KR20240019301A - 트리스링커-접합된 이량체 표지 전구체 및 이로부터 유도되는 방사성 추적자 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 구조 I을 갖는 방사성 추적자 표지 전구체로서, 상기 구조는 제1 표적화 벡터(TV1), 제2 표적화 벡터(TV2), 방사성 동위 원소의 착체화 또는 공유 결합을 위한 표지 그룹(MG), 제1 스페이서(S1), 제2 스페이서(S2), 제3 스페이서(S3) 및 트리스 링커(TL)를 포함하는, 방사성 추적자 표지 전구체에 관한 것이다.
[구조 I]
[구조 I]
Description
본 발명은, 암의 진단 및 치료를 위한, 이량체 표지 전구체 및 방사성 동위 원소와의 착체화에 의해 상기 이량체 표지 전구체로부터 유도되는 방사성 추적자에 관한 것이다.
표지 전구체는 다음과 같은 구조를 갖는다:
상기 구조에서, TV1은 제1 표적화 벡터이고, TV2는 제2 표적화 벡터이고, MG는 방사성 동위 원소의 착체화 또는 공유 결합을 위한 표지 그룹이고, S1은 제1 스페이서이고, S2는 제2 스페이서이고, S3은 제3 스페이서이고, TL은 트리스 링커이다.
본 발명의 표지 전구체 및 방사성 추적자는 핵의학적 진단, 특히 양전자 방출 단층 촬영(PET) 및 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영(SPECT), 및 암종 및 다양한 암 유형의 전이의 방사성 핵종 요법/내시경 요법을 영상화하기 위한 것이다.
핵의학 진단에서는 방사성 동위 원소, 예를 들면, 갈륨-68(68Ga), 테크네튬-99m(99mTc) 또는 스칸듐-44(44Sc)의 도움으로 종양 세포 또는 전이를 표지하고 영상화한다. 상기 유형의 금속 방사성 핵종의 경우, 착체화 킬레이터가 사용된다.
비금속 방사성 동위 원소, 예를 들면, 불소-18(18F), 요오드-123(123I), 요오드-131(131I) 및 아스타틴-211(211At)은 공유 결합되어 있으며, 즉, 킬레이터가 필요하지 않다.
진단과 비교하여, 핵의학 요법에서는 종양 조직을 파괴하기 위해 더 높은 방사선량이 사용된다. 이를 위해, 예를 들면, 베타-마이너스-방출 방사성 동위 원소, 예를 들면, 루테튬-177(177Lu), 이트륨-90(90Y) 및 요오드-131(131I) 또는 알파-방출체, 예를 들면, 악티늄-225(225Ac)가 사용된다. 알파-마이너스선 및 베타-마이너스선은 조직 내에서 짧은 범위를 갖는다. 짧은 범위에서는 적은 방사선량으로 종양 및 전이에 국부적으로 방사선을 조사할 수 있고, 주변의 건강한 조직에 손상을 가할 수 있다.
지난 몇 년 동안, 전문가들 사이에서는 치료 진단학(theranostics)으로 나타내는 진단과 치료의 결합이 점점 더 중요해지고 있다. 이러한 맥락에서, 동일한 표지 전구체가 진단용 및 치료용 둘 다로 사용될 수 있다. 여기서, 표지 전구체는 상이한 방사성 동위 원소, 예를 들면, 68Ga 및 177Lu로만 표지되어, PET 진단 및 방사선 요법은 화학적으로 본질적으로 동일한 화합물로 수행할 수 있다. 이를 통해 영상 핵의학 진단 결과를 개선된 용량 조정을 통해 핵의학 치료(치료 진단학)로 변환할 수 있다.
표지 그룹, 특히 킬레이터는 표지 그룹에 접합된 표적 벡터의 구성 및 화학적 성질을 개질하고, 일반적으로 이들의 종양 세포에 대한 친화도에 영향을 미친다. 따라서, 표지 전구체는 방사성 동위 원소와의 착체화와 관련하여, 특히 이의 생화학적 및 약리학적 시험관내 및 생체내 성질과 관련하여 재평가되어야 한다. 표지 그룹 및 이의 표적 벡터에 대한 화학적 결합은 해당 방사성 추적자의 생물학적 및 핵의학 효능에 대해 매우 중요하다.
혈류에 정맥 주사 후, 방사성 동위 원소로 표지된 표지 전구체(이하, 방사성 추적자로도 나타냄)가 종양 세포 또는 전이 부위에 또는 종양 세포 또는 전이 부위 내에 축적된다. 건강한 조직 내의 방사선량을 최소화하기 위해, 반감기가 수 시간 내지 수 일로 짧은 방사성 동위 원소가 사용된다.
요약하면, 표지 전구체 및 이로부터 유도되는 방사성 추적자는 다음 요구 사항을 충족해야 한다고 말할 수 있다.
1. 각각의 방사성 동위 원소의 신속하고 효과적인 착체화 또는 결합
2. 건강한 조직에 비해 종양 세포 및 전이에 대한 높은 선택성
3. 생체내 안정성, 즉 생리학적 조건 하에 혈청의 생화학적 안정성
4. 정확한 진단 및 효과적인 요법을 가능하게 하는, 종양 및 모든 전이에서의 높은 풍부함
5. 상기 기관에 대한 복용량 및 독성을 최소화하기 위해, 낮은 체류율 및 건강한 조직 및 혈액으로부터의 빠른 배설율
전립선암
산업 국가의 남성에게 전립선암은 가장 흔한 유형의 암이고, 세 번째로 치명적인 암이다. 이러한 장애에서 종양 성장은 천천히 진행되며, 초기 단계의 진단의 경우 5년 생존율은 거의 100%에 가깝다. 그러나, 종양이 전이된 후에야 장애가 발견되면 생존율은 크게 떨어진다. 반면, 종양에 대한 지나치게 조기의 그리고 지나치게 공격적인 행동은 환자의 삶의 질을 불필요하게 심각하게 손상시킬 수 있다. 예를 들면, 전립선을 수술로 제거하면 요실금 및 발기 부전으로 이어질 수 있다. 질환의 단계에 대한 신뢰할 수 있는 진단 및 정보는 환자의 높은 삶의 질과 함께 하는 성공적인 치료에 있어 필수적이다. 의사의 전립선 촉진과 함께 널리 사용되는 진단 방법은 환자의 혈액에서 종양 표지자를 확인하는 것이다. 전립선 암종의 가장 두드러진 마커는 혈액 중 전립선-특이적 항원(PSA)의 농도이다. 그러나, PSA 농도의 의미에 대해서는 논란의 여지가 있는데, 이는 약간 높은 값을 보이는 환자는 전립선 암종이 없는 경우가 많지만, 전립선 암종 환자의 15%에서는 혈액 중 PSA 농도가 상승하지 않기 때문이다. 전립선 종양을 진단하기 위한 추가의 표적 구조는 전립선-특이적 막 항원(PSMA)이다. PSA와 달리, PSMA는 혈액에서 검출할 수 없다. PSMA는 효소 활성을 갖는 막 결합 당단백질이다. 이의 기능은 N-아세틸-아스파틸-글루타메이트(NAAG) 및 엽산-(폴리)-γ-글루타메이트로부터 C-말단 글루타메이트를 제거하는 것이다. PSMA는 정상 조직에서는 거의 발생하지 않지만, 전립선 암종 세포에서는 크게 과발현되며, 발현은 종양 장애의 단계와 밀접한 상관관계가 있다. 전립선 암종의 림프절 전이 및 골 전이에서도 PSMA가 40% 정도 발현되는 것으로 나타났다.
PSMA의 분자 표적화 전략은 항체를 사용하여 PSMA의 단백질 구조에 결합하는 것이다. 또한, PSMA의 효소 결합 포켓을 어드레싱하는(address) 리간드가 사용된다. PSMA의 중앙 효소 결합 포켓에는 글루타메이트를 결합하는 2개의 Zn2+ 이온이 포함되어 있다. 중앙 결합 포켓 앞에는 방향족 결합 포켓이 있다. PSMA 단백질은 확장될 수 있고 다양한 리간드, 예를 들면, 억제제에 대해 유도된 적합성이 있거나, 효소적으로 절단될 수 있다. 따라서, PSMA는 NAAG와 마찬가지로, 프테로산 그룹이 방향족 결합 포켓에 도킹되는 엽산에도 결합한다. PSMA 결합 포켓을 억제제 또는 기질로 어드레싱하면 일반적으로 세포 통합(세포내 이입)이 유도된다.
PSMA 억제제는 영상 진단 및 치료 진단 방사성 의약품 또는 방사성 추적자를 위한 표적화 벡터로서 특히 적합하다. 방사성 표지된 억제제는 중앙 PSMA 결합 포켓에 도킹되며, 효소적으로 변환되거나 절단되지 않으며, 억제제/표적화 벡터는 방사성 표지로부터 분리되지 않는다. 세포내 이입에 의해 촉진된 방사성 표지가 있는 억제제는 종양 세포에 포함되어 그 안에서 풍부화된다.
PSMA에 대해 높은 친화력을 갖는 억제제(도식 1)는 일반적으로 글루타메이트 모티프 및 효소적으로 절단할 수 없는 구조를 포함한다. 매우 효과적인 PSMA 억제제는 2-포스포노메틸글루타르산 또는 2-포스포노메틸펜탄디오산(2-PMPA)이며, 여기서 글루타메이트 모티프는 PSMA에 의해 절단되지 않는 포스포네이트 그룹에 결합되어 있다. 또한, 우레아계 PSMA 억제제는 예를 들면, PSMA-11 유형(도식 2) 및 PSMA-617 유형(도식 3)의 임상적으로 관련된 방사성 추적자에 사용된다.
중앙 결합 포켓 이외에, PSMA의 방향족 결합 포켓을 어드레싱하는 것이 유리한 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, PSMA-11 유형의 고활성 방사성 추적자에서, L-리신-우레아-L-글루타메이트 결합 모티프(KuE)는 헥실(헥실 스페이서)을 통해 방향족 HBED 킬레이터(N,N'-비스[2-하이드록시-5-카복시에틸]벤질)에틸렌-디아민-N,N'-디아세테이트)에 결합한다.
이와 대조적으로 L-리신-우레아-L-글루타메이트(KuE)가 비방향족 DOTA 킬레이터(1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세테이트)에 결합하면, 친화력이 감소하고, 종양 조직에서의 풍부함이 확립된다. 그럼에도 불구하고 치료 방사성 핵종, 예를 들면, 177Lu 또는 225Ac와 PSMA 친화성을 갖는 방사성 의약품용 DOTA 킬레이터를 사용할 수 있으려면 스페이서를 조정해야 한다. 다양한 방향족 구조로 헥실 스페이서를 제어하여 대체함으로써, PSMA-617 표지 전구체 및 이로부터 유도되는 고활성 177Lu-PSMA-617 방사성 추적자가 현재의 최적 표준으로 확인되었다.
도식 1: PSMA 억제제
도식 2: PSMA-11 표지 전구체.
도식 3: PSMA-617 표지 전구체.
종양 간질
악성 상피 세포는 많은 종양 및 종양 유형의 구성 요소이며, 늦어도 1 내지 2mm의 크기로 종양을 둘러싸는 종양 기질을 형성한다.
종양 기질(종양 미세 환경, TME)은 다양한 비악성 유형의 세포로 구성되며, 전체 종양 질량의 최대 90%를 차지할 수 있다. 이는 종양 진행 또는 종양 성장 및 전이에 중요한 역할을 한다.
종양 간질의 가장 중요한 세포 구성 요소는 다양한 사이토카인, 내피 세포, 혈관 주위 세포, 대식 세포, 면역 조절 세포 및 활성화된 섬유아세포를 포함하는 세포외 기질이다. 종양 주변의 활성화된 섬유아세포를 CAF(암-관련 섬유아세포)로 나타낸다.
종양 진화 과정에서, CAF는 형태 및 생물학적 기능을 변화시킨다. 이러한 변화는 암세포와 CAF 사이의 세포간 의사소통에 의해 유도된다. 이러한 맥락에서, CAF는 암세포의 성장을 촉진하는 환경을 형성한다. 암세포만을 표적으로 하는 요법은 부적절하다는 것이 밝혀졌다. 효과적인 요법에는 종양 미세 환경이, 따라서 CAF도 포함되어야 한다.
모든 인간 상피 암종의 90% 이상에서 CAF는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)을 과발현한다. 따라서, FAP는 핵의학 진단 및 요법에 대한 유망한 공격 지점을 나타낸다. PSMA와 유사하게, FAP 억제제(FAPI 또는 FAPi)는 특히 FAP 표지 전구체 및 이로부터 유도되는 방사성 추적자를 위한 표적화 벡터로서 적합하다. 생체내에서 FAP의 역할은 아직 완전히 이해되지는 않았지만, 특정한 촉매 활성을 갖는 효소인 것으로 알려져 있다. 이는 디펩티딜펩티다제(DPP) 활성 및 프롤릴롤리고펩티다제(PREP) 활성을 둘 다 갖는다. 따라서, 유용한 억제제는 FAP의 DPP 활성 및/또는 PREP 활성을 억제하는 것이다. 중요한 것은 다른 유사한 효소, 예를 들면, 디펩티딜펩티다제 DPPII, DPPIV, DPP8 및 DPP9 및 프롤릴롤리고펩티다제(PREP)에 대한 억제제의 선택성이다. 그러나, FAP 및 PREP가 둘 다 과발현되는 암 유형의 경우, PREP와 FAP 사이의 선택성이 높지 않지만 상기 효소 둘 다 억제하는 억제제를 사용할 수도 있다.
2013년에는 퀴놀린에 커플링된 개질된 글리신-프롤린 단위를 기반으로 하는 고친화성 고선택성 억제제 구조가 개발 및 발표되었다(Jansen et al. ACS Med. Chem. Lett. 2013, 4, 491-496). 문제의 화합물인 (S)-N-(2-(2-시아노피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)퀴놀린-4-카복스아미드는 도식 4(좌측)에 도시되어 있다. 후속 구조 활성 연구(SAR)에서 디플루오르화 유도체인 (S)-N-(2-(2-시아노-4,4'-디플루오로피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)퀴놀린-4-카복스아미드, 줄여서 UAMC1110를 포함하여 개선된 친화성 및 선택성을 갖는 화합물이 발견되었으며, 상기 화합물은 도식 4(우측)에 도시되어 있다(Jansen et al. J. Med. Chem. 2014, 57 (7), 3053-3074).
도식 4: FAP 억제제(FAPi): (S)-N-(2-(2-시아노피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)퀴놀린-4-카복스아미드(좌측), UAMC1110(우측)
UAMC1110은 핵의학적 용도를 위한 다양한 FAP 표지 전구체 및 방사성 추적자의 표적화 벡터를 위한 기초를 형성한다. 도식 5(상단)는 FAPI-04 표지 전구체를 예시로 보여준다(Lindner et al. J. Nucl. Med. 2018, 59 (9), 1415-1422). 도식 5(하단)는 DOTA 킬레이터를 포함하는 추가의 FAP 표지 전구체를 보여준다. DOTA 킬레이터는, 4-아미노부톡시 그룹, 스쿠아르산 그룹 및 에틸렌디아민 그룹을 통해 약리성 FAPi 표적화 벡터의 퀴놀린 단위에 결합된다.
도식 5: FAP 표지 전구체 FAPI-04(상단) 및 DOTA.SA.FAPi(하단).
골 전이
골 전이는 HMG-CoA 환원 효소(메발로네이트) 경로의 효소인 파르네실 피로포스페이트 합성 효소(FPPS)를 발현한다. FPPS의 억제는, 신호 단백질을 세포막에 도킹하는 데 중요한 분자인 파르네실의 생성을 억제한다. 그 결과, 발암성 골 세포의 세포자멸사가 유도된다. FPPS는 비스포스포네이트, 예를 들면, 알렌드로네이트, 파미드로네이트 및 졸레드로네이트에 의해 억제된다. 예를 들면, BPAMD 추적자는 파미드로네이트 표적화 벡터와 함께 골 전이 치료에 정기적으로 사용된다.
골 전이의 치료 진단에 특히 효과적인 추적자는, 헤테로방향족 이미다졸 단위를 갖는 하이드록시-비스포스포네이트인 졸레드로네이트(ZOL)인 것으로 밝혀졌다. NODAGA- 및 DOTA-접합된 졸레드로네이트 킬레이터(도식 6)는 현재 골 전이에 대한 가장 강력한 방사선 치료 진단제이다.
도식 6: DOTA 졸레드로네이트(좌측) 및 NODAGA 졸레드로네이트(우측) 추적자
선행 기술은 방사성 동위 원소를 사용하는 암의 진단 및 치료 진단을 위한 다수의 표지 전구체를 개시하고 있다.
예를 들면, WO 2015055318 A1은 전립선 암종 또는 상피 암종의 진단 및 치료진단을 위한 방사성 추적자, 예를 들면, 특히 도식 3에 도시된 PSMA 617 표지 전구체를 개시한다.
표적 벡터(TV)를 갖는 단량체 방사성 추적자는 핵의학에서 중심 역할을 하며, "정밀 종양학"이라는 이름을 받을 자격이 있다. 최근에는 2개의 표적화 벡터를 가진 이량체 표지 전구체도 조사되고 있다. 여기서는 2개의 표적화 벡터를 가진 방사성 추적자가 상승된 친화력을 갖는다고 가정한다. 선행 기술은 각각 중앙 킬레이터에 커플링된 2개의 동일한 표적화 벡터를 갖는 "선형" 동종이량체 표지 전구체를 개시하고 있으며, 이와 관련하여 첫 번째 연구는 상기 가설을 뒷받침한다(Zia, N.A. et al. Angw. Chem. Int. Ed. 2019, 58, 14991 -14994).
본 발명에서는, 트리스 링커(TL)를 통해 표지 그룹과 접합된 2개의 동일한 표적화 벡터 또는 2개의 상이한 표적화 벡터를 포함하는 동종이량체 및 이종이량체 표지 전구체가 처음으로 제공된다. 사용되는 트리스 링커(TL)는 예를 들면, 아미노산 잔기, 예를 들면, 특히 리신 잔기 또는 글루탐산 잔기이다.
본 발명의 트리스 링커(TL)는 입체적 및 전자적으로 유도된 상호작용과 관련하여 킬레이터 및 표적화 벡터를 디커플링한다. 킬레이터에 대한 트리스 링커(TL)의 커플링은 임상 관련 방사성 동위 원소와의 착체화를 손상시키지 않도록 디자인되었다. 이를 위해, 단량체 표지 전구체에 유용한 것으로 밝혀진 커플링을 사용할 수 있다. 본 발명은 동종이량체 및 이종이량체 방사성 추적자의 방사성 동위 원소 착체화, 친화성, 및 약동학 및 약력학의 독립적인(직교하는) 최적화를 가능하게 한다. 대조적으로, 알려진 선형의 동종이량체 표지 전구체는 복잡한 분자 공학을 수반하며, 이는 종종 기능 장애와 관련된다.
본 발명의 FAP-어드레싱 표지 전구체 및 방사성 추적자는 다음 특징들을 추가로 갖는다:
1. 나노몰 및 나노몰 미만 범위의 IC50 값을 갖는 FAP에 대한 높은 결합 친화도.
2. 경쟁하는 PREP 프로테아제 및 DPPIV 패밀리, 예를 들면, 특히 DPP4(세포내 형태 및 세포외 형태를 갖는 유형 II 통합 단백질)뿐만 아니라 DPP8 및 DPP9(세포내 단백질)에 대한 우수한 결합 특이성(Hamson et al., Proteomics Clin. Appl. 2014, 8, 454-463). 여기서, 본 발명의 화합물의 결합 친화도는 마이크로몰 범위이고, 그 결과 FAP 표적 및 경쟁 프로테아제에 대한 결합 비는 일반적으로 >1,000의 값을 가정한다. 상기 비는 IC50 값들 사이의 선택성 지수(SI)(표 2 참조)의 도움으로 예시할 수 있다. 이는 본 발명의 방사성 표지된 화합물의 종양 미세 환경 외부의 조직(건강한 조직)에서의 축적을 상당히 감소시키고, 분자 영상화에서 예외적으로 높은 콘트라스트를 보장한다.
3. 높은 친수성(낮은 logD 값)으로서, 이는 본 발명의 화합물의 혈액 중에서의 짧은 체류 시간을 초래한다. 이는 종양과 주변의 관류된 건강한 조직과의 사이의 분자 영상화에서 매우 높은 콘트라스트를 보장한다.
4. 종양 미세 환경에서 본 발명의 화합물의 신속한 풍부화 및 긴 체류 시간. 이는 내시경 방사선 요법에서 상대적으로 수명이 긴 방사성 동위 원소, 예를 들면, 루테튬-177 및 악티늄-225를 사용하는 경우에도 높은 방사선량이 종양에 또는 이의 환경에 투여될 수 있음을 보장한다.
5. 신장 및 방광을 통한 신속한 제거에 의한 건강한 조직에서의 본 발명의 화합물의 짧은 체류 시간. 이는 종양과 주변의 혈액-공급된 건강한 조직과의 사이의 분자 영상화에서 예외적으로 높은 콘트라스트를 보장할 뿐만 아니라, 환자에 대한 낮은 방사선 스트레스도 보장한다.
또한, 본 발명의 개념은 2개의 상이한 표적화 벡터를 갖는 화합물에 쉽게 적용될 수 있다. 여기서는 예를 들면, 골 전이-어드레싱 표적화 벡터(비스포스포네이트)와 전립선암-어드레싱 표적화 벡터(PSMA 억제제)를 함께 사용할 수 있다. 이는 골 전이가 있는 전립선암 환자의 경우 PSMA 표적화 벡터만을 사용하는 방사성 의약품보다 이러한 과제를 더 잘 해결할 수 있다는 이점이 있다. 그 이유는 환자의 골 전이에서 PSMA 발현의 높은 이질성에 있으며, PSMA 억제제 구조를 사용하는 일부 상황에서는 이러한 과제가 부적절하게만 해결할 수 있다.
전립선 암종을 앓고 있는 환자의 약 90%에서만 PSMA가 과발현된다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, FAP 표적화 벡터 및 PSMA 표적화 벡터를 갖는 이종이량체 표지 전구체도 고려된다. 이러한 이종이량체 표지 전구체는 PSMA 발현 종양 조직 및 종양 관련 FAP 발현 간질 세포 둘 다를 어드레싱한다. 따라서, PET 및 SPECT를 통해 PSMA가 과발현되지 않는 전립선 암종 및 전이를 검출하고 시각화할 수도 있다.
본 발명의 목적은 암 장애의 개선된 진단 및 치료 진단을 위한 표지 전구체 및 방사성 추적자를 제공하는 것이다. 특히, 표지 전구체 및 방사성 추적자는 상승된 선택성 및 특이성, 효과적인 방사성 동위 원소 착체화 및 접합, 및 빠른 흡수 및 전신 배설을 제공해야 한다.
이러한 목적은 하기 구조를 갖는 표지 전구체에 의해 달성된다:
상기 구조에서, TV1은 제1 표적화 벡터이고, TV2는 제2 표적화 벡터이고, MG는 방사성 동위 원소의 착체화를 위한 킬레이터 또는 방사성 동위 원소의 공유 결합을 위한 링커이고, S1은 제1 스페이서이고, S2는 제2 스페이서이고, S3은 제3 스페이서이고, TL은 트리스 링커이다.
본 발명의 표지화 전구체의 적절한 양태는, 다음 특징적인 구성들을, 특징적인 구성들이 상호 배타적이지 않은 정도의 임의의 조합으로 특징으로 하며, 이에 따르면
- TV1 및 TV2는 하기 구조 [1] 내지 [43] 중 하나로부터 독립적으로 선택된다.
상기 구조 [1] 내지 [43]에서,
- 구조 [1] 내지 [8] 및 [43]은 펩타이드를 나타내고,
- X = H 또는 F이고,
- Y = H, CH3, CH(CH3)2, C(CH3)3 또는 (CH2)nCH3이고, n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이고,
- TV1과 TV2는 동일하고(TV1 = TV2),
- TV1과 TV2는 상이하고(TV1 ≠ TV2),
- TV1은 상기 구조 [13]을 갖고,
- TV1은 상기 구조 [14]를 갖고,
- TV2는 상기 구조 [13]을 갖고,
- TV2는 상기 구조 [14]를 갖고,
- TV1 및 TV2는 각각 상기 구조 [13]을 갖고,
- TV1 및 TV2는 각각 상기 구조 [14]를 갖고,
- TV1은 상기 구조 [9] 내지 [12] 중 하나를 갖고, TV2는 상기 구조 [13] 또는 [14] 중 하나를 갖고,
- TV1은 상기 구조 [9] 내지 [12] 중 하나를 갖고, TV2는 상기 구조 [40] 또는 [41] 중 하나를 갖고,
- TV2는 상기 구조 [9] 내지 [12] 중 하나를 갖고, TV1은 상기 구조 [13] 또는 [14] 중 하나를 갖고,
- TV2는 상기 구조 [9] 내지 [12] 중 하나를 갖고, TV1은 상기 구조 [40] 또는 [41] 중 하나를 갖는다.
- S1, S2 및 S3은 독립적으로 다음 구조들로부터 선택되는 구조를 갖는다:
및
상기 구조들에서,
A, B 및 C는 아미드 라디칼, 카복스아미드 라디칼, 포스피네이트 라디칼, 알킬 라디칼, 트리아졸 라디칼, 티오우레아 라디칼, 에틸렌 라디칼, 말레이미드 라디칼, 아미노산 잔기, , 및 (s = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10)로 이루어지는 그룹으로부터 독립적으로 선택되고,
p, q 및 r은 세트 {0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20}으로부터 독립적으로 선택된다.
- S1, S2 및 S3은 독립적으로 다음 구조를 갖는다:
- S1, S2 및 S3은 독립적으로, 하기 구조를 갖는 펩타이드 그룹이다:
- S1, S2 및 S3은 독립적으로, 하기 구조를 갖는 디펩타이드 그룹이다:
- S1, S2 및 S3은 독립적으로, 하기 구조를 갖는 트리펩타이드 그룹이다:
- 측쇄 R1, R2 및 R3은, -H, -CH3, -CH(CH3)2, -CH2CH(CH3)2, -CH(CH3)-CH2CH3, -CH2-Phe, -CH2-Phe-OH, -CH2SH, -(CH2)2-S-CH3, -CH2OH, -(CH)(OH)(CH3), -(CH2)4NH2, -(CH2)3NH(C=NH)NH2, -CH2COOH, -(CH2)2COOH, -CH2(C=O)NH2, -(CH2)2(C=O)NH2,
로 이루어지는 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 펩티드 스페이서 S1, S2 및 S3이다.
- MG는, 43Sc, 44Sc, 47Sc, 55Co, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 66Ga, 67Ga, 68Ga, 89Zr, 86Y, 90Y, 89Zr, 90Nb, 99mTc, 111In, 135Sm, 140Pr 159Gd, 149Tb, 160Tb, 161Tb, 165Er, 166Dy, 166Ho, 175Yb, 177Lu, 186Re, 188Re, 211At, 212Pb, 213Bi, 225Ac 및 232Th로 이루어지는 그룹으로부터의 방사성 동위 원소 착체화를 위한 킬레이터이다.
- MG는 H4pypa, EDTA(에틸렌디아민테트라아세테이트), EDTMP(디에틸렌트리아민펜타(메틸렌포스폰산)), DTPA(디에틸렌트리아민펜타아세테이트) 및 이의 유도체, NOTA(노나-1,4,7-트리아민 트리아세테이트) 및 이의 유도체, 예를 들면, NODAGA(1,4,7-트리아자사이클로노난,1-글루타르산,4,7-아세테이트), TRAP(트리아자사이클로노난포스핀산), NOPO(1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4-비스[메틸렌(하이드록시메틸)포스핀산]-7-[메틸렌(2-카복시에틸)포스핀산]), DOTA(도데카-1,4,7,10-테트라아민테트라아세테이트), DOTAGA(2-(1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-4,7,10)펜탄디오산) 및 기타 DOTA 유도체, TRITA(트리데카-1,4,7,10-테트라아민테트라아세테이트), TETA(테트라데카-1,4,8,11-테트라아민테트라아세테이트) 및 이의 유도체, PEPA(펜타데카-1,4,7,10,13-펜타아민펜타아세테이트), HEHA(헥사데카-1,4,7,10,13,16-헥사아민헥사아세테이트) 및 이의 유도체, HBED(N,N'-비스(2-하이드록시벤질)에틸렌디아민-N,N'-디아세테이트) 및 이의 유도체, 예를 들면, HBED-CC(N,N'-비스[2-하이드록시-5-카복시에틸]벤질)에틸렌디아민-N,N'-디아세테이트), DEDPA 및 이의 유도체, 예를 들면, H2dedpa(1,2-[[6-(카복실)피리딘-2-일]메틸아민]에탄) 및 H4octapa(1,2-[[6-(카복실)피리딘-2)-일]메틸아민]에탄-N,N'-디아세테이트), DFO(데페록사민) 및 이의 유도체, 트리스하이드록시피리디논(THP) 및 이의 유도체, 예를 들면, H3THP-Ac 및 H3THP-mal(YM103), TEAP(테트라아자사이클로데칸포스핀산) 및 이의 유도체, AAZTA(6-아미노-6-메틸퍼하이드로-1,4-디아제판-N,N,N',N'-테트라아세테이트) 및 이의 유도체, 예를 들면, AAZTA5(5-[(6-아미노)-1,4-디아제판]펜탄산-N,N,N',N'-테트라아세테이트), DATA5m(5-[[6-(N-메틸)아미노]-1,4-디아세테이트-1,4-디아제판]-펜탄산-N,N',N'-트리아세테이트); 사르코파긴 SAR(1-N-(4-아미노벤질)-3,6,10,13,16,19-헥사아자바이사이클로[6.6.6]에이코산-1,8-디아민) 및 이의 유도체, 예를 들면, (NH2)2SAR(1,8-디아미노-3,6,10,13,16,19-헥사아자바이사이클로[6.6.6]에이코산), N4(3-[(2'-아미노에틸)아미노]-2[(2"-아미노에틸)아미노메틸]프로피온산) 및 기타 N4 유도체, PnAO(6-(4-이소티오시아네이토벤질)-3,3,9,9-테트라메틸-4,8-디아자운데칸-2,10-디온 디옥심) 및 유도체, 예를 들면, BMS181321(3,3'-(1,4-부탄디일디아미노)-비스(3-메틸-2-부타논)디옥심), MAG2(머캅토아세틸글리실글리신) 및 이의 유도체, MAG3(머캅토아세틸글리실글리실글리신) 및 이의 유도체, 예를 들면, N3S-아디페이트, MAS3(머캅토아세틸세릴세릴세린) 및 이의 유도체, MAMA(N-(2-머캅토에틸)-2-[(2-머캅토에틸)아미노]아세트아미드) 및 이의 유도체, EC(에틸렌디시스테인) 및 이의 유도체, dmsa(디머캅토석신산) 및 이의 유도체, DADT(디아미노디티올), DADS(디아미노디설파이드), N2S2 킬레이터 및 이의 유도체, 아미노티올 및 이의 유도체; 상기 킬레이터의 염; 하이드라진니코틴아미드(HYNIC) 및 하이드라진니코틴아미드 유도체로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 킬레이터이다.
- 표지 그룹 MG는 구조 [44], [45], [46] 및 [47]로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 구조를 갖는다.
- 표지 그룹 MG는 구조 [48], [49], [50] 및 [51]로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 구조를 갖는다.
- MG는 DOTA(도데카-1,4,7,10-테트라아민테트라아세테이트)이다.
- MG는 DATA5m(1,4-비스(카복시메틸)-6-[메틸카복시메틸아미노]-6-펜탄산-1,4-디아제판)이다.
- MG는 AAZTA(1,4-비스(카복시메틸)-6-[비스(카복시메틸)아미노]-6-펜탄산-1,4-디아제판)이다.
- MG는 18F, 131I 또는 211At의 공유 결합을 위한 링커이다.
- MG는 다음 구조들로부터 선택된다:
- MG는 18F, 131I 또는 211At로 대체되는 이탈 그룹 X가 있는 
유형의 링커이다.
- MG는 브롬(Br) 라디칼, 염소(Cl) 라디칼 또는 요오드(I) 라디칼, 토실(Ts) 라디칼, 브로실레이트(Bs) 라디칼, 노실레이트(Nos) 라디칼, 2(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES) 라디칼, 트리플레이트(Tf) 라디칼 및 노나플레이트(Non) 라디칼로부터 선택되는 이탈 그룹 X를 포함한다.
- 트리스 링커 TL은 하기 구조 [52] 내지 [64] 중 하나로부터 선택된다.
- 트리스 링커 TL은 하기 구조 [65] 내지 [116] 중 하나로부터 선택된다.
펩타이드 또는 구조식 [1] 내지 [8]에서, 합성 아미노산에 대해 이하의 용어가 사용된다.
Aph(Hor) = 4-[2,6-디옥소헥사하이드로피리미딘-4-카보닐아미노]-L-페닐알라닌
Cpa = 4-클로로페닐알라닌
D-Aph(Cbm) = D-4-아미노카바모일페닐알라닌
Pal = 2-, 3- 또는 4-피리딜알라닌
방사성 동위 원소 18F, 131I 또는 211At의 공유 결합을 위한 표지 그룹 MG는 특히, 브롬(Br) 라디칼, 염소(Cl) 라디칼, 요오드(I) 라디칼, 토실(-SO2-C6H4-CH3; 약어로 "Ts") 라디칼, 브로실레이트(-SO2-C6H4-Br; 약어로 "Bs") 라디칼, 노실레이트 라디칼 또는 니트로벤젠설포네이트(-OSO2-C6H4-NO2; 약어로 "Nos") 라디칼, 2(N-모르폴리노)에탄설폰산(-SO3-(CH2)2-N(CH2)4O; 약어로 "MES") 라디칼, 트리플레이트 라디칼 또는 트리플루오로메탄설포닐(-SO2CF3; 약어로 "Tf") 라디칼 또는 노나플레이트(-OSO2-C4F9; 약어로 "Non") 라디칼로부터 선택되는 이탈 그룹 X를 포함한다.
놀랍게도, 본 발명자들은, 동일한 전신 투여량에서 비특이적 풍부화(표적 외(off-target) 노출)를 갖는 1개의 표적화 벡터를 갖는 단량체성 방사성 추적자와 비교하여, 종양 조직에서의 풍부화(표적 노출)가 훨씬 더 높은, 2개의 표적화 벡터 TV1 및 TV2를 갖는 상기 이량체 표지 전구체 또는 이로부터 유도되는 방사성 추적자를 발견하였다. 이러한 유리한 성질은 상승된 도킹 확률 및/또는 선택성에 기인하는 것으로 생각된다.
본 발명에 따라 사용되는 표적화 벡터 TV1 및 TV2는 막 상의 종양 마커, 예를 들면, 특히 PSMA(전립선-특이적 막 항원), FAP(섬유아세포 활성화 단백질) 및 FPPS(파르네실 피로포스페이트 신타제)에 대해 높은 결합 친화도를 갖는다.
본 발명의 이종이량체 표지 전구체 및 방사성 추적자는 다양한 종양 조직 및 전이를 해결하는 데 사용될 수 있다. 이는 전립선 암종에 의해 유발된 골 전이의 치료에 유리하다. PSMA에 대한 제1 표적화 벡터 TV1(PSMA 표적화 벡터) 및 FPPS에 대한 제2 골 형성 표적화 벡터 TV2(FPPS 표적화 벡터)를 갖는 표지 전구체 또는 방사성 추적자가 상기 목적에 대해 특히 유용하다.
본 발명의 표지 전구체 및 방사성 추적자는 마찬가지로 종양 기질을 어드레싱하는 데 적합하다. 예를 들면, 삼중-음성 유방암(TNBC)의 경우, 발암성 세포 표면에 직접 어드레싱 할 수 있게 하는 특정 수용체가 부족하다. 여기서 한 가지 옵션은 종양 기질을 "간접적으로" 어드레싱하는 것이다. TNBC의 경우, 종양 기질은 각각 FAP 및 PSMA를 과발현하는 암-관련 섬유아세포(CAF) 및 개질된 내피 세포(EC)로 구성된다. 따라서, PSMAi, FAPi 또는 비스포스포네이트 벡터를 갖는 동종이량체 전구체, 및 제1 PSMA 표적화 벡터 및 제2 FAP 표적화 벡터를 갖는 이종이량체 표지 전구체 둘 다 TNBC의 진단 및 치료에 적합하다.
이러한 상황은 PSMA 음성 전립선 암종, 즉 PSMA를 과발현하지 않는 암종의 경우에도 유사하며, 이는 전립선암의 약 10%에 해당하는 경우이다. 그러나, PSMA-음성 종양 및 전이는 FAP 표적화 벡터의 도움으로 종양 간질을 어드레싱함으로써 진단 및 치료될 수 있다. 따라서, 제1 PSMA 표적화 벡터 및 제2 FAP 표적화 벡터를 갖는 이종이량체 표지 전구체는 PSMA-양성 및 PSMA-음성 전립선암의 포괄적인 진단 및 치료에 적합하다.
방사성 동위 원소, 예를 들면, 177Lu 및 225Ac를 사용하여 종양 간질을 치료 진단적으로 어드레싱하는 것은 진행에 필수적인 종양 미세 환경을 직접적으로 손상시키고, 인접한 암세포에 "간접적인" 방사선 손상(방사선 유도 방관자 효과, RIBE)을 유발한다.
스페이서 S1, S2 및 S3은, 표적화 벡터의 생화학적 기능(표적에 대한 결합 친화도), 표지 그룹의 방사선 화학적 기능(방사성 동위 원소의 안정한 착체화 또는 접합) 및 혈청에서의 반감기(친수성)를 최적화하는 입체 스페이서 및 약동학적 조절제로서 기능한다. 스페이서 S1, S2 및 S3은 바람직하게는 PSMA에 대한 친화도를 개선하는 구조적 요소, 예를 들면, 스쿠아라미드 또는 기타 방향족 단위를 함유한다.
트리스 링커 TL은, 단 하나의 표적화 벡터를 갖는 확립된 단량체 방사성 의약품과 유사하게 표지 그룹 MG와 2개의 표적화 벡터 TV1 및 TV2의 직교의 입체적이고 약동학적으로 최적화된 커플링을 위한 전제 조건을 생성한다. 따라서, 본 발명은 높은 치료 진단 효능을 갖는 효과적인 표지 전구체 및 방사성 추적자의 합성을 가능하게 한다.
본 발명은 상기 표지 전구체들 중 하나 및
- 43Sc, 44Sc, 47Sc, 55Co, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 66Ga, 67Ga, 68Ga, 89Zr, 86Y, 90Y, 89Zr, 90Nb, 99mTc, 111In, 135Sm, 140Pr, 159Gd, 149Tb, 160Tb, 161Tb, 165Er, 166Dy, 166Ho, 175Yb, 177Lu, 186Re, 188Re, 211At, 212Pb, 213Bi, 225Ac 및 232Th로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 표지 전구체와 착체화된 방사성 동위 원소 또는
- 18F, 131I 및 211At로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는, 표지 전구체에 공유 결합된 방사성 동위 원소로 이루어지는 방사성 추적자를 포함한다.
본 발명의 적절한 양태에서, 방사성 추적자는 다음을 갖는 상기 표지 전구체들 중 하나로 구성된다:
- NOTA(노나-1,4,7-트리아민 트리아세테이트), DATA5m(5-[[6-(N-메틸)아미노]-1,4-디아세테이트-1,4-디아제판] 펜탄산-N,N',N'-트리아세테이트) 및 NODAGA(1,4,7-트리아자사이클로노난,1-글루타르산,4,7-아세테이트)로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 표지 그룹 MG 및
- 표지 전구체와 착체화된 방사성 화합물인 알루미늄 [18F]플루오라이드(즉, [18F]AlF).
킬레이터 형태의 표지 그룹 MG의 경우, 킬레이터는 43Sc, 44Sc, 47Sc, 55Co, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 66Ga, 67Ga, 68Ga, 89Zr, 86Y, 90Y, 89Zr, 90Nb, 99mTc, 111In, 135Sm, 140Pr, 159Gd, 149Tb, 160Tb, 161Tb, 165Er, 166Dy, 166Ho, 175Yb, 177Lu, 186Re, 188Re, 211At, 212Pb, 213Bi, 225Ac 및 232Th로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 방사성 동위 원소로 표지하는 역할을 한다.
따라서, 본 발명은 상기 표지 전구체로부터 방사성 동위 원소와의 착체화에 의해 얻을 수 있는 방사성 추적자를 포함하며, 여기서 방사성 동위 원소는 43Sc, 44Sc, 47Sc, 55Co, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 66Ga, 67Ga, 68Ga, 89Zr, 86Y, 90Y, 89Zr, 90Nb, 99mTc, 111In, 135Sm, 140Pr 159Gd, 149Tb, 160Tb, 161Tb, 165Er, 166Dy, 166Ho, 175Yb, 177Lu, 186Re, 188Re, 211At, 212Pb, 213Bi, 225Ac 및 232Th를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
킬레이터
선행 기술은 방사성 동위 원소의 착체화를 위한 다수의 킬레이터를 개시하고 있다. 도식 7은 본 발명에 따라 사용되는 킬레이터의 예를 보여준다.
도식 7: 본 발명에 따라 사용되는 킬레이터.
아미드 커플링
본 발명에서는, 관능 그룹, 예를 들면, 킬레이터 Chel, 표적 벡터 TV1 및 TV2, 스페이서 S1, S2 및 S3 및 트리스 링커 TL이 아미드 커플링 반응에 의해 접합되는 것이 바람직하다. 단백질의 골격을 형성하는 아미드 커플링은 의약 화학에서 가장 일반적으로 사용되는 반응이다. 아미드 커플링의 일반적인 예는 도식 8에 나와 있다.
도식 8: 아미드 커플링
사실상 무제한인 쉽게 사용할 수 있는 카복실산 및 아민 유도체 세트로 인해, 아미드 커플링 전략은 신규한 화합물의 합성을 위한 간단한 경로를 열어준다. 당업자는 아미드 커플링을 위한 수많은 시약 및 프로토콜을 알고 있다. 가장 일반적으로 사용되는 아미드 커플링 전략은 카복실산과 아민의 축합을 기반으로 한다. 이를 위해 카복실산이 일반적으로 활성화된다. 활성화 전, 나머지 관능 그룹은 보호된다. 반응은 하나의 반응 매질(단일 포트)에서 활성화된 카복실산을 직접 전환하는 2개의 단계로 또는 활성화된 "포집된" 카복실산을 단리하고 아민과 반응시키는 2개의 단계로 수행된다.
여기서, 카복실산은 커플링 시약과 반응하여 반응성 중간체를 형성하며, 상기 반응성 중간체는 단리되거나 아민과 직접 반응할 수 있다. 카복실산 활성화를 위해 산 할라이드(클로라이드, 플루오라이드), 아지드, 무수물 또는 카보디이미드와 같은 다양한 시약이 사용될 수 있다. 또한, 형성된 반응성 중간체는 에스테르, 예를 들면, 펜타플루오로페닐 또는 하이드록시석신이미도 에스테르일 수 있다. 아실 클로라이드 또는 아지드로부터 형성된 중간체는 반응성이 높다. 그러나, 가혹한 반응 조건 및 높은 반응성은 민감한 기질 또는 아미노산에 사용하는 데 장벽이 된다. 따라서, 카보디이미드, 예를 들면, DCC(디사이클로헥실카보디이미드) 또는 DIC(디이소프로필카보디이미드)를 사용하는 아미드 커플링 전략은 광범위한 적용 범위를 열어준다. 빈번하게는, 특히 고상 합성의 경우, 반응 효율을 개선하기 위해 첨가제를 사용한다. 아미늄 염은 반응 시간이 짧고 라세미화를 최소화하는 매우 효율적인 펩타이드 커플링 시약이다. HOBt와 같은 일부 첨가제를 사용하면 라세미화를 완전히 피할 수 있다. 아미늄 시약은, 펩타이드의 유리 아민과의 과도한 반응을 방지하기 위해, 카복실산과 등몰량으로 사용된다. 포스포늄 염은 카복실레이트와 반응하는데, 일반적으로 2당량의 염기, 예를 들면, DIEA를 필요로 한다. 이미늄 시약에 비한 포스포늄염의 주요 이점은 포스포늄이 아민 성분의 유리 아미노 그룹과 반응하지 않는다는 것이다. 이는 산과 아민의 등몰비로의 커플링을 가능하게 하며, 선형 펩타이드의 분자내 환화 및 값비싼 아민 성분의 과도한 사용을 방지하는 데 도움이 된다.
아미드 커플링을 위한 반응 전략 및 시약의 광범위한 조합은 리뷰 문헌들에서 확인할 수 있다.
-Analysis of Past and Present Synthetic Methodologies on Medicinal Chemistry: Where Have All the New Reactions Gone?; D. G. Brown, J. Bostroem; J. Med. Chem. 2016, 59, 4443-4458;
- Peptide Coupling Reagents, More than a Letter Soup; A. El-Faham, F. Albericio; Chem. Rev. 2011, 111, 6557-6602;
- Rethinking amide bond synthesis; V. R. Pattabiraman, J. W. Bode; Nature, Vol. 480 (2011) 22/29;
- Amide bond formation: beyond the myth of coupling reagents; E. Valeur, M. Bradley; Chem. Soc. Rev., 2009, 38, 606-631.
본 발명에 따라 사용되는 킬레이터들 중 다수의 킬레이터, 예를 들면, DOTA 및 이의 유도체는 하나 이상의 카복시 또는 아민 그룹을 갖는다. 따라서, 이러한 킬레이터는 선행 기술에 공지된 아미드 커플링 전략들 중 하나의 도움으로 간단한 방식으로 스페이서 S3에 접합될 수 있다.
본 발명의 맥락에서 사용되는 일부 용어의 의미는 이하에 설명된다.
치료 진단: 유사한 표적화 벡터를 가진 핵의학 방사성 추적자를 사용하는 암의 진단 및 요법.
표지 전구체: 방사성 동위 원소로 표지하기 위한, 제1 표적화 벡터 및 제2 표적화 벡터 및 킬레이터 또는 관능 그룹을 함유하는 화학적 화합물.
방사성 추적자: 핵의학 진단 또는 치료 진단을 위해 방사성 동위 원소로 표지된 표지 전구체로서, 환자의 대사에 영향을 미치지 않으면서 저농도로 사용되는 표지 전구체.
표적: 생물학적 표적 구조, 특히 표적 벡터가 결합하는 살아있는 유기체 내의 (막 결합) 수용체, 단백질, 효소 또는 항체.
표적화 벡터: 생물학적 표적(예를 들면, 단백질, 효소 또는 수용체)에 대해 리간드, 작용제, 길항제 또는 억제제로 기능하고, 해당 표적에 대해 결합 친화도가 높은 화학적 그룹 또는 라디칼.
트리스 링커: 제1 표적화 벡터 및 제2 표적화 벡터 및 표지 그룹에 대한 제1, 제2 및 제3 스페이서에 접합하기 위한 3개의 관능 그룹을 갖는 구조 단위.
스페이서: 제1 표적화 벡터 및 제2 표적화 벡터 및 표지 그룹을 트리스 링커에 연결하고 입체적 및/또는 약동학적 조절자로서 기능하는 구조적 단위, 그룹 또는 라디칼.
실시예
화합물 (S)-6-(4-아미노부톡시)-N-(2-(2-시아노-4,4-디플루오로피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)-퀴놀린-4-카복스아미드는 이하 FAPi-NH2로 약칭된다.
도식 9: FAPi-NH2의 구조 = (S)-6-(4-아미노부톡시)-N-(2-(2-시아노-4,4-디플루오로피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)퀴놀린-4-카복스아미드
재료 및 방법:
핵 자기 공명(NMR) 분광학:
NMR 스펙트럼은 Bruker(Rheinstatten, Germany)의 5mm BBFO 샘플 헤드(z 구배)가 있는 Avance II 400(400MHz) 분광계에서 중수소화 용매 중에서 기록되었다. 화학적 이동 δ(ppm)는 테트라메틸실란 표준(= 0.00ppm)에 대한 중수소화 용매의 양성자 신호를 기준으로 한다. 계산된 커플링 상수는 헤르츠(Hz) 단위로 보고되었다. 스핀 다중도는 다음과 같이 축약된다: s = 단일선, d = 이중선, t = 삼중선, q = 사중선 및 m = 다중선 또는 이들의 조합. 스펙트럼은 Mestrelab Research(Santiago de Compostela, Spain)의 MestReNova 14.2.0 소프트웨어를 사용하여 분석되었다.
ESI-LC/MS:
ESI-LC/MS 질량 스펙트럼은 Agilent Technologies의 6130B Single Quadruple LC/MS 시스템과 커플링된 Agilent Technologies의 1220 Infinity LC를 사용하여, Agilent Zorbax SB-C18 컬럼(21x50mm, 1.8μm)으로, 아세토니트릴(ACN)/Milli-Q® 물(H2O) + 0.05% 포름산(HFo)의 선형 기울기 및 0.5mL/분의 유속으로 측정하였다.
ESI-HPLC/MS:
HPLC-MS 측정은, G7111B 1260 4차 펌프, G7129A 1260 바이알 샘플러 및 G7116A 다중 컬럼 온도 조절 장치를 갖춘 1260 Infinity II HPLC 시스템(Agilent Technologies)과 커플링된, 전자 분무 이온화 기능을 갖춘 Agilent Technologies의 G6545A Q-ToF를 사용하여 수행되었다. Agilent Poroshell 120 EC-C8 컬럼(2.1x100mm, 2.7μm)을 사용하여 H2O + 2% ACN/ACN + 2% H2O + 0.05% HFo 및 0.1mL/분의 유속으로 분리를 수행하였다.
RP-HPLC:
반제조용 역상 고압 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)는 Merck Hitachi의 LaChrom-HPLC(7000 시리즈) 및 L-7100 펌프, L-7400 UV 검출기(λ = 254nm), D-7000 인터페이스 및 자동 샘플러를 사용하여 수행되었다. Phenomenex Synergi Max-RP C18 컬럼(250x10mm, 4μm) 및 ACN/H2O + 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)의 선형 구배 및 5mL/분의 유속을 사용하여 분리를 수행하였다.
방사성-TLC:
방사성-TLC는 Raytest의 CR-35 Bio Test-Imager 및 AIDA 소프트웨어를 사용하여 평가되었다.
방사성-HPLC:
분석 방사성-HPLC는 동일한 Merck Hitachi LaChrom-HPLC(7000 시리즈)를 사용하여 수행되었다. 분리는 Phenomenex Luna C18 컬럼(250x4.6mm, 5μm) 및 ACN/H2O + 0.1% TFA의 선형 구배 및 1mL/분의 유속을 사용하여 수행되었다. 방사성-HPLC에는 Elysia Raytest의 Ramona 방사성 검출기가 추가로 장착되어 있으며, 에너지 윈도우는 68Ga 측정의 경우 100 내지 1,200keV로 설정되었고, 177Lu 측정의 경우 100 내지 250keV로 설정되었다.
안정성 측정:
각각의 표지된 화합물의 인간 혈청(HS) 및 포스페이트-완충 염 용액(PBS) 중에서의 안정성은 0.5mL의 HS 또는 PBS 중 약 10MBq의 표지 용액을 37℃에서 약 2반감기 동안(68Ga: 2시간, 177Lu: 14일) 인큐베이션하여 조사되었다(각각의 경우 n = 3).
logD의 측정(친유성의 측정):
각각의 표지된 화합물의 logD 값은 PBS로 표지 용액을 매회 약 10MBq씩 4x 700μL로 희석하여 측정하였다. 여기에 700μL의 1-옥탄올을 매번 첨가하고, 혼합물을 2분간 격렬하게 진탕한 후, 1분간 원심분리하였다. 유기상과 수성상을 분리하고, 각각 400μL를 단리하였다. 3μL(PBS) 및 6μL(1-옥탄올) 샘플을 TLC 플레이트에 두었다. 활성의 대부분은 수성상에서 나타났다. 후속적으로 이를 700μL로 희석하고, 1-옥탄올로 2회 더 추출한 후, 다시 두었다. TLC를 약 5분 동안 노출시키고, 각각의 지점의 적분(옥탄올상: I0, 수성 PBS 상: IW)을 측정하였다. 수학식 1에 의한 logD 값의 계산에서는 VO = 6μL 및 VW = 3μL의 다양한 체적을 고려하였다.
[수학식 1]
평가를 위해 4개 배취의 2차 및 3차 추출 값을 평균하였다.
시험관내 검정:
rhFAP(섬유아세포 활성화 단백질), PREP(프롤릴 엔도펩티다제), DPP4(디펩티딜펩티다제 IV), DPP8(디펩티딜펩티다제 VIII) 및 DPP 9(디펩티딜펩티다제 IX) 효소를 시험관내 검정에 사용하기 전에 발현시킨 다음 정제하였다.
IC50 측정은 Infinite 200 장비(Tecan Group Ltd.)로 수행되었으며, Magellan 소프트웨어로 평가하였다.
데이터는 GraFit 7에 의해 비선형 피팅을 사용하여 다음 수학식에 따라 평가하였다.
[수학식 2]
상기 수학식에서, y는 억제되지 않은 샘플과 비교하여 남은 효소 활성이고, x는 검정에 사용된 최종 억제제 농도이고, s는 기울기 인자이고, IC50은 평균 억제 농도이다.
실시예 1: FAPi-NH
2
도식 10: FAPi-NH2의 합성
도식 10은 FAPi-NH2의 합성을 보여준다.
4-브로모부틸아민
4-아미노부탄올(5.39g, 60.47mmol, 1.00eq)에 70mL의 47% 브롬화수소산를 서서히 첨가한 후, 혼합물을 환류 하에 4시간 동안 가열하였다. 이어서, 반응 혼합물을 감압 하에 완전히 농축시켰다. 무색 고체를 얻었다(13.521g, 58.04mmol, 96%). 이를 추가의 정제 없이 다음 합성 단계에 직접 사용하였다.
MS (ESI-양성): m/z (%) = 152.0 (100, [M+H]+), 154.0 (98, [M+H]+), C4H10BrN에 대해 계산됨: 151.00 [M].
1 H NMR (400 MHz, MeOD): δ [ppm] = 3.51 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.98 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.00 - 1.78 (m, 4H).
tert-부틸 (4-브로모부틸)카바메이트
4-브로모부틸아민(7.01g, 30.09mmol, 1.0eq.)을 디-tert-부틸 디카보네이트(Boc2O, 7.34g, 33.63mmol, 1.12eq.)와 함께 아르곤 하에 무수 THF(34mL)에 용해시켰다. 그 후, TEA(4.6mL, 36.12mmol, 1.2eq.)를 첨가하였다. 용액이 다시 투명해질 때까지 형성된 현탁액에 MeOH(36mL)를 첨가한 후, 실온에서 19시간 동안 교반하였다. 이어서, 용매를 감압 하에 제거하고, pH = 2.5가 되도록 묽은 HBr을 잔류물에 첨가하였다. 수용액을 Et2O(5 x 80mL)로 추출하고, 합한 유기상을 소량의 NaHCO3 및 염수로 각각 1회 세척한 후, Na2SO4로 건조시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 컬럼 크로마토그래피(CH/EA 5:1)에 의해 무색 고체(5.08g, 20.15mmol, 66%)를 얻었다.
MS (ESI-양성): m/z (%) = 196.0 (100, [M-tBu]+), 198.0 (100, [M-tBu]+), C9H18BrNO2에 대해 계산됨: 251.05 [M].
1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ): δ [ppm] = 3.36 - 3.21 (m, 4H), 1.86 - 1.76 (m, 4H), 1.43 (s, 9H).
Boc-Gly-Pro-CONH 2 (tert-부틸 (S)-(2-(2-카바모일-4,4-디플루오로피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카바메이트)
Boc-Gly-OH(1.38g, 7.88mmol, 1.05eq.) 및 HBTU(3.12g, 8.20mmol, 1.1eq.)를 아르곤 하에 무수 DCM(8mL) 및 DMF(8mL)에 용해시켰다. 그 후, DIPEA(1.53mL, 8.97mmol, 1.2eq.)를 첨가하고 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 추가의 반응 용기에서, 4,4-디플루오로-L-프롤린아미드 하이드로클로라이드를 무수 DCM(5mL) 및 DMF(5mL)에 용해시키고, DIPEA(2.54mL, 14.90mmol, 2.0eq.)를 마찬가지로 여기에 첨가하였다. 용액을 합하고 실온에서 19시간 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과 제거하고, 침전을 완료하기 위해 모액을 밤새 냉각시켰다. 두 침전물을 합쳤다. 무색 고체(1.97g, 6.41mmol, 86%)를 얻었다.
MS (ESI-양성): m/z (%) = 207.8 (62, [M-Boc+H]+), 251.8 (100, [M-tBu+H]+), 307.9 (39, [M+H]+), 329.9 (24, [M+Na]+), C12H19F2N3O4에 대해 계산됨: 307.13 [M]+.
1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ): δ [ppm] = 7.40 (s, 1H), 7.16 (s, 1H), 6.87 (dt, J = 10.4, 5.8 Hz, 1H), 4.45 (dd, J = 9.0 Hz, 1H), 4.15 - 3.85 (m, 2H), 3.86 - 3.63 (m, 2H), 2.81-2.27 (m, 2H), 1.37 (s, 9H).
Boc-Gly-Pro-CN(tert-부틸 (S)-(2-(2-시아노-4,4-디플루오로피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카바메이트)
Boc-Gly-Pro-CONH2(1.97g, 6.41mmol, 1.0eq.)를 아르곤 하에 무수 THF(50mL)에 용해시키고 0℃로 냉각시켰다. 피리딘(4.1mL, 51.3mmol, 8.0eq.)을 첨가하였다. 추가의 반응 용기에서, TFAA(2.7mL, 19.2mmol, 3.0eq.)를 아르곤 하에 무수 DCM(35mL)에 용해시키고, 반응 용액에 천천히 적가하였다. 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 그 후, 1M HCl(80mL)을 첨가하고, 수용액을 DCM(5 x 80mL)으로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 소량의 Na2CO3 및 염수로 각각 1회 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 용매를 감압 하에 제거하고, 생성물을 컬럼 크로마토그래피(CH/EA = 3:2)를 통해 정제하였다. 무색 고체(1.49g, 4.81mmol, 81%)가 얻어졌다.
MS (ESI-양성): m/z (%) = 190.0 (31, [M-Boc+H]+), 233.9 (100, [M-tBu+H]+), C12H17F2N2O3에 대해 계산됨: 289.12 [M]+.
1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ): δ [ppm] = 5.34 (s, 1H), 4.97 (t, J = 6.5 Hz, 1H), 4.04 - 3.78 (m, 4H), 2.81 - 2.69 (m, 2H), 1.45 (s, 9H).
Gly-Pro-CN((S)-4,4-디플루오로글리실피롤리딘-2-카보니트릴)
Boc-Gly-Pro-CN(1.15g, 3.97mmol, 1.0eq.)을 아르곤 하에 무수 MeCN(2mL)에 용해시키고, TFA(2mL)를 천천히 적가하였다. 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반한 후, 용매를 감압 하에 제거하고, 잔류물을 MeOH(5 x 25mL)와 함께 공증류시켰다. 황색을 띠는 오일을 얻었고, 이를 추가의 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
MS (ESI-양성): m/z (%) = 189.9 (100, [M+H]+), 231.0 (20, [M+ACN+H]+), CH C7H9F2N3O에 대해 계산됨: 189.07 [M]+.
1 H NMR (400 MHz, MeOD): δ [ppm] = 8.25 (s, 2H), 5.22 - 5.15 (m, 1H), 4.15 - 3.91 (m, 4H), 3.00 - 2.81 (m, 2H).
6-하이드록시퀴놀린-4-카복실산 하이드로브로마이드
6-메톡시퀴놀린-4-카복실산(2.46g, 12.1mmol, 1.0eq.)을 47% HBr(28.18mL, 242.42mmol, 20eq.)에 용해시키고 환류 하에 1일 동안 가열하였다. 실온으로 냉각한 후, 브롬화수소산을 감압 하에 부분적으로 제거한 다음, 침전물을 여과하고, 먼저 차가운 EA(20mL)로 세척한 다음 약간 차가운 EA/MeOH(90:10)로 세척하였다. 황색 고체(3.25g, 12.1mmol, 100%)를 얻었다.
MS (ESI-양성): m/z (%) = 190.0 (100, [M+H]+), 191.0 (12, [M+H]+), C10H8BrNO3에 대해 계산됨: 189.04 [M].
1 H NMR (400 MHz, MeOD): δ [ppm] = 9.04 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 8.41 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 8.34 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 8.19 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 7.77 (dd, J = 9.3, 2.6 Hz, 1H).
6-하이드록시퀴놀린-4-카복실산 메틸 에스테르
먼저, 무수 MeOH(20mL)를 아르곤 하에 0℃로 냉각시킨 후, SOCl2(4.43mL, 61.09mmol, 5.0eq.)를 적가하였다. 6-하이드록시퀴놀린-4-카복실산 하이드로브로마이드를 무수 MeOH(20mL)에 용해시키고, 마찬가지로 아르곤 하에 0℃로 냉각시켰다. 그 후, SOCl2-MeOH 용액을 적가하였다. 반응 용액을 실온으로 가온하고, 환류 하에 1일 동안 가열하였다. SOCl2(2.91g, 24.44mmol, 2eq.) 및 MeOH(20mL)를 0℃에서 다시 합치고 실온에서 반응 혼합물에 첨가하였다. 용액을 추가의 24시간 동안 환류 하에 가열하였다. 상기 단계를 1회 더 반복하고, 환류 하에 추가로 4시간 동안 가열한 후, 용매를 감압 하에 제거하였다. 황색 고체가 얻어졌고, 이를 추가의 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
MS (ESI-양성): m/z (%) = 204.0 (100, [M+H]+), 205.1 (12, [M+H]+), C11H9NO3에 대해 계산됨: 203.06 [M].
1 H NMR (400 MHz, MeOD): δ [ppm] = 9.02 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 8.38 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 8.24 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 8.17 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 7.75 (dd, J = 9.3, 2.6 Hz, 1H), 4.09 (s, 3H).
Boc-Quino-COOMe(6-(4-((tert-부톡시카보닐)아미노)부톡시)퀴놀린-4-카복실산 메틸 에스테르)
아르곤 하에, 6-하이드록시퀴놀린-4-카복실산 메틸 에스테르(2.48g, 12.1mmol, 1.0eq.) 및 Cs2CO3(4.37g, 13.4mmol, 1.25eq.)를 무수 DMF(55mL)에 현탁시켰다. 반응 용액을 70℃로 가열하였다. 후속적으로, tert-부틸 (4-브로모부틸)카바메이트(3.76g, 14.91mmol, 1.22eq.)를 무수 DMF(80mL)에 용해시키고, 뜨거운 반응 혼합물에 적가하였다. 용액을 70℃에서 3시간 동안 교반하였다. 반응을 확인한 후, tert-부틸 (4-브로모부틸)카바메이트(1.23g, 4.88mmol, 0.4eq.)를 다시 무수 DMF(20mL)에 용해시키고, 반응 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 70℃에서 밤새 교반하였다. 추가로 첨가(308mg, 1.22mmol, 0.1eq.)한 후, 70℃에서 3시간 동안 용매를 감압 하에 제거하고, 잔류물을 묽은 HBr(150mL, pH = 2.6)에 용해시켰다. 혼합물을 EA(5 x 80mL)로 추출하고, 합한 유기상을 염수로 세척하고 Na2SO4로 건조시켰다. 용매를 감압 하에 제거하고, 컬럼 크로마토그래피(CHCl3/MeOH, 100:1)를 통해 조생성물을 담황색 고체(2.68g, 7.17mmol, 59%)로 얻었다.
MS (ESI-양성): m/z (%) = 375.2 (100, [M+H]+), 376.2 (23, [M+H]+), C20H26N2O5에 대해 계산됨: 374.18 [M].
1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ): δ [ppm] = 8.84 (d, J = 4.6 Hz, 1H), 8.24 (dd, J = 16.7, 2.8 Hz, 1H), 8.11 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.94 (d, J = 4.6 Hz, 1H), 7.43 (dd, J = 9.2, 2.8 Hz, 1H), 4.74 - 4.60 (m, 1H), 4.15 (t, J = 6.21 Hz, 2H), 4.03 (s, 3H), 3.27 - 3.16 (m, 2H), 1.95 - 1.86 (m, 2H), 1.78 - 1.67 (m, 2H), 1.42 (s, 9H).
Boc-Quino-COOH(6-(4-((tert-부톡시카보닐)아미노)부톡시)퀴놀린-4-카복실산)
Boc-Quino-COOMe(3.34g, 8.92mmol, 1.0eq.)를 1,4-디옥산(40mL)에 용해시켰다. 후속적으로, 1M LiOH(17.8mL, 17.84mmol, 2.0eq.)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 유기 용매를 감압 하에 제거한 후, 1M HCl을 사용하여 pH를 3.5로 설정하였다. 수용액을 EA(8 x 80mL)로 추출하고 합한 유기상을 Na2SO4로 건조시킨 다음 용매를 감압 하에 제거하였다. 담황색 고체(1.82g, 5.05mmol, 57%)를 얻었다.
MS (ESI-양성): m/z (%) = 261.1 (20, [M-Boc+H]+), 361.2 (100, [M+H]+), 362.2 (22, [M+H]+), C19H24N2O5에 대해 계산됨: 360.17 [M].
1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ): δ [ppm] = 8.86 (d, J = 4.5 Hz, 1H), 8.15 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 8.02 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 7.92 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 7.49 (dd, J = 9.2 Hz, 2.8 Hz, 1H), 6.87 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 4.10 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.00 (q, J = 6.6 Hz, 2H), 1.78 (q, J = 11.8, 6.5 Hz, 2H), 1.62 - 1.51 (m, 2H), 1.37 (s, 9H).
FAPi-NHBoc(tert-부틸 (S)-(4-((4-((2-(2-시아노-4,4-디플루오로피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카바모일)퀴놀린-6-일)옥시)부틸)카바메이트)
아르곤 하에, Boc-Quino-COOH(1.64g, 4.55mmol, 1.0eq.) 및 DIPEA(0.93mL, 5.46mmol, 1.2eq.)를 무수 DMF(16mL)에 용해시켰다. 그 후, HOBt(0.68g, 5.01mmol, 1.1eq.) 및 HBTU(1.90g, 5.01mmol, 1.1eq.)를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 후속적으로, 마찬가지로 무수 DMF(10mL)에 용해시키고 여기에 DIPEA(1.93ml, 11.38mmol, 2.5eq.)를 첨가한 Gly-Pro-CN을 첨가하고, 전체 반응 혼합물을 실온에서 추가로 1일 동안 교반하였다. 그 후, 용매를 진공에서 제거하고 잔류물을 EA에 용해시켰다. 유기상을 1M 시트르산, 포화 Na2CO3 및 염수로 세척하였다. 그런 다음, 수성상을 EA(3 x 100mL)로 추출하고 합친 유기 추출물을 Na2SO4로 건조하였다. 용매를 감압 하에 제거하고, 컬럼 크로마토그래피(CHCl3/MeOH, 100:3)를 통해 생성물을 무색 고체(1.74g, 3.27mmol, 72%)로 얻었다.
MS (ESI-양성): m/z (%) = 432.0 (33, [M-Boc+H]+), 476.1 (46, [M-tBu+H]+), 532.4 (100, [M+H]+), C26H31F2N5O5에 대해 계산됨: 531.23 [M]+.
1 H NMR (400 MHz, MeOD): δ [ppm] = 8.74 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 7.96 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 7.93 - 7.88 (m, 1H), 7.56 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 7.46 (dd, J = 9.3, 2.7 Hz, 1H), 5.15 (dd, J = 9.4, 3.1 Hz, 1H), 4.39 - 3.98 (m, 8H), 3.19 - 3.09 (m, 2H), 3.02 - 2.70 (m, 2H), 1.94 - 1.83 (m, 2H), 1.76 - 1.65 (m, 2H), 1.43 (s, 9H).
FAPi-NH 2 ((S)-6-(4-아미노부톡시)-N-(2-(2-시아노-4,4-디플루오로피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)퀴놀린-4-카복스아미드)
FAPi-NHBoc(531.6mg, 1.0mmol, 1.0eq)를 0℃에서 아르곤 하에 무수 아세토니트릴(10mL)에 용해시켰다. 이는 1,4-디옥산 중 4M HCl(5.0mL, 5.0mmol, 5.0eq)이었고, 천천히 실온으로 가온하였다. 3시간 후, 1,4-디옥산 중 4M HCl(2.5mL, 2.5mmol, 2.5eq)을 다시 한 번 첨가하고, 실온에서 추가로 4시간 후, 혼합물을 추가의 아세토니트릴(30mL)로 희석한 다음, 진공에서 완전히 농축하였다. 무색 고체(467mg, 1.0mmol, 100%)를 얻었다.
MS (ESI-양성): m/z (%) = 216.7 (100, [M+H]2+), 237.2 (27, [M+ACN+H]2+), 432.1 (22, [M+H]+), C21H23O5F2N5O3에 대해 계산됨: 431.18 [M]+.
1 H NMR (400 MHz, MeOD): δ [ppm] = 9.10 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 8.32 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 8.24 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 8.08 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 7.86 (dd, J = 9.4, 2.6 Hz, 1H), 5.15 (dd, J = 9.4, 3.1 Hz, 1H), 4.48 - 4.33 (m, 4H), 4.32 - 4.07 (m, 2H), 3.06 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.02 - 2.74 (m, 2H), 2.09 - 1.87 (m, 4H).
실시예 2: DOTA.Glu.(FAPi)
2
, DOTAGA.Glu.(FAPi)
2
, DATA
5m
.Glu.(FAPi)
2
표지 전구체 DOTA.Glu.(FAPi)2, DOTAGA.Glu.(FAPi)2 및 DATA5m.Glu.(FAPi)2의 합성에 대한 설명이 이어진다. 첫 번째 합성 단계는 세 가지 화합물 모두 동일하며, 대표적인 합성은 도식 11에 나와 있다.
도식 11: Glu(FAPi)2의 합성
Boc-Glu.(FAPi) 2 (tert-부틸 ((S)-1,5-비스((4-((4-((2-((S)-2-시아노-4,4-디플루오로피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카바모일)퀴놀린-6-일)옥시)부틸)아미노)-1,5-디옥소펜탄-2-일)카바메이트)
tert-부톡시카보닐-L-글루탐산(Boc-Glu-OH, 40mg, 162μmol, 1.0eq), 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBt, 55mg, 405μmol, 2.5eq) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC*HCl, 78mg, 405μmol, 2.5eq)을 무수 N,N-디메틸포름아미드(DMF, 4mL)에 용해시키고, N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA, 68.9μL, 405μmol, 2.5eq)을 첨가하고, 혼합물을 아르곤 분위기 하에 실온(RT)에서 90분 동안 교반하였다. 이어서, DMF(4mL) 중 FAPi-NH2*TFA(265mg, 486μmol, 3eq) 및 DIPEA(110μL, 648μmol, 4eq) 용액을 첨가하고, 실온에서 밤새 계속 교반하였다. HOBt(16mg, 121μmol, 0.75eq) 및 EDC*HCl(23mg, 121μmol, 0.75eq)을 추가로 첨가하고, 추가로 60분 후에 DMF(2mL) 중 FAPi-NH2*TFA(88mg, 162μmol, 1.0eq) 및 DIPEA(41.4μL, 243μmol, 1.5eq)의 다른 용액을 첨가하였다. 실온에서 밤새 계속 교반한 후, 용매를 진공에서 제거하였다. 컬럼 크로마토그래피(CHCl3/MeOH (100:10-15)) 후, 127mg(118μmol, 73%)의 Boc-Glu.(FAPi)2를 황색 오일로 얻었다.
LC-MS (ESI-양성): m/z (%) = 487.8 (100, [M-Boc+H]2+), 537.8 (73, [M+H]2+), 1074.4 (9, [M+H]+), 1075.4 (6, [M+H]+), C52H59F4N11O10에 대해 계산됨: 1073.44 [M]+.
Glu.(FAPi) 2 ((S)-2-아미노-N1,N5-비스(4-((4-((2-((S)-2-시아노-4,4-디플루오로피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카바모일)퀴놀린-6-일)옥시)부틸)펜탄디아미드)
Boc-Glu.(FAPi)2(127mg, 118μmol)에 50μL의 Milli-Q® 물, 50μL의 트리이소프로필실란(TIPS) 및 1.9mL의 TFA(TFA:TIPS:H2O(95:2.5:2.5))를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 후속적으로, 각각 약 10mL의 MeOH를 5x 첨가하고, 용매를 진공에서 다시 제거하여 황색 오일을 얻었다. 이를 추가의 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
LC-MS (ESI-양성): m/z (%) = 325.6 (100, [M-Boc+H]3+), 487.8 (28, [M+H]2+), 974.3 (5, [M+H]+), C47H51F4N11O8에 대해 계산됨: 973.39 [M]+.
도식 12: DOTA.Glu.(FAPi)2의 합성
표지 전구체 DOTA.Glu.(FAPi)2의 합성은 아래 도식 12에 나타나 있다.
DOTA(tBu) 3 -NHS(2,2',2''-(10-(2-((2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시)-2-옥소에틸)-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리일)트리아세트산 tert-부틸 에스테르)
DOTA-트리스(tert-부틸 에스테르)(129mg, 224μmol, 1.0eq) 및 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU, 87mg, 229μmol, 1.0eq)을 무수 ACN(5mL)에 용해시켰다. 혼합물을 아르곤 대기 하에 실온에서 75분 동안 교반한 후, N-하이드록시석신이미드(NHS, 31mg, 267μmol, 1.2eq)를 첨가하였다. 밤새 계속 교반한 후, HBTU(52.2mg, 138μmol, 0.6eq)를, 그리고 1시간 후 NHS(22mg, 191μmol, 0.85eq)를 첨가하고 혼합물을 추가로 1일 동안 교반하였다. 모든 용매를 진공에서 제거한 후, 컬럼 크로마토그래피(DCM:MeOH(100:15))를 수행하여 145mg(217μmol, 97%)의 DOTA(tBu)3-NHS를 무색 고체로 얻었다.
LC-MS (ESI-양성): m/z (%) = 335.7 (100, [M+H]2+), 670.4 (50, [M+H]+), 671.4 (18, [M+H]+), C32H55N5O10에 대해 계산됨: 669.39 [M]+.
DOTA(tBu) 3 .Glu.(FAPi) 2 (2,2',2''-(10-(2-(((S)-1,5-비스((4-((4-((2-((S)-2-시아노-4,4-디플루오로피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카바모일)퀴놀린-6-일)옥시)부틸)아미노)-1,5-디옥소펜탄-2-일)아미노)-2-옥소에틸)-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리일)트리아세트산 tert-부틸 에스테르)
DOTA(tBu)3-NHS(40mg, 60μmol, 1.2eq)를 Glu.(FAPi)2(48.7mg, 50μmol, 1.0eq)와 함께 무수 DMF(2mL)에 용해시키고, DIPEA(200μL)를 첨가하였다. 혼합물을 아르곤 분위기 하에 40℃에서 1일 동안 교반한 후, 모든 용매를 진공에서 완전히 제거하였다. 황색 오일을 얻었고, 추가의 정제 없이 다음 단계에 바로 사용하였다.
HPLC-MS (ESI-양성): m/z (%) = 382.95 (22, [M+H]4+), 383.20 (19, [M+H]4+), 491.57 (34, [M-tBu+H]3+), 491.90 (28, [M-tBu+H]3+), 492.24 (13, [M-tBu+H]3+), 510.26 (100, [M+H]3+), 510.59 (90, [M+H]3+), 510.93 (44, [M+H]3+), 511.26 (14, [M+H]3+), 764.88 (42, [M+H]2+), 765.38 (37, [M+H]2+), 765.89 (17, [M+H]2+), 1528.76 (25, [M+H]+), 1529.76 (22, [M+H]+), 1530.77 (10, [M+H]+), C75H101F4N15O15에 대해 계산됨: 1527.75 [M]+.
DOTA.Glu.(FAPi) 2 (2,2',2''-(10-(2-(((S)-1,5-비스((4-((4-((2-((S)-2-시아노-4,4-디플루오로피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카바모일)퀴놀린-6-일)옥시)부틸)아미노)-1,5-디옥소펜탄-2-일)아미노)-2-옥소에틸)-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리일)트리아세트산)
DOTA(tBu)3.Glu.(FAPi)2에 50μL의 Milli-Q® 물, 50μL의 TIPS 및 1.9mL의 TFA(TFA:TIPS:H2O(95:2.5:2.5))를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 8시간 동안 교반하였다. 이어서, 매회 약 10mL의 MeOH를 4x 첨가하고, 용매를 진공에서 다시 제거하였다. 조 생성물을 반제조용 RP-HPLC(16분 내에 22-23%의 ACN, tR = 14 내지 15분)로 정제하였다. 19.9mg(14.6μmol, 29%)의 황색 고체를 얻었다.
LC-MS (ESI-양성): m/z (%) = 340.85 (42, [M+H]4+), 351.00 (57, [M+ACN+H]4+), 361.35 (13, [M+2ACN+H]4+), 454.15 (100, [M+H]3+), 468.00 (20, [M+ACN+H]3+), 680.85 (9, [M+H]2+), C63H77F4N15O15에 대해 계산됨: 1359.57 [M]+.
[
nat
Lu]Lu-DOTA.Glu.(FAPi)
2
DOTA.Glu.(FAPi)2(2.8mg, 2.0μmol, 1.0eq)를 500μL의 1M HEPES 완충액(pH = 5.5)에 용해시키고, 40μL의 0.1M LuCl3 용액(4μmol, 2.0eq)을 첨가하고, 혼합물을 90℃에서 4시간 동안 진탕시켰다. 후속적인 반제조용 RP-HPLC(20분 내 20-25% ACN, tR = 14 내지 15분)를 통해 0.7mg(0.46μmol, 23%)의 [natLu]Lu-DOTA.Glu.(FAPi)2를 황색 고체로 제공하였다.
LC-MS (ESI-양성): m/z (%) = 511.55 (100, [M+H]3+), 766.75 (14, [M+H]2+), C63H74F4LuN15O15에 대해 계산됨: 1531.48 [M]+.
[
68
Ga]Ga-DOTA.Glu.(FAPi)
2
100MBq [68Ga]GaCl3의 초기 충전물에 400μL의 1M HEPES 완충액(pH = 4.5 또는 5.5) 및 5 내지 20nmol의 DOTA.Glu.(FAPi)2 용액(Trace-Select H2O를 함유한 1μmol/mL 스톡 용액 5 내지 20μL)을 95℃에서 첨가한 다음, 혼합물을 30분 동안 진탕시켰다. 각각의 몰량(5, 10 및 20nmol)에 대해 적어도 3회(n = 3) 표지를 수행하고, 이동상으로 0.1M Na3 시트르산나트륨 완충액(pH = 4.0)을 사용하여 방사성-TLC를 통해 매번 분석하였다(도 1 참조). 또한, 1M AmOAc(pH = 4)/MeOH(1:1)를 사용하는 방사성-TLC 및 분석용 방사성-HPLC(도 2)와의 비교를 통해 일관성을 검사하였다. >98%의 높은 방사화학적 전환율을 달성할 수 있었다. HS 및 PBS 중에서 2시간 후의 안정성은 98% 초과이다(도 3 참조). logD 값은 -2.08±0.07로 측정되었다.
[
177
Lu]Lu-DOTA.Glu.(FAPi)
2
20 내지 40μL의 0.04M HCl 중 50 내지 100MBq [177Lu]LuCl3의 초기 충전물에 400μL의 1M HEPES 완충액(pH = 5.5) 및 2 내지 5nmol의 DOTA.Glu.(FAPi)2(Trace-Select H2O가 포함된 1μmol/mL 스톡 용액 2 내지 5μL) 용액을 95℃에서 첨가한 후, 혼합물을 60분 동안 진탕하였다. 표지를 반복하여 수행하였으며(n = 3(50MBq), n = 2(100MBq)), 이동상으로 0.1M Na3 시트레이트 완충액(pH = 4.0)을 사용하여 각각의 경우에 방사성-TLC를 전개하고 평가하여 분석하였다(도 4 참조). 또한, 1M AmOAc(pH = 4)/MeOH(1:1)을 사용하는 방사성-TLC 및 분석용 방사성-HPLC와의 비교를 통해 일관성을 검사하였다(도 5). >99%의 높은 방사화학적 전환율을 달성할 수 있었다. 14일 후 안정성은 HS 중에서 약 99%, PBS 중에서 95%이다(도 6 참조). logD 값은 1.77±0.10으로 측정되었다.
표지 전구체 DOTAGA.Glu.(FAPi)2의 합성은 아래 도식 12에 나타나 있다.
도식 12: DOTAGA.Glu.(FAPi)2의 합성
DOTAGA(tBu) 4 .Glu.(FAPi) 2 (2,2',2''-(10-(5-(((S)-1,5-비스((4-((4-((2-((S)-2-시아노-4,4-디플루오로피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카바모일)퀴놀린-6-일)옥시)부틸)아미노)-1,5-디옥소펜탄-2-일)아미노)-1-(tert-부톡시)-1,5-디옥소펜탄-2-일)-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리일)트리아세트산 tert-부틸 에스테르)
DOTAGA(tBu)4(60mg, 85.6μmol, 1.0eq) 및 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HATU, 36mg, 94.2μmol, 1.1eq)를 아르곤 분위기 하에 무수 DMF(2mL)에 용해시키고, DIPEA(17.5μL, 103μmol, 1.2eq)를 첨가하였다. 30℃에서 1시간 후, 무수 DMF(3mL) 중 Glu.(FAPi)2(104mg, 107μmol, 1.25eq) 및 DIPEA(43.7μL, 257μmol, 3eq) 용액을 첨가하였다. 혼합물을 30℃에서 밤새 교반한 후, HATU(16mg, 42μmol, 0.5eq)를 다시 첨가하였다. 추가로 1일 동안 30℃에서 교반한 후, 용매를 진공에서 제거하였다. 컬럼 크로마토그래피(CHCl3:MeOH:트리에틸아민(TEA)(100:10 내지 15:1))로 정제하여 39mg(23.5μmol, 27%)의 DOTAGA(tBu)4.Glu.(FAPi)2를 황색 오일로 제공하였다.
HPLC-MS (ESI-양성): m/z (%) = 414.97 (13, [M+H]4+), 415.22 (12, [M+H]4+), 552.95 (100, [M+H]3+), 553.29 (97, [M+H]3+), 553.62 (51, [M+H]3+), 553.96 (18, [M+H]3+), 828.93 (82, [M+H]2+), 829.43 (78, [M+H]2+), 829.93 (40, [M+H]2+), 830.43 (15, [M+H]2+), 1656.85 (87, [M+H]+), 1657.85 (85, [M+H]+), 1658.85 (43, [M+H]+), 1659.86 (15, [M+H]+), C82H113F4N15O17에 대해 계산됨: 1655.84 [M]+.
DOTAGA.Glu.(FAPi) 2 (2,2',2''-(10-(4-(((S)-1,5-비스((4-((4-((2-((S)-2-시아노-4,4-디플루오로피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카바모일)퀴놀린-6-일)옥시)부틸)아미노)-1,5-디옥소펜탄-2-일)아미노)-1-카복시-4-옥소부틸)-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리일)트리아세트산)
DOTAGA(tBu)4.Glu.(FAPi)2에 50μL의 Milli-Q® 물, 50μL의 TIPS 및 1.9mL의 TFA(TFA:TIPS:H2O(95:2.5:2.5))를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 7시간 동안 교반하였다. 이어서, MeOH를 매회 약 10mL씩 5x 첨가하고, 용매를 진공에서 다시 제거하였다. 조 생성물을 반제조용 RP-HPLC(23% ACN 등용매, tR = 10 내지 10.5분)로 정제하였다. 16.4mg(11.5μmol, 49%)의 황색 고체를 얻었다.
LC-MS (ESI-양성): m/z (%) = 358.85 (65, [M+H]4+), 369.05 (24, [M+ACN+H]4+), 478.30 (100, [M+H]3+), 717.30 (6, [M+H]2+), 1432.40 (1, [M+H]+), 1454.70 (1, [M+Na]+), C66H81F4N15O17에 대해 계산됨: 1431.59 [M]+.
[
nat
Lu]Lu-DOTAGA.Glu.(FAPi)
2
DOTAGA.Glu.(FAPi)2(2.8mg, 2.0μmol, 1.0eq)를 550μL의 1M HEPES 완충액(pH = 5.5) 및 50μL의 EtOH에 용해시키고, 40μL의 0.1M LuCl3 용액(4μmol, 2.0eq)을 첨가하고 혼합물을 90℃에서 4시간 동안 진탕시켰다. 후속적인 반제조용 RP-HPLC(23% ACN 등용매, tR = 13 내지 14분)로 0.5mg(0.31μmol, 16%)의 [natLu]Lu.DOTAGA.Glu.(FAPi)2를 황색 고체로 생성하였다.
LC-MS (ESI-양성): m/z (%) = 535.50 (100, [M+H]3+), 802.95 (36, [M+H]2+), C66H78F4LuN15O17에 대해 계산됨: 1603.50 [M]+.
[
68
Ga]Ga-DOTAGA.Glu.(FAPi)
2
0.05M HCl 중 100 또는 400MBq [68Ga]GaCl3의 초기 충전물(0.5 또는 2mL)에 0.5 또는 2mL의 1M HEPES 완충액(pH = 4.5) 및 10 내지 40nmol의 DOTAGA.Glu.(FAPi)2(Trace-Select H2O를 함유한 1μmol/mL 스톡 용액 10 내지 40μL)를 95℃에서 첨가한 다음 혼합물을 30분 동안 진탕시켰다. 표지를 반복적으로 수행하였으며(n = 4(100MBq), n = 2(400MBq)), 반응 키네틱은 이동상으로 0.1M Na3 시트레이트 완충액(pH = 4.0)을 사용하는 방사성-TLC를 통해 각각의 경우에 조사되었다(도 7 참조). 또한, 1M AmOAc(pH = 4)/MeOH(1:1)을 사용하는 방사성-TLC 및 분석용 방사성-HPLC와의 비교를 통해 일관성을 검사하였다(도 8). >97%의 높은 방사화학적 전환율을 달성할 수 있었다. HS 및 PBS 중에서 2시간 후의 안정성은 95% 초과이다(도 9 참조). logD 값은 -2.48±0.05로 측정되었다.
[
177
Lu]Lu-DOTAGA.Glu.(FAPi)
2
20 내지 40μL의 0.04M HCl 중 50 내지 100MBq [177Lu]LuCl3의 초기 충전물에 400μL의 1M HEPES 완충액(pH = 5.5) 및 1 내지 5nmol의 DOTAGA.Glu.(FAPi)2(Trace-Select H2O가 함유된 1μmol/mL 스톡 용액 1 내지 5μL) 용액을 95℃에서 첨가한 후 혼합물을 60분 동안 진탕하였다. 이동상으로 0.1M Na3 시트레이트 완충액(pH = 4.0)을 사용하여 방사성-TLC를 전개하고 평가하여 반응 키네틱을 검사하였다(표지 수: n = 3(50MBq), n = 1 내지 2(100MBq)(도 10 참조). 또한, 1M AmOAc(pH = 4)/MeOH(1:1)을 사용하는 방사성-TLC 및 분석용 방사성-HPLC(도 11)와의 비교를 통해 일관성을 검사하였다. >99%의 높은 방사화학적 전환을 달성할 수 있었다. 14일 후의 안정성은 HS 및 PBS 중에서 >99%였다(도 12 참조). logD 값은 2.77±0.10으로 측정되었다.
[
225
Ac]Ac-DOTAGA.Glu.(FAPi)
2
100μL의 0.04M HCl 중 1.6 내지 3.2MBq의 [225Ac]AcCl3의 초기 충전물에 1mL의 0.1M 나트륨 아스코르베이트(pH = 7.0) 및 30nmol/MBq의 DOTAGA.Glu.(FAPi)2(Trace-Select H2O를 함유한 30μl/MBq 1μmol/mL 스톡 용액)를 95℃에서 첨가한 후 혼합물을 60분 동안 진탕하였다. 표지는 3회 수행하였으며(n = 3), 반응 키네틱을 조사하였다. 이를 위해, 이동상으로 0.1M Na3 시트레이트 완충액(pH = 4.0)을 사용하는 방사성-TLC(도 13 참조)를 상이한 시간(1시간 및 1일) 동안 전개하고 노출하였다. 15분 후에 >94.3±2.1%(1일 후 노출)의 높은 방사화학적 전환율이 관찰되었다. SepPak® Light C18 카트리지를 사용한 후속 정제를 통해 방사화학적 순도가 높은(>98%, HPGe 검출기를 사용한 방사성-TLC 및 고해상도 감마 분광법을 통해 측정됨)의 생성물을 궁극적으로 얻었다.
[225Ac]Ac-DOTAGA.Glu.(FAPi)2의 안정성 측정을 위해 350 내지 400kBq의 표지 용액을 HS 및 PBS(각각의 경우 n = 3)에 첨가하고 37℃에서 20일간 인큐베이션하였다(도 14 참조).
표지 전구체 DATA5m.Glu.(FAPi)2의 합성은 아래 도식 13에 표시되어 있다.
도식 13: DATA5m.Glu.(FAPi)2의 합성
DATA 5m (tBu) 3 .Glu.(FAPi) 2 (2,2'-(6-(5-(((S)-1,5-비스((4-((4-((2-((S)-2-시아노-4,4-디플루오로피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카바모일)퀴놀린-6-일)옥시)부틸)아미노)-1,5-디옥소펜탄-2-일)아미노)-5-옥소펜틸)-6-((2-(tert-부톡시)-2-옥소에틸)(메틸)아미노)-1,4-디아제판-1,4-디일)디아세트산 tert-부틸 에스테르)
DATA5m(tBu)3(22.8mg, 40μmol, 1.0eq) 및 HATU(17.5mg, 46μmol, 1.15eq)를 무수 DMF(1mL)에 용해시키고, DIPEA(8.5μL, 50μmol, 1.25eq)를 첨가하였다. 아르곤 분위기 하에 25℃에서 1시간 후 무수 DMF(2mL) 중 Glu.(FAPi)2(39mg, 40μmol, 1.0eq) 및 DIPEA(17μL, 100μmol, 2.5eq) 용액을 첨가하였다. 25℃에서 2시간 동안 계속 교반하였다. 용매를 진공에서 제거하고, 컬럼 크로마토그래피(CHCl3:MeOH:트리에틸아민(TEA)(100:10-15:1))로 후속적으로 정제하여 60mg(39.2μmol, 98%)의 황색 오일을 얻었다.
LC-MS (ESI-양성): m/z (%) = 510.0 (100, [M+H]3+), 764.5 (24, [M+H]2+), C76H102F4N14O15에 대해 계산됨: 1526.76 [M]+.
DATA 5m .Glu.(FAPi) 2 (2,2'-(6-(5-(((S)-1,5-비스((4-((4-((2-((S)-2-시아노-4,4-디플루오로피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카바모일)퀴놀린-6-일)옥시)부틸)아미노)-1,5-디옥소펜탄-2-일)아미노)-5-옥소펜틸)-6-((카복시메틸)(메틸)아미노)-1,4-디아제판-1,4-디일)디아세트산)
DATA5m(tBu)3.Glu.(FAPi)2에 25μL의 Milli-Q® 물, 25μL의 TIPS 및 950μL의 TFA(TFA:TIPS:H2O(95:2.5:2.5))를 첨가하고 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 교반하였다. 후속적으로, 매회 약 10mL의 MeOH를 3x 첨가하고, 용매를 진공에서 다시 제거하였다. 조 생성물을 반제조용 RP-HPLC(23% ACN 등용매, tR = 13 내지 13.5분)로 정제하였다. 8.2mg(6.0μmol, 15%)의 황색 고체를 얻었다.
LC-MS (ESI-양성): m/z (%) = 340.7 (6, [M+H]4+), 454.0 (100, [M+H]3+), 680.4 (48, [M+H]2+), 706.8 (47, [M+Fe]2+), 707.3 (35, [M+Fe]2+), 1359.5 (6, [M+H]+), 1360.5 (5, [M+H]+), C64H78F4N14O15에 대해 계산됨: 1358.57 [M]+.
[
68
Ga]Ga-DATA
5m
.Glu.(FAPi)
2
50MBq [68Ga]GaCl3의 초기 충전물에 400μL의 0.5M HEPES 완충액(pH = 5.5) 및 10 내지 20nmol의 DOTA.Glu.(FAPi)2(Trace-Select H2O가 포함된 1μmol/mL 저장 용액 10 내지 20μL)를 실온에서 첨가한 후 30분 동안 진탕하였다. 표지는 몰량 둘 다에 대해 4회(n = 4) 수행하였으며, 이동상으로서 0.1M Na3 시트레이트 완충액(pH = 4.0)을 사용하여 방사성-TLC를 통해 분석하였다(도 15 참조). 또한, 1M AmOAc(pH = 4)/MeOH(1:1)을 사용하는 방사성-TLC와 분석용 방사성-HPLC의 비교를 통해 일관성을 검사하였다(도 16). >96%의 높은 방사화학적 전환율이 달성되었다. HS 및 PBS 중에서 2시간 후의 안정성은 >97%이다(도 17 참조). logD 값은 -2.03±0.05로 측정되었다.
표 1은 실험적으로 측정된 logD 값을 요약한다.
시험관내 연구:
FAP:
IC50 측정은 Z-Gly-Pro-7-아미노-4-메틸쿠마린(AMC)을 기질로 50μM 농도로 사용하여 pH = 8(0.05M Tris-HCl 완충액, 1mg/mL의 소 혈청 알부민(BSA) 및 140mM NaCl)에서 수행하였다. 검사된 FAP 억제제의 8개 농도를 항상 동일한 DMSO 농도로 검사하였다. Z-Gly-Pro-AMC 기질을 첨가하기 전에 억제제를 37℃에서 15분 동안 사전 인큐베이션하였다. AMC의 방출 키네틱은 여기 파장 λex = 380nm 및 방출 파장 λem = 465nm에서 적어도 10분 동안 측정하였다.
PREP:
IC50 측정은 기질로서 N-석시닐-Gly-Pro-AMC를 250μM의 농도로 사용하여 pH = 7.4(0.1M K 포스페이트 완충액, 1mM EDTA, 1mM DTT 및 1mg/mL BSA)에서 수행하였다. 검사된 FAP 억제제의 8개 농도를 항상 동일한 DMSO 농도로 검사하였다. N-석시닐-Gly-Pro-AMC 기질을 첨가하기 전에 억제제를 37℃에서 15분 동안 사전 인큐베이션하였다. AMC의 방출 키네틱은 여기 파장 λex = 380nm 및 방출 파장 λem = 465nm에서 적어도 10분 동안 측정하였다.
DPP4, DPP8 및 DPP9:
IC50 측정은 기질로서 Ala-Pro-p-니트로아닐라이드(pNA)를 25μM(DPP4), 300μM(DPP8) 또는 150μM(DPP9) 농도로 사용하여 pH = 7.4에서(0.1% Tween-20, 1mg/mL BSA 및 150mM NaCl을 포함하는 0.05M HEPES-NaOH 완충액) 수행하였다. 검사된 FAP 억제제의 적어도 8가지 농도를 항상 동일한 DMSO 농도로 검사하였다. Ala-Pro-pNA 기질을 첨가하기 전에 억제제를 37℃에서 15분 동안 사전 인큐베이션하였다. pNA의 방출 키네틱은 λex = 405nm의 파장에서 적어도 10분 동안 측정하였다.
표 2는 IC50 측정 결과를 요약한 것이다. 선택성 지수(SI)는 FAP의 IC50 값과 해당 경쟁 효소(PREP, DPP4, DPP8 및 DPP9)의 비로 구한다.
실시예 3: DOTA.NPyr.(FAPi)
2
, DOTAGA.NPyr.(FAPi)
2
표지 전구체 DOTA.NPyr.(FAPi)2, DOTAGA.NPyr.(FAPi)2의 합성에 대한 설명이 이어진다. 첫 번째 합성 단계는 화합물 둘 다에 대해 동일하며, 대표적인 합성이 도식 14에 나와 있다.
도식 14: NPyr.(FAPi)2의 합성
Boc-NPyr(OBzl) 2 ((S)-2,2'-((1-(tert-부톡시카보닐)피롤리딘-3-일)아잔디일)디아세트산 벤질 에스테르)
(S)-1-Boc-3-아미노피롤리딘(1.07g, 5.74mmol, 1.0eq) 및 DIPEA(1.5mL)를 먼저 아세토니트릴(6mL)에 충전하였다. 60분 후, 아세토니트릴(6mL) 중 벤질 브로모아세테이트(1.74g, 7.55mmol, 1.3eq) 용액을 천천히 적가하고, 혼합물을 실온에서 추가로 2시간 동안 교반하였다. 아세토니트릴을 감압 하에 제거하였다. 후속적인 컬럼 크로마토그래피(CHCl3:MeOH(30:1) + 1% TEA)를 수행하여, 부산물로서 Boc-NPyr(OBzl)2(1.31g, 2.71mmol, 47%)를 Boc-NPyr-OBzl(벤질-(벤질-(S)-N-(피롤리딘-3-tert-부톡시카바메이트)글리신, 680mg, 2.03mmol, 35%)과 함께 제공하였다.
LC-MS (ESI-양성): m/z (%) = 383.2 (45, [M-Boc+H]+), 483.2 (100, [M+H]+), 484.2 (30, [M+H]+), C27H34N2O6에 대해 계산됨: 482.24 [M]+.
Boc-NPyr((S)-2,2'-((1-(tert-부톡시카보닐)피롤리딘-3-일)아잔디일)디아세트산)
Boc-NPyr(OBzl)2(1.21g, 2.51mmol, 1.0eq)에 활성탄상 팔라듐(10wt% Pd, 53mg, 50μmol, 0.02eq) 및 무수 메탄올(8mL)을 첨가하였다. 혼합물을 수소 분위기 하에 실온에서 2일 동안 교반하였다. 혼합물을 셀라이트를 통해 여과한 후, 메탄올을 감압 하에 제거하였다. 무색 고체가 얻어졌다(643mg, 2.13mmol, 85%).
LC-MS (ESI-양성): m/z (%) = 247.0 (100, [M-tBu+H]+), 303.1 (36, [M+H]+), 605.3 (23, [2M+H]+), C13H22N2O6에 대해 계산됨: 302.15 [M]+.
Boc-NPyr.(FAPi) 2 (tert-부틸 (S)-3-(비스(2-((4-((4-((2-((S)-2-시아노-4,4-디플루오로피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카바모일)퀴놀린-6-일)옥시)부틸)아미노)-2-옥소에틸)아미노)피롤리딘-1-카복실레이트)
Boc-NPyr(30.2mg, 100μmol, 1.0eq), HOBt(36mg, 266μmol, 2.7eq) 및 EDC*HCl(50mg, 260μmol, 2.6eq)을 아르곤 분위기 하에 30℃에서 60분 동안 무수 DMF(3mL)에 용해시키고 교반하였다. 그런 다음 DMF(2mL) 중 FAPi-NH2*TFA(110mg, 202μmol, 2.0eq) 및 DIPEA(51.0μL, 300μmol, 3.0eq) 용액을 첨가하고, 혼합물을 30℃에서 3.5시간 동안 계속 교반하였다. 그런 다음 HOBt(8.5mg, 63μmol, 0.63eq) 및 EDC*HCl(12mg, 63μmol, 0.63eq)을 첨가하고, 30분 후에 DMF(1mL) 중 FAPi-NH2*TFA(25mg, 46μmol, 0.46eq) 및 DIPEA(17.0μL, 100μmol, 1.0eq) 용액을 첨가하였다. 30℃에서 밤새 교반한 후, HOBt(8.5mg, 63μmol, 0.63eq), EDC*HCl(12mg, 63μmol, 0.63eq)를, 그리고 추가로 30분 후 DMF(1mL) 중 FAPi-NH2*TFA(16mg, 29μmol, 0.29eq) 및 DIPEA(17.0μL, 100μmol, 1.0eq)의 첨가를 반복하였다. 혼합물을 30℃에서 추가로 5시간 동안 교반한 후, 용매를 진공에서 제거하였다. 컬럼 크로마토그래피(CHCl3:MeOH:TEA(100:7.5-10:1)) 후 102mg(90.3μmol, 90%)의 Boc-NPyr.(FAPi)2를 황색 오일로 얻었다.
LC-MS (ESI-양성): m/z (%) = 358.6 (86, [M-tBu+H]3+), 372.2 (58, [M-tBu+ACN+H]3+), 377.3 (100, [M+H]3+), 390.3 (68, [M+ACN+H]3+), 515.3 (36, [M-Boc+H]2+), 537.5 (8, [M-tBu+H]2+), 565.5 (84, [M+H]2+), 1129.6 (28, [M+H]+), 1130.6 (17, [M+H]+), C55H64F4N12O10에 대해 계산됨: 1128.48 [M]+.
NPyr.(FAPi) 2 (6,6'-((((2,2'-(((S)-피롤리딘-3-일)아잔디일)비스(아세틸))비스(아잔디일))비스(부탄-4,1-디일))비스(옥시))비스(N-(2-((S)-2-시아노-4,4-디플루오로피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)퀴놀린-4-카복스아미드)
Boc-NPyr.(FAPi)2(102mg, 90μmol)에 50μL의 Milli-Q® 물, 50μL의 트리이소프로필실란(TIPS) 및 1.9mL의 TFA(TFA:TIPS:H2O(95:2.5:2.5))를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 후속적으로, MeOH를 매회 약 10mL씩 5x 첨가하고, 용매를 진공에서 다시 제거하여 황색 오일을 얻었다. 이를 추가의 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
LC-MS (ESI-양성): m/z (%) = 344.1 (100, [M+H]3+), 357.6 (45, [M+ACN+H]3+), 515.5 (18, [M+H]2+), 1029.5 (3, [M+H]+), C50H56F4N12O8에 대해 계산됨: 1028.43 [M]+.
표지 전구체 DOTA.NPyr.(FAPi)2의 합성은 아래 도식 15에 나타나 있다.
도식 15: DOTA.NPyr.(FAPi)2의 합성
DOTA(tBu) 3 .NPyr.(FAPi) 2 (2,2',2''-(10-(2-((S)-3-(비스(2-((4-((4-((2-((S)-2-시아노-4,4-디플루오로피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카바모일)퀴놀린-6-일)옥시)부틸)아미노)-2-옥소에틸)아미노)피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리일)트리아세트산 tert-부틸 에스테르)
DOTA(tBu)3-NHS(33.5mg, 50μmol, 1.25eq)를 NPyr.(FAPi)2(41.2mg, 40μmol, 1.0eq)와 함께 무수 DMF(1mL)에 용해시키고 및 DIPEA(50μL)를 첨가하였다. 혼합물을 아르곤 분위기 하에 40℃에서 3일 동안 교반한 후, 모든 용매를 진공에서 완전히 제거하였다. 황색 오일을 얻었고, 추가의 정제 없이 다음 단계에 바로 사용하였다.
HPLC-MS (ESI-양성): m/z (%) = 396.71 (35, [M+H]4+), 396.96 (33, [M+H]4+), 397.21 (15, [M+H]4+), 509.92 (48, [M-tBu+H]3+), 510.25 (42, [M-tBu+H]3+), 510.59 (20, [M-tBu+H]3+), 528.61 (100, [M+H]3+), 528.94 (95, [M+H]3+), 529.27 (50, [M+H]3+), 529.61 (17, [M+H]3+), 792.40 (30, [M+H]2+), 792.91 (28, [M+H]2+), 793.41 (13, [M+H]2+), 1583.80 (18, [M+H]+), 1584.81 (17, [M+H]+), 1585.81 (8, [M+H]+), 1605.79 (8, [M+Na]+), 1606.79 (8, [M+Na]+), C78H106F4N16O15에 대해 계산됨: 1582.80 [M]+.
DOTA.NPyr.(FAPi) 2 (2,2',2''-(10-(2-((S)-3-(비스(2-((4-((4-((2-((S)-2-시아노-4,4-디플루오로피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카바모일)퀴놀린-6-일)옥시)부틸)아미노)-2-옥소에틸)아미노)피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리일)트리아세트산)
DOTA(tBu)3.NPyr.(FAPi)2에 50μL의 Milli-Q® 물, 50μL의 TIPS 및 1.5mL의 TFA(TFA:TIPS:H2O(94:3:3))를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 후속적으로, MeOH를 매회 약 10mL씩 4x 첨가하고, 용매를 진공에서 다시 제거하였다. 조 생성물을 반제조용 RP-HPLC(20분 내에 21-22% ACN, tR = 18.5 내지 19.5분)로 정제하였다. 5.6mg(4.0μmol, 10%)의 황색 고체를 얻었다.
LC-MS (ESI-양성): m/z (%) = 354.55 (95, [M+H]4+), 364.750 (59, [M+ACN+H]4+), 472.60 (100, [M+H]3+), 708.55 (13, [M+H]2+), 1415.50 (5, [M+H]+), C66H82F4N16O15에 대해 계산됨: 1414.61 [M]+.
표지 전구체 DOTAGA.NPyr.(FAPi)2의 합성은 아래 도식 16에 나타나 있다.
도식 16: DOTAGA.NPyr.(FAPi)2의 합성
DOTAGA(tBu) 4 .NPyr.(FAPi) 2 (2,2',2''-(10-(5-((S)-3-(비스(2-((4-((4-((2-((S)-2-시아노-4,4-디플루오로피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카바모일)퀴놀린-6-일)옥시)부틸)아미노)-2-옥소에틸)아미노)피롤리딘-1-일)-1-(tert-부톡시)-1,5-디옥소펜탄-2-일)-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리일)트리아세트산 tert-부틸 에스테르)
DOTAGA(tBu)4(23.5mg, 33.5μmol, 1.0eq), NHS(8.0mg, 70μmol, 2.0eq) 및 HBTU(26.5mg, 70μmol, 2.0eq)를 무수 DMF(0.5mL)에 용해시키고 30℃에서 밤새 진탕하였다. NHS(4.5mg, 39.0μmol, 1.26eq) 및 HBTU(13.5mg, 35.6μmol, 1.06eq)를 다시 한 번 첨가하였다. 4시간 후, 무수 DMF(1mL) 중 NPyr.(FAPi)2(41.2mg, 40μmol, 1.0eq) 및 DIPEA(50μL) 용액을 첨가하였다. 혼합물을 40℃에서 3일 동안 교반한 후, 모든 용매를 진공에서 완전히 제거하였다. 황색 오일이 얻어졌고, 추가의 정제 없이 다음 단계에 바로 사용하였다.
HPLC-MS (ESI-양성): m/z (%) = 428.73 (100, [M+H]4+), 428.98 (32, [M+H]4+), 429.23 (25, [M+H]4+), 571.64 (16, [M+H]3+), 571.97 (10, [M+H]3+), 856.45 (5, [M+H]2+), 856.95 (5, [M+H]2+), 1711.89 (2, [M+H]+), 1712.89 (2, [M+H]+), 1733.87 (2, [M+Na]+), 1734.87 (2, [M+Na]+), C85H118F4N16O17에 대해 계산됨: 1710.88 [M]+.
DOTAGA.NPyr.(FAPi) 2 (2,2',2''-(10-(4-((S)-3-(비스(2-((4-((4-((2-((S)-2-시아노-4,4-디플루오로피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카바모일)퀴놀린-6-일)옥시)부틸)아미노)-2-옥소에틸)아미노)피롤리딘-1-일)-1-카복시-4-옥소부틸)-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리일)트리아세트산)
DOTA(tBu)3.NPyr.(FAPi)2에 50μL의 Milli-Q® 물, 50μL의 TIPS 및 1.9mL의 TFA(TFA:TIPS:H2O(95:2.5:2.5))를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 8시간 동안 교반하였다. 후속적으로, MeOH를 매회 약 10mL씩 4x 첨가하고, 용매를 진공에서 다시 제거하였다. 조 생성물을 반제조용 RP-HPLC(21% ACN 등용매, tR = 23 내지 24분)로 정제하였다. 3.0mg(2.0μmol, 6%)의 황색 고체를 얻었다.
LC-MS (ESI-양성): m/z (%) = 372.55 (100, [M+H]4+), 382.90 (38, [M+ACN+H]4+), 496.60 (76, [M+H]3+), 744.40 (5, [M+H]2+), C69H86F4N16O17에 대해 계산됨: 1486.63 [M]+.
실시예 4: DOTA.PEG2.Glu.(FAPi)
2
, DOTAGA.PEG2.Glu.(FAPi)
2
표지 전구체 DOTA.PEG2.Glu.(FAPi)2, DOTAGA.PEG2.Glu.(FAPi)2의 합성에 대한 설명이 이어진다. 첫 번째 합성 단계는 화합물 둘 다에 대해 동일하며, 대표적인 합성이 도식 17에 나와 있다.
도식 17: PEG2.Glu.(FAPi)2의 합성
Fmoc-PEG2.Glu(OBzl) 2 ((1-(9H-플루오렌-9-일)-3-옥소-2,7,10-트리옥사-4-아자트리데칸-13-오일)-L-글루탐산 디벤질 에스테르)
Fmoc-N-아미도-dPEG2 산(450.0mg, 1.1mmol, 1.00eq.) 및 DIPEA(182.0mg, 240μL, 1.4mmol, 1.25eq.)를 무수 DMF(9.0mL)에 용해시키고, HBTU(470.3mg, 1.2mmol, 1.10eq.) 및 HOBt(167.6mg, 1.2mmol, 1.10eq.)를 첨가하였다. 무색 용액을 아르곤 분위기 하에 25℃에서 24시간 동안 교반하였다. 1시간 후, 무수 DMF(3.0mL)에 용해된 디벤질 글루타메이트(460.6mg, 1.4mmol, 1.25eq.) 및 DIPEA(320.5mg, 422μL, 4.5mmol, 2.20eq.)를 첨가하였다. 반응이 종료된 후, 용매를 감압 하에 제거하고 황색 오일을 컬럼 크로마토그래피(DCM:MeOH(100:2))로 정제하였다. Fmoc-PEG2.Glu(OBzl)2(795.1mg, 1.1mmol, 99%)를 무색 오일로 얻었다.
LC-MS (ESI-양성): m/z (%) = 709.4 (100, [M+H]+), 710.2 (15, [M+H]+), C41H44N2O9에 대해 계산됨: 708.30 [M]+.
Fmoc-PEG2.Glu((1-(9H-플루오렌-9-일)-3-옥소-2,7,10-트리옥사-4-아자트리데칸-13-오일)-L-글루탐산)
Fmoc-PEG2.Glu(OBzl)2(196.4mg, 0.3mmol, 1.00eq.)를 무수 테트라하이드로푸란(THF)(2.0mL) 및 활성탄 상 팔라듐(10wt% Pd, 30.0mg, 0.3mmol, 1.00eq.)을 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 수소 분위기 하에 24시간 동안 교반하였다. 현탁액을 셀라이트를 통해 여과하고, 잔류물을 THF로 세척한 후, 용매를 감압 하에 제거하였다. Fmoc-PEG2.Glu(122.2mg, 231.3μmol, 82%)를 무색 오일로 얻었고, 추가의 후작업 없이 다음 단계에서 사용하였다.
LC-MS (ESI-양성): m/z (%) = 529.25 (100, [M+H]+), 530.15 (12, [M+H]+), C27H32N2O9에 대해 계산됨: 528.21 [M]+.
Fmoc-PEG2.Glu.(FAPi) 2 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 ((11S)-19-((4-((2-(2-시아노-4,4-디플루오로피롤리딘-1-일))-2-옥소에틸)카바모일)퀴놀린-6-일)옥시)-11-((4-((4-((2-(2-시아노-4,4-디플루오로피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸))카바모일)퀴놀린-6-일)옥시)부틸)카바모일)-9,14-디옥소-3,6-디옥사-10,15-디아자노나데실)카바메이트)
Fmoc-PEG2.Glu(32.0mg, 60.0μmol, 1.00eq.)를 HOBt(20.4mg, 150.0μmol, 2.50eq.) 및 EDC*HCl(28.8mg, 150.0μmol, 2.50eq.)과 함께 무수 DMF(1.0mL)에 용해시키고, 아르곤 분위기 하에 실온에서 교반하였다. 1시간 후, FAPi*TFA(65.4mg, 120.0μmol, 2.00eq.), DIPEA(23.3mg, 30μL, 180.0μmol, 3.00eq.) 및 무수 DMF(0.5mL)의 무색 용액을 첨가하였다. 추가로 3시간 후에 HOBt(7.8mg, 60.0μmol, 1.00eq.) 및 EDC*HCl(11.4mg, 60.0μmol, 1.00eq.)을 다시 첨가하였다. 그 직후 DIPEA(7.8mg, 10μL, 60.0μmol, 1.00eq.)에 용해된 추가의 FAPi*TFA(16.5mg, 30.0μmol, 0.50eq.) 및 0.5mL의 무수 DMF를 첨가하였다. 다음날 HOBt(3.9mg, 30.0μmol, 0.50eq.) 및 EDC*HCl(5.7mg, 30.0μmol, 0.5eq.)의 절반 당량을 첨가하고, 추가로 4시간 후에 반응을 종료하였다. DMF를 감압 하에 제거하고, 컬럼 크로마토그래피(CHCl3:MeOH(100:10))로 정제한 후, Fmoc-PEG2.Glu.(FAPi)2(79.1mg, 58.4μmol, 97%)를 담황색 고체로 얻었다.
LC-MS (ESI-양성): m/z (%) = 452.50 (31, [M+H]3+), 678.45 (100, [M+H]2+), 679.25 (13, [M+H]2+), 1355.85 (9, [M+H]+), C69H74F4N12O13에 대해 계산됨: 1354.54 [M]+.
PEG2.Glu.(FAPi) 2 ((2S)-2-(3-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)프로판아미도)-N1,N5-비스(4-((4-((2-(2-시아노-4,4-디플루오로피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카바모일)퀴놀린-6-일)옥시)부틸)-펜탄디아미드)
Fmoc-PEG2.Glu.(FAPi)2(67.0mg, 50.0μmol, 1.00eq.)를 1.0mL의 무수 DMF에 용해시키고, 10% 피페리딘(0.1mL)을 첨가하였다. 담황색 용액을 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 용매를 감압 하에 제거하였다. PEG2.Glu.(FAPi)2를 정량적 수율로 얻었으며, 이를 추가의 정제 없이 사용하였다.
LC-MS (ESI-양성): m/z (%) = 378.40 (100, [M+H]3+), 567.35 (26, [M+H]2+), 1133.35 (3, [M+H]+), C 54 H 64 F 4 N 12 O 11 에 대해 계산됨: 1132.48 [M]+.
표지 전구체 DOTA.PEG2.Glu.(FAPi)2의 합성은 아래 도식 18에 나타나 있다.
도식 18: DOTA.PEG2.Glu.(FAPi)2의 합성
DOTA(tBu) 3 .PEG2.Glu.(FAPi) 2 (2,2',2''-(10-(2-(((S)-1,5-비스((4-((4-((2-((S)-2-시아노-4,4-디플루오로피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카바모일)퀴놀린-6-일)옥시)부틸)아미노)-1,5-디옥소펜탄-2-일)아미노)-2-옥소에틸)-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리일)트리아세트산 tert-부틸 에스테르)
PEG2.Glu.(FAPi)2(13.4mg, 20.0μmol, 1.00eq.)를 DMF(0.4mL) 및 1vol%의 DIPEA(10.4mg, 14μL, 82.3μmol)에 용해시킨 후, 마찬가지로 DMF(1.0mL)에 용해된 DOTA(tBu)3-NHS(22.7mg, 20.0μmol, 1.00eq.)를 첨가하였다. 혼합물을 35℃에서 3일 동안 교반한 후, DMF를 감압 하에 제거하였다. 황갈색 오일은 추가의 후처리 없이 추가로 전환되었다.
HPLC-MS (ESI-양성): m/z (%) = 432.70 (55, [M+H]4+), 576.60 (26, [M+H]3+), 864.90 (18, [M+Na]2+), 1687 .84 (1, [M+H]+), 1709.82 (1, [M+Na]+), C82H114F4N16O18에 대해 계산됨: 1686.84 [M]+.
DOTA.PEG2.Glu.(FAPi) 2 (2,2',2''-(10-(2-(((S)-1,5-비스((4-((4-((2-((S)-2-시아노-4,4-디플루오로피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카바모일)퀴놀린-6-일)옥시)부틸)아미노)-1,5-디옥소펜탄-2-일)아미노)-2-옥소에틸)-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리일)트리아세트산)
DOTA(tBu)3.PEG2.Glu.(FAPi)2에 50μL의 물, 50μL의 TIPS 및 1.5mL의 트리플루오로아세트산(TFA)을 첨가하였다. 갈색 용액을 실온에서 5시간 동안 교반하고, 용매를 감압 하에 제거하였다. 생성된 암갈색 오일을 반제조용 RP-HPLC(20분 내 22-23% ACN, tR = 16 내지 17분)로 정제하여, DOTA.PEG2.Glu.(FAPi)2(1.8mg, 1.2μmol, 6%)가 황색 고체로 얻어졌다.
LC-MS (ESI-양성): m/z (%) = 380.60 (66, [M+H] 4+), 507.30 (100, [M+H]3+), 760.30 (12, [M+H]2+), 1519.55 (4, [M+H]+), 1541.75 (7, [M+Na]+), C70H90F4N16O18에 대해 계산됨: 1518.66 [M]+.
표지 전구체 DOTAGA.PEG2.Glu.(FAPi)2의 합성은 아래 도식 19에 나타나 있다.
도식 19: DOTAGA.PEG2.Glu.(FAPi)2의 합성
DOTAGA(tBu) 4 .PEG2.Glu.(FAPi) 2 (2,2',2''-(10-((20S)-28-((4-((2-(2-시아노-4,4-디플루오로피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카바모일)퀴놀린-6-일)옥시)-20-((4-((4-((2-(2-시아노-4,4-디플루오로피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카바모일)퀴놀린-6-일)옥시)부틸)카바모일)-2,2-디메틸-4,8,18,23-테트라옥소-3,12,15-트리옥사-9,19,24-트리아자옥타코산-5-일)-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리일)트리아세트산 tert-부틸 에스테르)
DOTAGA(tBu)4(10.0mg, 14.3μmol, 1.00eq.)를 HBTU(10.8mg, 28.6μmol, 2.00eq.)와 함께 0.8mL의 무수 MeCN에 용해시키고, NHS(3.3g, 28.6μmol, 2.00eq.)를 첨가하고, 무색 용액을 아르곤 분위기 하에 교반하였다. 6시간 후, HBTU(5.4mg, 14.3μmol, 1.00eq.) 및 NHS(1.6mg, 14.3μmol, 1.00eq.)를 추가로 첨가하였다.
Glu.(FAPi)2(8.2mg, 8.7μmol, 1.00eq.)를 0.4mL의 무수 MeCN 및 1.0mL의 무수 DMF에 용해시키고, 1vol%의 DIPEA(19mg, 25μL, 147.0μmol)를 첨가하고, 혼합물을 적색 DOTAGA(tBu)4-NHS 용액(1.1mL의 MeCN 중 11.4mg, 14.3μmol, 1.65eq.)에 첨가하였다. 반응물을 40℃에서 24시간 동안 교반한 후, PEG2.Glu.(FAPi)2(8.2mg, 8.7μmol, 1.00eq.)를 추가로 첨가하였다. 추가로 24시간 후, 용매를 감압 하에 제거하여 황색 오일이 얻어졌고, 이는 추가의 후처리 없이 다음 단계에서 사용하였다.
HPLC-MS (ESI-양성): m/z (%) = 454.99 (100, [M+H]4+), 606.31 (55, [M+H]3+), 908.97 (34, [M+H]2+), 1815.93 (4, [M+H]+), 1837.91 (2, [M+Na]+), C89H126F4N16O20에 대해 계산됨: 1814.93 [M]+.
DOTAGA.PEG2.Glu.(FAPi) 2 (2,2',2''-(10-((20S)-28-((4-((2-(2-시아노-4,4-디플루오로피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카바모일)퀴놀린-6-일)옥시)-20-((4-((4-((2-(2-시아노-4,4-디플루오로피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카바모일)퀴놀린-6-일)옥시)부틸)카바모일)-2,2-디메틸-4,8,18,23-테트라옥소-3,12,15-트리옥사-9,19,24-트리아자옥타코산-5-일)-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리일)트리아세트산)
DOTAGA(tBu)4.PEG2.Glu.(FAPi)2에 50μL의 물, 50μL의 TIPS 및 1.5mL의 트리플루오로아세트산(TFA)을 첨가하였다. 암갈색 용액을 실온에서 6시간 동안 교반하고, 용매를 감압 하에 제거하였다. 갈색 오일이 얻어졌고, 이를 반제조용 RP-HPLC(22% ACN 등용매, tR = 17 내지 18분)로 정제하였다. DOTAGA.PEG2.Glu.(FAPi)2(2.3mg, 1.5μmol, 10%)가 황색 고체로 얻어졌다.
LC-MS (ESI-양성): m/z (%) = 398.70 (93, [M+H] 4+), 531.30 (100, [M+H]3+), 796.20 (8, [M+H]2+), 1591.85 (3, [M+H]+), C73H94F4N16O20에 대해 계산됨: 1590.68 [M]+.
실시예 5: DOTA.Glu.Glu.(FAPi)
2
, DOTAGA.Glu.Glu.(FAPi)
2
표지 전구체 DOTA.Glu.Glu.(FAPi)2 및 DOTAGA.Glu.Glu.(FAPi)2의 합성은 아래 도식 20에 예시되어 있다. 첫 번째 합성 단계는 화합물 둘 다에 대해 동일하다.
도식 20: Glu.Glu.(FAPi)2의 합성
Fmoc-Glu(OtBu).Glu(OBzl) 2 ((S)-4-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-5-(tert-부톡시)-5-옥소펜타노일)-L-글루탐산 디벤질 에스테르)
Fmoc-Glu-OtBu(400.0mg, 0.94mmol, 1.00eq.)를 무수 DMF(2.0mL)에 용해시키고, DIPEA(151.9mg, 200μL, 1.2mmol, 1.25eq.) 및 HATU(393.2mg, 1.0mmol, 1.10eq.)를 첨가하였다. 후속적으로, 용액을 아르곤 분위기 하에 25℃에서 교반하였다. 1시간 후, 무수 DMF(1.0mL)에 용해된 디벤질 글루타메이트(384.7mg, 1.2mmol, 1.25eq.) 및 DIPEA(267.3mg, 352μL, 2.1mmol, 2.20eq.)를 첨가하였다. 다음날 HATU(357.4mg, 0.9mmol, 1.00eq.) 및 DIPEA(121.5mg, 156μL, 0.9mmol, 1.00eq.)를 다시 첨가하였다. 3일 후, 1.00eq.의 HATU를, 그리고 1시간 후 0.5mL의 DMF 중 디벤질 글루타메이트(153.87mg, 0.5mmol, 0.50eq.) 및 1.00eq.의 DIPEA 용액을 첨가하였다. 25℃에서 추가로 1일 후, 용매를 감압 하에 제거하고, 생성물을 컬럼 크로마토그래피(사이클로헥산:에틸 아세테이트(CH:EA, 3:1))로 정제하였다. Fmoc-Glu(OtBu).Glu(OBzl)2(657.3mg, 0.89mmol, 95%)를 담황색 고체로 얻었다.
LC-MS (ESI-양성): m/z (%) = 679.20 (27, [M- t Bu+H]+), 680.30 (11, [M- t Bu+H]+), 735.50 (100, [M+H]+), 736.15 (15, [M+H]+), C43H46N2O9에 대해 계산됨: 734.32 [M]+.
Fmoc-Glu(OtBu).Glu((S)-4-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-5-(tert-부톡시)-5-옥소펜타노일)-L-글루탐산)
Fmoc-Glu(OtBu).Glu(OBzl)2(25.0mg, 34.0μmol, 1.00eq.)를 1.0mL의 무수 THF에 용해시키고, 활성탄 상 팔라듐(10wt% Pd, 7.25mg, 78.0μmol, 2.00eq.)을 첨가하였다. 현탁액을 수소 분위기 하에 밤새 교반하고, 다음날 셀라이트를 통해 여과하였다. 잔류물을 THF로 세척한 후, THF를 감압 하에 제거하였다. Fmoc-Glu(OtBu).Glu(17.8mg, 32.1μmol, 94%)가 무색 고체로 얻어졌다.
LC-MS (ESI-양성): m/z (%) = 499.05 (57, [M- t Bu+H]+), 500.15 (11, [M- t Bu+H]+), 555.25 (100, [M+H]+), 556.15 (21, [M+H]+), C29H34N2O9에 대해 계산됨: 554.23 [M]+.
Fmoc-Glu(OtBu).Glu.(FAPi) 2 (N2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)-N5-((2S)-1,5-비스((4-((4-((2-(2-시아노-4,4-디플루오로피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카바모일)퀴놀린-6-일)옥시)부틸)-아미노)-1,5-디옥소펜탄-2-일)-L-글루탐산 tert-부틸 에스테르)
Fmoc-Glu(OtBu).Glu(33.3mg, 60.0μmol, 1.00eq.)를 HOBt(20.4mg, 15.0μmol, 2.50eq.) 및 EDC*HCl(28.8mg, 15.0μmol, 2.50eq.)과 함께 무수 DMF(2.5mL)에 용해시키고, 아르곤 대기 하에 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 그런 다음 무수 DMF(0.5mL)에 용해된 FAPi*TFA(65.4mg, 12.0μmol, 2.00eq.) 및 DIPEA(23.3mg, 31μL, 18.0μmol, 3.00eq.)를 첨가하였다. 다음날, 추가의 당량의 HOBt(7.8mg, 60.0μmol, 1.00eq.) 및 EDC*HCl(11.4mg, 60.0μmol, 1.00eq.)를, 30분 후에는 1당량의 DIPEA(7.8mg, 10μL, 60.0μmol, 1.00eq.) 및 0.5mL의 DMF에 용해된 절반의 양의 FAPi*TFA(16.5mg, 30.0μmol, 0.50eq.)을 첨가하였다. 24시간 후, HOBt(3.9mg, 30.0μmol, 0.50eq.) 및 EDC*HCl(5.7mg, 30.0μmol, 0.50eq.)을 다시 첨가하고, 1시간 후에 DMF(0.5mL)에 용해된 추가의 FAPi*TFA(16.5mg, 30.0μmol, 0.50eq.) 및 DIPEA(3.9mg, 5μL, 30.0μmol, 0.50eq.)를 첨가하였다. 이 단계는 다음날 다시 한 번 반복되었다. 담황색 용액을 추가로 1일간 교반한 후, 용매를 감압 하에 제거하였다. 컬럼 크로마토그래피(CHCl3:MeOH(100:10))를 사용하여 Fmoc-Glu(OtBu).Glu.(FAPi)2(86.7mg, 62.8μmol, 79%)를 황색 고체로 얻었다.
LC-MS (ESI-양성): m/z (%) = 461.25 (32, [M+H]3+), 691.45 (100, [M+H]2+),692.25 (12, [M+H]2+), 1381.95 (12, [M+H]+), C71H76F4N12O13에 대해 계산됨: 1380.56 [M]+.
Glu(OtBu).Glu.(FAPi) 2 (N5-((2S)-1,5-비스((4-((4-((2-(2-시아노-4,4-디플루오로피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카바모일)퀴놀린-6-일)옥시)부틸)아미노)-1,5-디옥소펜탄-2-일)-L-글루탐산 tert-부틸 에스테르)
Fmoc-Glu(OtBu).Glu.(FAPi)2(72.2mg, 52.2μmol, 1.00eq.)를 무수 DMF(1.0mL)에 용해시키고, 10% 피페리딘(0.1mL)을 첨가하고 혼합물을 실온에서 90분 동안 교반하였다. 후속적으로, 용매를 감압 하에 제거하여 황색 오일이 얻어졌으며, 이를 추가의 정제 없이 다음 단계에 바로 사용하였다.
LC-MS (ESI-양성): m/z (%) = 387.10 (99, [M+H]3+), 580.35 (37, [M+H]2+), 1159.30 (4, [M+H]+), C56H66F4N12O11에 대해 계산됨: 1158.49 [M]+.
표지 전구체 DOTA.Glu.Glu.(FAPi)2의 합성은 아래 도식 21에 나타나 있다.
도식 21: DOTA.Glu.Glu.(FAPi)2의 합성
DOTA(tBu) 3 .Glu(OtBu).Glu.(FAPi) 2 (2,2',2''-(10-(2-(((2S)-5-(((2S)-1,5-비스((4-((4-((2-(2-시아노-4,4-디플루오로피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카바모일)퀴놀린-6-일)옥시)부틸)아미노)-1,5-디옥소펜탄-2-일)아미노)-1-(tert-부톡시)-1,5-디옥소펜탄-2-일)아미노)-2-옥소에틸)-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리일)트리아세트산 tert-부틸 에스테르)
DOTA(tBu)3-NHS(17.5mg, 26.1μmol, 1.00eq.)를 1.0mL의 무수 DMF에 용해시키고, 0.5mL의 DMF에 용해된 Glu(OtBu).Glu.(FAPi)2(30.3mg, 26.1μmol, 1.00eq.) 및 1vol%의 DIPEA(11.4mg, 15μL, 88.2μmol)를 첨가하였다. 담황색 용액을 아르곤 분위기 하에 40℃에서 24시간 동안 교반한 후, 용매를 감압 하에 제거하였다.
후속적으로, 얻어진 황색 오일을 0.5mL의 무수 DMF에 용해시키고 DIPEA(3.4mg, 4μL, 26.1μmol, 1.00eq.)를 첨가하였다. DOTA(17.5mg, 26.1μmol, 1.00eq.), HATU(14.9mg, 39.2μmol, 1.50eq.) 및 DIPEA(6.7mg, 9μL, 52.2μmol, 2.00eq.)를 0.5mL의 무수 DMF에 우선 충전하고, 혼합물을 1시간 동안 교반한 후 첨가하였다. 황색 용액을 아르곤 분위기 하에 30℃에서 24시간 동안 교반한 후 추가의 HATU(1.50eq.) 및 DIPEA(2.00eq.)를 첨가하였다. 40℃에서 추가로 6시간 후, HATU(1.50eq.) 및 DIPEA(2.00eq.)를 한 번 더 첨가하였다. 다음날, 용매를 감압 하에 제거하여 황색 오일이 얻어졌고, 이는 추가의 후처리 없이 추가로 전환하였다.
HPLC-MS (ESI-양성): m/z (%) = 429.47 (9, [M+H]4+), 571.96 (10, [M+H]3+), 857.43 (3, [M+H]2+), C84H116F4N16O18에 대해 계산됨: 1712.94 [M]+.
DOTA.Glu.Glu.(FAPi) 2 (2,2',2''-(10-(2-(((1S)-4-(((2S)-1,5-비스((4-((4-((2-(2-시아노-4,4-디플루오로피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카바모일)퀴놀린-6-일)옥시)부틸)아미노)-1,5-디옥소펜탄-2-일)아미노)-1-카복시-4-옥소부틸)아미노)-2-옥소에틸)-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리일)트리아세트산)
DOTA(tBu)3.Glu(OtBu).Glu.(FAPi)2에 50μL의 물, 50μL의 TIPS 및 1.5mL의 트리플루오로아세트산(TFA)을 첨가하였다. 황색 용액을 실온에서 5시간 동안 교반하고 용매를 감압 하에 제거하였다. 조 생성물을 반제조용 RP-HPLC(20분 내 22-23% ACN, tR = 13 내지 14분)로 정제하고, DOTA.Glu.Glu.(FAPi)2(6.6mg, 4.4μmol, 17%)를 정제하였다. 황색 고체가 얻어졌다.
LC-MS (ESI-양성): m/z (%) = 373.05 (84, [M+H]4+), 497.15 (100, [M+H]3+), 745.70 (5, [M+H]2+), 1511.35 (1, [M+Na]+), C68H84F4N16O18에 대해 계산됨: 1488.61 [M]+.
표지 전구체 DOTAGA.Glu.Glu.(FAPi)2의 합성은 아래 도식 22에 나타나 있다.
도식 22: DOTAGA.Glu.Glu.(FAPi)2의 합성
DOTAGA(tBu) 4 .Glu(OtBu).Glu.(FAPi) 2 (2,2',2''-(10-((10S,15S)-10-(tert-부톡시카보닐)-23-((4-((2-(2-시아노-4,4-디플루오로피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카바모일)퀴놀린-6-일)옥시)-15-((4-((4-((2-(2-시아노-4,4-디플루오로피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카바모일)퀴놀린-6-일)옥시)부틸)-카바모일)-2,2-디메틸-4,8,13,18-테트라옥소-3-옥사-9,14,19-트리아자트리코산-5-일)-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리일)트리아세트산 tert-부틸 에스테르)
DOTAGA(tBu)4(22.4mg, 32.6μmol, 1.00eq.)를 HBTU(24.7mg, 65.3μmol, 2.00eq.)와 함께 무수 MeCN(1.0mL)에 용해시키고, NHS(7.5mg, 65.3μmol, 2.00eq.)를 첨가하였다. 무색 용액을 아르곤 분위기 하에 4시간 동안 교반하고, DMF(0.2mL)에 용해된 HBTU(12.4mg, 32.6μmol, 1.00eq.) 및 NHS(3.8mg, 32.6μmol, 1.00eq.)를 첨가하였다. 이어서, DMF(1.0mL)에 용해된 Glu(OtBu).Glu.(FAPi)2(30.3mg, 26.1μmol, 1.00eq.) 및 1vol%의 DIPEA(19mg, 25μL, 147.0μmol)를 첨가하였다. 무색 용액을 실온에서 밤새 교반하고, 다음날 용매를 감압 하에 제거하였다. 황색 오일이 얻어졌고, 이를 후처리 없이 추가로 전환하였다.
HPLC-MS (ESI-양성): m/z (%) = 461.49 (52, [M+H]4+), 614.99 (100, [M+H]3+), 921.97 (56, [M+H]2+), 1841.94 (35, [M+H]+), 1863.93 (6, [M+Na]+), C91H128F4N16O20에 대해 계산됨: 1840.94 [M]+.
DOTAGA.Glu.Glu.(FAPi) 2 (2,2',2''-(10-(4-(((1S)-4-(((2S)-1,5-비스((4-((4-((2-(2-시아노-4,4-디플루오로피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카바모일)퀴놀린-6-일)옥시)부틸)아미노)-1,5-디옥소펜탄-2-일)아미노)-1-카복시-4-옥소부틸)아미노)-1-카복시-4-옥소부틸)-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리일)트리아세트산)
DOTAGA(tBu)4.Glu(OtBu).Glu.(FAPi)2에 50μL의 물, 50μL의 TIPS 및 1.5mL의 트리플루오로아세트산(TFA)을 첨가하였다. 황색 용액을 실온에서 6시간 동안 교반하고, 용매를 감압 하에 제거하였다. 조 생성물을 반제조용 RP-HPLC(22% ACN 등용매, tR = 14 내지 15분)로 정제하여 DOTAGA.Glu.Glu.(FAPi)2(2.0mg, 1.3μmol, 5%)를 황색 고체로 얻었다.
LC-MS (ESI-양성): m/z (%) = 391.10 (78, [M+H]4+), 401.15 (19, [M+ACN+H]4+), 521.30 (100, [M+H]3+), 781.75 (6, [M+H]2+), 1561,65 (3, [M+H]+) C71H88F4N16O20에 대해 계산됨: 1560.63 [M]+.
실시예 6:
스페이서 단위(S1, S2 및 S3)가 없는 본 발명의 화합물의 예는 아래와 같다.
도식 23: AAZTA5.Glu.(FAPi)2
도식 24: MAG3.Glu.(FAPi)2
도식 25: MAS3.Glu.(FAPi)2
도식 26: N4.Glu.(FAPi)2
도식 27: DATA5m.NPyr.(FAPi)2
도식 28: AAZTA5.NPyr.(FAPi)2
도식 29: MAG3.NPyr.(FAPi)2
도식 30: MAS3.NPyr.(FAPi)2
도식 31: N4.NPyr.(FAPi)2
도식 32: DOTA.Asp.(FAPi)2
도식 33: DOTAGA.Asp.(FAPi)2
도식 34: DATA5m.Asp.(FAPi)2
도식 35: AAZTA5.Asp.(FAPi)2
도식 36: MAG3.Asp.(FAPi)2
도식 37: MAS3.Asp.(FAPi)2
도식 38: N4.Asp.(FAPi)2
도식 39: DOTA.5AIPA.(FAPi)2
도식 40: DOTA.SA.5AIPA.(FAPi)2
도식 41: DOTA.5AIPA.(FAPi)2
도식 42: DATA5m.Lys.(KuE)2
도식 43: DOTA.Lys.(KuE)2
도식 44: DOTAGA.Lys.(KuE)2
도식 45: DOTA.5AIPA.(KuE)2
도식 46: DOTA.5AIPA.(KuE)(FAPi)
도식 47: DOTA.5AIPA.(KuE).(Zol)
도식 48: DOTA.5AIPA.(Zol)(FAPi)
실시예 7:
스페이서 단위(S3)를 갖는 본 발명의 화합물의 예는 하기에 나타나 있다.
도식 49: DATA5m.Glu.Glu.(FAPi)2
도식 50: AAZTA5.Glu.Glu.(FAPi)2
도식 51: DOTA.Glu.NPyr.(FAPi)2
도식 52: DOTAGA.Glu.NPyr.(FAPi)2
도식 53: DATA5m.Glu.NPyr.(FAPi)2
도식 54: AAZTA5.Glu.NPyr.(FAPi)2
도식 55: DOTA.SA.Glu.Glu.(FAPi)2
도식 56: DOTAGA.SA.Glu.Glu.(FAPi)2
도식 57: DATA5m.SA.Glu.Glu.(FAPi)2
도식 58: AAZTA5.SA.Glu.Glu.(FAPi)2
도식 59: DATA5m.PEG2.Glu.(FAPi)2
도식 60: AAZTA5.PEG2.Glu.(FAPi)2
도식 61: MAG3.PEG2.Glu.(FAPi)2
도식 62: MAS3.PEG2.Glu.(FAPi)2
도식 63: N4.PEG2.Glu.(FAPi)2
도식 64: DOTA.PEG3.Glu.(FAPi)2
도식 65: DOTAGA.PEG3.Glu.(FAPi)2
도식 66: DOTA.PEG4.Glu.(FAPi)2
도식 67: DOTAGA.PEG4.Glu.(FAPi)2
도식 68: DATA5m.PEG4.Glu.(FAPi)2
도식 69: AAZTA5.PEG4.Glu.(FAPi)2
도식 70: MAG3.PEG4.Glu.(FAPi)2
도식 71: MAS3.PEG4.Glu.(FAPi)2
도식 72: N4.PEG4.Glu.(FAPi)2
도식 73: DOTA.PEG2.NPyr.(FAPi)2
도식 74: DOTAGA.PEG2.NPyr.(FAPi)2
도식 75: DATA5m.PEG2.NPyr.(FAPi)2
도식 76: AAZTA5.PEG2.NPyr.(FAPi)2
도식 77: MAG3.PEG2.NPyr.(FAPi)2
도식 78: MAS3.PEG2.NPyr.(FAPi)2
도식 79: N4.PEG2.NPyr.(FAPi)2
도식 80: DOTA.PEG3.NPyr.(FAPi)2
도식 81: DOTAGA.PEG3.NPyr.(FAPi)2
도식 82: DOTA.PEG4.NPyr.(FAPi)2
도식 83: DOTAGA.PEG4.NPyr.(FAPi)2
도식 84: DATA5m.PEG4.NPyr.(FAPi)2
도식 85: AAZTA5.PEG4.NPyr.(FAPi)2
도식 86: MAG3.PEG4.NPyr.(FAPi)2
도식 87: MAS3.PEG4.NPyr.(FAPi)2
도식 88: N4.PEG4.NPyr.(FAPi)2
실시예 8:
2개의 스페이서 단위(S1 + S2)를 갖는 본 발명의 화합물의 예가 하기에 제시되어 있다.
도식 89: DOTA.Glu.(Glu.FAPi)2
도식 90: DOTAGA.Glu.(Glu.FAPi)2
도식 91: DATA5m.Glu.(Glu.FAPi)2
도식 92: AAZTA5.Glu.(Glu.FAPi)2
도식 93: DOTA.Glu.(NPyr.FAPi)2
도식 94: DOTAGA.Glu.(NPyr.FAPi)2
도식 95: DATA5m.Glu.(NPyr.FAPi)2
도식 96: AAZTA5.Glu.(NPyr.FAPi)2
도식 97: DOTA.Glu.(SA.FAPi)2
도식 98: DOTAGA.Glu.(SA.FAPi)2
도식 99: DATA5m.Glu.(SA.FAPi)2
도식 100: AAZTA5.Glu.(SA.FAPi)2
도식 101: DOTA.NPyr.(Glu.FAPi)2
도식 102: DOTAGA.NPyr.(Glu.FAPi)2
도식 103: DATA5m.NPyr.(Glu.FAPi)2
도식 104: AAZTA5.NPyr.(Glu.FAPi)2
도식 105: DOTA.NPyr.(NPyr.FAPi)2
도식 106: DOTAGA.NPyr.(NPyr.FAPi)2
도식 107: DATA5m.NPyr.(NPyr.FAPi)2
도식 108: AAZTA5.NPyr.(NPyr.FAPi)2
도식 109: DOTA.NPyr.(SA.FAPi)2
도식 110: DOTAGA.NPyr.(SA.FAPi)2
도식 111: DATA5m.NPyr.(SA.FAPi)2
도식 112: AAZTA5.NPyr.(SA.FAPi)2
도식 113: DOTA.Glu.(PEG2.FAPi)2
도식 114: DOTAGA.Glu.(PEG2.FAPi)2
도식 115: DATA5m.Glu.(PEG2.FAPi)2
도식 116: AAZTA5.Glu.(PEG2.FAPi)2
도식 117: DOTA.Glu.(PEG3.FAPi)2
도식 118: DOTAGA.Glu.(PEG3.FAPi)2
도식 119: DATA5m.Glu.(PEG3.FAPi)2
도식 120: AAZTA5.Glu.(PEG3.FAPi)2
도식 121: DOTA.Glu.(PEG4.FAPi)2
도식 122: DOTAGA.Glu.(PEG4.FAPi)2
도식 123: DATA5m.Glu.(PEG4.FAPi)2
도식 124: AAZTA5.Glu.(PEG4.FAPi)2
도식 125: DOTA.NPyr.(PEG2.FAPi)2
도식 126: DOTAGA.NPyr.(PEG2.FAPi)2
도식 127: DATA5m.NPyr.(PEG2.FAPi)2
도식 128: AAZTA5.NPyr.(PEG2.FAPi)2
도식 129: DOTA.NPyr.(PEG3.FAPi)2
도식 130: DOTAGA.NPyr.(PEG3.FAPi)2
도식 131: DATA5m.NPyr.(PEG3.FAPi)2
도식 132: AAZTA5.NPyr.(PEG3.FAPi)2
도식 133: DOTA.NPyr.(PEG4.FAPi)2
도식 134: DOTAGA.NPyr.(PEG4.FAPi)2
도식 135: DATA5m.NPyr.(PEG4.FAPi)2
도식 136: AAZTA5.NPyr.(PEG4.FAPi)2
도식 137: DOTA.TAEA.(SA.FAPi)2
도식 138: DOTAGA.TAEA.(SA.FAPi)2
도식 139: DATA5m.TAEA.(SA.FAPi)2
도식 140: DOTA.TAEA.(SA.KuE)2
도식 141: DOTAGA.TAEA.(SA.KuE)2
도식 142: DATA5m.TAEA.(SA.KEuE)2
실시예 9:
3개의 스페이서 단위(S1 + S2 + S3)를 갖는 본 발명의 화합물의 예가 하기에 나타나 있다.
도식 143: DOTA.PEG2.Glu.(Glu.FAPi)2
도식 144: DOTAGA.PEG2.Glu.(Glu.FAPi)2
도식 145: DOTA.PEG3.Glu.(Glu.FAPi)2
도식 146: DOTAGA.PEG3.Glu.(Glu.FAPi)2
도식 147: DOTA.PEG4.Glu.(Glu.FAPi)2
도식 148: DOTAGA.PEG4.Glu.(Glu.FAPi)2
도식 149: DOTA.PEG2.Glu.(NPyr.FAPi)2
도식 150: DOTAGA.PEG2.Glu.(NPyr.FAPi)2
도식 151: DOTA.PEG3.Glu.(NPyr.FAPi)2
도식 152: DOTAGA.PEG3.Glu.(NPyr.FAPi)2
도식 153: DOTA.PEG4.Glu.(NPyr.FAPi)2
도식 154: DOTAGA.PEG4.Glu.(NPyr.FAPi)2
도식 155: DOTA.PEG2.Glu.(SA.FAPi)2
도식 156: DOTAGA.PEG2.Glu.(SA.FAPi)2
도식 157: DATA5m.PEG2.Glu.(SA.FAPi)2
도식 158: AAZTA5.PEG2.Glu.(SA.FAPi)2
도식 159: DOTA.PEG2.Glu.(PEG2.FAPi)2
도식 160: DOTAGA.PEG2.Glu.(PEG2.FAPi)2
도식 161: DATA5m.PEG2.Glu.(PEG2.FAPi)2
도식 162: AAZTA5.PEG2.Glu.(PEG2.FAPi)2
도식 163: DOTA.Glu.Glu.(Glu.FAPi)2
도식 164: DOTAGA.Glu.Glu.(Glu.FAPi)2
도식 165: DOTA.PEG2.NPyr.(Glu.FAPi)2
도식 166: DOTAGA.PEG2.NPyr.(Glu.FAPi)2
도식 167: DOTA.PEG2.NPyr.(PEG2.FAPi)2
도식 168: DOTAGA.PEG2.NPyr.(PEG2.FAPi)2
도식 169: DATA5m.PEG2.NPyr.(PEG2.FAPi)2
도식 170: AAZTA5.PEG2.NPyr.(PEG2.FAPi)2
도식 171: DOTA.PEG2.NPyr.(NPyr.FAPi)2
도식 172: DOTAGA.PEG2.NPyr.(NPyr.FAPi)2
도식 173: DATA5m.PEG2.NPyr.(NPyr.FAPi)2
도식 174: AAZTA5.PEG2.NPyr.(NPyr.FAPi)2
SEQUENCE LISTING
<110> MEDIANEZIA GMBH
<120> TRISLINKER-CONJUGATED DIMERIC LABELLING PRECURSORS AND RADIOTRACERS DERIVED THEREFROM
<130> 21/008 AOC
<150> DE 10 2021 114 711.5
<151> 2021-06-08
<160> 9
<170> KoPatentIn 3.0
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Phe Cys Phe Phe Lys Thr Cys Tyr
1 5
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<222> (2)..(7)
<400> 2
Phe Cys Tyr Phe Lys Thr Cys Tyr
1 5
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> Artficial Sequence
<220>
<221> DISULFID
<222> (2)..(7)
<220>
<221> DISULFID
<222> (2)..(7)
<223> 3 = Pyridylalanine
<400> 3
Phe Cys Xaa Phe Lys Thr Cys Tyr
1 5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> Artficial Sequence
<220>
<221> DISULFID
<222> (2)..(7)
<400> 4
Phe Cys Phe Trp Lys Thr Cys Thr
1 5
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> Artficial Sequence
<220>
<221> DISULFID
<222> (2)..(7)
<400> 5
Phe Cys Tyr Trp Lys Thr Cys Thr
1 5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> Artficial Sequence
<220>
<221> DISULFID
<222> (2)..(7)
<400> 6
Phe Cys Tyr Trp Lys Thr Cys Thr
1 5
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> Artficial Sequence
<220>
<221> DISULFID
<222> (2)..(7)
<220>
<221> DISULFID
<222> (2)..(7)
<223> 3 = L-1-Naphthylalanine
<400> 7
Phe Cys Xaa Trp Lys Thr Cys Thr
1 5
<210> 8
<211> 19
<212> PRT
<213> Artficial Sequence
<400> 8
Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Ser Arg Gly Lys Arg Asn Asn Phe Lys Thr
1 5 10 15
Glu Glu Tyr
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> Polaribacter haliotis
<400> 9
Val Asn Thr Ala Asn Ser Thr
1 5
Claims (13)
- 하기 구조를 갖는, 핵의학 진단 및 치료 진단(theranostic)용 이량체 표지 전구체(dimeric labeling precursor):
상기 구조에서,
TV1은 제1 표적화 벡터이고, TV2는 제2 표적화 벡터이고, MG는 방사성 동위 원소의 착체화를 위한 킬레이터 또는 방사성 동위 원소의 공유 결합을 위한 링커이고, S1은 제1 스페이서이고, S2는 제2 스페이서이고, S3은 제3 스페이서이고, TL은 트리스 링커이고;
- TV1 및 TV2는 하기 구조 [1] 내지 [43] 중 하나로부터 독립적으로 선택되고:
상기 구조 [1] 내지 [43]에서,
- 구조 [1] 내지 [8] 및 [43]은 펩타이드를 나타내고,
- X = H 또는 F이고,
- Y = H, CH3, CH(CH3)2, C(CH3)3 또는 (CH2)nCH3이고, n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이고;
- 트리스 링커 TL은 하기 구조 [52] 내지 [116] 중 하나로부터 선택된다:
.
- 제1항에 있어서, MG가, H4pypa, EDTA(에틸렌디아민테트라아세테이트), EDTMP(디에틸렌트리아민펜타(메틸렌포스폰산)), DTPA(디에틸렌트리아민펜타아세테이트) 및 이의 유도체, NOTA(노나-1,4,7-트리아민 트리아세테이트) 및 이의 유도체, 예를 들면, NODAGA(1,4,7-트리아자사이클로노난,1-글루타르산,4,7-아세테이트), TRAP(트리아자사이클로노난포스핀산), NOPO(1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4-비스[메틸렌(하이드록시메틸)포스핀산]-7-[메틸렌(2-카복시에틸)포스핀산]), DOTA(도데카-1,4,7,10-테트라아민테트라아세테이트), DOTAGA(2-(1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-4,7,10)펜탄디오산) 및 기타 DOTA 유도체, TRITA(트리데카-1,4,7,10-테트라아민테트라아세테이트), TETA(테트라데카-1,4,8,11-테트라아민테트라아세테이트) 및 이의 유도체, PEPA(펜타데카-1,4,7,10,13-펜타아민펜타아세테이트), HEHA(헥사데카-1,4,7,10,13,16-헥사아민헥사아세테이트) 및 이의 유도체, HBED(N,N'-비스(2-하이드록시벤질)에틸렌디아민-N,N'-디아세테이트) 및 이의 유도체, 예를 들면, HBED-CC(N,N'-비스[2-하이드록시-5-카복시에틸]벤질)에틸렌디아민-N,N'-디아세테이트), DEDPA 및 이의 유도체, 예를 들면, H2dedpa(1,2-[[6-(카복실)피리딘-2-일]메틸아민]에탄) 및 H4octapa(1,2-[[6-(카복실)피리딘-2)-일]메틸아민]에탄-N,N'-디아세테이트), DFO(데페록사민) 및 이의 유도체, 트리스하이드록시피리디논(THP) 및 이의 유도체, 예를 들면, H3THP-Ac 및 H3THP-mal(YM103), TEAP(테트라아자사이클로데칸포스핀산) 및 이의 유도체, AAZTA(6-아미노-6-메틸퍼하이드로-1,4-디아제판-N,N,N',N'-테트라아세테이트) 및 이의 유도체, 예를 들면, AAZTA5(5-[(6-아미노)-1,4-디아제판]펜탄산-N,N,N',N'-테트라아세테이트) DATA5m(5-[[6-(N-메틸)아미노]-1,4-디아세테이트-1,4-디아제판]-펜탄산-N,N',N'-트리아세테이트); 사르코파긴 SAR(1-N-(4-아미노벤질)-3,6,10,13,16,19-헥사아자바이사이클로[6.6.6]에이코산-1,8-디아민) 및 이의 유도체, 예를 들면, (NH2)2SAR(1,8-디아미노-3,6,10,13,16,19-헥사아자바이사이클로[6.6.6]에이코산), N4(3-[(2'-아미노에틸)아미노]-2[(2"-아미노에틸)아미노메틸]프로피온산) 및 기타 N4 유도체, PnAO(6-(4-이소티오시아네이토벤질)-3,3,9,9-테트라메틸-4,8-디아자운데칸-2,10-디온 디옥심) 및 유도체, 예를 들면, BMS181321(3,3'-(1,4-부탄디일디아미노)-비스(3-메틸-2-부타논)디옥심), MAG2(머캅토아세틸글리실글리신) 및 이의 유도체, MAG3(머캅토아세틸글리실글리실글리신) 및 이의 유도체, 예를 들면, N3S-아디팟, MAS3(머캅토아세틸세릴세릴세린) 및 이의 유도체, MAMA(N-(2-머캅토에틸)-2-[(2-머캅토에틸)아미노]아세트아미드) 및 이의 유도체, EC(에틸렌디시스테인) 및 이의 유도체, dmsa(디머캅토석신산) 및 이의 유도체, DADT(디아미노디티올), DADS(디아미노디설파이드), N2S2 킬레이터 및 이의 유도체, 아미노티올 및 이의 유도체; 상기 킬레이터의 염; 하이드라진니코틴아미드(HYNIC) 및 하이드라진니코틴아미드 유도체로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 킬레이터임을 특징으로 하는, 이량체 표지 전구체.
- 제2항에 있어서, MG가 DOTA(도데카-1,4,7,10-테트라아민테트라아세테이트), DATA5m(1,4-비스(카복시메틸)-6-[메틸-카복시메틸아미노]-6-펜탄산-1,4-디아제판) 또는 AAZTA(1,4-비스(카복시메틸)-6-[비스(카복시메틸)아미노]-6-펜탄산-1,4-디아제판)임을 특징으로 하는, 이량체 표지 전구체.
- 제1항에 있어서, MG가 하기 구조들로부터 선택됨을 특징으로 하는, 이량체 표지 전구체:
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서 S1, S2 및 S3이 하기 구조들로부터 독립적으로 선택되는 구조를 가짐을 특징으로 하는, 이량체 표지 전구체:
및
.
상기 구조들에서,
A, B 및 C는 아미드 라디칼, 카복스아미드 라디칼, 포스피네이트 라디칼, 알킬 라디칼, 트리아졸 라디칼, 티오우레아 라디칼, 에틸렌 라디칼, 말레이미드 라디칼, 아미노산 잔기 및 ,
및(s = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10)로 이루어지는 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
p, q 및 r은 세트 {0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20}으로부터 독립적으로 선택된다. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서 S1, S2 및 S3이 독립적으로 하기 구조를 가짐을 특징으로 하는, 이량체 표지 전구체:
.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서 S1, S2 및 S3이 하기 구조를 갖는 펩타이드 그룹, 디펩타이드 그룹 또는 트리펩타이드 그룹으로부터 독립적으로 선택됨을 특징으로 하는, 이량체 표지 전구체:
.
- 제7항에 있어서, R1, R2 및 R3이 -H, -CH3, -CH(CH3)2, -CH2CH(CH3)2, -CH(CH3)-CH2CH3, -CH2-Phe, -CH2-Phe-OH, -CH2SH, -(CH2)2-S-CH3, -CH2OH, -(CH)(OH)(CH3), -(CH2)4NH2, -(CH2)3NH(C=NH)NH2, -CH2COOH, -(CH2)2COOH, -CH2(C=O)NH2, -(CH2)2(C=O)NH2,
로 이루어지는 그룹으로부터 독립적으로 선택됨을 특징으로 하는, 이량체 표지 전구체. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, TV1과 TV2가 동일함(TV1 = TV2)을 특징으로 하는, 이량체 표지 전구체.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, TV1과 TV2가 서로 상이함(TV1 ≠ TV2)을 특징으로 하는, 이량체 표지 전구체.
- 제10항에 있어서, TV1이 상기 구조 [9] 내지 [12] 중 하나를 갖고, TV2가 상기 구조 [13] 또는 [14] 중 하나를 가짐을 특징으로 하는, 이량체 표지 전구체.
- 제10항에 있어서, TV1이 상기 구조 [9] 내지 [12] 중 하나를 갖고, TV2가 상기 구조 [40] 또는 [41] 중 하나를 가짐을 특징으로 하는, 이량체 표지 전구체.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 표지 전구체, 및 44Sc, 47Sc, 55Co, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 66Ga, 67Ga, 68Ga, 89Zr, 86Y, 90Y, 89Zr, 90Nb, 99mTc, 111In, 135Sm, 140Pr 159Gd, 149Tb, 160Tb, 161Tb, 165Er, 166Dy, 166Ho, 175Yb, 177Lu, 186Re, 188Re, 211At, 212Pb, 213Bi, 225Ac, 232Th, 18F, 131I 및 211At로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 방사성 동위 원소로 이루어지는, 핵의학 진단 및 치료 진단용 방사성 추적자.
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