips Petroleum Company Fermentation of bacteria at high productivities
DD272182A3 (de) * 1986-12-17 1989-10-04 Leipzig Chemieanlagen Verfahren zur gewinnung von hochwertigem futtereiweiss aus molke
EP0338098B1 (de) * 1988-04-16 1993-08-04 Starcosa GmbH Verfahren zur Erzeugung von Zellmaterial aus Mikroorganismen, insbesondere von Hefen
GB9902000D0 (en) 1999-01-30 1999-03-17 Delta Biotechnology Ltd Process
CN109136118A (zh) * 2018-09-30 2019-01-04 南京林业大学 一种以乙醇为过渡碳源的双菌分步发酵产单细胞蛋白的方法
CN117801964B (zh) * 2024-02-29 2024-05-28 中国食品发酵工业研究院有限公司 一种快速富集培养真菌的培养基、培养方法及应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1274855A (en) * 1968-07-15 1972-05-17 Storey Brothers And Company Lt The welding of thermoplastics materials
GB1348304A (en) * 1971-04-19 1974-03-13 Phillips Petroleum Co Microbiological fermentation processes using oxygenated hydrocarbon feedstock
JPS5840463B2 (ja) * 1977-08-11 1983-09-06 鐘淵化学工業株式会社 酵母の高菌体濃度培養法

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Publication number Publication date
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EP0017853B2 (en) 1990-04-04
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EP0017853B1 (en) 1984-10-24
GB2047268A (en) 1980-11-26
NO168370C (no) 1992-02-12
GB2124652B (en) 1984-08-01
ES8105384A1 (es) 1981-04-16
GB2047268B (en) 1983-06-15
NO168370B (no) 1991-11-04
DK157480A (da) 1980-10-13
DE3069485D1 (en) 1984-11-29

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