JP6487306B2 - Pprモチーフを利用したdna結合性タンパク質およびその利用 - Google Patents
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Description
[1] 以下の式1の構造を有するPPRモチーフ:
Helix Aは、αヘリックス構造を形成可能な部分であり;
Xは、存在しないかまたは1〜9アミノ酸長からなる部分であり;
Helix Bは、αヘリックス構造を形成可能な部分であり;そして
Lは、2〜7アミノ酸長からなる部分である。)
を1個以上含むタンパク質であって、
タンパク質に含まれる一のPPRモチーフ(Mn)が、
Helix Aの最初のアミノ酸を1番アミノ酸(1番A.A.)、そして4番目のアミノ酸を4番アミノ酸(4番A.A.)とし、そして
・PPRモチーフ(Mn)のC末端側に連続して次のPPRモチーフ(Mn+1)が存在するとき(PPRモチーフ間にアミノ酸挿入がないとき)、PPRモチーフ(Mn)を構成するアミノ酸の最後(C末端側)から-2番目のアミノ酸;
・PPRモチーフ(Mn)とそのC末端側の次のPPRモチーフ(Mn+1)の間に1〜20アミノ酸の非PPRモチーフが見いだされるときは、次のPPRモチーフ(Mn+1)の1番アミノ酸の2個上流、すなわち-2番目のアミノ酸;または
・PPRモチーフ(Mn)のC末端側に次のPPRモチーフ(Mn+1)が見いだせないとき、もしくはC末端側の次のPPRモチーフ(Mn+1)との間に21アミノ酸以上の非PPRモチーフを構成するアミノ酸が見いだされる場合、PPRモチーフ(Mn)を構成するアミノ酸の最後(C末端側)から2番目のアミノ酸
を“ii”(-2)番のアミノ酸(“ii”(-2)番A.A.)としたときに、
1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸を、対象DNA塩基または対象DNA塩基配列に対応した特定のアミノ酸の組み合わせで有するPPRモチーフである、DNA塩基選択的に、またはDNA塩基配列特異的に結合可能なタンパク質。
[2] 1番A.A.、4番A.A.および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸の組み合わせを、対象DNA塩基または対象DNA塩基配列に応じたものとする、[1]に記載のタンパク質であって、アミノ酸の組み合わせが、下記のいずれか:
(1-1)4番A.A.がグリシン(G)である場合、1番A.A.は任意のアミノ酸であってもよく、そして“ii”(-2)番A.A.はアスパラギン酸(D)、アスパラギン(N)またはセリン(S)である;
(1-2)4番A.A.がイソロイシン(I)である場合、1番A.A.および“ii”(-2)番A.A.はいずれも任意のアミノ酸であってもよい;
(1-3)4番A.A.がロイシン(L)である場合、1番A.A.および“ii”(-2)番A.A.はいずれも任意のアミノ酸であってもよい;
(1-4)4番A.A.がメチオニン(M)である場合、1番A.A.および“ii”(-2)番A.A.はいずれも任意のアミノ酸であってもよい;
(1-5)4番A.A.がアスパラギン(N)である場合、1番A.A.および“ii”(-2)番A.A.はいずれも任意のアミノ酸であってもよい;
(1-6)4番A.A.がプロリン(P)である場合、1番A.A.および“ii”(-2)番A.A.はいずれも任意のアミノ酸であってもよい;
(1-7)4番A.A.がセリン(S)である場合、1番A.A.および“ii”(-2)番A.A.はいずれも任意のアミノ酸であってもよい;
(1-8)4番A.A.がトレオニン(T)である場合、1番A.A.および“ii”(-2)番A.A.はいずれも任意のアミノ酸であってもよい;
(1-9)4番A.A.がバリン(V)である場合、1番A.A.および“ii”(-2)番A.A.はいずれも任意のアミノ酸であってもよい;
に基づいて決定される、タンパク質。
[3] 1番A.A.、4番A.A.および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸の組み合わせを、対象DNA塩基または対象DNA塩基配列に応じたものとする、[1]に記載のタンパク質であって、アミノ酸の組み合わせが、下記のいずれか:
(2-1) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、グリシン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Gに選択的に結合する;
(2-2) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、グルタミン酸、グリシン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Gに選択的に結合する;
(2-3) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、グリシン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-4) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、グルタミン酸、グリシン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-5) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、グリシン、セリンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合し、次にCに対して結合する;
(2-6) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、イソロイシン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、TおよびCに選択的に結合する;
(2-7) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、イソロイシン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合し、次にCに対して結合する;
(2-8) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、ロイシン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、TおよびCに選択的に結合する;
(2-9) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、ロイシン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-10) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、ロイシン、リシンであるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-11) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、メチオニン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-12) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、メチオニン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-13) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合し、次にCに対して結合する;
(2-14) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、アスパラギン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、CおよびTに選択的に結合する;
(2-15) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、アスパラギン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-16) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、フェニルアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-17) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、グリシン、アスパラギン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-18) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、イソロイシン、アスパラギン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-19) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、トレオニン、アスパラギン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-20) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、バリン、アスパラギン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合し、次にCに対して結合する;
(2-21) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、チロシン、アスパラギン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合し、次にCに対して結合する;
(2-22) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、アスパラギン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-23) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、イソロイシン、アスパラギン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-24) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、セリン、アスパラギン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-25) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、バリン、アスパラギン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-26) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、アスパラギン、セリンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-27) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、バリン、アスパラギン、セリンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-28) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、アスパラギン、トレオニンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-29) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、バリン、アスパラギン、トレオニンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-30) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、アスパラギン、トリプトファンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合し、次にTに対して結合する;
(2-31) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、イソロイシン、アスパラギン、トリプトファンであるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合し、次にCに対して結合する;
(2-32) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、プロリン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-33) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、プロリン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-34) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、フェニルアラニン、プロリン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-35) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、チロシン、プロリン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-36) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、セリン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、AおよびGに選択的に結合する;
(2-37) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、セリン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-38) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、フェニルアラニン、セリン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-39) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、バリン、セリン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-40) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、トレオニン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、AおよびGに選択的に結合する;
(2-41) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、トレオニン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Gに選択的に結合する;
(2-42) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、バリン、トレオニン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Gに選択的に結合する;
(2-43) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、トレオニン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-44) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-45) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、イソロイシン、トレオニン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-46) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、バリン、トレオニン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-47) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、バリン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、A、CおよびTに結合するが、Gには結合しない;
(2-48) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、イソロイシン、バリン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合し、次にAに対して結合する;
(2-49) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、バリン、グリシンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-50) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、バリン、トレオニンであるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
に基づいて決定される、前記タンパク質。
[4] [1]に定義されるPPRモチーフ(Mn)が、2〜30個含まれる、[1]〜[3]のいずれか1項に記載のタンパク質。
[5] [1]に定義されるPPRモチーフ(Mn)が、5〜25個含まれる、[1]〜[3]のいずれか1項に記載のタンパク質。
[6] [1]に定義されるPPRモチーフ(Mn)が、9〜15個含まれる、[1]〜[3]のいずれか1項に記載のタンパク質。
[7] PPRモチーフを9個有するSEQ ID NO: 1のアミノ酸配列、PPRモチーフを11個有するSEQ ID NO: 2のアミノ酸配列、PPRモチーフを15個有するSEQ ID NO: 3のアミノ酸配列、PPRモチーフを10個有するSEQ ID NO: 4のアミノ酸配列、PPRモチーフを11個有するSEQ ID NO: 5のアミノ酸配列から選択される配列からなる、[6]に記載のPPRタンパク質。
[8] [1]に定義されるPPRモチーフ(Mn)を、1個以上(好ましくは2〜30個)含む、DNA結合性タンパク質の標的となるDNA塩基、またはDNA塩基配列を同定する方法であって:
同定が、[1]に記載の(1-1)〜(1-9)または3に記載の(2-1)〜(2-50)のいずれかに基づいて、PPRモチーフの1番A.A.、4番A.A.および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸の組み合わせに応じたDNA塩基の有無を認定することにより行われる、方法。
[9] 標的DNA塩基、または特定の塩基配列を有する標的DNAに結合可能な、[1]に定義されるPPRモチーフ(Mn)を1個以上(好ましくは2〜30個)含む、PPRタンパク質を同定する方法であって:
同定が、[1]に記載の(1-1)〜(1-9)または[1]に記載の(2-1)〜(2-50)のいずれか基づいて、標的DNA塩基、または標的DNAを構成する特定の塩基に応じた、PPRモチーフの1番A.A.、4番A.A.および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸の組み合わせの有無を認定することにより行われる、方法。
[10] [1]に記載されたタンパク質を用いる、DNAの機能の制御方法。
[11] [1]に記載されたタンパク質からなる領域と機能性領域とが連結されてなる、複合体。
[12] 複合体が、[1]に記載されたタンパク質のC末端側に、機能性領域を融合してなる、[11]に記載の複合体。
[13] 機能性領域が、DNA切断酵素またはそのヌクレアーゼドメイン、または転写制御ドメインであり、複合体が標的配列特異的DNA切断酵素、または転写制御因子として機能する、[11]または[12]に記載の複合体。
[14] DNA切断酵素がFokIのヌクレアーゼドメイン(SEQ ID NO: 6)である、[13]に記載の複合体。
[15] 以下の工程を含む、細胞の遺伝物質を改変する方法:
標的配列を有するDNAを含む細胞を準備し;そして
[11]に記載された複合体を細胞に導入することにより、複合体のタンパク質からなる領域が標的配列を有するDNAに結合し、そのため機能性領域が、標的配列を有するDNAを改変する、前記方法。
[16] PPRモチーフを1個以上含むPPRタンパク質を用いて、DNA塩基または特定の塩基配列を有するDNAを、同定、認識または標的化する方法。
[17] タンパク質が、構成するアミノ酸のうち3つが特定のアミノ酸の組み合わせであるものであるPPRモチーフを1個以上含む、[16]に記載の方法。
[18] タンパク質が、1に定義されたPPRモチーフ(Mn)を1個以上含む、[16]または[17]に記載の方法。
本発明で「PPRモチーフ」というときは、特に記載した場合を除き、Web上のタンパク質ドメイン検索プログラム(例えば、Pfam、Prosite、Uniprotなど)でアミノ酸配列を解析した際に、Pfam(http://pfam.sanger.ac.uk/)においてPF01535、Prosite(http://www.expasy.org/prosite/)においてPS51375で得られるE値が所定値以下(望ましくはE-03)のアミノ酸配列をもつ30〜38アミノ酸で構成されるポリペプチドをいう。また、Uniprot database(http://www.uniprot.org)でも、様々なタンパク質中のPPRモチーフが定義されている。
・PPRモチーフ(Mn)のC末端側に連続して次のPPRモチーフ(Mn+1)が存在するとき(PPRモチーフ間にアミノ酸挿入がないとき、例えば、図4-1の(A)では、Motif Nos.1, 2, 3, 4, 6および7が該当する。)は、PPRモチーフ(Mn)を構成するアミノ酸の最後(C末端側)から-2番目のアミノ酸を指す;
・PPRモチーフ(Mn)とそのC末端側の次のPPRモチーフ(Mn+1)の間に1〜20アミノ酸の非PPRモチーフ(PPRモチーフではない部分)が見いだされるとき(例えば、図4-1の(A)では、Motif Nos. 5および8が該当する。図4-3の(D)では、Motif Nos. 1, 2, 7および8が該当する。)は、次のPPRモチーフ(Mn+1)の1番アミノ酸に対して2個上流、すなわち-2番目のアミノ酸を“ii”(-2)番アミノ酸とする(図1を参照);そして
・PPRモチーフ(Mn)のC末端側に次のPPRモチーフ(Mn+1)が見いだせないとき(例えば、図4-1では、(A)のMotif No. 9、(B)のMotif No. 11が該当する。)、もしくはC末端側の次のPPRモチーフ(Mn+1)との間に21アミノ酸以上の非PPRモチーフを構成するアミノ酸が見いだされる場合、PPRモチーフ(Mn)を構成するアミノ酸の最後(C末端側)から2番目のアミノ酸を“ii”(-2)番のアミノ酸とする。
本発明により、以下の知見が提供される。
具体的には、PPRモチーフの、Helix Aの最初のアミノ酸を1番アミノ酸、そして4番目のアミノ酸を4番アミノ酸とし、そして
・PPRモチーフ(Mn)のC末端側に連続して次のPPRモチーフ(Mn+1)が存在するとき(PPRモチーフ間にアミノ酸挿入がないとき)、PPRモチーフ(Mn)を構成するアミノ酸の最後(C末端側)から-2番目のアミノ酸;
・PPRモチーフ(Mn)とそのC末端側の次のPPRモチーフ(Mn+1)の間に1〜20アミノ酸の非PPRモチーフが見いだされるときは、次のPPRモチーフ(Mn+1)の1番アミノ酸の2個上流、すなわち-2番目のアミノ酸;または
・PPRモチーフ(Mn)のC末端側に次のPPRモチーフ(Mn+1)が見いだせないとき、もしくはC末端側の次のPPRモチーフ(Mn+1)との間に21アミノ酸以上の非PPRモチーフを構成するアミノ酸が見いだされる場合、PPRモチーフ(Mn)を構成するアミノ酸の最後(C末端側)から2番目のアミノ酸
を“ii”(-2)番のアミノ酸とした場合に、ヘリックス(Helix A)の1番および4番アミノ酸である1番A.A.、4番A.A. および上記で定義する“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸の組み合わせ(1番A.A.、4番A.A.および“ii”(-2)番A.A.)が、DNA塩基との選択的な結合のために重要であり、これらの組み合わせにより、結合するDNA塩基がいずれであるかを決定できる。
(1-1)4番A.A.がグリシン(G)である場合、1番A.A.は任意のアミノ酸であってもよく、そして“ii”(-2)番A.A.はアスパラギン酸(D)、アスパラギン(N)またはセリン(S)であり、一例として1番A.A.と“ii”(-2)番A.A.の組み合わせとしては、
・任意のアミノ酸とアスパラギン酸(D)との組み合わせ(*GD)、
・好ましくは、グルタミン酸(E)とアスパラギン酸(D)との組み合わせ(EGD)、
・任意のアミノ酸とアスパラギン(N)との組み合わせ(*GN)、
・好ましくは、グルタミン酸(E)とアスパラギン(N)との組み合わせ(EGN)、または
・任意のアミノ酸とセリン(S)との組み合わせ(*GS)、であってもよい;
(1-2)4番A.A.がイソロイシン(I)である場合、1番A.A.および“ii”(-2)番A.A.はいずれも任意のアミノ酸であってもよく、一例として1番A.A.と“ii”(-2)番A.A.の組み合わせとしては、
・任意のアミノ酸とアスパラギン(N)との組み合わせ(*IN)、であってもよい;
(1-3)4番A.A.がロイシン(L)である場合、1番A.A.および“ii”(-2)番A.A.はいずれも任意のアミノ酸であってもよく、一例として1番A.A.と“ii”(-2)番A.A.の組み合わせとしては、
・任意のアミノ酸とアスパラギン酸(D)との組み合わせ(*LD)、または
・任意のアミノ酸とリシン(K)との組み合わせ(*LK)、であってもよい;
(1-4)4番A.A.がメチオニン(M)である場合、1番A.A.および“ii”(-2)番A.A.はいずれも任意のアミノ酸であってもよく、一例として1番A.A.と“ii”(-2)番A.A.の組み合わせとしては、
・任意のアミノ酸とアスパラギン酸(D)との組み合わせ(*MD)、または
・イソロイシン(I)とアスパラギン酸(D)との組み合わせ(IMD)、であってもよい;
(1-5)4番A.A.がアスパラギン(N)である場合、1番A.A.および“ii”(-2)番A.A.はいずれも任意のアミノ酸であってもよく、一例として1番A.A.と“ii”(-2)番A.A.の組み合わせとしては、
・任意のアミノ酸とアスパラギン酸(D)との組み合わせ(*ND)、
・フェニルアラニン(F)、グリシン(G)、イソロイシン(I)、トレオニン(T)、バリン(V)、チロシン(Y)のいずれかとアスパラギン酸(D)との組み合わせ(FND、GND、IND、TND、VND、またはYND)、
・任意のアミノ酸とアスパラギン(N)との組み合わせ(*NN)、
・イソロイシン(I)、セリン(S)、バリン(V)のいずれかとアスパラギン(N)との組み合わせ(INN、SNN、またはVNN)、
・任意のアミノ酸とセリン(S)との組み合わせ(*NS)、
・バリン(V)とセリン(S)との組み合わせ(VNS)、
・任意のアミノ酸とトレオニン(T)との組み合わせ(*NT)、
・バリン(V)とトレオニン(T)との組み合わせ(VNT)、
・任意のアミノ酸とトリプトファン(W)との組み合わせ(*NW)、または
・イソロイシン(I)とトリプトファン(W)との組み合わせ(INW)、であってもよい;
(1-6)4番A.A.がプロリン(P)である場合、1番A.A.および“ii”(-2)番A.A.はいずれも任意のアミノ酸であってもよく、一例として1番A.A.と“ii”(-2)番A.A.の組み合わせとしては、
・任意のアミノ酸とアスパラギン酸(D)との組み合わせ(*PD)、
・フェニルアラニン(F)とアスパラギン酸(D)との組み合わせ(FPD)、または
・チロシン(Y)とアスパラギン酸(D)との組み合わせ(YPD)、であってもよい;
(1-7)4番A.A.がセリン(S)である場合、1番A.A.および“ii”(-2)番A.A.はいずれも任意のアミノ酸であってもよく、一例として1番A.A.と“ii”(-2)番A.A.の組み合わせとしては、
・任意のアミノ酸とアスパラギン(N)との組み合わせ(*SN)、
・フェニルアラニン(F)とアスパラギン(N)との組み合わせ(FSN)、または
・バリン(V)とアスパラギン(N)との組み合わせ(VSN)、であってもよい;
(1-8)4番A.A.がトレオニン(T)である場合、1番A.A.および“ii”(-2)番A.A.はいずれも任意のアミノ酸であってもよく、一例として1番A.A.と“ii”(-2)番A.A.の組み合わせとしては、
・任意のアミノ酸とアスパラギン酸(D)との組み合わせ(*TD)、
・バリン(V)とアスパラギン酸(D)との組み合わせ(VTD)、
・任意のアミノ酸とアスパラギン(N)との組み合わせ(*TN)、
・フェニルアラニン(F)とアスパラギン(N)との組み合わせ(FTN)、
・イソロイシン(I)とアスパラギン(N)との組み合わせ(ITN)、または
・バリン(V)とアスパラギン(N)との組み合わせ(VTN)、であってもよい;
(1-9)4番A.A.がバリン(V)である場合、1番A.A.および“ii”(-2)番A.A.はいずれも任意のアミノ酸であってもよく、一例として1番A.A.と“ii”(-2)番A.A.の組み合わせとしては、
・イソロイシン(I)とアスパラギン酸(D)との組み合わせ(IVD)、
・任意のアミノ酸とグリシン(G)との組み合わせ(*VG)、または
・任意のアミノ酸とトレオニン(T)との組み合わせ(*VT)、であってもよい。
具体的には、下記のようなものである。
(2-1) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、グリシン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Gに選択的に結合する;
(2-2) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、グルタミン酸、グリシン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Gに選択的に結合する;
(2-3) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、グリシン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-4) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、グルタミン酸、グリシン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-5) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、グリシン、セリンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合し、次にCに対して結合する;
(2-6) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、イソロイシン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、TおよびCに選択的に結合する;
(2-7) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、イソロイシン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合し、次にCに対して結合する;
(2-8) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、ロイシン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、TおよびCに選択的に結合する;
(2-9) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、ロイシン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-10) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、ロイシン、リシンであるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-11) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、メチオニン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-12) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、メチオニン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-13) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合し、次にCに対して結合する;
(2-14) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、アスパラギン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、CおよびTに選択的に結合する;
(2-15) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、アスパラギン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-16) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、フェニルアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-17) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、グリシン、アスパラギン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-18) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、イソロイシン、アスパラギン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-19) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、トレオニン、アスパラギン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-20) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、バリン、アスパラギン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合し、次にCに対して結合する;
(2-21) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、チロシン、アスパラギン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合し、次にCに対して結合する;
(2-22) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、アスパラギン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-23) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、イソロイシン、アスパラギン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-24) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、セリン、アスパラギン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-25) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、バリン、アスパラギン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-26) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、アスパラギン、セリンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-27) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、バリン、アスパラギン、セリンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-28) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、アスパラギン、トレオニンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-29) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、バリン、アスパラギン、トレオニンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-30) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、アスパラギン、トリプトファンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合し、次にTに対して結合する;
(2-31) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、イソロイシン、アスパラギン、トリプトファンであるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合し、次にCに対して結合する;
(2-32) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、プロリン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-33) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、プロリン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-34) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、フェニルアラニン、プロリン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-35) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、チロシン、プロリン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-36) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、セリン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、AおよびGに選択的に結合する;
(2-37) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、セリン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-38) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、フェニルアラニン、セリン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-39) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、バリン、セリン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-40) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、トレオニン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、AおよびGに選択的に結合する;
(2-41) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、トレオニン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Gに選択的に結合する;
(2-42) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、バリン、トレオニン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Gに選択的に結合する;
(2-43) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、トレオニン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-44) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-45) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、イソロイシン、トレオニン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-46) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、バリン、トレオニン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-47) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、バリン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、A、CおよびTに結合するが、Gには結合しない;
(2-48) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、イソロイシン、バリン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合し、次にAに対して結合する;
(2-49) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、バリン、グリシンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-50) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、バリン、トレオニンであるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;に基づいて決定される、タンパク質であって、選択的なDNA塩基結合能を有する。
・条件としては、例えば特許文献2を参考にすることができる。
同定および設計:
一つのPPRモチーフは、DNAの特定の一塩基を認識し、連続した複数個のPPRモチーフで、DNA配列中の連続した塩基を認識しうる。そして、本発明に基づけば、特定の位置のアミノ酸を適切にすることで、A、T、G、Cそれぞれに選択的なPPRモチーフを選択または設計することができ、さらにはそのようなPPRモチーフの適切な連続を含むタンパク質は、対応する特異的な配列を認識しうる。そのため、本発明に基づけば、特定の塩基配列を有するDNAに選択的に結合する天然型PPRタンパク質を予測
・同定することができ、また逆に、PPRタンパク質の結合の標的となるDNAを予測
・同定することができる。標的の予測
・同定は、遺伝子的実体を明らかにするのに役立ち、また標的の利用可能性を拡大しうる点でも有用である。
本発明により提供されるPPRモチーフまたはPPRタンパク質は、機能性領域を連結し、複合体とすることができる。機能性領域とは一般的に、生体内または細胞内で特定の生物学的機能、例えば酵素機能、触媒機能、阻害機能、亢進機能などの機能を有する部分、または標識としての機能を有する部分をいう。そのような領域は、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、生理活性物質、薬剤からなる。
先行技術文献(非特許文献11〜非特許文献15)に示された情報を参照し、p63タンパク質(SEQ ID NO: 1)、GUN1タンパク質(SEQ ID NO: 2)、pTac2タンパク質(SEQ ID NO: 3)、DG1タンパク質(SEQ ID NO: 4)、そしてGRP23タンパク質(SEQ ID NO: 5)の構造および機能を解析した。
・ピリミジン(AG or CT;PY)、水素結合グループ(AT or GC;HB)、もしくは、アミノ
・ケト型(AC or GT)において行った。有意値をP<0.06(5.E-02;5%有意水準)とし、いずれかの検定において有意値が得られた場合に、1番アミノ酸、4番アミノ酸、“ii”(-2)番アミノ酸の組み合わせを選択した。
本実施例では、p63、pTac2、GUN1の3種類のDNA結合型(と目される)PPR分子に、転写活性化ドメインであるVP64を融合させた人工転写因子を作製し、ヒト培養細胞内でそれぞれの標的配列を有するルシフェラーゼレポーターを活性化できるかどうかを検討することで、各PPR分子が配列特異的なDNA結合能を有するかどうかを調べた(図5)。
1. PPR-VP64発現ベクターの作製
p63、pTac2、GUN1のコード配列のうち、PPRモチーフに相当する部分のみを人工合成により作製した。DNA合成はBiomatik社の人工遺伝子合成サービスを利用した。バックボーンベクターとしてはCMVプロモーターを有するpCS2Pベクターを利用し、合成したPPR配列を挿入した。更にPPR配列のN末端にFlagタグと核移行シグナルを、C末端にVP64配列をそれぞれ挿入した。作製したp63-VP64、pTac2-VP64、GUN1-VP64の配列を配列表のSEQ ID NO:7〜9に示す。
Minimal CMVプロモーターの下流にホタルのルシフェラーゼ遺伝子を連結し、プロモーターの上流にマルチクローニングサイトを配置したレポーターベクター(pminCMV-luc2、SEQ ID NO:10)を作製した。このベクターのマルチクローニングサイトに各PPRの予測標的配列を挿入した。各PPRの標的配列(p63はTCTATCACT、pTac2はAACTTTCGTCACTCA、GUN1はAATTTGTCGAT。配列表のSEQ ID NO:11〜13)は、RNA結合型PPRでのモチーフ−RNA間の認識コードから、DNA結合型PPRでのモチーフ−DNA間のコードを予測することによって決定した。それぞれのPPRにつき、標的配列を4つ挿入したものと8つ挿入したものをそれぞれ作製し、以下のアッセイに使用した。各ベクターの塩基配列は、配列表のSEQ ID NO:14〜19に示す。
1で作製したPPR-VP64発現ベクターと、2で作製したホタルルシフェラーゼ発現ベクター、更にリファレンスとしてプロメガ社のpRL-CMVベクター(ウミシイタケルシフェラーゼの発現ベクター)を、ライフテクノロジーズ社のLipofectamine LTXを用いて導入した。96ウェルプレートの各ウェルに、DMEM培地を25 μl加え、更にPPR-VP64発現ベクター400 ngとホタルルシフェラーゼ発現ベクター100 ng、pRL-CMVベクター20 ngを混合した溶液を加えた。その後DMEM培地25 μlとLipofectamine LTX 0.7 μlを混合した溶液を各ウェルに加え、30分室温で静置した後、100 μlの15%ウシ胎児血清を含むDMEM培地に懸濁した6×104細胞分のHEK293T細胞を加え、37℃のCO2インキュベーターで24時間培養した。
ルシフェラーゼアッセイは、プロメガ社のDual-Glo Luciferase Assay Systemを使用し、キットの取扱説明書の通りに行った。ルシフェラーゼ活性の測定にはベルトールド社のTriStar LB 941プレートリーダーを使用した。
pTac2-VP64およびGUN1-VP64のそれぞれについて、ネガティブコントロールとなるpminCMV-luc2と共導入した場合、および標的配列を4つまたは8つ有するレポーターベクターと共導入した場合で、ルシフェラーゼ活性を比較した(下表、図6)。活性の比較はFluc(ホタルルシフェラーゼ)の測定値をリファレンスのRluc(ウミシイタケルシフェラーゼ)の測定値で割り込んで標準化したスコア(Fluc/Rluc)に基づいて行った。その結果、双方とも標的配列を増やすほど活性が上昇する傾向が見られ、これらのPPR-VP64分子がそれぞれの標的配列に特異的に結合し、部位特異的な転写活性化因子として機能していることが証明された。
Claims (16)
- 機能性領域と融合された、DNA塩基または特定の塩基配列を有するDNAに結合する融合タンパク質を設計する方法であって、
DNA塩基または特定の塩基配列を有するDNAに結合する結合性領域を、
以下の式1の構造を有するPPRモチーフ:
Helix Aは、αヘリックス構造を形成可能な部分であり;
Xは、存在しないかまたは1〜9アミノ酸長からなる部分であり;
Helix Bは、αヘリックス構造を形成可能な部分であり;そして
Lは、2〜7アミノ酸長からなる部分である。)
を、1個以上含み;
該結合性領域に含まれる一のPPRモチーフ(Mn)が、
Helix Aの最初のアミノ酸を1番アミノ酸(1番A.A.)、そして4番目のアミノ酸を4番アミノ酸(4番A.A.)とし、そして
・PPRモチーフ(Mn)のC末端側に連続して次のPPRモチーフ(Mn+1)が存在するとき(PPRモチーフ間にアミノ酸挿入がないとき)、PPRモチーフ(Mn)を構成するアミノ酸の最後(C末端側)から-2番目のアミノ酸;
・PPRモチーフ(Mn)とそのC末端側の次のPPRモチーフ(Mn+1)の間に1〜20アミノ酸の非PPRモチーフが見いだされるときは、次のPPRモチーフ(Mn+1)の1番アミノ酸の2個上流、すなわち-2番目のアミノ酸;または
・PPRモチーフ(Mn)のC末端側に次のPPRモチーフ(Mn+1)が見いだせないとき、もしくはC末端側の次のPPRモチーフ(Mn+1)との間に21アミノ酸以上の非PPRモチーフを構成するアミノ酸が見いだされる場合、PPRモチーフ(Mn)を構成するアミノ酸の最後(C末端側)から2番目のアミノ酸
を“ii”(-2)番のアミノ酸(“ii”(-2)番A.A.)としたときに、1番A.A.、4番A.A.および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸の組み合わせを、DNA塩基または特定の塩基配列に応じたものとする、方法。 - 請求項1に記載の方法であって、1番A.A.、4番A.A.および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸の組み合わせが、下記のいずれか:
(1-1)4番A.A.がグリシン(G)である場合、1番A.A.は任意のアミノ酸であってもよく、そして“ii”(-2)番A.A.はアスパラギン酸(D)、アスパラギン(N)またはセリン(S)である;
(1-2)4番A.A.がイソロイシン(I)である場合、1番A.A.および“ii”(-2)番A.A.はいずれも任意のアミノ酸であってもよい;
(1-3)4番A.A.がロイシン(L)である場合、1番A.A.および“ii”(-2)番A.A.はいずれも任意のアミノ酸であってもよい;
(1-4)4番A.A.がメチオニン(M)である場合、1番A.A.および“ii”(-2)番A.A.はいずれも任意のアミノ酸であってもよい;
(1-5)4番A.A.がアスパラギン(N)である場合、1番A.A.および“ii”(-2)番A.A.はいずれも任意のアミノ酸であってもよい;
(1-6)4番A.A.がプロリン(P)である場合、1番A.A.および“ii”(-2)番A.A.はいずれも任意のアミノ酸であってもよい;
(1-7)4番A.A.がセリン(S)である場合、1番A.A.および“ii”(-2)番A.A.はいずれも任意のアミノ酸であってもよい;
(1-8)4番A.A.がトレオニン(T)である場合、1番A.A.および“ii”(-2)番A.A.はいずれも任意のアミノ酸であってもよい;
(1-9)4番A.A.がバリン(V)である場合、1番A.A.および“ii”(-2)番A.A.はいずれも任意のアミノ酸であってもよい;
に基づいて規定されている、方法。 - 請求項1または2に記載の方法であって、1番A.A.、4番A.A.および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸の組み合わせが、下記のいずれか:
(2-1) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、グリシン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Gに選択的に結合する;
(2-2) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、グルタミン酸、グリシン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Gに選択的に結合する;
(2-3) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、グリシン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-4) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、グルタミン酸、グリシン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-5) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、グリシン、セリンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合し、次にCに対して結合する;
(2-6) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、イソロイシン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、TおよびCに選択的に結合する;
(2-7) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、イソロイシン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合し、次にCに対して結合する;
(2-8) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、ロイシン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、TおよびCに選択的に結合する;
(2-9) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、ロイシン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-10) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、ロイシン、リシンであるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-11) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、メチオニン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-12) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、メチオニン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-13) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合し、次にCに対して結合する;
(2-14) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、アスパラギン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、CおよびTに選択的に結合する;
(2-15) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、アスパラギン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-16) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、フェニルアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-17) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、グリシン、アスパラギン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-18) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、イソロイシン、アスパラギン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-19) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、トレオニン、アスパラギン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-20) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、バリン、アスパラギン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合し、次にCに対して結合する;
(2-21) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、チロシン、アスパラギン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合し、次にCに対して結合する;
(2-22) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、アスパラギン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-23) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、イソロイシン、アスパラギン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-24) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、セリン、アスパラギン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-25) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、バリン、アスパラギン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-26) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、アスパラギン、セリンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-27) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、バリン、アスパラギン、セリンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-28) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、アスパラギン、トレオニンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-29) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、バリン、アスパラギン、トレオニンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-30) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、アスパラギン、トリプトファンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合し、次にTに対して結合する;
(2-31) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、イソロイシン、アスパラギン、トリプトファンであるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合し、次にCに対して結合する;
(2-32) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、プロリン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-33) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、プロリン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-34) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、フェニルアラニン、プロリン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-35) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、チロシン、プロリン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-36) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、セリン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、AおよびGに選択的に結合する;
(2-37) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、セリン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-38) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、フェニルアラニン、セリン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-39) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、バリン、セリン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-40) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、トレオニン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、AおよびGに選択的に結合する;
(2-41) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、トレオニン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Gに選択的に結合する;
(2-42) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、バリン、トレオニン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Gに選択的に結合する;
(2-43) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、トレオニン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-44) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-45) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、イソロイシン、トレオニン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-46) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、バリン、トレオニン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-47) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、バリン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、A、CおよびTに結合するが、Gには結合しない;
(2-48) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、イソロイシン、バリン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合し、次にAに対して結合する;
(2-49) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、バリン、グリシンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-50) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、バリン、トレオニンであるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
に基づいて規定されている、方法。 - 機能性領域が、DNA切断酵素またはそのヌクレアーゼドメイン、または転写制御ドメインであり、融合タンパク質が標的配列特異的DNA切断酵素、または転写制御因子として機能する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- DNA切断酵素がFokIのヌクレアーゼドメイン(配列番号6)である、請求項4に記載の方法。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法により設計された融合タンパク質を用いることを特徴とする、ゲノムを編集する方法(ヒト個体での実施を除く。)。
- 請求項6に記載された方法でゲノムを編集し、その編集されたゲノムを製造する方法。
- 請求項6に記載された方法でゲノムを編集し、その編集されたゲノムを含む細胞を製造する方法(ヒト個体での実施を除く。)。
- DNA塩基もしくは特定の塩基配列を有するDNAとの結合における、タンパク質の使用方法であって、
タンパク質が、
以下の式1の構造を有するPPRモチーフ:
Helix Aは、αヘリックス構造を形成可能な部分であり;
Xは、存在しないかまたは1〜9アミノ酸長からなる部分であり;
Helix Bは、αヘリックス構造を形成可能な部分であり;そして
Lは、2〜7アミノ酸長からなる部分である。)
を、1個または2〜30個含んでなるタンパク質であって;
タンパク質に含まれる一のPPRモチーフ(Mn)が、
Helix Aの最初のアミノ酸を1番アミノ酸(1番A.A.)、そして4番目のアミノ酸を4番アミノ酸(4番A.A.)とし、そして
・PPRモチーフ(Mn)のC末端側に連続して次のPPRモチーフ(Mn+1)が存在するとき(PPRモチーフ間にアミノ酸挿入がないとき)、PPRモチーフ(Mn)を構成するアミノ酸の最後(C末端側)から-2番目のアミノ酸;
・PPRモチーフ(Mn)とそのC末端側の次のPPRモチーフ(Mn+1)の間に1〜20アミノ酸の非PPRモチーフが見いだされるときは、次のPPRモチーフ(Mn+1)の1番アミノ酸の2個上流、すなわち-2番目のアミノ酸;または
・PPRモチーフ(Mn)のC末端側に次のPPRモチーフ(Mn+1)が見いだせないとき、もしくはC末端側の次のPPRモチーフ(Mn+1)との間に21アミノ酸以上の非PPRモチーフを構成するアミノ酸が見いだされる場合、PPRモチーフ(Mn)を構成するアミノ酸の最後(C末端側)から2番目のアミノ酸
を“ii”(-2)番のアミノ酸(“ii”(-2)番A.A.)としたときに、1番A.A.、4番A.A.および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸の組み合わせが、下記のいずれか:
(1-1)4番A.A.がグリシン(G)である場合、1番A.A.は任意のアミノ酸であってもよく、そして“ii”(-2)番A.A.はアスパラギン酸(D)、アスパラギン(N)またはセリン(S)である;
(1-2)4番A.A.がイソロイシン(I)である場合、1番A.A.および“ii”(-2)番A.A.はいずれも任意のアミノ酸であってもよい;
(1-3)4番A.A.がロイシン(L)である場合、1番A.A.および“ii”(-2)番A.A.はいずれも任意のアミノ酸であってもよい;
(1-4)4番A.A.がメチオニン(M)である場合、1番A.A.および“ii”(-2)番A.A.はいずれも任意のアミノ酸であってもよい;
(1-5)4番A.A.がアスパラギン(N)である場合、1番A.A.および“ii”(-2)番A.A.はいずれも任意のアミノ酸であってもよい;
(1-6)4番A.A.がプロリン(P)である場合、1番A.A.および“ii”(-2)番A.A.はいずれも任意のアミノ酸であってもよい;
(1-7)4番A.A.がセリン(S)である場合、1番A.A.および“ii”(-2)番A.A.はいずれも任意のアミノ酸であってもよい;
(1-8)4番A.A.がトレオニン(T)である場合、1番A.A.および“ii”(-2)番A.A.はいずれも任意のアミノ酸であってもよい;
(1-9)4番A.A.がバリン(V)である場合、1番A.A.および“ii”(-2)番A.A.はいずれも任意のアミノ酸であってもよい;
に基づいて規定されている、方法。 - 請求項9に記載の方法であって、1番A.A.、4番A.A.および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸の組み合わせが、下記のいずれか:
(2-1) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、グリシン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Gに選択的に結合する;
(2-2) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、グルタミン酸、グリシン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Gに選択的に結合する;
(2-3) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、グリシン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-4) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、グルタミン酸、グリシン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-5) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、グリシン、セリンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合し、次にCに対して結合する;
(2-6) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、イソロイシン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、TおよびCに選択的に結合する;
(2-7) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、イソロイシン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合し、次にCに対して結合する;
(2-8) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、ロイシン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、TおよびCに選択的に結合する;
(2-9) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、ロイシン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-10) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、ロイシン、リシンであるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-11) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、メチオニン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-12) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、メチオニン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-13) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合し、次にCに対して結合する;
(2-14) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、アスパラギン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、CおよびTに選択的に結合する;
(2-15) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、アスパラギン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-16) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、フェニルアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-17) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、グリシン、アスパラギン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-18) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、イソロイシン、アスパラギン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-19) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、トレオニン、アスパラギン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-20) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、バリン、アスパラギン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合し、次にCに対して結合する;
(2-21) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、チロシン、アスパラギン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合し、次にCに対して結合する;
(2-22) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、アスパラギン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-23) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、イソロイシン、アスパラギン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-24) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、セリン、アスパラギン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-25) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、バリン、アスパラギン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-26) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、アスパラギン、セリンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-27) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、バリン、アスパラギン、セリンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-28) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、アスパラギン、トレオニンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-29) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、バリン、アスパラギン、トレオニンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-30) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、アスパラギン、トリプトファンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合し、次にTに対して結合する;
(2-31) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、イソロイシン、アスパラギン、トリプトファンであるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合し、次にCに対して結合する;
(2-32) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、プロリン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-33) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、プロリン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-34) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、フェニルアラニン、プロリン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-35) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、チロシン、プロリン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-36) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、セリン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、AおよびGに選択的に結合する;
(2-37) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、セリン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-38) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、フェニルアラニン、セリン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-39) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、バリン、セリン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-40) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、トレオニン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、AおよびGに選択的に結合する;
(2-41) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、トレオニン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Gに選択的に結合する;
(2-42) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、バリン、トレオニン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Gに選択的に結合する;
(2-43) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、トレオニン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-44) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-45) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、イソロイシン、トレオニン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-46) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、バリン、トレオニン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-47) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、バリン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、A、CおよびTに結合するが、Gには結合しない;
(2-48) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、イソロイシン、バリン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合し、次にAに対して結合する;
(2-49) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、バリン、グリシンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-50) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、バリン、トレオニンであるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
に基づいて規定されている、方法。 - タンパク質をコードする核酸であって、タンパク質が、
以下の式1の構造を有するPPRモチーフ:
Helix Aは、αヘリックス構造を形成可能な部分であり;
Xは、存在しないかまたは1〜9アミノ酸長からなる部分であり;
Helix Bは、αヘリックス構造を形成可能な部分であり;そして
Lは、2〜7アミノ酸長からなる部分である。)
を1個または2〜30個含んでなるタンパク質であって、
タンパク質に含まれる一のPPRモチーフ(Mn)が、
Helix Aの最初のアミノ酸を1番アミノ酸(1番A.A.)、そして4番目のアミノ酸を4番アミノ酸(4番A.A.)とし、そして
・PPRモチーフ(Mn)のC末端側に連続して次のPPRモチーフ(Mn+1)が存在するとき(PPRモチーフ間にアミノ酸挿入がないとき)、PPRモチーフ(Mn)を構成するアミノ酸の最後(C末端側)から-2番目のアミノ酸;
・PPRモチーフ(Mn)とそのC末端側の次のPPRモチーフ(Mn+1)の間に1〜20アミノ酸の非PPRモチーフが見いだされるときは、次のPPRモチーフ(Mn+1)の1番アミノ酸の2個上流、すなわち-2番目のアミノ酸;または
・PPRモチーフ(Mn)のC末端側に次のPPRモチーフ(Mn+1)が見いだせないとき、もしくはC末端側の次のPPRモチーフ(Mn+1)との間に21アミノ酸以上の非PPRモチーフを構成するアミノ酸が見いだされる場合、PPRモチーフ(Mn)を構成するアミノ酸の最後(C末端側)から2番目のアミノ酸
を“ii”(-2)番のアミノ酸(“ii”(-2)番A.A.)としたときに、1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸を、対象DNA塩基または対象DNA塩基配列に対応した特定のアミノ酸の組み合わせで有するPPRモチーフであり、アミノ酸の組み合わせが、下記のいずれか:
(2-1) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、グリシン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Gに選択的に結合する;
(2-2) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、グルタミン酸、グリシン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Gに選択的に結合する;
(2-3) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、グリシン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-4) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、グルタミン酸、グリシン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-5) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、グリシン、セリンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合し、次にCに対して結合する;
(2-6) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、イソロイシン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、TおよびCに選択的に結合する;
(2-7) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、イソロイシン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合し、次にCに対して結合する;
(2-8) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、ロイシン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、TおよびCに選択的に結合する;
(2-9) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、ロイシン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-10) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、ロイシン、リシンであるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-11) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、メチオニン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-12) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、メチオニン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-13) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合し、次にCに対して結合する;
(2-14) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、アスパラギン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、CおよびTに選択的に結合する;
(2-15) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、アスパラギン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-16) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、フェニルアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-17) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、グリシン、アスパラギン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-18) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、イソロイシン、アスパラギン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-19) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、トレオニン、アスパラギン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-20) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、バリン、アスパラギン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合し、次にCに対して結合する;
(2-21) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、チロシン、アスパラギン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合し、次にCに対して結合する;
(2-22) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、アスパラギン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-23) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、イソロイシン、アスパラギン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-24) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、セリン、アスパラギン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-25) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、バリン、アスパラギン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-26) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、アスパラギン、セリンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-27) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、バリン、アスパラギン、セリンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-28) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、アスパラギン、トレオニンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-29) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、バリン、アスパラギン、トレオニンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-30) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、アスパラギン、トリプトファンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合し、次にTに対して結合する;
(2-31) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、イソロイシン、アスパラギン、トリプトファンであるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合し、次にCに対して結合する;
(2-32) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、プロリン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-33) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、プロリン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-34) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、フェニルアラニン、プロリン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-35) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、チロシン、プロリン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-36) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、セリン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、AおよびGに選択的に結合する;
(2-37) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、セリン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-38) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、フェニルアラニン、セリン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-39) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、バリン、セリン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-40) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、トレオニン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、AおよびGに選択的に結合する;
(2-41) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、トレオニン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Gに選択的に結合する;
(2-42) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、バリン、トレオニン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Gに選択的に結合する;
(2-43) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、トレオニン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-44) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-45) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、イソロイシン、トレオニン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-46) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、バリン、トレオニン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-47) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、バリン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、A、CおよびTに結合するが、Gには結合しない;
(2-48) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、イソロイシン、バリン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合し、次にAに対して結合する;
(2-49) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、バリン、グリシンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-50) 1番A.A.、4番A.A.、および“ii”(-2)番A.A.の3つのアミノ酸が、順に、任意のアミノ酸、バリン、トレオニンであるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
に基づいて決定される、前記タンパク質(ただし、SEQ ID NO: 1のアミノ酸配列、SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列、SEQ ID NO: 3のアミノ酸配列、SEQ ID NO: 4のアミノ酸配列およびSEQ ID NO: 5のアミノ酸配列から選択される配列からなるタンパク質を除く。)
である、核酸。 - PPRモチーフが、配列番号1のアミノ酸配列からなるタンパク質が有する9個のPPRモチーフ、配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質が有する11個のPPRモチーフ、配列番号3のアミノ酸配列からなるタンパク質が有する15個のPPRモチーフ、配列番号4のアミノ酸配列からなるタンパク質が有する10個のPPRモチーフ、および配列番号5のアミノ酸配列からなるタンパク質が有する11個のPPRモチーフからなる群から選択されるいずれかである、請求項11に記載の核酸。
- 下記のアミノ酸配列を含んでなる、DNA塩基選択的に、またはDNA塩基配列特異的に結合可能なタンパク質をコードする核酸:
配列番号1の230〜541番からなるアミノ酸配列、配列番号2の234〜621番からなるアミノ酸配列、配列番号3の106〜632番からなるアミノ酸配列、配列番号4の106〜632番からなるアミノ酸配列、および配列番号5の256〜624からなるアミノ酸配列のいずれか一のアミノ酸配列において、一または複数個のアミノ酸が、請求項11に定義した(2-1)〜(2-50)のいずれかに基づいて置換されたアミノ酸配列。 - 請求項11〜13のいずれか1項に記載された核酸を含有する、ベクター。
- 請求項14に記載のベクターが導入された、細胞。
- 大腸菌である、請求項15に記載の細胞。
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