KR20240060738A - 암 줄기세포와 연관된 암의 진단 및 치료 - Google Patents

암 줄기세포와 연관된 암의 진단 및 치료 Download PDF

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KR20240060738A
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슈테판 야콥스
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비온테크 에스이
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Abstract

본 발명은 CLDN6을 표적화하는 것을 포함하는 암 줄기세포와 연관된 암 질환의 진단 또는 치료 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 CLDN6을 발현하는 세포를 검색하는 것을 포함하는, 암 줄기세포의 탐지 방법을 제공한다. 뿐만 아니라, 본 발명은 CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체를 암 환자에게 투여함으로써 암 줄기세포를 억제 및/또는 제거하는 것을 포함하는 암의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.

Description

암 줄기세포와 연관된 암의 진단 및 치료{DIAGNOSIS AND THERAPY OF CANCER INVOLVING CANCER STEM CELLS}
통상적인 암 치료법은 주로 매우 빠르게 성장하는 암 세포(즉, 종양 덩어리르르 형성하는 세포)를 선택적으로 검출 및 제거하여 주로 세포 성장 및 DNA 복제와 연관된 세포 메카니즘을 간섭하여 세포 성장에 미치는 그의 독성 효과를 발휘하도록 하도록 시도되어 오고 있다. 뿐만 아니라, 표준적인 종양 치료법은 주로 과도한 독성 없는 한도에서 방사선 선량 또는 화학요법제를 최고량으로, 즉 "최대관용량(MTD:maximum tolerated dose"으로 투여하도록 설계되어 왔다.
화학치료 프로토콜은 또한 치료의 효능을 증강시키려는 시도에서 화학 치료제들의 조합을 투여하는 것도 포함한다. 다양한 화학요법제들을 이용할 수 있음에도 불구하고, 이 치료법은 많은 결점을 안고 있다. 예를 들어, 화학요법제는 정상세포건 종양세포건 빨리 자라는 세포에 대해서는 비특이적인 부작용으로 인해 심각하고 종종 위험한 부작용을 일으킨다.
기타 유형의 암 치료법으로는 환자로부터 신생 세포를 제거하기 위한 외과수술, 호르몬요법, 면역요법, 후성요법, 항신생혈관요법, 표적요법, 방사선요법을 들 수 있다.
그러나, 암 치료법의 기존 접근법 모두는 효능 결핍(특히 장기간 결과측면에서) 및 독성을 비롯하여, 환자에서 심각한 결점을 갖는다. 따라서, 암 환자를 치료하기 위한 새로운 치료법이 요구되고 있다.
종양 내에는 줄기세포와 유사한 특성을 갖는, 암 세포의 부분모집단(subpopulation)이 존재한다는 증거가 속속 밝혀지고 있다. 이 부분모집단은 암 줄기세포(CSC: cancer stem cells)라 칭해진다. 암 줄기세포는 정상적인 줄기세포들과 유사한 특성을 가지며, 이들 역시 자가-재생능을 갖고, 종양의 모든 이질적인 세포 유형을 형성할 수있다. 종양 세포의 CSC-유사 특성을 분석하기 위한 잠재 분석법은 집락형성능 측정법이다. 이 측정법을 이용함으로써, 단일 종양 세포의 종양 형성능과 자가-재생능을 쉽게 검사할 수 있다.
암 줄기세포는 종양 형성을 개시하고, 종양 성장을 유지하며 가능하게는 체내 원격 장기 부위까지 종양을 확산시킬 수 있는 것으로 여겨진다. 암 줄기세포는 종양의 나머지 세포들(즉 종양 덩어리)에 비해, 보다 종양원성(tumorigenic)이고, 비교적 더 천천히 자라거나 성장이 중단되고, 종양 덩어리에 비해 종종 더 화학내성을 나타내는 것으로 여겨지는, 종양의 독특한 부분모집단을 이루고 있다. 통상적인 암 치료법은 급속히 증식하는 세포들(즉 종양 덩어리를 형성하는 세포들)을 표적으로 하므로 이러한 치료법들은 암 줄기세포를 표적화 및 손상시키기에는 상대적으로 효과가 없는 것으로 믿어진다. 암 줄기세포는 다제내성 및 항세포자멸사 경로와 같이 이들을 비교적 화학요법 내성을 만드는 기타 몇 가지 특징들을 발현할 수 있다. 암 줄기세포를 적절히 표적화및 제거하지 못하면 많은 암 환자들에서 장기간의 이점을 확보해주는 표준적인 종양 치료법이 실패하는 주요 원인이 된다. 따라서, 암 줄기세포는 치료 후 암의 재발과 약물의 비효율성 뿐만 아니라 악성 종양 전이의 주요 원인이 될 수도 있다. 그러므로, 암의 완치를 위한 한 가지 기회는 암 줄기세포를 제거하는 것이다.
클라우딘은 표피 및 내피의 밀착연접부(tight junction)에 위치하는 통합 막 단백질이다. 클라우딘은 세포질 내에 위치한 N- 및 C-말단 및 2개의 세포외 루프를 갖는 4개의 막통과 세그먼트를 갖는 것으로 예상된다. 막통과 단백질들의 클라우딘 (CLDN) 패밀리는 표피 및 내피 밀착연접을 유지하는데 중요한 역할을 하며 세포골격의 유지 및 세포 시그널링에 있어서도 어떤 역할을 한다. CLDN6은 여러가지 인간 암 세포들에서 발현되지만 정상 조직에서의 발현은 태반으로 국한되어 있다.
본 발명에서 출원인은 CLDN6 발현이 다능성 세포의 발생 동안 상향조절된다는 증거를 제기한다. 또한, CLDN6은 암 줄기세포의 공지 마커와 강하게 연관되어 있으며 CLDN6 양성 종양 세포는 개선된 콜로니 형성을 나타낸다. CLDN6 특이적인 항체를 이용한 치료법이 난소암과 같은 종양의 화학요법 내성을 극복할 수 있고 화학요법과 CLDN6 항체 치료법의 조합이 현저한 상승 효과를 갖는다는 것도 증명된다.
본 발명의 발견은 CLDN6이 암 줄기세포에 대한 신규한 마커라는 것과 CLDN6 표적화에 의해 암 줄기세포를 진단 및 치료 목적으로 표적화될 수 있음을 시사한다.
발명의 개요
일 측면에서, 본 발명은 CLDN6을 발현하는 세포를 검출하는 것을 포함하는, 암 줄기세포의 탐지방법에 관한 것이다. 일 구체예에서, 암 치료 전, 치료 중 및/또는 치료 후에 암 환자로부터 얻은 샘플에서 CLDN6을 발현하는 세포를 찾아낸다. 일 구체예에서, 이 방법은 CLDN6을 발현하는 세포를 정량적 및/또는 정성적으로 탐지하는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 이 방법은 CLDN6을 발현하는 세포의 양을 레퍼런스 샘플 또는 소정의 레퍼런스 범위에서 CLDN6을 발현하는 세포의 양과 비교하는 것을 포함한다. 레퍼런스 샘플은 암이 진단되지 않은 환자로부터의 샘플일 수 있다. 소정의 레퍼런스 범위는 암이 진단되지 않은 환자 집단에 기초할 수 있다. 일 구체예에서, 이 방법은 암 환자에서 암 줄기세포의 양을 모니터링하는 것을 포함하되, 암 환자에서 암 줄기세포의 양을 모니터링하는 것은 좋기로는 암 환자로부터 얻은 샘플에서의 암 줄기세포의 양과 그 암 환자로부터 미리 수득한 샘플중의 암 줄기세포의 양을 비교하는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 암 환자로부터 얻은 샘플은 암 치료제의 투여 중 또는 투여 후에 암 환자로부터 채취한 샘플이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) 암 치료제의 투여 중 또는 투여 후에 암 환자로부터 얻은 샘플 내의 암 줄기세포의 양을 탐지하는 단계 및; (ii) 암 환자로부터 얻은 샘플 내의 암 줄기세포의 양을 그 암 환자로부터 이전에 얻은 샘플 내의 암 줄기세포의 양과 비교하는 단계를 포함하되, 상기 암 환자로부터 얻은 샘플 내의 암 줄기세포의 양의 탐지 및/또는 암 환자로부터 이전에 얻은 샘플 내의 암 줄기세포의 양의 탐지는 CLDN6을 발현하는 세포의 양을 탐지하는 것을 포함하는 것인, 암 환자에서 암 치료법의 효능을 모니터링하는 방법에 관한 것이다.
일 구체예에서, 암 환자로부터 이전에 얻은 샘플은 암 치료제의 투여 전, 투여 중 또는 투여 후에 채취된 샘플이다.
본 발명의 모든 측면의 방법의 일 구체예에서, 암 줄기세포의 양이 안정화 또는 감소된 것은 그 암 치료법이 효과적임을 가리킨다. 본 발명의 모든 측면의 방법의 일 구체예에서, 암 줄기세포의 양의 증가는 그 암 치료법이 효과가 없음을 가리킨다. 본 발명의 모든 측면의 방법의 일 구체예에서, 암 치료법은 암 줄기세포에 대한 암 치료법이다. 본 발명의 모든 측면의 방법의 일 구체예에서, 암 환자로부터 얻은 샘플은 생물학적 체액 또는 종양 생검물이다. 본 발명의 모든 측면의 방법의 일 구체예에서, 샘플은 하나 이상의 전처리 단계를 거친 것이다. 본 발명의 모든 측면의 방법의 일 구체예에서, CLDN6 단백질 및/또는 CLDN6 mRNA의 양을 검색하거나 탐지함으로써 CLDN6을 발현하는 세포를 검색하거나 또는 그의 양을 탐지한다. 본 발명의 모든 측면의 방법의 일 구체예에서, CLDN6을 발현하는 세포 또는 그의 양은 면역측정법을 이용하여 탐지되는데, 여기서 면역측정법은 좋기로는 웨스턴 블롯, 면역조직화학법, 방사능면역측정법, ELISA (효소결합면역흡수측정법), "샌드위치" 면역분석법, 면역침전분석법, 침전반응, 겔 확산 침전반응, 면역확산 분석법, 응집 분석법, 보체결합 분석법, 면역방사능측정 분석법, 형광 면역분석법, 면역형광법, 단백질 A 면역분석법, 유세포분석법 및 FACS 분석법으로부터 선택된다. 본 발명의 모든 측면의 방법의 일 구체예에서, CLDN6을 발현하는 세포 또는 그의 양은 CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체를 이용함으로써 검색되거나 탐지된다. 본 발명의 모든 측면의 방법의 일 구체예에서, CLDN6을 발현하는 세포는 CLDN6을 발현하는 암세포 및/또는 종양 부위에 존재하는 세포들이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 암 환자에게 CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체를 투여함으로써 암 줄기세포를 억제 및/또는 제거하는 것을 포함하는 암의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다.
일 구체예에서, 암 줄기세포는 CLDN6을 발현한다. 일 구체예에서, 이 방법은 화학요법제 및/또는 방사선요법제를 투여하는 것을 더 포함한다. 일 구체예에서, 암 줄기세포의 억제 및/또는 제거는 화학요법 및/또는 방사선요법의 항암 효과를 증강시키되, 여기서 화학요법 및/또는 방사선요법의 항암 효과의 증강은 좋기로는 화학요법 및/또는 방사선요법이 수행되는 암 환자의 생명을 언장시키는 것을 포함하는 것이 바람직하다..
또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체 및 (ii) 화학요법제를 암 환자에게 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다.
일 구체예에서, 암은 CLDN6을 발현하는 암 줄기세포와 관련된 것이다. 일 구체예에서, CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체를 투여하면 CLDN6을 발현하는 암 줄기세포의 억제 또는 제거가 결과된다. 일 구체예에서, CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체의 투여는 화학요법제의 항암 효과를 증강시키되, 여기서 화학요법제의 항암 효과의 증강은 좋기로는 화학요법이 수행되는 암 환자의 생명을 연장시키는 것을 포함한다.
본 발명의 모든 측면의 방법의 일 구체예에서, 암 줄기세포의 제거에 의해 암이 치유(cure)된다. 본 발명의 모든 측면의 방법의 일 구체예에서, CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체 및 화학요법제는 상승적으로 효과적인 양으로 투여된다. 본 발명의 모든 측면의 방법의 일 구체예에서, 화학요법제는 최대 관용량 미만의 투여량으로 투여된다. 본 발명의 모든 측면의 방법의 일 구체예에서, 화학요법은 탁산, 백금 화합물, 뉴클레오사이드 유사체, 캄토테신 유사체, 안트라사이클린, 그의 전구약물, 그의 염, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제제를 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 모든 측면의 방법의 일 구체예에서, 화학요법은 파클리탁셀, 시스플라틴, 카르보플라틴, 그의 전구약물, 그의 염, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제제를 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 모든 측면의 방법의 일 구체예에서, 암 줄기세포는 암 환자의 종양 부위에 존재한다. 본 발명의 모든 측면의 방법의 일 구체예에서, 암은 화학요법제에 내성이며, 특히, 만일 단일요법제로서 투여될 경우 특히 그러하다. 본 발명의 모든 측면의 방법의 일 구체예에서, CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체는 암 줄기세포에 대해 억제 및/또는 세포독성 효과를 갖는데, 여기서 CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체는 암 줄기세포에 미치는 그의 억제 및/또는 세포독성 효과를 좋기로는 보체의존세포독성(CDC: complement dependent cytotoxicity) 매개된 용해(lysis), 항체 의존성 세포독성(ADCC) 매개된 용해, 세포자멸사의 유도 및 증식 억제 중 1 이상을 매개함으로써 발휘하는 것이 바람직하다. 본 발명의 모든 측면의 방법의 일 구체예에서, CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체는 치료 모이어티(therapeutic moiety)에 커플링되며 본 명세서에 설명되는 바와 같은 항체 약물 컨쥬게이트일 수 있다. 일 구체예에서, 치료 모이어티는 세포독성 제제, 화학요법제 또는 방사능핵종이다. 일 구체예에서, 치료 모이어티는 서서히 자라는 세포에 작용한다. 본 발명의 모든 측면의 방법의 일 구체예에서, CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체는 CLDN6의 첫 번째 세포외 루프에 결합한다. 본 발명의 모든 측면의 방법의 일 구체예에서, CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체는 SEQ ID NO: 5 또는 그의 단편으로 나타내지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부(VH) 및 SEQ ID NO: 4 또는 그의 단편으로 나타내지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부(VL)을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 링커에 의해 1 이상의 독소 약물 모이어티(toxin drug moiety)에 공유결합된 CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체를 포함하는 항체 약물 컨쥬게이트를 환자에게 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다.
일 구체예에서, 상기 독소 약물 모이어티는 세포막-투과성이다. 일 구체예에서, 독소 약물 모이어티들 중 적어도 하나는 서서히 자라는 세포에 대해 작용한다. 일 구체예에서, 독소 약물 모이어티는 메이탄시노이드 또는 아우리스타틴이다. 일 구체예에서, 메이탄시노이드는 DM1 및 DM4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구체예에서, 아우리스타틴은 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE) 및 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구체예에서, 링커는 절단가능한 링커이며, 좋기로는 카텝신-절단가능한 링커인 것이 바람직하다. 일 구체예에서, 항체는 항체의 시스테인 티올을 통해 링커에 결합된다.
일 구체예에서, 암은 CLDN6을 발현하는 암 줄기세포와 연관된다. 일 구체예에서, 항체 약물 컨쥬게이트의 투여에 의해 CLDN6을 발현하는 암 줄기세포의 억제 또는 제거가 결과된다. 일 구체예에서, 암 줄기세포의 제거는 암의 치유를 결과시킨다. 일 구체예에서, 암 줄기세포는 암 환자의 종양 부위에 존재한다. 일 구체예에서, 항체 약물 컨쥬게이트는 암 줄기세포에 대해 억제 및/또는 세포독성 효과를 갖되, 상기 항체 약물 컨쥬게이트는 암 줄기세포에 대한 그의 억제 및/또는 세포독성 효과를, 세포자멸사의 유도 및/또는 증식 억제에 의해 발휘한다.
일 구체예에서, 이 방법은 화학요법제 및/또는 방사선요법제를 투여하는 것을 더 포함한다. 일 구체예에서, 항체 약물 컨쥬게이트의 투여는 화학요법 및/또는 방사선요법의 항암효과를 증강시키는데, 여기서 화학요법 및/또는 방사선요법의 항암 효과의 증강은 좋기로는 화학요법 및/또는 방사선요법이 수행되는 암 환자의 수명을 연장시키는 것을 포함한다.
일 구체예에서, 항체 약물 컨쥬게이트 및 화학요법제는 상승적으로 효과적인 양으로 투여된다. 일 구체예에서, 화학요법제는 최대관용량 미만으로 투여된다. 일 구체예에서, 화학요법은 탁산, 백금 화합물, 뉴클레오사이드 유사체, 캄토테신 유사체, 안트라사이클린, 그의 전구약물, 그의 염, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제제를 투여하는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 화학요법은 파클리탁셀, 시스플라틴, 카르보플라틴, 그의 전구약물, 그의 염, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제제를 투여하는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 암은 특히 만일 단일요법제로서 투여되는 경우 화학요법에 대해 내성을 갖는다.
일 구체예에서, CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체는, 특히 항체 약물 컨쥬게이트에 존재할 경우, 그 항체 및/또는 항체 약물 컨쥬게이트의 세포내이입(endocytosis)을 가능케하는데 적합한 CLDN6에 대해 친화성 및/또는 특이성을 갖는다. 일 구체예에서, 항체 약물 컨쥬게이트 중의 CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체는 CLDN6의 첫 번째 세포외 루프에 결합한다. 일 구체예에서, 항체 약물 컨쥬게이트 중의 CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체는 SEQ ID NO: 5 또는 그의 단편으로 나타내지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부 (VH) 및 SEQ ID NO: 4 또는 그의 단편에 의해 나타내지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부 (VL)를 포함한다.
본 발명의 모든 측면의 방법의 일 구체예에서, CLDN6은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명의 모든 측면의 방법의 일 구체예에서, 암에는 원발암, 진행된 암, 전이암, 재발암 또는 이들의 조합이 포함된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) 본 발명의 방법에 의해 암 환자에서 암 줄기세포를 탐지하는 단계 및 (ii) 암 줄기세포에 지향된 암 치료제를 암 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다. 일 구체예에서, 암 줄기세포에 지향된 암 치료는 본 발명의 암의 치료 또는 예방 방법을 수행하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 특히 암 치료 중 또는 암 치료 후에, 본 발명의 방법에 따라 암을 치료하는 것을 포함하는, 암 화학내성, 암 재발 또는 암 전이를 방지하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체 및 (ii) 화학요법제를 포함하는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약 제제를 제공한다. CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체 및 화학요법제는 의약 제제 내에 혼합물로서 또는 상호 분리된 상태로 존재할 수 있다. 의약 제제는 CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체를 포함하는 제1 용기와 화학요법제를 포함하는 제2 용기를 포함하는 키트의 형태로 존재할 수 있다. 의약 제제는 또한 암의 치료 또는 예방을 위한 제제를, 특히 본 발명의 방법으로 제제를 사용하기 위한 인쇄된 지침서를 포함할 수도 있다. 의약 제제 및 특히 CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체 및 화학요법제의 여러가지 구체예들은 본 명세서에 설명된 바와 같다.
특정 측면에서, 본 발명은 (i) CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체 및 (ii) 파클리탁셀을 포함하는 의약 제제를 제공한다. CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체 및 파클리탁셀은 의약 제제 내에 혼합물 또는 서로 분리된 상태로 존재할 수 있다. 의약 제제는 난소암과 같은 암의 치료 또는 예방을 위한 것일 수 있다. 의약 제제는 CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체를 함유하는 제1 용기 및 파클리탁셀을 함유하는 제2 용기를 포함하는 키트의 형태로 존재할 수 있다. 의약 제제는 추가로 난소암과 같은 암의 치료 또는 예방의 위한 제제의 사용, 특히 본 발명의 방법에서의 제제의 사용을 위한 인쇄된 지침서를 더 포함할 수 있다. 의약 제제 및 특히 CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체 및 화학요법제의 여러가지 구체예들은 본 명세서에 설명된 바와 같다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 독소 약물 모이어티에 링커에 의해 공유 결합된 CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체를 포함하는 항체 약물 컨쥬게이트를 제공한다.
일 구체예에서, 상기 독소 약물 모이어티(toxin drug moiety)는 세포막-투과성이다. 일 구체예에서, 독소 약물 모이어티들 중 적어도 하나는 서서히 자라는 세포에 대해 작용한다. 일 구체예에서, 독소 약물 모이어티는 메이탄시노이드 또는 아우리스타틴이다. 일 구체예에서, 메이탄시노이드는 DM1 및 DM4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구체예에서, 아우리스타틴은 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE) 및 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구체예에서, 링커는 절단가능한 링커이며, 좋기로는 카텝신-절단가능한 링커인 것이 바람직하다. 일 구체예에서, 항체는 항체의 시스테인 티올을 통해 링커에 결합된다.
일 구체예에서, CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체는, 특히 항체 약물 컨쥬게이트 내에 존재할 경우, 항체 및/또는 항체 약물 컨쥬게이트의 세포내이입을 허용하는데 적절한 CLDN6에 대한 친화성 및/또는 특이성을 갖는다. 일 구체예에서, 항체 약물 컨쥬게이트 내의 CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체는 CLDN6의 첫 번째 세포외 루프에 결합한다. 일 구체예에서, 항체 약물 컨쥬게이트 내의 CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체는 SEQ ID NO: 5 또는 그의 단편으로 나타내지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부 (VH) 및 SEQ ID NO: 4 또는 그의 단편으로 나타내지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부 (VL)를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 약물 항체 컨쥬게이트 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는 의약 포뮬레이션을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트, 및 화학요법제를 포함하는 의약 제제를 제공한다. 좋기로는, 의약 제제는 암을 치료 또는 예방하기 위한 것이다. 항체 약물 컨쥬게이트 및 화학요법제는 의약 제제 내에 혼합물 또는 서로 분리된 상태로 존재할 수 있다. 의약 제제는 항체 약물 컨쥬게이트를 함유하는 제1 용기 및 화학요법제를 함유하는 제2 용기를 포함하는 키트의 형태로서 존재할 수 있다. 의약 제제는 추가로 암의 치료 또는 예방의 위한 제제의 사용, 특히 본 발명의 방법에서의 제제의 사용을 위한 인쇄된 지침서를 더 포함할 수 있다. 의약 제제 및 특히 항체 약물 컨쥬게이트 및 화학요법제의 여러가지 구체예들은 본 명세서에 설명된 바와 같다.
특정 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트 및 파클리탁셀을 포함하는 의약 제제를 제공한다. 항체 약물 컨쥬게이트 및 파클리탁셀은 의약 제제 내에 혼합물 형태로 또는 상호 분리된 상태로 존재할 수 있다. 의약 제제는 난소암과 같은 암을 치료 또는 예방하기 위한 것일 수 있다. 의약 제제는 항체 약물 컨쥬게이트를 함유하는 제1 용기 및 파클리탁셀을 함유하는 제2 용기를 포함하는 키트의 형태로 존재할 수 있다. 의약 제제는 추가로 추가로 난소암과 같은 암의 치료 또는 예방의 위한 제제의 사용, 특히 본 발명의 방법에서의 제제의 사용을 위한 인쇄된 지침서를 더 포함할 수 있다. 의약 제제 및 특히 항체 약물 컨쥬게이트의 의약 제제의 여러가지 다른 구체예들은 본 명세서에 설명된 바와 같다.
본 발명은 또한 본 명세서에 설명된 방법에 사용되기 위한, 항체 약물 컨쥬게이트와 같은 본 명세서에 설명된 제제 및 조성물, CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체 및/또는 화학요법제도 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 파클리탁셀과 같은 화학요법제와 연계하여 투여하기 위한 항체 약물 컨쥬게이트 또는 CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체 역시도 제공한다.
일 구체예에서, CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체는 모노클로날, 키메라 또는 인간화 항체, 또는 항체의 단편이다. 일 구체예에서, 항체는 세포성(cellular) CLDN6, 특히 그의 세포 표면 상의 세포에 의해 발현되는 CLDN6에 결합할 경우 세포 살해를 매개하는 것으로서, 여기서 상기 세포는 본 명세서에 설명된 암의 줄기세포와 같은 암 줄기세포인 것이 바람직하다.
본 발명에서 암은 난소암, 특히 난소 선암종 및 난소 기형암종, 소세포 폐암 (SCLC) 및 비소세포 폐암(NSCLC)을 비롯한 폐암, 특히 편평세포 폐암종 및 선암종, 대세포암종 (LCC), 위암, 유방암, 간암, 췌장암, 피부암, 특히 기저세포 암종 및 편평세포 암종, 악성 흑색종, 두경부암, 특히 악성 다형 선종, 육종, 특히 활막 육종및 암육종, 담관암, 방광의 암, 특히 이행세포암종 및 유두암종, 신장암, 특히 투명세포 신장세포 암종 및 유두상 신장세포 암종을 비롯한 신장세포 암종, 결장암, 회장의 암을 비롯한 소장암, 특히 소장 선암종 및 회장의 선암종, 태반 융모막암종, 자궁경부암, 고환암, 특히 고환 정상피종, 고환 기형암 및 배아 고환암, 자궁암, 생식세포 종양 예컨대 기형암종 또는 배아암종, 특히 고환 및 난소의 생식세포 종양, 및 이들의 전이형태로 이루어진 군으로부터 선택된 암의 암세포들이다.
본 발명에 따라, 암 세포 및/또는 CLDN6을 발현하는 암 줄기세포는 좋기로는 본 명세서에 설명된 암의 세포인 것이 바람직하다.
일 구체예에서, 본 명세서에 설명된 암은 CLDN6 양성이다. 일 구체예에서, 본 명세서에 설명된 암 세포는 CLDN6 양성이다. 일 구체예에서, 본 명세서에 설명된 암의 암 세포는 그의 세포 표면에서 CLDN6을 발현한다.
일 구체예에서, 본 명세서에 설명된 암은 원발암, 진행된 암, 전이암, 재발암 또는 예컨대 원발암과 전이암의 조합과 같은 이들의 조합을 포함한다. 일 구체예에서, 암은 파클리탁셀과 같은 화학요법 단일요법으로는 부분적으로 또는 전적으로 난치성이다. 일 구체예에서, 암은 난소암, 특히 파클리탁셀과 같은 화학요법 단일요법으로는 부분적으로 또는 전적으로 난치성인 난소암이다.
본 발명의 기타 특징과 장점은 이하의 설명과 청구범위를 참조하면 더욱 명확히 이해될 수 있다.
도 1: CLDN6 mRNA는 인간 iPS 세포에서 발현된다.
인간 포피(包皮) 섬유모세포 (HFF)를 RNA 없이(무RNA 대조군) 또는 리프로그램 칵테일(unmod. OSKMNL+EBK+miR-mix)과 함께 리포펙타민 RNAiMAX (Life Technologies)을 이용하여 트랜스펙션시키고 세포를 처리 후 제5일, 제12일 및 제19일에 수집하였다. RNA를 추출하고 cDNA로 전사한 후 ABI PRISM 7300 서열 검색 시스템 및 소프트웨어 (Applied Biosystems with QuantiTect SYBR green Kit (Qiagen))을 이용하여 정량적 실시간 RT-PCR에 의해 분석하였다. 처리 제1일차 HFF 세포 (회색 막대)에 비해 재프로그램 칵테일(reprogramming cocktail) 처리된 세포(검은색 막대)의 CLDN6 발현의 폴드 유도(fold induction)을 나타내었다. CLDN6 mRNA 발현을 하우스키핑 유전자 HPRT1의 mRNA 발현으로 정규화시켰다. OSKMNL = 전사 인자 OCT4, SOX2, KLF4, cMYC, NANOG 및 LIN28, EBK= IFN-escape 단백질 E3, K3 및 B18R, miR-mix = miRNA-302a/b/c/d 및 367.
도 2: CLDN6은 인간 iPS 세포의 표면에서 발현된다.
HFF 세포를 cells RNA 없이(무RNA 대조군) 또는 리프로그램 칵테일(unmod. OSKMNL+EBK+miR-mix)과 함께 트랜스펙션시키고 세포를 처릴 후 제5일(A), 제2일(B) 및 제19일(C)에 수집하였다. 세포들을 4℃에서 30분간 1 μg/ml CLDN6-특이 IMAB027-AF647 및 SSEA-4-V450 항체 (테스트 당 2.5 μl, BD로부터 구입)로 염색하고 표면 발현을 유세포분석법에 의해 측정하였다. 이 실험은 두 번 수행하고 대표적인 점 그래프를 나타내었다. OSKMNL = 전사 인자 OCT4, SOX2, KLF4, cMYC, NANOG 및 LIN28, EBK= IFN-escape 단백질 E3, K3 및 B18R, miR-mix = miRNA-302a/b/c/d 및 367.
도 3: 난소암 세포주에서의 CLDN6 표면 발현.
CLDN6 발현을 분석하기 위해 1E6 세포를 4℃에서 30분간 1 μg/ml IMAB027-AF647로 염색하고 유세포분석법에 의해 표면 발현을 분석하였다. (A)에는 COV318 세포가 도시되어 있다. 실험을 3회 수행하고 대표적인 하나의 점 그래프를 나타내었다. (B)에는 대조군 벡터(PA-1 76)나 또는 CLDN6에 대해 shRNA를 발현하는 벡터 (클론PA-1 50 및 PA-1 54)로 안정하게 트랜스펙션된 PA-1 세포들이 도시되어 있다. 실험을 3회 수행하고 대표적인 하나의 점 그래프를 나타내었다. shRNA= 스몰 페어핀 RNA
도 4: CLDN6은 난소암 세포의 집락 형성에 중요하다.
클론원성 거동을 분석하기 위해, COV318, PA-1 50 및 PA-1 54 세포들을 4℃에서 30분 동안 1 μg/ml IMAB027-AF647로 염색한 다음 700 (COV318) 또는 500 (PA-1 50/54) CLDN6-양성 또는 CLDN6-음성 세포들을 6 웰 플레이트로 소팅하였다. 세포들로 하여금 14일 동안 집락을 형성하게 한 다음 20분간 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. (A)는 각 세포주에 대하여 대표적인 도면을 나타내었다. (B) 수동으로 계수하여 집락을 정량하였다. 3가지 독립적일 실험의 평균 및 표준편차를 나타내었다.
도 5: CLDN6는 난소암 세포주 COV318에서 CSC 마커 CD24, CD90 및 CD44와 함께 공통-발현된다.
표 1에 기재된 FACS 패널에 따라 상이한 표면 마커에 대한 항체들로 1E6 COV318 세포를 4℃에서 30분간 염색하고 유세포분석법으로 CSC 마커 발현을 측정하였다. 실험을 3회 수행하였다. (A)에는 상이한 수립된 CSC 마커들과 CLDN6의 공통-국소화(co-localization)의 대표적인 점 그래프를 나타내었다. (B)에는 다이아그램의 x축 상에 표시된 여러가지 상이한 게이팅 전략(gating strategies)을 이용하여 CD44, CD24, CD90 및 CLDN6 양성 세포의 공통-국소화 백분율을 계산하였다. 삼회에 걸친 평균값과 표준편차를 나타내었다.
도 6: CLDN6 발현 세포의 강화(enrichment)는 수립된 CSC 마커의 축적을 일으킨다.
COV318 세포를 0.5 μg/ml IMAB027 및 2차 APC-컨쥬게이트형 염소 항-인간 IgG 2차 항체 (1:300)로 염색하고 이어서 CLDN6-양성 및 CLDN6-음성 분획을 FACS 소팅에 의해 분리하였다. 두 가지 분획 모두의 세포들을 10일간 증식시켰다. 각 분획의 1E6 세포들을 표 1에 나타낸 FACS 패널에 따른 상이한 표면 마커들에 대한 항체로 4℃에서 30분간 염색하였다. 이 실험을 3회 수행하였다. (A)에는 CLDN6-양성 및 CLDN6-음성 분획에서의 여러가지 상이한 CSC 마커의 발현 수준의 대표적인 점 그래프를 CLDN6과의 이들의 공통-국소화와 함께 도시하였다. (B)에는 CSC 마커 발현 수준의 백분율을 다이아그램으로 나타내고, CLDN6-양성 및 CLDN6-음성 분획에서의 양성 세포의 백분율을 비교함으로써 관련 마커 CD44, CD90 및 CD24에 대한 강화 인자(폴드 발현)을 산출하였다.
도 7: CLDN6 고발현 세포주들은 CLDN6 저발현 세포주들에 비해 CSC 마커가 더 풍부(강화: enrichment)한 것으로 나타났다.
CLDN6-고발현 난소암 세포주 OV90 (A) 및 PA-1 (B) 또는 고환 암종 세포주 NEC-8 (C) 및 NEC-14 (D)의 1E6개의 세포들을 표 1에 기재된 FACS 패널에 따라 여러가지 상이한 표면 마커에 대한 항체들로 4℃에서 30분간 염색하고 유세포분석법에 의해 CSC 마커 발현을 측정하였다. 실험을 3회 수행하고 대표적인 점 그래프를 나타내었다.
도 8: 초기 이종이식편 종양 모델에서 파클리탁셀과 조합된 IMAB027의 항종양 효과.
인간 CLDN6을 이소(ectopically) 발현하는 피하 인간 ES-2 이종이식편 종양을 이식으로부터 제3일, 제10일 제17일에 15 mg/kg 파클리탁셀을 복강 주사하여 처리하였다. 항체 유지 요법을 제4일에 개시하되 1주일에 3회 35 mg/kg IMAB027 주사하여 수행하였다 (교대로 i.v./i.p./i.p.). (A) IMAB027 (흰색 사각형), 파클리탁셀 (회색 원형), 파클리탁셀과 조합된 IMAB027 (검은색 사각형) 또는 비히클 대조군(흰색 원형) 처리 후 평균 종양 성장 키네틱(± SEM). 화살표는 치료 개시 시점을 나타낸다. (B) 처리된 마우스의 생존 곡선. 그룹 크기: n=12.
도 9: 진행된 이종이식편 종양 모델에서 시스플라틴과 조합된 IMAB027의 항종양 효과.
처리 전까지 피하 인간 NEC14 이종이식편 종양을 중앙 크기 ~100 mm3가 될 때까지 성장시켰다. 마우스들을 생착(engraftment) 후 제6일 내지 제10일에 1 mg/kg 시스플라틴을 매일 복강 주사하고 유지 요법으로서 제6일에 시작하여 35 mg/kg IMAB027을 1주 3회 (교대로 i.v./i.p./i.p.) 주사하였다. (A) IMAB027 (검은색 원형), 시스플라틴 (흰색 사각형), 시스플라틴과 조합된 IMAB027 (검은색 사각형) 또는 비히클 대조군 (흰색 원형)으로 처리된 후 평균 종양 크기 키네틱(± SEM). 화살표는 치료 개시 시점을 나타낸다. (B) 이식 24일 후 마우스에서의 개별 종양 크기 (평균 ± 표준편차). (C) 처리된 마우스의 생존 곡선. 그룹 크기: n=19. P-값: *, p < 0.05; **, p < 0.01 및 ***, p < 0.001.
도 10: 진행된 이종이식편 종양 모델에서 카르보플라틴과 병용된 IMAB027의 항종양 효과.
진행된 인간 NEC14 이종이식편 종양을 도 9에 설명된 바와 같이 IMAB027 단독 또는 세포증식억제 약물과 조합하여 처리하였다. 시스플라틴 대신, 마우스들에게 제6, 13 및 20일에 30 mg/kg 카르보플라틴을 볼루스(bolus) 복강 주사하였다. (A) IMAB027 (검은색 원형), 카르보플라틴 (흰색 사각형), 카르보플라틴과 조합된 IMAB027 (검은색 사각형) 또는 비히클 대조군 (흰색 원형)으로 처리한 후의 평균 종양 크기 키네틱(± SEM). 화살표는 처리 개시 시점을 나타낸다. (B) 이식 24일 후 마우스에 있어서의 개별적인 종양 크기 (평균 ± 표준편차). (C) 처리된 마우스의 생존 곡선. 그룹 크기: n=19. P-값: *, p < 0.05; **, p < 0.01 및 ***, p < 0.001.
도 11: CLDN6은 난소암 세포의 스피어(spheres) 형성 거동에 있어 중요하다.
스피어 형성에 미치는 CLDN6의 영향을 분석하기 위해, CLDN6 양성 및 CLDN6 음성 COV318 세포를 0.5 μg/ml IMAB027으로 염색 후 형광 활성화 세포 소팅법에 의해 분리하였다. CLDN6 양성 및 CLDN6 음성 COV318 세포들을 스피어 형성 조건 (0.4% 소혈청 알부민, 20 ng/ml 염기성 섬유모세포 성장인자, 10 ng/ml 표피 성장인자 및 5 μg/ml 인슐린을 함유하는 무혈청 DMEM/F12 배지) 하에 초저 부착 플레이트에서 성장시켰다. (A) 소팅 후 제3일, 제8일 및 제19일에 CLDN6 양성 (CLDN6+) 및 CLDN6 음성 (CLDN6-) COV318 세포들의 제1 세대 스피어의 대표적인 도면. (B) 소팅 후 제22일에 (A)로부터의 CLDN6+ 제1 세대 스피어의 단일 세포들로부터 수득된 제2 세대 스피어의 대표적인 도면.
도 12: 플라틴-유도체에 의한 처리 후 CLDN6-양성 세포들의 강화(enrichment).
COV318 세포들을 500 ng/ml 시스플라틴 또는 2,000 ng/ml 카르보플라틴으로 4일간 처리하였다. 처리 후, 세포들을 각각 다시 3일 (흰색 막대) 및 6일 (검은색 막대) 동안 부가적으로 세포증식억제 약물 부재 하에 성장시켰다. CLDN6 특이 항체IMAB027 및 아이소타입 대조군 항체를 이용하여 유세포분석법으로 CLDN6의 발현을 분석하였다. 처리된 COV318 세포의 발현을 미처리 세포와 비교하여 도시하였다. 평가를 위해, 아이소타입 대조군의 값을 CLDN6 염색으로부터 제하였다.
도 13: 복강내 생착 후 CLDN6-양성 세포들의 강화.
COV318 세포를 무흉선 누드 마우스에 복강 주사하였다. 복수가 생긴 마우스들을 안락사시키고 복수와 고형 종양 두 가지 모두를 추가 특징화를 위해 수집하였다. 분리된 세포들을 CLDN6 발현을 위해 제조 직후 및 몇 세대에 걸쳐 계대배양하여 유지시킨 후에 분석하였다. (A) CLDN6 특이 항체IMAB027 및 아이소타입 대조군을 이용한 모(parental) COV318 세포에 대한 CLDN6 발현의 유세포분석. (B) 분리 후 상이한 시점 (*: 제5일 및 제35일에 복수; **: 제12일 및 제29일에 고형 종양)에서 난소, 간, 위장, 췌장 및 횡경막으로부터의 복수 및 고형 종양으로부터 유도된 세포들에 대한 CLDN6 발현. 형광 강도를 X 축에 나타내었다. Y 축에 나타낸 이벤트 횟수를 이벤트 최대 횟수 백분율의 척도로서 나타내었다.
도 14: CLDN6은 원발성 종양 샘플에서 난소암 줄기세포 마커와 상관이 있다.
42종의 난소암 샘플들을 CLDN6의 그들의 mRNA 발현 수준 및 다양한 설명된 난소암 줄기세포 마커에 대해 Fluidigm 검색 시스템 및 소프트웨어를 이용하여 qRT-PCR에 의해 분석하였다. 스피어만 상관 분석(Spearman correlation analysis)을 수행하여 암 줄기세포 특이 마커와의 CLDN6의 상관관계를 분석하였다. (A)에는 유의적인 상관관계의 산포도를 나타내었다(P-값 ≤ 0.05). (B)에는 모든 상관관계들을 요약해놓았다.
도 15: 카르보플라틴 및 파클리탁셀 처리 후 IMAB027-매개된 ADCC.
화학요법과 조합된 IMAB027의 ADCC 활성을 COV362(Luc) 표적 세포를 이용하여 분석하였다. 즉, 세포들을 표시 농도의 카르보플라틴, 겜시타빈, 파클리탁셀, 독소루비신 또는 토포테칸으로 4일간 처리하였다. 처리 후, 세포들을 세포증식억제 약물 부재 하에 각각 3일(A-D) 및 10일(E-J) 동안 성장시켰다. 대조군 세포는 세포증식저해제 없이 배양하였다. (A, C, E, G, I) 이펙터 (PBMC) 대 표적 세포 비를 ~40:1로 하여 건강한 도너로부터의 PBMC를 이용하여 IMAB027 (검은색 선) 또는 아이소타입 대조군 항체 (회색 선)로 ADCC 실험을 실시하였다. 데이터 포인트(n=4 복제물)는 평균 ± SD로 나타내었다. (B, D, F, H, J) CLDN6의 발현을 IMAB027을 이용하여 유세포분석법으로 분석하였다. 검은색 점선은 미처리 세포에서 CLDN6이 발현되었음을 증명하고, 회색칠된 히스토그램은 처리 후 CLDN6 발현을 나타낸다.
도 16: 매우 진행된 이종이식편 종양 모델에서 PEB 처리와 조합된 IMAB027의 항종양 효과.
피하 인간 NEC14 이종이식편 종양을 누드 마우스에서 매우 진행된 단계까지 성장시켰다. 제13일에 PEB (시스플라틴, 에토포사이드 및 블레오마이신) 및 IMAB027를 이용하여 종양 치료를 개시하였다. PEG 치료를 받는 마우스들은, 제13, 14, 15, 16 및 17일에 1 mg/kg 시스플라틴 및 5 mg/kg 에토포사이드를, 그리고 제13, 17 및 21일에 10 mg/kg 블레오마이신을 복강 주사하여 처리하였다. 항체 IMAB027은 이식 후 제13일부터 제101일까지 35 mg/kg을 주3회 교대로 i.v./i.p./i.p.주사하여 투여하였다. 비히클 대조군에게는 0.9% NaCl 용액 및 약물 물질 완충액을 대신 투여하였다. 총 220일 동안 마우스들을 모니터링하였다. (A), (B) 미처리 마우스 및 IMAB027, PEB 또는 IMAB027와 조합된 PEB로 처리된 마우스의 평균 종양 성장 키네틱 (± SEM). 화살표는 치료 개시 시점을 나타낸다 (Dunn's 다중비교검사: ***, p < 0.001). (C) 미처리 마우스 및 IMAB027, PEB 또는 IMAB027와 조합된 PEB로 처리된 마우스의 생존 곡선 (Mantel-Cox 검사: *, p < 0.05; **, p < 0.01). 그룹 크기: n=14.
도 17: IMAB027, IMAB027-DM1 및 IMAB027-vcMMAE의 상대적인 결합 친화성 및 세포독성.
(A) IMAB027, IMAB027-DM1 및 IMAB027-vcMMAE의 결합을 내인적으로 CLDN6을 발현하는 OV90 세포들에 대해 유세포분석하여 측정하였다. (B) OV90 세포 생존능(viability)의 IMAB027-DM1 및 IMAB027-vcMMAE 매개된 감소의 투여량-반응 곡선. 종양 세포들을 72 시간 동안 IMAB027-DM1 또는 IMAB027-vcMMAE와 함께 인큐베이션시켰다. 세포 생존능 감소를 XTT-기반 생존능 분석을 이용하여 측정하였다. 데이터 포인트들 (n=3 복제물)을 평균 ± SD로 나타내었다. MFI: 평균 형광 강도.
도 18: 진행된 이종이식편 종양에 미치는 IMAB027-DM1 컨쥬게이트의 항종양 효과.
수립된 피하 인간 OV90 이종이식편 종양을 산생하는 누드 마우스들을 이식 후 10일 동안 1.78, 5.33 또는 16 mg/kg IMAB027-DM1 또는 비히클 대조군을 1회 정맥내 주사하여 처리하였다. 피하 종양 크기를 1주에 2회 측정하였다 (평균 + SEM). 그룹 크기: n=5, *: p<0.05, **: p<0.01.
도 19: 진행된 OV90 이종이식편 종양에 미치는 IMAB027-DM1 및 IMAB027-vcMMAE 컨쥬게이트의 투여량 범위 발견.
수립된 피하 인간 OV90 이종이식편 종양을 갖는 누드 마우스들을 이식 후 10일 동안 IMAB027-DM1, IMAB027-vcMMAE, 비히클을 단회 정맥 주사하거나 또는 IMAB027를 반복 투여 주사함으로써 처리하였다. (A) 1.33, 2.67 또는 5.33 mg/kg IMAB027-DM1 i.v. (상단) 또는 with 4, 8 또는 16 mg/kg IMAB027-vcMMAE i.v. (하단) 처리된 마우스의 종양 성장을 비히클 대조군 및 IMAB027 (35 mg/kg, weekly i.v./i.p./i.p.) 처리한 경우와 비교하였다. 피하 종양의 크기를 주 2회 측정하였다 (평균 + SEM). (B) 비히클 또는 4, 8 또는 16 mg/kg IMAB027-vcMMAE로 처리된 마우스의 카플란-마이어 생존 곡선. 종양 크기가 1400 mm3에 달하거나 또는 종양이 궤양성으로 되면 마우스들을 희생시켰다. 그룹 크기: n=10, *: p<0.05, **: p<0.01, ***: p<0.001.
도 20: 진행된 PA-1 이종이식편 종양에 있어서 IMAB027-vcMMAE 컨쥬게이트의 투여량 범위 발견.
수립된 피하 인간 PA-1 이종이식편 종양을 갖는 누드 마우스들을 이식 후 15일 동안 IMAB027-vcMMAE, 비히클 대조군을 단회 정맥 투여하거나 또는 IMAB027을 반복 주사하여 처리하였다. (A) 평균 종양 성장 (± SEM) 및 (B) 비히클 대조군, IMAB027 (35 mg/kg, weekly i.v./i.p./i.p.) 또는 4, 8 또는 16 mg/kg IMAB027-vcMMAE으로 처리된 마우스의 카플란-마이어 생존 곡선. 종양 크기가 1400 mm3에 달하거나 또는 종양이 궤양성으로 되면 마우스들을 희생시켰다. 그룹 크기: n=8, *: p<0.05, **: p<0.01. (C) 생착 후 여러가지 시점에서 PA-1 이종이식편 종양 절편에서 CLDN6에 대한 대표적인 면역조직화학 염색.
도 21: 진행된 MKN74 이종이식편 종양에 미치는 IMAB027-vcMMAE의 항종양 효과.
수립된 피하 인간 MKN74 이종이식편 종양을 갖는 누드 마우스들을 이식 후 7일 동안 16 mg/kg IMAB027-vcMMAE 또는 비히클 대조군을 정맥 주사하여 처리하였다. 비히클 대조군 또는 IMAB027-vcMMAE으로 처리된 마우스의 (A) 평균 종양 성장 (± SEM) 및 (B) 카플란-마이어 생존 곡선. 종양 크기가 1400 mm3에 달하거나 또는 종양이 궤양성으로 되면 마우스들을 희생시켰다. 그룹 크기: n=10. (C) 생착전MKN74 종양 세포에 대한 CLDN6 발현의 유세포 분석 및 생착 후 제31일에 미처리 MKN74 이종이식편의 대표적인 면역조직화학 염색. **: p<0.01, ***: p<0.001.
도 22: 진행된 복강내 전이 인간 난소 종양에 미치는 IMAB027-DM1 및 IMAB027-vcMMAE의 항종양 효과.
루시페라제를 이소적으로(ectopically) 발현하는 인간 난소 암종 세포주 PA-1(Luc)를 누드 마우스에게 복강내 생착시켰다. 복강내 전이 이종이식편 종양이 형성된 후, 이식으로부터 14일 후에 동물들을 16 mg/kg IMAB027-DM1, IMAB027-vcMMAE 또는 비히클 대조군으로 복강내 (i.p.) 주사하였다. IVIS Lumina Imaging System을 이용하여 발광 활성에 의해 루시페린 투여 후 전이암의 성장을 구하였다. (A) IMAB027-DM1, IMAB027-vcMMAE 또는 비히클로 처리된 마우스들의 전이 로드 정량. (B) 이식후 제28일에 누드 마우스의 생체내 전신 발광 이미지. 그룹 크기: n=8 (비히클) 또는 n=9 (IMAB027-DM1, IMAB027-vcMMAE), **: p<0.01, *** *: p<0.0001.
도 23: 인간 암종 세포에 의한 CLDN6 결합 항체의 세포내이입.
표적 결합된 항체와 사포린-컨쥬게이트된 항인간 IgG Fab 단편 (FabZap)의 공통-내면화에 의존하는 세포독성 기반 분석법을 이용하여 CLDN6 결합된 IMAB027, chimAB5F2D2 또는 아이소타입 대조군 항체들의 세포내이입을 탐지하였다. PA-1, OV90 또는 NEC14 인간 암종 세포들을 IMAB027, chimAB5F2D2 또는 아이소타입 대조군 항체 및 항인간 FabZap와 함께 72 시간 동안 인큐베이션하였다. (A) 각각 PA-1, OV90 및 NEC14 세포 생존능의 IMAB027/FabZap 및 chimAB5F2D2/FabZap 매개된 감소의 투여량-반응 곡선. 데이터 포인트 (n=3 복제물)은 평균 ± SD로서 서술된다. (B) 유세포 결합 및 세포내이입의 IMAB027 정규화된 EC50 (rel EC50) 및 최대값 (rel 최대값)의 비교.
발명의 상세한 설명
이하에 본 발명을 보다 상세히 설명하지만, 본 발명이 본 명세서에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약들로 한정되는 것이 아님을 이해하여야 한다. 또한 본 명세서에 사용된 용어들은 어디까지나 특정 구체예를 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 한정하려는 의도로 해석되어서는 아니되며 본 발명의 범위는 청구범위에 의해서만 한정되는 것으로 이해되어야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 통상의 기술자에게 흔히 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
이하에서, 본 발명의 요소들을 설명한다. 이 구성 요소들은 특정 구체예와 함께 리스트되지만, 이들은 여하한 방식 및 여하한 횟수로든 조합되어 부가적인 구체예를 생성할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 다양한 실시예와 바람직한 구체예들은 다양하게 설명된 실시예와 바람직한 구체예들은 본 발명을 단지 명시적으로 설명된 구체예들만으로 한정짓는 것으로 해석되어서는 아니된다. 이 설명은 명시적으로 설명된 구체예들과 여하한 수의 개시된 및/또는 바람직한 구성 요소들을 조합하는 구체에들을 뒷받침하고 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 뿐만 아니라, 이 출원의 모든 설명된 구성요소들의 여하한 순열 및 조합들 역시 문맥상 달리 지시되지 않는 한, 본 출원의 설명에 의해 개시된 것으로 간주되어야 한다.
좋기로는, 본 명세서에 사용된 용어들은 "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, 및 H. Koebl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995)에 설명된 바와 같이 정의된다.
본 발명을 실시하는데 있어서는 달리 설명되지 않는 한, 이 기술분야의 문헌 (cf., 예컨대, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook 외 eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989)에서 설명되는 화학, 생화학, 세포생물학, 면역학 및 재조합 DNA 기술의 상법이 이용될 것이다.
이하의 상세한 설명과 청구범위에 걸쳐, 문맥상 달리 요구되지 않는 한 "포함하다(comprise)" 및 그의 변형어들 예컨대 "comprises" 및 "comprising"은 명시된 멤버, 정수 또는 단계 또는 멤버, 정수 또는 단계들의 그룹을 포괄하되, 비록 몇몇 구체예에서는 다른 멤버, 정수 또는 단계 또는 멤버, 정수 또는 단계들의 그룹이 배제될 수도 있지만, 다른 멤버, 정수 또는 단계 또는 멤버, 정수 또는 단계들의 그룹이 배제되는 것은 아니다, 즉, 본 발명의 청구대상은 명시된 멤버, 정수 또는 단계 또는 멤버, 정수 또는 단계들의 그룹들을 포함한다. 본 발명을 설명함에 있어 문맥상 사용된 관사 "a" 및 "an" 및 "the" 그리고 이와 유사한 참조 용어들(특히 청구범위 문맥상)은 달리 언급되거나, 반대 의미를 갖는 것이 명백하지 않은 한, 단복수를 아우르는 것이다.
본 발명의 값들을 범위로 인용하는 것은 단지 해당 범위에 속하는 각각의 분리된 값들을 개별적으로 손쉽게 칭하기 위한 것이다. 달리 언급하지 않는 한, 각각의 개별적인 값은 본 명세서에서 개별적으로 언급된 것처럼 명세서에 인용된 것으로 간주된다. 본 발명에 설명된 모든 방법들은 달리 언급하거나 문맥상 모순되지 않는 한, 적절한 순서로 실시될 수 있다. 본 명세서에 제공된 여하한 그리고 모든 예시 또는 예시적 언어 (예컨대 "와 같은")는 본 발명을 좀 더 잘 설명하기 위해 의도된 것으로, 본 발명의 범위를 달리 한정지으려는 것이 아니다. 명세서 내의 어떠한 언어도 청구되지 않은 구성요소를 본 발명을 실시하는데 필수적인 것으로 가리키는 것으로 해석되어서는 아니된다.
본 발명의 명세서 전반에 걸쳐 몇 가지 문헌들이 인용된다. 인용된 이들 각각의 상기 또는 하기 문헌들 (모든 특허, 특허출원, 과학간행물, 제조업체의 설명서, 지침서 등)은 모두 그 내용 전체가 본 발명에 참조 병합된다. 이들 언급된 문헌들 중 어느 것도 선행발명임을 이유로, 본 발명이 그러한 개시내용에 선행한다고 하지 못함을 인정하는 것으로 해석되어서는 아니된다.
클라우딘은 밀착연접부의 가장 중요한 구성원인 단백질 패밀리로서, 밀착연접부에서 이들은 상피의 세포들 간의 세포간 공간에서의 분자 흐름을 제어하는 세포주위 장벽을 확립한다. 클라우딘은 N-말단 및 C-말단 (두 가지 모두 세포질 내에 위치)과 함께 4회에 걸쳐 막을 관통하는 막통과 단백질이다. EC1 또는 ECL1이라 명명된 제1 세포외 루프는 평균 53개의 아미노산으로 구성되고, EC2 또는 ECL2라 명명된 제2 세포외 루프는 대략 24개의 아미노산으로 이루어진다. CLDN6과 같은 클라우딘 패밀리의 세포 표면 단백질은 다양한 기원의 종양에서 발현되는데, 이들의 선택적 발현(독성 관련 정상 조직에서는 발현되지 않음)과 세포질 막으로의 국소화로 인해, 이들은 항체-매개된 암 면역치료법과 관련하여 특히 적합한 표적 구조를 갖는다.
CLDN6은 종양 조직에서 차별적으로 발현되는 것으로 동정된 바 있으며 CLDN6을 발현하는 유일한 정상 조직은 태반으로서 태반에서는 오직 소량의 CLDN6이 RNA 수준으로 검출된다. CLDN6은 예를 들어, 난소암, 폐암, 위암, 유방암, 간암, 췌장암, 피부암, 흑색종, 두경부암, 육종, 담관암, 신장세포암, 및 방광암에서 발현되는 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 다양한 구체예들에서, CLDN6의 발현과 관련된 암 질환으로는 난소암, 특히 난소 선암종 및 난소 기형암종, 소세포 폐암 (SCLC) 및 비소세포 폐암(NSCLC)을 비롯한 폐암, 특히 편평세포 폐암종 및 선암종, 위암, 유방암, 간암, 췌장암, 피부암, 특히 기저세포 암종 및 편평세포 암종, 악성 흑색종, 두경부암, 특히 악성 다형 선종, 육종, 특히 활막 육종및 암육종, 담관암, 방광의 암, 특히 이행세포암종 및 유두암종, 신장암, 특히 투명세포 신장세포 암종 및 유두상 신장세포 암종을 비롯한 신장세포 암종, 결장암, 회장의 암을 비롯한 소장암, 특히 소장 선암종 및 회장의 선암종, 태아 고환암종, 태반 융모막암종, 자궁경부암, 고환암, 특히 고환 정상피종, 고환 기형암 및 배아 고환암, 자궁암, 생식세포 종양 예컨대 기형암종 또는 배아암종, 특히 고환의 생식세포 종양, 및 이들의 전이형태의 예방 및/또는 치료에 있어서 특히 바람직한 표적이다. 일 구체예에서, CLDN6 발현과 연관된 암 질환은 난소암, 폐암, 전이성 난소암 및 전이성 폐암이다. 좋기로는 난소암은 암종 또는 선암종이다. 좋기로는, 폐암은 암종 또는 선암종이고 좋기로는 세기관지암 예컨대 세기관지성 암종 또는 세기관지성 선암종을 들 수 있다.
본 명세서에서 "CLDN"이라는 용어는 클라우딘을 의미하며 CLDN6을 포함한다. 좋기로는, 클라우딘이 인간 클라우딘인 것이 바람직하다.
용어 “CLDN6”은 좋기로는 인간 CLDN6에 관한 것으로, 특히, 좋기로는 서열목록의 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열의 변이체를 포함하는, 좋기로는 이러한 서열로 구성된 단백질에 관한다. CLDN6의 제1 세포외 루프는 좋기로는 아미노산 28 내지 80, 더욱 좋기로는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 나타난 아미노산 서열의 아미노산 28 내지 80, 더욱 좋기로는 아미노산 28 내지 76을 포함하는 것이 바람직하다. CLDN6의 제2 세포외 루프는 좋기로는 SEQ ID NO: 1에 나타난 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 2에 나타난 아미노산 서열의 아미노산 138 내지 160, 좋기로는 아미노산 141 내지 159, 더욱 좋기로는 아미노산 145 내지 157을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 제1 및 제2 세포외 루프는 좋기로는 CLDN6의 세포외 부분을 형성하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서 용어 “변이체(variant)”는 특히 돌연변이체, 스플라이스 변이체, 컨포메이션(conformations), 아이소타입(isoforms), 대립형 변이체(allelic variants), 종 변이체(species variants) 및 종 동족체(species homologs), 특히 자연적으로 존재하는 것들을 칭한다. 대립형 변이체는 어떤 유전자의 정상적 서열에 있어서의 변경과 관련된 것으로, 그 유의성은 종종 불확실하다. 주어진 유전자에 대한 완전한 유전자 시퀀싱에 의해 종종 수많은 대립형 변이체들이 동정된다. 종 동족체는 주어진 핵산이나 아미노산 서열의 그것과 기원을 달리하는 다른 종의 핵산 또는 아미노산 서열이다. "변이체"라는 용어는 후번역적으로 변형된 변이체 및 컨포메이션 변이체들을 모두 포괄한다.
본 발명에 따라, 용어 "클라우딘 양성 암" 또는 이와 유사한 용어들은 클라우딘을 발현하는 암세포, 좋기로는 상기 암세포 표면에서 클라우딘을 발현하는 암세포를 포함하는 암을 의미한다. CLDN6은 상기 세포의 표면에 위치할 경우 그 세포 표면에서 발현되며 세포에 첨가된 CLDN6-특이 항체에 의해 결합될 수 있다.
"세포 표면"이라 함은 기술분야에서 흔히 갖는 그대로의 의미로 사용되며, 따라서 단백질 및 기타 분자들이 결합할 수 있도록 접근가능한 세포의 외부를 포함한다. 예를 들어, 하나 이상의 세포외 부분을 갖는 막투과 단백질은 그 세포 표면에서 발현되는 것으로 고려된다.
본 발명에서 "세포외 부분(extracellular portion)"이라 함은 어떤 세포에서 세포외 공간을 마주하는 단백질과 같은 분자의 부분을 가리키는 것으로 좋기로는 상기 세포의 외부로부터 예컨대 상기 세포 외부에 위치하는 항체와 같은 항원-결합 분자가 접근가능한 부분을 의미한다. 좋기로는 이 용어는 하나 이상의 세포외 루프 또는 도메인 또는 그의 단편을 가리킨다.
본 발명에서 "부분/일부(part)" 또는 "단편(fragment)"이라는 용어는 호환적으로 사용되며 연속적인 요소를 가리킨다. 예를 들어, 아미노산 서열 또는 단백질과 같은 구조의 일부는 상기 구조의 연속적인 요소를 칭한다. 어떤 구조의 일부, 부분 또는 단편은 좋기로는 상기 구조의 하나 이상의 기능적 특성을 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 어떤 에피토프나 펩타이드의 일부, 부분 또는 단편은 이들이 유도된 바로 그 에피토프나 펩타이드와 면역학적으로 동등한 것이 바람직하다. 단백질 서열의 일부 또는 단편은 그 단백질 서열의 적어도 6, 특히 적어도 8, 적어도 10, 적어도 12, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 50, 또는 적어도 100개의 연속적인 아미노산으로 된 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, CLDN6은 만일 발현 수준이 태반 세포 또는 태반 조직에서의 발현 수준보다 낮을 경우 세포에서 실제로 발현되지 않는다. 좋기로는, 발현 수준은 태반 세포 또는 태반 조직에서의 발현 수준의 10% 미만, 좋기로는 5% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만, 0.1% 미만 또는 0.05% 미만 또는 심지어 이보다 더 낮은 것이 바람직하다. 좋기로는, CLDN6은 만일 발현 수준이 태반이 아닌 다른 비암(non-cancerous) 조직에서의 발현 수준을 2배 이하, 좋기로는 1.5배 이하로 초과할 경우 실제로 세포에서 발현되지 않으며, 바람직하게는, 상기 비암 조직에서의 발현 수준을 초과하지 않는 것이 좋다. 좋기로는, CLDN6은 만일 발현 수준이 검출한계 미만이고/미만이거나 세포에 첨가된 CLDN6-특이적 항체에 의한 결합을 허용하기에 발현 수준이 너무 낮을 경우 세포에서 실제로 발현되지 않는다.
본 발명에 따라, CLDN6은 발현 수준이 태반이 아닌 비암 조직에서의 발현 수준을 좋기로는 2배 초과, 좋기로는 10배 초과, 100배 초과, 1000배 초과, 또는 10000배 초과할 경우 세포에서 발현된다. 좋기로는, CLDN6은 발현 수준이 검출한계를 상회하고/상회하거나 세포에 첨가된 CLDN6-특이적 항체에 의한 결합을 허용하기에 충분할 정도로 발현 수준이 높을 경우 세포에서 발현된다. 좋기로는, 세포에서 발현된 CLDN6은 상기 세포의 표면에서 발현되거나 노출되는 것이 바람직하다.
CLDN6 발현은 mRNA로서 태반에서만 검출가능한 반면 단백질은 전혀 검출되지 않는다. 따라서, 본 명세서에서 태반에서의 CLDN6과 관련한 설명은 좋기로는 mRNA의 발현에 관한 것이다.
본 발명에 따라, "질병/질환(disease)"이라는 용어는 암, 특히 본 명세서에 설명된 유형의 암을 비롯하여 모든 병리적 상태를 일컫는다. 암 또는 암의 특정 형태에 대한 모든 칭호는 그의 암 전이도 포괄한다. 바람직한 구체예에서, 본 출원발명에 따라 치료될 질병은 CLDN6을 발현하는 세포, 특히 CLDN6을 발현하는 암 줄기세포를 포함한다.
"CLDN6을 발현하는 세포와 연관된 질병" 또는 이와 비슷한 표현은 본 발명에 따라, CLDN6이 병에 걸린 조직 또는 장기의 세포에서 발현됨을 의미한다. 일 구체예에서, 병에 걸린 조직이나 장기의 세포에서 CLDN6의 발현은 건강한 조직 또는 장기에서의 상태에 비해 증가된다. 증가라 함은 적어도 10%, 특히 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 적어도 1000%, 적어도 10000% 또는 그 이상의 증가를 의미한다. 일 구체예에서, 발현은 오직 병에 걸린 조직에서만 발견되는 반면, 건강한 조직에서는 발현이 억제된다. 본 발명에 따라, CLDN6을 발현하는 세포와 연관된 질환에는 암 질환이 포함된다. 또한, 본 발명에 따라, 암 질환은 좋기로는 암세포가 CLDN6을 발현하는 질환이다.
본 발명에서, "암 질환" 또는 "암"은 세포 성장, 증식, 분화, 유착 및/또는 이동이 비정상적으로 조절됨을 특징으로 하는 질환을 포괄한다. "암 세포"라 함은 급속하게 제어되지 않는 세포 증식에 의해 성장하고 그 새로운 성장을 개시시킨 자극이 멈춘 후에도 지속적으로 성장하는 비정상적인 세포를 의미한다. 좋기로는, "암 질환"은 CLDN6을 발현하는 세포, 특히 CLDN6을 발현하는 암 줄기세포에 의해 특징지어진다.
본 발명에서 "암"이라는 용어는 백혈병, 정상피종, 흑색종, 기형암종, 림프종, 신경모세포종, 신경아교종, 직장암, 자궁내막암, 신장암, 부신암, 갑상선암, 혈액암, 피부암, 뇌의 암, 자궁경부암, 장암, 간암, 결장암, 위암, 장암, 두경부암, 위장관암, 림프절암, 식도암, 대장암, 췌장암, 귀, 코 및 인후(ENT)암, 유방암, 전립선암, 자궁암, 난소암 및 폐암 및 이들의 전이암을 포함한다. 이의 예로는 폐암종, 유방암종, 전립선암종, 결장암종, 신장세포암종, 자궁경부암종, 또는 전술한 암이나 종양의 전이암을 들 수 있다. 본 발명에 따른 용어 암은 전이암 역시도 포괄한다.
본 발명에서, "암종(carcinoma)"이라 함은 상피 세포로부터 유도된 악성 종양을 의미한다. 이 그룹은 유방암, 전립선암, 폐암 및 결장암과 같은 흔한 형태의 암을 비롯한 가장 일반적인 암을 나타낸다.
"선암종(Adenocarcinoma)"은 샘조직에 기원을 둔 암이다. 이 조직은 또한 상피 조직이라 알려진 보다 큰 조직 카테고리의 일부이기도 하다. 상피 조직에는 피부, 샘 및 신체의 캐비티와 장기들을 라이닝하는 다양한 기타 조직이 포함된다. 상피는 발생학적으로 외배엽, 내배엽 및 중배엽으로부터 유래한다. 해당 세포가 분비 특성을 갖는 한, 선암종으로 분류되기 위해, 이들이 반드시 샘의 일부일 필요는 없다. 암종의 이러한 형태는 인간을 비롯한 어느 정도 고등 포유동물에서 일어날 수 있다. 잘 분화된 선암종은 이들이 유래한 샘 조직과 유사한 경향이 있는 반면, 덜 분화된 선암종은 그렇지 않을 수 있다. 생검에 의해 세포를 염색함으로써, 병리학자는 종양이 선암종인지 또는 다른 유형의 암인지 결정할 수 있다. 선암종은 샘들이 체내 도처에 존재하는 특성 상 신체의 많은 조직에서 일어날 수 있다. 각각의 샘이 동일한 물질을 분비하는 것이 아닐 수 있으나, 세포에 대해 외분비 기능이 있는 한, 샘이라 간주되며 그의 악성 형태는 따라서 선암종이라 명명된다. 악성 선암종은 다른 조직을 침습하며 시간이 충분할 경우 종종 전이되기도 한다. 난소 선암종은 난소 암종의 가장 흔한 유형이다. 이것은 장액성(serous) 및 점액성(mucinous) 선암종, 투명한 세포 선암종 및 자궁내막모양 선암종을 포함한다.
"전이(metastasis)"라 함은 암 세포가 그의 원래 자리로부터 체내의 다른 부분으로 확산되는 것을 의미한다. 전이의 형성은 매우 복잡한 과정으로서 종양으로부터 악성 세포의 탈착, 세포외 매트릭스의 침습, 상피기저막의 침입에 의한 체강 및 혈관으로의 유입 및 이어서 혈액에 의한 운반 후 표적 장기내로의 침윤에 의존한다. 마지막으로, 표적 부위에서의 새로운 종양의 성장은 혈관신생에 의존한다. 종양 전이는 원발성 종양의 제거 후에도 종양 세포 또는 성분들이 남아있을 수 있거나 전이 잠재능을 발달시키기 때문에 종종 발생한다. 일 구체예에서, 본 발명에 따라 "전이"라는 용어는 원발성 종양 및 지역 림프절 시스템으로부터 멀리 떨어진 전이에 관한 것인 "원격전이(distant metastasis)"에 관한 것이다. 일 구체예에서, 본 발명에 따른 "전이"라는 용어는 림프절 전이에 관한 것이다.
난치성 암은 특정 치료가 효과가 없는 종양으로서, 그 치료에 대해 초기에 무반응성이거나, 시간이 지남에 따라 무반응성이 되어 가는 암을 말한다. 용어 "난치성(refractory)" 또는 "무반응성(unresponsive)" 또는 "내성(resistanct)"는 본 명세서에서 호환된다.
본 명세서에서 "암 줄기세포"라는 용어는 고도로 증식성인 암세포의 기원세포(progenitor)일 수 있는 세포를 가리킨다. 암 줄기세포는 면역손상된(immunocompromised) 마우스에서 종양을 형성하는 그의 능력에 의해 입증되는 바와 같이 종양을 재성장시킬 수 있는 능력을 갖는다. 암 줄기세포는 또한 종양 덩어리에 비해 일반적으로 서서히 성장하며, 즉 암 줄기세포는 일반적으로 정적이다. 전부는 아니지만 특정 구체예에서, 암 줄기세포는 종양의 오직 일부, 예컨대 약 0.1 내지 10%만을 나타낼 수도 있다. 암 줄기세포는 다음 특성들 중 하나 이상 또는 다음 특성들 전부를 가질 수도 있다: (i) 종양을 개시 및/또는 종양 성장을 영속화시킬 수 있는 능력을 가질 수 있고, (ii) 종양 덩어리에 비해 일반적으로 비교적 돌연변이가 덜 될 수 있음 (예컨대 보다 느린 성장 및 그에 따른 보다 적은 DNA 복제-의존성 에러로 인해, 개선된 DNA 복구, 및/또는 그들의 종양성에 기여하는 후생적/비돌연변이성 변화), (iii) 정상적인 줄기세포(들)이 갖는 많은 특징 (예컨대, 유사한 세포 표면 항원 및/또는 세포내 발현 프로파일, 자가-재생 프로그램, 다제내성, 조숙한 표현형 등, 종상적인 줄기세포의 특징들)을 가질 수 있고 정상적인 줄기세포(들)로부터 유래할 수 있으며, (iv) 전이의 원인이 될 수 있고, (v) 서서히 성장하거나 정적(quiescent)일 수 있으며, (vi) 종양원성일 수 있고(예컨대 NOD/SCID 이식 실험에 의해 결정됨), (vii) 전통적인 치료법(즉 화학요법)에 비교적 내성을 나타낼 수 있고, 및 (viii) 종양의 부분모집단(예컨대 종양 덩어리에 상대적으로)을 포함할 수 있다.
"치료하다(treat)"라 함은 대상자에서 종양의 크기 또는 종양의 수를 감소시키는 것; 대상자의 질환 진행을 멈추거나 둔화시키는 것; 대상자에서 새로운 질병의 발달을 억제하거나 둔화시키는 것; 현재 질병에 걸려 있거나 이전에 질병에 걸렸었던 대상자에서 증상 및/또는 재발의 빈도나 위중도를 감소시키는 것; 및/또는 대상자의 수명을 연장, 즉 증가 또는 확장시키는 것을 비롯하여, 질병을 예방 또는 제거하기 위해, 대상자에게 화합물이나 조성물 또는 화합물이나 조성물의 조합과 같은 치료제를 투여하는 것을 의미한다. 특히, "질병의 치료"라는 용어에는, 질병이나 그의 증상을 치유, 기간 단축, 완화, 예방, 둔화시키거나 진행이나 악화를 억제하거나 또는 개시를 예방 또는 둔화시키는 것이 포함된다.
본 발명의 문맥 상, "보호하다" 또는 "예방하다" 등의 표현은 대상자에 있어서 어떤 질병의 발병 및/또는 전파의 예방 또는 치료 또는 양자 모두에 관한 표현으로서, 특히, 대상자에 있어서 질병의 진행 기회를 최소화하거나 질병의 진행을 지연시키는 것과 관련된 표현이다. 예를 들어, 암에 걸릴 위험이 있는 개체는 암 예방 요법의 후보가 된다.
"위험에 처하다"라는 표현은 일반 집단에 비해, 어떤 대상자에서 질병, 특히 암이 일어날 정상적인 기회가 더 높은 것으로 동정된 것을 의미한다. 또한, 질병, 특히 암에 걸렸었거나, 현재 걸린 대상자는 질환이 계속적으로 일어날 수 있으므로, 질환에 걸릴 위험성이 큰 대상자이다. 현재 암에 걸려있거나 암에 걸렸던 적이 있는 대상자 역시 암 전이 위험성이 증가된 대상자이다.
본 발명에서 "환자"라는 용어는 치료의 대상자, 특히 질병에 걸린 대상자를 의미하며 여기에는 인간, 비인간 영장류 또는 기타 동물, 특히 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이와 같은 포유동물 또는 마우스나 래트와 같은 설치류가 포함된다. 특히 바람직한 구체예에서, 환자는 인간이다.
본 명세서에서, 치료제의 투여와 관련한 문맥에서 "조합(combination)"이라는 용어는 2종 이상의 치료법 또는 치료제의 사용을 가리킨다. "조합하여"라는 용어의 사용은 대상자에게 투여되는 치료제 또는 행해지는 치료법의 순서를 한정하지는 않는다. 치료법 또는 치료제는 제2의 치료법이나 치료제의 실시 또는 투여 전, 또는 동시 또는 후에 대상자에게 행해질 수 있다. 좋기로는, 치료법 또는 치료제는 그 치료법이나 치료제가 한데 작용하도록 하는 순서, 양 및 또는 기간 내에 대상자에게 행해진다. 특정 구체예에서, 치료법 또는 치료제는 이들이 달리, 특히 상호 독립적으로 투여될 경우에 비해 더 유익한 장점을 제공하는 순서, 양 및/또는 시간 간격으로 대상자에게 투여된다. 좋기로는, 증가된 장점은 상승 효과이다.
"표적 세포"라 함은 암 세포, 특히 암 줄기세포와 같이 바람직하지 못한 세포를 의미한다. 바람직한 구체예에서, 표적 세포는 CLDN6을 발현하는 것이다.
본 발명에서, 용어 "화학요법"은 1종 이상의 화학요법제 또는 세포증식저해제 또는 세포독성제와 같은 화학요법제들의 조합에 의한 치료에 관한 것이다. 본 발명에 따른 화학요법제들에는 세포증식억제 화합물 및 세포독성 화합물이 포함된다.
본 발명에서, 용어 "화학요법제"는 파클리탁셀 및 도세탁셀과 같은 탁산 및 시스플라틴 및 카르보플라틴과 같은 백금 화합물 및 그의 조합을 포함한다. 특히 난소암의 치료를 위한 바람직한 조합은 예컨대 파클리탁셀과 카르보플라틴과의 조합과 같은 탁산과 백금 화합물의 조합을 포함할 수 있다. 또 다른 바람직한 조합, 특히 난소암의 치료, 특히 난소 생식 세포 종양 및/또는 생식 세포 종양의 치료, 특히 난소 및 고환 생식 세포 종양의 치료를 위한 조합의 예로는 시스플라틴과 같은 백금 화합물과 에토포사이드 및/또는 블레오마이신과의 조합을 들 수 있다. 본 발명에서 화학요법제라는 용어에는 상기 치료제의 전구체 예컨대 에스테르, 염 또는 컨쥬게이트와 같은 유도체도 포함된다. 상기 치료제와 캐리어 물질의 컨쥬게이트의 예로는, 예컨대 단백질-결합된 파클리탁셀 예컨대 알부민-결합된 파클리탁셀을 들 수 있다. 좋기로는, 상기치료제의 염은 약학적으로 허용가능한 것이 바람직하다.
탁산은 처음 Taxus 속의 식물과 같은 천연 공급원으로부터 유도된 디테르펜 화합물 부류이지만, 이들 중 몇몇은 인공적으로 합성되어왔다. 탁산 부류 약물의 기본적인 작용 메카니즘은 미세관(microtubule) 기능을 와해시킴으로써, 세포 분열 과정을 억제하는 것이다. 탁산에는 도세탁셀 (Taxotere) 및 파클리탁셀 (Taxol)이 포함된다.
본 발명에 따라, 용어 "도세탁셀"은 다음 화학식을 갖는 화합물을 가리킨다:
Figure pat00001
특히, 용어 "도세탁셀"은 1,7β,10β-트리히드록시-9-옥소-5β,20-에폭시탁-11-센-2α,4,13α-트리틸 4-아세테이트 2-벤조에이트 13-{(2R,3S)-3-[(3차-부톡시카르보닐)-아미노]-2-히드록시-3-페닐프로파노에이트} 화합물을 가리킨다.
본 발명에서, 용어 "파클리탁셀"은 다음 화학식을 갖는 화합물을 가리킨다:
Figure pat00002
특히, 용어 "파클리탁셀"은 (2α,4α,5β,7β,10β,13α)-4,10-비스-(아세틸옥시)-13-{[(2R,3S)-3-(벤조일아미노)-2-히드록시-3-페닐프로파노일]옥시}-1,7-디히드록시-9-옥소-5,20-에폭시탁-11-센-2-일 벤조에이트 화합물을 가리킨다.
본 발명에서, 용어 "백금 화합물"은 백금 착화합물과 같이 그의 구조 내에 백금을 함유하는 화합물을 가리키며 여기에는 시스플라틴, 카르보플라틴 및 옥살리플라틴 등이 포함된다.
용어 "시스플라틴" 또는 "시스플라티늄"은 다음 화학식을 갖는 화합물 cis-디아민디클로로백금(II) (CDDP)을 가리킨다:
Figure pat00003
용어 "카르보플라틴"은 다음 화학식을 갖는 화합물 cis-디아민(1,1-시클로부탄디카르복실레이토)백금(II)을 가리킨다:
Figure pat00004
용어 "옥살리플라틴"은 다음 화학식을 갖는 디아미노시클로헥산 담체 리간드에 착화된 백금 화합물인 화합물을 가리킨다:
Figure pat00005
특히, 용어 "옥살리플라틴"은 화합물 [(1R,2R)-시클로헥산-1,2-디아민](에탄디오에이토-O,O')백금(II)을 가리킨다. 주사용 옥살리플라틴은 엘록사틴 (Eloxatine)이라는 상표명으로도 시판되고 있다.
본 발명에서 탁산 또는 백금 화합물과 같이 단독으로 또는 다른 화학요법제와 조합하여 사용될 수 있는 또 다른 화학요법제의 비제한적인 예로는 뉴클레오사이드 유사체, 캄토테신 유사체 및 안트라사이클린을 들 수 있다.
용어 "뉴클레오사이드 유사체"는 퓨린 유사체와 피리미딘 유사체 양자를 모두 포괄하는 카테고리인 뉴클레오사이드의 구조 유사체를 가리킨다.
용어 "겜시타빈"은 다음 화학식을 갖는 뉴클레오사이드 유사체인 화합물을 가리킨다:
Figure pat00006
특히, 이 용어는 화합물 4-아미노-1-(2-데옥시-2,2-디플루오로-β-D-에리쓰로-펜토퓨라노실)피리미딘-2(1H)-온 또는 4-아미노-1-[(2R,4R,5R)-3,3-디플루오로-4-히드록시-5-(히드록시메틸)옥솔란-2-일]-1,2-디히드로피리미딘-2-온을 가리킨다.
용어 "뉴클레오사이드 유사체"는 플루오로피리미딘 유도체 예컨대 플루오로우라실 및 그의 전구약물을 포함한다. 용어 "플루오로우라실" 또는 "5-플루오로우라실" (5-FU 또는 f5U) (Adrucil, Carac, Efudix, Efudex 및 Fluoroplex라는 브랜드명으로 판매됨)은 다음 화학식을 갖는 피리미딘 유사체인 화합물이다:
Figure pat00007
특히, 이 용어는 화합물 5-플루오로-1H-피리미딘-2,4-디온을 가리킨다.
용어 "카페시타빈" (Xeloda, Roche)은 조직 내에서 5-FU로 전환되는 전구약물인 화학요법제를 가리킨다. 경구 투여될 수 있는 카페시타빈은 다음 화학식을 갖는다:
Figure pat00008
특히, 이 용어는 화합물 펜틸 [1-(3,4-디히드록시-5-메틸테트라히드로퓨란-2-일)-5-플루오로-2-옥소-1H-피리미딘-4-일]카르바메이트를 가리킨다.
용어 "폴린산" 또는 "류코보린"은 화학요법제 5-플루오로우라실과의 상승적 조합에 유용한 화합물이다. 따라서, 만일 본 명세서에서 5-플루오로우라실 또는 그의 전구약물을 투여한다 할 때, 일 구체예에서 상기 투여는 폴린산과 연계하여 투여하는 것을 포함한다. 폴린산은 다음 화학식을 갖는다:
Figure pat00009
특히, 이 용어는 화합물 (2S)-2-{[4-[(2-아미노-5-포르밀-4-옥소-5,6,7,8-테트라히드로-1H-프테리딘-6-일)메틸아미노]벤조일]아미노}펜탄디오인산을 가리킨다.
본 발명에서, 용어 "캄토테신 유사체"이라 함은 화합물 캄토테신 (CPT; (S)-4-에틸-4-히드록시-1H-피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b] 퀴놀린-3,14-(4H,12H)-디온)을 가리킨다. 좋기로는, 용어 "캄토테신 유사체"는 다음 화학식을 갖는 화합물을 가리킨다:
Figure pat00010
본 발명에서, 바람직한 캄토테신 유사체는 DNA 효소 토포이소머라제 I (topo I)의 저해제이다. 본 발명에 따라 바람직한 캄토테신 유사체는 이리노테칸 및 토포테칸이다.
이리노테칸은 토포이소머라제 I의 억제에 의해 DNA가 풀리는 것을 방지하는 약물이다. 화학 용어상, 이것은 다음 화학식을 갖는 천연 알칼로이드 캄토테신의 반합성 유사체이다:
Figure pat00011
특히, 용어 "이리노테칸"은 화합물 (S)-4,11-디에틸-3,4,12,14-테트라히드로-4-히드록시-3,14-디옥소1H-피라노[3',4':6,7]-인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-9-일-[1,4'-비피페리딘]-1'-카르복실레이트를 가리킨다.
토포테칸은 다음 화학식을 갖는 토포이소머라제 저해제이다:
Figure pat00012
특히, 용어 "토포테칸"은 화합물 (S)-10-[(디메틸아미노)메틸]-4-에틸-4,9-디히드록시-1H-피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-3,14(4H,12H)-디온 모노히드로클로라이드를 가리킨다.
안트라사이클린은 암 화학요법에 흔히 사용되는 약물 부류로서 항생제이기도 하다. 구조적으로, 모든 안트라사이클린은 공통적으로 4환 7,8,9,10-테트라히드로테트라센-5,12-퀴논 구조를 공유하며 대개 특정 위치에서 글리코실화를 필요로 한다.
안트라사이클린은 좋기로는 다음 작용 메카니즘들 중 하나 이상을 초래하는 것이 바람직하다: 1. DNA/RNA 가닥의 염기쌍들 사이에 인터컬레이팅함으로써 DNA 및 RNA 합성을 저해하여, 급속히 성장하는 암 세포의 복제를 방지한다. 2.토포이소머라제 II 효소를 억제하여, 수퍼코일형 DNA의 풀림을 방지함으로 해서 DNA 전사 및 복제를 차단한다. 3. DNA와 세포막을 손상시키는 철-매개형 유리 산소 래디칼을 발생시킨다.
본 발명에서, 용어 "안트라사이클린"은 좋기로는 제제, 좋기로는 좋기로는 토포이소머라제 II 내의 DNA의 재결합을 억제함으로써 세포자멸사를 유도하는 항암제인 것이 바람직하다.
안트라사이클린 및 안트라사이클린 유사체의 비제한적인 예로는, 다우노루비신 (다우노마이신), 독소루비신 (아드리아마이신), 에피루비신, 이다루비신, 로도마이신, 피라루비신, 발루비신, N-트리플루오로-아세틸 독소루비신-14-발레레이트, 아클라시노마이신, 모르폴리노독소루비신 (모르폴리노-DOX), 시아노모르폴리노-독소루비신 (시아노-모르폴리노-DOX), 2-피롤리노-독소루비신 (2-PDOX), 5-이미노다우노마이신, 미토잔트론 및 아클라시노마이신 A (아클라루비신)을 들 수 있다. 미토잔트론은 안트라센디온 화합물 부류의 일원으로서, 안트라사이클린의 당 모이어티는 결여하지만 DNA 내로 인터컬레이션하게 해주는 평면형 폴리사이클릭 방향족 고리 구조는 견지하는, 안트라사이클린 유사체이다.
본 발명의 문맥상 특히 안트라사이클린이라 함은 에피루비신이다. 에피루비신은 다음 화학식을 갖는 안트라사이클린 약물이며:
Figure pat00013
미국에서는 엘렌스(Ellence)라는 상표명으로, 그리도 다른 나라에서는 파르모루비신(Pharmorubicin) 또는 에피루비신 에베웨(Ebewe)라는 상표명으로 시판중이다. 특히, 용어 "에피루비신"은 화합물 (8R,10S)-10-[(2S,4S,5R,6S)-4-아미노-5-히드록시-6-메틸-옥-2-일]옥시-6,11-디히드록시-8-(2-히드록시아세틸)-1-메톡시-8-메틸-9,10-디히드로-7H-테트라센-5,12-디온이다. 에피루비신은 부작용이 덜한 것으로 나타났기 때문에 몇몇 화학요법에서는 가장 흔한 안트라사이클린인 독소루비신보다 더 선호된다.
용어 "에토포사이드"는 항종양 활성을 나타내는 포로필로톡신의 반합성 유도체이다. 에토포사이드는 토포이소머라제 II 및 DNA와의 착화합물 형성에 의해 DNA 합성을 억제한다. 이 착화합물은 이중가닥 DNA에서 파단되어 토포이소머라제 II 결합에 의한 복구를 방지한다. DNA에 이러한 파단이 축적되면 세포 분열의 유사분열 단계로 들어가지 못하여 세포가 사멸되기에 이르른다. 에토포사이드는 다음 화학식을 갖는다:
Figure pat00014
특히, 이 용어는 화합물 4'-데메틸-에피포도필로톡신 9-[4,6-O-(R)-에틸리덴-베타-D-글루코피라노사이드], 4' -(디히드로겐 포스페이트)을 가리킨다.
용어 "블레오마이신"은 세균 스트렙토마이세스 베르티실루스에 의해 생산되는 글리코펩타이드 항생제를 가리킨다. 항암제로서 사용될 경우, 이것은 DNA의 파단을 일으킴으로써 작동한다. 블레오마이신은 좋기로는 다음 화학식을 갖는 화합물을 포함하는 것이 바람직하다:
Figure pat00015
만일 본 발명에 따라 화학요법제가 CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체 (적어도 1종의 독소 약물 모이어티와의 컨쥬게이트로서, 즉 항체 약물 컨쥬게이트로서 존재)와 조합 투여되면, 화학요법제가 그 항체의 투여 전 및/또는 투여와 동시에 투여되는 것이 바람직하다 (즉 혼합물로서 또는 별도 조성물들로서). 좋기로는, 화학요법제의 투여는 항체의 투여 전에 개시하는 것이 바람직하다. 좋기로는, 화학요법제는 암 줄기세포와 같은 암 세포에서 CLDN6 발현을 증가시키고 항체 투여보다 먼저 개시되거나 투여되어 그 항체의 항종양 활성이 증강되도록 하는 것이 바람직하다. 좋기로는, 화학요법의 투여는 항체의 제1 투여로부터 적어도 2일 전, 적어도 4일 전, 적어도 6일 전, 적어도 8일 전, 적어도 10일 전, 적어도 12일 전 또는 적어도 14일 전에 개시하는 것이 바람직하다. 화학요법의 투여는 항체 투여 동안 지속될 수 있거나 또는 항체 투여 1 내지 3일 전, 1 내지 7일 전, 1 내지 10일 전 또는 1 내지 14일 전에 미리 중단될 수 있다. 좋기로는, 화학요법제는 파클리탁셀 또는 도세탁셀과 같은 탁산 및/또는 시스플라틴 또는 카르보플라틴과 같은 백금 화합물을 포함하는 것이 바람직하다.
용어 "항원"은 면역 반응이 지향되거나 지향될 에피토프를 포함하는 단백질 또는 펩타이드와 같은 물질에 관한다. 바람직한 구체예에서, 항원은 예컨대 CLDN6과 같은 종양-관련 항원, 즉 세포질, 세포 표면 및 세포핵으로부터 유래할 수 있는 암 세포의 구성원이며, 특히, 암 세포 상에서 표면 항원으로서 또는 세포내에서 대량 생산되는 항원인 것들이 바람직하다.
본 발명의 문맥 상, 용어 "종양-관련 항원" 또는 "종양 항원"은 좋기로는 정상 조건 하에서 제한된 수의 조직 및/또는 장기에서 특이적으로 또는 특이적 발달 단계에서 발현되고 하나 이상의 종양 또는 암 조직에서 발현되거나 또는 비정상적으로 발현되는 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 문맥 상, 종양-관련 항원은 암 세포의 세포 표면과 연관이 있고, 정상 조직에서는 발현되지 않거나 발현되더라도 드물게만 발현되는 것이 바람직하다.
"에피토프"라는 용어는 분자 내의 항원 결정인자를 가리키는데, 즉, 면역계에 의해 인식되는, 예컨대, 항체에 의해 인식되는 분자의 일부를 가리킨다. 예컨대, 에피토프는 항원 상의 불연속적인, 3차원적 부분이며, 면역계에 의해 인식된다. 에피토프는 대개 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학 활성적인 표면 그루핑을 구성하며, 대체로 특이적인 3차원 구조 특징과 특이적인 전하 특징을 갖는다. 입체형태적(Conformational) 에피토프와 비입체형태적(non-conformational) 에피토프는 변성 용매의 존재 하에서는 전자에 대한 결합이 소실되는 반면 후자에대한 결합은 그렇지 않다는 점에서 구별된다. 단백질의 에피토프 예컨대 CLDN6은 좋기로는 상기 단백질의 연속적 또는 불연속적 부분을 포함하며 좋기로는 길이가 예컨대 5 내지 100, 좋기로는 5 내지 50, 더욱 좋기로는 8 내지 30, 가장 좋기로는 10 내지 25 아미노산인 것이 바람직하고, 예컨대, 에피토프의 길이가 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 아미노산인 것이 좋다.
용어 "항체"는 디설파이드 결합에 의해 상호 연결되어 있는 적어도 2개의 중쇄(H)와 2개의 경쇄(L)를 포함하는 당단백질로서, 이러한 당단백질의 항원-결합 부분을 포함하는 모든 분자를 포함한다.
"항체"에는 모노클로날 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 항체의 단편 또는 유도체, 제한없이 단일 사슬 항체, 예컨대, scFv's 및 항원-결합 항체 단편 예컨대 Fab 및 Fab' 단편이 포함되며 및 항체의 모든 재조합 형태, 예컨대, 원핵생물에서 발현되는 항체, 비글리코실화 항체 및 본 명세서에 설명된 바와 같은 항원-결합 항체 단편 및 유도체도 포함된다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변부 (VH라 약칭됨) 및 중쇄 불변부로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변부 (VL라 약칭됨) 및 경쇄 불변부로 이루어진다. VH 및 VL 부분은 상보성 결정부(CDR)라 명명되는 하이퍼변이성 부분들로 더 세분화될 수 있고, 프레임워크부(FR)로 명명되는, 보다 보존적인 부분들이 사이사이에 배치될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDRs과 4개의 FRs로 구성되며, 이들은 아미노 말단으로부터 카르복시 말단까지 다음 순서로 배치된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄와 경쇄의 가변부는 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변부는 면역계의 다양한 세포들(예컨대 이펙터 세포) 및 클래시컬 보체계의 제1 성분(Clq)을 비롯하여, 숙주의 조직 또는 인자들에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본 발명에서 "모노클로날 항체"라는 용어는 단일 분자 조성물의 항체 분자들의 제조물을 말한다. 모노클로날 항체는 단일 결합 특이성과 친화성을 나타낸다. 일 구체예에서, 모노클로날 항체들은 불멸화된 세포에 융합되는 비인간 동물, 예컨대, 마우스로부터 얻어지는 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.
본 발명에서 "재조합 항체"라는 용어는 (a) 면역글로불린 유전자들 또는 그들로부터 제조되는 하이브리도마에 관하여 유전자 이식 또는 트랜스염색체적인 동물 (예컨대, 마우스)로부터 분리된 항체들 , (b) 항체를 발현하기 위해 형질전환된 숙주 세포, 예컨대, 트랜스펙토마로부터 분리된 항체들, (c) 재조합, 조합 항체 라이브러리로부터 분리된 항체들, 및 (d) 다른 DNA 서열들에 면역글로불린 유전자 서열들의 스플라이싱과 관련된 다른 수단들에 의해 분리되거나, 생성되거나, 발현되거나 제조된 항체들을 비롯한, 재조합적 수단에 의해 분리되거나, 생성되거나, 발현되거나, 제조된 모든 항체들을 포함한다.
본 발명에서 "인간 항체"라는 용어는 인간 생식세포 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변부와 불변부를 갖는 항체를 포괄하는 것으로 의도된다. 본 발명에 설명된 인간 항체는 인간 생식세포 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않은 아미노산 잔기들을 포함할 수 있다(예컨대, 무작위적인 또는 위치-특이적 돌연변이 유발에 의해 시험관내 유도된 돌연변이 또는 생체내 체세포 돌연변이).
"인간화 항체"라 함은 분자의 항원 결합부는 실질적으로 비인간 종으로부터의 면역글로불린으로부터 유래한 반면, 분자의 나머지 면역글로불린 구조는 인간 면역글로불린의 구조 및/또는 서열에 기초하는 것인 분자를 가리킨다. 항원-결합 부분는 불변 도메인 상에 융합된 완전한 가변 도메인을 포함할 수도 있고 또는 가변 도메인 내의 적절한 프레임워크 부분에 그래프트된 상보성 결정부(CDR) 만을 포함할 수도 있다. 항원-결합 부분는 야생형이거나 또는 1 이상의 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있는데, 예컨대, 인간 면역글로불린에 보다 더 밀접히 닮도록 변형될 수 있다. 인간화 항체들 중 몇몇 유형은 모든 CDR 서열을 보존한다 (예컨대 마우스 항체로부터의 모든 6개의 CDRx를 함유하는 인간화된 마우스 항체). 다른 유형들은 하나 이상의 CDR이 오리지널 항체와 다를 수 있다.
"키메라 항체"라는 용어는 중쇄 및 경쇄의 각각의 아미노산 서열의 일 부분이 특별한 클래스에 속하거나 특별한 종들로부터 유래된 항체들에서 상응하는 서열들과 상동성이고, 반면 사슬의 남아있는 세그먼트(segment)는 상응하는 서열들에 달리 상동성이다. 전형적으로 경쇄 및 중쇄들의 가변부는 포유류의 한 종들로부터 유래된 항체들의 가변부들과 닮은 반면, 불변 부분들은 달리 유래된 항체들의 서열들과 상동성이다. 그러한 키메라 형태들의 한가지 분명한 잇점은 가변부가 예컨대, 인간 세포 제조로부터 유래된 불변부들과 조합하여 비인간 숙주 유기체로부터 쉽게 이용가능한 B-세포들 또는 하이브리도마를 이용하여 현재 알려진 소스로부터 편리하게 유래될 수 있다는 것이다. 가변부는 각각의 제조물의 잇점을 가지고, 특이성은 소스에 영향을 받지 않는 반면, 인간인 불변부는 항체들이 비인간 소스로부터의 불변부인 것 보다 항체들이 주입될 때 인간 대상으로부터의 면역 반응을 잘 이끌어내지 않는다. 그러나 상기 정의는 이러한 특별한 예시로 국한되지 않는다.
항체는 비제한적인 예로서 마우스, 래트, 토끼, 기니 피그 및 인간을 비롯한 여러 가지 종들로부터 유래할 수 있다.
본 발명에 설명된 항체들에는 IgA 예컨대 IgA1 또는 IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgM, 및 IgD 항체가 포함된다. 다양한 구체예에서, 항체는 IgG1 항체, 더욱 특히는 IgG1, 카파 또는 IgG1, λ 아이소타입 (즉 IgG1, κ,λ), IgG2a 항체 (예컨대 IgG2a, κ,λ), IgG2b 항체 (예컨대 IgG2b, κ,λ), IgG3 항체 (예컨대 IgG3, κ,λ) 또는 IgG4 항체 (예컨대 IgG4, κ,λ)이다.
본 발명에서, "이종 항체(heterologous antibody)"는 그러한 항체를 생산하는 형질전환 유기체와 관련하여 규정된다. 이 용어는 형질전환 유기체가 아닌 유기체에서 발견되는 아미노산 서열 또는 그것에 상응하는 인코딩 핵산 서열을 갖는 항체를 가리킨다.
본 발명에서, "헤테로하이브리드 항체"는 상이한 유기체들 기원의 경쇄 및 중쇄를 가지는 항체를 말한다. 예컨대, 쥐의 경쇄와 연관된 인간 중쇄를 가지는 항체는 헤테로하이브리드 항체이다.
본 발명에 기재된 항체들은 좋기로는 분리된 것이다. 본 발명에서 사용된 "분리된 항체"라는 용어는 상이한 항원성 특이성을 가지는 다른 항체들이 실질적으로 없는 항체를 가리키는 것으로 의도된 것이다 (예컨대, CLDN6에 특이적으로 결합하는 분리된 항체에는 실질적으로 CLDN6가 아닌 항원들과 특이적으로 결합하는 항체들이 없다). 인간 CLDN6의 에피토프, 아이소타입 또는 변이체에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 그러나, 다른 관련된 항원들, 예컨대, 다른 종들로부터 유래된 다른 관련된 항원들과 교차반응성을 가질 수 있다 (예컨대, CLDN6 종 동족체). 또한, 분리된 항체에는 실질적으로 다른 세포성 물질 및/또는 화학물질이 없을 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, "분리된" 모노클로날 항체들의 조합은 상이한 특이성들을 가지며 잘 규정된 조성물 또는 혼합물로서 조합된 항체들에 관한 것이다.
항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어 (또는 간단히, "결합 부분") 또는 항체의 "항원-결합 단편(또는 간단히 "결합 단편")은 항체에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 말한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장(full-length) 항체의 단편들에 의해 수행될 수 있다는 것으로 나타났다. 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어 내에 포함된 결합 단편들의 예들은 (i) Fab 단편들, VL, VH, CL 및 CH 도메인들로 구성된 1가의 단편들; (ii) F(ab')2 단편들, 힌지 영역에서 이황화 결합에 의해 연결된 2개의 Fab 단편들을 포함하는 2가의 단편들; (iii) VH 및 CH 도메인들로 구성된 Fd 단편들; (iv) 항체의 단일 팔(arm)의 VL 및 VH 도메인들로 구성된 Fv 단편들, (v) dAb 단편들 (Ward 외, (1989) Nature 341: 544-546), VH 도메인으로 구성됨; (vi) 분리된 상보성 결정 영역들 (CDR), 및 (vii) 합성 링커에 의해 임의적으로 결합될 수 있는 두개 이상의 CDR들의 조합들을 포함한다. 또한, VL 및 VH의 2개의 도메인들이 분리된 유전자들에 의해 코딩됨에도 불구하고, VL과 VH영역들이 1가의 분자들을 형성하기 위해 짝을 이루는 단일 단백질 사슬로써 그것들이 만들어지도록 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법들을 이용하여 결합될 수 있다 (단일 사슬 Fv (scFv)로 알려진; Bird 외 (1988) Science 242: 423-426; 및 Huston 외 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 참고). 그러한 단일 사슬 항체들은 항체의 "항원-결합 단편"이라는 용어 내에서 포함될 수 있는 것으로 생각된다. 추가적인 예는 (i) 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩타이드에 융합되는 결합 도메인 폴리펩타이드, (ii) 힌지 영역에 융합되는 면역글로불린 중쇄 CH2 불변부, (iii) CH2 불변부에 융합되는 면역글로불린 중쇄 CH3 불변부를 포함하는 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질들이다. 결합 도메인 폴리펩타이드는 중쇄 가변부 또는 경쇄 가변부일 수 있다. 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질들은 추가적으로 US 2003/0118592 및 US 2003/0133939에 개시된다. 이러한 항체 단편들은 기술분야에 당업자에게 알려져있는 통상의 기술을 이용하여 얻고, 그 단편들은 온존한(intact) 항체들처럼 동일한 방식으로 사용을 위해 스크리닝된다.
용어 "결합 도메인(binding domain)"은 본 발명에 있어서 예컨대, 주어진 표적 구조/항원/에피토프에 결합하거나 이와 상호반응하는 항체의 구조를 특징짓는 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 결합 도메인은 "항원-상호반응-자리"를 가리킨다.
본 발명의 목적 상 본 명세서에 설명된 바와 같은 모든 항체 및 항체의 유도체는 "항체"라는 용어에 의하여 포괄된다. 용어 "항체 유도체"란 항체의 임의의 변형된 형태, 예컨대 항체와 다른 약제 또는 항체, 또는 항체 단편과의 컨쥬게이트를 의미한다.
자연발생적인 항체들은 일반적으로 단일특이적이다. 즉 이들은 단일 항원에 결합한다. 본 발명은 표적 세포에 결합하는 (CLDN6에 연계되어) 항체 및 세포독성 세포(예컨대 CD3 수용체에 연계되어)와 같은 제2 엔터티를 포함한다. 본 발명의 항체는 이중특이적이거나 다중특이적, 예컨대 삼중특이적, 사중특이적일 수도 있다.
용어 "이중특이 분자"는 2개의 서로 다른 결합 특이성을 갖는 물질을 포함하도록 의도된다. 예를 들어, 이 분자는 (a) 세포 표면 항원 및 (b) 이펙터 세포 표면 상의 Fc 수용체와 같은 수용체에 결합하거나 이와 상호반응할 수 있다. 용어 "다중특이 분자"는 3개를 초과하는 서로 다른 결합 특이성을 갖는 물질을 포함하도록 의도된다. 예를 들어, 이 분자는 (a) 세포 표면 항원 및 (b) 이펙터 세포 표면 상의 Fc 수용체와 같은 수용체, 및 (c) 적어도 하나의 다른 성분에 결합하거나 이와 상호반응할 수 있다. 따라서, 용어 "CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체"는 CLDN6 및 예컨대 이펙터 세포 상의 Fc 수용체와 같은 기타 표적에 지향된, 이중특이, 삼중특이, 사중특이 및 기타 다중특이 분자를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 용어 "이중특이 항체"는 이중체(diabodies)들을 또한 포함한다. 이중체들은 2가의 이중특이 항체들로서 그의 VH 및 VL 도메인들이 단일 폴리펩타이드 사슬에 발현되지만, 같은 사슬 상에 두 개의 도메인들 사이에 짝을 이루도록 하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로 해서 이들 도메인들이 다른 사슬의 상보적 도메인들과 쌍을 이루어 2개의 항원 결합부를 생성할 수 있도록 하는 2가의 이중특이 항체들이다(예를 들어, Holliger, P., 외 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J., 외 (1994) Structure 2: 1121-1123 참고).
본 발명의 문맥 상, "CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체"는 좋기로는 본 명세서에 설명된 바와 같은 면역 이펙터 기능을 이끌어낼 수 있는 것이 바람직하다. 좋기로는, 상기 면역 이펙터 기능은 그 표면에 종양-관련 항원 CLDN6을 담지하는 암 줄기세포와 같은 세포에 지향된 것이 바람직하다.
본 발명의 문맥 상 용어 "면역 이펙터 기능"은 예컨대, 종양의 전파 및 전이 억제를 비롯한 종양 진행의 억제 및/또는 종양 성장의 억제를 야기하는 면역계의 성분들에 의해 매개되는 임의 기능을 포함한다. 좋기로는, 면역 이펙터 기능은 암 세포, 특히 암 줄기세포의 사멸을 야기하는 것이 바람직하다. 이러한 기능은 보체 의존성 세포독성 (CDC), 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC), 항체-의존성 세포-매개된 포식작용(ADCP), 종양-관련 항원을 지니는 세포들에 있어서의 세포자멸사 유도, 종양-관련 항원을 지니는 세포들의 세포용해, 및/또는 종양-관련 항원을 지니는 세포들의 증식 억제를 포함한다. 예를 들어, 항체들은 단지 암 세포 표면 상의 종양-관련 항원에 대해 결합함으로써 종양-관련 항원의 기능을 차단하거나 세포자멸사를 유도할 수 있다.
본 발명에 따라, 항체는 예컨대 독소 약물 모이어티, 특히 세포독소, 약물 (예컨대, 면역억제제) 또는 방사능동위원소와 같은 치료 모이어티 또는 치료제에 컨쥬게이트될 수도 있다. 세포독소 또는 세포독성 물질은 세포에 해롭거나 특히 세포를 살해시키는 모든 물질을 포함한다. 그 예로는 탁솔, 사이토칼라신 B(cytochalasin B), 그라미디신 D, 이티디움 브로마이드, 에메틴, 마이토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미토잔트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 아마니틴, 1-디히드록테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 그리고 퓨로마이신과 이것들의 유사체 또는 동족체 물질을 포함한다. 컨쥬게이트를 형성하기 위한 적절한 치료적 물질은, 이것에 제한되는 것은 아니지만, 항대사산물 (예컨대, 메토트렉세이트(methodtrexate), 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 플루다라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬레이팅 물질(예컨대, 메크로레타민, 티오에파, 클로람부실, 멜파란, 카르무스틴 (BSNU), 및 로무스틴(CCNU), 시클로포스파미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C 및 시스-디클로로디아민 플라티넘 (II) (DDP) 시스플라틴), 안트라시클린 (예컨대, 다우노루비신 (이전에 다우노마이신)) 및 독소루비신), 항생제 (예컨대, 닥티노마이신 (이전에 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신 및 안트라마이신 (AMC), 및 항-미토틱 물질 (예컨대, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)를 포함한다. 일 선호된 구체예에서, 치료제는 세포 독성 물질나 방사성 독성 물질이다. 다른 구체예예서, 치료제는 면역억제제이다. 또 다른 구체예에서, 치료제는 GM-CSF이다. 선호된 구체예에서, 치료제는 독소루비신, 시스플라틴, 블레오마이신, 황산염, 카르무스틴, 클로람부실, 시클로포스파미드 또는 리신 A이다. 본 발명에 따라 특히 바람직한 독소 약물 모이어티는 미세관 어셈블리를 억제하고 항증식 효과 및/또는 세포독성 효과를 갖는 화합물이다.
본 발명에서 특히 바람직한 것은 세포독소와 같은 치료 모이어티 또는 치료제에 컨쥬게이트되어, 암 줄기세포와 같은 서서히 자라거나 정적인 세포에 작용하는 항체이다. 이러한 치료 모이어티에는 mRNA 및/또는 단백질 합성에 작용하는 치료 모이어티가 포함된다. 몇몇 전사 저해제들이 알려져 있다. 예를 들어, 전사 저해제이면서 DNA 손상제인 악티노마이신 D는 DNA 내에 인터컬레이트하여 전사의 초기 단계를 억제한다. 플라보피리돌은 전사의 연장 단계를 표적으로 한다. α-아마니틴은 RNA 폴리머라제에 직접 결합하여, 개시 단계와 연장 단계 양자 모두를 억제한다.
항체는 또한 방사능동위원소, 예컨대 요오드-131, 이트륨-90 또는 인듐-111에 컨쥬게이션하여 세포독성 방사능 약물을 생성할 수도 있다.
본 발명의 항체 컨쥬게이트는 주어진 생물학적 반응을 주어진 생물학적 반응을 변형하는데 이용될 수 있으며, 약물 모이어티는 전통적인 화학요법제로 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 약물 모이어티는 소망되는 생물학적 활성을 갖는 펩타이드, 단백질 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 이러한 단백질들의 예로는 예컨대 효소적으로 활성적인 독소 또는 그의 활성 단편, 예컨대 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소 또는 디프테리아 독소; 종양괴사인자 또는 인터페론-γ와 같은 단백질; 또는 생물학적 반응 변형제 예컨대 림포카인, 인터류킨-1 ("IL-1"), 인터류킨-2 ("IL-2"), 인터류킨-6 ("IL-6"), 과립구 대식세포 집락자극인자("GM-CSF"), 과립구 집락 자극인자("G-CSF"), 또는 기타 성장인자를 들 수 있다. 본 발명에 따른 그 밖의 바람직한 약물 모이어티로는 커커민, 살리노마이신 및 설포라판을 들 수 있다.
이러한 치료적 모이어티를 항체에 컨쥬게이트시키는 기술은 잘 알려져 있다. 예를 들어 문헌들(Arnon 외, "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld 외(eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom 외, "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson 외 (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological 및 Clinical Applications, Pinchera외 (eds. ), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, 및 Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection 및 Therapy, Baldwin 외 (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), 및 Thorpe 외, "The Preparation 및 Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982))을 참조할 것.
바람직한 일 구체예에서, 본 발명에 따른 항체는 1 이상의 메이탄시노이드 분자에 컨쥬게이션된다.
메이탄시노이드는 유사분열시 세포의 증식을 억제하는 강력한 미세관-표적화 화합물이다. 메이탄시노이드는 염소화 벤젠 고리에 결합된 19-원 안사 마크롤라이드 구조인 메이탄신의 유도체이다. 메이탄신은 다음 구조식을 갖는다:
Figure pat00016
어떤 미생물들 역시도 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄시놀 및 C-3 메이탄시놀 에스테르를 생산하는 것으로 밝혀졌다(미국특허 No. 4,151,042). 합성 메이탄시놀 및 메이탄시놀 유사체가 예컨대 미국특허 Nos. 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,362,663; 및 4,371,533, 및 Kawai et al (1984) Chem. Pharm. Bull. 3441-3451을 통해 보고된 바 있으며 상기 문헌들은 모두 본원발명에 참고 병합되었다.
메이탄시노이드는 기술분야에 잘 알려져 있으며 공지 기술로 합성되거나 천연 원료로부터 분리될 수 있다. 본 발명에서 특히 바람직한 메이탄시노이드는 메이탄신의 티올-함유 유도체, 예컨대 DM1 및 DM4이다. 메이탄신의 이러한 티올-함유 유도체에는 카르보닐기에 결합된 메틸기가 -R-SH (여기서 R은 알킬렌기 또는 다른 탄소-함유기 원자를 나타냄)와 같은 유리 설프히드릴기를 함유하는 기에 의해 대체되어 있는 화합물이 포함된다.
메르탄신으로도 알려져 있는 DM1은 다음 화학식을 갖는 메이탄시노이드이다:
Figure pat00017
특히, 용어 "메르탄신" 또는 "DM1"은 화합물 N 2'-데아세틸-N 2'-(3-메르캅토-1-옥소프로필)-메이탄신을 가리킨다.
"DM4"는 화합물 N 2'-데아세틸-N 2'-(4-메틸-4-메르캅토-1-옥소펜틸)-메이탄신을 가리킨다.
항-CLDN6 항체-메이탄시노이드 컨쥬게이트는 항체나 메이탄시노이드 분자의 생물학적 활성을 유의적으로 저하시키지 않고 메이탄시노이드 분자에 항-CLDN6 항체를 화학적으로 연결시킴으로써 제조된다. 항체 분자 당 평균 3-4개의 메이탄시노이드 분자들이 컨쥬게이션되지만, 심지어 한 개의 독소/항체 조차도 네이키드 항체를 사용하는 것보다는 세포독성을 증강시킬 것으로 기대된다.
이와 관련하여, 용어 "적어도 하나의 독소 약물 모이어티에 공유결합된 항체"라는 용어에는 1 이상의 동일한 약물 분자가 항체 분자에 공유 결합된 것 뿐만 아니라 상이한 약물들이 항체 분자에 공유 결합된 상황도 포함된다. 후자의 상황에서는, 각각의 상이한 약물 분자 하나 이상이 항체 분자에 결합되거나 또는 그의 조합에 부착될 수 있을 것이다 (예컨대 하나의 약물의 하나의 분자가 다른 약물의 여러 분자에 결합됨).
본 발명의 몇몇 구체예에서, 항체는 돌라스타틴 또는 돌로스타틴 펩타이드 유사체 및 유도체, 아우리스타틴 (미국특허 Nos. 5,635,483; 5,780,588, 본 발명에 참조 병합됨)에 컨쥬게이트된다. 아우리스타틴은 돌로스타틴 10의 합성 유사체로서, 해양 연체동물인 Dolabela auricularia로부터 유도된 천연 생성물이다. 메이탄시노이드와 마찬가지로, 아우리스타틴도 미세관 파괴제이다. 돌라스타틴 또는 아우리스타틴 약물 모이어티는 펩타이드 약물 모이어티의 N (아미노) 말단 또는 C (카르복실) 말단을 통해 항체에 결합될 수 있다.
예시적인 아우리스타틴의 구체예로는 MMAE 및 MMAF와 같은 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티를 들 수 있으며 이들은 좋기로는 N-말단 결합되는 것이 바람직하다.
모노메틸 아우리스타틴 E로도 알려진 MMAE는 다음 화학식을 갖는다:
Figure pat00018
특히, 용어 "MMAE"는 화합물 (S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-히드록시-1-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N,3-디메틸-2-((S)-3-메틸-2-(메틸아미노)부탄아미도)부탄아미드를 가리킨다. MMAE는 실제로 데스메틸-아우리스타틴 E이며, 즉, N-말단 아미노기가 아우리스타틴 E 자체에서처럼 2개의 메틸 치환기 대신 오직 1개의 메틸 치환기만을 갖는다.
본 발명에서 특히 바람직한 것은 항체-vc아우리스타틴 컨쥬게이트 예컨대 항체-vcMMAE 컨쥬게이트이다. 본 발명에서, 용어 "항체-vc아우리스타틴" 또는 "vcMMAE"는 MMAE와 같은 아우리스타틴이 리포좀 절단가능한 디펩타이드, 발린-시트룰린(vc)를 통해 항체에 결합되어 있는 것을 포함하는, 항체-약물 컨쥬게이트(ADC)를 가리킨다.
모노메틸 아우리스타틴 F라고도 알려져 있는 MMAF는 화합물 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-디메틸-2-((S)-3-메틸-2-(메틸아미노)부탄아미도)부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산을 가리킨다.
항체-약물 컨쥬게이트를 만들기 위한 많은 연결기(linking groups)가 기술 분야에 알려져 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 항체는 이관능성 가교제를 통해 약물과 연결된다. 본 발명에서, "이관능성 가교제"라 함은 2개의 반응기를 갖되 그 중 하나는 한 항체와 반응할 수 있는 것이고 다른 하나는 상기 항체를 약물에 연결시켜 컨쥬게이트를 형성하기 위해 약물과 반응할 수 있는 것이다. 링커 시약이 약물의 유지, 예컨대 세포독성, 및 항체의 표적 특성을 유지하기만 한다면, 적절한 모든 이관능성 가교제가 본 발명에서 사용될 수 있다. 좋기로는, 링커 분자가 화학 분자를 통해 항체에 약물을 연결하여, 그 약물과 항체가 화학적으로 서로 커플링(예컨대 공유결합)되는 것이 바람직하다.
일 구체예에서, 이관능성 가교제는 비절단성 링커들을 포함한다. 비절단성 링커(a non-cleavable linker)는 메이탄시노이드와 같은 약물을 항체에 안정하고도 공유적인 방식으로 연결시킬 수 있는 여하한 모든 화학적 모이어티이다. 좋기로는, 비절단성 링커는 생리적 조건, 특히 세포 내부에서는 분해되지 않는 것이 바람직하다. 따라서, 비절단성 링커는 그 약물이나 항체가 활성을 유지하는 조건에서 실제로 산-유도 분해, 광-유도된 분해, 펩티다제-유도된 분해, 에스테라제-유도된 분해 및 디설파이드 결합 분해에 대해 실제로 내성을 갖는다. 약물과 항체 사이에 비절단성 링커를 형성하는 적절한 가교제는 기술분야에 잘 알려져 있다. 일 구체예에서, 약물은 티오에테르 결합을 통해 항체에 연결되어 있다. 비절단성 링커의 예로는 메이탄시노이드의 설프히드릴기와 같은 약물과의 반응을 위해 말레이미도- 또는 할로아세틸-기반 모이어티를 갖는 링커를 들 수 있다. 이러한 이관능성 가교제는 기술분야에 잘 알려져 있으며 이의 비제한적인 예로는, N-숙신이미딜 4-(말레이미도메틸)시클로헥산카르복실레이트 (SMCC) 및 SMCC의 "장쇄(long chain)" 유사체 (LC-SMCC)인 N-숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)-시클로헥산-1-카르복시-(6-아미도카프로에이트)를 들 수 있다. 좋기로는, 이관능성 가교제는 SMCC인 것이 바람직하다. 이러한 링커를 이용하여, 메르탄신과 같은 약물을 4-(3-메르캅토-2,5-디옥소-1-피롤리디닐메틸)-시클로헥산카르복실산을 경유하여, 항체의 리신 잔기의 유리 NH2기와 같은 아미노기에 결합시킬 수 있다. 각각의 항체 약물 컨쥬게이트 분자는 메르탄신의 몇몇 분자들에 결합된 단일 항체 분자를 포함할 수 있다.
하나의 특히 바람직한 구체예에서, 링크 시약은 절단가능한 링커이다. 좋기로는, 절단가능한 링커는 생리적 조건, 특히 세포 내부에서 절단가능한 것이 바람직하다. 적절한 절단가능하나 링커의 예로는 디설파이드 링커, 산 불안정성 링커, 광불안정성 링커, 펩티다제 불안정성 링커 및 에스테라제 불안정성 링커를 들 수 있다. 디설파이드 함유 링커는 디설파이드 교환을 통해 절단가능한 링커로서, 생리적 조건 하에서 발생할 수 있다. 산 불안정성 링커는 산성 pH에서 절단가능한 링커이다. 예컨대, 엔도좀 및 리소좀과 같은 어떤 세포내 구획들은 산성 pH(pH 4-5)를 가지며, 산에 불안정상 링커를 절단하는데 적합한 조건을 제공한다. 광불안정성 링커는 빛이 닿을 수 있는 체표면과 많은 체강에서 유용하다. 뿐만 아니라, 적외선은 조직을 침투할 수 있다. 펩티다제 불안정성 링커는 어떤 펩티다제를 세포 내부나 외부에서 절단하는데 이용될 수 있다. 일 구체예에서, 절단가능한 링커는 온화한 조건, 즉 세포독성제의 활성이 영향을 받지않는 세포내 조건에서 절단된다.
특히 바람직한 일 구체예에서, 링커는 디펩타이드 발린(Val) - 시트룰린 (Cit) (vc)으로 구성되거나 이를 포함하며, 종양 세포 내부의 카텝신에 의해 절단되는 링커이다.
본 발명에 따라, 용어 "암 줄기세포에 지향된 암 치료제"는 암 줄기세포를 표적으로 하여 좋기로는 이를 살해 및/또는 암 줄기세포의 증식 또는 생존능에 손상을 입힐 수 있는 모든 치료제를 의미한다. 이러한 치료제에는 i) 예컨대 CLDN6과 같이, 암 줄기세포 상의 특정 세포 표면 표적을 표적화하는 치료 부분에 컨쥬게이트되거나 또는 네이키드인 항체, 항체 단편 및 단백질 (예컨대 전술한 바와 같은 CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체 또는 항체 컨쥬게이트) 또는 ii) 암 줄기세포의 증식 또는 생존능을 손상시키는 소분자가 포함된다. 특정 구체예에서, 이러한 물질은 정상 줄기세포에 비해 암 줄기세포 상에서 더 높은 수준으로 발현되는 항원에 결합한다. 특정 구체예에서, 이러한 물질은 암 줄기세포 항원에 특이적으로 결합한다.
본 발명에서 "결합(binding)"이라는 용어는 좋기로는 특이적 결합에 관한 것이다.
본 발명에서, 만일 항체가 표준 분석법에 의할 때 소정의 표적에 대해 유의적인 친화도를 가지고 상기 소정의 표적과 결합한다면 상기 항체는 상기 소정의 표적에 결합할 능력이 있는 것이다. "친화도" 또는 "결합 친화도"는 평형 해리 상수(KD)에 의하여 종종 측정된다. 바람직하게는, 용어 "유의적인 친화도"란 10-5 M 또는 그 미만, 10-6 M 또는 그 미만, 10-7 M 또는 그 미만, 10-8 M 또는 그 미만, 10-9 M 또는 그 미만, 10-10 M 또는 그 미만, 10-11 M 또는 그 미만, 또는 10-12 M 또는 그 미만의 해리 상수(KD) 값으로 소정의 표적에 결합하는 것을 의미한다.
만일 항체가 상기 표적에 대해 유의적인 친화도를 가지지 않고, 표준 분석에서 상기 표적에 유의적으로 결합하지 않는다면, 그 항체는 상기 표적에 결합할 능력이 (실질적으로) 없는 것이다. 좋기로는, 항체가 최대 2, 좋기로는 최대 10, 더욱 좋기로는 최대 20, 특히 최대 50 또는 100 ㎍/ml 또는 그 이상의 농도로 존재하면, 그 항체는 상기 표적과 검출가능할 정도로 결합하는 것이 아니다. 좋기로는, 만일 항체가 결합할 능력이 있는 소정의 표적에 대한 결합 KD에 비해 KD값이 적어도 10배, 100배, 103배, 104배, 105배, 또는 106배 더 높게 상기 표적과 결합한다면 그 항체는 상기 표적에 대해 유의적인 친화도를 갖는 것이 아니다. 예컨대, 만일 항체가 결합 가능한 표적에 대한 항체의 결합 KD값이 10-7 M이면, 그 항체가 유의적인 친화도를 갖지 않는 표적에 대한 결합 KD는 적어도 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, 10-3 M, 10-2 M, 또는 10-1 M이 될 것이다.
어느 항체가 다른 표적에는 결합할 수 없는 것, 즉 다른 표적에는 유의적인 친화도를 가지지 않고, 표준 분석에서 다른 표적에는 유의적으로 결합하지 않는 것인 반면에, 소정의 표적에는 결합할 수 있는 것이라면, 그 항체는 상기 소정의 표적에 특이적인 것이다. 본 발명에 따를 때, 어느 항체가 CLDN6에 대해서는 결합할 수 있지만, 다른 표적에는 결합할 수 없는 것이라면, 그 항체는 CLDN6에 특이적인 것이다. 좋기로는, 그러한 다른 표적에 대한 친화도 및 결합이, 소 혈청 알부민(BSA), 카세인, 인간 혈청 알부민(HSA)과 같은 클라우딘과 관계없는 단백질에 대한 친화도 또는 결합, 또는 MHC 분자 또는 트랜스페린 수용체와 같은 비클라우딘 막투과 단백질, 또는 다른 특정 폴리펩타이드에 대한 친화도 또는 결합을 유의적으로 능가하는 것이 아니라면, 상기 항체는 CLDN6에 대하여 특이적인 것이다. 좋기로는 어느 항체가 특이적이지 않은 표적에의 결합을 위한 KD 값보다 적어도 10-배, 100-배, 103-배, 104-배, 105-배, 또는 106-배 더 낮은 KD 값을 가지고 소정의 표적에 결합한다면, 그 항체는 상기 표적에 대하여 특이적인 것이다. 예를 들어 어느 항체가 그것이 특이적인 표적에 결합하기 위한 KD 값이 10-7 M인 경우, 그것이 특이적이지 않은 표적에 결합하기 위한 KD 값은 적어도 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, 10-3 M, 10-2 M, 또는 10-1 M일 것이다.
항체의 표적에 대한 결합은 임의의 적절한 방법을 사용하여 실험적으로 결정될 수 있는데, 예를 들어 논문(Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman 및 Company New York, N Y (1992)) 및 본 명세서에 기술된 방법을 참조할 것. 평형투석의 사용; 제조사에 의해 개괄된 일반적 절차를 사용하는 BIAcore 2000 기구의 사용; 방사능 표지된 표적 항원을 사용하는 방사능 면역 분석법에 의하여; 또는 숙련된 기술자에게 알려진 또 다른 방법에 의하는 것과 같은 통상적인 기법을 사용하여 친화도를 손쉽게 결정할 수 있다. 친화도 데이터는 예를 들어 논문(Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. ScL, 51:660 (1949))의 방법에 의하여 분석될 수 있다. 만일 다른 조건(예컨대 염 농도, pH)에서 측정된다면, 특정 항체-항원 결합의 측정된 친화도는 변할 수 있다. 따라서, 친화도 및 KD, IC50와 같은 다른 항원-결합 파라미터의 측정은 표준화된 항체 및 항원 용액 및 표준화된 완충액을 사용하여 이루어지는 것이 바람직하다.
본 발명에서, "아이소타입(isotype)"이라 함은 중쇄 불변부 유전자들에 의해 코딩되는 항체 클래스(예컨대, IgM 또는 IgG1)를 나타낸다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "아이소타입 스위칭(switching)"은 항체들의 클래스 또는 아이소타입이 하나의 Ig 클래스로부터 다른 Ig 클래스들 중 하나까지로 변화하는 것에 의한 현상을 나타낸다.
목적에서 적용된 바와 같이, 본 발명에서 사용된 바와 같은, "자연적으로 일어나는"이라는 용어는 목적을 자연에서 찾을 수 있는 사실을 나타낸다. 예컨대, 자연에서 소스로부터 분리될 수 있고, 실험실에서 사람에 의해 의도적으로 변형되지 않은 유기체 (바이러스들을 포함)에 존재하는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 자연적으로 일어난다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "재배열된(rearranged)"라는 용어는 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린 로커스(locus)의 배열을 나타내는 것으로, V 세그먼트는 필수적으로 완전한 VH 또는 VL 도메인을 코딩하는 구조에서 D-J 또는 J 세그먼트에 즉시 인접하여 위치된다. 재배열된 면역글로불린 (항체) 유전자 로커스는 생식세포(germline) DNA와 비교에 의해 확인될 수 있다; 재배열된 로커스는 적어도 하나의 재조합된 헵타머/나노머 상동성 요소를 가질 것이다.
V 세그먼트와 관련하여 본 명세서에서 사용된 "비재배열된(unrearranged)" 또는 "생식세포(germline) 배열"이라는 용어는 V 세그먼트가 재조합되지 않아 D 또는 J 세그먼트에 직접적으로 인접되어 있는 배열을 가리킨다.
좋기로는, CLDN6을 발현하는 세포에 CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체가 결합하면 CLDN6을 발현하는 세포의 살해가 유도되거나 매개된다. CLDN6을 발현하는 세포는 좋기로는 암 줄기세포이며 특히, 본 명세서에 설명된 암 질환의 세포 예컨대 난소암의 암 줄기세포인 것이 좋다. 좋기로는, 좋기로는, 세포의 ADCC 매개형 용해는, 특정 구체예에서 단핵구, 단핵구 세포, NK 세포 및 PMNs로 이루어지는 군으로부터 선택되는 이펙터 세포의 존재 하에 일어나는 것이 바람직하다. 세포의 증식 억제는 브로모데옥시우리딘(5-브로모-2-데옥시우리딘, BrdU)을 이용하는 분석에서 세포의 증식을 탐지함으로써 시험관내 측정가능하다. BrdU는 티미딘의 유사체인 합성 뉴클레오사이드로서 복제중인 세포(세포 주기의 S 페이즈 동안)의 새롭게 합성된 DNA내로 병합되어, DNA 복제가 일어나는 동안 티미딘을 대체할 수 있다. 예컨대 BrdU에 특이적인 항체들을 이용하여, 병합된 화학물질을 탐지함으로써, 그들의 DNA를 활발하게 복제하는 세포들을 찾아낼 수 있다.
바람직한 구체에에서, 본 발명에 설명된 항체들은 다음 특성들 중 한 가지 이상에 의해 특징지어질 수 있다:
a) CLDN6에 대한 특이성;
b) CLDN6 of 약 100 nM 이하, 좋기로는, 약 5-10 nM 이하 및, 더욱 좋기로는, 약 1-3 nM 이하의 CLDN6에 대한 결합 특이성,
c) CLDN6 양성 세포에 대한 CDC를 유도하거나 매개하는 능력;
d) CLDN6 양성 세포에 대한 ADCC를 유도하거나 매개하는 능력;
e) CLDN6 양성 세포의 성장을 억제하는 능력;
f) CLDN6 양성 세포의 세포자멸사를 유도하는 능력.
일 구체예에서, CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체는 CLDN6에 존재하는 에피토프, 좋기로는 CLDN6의 세포외 도메인 내에 위치하는 에피토프, 특히 제1 세포외 루프, 좋기로는 CLDN6의 아미노산 위치 28 내지 76, 좋기로는 CLDN6의 아미노산 위치 141 내지 159에 결합하는 능력을 갖는다. 특정 구체예에서, CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체는 CLDN9에는 존재하지 않는, CLDN6 상의 에피토프에 결합한다. 좋기로는, CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체는 CLDN4 및/또는 CLDN3 상에 존재하지 않는, CLDN6 상의 에피토프에 결합하는 것이 바람직하다. 가장 좋기로는, CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체는 CLDN6 이외의 다른 CLDN 단백질에 존재하지 않는, CLDN6 상의 에피토프에 결합하는 것이 바람직하다.
CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체는 좋기로는 CLDN6에는 결합하지만 CLDN9에 결합하지 않고 좋기로는 CLDN4 및/또는 CLDN3에 결합하지 않는 것이 바람직하다. 좋기로는, CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체는 CLDN6에 특이적인 것이 바람직하다. 좋기로는, CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체는 세포 표면 상에 발현된 CLDN6에 결합하는 것이 바람직하다. 특히 바람직한 구체예에서, CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체는 살아있는 세포 표면에 존재하는 CLDN6의 본래의 에피토프에 결합하는 것이 좋다.
바람직한 일 구체예에서, CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체는 SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 및 그의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부(VH)를 포함하는 것이 좋다.
바람직한 일 구체예에서, CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체는 SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 11, 12, 및 그의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부 (VL)를 포함하는 것이 좋다.
바람직한 특정 구체예에서, CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체는 다음 (i) 내지(vii)의 가능성으로부터 선택되는, 중쇄 가변부 (VH)와 경쇄 가변부 (VL)과의 조합을 포함한다:
(i) VH는 SEQ ID NO: 3으로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 4로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(ii) VH는 SEQ ID NO: 5로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 6으로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(iii) VH는 SEQ ID NO: 7로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 8로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(iv) VH는 SEQ ID NO: 9로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 10으로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(v) VH는 SEQ ID NO: 5로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 4로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(vi) VH는 SEQ ID NO: 5로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 11로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(vii) VH는 SEQ ID NO: 5로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 12로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함.
특히 바람직한 구체예에서, CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체는 다음의 중쇄 가변부 (VH)와 경쇄 가변부 (VL)와의 조합을 포함한다:
VH는 SEQ ID NO: 5로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 VL은 SEQ ID NO: 4로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함한다.
용어 "단편"이라 함은, 특히, 하나 이상의 상보성-결정 영역(CDR), 좋기로는중쇄 가변부 (VH)의 CDR3 가변부 및/또는 경쇄 가변부 (VL)의 CDR3 가변부를 가리킨다. 일 구체예에서 상기 하나 이상의 상보성-결정 영역 (CDRs)은 상보성-결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3의 세트로부터 선택된다. 특히 바람직한 구체예에서, 용어 "단편"이라 함은 CDR1, CDR2 및 CDR3 of the 중쇄 가변부 (VH)의 상보성-결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 및/또는 경쇄 가변부 (VL)의 상보성-결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 가리킨다.
일 구체예에서 본 발명에 설명된 바와 같은 하나 이상의 CDRs, CDRs 세트 또는 CDRs 세트의 조합을 포함하는 항체는 상기 CDRs 및 그들의 개재(intervening) 프레임워크 부분을 함께 포함한다. 좋기로는 상기 부분은 또한 제1 및 제4 프레임워크 부분 중 어느 일방 또는 양방을 적어도 약 50% 포함하며, 이 50%는 제1 프레임워크 부분의 C-말단 50%와 제4 프레임워크 부분의 N-말단 50%이다. 재조합 DNA 기술에 의해 만들어진 항체의 구조는, 면역글로불린 중쇄, 기타 가변부(예컨대 다이아바디 제조시) 또는 단백질 표지를 비롯한 추가 단백질 서열에 본 발명의 가변부를 결합시키기 위해 링커를 도입하는 것을 비롯하여, 클로닝 또는 기타 조작 단계를 용이하게 수행하도록 도입되는 링커에 의해 코딩된 가변부의 N-말단 또는 C-말단 잔기가 도입되도록 할 수 있다.
일 구체예에서 본 발명에 설명된 하나 이상의 CDRs, CDRs 세트 또는 CDR 세트들의 조합은 인간 항체 프레임워크 내의 상기 CDRs을 포함한다.
본 발명에서 항체가 중쇄와 관련하여 특정 사슬 또는 특정 부분 또는 서열을 포함하는 경우 좋기로는 상기 항체의 모든 중쇄들이 상기 사슬, 부분 또는 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 이것은 항체의 경쇄에도 마찬가지로 적용된다.
본 발명에 설명된 결합제는 항체를 인코딩하는 RNA와 같은 핵산을 포함하는 숙주 세포를 투여함으로써 및/또는 항체를 인코딩하는 RNA 와 같은 핵산을 투여함으로서 환자에게 전달될 수 있다. 따라서, 환자에게 투여될 때 항체를 인코딩하는 핵산은 리포좀 또는 바이러스 입자 형태와 같은 적절한 전달 비히클 내에 네이키드 형태로 또는 숙주 세포 내에 존재할 수 있다. 제공된 핵산은 치료 항체들, 특히 이중특이 항체들의 경우 적어도 부분적으로 관찰된 불안정성을 완화하는 지속적 방식으로 장기간에 걸쳐 항체를 생산할 수 있다. 환자에게 전달될 핵산은 재조합 방식으로 제조될 수 있다. 만일 핵산이 숙주 세포에 제시되지 않은 채로 환자에게 투여되면, 좋기로는 그 핵산에 의해 인코딩되는 항체 발현을 위해 환자 세포에 의해 취해지는 것이 좋다. 만일 핵산이 숙주 세포 내에 제시되어 환자에게 투여되는 경우에는, 그 핵산에 의해 인코딩되는 항체 발현을 위해 환자 내의 숙주 세포에 의해 발현되는 것이 좋다.
본 발명에서 용어 "핵산"은 재조합적으로 생산되고 화학적으로 합성된 분자들, 게놈 DNA, cDNA, mRNA와 같은 DNA 및 RNA를 포함하는 것으로 의도된다. 핵산은 단일-사슬 또는 이중-사슬일 수 있다. RNA는 시험관내 전사된 RNA(IVT RNA) 또는 합성 RNA를 포함한다.
핵산은 벡터 내에 포함될 수 있다. 본 발명에서 용어 "벡터"는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 예컨대 λ 파지와 같은 파지 벡터, 예컨대 아데노바이러스 벡터 또는 배큘로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터, 또는 세균 인공 염색체(BAC), 효모 인공 염색체(YAC) 또는 P1 인공 염색체(PAC)와 같은 인공 염색체 벡터를 비롯하여, 통상의 기술자에게 잘 알려진 여하한 벡터를 모두 포함한다. 상기 벡터에는 클로닝 벡터와 같은 발현 벡터도 포함된다. 발현 벡터는 플라스미드 벡터 및 바이러스 벡터를 포함하며 일반적으로 특정 숙주 생명체(예컨대 세균, 효모, 식물, 곤충 또는 포유동물) 또는 시험관내 발현 시스템에서 작동적으로 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 요구되는 코딩 서열 및 적절한 DNA 서열들을 일반적으로 함유한다. 클로닝 벡터는 일반적으로 어떤 소망되는 DNA 단편을 조작 및 증폭하는데 사용되며 소망되는 DNA 단편의 발현에 요구되는 기능적 서열들을 결여할 수 있다.
본 발명의 문맥 상, 용어 "RNA"는 리보뉴클레오타이드 잔기들을 포함하고 좋기로는 전적으로 또는 실제로 리보뉴클레오타이드 잔기들로 이루어진 분자에 관한 것이다. "리보뉴클레오타이드"는 β-D-리보퓨라노실기의 2'-위치에 히드록실기를 갖는 뉴클레오타이드에 관한다. 이 용어에는 이중사슬 RNA 단일사슬 RNA, 분리된 RNA 예컨대 부분 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 재조합 생산된 RNA 및 하나 이상의 뉴클레오타이드의 부가, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 자연발생적인 RNA와 차이가 나는 변형된 RNA가 포괄된다. 이러한 변경에는 비뉴클레오타이드 물질의 예컨대 RNA의 말단(들)에 대한 또는 내부에로의 부가, 예컨대 RNA의 하나 이상의 뉴클레오타이드에서의 부가가 포함될 수 있다. RNA 분자 중의 뉴클레오타이드는 또한 비표준 뉴클레오타이드, 예컨대 비자연발생적인 뉴클레오타이드 또는 화학합성된 뉴클레오타이드 또는 데옥시뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 이들 변경된 RNA는 유사체 또는 자연발생적인 RNA의 유사체라 칭할 수 있다.
본 발명에 따라, 용어 "RNA"에는 "메신저 RNA"를 의미하며 주형으로서 DNA를 이용하여 생산가능하고 펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 "mRNA"가 포함되며 좋기로는 이에 관한 것이다. mRNA는 일반적으로 5' 비번역 영역(5'-UTR), 단백질 또는 펩타이드 코딩 영역 및 3' 비번역 영역(3'-UTR)을 포함한다. mRNA는 세포내 및 시험관 내에서 제한된 반감기를 갖는다. 좋기로는, mRNA는 DNA 주형을 이용하여 시험관내 전사에 의해 생산되는 것이 바람직하다. 본 발명의 일 구체예에서, RNA는 시험관내 전사 또는 화학 합성에 의해 수득된다. 시험관내 전사 방법론은 통상의 기술자에게 공지이다. 예를 들어, 다양한 종류의 시험관내 전사 키트가 시판되고 있다.
본 발명의 일 구체예에서, RNA는 예컨대 단일 사슬 자가-복제 RNA와 같은 자가-복제 RNA이다. 일 구체예에서, 자가-복제 RNA는 포지티브 센스의 단일 사슬 RNA이다. 일 구체예에서, 자가-복제 RNA는 바이러스성 RNA이거나 또는 바이러스 RNA로부터 유도된 RNA이다. 일 구체예에서, 자가-복제 RNA는 알파바이러스 게놈 RNA이거나 알파바이러스 게놈 RNA로부터 유도된다. 일 구체예에서, 자가-복제 RNA는 바이러스 유전자 발현 벡터이다. 일 구체예에서, 바이러스는 셈리키 포레스트 바이러스(Semliki forest virus)이다. 일 구체예에서, 자가-복제 RNA는 하나 이상의 트랜스유전자를 함유하며 상기 트랜스유전자들 중 적어도 하나는 본 발명에 설명된 항체를 인코딩하는 것이다. 일 구체예에서, 만일 RNA가 바이러스 RNA이거나 또는 바이러스 RNA로부터 유도된 경우, 트랜스유전자는 예컨대 구조 단백질을 코딩하는 qkldfjtm 서열들과 같은 바이러스 서열들을 부분적으로 또는 전적으로 대체할 수 있다. 일 구체예에서, 자가-복제 RNA는 시험관내 전사된 RNA이다.
알파바이러스의 게놈은 큰 폴리단백질의 2개의 오픈 리딩 프레임(ORF)를 인코딩하는 포지티브 센스의 단일사슬 RNA(ssRNA(+))이다. 게놈의 5'-말단의 ORF는 비구조 단백질들인 nSP1 내지 nSP4 (nsP1-4)를 인코딩하는데, 이들은 번역되어 RNA-의존성 RNA-폴리머라제(레플리카제)로 프로세싱되고; 3'-말단의 ORA는 구조 단백질 - 캡시드 및 당단백질들을 인코딩한다. 두 가지 ORF 모두 구조 ORF의 전사를 지배하는 소위 서브게놈 프로모터(SGP)에 의해 이격되어 있다. 유전자 벡터로 이용될 경우, 구조 SGP 뒤의 단백질들은 흔히 트랜스유전자에 의해 대체된다. 이러한 벡터들을 바이러스 입자들 내로 패키지하기 위해, 구조 단백질들은 흔히 헬퍼 구조물들로부터 트랜스 발현된다. 알파바이러스들은 RNA 수준에서 감염된 세포들의 세포질에서만 복제된다. 감염 후, ssRNA(+) 게놈은 nsP1234 폴리-단백질 전구체의 번역을 위한 mRNA로서 작용하는데, 상기 전구체는 바이러스 생명 주기의 초기 단계에서 자가단백질분해적으로 프로세싱되어 단편 nsP123 및 nsP4로 된다. 단편 nsP123 및 nsP4는 (-) 가닥 레플리카제 복합체를 형성하고 이것은 (-)가닥 RNA를 게놈 RNA 주형으로부터 전사한다. 후기 단계에서, nsP1234 폴리단백질은 단일 단백질들로 완벽하게 절단되어 구조 단백질 또는 트랜스유전자를 코딩하는 새로운 (+) 가닥 게놈 및 서브게놈 전사체를 합성하는 (+) 가닥 레플리카제 복합체로 어셈블된다. 서브게놈 RNA와 새로운 게놈 RNA는 캡핑 및 폴리아데닐화되고 그에 따라 표적 세포들 감염 후 mRNA로서 인식된다. 오직 새로운 게놈 RNA만이 패키징 시그널을 함유함으로 해서 게놈 RNA만을 발아 비리온 내로 패키징시키게끔 한다. 벡터학에 있어서 알파바이러스 레플리콘의 매력은 캡핑되어 폴리아데닐화된 RNA 게놈의 포지티브 배향에 기초한다. 번역가능한 레플리콘 RNA는 시험관내에서 용이하게 합성가능하므로, 캡핑은 시험관내 전사 반응에 부가된 캡-유사체에 의해 달성될 수 있고 poly-A 테일은 플라스미드 주형 상에 poly-T 트랙으로서 코딩될 수 있다. 시험관내 전사된(IVT) 레플리콘들은 통상적인 트랜스펙션 기술에 의해 트랜스펙션되어 심지어 적은 양의 출발 IVT RNA가 급속히 배가된다. 전달 후 수시간 이내에, SGP의 하류에 위치한 트랜스유전자들은 세포 당 서브게놈 RNA 약 40,000 내지 200,000 카피의 매우 높은 카피 수로 전사되므로, 재조합 단백질들이 강력하게 발현되는 것은 놀라운 일이 아니다. 특정 목적에 따라, IVT 레플리콘들은 표적 세포 내로 직접 트랜스펙션되거나 또는 트랜스 내에서 구조 유전자를 제공하는 헬퍼 벡터와 함께 알파바이러스 입자 내로 패키징될 수 있다. 피부나 근육 내로의 전달은 고도의 지속적인 국소 발현을 야기하며 체액성 및 세포성 면역반응의 강력한 유도가 수반된다.
본 발명에 사용된 RNA의 발현 및/또는 안정성을 증가시키기 위해, 좋기로는 발현된 펩타이드 또는 단백질의 서열을 변경함이 없이 이를 변형시킬 수 있다.
본 발명에서 RNA와 관련한 용어 "변형(modification)"은 상기 RNA에 자연적으로 존재하지 않는 RNA의 임의의 변형을 모두 포괄한다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에서 사용된 RNA는 캡핑되지 않은 5'-트리포스페이트를 갖지 않는다. 이러한 캡핑되지 않은 5'-트리포스페이트의 제거는 RNA를 포스파타제로 처리함으로써 달성가능하다.
본 발명에 따른 RNA는 그의 안정성을 증가시키고 및/또는 세포독성을 감소시키기 위해 자연발생적인 또는 합성 리보뉴클레오타이드로 변형될 수 있다. 예를 들어, 일 구체예에서, 본 발명에서 사용된 RNA에서 5-메틸시티딘이 부분적으로 또는 완전히, 좋기로는 완전히 시티딘을 대신할 수 있다. 별법으로 또는 부가적으로, 일 구체예에서, 본 발명에서 사용된 RNA에서 슈도우리딘이 부분적으로 또는 전적으로, 좋기로는 전적으로 우리딘을 대신하는 것이 바람직하다.
일 구체예에서, 용어 "변형(modification)"은 RNA에 5'-캡 또는 5'-캡 유사체를 제공하는 것에 관한다. 용어 "5'-캡"은 mRNA 분자의 5'-말단에서 발견되는 캡 구조를 가리키며 일반적으로 흔치 않은 5'에서 5'로의 트리포스페이트 결합을 통해 mRNA에 연결된 구아노신 뉴클레오타이드로 이루어져 있다. 일 구체예에서, 이 구아노신은 7-위치에서 메틸화된다. 용어 "통상적인 5'-캡"은 자연발생적인 RNA 5'-캡, 좋기로는 7-메틸구아노신 캡(m7G)을 칭한다. 본 발명의 문맥 상, 용어 "5'-캡"에는 RNA 캡 구조와 유사하고 RNA에 결합될 경우, 좋기로는 생체내 및/또는 세포내에서 RNA를 안정화시키는 능력을 갖도록 변형된 5'-캡 유사체가 포함된다.
RNA에 5'-캡 또는 5'-캡 유사체를 제공하는 것은 상기 5'-캡 또는 5'-캡 유사체의 존재 하에 DNA 주형의 시험관내 전사에 의해 달성될 수 있는데, 여기서 상기 5'-캡은 생성된 RNA 가닥 내로 공-전사적으로 혼입되거나 RNA가 예컨대 시험관내 전사에 의해 생성되고, 5'-캡이 캡핑 효소, 예컨대 백시니아 바이러스의 캡핑 효소를 이용하여 RNA에 후전사적으로 결합될 수 있다.
RNA는 추가 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 사용된 RNA의 추가 변형에는 자연발생적인 폴리(A) 테일의 연장 또는 트렁케이션이거나 또는 5'- 또는 3'-미번역 영역 (UTR)의 변형 에컨대 상기 RNA의 코딩 영역에 관련되지 않은 UTR의 도입, 예를 들어 알파2-글로빈, 알파1-글로빈, β-글로빈, 좋기로는 β-글로빈, 더욱 좋기로는 인간 β-글로빈과 같은 글로빈 유전자로부터 유도된 3'-UTR의 하나 이상의 카피 좋기로는 2개의 카피의 삽입이 포함된다.
따라서, 본 발명에 따라 사용된 RNA의 안정성 및/또는 발현 증가를 위해서, 좋기로는 길이가 10 내지 500, 더욱 좋기로는 30 내지 300, 더더욱 좋기로는 65 내지 200 및 특히 100 내지 150개의 아데노신 잔기를 갖는, 폴리-A 서열과 함께 존재하도록 변형될 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 폴리-A 서열은 약 120 아데노신 잔기의 길이를 갖는다. 이에 더해, 2개 이상의 RNA 분자의 3'-비번역 영역(UTR)의 3'-비번역 영역 내로의 혼입은 번역 효율성을 향상시킬 수 있다. 특정한 일 구체예에서 3'-UTR은 인간 β-글로빈 유전자로부터 유도된다.
좋기로는, RNA가 세포 특히 생체내 존재하는 세포 내로 전달, 즉 트랜스펙션될 경우, 그것이 인코딩하는 단백질 또는 펩타이드를 발현하는 것이 바람직하다.
용어 "트랜스펙션"은 핵산, 특히 RNA의 세포 내로의 도입에 관한 것이다. 본 발명의 목적 상, 용어 "트랜스펙션"은 또한 핵산의 세포 내로의 도입 또는 그러한 세포에 의한 핵산의 흡수를 포괄하며, 이 때 상기 세포는 대상자, 예컨대 환자 내에 존재하는 것일 수 있다. 따라서, 본 발명에 있어서, 본 발명에 설명된 핵산의 트랜스펙션을 위한 세포는 시험관내 또는 생체내 존재할 수 있으며, 예컨대 이러한 세포는 환자의 장기, 조직 및/또는 조직의 일부를 구성할 수 있다. 본 발명에 따라, 트랜스펙션은 일시적이거나 안정적일 수 있다. 트랜스펙션의 몇 가지 적용예에서, 트랜스펙션된 유전 물질이 일시적으로 발현되기만 해도, 충분하다. 트랜스펙션 과정에서 도입된 핵산은 대개 핵 게놈 내로 통합되지 않으므로, 외래 핵산은 세포유사분열을 통해 희석되거나 분해될 것이다. 핵산의 에피좀 증폭을 허여하는 세포들은 희석비율을 크게 감소시킨다. 만일 트랜스펙션된 핵산이 세포 및 그의 딸 세포들의 게놈 내에 실제로 남아있는 것이 요구될 경우, 안정한 트랜스펙션이 일어나야 한다. RNA는 그의 코딩된 단백질을 일시적으로 발현하기 위해 세포 내로 트랜스펙션될 수 있다.
용어 RNA의 "안정성"은 RNA의 "반감기"에 관한 것이다. "반감기"는 분자의 활성, 양 또는 갯수의 절반을 제거하는데 필요한 기간이다. 본 발명의 문맥 상, RNA의 반감기는 상기 RNA의 안정성의 지표이다. RNA의 반감기는 그 RNA의 "발현 기간"에 영향을 미칠 수 있다. 수명이 긴 RNA는 장기간 발현될 것으로 기대할 수 있다.
본 발명의 문맥 상, 용어 "전사"는 DNA 서열의 유전자 코드가 RNA로 전사되는 프로세스에 관한 것이다. 후속적으로, RNA는 단백질로 번역될 수 있다. 보노 발명에 있어서, 용어 "전사"는 "시험관내 전사"를 포함하는데, 상기 용어 "시험관내 전사"는 RNA, 특히 mRNA가 무세포 시스템에서, 좋기로는 적절한 세포 추출물을 이용하여 시험관내 합성되는 프로세스에 관한 것이다. 좋기로는, 전사체 생성에 클로닝 벡터가 응용되는 것이 바람직하다. 이들 클로닝 벡터들은 일반적으로 전사 벡터로서 설계되며 용어 "벡터"에 의해 포괄되는 본 발명에 따른 것들이다.
본 발명에서 용어 "번역"은 메신저 RNA의 한 가닥이 아미노산 서열의 어셈블리를 지시하여 펩타이드 또는 단백질을 만들어내는, 세포의 리보좀 내에서 일어나는 프로세스에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "발현"은 가장 일반적인 의미로, RNA 및/또는 펩타이드 또는 단백질의 예컨대 전사 및/또는 번역에 의한 생산을 포함한다. RNA의 경우, 용어 "발현" 또는 "번역"은 특히 펩타이드 또는 단백질의 생산에 관한 것이다. 이것은 또한 헥산의 부분적 발현을 포함하기도 한다. 뿐만 아니라, 발현은 일시적 또는 안정적일 수 있다. 본 발명에 따라, 용어 발현에는 또한 "비정상 발현" 또는 "이상성 발현"도 포함된다.
본 발명에서 "비정상 발현" 또는 "이상 발현"이라 함은 발현이 변경되는 것, 좋기로는 레퍼런스, 예컨대 어떤 단백질, 예컨대 종양 항원의 비정상 또는 이상 발현과 연관된 질병이 없는 대상자의 상태와 같은 레퍼런스에 비해 증가된 것을 의미한다. 발현이 증가되었다 함은 적어도 10%, 특히 적어도 20%, 적어도 50% 또는 적어도 100%, 또는 그 이상 증가된 것을 의미한다. 일 구체예에서, 발현은 질병 상태에서만 발견되는 반면 건강한 조직에서의 발현은 억제된다.
용어 "특이적으로 발현되다"라는 것은 단백질이 특이 조직 또는 장기에서만 본질적으로 발현됨을 의미한다. 예를 들어, 태반에서 특이적으로 발현되는 종양 항원은 상기 단백질이 태반에서 우선적으로 발현되고 다른 조직에서는 발현되지 않거나 또는 다른 조직이나 장기 종류에서는 유의적인 정도로 발현되지 않음을 의미한다. 따라서, 태반 세포에만 배타적으로 발현되고 다른 조직에서는 유의적으로 훨씬 낮은 정도로 발현되는 단백질은 태반 세포에서 특이적으로 발현되는 것이다. 몇몇 구체예에서, 종양 항원은 또한 두 개 이상의 조직 종류 또는 장기, 예컨대 2개 또는 3가지 조직 종류 또는 장기에서 그러나 네 가지 이하의 상이한 조직 또는 종양 종류에서 정상 조건 하에 특이적으로 발현될 수도 있다. 이 경우, 종양 항원은 이들 장기에서 특이적으로 발현되는 것이다.
본 발명에 따라, 용어 "RNA가 인코딩하다"라 함은 RNA가 적절한 환경 하에 존재할 경우, 좋기로는 세포 내에 존재할 경우, 그것이 인코딩하는 단백질이나 펩타이드를 생산하도록 발현될 수 있음을 의미한다.
본 발명의 몇몇 측면들은 본 발명에 설명된 항체를 인코딩하는 RNA와 같은 핵산에 의해 시험관내 트랜스펙션되어 좋기로는 낮은 전구체 빈도로부터 임상적으로 타당한 세포 수까지 생체외 증폭된 후 환자와 같은 수혜자에게 전달되는 숙주 세포들의 후천적 전달에 의존한다. 본 발명에 따라 사용되는 숙주 세포들은 처리되는 수헤자에 대해 자가, 동종이계, 또는 동계일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "자가(autologous)"는 동일한 대상자로부터 유래하는 것을 설명하는데 사용된다. 예를 들어, "자가이식(autologous transplant)"이라 함은 동일한 대상자로부터 유래하는 조직이나 장기의 이식을 가리킨다. 이러한 절차는 그렇지 않다면 이식거부를 야기할 면역장벽을 극복해주므로 유리하다.
본 발명에서 사용되는 용어 "동종이계(allogeneic)"는 동일한 종(species)의 다른 개체로부터 유래한 것을 설명하는데 사용된다. 2 이상의 개체에서 하나 이상의 위치(loci)에서의 유전자가 동일하지 않을 경우 그 2 이상의 개체들은 서로에 대해 동종이계이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "동계(syngeneic)"는 동일한 유전형을 갖는 개체나 조직, 즉 동일한 쌍동이 또는 동일한 순계(inbred strain)의 동물 또는 그들의 조직으로부터 유래한 것을 설명하는데 사용된다.
본 발명에서 사용되는 용어 "이종(heterologous)"이라는 표현은 복수개의 서로 다른 요소들로 이루어진 것들을 설명하는데 사용된다. 일례로서, 어떤 개체의 골수를 다른 개체로 전달하는 것은 이종 이식을 구성하는 것이다. 이종 유전자는 그 대상자와는 다른 소스로부터 유도된 유전자이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "펩타이드"에는 올리고펩타이드 및 폴리펩타이드가 포함되며 펩타이드 결합에 의해 공유적으로 결합된 2개 이상, 좋기로는 3개 이상, 좋기로는 4개 이상, 좋기로는 6개 이상, 좋기로는 8개 이상, 좋기로는 9개 이상, 좋기로는 10개 이상, 좋기로는 13개 이상, 좋기로는 16개 이상, 좋기로는 21개 이상 및 좋기로는 최대 8, 10, 20, 30, 40 또는 50, 특히 최대 100개의 아미노산들을 포함하는 물질을 의미한다. 용어 "단백질"은 큰 펩타이드, 좋기로는 100개를 초과하는 아미노산 잔기들로 된 펩타이드를 가리키지만, 일반적으로 용어 "펩타이드" 및 "단백질"은 동의어이며 본 발명에서 호환적으로 사용된다.
특정한 아미노산 서열, 예컨대 서열목록에 나타난 아미노산 서열에 관한 본 발명의 교시 내용은 그 특이적인 서열들과 기능적으로 동등한 서열들, 예컨대 상기 특이적인 아미노산 서열과 동일하거나 유사한 특성을 갖는 아미노산 서열들을 결과시키는 상기 특이적인 서열들의 변이체에 관한 것으로 이해되어야 한다. 한 가지 중요한 특성은 그의 표적에 대한 항체의 결합을 유지하거나 항체의 이펙터 기능을 유지하는 것이다. 좋기로는, 특이적인 서열과 관련한 변이체인 서열은 그것이 항체의 특이 서열을 대체할 경우 CLDN6에 대한 상기 항체의 결합을 유지하는 것이 바람직하고 좋기로는 본 발명에 설명된 바와 같은 상기 항체의 기능, 예컨대 CDC 매개된 용해 또는 ADCC 매개된 용해를 유지하는 것이 바람직하다.
예를 들어, 서열목록에 나타난 서열들은 하나 이상의, 좋기로는 모든 유리 시스테인 잔기들이 제거되도록, 특히, 이들 시스테인 잔기들을 시스테인이 아닌 아미노산, 좋기로는 세린, 알라닌, 쓰레오닌, 글리신, 티로신, 류신 또는 메티오닌, 가장 좋기로는 알라닌 또는 세린으로 대체함으로써 시스테인 잔기들을 대체하도록 변형될 수 있다.
통상의 기술자는 특히 CDR, 하이퍼가변부 및 가변부의 서열들이 CLDN6에 대한 결합능을 잃지 않고도 변형될 수 있음을 이해할 것이다. 예컨대, CDR 부분은 본 발명에 명시된 항체의 부분들과 동일하거나 고도로 상동적일 것이다. "고도로 상동적인(highly homologous)"이라는 의미는 CDRs 내에 1 내지 5, 좋기로는 1 내지 4, 예컨대 1 내지 3 또는 1 또는 2개의 치환이 있을 수 있는 것으로 의도된다. 또한, 하이퍼가변부 및 가변부는 이들이 본 발명에 특별히 설명된 항체들의 부분과 실제로 상동성을 갖도록 변형될 수도 있다.
본 발명의 목적상, 아미노산 서열의 "변이체"는 아미노산 삽입 변이체, 아미노산 첨가 변이체, 아미노산 결여 변이체 및/또는 아미노산 치환 변이체를 포함한다. 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단의 결여를 포함하는 아미노산 결여 변이체는 또한 N-말단 및/또는 C-말단 절단 변이체로도 불리운다.
아미노산 삽입 변이체는 특정 아미노산 서열 중에 1 또는 2 이상의 아미노산의 삽입을 포함한다. 삽입을 가지는 아미노산 서열 변이체의 경우, 생성물의 적절한 스크리닝을 구비한 랜덤한 삽입 또한 가능하지만, 1 이상 아미노산 잔기는 아미노산 서열의 특정 부위 속으로 삽입된다.
아미노산 첨가 변이체는 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50개 또는 그 이상의 아미노산과 같은 1 이상의 아미노산의 아미노- 및/또는 카복시-말단 융합을 포함한다.
아미노산 결여 변이체는 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50개 또는 그 이상의 아미노산을 제거하는 것에 의하는 것과 같이 서열로부터 1 이상의 아미노산을 제거하는 것을 특징으로 한다. 결여는 단백질의 임의의 부위에 있을 수 있다.
아미노산 치환 변이체는 서열 내 적어도 하나의 잔기를 제거하고 그 위치에 다른 잔기를 삽입하는 것을 그 특징으로 한다. 상동체 단백질 또는 펩타이드 사이에 보존되지 않은 아미노산 서열 부위에서의 변형 및/또는 아미노산을 유사한 성질을 가지는 다른 것으로 치환하는 것이 선호된다. 바람직하게는 단백질 변이체에서의 아미노산의 변화는 보존적 아미노산 변화, 즉 유사하게 전하성 또는 비전하성 아미노산의 치환이다. 보존적 아미노산 변화는 그것의 측쇄와 관련된 아미노산 족의 하나의 치환과 관련된다. 자연적으로 발생하는 아미노산은 일반적으로 다음의 4개 족으로 나뉜다: 산성 아미노산(아스파르트, 글루타메이트), 염기성 아미노산(라이신, 아르기닌, 히스티딘), 비극성 아미노산(알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 및 비전하성 극성 아미노산(글라이신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 타이로신). 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신은 때때로 방향족 아미노산으로 함께 분류된다.
좋게는, 유사성 정도, 좋기로는 주어진 아미노산 서열과 상기 주어진 아미노산 서열의 변이체인 아미노산 서열 간의 동일성이 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%인 것이 바람직하다. 유사성 또는 동일성의 정도는 좋기로는 참조 아미노산 서열의 전장의 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 약 100%인 아미노산 영역에 대하여 주어진다. 예를 들어 참조 아미노산 서열이 200개 아미노산으로 구성된 경우, 유사성 또는 동일성의 정도는 좋기로는 적어도 약 20, 적어도 약 40, 적어도 약 60, 적어도 약 80, 적어도 약 100, 적어도 약 120, 적어도 약 140, 적어도 약 160, 적어도 약 180, 또는 약 200개 아미노산에 대하여, 좋기로는 연속되는 아미노산에 대하여 주어진다. 바람직한 구체예에서, 유사성 또는 동일성의 정도는 서열 목록에 나타난 아미노산 서열과 같은 참조 아미노산 서열의 전체 길이에 대하여 주어진다. 서열 유사성 결정을 위한 배열, 좋기로는 서열 동정은 당업계에 알려진 도구를 이용하여, 좋기로는 최상의 서열 배열을 사용하여, 예를 들어 얼라인(Align)을 사용하여, 표준 세팅, 좋기로는 EMBOSS::니들, 매트릭스(Matrix): Blosum62, 갭 오픈(Gap Open) 10.0, 갭 익스텐드(Gap Extend) 0.5를 사용하여 수행될 수 있다.
"서열 유사성"은 동일하거나 또는 보존적 아미노산 치환을 나타내는 아미노산들의 백분율을 나타낸 것이다. 두 개의 아미노산 서열들 간의 "서열 동일성"은 서열 간 동일한 아미노산들의 백분율을 가리킨다.
용어 "퍼센트 동일성(percentage identity)"은 가장 적합한 정렬 후 얻어지는 비교될 두 개의 서열들 간에 동일한 아미노산 잔기들의 퍼센트를 나타내고자 하는 것으로, 이러한 퍼센트는 오로지 통계적인 퍼센트이고 임의적으로 분포된 두 개의 서열 간의 차이 및 전장 서열에 걸친 두 개의 서열 간의 차이이다. 두 개의 아미노산 서열들 간의 서열 비교는 통상적으로 상술한 서열들을 최적으로 정렬시킨 후 비교함으로써 실시되고, 상기 비교는 절편 또는 "비교 윈도우(window of comparison)"에 의해 실시되어 서열 유사성의 국소적 부위들을 동정하고 비교하는 것이다. 비교를 위한 서열들 간의 최적 정렬은 수작업을 제외한 Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482의 국소 상동성 알고리즘, Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443의 국소 상동성 알고리즘, Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444의 유사성 탐구 방법, 또는 상술한 알고리즘들을 이용하는 컴퓨터 프로그램들(GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N and TFASTA in Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.)에 의해 얻어질 수 있다.
퍼센트 동일성은 비교되는 두 개의 서열들 간의 동일한 위치들의 수를 결정하는 단계, 비교된 위치들의 수로 상기 동일한 위치들의 수를 나누는 단계 및 얻어진 결과들에 100을 곱하는 단계에 의해 계산되어 상술한 두 개의 서열들 간의 퍼센트 동일성을 얻는다.
용어 "세포" 또는 "숙주 세포"는 좋기로는 온전한 세포, 즉 효소, 소기관 또는 유전 물질과 같은 그의 정상적인 세포내 성분들을 방출하지 않은 온전한 막을 갖는 온전한 세포에 관한 것이다. 온전한 세포(intact cell)는 좋기로는 살아있는 세포, 즉 그의 정상적인 대사 기능을 수행할 수 있는 살아있는 세포이다. 좋기로는 상기 용어는 본 발명에 따라 외인성 핵산으로 트랜스펙션될 수 있는 여하한 세포에 관한 것이다. 좋기로는 상기 세포는 외인성 핵산으로 트랜스펙션되어 수혜자에게 전달된 경우 그 수혜자에서 그 핵산을 발현할 수 있는 것이 바람직하다. 용어 "세포"에는 세균 세포들이 포함된다; 기타 유용한 세포들은 효모 세포, 진균 세포 또는 포유동물 세포들이다. 적절한 세균 세포에는 예컨대 대장균, 프로테우스 및 슈도모나스와 같은 그램-음성 세균 균주 바실러스, 스트렙토마이세스, 스타필로코커스 및 락토코커스와 같은 그램-양성 세균 균주가 포함된다. 적절한 진균 세포로는 트리코더마, 뉴로스포라 및 아스퍼질러스 종의 세포들이 포함된다. 적절한 효모 세포에는 사카로마이세스(예컨대 사카로마이세스 세레비지에), 쉬조사카로마이세스 (예컨대 쉬조 사카로마이세스 폼베), 피치아(예컨대 피치아 파스토리스 및 피치아 메타놀리카), 및 한세눌라가 포함된다. 적절한 포유동물 세포에는 예컨대 CHO 세포들, BHK 세포들, HeLa 세포들, COS 세포들, 293 HEK 등이 포함된다. 그러나, 이종 단백질 발현을 위해 기술 분야에서 사용되는 양서동물 세포들, 곤충 세포들, 식물 세포들, 및 그 밖의 다른 세포들 역시도 본 발명에서 사용될 수 있다. 예컨대 인간, 마우스, 햄스터, 돼지, 염소 및 영장류와 같은 포유동물 세포들이 후천적인 전달에 특히 적합하다. 세포들은 다수의 조직 종류로부터 유래될 수 있고 여기에는 일차 세포들 및 세포주들 예컨대 면역계 세포들, 특히 항원-제시 세포들 예컨대 수지상 세포들 및 T 세포들, 조혈 줄기세포 및 중간엽 줄기세포와 같은 줄기세포들 및 그 밖의 세포 종류가 포함된다. 항원-제시 세포는 그의 표면에서 주요 조직적합성 복합체 관점에서 항원을 나타내는 세포이다. T 세포들은 그의 T세포 수용체 (TCR)을 이용하여 이 복합체를 인식할 수 있다.
용어 "형질전환 동물(transgenic animal)"은 하나 이상의 트랜스유전자(transgenes)를 포함하는 게놈, 좋기로는 중쇄 및/또는 경쇄 트랜스 유전자, 또는 트랜스염색체 (그 동물의 천연 게놈 DNA 내로 통합되거나 통합되지 않은)를 가지며 좋기로는 트랜스유전자를 발현할 수 있는 동물을 가리킨다. 예를 들어, 형질전환 마우스는, CLDN6 항원 및/또는 CLDN6을 발현하는 세포로 면역될 경우 인간 항-CLDN6 항체를 생산하도록 인간 경쇄 트랜스유전자와 인간 중쇄 트랜스유전자 또는 인간 중쇄 트랜스염색체를 가질 수 있다. 인간 중쇄 트랜스유전자는 트랜스유전자 마우스의 경우와 같이, 예컨대, HuMAb 마우스, 예컨대 HCo7 또는 HCol2 마우스와 같이, 마우스의 염색체 DNA 내로 통합될 수 있으며 또는 인간 중쇄 트랜스유전자는 WO 02/43478에 설명된 트랜스염색체(예컨대 KM), 마우스의 경우에서처럼, 염색체외 (extrachromosomally) 유지될 수도 있다. 이러한 형질전환 및 트랜스염색체 마우스는 V-D-J 재조합 및 아이소타입 스위칭을 수행함으로써 CLDN6에 대한 인간 모노클로날 항체의 다중 아이소타입들 (예컨대, IgG, IgA 및/또는 IgE)을 생산할 수 있을 것이다.
본 발명에서 "감소시키다", "저감시키다", "억제하다"의 의미는 어떤 수준, 예컨대 세포의 증식 수준 또는 발현 수준을, 좋게는 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 보다 좋게는 50% 이상, 및 가장 좋게는 75% 이상 전반적으로 감소시키거나 전반적인 감소를 유발하는 능력을 의미한다.
"증가시키다" 또는 "증대시키다"라는 용어는 좋기로는 약 적어도 10%, 좋기로는 적어도 20%, 좋기로는 적어도 30%, 더욱 좋기로는 적어도 40%, 더욱 좋기로는 적어도 50%, 더더욱 좋기로는 적어도 80%, 및 가장 좋기로는 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 적어도 1000%, 적어도 10000% 또는 그 이상 증가 또는 증대시키는 것에 관한다.
다음의 설명은 항체의 치료 효능의 기저 메카니즘과 관련한 고찰에 관한 것이지만 본 발명이 이러한 설명으로 인해 어떠한 방식으로든 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 설명된 항체들은 좋기로는 ADCC 또는 CDC를 통해 면역계 성분들과 상호작용하는 것이 바람직하다. 본 발명에 설명된 항체들은 페이로드(예컨대 방사능동위원소, 약물 또는 독소)를 표적화하여 종양 세포를 직접 사멸시키는데 사용될 수도 있고 또는 T 림프구 상의 화학요법제의 세포독성 부작용으로 인해 약화되었을 수 있는 항-종양 면역 반응일 수도 있는 보체 작용 메카니즘을 통해 종양을 공격하는, 전통적인 화학요법제와 상승적으로 사용될 수도 있다. 그러나, 본 발명에 설명된 항체들은 세포 표면 상의 CLDN6에 단순히 결합함에 따라, 예컨대 세포의 증식을 차단함으로써 그 효과를 발휘할 수도 있다.
항체 의존성 세포-매개된 세포독성
ADCC는 본 발명에 개시된 것처럼 이펙터 세포들, 특히 임파구들의 세포 살해 능력을 설명하고, 이것은 좋게는 항체에 의해 마킹(mark)되는 표적 세포를 필요로한다.
ADCC는 좋게는 항체들이 종양 세포상에 항원과 결합하고, 항체 Fc 도메인들이 면역 이펙터 세포들의 표면에 Fc 수용체와 관여할 때 일어난다. Fc 수용체들의 몇몇 패밀리는 확인되어왔고, 특이적 세포 집단은 특징적으로 규명된 Fc 수용체들을 발현한다. ADCC는 항원 표시 및 종양 관련된 T 세포 반응의 유도를 가져오는 즉각적인 종양 파괴의 다양한 정도를 직접 유도하기 위한 메카니즘으로서 간주될 수 있다. 좋게는, ADCC의 생체 내 유도는 종양 관련 T 세포 반응들 및 숙주 유래 항체 반응을 가져온다.
보체 의존성 세포독성
CDC는 항체에 의해 지시될 수 있는 다른 세포 살해 방법이다. IgM은 보체 활성을 위한 가장 효과적인 이소형이다. IgG1 및 IgG3는 전형적인 보체활성 경로를 통해 CDC를 지시하는 것에서 매우 효과적이다. 좋게는, 이러한 캐스캐이드(cascade)에서, 항원-항체 복합체들의 형성은 IgG 분자 (C1q는 보체 C1의 3개의 하위인자 중 하나이다)를 비롯한 항체 분자를 참여하는 CH2 도메인상에 가깝게 근접하여 다중 C1q 결합 사이트의 노출을 일으킨다. 좋게는, 이러한 노출된 C1q 결합 사이트는 이전의 낮은 친화도의 C1q-IgG 상호반응을 높은 애비더티(avidity)로 전환하고, 이것은 다른 일련의 보체 단백질이 관련된 하나의 캐스캐이드 작용을 일으키고, 이펙터 세포 화학주성의/활성제 C3a 및 C5a의 단백질 분해적 방출을 가져온다. 좋게는, 막의 형성에서 보체 캐스캐이드 말단은 복합체를 공격하고, 이것은 세포 내외의 용질 및 물의 자유(free) 통로를 촉진하는 세포 막에서 구멍을 형성한다.
본 발명의 항체는 통상적인 모노클로날 항체 방법론, 예컨대, Kohler 및 Milstein, Nature 256: 495 (1975)의 표준 체세포 하이브리다이제이션 기술을 비롯한 다양한 기술에 의해 생산가능하다. 체세포 혼성화 절차가 선호될 지라도, 주로, 모노클로날 항체를 생산하기 위한 다른 기술들이 전개될 수 있다, 예컨대, B-임파구 또는 파지의 바이러스 또는 종양 형질변환은 항체 유전자의 라이브러리를 이용한 기술을 나타낸다.
모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 생산하기 위한 선호되는 동물 시스템은 쥐과(murine) 계열이다. 마우스에서 하이브리도마 생산은 매우 잘 구축된 절차이다. 융합을 위한 면역화된 비장림프구의 분리를 위한 면역화 프로토콜 및 기술은 기술분야에서 잘 알려져있다. 융합 파트너 (예컨대, 쥐의 골수종 세포)와 융합 절차는 또한 알려져있다.
모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 제조하기 위한 다른 선호되는 동물 시스템은 래트 및 래빗 시스템이다 (예컨대, Spieker-Polet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:9348 (1995), Rossi et al., Am. J. Clin. Pathol. 124: 295 (2005)에 개시됨).
또 다른 바람직한 구체예에서, 인간 모노클로날 항체들은 마우스 시스템 보다 인간 면역 시스템의 부분들을 수행하는 유전자이식(transgenic) 또는 트랜스염색체적(transchromosomal) 마우스를 이용하여 생성가능하다. 이러한 유전자이식 및 트랜스염색체적 마우스는 각각 HuMab 마우스 및 KM 마우스로 알려져 있고, "유전자 이식 마우스"로 본 발명에 집합적으로 언급된다. 그러한 유전자 이식 쥐 내에 인간 항체의 생산은 WO2004 035607에서 CD20을 위한 자세히 기재된 내용으로써 수행될 수 있다.
모노클로날 항체들을 생성하기 위한 또 다른 전략은 예컨대, Babcock et al., 1996; 규정된 특이성의 항체를 생산하는 단일의 분리된 임파구들로부터 모노클로날 항체를 생산하기 위한 신규한 전략을 참고한, 규정된 특이성의 항체를 생산하는 임파구로부터 항체를 코딩하는 유전자를 직접 분리하는 것이다. 재조합 항체 공학의 자세한 내용은 또한 문헌(Welschof 및 Kraus, Recombinant antibodes for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8 및 Benny K.C. Lo Antibody Engineering ISBN 1-58829-092-1)을 참고할 것.
항체를 생성하기 위해, 항원 서열, 즉 그 항체을 지향시키고자 하는 서열로부터 유래된 담체-컨쥬게이트된 펩타이드, 기재된 CLDN6을 재조합적으로 발현된 풍부한 제조물 또는 그 단편 및/또는 CLDN6 또는 그의 단편을 발현하는 세포들로 마우스를 면역화시킬 수 있다. 별법으로, 마우스는 항원 또는 그 단편을 코딩하는 DNA로 면역화될 수 있다. 항원의 정제된 또는 풍부한 제조물을 이용한 면역화가 항체를 생성하지 않는 경우에, 마우스는 면역 반응을 촉진하기 위해, 항원을 발현하는 세포들, 예컨대 세포주로 또한 면역화될 수 있다.
면역 반응은 꼬리 정맥 또는 안와후(retroorbital) 블리즈(bleeds)에 의해 수득되는 혈장 및 혈청 시료로 면역화 프로토콜의 코스로 모니터될 수 있다. 충분한 역가의 면역글로불린을 가진 마우스는 융합에 이용될 수 있다. 마우스는 희생되어, 하이브리도마를 분비하는 특이적 항체의 비율을 증가시키기 위한 비장(spleen) 제거전에 3일 동안 항원 발현 세포들로 복강내 또는 정맥내로 부스트(boost)될 수 있다.
모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하기 위해, 면역화된 마우스들로부터의 림프절 세포들 및 비장림프구를 분리하여, 마우스 골수종 세포주를 비롯한 적절한 불사화된 세포주에 융합시킬 수 있다. 이어서, 결과적으로 나오는 하이브리도마들을 항원 특이적 항체의 생산을 위해 스크리닝할 수 있다. 그리고나서, 각각의 웰들은 하이브리도마를 분비하는 항체를 위한 ELISA에 의해 스크린될 수 있다. 항원 발현 세포들을 이용한 면역형광 및 FACS에 의해, 항원에 특이적인 항체들이 확인될 수 있다. 하이브리도마를 분비하는 항체는 리플레이트(replate)될 수 있고, 다시 스크린될 수 있으며, 만약 모노클로날 항체들을 위해 여전히 양성이라면 제한하는 희석에 의해 서브클론될 수 있다. 안정적인 서브클론은 그리고나서 특성화를 위한 조직 배양 배지에서 항체를 생성하기 위해 시험관내(in vitro)에서 배양될 수 있다.
항체들은 또한 예컨대, 기술분야에 잘 알려져 있는 재조합 DNA 기술 및 유전자 형질감염 방법들의 조합을 이용하여 숙주 세포 트랜스펙토마에서 생산될 수 있다 (Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).
예컨대, 일 구체예에서, 흥미로운 유전자(들), 예컨대, 항체 유전자들은 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338 841에 개시된 GS 유전자 발현 시스템 또는 기술분야에 잘 알려진 다른 발현 시스템에 의해 사용된 것을 비롯한 진핵 발현 플라스미드를 비롯한 발현 벡터내로 라이게이션 될 수 있다. 클론된 항체 유전자들을 가진 정제된 플라스미드는 CHO 세포들, NS/0 세포들, HEK293T 세포들 또는HEK293 세포들 또는 대안적으로 식물 유래 세포들, 곰팡이 또는 효모 세포들과 같은 다른 진핵 세포들내로 도입될 수 있다. 이러한 유전자들을 도입하기 위해 사용되는 방법은 일렉트로포레이션, 리포펙틴, 리포펙타민 또는 다른 것들을 비롯한 기술분야에 기재된 방법들일 수 있다. 숙주 세포 내에서 이러한 항체 유전자들의 도입 후에, 항체를 발현하는 세포들은 확인되고 선택된다. 이러한 세포들은 그리고나서 그 발현 수준을 위해 증폭되고, 항체를 생산하기 위해 업스케일(upscale)될 수 있는 트랜스펙토마를 나타낸다. 재조합 항체들은 이러한 배양 상청액 및/또는 세포들로부터 분리되고 정제될 수 있다.
다르게, 클론된 항체 유전자들은 E.coli를 비롯한 미생물을 비롯한 원핵 세포들을 함유하는 다른 발현 시스템에서 발현될 수 있다. 또한, 항체들은 쉽(sheep) 또는 래빗으로부터의 우유에서 또는 암탉의 달걀에서와 같은 형질전환 비인간 동물들 또는 형질전환 식물들에서 생산될 수 있다(Verma, R., et al. (1998) J. Immunol. Meth. 216: 165-181; Pollock, et al. (1999) J. Immunol. Meth. 231: 147-157; 및 Fischer, R., et al. (1999) Biol. Chem. 380: 825-839 참고).
키메라화(Chimerization)
쥐의 항체들은 반복적으로 치료적 효과의 감소를 가져올 때 인간 내에서 높은 면역성이다. 쥐의 항체의 면역원성은 중쇄 불변부에 의해 매개된다. 인간에서 쥐의 항체들의 면역원성은 만약 각각의 항체들이 키메라화되거나 인간화되면 감소되거나 완전히 막을 수 있다. 키메라 항체들은 항체들이고, 쥐의 항체로부터 유래된 가변부 및 인간 면역글로불린 불변부를 가지는 것을 비롯한 상이한 동물 종들로부터 유래된 상이한 부분들이다. 항체들의 키메라화는 인간 중쇄 및 경쇄의 불변영역과 쥐의 항체 중쇄 및 경쇄의 불변부를 결합함에 의해 성취된다 (예컨대, Kraus et al., in Methods in Molecular Biology series, Recombinant antibodies for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8에 의해 개시된). 선호되는 방식으로는, 키메라화된 항체는 인간 카파 경쇄의 불변부를 쥐의 경쇄의 가변부에 결합시킴으로써 생성할 수 있다. 또 다른 선호되는 항체의 키메라화 방식으로는 인간 λ(lambda) 경쇄의 불변부를 쥐의 경쇄의 가변부에 결합시키는 방법이 있다. 키메라화된 항체 생성을 위한 선호되는 중쇄 불변부는 IgG1, IgG3 및 IgG4가 있다. 그 밖에 키메라 항체의 생성을 위해 선호되는 중쇄 불변부으로는 IgG2, IgA, IgD 및 IgM이 있다.
인간화(Humanization)
항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 CDR 안에 존재하는 아미노산 잔여물을 통해 우세하게 표적 항원과 반응한다. 이 때문에 CDR 내부의 아미노산 서열들은 CDR 외부의 서열보다 각각의 항체들 사이에서 다양하게 나타난다. CDR 서열이 대부분의 항체-항원간 반응에 있어 결정적 역할을 하기 때문에, 서로 다른 성질들을 가진 서로 다른 항체로부터의 프래임워크(framework) 서열들 상에 이식되는 특이적으로 일어나는 항체로부터 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구축함으로써, 특이적 자연적으로 발생하는 항체들의 성질을 모방하는 재조합 항체를 발현하는 것이 가능하다(e.g., Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332: 323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321: 522-525; 및 Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86: 10029-10033). 그러한 프래임워크 서열은 생식세포(germline) 항체 유전자 서열을 포함하는 공공 DNA 데이터베이스에서 얻을 수 있다. 이러한 생식세포 서열은 성숙한 항체 유전자 서열과 다를 것인데, 이들은 B 세포의 성숙 분열기 동안 V (D) J가 결합됨으로써 생성되는 완전히 결합된 가변 유전자를 포함하지 않을 것이기 때문이다. 생식세포 유전자 서열은 또한 가변부 전체에 고르게 분포된 각각의 고친화도 이차적 레퍼토리 항체와도 다를 것이다.
항원에 결합하는 항체의 능력은 표준 결합분석법(예컨대, ELISA, 웨스턴 블롯, 면역형광법 및 유세포분석법)을 이용하여 탐지될 수 있다.
항체들을 정제하기 위해, 모노클로날 항체 정제를 위한 2-리터 스피너-플라스크에서 선택된 하이브리도마를 성장시킬 있다. 별법으로, 항체들은 투석 기반 생물반응기에서 생산될 수 있다. 상청액은 필터될 수 있고, 만약 필요하다면, 단백질 G-세파로스 또는 단백질 A-세파로스로 친화도 크로마토그래피 전에 농축될 수 있다. 녹여서 분리된(eluted) IgG는 젤 전기영동 및 순도를 보장하기 위해 고 수행 액체 크로마토그래피에 의해 체크될 수 있다. 완충 용액은 PBS로 교체될 수 있고, 농도는 1.43 소광 계수(extinction coefficient)를 이용하여 OD280에 의해 측정된다. 모노클로날 항체들을 분주하여(aliquote), -80℃에서 보관할 수 있다.
만약 선택된 모노클로날 항체들이 유일한 에피토프와 결합하는지를 알아보기 위해, 사이트-지시된(site-directed) 또는 멀티사이트 지시된(multi-site directed) 돌연변이유발(mutagenesis)이 이용될 수 있다.
항체들의 이소형을 알아보기 위해, 다양한 키트의 이소형 ELISA(예컨대, Zymed, Roche Diagnostics)가 수행되었다. 마이크로 타이터의 웰들은 항-마우스 Ig로 코팅될 수 있다. 블록킹 후에, 플레이트는 2시간동안 주변 온도에서 모노클로날 항체들 또는 정제된 이소형 대조군들로 반응시켰다. 그리고나서 웰들은 마우스 IgG1, IgG2a, IgG2b 또는 IgG3, IgA 또는 마우스 IgM-특이적 페록시다제-컨쥬게이트된 프로브들과 반응시킬 수 있다. 세척 후, 플레이트들은 ABTS 기질 (1mg/ml)로 현상시키고, 405-650 OD로 분석할 수 있다. 또 다르게는, 아이소스트립 마우스 모노클로날 항체 아이소타이핑 키트 (Roche, Cat. No. 1493027)가 제조자에 의해 기재된 바와 같이 사용될 수 있다.
항원을 발현하는 살아있는 세포들에 대한 모노클로날 항체들의 결합 또는 면역화된 마우스들의 혈청에서 항체들의 존재를 증명하기 위해, 유세포 분석법이 사용되었다. 천연 또는 형질감염후 CLDN6 발현하는 세포주들 및 항원 발현을 결여한 음성 대조군들 (표준 성장 조건에서 자란)은 하이브리도마 상청액들 또는 1% FBS 함유 PBS 내 모노클로날 항체들의 다양한 농도로 혼합될수 있고, 40분동안 4℃에서 인큐베이션 할 수 있다. 세척 후, APC- 또는 Alexa647-표지된 항 IgG 항체는 초기 항체 염색과 같은 조건하에 항원-결합된 모노클로날 항체와 결합할 수 있다. 시료들은 단일, 살아있는 세포들을 게이트(gate)하기 위한 빛 및 사이드 산란 특징(light 및 side scatter properties)들을 이용한 FACS 기구로 유세포 분석법에 의해 분석될 수 있다. 단일 측정에서 비특정 바인더(binder)들로부터 항원-특이적 모노클로날 항체들을 구별하기 위해, 공동-형질감염 방법이 구현될 수 있다. 항원 및 형광 마커를 코딩하는 플라스미드로 일시적으로 트랜스펙션된 세포들은 상기에 기재된 바와 같이 염색될 수 있다. 트랜스펙션된 세포들은 항체-염색된 세포들보다 서로 다른 형광 채널에서 검출될 수 있다. 트랜스펙션된 세포들의 다수가 이식유전자(transgene) 모두를 발현하는 것처럼, 항원-특이적 모노클로날 항체들은 형광 마커 발현 세포들에 선호되게 결합하는 반면, 비특이적 항체들은 비트랜스펙션된 세포들에 비교할만한 비율로 결합한다. 형광 현미경을 이용하는 대안적인 어세이는 유세포 분석법 어세이에 더하여 또는 대신으로 사용될 수 있다. 세포들은 상기한 바와 같이 정확히 염색되고, 형광 현미경에 의해 조사될 수 있다.
면역화된 마우스의 혈청에 항체의 존재 또는 항원을 발현하는 살아있는 세포와 모노클로날 항체와의 결합을 증명하기 위해 면역 형광 현미경이 사용될 수 있다. 예를 들어 자발적으로, 혹은 형질감염 후에 항원을 발현하는 세포주나 항원 발현을 결여하는 음성대조군은 10% FCS, 2 mM L-글루타민, 100IU/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신이 보충된 DMEM/F12 배지에서 표준 성장 조건하의 챔버 슬라이드에서 배양된다. 세포들은 그 후 메탄올이나 파라포름알데히드로 고정되거나 미처리된다. 그리고나서 30분간 25℃에서 항원에 대해 모노클로날 항체와 반응하게 된다. 세척 후, 이 세포들은 동일 조건에서 Alexa555 표지된 항-마우스 IgG 2차 항체(Molecular Probes)와 반응하게 된다. 그리고 나서 형광 현미경으로 조사할 수 있다.
항원을 발현하는 세포나 적절한 음성대조군으로부터의 세포추출물을 준비해 SDS 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동시킬 수 있다. 전기이동 후, 분리된 항원은 니트로셀룰로오스 막으로 이동되어 차단되고, 실험할 모노클로날 항체와 함께 조사된다. IgG 결합은 항-마우스 IgG 페록시다아제를 사용해 검출되고 ECL 기질로 현상(develop)된다.
항체는 당업자에게는 잘 알려진 방식으로 면역조직화학에 의해, 예컨대, 수술 과정에서 환자로부터, 혹은 자발적으로 또는 형질 감염후, 항원을 발현하는 세포주가 접종된 이종 이식된 종양을 갖고 있는 마우스로부터 얻은 암 없는 조직이나 암 조직 시료들로부터 파라포름알데히드나 아세톤 고정된 크라이오절편, 또는 파라핀을 함유하고 파라포름알데히드로 고정된 조직 절편을 사용하는 방식에 의해, 항원에 대한 반응성을 추가적으로 측정할 수 있다. 면역염색을 위해, 항원에 대해 반응성이 있는 항체들을 인큐베이션한 다음 배포업체 지시에 따라 고트 항-마우스 또는 고트(goat) 항-래빗 항체들(DAKO)과 호스래디쉬-퍼옥시다제 컨쥬게이트시킨다.
항체를 대식작용을 매개하는 능력 및 CLDN6을 발현하는 세포를 사멸하는 능력에 대해 테스트할 수 있다. 시험관내에서의 모노클로날 항체 활성의 테스트 의해 생체내 모델에서의 테스트에 앞서, 초기 스크리닝이 이루어질 수 있다.
항체 의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC)
간단히 설명하면, 건강한 도너로부터 나온 PMNs(polymorphonuclear cells), NK 세포, 모노사이트, 단핵 세포, 또는 다른 이펙터 세포를 오염된 적혈구의 용해 후에 피콜 하이파크 밀도 원심분리에 의해 정제할 수 있다. 세척된 이펙터 세포를 10% 열-비활성화된 FCS가 보강되거나 또는 별법으로, 5% 열-비활성화된 인간 혈청이 보강된 RPMI에 현탁하고, CLDN6를 발현하는, 51Cr로 표지된 표적 세포와 다양한 이펙터 세포 대 표적 세포의 비율로 혼합한다. 별법으로, 표적 세포를 리간드를 향상시키는 형광(BATDA)으로 표지할 수도 있다. 죽은 세포에서 나오는 강화 리간드와의 유로피움의 고형광 킬레이트를 형광계로 측정할 수 있다. 또 다른 대안 기술은 루시페라제에 의한 표적 세포의 형질감염을 이용하는 것일 수 있다. 이렇게 첨가된 루시퍼 옐로우는 살아있는 세포에 의해서만 산화될 수 있다. 이어서 정제된 항-CLDN6 IgGs를 다양한 농도로 첨가할 수 있다. 무관한 인간 IgG를 음성대조군으로 사용할 수 있다. 사용된 이펙터 세포 유형에 따라 적게는 4시간에서 많게는 20시간동안 37℃에서 분석을 실시할 수 있다. 시료들을 배양 상청액의51Cr 배출 또는 EuTDA 킬레이트 화합물의 존재를 측정함으로써 세포용해를 위해 분석한다. 별법으로, 루시퍼옐로우의 산화에 의한 발광이 살아있는 세포들의 척도가 될 수 있다.
또한 세포용해가 다수의 모노클로날 항체와 함께 증가하는지를 알아보기 위해, 항-CLDN6 모노클로날 항체를 다양한 조합으로 테스트할 수 있다.
보체 의존성 세포독성(CDC)
모노클로날 항-CLDN6 항체의 CDC 매개 능력을 다양한 알려진 테크닉을 통해 테스트할 수 있다. 예를 들어, 보체를 위한 혈청은 당업자에게 알려진 방식에 따라 혈액으로부터 얻을 수 있다. mAbs의 CDC 작용을 측정하기 위해서는 다른 방법이 사용된다. 예를 들어 51Cr 배출을 측정할 수도 있고 상승한 세포막 삼투성을 PI 제외 어세이를 사용해 측정할 수도 있다. 간단하게, 표적 세포를 세척해 5 x 105/ml를 다양한 농도의 mAb로 10-30분간 37℃정도의 실온에서 인큐베이팅할 수 있다. 그리고나서 혈청이나 혈장을 최종 농도가 20%(v/v)가 될 때까지 첨가하여 세포를 37℃에서 20-30분간 둔다. 각각의 시료에서 나온 모든 세포를 FACS 튜브의 PI 용액에 더한다. 이 혼합물은 FACS 어레이를 사용하여 플로우 사이토미트릭 분석을 통해 즉시 분석할 수 있다.
또 다른 분석법에서, CDC 유도는 부착 세포(adherent cell)에 따라 결정된다. 이러한 분석법의 일 구체예에서, 세포들을 조직배양 편평한 바닥 마이크로티터 플레이트에서 3 x 104/웰의 밀도로 분석 24시간 전에 접종한다. 그 다음날 생장 배지를 제거하고 이 세포들을 항체들과 함께 세벌(triplicate)로 인큐베이션시킨다. 대조군 세포들을 각각 배경(background) 용해나 최대 용해의 측정을 위해 생장 배지나 0.2%의 사포닌을 함유하는 생장 배지와 함께 인큐베이션한다. 20분간 상온에서 인큐베이션한 후에 상청액을 제거하고 DMEM(37℃에서 예열됨) 안의 20%(v/v) 인간 혈장이나 혈청을 세포에 더해 37℃에서 다시 20분간 인큐베이션한다. 각 시료에서 나온 모든 세포들을 프로피디윰 요오드화물 용액(10㎍/ml)에 더한다. 그리고나서, 상청액을 2.5㎍/ml 에티디움 브로마이드를 포함하는 PBS로 대체하고 520 nm에서 여기(excitation)에 의한 형광 방출을 Tecan Safire를 사용해 600nm에서 측정한다. 특이적 용해 백분율은 다음과 같이 계산된다.: % 특이적 용해 = (형광 시료-형광 배경)/ (형광 최대 용해-형광 배경) x 100
모노클로날 항체에 의한 세포자멸사의 유도 및 세포 증식의 억제
세포자멸사(apoptosis) 개시 능력을 시험하기 위해, 예를 들어 모노클로날 항 CLDN6 항체를 CLDN6 양성 종양 세포 또는 CLDN6로 트랜스펙션된 종양 세포와 37℃에서 약 20시간 동안 인큐베이션할 수 있다. 이 세포들을 채취된 후 Annexin-V 결합되는 버퍼(BD 생명과학)에서 세척하여 FITC나 APC(BD 생명과학)와 접합된 Annexin V와 15분간 암실에서 인큐베이션한다. 각 시료에서 나온 모든 세포들을 FACS 튜브 안의 PI 용액(10 ㎍/ml in PBS)에 첨가하고 즉시 유세포분석법(상기한 바와 같음)으로 평가한다. 별법으로 상용 키트에 의해 모노클로날 항체에 의한 세포 증식의 일반적 억제를 검출할 수도 있다. DELFIA Cell Proliferation Kit (Perkin-Elmer, Cat. No. AD0200)는 마이크로플레이트 안의 증식하는 세포의 DNA 합성 동안의 5-브로모-2'-데옥시우리딘 (BrdU) 혼합 측정에 기초한 비동위원소 면역분석법이다. 혼합된 BrdU는 유로피움 표지된 모노클로날 항체를 사용해 검출된다. 항체가 검출될 수 있도록, 세포들을 고정하고 Fix 용액을 사용해 DNA를 변성시킨다. 결합되어 있지 않은 항체를 씻어내고, 표지된 항체로부터 유로피움 이온을 분리시키기 위해 DELFIA 유도인자를 용액에 첨가하면, 여기서. 이들은 DELFIA 유도인자의 구성성분을 가진 고 형광 킬레이트 화합물을 형성한다. 측정된 형광 -검출에서 시간-분해된(time-resolved) 유세포분석법을 이용함-은 각 웰의 세포에서 DNA 합성에 비례한다.
전임상 연구
본 발명에 설명된 결합제는 생체내 모델 예컨대 CLDN6을 발현하는 세포주가 접종된 이종이식편 종양을 갖는 면역결핍 마우스에서 CLDN-발현 종양 세포의 성장을 제어하는데 있어서의 이들의 효능을 알아내기 위한 검사에 이용될 수도 있다.
CLDN6 발현 양성 세포를 면역손상 마우스나 다른 동물에 주입한 후의 체내 연구를 본 발명의 항체를 사용해 수행할 수 있다. 종양의 형성이나 종양 관련 증상을 예방하기 위한 항체의 효과를 측정하기 위해, 종양 없는 마우스에게 항체들을 투여하고 종양 세포의 투여할 수 있다. 항체들을 종양이 있는 마우스에 투여하여 종양의 성장, 전이 또는 종양 관련 증상을 줄이기 위한 각각의 항체의 치료 효능을 측정할 수 있다. 항체 적용(application)은 세포 증식 억제제(cystostatic drugs), 성장 인자 억제제, 세포주기 차단제, 혈관신생 억제제 같은 다른 물질과 다른 항체들의 적용을 조합들의 시너지 효과나 잠재적 독성을 측정할 수 있다. 항체에 의한 독성 부작용을 분석하기 위해 동물에 항체나 대조 시약을 주입하고 CLDN6 항체 치료와 연관이 있을 수 있는 증상에 대해 면밀히 조사할 수 있다. CLDN6 항체의 생체 내 적용의 가능한 부작용으로는 태반을 비롯한 CLDN6 발현 조직에서의 독성이 있다. 인간이나 그 밖에 쥐와 같은 다른 종에서의 CLDN6을 인식하는 항체는 특히 인간에서의 모노클로날 CLDN6 항체의 적용에 의해 나타나는 잠재적 부작용을 예방하는 데 유용하다.
항체에 의해 인지되는 에피토프 맵핑을 "Epitope Mapping Protocols (Methods in Molecular Biology) by Glenn E. Morris ISBN-089603-375-9 및 in 'Epitope Mapping: A Practical Approach" Practical Approach Series, 248 by Olwyn M. R. Westwood, Frank C. Hay 에 자세히 설명된 대로 수행할 수 있다.
본 발명에 설명된 화합물들과 약제는 적절한 의약 조성물의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은 멸균된 것이 좋고 본 발명에 설명된 항체의 유효량 및, 소망되는 반응 또는 소망되는 효과를 발생시키기 위해, 임의로 본 발명에 설명된 추가 물질을 함유한다.
의약 조성물은 단위 투여제형으로 대개 제공되며 공지 방식으로 제조될 수 있다. 의약 조성물은 예컨대 용액 또는 현탁액 형태일 수 있다.
의약 조성물은 염, 완충물질, 보존제, 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함할 수 있으며, 이들 모두는 약학적으로 허용가능한 것이 좋다. "약학적으로 허용가능한"이라 함은 그 의약 조성물의 활성 성분의 작용과 상호반응하지 않는, 물질의 비독성을 가리킨다.
약학적으로 허용가능하지 않은 염들을 이용하여 약학적으로 허용가능한 염을 만들 수 있으며 이들 역시 본 발명에 속한다. 이러한 종류의 약학적으로 허용가능한 염에는 다음의 산으로부터 제조되는 것이 포함되나 이에 한정되지 않는다: 염산, 히드로브롬산, 황산, 질산, 인산, 말레산, 아세트산, 살리실산, 시트르산, 포름산, 말론산, 숙신산 등. 약학적으로 허용가능한 염은 또한 알칼리금속 염이나 알칼리토금속염, 예컨대 나트륨염, 칼륨염 또는 칼슘염으로서 제조될 수도 있다.
의약 조성물에 사용되기에 적합한 완충물질에는 아세트산염, 시트르산염, 붕산염 및 인산염이 포함된다.
의약 조성물에 사용되기에 적합한 보존제로는 염화벤잘코늄, 클로로부탄올, 파라벤 및 티메로살을 들 수 있다.
주사가능한 포뮬레이션은 Ringer Lactate와 같은 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다.
"담체"라는 용어는 활성성분의 적용을 용이화, 증강 또는 가능하게 하기 위해, 활성성분과 조합되는, 천연 또는 합성된 유기 또는 무기 성분을 가리키다. 본 발명에 따라, "담체"는 또한 환자에게 투여하는데 적합한 1 이상의 혼용가능한 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질을 포함하기도 한다.
비경구 투여를 위한 가능한 담체 물질은 예컨대 멸균수, Ringer, Ringer 락테이트, 멸균 염화나트륨 용액, 폴리알킬렌 글리콜, 수소첨가된 나프탈렌 미치 특히, 생물적합성 락타이드 폴리머, 락타이드/글리콜라이드 코폴리머 또는 폴리옥시에틸렌/폴리옥시프로필렌 코폴리머이다.
본 발명에서 "부형제"라는 용어는 의약 조성물 내에 존재할 수 있으나, 예컨대 담체, 바인더, 윤활제, 농후제, 표면활성제, 보존제, 유화제, 완충제, 풍미제 또는 착색제와 같이, 활성성분은 아닌 모든 물질을 가리키는 것으로 의도된다.
본 발명에 설명된 물질과 조성물은 주사 또는 주입을 비롯한 비경구 투여와 같은 여하한 통상적인 경로를 통해 투여될 수 있다. 투여는 좋기로는 예컨대 정맥내, 동맥내, 피하(subcutaneously), 피내(intradermally), 또는 근육내를 비롯한 비경구 투여에 의해 투여될 수 있다.
비경구 투여에 적합한 조성물은 대체로 활성 화합물의 멸균된 수성 또는 비수성 제제를 포함하며, 이것은 수용자의 혈액과 등장성인 것이 좋다. 적합한 담체 및 용매는 Ringer 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이다. 이에 더해, 대개 멸균된 고정 오일(fixed oils)이 용액 또는 현탁액 매질로서 이용된다.
본 발명에 설명된 물질 및 조성물은 유효량으로 투여된다. "유효량"이라 함은 그 단독으로 또는 추가 투여량(doses)과 함께 소망되는 반응 또는 소망되는 효과를 낼 수 있는 양이다. 특정 질환 또는 특정 상태를 치료하는 경우, 소망되는 반응은 좋기로는 그 질환의 경과를 억제하는 것에 관한다. 이것은 질병의 진행을 둔화시키는 것, 특히, 질병의 진행을 방해하거나 역전시키는 것을 포함한다. 질병 또는 상태의 치료시 소망되는 반응은 또한 상기 질병이나 상기 상태의 개시를 둔화시키거나 개시를 방지하는 것일 수도 있다. 특히 용어 "유효량"은 암 및 그의 한 가지 이상의 증상의 발달, 재발 또는 개시를 방지하고, 암의 위중도, 기간을 경감시키며 암의 한 가지 이상의 증상을 완화하고, 암의 진행을 방지하거나, 암의 퇴행을 일으키고 및/또는 암 전이를 예방하는데 충분한 치료제의 양을 가리킨다. 본 발명의 일 구체예에서, 치료제의 양은 암 줄기세포 집단의 안정화, 감소 또는 제거를 달성하고 및/또는 원발성 암 및/또는 재발암의 제거나 제어를 달성하는데 유효한 양이다.
본 발명에 설명된 물질 또는 조성물의 유효량은 치료하고자 하는 상태, 질병의 위중도, 환자의 개별적인 변수, 예컨대 연령, 생리적 상태, 크기 및 체중, 치료 기간, 부수되는 치료법의 종류(있을 경우), 특정 투여 경로 및 유사 인자들에 따라 달라진다. 따라서, 본 발명에 설명된 물질의 투여량은 이러한 다양한 변수에 따라 달라진다. 만일 환자의 반응이 초기 투여량으로 불충분할 경우, 더 많은 투여량(또는 보다 국소적인, 다른 투여 경로에 의해 달성되는 효과적으로 더 높은 투여량)이 사용될 수 있다.
본 발명에 설명된 물질 및 조성물은 암 질환, 예컨대 CLDN6을 발현하는 암 줄기세포가 존재함을 특징으로 하는, 본 발명에 설명된 바와 같은 암 질환을 치료 또는 예방하기 위해 환자에게 투여될 수 있다.
본 발명에 제공된 물질 및 조성물들은 단독으로 또는 통상적인 치료법, 예컨대 외과수술, 방사선조사, 화학요법 및/또는 골수이식(자가, 동계, 동종이계 또는 무관련)과 같은 치료법과 조합적으로 사용될 수도 있다.
암의 치료는 2종, 3종, 4종 또는 그 이상의 항암제/치료법의 조합 작용이 흔히 단일요법 접근의 효과에 비해 훨씬 더 강력하게 상승효과를 생성하기 때문에, 조합 전략이 특히 바람직한 분야이다. 따라서, 본 발명의 또 다른 구체예에서, 암 치료는 다양한 다른 약물과 효과적으로 조합될 수 있다. 이들의 예로는 예컨대 통상적인 종양치료법, 다중-에피토프 전략, 부가적인 면역요법 및 혈관신생 또는 세포자멸사를 표적으로 하는 치료적 접근을 들 수 있다(검토를 위해 예컨대, Andersen et al. 2008: Cancer treatment: the combination of vaccination with other therapies. Cancer Immunology Immunotherapy, 57(11): 1735-1743 참조). 상이한 물질을 순차 투여하여 상이한 검토시점에서 암세포 성장을 억제할 수 있는 한편, 다른 제제들은 예컨대 새로운 혈관신생, 악성세포들의 생존 또는 잠재적으로 암을 만성 질환으로 전환시키는 전이를 억제할 수 있다. 다음의 리스트들은 항암제의 몇몇 비제한적인 예를 제공하며 이들은 본 발명에서 조합적으로 사용가능하다:
1. 화학요법(Chemotherapy)
화학요법은 여러 가지 종류의 암의 표준 치료법이다. 가장 흔한 화학요법 약물은 암세포들의 주요 특성 중 하나인 급속히 분열하는 세포들을 사멸시킴으로써 작용한다. 따라서, 통상적인 화학요법 약물 예컨대 알킬화제, 항대사물질, 안트라사이클린, 식물성 알칼로이드, 토포이소머라제 저해제 및 세포 분열 또는 DNA 합성에 영향을 미치는 기타 항종양제와 같은 통상적인 화학요법제는 억제자 세포들을 소거하고, 면역계를 재부팅하며, 종양 세포들로 하여금 면역매개된 사멸에 대해 보다 감수성을 갖도록 하거나, 또는 면역계의 세포들을 부가적으로 활성화시키는 것을 조합적으로 이용함으로써, 본 발명의 치료효과를 유의적으로 향상시킬 수 있다. 화학요법 약물 및 백신접종-기반 면역치료약물의 상승적 항암작용은 여러가지 연구를 통해 입증된 바 있다(예컨대 Quoix et al. 2011: Therapeutic vaccination with TG4010 and first-line chemotherapy in advanced non-small-cell lung cancer: a controlled phase 2B trial. Lancet Oncol. 12(12): 1125-33 참조; 또한 Liseth et al. 2010: Combination of intensive chemotherapy and anticancer vaccines in the treatment of human malignancies: the hematological experience. J Biomed Biotechnol. 2010: 6920979 참조; 또한 Hirooka et al 2009: A combination therapy of gemcitabine with immunotherapy for patients with inoperable locally advanced pancreatic cancer. Pancreas 38(3): e69-74 참조). 복합 치료법에 기본적으로 적합한 화학요법약물로서 이용가능한 약물이 수백가지 존재한다. 본 발명에 조합 사용가능한 이러한 화학요법 약물의 몇몇(비제한적인) 예로는 카르보플라틴(파라플라틴), 시스플라틴(플라티놀, 플라티놀-AQ), 크리조티닙(잘코리), 시클로포스파미드(시톡산, 네오사르), 도세탁셀(탁소티어), 독소루비신(아드리아마이신), 엘로티닙(타르세바), 에토포사이드(베페시드), 플루오로우라실(5-FU), 겜시타빈(겜자), 이마티닙 메실레이트(글리벡), 이리노테칸(캄토사르), 리포좀-캡슐화된 독소루비신(독실), 메토트렉세이트(폴렉스, 멕세이트, 아메토프테린), 파클리탁셀(탁솔, 아브락산), 소라피닙(넥사바), 수니티닙(수텐트), 토포테칸(하이캄틴), 트라벡티딘(욘델리스), 빈크리스틴(온코빈, 빈카사르 PFS), 및 빈블라스틴(벨반)을 들 수 있다.
2. 외과적 수술(Surgery)
암 외과 적수술 - 종양을 제거하기 위한 수술 - 은 여전히 암 치료의 근간이 되는 치료방법으로서 남아있다. 외과적 수술은 잔류하는 여하한 종양 세포들을 제거하기 위해 다르느 암 치료법과 조합될 수 있다. 외과적 수술방법 후에 면역치료법을 조합시키는 것은 수없이 많이 유망한 치료적 접근법인 것으로 입증되어 왔다.
3. Radiation(방사선 치료법)
방사선 치료법은 모든 암 환자의 대략 50%가 그의 투병 기간 동안 방사능 치료를 받을 정도로 암 치료에 있어서 중요한 요소로 남아있다. 방사선 치료법의 주목적은 암세포들로부터 그의 잠재적인 복제능(세포분열)을 제거하는 데 있다. 암 치료에 사용되는 방사선의 종류로는 광자(photon) 방사선 치료(x선 및 γ선) 및 입자 방사선요법(전자, 양성자 및 중성자 빔)을 들 수 있다. 암 부위에 방사선으르 전달하는데는 2 가지 방법이 있다. 즉, 고에너지선(광자, 양성자 또는 입자 방사선조사)을 종양 부위에 표적화함으로써 체외로부터 외부 빔을 조사 전달하는 방법이 그 하나이다. 다른 한 가지는 내부 방사선 조사 또는 근접치료(brachytherapy)로서 이 방법은 카테터 또는 씨드 내에 봉입된 방사선원을 체내로부터 종양 부위로 전달하는 것이다. 본 발명에 조합사용될 수 있는 방사선 요법 기술에는 예컨대 분획화(fractionation: 분획화된 영역 내로 전달되는 방사선 요법, 예컨대 수 주일에 걸쳐 주 1.5 내지 3 Gy 분획의 선량을 매일 조사함), 3D 입체배열 방사선 요법(3DCRT; 육안적 종양체적에 방사선을 전달), 강도조절 방사선 요법(IMRT; 다양한 방사선 빔의 컴퓨터-제어된 강도 조절), 영상 가이드형 방사선요법(IGRT; 보정이 가능하능한 예비-방사선요법 조영을 포함하는 기술), 및 입체 체형 방사선 요법(SRBT, 단지 몇몇 치료 분획에 대해서만 매우 높은 선량의 방사선을 전달함)이 포함된다. 방사선 요법에 관한 보다 자세한 내용은 Baskar et al. 2012: Cancer and radiation therapy: current advances and future directions. Int. J Med Sci. 9(3): 193-199를 참조할 것.
4. 항체(Antibodies)
항체들(좋기로는 모노클로날 항체들)은 다양한 메카니즘을 통해 암세포들에 대한 치료 효과를 거둔다. 이들은 세포자멸사의 발생 또는 프로그램된 세포 사멸을 직접적으로 일으킬 수 있다. 이들은 종양세포들의 증식을 효과적으로 정지시키는 예컨대 성장인자 수용체와 같은 시그널 형질도입(transduction) 경로의 성분을 차단할 수 있다. 모노클로날 항체들을 발현하는 세포들에서, 이들은 항이디오타입 항체 형성을 야기할 수 있다. 간접 효과에는 단핵구 및 식세포와 같이 세포독성을 갖는 세포들을 동원(recruiting)하는 것이 포함된다. 항체-매개된 세포 사멸의 이러한 유형은 항체-의존성 세포 매개형 세포독성 (ADCC)이라 부른다. 항체는 또한 보체에도 결합하여, 보체 의존성 세포독성(CDC)라고 알려진 직접적인 세포 독성을 유도하기도 한다. 외과적 수술법을 면역치료 약물 또는 방법과 조합하는 것은 예컨대 문헌 [Gadri et al. 2009: Synergistic effect of dendritic cell vaccination and anti-CD20 antibody treatment in the therapy of murine lymphoma. J Immunother. 32(4): 333-40]에 입증된 바와 같이 성공적인 접근법이다. 다음의 리스트는 항암제 항체의 몇몇 비제한적인 예와 본 발명에서 조합 사용가능한 잠재적인 항체 표적(괄호 안)을 나타낸다: 아바고맙(CA-125), 아브식시맙(CD41), 아베카투무맙(EpCAM), 아푸투주맙(CD20), 알라시주맙 페골(VEGFR2), 알투모맙 펜테테이트(CEA), 아마툭시맙(MORAb-009), 아나투무맙 마페나톡스 (TAG-72), 아폴리주맙(HLA-DR), 아르시투모맙(CEA), 바비툭시맙(포스파티딜세린), 벡투모맙(CD22), 벨리무맙(BAFF), 베바시주맙(VEGF-A), 바이바투주맙 메르탄신(CD44 v6), 블리나투모맙(CD19), 브렌툭시맙 베도틴(CD30 TNFRSF8), 칸투주맙 메르탄신(뮤신 CanAg), 칸투주맙 라브탄신(MUC1), 카프로맙 펜데타인 (전립선 암종 세포들), 칼루맙(CNTO888), 카투막소맙(EpCAM, CD3), 세툭시맙(EGFR), 시타투주맙 보가톡스(EpCAM), 식수투무맙(IGF-1 수용체), 클라우딕시맙(클라우딘), 클리바투주맙 테트락세탄(MUC1), 코나투무맙(TRAIL-R2), 다세투주맙(CD40), 달로투주맙(인슐린-유사 성장인자 I 수용체), 데노수맙(RANKL), 데투모맙(B-림프종 세포), 드로지투맙(DR5), 에크로멕시맙(GD3 강글리오사이드), 에드레콜로맙(EpCAM), 엘로투주맙(SLAMF7), 에나바투주맙(PDL192), 엔시툭시맙(NPC-1C), 에프라투주맙 (CD22), 에르투막조맙(HER2/neu, CD3), 에타라시주맙 (인테그린 알파vβ3), 팔레투주맙(폴레이트 수용체 1), FBTA05 (CD20), 피클라투주맙(SCH 900105), 피지투무맙(IGF-1 수용체), 플란보투맙(당단백질 75), 프레솔리무맙(TGF-β), 갈릭시맙(CD80), 가투맙(IGF-I), 겐투주맙 오조가미신(CD33), 게보키주맙(IL-1β), 기렌툭시맙(탄산탈수소효소 9 (CA-IX)), 글렘바투무맙 베도틴(GPNMB), 이브리투모맙 티욱세탄(CD20), 이크루쿠맙(VEGFR-1), 이고보마(CA-125), 인다툭시맙 라브탄신(SDC1), 인테투무맙(CD51), 이노투주맙 오조가미신(CD22), 이필리무맙(CD152), 이라투무맙(CD30), 라베투주맙(CEA), 렉사투무맙(TRAIL-R2), 리비비루맙(B형 표면 항원), 린투주맙(CD33), 로보투주맙 메르탄신(CD56), 루카투무맙(CD40), 루밀릭시맙(CD23), 마파투무맙(TRAIL-R1), 마투주맙(EGFR), 메폴리주맙(IL-5), 밀라투주맙(CD74), 미투모맙(GD3 강글리오사이드), 모가물리주맙(CCR4), 목세투모맙 파수도톡스(CD22), 나콜로맙 타페나톡스(C242 항원), 납투모맙 에스타페나톡스(5T4), 나르나투맙(RON), 네시투무맙(EGFR), 니모투주맙(EGFR), 니볼루맙(IgG4), 오파투무맙(CD20), 오라라투맙(PDGF-R 알파), 오나르투주맙(인간 스캐터 인자 수용체 키나아제), 오포르투주맙 모나톡스(EpCAM), 오레고보맙(CA-125), 옥셀루맙(OX-40), 파니투무맙(EGFR), 파트리투맙(HER3), 펨투모마(MUC1), 페르투주맙(HER2/neu), 핀투모맙(선암종 항원), 프리투무맙(비멘틴), 라코투모맙 (N-글리콜릴뉴라민산), 라드레투맙(피브로넥틴 엑스트라 도메인-B), 라피비루맙(라비에스 바이러스 당단백질), 라무시루맙(VEGFR2), 릴로투무맙(HGF), 리툭시맙(CD20), 로바투무맙(IGF-1 수용체), 사말리주맙(CD200), 시브로투주맙(FAP), 실툭시맙(IL-6), 타발루맙(BAFF), 타카투주맙 테트락세탄(알파-태아단백질), 타플리투모맙 팝톡스(CD19), 테나투모맙(테나신 C), 테프로투무맙(CD221), 티실리무맙(CTLA-4), 티가투주맙(TRAIL-R2), TNX-650 (IL-13), 토시투모맙(CD20), 트라스투주맙(HER2/neu), TRBS07 (GD2), 트레멜리무맙(CTLA-4), 투모투주맙 셀모류킨(EpCAM), 유블리툭시맙(MS4A1), 유렐루맙(4-1BB), 볼로식시맙(인테그린 알파5β1), 보투무맙(종양 항원 CTAA16.88), 잘루투무맙(EGFR), 자놀리무맙(CD4).
5. 사이토카인, 케모카인, 공자극 분자, 융합 단백질
이로운 면역조절 또는 종양 억제 효과를 일으키기 위해 본 발명의 항원-코딩 의약 조성물과 사이토카인, 케모카인, 공자극 분자 및/또는 융합 단백질들을 조합 사용하는 것은 본 발명의 또 다른 구체예이다. 면역세포들의 종양 내로의 침윤을 증가시키고 항원-제시 세포들의 종양-배출 림프절로의 이동을 용이하게 하기 위해, C, CC, CXC 및 CX3C 구조를 갖는 다양한 케모카인이 이용될 수 있다. 가장 유망한 케모카인의 몇몇 예는 예컨대 CCR7 그의 리간드 CCL19 및 CCL21, 또한 CCL2, CCL3, CCL5, 및 CCL16이다. 그 밖의 예로는 CXCR4, CXCR7 및 CXCL12를 들 수 있다. 또한, B7 리간드(B7.1 및 B7.2)와 같은 공자극 또는 조절 분자가 유용하다. 또한 사이토카인 예컨대 인터류킨 특히(예컨대 IL-1 내지 IL17), 인터페론(예컨대 IFNalpha1 내지 IFNalpha8, IFNalpha10, IFNalpha13, IFNalpha14, IFNalpha16, IFNalpha17, IFNalpha21, IFNbeta1, IFNW, IFNE1 및 IFNK), 조혈인자, TGFs (예컨대 TGF-알파, TGF-β, 및 TGF 패밀리의 기타 멤버), 마지막으로 수용체의 종양괴사인자 패밀리 멤버 및 이들의 리간드 그리고 비제한적인 예로서 4-1BB, 4-1BB-L, CD137, CD137L, CTLA-4GITR, GITRL, Fas, Fas-L, TNFR1, TRAIL-R1, TRAIL-R2, p75NGF-R, DR6, LT.β.R, RANK, EDAR1, XEDAR, Fn114, Troy/Trade, TAJ, TNFRII, HVEM, CD27, CD30, CD40, 4-1BB, OX40, GITR, GITRL, TACI, BAFF-R, BCMA, RELT, 및 CD95 (Fas/APO-1), 글루코코르티코이드-유도된 TNFR-관련 단백질, TNF 수용체-관련 세포자멸사-매개 단백질 (TRAMP) 및 사멸 수용체-6 (DR6)를 비롯한 기타 자극 분자들도 유용하다. 특히 CD40/CD40L 및 OX40/OX40L은 T 세포 생존 및 증식에 대한 이들의 직접적인 영향으로 인해 복합 면역요법에서 중요한 표적이 된다. 이에 대한 보다 구체적인 검토를 위해서는 문헌 [Lechner et al. 2011: Chemokines, costimulatory molecules and fusion proteins for the immunotherapy of solid tumors. Immunotherapy 3 (11), 1317-1340]을 참조할 것.
6. 세균 치료(Bacterial treatments)
여러 연구들에서 산소가 부족한 종양 내부를 소비하기 위해 클로스트리듐 노비이 같은 혐기성 세균이 이용되었다. 이들은 종양의 산소화된 부분과 접촉시 죽게 되는데, 이는, 이들이 체내 나머지 부분에 대해서는 무해함을 의미한다. 또 다른 전략은 비독성 전구약물을 독성 약물로 전환시킬 수 있는 효소로 형질전환된 혐기성 세균을 이용하는 것이다. 종양의 괴사 부분 및 저산소 부분에서 세균이 증식함에 따라, 이 효소는 종양에서만 발현된다. 따라서, 전신투여된 전구약물은 오직 종양에서만 독성 약물이 되도록 대사된다. 이것은 비병원성 혐기미생물인 클로스트리듐 스포로제네스의 이용에 따라 유용한 것으로 입증되었다.
7. 키나아제 억제제(Kinase inhibitors)
상보적인 암 치료법에 있어서 또 다른 커다란 잠재적인 표적 그룹은 키나아제 억제제인데 이는, 암세포의 성장 및 생존이 키나아제 활성의 탈조절과 밀접히 연관되어 있기 때문이다. 정상적인 키나아제 활성을 회복하고 그에 따라 종양 성장을 감소시키기 위해 광범한 억제제가 사용되고 있다. 표적화된 키나아제 그룹에는 수용체 티로신 키나아제 예컨대 BCR-ABL, B-Raf, EGFR, HER-2/ErbB2, IGF-IR, PDGFR-알파, PDGFR-β, c-Kit, Flt-4, Flt3, FGFR1, FGFR3, FGFR4, CSF1R, c-Met, RON, c-Ret, ALK, 세포질 티로신 키나아제 예컨대 c-SRC, c-YES, Abl, JAK-2, 세린/쓰레오닌 키나아제 예컨대 ATM, Aurora A & B, CDKs, mTOR, PKCi, PLKs, b-Raf, S6K, STK11/LKB1 및 지질 키나아제 예컨대 PI3K, SK1이 포함된다. 소분자 키나아제 억제제로는 예컨대 PHA-739358, 닐로티닙, 다사티닙 및 PD166326, NSC 743411, 라파티닙(GW-572016), 카네르티닙(CI-1033), 세막시닙(SU5416), 바탈라닙(PTK787/ZK222584), 수텐트(SU11248), 소라페닙(BAY 43-9006) 및 레플루노마이드(SU101)를 들 수 있다. 보다 상세한 정보를 찾기를 원하면 예컨대 Zhang et al. 2009: Targeting cancer with small molecule kinase inhibitors. Nature Reviews Cancer 9, 28-39을 참조할 것.
8. Toll-유사 수용체(Toll-like receptrs)
Toll-유사 수용체 (TLRs) 패밀리의 멤버들은 선천성 면역과 후천선 면역간의 중요한 연결고리로서 많은 아쥬반트들의 효과가 TLR의 활성화에 달려있다. 암에 대하여 수립된 백신들의 다수가 백신 반응의 부스팅을 위해 TLR에 대한 리간드를 포함한다. 그 밖에도 TLR2, TLR3, TLR4 특히 TLR7 및 TLR 8이 수동면역치료적 접근법에서 암 치료에 시험된 바 있다. 밀접하게 관련된 TLR7 및 TLR8은 면역 세포, 종양 세포들, 및 종양의 미세한경에 영향을 미침으로서 항종양 반응에 기여하고 뉴클레오사이드 유사체 구조에 의해 활성화될 수도 있다. 모든 TLR들은 단독으로 면역요법에 또는 암 백신 아쥬반트에 사용되어왔으며 본 발명의 포뮬레이션 및 방법에 상승적으로 조합사용될 수 있다. 보다 자세한 정보를 알고 싶으면 van Duin et al. 2005: Triggering TLR signaling in vaccination. Trends in Immunology, 27(1):49-55을 참조할 것.
9. 혈관생성 억제제(Angiogenesis inhibitors)
종양-매개된 탈출 메카니즘 및 면역 억제에 의해 영향을 받는 면역조절 수용체를 표적화하는 치료법에 더해 종양 환경을 표적으로 하는 치료법도 있다. 혈관생성 억제제는 종양이 성장하는데 필요한 혈관의 과도한 성장(혈관생성)을 예방한다. 예컨대 종양의 증가일로에 있는 영양 요구성 및 산소 요구성을 만족시키기 위해 종양 세포들에 의해 촉진된 혈관생성은 다른 분자들을 표적화함으로써 차단될 수 있다. 본 발명과 조합 사용가능한 혈관생성-매개 분자 또는 혈관생성 억제제의 비제한적인 예로는 가용성 VEGF (VEGF 이소폼 VEGF121 및 VEGF165, 수용체 VEGFR1, VEGFR2 및 co-수용체 뉴로필린-1 및 뉴로필린-2) 1 및 NRP-1, 안지오포이에틴 2, TSP-1 및 TSP-2, 안지오스타틴 및 관련 분자, 엔도스타틴, 바소스타틴, 칼레티큘린, 혈소판인자-4, TIMP 및 CDAI, Meth-1 및 Meth-2, IFN-알파, -β 및 -γ, CXCL10, IL-4, -12 및 -18, 프로트롬빈(크링글 도메인-2), 항트롬빈 III 단편, 프로락틴, VEGI, SPARC, 오스테오폰틴, 마스핀, 칸스타틴, 프롤리페린-관련 단백질, 레스틴 및 약물 예컨대 베바시주맙, 이트라코나졸, 카르복시아미도트리아졸, TNP-470, CM101, IFN-알파, 혈소판인자-4, 수라민, SU5416, 트롬보스폰딘, VEGFR 길항제, 혈관생성저해(angiostatic) 스테로이드 + 헤파린, 연골-유도 혈관생성 억제제 인자, 매트릭스 메탈로단백질분해효소 억제제, 2-메톡시에스트라디올, 테코갈란, 테트라티오몰리브데이트, 탈리도마이드, 트롬보스폰딘, 프로락틴알파 Vβ3 억제제, 리노마이드, 타스퀴니모드를 들 수 있다. 이에 대한 보다 자세한 정보는 Schoenfeld 및 Dranoff 2011: 항angiogenesis immunotherapy. Hum Vaccin. (9):976-81를 참조할 수 있다.
10. 소분자 표적요법 약물(Small molecule targeted therapy drugs)
소분자 표적요법 약물은 일반적으로 암세포 내의 돌연변이된, 과발현된, 또는 달리 중요한 단백질들의 효소 도메인의 억제제이다. 이들의 주요한 예로는 티로신 키나아제 억제제 이마티닙(글리벡(Gleevec/Glivec)) 및 게피티닙(이레사)를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 암 치료를 위해 백신과 조합되어 몇몇 키나아제를 표적화하는 소분자 예컨대 수니티닙 말레이트 및/또는 소라페닙 토실레이트의 용도는 이전의 특허출원 US2009004213에 잘 설명되어 있다.
11. 바이러스-기반 백신(Virus-based vaccines)
본 발명의 포뮬레이션과 조합 치료법 접근에 함께 사용될 수 있는 몇몇 바이러스-기반 암 백신이 현재 이용가능하거나 또는 개발 중에 있다. 이러한 바이러스 벡터를 사용하는 한 가지 장점은 면역활성화에 필요한 위험 시그널을 발생시키는 바이러스 감염의 결과로서 일어나는 염증반응과 함께, 면역 반응을 개시하는 이들의 고유한 능력이다. 이상적인 바이러스 벡터는 안전하여야 할 뿐 아니라 항종양 특이적인 반응을 부스팅할 수 있도록 항벡터 면역반응을 도입하지 않아야 한다. 재조합 바이러스, 예컨대 백시니아 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 레트로바이러스 및 아비폭스 바이러스가 동물 종양 모델에 사용되어 왔으며 이들의 고무적인 결과에 기초하여, 인간을 대상으로 한 임상시험이 개시되었다. 특히 중요한 바이러스-기반 백신은 바이러스-유사 입자(VLP), 바이러스의 외피로부터의 특정 단백질을 함유하는 작은 입자들이다. 바이러스-유사 입자들은 바이러스로부터의 유전 물질은 함유하지 않으며 감염을 일으키지 못하지만 그들의 외피 상에 종양 항원들을 제시하도록 구축될 수 있다. VLP는 다양한 바이러스들, 예컨대 B형 간염 바이러스 또는 파보바이러스(예컨대 아데노-관련 바이러스), 레트로바이러스(예컨대 HIV) 및 플라비바이러스(예컨대 C형 간염 바일스)를 비롯한 다른 바이러스 패밀리로부터 유래할 수 있다. 일반적인 검토를 위해서는 문헌[Sorensen 및 Thompsen 2007: Virus-based immunotherapy of cancer: what do we know and where are we going? APMIS 115(11):1177-93; virus-like particles against cancer are reviewed in Buonaguro et al. 2011: Developments in virus-like particle-based vaccines for infectious diseases and cancer. Expert Rev Vaccines 10(11):1569-83; 및 Guillen et al. 2010: Virus-like particles as vaccine antigens and adjuvants: application to chronic disease, cancer immunotherapy and infectious disease preventive strategies. Procedia in Vaccinology 2 (2), 128-133]을 참조할 수 있다.
12. 다중-에피토프 전략(Multi-epitope strategies)
다중 에피토프의 사용은 백신접종에 유망한 결과를 나타낸다. 지능적 알고리듬 시스템과 연계된 패스트 시퀀싱 기술을 이용함으로서 종양 뮤타놈(mutanome)을 이용할 수 있고 본 발명과 조합가능한 개별화된 백신에 대한 다중 에피토프를 제공할 수 있다. 보다 자세한 정보는 문헌 [2007: Vaccination of metastatic colorectal cancer patients with matured dendritic cells loaded with multiple major histocompatibility complex class I peptides. J Immunother 30: 762-772; furthermore Castle et al. 2012: Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer Res 72 (5):1081-91]을 참조할 수 있다.
13. 후천적 T 세포 전달(Adoptive T cell transfer)
예를 들어, 종양 항원 백신접종 및 T 세포 전달의 조합이 다음 문헌에 설명되어 있다: Rapoport et al. 2011: Combination immunotherapy using adoptive T-cell transfer and tumor antigen vaccination on the basis of hTERT and survivin after ASCT for myeloma. Blood 117(3):788-97.
14. 펩타이드-기반 표적 치료법(Peptide-based target therapies)
펩타이드들은 세포 표면 수용체에 결합하거나 또는 종양을 둘러싼 영향을 받은 세포외 매트릭스에 결합할 수 있다. 이들 펩타이드에 부착된 방사성핵종(예컨대 RGDs)는 상기 방사성핵종이 세포 근방에서 붕괴할 경우 종국적으로 그 암세포를 사멸시킨다. 특히 이들 결합 모티프의 올리고머 또는 멀티머들은 매우 흥미로운데, 이는 이것이 증가된 종양 특이성 및 결합활성(avidity)를 유도할 수 있기 때문이다. 이의 비제한적인 예는 문헌 [Yamada 2011: Peptide-based cancer vaccine therapy for prostate cancer, bladder cancer, and maligmant glioma. Nihon Rinsho 69(9): 1657-61]에 설명되어 있다.
15. 기타 치료법
다른 수 많은 암 치료법을 본 발명과 조합할 수 있다. 이의 비제한적인 예로는 세포자멸사 표적화, 온열요법, 호르몬 요법, 텔로머라제 요법, 인슐린 강화 치료법, 유전자치료법 및 광역학 치료법을 들 수 있다.
기술분야의 다양한 공지 방법들을 이용하여 CLDN6을 발현하는 세포를 검색하고 및/또는 그의 양을 구할 수 있다.
예를 들어, 세포내 또는 세포 표면 상에서의 CLDN6 단백질 발현을 검출하기 위해 면역분석법을 이용할 수 있다. 본 발명에서, 면역분석법의 예로는 웨스턴 블롯, 면역조직화학법, 방사능면역측정법, ELISA (효소결합면역흡수측정법), "샌드위치" 면역분석법, 면역침전분석법, 침전반응, 겔 확산 침전반응, 면역확산 분석법, 응집 분석법, 보체결합 분석법, 면역방사능측정 분석법, 형광 면역분석법, 면역형광법, 단백질 A 면역분석법, 유세포분석법 및 FACS 분석법을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
일 구체예에서, CLDN6을 검색 및/또는 그 양을 구하기 전에 CLDN6에 결합하는 능력이 있는 하나 이상의 표지된 항체와 세포를 결합시킨다.
별법으로, CLDN6 mRNA의 발현을 검색하거나 CLDN6 mRNA의 양을 구하여 CLDN6을 발현하는 세포를 검색하거나 그 양을 알아낼 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, CLDN6을 발현하는 세포를 검색하거나 및/또는 그 양을 구하기 위해 환자로부터 얻어지는 샘플은 생물학적 체액일 수 있으며, 이의 비제한적인 예로는 혈액, 골수, 혈청, 뇨 또는 장액일 수 있다. 다른 구체예에서, 환자로부터의 샘플은 조직 샘플(예컨대 암 조직을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상자로부터의 생검물)이다. 가장 좋기로는, 샘플이 종양의 생검물인 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에서, 샘플은 CLDN6을 발현하는 세포를 검색하거나 및/또는 그 양을 구하기 전에 1종 이상의 전처리 단계를 거친 생물학적 샘플일 수 있다. 특정 구체예에서, 생물학적 체액은 원심분리, 여과, 침전, 투석 또는 크로마토그래피 또는 이들 전처리 단계의 조합에 의해 전처리될 수 있다. 다른 구체예에서, 조직 샘플은 냉동, 화학적 고정, 파라핀 포매, 탈수, 투과(permeablization) 또는 균질화 후 원심분리, 여과, 침전, 투석 또는 크로마토그래피 또는 이들 전처리 단계들의 조합에 의해 전처리된다.
샘플 중의 암 줄기세포의 양은 샘플 중의 전체 세포 또는 전체 암 세포에 대한 백분율로서 표현되거나 또는 면적(예컨대 필드 당 세포), 부피 (예컨대 ml 당 세포) 또는 중량 (예컨대 ml 당 세포)에 대해 상대적으로 정량될 수도 있다.
테스트 샘플 중의 암 줄기세포의 양은 레퍼런스 샘플(들) 중의 암 줄기세포의 양과 비교될 수 있다. 일 구체예에서, 레퍼런스 샘플은 이른 시점에서 (예컨대 베이스라인 레퍼런스 샘플로서 치료를 받기 전 또는 치료를 받는 동안 조기 시점에서) 치료를 받는 중인 대상자로부터 수득된 샘플이다. 이 구체예에서, 치료는 레퍼런스 샘플에 비해 테스트 샘플에서 암 줄기세포의 양의 감소를 초래하는 것이 바람직하다. 또 다른 구체예에서, 레퍼런스 샘플은 검색가능한 암에 걸리지 않은 건강한 환자, 또는 동일한 종류의 암에 대해 관해 상태의 환자로부터 얻어진다. 이 구체예에서, 치료는 레퍼런스 샘플에서 검색되는 것과 동량의 암 줄기세포를 갖거나 더 적은 양의 암 줄기세포를 갖는 테스트 샘플을 결과시키는 것이 바람직하다. 특정 구체예에서, 해당 대상자에 대해 앞서 구해진 (미리 검색된) 암 줄기세포 양에 비해 암 줄기세포의 양이 안정화 또는 감소되었다 함은 대상자의 예후가 좋아졌거나 치료에 대해 긍정적인 반응이 얻어졌음을 가리키는 것인 반면, 앞서의 암 줄기세포 양에 비해 증가되었다면 예후에 변동이 없거나 더 악화되었음을 가리키거나 및/또는 그 치료에 반응하지 못하였음을 가리키는 것이다.
몇몇 구체예에서, 샘플 중의 암 줄기세포의 양을 구하기 위해 세포 표면 마커들의 조합, 예컨대 암 줄기세포에 전형적인 다른 마커들과 CLDN6과의 조합을 이용한다.
본 발명은 또한 CLDN6을 발현하는 세포를 검색, 그 양의 결정 또는 모니터링하기 위한 시약이 충전된 용기를 하나 이상 포함 하는 키트를 제공한다. 일 구체예에서, 키트는 임의로 CLDN6을 발현하는 세포를 검색 및/또는 그의 양을 구함으로써 암 치료의 효능을 모니터링하거나 암 줄기세포를 검색하기 위한 시약의 사용, 특히 본 발명의 방법에 따라 시약을 사용하기 위한 지침서를 포함한다. 일 구체예에서, 키트는 CLDN6 단백질 또는 CLDN6 mRNA에 특이적으로 결합하는 물질을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 이 물질은 항체 또는 항체 단편이다. 다른 구체예에서, 이 물질은 핵산이다. 핵산 검색을 위해, 키트는 일반적으로 CLDN6 mRNA에 특이적인 프로브 (그러나 이에 한정되지 않음)를 포함한다. 정량적 PCR을 위해, 키트는 일반적으로 CLDN6 핵산 서열에 특이적인 미리-선택된 프라이머들을 포함한다. 정량적 PCR 키트는 또한 핵산을 증폭시키는데 적합한 효소(예컨대 Taq와 같은 폴리머라제) 및 데옥시뉴클레오타이드 및 반응 혼합물의 증폭에 요구되는 완충액 역시도 포함할 수 있다. 정량적 PCR 키트는 또한 CLDN6 핵산 서열에 특이적인 프로브도 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 정량적 PCR 키트는 데옥시뉴클레오타이드와 함께 역전사를 위한 프라이머 및 RNA 포함 효소를 역전사하는데 적합한 성분 (예컨대 역전사효소) 및 역전사 반응에 필요한 완충액을 포함할 수도 있다.
특정 구체예에서, 이 물질은 검색가능하게 표지된다. 또한, 키트는 분석을 실시하기 위한 지침과 분석 수행의 결과 얻어진 데이터를 해석 및 분석하는 방법에 대한 지침을 포함할 수도 있다.
얻어진 데이터에 기초하여 (즉 암 줄기세포가 존재하는지 또는 암 줄기세포가 안정화되거나 감소되었는지), 의사는 암 줄기세포에 지향된 암 치료법과 같은 특정 암 치료법을 선택하거나 또는 치료를 계속할지를 선택할 수 있다. 별법으로, 암 줄기세포가 존재하지 않거나, 암 줄기세포의 양이 증가했다는 결과에 기초해서, 의사는 암 줄기세포에 지향되지 않은 암 치료제를 투여하거나 또는 당해 치료를 지속, 변경 또는 중단할 지를 결정할 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, 암 치료를 받는 환자로부터 얻어진 샘플 중의 암 줄기세포 집단을 그 환자로부터 미리 얻은 샘플과 비교시 만일 암 줄기세포집단의 감소가 부적합한 것으로 결정되는 경우, 의사는 치료법을 조정할 몇 가지 옵션을 갖는다. 예를 들어, 의사는 암 치료제의 양, 투여 빈도 또는 투여 기간을 증가시키거나 또는 이들의 조합을 수행할 수 있다. 특정 구체예에서, 이러한 결정 후, 제1 치료제 대신 또는 제1 치료제와 조합하여, 또 다른 암 치료제를 환자에게 투여할 수 있다.
또 다른 특정 구체예에서, 암 치료를 받는 환자로부터 얻어진 샘플 중의 암 줄기세포 집단을 그 환자로부터 미리 얻은 샘플과 비교시 만일 암 줄기세포집단의 감소가 허용가능한 것으로 결정될 경우, 의사는 그 암 치료법을 변형시키지 않도록 선택할 수 있을 것이다. 예를 들어, 의사는 암 치료제의 양, 투여 빈도 또는 투여 기간을 증가시키지 않도록 선택할 수 있다. 또한, 의사는 부가적인 치료제를 첨가하거나 조합 치료법을 부가하도록 선택할 수도 있다.
이하의 구체적인 실시예들을 참조로 본 발명을 더욱 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: CLDN6은 유도된 인간 다능성 줄기세포 상에서 발현된다
CLDN6이 인간의 유도된 다능성 줄기세포(iPSC: induced pluripotent stem cells)에서 발현되는지 알아보기 위해, ABI PRISM 7300 서열 검색 시스템 및 소프트웨어 (Applied Biosystems with QuantiTect SYBR green Kit (Qiagen))를 이용하여 QuantiTect SYBR 그린 키트(Qiagen))에 의해 정량적 실시간 RT-PCR (qRT-PCR)을 이용함으로써, 다양한 처리 시점에서의 신생아의 HFF (인간 포피 섬유모세포, System Bioscience)에서의 CLDN6의 전사 발현을 재프로그램 칵테일 (비변형 OSKMNL+EBK+miR-mix; OSKMNL의 시험관내 전사된 (IVT) RNA = OCT4, SOX2, KLF4, cMYC, NANOG 및 LIN28, EBK의 전사 인자 IVT-RNA = IFN-escape 단백질 E3, K3 및 B18R 및 miR-302a/b/c/d 및 367로 이루어진 miRNA 믹스; PCT/EP2012/04673에 설명된 프로토콜에 따름) 또는 목(mock) 트랜스펙션된 HFFs (무RNA 대조군: no RNA control)를 이용하여 분석하였다. 세포들을 10 ng/ml bFGF 및 0.5 μM 티아조비빈이 보강된 Nutristem 무혈청 배지(Stemgent, Cambridge (MA))에서 배양하였다. 실험 제1, 2, 3, 4, 8, 9, 10 및 11일에 리포펙타민 RNAiMAX (Life Technologies)을 이용하여 재프로그램 칵테일을 트랜스펙션시켰다. 대조군으로서, 세포들을 리포펙타민 RNAiMAX 만으로 (무RNA 대조군) 처리하였다. 본 발명자들은 처리 제19일에 무처리 HFF에 비해 거의 6000배나 CLDN6이 증가하고 처리 제12일에 무처리 HFF에 비해 CLDN6이 약 2000배 상향조절되었음을 명확히 검색하였다 (도 1). 따라서, CLDN6 은 인간 유도된 다능성 줄기세포(iPSC)에서 발현된다.
iPSC의 표면에서도 CLDN6이 발현하는지 검사하기 위이해 유세포분석법을 이용하였다. iPSC가 HFF 피더 세포에서 성장함에 따라, 본 발명자들은 iPSCs를 특이적으로 검출하기 위해 잘 허용된 줄기세포 마커인 SSEA-4에 대한 염색 분석을 병용하였다. 이 목적을 위해, 재프로그램 칵테일로 처리된 HFF 세포들 또는 목 콘트릴(RNA 없음)을 처리 제5, 12 및 19일에 수집하고 1 μg/ml CLDN6-특이적 IMAB027-AF647 및 2 μl SSEA-4 항체로 4℃에서 30분간 염색하고 표면 발현을 유세포분석법에 의해 측정하였다. 본 발명자들은 또한 우리의 분석 대상으로부터 죽은 세포를 배제시키기 위해 염색 프로토콜에 Viability Dye 7-AAD도 포함시켰다. 실험은 두 번 실시하였고 BD Canto II Flow Cytometer를 이용하여 각 샘플에 대해 50.000 이벤트를 기록하였다. 기록된 샘플들의 분석은 FlowJo Software를 이용하여 수행하고 대표적인 점 그래프를 나타내었다 (도 2).
제5일에, CLDN6은 재프로그램 칵테일로 처리되었는지 안되었는지와 관계 없이 HFF 표면 상에서 검출되지 않았다. 예기치 않게도 본 발명자들은 재프로그램 칵테일로 처리되었는지 안되었는지와 관계 없이 HFF의 15%에서 SSEA-4가 발현된 것을 발견하였다. 이것은 사용된 HFF가 신생아의 섬유모세포이고 이들 세포들이 SSEA-4에 대해 특정 양성을 유지한다는 사실에 의해 설명가능하다. 처리 제12일에, 처리된 HFF의 약 63%가 SSEA-4에 대해 양성이었고 본 발명자들은 약 15%의 CLDN6-SSEA-4 이중 양성 분획을 관찰하였다. 처리 제19일에는, 처리된 HFF의 15%가 CLDN6 및 SSEA-4에 대해 양성을 나타내어, 뚜렷한 부분모집단을 나타내었다. CLDN6-SSEA-4 양성 부분모집단은 iPSC만을 마크하는 반면, CLDN6-SSEA-4 음성 부분모집단은 HFF 피더 세포 또는 재프로그램되지 않은 세포를 나타내고 SSEA-4 단일 양성 세포들은 재프로그래밍 개시 무렵의 세포들을 나타내는 것으로 추정된다.
본 발명자들이 발견한 바와 같이 HFF 세포의 15%가 SSEA-4에 대해 양성인 반면 CLDN6에 대해서는 그렇지 않으므로, CLDN6은 SSEA-4에 비해 인간 iPSC에 대해 더욱 특이적인 마커인 것으로 추정된다. SSEA-4는 또한 신생아 HFF에서도 발현되는 반면 CLDN6은 iPSC 분획을 나타내는 완전히 재프로그램된 HFF 세포에서만 특이적으로 발현되는 것으로 보인다.
따라서, CLDN6은 인간 iPSC 표면에서 특이적으로 발현된다.
실시예 2: CLDN6은 난소암 세포의 집락 형성에 중요하다
종양 세포의 CSC-유사 특성을 분석하기 위한 강력한 분석법은 집락형성능 분석법이다. 이 분석법을 이용함으로써, 단일 종양 세포의 자가-재생능과 종양 형성능을 쉽게 시험할 수 있다. CLDN6이 종양 형성에 있어 어떤 역할을 하는지 알아보기 위해, 본 발명자들은 한 편으로는 CLDN6 양성 세포의 부분모집단만을 나타내는 난소 종양 세포주인 COV318을, 다른 한 편으로는 CLDN6의 안정한 렌티바이러스 스몰 헤파린 RNA(shRNA) 매개된 녹다운 (클론 PA-1 50, PA-1 54)을 갖는, 동종적으로(homogeneously) CLDN6을 발현하는 세포주인 PA-1을 선택하였다; 도 3 참조.
세포들을 4℃에서 30분간 1 μg/ml IMAB027-AF647으로 CLDN6에 대해 염색한 후 이들의 CLDN6 발현과 관련하여 BD FACSAria 세포 소터(sorter)를 이용하여 FACS (형광활성화 세포 소팅)를 이용하여 소팅하였다. CLDN6-양성 또는 -음성 부분모집단의 500 (PA-1 50, PA-1 54) 세포 또는 700 (COV318) 세포들을 6-웰 플레이트의 웰에 직접 소팅하고 충분한 집락이 형성될 때까지 최대 14일 동안 성장시켰다. 1주일에 2회, 배양 배지를 갈아주었다. 집락들을 염색하고 10% 에탄올 중 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 20분간 고장한 다음, 증류수로 3회 세척하고 공기-건조시켰다. 사진을 찍고 집락들을 수동으로 계수하였다. 적어도 50개의 세포들은 집락이 된 것으로 간주되었다. 도 4에, COV318 및 CLDN6-녹다운 세포주 PA-1 50 및 54 세포주의 대표적인 집락 형성능 분석 결과를 나타내었다.
흥미롭게도, CLDN6 음성 세포들은 CLDN6 양성 세포들에 비해 두 가지 세포주 모두에서 유의적으로 더 낮은 집락형성능을 나타내었다. 이 결과로부터 본 발명자들은 CLDN6이 암 줄기세포의 기본 특성인 집락형성능에 있어서 중요한 역할을 한다고 결론지었다.
실시예 3: CLDN6은 난소암 세포주에서 CSC 마커인 CD24, CD90 및 CD44와 함께 공동-발현된다.
고형 종양 및 세포주로부터 CSC를 동정 및 분리하기 위해 특이적인 표면 마커 발현 프로파일을 이용하는 것은 흔한 전략이다. 문헌 상에 나타난, 난소암으로부터의 CSC 분리를 위한 표면 마커로는 CD44, CD24, CD90, CD34, CD117 및 CD133을 들 수 있다. CLDN6 양성 세포의 작은 부분모집단을 함유하는 난소암 세포주 내의 CSC 부분모집단을 동정하는 것이 가능한지를 분석하기 위해, 본 발명자들은 이들 표면 마커에 대한 항체들을 포함하는 FACS 패널을 수립하였다 (표 1). 또한, 본 발명자들은 잘-확립된 CSC 마커를 이용하여 CLDN6의 공통-국소화(co-localization) 백분율 조사를 위해 패널 내의 CLDN6의 검사를 위한 항체를 포함시켜, CLDN6이 CSC에 대한 마커 역할을 할 수 있는 잠재능을 판단하였다. 이 목적을 위해, 세포주 COV318의 1E6개의 세포들을 표시량의(표 1 참조) 항체로 4℃에서 30분간 염색한 다음 세포들을 그의 표면 마커 발현 프로파일에 대해 유세포분석하였다. 본 발명자들은 죽은 세포를 우리의 분석에서 배제하기 위해, 염색 프로토콜에 Viability Dye eFluor®506도 포함시켰다. 실험은 3회 실시하고 BD Canto II Flow Cytometer를 이용하여 각 샘플로부터 50.000 이벤트를 기록하였다. 기록된 세포들의 분석은 FlowJo Software를 이용하여 수행하였다.
Figure pat00019
표 1: CSC FACS 패널. 난소암 세포주에서 CLDN6 발현 및 CSC 마커의 분석을 위한 FACS 패널을 나타냈다. 대응하는 마커에 대해 사용된 항체의 양과 커플링된 플루오로크롬을 나타냈다.
FACS 분석 결과 COV318 세포는 CSC 마커 CD44, CD90 및 CD24의 부분모집단을 발현하고 CLDN6은 이들 세가지 모든 마커에 대해 적어도 부분적으로 공통-국소화하는 것으로 나타났다 (도 5A). 이어서 본 발명자들은 4가지 마커 모두의 공통-국소화 백분율을 계산하기 위해 다른 게이트 전략을 이용하였다. 먼저, 본 발명자들은 전체 살아있는 세포집단에서의 CD44, CD24, CD90 및 CLDN6 양성 세포의 백분율을 구하였다. 본 발명자들은 살아있는 세포의 0.18%가 4 가지 모든 마커들에 양성임을 발견하였다. 이어서, 본 발명자들은 살아있는 세포집단에서의 CD44, CD24 및 CD90 양성 세포의 백분율을 계산하였다 (CSC 분획을 나타내는 것일 수 있음). 본 발명자들은 세포들의 0.23%만이 전체 살아있는 세포집단을 기준으로 할 경우 세 가지 모든 마커들에 대해 양성인 반면, CLDN6-양성 부분모집단과 관련하여 계산할 경우 세포들의 20.1%가, CLDN6-양성 부분모집단에서 3 가지 마커의 87배 농도를 나타내는 삼중 양성인 것을 발견하였다. 마지막 단계에서 본 발명자들은 한 편으로는 살아있는 전체 세포집단에서 다른 한편으로는 CD44/CD24/CD90 양성 부분모집단에서의 CLDN6 양성 세포의 백분율을 구하였다. 이로부터 CLDN6 발현 세포 농도가 전체 세포집단에서는 0.91%인 반면, CSC 분획에서는 66.78%로서, 74배 증가하였음을 나타낸다 (도 5B).
이와 함께, 이들 데이터는 CLDN6이 CSC 분획 내에 축적되고 존재하고, 역으로 CSC 마커에는 CLDN6-양성 부분모집단이 풍부하다. 이러한 발견은 CLDN6이 CSCs에 대한 마커임을 가리키는 것이다.
실시예 4: CLDN6 발현 세포의 강화(enrichment)는 수립된 CSC 마커들인 CD44, CD24 및 CD90의 축적을 일으킨다
세포주 및 종양으로부터 분리된 CSC 분획들은 CD44 및 CD24와 같은 CSC 마커가 종종 풍부한 것으로 나타났다. CSC에 대한 신규 마커로서 기능할 수 있는 CLDN6의 잠재력을 분석하기 위해, 본 발명자들은 벌크 세포들로부터의 CLDN6-양성 분획의 세포 분리가 수립된 난소 CSC 마커의 축적을 결과시키는지 조사하였다.
이 목적을 위해, COV318 세포들을 0.5 μg/ml IMAB027로 30분간 4℃에서 염색한 다음 염소 항-인간 IgG 2차 항체(1:300)과 함께 10분간 4℃에서 인큐베이션한 다음 BD FACSAria 세포 소터를 이용하여 FACS 소팅에 의해 COV318 세포로부터 CLDN6-양성 및 CLDN6-음성 세포 분획들을 분리하였다. 이어서 선택된 세포들을 표준성장 조건 하에 10일간 증식시켰다. 두 가지 부분모집단 모두의 1E6개 세포들을 CSC 마커인 CD44, CD24, CD90, CD34, CD117 및 CD133로 30분간 4℃에서 염색하고 (자세한 내용은 표 1 참조) 이들의 표면 마커 발현 프로파일을 알아보기 위해 유세포분석법을 실시하였다. BD Canto II Flow Cytometer을 이용하여 각 샘플로부터 50.000 이벤트를 기록하고 기록된 세포들의 분석을 FlowJo Software를 이용하여 수행하였다.
FACS 분석 결과 CLDN6-양성 소팅된 분획 세포들의 약 50%가 10일간의 표준 조건 하 배양 후에도 CLDN6에 대해 여전히 양성인 반면, CLDN6-음성 소팅된 세포들은 CLDN6에 대해 완전히 음성인 것으로 나타났다. 본 발명자들은 CLDN6-양성 분획이 COV318 세포의 CLDN6-음성 세포 분획에 비해 CSC 마커들인 CD44, CD24 및 CD90을 더 축적하였음을 발견하였는데 이는 중요한 것이다. 여러 샘플들의 대표적인 점 그래프를 도 6A에 나타내었다. 이들 마커들의 발현 수준의 추가 정량 결과, CLDN6-양성 및 CLDN6-음성 부분모집단을 비교하자 CD44는 99배 강화, CD90은 8배 강화, CD24는 33배 강화된 것으로 밝혀졌다 (도 6B).
이러한 발견은 CLDN6이 벌크 세포주들로부터 CSC 분획을 분리하는 선발 마커로서 사용가능하며 CLDN6이 신규한 CSC 마커임을 가리키는 것이다.
실시예 5: CLDN6 고발현 세포주는 CLDN6 저발현 세포에 비해 CSC 마커가 강화된 것으로 나타난다
CLDN6은 생식세포 종양, 난소 선암종 및 초기(primitive) 표현형에서 고도로 발현되는 것으로 나타났다. CLDN6이 CSC 마커라면 그러한 세포주나 종양에 CSC-유사 특성을 갖는 세포들이 축적되고 그에 따라 CSC 마커 양성 세포가 축적될 것으로 예상할 수 있다.
본 발명자들은 4종의 CLDN6-고발현 세포주, 즉 난소 암종 세포주 OV90 및 PA-1와 고환 암종 세포주 NEC-8 및 NEC-14를 대상으로, 수립된 CSC 마커의 발현 수준을 조사하였다. 이 목적을 위해, 각 세포주 1E6개를 표면 마커 CD44, CD24, CD90, CD34, CD117 및 CD133에 대해, 그리고 CLDN6에 대해 30분 동안 4℃에서 염색한 다음 (상세한 내용은 표 1 참조) 세포들의 발현 프로파일을 유세포분석법으로 분석하였다. 실험은 3회 실시하고 BD Canto II Flow Cytometer을 이용하여 각 샘플로부터 50.000 이벤트를 기록하고 기록된 세포들의 분석을 FlowJo Software를 이용하여 수행하였다. 생존능 염료 eFluor®506를 이용하여 세포를 카운터염색시킴으로써, 죽은 세포들을 분석대상에서 제외하였다. 각 샘플의 대표적인 점 그래프를 도 7에 나타내었다.
FACS 분석 결과 조사된 모든 세포주들이 CLDN6에 대해 약 95% 양성인 것으로 나타났다. 예상된 바와 같이, 이들 CLDN6-고발현 세포주들은 CLDN6 외에도 수립된 CSC 마커들 역시도 축적한 것으로 나타났으며, OV90 세포는 CD44, CD133, CD24 및 CD117을 고발현하고, PA-1 세포는 CD44, CD133, CD90 및 CD117 및 NEC-8을 고발현하며 NEC-14 세포는 마커 CD133, CD90, CD24 및 CD117에 대해 상승된 발현 수준을 나타내었다.
이러한 발견은 CLDN6-고발현 세포주들에 CSC-유사 세포가 풍부하고 CLDN6이 CSC 마커라는 것을 더 뒷받침해준다.
실시예 6: 진행된 인간 이종이식편 종양을 CLDN6 항체와 화학치료 약물로 처리하면 상승적인 방식으로 종양 세포 성장이 억제되고 생존이 연장된다
Hsd:무흉선 누드-Foxn1 nu 마우스들에게 인간 암 세포주를 생착시켰다. 종양이 수립된 후, 종양-산생 마우스들을 그룹지어 이들에게 CLDN6-특이적 모노클로날 항체 (IMAB027), 화학치료 약물 또는 이들 양자의 조합을 투여하였다. 대조군에게는 항체 완충액 (비히클 대조군)을 투여하였다.
특히, 인간 ES-2(CLDN6) 이종이식편 종양의 치료를 위해, 인간 CLDN6으로 안정하게 트랜스펙션된 인간 난소 암종 세포주 ES-2를 1 x 비필수 아미노산 용액 (Life Technologies), 700 μg/ml G418 (Life Technologies) 및 10% FCS (Life Technologies)를 함유하는 최소필수배지에서 37℃, 5% CO2의 보습 인큐베이터에서 배양하였다. 생착을 위해, 6주령의 암컷 Hsd:무흉선 누드-Foxn1 nu 마우스들의 옆구리에 200 μl PBS 중 5 x 106 ES-2(CLDN6) 세포를 피하 접종하였다. 종양을 피하 접종한 후 제3일에 마우스들을 염수 대조군, 항체 또는 화학요법제 단일요법 및 항체/세포증식억제 약물 조합 요법 처리군 (그룹 당 n=12)으로 처리하였다. 15 mg/kg 파클리탁셀 또는 염수 대조군을 생착 후 제3일, 10일 및 17일에 투여하였다. 항체 유지 처리를 위해 제4일에 개시하여 1주일에 3회 35 mg/kg IMAB027 또는 비히클 대조군 (IMAB027 완충액) 볼러스 주사하였다 (교대로 i.v./i.p./i.p.). 종양 부담과 동물의 건강 상태를 1주일에 2회 모니터링하였다. 종양 크기가 최대 1400 mm3에 달하거나 종양이 궤양화되면 마우스들을 희생시켰다. 크루스칼-월리스(Kruskal-Wallis) 검사 및 사후 Dunn's 다중비교검사를 이용하여 종양 크기 억제를 분석하였다.
진행된 인간 NEC14 이종이식편 종양의 치료를 위해 인간 고환 생식세포 종양 세포주 NEC14를 5% CO2와 함께 37℃ 보습 인큐베이터에서, 10% FCS (Life Technologies)를 함유하는 RPMI 1640 배지 GlutaMAX™ (Life Technologies)에서 공급자 지침에 따라 배양하였다. 생착을 위해, 6-8 주령의 암컷 Hsd:무흉선 누드-Foxn1 nu 마우스들의 옆구리에 200 μl PBS 내의 2 x 107 NEC14 세포들을 피하 접종하였다. 진행된 치료 연구에서, 종양들을 50 내지 150 mm3 크기로 성장시키고 치료 전에 마우스들을 대조군, 항체 또는 세포증식억제 약물 단일요법 및 항체/세포증식억제 약물 조합 요법 그룹으로 나누었다 (그룹 당 n=19). 생착으로부터 6일 후 약물들을 단독으로 또는 비히클 대조군 (염수)와 조합하여 다음과 같이 투여하였다: 제6, 7, 8, 9 및 10일에 1 mg/kg 시스플라틴 볼러스 i.p. 주사; 제6, 13 및 20일에 30 mg/kg 카르보플라틴 및 항체 유지 처리를 위해 볼러스 i.p. 주사 및 1주일에 3회 35 mg/kg IMAB027 또는 비히클 대조군 (IMAB027 완충액) 볼러스 주사 (교대로 alternating i.v./i.p./i.p.). 종양 부담을 1주일에 2회 모니터링하였다. 종양 크기가 최대 1400 mm3에 이르거나 종양이 궤양화되면 마우스들을 희생시켰다. 크루스칼-월리스 검사 및 사후 Dunn's 다중비교검사를 이용하여 종양 성장 억제를 분석하였다.
대조군과 비교해서, 인간 CLDN6을 이소적으로 발현하는 인간 ES-2(CLDN6) 이종이식편 종양을 파클리탁셀로 치료하는 것은 효과가 없으며 항-종양 활성을 나타내지 않는다. 이와 대조적으로, IMAB027은 종양 성장을 억제하고 마우스 생존을 연장시킨다. IMAB027과 파클리탁셀과의 조합으로 치료하면 종양 성장이 상승적으로 억제된다 (도 8).
또한, 단일 제제로서 시스플라틴 및 IMAB027 양자 모두 NEC14 종양 산생 동물에서 종양 성장을 고도로 유의적으로 감소시킬 수 있다. 그러나, 초기 종양 성장 억제 후, 본 발명자들은 대부분의 동물에서 종양 성장이 재발되는 것을 관찰하였다. 조합 요법 접근법에서, 시스플라틴과 IMAB027은 상승적으로 작용하여 종양 성장을 억제하는 것 뿐 아니라, 완전한 NEC14 종양 관해를 일으킨다. 생존 데이터는 시스플라틴과의 조합시 IMAB027의 치료 효능이 가장 명확하다는 것을 보여준다. 단일약물 접근법에 비해 시스플라틴과 조합하여 IMAB027로 치료된 거의 모든 마우스들은 종양 생착 90일 후에도 여전히 살아있었다(도 9).
NEC14 이종이식편 종양을 산생하는 마우스의 진행된 치료에서, 카르보플라틴과 같은 다른 플라틴-유도체들은 오직 제한된 항종양 효능만을 나타내었다. 그러나, 카르보플라틴과 IMAB027와의 조합은 종양 성장 억제 및 생존 연장 측면에서 고도로 효과적으로, 상승적인 종양 억제 효과를 나타내었다 (도 10).
따라서, 화학치료 약물과 CLDN6-특이 항체와의 조합은 종양 성장 억제를 증가시키고 인간 종양 세포가 생착된 마우스의 생존을 연장시킨다. 항체와 화학치료약물과의 조합은 종양 세포 성장의 억제 및 생존 연장와 관련하여 상승된 효과를 나타낸다.
실시예 7: CLDN6은 CSC 마커이다
실시예 7.1: CLDN6은 난소암 세포의 스피어(sphere) 형성 거동에 있어 중요하다
종양 세포의 CSC-유사 특성을 분석하는 또 다른 강력한 분석법은 스피어 형성 분석법이다. 이 분석법을 이용함으로써, CSC의 전형적인 특징인 비부착증식(anchorage independent growth)에 대한 세포의 능력을 쉽게 검사할 수 있다. CLDN6이 종양 세포의 비부착증식에 어떤 역할을 하는지 분석하기 위해, 본 발명자들은 CLDN6 양성 세포들의 부분모집단만을 함유하는 난소 종양 세포주인 COV318 세포를 선택하였다. COV318 세포들을 그들의 CLDN6 발현에 대해 소팅하고 CLDN6 양성 및 음성 세포집단을 줄기세포-특이 조건 하에서 21일간 방치시켜 스피어를 형성하도록 하였다. 스피어 형성능 분석(Spheres Forming Assays) 결과 CLDN6 양성 COV318 세포들은 줄기세포 특이 조건 하에서 배양시 스피어를 형성하는 능력을 나타내지만, CLDN6 음성 세포들은 거의 다 죽은 것으로 나타났다 (도 11A). 이러한 발견은 CLDN6 양성 분획이 비부착증식능을 나타내는 줄기세포가 풍부한 세포집단임을 나타낸다.
CLDN6 양성 COV318 세포가 그의 미분화 상태를 유지하면서 세포 분열의 많은 사이클을 거칠 수 있는 능력을 규정하기 위해, 본 발명자들은 제2 세대 스피어를 생산하는 스피어 형성능을 분석하였다. 이 목적을 위해 CLDN6 양성 COV318 세포의 제1 세대 스피어 (접종 22일 후)들을 단일 세포로 나눈 다음 재도말하였다. 재도말한지 23일 후 본 발명자들은 제2 세대 스피어들이 형성되었음과 이들 새로이 형성된 스피어들이 최초의 제1 세대 스피어에 비해 형태학적으로 더 균질함을 발견하였다 (도 11B). 이러한 관찰은 COV318 세포의 CLDN6 양성 분획이 이 세포주의 줄기세포 분획을 나타냄을 더욱 확인해주는 것이다.
이를 종합하면, 이러한 결과는 CLDN6이 암 줄기세포의 필수 특성인 난소암 세포의 비부착증식에 있어 대단히 중요한 역할을 함을 명확히 보여주는 것이다.
실시예 7.2: 시험관내 화학치료약물로 치료 후 CLDN6-양성 COV318 세포의 강화
난소암 세포주 COV318은 CLDN6의 이질적인 발현을 나타내며 세포들의 매우 작은 부분모집단(~ 0.3 - 0.5%)이 CLDN6을 발현한다. COV318 세포를 시험관내에서 플라틴-유도체로 처리하면 각 경우에 CLDN6 양성 세포를 더 높은 백분율 (> 2%)로 갖는 잔여 세포집단이 생성된다 (도 12). 처리 후 CLDN6 양성 세포의 특이적인 축적인 이들 세포들이 화학요법 동안 선택적 생존 또는 성장에 관하여 장점을 가질 수 있음을 가리킨다. 통상적인 화학요법에 대한 내성은 CSCs의 한 가지 특징이다.
실시예 7.3: 생체내 CLDN6-양성 COV318 세포들의 강화
앞서의 연구에서, 본 발명자들은 무흉선 누드 마우스의 옆구리에 피하 접종된 COV318 세포들이 약한 종양원성을 나타냄을 발견하였다. 이와 대조적으로, COV318 세포가 복강 주사에 의해 투여된 마우스들에서는 100일 이후에 악성 복수가 차고 복부 종양이 발생하였다. 모(parental) COV318 세포와 대조적으로 (도 13A), 복수 및 종양으로부터 분리된 세포들 대다수는 CLDN6 양성이었다 (도 13B, 상부 패널). COV318 세포들은 표준 조건 하에서 배양된 후에 시험관내에서 CLDN6 발현능을 다시 상실한다 (도 13B, 하부 패널). 이것은 CLDN6 양성 COV318 세포들이 더 큰 종양-형성능을 갖는다는 것과, 적은 CLDN6 양성 부분모집단이 CSC를 함유함을 시사하는 것이다.
실시예 7.4: CLDN6은 원발 종양 샘플에서 난소암 줄기세포 마커와 상관관계가 있다
본 발명자들의 이전의 연구 결과가 CLDN6이 몇몇 CSC 마커와 함께 난소암 세포주에서 공통-국소화한다는 것을 나타냈기 때문에 본 발명자들은 CLDN6 발현이 난소암 환자로부터의 원발 종양 샘플에서 CSC 마커와도 상관관계가 있는지 알아보기로 하였다.
이 목적을 위해, 난소암에서 암 줄기세포 특이적이라고 문헌상에 설명된 선발된 마커들 (CTCFL, LIN28B, CD24, GNL3, EpCAM, CD44, ABCG2, ALDH1A1, AMACR, ATXN1, BMI1, BMP4, CD34, CD117, Myd88, Nanog, Notch 1, Pou5F1, CD133, Snail, Sox 2)과 CLDN6의 mRNA 발현을 qRT-PCR에 의해 42종의 인간 난소암 샘플에서 분석하였다. 이들 마커들과 CLDN6의 상관관계를 스피어만 분석법을 이용하여 후속적으로 분석하였다. 유의적인 상관관계로부터의 산포도와 모든 상관관계를 요약하여 도 14에 나타내었다.
CLDN6와 CTCFL, LIN28B, CD24, GNL3 및 EPCAM에서는 양의 상관관계가 발견된 반면, CD44는 분석된 난소암 샘플에서 CLDN6과 음의 상관관계를 갖는 것으로 밝혀졌다(도 14A). 다른 모든 조사된 마커에 있어서 어떠한 유의적인 상관관계도 관찰되지 않았다 (도 14B).
이러한 발견은 CLDN6이 CSC 마커임을 뒷받침하는 것이다.
실시예 8: 항-CLDN6 항체의 항종양 활성은 화학치료 약물과의 조합에 의해 증강된다
실시예 8.1: IMAB027-매개된 ADCC에 미치는 화학요법제의 영향
IMAB027-매개된 ADCC에 미치는 화학요법제의 영향을, 카르보플라틴, 겜시타빈, 파클리탁셀, 독소루비신 및 토포테칸으로 각각 전처리된 COV362(Luc) 세포를 이용하여 분석하였다. 유세포분석법으로 나타난 바와 같이, 표적 세포의 전처리에 의해 CLDN6의 단백질 수준이 증가되었다 (도 15B, D, F, H 및 J). 미처리 표적 세포와 대조적으로, 화학요법제로 처리된 세포들의 최대 용해는 최대 3배까지 증가된다 (도 15A, C, F, G 및 I). 요약하면, IMAB027의 항종양 활성은 화학치료 약물과의 조합으로 증강될 수 있다.
실시예 8.2: 다중-화학요법 PEB (시스플라틴, 에토포사이드 및 블레오마이신)와 IMAB027와의 조합은 NEC14가 생착된 마우스의 종양 성장을 고도로 효과적으로 억제해주고 수명을 연장시킨다
Hsd:무흉선 누드-Foxn1 nu 마우스들에게 인간 고환 생식세포 종양 세포주 NEC14를 피하 생착시켰다. 매우 진행된 종양을 갖는 마우스들을 무작위화하여 항체 IMAB027, 다중-화학요법 PEB (시스플라틴, 에토포사이드 및 블레오마이신) 또는 IMAB027와 PEB와의 조합으로 처리하였다.
무처리 마우스 및 IMAB027-처리된 마우스에 비해 다중-화학요법 처리군이 종양 성장을 훨씬 유의적으로 감소시킨다 (도 16A). 그러나, 초기에 종양이 PEB 처리에 반응한 후, 제30일에 종양은 대부분의 동물에서 자라기 시작했다. PEB와 IMAB027가 함께 상승적으로 작용한 조합 접근법에서만 종양 성장이 지속적으로 억제되었다 (도 16B). 무처리 마우스들은 중앙 생존기간이 30일인 반면, IMAB027 및 PEB로 각각 처리된 마우스들에 있어서는 중앙 생존 기간이 각각 34일과 97일이었다. PEB으로 처리된 그룹에서는, 3/14 (21%) 마우스들이 완전한 종양 관해를 나타내었고 1/14 (7%) 마우스들은 연구 말기에 ~30 mm3의 잔여 종양 덩어리가 남아있었다. 놀랍게도 PEB와 IMAB027와의 조합으로 처리된 마우스들에 있어서는 12/14 (86%) 마우스들에서 완전한 종양 관해가 관찰되었다. 6개월 넘게 11마리의 마우스들에서 어떠한 재발도 일어나지 않고 치유되었으며 한 마리의 무종양(tumor-free) 마우스는 일반적인 건강상태가 좋지 않았기 때문에 제93일에 안락사시켰다 (도 16C). 이 연구는 IMAB027와 PEB가 조합 투여된, 매우 진행된 인간 NEC14 고환 종양을 갖는 동물들이, 다중 화학요법 단독으로 치료된 동물에 비해 유의적으로 더 생존기간이 길고 유의적으로 더 높은 응답율을 나타냈음을 보여준다.
실시예 9: 항-CLDN6 항체-약물 컨쥬게이트는 CLDN6-발현 종양을 치료하는데 매우 효과적이다
실시예 9.1: 독소-컨쥬게이트된 IMAB027의 시험관내 결합 및 항종양 활성
유세포분석법을 이용하여 난소암 세포주 OV90에 대한 IMAB027-약물 컨쥬게이트 IMAB027-DM1 및 IMAB027-vcMMAE의 상대적인 결합 친화성을 시험하였다. 포화 결합 실험에서 항체 농도를 형광 강도 중앙값 (MFI: median of fluorescence intensity) 및 EC50 (평형시 결합 부위들의 절반에 결합하는 항체 농도)에 대해 플로팅하고 비선형 회귀법을 이용하여 최대 결합을 계산하였다. 컨쥬게이트되지 않은 IMAB027에 비해, 두 가지 IMAB027-약물 컨쥬게이트 모두 비슷하게 낮은 EC50 값을 나타냈으며 결합 포화도는 낮은 농도에서 달성되었다 (도 17A). IMAB027-약물 컨쥬게이트의 세포독성 활성을 XTT 증식 분석법을 이용하여 OV90 세포에 의해 측정하였다. 투여량-반응 곡선은 IMAB027-DM1 및 IMAB027-vcMMAE에 대해 시험관내에서 종양 세포 성장의 유사한 억제를 나타냈다 (도 17B). 요약하면, DM1 또는 vcMMAE에 컨쥬게이션된 IMAB027은 유사한 상대적 친화도로 CLDN6 양성 표적 세포에 결합하여 매우 효과적으로 종양 세포 사멸을 유도한다.
실시예 9.2: 진행된 인간 이종이식편 종양을 독소-컨쥬게이트된 IMAB027 항-CLDN6 항체로 처리하면 종양 세포 성장이 억제되고, 생존이 연장되며 완전한 종양 관해가 매개된다
세포독성 약물에 컨쥬게이트된 CLDN6-특이 항체 IMAB027의 항-종양 활성을, CLDN6 양성 인간 암종 세포주가 생착된 마우스들에서 시험하였다. 이 표적 접근법에서, IMAB027를 메이탄시노이드 DM1 또는 아우리스타틴 E (MMAE)에 부착시키고 진행된 이종이식편 종양을 갖는 무흉선 누드-Foxn1 nu 마우스들에서 종양 성장을 모니터링하였다.
진행된 인간 OV90 난소 피하 이종이식편 종양 모델의 치료:
독소-컨쥬게이트된 IMAB027의 항종양 효과를 균질한 CLDN6 발현을 갖는 진행된 인간 이종이식편 종양이 있는 마우스들에서 시험하였다. 종양 세포 생착으로부터 10일 후 처리를 개시하였다. 단일 i.v. 볼러스 주사 후, IMAB027-DM1 및 IMAB027-vcMMAE는 동종적으로 CLDN6을 발현하는 OV90 난소 암종 세포 이종이식편의 종양 성장을 고도로 유의적으로 억제하였다 (도 18 및 19A). 더욱 중요한 것은, 16 mg/kg IMAB027-vcMMAE의 단일 적용이 처리된 마우스의 60%에서 완전한 종양 관해를 일으켰다는 것이다 (도 19B).
진행된 인간 PA-1 난소 피하 이종이식편 종양 모델의 치료:
독소-컨쥬게이트된 IMAB027의 항종양 효과를 이질적인 CLDN6 발현을 갖는 진행된 이종이식편 종양 모델에서도 시험하였다. 피하 생착 후, 일정 기간이 지나자 PA-1 이종이식편 종양은 CLDN6 발현을 상실하였다 (도 20C). 처리는 제15일부터 시작하였다. 이 시점에서, PA-1 이종이식편 종양은 CLDN6 발현을 상실하기 시작하였다. 단일 i.v. 볼러스 주사에 의해 동물들에게 4, 8 또는 16 mg/kg IMAB027-vcMMAE를 투여하였다. 대조군 동물에게는 컨쥬게이트되지 않은 IMAB027 또는 비히클 대조군 완충액을 대신 투여하였다.
IMAB027-vcMMAE를 이용한 치료는 PA-1 이종이식편의 종양 성장을 고도로 유의적으로 억제하였고 종양-산생 마우스들의 생존을 연장시킨 반면, IMAB027 또는 IMAB027-DM1 (데이터 나타내지 않음)은 PA-1 종양 성장에 영향을 미치지 않았다 (도 20A 및 B).
종양 덩어리 내의 CLDN6 양성 종양 세포의 감소된 수준은 아마도 이 생체내 종양 모델에서 IMAB027 및 IMAB027-DM1의 약한 항-종양 활성에 책임이 있는 듯 하다. IMAB027-DM1은 비절단성(non-cleavable) 링커를 경유하여 비-막투과성 독소인 DM1에 컨쥬게이트된다. 이와 대조적으로, IMAB027-vcMMAE는 카텝신 절단가능한 링커를 경유하여 세포막-투과성 독소인 MMAE에 컨쥬게이트된다. 세포 프로세싱 후 MMAE의 막 투과성 형태의 방출은 특정 에피토프를 결여하는 종양 세포의 사멸을 쉽게 해준다 (방관자 효과). 따라서, IMAB027-vcMMAE에 의한 치료는 CLDN6 양성 세포와 및 CLDN6 음성 세포 양자를 모두 함유하는 PA-1 종양을 제거하는데 매우 효과적이다. 요약하면, IMAB027-vcMMAE는 방관자 세포의 표적 세포-활성화된 사멸에 의한 이질적인 CLDN6 발현을 갖는 인간 이종이식편 종양을 사멸하는데 매우 효과적이다.
진행된 인간 MKN74 위장 피하 이종이식편 종양 모델의 치료:
진행된 종양에서 CLDN6 발현이 상실된 PA-1 이종이식편 종양과 대조적으로, MKN74 이종이식편 종양은 CLDN6 발현을 얻는다. CLDN6-특이 항체IMAB027를 이용한 유세포분석법에 의해 나타난 바와 같이, 위암 세포주 MKN74의 <0.3% 세포는 시험관내에서 CLDN6 양성이다. 흥미롭게도, 상당한 수의 종양 세포들이 무흉선 누드 마우스에서의 피하 생착 후 CLDN6 발현을 나타낸다 (도 21C). 수립된 MKN74 이종이식편 종양을 16 mg/kg IMAB027-vcMMAE으로 처리하자 종양 성장이 고도로 유의적으로 억제되고 생존도 크게 연장되었다 (도 21A 및 B). IMAB027-vcMMAE의 경우 관찰된 종양 성장 억제는 방관자 세포들의 표적 세포-활성화에 의해 일어날 수 있다.
진행된 인간 PA-1 난소 복강내 이종이식편 종양 모델의 치료:
s.c. 이종이식편 종양의 치료에 더해, 생체내 모니터링을 위해 루시페라제를 이소적으로 발현하는 PA-1 세포를 이용하는 i.p. 이종이식편 종양 모델에서 독소-컨쥬게이트된 IMAB027 항체들 역시도 그들의 항종양 활성에 대해 시험하였다 (도 22). 마우스들에게 종양 세포 생착 후 제14일에 단일 볼러스 i.v., 주사에 의해 16 mg/kg IMAB027-DM1 또는 16 mg/kg IMAB027-vcMMAE를 투여하였다.
생물발광 강도의 생체내 측정 결과 IMAB027-DM1으로 처리한 후 복강의 PA-1 전이암의 종양 성장이 억제된 것으로 나타났다. 뿐만 아니라, IMAB027-vcMMAE는 IMAB027-DM1 또는 비히클에 비해 훨씬 더 높은 항종양 효과를 나타냈으며 동물들 100%에서 복강 종양이 완전히 관해되었다 (도 22).
요약하면, IMAB027-vcMMAE 및 IMAB027-DM1은 생체내 시험된 농도 범위에서 독성 부작용 없이 고도로 효과적이다. IMAB027-DM1은 피하 이종이식편 종양의 종양 성장을 유의적으로 억제하고 복강 이종이식편 종양의 종양 성장을 감소시켰다. IMAB027-vcMMAE는 동질 또는 심지어 이질의 CLDN6 발현을 갖는 피하 또는 복강의 인간 이종이식편 종양을 갖는 동물의 종양 성장을 고도로 유의적으로 억제하고 생존을 연장시켰다. 가장 놀라운 것은, MMAE-컨쥬게이트된 항체로 처리한 후 종양-산생 마우스들의 대부분이 치유되었다는 것이다. 종양이 이질적인 CLDN6 발현을 나타내는 동물에서 특히 관찰되는, IMAB027-vcMMAE의 뛰어난 항-종양 활성은, IMAB027-vcMMAE 컨쥬게이트가 CLDN6 양성 백분율이 낮은 종양을 치료하는데 적합하다는 것을 입증한다.
실시예 9.3: CLDN6-특이적 항체들의 세포내이입은 이들의 친화도 및 CLDN6 결합 에피토프에 의존한다.
독소-컨쥬게이트된 항체들의 세포독성 효능은 내면호에 대한 이들의 표적-매개된 잠재능에 엄격하게 의존한다. 따라서, 세포내이입율이 높은 항체를 생성하는 것이 독소-컨쥬게이트된 항체를 개발하는데 이어서 핵심적인 주요 인자이다. 내인적으로 CLDN6을 발현하는 인간 암종 세포주를 CLDN6-반응성 모노클로날 키메라 항체 및 사포린 독소와 컨쥬게이트된 항-인간 Fab 단편을 함께 인큐베이션함으로써 세포내이입의 효능을 시험관내에서 시험하였다. CLDN6-결합 항체/Fab-사포린 복합체의 내면화는 세포의 특이적인 살해를 일으키며 세포 생존능 분석을 이용하여 측정할 수 있다. 여러가지 상이한 CLDN6-반응성 항체들을 스크리닝한 결과 세포내이입은 항체의 결합 친화도에만 의존하는 것이 아니라 항원성 에피토프에도 의존하는 것으로 입증되었다. 본 발명자들은 CLDN6의 제1 세포외 루프 내의 에피토프에 CLDN6-특이적인 항체가 결합하는 것이 OV-90 및 PA-1 인간 암종 세포에서 세포내이입을 뒷받침한다는 것을 관찰하였다. 주목할만한 것은, 다른 에피토프에 보다 높은 친화도로 유사하게 결합하는 CLDN6-반응성 항체 5F2D2가 이 분석에서는 더 낮은 세포독성 잠재능을 보인다는 것이다 (도 23).
실시예 10: 전술한 실시예 7 내지 9에 사용되는 재료 및 방법
세포 배양:
세포주 COV362 (ECACC, 07071910) 및 PA-1 (ATCC, CRL-1572)를 파이어플라이 루시페라제로 각각 안정하게 트랜스펙션시킴으로써, 발광 리포터 유전자를 안정적으로 발현하는 COV362(Luc) 및 PA-1(Luc) 세포들을 생성시켰다.
10% 열-불활성화된 FCS (Gibco, 10270-106)가 보강된 RPMI1640 배지 (Gibco, 61870-010)에서 NEC14 (JCRB, 0162) 및 MKN74 (JCRB, 0255) 세포들을 배양하였다. COV318 (ECACC, 07071903) 및 COV362(Luc) 세포를 2 mM GlutaMAX (Gibco, 35050-038) 및 10% 열-불활성화된 FCS를 함유하는 DMEM (Gibco, 41965-039)에서 배양하였다. 1.5 g/l 중탄산나트륨 (Invitrogen, 25080), 1 mM 피루브산나트륨 (Invitrogen, 11360), 1% 비필수 아미노산 (Gibco, 11140-035) 및 10% 열-불활성화된 FCS이 보강된 MEM (Gibco, 31095-029)에서 PA-1 및 PA-1(Luc) 세포들을 배양하였다. OV90 (ATCC, CRL-11732) 세포들은 1.5 g/l 중탄산나트륨 및 15% 열-불활성화된 FCS이 보강된 199 배지 (Sigma, M4530)와 MCB105 (Sigma, M6395)의 1:1 혼합물에서 배양하였다. 세포들을 37 ℃ 및 5% CO2에서 증식시켰다.
유세포분석법에 의한 CLDN6 발현 측정:
세포들을 0.05% 트립신/EDTA (Gibco, 25300-054)를 이용하여 수확하고, FACS 완충액 (2% FCS (Gibco, 10270-106) 및 0.1% 아자이드 나트륨 (Applichem, A1430)을 함유하는 PBS)으로 세척한 다음 2 x 106 세포/ml 농도로 FACS 완충액에 재현탁시켰다. 100 μl의 세포 현탁액을 항-CLDN6 항체 IMAB027 또는 아이소타입 대조군 인간 IgG1 항체 (Sigma, I5154)와 함께 2.5 μg/ml의 농도로 4℃에서 30분간 인큐베이션시켰다. 세포들을 FACS 완충액으로 3회 세척하고 FACS 완충액에 1:200으로 희석된 APC-컨쥬게이트된 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG (Jackson ImmunoResearch, 109-136-170)와 함께 4℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 세포들을 2회 세척하고 FACS 완충액에 재현탁시켰다. BD FACSArray 및 FlowJo 소프트웨어 (Tree Star Inc.)를 이용하여 유세포분석법으로 결합에 대해 분석하였다. 분석 대상으로부터 죽은 세포들을 배제하기 위해 생/사 염료인 프로피디움 요오다이드 (Sigma, P4864)를 이용하였다.
플라틴-유도체에 의한 COV318 세포의 처리:
COV318 세포들 (100 mm 세포 배양 디쉬 당 1.2 x 106 세포)을 표준 조건 하에서 증식시켰다. 24시간 후, 세포들을 0.5 μg/ml 시스플라틴 또는 2 μg/ml 카르보플라틴으로 처리하고 96 시간 인큐베이션시켰다. 배지를 갈아주고, 처리된 세포들을 표준 증식 조건 하에서 증식시켰다. 3일 및 6일 후, 세포들을 유세포분석법에 의해 CLDN6 발현에 대해 분석하였다.
세포증식억제제 처리 후 항체-의존성 세포매개 세포독성(ADCC):
IMAB027-매개된 ADCC에 미치는 카르보플라틴 및 파클리탁셀의 영향을 알아보기 위해 리포터로서 루시페라제로 안정하게 트랜스펙션된 인간 난소 암종 세포주 COV362를 이용하였다. COV362(Luc) 세포 (150 mm 세포 배양 디쉬 당 3 x 106 세포)를 표준 조건 하에서 증식시켰다. 24시간 후, 세포들을 5 ng/ml 파클리탁셀, 20 μg/ml 카르보플라틴, 25 ng/ml 겜시타빈, 20 ng/ml 독소루비신 또는 7.5 ng/ml 토포테칸으로 처리하고 4일간 인큐베이션하였다. 배지를 갈아주고 처리된 세포들을 카르보플라틴과 겜시타빈의 경우 3일 더, 파클리탁셀, 독소루비신 또는 토포테칸의 경우 10일 더 표준 조건 하에서 증식시켰다.
0.05% 트립신/EDTA (Gibco, 25300-054)를 이용하여 세포들을 수확하고 2 mM 글루타민 (Gibco, 25030-081) 및 20 mM HEPES (Gibco, 15630-056)을 함유하는 DMEM 중 2 x 105 세포/ml 농도로 조정하였다. 웰 당 1 x 104 세포들을 백색 96-웰 PP-플레이트 내로 접종하고 37℃ 및 5% CO2에서 ~ 5 시간 동안 인큐베이션하였다.
Ficoll Hypaque (GE Healthcare, 17144003)를 이용한 밀도구배 원심분리에 의해 인간 도너 혈액 샘플로부터 PBMC (말초혈액 단핵구 세포)를 분리하였다. 인터페이즈를 함유하는 PBMC를 분리하고 세포들을 2 mM EDTA를 함유하는 PBS로 3회 세척하였다. PBMC를 1.6 x 107 세포/mL의 농도로 X-Vivo 15 배지 (Lonza, BE04-418Q)에 재현탁시키고 분석 전까지 37℃ 및 5% CO2 에서 인큐베이션시켰다.
25 μl IMAB027 및 아이소타입 대조군 항체를 지시된 농도로 세포에 첨가하였다. 그 후, 25 μl의 PBMC 현탁액을 첨가하고 세포들을 37℃ 및 5% CO2에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다.
PBS 중 10 μl 8% Triton X-100 (Sigma, T8787)를 총 용해(total lysis) 대조군에 첨가하고 10 μl PBS를 최대 생존능 세포 대조군에 첨가하고 샘플에는 50 μl 루시페린 믹스 (ddH2O 중 3.84 mg/ml D-루시페린 (Sigma Aldrich, 50227) 및 160 mM HEPES)를 첨가하고 세포들을 실온의 암실에서 90분간 인큐베이션하였다. 발광계(Infinite M200, TECAN)를 이용하여 생물발광도를 측정하였다. 결과를 통합식 디지털 상대 광단위로 나타내었다.
특이적 용해(specific lysis)는 다음과 같이 산출한다:
특이적 용해 [%] = 100 - [(샘플-총 용해)/(최대 생존능 세포-총 용해) x 100]
최대 생존능 세포: 10 μl PBS, 항체 없음
총 용해(total lysis): PBS 중 10 μl 8% Triton X-100, 항체 없음
무흉선 누드 마우스에서 COV318 세포의 복강내 생착:
인간 난소 암종 세포주 COV318의 생체내 종양원성(tumorigenicity) 및 CLDN6 양성 세포의 축적을 마우스에서 시험하였다. 이에 따라, PBS에 재현탁시킨 2 x 107 COV318 세포들을 6-8주령의 암컷 Hsd:무흉선 누드-Foxn1 nu 마우스의 복강내로 주사하였다. 마우스들을 매일 모니터링하였다. 생명을 위협하는 증상이 현저해지면 동물들을 안락사시켰다. 종양과 복수 세포를 분리하여 추가 분석을 위해 배양하였다.
종양들을 기계적으로 해체하고, 메쉬를 통해 통과시킨 다음 DMEM 배지 (Gibco, 41965-039)로 세척하였다. 단일 세포 현탁액을 얻기 위해, 종양 세포들을 어큐타제(accutase)(Life Technologies, A11105-01)로 37℃에서 30분간 처리한 다음, 40 μm 세포 스트레이너를 통해 통과시키고 DMEM 배지로 세척하였다. 복수를 수집하고 적혈구 오염 세포를 ACK (암모늄-클로라이드-포타슘) 용해 완충액 (Invitrogen, A10492-01)을 이용하여 제거하였다. 종양 및 복수 세포들을 페니실린/스트렙토마이신이 보강된 표준 COV318 배지(Gibco, 15140)를 이용하여 표준 조건 하에서 증식시켰다. 유세포분석법에 의해 세포들을 CLDN6 발현에 대해 스크리닝하였다.
매우 진행된 인간 NEC14 이종이식편 종양의 치료:
생착을 위해, 6-8 주령의 암컷 Hsd:무흉선 누드-Foxn1 nu 마우스들의 옆구리에 200 μl PBS 중 2 x 107 NEC14 세포들을 피하 접종하였다. 매우 진행된 치료 연구에서, 종양들의 크기가 최대 170 mm3에 이르도록 13일간 증식시키고 처리에 앞서서 마우스들을 대조군, IMAB027, PEB (시스플라틴, 에토포사이드, 블레오마이신) 및 IMAB027/PEB 그룹으로 나누었다 (그룹 당 n=14).
생착으로부터 13일 후, 약물들을 다음과 같이 투여하였다: 제13, 14, 15, 16 및 17일에 1 mg/kg 시스플라틴 볼러스 i.p. 주사; 제13, 14, 15, 16 및 17일에 5 mg/kg 에토포사이드 볼러스 i.p. 주사; 제13, 17 및 21일에 10 mg/kg 블레오마이신 볼러스 i.p. 주사. IMAB027는 1주일에 3회 제13일부터 제101일까지 35 mg/kg IMAB027를 교대로 볼러스 i.v./i.p./i.p. 주사하였다. 비히클 대조군으로서, 마우스들에게 항체 대신 약물질 완충액 또는 PEB 대신 NaCl 용액을 각각 투여하였다.
종양 부담 및 동물 건강을 1주일에 2회 모니터링하였다. 종양 크기가 1400 mm3에 달하거나 종양이 궤양화되었을 때 마우스들을 희생시켰다. 크루스칼-월리스 검사 및 사후 Dunn's 다중비교검사를 이용하여 종양 성장의 억제에 대해 분석하였다.
스피어 형성능 분석:
스피어 형성능 분석을 위해, COV318 세포들을 CLDN6에 대해 0.5 μg/ml IMAB027로 30분간 4℃에서 염색한 다음 염소 항-인간 IgG 2차 항체(1:300)와 함께 10분간 4℃에서 인큐베이션한 다음 BD FACSAria 세포 소터를 이용하여 세포들을 그들의 CLDN6 발현에 따라 소팅하였다. 이어서 1 x 106 CLDN6-양성 또는 -음성 소팅된 세포들을, 6-웰 초저부착 플레이트(Corning)의 웰 내, 0.4% 소 혈청 알부민, 20 ng/ml 염기성 섬유모세포 성장인자, 10 ng/ml 표피 성장인자 및 5 μg/ml 인슐린을 함유하는 무혈청 DMEM/F12 배지에 접종한 다음 세포들을 이들 줄기 세포-특이 조건 하에서 21일간 스피어를 형성하도록 하였다. 스피어를 파열시키지 않고 매 이틀마다 배지를 교환해주고 정기적으로 대표적인 사진을 찍었다.
제2 세대 스피어의 생산을 위해, CLDN6 양성 COV318 세포 (접종으로부터 22일 후)의 제1 세대 스피어들을 단일 세포로 나눈 다음 6-웰 초저부착 플레이트의 웰 내로 재도말하였다. 다시 스피어를 파열시키지 않고 매 이틀마다 배지를 교환해주고 정기적으로 대표적인 사진을 찍었다.
Bio Mark™ HD System (Fluidigm)을 이용한 정량적 실시간 RT-PCR:
42개의 인간 난소암 샘플들을, Bio Mark™ HD System (Fluidigm)을 이용하여, 선택된 난소암 줄기세포 특이 인자들(CTCFL, LIN28B, CD24, GNL3, EpCAM, CD44, ABCG2, ALDH1A1, AMACR, ATXN1, BMI1, BMP4, CD34, CD117, Myd88, Nanog, Notch 1, Pou5F1, CD133, Snail, Sox 2)에 대해 TaqMan® 유전자 발현 분석법 (Life technologies)으로 qRT-PCR에 의해 분석하였다.
각 제조자 지침에 따라, RNeasy Mini Kit (Qiagen)를 이용하여 난소암 샘플로부터 RNA를 분리하고 PrimeScript RT Reagent Kit (Takara Bio Inc.)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. Fluidigm® Advanced Development Protocol 28 - TaqMan® GE Assays rev A2를 이용하는 Fast Gene Expression Analysis에 따라, 샘플들을 제조하고 분석하였다. IFC Controller HX에 의해 96.96 Gene Expression Dynamic Array IFCs 상에 로딩하였다. Fluidigm BioMark™ HD 시스템을 통해 칩 어레이를 분석하였다. TaqMan PreAmp MasterMix는 Applied Biosystems로부터 구입하였다. ΔΔCt-법에 따라 데이터 세트를 평가하였다. 스피어만' r을 이용하여, 선택된 난소암 줄기세포 마커와 CLDN6의 상관관계를 분석하였다. 상관관계 값의 유의성을 상관관계 계수에 대한 테스트에 의해 평가하였다. 벤자미니 및 호흐버그(Benjamini 및 Hochberg)법을 이용하여 복수회 테스트에 대한 P-값을 조정하고, 조정된 p-값 ≤ 0.05이면 유의적인 것으로 간주하였다.
CLDN6 항체의 독소-컨쥬게이션
모노클로날 항체의 독소-컨쥬게이션을 Piramal Healthcare (Grangemouth, UK)에서 수행하였다.
DM1 컨쥬게이션을 위해, 네이키드 항체들을 실온에서 1 시간 동안 PBS (pH 7.2)에서 인큐베이션 함으로써 라이신기의 유리 NH2 잔기와 반응하는 SMCC (6x 몰농도)를 이용하여 변형시켰다. 이어서 변형된 항체들을 35 mM 시트레이트 완충액 (pH 5.0) 내로 투석하고 역 엘만 분석법을 이용하여 링커 대 항체의 비를 구하였다. 실온에서 17 시간 인큐베이션함으로써 DM1 (6x 몰농도)를 그의 설프히드릴기를 통해 SMCC 링커의 말레이미드 모이어티에 컨쥬게이션시켰다. 컨쥬게이트된 항체들을 제제 완충액 (20 mM His, 85 mg/ml 수크로스, pH 5.8)으로 투석하고 -80℃에서 보관하였다. UV 분광광도 측정에 의해 약물 항체 비를 분석하고, 모노머 함량은 SEC-HPLC에 의해, 그리고 유리 약물 함량은 RP-HPLC에 의해 분석하였다.
MMAE 컨쥬게이션을 위해, 네이키드 항체들을 PBS (pH 7.2)로 투석하고 실온에서 2 시간 동안 트라우트 시약(2-이미노티올란) (20x 몰농도)을 이용하여 라이신 잔기의 유리 NH2기의 티올화에 의해 변형시켰다. 이어서, 티올화된 항체들을 35 mM 시트레이트 완충액 (pH 5.5)으로 투석하고 링커 대 항체의 비를 역 엘만 분석법을 이용하여 구하였다. 실온에서 15 시간 인큐베이션함으로써, 카텝신-절단가능한 링커의 발린을 통해 vcMMAE (6x 몰농도)를 티올화된 항체의 설프히드릴기에 컨쥬게이션시켰다. 컨쥬게이트된 항체들을 제제 완충액(20 mM His, 85 mg/ml 수크로스, pH 5.8) 내로 투석하고 -80℃에서 보관하였다. 약물 항체 비를 UV 분광광도 측정에 의해 분석하고, 모노머 함량은 SEC-HPLC에 의해, 그리고 유리 약물 함량은 RP-HPLC에 의해 분석하였다.
유세포분석법에 의한 결합 친화도 탐지:
0.05% 트립신/EDTA (Gibco, 25300-054)를 이용하여 세포들을 수확하고, FACS 완충액 (2% FCS (Gibco, 10270-106) 및 0.1% 아자이드 나트륨 (Applichem, A1430)을 함유하는 PBS)으로 세척한 다음 FACS 완충액에 2 x 106 세포/ml의 농도로 재현탁시켰다. 100 μl의 세포 현탁액을 4℃에서 30분간 IMAB027, IMAB027-DM1 IMAB027-vcMMAE (0.1 ng/ml 내지 20 μg/ml의 연쇄 적정)와 함께 인큐베이션시켰다. 이어서 세포들을 FACS 완충액으로 3회 세척하고 4℃에서 30분간, FACS 완충액에 1:200으로 희석된 항-인간 IgG (Jackson ImmunoResearch, 109-136-170)와 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포들을 100 μl FACS 완충액으로 2회 세척하고 재현탁시켰다. BD FACSArray (BD Biosciences) 및 FlowJo 소프트웨어 (Tree Star Inc.)를 이용하여 유세포분석법에 의해 결합에 관해 분석하였다.
독소-컨쥬게이트된 IMAB027을 이용한 생존능 분석:
세포의 대사 활성을 탐지하는 비색분석법 (Cell Proliferation Kit XTT, AppliChem 제품)을 이용하여 인간 종양 세포주의 생존능에 미치는 IMAB027-DM1 및 IMAB027-vcMMAE의 효과를 시험관내에서 알아보았다.
OV90 세포들을 0.05% 트립신/EDTA (Gibco, 25300-054)으로 수확하고 2500 세포를 95-웰 컬쳐 중 50 μl 성장 배지에 접종하였다. 24시간 후, 50 μl 배지에 희석된 아이소타입 대조군 항체 또는 DM1- 및 MMAE-컨쥬게이트된 IMAB027를 연쇄 농도로 하여 첨가하였다. 미처리 세포들의 컨플루언스가 ~80%에 달할 때까지 세포들을 3 내지 7일간 배양하였다. 제조자 지침에 따라 세포의 생존능을 AppliChem Cell Proliferation Kit II (AppliChem, A8088-1000)를 이용하여 분석하였다. XTT 시약과 함께 3-5 시간 인큐베이션한 후, 100 μl의 세포 상등액을 새로운 96-웰 분석 플레이트에 옮기고 분광광도계 (Tecan)을 이용하여 480 nm (레퍼런스 630 nm)에서 흡광도를 측정하였다. 다음 방정식을 이용하여 생존능을 계산하였다:
생존능의 감소 [%] = 100 - [(샘플-블랭크)/(최대 생존능 세포-블랭크) x 100 ]
블랭크: 세포 없는 XTT 및 배지
최대 생존능 세포: 세포, 배지 및 XTT
EC50 값은 비선형 회귀법에 의해 GraphPad Prism 6 소프트웨어를 이용하여 구하였다.
진행된 피하 OV90 이종이식편 종양의 치료:
표준 조건 하에서 인간 난소 암종 세포주 OV90를 배양하였다. 생착을 위해, 6-8주량의 암컷 Hsd:무흉선 누드-Foxn1 nu 마우스의 옆구리에 200 μl PBS 중 1 x 107 OV90 세포를 피하 접종하였다. 진행된 치료 연구에서, 종양들을 10일간 자라게 하고, 50 - 150 mm3 크기의 종양이 수립된 마우스들을 치료 전에, 비히클과 항체 그룹 (n=10)으로 무작위로 나누었다. 종양 크기(TV = (길이 x 폭2)/2)를 주2회 모니터링하였다. TV(종양 크기)를 mm3로 표시하여, 경시적인 종양 성장 곡선을 작성하였다.
초기 투여량 범위 발견 연구에서, 동물들에게 비히클, IMAB027-DM1 (1.78 mg/kg, 5.33 mg/kg 또는 16 mg/kg)을 1회 i.v. 주사하고 생착 35일 후에 절제하였다. 2차 투여량 범위 발견 연구에서는 동물들에게 비히클, IMAB027-vcMMAE (4 mg/kg, 8 mg/kg 또는 16 mg/kg) 또는 IMAB027-DM1 (1.33 mg/kg, 2.67 mg/kg 또는 5.33 mg/kg)를 1회 i.v. 주사하였다. 35 mg/kg IMAB027를 1주 3회 볼러스로 i.v./i.p./i.p.에 의해 교대로 주사함으로써 IMAB027을 적용하였다. 종양 크기가 1400 mm3을 넘거나 궤양화되면 마우스들을 희생시켰다. 크루스칼-월리스 검사 및 사후 Dunn's 다중비교검사에 의해 종양 성장 억제를 분석하였다. 만텔 콕스(Mantel Cox) 시험법을 이용하여 생존능을 분석하였다.
진행된 피하 PA-1 이종이식편 종양의 처리 및 종양 절편들의 면역조직화학:
표준 조건 하에서 인간 난소 암종 세포주 PA-1을 배양하였다. 생착을 위해, 6-8주령의 암컷 Hsd:무흉선 누드-Foxn1 nu 마우스들의 옆구리에 200 μl PBS 중의 1 x 107 PA-1 세포를 피하 접종하였다. 진행된 치료 연구에서, 종양을 15일간 자라게 하고 40 - 120 mm3 크기의 종양이 수립된 마우스들을 치료 전에 비히클 그룹과 항체 그룹 (n=10)으로 무작위로 나누었다. 종양 크기(TV = (길이 x 폭2)/2)를 주2회 모니터링하였다. TV(종양 크기)를 mm3로 표시하여, 경시적인 종양 성장 곡선을 작성하였다.
동물들에게 비히클, IMAB027-vcMMAE (4 mg/kg, 8 mg/kg 또는 16 mg/kg) 또는 IMAB027-DM1 (4 mg/kg, 8 mg/kg 또는 16 mg/kg)를 1회 주사하였다. 35 mg/kg IMAB027를 1주 3회 볼러스로 i.v./i.p./i.p.에 의해 교대로 주사함으로써 IMAB027을 적용하였다. 종양 크기가 1400 mm3을 넘거나 궤양화되면 마우스들을 희생시켰다. 크루스칼-월리스 검사 및 사후 Dunn's 다중비교검사에 의해 종양 성장 억제를 분석하였다. 만텔 콕스(Mantel Cox) 시험법을 이용하여 생존능을 분석하였다.
종양 수립 및 진행 동안 CLDN6 발현을 분석하기 위해 미처리 마우스들의 PA-1 종양을 각각 제7, 14 및 56일에 절제하고 포르말린 고정 및 파라핀 포매시켰다. 4 μm 조직 절편들을 각 샘플 FFPE (포르말린 고정 파라핀 포매) 블록으로부터 준비하고, 접착 슬라이드(SuperFrost Ultra Plus, Thermo Fisher Scientific) 상에 올린 다음, 60℃에서 60분간 구웠다. 염색 전에, FFPE 조직 절편들로부터 파라핀을 제거하였다. 절편들을 0.05% Tween-20 (pH 6.0)이 보강된 10 mM 구연산에서 120℃에서 10분간 삶았다. 내인성 퍼옥시다제를 PBS 중 0.3% H2O2에서 15분간 인큐베이션함으로써 켄칭(quenched)하였다. PBS로 세척한 후, 비특이적 항체 결합 부위를 실온에서 블로킹 완충액 (PBS 중 10% 염소 혈청)으로 30분간 블로킹한 후, 블로킹 완충액에 희석된 일차 토끼 항-클라우딘-6 항체 (IBL-America, 18865) 0.2 μg/ml과 함께 밤새 인큐베이션시켰다. 샘플들을 PBS로 3회 세척하고 각각의 2차 즉석 사용이 가능한 항체(Power Vision HRP 염소 항-토끼; Immunologic)와 함께 실온에서 30분간 인큐베이션하였다. 기질-크로모겐 용액(VectorRed; Vector Laboratories)을 이용하여 4:30분 동안 시각화를 수행하였다. 헤마톡실린을 이용하여 카운터염색한 후, 탈수 및 마운팅하고 절편들을 Leica DM2000 현미경으로 분석하였다.
진행된 피하 MKN74 이종이식편 종양의 처리 및 종양 절편들의 면역조직화학
표준 주건 하에 인간 위암종 세포주 MKN74를 배양하였다. 생착을 위해, 6-8주령의 암컷 Hsd:무흉선 누드-Foxn1 nu 마우스들의 옆구리에 200 μl PBS 중 1 x 107 MKN74 세포를 피하 접종하였다. 진행된 치료 연구에서, 종양들을 7일간 자라게 하고 200 ± 30 mm3 크기의 종양이 수립된 마우스들을 치료 전에 비히클 그룹과 항체 그룹(n=10)으로 무작위로 나누었다. TV(종양 크기)를 mm3로 표시하여, 경시적인 종양 성장 곡선을 작성하였다.
제8일에 동물들에게 비히클 대조군 완충액 또는 16 mg/kg IMAB027-vcMMAE를 볼러스로 1회 i.v. 주사하였다. 종양 크기가 1400 mm3을 넘거나 궤양화되면 마우스들을 희생시켰다. 크루스칼-월리스 검사 및 사후 Dunn's 다중비교검사에 의해 종양 성장 억제를 분석하였다. 만텔 콕스(Mantel Cox) 시험법을 이용하여 생존능을 분석하였다.
MKN74 세포 상의 CLDN6 표적 발현을 생착전 유세포분석법으로 분석하고 조직화학에 의해 제31일에 절제된 미처리 MKN74 이종이식편에 대해 분석하였다.
면역조직화학 측정을 위해, 두께가 3 μm인 조직 절편들을 제조하고, 슬라이드 상에 마운트시킨 다음 실온에서 90분간 공기 건조 시켰다. 모든 조직 섹션들을 아세톤에서 10분간 -20℃에서 고정시키고 PBS로 5분간 세척하였다. 0.03% 과산화수소(Dakocytomation EnVision System, K4011)와 함께 15분간 인큐베이션시킴으로써 내인성 퍼옥시다제를 켄칭하였다. PBS로 세척한 후, 비특이적 항체 결합 부위를 실온에서 블로킹 완충액 (PBS 중 10% 염소 혈청)으로 30분간 블로킹한 후, 5 μg/ml IMAB027-FITC와 함께 실온에서 60분간 인큐베이션하였다. 이어서 샘플들을 PBS로 3회 세척하고 각각의 2차 즉석 사용이 가능한 항체(Bright Vision 폴리-HRP 항-토끼 IgG, Immunologic, DPVR-110HRP)와 함께 실온에서 30분간 인큐베이션하였다. 기질-크로모겐 용액(VectorRed; Vector Laboratories)을 이용하여 2:30분 동안 시각화를 수행하였다. 헤마톡실린을 이용하여 카운터염색한 후, 탈수 및 마운팅하고 절편들을 Leica DM2000 현미경으로 분석하였다.
진행된 복강내 PA-1(Luc) 이종이식편 종양의 치료:
발광 리포터유전자로서 파이어플라이 루시페라제를 안정적으로 발현하는 인간 난소 기형암종 세포주 PA-1(Luc)를 복강내 이종이식편 종양 모델로서 이용하여, 독소-컨쥬게이트된 IMAB027 항체의 항-종양 활성을 생체내에서 연구하였다. 이전의 생착 실험 결과 PA-1(Luc) 세포를 복강내 접종하면 복강내 종양 결절이 생기는 것으로 나타났다.
PBS에 재현탁된 1 x 107 PA-1(Luc) 세포를 암컷 Hsd:무흉선 누드-Foxn1 nu 에게 복강내 주사하였다. 종양 세포 접종 14일 후부터 생물발광 영상화를 개시한 후 연구가 종료될 때가지 매주 실시하였다. D-루시페린 (PerkinElmer, 122796)을 멸균수에 용해시키고 IVIS Lumina Imaging System (Advanced Molecular Vision)을 이용하여 영상화 5분 전에 복강내 주사하였다(150 mg/kg, 주사 부피 200 μl). 이소플루오란으로 마우스들을 마취하고 IVIS Lumina의 암실에 넣고 1분의 통합 시간 동안 방출된 광자를 정량하였다. 동물에서 루시페라제 발현 PA-1 세포에 기원하는 발광 강도를 슈도컬러 이미지로 나타내었는데, 여기서 청색은 가장 약한 강도를, 적색은 가장 강한 생물발광 시그널을 나타낸다. LED 저광 조명 하에서도 마우스의 흑백 사진 이미지를 얻었다. Living Image Software (Xenogen)를 이용하여 이미지들을 중첩시켰다. 모든 이미지에 대해 필적할만한 조명 세팅을 사용하였다. 생물발광을 정량하기 위해, 관심 영역(ROI: regions of interest)을 결정하고 각 ROI의 총 플럭스를 광자 단위/초(p/x)로 측정하였다. 동물의 비-시그널 발광 영역으로부터 얻은 배경 생물발광값을 각 동물에 있어서 각 생물발광값으로부터 뺐다.
제14일에, 마우스들을 무작위화하고 각각 16 mg/kg IMAB027-DM1 또는 IMAB027-vcMMAE씩 복강내 투여하여 처리하였다. 대조군 동물에게 비히클 완충액을 투여하였다. 복부의 생물발광 이미징에 의해 주2회 종양 성장을 모니터링한 다음 이어서 마우스의 복부를 커버하는 관심 영역에서의 총 플럭스(광자/초)를 분석하였다.
세포내이입:
CLDN6 결합 항체의 세포내이입을 세포독성 기반 세포내이입 분석법을 이용하여 탐지하였는데 이 방법은 표적 결합된 항체와 사포린-컨쥬게이트된 항-인간 IgG Fab 단편 (Fab-ZAP human, Advanced Targeting Systems, IT-51)의 공통-내면화(co-internalization)에 기반한 것이다. 사포린은 내면화될 경우 단백질 생합성을 억제함으로 해서 세포를 사멸시키는, 리보솜-불활성화 단백질이다.
PA-1 세포들을 0.05% 트립신/EDTA (Gibco, 25300-054)을 이용하여 수확하고 2.5 x 103 세포/웰을 96-웰 배양 플레이트 중 50 μl 성장 배지에 접종하였다. 24시간 후, Fab-ZAP 및 이어서 각 25 μl의 IMAB027 또는 아이소타입 대조군 항체를 첨가하였다. CLDN6 항체는 6 단계 또는 8 단계 희석한 반면 Fab-ZAP는 일정 농도 (Fab-ZAP:항체 비 = 3:1 내지 6561:1)로 적용하였다. 37℃의 보습 CO2 인큐베이터에서 추가로 72 시간 동안 세포들을 배양하였다. 그 후, 제조자 지침에 따라, Cell Proliferation Kit II from AppliChem (AppliChem, A8088-1000)을 이용하여 세포 생존능을 분석하였다. 480 nm (레퍼런스 630 nm)에서 분광광도계(Tecan)을 이용하여 흡광도를 측정하였다.
SEQUENCE LISTING <110> BioNTech AG et al. <120> DIAGNOSIS AND THERAPY OF CANCER INVOLVING CANCER STEM CELLS <130> 342-79 PCT <150> PCT/EP2013/002272 <151> 2013-07-31 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 220 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Ser Ala Gly Met Gln Ile Leu Gly Val Val Leu Thr Leu Leu 1 5 10 15 Gly Trp Val Asn Gly Leu Val Ser Cys Ala Leu Pro Met Trp Lys Val 20 25 30 Thr Ala Phe Ile Gly Asn Ser Ile Val Val Ala Gln Val Val Trp Glu 35 40 45 Gly Leu Trp Met Ser Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys 50 55 60 Lys Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala 65 70 75 80 Arg Ala Leu Cys Val Ile Ala Leu Leu Val Ala Leu Phe Gly Leu Leu 85 90 95 Val Tyr Leu Ala Gly Ala Lys Cys Thr Thr Cys Val Glu Glu Lys Asp 100 105 110 Ser Lys Ala Arg Leu Val Leu Thr Ser Gly Ile Val Phe Val Ile Ser 115 120 125 Gly Val Leu Thr Leu Ile Pro Val Cys Trp Thr Ala His Ala Ile Ile 130 135 140 Arg Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Ala Glu Ala Gln Lys Arg Glu Leu 145 150 155 160 Gly Ala Ser Leu Tyr Leu Gly Trp Ala Ala Ser Gly Leu Leu Leu Leu 165 170 175 Gly Gly Gly Leu Leu Cys Cys Thr Cys Pro Ser Gly Gly Ser Gln Gly 180 185 190 Pro Ser His Tyr Met Ala Arg Tyr Ser Thr Ser Ala Pro Ala Ile Ser 195 200 205 Arg Gly Pro Ser Glu Tyr Pro Thr Lys Asn Tyr Val 210 215 220 <210> 2 <211> 220 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Ser Ala Gly Met Gln Ile Leu Gly Val Val Leu Thr Leu Leu 1 5 10 15 Gly Trp Val Asn Gly Leu Val Ser Cys Ala Leu Pro Met Trp Lys Val 20 25 30 Thr Ala Phe Ile Gly Asn Ser Ile Val Val Ala Gln Val Val Trp Glu 35 40 45 Gly Leu Trp Met Ser Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys 50 55 60 Lys Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala 65 70 75 80 Arg Ala Leu Cys Val Ile Ala Leu Leu Val Ala Leu Phe Gly Leu Leu 85 90 95 Val Tyr Leu Ala Gly Ala Lys Cys Thr Thr Cys Val Glu Glu Lys Asp 100 105 110 Ser Lys Ala Arg Leu Val Leu Thr Ser Gly Ile Val Phe Val Ile Ser 115 120 125 Gly Val Leu Thr Leu Ile Pro Val Cys Trp Thr Ala His Ala 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Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Tyr Gly Phe Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 6 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody fragment <400> 6 Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ile Met Ser Val Ser Pro Gly Glu 1 5 10 15 Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His 20 25 30 Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Cys Ile Tyr Ser 35 40 45 Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Arg Gly 50 55 60 Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu Asp 65 70 75 80 Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Tyr Pro Pro Trp Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 7 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody fragment <400> 7 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Met Lys 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Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 9 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody fragment <400> 9 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Arg Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Leu Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Tyr Gly Tyr Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 10 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody fragment <400> 10 Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu 1 5 10 15 Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His 20 25 30 Trp Phe Gln Leu Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser 35 40 45 Thr Ser Asn 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Claims (81)

  1. CLDN6을 발현하는 세포를 검색하는 것을 포함하는 암 줄기세포의 탐지 방법.
  2. 제1항에 있어서, CLDN6을 발현하는 세포가 존재하면 암 줄기세포가 존재함을 가리키는 것이고 및/또는 CLDN6을 발현하는 세포의 양은 암 줄기세포의 양과 상관관계가 있는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, CLDN6을 발현하는 세포는 암 환자로부터 얻은 샘플에서 검색되는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, CLDN6을 발현하는 세포의 정량적 및/또는 정성적 탐지를 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, CLDN6을 발현하는 세포의 양을 레퍼런스 샘플 중의 CLDN6을 발현하는 세포의 양 또는 소정의 레퍼런스 범위와 비교하는 것을 포함하는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 레퍼런스 샘플은 암에 걸린 것으로 진단되지 않은 환자로부터의 샘플인 것인 방법.
  7. 제5항에 있어서, 소정의 레퍼런스 범위는 암에 걸린 것으로 진단되지 않은 환자의 세포집단에 기반한 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 암 환자에서 암 줄기세포의 양을 모니터링하는 것을 포함하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 암 환자에서 암 줄기세포의 양을 모니터링하는 것은 암 환자로부터 얻어진 샘플 중의 암 줄기세포의 양을 상기 암 환자로부터 이전에 얻은 샘플 중의 암 줄기세포의 양과 비교하는 것을 포함하는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 암 환자로부터 얻은 샘플은 암 치료법의 실시 중 또는 암 치료법의 실시 후 암 환자로부터 채취된 샘플인 것인 방법.
  11. 암 환자에 있어서 암 치료법의 효능을 모니터링하는 방법으로서 이 방법은:
    (i) 상기 암 치료법의 실시 도중 또는 실시 후 암 환자로부터 얻은 샘플 중의 암 줄기세포의 양을 구하는 단계;; 및
    (ii) 암 환자로부터 얻은 샘플 중의 암 줄기세포의 양을 상기 암 환자로부터 이전에 얻은 샘플 중의 암 줄기세포의 양의 양과 비교하는 단계를 포함하며,
    암 환자로부터 얻은 샘플 중의 암 줄기세포의 양을 구하는 것 및/또는 암 환자로부터 이전에 얻은 샘플 중의 암 줄기세포의 양을 구하는 것은 CLDN6을 발현하는 세포의 양을 구하는 것을 포함하는 것인 방법.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 암 환자로부터 이전에 얻은 샘플은 암 치료법 실시 전, 실시 도중 또는 실시 후에 암 환자로부터 채취된 샘플인 것인 방법.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 암 줄기세포의 양의 안정화 또는 감소는 상기 암 치료법이 효과적임을 가리키는 것인 방법.
  14. 제10항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 암 줄기세포의 양의 증가는 상기 암 치료법이 효과가 없음을 가리키는 것인 방법.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, 암 치료법은 암 줄기세포에 지향된 암 치료법인 것인 방법.
  16. 제3항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 암 환자로부터 얻은 샘플은 생물학적 체액 또는 종양 생검물인 것인 방법.
  17. 제3항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 샘플은 한 가지 이상의 전처리 단계를 거친 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 면역분석법에 의해 LDN6을 발현하는 세포가 검색되거나 그의 양이 구해지는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 면역분석법은 웨스턴 블롯, 면역조직화학법, 방사능면역측정법, ELISA (효소결합면역흡수측정법), "샌드위치" 면역분석법, 면역침전분석법, 침전반응, 겔 확산 침전반응, 면역확산 분석법, 응집 분석법, 보체결합 분석법, 면역방사능측정 분석법, 형광 면역분석법, 면역형광법, 단백질 A 면역분석법, 유세포분석법 및 FACS 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체를 이용함으로써 CLDN6을 검색하거나 그의 양을 구하는 것인 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에 있어서, CLDN6을 발현하는 세포는 CLDN6을 발현하는 암세포 및/또는 종양 부위에 존재하는 세포인 것인 방법.
  22. CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체를 암 환자에게 투여함으로써 암 줄기세포를 억제 및/또는 제거하는 것을 포함하는 암의 치료 또는 예방 방법
  23. 제22항에 있어서, 암 줄기세포는 CLDN6을 발현하는 것인 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 화학요법 및/또는 방사능요법을 실시하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 하나의 항에 있어서, 암 줄기세포의 억제 및/또는 제거는 화학요법 및/또는 방사선요법의 항암 효과를 증강시키는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 화학요법 및/또는 방사선요법의 항암 효과는 화학요법 및/또는 방사선요법이 수행되는 암 환자의 수명 연장을 포함하는 것인 방법.
  27. (i) CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체 및 (ii) 화학요법제를 암 환자에게 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 또는 예방 방법.
  28. 제27항에 있어서, 암은 CLDN6을 발현하는 암 줄기세포와 연관된 것인 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체의 투여에 의해 CLDN6을 발현하는 암 줄기세포의 억제 또는 제거가 초래되는 것인 방법.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 하나의 항에 있어서, CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체의 투여는 화학요법의 항암 효과를 증강시키는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 화학요법의 항암 효과의 증강은 화학요법이 수행되는 암 환자의 수명 연장을 포함하는 것인 방법.
  32. 제22항 내지 제26항 및 제29항 내지 제31항 중 어느 하나의 항에 있어서, 암 줄기세포의 제거에 의해 암이 치유되는 것인 방법.
  33. 제24항 내지 제32항 중 어느 하나의 항에 있어서, CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체 및 화학요법은 상승적 유효량으로 투여 또는 실시되는 것인 방법.
  34. 제24항 내지 제33항 중 어느 하나의 항에 있어서, 화학요법은 최대 관용 투여량 미만의 투여량으로 실시되는 것인 방법.
  35. 제24항 내지 제34항 중 어느 하나의 항에 있어서, 화학요법은 탁산, 백금 화합물, 뉴클레오사이드 유사체, 캄토테신 유사체, 안트라사이클린, 그의 전구약물, 그의 염, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 물질을 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  36. 제24항 내지 제35항 중 어느 하나의 항에 있어서, 화학요법은 파클리탁셀, 시스플라틴, 카르보플라틴, 그의 전구약물, 그의 염, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 물질을 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  37. 제22항 내지 제26항 및 제28항 내지 제36항 중 어느 하나의 항에 있어서, 암 줄기세포는 암 환자의 종양 부위에 있는 것인 방법.
  38. 제22항 내지 제37항 중 어느 하나의 항에 있어서, 암은 화학요법, 특히 단일요법제로서 투여되는 화학요법에 대해 내성인 것인 방법.
  39. 제22항 내지 제38항 중 어느 하나의 항에 있어서, CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체는 암 줄기세포에 대해 억제 및/또는 세포독성 효과를 갖는 것인 방법.
  40. 제39항에 있어서, CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체는 보체의존성 세포독성(CDC) 매개된 용해, 항체의존성 세포매개 세포독성(ADCC) 매개된 용해, 세포자멸사의 유도 및 증식 억제 중 한 가지 이상을 매개함으로써 암 줄기세포에 대한 그의 억제 및/또는 세포독성 효과를 발휘하는 것인 방법.
  41. 제22항 내지 제40항 중 어느 하나의 항에 있어서, CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체는 치료 모이어티에 커플링되는 것인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 치료 모이어티는 세포독성제, 화학요법제 또는 방사능핵종인 것인 방법.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 치료 모이어티는 서서히 자라는 세포에 대해 작용하는 것인 방법.
  44. 제22항 내지 제43항 중 어느 하나의 항에 있어서, CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체는 CLDN6의 제1 세포외 루프에 결합하는 것인 방법.
  45. 제22항 내지 제44항 중 어느 하나의 항에 있어서, CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체는 SEQ ID NO: 5 또는 그의 단편으로 나타내지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부(VH) 및 SEQ ID NO: 4 또는 그의 단편으로 나타내지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부(VL)를 포함하는 것인 방법.
  46. 링커에 의해 적어도 1종의 독소 약물 모이어티에 공유 결합되어 있는 CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체를 포함하는 항체 약물 컨쥬게이트를 암 환자에게 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 또는 예방 방법.
  47. 제46항에 있어서, 독소 약물 모이어티는 세포막-투과성인 것인 방법.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서, 독소 약물 모이어티는a 메이탄시노이드 또는 아우리스타틴인 것인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 메이탄시노이드는 DM1 및 DM4로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  50. 제48항에 있어서, 아우리스타틴은 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE) 및 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  51. 제46항 내지 제50항 중 어느 하나의 항에 있어서, 링커는 절단가능한 링커인 것인 방법.
  52. 제46항 내지 제51항 중 어느 하나의 항에 있어서, 링커는 카텝신-절단가능한 링커인 것인 방법.
  53. 제46항 내지 제52항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항체는 항체의 시스테인 티올을 통해 링커에 결합하는 것인 방법.
  54. 제46항 내지 제53항 중 어느 하나의 항에 있어서, 암은 CLDN6을 발현하는 암 줄기세포와 관련된 것인 방법.
  55. 제46항 내지 제54항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항체 약물 컨쥬게이트의 투여에 의해 CLDN6을 발현하는 암 줄기세포의 억제 또는 제거가 초래되는 것인 방법.
  56. 제46항 내지 제55항 중 어느 하나의 항에 있어서, 화학요법 및/또는 방사선요법을 실시하는 것을 더 포함하는 것인 방법.
  57. 제46항 내지 제56항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항체 약물 컨쥬게이트는 화학요법 및/또는 방사선요법의 항암 효과를 증강시키는 것인 방법.
  58. 제46항 내지 제57항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항체 약물 컨쥬게이트 중의 CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체는 CLDN6의 제1 세포외 루프에 결합하는 것인 방법.
  59. 제46항 내지 제58항 중 어느 하나의 항에 있어서, CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체는 SEQ ID NO: 5 또는 그의 단편으로 나타내지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부(VH) 및 SEQ ID NO: 4 또는 그의 단편으로 나타내지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부(VL)를 포함하는 것인 방법.
  60. 제1항 내지 제59항 중 어느 하나의 항에 있어서, CLDN6은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
  61. 제1항 내지 제60항 중 어느 하나의 항에 있어서, 암은 원발암, 진행된 암, 전이암, 재발암 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  62. (i) 제1항 내지 제21항 중 어느 하나의 항에 기재된 방법에 의해 암 환자에서 암 줄기세포를 탐지하고,
    (ii) 암 줄기세포에 지향된 암 치료법을 암 환자에게 실시하는 것
    을 포함하는, 암의 치료 또는 예방 방법.
  63. 제62항에 있어서, 암 줄기세포에 지향된 암 치료법은 제22항 내지 제61항 중 어느 하나의 항에 기재된 암의 치료 또는 예방 방법을 수행하는 것을 포함하는 것인 방법.
  64. 제22항 내지 제63항 중 어느 하나의 항에 기재된 방법에 의해 암을 치료하는 것을 포함하는, 특히 암 치료 도중 또는 암 치료 후의 암 화학내성, 암 재발, 또는 암 전이를 예방하는 방법.
  65. (i) CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체 및 (ii) 화학요법제를 포함하는 암의 치료 또는 예방을 의한 의약 제제.
  66. 제65항에 있어서, CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체를 함유하는 제1 용기 및 화학요법제를 함유하는 제2 용기를 포함하는 키트의 형태로 존재하는 것인 의약 제제.
  67. 제65항 또는 제66항에 있어서, 암의 치료 또는 예방을 위한 제제의 사용에 관한 인쇄된 지침서를 더 포함하는 것인 의약 제제.
  68. 링커를 통해 적어도 1종의 독소 약물 모이어티에 공유 결합된 CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체를 포함하는 항체 약물 컨쥬게이트.
  69. 제68항에 있어서, 독소 약물 모이어티는 세포막-투과성인 것인 항체 약물 컨쥬게이트.
  70. 제68항 또는 제69항에 있어서, 독소 약물 모이어티는a 메이탄시노이드 또는 아우리스타틴인 것인 항체 약물 컨쥬게이트.
  71. 제70항에 있어서, 메이탄시노이드는 DM1 및 DM4로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항체 약물 컨쥬게이트.
  72. 제70항에 있어서, 아우리스타틴은 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE) 및 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항체 약물 컨쥬게이트.
  73. 제68항 내지 제72항 중 어느 하나의 항에 있어서, 링커는 절단가능한 링커인 것인 항체 약물 컨쥬게이트.
  74. 제68항 내지 제73항 중 어느 하나의 항에 있어서, 링커는 카텝신-절단가능한 링커인 것인 항체 약물 컨쥬게이트.
  75. 제68항 내지 제74항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항체는 항체의 시스테인 티올을 통해 링커에 결합되는 것인 항체 약물 컨쥬게이트.
  76. 제68항 내지 제75항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항체 약물 컨쥬게이트 중의 CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체는 CLDN6의 제1 세포외 루프에 결합하는 것인 항체 약물 컨쥬게이트.
  77. 제68항 내지 제76항 중 어느 하나의 항에 있어서, CLDN6에 결합하는 능력이 있는 항체는 SEQ ID NO: 5 또는 그의 단편으로 나타내지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부(VH) 및 SEQ ID NO: 4 또는 그의 단편으로 나타내지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부(VL)를 포함하는 것인 항체 약물 컨쥬게이트.
  78. 제68항 내지 제77항 중 어느 하나의 항에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는 의약 포뮬레이션.
  79. 제68항 내지 제77항 중 어느 하나의 항에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트 및 화학요법제를 포함하는 의약 제제.
  80. 제79항에 있어서, 항체 약물 컨쥬게이트를 함유하는 제1 용기 및 화학요법제를 함유하는 제2 용기를 포함하는 키트의 형태로 존재하는 것인 의약 제제.
  81. 제79항 또는 제80항에 있어서, 암의 치료 또는 예방을 위한 상기 제제의 사용에 관한 인쇄된 지침서를 추가로 포함하는 것인 의약 제제.
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