JPH07147991A

JPH07147991A - β−ヒドロキシ酸の製造方法

Info

Publication number: JPH07147991A
Application number: JP5329708A
Authority: JP
Inventors: Tsunetoshi Miura; 常稔三浦; Akihisa Kanda; 彰久神田; Toshimitsu Nakajima; 敏光中嶋
Original assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1993-11-30
Filing date: 1993-11-30
Publication date: 1995-06-13

Abstract

(57)【要約】【構成】β−ヒドロキシ酸の生産能を有する微生物を培
養してβ−ヒドロキシ酸を製造するに際し、微生物のエ
ネルギー源の比供給速度を制御することにより該微生物
の比増殖速度を制御しながら培養することを特徴とする
β−ヒドロキシ酸の製造方法。【効果】本発明の方法により、β−ヒドロキシ酸生産微
生物のβ−ヒドロキシ酸生産能を長期間安定に維持する
ことが可能となり、また光学活性なβ−ヒドロキシ酸の
生産性の向上および生産のための培養槽の小型化が可能
となる。さらに、分離装置との組み合わせにより培養槽
内の菌濃度を高濃度に維持できる上、菌体と生産物とを
容易に分離できるためβ−ヒドロキシ酸の精製などの後
処理プロセスの負荷が著しく低減され工業的に極めて有
利である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、２種の異なる官能基を
有し、医薬、農薬などの有用な合成中間体となるβ−ヒ
ドロキシ酸の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、生化学、有機化学などの著しい進
展により、種々の生理活性物質が分離同定、あるいは合
成され、それらの立体構造と生理活性との相関が明らか
にされるに伴い、光学活性もその重要な因子として確認
されるようになった。現在、種々の手法を用いて光学活
性な生理活性物質の合成研究が盛んに行われている。本
発明者らが本特許で対象としている光学活性な脂肪酸系
のβ−ヒドロキシ酸は、２種の官能基を持ち、その特性
の違いを利用して種々の光学活性物質へ容易に誘導し得
ることから、学際的にも産業的にも魅力ある物質群であ
る。

【０００３】すでに工業的に実施し得る経済的なβ−ヒ
ドロキシ酸の生産法は、精力的に研究され、微生物の代
謝制御を利用して立体特異性を異にするＤおよびＬ型の
各種β−ヒドロキシ酸の選択的かつ効率的な生産法が開
発されている（特公昭５９−２１５９９号公報、特公昭
５９−２１６００号公報、特公昭６０−１６２３５号公
報、特公昭６１−１２６７６号公報、特公昭５９−５３
８３８号公報、特公昭６１−１２６７８号公報、特公昭
６２−５７３１１号公報、特公昭６２−５７３１２号公
報、特公昭６１−４２５５９号公報、特公昭６１−４２
５６０号公報、特公昭６３−１９１５３号公報、特公昭
６２−５４４７４号公報、特開昭５７−６５１８９号公
報、特公平０４−８０３５号公報、特公平０４−８０３
６号公報）。なかでも、例えば血圧降下剤カプトプリル
の原料となるＤ−β−ヒドロキシイソ酪酸（以下、ＨＩ
ＢＡと略す）などは、すでに工業生産されている。

【０００４】光学活性なβ−ヒドロキシ酸（以下、単に
β−ヒドロキシ酸と略す場合がある）、例えばＨＩＢＡ
の工業生産では安価で大量入手が容易な脂肪酸、アルコ
ールがその原料として利用され、脂肪酸のβ−水酸化法
は脂肪酸の主代謝経路であるβ−酸化酵素系や、類縁の
分岐状アミノ酸代謝経路と共通すると思われる酵素系を
利用して行われている。これらの代謝経路では、その代
謝主要経路にＡＴＰが必須であり、したがって代謝系を
活性化し、β−ヒドロキシ酸の生産速度を上昇させるに
は、好気的条件下にグルコース、グリセリンなどの微生
物のエネルギー源を補給しながら培養することが重要で
ある。したがって現在、主要なβ−ヒドロキシ酸、例え
ばＨＩＢＡは、前述のごとく変異改良により代謝制御さ
れた微生物を通気攪拌槽でサスペンジョン回分培養して
工業生産されている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、現在、
工業生産で実施されているサスペンジョン回分培養は、
（１）培養終了後、生産物（β−ヒドロキシ酸）と分離
した微生物を再利用することが困難であり、β−ヒドロ
キシ酸の生産能（代謝活性）を有し、かなりの高菌体濃
度にまで高められた活性微生物を結果的には廃棄しなけ
ればならない、（２）培養後期においてβ−ヒドロキシ
酸の生産能（代謝活性）の低下が見られる、（３）大容
量培養槽で培養するため、培養終了時の菌体の分離、洗
浄、生産物の抽出などに大きな負荷を要する、などの問
題点を有し、工業的な生産技術としては改善が望まれて
いる。特に、β−ヒドロキシ酸の工業生産においては、
活性を有する微生物を最大限に有効利用するために、前
記（１）、（２）、（３）の問題を、とりわけ（１）の
問題を克服できるような新たな培養方法の開発が望まれ
ていた。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上述の課題
を解決するために鋭意検討した結果、β−ヒドロキシ酸
の生産能を有する微生物を培養してβ−ヒドロキシ酸を
生産するに際し、エネルギー源の比供給速度を制御する
ことによって、該微生物の増殖を制御でき、かつ高いβ
−ヒドロキシ酸の生産能を長期間維持できることを見出
し、本発明を完成するに到った。

【０００７】即ち、本発明の要旨は、（１）β−ヒドロ
キシ酸の生産能を有する微生物を培養してβ−ヒドロキ
シ酸を製造するに際し、微生物のエネルギー源の比供給
速度を制御することにより該微生物の比増殖速度を制御
しながら培養することを特徴とするβ−ヒドロキシ酸の
製造方法、並びに（２）β−ヒドロキシ酸の生産能を有
する微生物が、（１）に記載の方法に従ってβ−ヒドロ
キシ酸の製造に既に使用されている微生物であって、β
−ヒドロキシ酸の製造のための培養の途中または終了後
に培養槽から培養液を抜き出し、分離装置に通して培養
上清を分離した後、再び培養槽内にリサイクルされたも
のであることを特徴とする（１）に記載の方法、に関す
る。

【０００８】本発明におけるβ−ヒドロキシ酸の生産能
を有する微生物（以下、β−ヒドロキシ酸生産微生物と
略す場合がある）としては、酵母が通常使用される。酵
母としてはβ−ヒドロキシ酸の生産能を有するものであ
れば特に限定されるものではなく、いかなる酵母も使用
可能であるが、代表的なものとして、キャンディダ（Ｃ
ａｎｄｉｄａ）属の酵母が挙げられ、具体的には、キャ
ンディダ・ルゴーサ（Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ）
ＩＦＯ０７５０、同ＫＴ８２０１、同ＫＴ８２０２、同
ＩＦＯ０５９１、およびそれらから誘導された変異株な
どを挙げることができる。なお、このうちキャンディダ
・ルゴーサＫＴ８２０１、同ＫＴ８２０２については、
工業技術院微生物工業技術研究所に表１に示した番号で
寄託されている。

【０００９】

【表１】

【００１０】本発明においてβ−ヒドロキシ酸生産微生
物の変異株を得るためには、自然変異、あるいは人工変
異が利用され、通常、効率的に行うためには紫外線照射
および、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ’−ニトロソグア
ニジンなどの変異誘起剤による処理が用いられるが、特
にこの方法に限定されるものではない。

【００１１】次に、これらの微生物は、基質として酪
酸、クロトン酸、ブチルアルコール、ブチルアルデヒ
ド、ブチルアミンなどを用いた場合は、β−ヒドロキシ
酸としてＤ−（−）−β−ヒドロキシ酪酸（以下、ＨＯ
ＢＡと略す）を生産し、基質としてイソ酪酸、メタクリ
ル酸、イソブチルアルコール、イソブチルアルデヒド、
イソブチルアミン、イソブチルアミドなどを用いた場合
は、Ｄ−（−）−β−ヒドロキシイソ酪酸を生産する。
またこれらのβ−ヒドロキシ酸生産のための基質は単独
あるいは２種以上の混合基質のいずれの場合も使用しう
る。

【００１２】これらの微生物を培養してβ−ヒドロキシ
酸を生産させる場合に使用される培地としては、微生物
の培養に通常使用される物が広く使用され得る。例えば
炭素源としてグルコース、シュクロース、マンニトール
等の炭水化物；エタノールを始めとするアルコール類；
パラフィン、オレフィン類の炭化水素；酢酸等の有機酸
類；大豆油等の油脂類の単独又はこれらの混合物、窒素
源として硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無
機窒素源、有機窒素源としてイーストエキス、麦芽エキ
ス、肉エキス、ポリペプトン等、無機塩類として塩化ナ
トリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム等、またビ
タミン等、通常の培養に用いられる栄養源を適宜混合し
た培地を用いることができる。

【００１３】培養の際の栄養培地のｐＨ、温度は、該微
生物が増殖しうる範囲であれば特に限定されないが、好
ましくはｐＨは４．０〜９．５の範囲で、温度は１５〜
４０℃の範囲で培養されるのが望ましい。培養液中の溶
存酸素濃度に関しては、溶存酸素濃度が著しく低い条件
下ではβ−ヒドロキシ酸生産微生物の生産能が著しく低
下するため、少なくとも０．５〜２ｐｐｍ必要であり、
これらの濃度より高い条件であればよい。即ち、０．５
ｐｐｍ未満の条件下では、β−ヒドロキシ酸生産微生物
の生産能が低下するので好ましくない。

【００１４】また、生産物であるＤ−（−）−β−ヒド
ロキシ酪酸あるいはＤ−（−）−β−ヒドロキシイソ酪
酸などのβ−ヒドロキシ酸の培養液中の濃度は、あまり
高濃度になると、生産物阻害が発生し、β−ヒドロキシ
酸生産微生物のβ−ヒドロキシ酸生産能の低下が起こ
る。従って、β−ヒドロキシ酸の濃度は生産物阻害が発
生しない条件下で行うことが必要であり、好ましくは生
産物濃度が８０ｇ／リットルを越えない条件下で培養を
行うのが望ましい。

【００１５】β−ヒドロキシ酸の生産能を維持している
活性微生物の再利用方法としては、培養終了時にバッチ
方式で無菌的分離装置を用いて、微生物とβ−ヒドロキ
シ酸を含む培養液を分離し、微生物を培養槽内にリサイ
クルして再利用する反復回分培養方式、あるいは培養と
同時に、培養槽から培養液を連続的あるいは間欠的に一
部を抜き出したのち分離装置に通し微生物と培養上清を
分離し、微生物を培養槽内に再び戻す操作を行う方法の
いずれも採用しうる。このような培養と同時に微生物の
分離を行う後者の方法では、生産物阻害を発生させない
範囲で、比較的高い生産物濃度を維持しながら、連続的
にβ−ヒドロキシ酸を生産することが可能となる。従っ
て、半回分培養方式に比べ工業的には生産性も高く好都
合である。

【００１６】このような、微生物と培養液を分離し、微
生物をリサイクルするための分離装置としては、例えば
（１）セラミック材料など培養液は通すが微生物は通さ
ない程度の孔径を有する精密濾過膜等を用いて培養液と
微生物とを分離する濾過型分離装置（２）遠心力によって培養液と微生物とを分離する遠心
型分離装置（３）重力沈降によって培養液と微生物とを分離する沈
降型分離装置などがあげられるが、無菌的に微生物と培養上清との分
離が可能な装置であれば上記装置に限定されるものでは
ない。

【００１７】また、本発明の方法は長期間、β−ヒドロ
キシ酸の生産活性が維持された活性微生物を再利用し
て、β−ヒドロキシ酸の生産性を向上させるものであ
る。このような活性微生物の生産活性を長期間維持する
ための手段として、本発明においては該微生物の比増殖
速度を制御しながら培養することを特徴とするものであ
る。即ち、該微生物の比増殖速度の制御はエネルギー源
の比供給速度を制御することによって実現される。具体
的には、（１）予め、エネルギー源の比供給速度と比増
殖速度の関係式を求め、求められた関係式を利用して制
御する方法、（２）菌濃度測定装置、例えばレーザー濁
度計などを培養槽に装着し、微生物濃度をオンラインで
検出しながらエネルギー源を供給する方法、（３）例え
ば酪酸、イソ酪酸などの基質、あるいはＨＩＢＡ、ＨＯ
ＢＡなどの生産物をチューブ法、あるいは培養槽に装着
した自動サンプリング装置を介して液体クロマトグラフ
ィーなどに取り込み、オンラインで検出し、一方では培
養排ガス中のＣＯ₂濃度をオンラインＣＯ₂分析装置で
検出し、エネルギー源の供給速度との間の炭素収支によ
り培養槽内の菌濃度を推定して制御する方法、などが適
用しうる。これらは対象となる微生物、生産物、基質、
エネルギー源の種類に応じて適宜選択され、単独あるい
は組み合わせて用いることができる。

【００１８】本発明者らの検討結果によれば、比生産速
度と比増殖速度の関係も、β−ヒドロキシ酸の工業的な
生産性を向上させる上で、極めて重要である。後述の参
考例に示したように、例えばＨＩＢＡの場合はその比生
産速度は増殖非連動型であり、比生産速度は比増殖速度
に依存しないので、比増殖速度は微生物の生産活性を長
期間維持しうる範囲で制御されればよいが、工業的には
余剰菌体量、使用するエネルギー源を極力抑制する上
で、活性を維持しうる範囲内でより低い比増殖速度に制
御するのが好ましい。

【００１９】しかしながら、例えばＨＯＢＡの場合のよ
うに比生産速度が増殖連動型、すなわち比生産速度が比
増殖速度に比例する場合、比増殖速度はより高く保つ方
が好ましいが、比増殖速度を上昇させた場合、培養槽内
での微生物の酸素要求量が急激に上昇し、結果として前
述したβ−ヒドロキシ酸の生産には不適な程度にまで、
溶存酸素濃度が低下する。したがってＨＯＢＡのような
増殖連動型のβ−ヒドロキシ酸の生産においても、使用
される培養槽の酸素供給能に応じて、溶存酸素濃度を一
定のレベルに維持できる範囲で、エネルギー源の比供給
速度を制御することにより、できるだけ大きな比増殖速
度に制御することが肝要となる。本発明において、この
ようなエネルギー源の比供給速度は、グルコース換算で
通常０．０２〜０．２ｇ／ｃｅｌｌ（ｇ）・ｈ、好まし
くは０．０５〜０．１８ｇ／ｃｅｌｌ（ｇ）・ｈの範囲
に設定するのが良い。

【００２０】本発明の方法によって、製造されたβ−ヒ
ドロキシ酸の培養上清からの分離、精製は、常法に従
い、有機溶媒、例えばエーテル、クロロホルム、酢酸エ
チル等による抽出等により容易に行うことができる。

【００２１】

【実施例】以下、本発明を実施例および参考例によりさ
らに詳しく説明するが、本発明はもとよりこれらに限定
されるものではない。実施例１５００ｍｌの坂口フラスコに、１００ｍｌの培地（グル
コース４０ｇ／Ｌ、イーストエキス３ｇ／Ｌ、（ＮＨ₄)
₂ＨＰＯ₄１３ｇ／Ｌ、ＫＨ₂ＰＯ₄７ｇ／Ｌ、ＮａＣ
ｌ０．１ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ８ｇ／Ｌ、
ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．６ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ₄・７
Ｈ₂Ｏ０．９ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ₄・４〜６Ｈ₂Ｏ
０．１ｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ０．０５ｇ／
Ｌ）を入れ、オートクレーブ後、キャンディダ・ルゴー
サＫＴ８２０１を植菌し、３０℃、ｐＨ７．０、振盪速
度１５０ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ／ｍｉｎで２日間培
養して種母を調製した。次いで、１０Ｌのジャーファー
メンターに、５Ｌの培地（グルコース２０ｇ／Ｌ、Ｈ₃
ＰＯ₄１．４０ｇ／Ｌ、ＫＣｌ１．８３ｇ／Ｌ、Ｍｇ
ＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ１．００ｇ／Ｌ、（ＮＨ₄)₂ＨＰＯ
₄０．６４ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ０．１１ｇ／Ｌ、ＺｎＳ
Ｏ₄・７Ｈ₂Ｏ０．１１ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ₄・４〜６
Ｈ₂Ｏ０．０１ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．
０９ｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ０．００５ｇ／
Ｌ、ビタミンＢ₁０．００２ｇ／Ｌ、ビオチン０．００
１ｇ／Ｌ、イソ酪酸２０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０）を入れ、
オートクレーブ後、上記フラスコ培養の終了したキャン
ディダ・ルゴーサＫＴ８２０１を培地ごと植菌し、３０
℃、ｐＨ７．０、通気量６Ｌ／ｍｉｎ、攪拌数４００ｒ
ｐｍで培養を行った。

【００２２】まず回分培養を行い、グルコースがなくな
った時点で、５５％グルコース溶液を菌体単位質量当た
りのグルコース流加速度がグルコース０．０９〜０．１
１ｇ／ｃｅｌｌ（ｇ）・ｈとなるように、また５０％イ
ソ酪酸溶液をイソ酪酸濃度は２〜５ｇ／Ｌになるように
流加し培養を行い、β−Ｄ−ヒドロキシイソ酪酸を生産
した（培養１−１）。このとき、流加培養期間を通じて
溶存酸素濃度は常に０．５ｐｐｍ以下であった。続い
て、上記培養と同一の条件で再度培養を行った（培養１
−２）。ただし通気には空気と純酸素との混合ガスを用
いることによって、流加培養期間を通じて溶存酸素濃度
が２ｐｐｍ以上となるようにした。これら２回の培養に
おける、比生産速度を表２に示す。

【００２３】

【表２】

【００２４】また上記β−Ｄ−ヒドロキシイソ酪酸生産
培養と同様の要領で、微生物としてキャンディダ・ルゴ
ーサＫＴ８２０２を用いて、β−Ｄ−ヒドロキシ酪酸の
生産培養を行った。基質としては、イソ酪酸の代わりに
酪酸を用いた。培養は、上記β−Ｄ−ヒドロキシイソ酪
酸生産培養と同様に、流加培養期間を通じて溶存酸素濃
度が０．５ｐｐｍ以下となる条件下（培養１−３）、及
び溶存酸素濃度が２ｐｐｍ以上となる条件下（培養１−
４）でそれぞれ行った。これらの培養における比生産速
度を表３に示す。

【００２５】

【表３】

【００２６】表２、表３より、微生物を用いてβ−ヒド
ロキシ酸生産を行う培養では、比生産速度の点から、溶
存酸素濃度が０．５ｐｐｍ以下とならない条件が適して
いると言える。

【００２７】参考例１ β−Ｄ−ヒドロキシイソ酪酸生産能を有する微生物の比
エネルギー源供給速度と比増殖速度との関係、および比
増殖速度と比生産速度の関係を調べるために、β−Ｄ−
ヒドロキシイソ酪酸生産のための培養を行った。培養
は、実施例１で述べた培養１−２と同様に行い、エネル
ギー源であるグルコース供給速度の設定を変えて数回を
行った。また通気には空気と純酸素との混合気体を用
い、溶存酸素濃度が２ｐｐｍ以上となる条件下で培養を
行った。

【００２８】比グルコース供給速度Ｆ_Glc.〔グルコース
（ｇ）／ｃｅｌｌ（ｇ）・ｈ〕と比増殖速度μ〔１／
ｈ〕間の関係を図１に示す。即ち、両者の間に、 μ＝−０．０２３３＋０．４７５Ｆ_Glc. なる実験式が得られた。また、比生産速度は比増殖速度
によらず０．１２〔ＨＩＢＡ（ｇ）／ｃｅｌｌ（ｇ）・
ｈ〕で一定であり、従って比生産速度は増殖非連動性で
あると結論された。

【００２９】参考例２ β−Ｄ−ヒドロキシ酪酸生産能を有する微生物の比エネ
ルギー源供給速度と比増殖速度との関係、および比増殖
速度と比生産速度の関係を調べるために、参考例１と同
様に、β−Ｄ−ヒドロキシ酪酸生産のための培養を行っ
た。培養は、実施例１で述べた培養１−４と同様に行
い、エネルギー源であるグルコース供給速度の設定を変
えて数回行った。また通気には空気と純酸素との混合気
体を用い、溶存酸素濃度が２ｐｐｍ以上となる条件下で
培養を行った。

【００３０】この結果、比グルコース供給速度Ｆ
_Glc.〔グルコース（ｇ）／ｃｅｌｌ（ｇ）・ｈ〕と比増
殖速度μ〔１／ｈ〕間に、 μ＝−０．０２５２＋０．４５０Ｆ_Glc. なる実験式が得られた。また、比生産速度ρ〔ＨＯＢＡ
（ｇ）／ｃｅｌｌ（ｇ）・ｈ〕と比増殖速度の間に、 ρ＝０．０６３５＋０．６９５μ なる実験式が得られ、比生産速度の増殖連動性が示され
た。

【００３１】実施例２ＨＩＢＡ生産微生物を用いた反復回分培養を行った。培
養は実施例１で述べた培養１−２と同様に行い、流加培
養を５０時間行った時点で培養液を抜き出し、菌体を濾
過分離装置（東京理化器製セラミック濾過器ＭＣＦ型）
を用いて分離した後無菌的に培養槽に戻し、培地を加え
て再び流加培養を行うという操作を繰り返し、流加培養
を計５回行った。培養は、比増殖速度を０となるように
制御したもの（培養２−１）、および０．０１〔１／
ｈ〕となるように制御したもの（培養２−２）をそれぞ
れ行った。なお比増殖速度の制御は、参考例１で示した
実験式をもとに、比グルコース供給速度を制御して行っ
た。また通気には空気と純酸素との混合気体を用い、溶
存酸素濃度が２ｐｐｍ以上となる条件下で培養を行っ
た。表４に各培養における比増殖速度および比生産速度
を示す。

【００３２】

【表４】

【００３３】実施例３実施例２と同様の濾過分離装置を用いたＨＩＢＡ生産連
続培養を行った。培養は実施例１で述べた培養１−２と
同様に行い、グルコース溶液およびイソ酪酸溶液流加開
始と同時に流加量と同量の培養液を培養槽外に連続的に
抜き出し、菌体を濾過分離装置（実施例２で用いたもの
と同一）によって培養液から分離した後、無菌的に槽内
にリサイクルする操作を行い、β−Ｄ−ヒドロキシイソ
酪酸を連続的に生産した。培養は、比増殖速度を０とな
るように制御したもの（培養３−１）、および０．０１
〔１／ｈ〕となるように制御したもの（培養３−２）を
それぞれ行った。なお比増殖速度の制御は実施例２と同
様に、参考例１で示した実験式をもとに、比グルコース
供給速度の制御によって行った。また通気には空気と純
酸素との混合気体を用い、溶存酸素濃度が２ｐｐｍ以上
となる条件下で培養を行った。表５に各培養における比
増殖速度および比生産速度を示す。

【００３４】

【表５】

【００３５】実施例４遠心分離を用いたＨＯＢＡ生産連続培養を行った。培養
は実施例１で述べた培養１−４と同様に行い、グルコー
ス溶液および酪酸溶液流加開始と同時に流加量と同量の
培養液を培養槽外に連続的に抜き出し、菌体を遠心分離
器（アルファ・ラバル製ＬＡＰＸ２０２）によって培養
液から分離した後、無菌的に槽内にリサイクルする操作
を行い、β−Ｄ−ヒドロキシ酪酸を連続的に生産した。
培養は、比増殖速度を０となるように制御したもの（培
養４−１）、および０．０１〔１／ｈ〕となるように制
御したもの（培養４−２）をそれぞれ行った。なお比増
殖速度の制御は、参考例２で示した実験式をもとに、比
グルコース供給速度の制御によって行った。また通気に
は空気と純酸素との混合気体を用い、溶存酸素濃度が２
ｐｐｍ以上となる条件下で培養を行った。表６に各培養
における比増殖速度および比生産速度を示す。

【００３６】

【表６】

【００３７】実施例２、実施例３、実施例４中で示した
表４、表５、表６より、予め求めた比グルコース供給速
度と比増殖速度間の実験式を利用することにより、比増
殖速度を制御することができ、比増殖速度を０．０１
〔１／ｈ〕に制御することにより実施例２〜４のいずれ
の場合も、β−ヒドロキシ酸生産酵母の活性を長期間維
持することができた。

【００３８】実施例５実施例４で述べた遠心分離を用いた連続培養系に、オン
ライン菌濃度計（ＡＳＲ製レーザー濁度計ＧＴ０１）、
チュービング・センサー（特開昭５７−２９９２５号公
報）、ＣＯ₂計（東京理化製ＣＯ₂−Ｏ₂分析計ＭＧＡ
１００型）などのオンラインセンサーを組み込んだ連続
培養制御システムを用いて、ＨＩＢＡ生産の自動制御連
続培養を行った。連続培養制御システムの概要図を図２
に示す。培養は実施例４と同様に行い、オンライン・セ
ンサーを用いて菌体濃度を測定し、基本的には参考例１
で示した実験式を用いて前述した炭素収支により補正を
加えながら、比グルコース供給速度により比増殖速度を
自動制御した。培養は、比増殖速度を０となるように制
御したもの（培養５−１）、および０．０１〔１／ｈ〕
となるように制御したもの（培養５−２）をそれぞれ行
った。また通気には空気と純酸素との混合気体を用い、
溶存酸素濃度が２ｐｐｍ以上となる条件下で培養を行っ
た。表７に各培養における比増殖速度および比生産速度
を示す。

【００３９】

【表７】

【００４０】表７より、自動制御システムを用いること
により、比増殖速度をより良く制御することができた。

【００４１】

【発明の効果】本発明の方法により、β−ヒドロキシ酸
生産微生物のβ−ヒドロキシ酸生産能を長期間安定に維
持することが可能となり、また光学活性なβ−ヒドロキ
シ酸の生産性の向上および生産のための培養槽の小型化
が可能となる。さらに、分離装置との組み合わせにより
培養槽内の菌濃度を高濃度に維持できる上、菌体と生産
物とを容易に分離できるためβ−ヒドロキシ酸の精製な
どの後処理プロセスの負荷が著しく低減され工業的に極
めて有利である。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は参考例１における比グルコース供給速度
と比増殖速度の関係を示す図である。

【図２】図２は実施例５で用いる連続培養制御システム
の概略図である。

【符号の説明】

１グルコース２イソ酪酸または酪酸３流量計４ポンプ５酸６アルカリ７チュービングセンサ８コンピュータ９遠心分離器 10 培養槽

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 β−ヒドロキシ酸の生産能を有する微生
物を培養してβ−ヒドロキシ酸を製造するに際し、微生
物のエネルギー源の比供給速度を制御することにより該
微生物の比増殖速度を制御しながら培養することを特徴
とするβ−ヒドロキシ酸の製造方法。
【請求項２】培養液の溶存酸素濃度が少なくとも０．
５ｐｐｍ以上である請求項１記載の方法。
【請求項３】エネルギー源の比供給速度がグルコース
換算で０．０２〜０．２ｇ／ｃｅｌｌ（ｇ）・ｈの範囲
にある請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】 β−ヒドロキシ酸の生産能を有する微生
物が、請求項１に記載の方法に従ってβ−ヒドロキシ酸
の製造に既に使用されている微生物であって、β−ヒド
ロキシ酸の製造のための培養の途中または終了後に培養
槽から培養液を抜き出し、分離装置に通して培養上清を
分離した後、再び培養槽内にリサイクルされたものであ
ることを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか１
項に記載の方法。
【請求項５】微生物がイソ酪酸あるいはイソブチルア
ルコールをβ−ヒドロキシイソ酪酸に変換する能力を有
する微生物である請求項１記載の方法。
【請求項６】微生物が酪酸あるいはブチルアルコール
をβ−ヒドロキシ酪酸に変換する能力を有する微生物で
ある請求項１記載の方法。