KR20230164213A - 피피알 단백질을 이용하는 dna 결합성 단백질 및 그의 이용 - Google Patents

피피알 단백질을 이용하는 dna 결합성 단백질 및 그의 이용 Download PDF

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다카히로 나카무라
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고쿠리쓰다이가쿠호진 규슈다이가쿠
고쿠리츠다이가쿠호진 히로시마다이가쿠
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Abstract

PPR 모티프를 가지는 RNA 인식규칙이 DNA의 인식에 대하여도 이용가능하다는 예측에 근거하여, DNA 결합에 작용하는 PPR 단백질을 해석하고, 이와 같은 특징을 가지는 PPR 단백질을 탐색하는 것을 과제로 한다. 본 발명은 하기 일반식(1)의 구조를 가지는 PPR 모티프: (Helix A)-X-(Helix B)-L 일반식(1)(상기 식에서, Helix A는 α-헬릭스 구조를 형성가능한 부분이고; X는 존재하지 않거나 또는 1 내지 9개의 아미노산으로 구성되는 부분이며; Helix B는 α-헬릭스 구조를 형성가능한 부분이고; 및, L은 2 내지 7개의 아미노산으로 구성되는 부분이다)이고, 상기 일반식(1)의 Helix A의 1번 아미노산, 4번 아미노산, 및 L에 포함되는 "ii"(-2)번 아미노산의 3개 아미노산이 대상 DNA 염기 또는 대상 염기서열에 대응하는 특이적인 아미노산의 조합을 가지는 PPR 모티프를 복수, 바람직하게는 2 내지 30개, 보다 바람직하게는 5 내지 25개, 가장 바람직하게는 9 내지 15개를 포함하고, DNA 염기 선택적으로, 혹은 DNA 염기서열 특이적으로 결합가능한 단백질에 의해 상기 과제를 해결할 수 있음을 밝혀내었다.

Description

피피알 단백질을 이용하는 DNA 결합성 단백질 및 그의 이용{DNA Binding Proteins Using PPR Motifs And Use Thereof}
본 발명은 의도하는 DNA 염기 또는 DNA 서열에 선택적 또는 특이적으로 결합 하는 단백질에 관한 것이다. 본 발명에서는 pentatricopeptide repeat(PPR) 모티프를 이용한다. 본 발명은 DNA 결합 단백질의 동정, 설계, PPR 모티프를 갖는 단백질의 표적 DNA의 동정, DNA의 기능제어를 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 의료 분야, 농업 분야 등에서 유용하다. 또한, 본 발명은 PPR 모티프를 포함한 단백질 및 기능성 영역을 규정하는 단백질의 복합체를 이용하는 신규한 DNA 절단효소에 관한 것이다.
최근 다양한 분석에 의해 밝혀진 핵산 결합성 단백질 인자를 이용하여 의도하는 서열에 결합하는 기술이 확립되어 이용되고 있다. 이 서열특이적인 결합을 이용하여 표적 핵산(DNA 또는 RNA)의 세포 내 국재화(intracellular localization)의 해석, 표적으로 하는 DNA 서열의 제거, 또는 그의 하류에 존재하는 단백질 코드 유전자의 발현 제어(활성화 또는 불활성화)가 가능하게 되었다.
DNA에 작용하는 단백질성 인자로서 징크 핑거 단백질(비특허문헌 1, 비특허문헌 2), TAL 이펙터(TALE, 비특허문헌 3, 특허문헌 1) 및 CRISPR(비특허문헌 4, 비특허문헌 5)를 단백질공학적인 재료로 하는 연구 및 개발이 이루어지고 있으나, 이러한 단백질성 인자의 종류는 아직 극히 한정되어 있다.
예를 들면, 인공 DNA 절단효소로 알려진 인공효소 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN, zinc finger protein)는 3~4개 염기의 DNA를 특이적으로 인식하여 결합하는 징크 핑거를 3 내지 6개 연결시켜 구성되는 3~4개 염기의 서열단위로 염기서열을 인식하는 부분에 대하여, 세균의 DNA 절단효소(예를 들어, FokI)의 DNA 절단 도메인을 하나 연결시킨 키메라 단백질이다(비특허문헌 2). 이러한 키메라 단백질은 징크 핑거 도메인이 DNA에 결합하는 것으로 알려진 단백질 도메인이며, 많은 전사 조절인자가 이 도메인을 가지고, 특이적인 DNA 서열에 결합하여 유전자의 발현 조절을 하고 있다는 지견에 근거한다. 3개의 징크 핑거를 가지는 이 ZFN을 2개 사용함으로써, 이론적으로는 약 700억 염기에 1개소의 절단을 유도할 수 있다.
그러나, 이 ZFN을 사용하는 방법은 그 작제에 비용이 소요되는 등의 이유로 널리 이용되는 데는 이르지 않았다. 또한, 기능적인 ZFN의 선별효율이 나쁘고, 그 점에서도 문제가 있음이 시사되고 있다. 또한, n개의 징크 핑거로 구성된 징크 핑거 도메인은, (GNN)n 서열을 인식하는 경향이 있기 때문에, 표적 유전자 서열의 자유도(degree of freedom)가 낮다는 문제점도 가지고 있다.
한편, 매 1 염기마다 인식할 수 있는 모듈 부분(module part)의 결합서열로 구성되는 단백질, TAL 이펙터(TALE)에 세균의 DNA 절단효소(예를 들어, FokI)의 DNA 절단 도메인을 결합시킨 것(TALEN)이 개발되어, ZFN을 대신하는 인공효소로서 검토가 이루어지고 있다(비특허문헌 3). 이 TALEN는 식물 병원균 Xanthomonas가 가지는 전사인자의 DNA 결합 도메인과 DNA 제한효소 FokI의 DNA 절단 도메인을 융합시킨 효소이며, 인접한 DNA 서열에 결합하여 이량체를 형성하고 이중가닥 DNA를 절단하는 것으로 알려져 있다. 이 분자는, 식물에 감염하는 세균에서 발견된 TALE의 DNA 결합 도메인이 34개 아미노산으로 구성되는 TALE 모티프 중 2개소 아미노산의 조합으로 하나의 염기를 인식하기 때문에, TALE 모듈의 반복하는 구조의 선택에 의하여 표적 DNA에의 결합성을 선택할 수 있다는 특징을 가지고 있다. 이러한 특징을 갖는 DNA 결합 도메인을 이용한 TALEN은 ZFN과 마찬가지로 표적 유전자에 변이 도입이 가능하다는 특징을 가지고 있지만, 그 표적 유전자(염기서열)의 자유도가 대폭 향상된다는 점과, 결합 염기를 코딩할 수 있는 점이 ZFN과 비교했을 때 큰 장점이다.
그러나, TALEN의 완전한 입체구조가 밝혀지지 않았기 때문에, TALEN의 DNA 절단부위를 동정하는 것은 현 상태에서 불가능하다. 따라서, TALEN은 ZFN과 비교하여 절단 부분이 부정확하고 일정하지 않고, 유사한 서열까지 절단해 버리는 문제점을 가지고 있다. 따라서, 정확하게 표적 염기서열 부분을 DNA 절단효소에 의해 절단할 수 없다는 문제점이 존재한다. 이러한 점에서 상술한 문제점이 없는 새로운 인공 DNA 절단효소의 개발이 요구되어 왔다.
게놈 서열정보에서 식물 만 500개의 큰 패밀리를 형성하는 단백질, PPR 단백질(pentatricopeptide repeat(PPR) 모티프를 갖는 단백질)이 발견되었다(비특허문헌 6). PPR 단백질은 핵 코드 단백질(nucleus-encoded protein)이지만, 오로지 기관(엽록체와 미토콘드리아)의 RNA 수준에서 제어, 절단, 번역, 접합(splicing), RNA 편집, RNA 안정성에 유전자 특이적으로 작용하는 것으로 알려진 단백질이다. 일반적으로, PPR 단백질은 보존성이 낮은 35개 아미노산 모티프, 즉 PPR 모티프가 약 10개 연속된 구조를 가지고, PPR 모티프의 조합이 RNA와 서열 선택적인 결합을 담당하는 것으로 여겨지고 있다. 대부분의 PPR 단백질은 PPR 모티프가 약 10개의 반복으로 구성되어 있으며, 종종 촉매 작용을 발휘하는데 필요한 도메인을 찾을 수 없다. 따라서, 이 PPR 단백질의 실체는 RNA 어댑터(RNA adapter)로 여겨지고 있다(비특허문헌 7).
일반적으로, 단백질과 DNA 사이의 결합 및 단백질과 RNA 사이의 결합은 다른 분자 메커니즘에 따라 이루어지고 있으며, DNA 결합형 단백질은 일반적으로, RNA에 결합하지 않고, 반대로 RNA 결합형 단백질은 통상적으로 DNA에 결합하지 않는다. 예를 들어, RNA 결합인자로 알려져 있으며, 인식 RNA를 코딩할 수 있는 Pumilio 단백질의 경우 DNA와의 결합은 보고되어 있지 않다(비특허문헌 8 및 9).
그러나, 다양한 종류의 PPR 단백질의 성질을 검토하는 과정에서 몇가지 유형의 PPR 단백질이 DNA 결합성 인자로 작용하는 것으로 여겨지고 있다.
밀(소맥, wheat)의 p63은 9개의 PPR 모티프를 가진 PPR 단백질이지만, 겔 시프트 분석(gel shift assay)에 의해 서열특이적으로 DNA와 결합하는 것으로 시사되었다(비특허문헌 10).
애기장대(Arabidopsis thaliana)의 GUN1은 11개의 PPR 모티프를 가지고, 풀다운 분석(pull down assay)에 의해 DNA와 결합하는 것으로 시사되었다(비특허문헌 11).
애기장대의 pTac2(15개 PPR 모티프를 갖는 단백질, 비특허문헌 12) 및 애기장대의 DG1(10 PPR 모티프를 갖는 단백질, 비특허문헌 13)는 DNA를 주형으로 RNA를 생성하는 전사에 직접 관여하는 것이 Run-On 분석에 의해 밝혀졌고, DNA에 결합하는 것으로 여겨지고 있다.
애기장대의 GRP23(11개 PPR 모티프를 갖는 단백질, 비특허문헌 14) 유전자 결손주는 배아 치사(embryonal death)의 표현형을 나타내지만, 그 단백질은 DNA 의존적 RNA 전사효소인 진핵생물형 RNA 전사효소 2의 주요 서브유닛과 물리적으로 상호 작용하는 것으로 알려져, 이 점에서 GRP23도 DNA 결합에 작용하는 것으로 여겨지고 있다.
그러나, 이러한 PPR 단백질은 DNA에의 결합이 간접적으로 시사된 것에 지나지 않고 실제로 서열특이적으로 결합하고 있다는 사실의 입증은 충분하지 않다. 또한, 만일 이러한 단백질이 DNA와 서열특이적으로 결합하더라도 일반적으로 단백질과 DNA 사이의 결합 및 단백질과 RNA 사이의 결합은 다른 분자 메커니즘에 의해 이루어지는 것으로 믿고 있기 때문에, 구체적으로 어떤 서열규칙을 통해 결합하고 있는지 등에 대해서는 전혀 예상조차 되지 않고 있다.
특허문헌 1: WO2011/072246 특허문헌 2: WO2011/111829
비특허문헌 1: Maeder, M.L., et al.(2008). Rapid "open-source" engineering of customized zinc-finger nucleases for highly efficient gene modification. Mol.Cell 31, 294-301. 비특허문헌 2: Urnov, F.D., et al., (2010) Genome editing with engineered zinc finger nucleases, Nature Review Genetics, 11, 636-646 비특허문헌 3: Miller, J.C., et al.(2011). A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nature biotech. 29, 143-148. 비특허문헌 4: Mali P, et al.(2013) RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826. 비특허문헌 5: Cong L, et al.(2013) Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 비특허문헌 6: Small, I.D., and Peeters, N.(2000). The PPR motif - a TPR-related motif prevalent in plant organellar proteins. Trends Biochem. Sci. 25, 46-47. 비특허문헌 7: Woodson, J.D., and Chory, J.(2008). Coordination of gene expression between organellar and nuclear genomes. Nature Rev. Genet. 9, 383-395. 비특허문헌 8: Wang, X., et al.(2002). Modular recognition of RNA by a human pumilio-homology domain. Cell 110, 501-512. 비특허문헌 9: Cheong, C.G., and Hall, T.M.(2006). Engineering RNA sequence specificity of Pumilio repeats. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 13635-13639. 비특허문헌 10: Ikeda T.M. and Gray M.W.(1999) Characterization of a DNA-binding protein implicated in transcription in wheat mitochondria. Mol. Cell Bio., l19(12):8113-8122 비특허문헌 11: Koussevitzky S, et al.(2007) Signals from chloroplasts converge to regulate nuclear gene expression. Science 316: 715-719. 비특허문헌 12: Pfalz J, et al.(2006) pTAC2, -6, and -12 are components of the transcriptionally active plastid chromosome that are required for plastid gene expression. Plant Cell 18: 176-197. 비특허문헌 13: Chi W, et al.(2008) The pentratricopeptide repeat protein DELAYED GREENING1 is involved in the regulation of early chloroplast development and chloroplast gene expression in Arabidopsis. Plant Physiol. 147: 573-584. 비특허문헌 14: Ding YH, et al.(2006) Arabidopsis GLUTAMINE-RICH PROTEIN23 is essential for early embryogenesis and encodes a novel nuclear PPR motif protein that interacts with RNA polymerase II subunit III. Plant Cell 18: 815-830.
본 발명자들은 PPR 단백질(PPR 모티프를 갖는 단백질)의 RNA 어댑터로서의 성질이, PPR 단백질을 구성하는 각각의 PPR 모티프의 성질과 복수의 PPR 모티프의 조합에 의해 결정되는 것으로 예상하고, 이 PPR 모티프를 이용한 RNA 결합 단백질의 개변방법을 제안하였다(특허문헌 2). 또한, PPR 모티프와 RNA가 일대일 대응으로 결합하여 연속된 PPR 모티프에 의하여 RNA 서열 중 연속적인 RNA 염기를 인식한다는 사실, PPR 모티프를 구성하는 35개 아미노산 중 특정 3개의 아미노산을 조합하여 RNA 인식이 결정된다는 사실을 밝혀내고, PPR 모티프의 RNA 인식코드를 이용한 custum RNA 결합 단백질의 설계방법과 그의 이용에 대해 특허출원한 바있다(PCT /JP2012/077274; Yagi, Y., et al.(2013) PLoS One, 8, e57286; 및, Barkan, A., etal.(2012) PLoS Genet., 8, e1002910).
일반적으로, 단백질과 DNA 사이의 결합 및 단백질과 RNA 사이의 결합은 다른 분자 메커니즘에 근거한다고 여겨지고 있다. 이에 대해, 본 발명에서는 PPR 모티프가 갖는 RNA 인식규칙(RNA recognition rule)이 DNA의 인식에 대해서도 이용 가능하다고 예측하고 DNA 결합에 작용하는 PPR 단백질을 분석하여, 그와 같은 특징을 가지는 PPR 단백질을 탐색하는 것을 과제로 하였다. 또한, 이렇게 얻어진 DNA에 특이적으로 결합할 수 있는 PPR 단백질을 이용하여 원하는 서열에 결합하는 custum DNA 결합 단백질을 조제함과 동시에, 기능성 영역을 규정하는 단백질과 함께 사용함으로써 새로운 인공효소를 제공하고, 기능성 영역으로 DNA 절단 활성영역과 함께 사용함으로써 새로운 인공 DNA 절단효소를 제공하는 것을 과제로 하였다.
PPR 단백질의 경우, 다양한 도메인 검색 프로그램(Pfam, Prosite, Interpro 등)에서 일반적인 RNA 결합형 PPR 단백질에 포함된 PPR 모티프와 전술한 여러 종류의 DNA 결합형 PPR 단백질 포함된 PPR 모티프로, 특별히 구별되지 않는 것으로 밝혀졌다. 따라서, PPR 단백질은 핵산 인식에 필요한 아미노산과는 별도로, DNA와의 결합성 또는 RNA와의 결합성을 결정하는 아미노산(아미노산 군)이 포함되는 것이 아닐까 예상되고 있다.
본 발명자들은 PCT/JP2012/077274에서 RNA 결합형 PPR 모티프와 RNA와 일대일 대응으로 결합하고 연속되는 PPR 모티프에 의해 RNA 서열 중의 연속되는 RNA 염기를 인식하는 것, 그때 PPR 모티프를 구성하는 35개 아미노산 중 특정 3개 아미노산(즉, 모티프를 구성하는 2개의 α-헬릭스 구조 중 최초의 헬릭스(Helix A)의 1번과 4번 아미노산(1번 AA 및 4번 AA) 및 C 말단에서 2번째 아미노산("ii"(-2)번 AA))의 RNA 인식 아미노산의 조합으로 염기 선택적인 RNA의 결합이 결정되는 것을 밝혀내고, PPR 모티프의 RNA 인식코드를 이용한 custum RNA 결합 단백질의 설계 방법과 그의 이용에 대해 특허출원을 하였다.
따라서, PPR 단백질 중에서 DNA와의 결합이 시사된 전술한 밀(소맥, wheat)의 p63(비특허문헌 11, 애기장대(Arabidopis thaliana)의 상동 단백질(homologous protein)의 아미노산 서열을 '서열번호 1'로 함) 애기장대의 GUN1(비특허문헌 12, 아미노산 서열을 '서열번호 2'로 함) 애기장대의 pTac2(비특허문헌 13, 아미노산 서열을 '서열번호 3'으로 함) DG1(비특허문헌 14, 아미노산 서열을 '서열번호 4'로 함) 애기장대의 GRP23(비특허문헌 15, 아미노산 서열을 '서열번호 5'로 함)에 있어서, RNA를 표적으로 하는 경우에 중요하다고 여겨지는 PPR 모티프 중의 핵산 인식코드를 담당하는 3개의 아미노산(1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA)에 있어서 아미노산 출현빈도를 RNA 결합형 모티프로 비교한 결과, 이러한 DNA 결합성이 시사되는 PPR 단백질의 PPR 모티프와 RNA 결합형 모티프 사이에서 아미노산 출현빈도의 경향이 거의 일치하는 것으로 밝혀졌다.
이러한 이유로, RNA 결합형 PPR 모티프의 핵산 인식코드(nucleic acid recognition code)가 DNA 결합형 PPR 모티프에도 적용할 수 있다는 것이 시사되었다. 티민(T)은 5-메틸우라실이라고도 불리우는 것처럼 우라실(U) 5번 위치의 탄소를 메틸화한 구조를 갖는 우라실(U) 유도체이다. 이와 같은 핵산을 구성하는 염기의 성질로부터 RNA 결합형 PPR 모티프의 우라실(U)을 인식하는 아미노산의 결합은 DNA의 경우 티민(T)의 인식에 이용되는 것이 시사되었다.
이러한 연구 결과에 따라, DNA 결합형 PPR 단백질인 상술한 p63(서열번호 1의 아미노산 서열) 애기장대의 GUN1(서열번호 2의 아미노산 서열) 애기장대의 pTac2(서열번호 3의 아미노산 서열), DG1(서열번호 4의 아미노산 서열), 애기장대의 GRP23(서열번호 5의 아미노산 서열)을 주형으로 사용하여, PPR 단백질에 RNA 결합형 PPR 모티프 검토의 결과 얻어진 지견을 적용하여 3개의 아미노산(1번 AA 및 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA)을 배치함으로써, 모든 DNA 서열에 결합하는 custum DNA 결합 단백질의 작제가 가능하다는 점을 밝혀내었다.
즉, 본 발명자들은 서열번호 1의 아미노산 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열, 서열번호 3의 아미노산 서열, 서열번호 4의 아미노산 서열, 서열번호 5의 아미노산 서열에 의해 대표되는 각각의 PPR 모티프 중 3개의 아미노산(1번 AA 및 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA)을 후술하는 특정 아미노산에 한 PPR 모티프를 여러 개, 바람직하게는 2 내지 30개, 보다 바람직하게는 5 내지 25개, 가장 바람직하게는 9 내지 15개 포함하는, DNA 염기 선택적 또는 DNA 염기서열 특이적으로 결합하는 단백질을 제공함으로써, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 다음을 제공한다:
[1] 다음 일반식(1)의 구조를 가지는 모티프를 하나 이상 포함하고, DNA 염기 선택적 또는 DNA 염기서열 특이적으로 결합하는 단백질:
(Helix A)-X-(Helix B)-L ..... 일반식(1)
(상기 식 1에서,
　Helix A는 α-헬릭스 구조를 형성할 수 있는 부분이고;
　X는 존재하지 않거나 또는 1 내지 9개의 아미노산으로 구성되는 부분이며;
　Helix B는 α-헬릭스 구조를 형성할 수 있는 부분이고; 및,
　L은 2 내지 7개의 아미노산으로 구성되는 부분이다)
단, 상기 단백질에 포함된 하나의 PPR 모티프(Mn)는
Helix A의 1번째 아미노산을 1번 아미노산(1번 AA), 4번째 아미노산을 4번 아미노산(4번 AA)로 하고,
· PPR 모티프(Mn)의 C 말단에 연속하여 다음 PPR 모티프(Mn+1)가 존재하는 경우(PPR 모티프 사이에 아미노산 삽입이 없는 경우), PPR 모티프(Mn)를 구성하는 아미노산의 마지막(C 말단)에서 -2번째 아미노산;
· PPR 모티프(Mn)와 그의 C 말단측 다음 PPR 모티프(Mn+1) 사이에 1 내지 20개 아미노산의 비 PPR 모티프(non-PPR motif)가 존재하는 경우, 다음 PPR 모티프(Mn+1)의 1번 아미노산의 2개 상류, 즉 -2번째 아미노산; 또는
· PPR 모티프(Mn)의 C 말단측 다음 PPR 모티프(Mn+1)가 존재하지 않는 경우, 혹은 C 말단측 다음 PPR 모티프(Mn+1)와의 사이에 21개 또는 그 이상 아미노산의 비 PPR 모티프를 구성하는 아미노산이 존재하는 경우, PPR 모티프(Mn)를 구성하는 아미노산의 마지막(C 말단측)에서 2번째 아미노산을
"ii"(-2)번의 아미노산("ii"(-2)번 AA)이라 했을 때,
1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산으로서, 대상(target) DNA 염기 또는 대상 DNA 염기서열에 대응하는 특이적인 아미노산의 조합을 가진다.
[2] [1]에 기재된 단백질에 있어서, 대상 DNA 염기 또는 대상 DNA 염기서열에 대응하는 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산의 조합이, 다음의 어느 하나에 근거하여 결정되는 단백질:
(1-1) 4번 AA가 글리신(G)인 경우, 1번 AA는 임의의 아미노산이어도 좋고, "ii"(-2)번 AA는 아스파라긴산(D), 아스파라긴(N) 또는 세린(S)이고;
(1-2) 4번 AA가 이소류신(I)인 경우, 1번 AA 및 "ii"(-2)번 AA는 모두 임의의 아미노산일 수 있으며;
(1-3) 4번 AA가 류신(L)인 경우, 1번 AA 및 "ii"(-2)번 AA는 모두 임의의 아미노산일 수 있고;
(1-4) 4번 AA가 메티오닌(M)인 경우, 1번 AA 및 "ii"(-2)번 AA는 모두 임의의 아미노산일 수 있으며;
(1-5) 4번 AA가 아스파라긴(N)인 경우, 1번 AA 및 "ii"(-2)번 AA는 모두 임의의 아미노산일 수 있고;
(1-6) 4번 AA가 프롤린(P)인 경우, 1번 AA 및 "ii"(-2)번 AA는 모두 임의의 아미노산일 수 있으며;
(1-7) 4번 AA가 세린(S)인 경우, 1번 AA 및 "ii"(-2)번 AA는 모두 임의의 아미노산일 수 있고;
(1-8) 4번 AA가 트레오닌(T)인 경우, 1번 AA 및 "ii"(-2)번 AA는 모두 임의의 아미노산일 수 있으며; 및,
(1-9) 4번 AA가 발린(V)인 경우, 1번 AA 및 "ii"(-2)번 AA는 모두 임의의 아미노산일 수 있다.
[3] [1]에 기재된 단백질에 있어서, 대상 DNA 염기 또는 대상 DNA 염기서열에 대응하는 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산의 조합이, 다음의 어느 하나에 근거하여 결정되는 단백질:
(2-1) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 글리신, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 G에 선택적으로 결합하고;
(2-2) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 글루타민산, 글리신, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 G에 선택적으로 결합하며;
(2-3) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 글리신, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 A에 선택적으로 결합하고;
(2-4) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 글루타민산, 글리신, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 A에 선택적으로 결합하며;
(2-5) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii" (-2) 번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 글리신, 세린인 경우, 그 PPR 모티프는 A에 선택적으로 결합하고, 다음으로 C에 결합하고;
(2-6) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 이소류신, 임의의 아미노산인 경우, 그 PPR 모티프는 T 및 C에 선택적으로 결합하며;
(2-7) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 이소류신, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프 는 T에 선택적으로 결합하고, 다음으로 C에 결합하고;
(2-8) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 류신, 임의의 아미노산인 경우, 그 PPR 모티프는 T 및 C에 선택적으로 결합하며;
(2-9) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 류신, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합하고;
(2-10) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii "(-2) 번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 류신, 리신인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하며;
(2-11) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 메티오닌, 임의의 아미노산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하고;
(2-12) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 메티오닌, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하며;
(2-13) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 이소류신, 메티오닌, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하고, 다음으로 C에 결합하고;
(2-14) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 아스파라긴, 임의의 아미노산인 경우, 그 PPR 모티프는 C 및 T에 선택적으로 결합하며;
(2-15) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 아스파라긴, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하고;
(2-16) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 페닐알라닌, 아스파라긴, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하며;
(2-17) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii "(-2) 번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 글리신, 아스파라긴, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하고;
(2-18) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 이소류신, 아스파라긴, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하며;
(2-19) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 트레오닌, 아스파라긴, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하고;
(2-20) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 발린, 아스파라긴, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하고, 다음으로 C에 결합하며;
(2-21) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 차례로, 티로신, 아스파라긴, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하고, 다음으로 C에 결합하고;
(2-22) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 아스파라긴, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합하며;
(2-23) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA 3개 아미노산이 순서대로 이소류신, 아스파라긴, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합하고;
(2-24) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 세린, 아스파라긴, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합하며;
(2-25) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii" (-2) 번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 발린, 아스파라긴, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합하고;
(2-26) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 아스파라긴, 세린인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합하며;
(2-27) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 발린, 아스파라긴, 세린인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합하고;
(2-28) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 아스파라긴, 트레오닌인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합하며;
(2-29) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 발린, 아스파라긴, 트레오닌인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합하고;
(2-30) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 아스파라긴, 트립토판인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합하고, 다음으로 T에 결합하며;
(2-31) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 이소류신, 아스파라긴, 트립토판인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하고, 다음으로 C에 결합하고;
(2-32) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 프롤린, 임의의 아미노산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하며;
(2-33) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 프롤린, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하고;
(2-34) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 페닐알라닌, 프롤린, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하며;
(2-35) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 차례로 티로신, 프롤린, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하고;
(2-36) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 세린, 임의의 아미노산인 경우, 그 PPR 모티프는 A 및 G에 선택적으로 결합하며;
(2-37) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 세린, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 A에 선택적으로 결합하고;
(2-38) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 페닐알라닌, 세린, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 A에 선택적으로 결합하며;
(2-39) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 발린, 세린, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 A에 선택적으로 결합하고;
(2-40) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 트레오닌, 임의의 아미노산인 경우, 그 PPR 모티프는 A와 G에 선택적으로 결합하며;
(2-41) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 트레오닌, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 G에 선택적으로 결합하고;
(2-42) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii "(-2) 번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 발린, 트레오닌, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 G에 선택적으로 결합하며;
(2-43) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 트레오닌, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 A에 선택적으로 결합하고;
(2-44) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 페닐알라닌, 트레오닌, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 A에 선택적으로 결합하며;
(2-45) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 이소류신, 트레오닌, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 A에 선택적으로 결합하고;
(2-46) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 발린, 트레오닌, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 A에 선택적으로 결합하며;
(2-47) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 발린, 임의의 아미노산인 경우, 그 PPR 모티프는 A, C 및 T에 결합하지만 G는 결합하지 않고;
(2-48) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 이소류신, 발린, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합하고, 다음으로 A에 결합하며;
(2-49) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 발린, 글리신인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합하고; 및,
(2-50) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 발린, 트레오닌인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합한다.
[4] [1]에 정의된 PPR 모티프(Mn)를 2 내지 30개 포함하는, [1] 내지 [3]의 어느 한 항에 기재된 단백질.
[5] [1]에 정의된 PPR 모티프(Mn)를 5 내지 25개 포함하는, [1] 내지 [3]의 어느 한 항에 기재된 단백질.
[6] [1]에 정의된 PPR 모티프(Mn)를 9 내지 15개 포함하는, [1] 내지 [3]의 어느 한 항에 기재된 단백질.
[7] PPR 모티프를 9개 가지는 서열번호 1의 아미노산 서열, PPR 모티프를 11개 가지는 서열번호 2의 아미노산 서열, PPR 모티프를 15개 가지는 서열번호 3의 아미노산 서열, PPR 모티프를 10개 가지는 서열번호 4의 아미노산 서열, PPR 모티프를 11개 가지는 서열번호 5의 아미노산 서열로부터 선택되는 서열로 구성되는, [6]에 기재된 PPR 단백질.
[8] [2]에 기재된 (1-1) 내지 (1-9) 또는 [3]에 기재된 (2-1) 내지 (2-50)의 어느 하나에 근거하여 PPR 모티프의 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산의 조합에 대응하는 DNA 염기의 존재 여부를 판정함으로써, [1]에 정의된 PPR 모티프(Mn)를 1개 이상(바람직하게는 2 내지 30개) 포함하는 DNA 결합 단백질의 표적이 되는 DNA 염기 또는 DNA 염기서열을 동정하는 방법.
[9] [2]에 기재된 (1-1) 내지 (1-9) 또는 [3]에 기재된 (2-1) 내지 (2-50)의 어느 하나에 근거하여 표적 DNA 염기 또는 표적 DNA를 구성하는 특정 염기에 대응하는, PPR 모티프의 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산의 결합 여부를 판정함으로써, 표적 DNA 염기 또는 특정 염기서열을 갖는 표적 DNA에 결합가능한 [1]에 정의된 PPR 모티프(Mn)를 1개 이상(바람직하게는 2 내지 30개) 포함하는 PPR 단백질을 동정하는 방법.
[10] [1]에 기재된 단백질을 이용하는 DNA의 기능 제어방법.
[11] [1]에 기재된 단백질을 포함하는 영역과 기능성 영역이 연결된 복합체.
[12] [1]에 기재된 단백질의 C 말단에 기능성 영역을 융합하여 구성되는 [11]에 기재된 복합체.
[13] 기능성 영역이 DNA 절단효소 또는 뉴클레아제 영역 또는 전사제어 영역이고, 표적서열 특이적 DNA 절단효소 또는 전사 조절인자 역할을 하는 [11] 또는 [12]에 기재된 복합체.
[14] DNA 절단효소가 FokI의 뉴클레아제 영역(서열번호 6)인 [13]에 기재된 복합체.
[15] 다음의 단계를 포함하는 세포의 유전물질을 개변하는 방법:
표적서열을 갖는 DNA를 포함하는 세포를 준비하는 단계; 및,
[11]에 기재된 복합체를 세포에 도입하여 복합체 단백질로 구성되는 영역이 표적서열을 갖는 DNA에 결합하고, 그로 인해 기능성 영역이 표적서열을 갖는 DNA를 개변하는 단계.
[16] PPR 모티프를 1개 이상 포함하는 PPR 단백질을 이용하여 DNA 염기 또는 특정 염기서열을 갖는 DNA를 동정, 인식 또는 표적화하는 방법.
[17] 단백질이 구성 아미노산 중 3개가 특정 아미노산의 조합인 PPR 모티프를 1개 이상 포함하는 [16]에 기재된 방법.
[18] 단백질이 [1]에 정의된 PPR 모티프(Mn)를 1개 이상 포함하는 [16] 또는 [17]에 기재된 방법.
본 발명에 따르면, 해당 DNA 염기에 결합가능한 PPR 모티프 및 이를 포함하는 단백질을 제공한다. 복수의 PPR 모티프를 배치하여 임의의 서열과 길이를 갖는 표적 DNA에 결합하는 단백질을 제공한다.
본 발명에 따르면, 임의의 PPR 단백질의 표적 DNA를 예측하고 동정할 수 있으며, 반대로 어떤 DNA에 결합하는 PPR 단백질을 예측하고 동정할 수 있다. 표적 DNA 서열을 예측하여 그 유전자의 실체를 밝히고, 유용성을 넓힐 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면, 산업적으로 유용한 PPR 단백질의 유전자에 있어서 다양한 아미노산 다형(amino acid polymorphism)을 가지는 상동 유전자의 기능을 그 표적 DNA 서열의 차이로부터 검정할 수 있다.
또한, 본 발명은 PPR 모티프를 이용한 새로운 DNA 절단효소를 제공한다. 즉, 본 발명에 의해 제공되는 PPR 모티프 또는 PPR 단백질에 기능성 영역 단백질을 연결하여, 특정 핵산서열에 대한 결합활성을 가지고 특정 기능을 갖는 단백질을 포함하는 복합체를 제조할 수 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 기능성 영역은 다양한 기능 중 DNA의 절단, 전사, 복제, 수복, 합성, 수식 등의 어느 하나의 기능을 부여하는 영역을 의미한다. 본 발명의 특징인 PPR 모티프의 서열을 조정하고 표적으로 하는 DNA의 염기서열을 정함으로써 거의 모든 DNA 서열을 표적으로 이용할 수 있으며, 그 표적으로 DNA의 절단, 전사, 복제, 수복, 합성, 수식 등 기능성 영역이 가지는 기능을 이용한 게놈 편집(genome edition)을 실현할 수 있다.
예를 들어, 기능성 영역이 DNA 절단기능을 갖는 경우, 본 발명에서 제조되는 PPR 단백질 부분과 DNA의 절단영역이 연결된 복합체가 제공된다. 이와 같은 복합체는 PPR 단백질 부분에 의해 표적으로 하는 DNA의 염기서열을 인식한 후, DNA의 절단영역에 의해 DNA를 절단하는 인공 DNA 절단효소로서 역할을 한다. 기능성 영역이 전사제어 기능을 갖는 경우, 본 발명에서 제조되는 PPR 단백질 부분과 DNA의 전사제어 영역이 연결된 복합체가 제공된다. 이와 같은 복합체는 PPR 단백질 부분에 의해 표적으로 하는 DNA의 염기서열을 인식한 후, 목적하는 DNA의 전사를 촉진하는 인공 전사조절인자로서 역할을 할 수 있다.
또한, 본 발명에 따라 상기 복합체를 생체 내에 전달하고, 기능하게 하는 방법 또는 본 발명에 의해 얻어진 단백질을 코딩하는 핵산서열(DNA, RNA)을 이용한 형질전환체의 작제나 생물(세포, 조직, 개체)의 다양한 상태에서의 특이적인 개변, 제어 및 기능의 부여에 이용할 수 있다.
도 1은 PPR 모티프의 보존서열과 아미노산 번호를 나타낸다. (A) 본 발명에서 정의하는 PPR 모티프를 구성하는 아미노산 및 그 아미노산 번호를 기재하였다. (B) 결합염기 선택성을 제어하는 3개의 아미노산(1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA)의 예측 구조에서의 위치를 나타낸다. (C) PPR 모티프의 구조적인 두 가지 예와 각각의 경우의 예측 구조에서 아미노산의 위치를 나타낸다. 여기에서, 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA는 단백질 입체구조도(conformational diagram)에서 자홍색(흑백 표시로는 진한 회색)의 막대로 나타내었다.
도 2는 DNA 결합형 DNA의 대사에 역할을 하는 PPR 단백질인 애기장대 p63(서열번호 1의 아미노산 서열), 애기장대의 GUN1(서열번호 2의 아미노산 서열), 애기장대의 pTac2(서열번호 3의 아미노산 서열), DG1(서열번호 4의 아미노산 서열), 애기장대의 GRP23(서열번호 5의 아미노산 서열)의 구조적인 개요 및 그로부터 DNA에 결합하는 것을 나타내는 분석 시스템의 개요에 대하여 정리한 것이다.
도 3은 DNA 결합성이 시사되는 PPR 단백질(서열번호 1 내지 5)의 PPR 모티프와 공지된 RNA 결합형 모티프 사이에서, PPR 모티프 중의 핵산 인식코드를 담당하는 3개의 아미노산(1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA)에 대한 아미노산 출현빈도를 정리한 것이다.
도 4a는 (A) 애기장대 p63(서열번호 1의 아미노산 서열), (B) 애기장대의 GUN1(서열번호 2의 아미노산 서열) 각각에 대해 내부에 포함되는 PPR 모티프의 위치 및 PPR 모티프 중의 핵산 인식코드를 담당하는 3개의 아미노산(1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA)의 위치를 나타낸 것이다.
도 4b는 (C) 애기장대의 pTac2(서열번호 3의 아미노산 서열), (D) DG1(서열번호 4의 아미노산 서열) 각각에 대해 내부에 포함되는 PPR 모티프의 위치 및 PPR 모티프 중의 핵산 인식코드를 담당하는 3개의 아미노산(1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA)의 위치를 나타낸 것이다.
도 4c는 (E) 애기장대의 GRP23(서열번호 5의 아미노산 서열)에 대해 내부에 포함되는 PPR 모티프의 위치 및 PPR 모티프 중의 핵산 인식코드를 담당하는 3개의 아미노산(1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA)의 위치를 나타낸다.
도 5는 PPR 분자의 서열특이적인 DNA 결합능력의 평가를 나타낸다. 3종류의 DNA 결합형(으로 보여지는) PPR 분자에 전사활성화 도메인인 VP64를 융합한 인공 전사인자를 작제하고, 사람 배양세포 내에서 각각의 표적서열을 갖는 루시퍼라제 리포터를 활성화할 수 있는지를 검토하였다.
도 6에서는 pTac2-VP64 및 GUN1-VP64 각각에 대하여 음성 대조군인 pminCMV-luc2와 함께 도입한 경우 및 표적서열을 4개 또는 8개 가지는 리포터 벡터와 함께 도입한 경우의 루시퍼라제 활성을 비교하였다. 그 결과, 양쪽 모두 표적서열을 늘릴수록 활성이 상승하는 경향을 보여, 이들 PPR-VP64 분자가 각각의 표적서열에 특이적으로 결합하는 부위 특이적인 전사 활성화 인자로서 역할을 하는 것이 입증되었다.
[PPR 모티프와 PPR 단백질]
본 발명에서 "PPR 모티프(PPR motif)"라고 함은, 특별히 기재한 경우를 제외하고는, Web에서 단백질 도메인 검색 프로그램(예를 들어, Pfam, Prosite, Uniprot 등)으로 아미노산 서열을 분석할 때, Pfam(http://pfam.sanger.ac.uk/)에서 PF01535, Prosite(http://www.expasy.org/prosite/)에서는 PS51375에서 얻을 수 있는 E 값(E value)이 소정 값 이하(바람직하게는 E-03)의 아미노산 서열을 가지는 30 내지 38개의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드를 의미한다. 또한, Uniprot database(http://www.uniprot.org)에도 다양한 단백질 중의 PPR 모티프가 정의되어 있다.
본 발명의 PPR 모티프는 PPR 모티프의 아미노산 서열의 보존성은 낮지만, 아래 일반식(1)에 나타낸 바와 같이 헬릭스(helix), 루프(loop), 헬릭스, 루프의 2차 구조는 잘 보존되어 있다.
(Helix A)-X-(Helix B)-L ..... 일반식(1)
본 발명에서 정의하는 PPR 모티프를 구성하는 아미노산의 위치번호는 본 발명자들의 논문(Kobayashi K, et al., Nucleic Acids Res., 40, 2712-2723(2012))에 따른다. 즉, 본 발명에서 정의하는 PPR 모티프를 구성하는 아미노산의 위치번호는, Pfam에서의 PF01535개 아미노산 번호와 거의 동일하지만, Prosite에서의 PS51375 아미노산의 번호에서 2를 뺀 수(예; 본 발명의 1번 → PS51375 3번)에 해당하고, Uniprot에서 정의된 PPR 모티프의 아미노산의 번호도 2를 뺀 수에 해당한다.
구체적으로, 본 발명에서 1번 아미노산은 일반식 1로 표시되는 Helix A가 시작하는 1번째 아미노산이다. 4번 아미노산은 1번 아미노산부터 세어서 4번째 아미노산이다. 단, "ii"(-2)번 아미노산이라고 하는 경우는
· PPR 모티프(Mn)의 C 말단에 연속하여 다음 PPR 모티프(Mn+1)가 존재하는 경우(PPR 모티프 사이에 아미노산 삽입이 없는 경우, 예를 들어, 도 4a의 (A)에서는 Motif Nos.1, 2, 3, 4, 6 및 7에 해당한다)는, PPR 모티프(Mn)을 구성하는 아미노산의 마지막(C 말단)에서 -2번째 아미노산을 의미하고;
· PPR 모티프(Mn)과 C 말단의 다음 PPR 모티프(Mn+1) 사이에 1 내지 20개 아미노산의 비 PPR 모티프(PPR 모티프가 아닌 부분)가 존재하는 경우(예를 들어, 도 4a의 (A)에서는 Motif Nos. 5 및 8이 해당되고, 도 4c의 (D)는 Motif Nos. 1, 2, 7과 8이 해당된다)는, 다음 PPR 모티프(Mn+1)의 1번 아미노산에 대하여 2개 상류, 즉 -2번째 아미노산을 "ii"(-2)번 아미노산으로 하며(도 1 참조); 및,
· PPR 모티프(Mn)의 C 말단에 다음 PPR 모티프(Mn+1)를 존재하지 않는 경우(예를 들어, 도 4a(A)의 Motif No. 9(B)의 Motif No. 11이 해당된다) 또는 C 말단의 다음 PPR 모티프(Mn+1) 사이에 21개 또는 그 이상 아미노산의 비 PPR 모티프를 구성하는 아미노산이 존재하는 경우, PPR 모티프(Mn)를 구성하는 아미노산의 마지막(C 말단)에서 2번째 아미노산을 "ii"(-2)번 아미노산으로 한다.
본 발명에서 "PPR 단백질"이라 함은, 특별히 기재한 경우를 제외하고, 상술한 PPR 모티프를 복수 가지는 PPR 단백질을 의미한다. 본 명세서에서 "단백질"이라 함은, 특별히 기재한 경우를 제외하고, 폴리펩티드(복수의 아미노산이 펩티드 결합한 사슬)로 구성되는 물질 전반을 의미하며, 비교적 저분자의 폴리펩티드로 구성되는 것도 이에 포함된다. 본 발명에서 "아미노산"이라 함은 보통의 아미노산 분자 이외에 펩타이드 사슬을 구성하는 아미노산 잔기를 의미함은 문맥으로부터 당업자에게 명백하다.
PPR 단백질은 식물에 많이 존재하고, 애기장대(Arabidopsis thaliana)에서 500 단백질, 약 5,000 모티프가 발견된다. 벼(rice), 포플러(poplar), 부처손(selaginella) 등 많은 육상 식물에서도 다양한 아미노산 서열의 PPR 모티프와 PPR 단백질이 존재한다. 일부 PPR 단백질은 꽃가루 형성(웅성 배우자)의 형성에 작용하는 임성(稔性) 회복인자(fertility restoration factor)로서, 잡종 강세를 위한 F1 종자 취득을 위한 중요한 유전자인 것으로 알려져 있다. 임성(稔性) 회복과 유사한 일부 PPR 단백질은 종 분화에 작용하고 있는 것으로 밝혀져 있다. 대부분의 PPR 단백질은 미토콘드리아 또는 엽록체 중의 RNA에 작용하는 것도 알려져 있다.
동물에서는 LRPPRC으로 동정되는 PPR 단백질의 이상이 Leigh syndrom French Canadian(LSFC; 리 증후군, 아급성 괴사성 뇌척수 질환)을 일으키는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 PPR 모티프의 DNA 염기와의 결합성과 관련하여, "선택적(selective)"이라 함은, 특별히 기재한 경우를 제외하고는, DNA 염기의 어느 하나의 염기에 대한 결합활성이 다른 염기에 대한 결합활성보다 높은 것을 의미한다. 이 선택성은 당업자라면 실험을 기획하고 확인할 수 있으며, 본 명세서의 실시예에 개시된 바와 같이, 계산에 의해 구할 수 있다.
본 발명에서 DNA 염기라고 함은, 특별히 기재한 경우를 제외하고는, DNA를 구성하는 디옥시리보뉴클레오타이드 염기를 의미하며, 구체적으로는 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C) 또는 티민(T) 중 하나를 의미한다. 또한, PPR 단백질은 DNA 중의 염기에 대해 선택성을 가지고 있지만, 핵산 단량체에 결합하는 것은 아니다.
본 발명 이전에는 PPR 모티프로 보존 아미노산의 서열검색법은 확립되어 있지만, 선택적인 DNA 염기와의 결합에 관한 법칙성은 전혀 발견되지 않았다.
[본 발명에 의해 제공되는 지견]
본 발명에 따르면, 다음과 같은 지견이 제공된다.
(I) 선택적인 결합을 위해 중요한 아미노산의 위치에 대한 정보
구체적으로, PPR 모티프, Helix A의 1번째 아미노산을 1번 아미노산, 4번째 아미노산을 4번 아미노산으로, 그리고
· PPR 모티프(Mn)의 C 말단에 연속하여 다음 PPR 모티프(Mn+1)가 있는 경우(PPR 모티프 사이에 아미노산 삽입이 없는 경우), PPR 모티프(Mn)를 구성하는 아미노산의 마지막(C 말단)에서 -2번째 아미노산;
· PPR 모티프(Mn)와 C 말단의 다음 PPR 모티프(Mn+1) 사이에 1 내지 20개 아미노산의 비 PPR 모티프가 존재하는 경우, 다음 PPR 모티프(Mn+1)의 1번 아미노산의 2개 상류, 즉 -2번째 아미노산; 또는
· PPR 모티프(Mn)의 C 말단에 다음 PPR 모티프(Mn+1)가 존재하지 않는 경우 혹은 C 말단의 다음 PPR 모티프(Mn+1) 사이에 21개 또는 그 이상 아미노산의 비 PPR 모티프를 구성하는 아미노산이 존재하는 경우, PPR 모티프(Mn)를 구성하는 아미노산의 마지막(C 말단)에서 2번째 아미노산을 "ii"(-2)번 아미노산으로 하는 경우,
헬릭스(Helix A)의 1번과 4번 아미노산인 1번 AA, 4번 AA, 및 상기에서 정의하는 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산의 조합(1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA)이 DNA 염기의 선택적인 결합을 위해 중요하며, 이러한 조합으로 결합하는 DNA 염기가 어떤 종류인지를 결정할 수 있다.
본 발명은 본 발명자들에 의해 발견된 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3가지 아미노산의 조합에 관한 지견에 근거한다. 구체적으로는
(1-1) 4번 AA가 글리신(G)인 경우, 1번 AA는 임의의 아미노산이어도 좋고, "ii"(-2)번 AA는 아스파라긴산(D), 아스파라긴(N) 또는 세린(S)이며, 예를 들어 1번 AA와 "ii"(-2)번 AA의 조합으로는
· 임의의 아미노산과 아스파라긴산(D)의 조합(* GD) ·
· 바람직하게는 글루타민산(E)과 아스파라긴산(D)의 조합(EGD)
· 임의의 아미노산과 아스파라긴(N)의 조합(* GN)
· 바람직하게는 글루타민산(E)과 아스파라긴(N)의 조합(EGN) 또는
· 임의의 아미노산 세린(S)과의 조합(* GS)이어도 무방하다;
(1-2) 4번 AA가 이소류신(I)인 경우, 1번 AA 및 "ii"(-2)번 AA는 모두 임의의 아미노산이어도 좋고, 예를 들어 1번 AA와 "ii"(-2)번 AA의 조합으로는
· 임의의 아미노산과 아스파라긴(N)과의 조합(* IN)이어도 무방하다;
(1-3) 4번 AA가 류신(L)인 경우, 1번 AA 및 "ii"(-2)번 AA는 모두 임의의 아미노산이어도 좋고, 예를 들어 1번 AA와 "ii"(-2)번 AA의 조합으로는
· 임의의 아미노산과 아스파라긴산(D)의 조합(* LD) 또는
· 임의의 아미노산과 리신(K)의 조합(* LK)이어도 무방하다;
(1-4) 4번 AA가 메티오닌(M)인 경우, 1번 AA 및 "ii"(-2) 번 AA는 모두 임의의 아미노산이어도 좋고, 예를 들어 1번 AA와 "ii"(-2)번 AA의 조합으로는
· 임의의 아미노산과 아스파라긴산(D)의 조합(* MD) 또는
· 이소류신(I)과 아스파라긴산(D)의 조합(IMD)이어도 무방하다;
(1-5) 4번 AA가 아스파라긴(N)인 경우, 1번 AA와 "ii"(-2)번 AA는 모두 임의의 아미노산이어도 좋고, 예를 들어 1번 AA와 "ii "(-2)번 AA의 조합으로는
· 임의의 아미노산과 아스파라긴산(D)의 조합(* ND),
· 페닐알라닌(F), 글리신(G), 이소류신(I), 트레오닌(T), 발린(V), 티로신(Y)의 어느 하나와 아스파라긴산(D)과의 조합(FND, GND, IND, TND, VND 또는 YND)
· 임의의 아미노산과 아스파라긴(N)와 조합(* NN),
· 이소류신(I), 세린(S), 발린(V)의 어느 하나와 아스파라긴(N)과의 조합(INN, SNN 또는 VNN),
· 임의의 아미노산과 세린(S)의 조합(* NS),
· 발린(V)과 세린(S)의 조합(VNS),
· 임의의 아미노산과 트레오닌(T)의 조합(* NT),
· 발린(V)과 트레오닌(T)의 조합(VNT),
· 임의의 아미노산과 트립토판(W)의 조합(* NW) 또는
· 이소류신(I)과 트립토판(W)과의 조합(INW)이어도 무방하다;
(1-6) 4번 AA가 프롤린(P)인 경우, 1번 AA 및 "ii"(-2)번 AA는 모두 임의의 아미노산이어도 좋고, 예를 들어 1번 AA와 "ii"(-2)번 AA의 조합으로는
· 임의의 아미노산과 아스파라긴산(D)의 조합(* PD)
· 페닐알라닌(F)과 아스파라긴산(D)의 조합(FPD) 또는
· 티로신(Y)과 아스파라긴산(D)의 조합(YPD)이어도 무방하다;
(1-7) 4번 AA가 세린(S)인 경우, 1번 AA 및 "ii"(-2)번 AA는 모두 임의의 아미노산이어도 좋고, 예를 들어 1번 AA와 "ii"(-2)번 AA의 조합으로는
· 임의의 아미노산과 아스파라긴(N)의 조합(* SN)
· 페닐알라닌(F)과 아스파라긴(N)의 조합(FSN) 또는
· 발린(V)와 아스파라긴(N)의 조합(VSN)이어도 무방하다;
(1-8) 4번 AA가 트레오닌(T)이면 1번 AA 및 "ii"(-2)번 AA는 모두 임의의 아미노산도 좋고, 예를 들어 1번 AA와 "ii"(-2)번 AA의 조합으로는
· 임의의 아미노산과 아스파라긴산(D)의 조합(* TD),
· 발린(V)과 아스파라긴산(D)의 조합(VTD),
· 임의의 아미노산과 아스파라긴(N)의 조합(* TN),
· 페닐알라닌(F)과 아스파라긴(N)의 조합(FTN),
· 이소류신(I)와 아스파라긴(N)와 조합(ITN) 또는
· 발린(V)과 아스파라긴(N)의 조합(VTN)이어도 무방하다;
(1-9) 4번 AA가 발린(V)인 경우, 1번 AA 및 "ii"(-2)번 AA는 모두 임의의 아미노산이어도 좋고, 예를 들어 1번 AA와 "ii"(-2)번 AA의 조합으로는
· 이소류신(I)과 아스파라긴산(D)의 조합(IVD),
· 임의의 아미노산 글리신(G)의 조합(* VG) 또는
· 임의의 아미노산 트레오닌(T)과의 조합(* VT)이어도 무방하다.
(II) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3가지 아미노산의 조합과 DNA 염기와의 대응에 대한 정보
　구체적으로, 다음에 근거하여 결정되는 단백질로서, 선택적인 DNA 염기 결합기능을 가진다.
(2-1) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 글리신, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 G에 선택적으로 결합한다;
(2-2) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 글루타민산, 글리신, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 G에 선택적으로 결합한다;
(2-3) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 글리신, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 A에 선택적으로 결합한다;
(2-4) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 글루타민산, 글리신, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 A에 선택적으로 결합한다; 　
(2-5) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 글리신, 세린인 경우, 그 PPR 모티프는 A에 선택적으로 결합하고, 다음으로 C에 결합한다;
(2-6) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 이소류신, 임의의 아미노산인 경우, 그 PPR 모티프는 T 및 C에 선택적으로 결합한다;
(2-7) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 이소류신, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하고, 다음으로 C에 대해 결합한다;
(2-8) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 류신, 임의의 아미노산인 경우, 그 PPR 모티프는 T 및 C에 선택적으로 결합한다;
(2-9) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노 류신, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합한다;
(2-10) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 류신, 리신인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합한다;
(2-11) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 메티오닌, 임의의 아미노산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합한다;
(2-12) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii" (-2) 번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 메티오닌, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합한다;
(2-13) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 이소류신, 메티오닌, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하고, 다음으로 C에 결합하는 ;
(2-14) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 아스파라긴, 임의의 아미노산인 경우, 그 PPR 모티프는 C 및 T에 선택적으로 결합한다;
(2-15) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 아스파라긴, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합한다;
(2-16) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 페닐알라닌, 아스파라긴, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합한다;
(2-17) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 글리신, 아스파라긴, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합한다;
(2-18) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 이소류신, 아스파라긴, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합한다;
(2-19) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 트레오닌, 아스파라긴, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합한다;
(2-20) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii" (-2) 번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 발린, 아스파라긴, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하고, 다음으로 C에 결합한다;
(2-21) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 티로신, 아스파라긴, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하고, 다음으로 C에 결합한다;
(2-22) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 아스파라긴, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합한다;
(2-23) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 이소류신, 아스파라긴, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합한다;
(2-24) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 세린, 아스파라긴, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합한다;
(2-25) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 발린, 아스파라긴, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합한다;
(2-26) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 아스파라긴, 세린인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합한다;
(2-27) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA 3개 아미노산이 순서대로 발린, 아스파라긴, 세린인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합한다;
(2-28) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 아스파라긴, 트레오닌인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합한다;
(2-29) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 발린, 아스파라긴, 트레오닌인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합한다;
(2-30) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 아스파라긴, 트립토판인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합하고, 다음으로 T에 결합한다;
(2-31) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 이소류신, 아스파라긴, 트립토판인 경우, 그 PPR 모티프는 T 선택적으로 결합하고, 다음으로 C에 결합한다;
(2-32) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 프롤린, 임의의 아미노산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합한다;
(2-33) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 프롤린, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합한다;
(2-34) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 페닐알라닌, 프롤린, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합한다;
(2-35) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 티로신, 프롤린, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합한다;
(2-36) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 세린, 임의의 아미노산인 경우, 그 PPR 모티프는 A와 G에 선택적으로 결합한다;
(2-37) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 세린, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 A에 선택적으로 결합한다;
(2-38) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 페닐알라닌, 세린, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 A에 선택적으로 결합한다;
(2-39) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 발린, 세린, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 A 선택적으로 결합한다;
(2-40) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 트레오닌, 임의의 아미노산인 경우, 그 PPR 모티프는 A와 G에 선택적으로 결합한다;
(2-41) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 트레오닌, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 G에 선택적으로 결합한다;
(2-42) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 발린, 트레오닌, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 G에 선택적으로 결합한다;
(2-43) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 트레오닌, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 A에 선택적으로 결합한다;
(2-44) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 페닐알라닌, 트레오닌, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 A에 선택적으로 결합한다;
(2-45) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii" (-2) 번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 이소류신, 트레오닌, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 A에 선택적으로 결합한다;
(2-46) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 발린, 트레오닌, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 A에 선택적으로 결합한다;
(2-47) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 발린, 임의의 아미노산인 경우, 그 PPR 모티프는 A, C 및 T에 결합하지만 G는 결합하지 않는다;
(2-48) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 이소류신, 발린, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합하고, 다음으로 A에 결합한다;
(2-49) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 발린, 글리신인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합한다;
(2-50) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 발린, 트레오닌인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합한다.
특정 위치의 아미노산의 특정 조합과 DNA 염기와의 결합성은 실험을 통해 확인할 수 있다. 이러한 목적으로의 실험은 PPR 모티프 또는 복수의 PPR 모티프를 포함하는 단백질의 조제, 기질 DNA의 조제 및 결합성 시험(예를 들어, 겔 시프트법)을 포함한다. 각각의 실험은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 보다 구체적인 절차/조건은, 예를 들면 특허문헌 2를 참조할 수 있다.
[PPR 모티프와 PPR 단백질의 이용]
동정 및 설계:　
하나의 PPR 모티프는 DNA의 특정 단일염기를 인식하고, 연속하는 복수의 PPR 모티프에서 DNA 서열 중의 연속하는 염기를 인식할 수 있다. 본 발명에 따르면, 특정 위치의 아미노산을 적절히 선택함으로써, A, T, G, C 각각에 선택적인 PPR 모티프를 선택하거나 설계할 수 있으며, 그러한 PPR 모티프의 적절한 연속을 포함하는 단백질은 대응하는 해당 특이적인 서열을 인식할 수 있다. 따라서, 본 발명에 의하면 특정 염기서열을 갖는 DNA에 선택적으로 결합하는 천연형 PPR 단백질을 예측/동정할 수 있고, 반대로, PPR 단백질의 결합의 표적이 되는 DNA를 예측/동정할 수 있다. 표적의 예측/동정은 유전적 실체를 밝히는 데 도움이 되고, 표적의 이용가능성을 확대할 수 있는 점에서도 유용하다.
또한, 본 발명에 의하면, 원하는 DNA 염기에 선택적으로 결합가능한 PPR 모티프 및 원하는 DNA에 서열특이적으로 결합가능한 복수의 PPR 모티프를 갖는 단백질을 설계할 수 있다. 설계시에는, PPR 모티프 중 중요한 위치의 아미노산 이외의 부분은 서열번호 1 내지 5에 기재된 바와 같은 DNA 결합형 PPR 단백질 중에서 천연형 PPR 모티프의 서열정보를 참조할 수 있다. 또한, 전체적으로 천연형을 이용하여 해당 위치의 아미노산만을 치환하여 설계할 수 있다. PPR 모티프의 반복 수는 표적서열에 따라 적절하게 선택할 수 있는데, 예를 들어 2개 이상, 2 내지 30개, 보다 바람직하게는 5 내지 25개, 가장 바람직하게는 9 내지 15개로 선택할 수 있다.
설계시에는, 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA 아미노산의 조합 이외에 고려하여도 좋다. 예를 들어, 상술한 특허문헌 2에 기재된 8번 및 12번 아미노산의 선택이 DNA 결합활성을 나타내는 데 중요한 경우가 있다. 본 발명자들의 검토에 따르면, 어떤 PPR 모티프의 8번 아미노산과 그것과 같은 PPR 모티프의 12번 아미노산이 DNA 결합에 협동할 가능성이 있다. 8번 아미노산은 염기성 아미노산, 바람직하게는 리신, 또는 산성 아미노산, 바람직하게는 아스파라긴산으로 하는 것이 가능하고, 12번 아미노산은 염기성 아미노산 또는 중성 아미노산 또는 소수성 아미노산으로 할 수 있다.
설계된 모티프 또는 단백질은 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 제조할 수 있다. 즉, 본 발명은 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA 아미노산의 조합에 착안한 특정 DNA 염기에 선택적으로 결합하는 PPR 모티프 및 특정 서열을 갖는 DNA에 특이적으로 결합하는 PPR 단백질을 제공한다. 이러한 모티프 및 단백질은 당업자에게 잘 알려진 방법으로, 비교적 대량으로도 제조가 가능하며, 이러한 방법은 원하는 모티프 또는 단백질이 갖는 아미노산 서열에서 그것을 암호화하는 핵산서열을 결정하고 복제한 다음, 원하는 모티프 또는 단백질을 생산하는 형질전환체를 작제하는 것을 포함할 수 있다.
복합체의 제조 및 그 이용:
본 발명에 의해 제공되는 PPR 모티프 또는 PPR 단백질은 기능성 영역을 연결하여, 복합체(complex)로 제조할 수 있다. 기능성 영역은 일반적으로, 생체 내 또는 세포 내에서 특정 생물학적 기능, 예를 들면 효소기능, 촉매기능, 억제기능, 항진기능 등의 기능을 갖는 부분 또는 표지로서의 기능을 갖는 부분을 의미한다. 이러한 영역은 예를 들어, 단백질, 펩타이드, 핵산, 생리활성 물질, 약물로 구성된다.
본 발명은 PPR 단백질에 기능성 영역을 연결시킴으로써, PPR 단백질에 의해 발휘되는 표적 DNA 서열 결합기능과 기능성 영역에 의해 발휘되는 기능을 조합하여 발휘시킬 수 있다. 예를 들어, 기능성 영역으로 DNA 절단기능을 갖는 단백질(예 FokI 등의 제한효소) 또는 뉴클레아제 영역을 사용하여 복합체가 인공 DNA 절단효소로 역할을 한다.
이러한 복합체를 제조하기 위해서는 당해 기술분야에서 일반적으로 사용할 수 있는 방법을 이용할 수 있으며, 단지 하나의 단백질 분자로 합성하는 방법과 여러 단백질의 부재를 별도 합성한 후 그들의 부재를 결합하여 복합체를 형성하는 방법 등이 알려져 있다.
일례로, 단지 하나의 단백질 분자로 합성하는 방법의 경우, PPR 단백질의 C 말단 아미노산 링커를 통해 절단효소를 융합 한 단백질 복합체를 설계하여 그 단백질 복합체를 발현하는 발현용 벡터 구조를 구축하고, 상기 구조에서 원하는 복합체를 발현시킬 수 있다. 이러한 제조방법은 특원 2011-242250에 기재된 방법 등을 사용할 수 있다.
PPR 단백질과 기능성 영역 단백질과의 결합은 아미노산에 의한 링커를 통해 연결, 아비딘-비오틴 등의 특이적 친화성을 통한 연결 등의 화학적 링커를 통한 연결 등 당해 기술분야에 알려진 어떠한 연결수단을 이용해도 무방하다.
본 발명에서 사용할 수 있는 기능성 영역으로는, 다양한 기능 중 DNA의 절단, 전사, 복제, 수복, 합성, 수식 등 중 하나의 기능을 부여할 수 있는 영역을 의미한다. 본 발명의 특징인 PPR 모티프의 서열을 조정하고, 표적으로 하는 DNA의 염기서열을 정함으로써, 거의 모든 DNA 서열을 표적으로 이용할 수 있으며, 그의 표적으로 DNA의 절단, 전사, 복제, 수복, 합성, 수식 등 기능성 영역이 가지는 기능을 이용한 게놈 편집을 실현할 수 있다.
예를 들어, 기능성 영역의 기능이 DNA의 절단기능인 경우, 본 발명에서 제조되는 PPR 단백질 부분과 DNA의 절단영역이 연결된 복합체가 제공된다. 이와 같은 복합체는 PPR 단백질 부분에 의해 표적으로 하는 DNA의 염기서열을 인식한 후, DNA의 절단영역에 의해 DNA를 절단하는 인공 DNA 절단효소로 역할을 한다.
본 발명에 사용할 수 있는 절단기능을 갖는 기능성 영역의 예는 엔도디옥시리보뉴클레아제 역할을 하는 디옥시뉴클레아제(DNase)이다. 이러한 DNase의 예로는, DNase A(예를 들어, bovine pancreatic ribonuclease A: PDB 2AAS), DNase H, DNase I 등의 엔도디옥시뉴클레아제, 혹은 다양한 세균 유래의 제한효소(예 FokI(서열번호 6) 등)과 그의 뉴클레아제 영역을 사용할 수 있다. 이러한 PPR 단백질과 기능성 영역을 포함 복합체는 천연에는 존재하지 않는 신규한 것이다.
기능성 영역의 기능이 전사제어 기능인 경우, 본 발명에서 제조되는 PPR 단백질 부분과 DNA의 전사제어 영역이 연결된 복합체가 제공된다. 이와 같은 복합체는 PPR 단백질 부분에 의해 표적으로 하는 DNA의 염기서열을 인식한 후, 원하는 DNA의 전사를 제어하는 인공 전사조절 인자로서 기능할 수 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 전사제어 기능을 갖는 기능성 영역은 전사를 활성화하는 영역이어도 좋고, 전사를 억제하는 영역이어도 무방하다. 전사제어 영역의 예로서는 VP16, VP64, TA2, STAT-6, p65이 있다. 이러한 PPR 단백질과 전사제어 영역을 포함하는 복합체는 천연에는 존재하지 않는 신규한 것이다.
또한, 본 발명에 의해 얻어지는 복합체는 생체 내 또는 세포 내에서 DNA 서열특이적으로 기능성 영역을 전달하고 기능할 수 있다. 따라서, 징크 핑거 단백질(전술한 비특허문헌 1 및 비특허문헌 2)와 TAL effector(전술한 비특허문헌 3, 전술한 특허문헌 1)를 이용한 단백질 복합체뿐만 아니라, 생체 내 또는 세포 내에서 DNA 서열특이적으로 개변(modification)/파괴(disruption)할 수 있고, DNA 절단 및 그 기능을 이용한 게놈 편집이라는 새로운 기능을 부여할 수 있다. 구체적으로는 특정 염기와 결합할 수 있는 PPR 모티프를 여러개 연결한 PPR 단백질에 의해 특정 DNA 서열을 인식할 수 있다. 그리고, PPR 단백질에 결합된 기능성 영역에 따라 기능성 영역이 가지는 기능을 이용하여 인식한 DNA 영역의 게놈 편집을 실현할 수 있다.
또한, DNA 서열특이적으로 결합하는 PPR 단백질에 약물을 결합하여 그 DNA 서열 주변을 대상으로 약물을 전달할 수 있다. 따라서, 본 발명은 DNA 서열특이적인 기능성 물질의 송달 방법을 제공하는 것이기도 하다.
본 발명에서 재료로 하는 PPR 단백질은 DNA 편집의 편집부위의 지정에 작용하고 이와 같은 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA 잔기 위치에 특정 아미노산을 배치한 PPR 모티프가 DNA 상의 특정 염기를 인식한 후, 그 DNA에 결합활성을 갖는 것을 밝혀 내었다. 이러한 특징에 따라 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA 잔기 위치에 특정 아미노산을 배치한 PPR 단백질은 각각의 PPR 단백질에 대해 DNA 상의 특이적인 염기를 인식하고 그 결과로 염기 다형성(base polymorphism)을 도입하는 것, 또는 염기 다형성에 기인한 질환 또는 상태를 처치하는 것이 기대되고, 상술한 바와 같은 다른 기능성 영역과 결합을 통해 DNA를 분리하고 게놈 편집을 실현하기 위한 기능의 개변(modification)/향상(improvemant)에 이바지할 것으로 기대되고 있다.
또한, PPR 단백질의 C 말단에는 외래성의 DNA 절단효소를 융합시킬 수 있다. 또한, N 말단의 PPR 모티프의 결합 DNA 염기 선택성을 개선하여 DNA 서열특이적인 DNA 절단효소를 구성할 수도 있다. 또한, GFP 등의 표지 부분을 연결한 복합체는 원하는 DNA를 생체 내에서 시각화하기 위해 사용하는 것도 가능하다.
DNA 편집에 관여하는 PPR 단백질 및 그 표적서열의 수집
선행기술 문헌(비특허문헌 11 내지 비특허문헌 15)에 제공된 정보를 참조하여, p63 단백질(서열번호 1), GUN1(서열번호 2), pTac2 단백질(서열번호 3), DG1 단백질(서열번호 4), 및 GRP23 단백질(서열번호 5)의 구조 및 기능을 분석하였다.
이러한 단백질 중의 PPR 모티프 구조에 대하여, Uniprot 데이터베이스(http://www.uniprot.org/) 정보와 함께 본 발명에서 정의하는 아미노산 번호를 부여하였다. 실험에 사용된 애기장대의 5종류(서열번호 1 내지 5) PPR 단백질에 포함된 PPR 모티프와 아미노산 번호를 도 3에 기재하였다.
구체적으로는, 전술한 p63 단백질(서열번호 1), GUN1(서열번호 2), pTac2 단백질(서열번호 3), DG1 단백질(서열번호 4) 및 GRP23 단백질(서열번호 5)에 대한 RNA를 표적으로 하는 경우에 중요하다고 여겨지는 PPR 모티프 중 핵산 인식코드를 담당하는 3개의 아미노산(1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA)에 대하여, 아미노산 출현빈도를 RNA 결합형 모티프와 비교하였다.
애기장대의 p63 단백질(서열번호 1)은 9개의 PPR 모티프를 가지고 있으며, 그 아미노산 서열 중 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA 잔기의 위치는 하기 표 및 도 3에 정리한 바와 같다.
애기장대의 GUN1(서열번호 2)은 11개의 PPR 모티프를 가지고 있으며, 그 아미노산 서열 중 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA 잔기의 위치는 하기 표 및 도 3에 정리한 바와 같다.
애기장대의 pTac2(서열번호 3)는 15개의 PPR 모티프를 가지고 있으며, 그 아미노산 서열 중 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA 잔기의 위치는 하기 표 및 도 3에 정리한 바와 같다.
애기장대의 DG1 단백질(서열번호 4)은 10개의 PPR 모티프를 가지고 있으며, 그 아미노산 서열 중 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA 잔기의 위치는 하기 표 및 도 3에 정리한 바와 같다.
애기장대의 GRP23 단백질(서열번호 5)은 11개의 PPR 모티프를 가지고 있으며, 그 아미노산 서열 중 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 잔기의 위치는 하기 표 및 도 3에 정리한 바와 같다.
*이들 위치의 아미노산 빈도를 각각의 단백질에 대해 확인하고, RNA 결합형 모티프의 경우 동일한 위치의 아미노산 빈도와 비교하였다. 결과를 도 2에 나타내었다. 이러한 DNA 결합성이 시사하는 PPR 단백질의 PPR 모티프와 RNA 결합형 모티프 사이에서 아미노산 출현빈도의 경향이 거의 일치하는 것으로 밝혀졌다. 즉, DNA 결합에 작용하는 PPR 단백질은 RNA 결합에 작용하는 PPR 단백질과 동일한 서열규칙으로 핵산과 결합하는 사실, 본 발명자들이 특허출원(PCT/JP2012/077274)에 기재한 RNA 인식코드는 DNA의 결합에 작용하는 PPR 단백질에 대한 DNA 인식코드로서 적용할 수 있다는 사실이 밝혀졌다.
비특허문헌(Yagi, Y. et al., Plos One 2013, 8, e57286)의 RNA 인식코드를 참고하여 각각의 염기에 선택적으로 결합하는 DNA 결합형 PPR 모티프를 평가하였다. 구체적으로, 표 6 및 표 7(DNA 결합코드의 염기선택성)에 나타낸 염기 출현빈도(occurrence nuceotide frequency)와 백그라운드 빈도(background frequency)로부터 산출한 기대값(expected nucleotide frequency)을 바탕으로 카이 제곱 검정법(chi square test)에 의하여 산출하였다. 각각의 염기(NT), 퓨린/피리미딘(AG or CT; PY), 수소결합 그룹(AT or GC; HB) 혹은 아미노·케토형(AC or GT)에 대하여 검정하였다. 유의값을 P <0.06(5.E-02; 5% 유의수준)으로 하여, 어느 하나의 검정에서 유의값이 얻어지는 경우, 1번 아미노산, 4번 아미노산, "ii"(-2)번 아미노산의 조합을 선택하였다.
표 6 및 표 7에는 유의한 염기 선택성을 나타내는 아미노산의 조합의 경우를 열거하였다. 즉, 이러한 결과는 유의한 P값이 얻어진 1번 아미노산, 4번 아미노산, "ii"(-2)번 아미노산(표에서는 (NSRs; 1,4, ii)의 아미노산 종을 가지는 PPR 모티프가 염기 선택적인 결합능력을 부여하는 PPR 모티프인 것, 및 백그라운드 차감 후에서 '긍정적(positive)'의 수치가 클수록 그 염기에 대한 염기 선택성이 높아지는 것을 의미한다. 1번 아미노산, 4번 아미노산, "ii"(-2)번 아미노산 중 4번 아미노산이 염기 선택성에 대해 가장 강하게 관여하고, "ii"(-2)번 아미노산이 염기 선택성에 대해 다음으로 강하게 관여하며, 1번 아미노산이 염기 선택성에 대하여 3개의 아미노산 중에서 약하게 관여한다.
PPR 분자의 서열특이적인 DNA 결합능력 평가
본 실시예에서는 p63, pTac2, GUN1의 3종류의 DNA 결합형(으로 보여지는) PPR 분자로 전사 활성화 도메인인 VP64를 융합시킨 인공 전사인자(transcription factor)를 작제하고, 사람 배양세포에서 각각의 표적서열을 갖는 루시퍼라제 리포터를 활성화할 수 있는지의 여부를 검토함으로써, 각 PPR 분자가 서열특이적인 DNA 결합능력이 있는지의 여부를 조사하였다(도 5).
(실험방법)
1. PPR-VP64 발현벡터의 작제
p63, pTac2, GUN1 코드 서열 중 PPR 모티프에 해당하는 부분만을 인공합성하여 작제하였다. DNA 합성은 Biomatik사의 인공 유전자 합성 서비스를 이용하였다. 백본 벡터(backbone vector)로는 CMV 프로모터를 갖는 pCS2P 벡터를 이용하여 합성한 PPR 서열을 삽입하였다. 또한, PPR 서열의 N 말단에 Flag 태그(Flag tag)와 핵 이행 시그널(nuclear signal transfer)을, C 말단에 VP64 서열을 각각 삽입하였다. 작제한 p63-VP64, pTac2-VP64, GUN1-VP64 서열을 서열목록의 서열번호 7 내지 9로 나타내었다.
2. PPR 표적서열을 갖는 리포터 벡터의 작제
Minimal CMV 프로모터의 하류에 반딧불(firefly)의 루시퍼라제 유전자를 연결하고 프로모터의 상류에 다클로닝 부위(multi-cloning site)를 배치한 리포터 벡터(pminCMV-luc2, 서열번호 10)를 작제하였다. 이 벡터의 다클로닝 부위에 각 PPR 예측 표적서열(predicted target sequence)을 삽입하였다. 각 PPR의 표적서열(p63은 TCTATCACT, pTac2는 AACTTTCGTCACTCA, GUN1는 AATTTGTCGAT, 서열목록의 서열번호 11 내지 13)은 RNA 결합형 PPR에서의 모티프-RNA 간의 인식코드로부터 DNA 결합형 PPR에서의 모티프-DNA 간의 코드를 예측함으로써 결정하였다. 각각의 PPR에 대해서는 표적서열을 4개 삽입한 것과 8개 삽입한 것을 각각 작제하고, 이하의 분석에 사용하였다. 각 벡터의 염기서열은 서열목록의 서열번호 14 내지 19로 나타내었다.
3. HEK293T 세포에의 형질도입
상기 항목 1에서 작제한 PPR-VP64 발현벡터와 상기 항목 2에서 작제한 반딧불(firefly) 루시퍼라제(luciferase) 발현벡터, 또한 참조로서 프로메가사의 pRL-CMV 벡터(레닐라(Renilla) 루시퍼라제 발현벡터)를 라이프테크놀로지스사(Life Technologies)의 리포펙타민(lipofectamine) LTX를 사용하여 도입하였다. 96웰 플레이트의 각 웰에 DMEM 배지를 25μl 이외에도 PPR-VP64 발현벡터 400ng과 반딧불의 루시퍼라제 발현벡터 100ng, pRL-CMV 벡터 20ng을 혼합한 용액을 가하였다. 그 후 DMEM 배지 25μl와 리포펙타민 LTX 0.7μl를 혼합한 용액을 각 웰에 가하고 30분간 실온에서 방치한 다음, 100μl의 15% 소 태아 혈청을 포함하는 DMEM 배지에 현탁한 6 × 104 세포분의 HEK293T 세포를 가하고, 37℃의 CO2 배양기에서 24시간 배양하였다.
4. 루시퍼라제 분석
루시퍼라제는 프로메가사의 Dual-Glo Luciferase Assay System을 사용하고, 키트에 첨부된 설명서대로 분석하였다. 루시퍼라제 활성의 측정에는 베르톨드사(Berthold)의 TriStar LB 941 플레이트 리더를 사용하였다.
(결과고찰)
pTac2-VP64 및 GUN1-VP64 각각에 대해 음성 대조군인 pminCMV-luc2와 함께 도입한 경우 및 표적서열을 4개 또는 8개 가지는 리포터 벡터와 함께 도입한 경우의 루시퍼라제 활성을 비교하였다(하기 표, 도 6). 활성은 Fluc(반딧불의 루시퍼라제)의 측정값을 참조 Rluc(레닐라(Renilla) 루시퍼라제)의 측정값으로 나누어 표준화한 점수(Fluc/Rluc)에 근거하여 비교하였다. 그 결과, 양쪽 모두 표적서열을 늘릴수록 활성이 상승하는 경향을 보였다. 이러한 PPR-VP64 분자가 각각의 표적서열에 특이적으로 결합하는 부위 특이적인 전사 활성화 인자(transcription activator)로서 역할을 하는 것이 입증되었다.
<110> Kyushu University Hiroshima University <120> DNA binding proteins using PPR motifs and use thereof <130> FP 1504-SIKs-JP <150> JP 2013-089840 <151> 2013-04-22 <160> 19 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 596 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 Met Phe Ala Leu Ser Lys Val Leu Arg Arg Thr Gln Arg Leu Arg Leu 1 5 10 15 Gly Ala Cys Ser Ala Val Phe Ser Lys Asp Ile Gln Leu Gly Gly Glu 20 25 30 Arg Ser Phe Asp Ser Asn Ser Ile Ala Ser Thr Lys Arg Glu Ala Val 35 40 45 Pro Arg Phe Tyr Glu Ile Ser Ser Leu Ser Asn Arg Ala Leu Ser Ser 50 55 60 Ser Ala Gly Thr Lys Ser Asp Gln Glu Glu Asp Asp Leu Glu Asp Gly 65 70 75 80 Phe Ser Glu Leu Glu Gly Ser Lys Ser Gly Gln Gly Ser Thr Ser Ser 85 90 95 Asp Glu Asp Glu Gly Lys Leu Ser Ala Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu 100 105 110 Leu Asp Leu Ile Glu Thr Asp Val Ser Arg Lys Thr Val Glu Lys Lys 115 120 125 Gln Ser Glu Leu Phe Lys Thr Ile Val Ser Ala Pro Gly Leu Ser Ile 130 135 140 Gly Ser Ala Leu Asp Lys Trp Val Glu Glu Gly Asn Glu Ile Thr Arg 145 150 155 160 Val Glu Ile Ala Lys Ala Met Leu Gln Leu Arg Arg Arg Arg Met Tyr 165 170 175 Gly Arg Ala Leu Gln Met Ser Glu Trp Leu Glu Ala Asn Lys Lys Ile 180 185 190 Glu Met Thr Glu Arg Asp Tyr Ala Ser Arg Leu Asp Leu Thr Val Lys 195 200 205 Ile Arg Gly Leu Glu Lys Gly Glu Ala Cys Met Gln Lys Ile Pro Lys 210 215 220 Ser Phe Lys Gly Glu Val Leu Tyr Arg Thr Leu Leu Ala Asn Cys Val 225 230 235 240 Ala Ala Gly Asn Val Lys Lys Ser Glu Leu Val Phe Asn Lys Met Lys 245 250 255 Asp Leu Gly Phe Pro Leu Ser Gly Phe Thr Cys Asp Gln Met Leu Leu 260 265 270 Leu His Lys Arg Ile Asp Arg Lys Lys Ile Ala Asp Val Leu Leu Leu 275 280 285 Met Glu Lys Glu Asn Ile Lys Pro Ser Leu Leu Thr Tyr Lys Ile Leu 290 295 300 Ile Asp Val Lys Gly Ala Thr Asn Asp Ile Ser Gly Met Glu Gln Ile 305 310 315 320 Leu Glu Thr Met Lys Asp Glu Gly Val Glu Leu Asp Phe Gln Thr Gln 325 330 335 Ala Leu Thr Ala Arg His Tyr Ser Gly Ala Gly Leu Lys Asp Lys Ala 340 345 350 Glu Lys Val Leu Lys Glu Met Glu Gly Glu Ser Leu Glu Ala Asn Arg 355 360 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cgctatgggc tgaatacaaa ccatcggatc gtggtgtgca 540 gcgagaatag cttgcagttc ttcatgcccg tgttgggtgc cctgttcatc ggtgtggctg 600 tggccccagc taacgacatc tacaacgagc gcgagctgct gaacagcatg ggcatcagcc 660 agcccaccgt cgtattcgtg agcaagaaag ggctgcaaaa gatcctcaac gtgcaaaaga 720 agctaccgat catacaaaag atcatcatca tggatagcaa gaccgactac cagggcttcc 780 aaagcatgta caccttcgtg acttcccatt tgccacccgg cttcaacgag tacgacttcg 840 tgcccgagag cttcgaccgg gacaaaacca tcgccctgat catgaacagt agtggcagta 900 ccggattgcc caagggcgta gccctaccgc accgcaccgc ttgtgtccga ttcagtcatg 960 cccgcgaccc catcttcggc aaccagatca tccccgacac cgctatcctc agcgtggtgc 1020 catttcacca cggcttcggc atgttcacca cgctgggcta cttgatctgc ggctttcggg 1080 tcgtgctcat gtaccgcttc gaggaggagc tattcttgcg cagcttgcaa gactataaga 1140 ttcaatctgc cctgctggtg cccacactat ttagcttctt cgctaagagc actctcatcg 1200 acaagtacga cctaagcaac ttgcacgaga tcgccagcgg cggggcgccg ctcagcaagg 1260 aggtaggtga ggccgtggcc aaacgcttcc acctaccagg catccgccag ggctacggcc 1320 tgacagaaac aaccagcgcc attctgatca cccccgaagg ggacgacaag cctggcgcag 1380 taggcaaggt ggtgcccttc ttcgaggcta aggtggtgga cttggacacc ggtaagacac 1440 tgggtgtgaa ccagcgcggc gagctgtgcg tccgtggccc catgatcatg agcggctacg 1500 ttaacaaccc cgaggctaca aacgctctca tcgacaagga cggctggctg cacagcggcg 1560 acatcgccta ctgggacgag gacgagcact tcttcatcgt ggaccggctg aagagcctga 1620 tcaaatacaa gggctaccag gtagccccag ccgaactgga gagcatcctg ctgcaacacc 1680 ccaacatctt cgacgccggg gtcgccggcc tgcccgacga cgatgccggc gagctgcccg 1740 ccgcagtcgt cgtgctggaa cacggtaaaa ccatgaccga gaaggagatc gtggactatg 1800 tggccagcca ggttacaacc gccaagaagc tgcgcggtgg tgttgtgttc gtggacgagg 1860 tgcctaaagg actgaccggc aagttggacg cccgcaagat ccgcgagatt ctcattaagg 1920 ccaagaaggg cggcaagatc gccgtgaatt cttaactgca gttaatctag agtcggggcg 1980 gccggccgct tcgagcagac atgataagat acattgatga gtttggacaa accacaacta 2040 gaatgcagtg aaaaaaatgc tttatttgtg aaatttgtga tgctattgct ttatttgtaa 2100 ccattataag ctgcaataaa caagttaaca acaacaattg cattcatttt atgtttcagg 2160 ttcaggggga ggtgtgggag gttttttaaa gcaagtaaaa cctctacaaa tgtggtaaaa 2220 tcgataagga tctgaacgat ggagcggaga atgggcggaa ctgggcggag ttaggggcgg 2280 gatgggcgga gttaggggcg ggactatggt tgctgactaa ttgagatgca tgctttgcat 2340 acttctgcct gctggggagc ctggggactt tccacacctg gttgctgact aattgagatg 2400 catgctttgc atacttctgc ctgctgggga gcctggggac tttccacacc ctaactgaca 2460 cacattccac agcggatccg tcgaccgatg cccttgagag ccttcaaccc agtcagctcc 2520 ttccggtggg cgcggggcat gactatcgtc gccgcactta tgactgtctt ctttatcatg 2580 caactcgtag gacaggtgcc ggcagcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg 2640 ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc 2700 cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag 2760 gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca 2820 tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca 2880 ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg 2940 atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag 3000 gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt 3060 tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca 3120 cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg 3180 cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt 3240 tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc 3300 cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg 3360 cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg 3420 gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta 3480 gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg 3540 gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg 3600 ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc 3660 atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc 3720 agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc 3780 ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag 3840 tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat 3900 ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg 3960 caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt 4020 gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag 4080 atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg 4140 accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt 4200 aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct 4260 gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac 4320 tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat 4380 aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat 4440 ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca 4500 aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgcgccct gtagcggcgc 4560 attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct 4620 agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg 4680 tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga 4740 ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt 4800 ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg 4860 aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc 4920 ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat 4980 attaacgctt acaatttgcc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc 5040 ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagcc caagctacca tgataagtaa gtaatattaa 5100 ggtacgggag gtacttggag cggccgcaat aaaatatctt tattttcatt acatctgtgt 5160 gttggttttt tgtgtgaatc gatagtacta acatacgctc tccatcaaaa caaaacgaaa 5220 caaaacaaac tagcaaaata ggctgtcccc agtgcaagtg caggtgccag aacatttctc 5280 tatcgata 5288

Claims (6)

  1. 다음 일반식(1)의 구조를 가지는 PPR 모티프를 1개 또는 2 내지 30개 포함하고 상기 모티프에 근거하여 결정되는 단백질로 구성되는 영역과 기능성 영역이 연결되는 복합체를 이용하는 것을 특징으로 하는 게놈의 편집방법으로서,

    (Helix A)-X-(Helix B)-L ..... 일반식(1)

    (상기 일반식(1)에서,
    　Helix A는 α-헬릭스 구조를 형성할 수 있는 부분이고;
    　X는 존재하지 않거나 또는 1 내지 9개의 아미노산으로 구성되는 부분이며;
    　Helix B는 α-헬릭스 구조를 형성할 수 있는 부분이고; 및,
    　L은 2 내지 7개의 아미노산으로 구성되는 부분이다)

    상기 단백질에 포함되는 하나의 PPR 모티프(Mn)는
    Helix A의 1번째 아미노산을 1번 아미노산(1번 AA), 4번째 아미노산을 4번 아미노산(4번 AA)로 하고,
    · PPR 모티프(Mn)의 C 말단에 연속하여 다음 PPR 모티프(Mn+1)가 존재하는 경우, PPR 모티프(Mn)를 구성하는 아미노산의 마지막(C 말단)에서 -2번째 아미노산;
    · PPR 모티프(Mn)와 그의 C 말단측 다음 PPR 모티프(Mn+1) 사이에 1 내지 20개 아미노산의 비 PPR 모티프가 존재하는 경우, 다음 PPR 모티프(Mn+1)의 1번 아미노산의 2개 상류, 즉 -2번째 아미노산; 또는
    · PPR 모티프(Mn)의 C 말단측 다음 PPR 모티프(Mn+1)이 존재하지 않는 경우, 혹은 C 말단측 다음 PPR 모티프(Mn+1)와의 사이에 21개 또는 그 이상 아미노산의 비 PPR 모티프를 구성하는 아미노산이 존재하는 경우, PPR 모티프(Mn)를 구성하는 아미노산의 마지막(C 말단측)에서 2번째 아미노산을
    "ii"(-2)번의 아미노산("ii"(-2)번 AA)이라 했을 때,
    1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산은 대상(target) DNA 염기 또는 대상 DNA 염기서열에 대응하는 특이적인 아미노산의 조합을 가지는 PPR 모티프이고,
    상기 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산의 조합은, 다음의 어느 하나에 근거하여 결정되는 방법:
    (2-1) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 글리신, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 G에 선택적으로 결합하고;
    (2-2) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 글루타민산, 글리신, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 G에 선택적으로 결합하며;
    (2-3) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 글리신, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 A에 선택적으로 결합하고;
    (2-4) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 글루타민산, 글리신, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 A에 선택적으로 결합하며;
    (2-5) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 글리신, 세린인 경우, 그 PPR 모티프는 A에 선택적으로 결합하고, 다음으로 C에 결합하고;
    (2-6) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 이소류신, 임의의 아미노산인 경우, 그 PPR 모티프는 T 및 C에 선택적으로 결합하며;
    (2-7) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 이소류신, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하고, 다음으로 C에 결합하고;
    (2-8) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 류신, 임의의 아미노산인 경우, 그 PPR 모티프는 T 및 C에 선택적으로 결합하며;
    (2-9) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 류신, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합하고;
    (2-10) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii "(-2) 번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 류신, 리신인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하며;
    (2-11) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 메티오닌, 임의의 아미노산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하고;
    (2-12) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 메티오닌, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하며;
    (2-13) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 이소류신, 메티오닌, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하고, 다음으로 C에 결합하고;
    (2-14) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 아스파라긴, 임의의 아미노산인 경우, 그 PPR 모티프는 C 및 T에 선택적으로 결합하며;
    (2-15) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA 세 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 아스파라긴, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하고;
    (2-16) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 페닐알라닌, 아스파라긴, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하며;
    (2-17) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii "(-2) 번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 글리신, 아스파라긴, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하고;
    (2-18) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 이소류신, 아스파라긴, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하며;
    (2-19) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 트레오닌, 아스파라긴, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하고;
    (2-20) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 발린, 아스파라긴, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하고, 다음으로 C에 결합하며;
    (2-21) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 티로신, 아스파라긴, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하고, 다음으로 C에 결합하고;
    (2-22) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 아스파라긴, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합하며;
    (2-23) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA 3개 아미노산이 순서대로 이소류신, 아스파라긴, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합하고;
    (2-24) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 세린, 아스파라긴, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합하며;
    (2-25) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii" (-2) 번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 발린, 아스파라긴, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합하고;
    (2-26) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 아스파라긴, 세린인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합하며;
    (2-27) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 발린, 아스파라긴, 세린인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합하고;
    (2-28) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 아스파라긴, 트레오닌인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합하며;
    (2-29) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 발린, 아스파라긴, 트레오닌인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합하고;
    (2-30) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 아스파라긴, 트립토판인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합하고, 다음으로 T에 결합하며;
    (2-31) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 이소류신, 아스파라긴, 트립토판인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하고, 다음으로 C에 결합하고;
    (2-32) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 프롤린, 임의의 아미노산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하며;
    (2-33) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 프롤린, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하고;
    (2-34) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 페닐알라닌, 프롤린, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하며;
    (2-35) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 차례로 티로신, 프롤린, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하고;
    (2-36) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 세린, 임의의 아미노산인 경우, 그 PPR 모티프는 A 및 G에 선택적으로 결합하며;
    (2-37) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 세린, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 A에 선택적으로 결합하고;
    (2-38) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 페닐알라닌, 세린, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 A에 선택적으로 결합하며;
    (2-39) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 발린, 세린, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 A에 선택적으로 결합하고;
    (2-40) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 트레오닌, 임의의 아미노산인 경우, 그 PPR 모티프는 A와 G에 선택적으로 결합하며;
    (2-41) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 트레오닌, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 G에 선택적으로 결합하고;
    (2-42) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii "(-2) 번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 발린, 트레오닌, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 G에 선택적으로 결합하며;
    (2-43) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 트레오닌, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 A에 선택적으로 결합하고;
    (2-44) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 페닐알라닌, 트레오닌, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 A에 선택적으로 결합하며;
    (2-45) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 이소류신, 트레오닌, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 A에 선택적으로 결합하고;
    (2-46) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 발린, 트레오닌, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 A에 선택적으로 결합하며;
    (2-47) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 발린, 임의의 아미노산인 경우, 그 PPR 모티프는 A, C 및 T에 결합하지만 G는 결합하지 않고;
    (2-48) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 이소류신, 발린, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합하고, 다음으로 A에 결합하며;
    (2-49) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 발린, 글리신인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합하고; 및,
    (2-50) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 발린, 트레오닌인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합한다
    (단, 상기 게놈의 편집방법은 사람 개체에서의 실시를 제외하고, 아울러 하기 [I] 또는 [II]의 설계방법에 의해 단백질을 설계하고, 그 설계된 단백질로 구성되는 영역과 기능성 영역을 연결한 복합체를 제조하며, 그 제조된 복합체를 이용하는 것을 특징으로 하는 게놈의 편집방법은 제외한다: [I] DNA 염기 또는 특정 염기서열을 가지는 DNA에 결합하는 단백질의 설계방법에 있어서, 상기 단백질을 하기 일반식(1)의 구조를 가지는 PPR 모티프를 1개 이상 포함하고, 단백질에 포함되는 하나의 PPR 모티프(Mn)가 1번 AA, 4번 AA, 및 "ii"(-2)번 AA의 3개의 아미노산을 DNA 염기 또는 특정 염기서열에 대응시키는 방법; [II] [I]의 설계방법에 있어서, 1번 AA, 4번 AA, 및 "ii"(-2)번 AA의 3개의 아미노산의 조합이 상기 (2-1) 내지 (2-50)의 어느 하나인 방법).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 PPR 모티프는, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 단백질이 가지는 9개의 PPR 모티프, 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 단백질이 가지는 11개의 PPR 모티프, 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성되는 단백질이 가지는 15개의 PPR 모티프, 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성되는 단백질이 가지는 10개의 PPR 모티프, 및 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성되는 단백질이 가지는 11개의 PPR 모티프로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는
    방법.
  3. 다음 일반식(1)의 구조를 가지는 모티프에 근거하여 결정되는 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 이용하는 것을 특징으로 하는 게놈의 편집방법으로서,

    (Helix A)-X-(Helix B)-L ..... 일반식(1)

    (상기 일반식(1)에서,
    Helix A는 α-헬릭스 구조를 형성할 수 있는 부분이고;
    X는 존재하지 않거나 또는 1 내지 9개의 아미노산으로 구성되는 부분이며;
    　Helix B는 α-헬릭스 구조를 형성할 수 있는 부분이고; 및,
    　L은 2 내지 7개의 아미노산으로 구성되는 부분이다)

    상기 단백질에 포함되는 하나의 PPR 모티프(Mn)는
    Helix A의 1번째 아미노산을 1번 아미노산(1번 AA), 4번째 아미노산을 4번 아미노산(4번 AA)로 하고,
    · PPR 모티프(Mn)의 C 말단에 연속하여 다음 PPR 모티프(Mn+1)가 존재하는 경우, PPR 모티프(Mn)를 구성하는 아미노산의 마지막(C 말단)에서 -2번째 아미노산;
    · PPR 모티프(Mn)와 그의 C 말단측 다음 PPR 모티프(Mn+1) 사이에 1 내지 20개 아미노산의 비 PPR 모티프가 존재하는 경우, 다음 PPR 모티프(Mn+1)의 1번 아미노산의 2개 상류, 즉 -2번째 아미노산; 또는
    · PPR 모티프(Mn)의 C 말단측 다음 PPR 모티프(Mn+1)이 존재하지 않는 경우, 혹은 C 말단측 다음 PPR 모티프(Mn+1)와의 사이에 21개 또는 그 이상 아미노산의 비 PPR 모티프를 구성하는 아미노산이 존재하는 경우, PPR 모티프(Mn)를 구성하는 아미노산의 마지막(C 말단측)에서 2번째 아미노산을
    "ii"(-2)번의 아미노산("ii"(-2)번 AA)이라 했을 때,
    1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산은 대상(target) DNA 염기 또는 대상 DNA 염기서열에 대응하는 특이적인 아미노산의 조합을 가지는 PPR 모티프이고,
    상기 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산의 조합은, 다음의 어느 하나에 근거하여 결정되는 게놈의 편집방법:
    (2-1) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 글리신, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 G에 선택적으로 결합하고;
    (2-2) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 글루타민산, 글리신, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 G에 선택적으로 결합하며;
    (2-3) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 글리신, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 A에 선택적으로 결합하고;
    (2-4) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 글루타민산, 글리신, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 A에 선택적으로 결합하며;
    (2-5) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 글리신, 세린인 경우, 그 PPR 모티프는 A에 선택적으로 결합하고, 다음으로 C에 결합하고;
    (2-6) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 이소류신, 임의의 아미노산인 경우, 그 PPR 모티프는 T 및 C에 선택적으로 결합하며;
    (2-7) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 이소류신, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하고, 다음으로 C에 결합하고;
    (2-8) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 류신, 임의의 아미노산인 경우, 그 PPR 모티프는 T 및 C에 선택적으로 결합하며;
    (2-9) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 류신, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합하고;
    (2-10) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii "(-2) 번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 류신, 리신인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하며;
    (2-11) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 메티오닌, 임의의 아미노산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하고;
    (2-12) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 메티오닌, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하며;
    (2-13) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 이소류신, 메티오닌, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하고, 다음으로 C에 결합하고;
    (2-14) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 아스파라긴, 임의의 아미노산인 경우, 그 PPR 모티프는 C 및 T에 선택적으로 결합하며;
    (2-15) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA 세 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 아스파라긴, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하고;
    (2-16) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 페닐알라닌, 아스파라긴, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하며;
    (2-17) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii "(-2) 번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 글리신, 아스파라긴, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하고;
    (2-18) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 이소류신, 아스파라긴, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하며;
    (2-19) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 트레오닌, 아스파라긴, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하고;
    (2-20) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 발린, 아스파라긴, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하고, 다음으로 C에 결합하며;
    (2-21) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 티로신, 아스파라긴, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하고, 다음으로 C에 결합하고;
    (2-22) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 아스파라긴, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합하며;
    (2-23) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA 3개 아미노산이 순서대로 이소류신, 아스파라긴, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합하고;
    (2-24) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 세린, 아스파라긴, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합하며;
    (2-25) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii" (-2) 번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 발린, 아스파라긴, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합하고;
    (2-26) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 아스파라긴, 세린인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합하며;
    (2-27) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 발린, 아스파라긴, 세린인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합하고;
    (2-28) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 아스파라긴, 트레오닌인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합하며;
    (2-29) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 발린, 아스파라긴, 트레오닌인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합하고;
    (2-30) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 아스파라긴, 트립토판인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합하고, 다음으로 T에 결합하며;
    (2-31) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 이소류신, 아스파라긴, 트립토판인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하고, 다음으로 C에 결합하고;
    (2-32) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 프롤린, 임의의 아미노산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하며;
    (2-33) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 프롤린, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하고;
    (2-34) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 페닐알라닌, 프롤린, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하며;
    (2-35) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 차례로 티로신, 프롤린, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합하고;
    (2-36) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 세린, 임의의 아미노산인 경우, 그 PPR 모티프는 A 및 G에 선택적으로 결합하며;
    (2-37) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 세린, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 A에 선택적으로 결합하고;
    (2-38) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 페닐알라닌, 세린, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 A에 선택적으로 결합하며;
    (2-39) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 발린, 세린, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 A에 선택적으로 결합하고;
    (2-40) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 트레오닌, 임의의 아미노산인 경우, 그 PPR 모티프는 A와 G에 선택적으로 결합하며;
    (2-41) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 트레오닌, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 G에 선택적으로 결합하고;
    (2-42) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii "(-2) 번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 발린, 트레오닌, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 G에 선택적으로 결합하며;
    (2-43) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 트레오닌, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 A에 선택적으로 결합하고;
    (2-44) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 페닐알라닌, 트레오닌, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 A에 선택적으로 결합하며;
    (2-45) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 이소류신, 트레오닌, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 A에 선택적으로 결합하고;
    (2-46) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 발린, 트레오닌, 아스파라긴인 경우, 그 PPR 모티프는 A에 선택적으로 결합하며;
    (2-47) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 발린, 임의의 아미노산인 경우, 그 PPR 모티프는 A, C 및 T에 결합하지만 G는 결합하지 않고;
    (2-48) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 이소류신, 발린, 아스파라긴산인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합하고, 다음으로 A에 결합하며;
    (2-49) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 발린, 글리신인 경우, 그 PPR 모티프는 C에 선택적으로 결합하고; 및,
    (2-50) 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산이 순서대로 임의의 아미노산, 발린, 트레오닌인 경우, 그 PPR 모티프는 T에 선택적으로 결합한다
    (단, 상기 게놈의 편집방법은 사람 개체에서의 실시는 제외한다).
  4. 제3항에 있어서,
    상기 핵산으로 암호화되는 단백질에 포함되는 PPR 모티프는, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 단백질이 가지는 9개의 PPR 모티프, 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 단백질이 가지는 11개의 PPR 모티프, 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성되는 단백질이 가지는 15개의 PPR 모티프, 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성되는 단백질이 가지는 10개의 PPR 모티프, 및 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성되는 단백질이 가지는 11개의 PPR 모티프로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는
    방법.
  5. 다음의 일반식(1)의 구조를 가지는 PPR 모티프를 1개 이상 포함하고 DNA 염기 또는 특정 염기서열을 가지는 DNA에 결합하는, 단백질을 설계하고, 상기 설계된 단백질을 암호화하는 핵산을 함유하는 벡터를 제조하며, 상기 제조된 벡터를 이용하는 것을 특징으로 하는 게놈의 편집방법으로서,

    (Helix A)-X-(Helix B)-L ..... 일반식(1)

    (상기 일반식(1)에서,
    　Helix A는 α-헬릭스 구조를 형성할 수 있는 부분이고;
    　X는 존재하지 않거나 또는 1 내지 9개의 아미노산으로 구성되는 부분이며;
    　Helix B는 α-헬릭스 구조를 형성할 수 있는 부분이고; 및,
    　L은 2 내지 7개의 아미노산으로 구성되는 부분이다)

    상기 단백질에 포함되는 하나의 PPR 모티프(Mn)는
    Helix A의 1번째 아미노산을 1번 아미노산(1번 AA), 4번째 아미노산을 4번 아미노산(4번 AA)로 하고,
    · PPR 모티프(Mn)의 C 말단에 연속하여 다음 PPR 모티프(Mn+1)가 존재하는 경우, PPR 모티프(Mn)를 구성하는 아미노산의 마지막(C 말단)에서 -2번째 아미노산;
    · PPR 모티프(Mn)와 그의 C 말단측 다음 PPR 모티프(Mn+1) 사이에 1 내지 20개 아미노산의 비 PPR 모티프가 존재하는 경우, 다음 PPR 모티프(Mn+1)의 1번 아미노산의 2개 상류, 즉 -2번째 아미노산; 또는
    · PPR 모티프(Mn)의 C 말단측 다음 PPR 모티프(Mn+1)이 존재하지 않는 경우, 혹은 C 말단측 다음 PPR 모티프(Mn+1)와의 사이에 21개 또는 그 이상 아미노산의 비 PPR 모티프를 구성하는 아미노산이 존재하는 경우, PPR 모티프(Mn)를 구성하는 아미노산의 마지막(C 말단측)에서 2번째 아미노산을
    "ii"(-2)번의 아미노산("ii"(-2)번 AA)이라 했을 때,
    1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산의 조합을 DNA 염기 또는 특정의 염기서열에 대응시키고, 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산의 조합이 제1항에 정의된 (2-1) 내지 (2-50)의 어느 하나인 방법(단, 상기 게놈의 편집방법은 사람 개체에서의 실시를 제외한다).
  6. 다음 일반식(1)의 구조를 가지는 PPR 모티프를 1개 이상 포함하고 이하에 기재된 방법에 의해 설계되는, DNA 염기 또는 특정 염기서열을 가지는 DNA에 결합하는 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 이용하는 것을 특징으로 하는 게놈의 편집방법으로서,

    (Helix A)-X-(Helix B)-L ..... 일반식(1)

    (상기 일반식(1)에서,
    　Helix A는 α-헬릭스 구조를 형성할 수 있는 부분이고;
    　X는 존재하지 않거나 또는 1 내지 9개의 아미노산으로 구성되는 부분이며;
    　Helix B는 α-헬릭스 구조를 형성할 수 있는 부분이고; 및,
    　L은 2 내지 7개의 아미노산으로 구성되는 부분이다)

    상기 단백질에 포함되는 하나의 PPR 모티프(Mn)는
    Helix A의 1번째 아미노산을 1번 아미노산(1번 AA), 4번째 아미노산을 4번 아미노산(4번 AA)로 하고,
    · PPR 모티프(Mn)의 C 말단에 연속하여 다음 PPR 모티프(Mn+1)가 존재하는 경우, PPR 모티프(Mn)를 구성하는 아미노산의 마지막(C 말단)에서 -2번째 아미노산;
    · PPR 모티프(Mn)와 그의 C 말단측 다음 PPR 모티프(Mn+1) 사이에 1 내지 20개 아미노산의 비 PPR 모티프가 존재하는 경우, 다음 PPR 모티프(Mn+1)의 1번 아미노산의 2개 상류, 즉 -2번째 아미노산; 또는
    · PPR 모티프(Mn)의 C 말단측 다음 PPR 모티프(Mn+1)이 존재하지 않는 경우, 혹은 C 말단측 다음 PPR 모티프(Mn+1)와의 사이에 21개 또는 그 이상 아미노산의 비 PPR 모티프를 구성하는 아미노산이 존재하는 경우, PPR 모티프(Mn)를 구성하는 아미노산의 마지막(C 말단측)에서 2번째 아미노산을
    "ii"(-2)번의 아미노산("ii"(-2)번 AA)이라 했을 때,
    1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산의 조합을 DNA 염기 또는 특정의 염기서열에 대응시키고, 1번 AA, 4번 AA 및 "ii"(-2)번 AA의 3개 아미노산의 조합이 제1항에 정의된 (2-1) 내지 (2-50)의 어느 하나인 방법(단, 상기 게놈의 편집방법은 사람 개체에서의 실시를 제외한다).





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