KR20240036074A - 레티닐 아세테이트 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 숙주 세포, 특히 야로위아(Yarrowia)와 같은 유지성 효모에서 레티닐 아세테이트를 생산하는 신규 방법으로서, 원치 않는 부산물의 감소로 생성물 순도가 증가될 수 있는 방법에 관한 것이다. 특히, 상기 신규 방법은 예를 들어 유가식 발효 방법으로 에탄올의 존재 하에서의 발효를 포함한다. 이러한 방법은 비타민 A 생산을 위한 생명공학 방법에 특히 유용하다.

Description

레티닐 아세테이트 생산 방법

본 발명은 숙주 세포, 특히 야로위아(Yarrowia)와 같은 유지성 효모(oleaginous yeast)에서 레티닐 아세테이트(retinyl acetate)를 생산하는 신규 방법으로서, 원치 않는 부산물의 감소로 생성물 순도가 증가될 수 있는 방법에 관한 것이다. 특히, 상기 신규 방법은, 예를 들어, 유가식(fed-batch) 발효 방법으로 에탄올의 존재 하에서 발효하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 비타민 A 생산을 위한 생명공학적 방법에 특히 유용하다.

비타민 A 및 그 전구체를 포함하는 레티노이드(retinoid)의 현행 화학 생산 방법은, 일부 바람직하지 않은 특성, 예를 들어 고-에너지 소비, 복잡한 정제 단계 및/또는 바람직하지 않은 부산물과 같은 특성을 가지고 있다. 따라서, 지난 수십 년 동안, 비타민 A 및 그 전구체를 포함하는 레티노이드를 제조하는 미생물 전환 단계를 포함하는 다른 접근법이 연구되었으며, 이는 보다 경제적이면서 생태학적으로 비타민 A 생산을 유도할 수 있다.

일반적으로, 레티노이드를 생산하는 생물학적 시스템은 산업적으로 다루기 어렵고/어렵거나, 상업적 규모의 분리가 실용적이지 않은 낮은 수준으로 화합물을 생산한다. 가장 제한적인 요인으로는, 이러한 생물학적 시스템에서의 중간체의 불안정성 및/또는 특히 탄소 공급원으로서 식물성 오일이나 포도당에서 성장한 유지성 숙주 세포를 사용하는 경우, 지방산 레티닐 에스테르(FARE)와 같은 부산물의 상대적으로 높은 생성이 포함된다.

불안정성은 숙주 세포에서 고도의 특이적인 아세틸화 효소(ATF)의 발현을 통해 해결되어 결과적으로 레티닐 아세테이트의 축적은 증가시킬 수 있지만, 비타민 A 생산의 경우 상대적으로 높은 비율의 레티놀이 여전히 "손실"된다. 즉, 이는 FARE와 같은 원하지 않는 부산물로 전환되는데, 이 부산물은 정제가 어렵고 결정을 형성하지 않고 대신 왁스를 형성한다. 따라서 높은 농도의 FARE는 순수 제품의 대규모 산업적 생산을 제한한다.

따라서, 효모, 특히 야로위아와 같은 유지성 숙주 세포를 사용하여 레티닐 아세테이트를 생산할 때 순도 및/또는 생산성을 향상시킬 강한 필요성이 있다.

놀랍게도, 우리는 이제, 에탄올의 존재 하에서의 발효를 통해, 특히 유가식 발효 방법에서, 레티노이드의 생산이 개선되어 FARE를 포함한 불순물의 감소 또는 제거를 유도하고, 레티닐 아세테이트 및/또는 총 레티노이드를 증가시킨다는 것을 발견했다.

특히, 본 발명은 진균 숙주 세포, 바람직하게는 유지성 효모 세포, 예를 들어 야로위아에서 레티닐 아세테이트를 생산하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 발효 과정 동안, 특히 유가식 발효 공정으로, 첨가된 에탄올의 존재 하에 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하며, 이때 에탄올 부재 하의 발효와 비교하여, 특히 트라이글리세리드, 특히 본 출원에서 정의된 식물성 오일의 존재 하에서의 (발효) 방법과 비교하여, FARE를 포함하는 부산물의 형성이 감소 또는 제거되며(abolished), 바람직하게는 전체 레티노이드를 기준으로 약 50-100% 감소된다.

본 출원에서 상호교환적으로 사용되는 레티노이드의 발효적인 생산과 관련된 "부산물(by-products)" 및 "부수적 산물(side-products)" 이라는 용어는, 레티닐 아세테이트를 제외한, 발효 과정에서 생성되는 레티노이드를 의미한다. 발효 동안 감소 또는 제거될 부산물의 형성은 특히 FARE의 형성을 포함하고, 선택적으로 추가로, 배양 배지에 존재하고 레티닐 아세테이트로부터 정제될 수 있는 레티놀(retinol) 또는 레티날(retinal)의 존재를 포함한다.

본 출원에서 사용되는 "에탄올의 존재" 또는 "발효 동안 첨가된 에탄올" 하에서의 발효는 특히 유가식 발효 방법을 의미하며, 여기서 배취 단계(batch phase)는, 발효의 배취 단계 동안 배양 배지에 첨가되는 약 5%(v/v) 이하 농도, 예를 들어 약 5, 4.5, 4, 3.5, 3, 2.5, 2, 1.5, 1%의 양의 에탄올을 포함한다. 에탄올 공급은 당업계에 알려진 것처럼 pH 및/또는 DO 측정을 통해 제어되고, 전형적으로 약 100% 에탄올을 공급하고 약 40 내지 20%의 DO 설정점을 사용한다. 선택적으로, 배취 단계에서 또는 상기 공급물은 포도당(glucose)을 포함하는데, 예를 들어 약 20, 15, 10, 8, 5, 3, 2% 또는 그 이하량의 포도당이 발효의 배취 단계 동안 배양 배지에 첨가되거나 에탄올 대 포도당의 비율은 약 9:1, 8:2, 7:3 범위이다.

본 출원에서 사용되는 "트라이글리세리드, 특히 식물성 기름의 존재" 또는 "발효 중에 첨가된 트라이글리세리드, 특히 식물성 기름" 하에서의 발효는 특히 유가식 발효 방법을 의미하며, 여기서 배취 단계는, 발효의 배취 단계 동안 배양 배지에 첨가되는 약 10%(v/v) 이하 농도, 예를 들어 약 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2, 1%의 양의 트라이글리세리드를 포함한다. 사용되는 오일은 특히 식물성 오일, 예를 들어 옥수수, 대두, 올리브, 해바라기, 카놀라, 목화씨, 유채, 참깨, 홍화(safflower), 포도씨 또는 이들의 혼합물로부터 유래된 오일이며, 이는 예를 들어 올레산(oleic acid), 팔미트산(palmitic acid) 또는 리놀레산과 같은 각각의 유리 지방산(free fatty acid)을 포함한다.

하나의 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 레티닐 아세테이트 생산 방법에서 FARE-생산을 감소시키기 위한 본 출원에 기술된 방법에 관한 것으로, 여기서 FARE를 포함한 부산물의 백분율은 약 100% 감소될 수도 있으며(더 제거되거나 혹은 덜 제거될 수도 있음), 상기 방법은 본 출원에 정의된 에탄올의 존재 하에서의 발효를 포함한다. 본 출원에 정의된 트라이글리세리드 존재 하에서의 발효 방법과 비교하여, FARE의 형성은 적어도 약 50%, 예를 들어 약 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100% (즉, FARE 형성 배제) 감소될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명은 본 출원에 정의된 레티닐 아세테이트 생산 방법으로서, 발효 동안 형성된 FARE의 생산량이 총 레티노이드 기준 약 25% 미만, 예를 들어 약 20, 15, 10, 8, 5, 3, 2, 1% 미만인 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은, 진균 숙주 세포, 바람직하게는 야로위아와 같은 유지성 효모 세포에서 레티닐 아세테이트를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 본 출원에서 정의된 에탄올의 존재 하에서의 발효를 포함하며, 여기서 레티닐 아세테이트 형성 비율이, 에탄올 부재 하의 각각의 방법, 특히 본 출원에 정의된 트라이글리세리드의 존재 하에서의 발효 방법과 비교시, 전체 레티노이드를 기준으로 적어도 약 25%, 예를 들어 약 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100% 또는 그 이상 증가될 수 있는, 방법에 관한 것이다.

따라서, 한 특정 실시형태에서, 본 발명은, 본 출원에 정의된 바와 같이 진균 숙주 세포에서 레티닐 아세테이트를 생산하기 위한 본 출원에 기술된 방법으로서, 이때 발효 동안 형성된 레티닐 아세테이트의 백분율이 총 레티노이드를 기준으로 적어도 약 50-80% 범위 내, 예를 들어 적어도 약 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 87, 90, 95, 98% 또는 최대 100%의 백분율이며, 상기 방법은 본 출원에 정의된 바와 같은 에탄올의 존재 하에서의 발효를 포함하는, 방법에 관한 것이다.

추가적인 양태에서, 본 발명은, 에탄올 부재 하의 각각의 방법, 특히 본 출원에 정의된 트라이글리세리드 존재 하에서의 발효 방법과 비교시, 총 레티노이드를, 적어도 약 30% 범위, 예를 들어 약 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80% 또는 그 이상의 레티노이드 증가율로 증가시키는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 본 출원에 정의된 에탄올 존재 하에서의 발효를 포함한다.

한 실시형태에서, 본 발명은, 레티닐 아세테이트 생산 숙주 세포, 바람직하게는 야로위아와 같은 유지성 효모 세포를 본 출원에 정의된 바와 같이 에탄올의 존재 하에서의 발효를 포함하는 적합한 배양 조건 하에서 배양시키는 본 출원에 정의된 바와 같은 방법에 관한 것으로, 이때 총 레티노이드를 기준으로 발효 동안 형성된 FARE의 백분율은 25% 미만, 바람직하게는 약 10% 미만 범위이고, 레티닐 아세테이트의 백분율은 적어도 약 50-80% 범위, 바람직하게는 적어도 약 70, 80, 85, 87, 90, 95, 98%범위이다. 발효 동안 에탄올이 없는 방법, 특히 숙주 세포가 본 출원에 정의된 바와 같은 트라이글리세리드, 특히 식물성 오일의 존재 하에서의 발효 방법에서 배양되는 방법과 비교하여, 총 레티노이드를 기준으로 레티닐 아세테이트의 백분율은 약 100% 혹은 그 이상 증가할 수 있고, FARE의 백분율은 약 10~1% 범위, 또는 심지어는 약 1% 미만으로 감소되거나 심지어 완전 제거될 수도 있다.

본 발명은 레티닐 아세테이트 생산 숙주 세포, 특히 진균 숙주 세포, 바람직하게는 유지성 효모 세포, 예를 들어 로도스포리듐(Rhodosporidium), 리포마이세스(Lipomyces) 또는 야로위아, 바람직하게는 야로위아, 더욱 바람직하게는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)의, 본 출원에서 개시한 방법, 예를 들어 본 출원에 정의된 발효 동안 에탄올을 첨가하는 것을 포함하는 발효 방법에서의 용도에 관한 것이며, 이때 상기 방법은 특히 유가식 발효이고, 배취 단계는 약 5% (v/v) 이하 농도의 에탄올, 특히 배취 단계에서 2 내지 1%(v/v) 농도의 에탄올을 포함한다. 특히, 적합한 숙주 세포는 레티놀의 레티닐 아세테이트로의 효소적 전환을 촉매하는 이종 효소 EC 클래스 [EC 2.3.1.84]를 코딩하는 유전자를 발현한다. 이러한 ATF를 발현하는 적합한 균주는 예를 들어 WO2019058001 또는 WO2020141168에 설명되어 있다.

바람직하게는, 본 발명에 사용되는 숙주 세포는, [NDEHCS]-Hx(3)-D-[GA] (모티프(motif)는, 웹페이지 (https://prosite.expasy.org/scanprosite/scanprosite_doc.html)에 정의된 프로사이트 구문(Prosite syntax)에 있음) (이때, "x"는 임의의 아미노산을 나타내고, 중앙 히스티딘은 효소의 결합자리(binding pocket)의 일부임)로부터 선택된 적어도 7개의 아미노산 잔기의 고도로 보존된 부분 아미노산 서열을 포함하는 이종 ATF, 특히 진균 ATF를 발현시키며, 바람직하게는 상기 7개의 아미노산 모티프는 [NDE]-Hx(3)-D-[GA], 더욱 바람직하게는 [ND]-Hx(3)-D-[GA], 가장 바람직하게는 서열번호 18에 따른 폴리펩티드 내 위치 N218 내지 G224에 대응하는 NHx(3)-D-[GA]로부터 선택된다. 이러한 효소의 예는 특히 엘. 미란티나(L. mirantina), 엘. 퍼멘타티(L. fermentati), 에스. 바야누스(S. bayanus) 또는 더블유. 아노말루스(W. anomalus), 예를 들어 서열번호 18에 따른 LmATF1, SbATF1, LffATF1, LfATF1, Wa1ATF1 또는 Wa3ATF1(WO2019058001에 개시된 바와 같음)으로부터 선택될 수 있고, 더욱 바람직하게는 상기 ATF는, 서열번호 18에 대해 적어도 약 20%, 예를 들어 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 97, 98, 99% 또는 최대 100% 동일성(identity)으로 서열 내의 하나 이상의 아미노산 치환(들)을 포함하며, 이때 상기 하나 이상의 아미노산 치환(들)은 위치 68, 69, 72, 73, 171, 174, 176, 178, 291, 292, 294, 301, 307, 308, 311, 312, 320, 322, 334, 362, 405, 407, 409, 480, 483, 484, 490, 492, 520, 521, 522, 524, 525, 526 및 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기(들)에 상응하는 위치(들)에 위치되고, 이는 특히 WO2020141168의 표 4에 예시된 바와 같으며, 가장 바람직하게는 상기 ATF는, 서열번호 18의 69, 407, 409, 480, 484 및 이들의 조합의 아미노산 잔기(들)에 상응하는 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환(들)을 포함한다.

한 특정 실시형태에서, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 숙주 세포는 서열번호 18에 따른 폴리펩티드의 잔기 69에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 이는 상기 잔기에서, 예를 들어 히스티딘의 아스파라긴(H69N), 세린(H69S) 또는 알라닌(H69A) (바람직하게는 H69A)에 의한 치환을 통해서, 아스파라긴, 세린 또는 알라닌을 야기한다. 상기 변형된 효소는 효모, 예를 들어 L. 미란티나, L. 퍼멘타티, W. 아노말루스 또는 S. 바야누스, 바람직하게는 L. 미란티나로부터 유래될 수 있으며, 선택적으로 서열번호 18에 따른 폴리펩타이드 내의 잔기 407에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환과 조합될 수도 있으며, 이는 상기 잔기에서, 예를 들어 발린을 이소류신(V407I)으로 치환함으로써, 이소류신을 야기하며, 선택적으로 서열번호 18에 따른 폴리펩타이드 내의 잔기 409에 상응하는 위치에서 아미노산 치환과 조합될 수도 있으며, 이는 상기 잔기에서, 예를 들어 글라이신을 알라닌(G409A)으로 치환함으로써, 알라닌을 야기하며, 선택적으로 서열번호 18에 따른 폴리펩타이드 내의 잔기 480에 상응하는 위치에서 아미노산 치환과 조합될 수도 있으며, 이는 상기 잔기에서, 예를 들어 세린을 글루탐산(S480E), 라이신(S480L), 메티오닌(S480M), 페닐알라닌(S480F) 또는 글루타민(S480Q)으로 치환함으로써, 글루탐산, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 또는 글루타민을 야기하며, 선택적으로 서열번호 18에 따른 폴리펩타이드 내의 잔기 484에 상응하는 위치에서 아미노산 치환과 조합될 수도 있으며, 이는 상기 잔기에서, 예를 들어 이소류신을 류신(I484L)으로 치환함으로써, 류신을 야기한다.

상기 변형된 효소는 효모, 예를 들어 L. 미란티나, L. 퍼멘타티, W. 아노말루스 또는 S. 바야누스, 바람직하게는 L. 미란티나로부터 유래될 수 있다. 가장 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 ATF는 아미노산 치환들 S480Q_G409A_V407I_H69A_I484L을 포함하는 변형된 ATF이고 라찬세아 미란티나(Lachancea mirantina)로부터 수득할 수 있다.

본 출원에 사용된 용어 "숙주 세포"는, 레티닐-아세테이트 생산 세포, 즉 레티놀을 합성할 수 있고, 본 출원에 정의된 ATF를 발현하여, 상기 숙주 세포에 의해 생산된 총 레티노이드를 기준으로 본 출원에 정의된 백분율로 레티닐 아세테이트를 생성할 수 있는 세포를 포함한다. 선택적으로, 이러한 숙주 세포는 또한 카로티노이드를 생산할 수 있다. "진균 숙주 세포"는 특히 효모 세포, 즉 레티닐 아세테이트-생산 효모 세포, 예컨대 비제한적으로 야로위아(Yarrowia), 로도스포리디움(Rhodosporidium) 또는 리포마이세스(Lipomyces)를 포함한다.

선택적으로, 레티놀의 전환으로부터 레티닐 아세테이트를 생산할 수 있는 야로위아와 같은 숙주 세포는, 베타-카로틴의 생합성에 사용되고/되거나 추가적으로 베타-카로틴의 레티날로의 전환 및/또는 레티날의 레티놀로의 전환을 촉매하는 데 사용되는 추가 효소를 발현한다. 당업자는 베타-카로틴의 생합성 및/또는 베타-카로틴의 레티놀로의 바이오-전환을 위해 어떤 유전자가 사용/발현되는지를 알고 있다. 본 출원에 정의된 ATF 유전자 및/또는 비타민 A의 생합성에 필요한 추가 유전자를 추가로 발현할 수 있는 이러한 숙주 세포는 수성 배지에서 배양되며, 이 배지는 발효 동안의 에탄올의 첨가를 포함하고, 선택적으로 호기성 또는 혐기성 조건 하에 레티닐 아세테이트의 생산을 가능하게 하는 것으로 당업자에게 알려진 적절한 영양분이 보충된다. 바람직하게는, 발효는 유가식으로 수행되며, 여기서 배취 단계는 약 5% 이하의 에탄올 농도, 특히 2 내지 1% 에탄올 농도를 가지며, 100% 에탄올의 공급물이 본 출원에 특별히 예시되어 있다. 특히, 발효는 유가식 교반 탱크 반응기에서 진행된다. 발효는 5~14일 동안, 예를 들어 약 118시간 동안 진행될 수 있다. 레티닐 아세테이트를 포함한 발효 생성물은 적절한 시기에, 예를 들어 공급물 첨가로 탱크가 채워질 때, 배양배지에서 수확될 수 있다. 숙주 세포에 따라, 바람직하게는, 레티노이드, 예를 들어 비타민 A, 이의 전구체 및/또는 유도체, 예컨대 레티날, 레티놀, 레티닐 아세테이트, 특히 레티닐 아세테이트의 생산은 당업자에게 공지된 바와 같이 다양할 수 있다. 레티놀, 레티닐 아세테이트, 비타민 A를 포함하되 이에 국한되지 않는 레티노이드는 식품, 사료, 제약 또는 화장품 산업에서 성분/제형으로 사용될 수 있다. 사카로마이세스로부터 선택된 베타-카로틴 및 레티노이드 생산 숙주 세포의 배양 및 분리는 예를 들어 WO2008042338에 기재되어 있다.

한 실시형태에서, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 숙주 세포는, 레티놀을 FARE로 전환시키는 내인성 효소 활성의 변형과 같은 추가 변형을 포함할 수 있다. 특히, 이러한 변형에는 내인성 리파제 활성(즉, 트라이글리세리드 오일, 예를 들어 식물성 기름의, 유지성 숙주 세포에서 정상적으로 발현되는 글리세롤 및 지방산으로의 사전 소화에 관여하는 효소의 활성)의 결실(deletion)이 포함된다. 본 출원에 정의된 방법에 사용되는 숙주 세포에서 변형되는 적합한 효소는 EC 번호 3.1.1.-에 속하는 내인성 효소, 예컨대 비제한적으로, 야로위아 LIP2, LIP3, LIP4, LIP8, TGL1, LIP16, LIP17 또는 LIP18 활성에 상응하는 활성을 갖는 하나 이상의 효소(들)로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 상기 변형은 야로위아 LIP2 및/또는 LIP3 및/또는 LIP4 및/또는 LIP8 활성에 상응하는 활성을 갖는 효소를 코딩하는 내인성 유전자의 감소 또는 제거일 수 있다.

본 출원에 사용될 때, 야로위아에서 각각의 LIP 활성에 상응하는 활성을 갖는 효소는 야로위아, 예를 들어 야로위아 리폴리티카, 예를 들어 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15에 따른 야로위아 LIP2, LIP3, LIP4, LIP8, TGL-1, LIP16, LIP17, LIP18 또는 이들의 조합에서 유래된 유전자를 포함하는 것뿐만 아니라, 다른 공급원 유기체, 특히 레티닐 아세테이트-생산 유지성 숙주 세포로부터 유래된 동등한 효소 활성을 갖는 효소도 포함한다. 바람직하게는, 숙주 세포는, 야로위아 리폴리티카 리파제 활성 2, 3, 4, 8 또는 이들의 조합에 상응하는 내인성 리파제 활성의 결실을 포함하고, 특히 상기 숙주 세포는, 내인성 리파제 활성, 예컨대 lip8 또는 lip8의 조합물(예를 들어, lip8과 lip2의 조합, lip8과 lip2 및 lip3의 조합, lip8과 lip2, lip3 및 lip4 활성의 조합)의 결실을 포함하는 야로위아 리폴리티카이다.

핵산 또는 아미노산으로의 돌연변이(mutation) 생성, 즉 돌연변이 유발(mutagenesis)은 무작위 또는 측면(side-directed) 돌연변이 유발, 예를 들어 방사선과 같은 요소에 의한 물리적 손상, 화학적 처리 또는 유전적 요소의 삽입과 같은 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 당업자는 어떻게 돌연변이를 도입하는지 알고 있다.

"서열 동일성(sequence identity)", "동일성%"라는 용어는, 본 출원에서 상호교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적을 위해, 이는 본 출원에서, 2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산 서열의 서열 동일성%를 결정하기 위하여, 최적의 비교 목적을 위해 서열이 정렬되는 것으로 정의된다. 2개의 서열 간의 정렬을 최적화하기 위해, 비교되는 임의의 2개의 서열에 공백(gap)이 도입될 수 있다. 이러한 정렬은 비교될 서열의 전체 길이에 걸쳐 수행될 수 있다. 대안적으로, 상기 정렬은 더 짧은 길이, 예를 들어 약 20개, 약 50개, 약 100개 또는 그 이상의 핵산/염기 또는 아미노산에 걸쳐 수행될 수 있다. 서열 동일성은, 보고되는 정렬 영역에 걸친 두 서열 간의 동일한 매칭의 %이다. 2개의 아미노산 서열 간의 또는 2개의 뉴클레오타이드 서열 간의 서열 동일성%는, 2개의 서열의 정렬에 대한 니들만-분쉬 알고리즘(Needleman and Wunsch algorithm)을 사용하여 결정될 수 있다(문헌[Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453] 참조). 아미노산 서열과 뉴클레오타이드 서열 둘 다 상기 알고리즘에 의해 정렬될 수 있다. 니들만-분쉬 알고리즘은 컴퓨터 프로그램 NEEDLE에서 구현되었다. 본 발명의 목적을 위해, EMBOSS 패키지로부터의 NEEDLE 프로그램이 사용되었다(버전 2.8.0 이상, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice, Longden and Bleasby, Trends in Genetics 16, (6) pp276―277, http://emboss.bioinformatics.nl/). 단백질 서열의 경우, EBLOSUM62가 치환 매트릭스에 사용된다. 염기 서열의 경우, EDNAFULL이 사용된다. 사용되는 임의적 매개변수는, 10의 갭-개방 페널티(gap-open penalty) 및 0.5의 갭-연장 페널티(gap extension penalty)이다. 당업자는, 이러한 모든 상이한 매개변수가 약간 상이한 결과를 제공할 것이지만 두 서열의 전체 동일성%는 상이한 알고리즘의 사용시 그다지 변하지 않음을 이해할 것이다.

전술된 바와 같은 NEEDLE 프로그램에 의해 정렬된 후, 질의 서열(query sequence)과 본 발명의 서열 간의 서열 동일성%는 다음과 같이 계산된다: [이들 서열 둘 다에서 동일한 아미노산 또는 동일한 뉴클레오타이드를 나타내는 정렬의 대응 위치의 개수]/[상기 정렬의 공백의 총 개수를 뺀 후의 상기 정렬의 총 길이]. 본 출원에 정의된 바와 같은 동일성은, NOBRIEF 옵션을 사용함으로써 NEEDLE로부터 수득될 수 있으며, 프로그램 출력에 "최장 동일성"으로 표시된다. 비교되는 아미노산 서열 둘 다가 이들의 임의의 아미노산 면에서 상이하지 않으면, 이들은 동일하거나 100% 동일성을 가진다.

본 발명에 사용되는 적합한 숙주 세포에서 발현되는, 본 출원에 기재된 바와 같은 효소는 또한, 효소 활성을 변경하지 않는(즉, 본 출원에 정의된 효소에 대하여 동일한 특성을 나타내는) (추가의) 아미노산 치환(들)을 포함하는 효소를 포함한다. 이러한 돌연변이는 또한 "침묵 돌연변이(silent mutation)"로도 불리는데, 이는 본 발명에 따른 효소의 (효소적) 활성을 변경하지 않는다.

본 발명과 관련하여, 유기체(예를 들어, 미생물, 진균, 조류 또는 식물)는 또한, 국제 원핵생물 명명 코드 또는 국제 조류, 균류 및 식물 명명 코드(멜버른 코드)에 정의된 것과 같은 생리학적 특성을 갖는 이러한 종의 동의어(synonym) 및 기본명(basonym)을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 라찬세아 미란티나(Lachancea mirantina) 균주는, 일본으로부터 유래된 자이고사카로마이세스(Zygosaccharomyces) 종 IFO 11066 균주의 동의어이다.

본 발명은 레티닐 아세테이트의 제조 방법에 관한 것이며, 여기서 레티닐 아세테이트는 기재된 바와 같은 변형/비변형된 ATF의 작용에 의해 본 출원에 기재된 바와 같은 레티놀(특히 트랜스-레티놀로서 적어도 65%)의 아세틸화를 통해 생성되며, 여기서 아세틸화 효소는 본 출원에 기재된 바와 같은 적합한 조건 하에 적합한 숙주 세포에서 이종 발현되고, 숙주 세포는 발효 동안 첨가된 유효량의 에탄올을 포함하는 배지에서 배양된다. 생산된 레티닐 아세테이트는 배지 및/또는 숙주 세포로부터 분리되고 선택적으로 추가로 정제될 수 있다. 본 출원에 정의된 상기 아세틸화된 레티노이드는 다-단계 과정에서 빌딩 블록(building block)으로 사용되어 비타민 A를 생성할 수 있다. 비타민 A는 당업계에 공지된 바와 같이 배지 및/또는 숙주 세포로부터 분리되고 선택적으로 추가로 정제될 수 있다.

본 출원에서 효소와 관련된 용어 "특이적 활성" 또는 "활성"은, 이의 촉매 활성(즉, 제시된 기질로부터 생성물의 형성을 촉진하는 능력)을 의미한다. 특이적 활성은, 제시된 기간 동안 정의된 온도에서 정의된 양의 단백질에 대한 소모된 기질(substrate) 및/또는 생성된 생성물의 양을 정의한다. 전형적으로, 특이적 활성은, 소모된 기질 또는 형성된 단백질(μmol/min/(단백질 mg))로 표현된다. 전형적으로, μmol/min은 U(= 단위)로 약칭된다. 따라서, μmol/min/(단백질 mg) 또는 U/(단백질 mg)의 특이적 활성에 대한 단위 정의가 본 출원 전반에 걸쳐 상호교환적으로 사용된다. 효소가 생체 내에서(즉, 본 출원에 정의된 바와 같은 숙주 세포 내에서) 또는 적합한 기질의 존재 하에 적합한 (무-세포) 시스템 내에서 이의 촉매 활성을 수행하는 경우, 이 효소는 활성이다. 당업자는, 효소 활성을 측정하는 방법을 알고 있다. 레티닐 아세테이트 생산 (즉, 레티놀의 아세틸화)에 대해 본 출원에 정의된 바와 같은 (야생형 또는 변형된) 적합한 ATF, 또는 본 출원에 정의된 바와 같은 리파제 활성을 갖는 효소의 능력을 평가하기 위한 분석 방법은, 예를 들어 WO2014096992의 실시예 4에 기재된 바와 같이, 당분야에 공지되어 있다. 간단히 말해서, 레티닐 아세테이트, 레티놀, 트랜스-레티날, 시스-레티날, 베타-카로틴 등과 같은 생성물의 역가(titer)가 HPLC에 의해 측정될 수 있다.

베타-카로틴의 생합성에 관여하고 생체 내에서 발현되고 활성을 나타내어 카로티노이드(예를 들어 베타-카로틴)을 생산하는 특정 효소를 포함하는 적합한 숙주 세포와 관련하여, 카로티노이드 생산 숙주 세포를 생성하는 유전자 및 방법은, 예를 들어 WO2006102342와 같이 당분야에 공지되어 있다. 생성되는 카로티노이드에 따라 다양한 유전자가 관련될 수 있다.

본 출원에서 사용되는 "레티놀-생산 숙주 세포"는, 생체 내에서 각각의 폴리펩티드가 발현되고 활성이어서, 본 출원에 개시된 ATF의 효소적 활성을 통해, 예를 들어 비타민 A 및 이의 전구체 (예컨대 레티놀) 의 생산을 유도하는 숙주 세포이다. 비타민 A 경로의 유전자 및 레티노이드-생산 숙주 세포를 생성하는 방법은 당분야에 공지되어 있다. 레티노이드라는 용어는, 본 출원에 정의된 변형된 아세틸화 효소에 대한 기질로 사용되는 레티놀을 포함한다. "레티닐 아세테이트 생산 숙주 세포"는 레티놀을 레티닐 아세테이트로 아세틸화할 수 있는 각각의 숙주 세포이다.

본 출원에서 사용되는 레티노이드는 아포카로티노이드로도 알려진 베타-카로틴 절단 생성물, 예컨대 비제한적으로, 레티날, 레티놀산, 레티놀, 레티노익 메톡사이드, 레티닐 아세테이트, 레티닐 에스테르, 4-케토-레티노이드, 3 하이드록시-레티노이드 또는 이들의 조합을 포함한다. 레티노이드의 생합성은, 예를 들어 WO2008042338에 기술되어 있다.

본 출원에서 사용되는 "레티날"은, IUPAC 명칭 (2E,4E,6E,8E)-3,7-다이메틸-9-(2,6,6-트라이메틸사이클로헥센-1-일)노나-2,4,6,8-테트라에날로 공지되어 있다. 이는 본 출원에서 레틴알데하이드 또는 비타민 A 알데하이드로서 상호교환적으로 지칭되며, 시스- 및 트랜스-이소형 둘 다(예를 들어, 11-시스 레티날, 13-시스 레티날, 트랜스-레티날 및 올-트랜스 레티날)를 포함한다.

본 출원에서 사용되는 용어 "카로티노이드"는 당분야에 널리 공지되어 있다. 이는, 2개의 C20 게라닐게라닐 파이로포스페이트 분자의 결합(ligation)에 의해 자연에서 형성되는 긴 C40 공액(conjugated) 이소프레노이드 폴리엔을 포함한다. 이는, 비제한적으로, 파이토엔(phytoene), 라이코펜(lycopene) 및 카로틴, 예를 들어 베타-카로틴을 포함하며, 이는 4-케토 위치 또는 3-하이드록시 위치에서 산화되어 칸타잔틴, 제아잔틴 또는 아스타잔틴을 생성할 수 있다. 카로티노이드의 생합성은, 예를 들어 WO2006102342에 기재되어 있다.

본 출원에서 사용되는 "비타민 A"는, 용액, 고체 및 제형에서 발견되는 비타민 A의 임의의 화학적 형태일 수 있으며, 레티놀, 레티닐 아세테이트 및 레티닐 에스테르를 포함한다. 이는 또한 레티노산, 예를 들어, 자유산 형태의 비-해리된 레티노산 또는 음이온으로서 해리된 레티노산을 포함한다.

또한 놀랍게도, 스테비올 글리코시드와 같은 다른 이소프레노이드-유래 생성물의 생산이 에탄올의 존재 하에서의 재조합 진균 숙주 세포, 특히 효모 세포, 예를 들어 사카로마이세스 세레비지애 세포, 더욱 특히 유지성 효모 세포, 예를 들어 재조합 야로위아 세포(스테비올 글리코시드를 생성할 수 있도록 적절하게 변형됨)의 발효를 통해 개선되었다는 사실도 발견되었다. 에탄올 부재 하의 각 방법과 비교했을 때, 에탄올이 탄소원으로 제공되었을 때, 특히 유가식 발효 방법에서, 상기 생성물의 생산이 증가한 것으로 밝혀졌다. 보다 특히, 배취 성장 단계 후에 순수한 에탄올 공급물 또는 혼합된 에탄올 공급물(예를 들어, 에탄올/글루코스 혼합물)을 사용하는 경우 상기 생성물의 생산이 증가되었다.

따라서, 본 개시내용은, 재조합 진균 숙주 세포, 바람직하게는 효모 세포, 예를 들어 사카로마이세스 세레비지애 세포, 더욱 바람직하게는 유지성 효모 세포, 예를 들어 재조합 야로위아 세포, 더욱 바람직하게는 야로위아 리폴리티카 (스테비올 글리코시드를 생성할 수 있도록 적절하게 변형됨)에서 스테비올 글리코시드를 생산하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 본 출원에 정의된 바와 같은 에탄올의 존재 하에서의 발효를 포함한다. 본 개시내용은 또한, 본 출원에 정의된 발효 동안 에탄올을 첨가하는 것을 포함하는 발효 방법에서의, 스테비올 글리코시드를 생산하는 숙주 세포, 바람직하게는 효모 세포, 예를 들어 사카로마이세스 세레비지애 세포, 더욱 바람직하게는 유지성 효모 세포, 예를 들어 재조합 야로위아 세포, 더욱 바람직하게는 야로위아 리폴리티카 (스테비올 글리코시드를 생성할 수 있도록 적절하게 변형됨)의 용도에 관한 것이다.

스테비올 글리코시드의 생산에 적합한 진균 숙주 세포는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 WO2011153378, WO2013022989, WO2014122227, WO2013110673 및 WO2015007748에 기재되어 있다.

생산된 스테비올 글리코시드는 당업자에게 공지된 방법에 따라 배지 및/또는 숙주 세포로부터 분리되고 선택적으로 추가로 정제될 수 있다.

하기 실시예는 예시일 뿐이며, 어떤 식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌, 특허 출원, 특허 및 특허 출원 공개, 특히 WO2019058001, WO2020141168, WO2008042338, WO2014096992, WO2006102342, WO2016172282, WO2011153378, WO2013022989, WO2014122227, WO2013110673, 및 WO2015007748를 본 출원에 참고로 인용한다.

실시예

실시예 1: 일반적인 방법 및 플라스미드

본 출원에 기술된 모든 기본적인 분자 생물학 및 DNA 조작 절차는 일반적으로 문헌[Sambrook et al. (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York (1989)] 또는 문헌[Ausubel et al. (eds). Current Protocols in Molecular Biology. Wiley: New York (1998)]에 따라 수행하였다.

DNA 형질전환. 균주를 YPD 플레이트 배지 상에서 밤새 성장시켜 형질전환시키고; 50 μL의 세포를 상기 플레이트로부터 스크랩하고, 1 μg의 형질전환 DNA(전형적으로, 통합 형질전환(integrative transformation)을 위한 선형 DNA), 40% PEG 3550MW, 100 mM 리튬 아세테이트, 50 mM 다이티오트레이톨, 5 mM Tris-Cl pH 8.0, 및 0.5 mM EDTA를 갖는 500 μL 중에서 40℃에서 60분 동안 배양함으로써 형질전환시키고, 선택적(selective) 배지에 직접 플레이팅하거나, 또는 우세한 항생제 마커 선택(dominant antibiotic marker selection)의 경우에는, 상기 세포를 30℃에서 4시간 동안 YPD 액체 배지 상에서 성장시킨 후 선택적 배지에 플레이팅하였다. 5-플루오로오로트산(FOA)을 사용하여, URA3 마커 재순환을 수행하였다. 비-선택적 배지 상의 계대배양(passage)에 의해 에피솜 하이그로마이신 내성 마커(hygromycin resistance marker, Hyg) 플라스미드를 큐어링하였으며(cured), 콜로니를 비-선택적 배지로부터 하이그로마이신-함유 배지(100 μg/mL)로 복제 플레이팅(replica plating) 함으로써, Hyg-민감성 콜로니를 동정하였다.

DNA 분자 생물학. DrBCO, LmATF-S480Q_G409A_V407I_H69A_I484L, 및 FfRDH(서열번호:10)를 위한 발현 시스템을 포함하는 플라스미드 MB9523이 진스크립트(Genscript)(미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)에서 합성되었다. 플라스미드 MB9523은, 야로위아 리폴리티카 형질전환에서의 마커 선택을 위해 'URA3'을 포함한다. 유전자와 마커의 무작위 비-상동성 말단 결합에 의한 유전자 삽입을 위해, 관심 있는 SfiI-분해된(digested) MB9523 플라스미드 단편을 겔 전기영동 및 퀴아젠(Qiagen) 겔 정제 칼럼으로 정제하였다. 클론을 시퀀싱으로 확인하였다. 전형적으로, 유전자는 진스크립트(미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)에서 합성 분자생물학에 의해 합성되었다.

플라스미드 목록. 사용된 플라스미드, 균주, 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 하기 표 1, 2 및 서열목록에 열거한다. 일반적으로, 본 출원에 언급된 모든 비-변형된 서열은 참조(reference) 균주 CLIB122에 대한 데이터베이스의 접근 서열과 동일하다(문헌[Dujon B, et al, Nature. 2004 Jul 1;430(6995):35-44] 참조).

[표 1]: "삽입"으로 제시되는 각각의 유전자의 과발현 또는 결실에 대한 균주의 구성에 대해 사용된 플라스미드의 목록

(“LmATF1-mut”는, aa 치환 S480Q_G409A_V407I_H69A_I484L 을 포함하는 라찬세아 미란티나 (LmATF1; WO2019058001의 서열번호 13)를 지칭하고; "DrBCO"는, 다니오 레리오로부터 유래하는 BCO(WO2020141168의 서열번호 16 참조)를 지칭하고; "FfRDH"는, 푸사리움 푸지쿠로이(Fusarium fujikuroi)로부터 유래하는 RDH(WO2020141168의 서열번호 22 참조)를 지칭하며; 상세한 설명은 본 출원 명세서를 참조한다)

[표 2]: 사용된 야로위아 리폴리티카 균주의 목록

(ML17544의 구성은 WO2020141168의 표 2에 기술되어 있고; 상세한 설명은 본 출원 명세서를 참조한다)

발효 조건. 유가식 발효는, 드라케올 5(펜레코(Penreco), 미국 펜실베이니아주 칸스 시티 소재) 또는 또 다른 덧층(overlay) 및 0.5 L 내지 5 L의 총 부피를 갖는 벤치 탑 반응기(bench top reactor)(WO2016172282 참조)에 옥수수유, 글루코스 또는 에탄올이 공급된 교반 탱크를 사용하는 것을 제외하고는, 전술된 조건과 동일하였다. 배취 배지 탄소 공급원 조성물 및 공급 배지가 하기 표 3에 열거된다. 공급은 초기 배취의 탄소가 소모된 후 시작되었으며, 이때 공급은 용존 산소 수준(DO) 설정값을 유지하도록 제어되는 방식으로 첨가되었다. 간략하게, 발효는 유리 재질의 뉴 브런즈윅(New Brunswick) 또는 에펜도르프(Eppendorf) 발효 시스템 내에서 3.0 L 범람(flood) 부피로 실행하였다. 발효기는, 2228mL의 탈이온수(deionized water), MgSO_4·7H₂O 1.96g/kg 및 NaCl 0.20g/kg (10.46mL), 1.04g의 CaCl₂-2H₂O, 26.18g의 (NH₄)₂SO_4, 27.10g의 KH₂PO₄, 19.62g의 Tastone 효모 추출물(마르코르(Marcor), 미국 메사추세츠주 레오민스터 소재), 26mL의 DF204 소포제, 0.654μL의 티아민 HCl (4mg/ml), 미량 원소 스톡(stock) 용액 3.27ml/L (시트르산(200 g/kg), FeSO_4·7H₂O(27.3 g/kg), Na₂MoO_4·2H₂O(19.6 g/kg), 7 CuSO_4·5H₂O(18.7 g/kg), H₃BO₃(4.9 g/kg), MnSO_4·H₂O(21.9 g/kg), 및 ZnSO_4·7H₂O (30.2 g/kg) 함유)으로 배취가 구성되고, 오토클레이빙되었다(autoclaved). 냉각 후, 탄소 공급원을 800 mL의 드라케올(Drakeol) 5 또는 다른 제2 상과 함께 첨가하였다. 이 발효액에, 30℃에서 250RPM의 교반 하에 성장한 YP 배지의 200 mL 밤새 진탕 플라스크 배양물과 상기 표 3에 제시된 특정 탄소 공급원을 접종하였다. 발효 매개변수는 1000RPM에서의 교반, 에탄올의 경우 4.6 LPM의 기류(airflow) 및 오일 및 혼합 지방산의 경우 2.3 LPM의 기류, NH₄OH를 사용한 제어로써 5.5로 제어된 pH, 및 30℃로 설정된 온도였다. 공급 시작 시, DO 설정값이 40%로 유지되도록 공급물을 공급하였다. DO 설정값을, 공급 속도를 증가시킴으로써 다음 24시간에 걸쳐 선형 방식으로 20%로 경사지게 감소시켰다. 이어서, 나머지 발효 동안 공급물 첨가를 통해 DO를 20%로 유지하였다.

[표 3] 발효 공급 프로토콜

(발효 제 2 상은 항상 대략 20중량%의 드라케올 5임; 상세한 설명은 본 출원 명세서를 참조한다)

레티노이드 정량화. 레티노이드의 분석은 C4 역상 레티노이드 방법(하기 참조) 및 다른 곳(WO2020141168)에 기재된 바와 같은 C18로 수행하였다. 모든 첨가된 중간체의 첨가가 레티노이드의 총량을 제공한다.

C4 역상 크로마토그래피. 개별 레티노이드의 정확한 결정을 위해 긴 실행 역상 시스템을 사용하였다. 본 발명자들은, YMC Pro C4, 150 x 3.0mm 3 μm 칼럼(와이엠씨 아메리카(YMC America), 미국 매사추세츠주 데벤스 소재) 고정 상, 5 μL의 주입 루프 부피, 및 23℃로 제어되는 샘플 트레이 및 칼럼을 갖는 애질런트(Agilent) 1290 장치를 통해 하기 표 4B에 기술되는 구배로 230 nm 및 325 nm에서 분석물을 분리하였다. 상기 분석물을 230 nm 및 325 nm에서 검출하였고, 피크 동일성은 LCMS로 확인하였다. 상기 분석물을, 하기 표 4A에 따라 지정된 개별 피크로서 분리하였다.

[표 4A] C4-역상 방법을 사용한 분석물의 목록

(모든 첨가된 중간체의 첨가가 총 레티노이드 양을 제공하며; “RT”는 체류 시간을 의미하고; 상세한 설명은 본 출원 명세서를 참조한다)

[표 4B] 용매 A(아세토나이트릴); 용매 B(물); 용매 C(물/아세토나이트릴/ 메탄설폰산 (1000:25:1))를 이용한 UPLC 방법 구배

(상세한 설명은 본 출원 명세서를 참조한다)

방법 보정(calibration). 디에스엠 뉴트리셔널 프로덕츠(DSM Nutritional Products)(스위스 카이저아우그스트 소재)로부터 입수한 고순도 레티닐 아세테이트를 사용하여 방법을 보정하였다. 레티놀과 레티날을 레티닐 아세테이트에 대해 정량화하였다. 희석액은 다음과 같이 제조되었다. 40 mg의 레티닐 아세테이트를 100 mL의 메스 플라스크에 칭량하여 넣고, 에탄올에 용해시켜, 400 μg/mL의 용액을 제조하였다. 용해를 보장하기 위해, 상기 용액을 필요한 만큼 초음파 처리하였다. 메탄올/메틸 3급-부틸 에터(MTBE)(50/50)를 희석제로서 사용하여, 상기 400 μg/mL의 용액 5 mL를 50 mL로 희석하고(1/10 희석, 최종 농도 40 μg/mL), 상기 용액 5 mL를 100 mL로 희석하고(1/20 희석, 최종 농도 20 μg/mL), 상기 40 μg/mL의 용액 5 mL를 50 mL로 희석하고(1/10 희석, 최종 농도 4 μg/mL), 상기 20 μg/mL의 용액 5 mL를 50 mL로 희석하였다(1/10 희석, 2 μg/mL). 모든 희석은 메스 플라스크에서 수행하였다. 레티닐 아세테이트의 순도는, 400 μg/mL 스톡 용액을 에탄올에 100배 추가 희석(2 mL의 부피측정 피펫 및 200 mL의 메스 플라스크 사용)하여 결정하였다. 에탄올을 사용한 325 nm에서의 상기 용액의 흡광도를 블랭크로 취하고, 하기 수학식 1을 사용하여 초기 농도를 조정하였다:

[수학식 1]

Abs * 희석 배율(100) * 분자량(328.5)/51180 = 농도(mg/mL).

레티닐 아세테이트의 UV 흡광도는 빠르게 최대화되기 때문에, 농도가 낮을수록 좋다.

샘플 제조. 각각의 균주로부터의 상부 제2상 층 샘플을, 필요하다면 테트라하이드로퓨란(THF)에, 25배 희석 배율 이상으로 희석하였다. 전체 발효액(fermentation broth)을, 2 mL의 프리셀리스(Precellys)(미국 메릴랜드주 락빌 소재의 버틴 코포레이션(Bertin Corp)) 튜브를 사용하여 제조하고, 25 μL의 잘 혼합된 발효액과 975 μL의 THF를 가했다. 상기 프리셀리스(3x15x7500 rpm)를 2사이클 동안 원심분리하고, 사이클 사이에 10분 동안 -80℃에서 동결시켰다. 세포 잔해물을 13000 rpm에서 1분 동안 원심분리를 통해 스핀다운시켰다. 분석을 위해 이들 샘플을 THF에 10배 희석하였다.

실시예 2: 야로위아를 사용한 유가식 발효에서 레티노이드 생산에 대한 탄소 공급원의 영향

야로위아 리폴리티카에서 레티노이드 생산에 대한 탄소 공급원원의 영향을 평가하기 위해, 에탄올 또는 오일(표 3 참조) 존재 하에서의 발효를 실시하고, 균주 ML18812로부터 FARE의 백분율을 측정하여 레티닐 아세테이트의 순도 및 백분율을 평가했다.

에탄올 존재 하에서의 발효는 옥수수유 존재 하에서의 발효에 비해 FARE 형성이 크게 감소하는 결과를 가져왔다. 총 레티노이드뿐 아니라 레티닐 아세테이트의 비율도 옥수수유 발효에 비해 증가될 수 있다. 그 결과는 표 5에 나타내었다.

[표 5] ML18812 균주를 사용시 FARE, 레티노이드 및 레티닐 아세테이트("retAc")의 생산에 대한 에탄올의 효과

("+++"는 최대값의 상위 사분위수에 있고, "++"는 중간 사분위수에 있으며, "+/-"는 미량으로 관찰됨을 나타내고, "---"는 관찰되지 않음을 나타내고, "retAc"는 레티닐 아세테이트를 의미한다. 상세한 설명은 본 출원 명세서를 참조한다.)

SEQUENCE LISTING <110> DSM IP Assets B.V. <120> Method to produce retinyl acetate <130> Case 33799 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 334 <212> PRT <213> Yarrowia lipolytica <400> 1 Met Lys Leu Ser Thr Ile Leu Phe Thr Ala Cys Ala Thr Leu Ala Ala 1 5 10 15 Ala Leu Pro Ser Pro Ile Thr Pro Ser Glu Ala Ala Val Leu Gln Lys 20 25 30 Arg Val Tyr Thr Ser Thr Glu Thr Ser His Ile Asp Gln Glu Ser Tyr 35 40 45 Asn Phe Phe Glu Lys Tyr Ala Arg Leu Ala Asn Ile Gly Tyr Cys Val 50 55 60 Gly Pro Gly Thr Lys Ile Phe Lys Pro Phe Asn Cys Gly Leu Gln Cys 65 70 75 80 Ala His Phe Pro Asn Val Glu Leu Ile Glu Glu Phe His Asp Pro Arg 85 90 95 Leu Ile Phe Asp Val Ser Gly Tyr Leu Ala Val Asp His Ala Ser Lys 100 105 110 Gln Ile Tyr Leu Val Ile Arg Gly Thr His Ser Leu Glu Asp Val Ile 115 120 125 Thr Asp Ile Arg Ile Met Gln Ala Pro Leu Thr Asn Phe Asp Leu Ala 130 135 140 Ala Asn Ile Ser Ser Thr Ala Thr Cys Asp Asp Cys Leu Val His Asn 145 150 155 160 Gly Phe Ile Gln Ser Tyr Asn Asn Thr Tyr Asn Gln Ile Gly Pro Lys 165 170 175 Leu Asp Ser Val Ile Glu Gln Tyr Pro Asp Tyr Gln Ile Ala Val Thr 180 185 190 Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Ala Ala Leu Leu Phe Gly Ile Asn Leu 195 200 205 Lys Val Asn Gly His Asp Pro Leu Val Val Thr Leu Gly Gln Pro Ile 210 215 220 Val Gly Asn Ala Gly Phe Ala Asn Trp Val Asp Lys Leu Phe Phe Gly 225 230 235 240 Gln Glu Asn Pro Asp Val Ser Lys Val Ser Lys Asp Arg Lys Leu Tyr 245 250 255 Arg Ile Thr His Arg Gly Asp Ile Val Pro Gln Val Pro Phe Trp Asp 260 265 270 Gly Tyr Gln His Cys Ser Gly Glu Val Phe Ile Asp Trp Pro Leu Ile 275 280 285 His Pro Pro Leu Ser Asn Val Val Met Cys Gln Gly Gln Ser Asn Lys 290 295 300 Gln Cys Ser Ala Gly Asn Thr Leu Leu Gln Gln Val Asn Val Ile Gly 305 310 315 320 Asn His Leu Gln Tyr Phe Val Thr Glu Gly Val Cys Gly Ile 325 330 <210> 2 <211> 1005 <212> DNA <213> Yarrowia lipolytica <400> 2 atgaagcttt ccaccatcct cttcacagcc tgcgctaccc tggctgccgc cctcccttcc 60 cccatcactc cttctgaggc cgcagttctc cagaagcgag tgtacacctc taccgagacc 120 tctcacattg 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tctacttccc cagcaccggc 180 gaggttgctc tcagaaagtc tcccgagcag ctcgaaaccg tcaacgctct gctcaaggcc 240 cgagactttg ttgaaatctg cgatttccat ggctaccagg ccgaagaaca tgtggttcag 300 accaaggatg gatttctgct aggagtgcac cgaatcctgc ccaagaaccc tgctgctctg 360 ctcaccgacg accccgaagt cctcagcacc cccgcccctc ccccggcctt cctggctgga 420 aacctcgaag tctactcttc gccccccaaa agaggctcca agcgaagtgt gtcctccaaa 480 ctgatcaccc gacccgttgt ctaccttcac catggtctgc tgatgaactc ggaggtctgg 540 gttgtgaaca cggacgccaa aaagtcgatt gcttttgctc tggccgacct gggatttgac 600 gtctggctcg gaaacaacag aggcaacaag tactcgcgaa aacacatgaa atacaacccc 660 gagtcgcgcg agttctggga tttctgtctc gacgactttg cgctgtttga tatccccgat 720 tccattgact atattctgtc tgtgaccaaa cagaagtctc tgtcttacat tggattctcc 780 cagggttcag cccaggcatt tgcatctctg gctatccgac ctcctctcaa cgataaggtc 840 aacctattca ttgccgttgc ccccgccatg tctcctcctg gcctgagatc caagattgtc 900 aactccctca tgagagcttc tccacagctg ctgttcctct gctttggtcg aagagctatc 960 ttgtcatcct ctcccttctg ggagtcggtt ctggacgcaa aactgtatgc tcgaatcatc 1020 gatgctgcct gcagaatgct gtttgactgg tacggagaga acatcacctg gccccagaag 1080 attgcagcct accaccacct gtactcgtac acctctgtca agtccgtcgt gcattggttc 1140 cagatcatcc gagcagcctc cttccacatg tttgaggatg tcatcaactc tcccctggac 1200 cctcatctgt gcaagtactc cactgtcacc cgatacccca ccgagaacat tcggacaccc 1260 attgctctga tctacggcaa gaccgactcg ctggtggaca ttgaccagat gctgtctact 1320 ctaccctcat ccactattgc atttggagtc cccaaacatg agcatctcga tcttctgtgg 1380 ggagacgaag ccgacactct ggttatcccc aagattgtcg ctctgctcga ttattacaca 1440 cctgtgccca gaagtaacaa gagcagcagt gaccatatca gcgagcgtct atttgagcct 1500 gctaactcca aggtctcggg tctgggactc agccaggacc tcaagtcgcc attgtctttg 1560 aaaaagagat ctctctccaa ctcctcatcg atccaggact ctcataaggt cggaggagac 1620 acagactcgg ttctaagtct ccgaaacctc actcccaagg ggtacgctct tggaagtgcc 1680 aagccagtga gtggcactct caacccttga 1710 <210> 11 <211> 365 <212> PRT <213> Yarrowia lipolytica <400> 11 Met Leu Ser Leu Ile Ala Ile Phe Leu Leu Val Thr Thr Ala Leu Ala 1 5 10 15 Gln Thr Ala Asn Ile Thr Gln 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cctattgtgt caaggccccc ggtccatacg aactggagac 300 ggacttcacc tgtggaagat cttgcggtca ctttcccaac gtgacgttgg aacaccagtt 360 tggaggcgac tttttctcca cgtccataac cggctttctg gcccacgatc acactaagaa 420 agagaaatac attgttttcc gaggcacctt ttctctggca gacgccatca ccgacgcctt 480 gtttctccag gagccctacc tggccgatct gccgcctctg aacaccacca acatcaactc 540 cactagcaat tcggcccgag tcgactgccc cgattgtgag attcatgacg gcttccaaaa 600 ggcataccga gagaccatgg tgaacatgca gggccacctg gtggcctttc ttagaaacaa 660 cacagactac aagctgatag tcaccggcca ttctctggga gccgccactg ctctgctcat 720 gggcatcaac ctgaagaatc tcggctttga ccctatggtg atcacgtttg gacagcctcg 780 agtgggaaac aaggcgtttg cggactacgc cgactcgctc tttttcaaac agggagataa 840 cggactgaat atcaaccctg aaagacgtct ttaccgagtc actcattgga atgacatcgt 900 ggtgggagtg cccttctggt ccggttatac ccatactctg ggagaagtgt acatcagcta 960 cccagacgga gtcaacgccc ccatcgaata cgtcaatgcg tgcgctggac cagacaacga 1020 ccagtgccac tacgggtcct tcgacctgct ggctcgagtc aacattctca aaaaccactg 1080 tgcctatctc aactggatct tctactgcgc 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LmATF-S480Q_G409A_V407I_H69A_I484L, and FfRDH <400> 17 gcggagccta ggccggccag cgtggcgcgt ggccatattg gccagcagct tactacagct 60 cagccaaagt ggatcatgat ggacggaaat atcggactgg aggccaaaaa ggaggtgctc 120 aaatacgcac gggacaagtc tgcacaggtg gcattcgaac ccacgtctgt ccccaaagcc 180 gctgctcttt ccgagctcaa tctgcccgtt taccccaaca actccattgc cttagccacc 240 cccaacactg cagagctcga ggccatgttc gaggcattcc acgagaaggg ccgatttgac 300 gttgacgact ggtttccagt catagacggt cttgctctcg gagctgactt tagaaacgga 360 gccaccatgt tgtcgcacca acatcgtgga ctcaaagcta ttctcgaaca aggaactctg 420 gcccaggcaa tccacatgct accatacatc ccaactttga tcatcaaggg cggagccaac 480 ggcgtcgtcg tcttccaact cattgatgat atcgagtctg ccattcattc acagcgttct 540 gcttccaata aaacgcctgg cctgttccag aagggcaacg ctgcgagtgg aaacaccaag 600 gtcggcgtct acatgcagta ctttgagccc gaagaagtgg gcagtcagtc gattgtaagc 660 gtgactggag ctggagacac tctgtttgga accctggcca tggagattgt caaggacgag 720 tcctggttga acgatatggg agacaagaag agtgcagttg tttctcgagc catgaacaat 780 gctgtgaaga ctattcagag taaggacgct gtctgcaaga gcatccttta agtgatttgc 840 catgctttct cttcttccac gatgtaaata cttattttac acactactgt gcagtagcaa 900 atacagaaca agagttgtcg cctattgaca gtacagtacg agtagtgtat gtacagtagt 960 tatacaatat ctatgtgaaa ttcgtcggca gctttcggct gatgaactac gagttcttcg 1020 taataaatca tcaacgtaat aagcttggta ccagagacgg gttggcggcg tatttgtgtc 1080 ccaaaaaaca gccccaattg ccccaattga ccccaaattg acccagtagc gggcccaacc 1140 ccggcgagag cccccttcac cccacatatc aaacctcccc cggttcccac acttgccgtt 1200 aagggcgtag ggtactgcag tctggaatct acgcttgttc agactttgta ctagtttctt 1260 tgtctggcca tccgggtaac ccatgccgga cgcaaaatag actactgaaa atttttttgc 1320 tttgtggttg ggactttagc caagggtata aaagaccacc gtccccgaat tacctttcct 1380 cttcttttct ctctctcctt gtcaactcac acccgaaatc gttaagcatt tccttctgag 1440 tataagaatc attcgctagc cacaaaaatg ggtgatctcg atgcccgagg aacctctgct 1500 caccccgagc tctctgagcg accttctatt atgccttcta tgtctgatat tcaggaccct 1560 tctggtgatg acaaggctac tccccgagga tctgctgctg gtctgcccca gcttgagctt 1620 gctggacacg cccgacgact tggccacctt gagaacttct ttgctgtcca ggctcgacag 1680 cagatttact cttcttttgc tgttttttgt gagtttgaca ctgcttgttc tctcgctcag 1740 cttgcttctg ctgtgcgaaa cgtttgtctt tctaaccccc ttctccttca cactgttgag 1800 cctaagcacc ctgacatcgc tggattctac cactctgacg agtacctttc ccgaccttgg 1860 cctcagcacg attacatgcg agttcttcga gaggttcacg tcgctgacgt tgttatgaac 1920 ggacagaagg agcacgctca cgttgttcga gatgctgttg acgtttttca ggctcacgga 1980 aaccaggtta cttctgagct ccttgagctt atgactcaga ttgagattcc tcacgcttct 2040 cagactcgac cctcttggcg acttctctgt tttccccacg gagaggctaa ccgatggcga 2100 acctttgctt ttgtttctaa ccactgttct tctgatggtc tttctggtct taacttcttt 2160 cgagatctcc agaaggagct tgctcacggc cccacctctg gtgctcctgg tgcccccgga 2220 gcttccggag ttattttcga ttacgctcag gacgctgcta ccctgcccaa gctgccccct 2280 cccattgatc agaagctcga ttaccgacct tctaagaagg ctcttctcgg ccttctcgct 2340 ggcaagttcg ttcgagagaa gctcggttac gtttctgctg ctcctcccac tacccctacc 2400 tctgaccttg ctcaccctga gggtcaccag tactactgtt accttgttaa cgttcccact 2460 tcttctgttg cccacattaa gactcaggtg cgagagaacg ttcctcacaa gtgtactctc 2520 actccctttc tccaggcttg ttggcttgtt tctctgttca agtacggtcg agttttttct 2580 ggttcttggc ttgagcgata caccgatgtt cttgttgcta tgaacactcg acagcttctc 2640 cccgaggacc ttgagcttca gcgacagtac cgatacggtt ctaacattgg agctgttcga 2700 tacaactacc ctattgctcc ccttgacgtt cgagataacg atcagaagtt ctggtccctt 2760 gttgagtctt accgacttgc cctttctgat gcccgagata agaacgatta cctttacgct 2820 cttggtgctc ttatgctccc tgagatttac gagaagaaga acgttgatgc tgttgttaac 2880 gataccattc ttaaccagcg acgacaggga acccttcttt ctaacgttgg ttacgttcga 2940 gatgagcagc ccactgcttt tgctattaag aaccacgttt tttctcaggg agttggagct 3000 aaccgaaacg cttttgttct taacatttgt gctaccgatc agggtggtct taacatcgct 3060 atttctattg ctaagggaac ccttgcttct cgacaggagg gacaggagct ttgtgatatt 3120 tttaagtcta ctctccttcg attttaaacg cgtctatccg aagatcaaga gcgaagcaag 3180 ttgtaagtcc aggacatgtt tcccgcccac gcgagtgatt tataacacct ctcttttttg 3240 acacccgctc gccttgaaat tcatgtcaca taaattatag tcaacgacgt ttgaataact 3300 tgtcttgtag ttcgatgatg atcatatgat tacattaata gtaattactg tatctgtacc 3360 tgctgtggac cacgcacggc ggaacgtacc gtacaaatat tttcttgctc acatgactct 3420 ctctcggccg cgcacgccgg tggcaaattg ctcttgcatt ggctctgtct ctagacgtcc 3480 aaaccgtcca aagtggcagg gtgacgtgat gcgacgcacg aaggagatgg cccggtggcg 3540 aggaaccgga cacggcgagc cggcgggaaa aaaggcggaa aacgaaaagc gaagggcaca 3600 atctgacggt gcggctgcca ccaacccaag gaggctattt tgggtcgctt tccatttcac 3660 attcgccctc aatggccact ttgcggtggt gaacatggtt tctgaaacaa ccccccagaa 3720 ttagagtata ttgatgtgtt taagattggg ttgctatttg gccattgtgg gggagggtag 3780 cgacgtggag gacattccag ggcgaattga gcctagaaag tggtaccatt ccaaccgtct 3840 cagtcgtccg aattgatcgc tataactatc acctctctca catgtctact tccccaacca 3900 acatccccaa cctcccccac actaaagttc acgccaataa tgtaggcact ctttctgggt 3960 gtgggacagc agagcaatac ggaggggaga ttacacaacg agccacaatt ggggagatgg 4020 tagccatctc actcgacccg tcgacttttg gcaacgctca attacccacc aaatttgggc 4080 tggagttgag gggaccgtgt tccagcgctg taggaccagc aacacacacg gtatcaacag 4140 caaccaacgc ccccgctaat gcacccagta ctgcgcaggt gtgggccagg tgcgttccag 4200 atgcgagttg gcgaacccta agccgacagt gtactttttg ggacgggcag tagcaatcgt 4260 gggcgtagac cccggtgtat ataaaggggt ggagaggacg gattattagc accaacacac 4320 acacttatac tacatgctag ccacaaaaat gctctctttc ttctggcgaa acggtatcga 4380 gactcccgag cccctcaagg ctgacgtttc cggctctatc cctccctggc ttcagggaac 4440 ccttctccga aacggtcctg gtctgttctc cgttggcaac acttcctaca agcactggtt 4500 cgatggtatg gctctcattc actccttcac ctttaaggat ggtgaggttt tttaccgatc 4560 taagtacctg aagtctgaga cttacaagaa gaacatcgct gccgaccgaa tcgttgtgtc 4620 tgagttcgga accatggtgt accccgatcc ctgcaagaac attttctccc gagccttctc 4680 ttacatgatg aacgccattc ctgactttac cgataacaac ctcattaaca tcattaagta 4740 cggtgaggat tactacgcct cctctgaggt caactacatc aaccagattg accccctgac 4800 ccttgagact ctcggacgaa ctaactaccg aaaccacatt gccatcaacc ttgccactgc 4860 tcaccctcac tacgacgagg agggtaacac ttacaacatg ggcactgcta ttatgaacct 4920 cggtcgaccc aagtacgtga ttttcaaggt gcccgccaac acctctgata aggagaacaa 4980 gaagcctgcc ctctctgagg tggagcaggt ttgctccatt cccatccgac cctcccttta 5040 cccttcttac ttccactctt ttggcatgac tgagaactac atcatcttcg ttgagcaggc 5100 cttcaagctg gacatcgtca agctggctac tgcttacttc cgagatatta actggggatc 5160 ttgccttaag ttcgaccagg atgacattaa cgtgttccac ctggtcaaca agaagactgg 5220 taaggctgtg tccgtgaagt actacactga cccctttgtt accttccacc acatcaacgc 5280 ttacgaggac gatggccacg tcgtcttcga tctcattact tacaaggact ctaagctgta 5340 cgatatgttc tacattcaga acatgaagca ggacgtcaag cgatttattg agactaacaa 5400 ggacttcgct cagcccgtgt gccagcgatt tgtccttccc gtcaacgttg ataaggagac 5460 tcctcaggac atcaaccttg tcaagctgca ggacaccact gccactgctg tcctgaagga 5520 ggacggctct gtctactgca cccctgacat catttttaag ggtcttgagc tccctgctat 5580 caactacaag tttaactcta agaagaaccg atacttctac ggcacccgag tggagtggtc 5640 cccttaccct aacaaggtcg ctaaggtgga cgttgttact cgaacccaca agatttggac 5700 tgaggaggag tgttaccctt ctgagcctgt ctttattgcc tcccctgacg ccgttgatga 5760 ggatgacggt gtgattcttt cttctgtggt ttctttcaac ccccagcgac cccctttcct 5820 ggttgtcctc gatgctaagt ccttcaagga gattgctcga gctaccatcg atgcctctat 5880 tcacatggac cttcacggcc ttttcatcca cgacaagtct acctaagttt tttgatcaat 5940 gatccaatgg ctttcacata cccccccacg cctataatta aaacacagag aaatataatc 6000 taacttaata aatattacgg agaatctttc gagtgttcag cagaaatata gccattgtaa 6060 caaaagccgg ctatcgaccg ctttatcgaa gaatatttcc cgccccccag tggccaaacg 6120 atatcggtca gaaggggcag ctctaaacga agaactgcgg tcaggtgaca caactttttc 6180 catctcaggg tgtgtcgcgt gtgcttcatc caaactttag ttggggttcg ggttcgcgcg 6240 agatgatcac gtgccctgat ttggtgtcgt cccccgtcgc gctgcgcacg tgatttattt 6300 atttccggtg gctgctgtct acgcggggcc ttctctgccc ttctgtttca accttcgggc 6360 ggttctcgta accagcagta gcaatccatt tcgaaactca aagagctaaa aacgttaaac 6420 ctcagcagtc gctcgacgaa tgggctgcgg ttgggaagcc cacgaggcct atagccagag 6480 cctcgagttg acaggagccc agacgccttt tccaacggca acttttatat aaaatggcaa 6540 tgtattcatg caattgcggc cgtgtcaggt tggagacact ggaccacact ctccattgct 6600 tcctgaggag atggatcatt gctagtgcat ctacgcgcag caatcccgca agctcgacaa 6660 ccgtagatgg gctttggtgg gccaatcaat tacgcaaccc gcacgttaaa ttgtatgagg 6720 aaggaaggcc acggtacaaa gtgggtggtc ttcacccagt ggttgttggt ggcgtcatgc 6780 agaccatgca ttggggatag cacagggttg gggtgtcttg tggactcaat gggtgaaagg 6840 agatggaaaa gggcggtgaa aagtggtaga atcgaaatcc ctgacgtcaa tttataaagt 6900 aaaatgcgtt tctgccattt tgctcccctc cttctttcgc aatcgcctcc ccaaaagttg 6960 tcgtggcagt acacatgctt gcatacaatg aagctaatcc ggcttgctca gtagttgcta 7020 tatccaggca tggtgtgaaa cccctcaaag tatatatagg agcggtgagc cccagtctgg 7080 ggtcttttct ctccatctca aaactacttt ctcacatgct agccacaaaa atgaccacta 7140 agtacacttc cgttcacgag tctcccaacg gccctggtga cgctcgaccc accgcttccc 7200 agattatcga cgattacaac cttgagggag agctttctgg caagactgtt ctcgtcaccg 7260 gctgttcctc tggtattggt gttgagactg cccgagctat ttaccgaact ggtgccaccc 7320 tttacctcac tgcccgagat gtcgataagg ccaagaccgt tcttcccgac cttgttgaca 7380 cttcccgagt ccactttctc caccttgacc ttaactctct ggagtctgtt cgaggttttg 7440 ctgagaactt caagtctaag tccactcagc ttcacattct catcgagaac gctggcgtga 7500 tggcctgtcc cgagggccga accgtcgatg gttttgagac tcagtttggt atcaaccacc 7560 ttgctcactt tctcctcttt tacctcctca aggataccct tctcaactct tctacccccg 7620 ctttcaactc ccgagttgtc atcctctctt cttgtgctca ccaggctggt tccgttcacc 7680 ttaacaacct gtctcttgag ggtggatacg agccttggaa gtcttacggc cagtccaaga 7740 ctgccaacct ttggactgcc cgagagatcg agaagcgatt tggtgcttcc ggtatccact 7800 cttgggctgt tcaccccggt tccatcgcta ctgagcttca gcgacacgtt tccgacgagc 7860 ttaagcagaa gtgggctgac gataaggagg gtgccaagct gtggaagtcc accgagcagg 7920 gtgccgccac cactgtcctt gctgctgttt cccctgagct tgagggtaag ggcggtcttt 7980 accttgagga tacccaggtt gccaagcccc ctgcccgagg aatgtttggt gttgctgact 8040 gggcttacga tgaggatggc ccctctaagc tctgggccaa gtctcttgag ctccttaagc 8100 tccagtaaag gttagactat ggatatgtaa tttaactgtg tatatagaga gcgtgcaagt 8160 atggagcgct tgttcagctt gtatgatggt cagacgacct gtctgatcga gtatgtatga 8220 tactgcacaa cctgtgtatc cgcatgatct gtccaatggg gcatgttgtt gtgtttctcg 8280 atacggagat gctgggtaca agtagctaat acgattgaac tacttatact tatatgaggc 8340 ttgaagaaag ctgacttgtg tatgacttat tctcaactac atccccagtc acaataccac 8400 cactgcacta ccactacaca ctagtggtgt gttctgtgga gcattctcac ttttggtaaa 8460 cgacattgct tcaagtgcag cggaatcaaa aagtataaag tgggcagcga gtatacctgt 8520 acagactgta ggcgataact caatccaatt accccccaca acatgactgg ccaaactgat 8580 ctcaagactt tattgaaatc agcaacaccg attctcaatg aaggcacata cttcttctgc 8640 aacattcact tgacgcctaa agttggtgag aaatggaccg acaagacata ttctgctatc 8700 cacggactgt tgcctgtgtc ggtggctaca atacgtgagt cagaagggct gacggtggtg 8760 gttcccaagg aaaaggtcga cgagtatctg tctgactcgt cattgccgcc tttggagtac 8820 gactccaact atgagtgtgc ttggatcact ttgacgatac attcttcgtt ggaggctgtg 8880 ggtctgacag ctgcgttttc ggcgcggttg gccgacaaca atatcagctg caacgtcatt 8940 gctggctttc atcatgatca catttttgtc ggcaaaggcg acgcccagag agccattgac 9000 gttctttcta atttggaccg atagccgtat agtccagtct atctataagt tcaactaact 9060 cgtaactatt accataacat atacttcact gccccagata aggttccgat aaaaagttct 9120 gcagactaaa tttatttcag tctcctcttc accaccaaaa tgccctccta cgaagctcga 9180 gctaacgtcc acaagtccgc ctttgccgct cgagtgctca agctcgtggc agccaagaaa 9240 accaacctgt gtgcttctct ggatgttacc accaccaagg agctcattga gcttgccgat 9300 aaggtcggac cttatgtgtg catgatcaag acccatatcg acatcattga cgacttcacc 9360 tacgccggca ctgtgctccc cctcaaggaa cttgctctta agcacggttt cttcctgttc 9420 gaggacagaa agttcgcaga tattggcaac actgtcaagc accagtacaa gaacggtgtc 9480 taccgaatcg ccgagtggtc cgatatcacc aacgcccacg gtgtacccgg aaccggaatc 9540 attgctggcc tgcgagctgg tgccgaggaa actgtctctg aacagaagaa ggaggacgtc 9600 tctgactacg agaactccca gtacaaggag ttcctggtcc cctctcccaa cgagaagctg 9660 gccagaggtc tgctcatgct ggccgagctg tcttgcaagg gctctctggc cactggcgag 9720 tactccaagc agaccattga gcttgcccga tccgaccccg agtttgtggt tggcttcatt 9780 gcccagaacc gacctaaggg cgactctgag gactggctta ttctgacccc cggggtgggt 9840 cttgacgaca agggagacgc tctcggacag cagtaccgaa ctgttgagga tgtcatgtct 9900 accggaacgg atatcataat tgtcggccga ggtctgtacg gccagaaccg agatcctatt 9960 gaggaggcca agcgatacca gaaggctggc tgggaggctt accagaagat taactgttag 10020 aggttagact atggatatgt aatttaactg tgtatataga gagcgtgcaa gtatggagcg 10080 cttgttcagc ttgtatgatg gtcagacgac ctgtctgatc gagtatgtat gatactgcac 10140 aacctgtgta tccgcatgat ctgtccaatg gggcatgttg ttgtgtttct cgatacggag 10200 atgctgggta caagtagcta atacgattga actacttata cttatatgag gcttgaagaa 10260 agctgacttg tgtatgactt attctcaact acatccccag tcacaatacc accactgcac 10320 taccactaca cctcgagcat gcacactatt atcacattac tacatccaaa cccctacagg 10380 gggaggagct ctccaatcaa atatgtacat taactatctc tcgtaaatca ttgttataag 10440 accgtccgtg actgtctaaa tcggttcatt cgttgtaaca aatcagtgta acaactcgtg 10500 gtacgcccgg tttgcttcgc tcacgctccc ctagattttc cgtctaggac acaacaagcc 10560 ctggtggatg acgttcaacg ccttcagcgc gtctttttcc tcaataacac acgagatgtt 10620 aatttcgttg gctccctgag aaatcatctc aatgttaata cctgcctggg ccagagtaga 10680 gaagaacatg cctgcacatc cgaccatggc cttcattctc gttccgatca gcgacacaat 10740 ggtcatgcct cgcttcacat ctactgtgcc gtactttcgc agctcctcca cagcctgctt 10800 gaggttggag tcgggagcat ggaaggccat cgacacatgg acctcagaag tggagatgag 10860 atcgacgaca agtttctgct ggtcgagagt agcaaagatc ttgttcaaga agccatgact 10920 cttggttcgc ttattcgaat gaacgttgag aacggtgata ttcgatttgg tagtgacagc 10980 tgtaggcttc ttctcgtcat ctacaggagc agacacctgg ggagtgaatg agccagagga 11040 cagagaagtt agcgagtcgg tggaagaagc cagatcctgg acattgtttt tcgttttcag 11100 gttgcccgag ccgtcagcag atgggtagat gatagttcct cctcccaggg ggttttccac 11160 gtttttgatt cggataggaa tatgggcctt aatgacctgc tccatggtga aggggtggat 11220 gacttcagat ccgtagtagg tcaactcagc ggcctcctcg ggggtaatga tgggcagcag 11280 acgggcagtg gacacctttc tgggatcggc agtgaagaca ccatcgactt ctttccagat 11340 ctgaagctcc ttggcgtcca gacccacagc caccagagca gcacacagat cggtgtatcc 11400 tcgtccgatc tggcttagga ggcctccctt gacggggcca aagaaaccgg tcaacacggg 11460 caccatgttt cccttgacag gagcagagtc cgtgttagga gagccgggaa gagtgatgat 11520 ctcgcccaga acacgtccga ggtccgaata gaacttggga tcttcggcat tggtggtggt 11580 aactgcgtga gacaggtcaa agtaccgtgc gttaacacca gcgtcccgca taactgcagt 11640 catgtacatg caactgagct tctccccaat ggccatgatg gagtcgagtg ttcgggggga 11700 gatctcagaa atgatttcag cagcagccag gattcgcaac agctggtcgc actcgccgtt 11760 gatgtcggca ttgaggtttt cgagcagttc ggggttcttg acgtcacgct tagcagctgc 11820 aagatggtct tctcggatag actcaatgat ggggttgtag gcgtctgatc cgagaagagc 11880 agagtcagca gcagcaataa gacgggtggt ggttccctcg gccttggtgg cctctagatg 11940 gcctccttgg ccccattcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt 12000 ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg 12060 ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg 12120 gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag 12180 gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga 12240 cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct 12300 ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc 12360 tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg 12420 gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc 12480 tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca 12540 ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag 12600 ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct 12660 ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc 12720 accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 12780 tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca 12840 cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat 12900 taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac 12960 caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt 13020 gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt 13080 gctgcaatga taccgcgaga gccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag 13140 ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct 13200 attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt 13260 gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc 13320 tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt 13380 agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg 13440 gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg 13500 actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct 13560 tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc 13620 attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt 13680 tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt 13740 tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg 13800 aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat 13860 tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg 13920 cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta 13980 acctataaaa ataggcgtat cacgag 14006 <210> 18 <211> 559 <212> PRT <213> Lachancea mirantina <400> 18 Met Gly Asp Leu Asp Ala Arg Gly Thr Ser Ala His Pro Glu Leu Ser 1 5 10 15 Glu Arg Pro Ser Ile Met Pro Ser Met Ser Asp Ile Gln Asp Pro Ser 20 25 30 Gly Asp Asp Lys Ala Thr Pro Arg Gly Ser Ala Ala Gly Leu Pro Gln 35 40 45 Leu Glu Leu Ala Gly His Ala Arg Arg Leu Gly His Leu Glu Asn Phe 50 55 60 Phe Ala Val Gln His Arg Gln Gln Ile Tyr Ser Ser Phe Ala Val Phe 65 70 75 80 Cys Glu Phe Asp Thr Ala Cys Ser Leu Ala Gln Leu Ala Ser Ala Val 85 90 95 Arg Asn Val Cys Leu Ser Asn Pro Leu Leu Leu His Thr Val Glu Pro 100 105 110 Lys His Pro Asp Ile Ala Gly Phe Tyr His Ser Asp Glu Tyr Leu Ser 115 120 125 Arg Pro Trp Pro Gln His Asp Tyr Met Arg Val Leu Arg Glu Val His 130 135 140 Val Ala Asp Val Val Met Asn Gly Gln Lys Glu His Ala His Val Val 145 150 155 160 Arg Asp Ala Val Asp Val Phe Gln Ala His Gly Asn Gln Val Thr Ser 165 170 175 Glu Leu Leu Glu Leu Met Thr Gln Ile Glu Ile Pro His Ala Ser Gln 180 185 190 Thr Arg Pro Ser Trp Arg Leu Leu Cys Phe Pro His Gly Glu Ala Asn 195 200 205 Arg Trp Arg Thr Phe Ala Phe Val Ser Asn His Cys Ser Ser Asp Gly 210 215 220 Leu Ser Gly Leu Asn Phe Phe Arg Asp Leu Gln Lys Glu Leu Ala His 225 230 235 240 Gly Pro Thr Ser Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ala Ser Gly Val Ile 245 250 255 Phe Asp Tyr Ala Gln Asp Ala Ala Thr Leu Pro Lys Leu Pro Pro Pro 260 265 270 Ile Asp Gln Lys Leu Asp Tyr Arg Pro Ser Lys Lys Ala Leu Leu Gly 275 280 285 Leu Leu Ala Gly Lys Phe Val Arg Glu Lys Leu Gly Tyr Val Ser Ala 290 295 300 Ala Pro Pro Thr Thr Pro Thr Ser Asp Leu Ala His Pro Glu Gly His 305 310 315 320 Gln Tyr Tyr Cys Tyr Leu Val Asn Val Pro Thr Ser Ser Val Ala His 325 330 335 Ile Lys Thr Gln Val Arg Glu Asn Val Pro His Lys Cys Thr Leu Thr 340 345 350 Pro Phe Leu Gln Ala Cys Trp Leu Val Ser Leu Phe Lys Tyr Gly Arg 355 360 365 Val Phe Ser Gly Ser Trp Leu Glu Arg Tyr Thr Asp Val Leu Val Ala 370 375 380 Met Asn Thr Arg Gln Leu Leu Pro Glu Asp Leu Glu Leu Gln Arg Gln 385 390 395 400 Tyr Arg Tyr Gly Ser Asn Val Gly Gly Val Arg Tyr Asn Tyr Pro Ile 405 410 415 Ala Pro Leu Asp Val Arg Asp Asn Asp Gln Lys Phe Trp Ser Leu Val 420 425 430 Glu Ser Tyr Arg Leu Ala Leu Ser Asp Ala Arg Asp Lys Asn Asp Tyr 435 440 445 Leu Tyr Ala Leu Gly Ala Leu Met Leu Pro Glu Ile Tyr Glu Lys Lys 450 455 460 Asn Val Asp Ala Val Val Asn Asp Thr Ile Leu Asn Gln Arg Arg Ser 465 470 475 480 Gly Thr Leu Ile Ser Asn Val Gly Tyr Val Arg Asp Glu Gln Pro Thr 485 490 495 Ala Phe Ala Ile Lys Asn His Val Phe Ser Gln Gly Val Gly Ala Asn 500 505 510 Arg Asn Ala Phe Val Leu Asn Ile Cys Ala Thr Asp Gln Gly Gly Leu 515 520 525 Asn Ile Ala Ile Ser Ile Ala Lys Gly Thr Leu Ala Ser Arg Gln Glu 530 535 540 Gly Gln Glu Leu Cys Asp Ile Phe Lys Ser Thr Leu Leu Arg Phe 545 550 555

Claims (10)

1. 진균(fungal) 숙주 세포, 특히 유지성(oleaginous) 효모 세포, 바람직하게는 야로위아(Yarrowia)에서 레티닐 아세테이트를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 에탄올의 존재 하에서의 상기 숙주 세포의 발효를 포함하는, 방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 발효가 유가식(fed-batch) 발효인, 방법.
3. 제2항에 있어서,
   배취 단계(batch phase) 동안 배양 배지에 약 5% 이하 농도(v/v)의 에탄올을 첨가하는 것을 포함하는, 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 방법은 트라이글리세리드(triglyceride), 바람직하게는 식물성 오일의 부재 하의 상기 숙주 세포의 발효를 포함하는, 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
   지방산 레티닐 에스테르(FARE)를 포함하는 부산물의 형성이 감소되거나 제거되고, 바람직하게는, 에탄올의 부재 하의 숙주 세포의 발효를 포함하는 방법과 비교시 총 레티노이드(retinoid)를 기준으로 적어도 약 50% 감소되는, 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
   총 레티노이드를 기준으로 한 레티닐 아세테이트의 백분율이, 에탄올의 부재 하의 숙주 세포의 발효를 포함하는 방법과 비교시 증가하고, 바람직하게는 적어도 약 25% 증가하는, 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
   총 레티노이드의 생산이 에탄올의 부재 하의 숙주 세포의 발효를 포함하는 방법과 비교시 증가하고, 바람직하게는 적어도 약 30% 증가하는, 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 숙주 세포가 이종(heterologous) 유전자, 바람직하게는 레티놀에서 레티닐 아세테이트로의 전환을 촉매하는 아세틸화 효소, 더욱 바람직하게는 진균 효소, 가장 바람직하게는 라찬세아 미란티나(Lachancea mirantina)에서 유래된 진균 효소를 코딩하는 유전자로 형질전환되고(transformed) 이를 발현하는, 방법.
9. 제8항에 있어서,
   상기 아세틸화 효소가, 서열번호 18에 대해 적어도 약 20%, 예를 들어 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 97, 98, 99% 또는 최대 100%의 동일성(identity)으로 서열 내의 하나 이상의 아미노산 치환(들)을 포함하며, 여기서 상기 하나 이상의 아미노산 치환(들)은, 서열번호 18에 따른 폴리펩타이드 내의 위치 68, 69, 72, 73, 171, 174, 176, 178, 291, 292, 294, 301, 307, 308, 311, 312, 320, 322, 334, 362, 405, 407, 409, 480, 483, 484, 490, 492, 520, 521, 522, 524, 525, 526 및 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기(들)에 상응하는 위치(들)에 위치되는, 방법.
10. 레티놀의 FARE로의 효소적 전환(enzymatic conversion)을 감소시키는 방법으로서, 바람직하게는 총 레티노이드를 기준으로 한 FARE의 백분율이 25% 미만이며, 상기 방법은 에탄올의 존재 하에서의 레티닐 아세테이트 생산 숙주 세포의 발효를 포함하는, 방법.