NO168370B - Kontinuerlig fremgangsmaate til fremstilling av encelleprotein-materiale - Google Patents

Description

Oppfinnelsen angår en fremgangsmåte til fremstilling av encelleprotein-materiale ved kontinuerlig dyrking av minst én gjærart i et vandig mineralsaltholdig gjæringsstoff ved aerobe gjæringsforhold, anvendelse av slike betingelser som effektivt fremmer gjærdyrking, herunder mengdene av karbon-energi-

substrat, assimilerbart nitrogen, tilsetningsvann, oksygen og et vandig mineralsaltmedium som omfatter et primært mineralsaltmedium og et spormineralmedium, og kontinuerlig avtapping av vandig gjæringsstoff inneholdende de resulterende mikro-organismer for utvinning av disse som et encelleprotein-materiale, idet karbonenergisubstratet er valgt fra karbohydrater, alkoholer, ketoner, aldehyder, syrer og estere med 1-20 karbonatomer pr. molekyl og normal-alkener med 10-20 karbon-

atomer pr. molekyl.

Anstrengelser for å avhjelpe den verdensomspennende mangel på protein har omfattet forskjellige biosyntese-prosesser hvor encelleprotein fås ved dyrking av en eller annen mikroorganisme på forskjellige karbonholdige substrater.

Karbonenergi-substratene bør være lett tilgjengelige, relativt billige, ensartede og ufarlige. Petroleumhydrokarboner har vært anvendt som karbonenergikilde, men har budt på prak-tiske vanskeligheter i form av mangel på vannoppløselighet og høyt forbruk av molekylært oksygen som var nødvendig for å bidra til den mikrobielle omsetning. Andre prosesser har konsentrert seg om bruken av oksiderte hydrokarbonderivater som råmaterialer, fordi disse er relativt vannoppløselige og følgelig lette å håndtere i et vandig gjæringsstoff, og pga. de vesentlig reduserte behov for molekylært oksygen i den mikrobielle omsetning/dyrkings-prosess.

En begrensende faktor ved den industrielle anvendelse av encelleprotein-prosesser har imidlertid vært nødvendigheten av å innstille gjæringen på relativt moderate celletettheter med bare moderate utbytter av tørkede celler regnet på det forbrukte substrat, og den resulterende nødvendighet av å håndtere store mengder samlet fermenterings-utløpsvæske for å gjenvinne mode-

rate mengder encelleprotein-materiale. Håndteringen av større mengder vandig fermenterings-utløpsvæske kompliserer konsentrasjonen av encelleprotein-produkt, f.eks. i sentrifuger, samt vaske- og tørketrinn.

Tidligere har enkelte prosesser vært konsentrert om dyrkingen av bakterier pga. det noe høyere innhold av råprotein i cellene sammenlignet med det innhold som kan skaffes fra gjær i sin alminnelighet. Gjærsorter er imidlertid vidt tilgjengelige og relativt enkle å dyrke. Gjærceller er generelt noe større enn bakterieceller, og gjærceller er derfor tilbøyelige til lettere å separeres fra fermenterings-utløps-væsken.

Oppdagelsen av midler og metoder til å øke celleutbyttet

og spesielt til å kunne utføre prosessen ved høye celletettheter ville være meget ønskelig. F.eks. ville den resulterende håndtering av vesentlig mindre volumer av fermenterings-utløpsvæske bety store besparelser i form av en reduksjon i størrelsen på rørledninger og pumper, redusert behov for etterfyllingsvann med følgelig redusert behov for sterilisering og reduserte krav når det gjelder utstyrets størrelse og håndtering i koagulerings-

og separeringsprosessene.

Det er nå funnet en måte som tillater utførelse av en kontinuerlig aerob gjæringsprosess som anvender gjærkulturer for å til-late gjæringsvæsken i gjærings.karet å arbeide ved meget høye celletettheter som vanligvis ikke: er oppnåelige, og.fremstilling av høye utbytter av encelleprotein-produkt fra gjær ved tilsetning av medier som inneholder høye konsentrasjoner av mineralsalter til gjæringsstoffet i. gjæringskaret. Celletettheten er definert som cellekonsentrasjonen. regnet i vekt på tørr basis pr. volumenhet gjæringsstof f. Gjæringsstof f et er angitt som det samlede' volum vandig gjæringsmedium eller -væske, innbefattet celler. Celletettheten blir vanligvis uttrykt i g/l. Utbyttet angis som mengden av produserte celler, regnet på vekt, for et gitt forbruk av karbon-energikilde eller -substrat, regnet på vekt, som mates til gjæringsvæsken, og uttrykkes vanligvis i g/g.

Ifølge oppfinnelsen anvendes der en gjæringstemperatur i området 25-65°C, en pH-verdi på 3-7 og et overtrykk på 0 - 1,03 MPa, samtidig som gjæringsforholdene innbefatter en gjæringstid

på 2-3 0 timer regnet på den midlere retensjon, og mineral-

saltene tilføres det vandige gjæringsstoff i slike mengder pr. tidsenhet at de følgende grunnstoffer foreligger i minst følgende mengder, regnet pr. liter vandig gjæringsstoff:

P: 1,9 g, K: 1 g, Mg: 0,15 g, Ca: 0,06 g, S: 0,1 g, Fe: 6 mg,

Zn: 2 mg, Cu: 0,6 mg og Mn: 0,6 mg, hvorved der opprettholdes

en celletetthet i det vandige gjæringsstoff på 60-160 g, regnet på tørr basis, pr. liter vandig gjæringsstoff.

De høye celletettheter som er oppnåelige ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, bidrar betraktelig til å forenkle og redu-sere omkostningene ved encelleprotein-produksjon. En konsentrasjon av encelleprotein-produkt, f.eks. ved hjelp av en sentrifuge, blir i mange tilfeller sterkt redusert eller til og med eliminert. Celleproduktet kan om ønskelig vaskes i vaskeapparater for fjerning av resterende uforbrukte salter og føres direkte til et tørkeapparat, f.eks. en forstøvningstørker. Vaskevæskene inneholder mesteparten av de resterende mineralsalter som ikke er blitt innlemmet i cellene, og kan resirkuleres til gjæringsapparatet. Behovet for vann til gjæringstrinnet blir således betraktelig redusert, og der foreligger små eller ingen mengder vaskevann som må avhendes, noe som er like viktig. Om ønskelig kan det samlede gjæringsstoff innbefattet resterende salter tørkes.

Hittil har kontinuerlige prosesser til fremstilling av encelleprotein-materialer fra gjærkulturer typisk gitt fermen-terings-utløpsstrømmer med relativt lavt innhold av gjærceller, f.eks. 20-25 g celler pr. liter gjæringsstoff. Ifølge oppfinnelsen er det imidlertid skaffet en fremgangsmåte som ved gjæring skaffer gjærceller på et relativt høyt nivå,

f.eks. mere enn 100 g pr. liter gjæringsstoff. Slike høye celletettheter i gjæringsstoffet sammen med høye utbytter av gjærceller betyr en mer effektiv produksjon, særlig under kontinuerlige produksjonsbetingelser.

Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen blir mineralsaltene tilsatt i nærmere angitte, høye konsentrasjoner, hvilket fører til at gjæringsprosessen utføres ved høyere celletettheter og

med høyere utbytter. Ved oppfinnelsen blir cellene så å si tvangsmatet ved tilsetning av (relativt sett) høykonsentrerte mineralsalter til gjæringsstoffet, hvilket fører til høye vekstrater. Konsentrasjonen av mineralsalter i supernatanten av gjæringsstoffet (dvs. gjæringsstoffet eksklusive celler)

forblir selvsagt på relativt lave nivåer, da saltene forbrukes

av cellene ved vekst og reproduksjon. Saltkonsentrasjonen i cellene pluss supernatanten er således meget høy.

Dyrkingen utføres i et vekstmedium som omfatter et vandig medium av mineralsalter, karbonenergikilde-materialet, molekylært oksygen, assimilerbart nitrogen og selvsagt et start-pode-stoff i form av én eller flere arter gjær-mikroorganismer som skal anvendes.

Ifølge oppfinnelsen blir høye konsentrasjoner av mineralsalter matet til og opprettholdt i gjæringsstoffet. For å sikre riktig mikroorganismevekt, for å øke assimileringen av karbon-

og energikilden i cellene til et maksimum i den mikrobielle omsetningsprosess og for å oppnå maksimalt celleutbytte med maksimal celletetthet i gjæringsmediene, må man tilføre de valgte mineral-næringsstoffer i matningsmediet i riktige mengder og forhold.

Skjønt sammensetningen av gjæringsstoffet kan variere over et visst område, til dels avhengig av den gjærsort og det substrat som anvendes, er mineralinnholdet i gjæringsstoffet (dvs. væske pluss celler) i henhold til. oppfinnelsen relativt høyt, høyere enn det som hittil har vært. an-se^tt som passende eller praktisert ved tidligere kjente metoder- I. tabellen nedenfor er der angitt minimumsområder, vide områder: ogj foretrukkede områder av konsentrasjoner av de forskjellige grunnstoffer i gjæringsvæsken, idet konsentrasjonen er: regnet på grunnstoffet, skjønt det er klart at alle kan foreligge helt eller delvis i form av et oppløselig ion, eller, f.eks. for P, i en eller annen bundet form, f.eks. som fosfat. Mengden av hvert grunnstoff er angitt i gram eller milligram pr. liter gjæringsvæske (vandig fase, inklusive celler):

Vekt av grunnstoff pr. liter gjæringsstoff

Svovel anvendes fortrinnsvis i form av sulfat. Noen av de metaller som er nødvendige, tilsettes med fordel i form av sulfat, slik at minimumskonsentrasjonen av svovel vanligvis over-skrides. Et hvilket som helst av de angitte metaller eller alle kan anvendes eller foreligge som sulfatet. Fortrinnsvis anvendes magnesium, kalsium, jern, zink, kobber og mangan i form av et sulfat eller klorid eller i form av en forbindelse som omdannes in situ tii et sulfat eller klorid. Kalium anvendes fortrinnsvis som et sulfat, klorid eller fosfat eller i form av en forbindelse som omdannes in situ til et sulfat, klorid eller fosfat. Fosfor anvendes fortrinnsvis i form av fosforsyre eller i form av et fosfat, monohydrogenfosfat eller dihydrogen-fosfat, f.eks. som et kalium- eller ammoniumsalt, eller som en forbindelse som omdannes in situ til et slikt salt.

Andre grunnstoffer som kan foreligge i det minste i spormengder, omfatter natrium og kobolt, f.eks. som et halogenid eller sulfat, molybden f.eks. som molybdat, bor f.eks. som borat, selen f.eks. som selenitt eller selenat, eller jod f.eks . som jodid.

I en typisk gjæringsprosess med høy celletetthet vil gjæringsstoffet bestå av ca. halvparten ovenpåflytende medium og halvparten celler regnet på volum. Disse celler, som utgjør halvparten av volumet, vil imidlertid inneholde minst ca. 2/3

av mineralsaltinnholdet i gjæringsstoffet.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen anvender en gjærkultur som er egnet til dyrking på karbonholdige substrater under vandige gjæringsforhold. Egnede gjærsorter omfatter arter av slektene Candida, Hansenula, Torulopsis, Saccharomyces, Pichia, Debaryomyces og Brettanomyces. De foretrukne slekter -omfatter Candida, Hansenula, Torulopsis, Pichia og Saccharomyces. Eksempler på egnede arter omfatter:

Om ønskelig kan blandinger av to eller flere arter anvendes. Den spesielle gjær som anvendes, avhenger delvis av det karbonholdige substrat som skal anvendes, da det er velkjent at forskjellige gjærsorter ofte krever noe forskjellige substrater for den beste vekst. Det er f.eks. fastslått at visse spesielle stammer av de ovenfor angitte arter, f.eks. Pichia pastoris, ikke vokser på metanol.

Pichia pastoris og Hansenula polymorpha foretrekkes. Disse vokser passende på karbonenergi-råmaterialer, spesielt en lavere alkohol, f.eks. metanol. De spesielle nye stammer som er betegnet som eller avledet fra stammer som er deponert under betegnelsen Pichia pastoris NRRL Y-11421, Pichia pastoris NRRL Y-11430, Hansenula polymorpha NRRL Y-11170, og Hansenula polymorpha NRRL Y-11432, foretrekkes, da det er funnet at disse stammer er særlig egnet til bruk ved fremstilling av encelleprotein-materiale ved høyere celletettheter med høye utbytter. Dette trekk anses som høyst uvanlig for disse arter, da bare to av fire av de utprøvede Pichia pastoris-kulturer ville vokse på metanol i det hele tatt.

Karbonenergisubstratet kan være et hvilket som helst av karbohydrater, alkoholer, ketoner, aldehyder, syrer og estere med 1-20 karbonatomer pr. molekyl og normal-alkaner med 1-20 karbonatomer pr. molekyl. Det er fastslått at spesielle gjærsorter varierer i sin forkjærlighet for forskjellige substrater.

De foretrukne substrater for vandige gjæringsforhold er de stort sett vannoppløselige karbon/oksygen/hydrogen-forbindelser. Uttrykket "oksiderte hydrokarboner" omfatter vannopp-løselige karbohydrater samt de alkoholer, ketoner, estere, syrer og aldehyder og blandinger derav som i en rimelig grad er vannoppløselige. De mer egnede oksiderte hydrokarboner er vanligvis de som har vesentlig høyere vannoppløselighet og opptil 10 karbonatomer pr. molekyl, eller de generelt vannopp-løselige karbohydrater.

Eksempler på karbohydrater omfatter glukose, fruktose, galaktose, laktose, sakkarose, stivelse, dekstrin og lignende, alene eller i blandinger. Eksempler på andre typer oksiderte hydrokarboner omfatter metanol, etanol, etenglykol, propenglykol, 1-propanol, 2-propanol, glyserol, 1-butanol, 2-butanol, 3-metyl-1- butanol, 1-pentanol, 2-heksanol, 1,7-heptandiol, 1-oktanol, 2- dekanol, 1-heksadekanol, 1-eikosanol, aceton, 2-butanon, 4-metyl-2-pentanon, 2-dekanon, 3-pentadekanon, 2-eikosanon, formaldehyd, acetaldehyd, propionaldehyd, butyraldehyd, heksanal, 7-metyloktanal, tetradekanal, eikosanal, eddiksyre, propionsyre, smørsyre, glutarsyre, 5-metylheksansyre, azelainsyre, dodekan-syre, eikosansyre, metylformat, metylacetat, etylacetat, propyl-butyrat, isopropylheksanoat, heksyl-5-metyloktanoat, oktyldode-kanoat, o.1., samt blandinger derav.

De nevnte normal-alkaner med 10-20 karbonatomer pr. molekyl er langt mindre foretrukket pga. de vanskeligheter som iblant er forbundet med å fjerne resterende substrat fra encelleproteinceller. Typiske eksempler er dekan, undekan, dodekan, tridekan, tetradekan, pentadekan, heksadekan, oktadekan, eikosan og blandinger derav.

De vannoppløselige alkoholer med 1-4 karbonatomer, vannoppløselige syrer med 2-4 karbonatomer og vannoppløselige karbohydrater foretrekkes. De vannoppløselige enverdige, alifatiske hydrokarbylalkoholer foretrekkes særlig. Det skal bemerkes at 2-metyl-l-propanol virker hindrende på noen gjærsorter, og ved gjæring med slike gjærsorter bør denne alkohol unngås. Alkoholer med 1-4 karbonatomer (med unntagelse av 2-metyl-l-propanol) foretrekkes særlig. Av disse foretrekkes metanol og etanol fremfor de andre, og metanol er den mest foretrukkede pga. den relativt lave pris av et slikt råmate-riale .

Petroleumsgasser kan oksideres og de vannoppløselige materialer anvendes som ved oksidering av metan, etan o.l. for å skaffe blandinger som overveiende inneholder den tilsvarende alkohol. Også forskjellige aldehyder, ketoner, syrer o.l. og tilsvarende egnede hydrokarbonfraksjoner fra forskjellige petroleumsraffineri-kilder som er fremstilt innen det integrerte raffineringsanlegg og kjemiske prosessanlegg, undertiden kalt et petrokompleks, kan anvendes for gjæring.

Saltene i den ovenpåflytende væske foreligger i relativt lav konsentrasjon pga. et høyt opptak av de voksende reprodu-serende celler. Mineralsaltene i cellene er ikke nødvendigvis de samme som de som mates inn eller tilføres, da noen kan foreligge i en bundet organisk form. Mineralanalyse av gjæringsstof f et vil selvsagt vise et samlet mineralinnhold.

I tillegg til mineralsaltene kan vitaminer (organiske vekstfaktorer) anvendes i gjæringsstoffet slik det er kjent i faget, hvor deres nærvær er ønskelig for forplantningen av den spesielle gjærsort som er valgt. For eksempel virker det som om riktig forplantning av mange gjærsorter krever nærvær av én av eller begge vitaminene biotin og tiamin eller andre bestand-deler som inneholder disse vitaminer, f.eks. gjærekstrakt. Med en gjær så som Hansenula polymorpha er det f.eks. ønskelig å anvende biotin i en mengde på 0,04 - 0,8 mg pr. liter vandig mineralmedium og tiaminhydroklorid i en mengde på 4-80 mg pr. liter vandig mineralmedium. Alternativt kan alt eller noe av biotinet og tiaminet skaffes ved bruk av gjærekstrakt o.l.

Det er tidligere funnet at bruken av vann som inneholder restmengder av klor, slik det er vanlig i vann fra renseanlegg i enkelte land, ved fremstillingen av mineralmedium som får tilsatt vekstfaktorer for bruk i vandige, aerobe gjæringsprosesser, er tilbøyelige til å ineffektivisere vekstfaktorene, og særlig gjelder dette vitaminer såsom biotin eller tiamin. I slike gjæringssystemer som anvender et vandig mineralmedium fremstilt av vann inneholdende restklor, er det også funnet at fjerning av klor før tilsetting av vekstfaktorer vil bevirke at tap eller deaktivering av vekstfaktorene unngås. Det er også funnet fremgangsmåter til behandling av vann som inneholder restklor, for på en effektiv måte å eliminere spormengder av restklor og derved unngå vitamintap.

Det er nå funnet at vann som inneholder hittil uakseptable mengder restklor, likevel kan benyttes i gjæringsprosesser som anvender vitaminer, uten at vitaminene inaktiveres av kloret, dersom vitaminene tilføres gjæringssonen som en strøm som er adskilt fra det vandige næringsmedium. Mineral-næringsmediet kan derfor nå bruke vann som inneholder spormengder av klor. Ved dette arrangement unngår man således behovet for å forbehandle vann som inneholder restmengder av klor, ved dyre og/eller tidkrevende metoder.

Den ovenfor beskrevne separate tilsetning av vitaminene til gjæringssonen utføres fortrinnsvis og bekvemt ved blanding av vitaminene med i det minste én porsjon av, men helst hele karbon-energisubstrat-strømmen før disse materialer mates til gjæringssonen. Hvis en vandig blanding av vitaminer og karbonenergi-substrat anvendes, bør det vann som brukes til opprinnelig for-tynning av vitaminene, fortrinnsvis være fritt for spormengder av restklor, f.eks. avionisert vann, for at der skal unngås ethvert for tidlig tap før blanding med den vandige karbon-substratstrøm, f.eks. metanol i vann.

Om ønskelig og foretrukket kan en blanding fremstilles fra vann og et vannoppløselig karbonsubstrat, f.eks. metanol, f.eks. ca. 20 volumprosent metanol i vann, og vitaminene kan så løses opp i metanol/vann-oppløsningen og deretter mates til gjæringsapparatet. Ved denne fremgangsmåte er det ikke nødvendig først å fjerne restklor, og likevel blir vitaminene fullstendig bevart.

I en mer foretrukket utførelsesform blir den separate tilsetning av vitaminer til gjæringssonen utført ved at der benyttes en blanding av vitaminer, minst en porsjon av det karbon-energisubstrat som er angitt ovenfor, og en ytterligere tilsetning av en vandig oppløsning av spormineralsalter. Spormineralsaltene omfatter hva som tidligere har vært betegnet som spor-elementer, f.eks. kobolt, molybden, bor, selen og jod samt mangan, kobber, zink og jern. Ved bruk av denne mer foretrukkede ut-førelsesform unngår man ikke bare problemet med vitamininakti-vering forårsaket av spormengder klor i det vann som anvendes til det vandige mineralsaltmedium, men man unngår også et annet problem som ofte inntreffer i fermenteringsprosesser. Dette problem er dannelsen av utfellinger i den varmesteriliseringssone som benyttes til behandling av det vandige mineralsaltmedium, noe som krever hyppig rengjøring. Nærværet av spormineralsaltene i vanlig blanding med de primære mineral-næringsstoffsalter fremmer tilsynelatende dannelsen av besværlige utfellinger i varmesteriliseringssonen. Ved ikke å innlemme spormineralsaltene i strømmen av vandig mineralsaltmedium, men isteden mate inn spormineralsaltene i blanding med vitaminene og minst én porsjon av karbonenergisubstratet, løser man to meget brysomme problemer. Som angitt ovenfor, bør vannet som anvendes til fremstilling av blandingen av spormineralsaltet, minst en porsjon av karbonenergisubstratet og vitaminene fortrinnsvis være frie for spormengder av restklor.

Den strøm som består av vitaminer, en porsjon av karbonenergisubstratet og spormineraler, kan steriliseres ved filtre-ring om ønskelig. Det er imidlertid foretrukket og bekvemt å kombinere den nevnte strøm med hovedstrømmen av karbonenergisubstratet før innmating i gjæringssonen og å filtrere de samlede kombinerte strømmer like før innmating i fermenterings-sonen.

Selve fermenteringen eller gjæringen er en aerob prosess som krever molekylært oksygen som skaffes av en gass inneholdende molekylært oksygen, f.eks. luft, oksygenanriket luft eller til og med stort sett rent molekylært oksygen for å holde partialtrykket av oksygen på et nivå hvor det bidrar til å skaffe en effektiv vekst av mikroorganismene. Ved bruk av et oksidert hydrokarbonsubstrat blir det totale oksygenbehov for veksten av mikroorganismen redusert i forhold til det som er nødvendig når et alkan anvendes. Tilstrekkelige mengder molekylært oksygen må likevel tilføres for veksten, da assimileringen av substratet og tilsvarende vekst av mikroorganismene delvis er en forbrennings-prosess.

Den hastighet som molekylært oksygen tilføres til gjæringsstoffet med, bør være slik at veksten av gjær ikke blir begrenset pga. mangel på oksygen. Konstruksjon av gjæringsapparater kan 'variere meget med hensyn til evnen til å overføre oksygen til kulturen. Skjønt de totale lufttilførsels-hastigheter kan variere over et vidt område, blir lufttilførselen i gjæringsapparater som er meget effektive med hensyn til oksygenoverføring, generelt utført med en hastighet på Q,5 - 8, fortrinnsvis 1-6 volumenheter (ved det trykk som anvendes, og 25°C) gass som inneholder molekylært oksygen, pr. volumenhet væske i gjæringsapparatet pr. minutt. Denne mengde er basert på luft med normalt oksygeninnhold som tilføres reaktoren, og uttrykt ved rent molekylært oksygen vil de tilsvarende områder være 0,1 - 1,7 eller fortrinnsvis 0,2 - 1,3 volumenheter molekylært oksygen pr. volumenhet væske i gjæringsstoffet pr. minutt (ved det trykk som anvendes, og 25°C).

Det trykk som anvendes for det mikrobielle gjæringstrinn, kan variere over vide områder. Typiske trykk er overtrykk på 0-1 MPa, fortrinnsvis 0 - 0,42 MPa, helst bare såvidt over atmosfæretrykk, idet kostnadene forbundet med utstyr og drift må avveies mot den oppnådde oksygenoppløselighet. Trykk høyere enn atmosfæretrykk er fordelaktige, idet slike trykk er tilbøye-lige til å øke konsentrasjonen av oppløst oksygen i det vandige gjæringsstoff, hvilket igjen kan bidra til å øke cellevekst-hastighetene. Samtidig blir dette oppveid av det forhold at høye trykk bidrar til å øke kostnadene for utstyr og drift.

Gjæringstemperaturen kan variere en del, men generelt vil

den ligge i området 25-65°C, fortrinnsvis 28-50°C. Gjærkulturene Pichia pastoris deponert under betegnelsen NRRL Y-11431 og Pichia.pastoris deponert under betegnelsen NRRL Y-11430

foretrekker generelt en gjæringstemperatur på ca. 30°C.

Hansenula polymorpha NRRL Y-1117 0 og Hansenula polymorpha

deponert under betegnelsen NRRL Y-11432 synes å foretrekke en gjæringstemperatur på 38-40°C.

• Gjærsorter trenger en kilde for assimilerbart nitrogen.

Det assimilerbare nitrogen kan tilføres av en hvilken som helst nitrogenholdig forbindelse eller forbindelser som kan avgi nitrogen i en form som er egnet for metabolsk anvendelse av gjær-mikroorganismen. Skjønt der teknisk sett kan anvendes en rekke organiske nitrogenkildeforbindelser, f.eks. proteinhydrolysater, vil vanligvis de billigere nitrogenholdige forbindelser, f.eks. ammoniakk, ammoniumhydroksid, urea og forskjellige ammonium-

salter såsom ammoniumfosfat, ammoniumsulfat, ammoniumpyrofosfat og ammoniumklorid bli anvendt. Ammoniakkgass er bekvemt for drift i stor skala og kan anvendes ved at det bobles gjennom det vandige mikrobielle gjæringsstoff i passende mengder. Samtidig bidrar også ammoniakk til regulering av pH-verdien.

Området for pH-verdien i det vandige mikrobielle gjæringsstof f bør ligge i området 3-7, fortrinnsvis og vanligvis 3,5 -

5,5. De forskjellige mikroorganismers ønsker med hensyn til pH-verdi avhenger til en viss grad av det medium som anvendes,

samt av den spesielle mikroorganisme og kan således forandre seg noe ved forandring av mediet, noe som lett kan bestemmes av fagfolk.

Den midlere oppholdstid av gjæringsstoffet i gjæringsapparatet kan variere betraktelig avhengig til dels av gjæringstemperaturen og den gjærkultur som anvendes. Generelt vil oppholdstiden være 2-30 timer, fortrinnsvis 4-14 timer, regnet på gjennomsnittlig tilbakeholdelse.

Høye konsentrasjoner av noen av de beskrevne karbonenerqi-substrater, særlig metanol eller formaldehyd e.l., kan virke hindrende på tilfredsstillende mikrobiell vekst eller til og med giftig på mikroorganismene i gjæringsprosessen. Relativt høye konsentrasjoner av substrater bør derfor unngås, slik at det generelt er ønskelig å holde konsentrasjonen av substrat i gjæringsstoffet på et maksimalt tolererbart nivå. For noen av de lavere alkoholer er dette nivå i gjæringsstoffet generelt 0,01 - 5 volumprosent, fortrinnsvis 0,01 - 0,5 volumprosent, men nivået for aldehyder bør ligge på 1/10 av de nevnte verdier pga. alde-hyders toksisitet, slik at mikroorganismene ikke sultes eller deres vekstrate ikke hindres.

Når karbonenergikilde-materialet inneholder et aldehyd i mengder som potensielt er skadelige for mikroorganismen, kan de skadelige aldehydvirkninger avhjelpes ved at substratet først behandles med en passende mengde nitrogenholdig forbindelse, fortrinnsvis ammoniakk, ammoniumhydroksid eller en annen aktiv ammoniumforbindelse i et forhold på 0,01 - 10 molekvivalenter av en slik nitrogenholdig forbindelse pr. mol aldehyd. Et slikt behandlet substrat utgjør deretter ikke bare karbonenergikilden, men inneholder også minst en del av det nødvendige assimilerbare nitrogen.

Gjæringen utføres bekvemt på en slik måte at det karbonholdige substrat kan reguleres som den begrensende faktor, slik at der skaffes god omsetning av det karbonholdige substrat til gjærceller og unngås potensiell forurensning av gjærcellene med en vesentlig mengde uomsatt substrat. Det sistnevnte er ikke noe problem med vannoppløselige substrater, da eventuelle gjenværende spormengder lett vaskes bort. Det kan imidlertid være et problem i forbindelse med substrater som ikke er oppløselige i vann, f.eks. de høyere n-alkaner, som krever ytterligere be-handlingstrinn for produktet, f.eks. fjerning av resterende hydrokarbon ved egnede oppløsnings-vasketrinn.

Kontinuerlig drift er langt å foretrekke pga. at den er

lett å regulere og gir ensartede mengder av ensartede produkter og den mest økonomiske bruk av alt utstyr. I en kontinuerlig prosess blir karbonenergikilde-materialet som substrat, vandig mineralmedium, assimilerbar nitrogenkilde og gasser inneholdende

molekylært oksygen kontinuerlig tilsatt gjæringsstoffet i gjæringsapparatet samtidig med kontinuerlig uttagning av gjæringsstof f. Skjønt volumforholdet mellom tilsatt karbonenergi-substrat og tilsatt vandig mineralmedium kan variere innen vide grenser avhengig til dels av det karbonholdige substrats beskaffenhet, vil det generelt ligge i området mellom 1:9 og 6:4 og fortrinnsvis i området mellom 2:8 og 5:5.

Hvis ønskelig kan en del av eller alt karbonenergikilde-materialet og/eller en del av den assimilerbare nitrogenkilde, f.eks. ammoniakk, tilsettes det vandige mineralmedium før dette føres til gjæringsapparatet. Et innmatningsforhold på ca. 40 volumprosent alkohol til 60 volumprosent mineralsaltmedium er funnet å være egnet for oppnåelse av gjæring med høy celletetthet.

Hver av de strømmer som føres inn i reaktoren, reguleres fortrinnsvis på en på forhånd fastlagt hastighet eller som res-pons på et behov som kan fastlegges ved måling, f.eks. konsentrasjonen av karbonenergisubstratet, pH-verdien, oppløst oksygen, oksygen eller karbondioksid i avgassene fra gjæringsapparatet, celletettheten målt ved lysgjennomgang e.l. Matnings-hastighetene for de forskjellige materialer kan varieres for oppnåelse av så hurtig cellevekst som mulig i overensstemmelse med effektiv utnyttelse av karbonenergikiIden for å skaffe et høyt utbytte av gjærceller i forhold til det tilførte substrat. Ifølge oppfinnelsen kan der således skaffes gjærceller med et utbytte på ca. 30-110 g pr. 100 g tilført substrat, avhengig til dels av det spesielle substrat som anvendes.

Alt utstyr, dvs. reaktor- eller gjæringsapparatet/ -karet eller beholderen, rør, tilhørende sirkulasjons- eller kjøle-utstyr o.l. blir fortrinnsvis sterilisert, vanligvis ved anvendelse av damp på f.eks. 121°C i minst 15 minutter. Den steriliserte reaktor blir podet med en kultur av den spesielle mikroorganisme i nærvær av alle de nødvendige næringsstoffer, inklusive molekylært oksygen og det karbonholdige substrat.

Den type gjæringsapparat som anvendes, er ikke kritisk ved utøvelsen av gjæringsprosessen ifølge oppfinnelsen, skjønt det for tiden foretrekkes å benytte et skumfylt gjæringsapparat.

Et gjæringsapparat som er konstruert for å fremme og opprettholde det produserte skum, er gunstig for prosessen med hensyn til oppnåelse av den økte oksygenoverføring som er nødvendig for opprettholdelse av de ønskede høye celletettheter og høye vekst-hastigheter .

Når gjæringen skal starte, blir det vandige mineralmedium, passende konsentrasjoner av karbonkilde, assimilerbart nitrogen, eventuelle sporbestanddeler og start-podestoffet av gjær plassert i et sterilisert gjæringsapparat, og passende mengder av oksygen og de forskjellige matningsmaterialer blir gradvis tilført. Om ønskelig kan det opprinnelige gjæringssubstrat f.eks. være glukose med en gradvis overgang til f.eks. metanol etterhvert som celletettheten bygges opp. Det er mulig å begynne med lavere nivåer av mineralsalter i det vandige gjæringsstoff og øke til et høyere nivå av mineralsalter ved å tilføre et vandig mineralmedium som har en høy konsentrasjon av mineralsalter, til gjæringsstoffet, skjønt man normalt ganske enkelt til-setter et medium med høyt saltinnhold til gjæringsapparatet fra begynnelsen for å begynne driften straks. Fagfolk vil forstå at der vanligvis vil gå noen tid ved starten før podestoffet bygger opp tilstrekkelig med celler, før full innmatning av salter og substrat kan anvendes.

Gjærcellene som produseres i henhold til prosessen med

høy celletetthet, gjenvinnes fra fermenterings-utløps- • strømmen på vanlig måte, f.eks. ved sentrifugering eller filtre-ring. Om ønskelig kan utenomcellulære produkter gjenvinnes fra den stort sett cellefrie, gjenværende, ovenpåflytende væske på vanlig måte. Den stort sett cellefrie utløpsstrøm kan behandles . f.eks. med aceton eller en lavere alkohol såsom metanol eller etanol for utfelling av eventuelt polymermateriale som er dannet utenom cellene. Den cellefrie utløpsstrøm kan også behandles ved ekstraksjon med oppløsningsmiddel og/eller base for eventuell gjenvinning av andre utenomcellulære produkter, f.eks. fargestoffer, vitaminer eller organiske syrer som produseres i løpet av dyrkingsprosessen. Den cellefrie utløpsstrøm med eller uten slik mellomliggende behandling kan føres tilbake til gjæringsapparatet som en del av den vandige etterfyllingsvæske eller som en vesentlig eller nesten fullstendig del av den vandige

etterfyllingsvæske for at der i størst mulig utstrekning skal unngås avfallsproblemer.

De mikrobielle celler drepes vanligvis med varme eller kjemiske midler, og dette kan gjøres før eller etter separering av cellene fra utløpsstrømmen fra gjæringsapparatet. Gjærcellene er en verdifull proteinkilde for mennesker såvel som for dyr.

For menneskelig forbruk kan cellene behandles etter behov for reduksjon av nukleinsyren, men for bruk som dyrefor synes ikke en slik behandling for tiden å være nødvendig.

I henhold til oppfinnelsen kan der ved drift med høy celletetthet, f.eks. en celletetthet i området 60-160, fortrinnsvis 70-150 g gjærceller regnet på tørr basis, pr. liter fermenterings-blanding, fås høyt utbytte. Om ønskelig kan cellene gjenvinnes fra fermenteringsblandingen ved sentrifugering eller andre separasjonsmåter. Om ønskelig kan også cellene deretter vaskes, f.eks. ved å blandes med vann, og separeres f.eks. ved resentrifugering eller ved tilsetning av vann før eller under sentrifugering for vesentlig å befri cellene for mineralmedium, og vaskevannet inklusive det separerte mineralmedium kan så føres inn igjen i gjæringsapparatet som etterfylling for vann og mineralmedium, hvilket fører til en vesentlig reduksjon eller unngåelse av avfallsdeponeringsproblemer. De utvunnede celler kan deretter ganske enkelt tørkes for fremstilling av et tørket produkt til videre bruk. Om ønskelig kan utløpsstrømmen fra gjæringsapparatet i sin helhet tørkes for fremstilling av et helt tørket produkt av tørkede celler og resterende vannoppløse-lige stoffer, innbefattet salter, og dette heltørkede produkt kan anvendes som et meget viktig dyrefor med høyt innhold av proteinrike salter.

Oppfinnelsen skal nå beskrives nærmere ved hjelp av eksempler. De mengder av materialer eller de forskjellige typer råmaterialer som er anvendt, og spesielle gjærarter eller -stammer er bare ment som en illustrasjon og skal ikke oppfattes som noen begrensning.

Eksempel I

I et forsøk som ble utført under kontinuerlige aerobe gjæringsbetingelser, ble metanol og et vandig mineralsaltmedium 1 et volumforhold på 30,15 : 69,85 hver for seg tilført et gjæringsapparat som var podet med den Pichia pastoris-gjær som er ;deponert under betegnelsen NRRL Y-11431. Der ble ikke anvendt noe forbehandlingsmedium eller -substrat. Gjæringsapparatet var et 4 liter's gjæringsapparat med et væskevolum på 2 liter med automatisk regulering av pH-verdi, temperatur og nivå. Omrøringen var ved to impellere med en rotasjonshastighet på 1000-1200 omdreininger pr. minutt. Luft ble tilført med en hastighet på 1 - 1,5 volumenheter (ved atmosfæretrykk og ca. 25°C) pr. volumenhet gjæringsstoff pr. minutt i form av luft som var supplert med og inneholdt tilstrekkelig oksygen til i fermenteringsblandingen å opprettholde en mengde av oppløst oksygen svarende til 20 % av det som ville ha foreligget oppløst i fermenteringsblandingen, hvis den var blitt mettet med luft ved atmosfæretrykk og en temperatur på ca. 30°C. Vandig ammoniumhydroksid (2 deler konsentrert ammoniumhydroksid og en del avionisert vann regnet på volum) ble tilsatt med en slik hastighet at pH-verdien av fermenteringsblandingen ble holdt på ca. 3,5.

Det vandige mineralsaltmedium som ble anvendt, ble fremstilt ved blanding pr. liter oppløsning av 12,5 ml 85%'s E^ PO^, 2,5 g 85%'s KOH, 8,5 g KCl, 7,0 g M<g>S<0>4•7H20, 1,5 g CaCl2*2H20, 25 ml spormineraloppløsning A,.25 ml spormineraloppløsning B,

10 ml biotin/tiaminhydroklorid-oppløsning, ca. 0,08 ml antiskummemiddel ("Mazu DF-37C) og tilstrekkelig avionisert vann

til å bringe oppløsningen på 1 liter.

Spormineraloppløsning A ble fremstilt ved blanding pr. liter oppløsning av 4,8 g FeCl3-6H20, 2,0 g ZnS04*7H20, 0,02 g H3B03, 0,20 g Na2Mo04"2H20, 0,30 g MnS04*H20, 0,08 g Kl, 0,06 g CuS04*5H20, 3 ml konsentrert H2S04 og tilstrekkelig avionisert vann til å bringe oppløsningen på 1 liter.

Spormineraloppløsning B ble fremstilt ved blanding pr. liter oppløsning av 2,0 g FeCl3«6H20, 2,0 g ZnS04«7H20, 0,3 g MnS04'H20, 0,6 g CuS04'5H20, 2 ml konsentrert H2S04 og tilstrekkelig avionisert vann til å bringe oppløsningen på én liter.

Biotin/tiaminhydroklorid-oppløsningen ble fremstilt ved blanding av 2 mg biotin, 200 mg tiamin-hydroklorid og 50 ml avionisert vann.

Fermenteringen ble utført ved ca. 30°C og atmosfæretrykk med en oppholdstid på 7,0 timer.

Gjærcellene ble separert fra fermenterings-utløpsstrømmen ved sentrifugering, vasket ved suspendering i vann og resentrifugering, tørket over natten ved 100°C og veid. Gjærcellene ble produsert i et utbytte på 42,3 g, regnet på tørr basis, pr. 100 g

tilført metanol, og celletettheten var så høy som 100,7 g celler pr. liter utløpsstrøm.

Eksempel II

Et annet fermenteringsforsøk ble utført ved anvendelse av stort sett den samme fremgangsmåte som i eksempel I med det unn-tak at sammensetningen av det vandige mineralsaltmedium var litt annerledes, volumforholdet mellom metanol og det vandige mineralsaltmedium var 40,8:59,2, det vandige ammoniumhydroksid for regulering av pH-verdien ble fremstilt fra tre deler konsentrert ammoniumhydroksid:og én del avionisert vann, regnet på volum, og oppholdstiden for gjæringen var 8,35 timer.

Det vandige mineralsaltmedium til bruk i dette forsøk ble fremstilt ved blanding pr. liter oppløsning av 20,0 ml 85%'s <H>3P04, 4,0 g 85%!s KOH, 12,0 g KCl, 10,4 g MgS04-7H20, 2,4 g CaCl2*2H20, 40 ml spormineraloppløsning A som beskrevet i eksempel I, 40 ml spormineraloppløsning B som beskrevet i eksempel I, 16 ml biotin/tiaminhydroklorid-oppløsning som beskrevet i eksempel I, ca. Q,Q8 ml antiskummemiddel og tilstrekkelig avionisert vann til å bringe oppløsningen på én liter.

Gjærceller ble separert fra fermenterings-utløpsstrømmen, vasket og tørket som i eksempel I. Gjærcellene ble produsert med et utbytte på 41,4 g, regnet på tørr basis, pr. 10 0 g tilført metanol, og celletettheten var på det meget ønskelige høye nivå av 133,3 g celler pr. liter utløpsstrøm.

Eksempel III

En kontinuerlig aerob gjæringsprosess ble utført i det gjæringsapparat som er beskrevet i eksempel I, som denne gang ble innpodet med den gjærart Hansenula polymorpha som er deponert under betegnelsen NRRL Y-11432. En blanding av metanol og vandig mineralsaltmedium inneholdende 300 ml metanol pr. liter samlet oppløsning ble matet til gjæringsapparatet. Den omrørte gjæringsblanding ble luftet ved at der til gjæringsapparatet pr. volum gjæringsstoff pr. minutt ble tilført to volumenheter luft (ved atmosfæretrykk og ca. 25°C) supplert med og inneholdende tilstrekkelig oksygen til i gjæringsblandingen å opprettholde en mengde oppløst oksygen svarende til ca. 20 % av det som ville ha vært oppløst i gjæringsvæsken mettet med luft ved atmosfæretrykk og en temperatur på ca. 38°C.

Vandig ammoniumhydroksid (2 deler konsentrert ammoniumhydroksid og én del avionisert vann, regnet på volum) ble tilsatt med en hastighet som holdt pH-verdien av fermenteringsblandingen på 3,7 - 4,1.

Blandingen av metanol og vandig mineralsaltmedium ble fremstilt ved blanding pr. liter oppløsning av 300 ml metanol, 6 ml 85%'s H3P04, 3 g KCl, 4,5 g MgS04<*>7H20, 0,6 g CaCl2<*>2H20, 0,3 g NaCl, 10 ml spormineraloppløsning A som beskrevet i eksempel I, 10 ml spormineraloppløsning B som beskrevet i eksempel I, 4 ml biotin/tiaminhydroklorid-oppløsning som beskrevet i eksempel I, 4 dråper antiskummemiddel og tilstrekkelig avionisert vann til å bringe oppløsningen på én liter.

Gjæringen ble utført ved ca. 38°C og atmosfæretrykk med en oppholdstid på 5,6 6 timer.

Gjærceller ble separert fra fermenterings-utløpsstrømmen, vasket og tørket som i eksempel I. Gjærcellene ble produsert med et utbytte på 31,0 g, regnet på tørr basis, pr. 100 g tilført metanol, og celletettheten var 73,3 g celler pr. liter utløps-strøm.

Eksempel IV

I en kontinuerlig aerob gjæringsprosess ble metanol og et vandig mineralmedium i et volumforhold på 36,9:63,1, hver for seg matet inn i et gjæringsapparat som var innpodet med den gjær-

art Pichia-pastoris som er deponert under betegnelsen NRRL Y-11430. Gjæringsapparatet var et 1500 liters skumfylt gjæringsapparat med et væskevolum på ca. 600 liter, automatisk regulering av pH-verdi, temperatur og nivå og utstyrt med et lufterør. Omrøringen ble besørget av et skovlhjul med en hastighet på 750 omdreininger pr. minutt og plassert under lufte-

røret. Lufttilførselen var ca. 1,6 volumenheter luft (ca. 26 2 kPa og 25°C) pr. volumenhet gjæringsvæske i gjæringsapparatet pr. minutt. Vannfri ammoniakk ble tilsatt med en hastighet som var tilstrekkelig til å holde pH-verdien av gjæringsblandingen på

ca . 3 ,5 .

Det primære vandige mineralsaltmedium ble fremstilt ved blanding pr. liter oppløsning av 12,2 ml 75 % H^PO^, 6 g KCl,

6,0 g MgS04'7H20, 0,8 g CaCl^t^O, 2,0 g 85%'s KOH, 2,0 ml spor-mineraloppløsning C, 0,8 ml biotin/tiaminhydroklorid-oppløsning og tilstrekkelig ledningsvann til å bringe oppløsningen på én liter, idet vannet først var blitt behandlet med tilstrekkelig natriumtiosulfat til å reagere med det frie klor som forelå i vannet.

Spormineraloppløsning C ble fremstilt ved blanding pr. liter oppløsning av 65 g FeCl3<*>6H20, 18 g ZnS04'7H20, 5,0 g MnS04'H20, 6,0 g CuS04-5H20, 2,0 ml konsentrert H2S04 og tilstrekkelig avionisert vann til å bringe oppløsningen på én liter.

Biotin/tiaminhydroklorid-oppløsningen ble fremstilt ved tilsetning av Q,4 g biotin og 40 g tiaminhydroklorid til én liter avionisert vann.

Gjæringen ble utført ved 30°C og 262 kPa med en oppholdstid på 12,7 timer.

Gjærceller ble separert fra fermenterings-utløpsstrømmen

ved sentrifugering, vasket ved suspendering i vann og resentrifugering, tørket over natten ved 100°C og veid. Gjærcellene ble produsert med et utbytte på 37 g regnet på tørr basis pr. 100 g tilført metanol, og celletettheten lå på det meget ønskelige nivå av 110,3 g celler pr. liter utløpsstrøm.

Eksempel V

I en kontinuerlig, aerob gjæringsprosess ble metanol og et vandig mineralsaltmedium i et volumforhold på 40:60 hver for seg tilført et gjæringsapparat som var podet med den gjær-

art Pichia pastoris som er deponert under betegnelsen NRRL Y-11430. Gjæringsapparatet var et 1500 liters skumfylt gjæringsapparat med et væskevolum på ca. 610 liter og automatisk kontroll av pH-verdi, temperatur og nivå. Omrøringen ble

besørget av to vanlige skovlhjul som ble drevet med en hastighet av 1000 omdreininger pr. minutt. Lufttilsetningen var ca. 4 volumenheter luft (ved ca. 262 kPa overtrykk og 25°C) pr. volumenhet gjæringsstoff i gjæringsapparatet pr. minutt. Vannfri ammoniakk ble tilsatt med en slik hastighet at pH-verdien i fermenteringsblandingen ble holdt på ca. 3,5.

Det vandige mineralsaltmedium ble fremstilt ved blanding pr. liter ledningsvann av 15,86 ml 75 % H3P04 , 9,53 g K2S04,

7,8 g MgS04'7H20, 0,6 g CaCl2'2H20 og 2,6 g 85%'s KOH. Spor-mineraloppløsningen pluss biotin ble via metanolstrømmen tilført hvor for seg med en hastighet på 10 ml pr. liter metanol. Spor-mineraloppløsningen pluss biotin ble fremstilt ved blanding av 78 0 ml spormineraloppløsning B, 20 ml vann, 200 ml metanol og 0,032 g biotin.

Spormineraloppløsning D ble fremstilt ved blanding pr. liter oppløsning av 65 g FeS04-7H20, 20 g ZnS04'7H20, 3,0 g MnS04'H20, 6,0 g CuS04*5H20, 5,0 ml konsentrert H2S04 og tilstrekkelig avionisert vann til å bringe oppløsningen på én liter.

Det vandige mineralsaltmedium ble matet inn med en hastighet på 31,5 liter pr. time og et overtrykk på ca. 26 2 kPa samt en oppholdstid på 11,6 timer.

Gjærcellene ble separert fra fermenterings-utløpsstrømmen for analyse ved sentrifugering, vasket ved suspendering i vann og resentrifugering, tørket over natten ved 100°C og veid. Der ble produsert gjærceller med et utbytte på 40,6 g, regnet på tørr basis, pr. 100 g tilført metanol, og celletettheten lå på det meget ønskelige nivå av 128,4 g celler pr. liter utløpsstrøm.

Det totale faststoffinnhold av gjæringsvæsken (utløpsstrøm fra gjæringsapparatetl var 134,7 g celler pluss oppløste fast-stoffer pr. liter. Utløpsstrømmen fra gjæringsapparatet ble matet direkte gjennom et pasteuriseringsapparat for å drepe gjæren og inn i en forstøvningstørker uten ytterligere konsentrasjon eller behandling.

Eksempel VI

I en kontinuerlig aerob gjæringsprosess ble metanol og et vandig mineralsaltmedium i et volumforhold på 29:71 hver for seg tilført et gjæringsapparat som var podet med gjærarten

Hansenula polymorpha NRRL Y-11170. Gjæringsapparatet var et

1500 liters skumfylt gjæringsapparat med et væskevolum på ca.

560 liter og automatisk kontroll av pH-verdi, temperatur og nivå samt utstyrt med et lufterør. Omrøring ble besørget av et skovlhjul med en hastighet på 810 omdreininger pr. minutt og anbragt under lufterøret. Lufttilsetningen var ca. 5 volumenheter luft (ved et overtrykk på 262 kPa og ca. 25°C) pr. volumenhet gjæringsstoff i gjæringsapparatet pr. min. Vannfri ammoniakk ble tilsatt med en slik hastighet at pH-verdien i fermenteringsblandingen ble holdt på ca. 3,5. Det vandige mineralsaltmedium ble fremstilt ved blanding av 10,38 ml 75%'s H3P04, 4,29 g KCl, 6,44 g MgS04-7H20, 0,86 g CaCl2.2H20, 0,43 g NaCl, 3,0 ml spor-, mineraloppløsning C og 0,6 5 ml biotin/tiaminhydroklorid-oppløsning i 10 00 ml ledningsvann, idet vannet først var blitt behandlet med tilstrekkelig natriumtiosulfat for reaksjon med det frie klor i vannet.

Gjæringen ble utført ved 39-40°C og et overtrykk på

262 kPa med en oppholdstid på 7,6 timer.

Gjærcellene ble separert fra fermenterings-utløps-strømmen for analyse ved sentrifugering, vasket ved suspendering i vann og resentrifugering, tørket over natten på 100°C og veid. Gjærcellene ble produsert med et utbytte på 33,3 g, regnet på tørr basis, pr. 100 g tilført metanol, og celletettheten lå på et ønskelig nivå av 76,2 g celler pr. liter utløpsstrøm.

Oppdagelsen av gjærsorter med evnen til hurtig vekst og

høy produktivitet er avgjort fordelaktig.

Der er nå oppdaget tre helt enestående gjærkulturer,

nemlig Pichia pastoris NRRL Y-11431, Pichia pastoris NRRL

Y-11430 og Hansenula polymorpha NRRL Y-11432, med meget

ønskelige og nyttige egenskaper. Disse enestående kulturer vokser særlig bra ved høyere nivåer av mineralsalter og celletettheter.

Disse tre enestående gjærkulturer vokser effektivt

med høy produktivitet på oksyderte hydrokarbon-råmaterialer, særlig lavere alkoholer, fortrinnsvis metanol eller etanol. Dette er spesielt bemerkelsesverdig når det gjelder de nye Pichia-pastoris-kulturer, siden noen kulturer av arten Pichia pastoris

ganske enkelt ikke kan vokse på metanol. Disse enestående arter er betegnet som følger:

Betegnelsene NRRL Y-11431, NRRL Y-11430 og NRRL Y-11432 viser til det faktum at de nye gjærkulturer 21-2, 21-1 og 21-3 er deponert i den offisielle deponeringsbank til United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois 61604, i form av to agar-skråkulturer av hver og av deponeringsbanken har fått de angitte NRRL-stammebetegnelser.

Stammene er klassifisert som følger:

De nye og enestående mikroorganismer kan karakteriseres ytterligere ved de følgende egenskaper:

Som tilfellet er med alle mikro-organismer, vil selvsagt noen av egenskapene til en viss grad variere avhengig av mediet og de spesielle forhold.

Oppskriften for medier som er vist i eksemplene, kan brukes til å dyrke de nye gjærarter, skjønt disse vil vokse på andre substrater enn metanolholdige substrater. Disse nye gjærkulturer kan ikke bare anvendes sammen med mediamatnings-materialer med høyt saltinnhold, som beskrevet ovenfor, men også under vanlige gjæringsbetingelser ved anvendelse av et medium såsom

Medium IM- 1

Spormineraloppløsning

Claims (12)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av encelleprotein-materiale ved kontinuerlig dyrking av minst én gjærart i et vandig mineralsaltholdig gjæringsstoff ved aerobe gjæringsforhold, anvendelse av slike betingelser som effektivt fremmer gjærdyrking, herunder mengdene av karbon-energisubstrat, assimilerbart nitrogen, tilsetningsvann, oksygen og et vandig mineralsaltmedium som omfatter et primært mineralsaltmedium og et spormineralmedium, og kontinuerlig avtapping av vandig gjæringsstoff inneholdende de resulterende mikroorganismer for utvinning av disse som et encelleprotein-materiale, idet karbonenergisubstratet er valgt fra karbohydrater, alkoholer, ketoner, aldehyder, syrer og estere med 1-20 karbonatomer pr. molekyl og normal-alkener med 10-20 karbonatomer pr. molekyl, karakterisert ved at der anvendes en gjæringstemperatur i området 25-65°C, en pH-verdi på 3-7 og et overtrykk på 0 - 1,0 3 MPa, samtidig som gjæringsforholdene innbefatter en gjæringstid på 2-30 timer regnet på den midlere retensjon, og at mineralsaltene tilføres det vandige gjæringsstoff i slike mengder pr. tidsenhet at de følgende grunnstoffer foreligger i minst følgende mengder, regnet pr. liter vandig gjæringsstoff: P: 1,9 g, K: lg, Mg: 0,15 g, Ca: 0,06 g, S: 0,1 g, Fe: 6 mg, Zn: 2 mg, Cu: 0,6 mg og Mn: 0,6 mg, hvorved der opprettholdes en celletetthet i det vandige, gjæringsstoff på 60-160 g, regnet på tørr basis, pr. liter vandig gjæringsstoff.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at der benyttes en gjær av slekten Pichia.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 2, karakterisert ved at der benyttes en gjær av arten P. pastoris.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, karakterisert ved at der som gjær anvendes en stamme betegnet som Pichia pastoris NRRL Y-11430, Pichia pastoris NRRL Y-11431 eller Hansenula polymorpha NRRL Y-11432.

5. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 1-4, karakterisert ved at der pr. liter gjæringsstof f opprettholdes følgende mengder av de følgende stoffer: P: 1,9 - 20 g, K: 1 - 20 g, Mg: 0,15 - 3 g, Ca: 0,06 - 1,6 g, S: 0,1 - 8 g, Fe: 6 - 140 mg, Zn: 2 - 100 mg, Cu: 0,6 - 16 mg og Mn: 0,6 - 2 0 mg.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at der pr. liter gjæringsstoff opprettholdes følgende mengder av de følgende stoffer: P: 2,2 - 10 mg, K: 1,5 - 10 g, Mg: 0,3 - 1,2 g, Ca: 0,08 - 0,8 g, S: 0,2 - 5 g, Fe: 9 - 80 mg, Zn: 3 - 40 mg, Cu: 1 - 10 mg og Mn: 0,9 - 8 mg.

7. Fremgangsmåte som angitt i et av de foregående krav, karakterisert ved at der som vandig gjæringsstoff anvendes et som inneholder ett eller flere av stoffene natrium, kobolt, molybden, bor og selen.

8. Fremgangsmåte som angitt i et av de foregående krav, karakterisert ved at de aerobe gjæringsforhold innbefatter anvendelsen av minst ett vitamin.

9. Fremgangsmåte som angitt i krav 8, karakterisert ved at der som vitamin anvendes biotin og/eller tiamin.

10. Fremgangsmåte som angitt i krav 8 eller 9, karakterisert ved at der i tillegg anvendes et spormineralmedium som inneholder forbindelser som skaffer næringsstoffer omfattende Fe, Zn, Mn og Cu, idet vitaminet blandes med en vandig fortynnet oppløsning av metanol eller etanol, spormineraloppløsningen tilsettes blandingen og den resulterende blanding tilføres gjæringssonen adskilt fra det primære mineralsaltmedium.

11. Fremgangsmåte som angitt i et av de foregående krav, karakterisert ved at der opprettholdes en celletetthet på 70-150 g, regnet på tørr basis, pr. liter gjæringsblanding.

12. Fremgangsmåte som angitt i et av de foregående krav, karakterisert ved at der opprettholdes et celleutbytte på 30-50 g pr. 100 g tilført substrat.