WO2011111829A1 - Pprモチーフを利用したrna結合性蛋白質の改変方法 - Google Patents

Pprモチーフを利用したrna結合性蛋白質の改変方法 Download PDF

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WO2011111829A1
WO2011111829A1 PCT/JP2011/055803 JP2011055803W WO2011111829A1 WO 2011111829 A1 WO2011111829 A1 WO 2011111829A1 JP 2011055803 W JP2011055803 W JP 2011055803W WO 2011111829 A1 WO2011111829 A1 WO 2011111829A1
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ppr
amino acid
protein
rna
motif
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PCT/JP2011/055803
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French (fr)
Inventor
崇裕 中村
啓子 小林
Original Assignee
国立大学法人九州大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants

Definitions

  • the present invention relates to the design of protein factors having various RNA binding properties using a polypeptide having a pentatricopeptide repeat (PPR) motif.
  • the factor group provided by the present invention can be used for RNA control, and is useful in the medical field, agricultural field, and the like.
  • RNA interference gene expression control mediated by small RNA of 21 to 28 bases has been actively used not only in the academic field, but also in the medical field, agricultural field, and industry.
  • RNA control technology using protein factors is highly expected due to its wide range of application from the viewpoint of its action location and duration.
  • the pumilio protein is composed of multiple puf motifs consisting of 38 amino acids, and one puf motif has been shown to bind to one RNA base (Non-patent Document 1), and a novel RNA using pumilio protein Proteins having binding properties (Non-patent Document 2) and RNA binding property modification techniques have been attempted (Non-Patent Document 3).
  • PPR protein pentatricopeptide repeat
  • RNA adapter RNA adapter
  • RNA interference requires many protein factors that eukaryotes originally have, the species that can be adapted are limited to some eukaryotes.
  • gene expression control technology such as the fact that it can only work in the direction of gene expression inhibition, and because it is an RNA component, the action period is short.
  • RNA control technology using protein factors the correlation between the amino acid sequence constituting the protein and the RNA affinity, and the law of the RNA sequence that can bind to the amino acid sequence are hardly clarified.
  • the pumilio protein is exceptionally present, but the motif belonging to the puf family has a highly preserved amino acid sequence between them and a small number of them. Therefore, there is a problem that it can only be used to create a protein factor that acts on a limited RNA sequence.
  • the properties of the PPR protein as an RNA adapter are expected to be determined by the properties of each PPR motif constituting the PPR protein and the properties exhibited by the combination thereof.
  • the PPR motif was identified by a computational scientific method of genome sequence information, and the correlation between its amino acid sequence and function was not clear at all. Once the amino acids essential for the PPR motif to exhibit RNA-binding properties are identified and a method for controlling the binding properties is established, various sequences and lengths can be obtained by modifying the PPR motif or combinations thereof. It may be possible to design new proteins that can bind to RNA molecules.
  • the present inventors made it a task to identify amino acids that play a major role in order for the PPR motif to function as an RNA binding unit, and to provide a technique for controlling the RNA binding characteristics. If a protein factor having various RNA binding characteristics using a PPR motif can be provided, it can be a general-purpose technique that can be used in various situations.
  • the present inventors prepared a plurality of recombinant mini-PPR proteins composed of two PPR motifs, and identified PPR motifs having different RNA binding characteristics. Furthermore, by comparing the RNA binding properties and amino acid sequences, and by performing amino acid substitution, the amino acids necessary for the PPR motif to exhibit RNA binding ability were identified. And by substituting such an amino acid, it succeeded in modifying the RNA binding property (to improve or decrease the RNA binding activity).
  • the RNA binding property of the PPR motif is the number 1, 4, 8, 12 of the first helix (Helix A) of the two ⁇ -helix structures constituting the motif. It was found that amino acids are particularly involved, and by focusing on these amino acids, it is possible to construct PPR motifs having different RNA binding characteristics or novel proteins having such motifs.
  • the present invention provides the following: [1] RNA binding characteristics of a PPR protein having 1 or more (preferably 2 or more, more preferably 2 to 14) PPR motifs comprising a 30-38 amino acid polypeptide represented by formula I A modification method,
  • Helix A is a 12 amino acid long part capable of forming an ⁇ -helix structure.
  • a 1 to A 12 each independently represents an amino acid
  • Helix B is an 11 to 13 amino acid long portion capable of forming an ⁇ helix structure
  • X i to iii are each independently a portion consisting of 1 to 9 amino acids in length or absent.
  • PPR motifs one or more selected from the group consisting of A 1 , A 4 , A 8 , A 9 and A 12 (preferably a group consisting of A 1 , A 4 , A 8 and A 12 ) Substituting a different amino acid with a different amino acid.
  • the PPR protein has two or more PPR motifs and includes any one of the following steps to improve the RNA binding activity of the PPR protein: Substitution of A 1 of the first PPR motif as a basic amino acid, preferably arginine; Substitution of A 4 of the second PPR motif as a neutral amino acid, preferably threonine; The A 8 of the first-th PPR motifs, basic amino acid, preferably lysine substitution, or acidic amino acid, preferably a substituted and aspartic acid; A 12 and / or the second and the first-th PPR motif It substituted a substituted of PPR motifs a 12, which either is a basic amino acid, and the other as a neutral amino acid or a hydrophobic amino acid.
  • a 1 is a basic amino acid, preferably arginine;
  • a 4 is a neutral amino acid, preferably threonine;
  • a 8 is a basic amino acid, preferably lysine, or an acidic amino acid, preferably aspartic acid; and
  • a 12 is a basic amino acid or neutral amino acid or hydrophobic.
  • a method for designing a protein capable of specifically binding to a target base in RNA comprising: 1. A method comprising using the PPR motif defined in 1, wherein A 1 and A 4 are combined in such a manner that a target base is specifically bound, and the base binding specificity of the motif is improved.
  • the target base is adenine, uracil or guanine (preferably adenine or uracil, more preferably adenine), and the combination of A 1 and A 4 is valine and threonine, or isoleucine and threonine;
  • the target base is adenine, guanine or uracil (preferably adenine or guanine, more preferably adenine), and the combination of A 1 and A 4 is, in order, valine and asparagine, isoleucine and asparagine or alanine and asparagine; or
  • the method according to [5] wherein the target base is guanine, thymine or adenine (preferably guanine or thymine, more preferably guanine), and the combination of A 1 and A 4 is leucine and asparagine in this order.
  • [7] The method according to [5] or [6], Using PPR motifs corresponding to each of two or more target bases in RNA, A combination of one motif A 1 and A 4 that specifically binds the corresponding target base to improve the binding specificity of the motif; and another motif A 1 and A 4
  • the method includes a combination in which target bases to be specifically bound are combined and improving the base binding specificity of each motif.
  • the binding activity of a protein having RNA binding properties to RNA can be increased, and conversely, the binding activity can be decreased.
  • the protein is an enzyme
  • an increase in the dissociation rate from the substrate RNA an increase in the number of reactions
  • RNA affinity and binding RNA base selectivity different from those of a natural PPR protein can be provided.
  • PPR motif or PPR protein provided by the present invention is useful for the preparation of complex proteins.
  • the present invention provides polynucleotides (genes, DNAs, RNAs) encoding such proteins, and can be used to create transformants and control and function in various situations in living organisms (cells, tissues, individuals). Can be used for granting.
  • the present invention provides a method for designing a protein having binding specificity to a base in RNA or a desired RNA.
  • composition of amino acids constituting the PPR motif Connection of amino acids 1, 2, 4 and 8 Phases of acidic amino acids or basic amino acids at positions 1, 4, 8, 9, 12 in each PPR motif of PPR protein Binding specificity of mini-PPR protein to RNA Polymorphisms between potential HCF152 homologous proteins Comparison of amino acid sequences of potential HCF152 homologous proteins in various plants (At is HCF152 of Arabidopsis, Vv1 ( Vitis vinifera ), Vv2 ( Vitis vinifera ), Rc ( Ricinus communis ), Pt ( Populus trichocarpa ), Sb ( Sorghum bicolor ), Os ( Oryza sativa ) potential HCF152 homologous protein sequence, the upper line of the sequence is PPR motif and the amino acids (1, 4, 8, 12) involved in RNA interaction are grayed out
  • the secondary structure of the protein (helix, h: coil region, c: ⁇ sheet, e) is described as Helix, and the number of amino acids
  • the term “PPR motif” refers to PF01535 in Pfam, IPR002885 in InterProScan, and PS51375 in Prosite, when the amino acid sequence is analyzed by a protein domain search program on the web, unless otherwise specified.
  • the resulting polypeptide is a polypeptide composed of 30 to 38 amino acids having an amino acid sequence with an E value equal to or less than a predetermined value (preferably E-03).
  • the amino acid location constituting the PPR motif defined in the present invention is synonymous with PF01535 and IPR002885, but is a number obtained by subtracting 2 from the amino acid location of PS51375 (eg, No. 1 ⁇ PS51375 No. 3 of the present invention).
  • a PPR motif consists of 30-38 amino acids and is variable in length, but a typical PPR motif is composed of 35 amino acids.
  • the PPR motif referred to in the present invention preferably has the following structure:
  • Helix A is a 12 amino acid long part capable of forming an ⁇ -helix structure.
  • Helix B is an 11 to 13 amino acid long portion capable of forming an ⁇ helix structure
  • X i to iii are each independently a portion consisting of 1 to 9 amino acids in length or absent.
  • a X represents an amino acid.
  • the first amino acid (A 1 ) may or may not be included in the ⁇ helix structure.
  • the amino acids that serve as the backbone of the ⁇ -helix structure are designated as A 3 , A 6 , A 7 and A 10 .
  • PPR protein refers to a PPR protein having 1 or more, preferably 2 or more, more preferably 2 to 14 PPR motifs, unless otherwise specified.
  • a protein having two PPR motifs is sometimes referred to as a “mini PPR protein”.
  • protein refers to all substances consisting of polypeptides (chains in which a plurality of amino acids are peptide-bound) unless otherwise specified, and includes those consisting of relatively low molecular weight polypeptides. .
  • binding characteristics regarding the ability of a protein to bind to RNA is used as a concept including binding activity and binding specificity, unless otherwise specified.
  • Binding activity is used synonymously with “affinity” in the present invention, unless otherwise specified, and refers to the strength of binding.
  • the presence or absence or degree of binding activity can be appropriately determined by those skilled in the art using various techniques used for the same purpose, and in the examples of the present specification, the details of the gel shift method therefor are described in detail. Explained.
  • Kd dissociation constant
  • RNA base is a base constituting RNA among nucleobases, and specifically refers to adenine (A), guanine (G), cytosine (C), or uracil (U).
  • a protein designed according to the present invention may have binding specificity for a base in RNA, but does not bind to a nucleic acid monomer.
  • a protein when a protein has “binding specificity” with respect to RNA, the binding activity to RNA having a certain base sequence is more than the binding activity to RNA having a different base sequence, unless otherwise specified. It's expensive.
  • a protein can have, for example, a plurality of PPR motifs having binding specificity for each of a plurality of bases in the target RNA.
  • the presence / absence or degree of binding specificity of a protein to an RNA base or RNA can be appropriately determined by those skilled in the art, and in the examples of the present specification, a gel shift method for that purpose is described in detail. .
  • Having binding specificity for an object may mean that the object can be recognized or the object can be identified.
  • Modification of binding characteristics or binding activity is a concept including a case where it is improved and a case where it is lowered.
  • To improve the binding activity means to reduce Kd to 1/10 or less, and to reduce it means to increase Kd by 10 times or more.
  • Kd may vary depending on the RNA used for binding.
  • RNA described in the examples of the present specification can be used as a standard RNA.
  • acidic amino acid refers to an amino acid having a negative charge on the side chain (sometimes expressed as R group) at pH 7.0, unless otherwise specified. Examples of this are aspartic acid and glutamic acid.
  • basic amino acid refers to an amino acid having a positive side chain at pH 7.0, unless otherwise specified, unless otherwise specified. Examples of this are lysine, arginine, and histidine.
  • neutral amino acid means an amino acid that is neither an acidic amino acid nor a basic amino acid unless otherwise specified. Examples are asparagine, serine, glutamine, threonine (sometimes referred to as threonine), glycine, tyrosine, tryptophan, cysteine, methionine, proline, phenylalanine, alanine, valine, leucine, isoleucine.
  • hydrophobic amino acid means an amino acid having a non-polar aliphatic side chain, unless otherwise specified. Hydrophobic amino acids are usually used synonymously with nonpolar amino acids. Examples of hydrophobic amino acids are glycine, tryptophan, methionine, proline, phenylalanine, alanine, valine, leucine, isoleucine.
  • amino acid may refer to a free amino acid or an amino acid residue constituting a peptide chain. Which meaning is used is clear from the context to those skilled in the art.
  • substitution when “substitution” is referred to with respect to the amino acid sequence of a motif or protein, the technique for that is not particularly limited.
  • a means for preparing a polynucleotide related to an amino acid sequence containing a substitution for example, there is a site-directed mutagenesis method (Kramer W & Fritz H-J: Methods Enzymol 154: 350, 1987).
  • a person skilled in the art can refer to the description of the embodiments of the present invention.
  • the present invention relates to substitution of an amino acid at a specific position in a motif or protein, but is not limited to substitution at a position defined as the present invention, and substitution at other positions with an amino acid having similar properties, Motifs or proteins can be made and including such substitutions are also within the scope of the present invention.
  • Substitution with amino acids having similar properties means, for example, substitution between acidic amino acids, substitution between basic amino acids, substitution between neutral amino acids, substitution between hydrophobic amino acids.
  • the number of amino acids substituted in this respect is not particularly limited as long as the polypeptide comprising the amino acid sequence has a desired function, but is, for example, about 1 to 9, or about 1 to 4.
  • the present invention provides the following findings: (1) From the amino acid sequence of the PPR motif and preliminary structure prediction, it is predicted that amino acids contributing to RNA binding are arranged in Helix A. (2) Introduction of substitution into five amino acids of A 1 , A 4 , A 8 , A 9 , and A 12 can lead to alteration of RNA binding properties. (3) The first (upstream) PPR motifs A 1 , A 4 and A 8 actively act on binding to RNA. That is, by appropriately manipulating A 1 , A 4 and A 8 , the RNA affinity of the PPR motif and thus the PPR protein can be improved.
  • RNA affinity PPR motifs when containing a plurality of PPR motifs, motifs and neutral (or hydrophobic) 12 th amino acid is a basic amino acid at amino acid
  • An RNA affinity can be expected to be improved by appropriately combining a certain motif.
  • (6) that there PPR A 1 motif, and A 4 on the same PPR motif may have cooperate in RNA binding and the A 8 of a PPR motif therewith and the A 12 the same PPR motif May cooperate in RNA binding.
  • the affinity of an existing PPR protein can be modified.
  • PPR proteins exist in plants. For example, certain PPR proteins work to form pollen formation (male gametes), but their RNA affinity can be modified to increase pollen formation efficiency. In addition, since existing PPR proteins often work in mitochondria and chloroplasts, modification of RNA affinity of PPR protein is modification of function of mitochondria and chloroplast (abnormality of PPR protein, photosynthesis, respiration, It is known that the synthesis of useful metabolites is altered.). In animals, PPR protein abnormalities identified as LRPPRC are known to cause Leigh syndrome French Canadian (LSFC; Lie syndrome, subacute necrotizing encephalomyelopathy), so the present invention treats LSFC (prevention, Treatment, suppression of progression).
  • LSFC Leigh syndrome French Canadian
  • Lie syndrome subacute necrotizing encephalomyelopathy
  • the modified PPR motif or PPR protein obtained by the present invention can be linked to other functional proteins and used as a useful complex protein.
  • one PPR protein has an RNA cleavage domain linked after a repeat of the PPR motif.
  • RNA binding domains By connecting RNA binding domains in this way, a sequence-specific RNA cleaving enzyme (restriction enzyme RNA version) can be constructed.
  • GFP green fluorescent protein
  • ribosomal S1 protein can be linked to improve translation speed.
  • some of the existing PPR proteins act on DNA.
  • a domain that is localized in the nucleus and interacts with Pol2 an RNA transcriptase present in the nucleus
  • Pol2 an RNA transcriptase present in the nucleus
  • PPR proteins are known to function in editing site specification in RNA editing (conversion of genetic information on RNA; in many cases C ⁇ U).
  • This type of PPR protein has a domain at the C-terminus that is predicted to interact with an RNA editing enzyme called the E domain.
  • E domain By linking such E domains, nucleotide polymorphisms can be introduced, and diseases or conditions associated with nucleotide polymorphisms can contribute to treatment.
  • the present invention relates to a novel PPR protein, that is, SEQ ID NOs: 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126. 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 168, 170, 172 or 174
  • a protein including a part having the same.
  • RNA binding protein DNA or RNA
  • proteins and polynucleotides may be synthetic or natural, and can be prepared by those skilled in the art using existing methods.
  • the present invention relates to substitution of an amino acid at a specific position in a motif or protein.
  • a protein that specifically binds to RNA having any RNA base or any sequence is designed. can do.
  • the motif When the first and fourth amino acids of a PPR motif are valine and asparagine, isoleucine and asparagine, or alanine and asparagine, the motif binds strongly to A, then to G, and then to U May have sex. (10) When the 1st and 4th amino acids of a PPR motif are leucine and asparagine, the motif may have a specificity to bind G, then T, then A. (11) A protein composed of a single PPR motif that has isoleucine and asparagine at the 1st and 4th amino acids (for example, CRR4 / 6) binds favorably to A and changes the 1st amino acid to leucine.
  • Those having leucine and asparagine at the 1st and 4th amino acids do not bind to A but can bind to G well. That is, by using PPR motifs corresponding to the RNA recognition codes of the 1st and 4th amino acids, a protein that binds to each base can be prepared, and a protein that binds to an RNA sequence having a continuous base by ligation Can be constructed.
  • the present invention provides a method for designing a protein capable of specifically binding an arbitrary RNA base of interest and a method of designing a protein capable of specifically binding RNA having an arbitrary sequence of interest.
  • Example 1 Preparation of mini-PPR protein consisting of two PPR motifs] (Preparation of genomic DNA from Arabidopsis thaliana) Arabidopsis thaliana (ecotype Columbia) was cultured in Murashige sukuk medium (containing 2% sucrose and 0.5% Gellangam) for 3 weeks. Green leaves (0.5 g) of the cultured plant were extracted with phenol / chloroform, and ethanol was added to insolubilize DNA. Dissolve the recovered DNA in 100 ⁇ l of TE solution (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA), add 10 units of RNase A (DNase-free, Takara Bio Inc.), and then at 37 ° C for 30 minutes. Reacted. Thereafter, the reaction solution was again extracted with phenol / chloroform, and then DNA was collected by ethanol precipitation. 10 ⁇ g of DNA was obtained.
  • TE solution 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA
  • Mini-PPR consisting of two PPR motifs of the 5th and 6th with reference to sequence information in the Arabidopsis genome information database (MATDB: http://mips.gsf.de/proj/thal/db/index.html)
  • Oligonucleotide primers (HCF / P5-F, HCF / P6-R; described in SEQ ID NOs: 1 and 2) for amplifying a DNA sequence having a protein gene were prepared. Spe I and Sal I sequences were added to the forward primer and reverse primer 5 ′ side of the oligonucleotide primer, respectively. Spe I and Sal I sequences were incorporated so that the resulting clones could be used to cut out inserts by restriction enzyme treatment.
  • the DNA fragment containing the mini-PPR protein gene composed of the 5th and 6th PPR motifs is a 50 ⁇ l reaction solution containing 100 ng genomic DNA and the above primers at 95 9530 seconds, 60 6030 seconds, 72 °C
  • Each sample was amplified by PCR using KOD-FX (TOYOBO) as a DNA extension enzyme in 25 cycles of 30 seconds.
  • the obtained DNA fragment was cloned using the pBAD / Thio-TOPO® vector (Invitrogen) according to the protocol attached to the product.
  • a DNA sequence encoding the cloned mini-PPR protein was determined, confirmed to be a sequence homologous to the target DNA sequence (SEQ ID NO: 79) on the database, and named pHCF152 / 5 & 6.
  • the plasmid obtained above was transformed into Escherichia coli TOP10 strain (Invitrogen).
  • the E. coli was cultured at 37 ° C. in 300 ml of LB medium (1 L Erlenmeyer flask containing 300 mL medium) containing ampicillin at a concentration of 100 ⁇ g / ml.
  • LB medium 1 L Erlenmeyer flask containing 300 mL medium
  • ampicillin 100 ⁇ g / ml.
  • an inducer, L-arabinose was added to a final concentration of 0.2%, and the culture was further continued for 4 hours.
  • the cells were mixed with 200 ml of buffer A containing 1 mg / ml lysozyme (50 mM Tris / HCl pH 8.0, 500 mM KCl, 2 mM imidazole, 10 mM MgCl2, 0.5% Triton X100, 10%
  • the cells were suspended in glycerol) and disrupted by sonication and freeze-thawing. After centrifugation at 15,000 xg for 20 minutes, the supernatant was recovered as a crude extract. This crude extract was applied to a column packed with a nickel column resin (ProBond A, Invitrogen) equilibrated with buffer A.
  • HCF152 / 5 & 6 protein This protein is a fusion protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 78, the amino acid sequence of thioredkin for enhancing solubility on the N-terminal side, and the histidine tag sequence on the C-terminal side.
  • mini PPR protein gene consisting of two different PPR motifs derived from HCF152 protein: pHCF152 / 6 & 7 (SEQ ID NO: 81) are primers HCF / P6-F and HCF / P7-R (described in SEQ ID NOs: 3 and 4), pHCF152 / 7 & 8 (SEQ ID NO: 83) are primers HCF / P7-F and HCF / P8-R (described in SEQ ID NOs: 5 and 6), pHCF152 / 8 & 9 (SEQ ID NO: 85) are primers HCF / P8-F and HCF / P9-R (described in SEQ ID NOs: 7 and 8), pHCF152 / 9 & 10 (SEQ ID NO: 87) are primers HCF / P9-F and HCF / P10-R (described in SEQ ID NOs: 9 and 10), pHCF152 / 10 & 11
  • proteins were prepared, and HCF152 / 6 & 7 (SEQ ID NO: 80), HCF152 / 7 & 8 (SEQ ID NO: 82), HCF152 / 8 & 9 (SEQ ID NO: 84), HCF152 / 9 & 10 (SEQ ID NO: 86), respectively.
  • the protein was named HCF152 / 10 & 11 (SEQ ID NO: 88) (FIG. 1A).
  • Amino-substituted mini-PPR protein is the primer HCF5 (4T-E) 2-F and HCF / P6-R (SEQ ID NO: 02, 17), p5 & 6 / 5-T4N (SEQ ID NO: 97) are primers HCF5 (4T-N) 2-F and HCF / P6-R (SEQ ID NO: 02, 17), p5 & 6 / 5-T5I (SEQ ID NO: 99) are primers HCF5 (T5I) -F and HCF / P6-R (SEQ ID NOs: 02, 17), p6 & 7 / 6-V1R (SEQ ID NO: 139) is the primer HCF6 & 7/6 # V1R-F and HCF / P7-R (SEQ ID NO: 04, 58) The gene was cloned using
  • proteins were prepared, and 5 & 6 / 5-T4E (SEQ ID NO: 94), 5 & 6 / 5-T4N (SEQ ID NO: 96), 5 & 6 / 5-T5I (SEQ ID NO: 98), 6 & 7 / 6-, respectively. It was named V1R protein (SEQ ID NO: 138).
  • p5 & 6 / 5-R1A is primer HCF / 5 & 6 # R1A-F (SEQ ID NO: 13) and HCF / 5 & 6 # R1A-R (SEQ ID NO: 14), and pHCF152 / 5 & 6 (SEQ ID NO: 14) as template DNA. : 79) was used to clone a gene according to the attached protocol using site ⁇ ⁇ ⁇ directed mutagenesis kit (Stratagene). Similarly, a protein was prepared and named 5 & 6 / 5-R1A (SEQ ID NO: 90) protein.
  • p5 & 6 / 5-R1I is the primer HCF / 5 & 6 # R1I-F and HCF / 5 & 6 # R1I-R (SEQ ID NO: 15, 16)
  • p5 & 6 / 5-K8N is primer 5 & 6/5 # K8N-F and 5 & 6/5 # K8N-R (SEQ ID NO: 20, 21)
  • p5 & 6 / 5-K8A (SEQ ID NO: 103) is primer 5 & 6/5 # K8A-F and 5 & 6/5 # K8A-R (SEQ ID NO: 22, 23)
  • p5 & 6 / 5-G9L is a primer HCF / 5 & 6 # G9L-F and HCF / 5 & 6 # G9L-R (SEQ ID NO: 24, 25), p5 & 6 / 5-G9
  • the protein was prepared, and 5 & 6 / 5-R1I (SEQ ID NO: 92), 5 & 6 / 5-K8N (SEQ ID NO: 100), 5 & 6 / 5-K8A (SEQ ID NO: 102), 5 & 6 / 5-G9L ( SEQ ID NO: 104), 5 & 6 / 5-G9A (SEQ ID NO: 106), 5 & 6 / 5-M11A (SEQ ID NO: 108), 5 & 6 / 5-M11I (SEQ ID NO: 110), 5 & 6 / 5-K12A (SEQ ID NO: : 112), 5 & 6 / 5-K12H (SEQ ID NO: 114), 5 & 6 / 5-K12N (SEQ ID NO: 116), 5 & 6 / 5-N13A (SEQ ID NO: 118), 5 & 6 / 5-N13L (SEQ ID NO: 120) ), 5 & 6 / 5-G14A (SEQ ID NO: 92),
  • p6 & 7 / 7-N4T (SEQ ID NO: 141) is primers 6 & 7 # 7 / N4T-F and 6 & 7 # 7 / N4T-R (SEQ ID NO: 59, 60)
  • p6 & 7 / 6-S8K (SEQ ID NO: 143) are primers 6 & 7 # 6 / S8K-F and 6 & 7 # 6 / S8K-R (SEQ ID NO: 61, 62)
  • p6 & 7 / 6-S8D (SEQ ID NO: 145) are primers 6 & 7 # 6 / S8D-F and 6 & 7 # 6 / S8D-R (SEQ ID NO: 63, 64), Cloned the gene using site directed mutagenesis kit (Stratagene) and pHCF152 / 6 & 7 as a template.
  • a protein was prepared and named 6 & 7 / 7-N4T (SEQ ID NO: 140), 6 & 7 / 6-S8K (SEQ ID NO: 142), and 6 & 7 / 6-S8D (SEQ ID NO: 144).
  • p8 & 9 / 8-D8K (SEQ ID NO: 151) comprises primers 8 & 9 # 8 / D8K-F and 8 & 9 # 8 / D8K-R (SEQ ID NO: 65, 66), template pHCF152 / 8 &9; p8 & 9 / 9-K8D (SEQ ID NO: 153) contains primers 8 & 9 # 9 / K8D-F and 8 & 9 # 9 / K8D-R (SEQ ID NO: 67, 68), pHCF152 / 8 & 9 as a template; p8 & 9 / 8-D8K, 9-K8D (SEQ ID NO: 155) are primers 8 & 9 # 8 / D8K-F and 8 & 9 # 8 / D8K-R (SEQ ID NO: 65, 66), 8 & 9 / 9-K8D as template; p5 & 6 / 5-K12N, 6 / N12K (SEQ
  • the protein was prepared, and 8 & 9 / 8-D8K (SEQ ID NO: 150), 8 & 9 / 9-K8D (SEQ ID NO: 152), 8 & 9 / 8-D8K, 9-K8D (SEQ ID NO: 154), 5 & 6 /
  • the proteins were named as 5-K12N, 6 / N12K (SEQ ID NO: 146) and 5 & 6 / 5-K12M, 6 / N12R (SEQ ID NO: 148) proteins.
  • substrate RNA As the substrate RNA, a 120-base RNA containing the start codon of the Arabidopsis thaliana chloroplast petB gene containing the endogenous target sequence of the at3g09650 protein was used (Reference 2).
  • the substrate RNA was named BD120 (SEQ ID NO: 77).
  • a DNA fragment for synthesizing the substrate RNA BD120 was prepared by using oligonucleotide primers BD120-F and BD120-R (SEQ ID NOs: 73 and 74), and 50 ⁇ l of 10 ng of the above Arabidopsis genomic DNA as a template DNA.
  • the reaction solution was amplified by PCR using KOD FX (TOYOBO) as a DNA extension enzyme at 25 cycles of 95 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds.
  • KOD FX TOYOBO
  • a T7 promoter sequence for synthesizing a substrate RNA in a test tube was added to the 5 ′ end side of the BD120-F primer.
  • the obtained DNA fragment was developed by agarose gel and then purified by cutting out from the gel.
  • NTP mix (10 nmol GTP, CTP, ATP, 0.5 nmol UTP), 4 ⁇ l [32P] ⁇ -UTP (GE Healthcare, 3000 Ci / mmol), T7 RNA polymerase (Takara Bio) using purified DNA fragment as template
  • Substrate RNA was synthesized by reacting 20 ⁇ l of the reaction solution containing at 37 ° C. for 60 minutes.
  • Substrate RNA was extracted with phenol / chloroform and precipitated with ethanol, and the entire amount was developed by denaturing 6% polyacrylamide gel electrophoresis containing 6 M urea and exposed to X-ray film for 60 seconds to detect 32P-labeled RNA.
  • RNA 32P-labeled RNA was excised from the gel, and immersed in 200 ⁇ l of gel eluent (0.3 M sodium acetate, 2.5 mM EDTA, 0.01% SDS) at 4 ° C. for 12 hours to elute the RNA from the gel. Of the eluted RNA, 1 ⁇ l of radioactivity was measured, and the total amount of synthesized RNA was calculated. After ethanol precipitation, RNA was dissolved in ultrapure water to 2500 cpm / ⁇ l (1 fmol / ⁇ l). This preparation method usually yields about 100 ⁇ l of 2500 cpm / ⁇ l RNA.
  • gel eluent 0.3 M sodium acetate, 2.5 mM EDTA, 0.01% SDS
  • RNA binding ability of mini-PPR protein The RNA binding activity of the mini PPR protein was analyzed by gel shift method. Add 375 pM (7.5 fmol / 20 ⁇ L) to 20 ⁇ l of the reaction solution (10 mM Tris-HCl pH 7.9, 30 mM KCl, 6 mM MgCl2, 2 mM DTT, 8% glycerol, 0.0067% of Triton X-100). Substrate RNA (BD120) and 0-3750 nM mini-PPR protein were mixed and reacted at 25 ° C. for 15 minutes.
  • the reaction solution 10 mM Tris-HCl pH 7.9, 30 mM KCl, 6 mM MgCl2, 2 mM DTT, 8% glycerol, 0.0067% of Triton X-100.
  • Substrate RNA (BD120) and 0-3750 nM mini-PPR protein were mixed and reacted at 25 ° C. for
  • RNA binding appears as a difference in mobility of 32P-labeled RNA.
  • each mini-PPR protein exhibits different RNA affinity.
  • the difference in RNA affinity is 1000 times or more.
  • the PPR motif is composed of two ⁇ helices, and is predicted from the sequence information to be classified into a broad sense of “helical-repeat-protein-family” (FIG. 2A; Non-patent Document 4).
  • This family includes the puf motif (36 amino acids; 3 helices) that constitutes the aforementioned pumilio protein, TPR (34 amino acids; 2 helices), ARM (38 amino acids; 3 helices), HEAT (34 amino acids; two helices) and the like, and uniformly shows the entire structure of a half-doughnut type and a crescent type (Ref. 3).
  • Helix A consists of amino acids 2-12.
  • the first amino acid may or may not be included in the helix (shown with a dotted line; FIG. 2C).
  • TPR motif Helix A As shown in Fig. 2B, it was found that the helix was concentrated in one place when viewed from the side. It is a known fact that the ⁇ -helix makes a full turn of 3.6 amino acids and has a right-handed structure of 5.4A units.
  • mini-PPR proteins are arranged in the order of high affinity with RNA (low Kd), and amino acids contained in Helix A other than those shown in gray are shown. Then, with the exception of HCF152 / 5 & 6, the mini PPR protein composed of two PPR motifs, which has a high affinity for RNA, is the 8th amino acid of the first PPR motif and the 8th of the second PPR motif. It was found that basic amino acids (K, R; lysine, arginine) and acidic amino acids (D, E; aspartic acid, glutamic acid) appear in pairs as amino acids (in no particular order).
  • the mini-PPR protein introduced with amino acid substitution shows various Kd (affinity with RNA).
  • Kd affinity with RNA
  • the natural mini-PPR protein HCF152 / 5 & 6 has a Kd of 21.1 nM, defining a decrease in RNA affinity more than 10 times as a significant decrease in RNA affinity due to amino acid substitution makes it possible to As a result, it was evaluated that RNA affinity was significantly reduced by introducing substitutions into five amino acids No. 1, 4, 8, 9, and 12. That is, it means that the RNA affinity of the PPR protein can be reduced by substituting the five amino acids of Nos. 1, 4, 8, 9, and 12 with different amino acids.
  • the first PPR motif No. 1 valine (V) is arginine (R)
  • the second PPR motif No. 4 asparagine (N) is threonine (T)
  • the first PPR motif is By replacing serine (S) of No. 8 with lysine (K) or aspartic acid (D), an improvement in RNA affinity was observed (FIG. 3-3).
  • S serine
  • K lysine
  • D aspartic acid
  • the 12th amino acid also actively acts on the RNA affinity of the PPR motif, and that the 12th amino acid in the two motifs is a basic, neutral (or hydrophobic) amino acid pair. It means that.
  • RNA affinity can be improved by making the 12th amino acid a basic / neutral (hydrophobic) pair. ing.
  • the 8th amino acid was characterized using HCF152 / 8 & 9 as a model.
  • the first PPR motif aspartic acid (D) was changed to lysine (K) to make a basic and basic pair
  • the RNA affinity did not change (8 & 9 / 8-D8K; FIG. 6).
  • the lysine (K) of the second PPR motif is changed to aspartic acid (D), making it an acidic and acidic pair (8 & 9 / 9-K8D).
  • RNA affinity is improved by making amino acid 8 basic or acidic, and it is suggested that it can be controlled to decrease by making it other (eg, asparagine, alanine).
  • Example 2 Statistical analysis of amino acids constituting the PPR motif
  • Pfam protein domain search program http://pfam.sanger.ac.uk/
  • the composition of amino acid sequences 1, 4, 8, and 12 was analyzed from the obtained sequences. As a result, it was revealed that most of the first amino acid is composed of hydrophobic amino acids and the fourth is composed of neutral amino acids.
  • the 8th amino acid has the most neutrality (43%), but is composed of basic, acidic and hydrophobic amino acids (about 20% each).
  • the 12th amino acid is the most basic amino acid (55%), but is often composed of neutral amino acids (22%).
  • amino acids 1, 4, 8, and 12 have different properties, suggesting that each amino acid plays a different role in the RNA binding ability of the PPR motif.
  • the neutral amino acid in this assay is neutral and hydrophilic, that is, asparagine, serine, glutamine, threonine, tyrosine, and cysteine.
  • Hydrophobic amino acids in this assay are tryptophan, glycine, methionine, proline, phenylalanine, alanine, valine, leucine, isoleucine, as already defined herein.
  • the PPR protein is thought to exhibit sequence-specific RNA binding ability by the continuous PPR motifs of different properties.
  • the binding RNA sequence specificity did not change.
  • the results of the above statistical analysis suggest that the binding RNA specificity of the PPR motif is determined centering on amino acids 1 and 4, and that the binding RNA sequence specificity can be altered by modifying the amino acid. ing.
  • the possibility of altering the binding RNA sequence specificity by substituting amino acids 8 and 12 is not denied.
  • RNA As a substrate RNA, a 25-base nucleotide homopolymer (LN25) with an AUCG linker added to the 5 ′ end was chemically synthesized (LA25, SEQ ID NO: 157; LU25, SEQ ID NO: 158; LG25, SEQ ID NO: 159; LC25, SEQ ID NO: 160; commissioned by Thermo SCIENTIFIC). A 32 P label was added to the 5 ′ end of the synthetic RNA using T4 polynucleotide kinase (Takara) and ⁇ [ 32 P] ATP (MP Biomedical, 6000 Ci / mmol). The labeled RNA was dissolved in ethanol at a concentration of 5 fmol / ⁇ L after ethanol precipitation to prepare radiolabeled RNA.
  • LN25 25-base nucleotide homopolymer
  • AUCG linker added to the 5 ′ end was chemically synthesized (LA25, SEQ ID NO
  • pHCF152 / 2 & 3 (SEQ ID NO: 169) are primers HCF / P2-F and HCF / P3-R (described in SEQ ID NOs: 161 and 162)
  • pHCF152 / 3 & 4 (SEQ ID NO: 171) are primers HCF / P3-F and HCF / P4-R (described in SEQ ID NOs: 163 and 164)
  • pCRR4 / 6 SEQ ID NO: 173 are primers CRR4 / 6-F and CRR4 / 6-R (described in SEQ ID NOs: 165 and 166)
  • pCRR4 / 6 (I1L) (SEQ ID NO: 175) are primers CRR4 / 6 (I1L) -F and CRR4 / 6-R (described in SEQ ID NOs: 167 and 166)
  • Recombinant protein expression vector and protein were prepared using HCF152 / 2 & 3
  • the binding specificity of the mini-PPR protein was analyzed by gel shift method. 4 pM (5 fmol / 20 ⁇ L) in 20 ⁇ l of the reaction solution (10 mM Tris-HCl pH 7.9, 30 mM KCl, 6 mM MgCl 2 , 2 mM DTT, 8% glycerol, 0.0067% of Triton X-100) Substrate RNA (LN25; LA25, LU25, LG25 or LC25) and 200 nM mini-PPR protein were mixed and reacted at 25 ° C. for 15 minutes.
  • RNA in the gel was measured with a bioimaging analyzer BAS2000 (Fuji Film).
  • FIG. 10A protein-RNA binding appears as a difference in mobility of 32 P-labeled RNA. This is because the molecular weight of the 32 P-labeled RNA / protein complex is larger than the molecular weight of the 32 P-labeled RNA alone, so that the mobility in electrophoresis becomes slow.
  • the binding of each mini-PPR protein to each of A, U, G, and C was quantified based on radioactivity (Fig. 10B), and WebLOGO (HYPERLINK "http://weblogo.berkeley.edu/" http: // weblogo. berkeley.edu/ ) (FIG. 10C). As shown in FIG.
  • the binding base specificity of each mini-PPR protein was A>G> U for HCF152 / 2 & 3, 5 & 6, and 9 & 10, and particularly strongly bound to A.
  • HCF152 / 7 & 8 also binds strongly to A, but its binding base specificity was A>U> G.
  • HCF152 / 3 & 4 bound well to G, and the binding base specificity was G>U> A.
  • the binding base specificity of the PPR motif constituting the mini PPR protein is determined by the 1st and 4th amino acids in the motif. Therefore, attention was paid to amino acids 1 and 4 of each mini-PPR protein (FIG. 11). Since the 1st and 4th amino acids of each PPR motif were diverse, we searched potential homologous proteins of Arabidopsis HCF152 protein from 6 kinds of vascular plants using NCBI BLAST, and analyzed the polymorphisms of the amino acids ( Figure 12).
  • the first amino acid is isoleucine and the fourth amino acid is asparagine (IN) (the seventh and tenth PPR motifs)
  • the polymorphisms of valine (V) and alanine (A) are present in the first amino acid.
  • the first amino acid was valine and the fourth amino acid was threonine (VT) (6th PPR motif)
  • the polymorphism of isoleucine (I) was seen as the first amino acid (FIG. 12). That is, it is suggested that these polymorphic amino acids are amino acids having the same function.
  • amino acids 1 and 4 are valine and threonine (VT) or isoleucine and threonine (IT), the motif binds strongly to A, then U, then G. Having preferred binding sequence specificity;
  • amino acids 1 and 4 are valine and asparagine (VN), isoleucine and asparagine (IN) or alanine and asparagine (AN), the motif binds strongly to A, and Has the specificity to bind to G and then U; and when amino acids 1 and 4 are leucine and asparagine (LN), the motif binds strongly to G, then T, then It was suggested that it has specificity for binding to A.
  • the mini-PPR protein used in the experiment is composed of two PPR motifs, but the nature of the first PPR motif was thought to be significant.
  • a protein composed of one PPR motif was prepared using CRR4 (at 2g45350, SEQ ID NO: 176, 177), which is a different PPR protein. And analyzed. As shown in FIG.
  • the protein CRR4 / 6 having isoleucine and asparagine (I, N) at the first and fourth amino acids prefers to bind A, but the first amino acid is changed to leucine, Leucine and asparagine (I, N) protein CRR4 / 6 (I1A) did not bind to A but well to G at the 4th amino acid.
  • HCF152 an Arabidopsis RNA binding pentatricopeptide repeat protein involved in the processing of chloroplast psbB-psbT-psbH-petB-petD RNAs.Plant Cell 15, 1480-1495.
  • Reference 2 Nakamura, T., Meierhoff, K., Westhoff, P., and Schuster, G. (2003).
  • RNA-binding properties of HCF152 an Arabidopsis PPR protein involved in the processing of chloroplast RNA.Eur. J. Biochem.

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Abstract

　PPRモチーフがRNA結合ユニットとして働くために主要な役割を担うアミノ酸を同定し、そしてそのRNA結合特性を制御する技術を提供することを課題とする。本発明は、30～38アミノ酸長のポリペプチドからなるPPRモチーフを、1個以上、好ましくは2個以上、より好ましくは2～14個有するPPR蛋白質の、RNA結合特性の改変方法であって、一又は複数のPPRモチーフにおいて、1、4、8、9及び12番のアミノ酸の一又は複数を、異なるアミノ酸に置換する工程を含む、方法を提供する。

Description

PPRモチーフを利用したRNA結合性蛋白質の改変方法
　本発明は、pentatricopeptide repeat(PPR)モチーフを有するポリペプチドを利用した、様々なRNA結合特性を持つ蛋白質因子の設計に関する。本発明よって提供される因子群は、RNA制御のために用いることができ、医療分野、農業分野等等で有用である。
　近年、生物体におけるRNAの機能が盛んに研究されるようになり、いくつかのRNA改変技術が開発されてきた。例えば、21～28塩基の低分子RNAを媒介とする遺伝子発現制御(RNA干渉)は、学術分野のみならず、医療分野、農業分野及び産業界においても盛んに利用され始めている。
　一方、蛋白質因子を用いたRNA制御技術は、その作用場所・作用期間などの観点から適応範囲が広いため、大きく期待されている。プミリオ蛋白質は38アミノ酸から成るpufモチーフの複数個の繰り返しで構成されており、pufモチーフ1個がRNA1塩基に結合することが示されており(非特許文献1)、プミリオ蛋白質を用いた新規RNA結合特性をもつ蛋白質(非特許文献2)、及び、RNA結合特性の改変技術が試みられている(非特許文献3)。
　他方、ゲノム配列情報から、植物のみで500個もの大きなファミリーを形成する新規蛋白質、pentatricopeptide repeat (PPR蛋白質)が同定された(非特許文献4及び5)。PPR蛋白質は名前が示すとおり、35アミノ酸の繰り返しで構成されており、その1単位である35アミノ酸はPPRモチーフと命名されている。500個のPPR蛋白質は、それぞれが異なるオルガネラRNA分子に作用し、切断、スプライシング、編集、安定性、翻訳などほぼ全てのRNA代謝に関わる。ほとんどのPPR蛋白質はPPRモチーフ約10個の繰り返しのみで構成されており、多くの場合、触媒に必要なドメインが見いだせない。そのため、この分子実体はRNAアダプターだと考えられている(非特許文献6)。
Wang, X., McLachlan, J., Zamore, P.D., and Hall, T.M. (2002). Modular recognition of RNA by a human pumilio-homology domain. Cell 110, 501-512. Ozawa, T., Natori, Y., Sato, M., and Umezawa, Y. (2007). Imaging dynamics of endogenous mitochondrial RNA in single living cells. Nature Methods 4, 413-419. Cheong, C.G., and Hall, T.M. (2006). Engineering RNA sequence specificity of Pumilio repeats. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 13635-13639. Small, I.D., and Peeters, N. (2000). The PPR motif - a TPR-related motif prevalent in plant organellar proteins. Trends Biochem. Sci. 25, 46-47. Lurin, C., Andres, C., Aubourg, S., Bellaoui, M., Bitton, F., Bruyere, C., Caboche, M., Debast, C., Gualberto, J., Hoffmann, B., Lecharny, A., Le Ret, M., Martin-Magniette, M.L., Mireau, H., Peeters, N., Renou, J.P., Szurek, B., Taconnat, L., and Small, I. (2004). Genome-wide analysis of Arabidopsispentatricopeptide repeat proteins reveals their essential role in organelle biogenesis. Plant Cell 16, 2089-2103. Chory, J., and Woodson, J.D. (2008). Coordination of gene expression between organellar and nuclear genomes. Nature Rev. Genet. 9, 383-395.
　RNA干渉は、真核生物が元来有する多くの蛋白質因子が必要であることから適応できる生物種がいくつかの真核生物に限られている。また、遺伝子発現阻害方向にしか働くことができない、RNA成分であるため作用期間が短い等、遺伝子発現制御技術としてはいくつかの制限がある。
　そして、蛋白質因子を用いたRNA制御技術においては、蛋白質を構成するアミノ酸配列とRNA親和性の相関、及びアミノ酸配列と結合可能なRNA配列との法則性は、ほとんど明らかになっていない。例外的にプミリオ蛋白質が存在するが、pufファミリーに属するモチーフは、各々の間でのアミノ酸配列が高度に保存され、かつ存在数が少ない。そのため、限られたRNA配列に作用する蛋白質因子の創成にしか用いることができないという問題がある。
　PPR蛋白質のRNAアダプターとしての性質は、PPR蛋白質を構成するそれぞれのPPRモチーフの性質と、それらの組み合わせにより奏される性質とで決定すると予想される。しかしながら、PPRモチーフは、ゲノム配列情報の計算科学的な手法で同定されたものであり、そのアミノ酸配列と機能の相関関係は全く明らかでなかった。PPRモチーフがRNA結合特性を発揮するために必須であるアミノ酸を同定し、結合特性の制御方法が確立すれば、PPRモチーフの改変や、それらの組み合わせの改変により、様々な配列・長さを有するRNA分子に結合可能な、新規な蛋白質を設計できる可能性がある。
　そこで、本発明者らは、PPRモチーフがRNA結合ユニットとして働くために主要な役割を担うアミノ酸を同定すること、そしてそのRNA結合特性を制御する技術を提供することを課題とした。PPRモチーフを利用した様々なRNA結合特性を有する蛋白質因子を提供することができれば、様々な場面で利用可能な汎用な技術となりうる。
　本発明者らは、上記課題を解決するために、2個のPPRモチーフで構成される組換えミニPPR蛋白質を複数個調製し、異なるRNA結合特性を有するPPRモチーフを同定した。さらに、そのRNA結合特性とアミノ酸配列とを比較し、またアミノ酸置換を行うことで、PPRモチーフがRNA結合能を発揮するために必要なアミノ酸を同定した。そしてそのようなアミノ酸を置換することにより、そのRNA結合特性を改変(RNA結合活性を向上させるように、または低下させるように)することに成功した。
　本発明者らの検討によると、PPRモチーフのRNA結合特性は、モチーフを構成する2つのαへリックス構造のうち、最初のへリックス(Helix A)を構成する1、4、8、12番のアミノ酸が特に関与しており、それらのアミノ酸に着目することで、異なるRNA結合特性をもつPPRモチーフや、またはそのようなモチーフを有する新規蛋白質が構成できることが分かった。
　本発明は、以下を提供する：
［1］　式Iで表される30～38アミノ酸長のポリペプチドからなるPPRモチーフを、1個以上(好ましくは2個以上、より好ましくは2～14個)有するPPR蛋白質の、RNA結合特性の改変方法であって
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 (式中：
　Helix Aは、12アミノ酸長の、αへリックス構造を形成可能な部分であり、Helix Aは式II
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 で表され(A1～A12は、それぞれ独立に、アミノ酸を表わす。)；
　Helix Bは、11～13アミノ酸長の、αへリックス構造を形成可能な部分であり；
　Xi～iiiは、それぞれ独立に、1～9アミノ酸長からなる部分であるか、又は存在しない。)
　一又は複数のPPRモチーフにおいて、A1、A4、A8、A9及びA12からなる群(好ましくはA1、A4、A8及びA12からなる群)から選択される一又は複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸に置換する工程を含む、方法。
［2］　1に記載の方法であって、PPR蛋白質がPPRモチーフを2個以上有し、下記のいずれかの工程を含む、PPR蛋白質のRNA結合活性を向上させるための方法：
　第一番目のPPRモチーフのA1を、塩基性アミノ酸、好ましくはアルギニンとする置換；
　第二番目のPPRモチーフのA4を、中性アミノ酸、好ましくはスレオニンとする置換；
　第一番目のPPRモチーフのA8を、塩基性アミノ酸、好ましくはリジンとする置換、又は酸性アミノ酸、好ましくはアスパラギン酸とする置換；及び
　第一番目のPPRモチーフのA12及び／又は第二番目のPPRモチーフのA12の置換であって、いずれか一方を塩基性アミノ酸とし、かつ他方を中性アミノ酸又は疎水性アミノ酸とする置換。
［3］　［1］又は［2］に記載の方法であって、一又は複数のPPRモチーフにおける下記を考慮した改変を含む、方法：
　あるモチーフのA1と、同じモチーフのA4との協同、及び／又は
　あるモチーフのA8と、同じモチーフのA12との協同。
［3-1］　［1］に記載の方法であって、下記のいずれかの工程を含む、PPR蛋白質のRNA結合活性を向上させるための方法：
　第一番目のPPRモチーフのA1を、塩基性アミノ酸、好ましくはアルギニンとする置換；
　第二番目のPPRモチーフのA4を、中性アミノ酸、好ましくはスレオニンとする置換；
　第一番目のPPRモチーフのA8を、塩基性アミノ酸、好ましくはリジンとする置換、又は
酸性アミノ酸、好ましくはアスパラギン酸とする置換；及び
　第一番目のPPRモチーフのA12及び／又は第二番目のPPRモチーフのA12の置換であって、いずれか一方を塩基性アミノ酸とし、かつ他方を中性アミノ酸又は疎水性アミノ酸とする置換。
［3-2］　［1］に記載の方法であって、下記の工程を含む、PPR蛋白質のRNA結合活性を向上させるための方法：
　第一番目のPPRモチーフのA8及び／又は第二番目のPPRモチーフのA8の置換であって、双方を塩基性アミノ酸若しくは酸性アミノ酸とするか、又はいずれか一方を塩基性アミノ酸とし、かつ他方を酸性アミノ酸とする置換。
［3-3］　［1］に記載の方法であって、下記の工程を含む、PPR蛋白質のRNA結合活性を低下させるための方法：
　第一番目のPPRモチーフのA8及び／又は第二番目のPPRモチーフのA8の置換であって、少なくとも一方を中性アミノ酸又は疎水性アミノ酸とする置換。［4］　A8及びA12に塩基性アミノ酸又は酸性アミノ酸を有する1に定義されたPPRモチーフを用いる、RNA結合特性を有する蛋白質の設計方法。
［4-1］　式II
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 で表される、配列：
(式中、　A1は、塩基性アミノ酸、好ましくはアルギニンであり；
　A4は、中性アミノ酸、好ましくはスレオニンであり；
　A8は、塩基性アミノ酸、好ましくはリジン、又は酸性アミノ酸、好ましくはアスパラギン酸であり；かつ
　A12は、塩基性アミノ酸又は中性アミノ酸又は疎水性である。)を利用する、RNA結合特性を有する蛋白質の設計方法。
［5］　RNA中の対象塩基に特異的に結合可能な蛋白質の設計方法であって：
　1に定義したPPRモチーフを用い、このときA1とA4とを、対象塩基が特異的に結合される組み合わせとし、そのモチーフの塩基結合特異性を向上させることを含む、方法。
［6］　対象塩基がアデニン、ウラシル又はグアニン(好ましくはアデニン又はウラシル、より好ましくはアデニン)であり、A1及びA4の組み合わせが、バリン及びトレオニン、又はイソロイシン及びトレオニンであるか；
　対象塩基がアデニン、グアニン又はウラシル(好ましくはアデニン又はグアニン、より好ましくはアデニン)であり、A1及びA4の組み合わせが、順に、バリン及びアスパラギン、イソロイシン及びアスパラギン又はアラニン及びアスパラギンであるか；又は
　対象塩基がグアニン、チミン又はアデニン(好ましくはグアニン又はチミン、より好ましくはグアニン)であり、A1及びA4の組み合わせが、順に、ロイシン及びアスパラギンである、［5］に記載の方法。
［7］　［5］又は［6］に記載の方法であって、
　RNA中の2以上の対象塩基それぞれに対応したPPRモチーフを用い、このとき、
　一のモチーフのA1とA4とを、対応する対象塩基が特異的に結合される組み合わせとし、そのモチーフの結合特異性を向上させ；かつ
　別のモチーフのA1とA4とを、対応する対象塩基が特異的に結合される組み合わせとし、各モチーフの塩基結合特異性を向上させることを含む、方法。
［7-1］　［1］に定義された、PPRモチーフ（式中、　A1は、塩基性アミノ酸、好ましくはアルギニンであり；
　A4は、中性アミノ酸、好ましくはスレオニンであり；
　A8は、塩基性アミノ酸、好ましくはリジン、又は酸性アミノ酸、好ましくはアスパラギン酸であり；かつ
　A12は、塩基性アミノ酸又は中性アミノ酸又は疎水性である。）。
［8］　配列番号：90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、168、170、172又は174のアミノ酸配列からなるポリペプチドの全部又はRNA結合活性を有する一部を含む、蛋白質。
［9］　［8］に定義されたRNA結合性蛋白質をコードする、ポリヌクレオチド。
［10］配列番号：89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、169、171、173又は175の塩基配列を有する、9に記載のポリヌクレオチド（DNA又はRNA）。
［11］　［1］～［3］のいずれか１項に記載の方法で改変されたPPR蛋白質、［4］～［7］のいずれか１項に記載の方法で設計された蛋白質、又は［8］に記載の蛋白質を用いる、RNAの機能の制御方法。
　本発明により、RNA結合特性を有する蛋白質のRNAとの結合活性を高めることができ、また逆に結合活性を低くすることができる。蛋白質が酵素である場合には、基質RNAとの解離速度の上昇(反応回数の増加)が期待できる。
　また本発明により、天然型PPR蛋白質とは異なるRNA親和性及び結合RNA塩基選択性を有する、新規な蛋白質が提供できる。
　さらに本発明により提供されるPPRモチーフ又はPPR蛋白質は、複合蛋白質の調製のために有用である。
　さらに本発明により、そのような蛋白質をコードするポリヌクレオチド(遺伝子、DNA、RNA)が提供され、形質転換体の作成や、生物(細胞、組織、個体)における様々な場面での制御や機能の付与に利用できる。
　さらに本発明により、RNA中の塩基や、所望のRNAに結合特異性を有する蛋白質の設計方法が提供される。
ミニPPR蛋白質の模式図及びRNA結合活性 ミニPPR蛋白質のRNA結合活性とアミノ酸配列 アミノ酸置換ミニPPR蛋白質のRNA結合活性 アミノ酸置換ミニPPR蛋白質のRNA結合活性 アミノ酸置換ミニPPR蛋白質のRNA結合活性 アミノ酸置換導入の模式図とアミノ酸置換ミニPPR蛋白質のRNA結合活性 12番アミノ酸を置換したミニPPR蛋白質のRNA結合活性 8番アミノ酸を置換したミニPPR蛋白質のRNA結合活性 PPRモチーフを構成するアミノ酸の組成 1、2、4及び8番アミノ酸のつながり PPR蛋白質の各PPRモチーフにおける、1、4、8、9、12番に位置する、酸性アミノ酸又は塩基性アミノ酸の位相 ミニPPR蛋白質のRNAに対する結合特異性 潜在的なHCF152相同蛋白質間での多型 様々な植物での潜在的なHCF152相同蛋白質のアミノ酸配列の比較( AtはアラビドプシスのHCF152、Vv1 (Vitis vinifera), Vv2 (Vitis vinifera), Rc (Ricinus communis), Pt (Populus trichocarpa), Sb (Sorghum bicolor),  Os (Oryza sativa)の潜在的なHCF152相同蛋白質の配列を示した。配列上部の線はPPRモチーフを、また、RNA相互作用に関わるアミノ酸(1、4、8、12番)を灰色で示した。 また、Helixとして、蛋白質の2次構造(へリックス、h；コイル領域、c；βシート、e)、AAPとしてアミノ酸多型の数を記した。 図12-1の続き PPRモチーフ1個で構成される蛋白質のRNAに対する結合特異性 本発明に関連するアミノ酸配列又は塩基配列 本発明に関連するアミノ酸配列又は塩基配列 本発明に関連するアミノ酸配列又は塩基配列 本発明に関連するアミノ酸配列又は塩基配列 本発明に関連するアミノ酸配列又は塩基配列 本発明に関連するアミノ酸配列又は塩基配列
　本発明で「PPRモチーフ」というときは、特に記載した場合を除き、Web上の蛋白質ドメイン検索プログラムでアミノ酸配列を解析した際に、PfamにおいてはPF01535、InterProScanにおいてはIPR002885、PrositeにおいてはPS51375、で得られるE値が所定値以下(望ましくはE-03)のアミノ酸配列をもつ30～38アミノ酸で構成されるポリペプチドである。本発明で定義するPPRモチーフを構成するアミノ酸の場所は、PF01535及びIPR002885と同義だが、PS51375のアミノ酸の場所から2引いた数(例；本発明の1番→PS51375の3番)である。
　Web情報: 
Pfam: http://pfam.sanger.ac.uk/
InterProScan: http://www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/
Prosite: http://www.expasy.org/prosite/
　PPRモチーフの保存アミノ酸配列は、前掲非特許文献4及び5に示されている。アミノ酸レベルでの保存性は低いが、2次構造上で2つのαへリックスはよく保存されている。PPRモチーフは、30～38個のアミノ酸からなり、長さが可変的であるが、典型的なPPRモチーフは、35個のアミノ酸で構成される。
　本発明でいうPPRモチーフは、好ましくは、下記の構造からなる：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
  (式中：
　Helix Aは、12アミノ酸長の、αへリックス構造を形成可能な部分であり、Helix Aは式II
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 で表され；
　Helix Bは、11～13アミノ酸長の、αへリックス構造を形成可能な部分であり；
　Xi～iiiは、それぞれ独立に、1～9アミノ酸長からなる部分であるか、又は存在しない。)。AXはアミノ酸を表わす。なお、1番のアミノ酸(A1)は、αへリックス構造に含まれる場合と含まれない場合とがある。αへリックス構造の骨格となるアミノ酸を、A3、A6、A7及びA10とする。
　本発明で「PPR蛋白質」というときは、特に記載した場合を除き、上述のPPRモチーフを、1 個以上、好ましくは2個以上、より好ましくは2～14個有するPPR蛋白質をいう。本発明では特に、PPRモチーフを2個有する蛋白質を、「ミニPPR蛋白質」ということがある。本明細書で「蛋白質」というときは、特に記載した場合を除き、ポリペプチド(複数のアミノ酸がペプチド結合した鎖)からなる物質全般をいい、比較的低分子のポリペプチドからなるものも含まれる。
　本発明において、蛋白質のRNAへの結合能力に関し「結合特性」というときは、特に記載した場合を除き、結合活性と結合特異性とを含む概念として使用している。 「結合活性」は、特に記載した場合を除き、本発明では「親和性」と同義で用いており、結合の強さをいう。結合活性の有無又は程度は、当業者であれば、同様の目的で使用される種々の技術を用いて適宜決定することができ、また本明細書の実施例では、そのためのゲルシフト法について、詳細に説明されている。本発明で、ある蛋白質に関し、結合活性が「ない」というときは、3750 nMの蛋白質を用いても、解離定数(Kd)が算出できない場合をいう。本発明においてある蛋白質がRNA塩基に関して「結合特異性」があるというときは、特に記載した場合を除き、RNA塩基のいずれか一に対する結合活性が、他のものに対する結合活性より高いことをいう。RNA塩基とは、核酸塩基のうち、RNAを構成する塩基であり、具体的には、アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)又はウラシル(U)をいう。なお本発明により設計された蛋白質は、RNA中の塩基に対して結合特異性を有しうるが、核酸モノマーに対して結合するわけではない。また本発明においてある蛋白質がRNAに関して「結合特異性」があるというときは、特に記載した場合を除き、ある塩基配列からなるRNAに対する結合活性が、それとは異なる塩基配列を有するRNA に対する結合活性より高いことをいう。このような蛋白質は、例えば、対象RNA中の複数の塩基それぞれに対して結合特異性のある複数のPPRモチーフを有しうる。ある蛋白質のRNA塩基又はRNAに対する結合特異性の有無又は程度は、当業者であれば適宜決定することができ、また本明細書の実施例では、そのためのゲルシフト法について、詳細に説明されている。対象に対する結合特異性があることを、対象を認識できる、対象を識別できる、ということもある。
　結合特性又は結合活性の「改変」は、向上させる場合と、低下させる場合とを含む概念である。結合活性を向上させるとは、Kdを1/10以下にすること、低下させるとはKdを10倍以上にすることをいう。Kdは、結合使用とするRNAに拠り、異なる可能性がある。比較のためには、標準となるRNAとして、本明細書の実施例に記載されているものを用いることができる。
　本明細書で「酸性アミノ酸」というときは、特に記載した場合を除き、pH7.0で側鎖(R基と表現されることもある。)が負電荷を有するアミノ酸をいう。この例は、アスパラギン酸及びグルタミン酸である。
　本明細書で「塩基性アミノ酸」というときは、特に記載した場合を除き、特に記載した場合を除き、pH7.0で側鎖が正電荷を有するアミノ酸をいう。この例は、リシン、アルギニン、及びヒスチジンである。
　本明細書で「中性アミノ酸」というときは、特に記載した場合を除き、酸性アミノ酸でなく、かつ塩基性アミノ酸でもないアミノ酸をいう。この例は、アスパラギン、セリン、グルタミン、スレオニン(トレオニンと表記されることもある。)、グリシン、チロシン、トリプトファン、システイン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンである。
　本明細書で「疎水性アミノ酸」というときは、特に記載した場合を除き、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸をいう。疎水性アミノ酸は、通常、非極性アミノ酸と同義で用いられる。疎水性アミノ酸の例は、グリシン、トリプトファン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンである。
　本明細書で「アミノ酸」というときは、遊離のアミノ酸を指している場合と、ペプチド鎖を構成しているアミノ酸残基を指している場合とがある。いずれの意味で用いているかは、当業者には文脈から明らかである。
　本明細書において、モチーフ又は蛋白質のアミノ酸配列に関して「置換」というとき、そのための手法は特に限定されない。置換を含むアミノ酸配列に係るポリヌクレオチドを調製するための手段には、例えば、site-directed mutagenesis法(Kramer W & Fritz H-J: Methods Enzymol 154: 350、 1987)がある。また、当業者であれば、本発明の実施例の記載を参考にすることができる。
　本発明は、モチーフ又は蛋白質において特定の位置にあるアミノ酸の置換に関するものであるが、本発明として規定した位置の置換に限らず、他の位置においても、性質の似たアミノ酸への置換は、モチーフ又は蛋白質を行うことができ、このような置換を含む場合もまた、本発明の範囲に含まれる。性質の似たアミノ酸への置換とは、例えば、酸性アミノ酸同士の置換、塩基性アミノ酸同士の置換、中性アミノ酸同士の置換、疎水性アミノ酸同士の置換をいう。この観点で置換されるアミノ酸の個数は、そのアミノ酸配列からなるポリペプチドが所望の機能を有する限り特に限定されないが、例えば1～9個、又は1～4個程度である。
　PPRモチーフとしての保存アミノ配列検索法は確立しているが、RNA結合特性を呈するために必要なアミノ酸に関しては、本発明以前に全く発見されていなかった。本発明により、以下の知見が提供される：
(1)PPRモチーフのアミノ酸配列、予備的な構造予測から、Helix AにRNA結合に寄与するアミノ酸が配置されていると予測される。
(2)A1、A4、A8、A9、A12の5つのアミノ酸への置換導入がRNA結合特性の改変をもたらしうる。
(3)第一の(上流の)PPRモチーフのA1、A4及びA8は、RNAとの結合に能動的に働く。すなわち、A1、A4及びA8を適切に操作することで、PPRモチーフひいてはPPR蛋白質のRNA親和性を向上しうる。
(4)A12もPPRモチーフのRNA親和性に能動的に働き、また複数個のPPRモチーフを含む場合には、12番アミノ酸が塩基性アミノ酸であるモチーフと中性(又は疎水性)アミノ酸であるモチーフとを適切に組み合わせることにより、RNA親和性の向上が期待できる。
(5) また多数(例えば4個以上、好ましくは4～14個、より好ましくは7～14個)のPPRモチーフを有するPPR蛋白質においては、1つおき又は2つおきの複数のPPRモチーフにおいて、A8が塩基性アミノ酸又は酸性アミノ酸であること、及び／又は1つおき又は2つおきの複数のPPRモチーフにおいて、A12が塩基性アミノ酸又は酸性アミノ酸であり、このような配置を模倣することにより、RNA結合特性の向上が期待できる。
(6)あるPPRモチーフのA1と、同じPPRモチーフ上のA4とがRNA結合において協同している可能性があり、またあるPPRモチーフのA8と、それと同じPPRモチーフのA12とが、RNA結合において協同している可能性がある。
　本発明により、既存のPPR蛋白質の親和性を改変できる。
　PPR蛋白質は、植物に多く存在する。例えば、ある種のPPR蛋白質は花粉形成(雄性配偶子)の形成に働くが、これのRNA親和性を改変し、花粉形成効率を上昇させることができる。また、既存のPPR蛋白質は、ミトコンドリアや葉緑体で働くことが多いので、PPR蛋白質のRNA親和性の改変は、ミトコンドリアや葉緑体の機能の改変(PPR蛋白質の異常で、光合成、呼吸、有用代謝物の合成が変化することが知られている。)をもたらし得る。動物では、LRPPRCと同定されるPPR蛋白質の異常がLeigh syndrome French Canadian (LSFC; リー症候群、亜急性壊死性脳脊髄症) を引き起こすことが知られているので、本発明はLSFCの処置(予防、治療、進行の抑制)に寄与しうる。
　本発明により得られる改変されたPPRモチーフ又はPPR蛋白質は、他の機能性蛋白質と連結して、有用な複合蛋白質として利用することができる。例えば、あるPPR蛋白質は、PPRモチーフの繰り返しの後にRNA切断ドメインが連結されている。このようにRNA結合ドメインを連結させれば、配列特異的なRNA切断酵素(制限酵素のRNA version)を構成しうる。また、GFP(緑色蛍光蛋白質)を連結し、目的RNAを可視化するために用いうる。さらに、リボソームS1蛋白質を連結し、翻訳速度の向上が期待できる。
　一方、既存のPPR蛋白質のうち、DNAに作用するものがある。このようなPPR蛋白質のあるものにおいては、核に局在し、Pol2(核に存在するRNA転写酵素)と相互作用するドメインが付加されている。したがって、本発明により得られたPPRモチーフ又はPPR蛋白質にこのようなドメインを連結して、転写の活性化を目指すことができる。
　また、PPR蛋白質には、RNA編集(RNA上での遺伝情報の変換；多くの場合、C→U)において、編集部位の指定に働くことが知られているものがある。このタイプのPPR蛋白質にはC末端にEドメインというRNA編集酵素と相互作用すると予想されるドメインが付いている。このようなEドメインを連結することにより、塩基多型を導入したり、また塩基多型に関連した疾患又は状態を処置に寄与しうる。
　本発明は、新規なPPR蛋白質、すなわち配列番号：90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、168、170、172又は174のアミノ酸配列からなるポリペプチドの全部又はRNA結合活性を有する一部を含む、蛋白質を提供する。また、このようなRNA結合性蛋白質をコードする、ポリヌクレオチド(DNA又はRNA)、すなわち配列番号：89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、169、171、173、175の塩基配列を有するポリヌクレオチドを提供する。このような蛋白質及びポリヌクレオチドは、合成物であっても、天然物であってもよく、当業者であれば、既存の方法で調製することができる。
　本発明は、モチーフ又は蛋白質において特定の位置にあるアミノ酸の置換に関するものであるが、そのような置換により、任意のRNA塩基又は任意の配列を有するRNAに対し、特異的に結合する蛋白質を設計することができる。
　本発明により、さらに下記の知見が提供される。
(7)  相同PPR蛋白質のアミノ酸配列の比較において、PPRモチーフの1番アミノ酸がイソロイシン、4番アミノ酸がアスパラギンの場合、1番アミノ酸にバリン、アラニンの多型がが見られ; また1番アミノ酸がバリン、4番アミノ酸がトレオニンの場合、一番アミノ酸にイソロイシンの多型が見られた。したがって、これら多型アミノ酸は同一機能を担うアミノ酸であることが示唆される。
(8)  あるPPRモチーフの 1番及び4番アミノ酸が、バリン及びトレオニン、又はイソロイシン及びトレオニンの場合、そのモチーフはAに強く結合し、次にU、その次にGに対して結合特異性を有しうる。
(9)   あるPPRモチーフの1番及び4番アミノ酸が、バリン及びアスパラギン、イソロイシン及びアスパラギン又はアラニン及びアスパラギンの場合、そのモチーフはAに強く結合し、次にG、その次にUに結合する特異性を有しうる。
(10)　あるPPRモチーフの1番及び4番アミノ酸が、ロイシン及びアスパラギンの場合、そのモチーフはGに強く結合し、次にT、その次にAに結合する特異性を有しうる。
(11)　PPRモチーフ1個で構成されるタンパク質において、1番、4番アミノ酸にイソロイシン、アスパラギンをもつもの(例えばCRR4/6)は、Aに好んで結合し、1番アミノ酸をロイシンに改変し、1番、4番アミノ酸にロイシン、アスパラギンをもつもの(例えばCRR4/6(I1A))は、Aに結合せず、Gと良く結合しうる。すなわち、1番及び4番アミノ酸それぞれのRNA認識コードに対応したPPRモチーフを用いることで、各塩基に結合する蛋白質を調製でき、また連結することで連続した当該塩基をもつRNA配列に結合する蛋白質の構築が可能である。
　したがって、本発明により、対象とする任意のRNA塩基を特異的に結合可能な蛋白質の設計方法、対象とする任意の配列を有するRNAを特異的に結合可能な蛋白質の設計方法が提供される。
　[実施例1：2個のPPRモチーフからなるミニPPR蛋白質の調製］
　(シロイヌナズナからのゲノムDNAの調製)
　シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia)をムラシゲ・スクーク培地(2%ショ糖、0.5% Gellangamを含む)で3週間培養した。培養した植物の緑葉(0.5 g)をフェノール/クロロホルム抽出した後、エタノールを加えてDNAを不溶化した。回収したDNAを100 μlのTE液(10 mM トリス・塩酸 (pH 8.0)、1mM EDTA)に溶解し、10ユニットのRNase A(DNase-free、タカラバイオ社)を加えて、37℃で30分反応させた。その後、反応液を再度フェノール/クロロホルム抽出した後、エタノール沈殿によりDNAを回収した。10 μgのDNAが得られた。
　(ミニPPR蛋白質HCF152/5&6をコードする遺伝子のクローニング)
　シロイヌナズナからのゲノムDNAの調製は上記の実施例1に記載されている方法により行った。PPR蛋白質遺伝子HCF152(at3g09650;配列番号:75、76)は12個のPPRモチーフをもつ(図1A) (参照文献1)。シロイヌナズナゲノム情報データベース(MATDB: http://mips.gsf.de/proj/thal/db/index.html)で配列情報を参照し、5番目と6番目の2つのPPRモチーフで構成されるミニPPR蛋白質遺伝子を持つDNA配列を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマー(HCF/P5-F、HCF/P6-R；配列番号：1、2に記載)を調製した。オリゴヌクレオチドプライマーのフォワードプライマー、リバースプライマー5'側にはそれぞれSpe I、Sal I配列を付加した。Spe IとSal I配列は得られたクローンを制限酵素処理で挿入配を切り出すのに利用できるように組み入れた。
　5番目と6番目のPPRモチーフで構成されるミニPPR蛋白質遺伝子を含むDNA断片は、100 ngのゲノムDNAと上記プライマーを含む50 μlの反応液を95℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 30秒の25サイクルでKOD-FX (TOYOBO社) をDNA 伸長酵素として用い、PCRすることによって、それぞれ増幅した。得られたDNA断片は、pBAD/Thio-TOPO ベクター(Invitrogen社)を用いて、製品に添付するプロトコールに従ってクローニングした。クローン化したミニPPR蛋白質をコードするDNA配列を決定し、上記データベース上において目的と相当するDNA配列と相同な配列(配列番号：79)であることを確認し、pHCF152/5&6と命名した。
　(ミニPPR蛋白質HCF152/5&6の調製)
　上で得られたプラスミドをEscherichia coli TOP10株(Invitrogen社)に形質転換した。この大腸菌をアンピシリンが100 μg/mlの濃度で存在するLB培地300 ml(300mL培地を含む1L三角フラスコ)中で、37℃で培養した。培養液の濁度が波長600 nmでの吸光度が0.5に達した時に、誘導物質であるL-アラビノースを最終濃度が0.2%になるように添加し、さらに4時間培養を行った。遠心による集菌後、菌体を1 mg/mlのリゾチームを含む200 mlのバッファーA(50 mM トリス・塩酸 pH 8.0、500 mM KCl、2 mM imidazole、10 mM MgCl2、0.5% Triton X100、10% グリセロール)に懸濁し、超音波破砕と凍結溶解により菌体を破壊した。15,000 x g、20分間の遠心分離後に、上清を粗抽出液として回収した。この粗抽出液をバッファーAで平衡化したニッケルカラム樹脂(ProBond A、Invitrogen社)を充填したカラムに供した。
　カラムクロマトグラフィーは、20 mM imidazoleを含むバッファーAで十分に洗浄した後、200 mM imidazoleを含むバッファーAで目的蛋白質を溶出する二段階濃度勾配により行った。得られた組み換え蛋白質をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認したところ、約30 kDaの蛋白質として検出された。これをHCF152/5&6蛋白質と命名した。なお、この蛋白質は、配列番号78に記載のアミノ酸配列を備えるとともに、N末端側に溶解性を高めるためのチオレドキンのアミノ酸配列、C末端側にヒスチジンタグ配列を備える融合蛋白質である。T-DYW蛋白質を含む精製画分100 μlを500 mLのバッファー E(20 mM トリス・塩酸 pH 7.9、60 mM KCl、12.5 mM MgCl2、0.1 mM EDTA、17% グリセロール、2 mM DTT)で透析した後、精製標品とした。
　(様々なミニPPR蛋白質の調製)
　上の方法と同様に、HCF152蛋白質に由来する異なるPPRモチーフ2個で構成されるミニPPR蛋白質遺伝子：
pHCF152/6&7(配列番号：81)はプライマーHCF/P6-F及びHCF/P7-R(配列番号3、4に記載)、
pHCF152/7&8(配列番号：83)はプライマーHCF/P7-F及びHCF/P8-R(配列番号5、6に記載)、
pHCF152/8&9(配列番号：85)はプライマーHCF/P8-F及びHCF/P9-R(配列番号7、8に記載)、
pHCF152/9&10(配列番号：87)はプライマーHCF/P9-F及びHCF/P10-R(配列番号9、10に記載)、
pHCF152/10&11(配列番号：89)はプライマーHCF/P10-F及びHCFP11-R(配列番号11、12に記載)
を用いて遺伝子のクローニングを行った。
　同様に蛋白質の調製を行い、それぞれ、HCF152/6&7(配列番号：80)、HCF152/7&8(配列番号：82)、HCF152/8&9(配列番号：84)、HCF152/9&10(配列番号：86)、HCF152/10&11(配列番号：88)蛋白質と命名した(図1A)。
　(アミノ酸置換ミニPPR蛋白質の調製)
　アミノ酸を置換したミニPPR蛋白質：
p5&6/5-T4E(配列番号：95)はプライマーHCF5(4T-E)2-F及びHCF/P6-R(配列番号：02、17)、
p5&6/5-T4N(配列番号：97)はプライマーHCF5(4T-N)2-F及びHCF/P6-R(配列番号：02、17)、
p5&6/5-T5I(配列番号：99)はプライマーHCF5(T5I)-F及びHCF/P6-R(配列番号：02、17)、
p6&7/6-V1R(配列番号：139)はプライマーHCF6&7/6#V1R-F及びHCF/P7-R(配列番号：04、58)
を用いて遺伝子のクローニングを行った。
　同様に蛋白質の調製を行い、それぞれ、5&6/5-T4E(配列番号：94)、5&6/5-T4N(配列番号：96)、5&6/5-T5I(配列番号：98)、6&7/6-V1R蛋白質(配列番号：138)と命名した。
　p5&6/5-R1A(配列番号：91)はプライマーHCF/5&6#R1A-F(配列番号:13)及びHCF/5&6#R1A-R(配列番号:14)、鋳型DNAにpHCF152/5&6(配列番号:79)を用いて、site directed mutagenesis kit (Stratagene社)により添付のプロトコールに従って、遺伝子のクローニングを行った。同様に蛋白質の調製を行い、5&6/5-R1A(配列番号：90)蛋白質と命名した。
　5&6/5-R1Aと同様に：
p5&6/5-R1I(配列番号：93)はプライマーHCF/5&6#R1I-F及びHCF/5&6#R1I-R(配列番号：15、16)、
p5&6/5-K8N(配列番号：101)はプライマー5&6/5#K8N-F及び5&6/5#K8N-R(配列番号：20、21)、
p5&6/5-K8A(配列番号：103)はプライマー5&6/5#K8A-F及び5&6/5#K8A-R(配列番号：22、23)、
p5&6/5-G9L(配列番号：105)はプライマーHCF/5&6#G9L-F及びHCF/5&6#G9L-R(配列番号：24、25)、
p5&6/5-G9A(配列番号：107)はプライマーHCF/5&6#G9A-F及びHCF/5&6#G9A-R(配列番号：26、27)、
p5&6/5-M11A(配列番号：109)はプライマーHCF5(M11A)-F及びHCF5(M11A)-R(配列番号：28、29)、
p5&6/5-M11I(配列番号：111)はプライマーHCF5(M11I)-F及びHCF5(M11I)-R(配列番号：30、31)、
p5&6/5-K12A(配列番号：113)はプライマー5&6/5#K12A-F及び5&6/5#K12A-R(配列番号：32、33)、
p5&6/5-K12H(配列番号：115)はプライマーHCF5(12K-H)-F及びHCF5(12K-H)-R(配列番号：34、35)、
p5&6/5-K12N(配列番号：117)はプライマー5&6/5#K12N-F及び5&6/5#K12N-R(配列番号：36、37)、
p5&6/5-N13A(配列番号：119)はプライマーHCF/5&6#N13A-F及びHCF/5&6#N13A-R(配列番号：38、39)、
p5&6/5-N13L(配列番号：121)はプライマーHCF/5&6#N13L-F及びHCF/5&6#N13L-R(配列番号：40、41)、
p5&6/5-G14A(配列番号：123)はプライマーHCF/5&6#G14A-F及びHCF/5&6#G14A-R(配列番号：42、43)、
p5&6/5-G14D(配列番号：125)はプライマーHCF/5&6#G14D-F及びHCF/5&6#G14D-R(配列番号：44、45)、
p5&6/6-T4N(配列番号：127)はプライマー5&6/6#T4N-F及び5&6/6#T4N-R(配列番号：46、47)、
p5&6/6-T4A (配列番号：129)はプライマー5&6/6#T4A-F及び5&6/6#T4A-R(配列番号：48、49)、
p5&6/6-S8A(配列番号：131)はプライマー5&6/6#S8A-F及び5&6/6#S8A-R(配列番号：50、51)、
p5&6/6-S8K(配列番号：133)はプライマー5&6/6#S8K-F及び5&6/6#S8K-R(配列番号：52、53)、
p5&6/6-N12A(配列番号：135)はプライマー5&6/6#N12A-F及び5&6/6#N12A-R(配列番号：54、55)、
p5&6/6-N12R(配列番号：137)はプライマー5&6/6#N12R-F及び5&6/6#N12R-R(配列番号：56、57)
を用いて、site directed mutagenesis kit (Stratagene社)により、遺伝子のクローニングを行った。
　同様に蛋白質の調製を行い、5&6/5-R1I(配列番号：92)、5&6/5-K8N(配列番号：100)、5&6/5-K8A(配列番号：102)、5&6/5-G9L(配列番号：104)、5&6/5-G9A(配列番号：106)、5&6/5-M11A(配列番号：108)、5&6/5-M11I(配列番号：110)、5&6/5-K12A(配列番号：112)、5&6/5-K12H(配列番号：114) 、5&6/5-K12N(配列番号：116)、5&6/5-N13A(配列番号：118)、5&6/5-N13L(配列番号：120)、5&6/5-G14A(配列番号：122)、5&6/5-G14D(配列番号：124)、5&6/6-T4N(配列番号：126)、5&6/6-T4A (配列番号：128)、5&6/6-S8A(配列番号：130)、5&6/6-S8K(配列番号：132)、5&6/6-N12A(配列番号：134)、5&6/6-N12R(配列番号：136)蛋白質と命名した。
　また：
p6&7/7-N4T(配列番号：141)はプライマー6&7#7/N4T-F及び6&7#7/N4T-R(配列番号：59、60)、
p6&7/6-S8K(配列番号：143)はプライマー6&7#6/S8K-F及び6&7#6/S8K-R(配列番号：61、62)、
p6&7/6-S8D(配列番号：145)はプライマー6&7#6/S8D-F及び6&7#6/S8D-R(配列番号：63、64)、
は、site directed mutagenesis kit (Stratagene社)及び、鋳型にpHCF152/6&7を用いて
、遺伝子のクローニングをした。
　同様に蛋白質の調製を行い、6&7/7-N4T(配列番号：140)、6&7/6-S8K(配列番号：142)、6&7/6-S8D(配列番号：144)蛋白質と命名した。
　さらに：
p8&9/8-D8K(配列番号：151)は、プライマー8&9#8/D8K-F及び8&9#8/D8K-R(配列番号：65、66)、鋳型にpHCF152/8&9；
p8&9/9-K8D(配列番号：153)は、プライマー8&9#9/K8D-F及び8&9#9/K8D-R(配列番号：67、68)、鋳型にpHCF152/8&9；
p8&9/8-D8K, 9-K8D(配列番号：155)は、プライマー8&9#8/D8K-F及び8&9#8/D8K-R(配列番号：65、66)、鋳型に8&9/9-K8D；
p5&6/5-K12N, 6/N12K(配列番号：147)は、プライマー5&6#6/N12K-F及び5&6#6/N12K-R(配列番号：69、70)、鋳型にp5&6#5/K12N；
p5&6/5-K12M, 6/N12R(配列番号：149)は、プライマー5&6#5/K12M-F及び5&6#5/K12M-R(配列番号：71、72)、鋳型にp5&6#6N12R
を用いて、遺伝子のクローニングをした。
　同様に蛋白質の調製を行い、8&9/8-D8K(配列番号：150)、8&9/9-K8D(配列番号：152)、8&9/8-D8K, 9-K8D(配列番号：154)、5&6/5-K12N, 6/N12K(配列番号：146)、5&6/5-K12M, 6/N12R(配列番号：148)蛋白質と命名した。
　(基質RNAの調製)
　基質RNAとして、at3g09650蛋白質の内在の標的配列を含むシロイヌナズナ葉緑体petB遺伝子の開始コドンを含む120塩基のRNAを用いた(参照文献2)。基質RNAをBD120と命名した
(配列番号：77)。基質RNAであるBD120を合成するためのDNA断片は、オリゴヌクレオチドプライマーBD120-FとBD120-R(配列番号73、74)を用いて、上記のシロイヌナズナゲノムDNA 10 ngを鋳型DNAとして含む50 μlの反応液を95℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 30秒の25サイクルでKOD FX (TOYOBO 社) をDNA 伸長酵素として用い、PCRすることによって増幅した。BD120-Fプライマーの5'末端側には基質RNAを試験管内で合成するためのT7 プロモータ配列を付加した。得られたDNA断片は、アガロースゲルで展開後、ゲルから切り出すことによって精製した。精製DNA断片を鋳型にNTP mix(10 nmol GTP、CTP、ATP、0.5 nmol UTP)、4 μl [32P] α-UTP (GE ヘルスケア社、3000 Ci/mmol)、T7 RNA polymerase(タカラバイオ社)を含む20μlの反応液を37℃ 60分間反応させることで、基質RNAを合成した。基質RNAはフェノール/クロロホルム抽出、エタノール沈殿後、全量を6 M 尿素を含む変性6%ポリアクリルアミドゲル電気泳動で展開し、X線フィルムで60秒間感光させることによって、32P標識RNAを検出した。32P標識RNAをゲルから切り出し、200 μlのゲル溶出液(0.3 M 酢酸ナトリウム、2.5 mM EDTA、0.01% SDS)中に、4℃で12時間浸し、RNAをゲルから溶出した。溶出したRNAのうち、1 μlの放射活性を測定し、合成したRNAの総量を算出した。エタノール沈殿後、2500 cpm/μl (1 fmol/μl)になるように、RNAを超純水に溶解した。この調製方法で通常、2500 cpm/μlのRNAが約100 μl得られる。
　(ミニPPR蛋白質のRNA結合能)
　ミニPPR蛋白質のRNA結合活性は、ゲルシフト法によって解析した。反応液(10 mM トリス・塩酸 pH 7.9、30 mM KCl、6 mM MgCl2、2 mM DTT、8% グリセロール、0.0067% of Triton X-100)20 μl中に上記の375 pM(7.5 fmol/20μL)の基質RNA(BD120)と0～3750 nMのミニPPR蛋白質を混合し、25℃で15分間反応した。その後、反応液に4 マイクロリットルの80% glycerol液を添加し、10μLを1xTBE (89 mM Tris-HCl、89 mM Boric acid、2 mM EDTA)を含む10%未変性ポリアクリルアミドゲルで展開し、電気泳動後にゲルを乾燥させた。ゲル中のRNAの放射活性をバイオイメージングアナライザーBAS2000(フジフィルム社)で測定した。その結果を図1C～Hに示した。図1C～Hに示すように、蛋白質とRNAの結合は、32P標識RNAの移動度の違いとして現れる。32P標識RNA・蛋白質複合体の分子量が、32P標識RNA単体の分子量より大きいため、電泳動での移動度が遅くなるためである。図1C～Hの結果をもとに、蛋白質とRNAの結合を定量し(図1B)、解離定数(Kd)を求めることによって評価した(図2C)。3750 nMの蛋白質を用いても、Kdが算出できない場合は、ND(not determined)とした。
　図2Cに示すとおり、それぞれのミニPPR蛋白質は異なるRNA親和性を呈することが明らかになった。例えば、HCF152/8&9蛋白質のRNA親和性はKd=5.3 nMであるが、HCF152/10&11はKd=5236.3 nMであり、そのRNA親和性の差は1000倍以上である。
　次に、上で記したRNA親和性の違いを司るアミノ酸の予測を行った。上で示したように、PPRモチーフは2つのαへリックスで構成され、広義のhelical repeat protein familyに分類されることが配列情報から予測されている(図2A; 前掲非特許文献4)。このファミリーには、前述のプミリオ蛋白質を構成するpufモチーフ(36アミノ酸；3つのへリックス)を含めて、TPR (34アミノ酸；2つのへリックス), ARM (38アミノ酸；3つのへリックス), HEAT (34アミノ酸；2つのへリックス)などが含まれ、一様に半ドーナッツ型、三日月型の全体構造を示す(参照文献3)。
　PPRモチーフのアミノ酸配列、予備的な構造予測から、Helix AにRNA結合に働くアミノ酸が配置されていると予測された。そこで、Helix Aに含まれるアミノ酸に着目した。PPRモチーフに於いてはHelix Aは2～12番のアミノ酸で構成される。1番のアミノ酸は、へリックスに含まれる場合と含まれない場合がある(点線でしめした；図2C)。PPRモチーフとよく似たTPRモチーフ(蛋白質・蛋白質相互作用に働く)の保存配列を比較すると、図2A及びBにおいて灰色で示すアミノ酸は、αへリックスの骨格を形成すると予測され(PPRモチーフHelix Aの3，6，7、10番のアミノ酸)、図2Bで示すようにへリックスを横側から見たときに1カ所に集中することがわかった。αへリックスは3.6アミノ酸で一回転し、5.4A単位の右巻き構造であることは既知の事実である。
　(8番アミノ酸の特徴付け)
　図2Cで、RNAとの親和性が高い(Kdが低い)順番でミニPPR蛋白質を並べ、Helix Aに含まれるアミノ酸のうち、上述の灰色で示したアミノ酸以外を示した。すると、HCF152/5&6を例外として、2つのPPRモチーフで構成されるミニPPR蛋白質でRNAとの親和性が高い蛋白質には、1つめのPPRモチーフの8番アミノ酸、2つめのPPRモチーフの8番アミノ酸に塩基性アミノ酸(K, R; リジン、アルギニン)と酸性アミノ酸(D, E; アスパラギン酸、グルタミン酸)がペアになって現れることを見いだした(順不同)。
　そこで、RNAとの親和性が検出限界以下(ND; Kd >3750 nM)であったHCF152/6&7ミニPPR蛋白質の1つ目のPPRモチーフの8番のアミノ酸、セリン(S)、をアスパラギン酸(D)に置換した6&7/6-S8Dを調製し、RNA結合能を検証したところ、著しいRNA親和性の向上(Kd=200)が観察された(図3-3及び4B)。これは、8番のアミノ酸をアスパラギン酸に置換することで、ミニPPR蛋白質のRNA親和性を少なくとも約20倍向上できること、すなわち、8番のアスパラギン酸がRNA結合に能動的に働くことを示している(詳しくは後述)。
　(RNA結合に働くアミノ酸の同定)
　へリックス構造上で8番の周辺にもRNA結合に働くアミノ酸が配置されると予想した。そこで、図2Bで示したアミノ酸の配置を基に、円形のへリックスの左下半分に位置する2～11番(1, 2, 4, 5, 8, 9,11,12番)のアミノ酸に着目した。HCF152/5&6をモデルに、当該箇所(1, 2, 4, 5, 8, 9,11,12番)を中心に1アミノ酸置換を導入したミニPPR蛋白質を調製した。アミノ酸の置換は、アラニンへの置換を基本にした。しかし、PPRモチーフにはアラニンが含まれる場所もあるため、同箇所をもう1つ異なるアミノ酸へ置換することで(図4A)、アミノ酸置換による効果を検証した。RNAとの親和性は上と同じゲルシフト方法により解析し(図3)、そのRNAとの親和性をKdで評価した(図4B)。
　図4Bに示すとおり、アミノ酸置換を導入したミニPPR蛋白質は様々なKd(RNAとの親和性)を示し、アミノ酸置換によりRNA親和性が低下(Kdが上昇)した場合と、アミノ酸置換による効果がほとんど見られなかった場合とがあった。この解析では、RNA親和性が著しく上昇(Kdが低下)したような蛋白質は得られなかった。天然型ミニPPR蛋白質であるHCF152/5&6のKdが21.1 nMであるため、10倍以上のRNA親和性の低下をアミノ酸置換による有意なRNA親和性の低下と定義することで、PPRモチーフ構成アミノ酸の番号で、1、4、8、9、12番の5つのアミノ酸への置換導入により、有意にRNA親和性が低下したと評価された。すなわち、1、4、8、9、12番の5つのアミノ酸を異なるアミノ酸に置換することで、PPR蛋白質のRNA親和性を低下できることを意味している。
　(RNA結合に能動的に働くアミノ酸の同定)
　次に、上のアミノ酸置換による解析をより詳細に評価するために、RNAとの親和性が検出限界以下(ND; Kd >3750 nM)であったHCF152/6&7ミニPPR蛋白質の1、4、8番のアミノ酸を、高いRNA親和性をもつミニPPR蛋白質(例えば、HCF152/8&9)が持つアミノ酸に置換することで、RNA親和性の上昇が観察されるかを検討した。9、12番に関しては、HCF152/6&7のみに特有のアミノ酸が見いだせなかったため、本解析ではアミノ酸置換を導入しなかった(後述)。
　その結果、1つ目のPPRモチーフの1番のバリン(V)をアルギニン(R)、2つ目のPPRモチーフの4番のアスパラギン(N)をスレオニン(T)、1つ目のPPRモチーフの8番のセリン(S)をリジン(K)もしくはアスパラギン酸(D)に置換することで、RNA親和性の向上が観察された(図3-3)。すなわち、1, 4, 8番のアミノ酸がRNA親和性に能動的に働くこと、1, 4, 8番のアミノ酸を操作することで、PPRモチーフ、ひいてはPPR蛋白質のRNA親和性を向上できることを意味している。
　(12番アミノ酸の特徴付け)
　ミニPPR蛋白質の12番アミノ酸の組成を見ると、一方のモチーフでは塩基性、他方のモチーフでは中性又は疎水性であることが多い。そこで、この塩基性と中性(疎水性)の組み合わせの有意性を検証した。HCF152/5&6を用いて、1つ目のPPRモチーフの12番、リジン(K)を同じく塩基性のヒスチジン(H)に置換すると、天然型とほぼ同等のRNA親和性(Kd)を示した (5&6/5-K12H;図3-1及び図5)。しかし、同アミノ酸をアスパラギン(N)に置換すると著しいRNA親和性の低下(5&6/5-K12N; Kd= ND( >3750 nM))が観察された。しかし、このアミノ酸置換蛋白質の2つ目のPPRモチーフの12番アミノ酸であるアスパラギン(N)を塩基性アミノ酸であるリジン(K)に置換するとRNA親和性が向上した(5&6/5-K12N, 6-N12K; 図3-3及び図5)。すなわち、第一番目のモチーフ12番アミノ酸の置換(K→N)のRNA親和性の低下が、第二番目のモチーフ12番アミノ酸の置換(N→K)で相補される。
　12番アミノ酸への塩基性アミノ酸の配置による単純なRNA親和性の向上(酸性であるRNAとの親和性の向上)が考えられたため、次に第二番目のモチーフの12番アミノ酸アスパラギンをアルギニン(R)に置換したが、この場合もRNA親和性の著しい低下が観察された(5&6/6-N12R; Kd=ND)。そこで、上と同様に、アルギニン置換を残したままで、1第一番目のモチーフの12番リジン(K)を疎水性アミノ酸であるメチオニン(M)に置換したところ、同じくRNA親和性の若干の向上が観察された(5&6/5-K12M, 6-N12R；Kd=473 nM; 図5)。
　この解析により、12番アミノ酸もPPRモチーフのRNA親和性に能動的に働くこと、2つのモチーフでの12番アミノ酸は、塩基性、中性(もしくは疎水性)のアミノ酸のペアになることが重要であることを意味している。
　また、PPRモチーフは単独で働くわけではなく、前後のモチーフに含まれるアミノ酸とのバランスで全体のRNA結合特性が制御されることを意味している。複数個のPPRモチーフを組み合わせて、RNA結合因子を設計するときに、12番のアミノ酸を塩基性、中性(疎水性)のペアにすることで、RNA親和性の向上が出来ることを意味している。
　(8番アミノ酸の特徴付け)
　12番アミノ酸では、隣り合うPPRモチーフ間での相互作用がRNA親和性に働くことがわかった。今回用いたミニPPR蛋白質では、2つのPPRモチーフで8番アミノ酸が塩基性、酸性のペアになっている場合に、RNA親和性が高くなる傾向が観察されており、実際、8番アミノ酸がRNA親和性に能動的に働くことをすでに示した(図2及び4)。
　そこで、HCF152/8&9をモデルに、8番アミノ酸の特徴付けを行った。1つめのPPRモチーフのアスパラギン酸(D)をリジン(K)にして、塩基性と塩基性のペアにしたところ、RNA親和性は変わらなかった(8&9/8-D8K; 図6)。同じく、2つめのPPRモチーフのリジン(K)をアスパラギン酸(D)にして、酸性、酸性のペアにしても(8&9/9-K8D)、塩基性と酸性のペアを逆方向の酸性と塩基性のペアにしても(8&9/8-D8K,9-K8D)にしても、RNA親和性に有意な差は見られなかった。
　これは、12番アミノ酸とは異なり、8番アミノ酸は酸性アミノ酸又は塩基性アミノ酸のどちらかが配置されていれば、RNA親和性は保たれることを意味している。言い換えれば
、8番アミノ酸を塩基性又は酸性アミノ酸にすることでRNA親和性を向上、それ以外(例、アスパラギン、アラニン)にすることで低下するように制御できることを示唆している。
　［実施例2：PPRモチーフを構成するアミノ酸の統計解析］
　Web上の蛋白質ドメイン検索プログラムPfam (Pfam: http://pfam.sanger.ac.uk/)において、PPRモチーフと規定されるPF01535より、PPRモチーフ558個の配列を入手した(配列番号156)。入手した配列より、1、4，8、12番のアミノ酸配列の組成を解析した。その結果、1番アミノ酸のほとんどは疎水性アミノ酸、4番は中性アミノ酸で構成されることが明らかとなった。8番アミノ酸は、中性が最も多いが(43%)、塩基性、酸性、疎水性アミノ酸(それぞれ約20%)で構成される。12番アミノ酸は塩基性アミノ酸(55%)が最も多いが、中性アミノ酸(22%)で構成されることも多い。このように1、4、8、12番アミノ酸はその性質が異なっていることから、それぞれのアミノ酸はPPRモチーフのRNA結合能においても異なった役割を担っていると示唆された。
　次に、同一モチーフ上での1番と4番に出現するアミノ酸の組み合わせの偏りを解析し、理論値との偏りをカイ2乗検定によって評価した(図8)。同様に、4番と8番アミノ酸の組み合わせ、8番と12番アミノ酸の組み合わせも解析した。その結果、1番と4番、及び8番と12番アミノ酸の組み合わせにおいて有意な偏りが明らかとなった(P値 < 0.05；5% 有意水準)。すなわち、1番と4番、及び8番と12番アミノ酸は、協調してRNA結合に働くことを示唆している。なお、この検定における中性アミノ酸とは、中性でありかつ親水性のもの、すなわちアスパラギン、セリン、グルタミン、スレオニン、チロシン、システインである。この検定における疎水性アミノ酸は、トリプトファン、グリシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンであり、本願明細書ですでに定義したとおりである。
　さらに、PPR蛋白質であるHCF152(12個のPPRモチーフ、配列番号:75、76)全長における各モチーフの1、4、8、12アミノ酸を解析したところ、12番には塩基性アミノ酸がほぼ1個おきのモチーフに出現することを見いだした。この塩基性アミノ酸の位相は、1から7番目、及び10から12番目の2つで構成されている。同じく8番アミノ酸でも同様のモチーフ1個おきの塩基性アミノ酸の位相が3から9番目のPPRモチーフに出現し、逆に8から12番目のPPRモチーフでは、酸性アミノ酸の1個おきの位相があることを見いだした(図9)。
　この位相の一般性を検証するために、異なるPPR蛋白質LOI1(14個のPPRモチーフ)での各モチーフの1、4、8、12番アミノ酸を解析した。すると、LOI1蛋白質の場合、2～11番のPPRモチーフの12番アミノ酸に2個おきに塩基性アミノ酸が出現すること、5～14番のPPRモチーフにおいて、8番アミノ酸に2個おきの酸性アミノ酸の位相が出現することを見いだした(図9)。すなわち、複数のPPRモチーフから構成される蛋白質においては、8、12番アミノ酸に、1個おき、又は2個おきに酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸を配置することで、蛋白質機能、すなわちRNA結合活性を上昇できる可能性を示唆している。
　PPR蛋白質は異なる性質のPPRモチーフが連続することで、配列特異的なRNA結合能を発揮すると考えられている。これまでに示した8番及び12番アミノ酸置換実験では、結合RNA配列特異性は変化しなかった。上記の統計解析の結果は、1、4番アミノ酸を中心にPPRモチーフの結合RNA特異性が決定すること、また同アミノ酸を改変することで、結合RNA配列特異性を改変できる可能性を示唆している。しかし、8、12番アミノ酸を置換することで結合RNA配列特異性を改変する可能性を否定するものではない。
　［実施例3］
　(基質RNAの調製)
基質RNAとして、5'末端側にAUCGのリンカーを付加した25塩基のヌクレオチドホモポリマー(LN25)を化学合成した(LA25、配列番号: 157；LU25、配列番号: 158；LG25、配列番号: 159；LC25、配列番号: 160；Thermo SCIENTIFIC社に受託)。合成RNAの5'末端にT4 polynucleotide kinase (Takara 社)とγ[32P]ATP (MP Biomedical社、6000Ci/mmol)を用いて、32Pラベルを付加した。ラベルしたRNAはエタノール沈殿後、5 fmol/μLとなるように溶解し、放射性ラベルRNAを調製した。
　(ミニPPR蛋白質の調製)
　前述の方法と同様に: 
pHCF152/2&3(配列番号: 169)はプライマーHCF/P2-F及びHCF/P3-R(配列番号: 161、162記載)、
pHCF152/3&4(配列番号: 171)はプライマーHCF/P3-F 及びHCF/P4-R (配列番号: 163、164に記載)、
 pCRR4/6(配列番号: 173)はプライマーCRR4/6-F及びCRR4/6-R(配列番号: 165、166に記載)、
pCRR4/6(I1L) (配列番号: 175)はプライマーCRR4/6(I1L)-F及びCRR4/6-R(配列番号: 167、166に記載)、
を用いて組換え蛋白質発現ベクターおよび蛋白質の調製を行い、それぞれ、HCF152/2&3(配列番号: 168)、HCF152/3&4(配列番号: 170)、CRR4/6(配列番号: 172)、CRR4/6(I1L)(配列番号: 174)蛋白質と命名した。
　(ミニPPR蛋白質の結合特異性)
　ミニPPR蛋白質の結合特異性は、ゲルシフト法によって解析した。反応液(10 mM トリス・塩酸 pH 7.9、30 mM KCl、6 mM MgCl2、2 mM DTT、8% グリセロール、0.0067% of Triton X-100)20 μl中に上記の4 pM(5 fmol/20μL)の基質RNA(LN25；LA25、LU25、LG25又はLC25)と200 nMのミニPPR蛋白質を混合し、25℃で15分間反応した。その後、反応液に4 μlの80% glycerol液を添加し、10μLを1xTBE (89 mM Tris-HCl、89 mM Boric acid、2 mM EDTA)を含む10%未変性ポリアクリルアミドゲルで展開し、電気泳動後にゲルを乾燥させた。ゲル中のRNAの放射活性をバイオイメージングアナライザーBAS2000(フジフィルム社)で測定した。
　その結果を図10に示した。図10Aに示すように、蛋白質とRNAの結合は、32P標識RNAの移動度の違いとして現れる。32P標識RNA・蛋白質複合体の分子量が、32P標識RNA単体の分子量より大きいため、電泳動での移動度が遅くなるためである。
各ミニPPR蛋白質のA、U、G、Cそれぞれとの結合を放射活性に基づいて定量し(図10B)、WebLOGO(HYPERLINK "http://weblogo.berkeley.edu/"http://weblogo.berkeley.edu/)で視覚化した(図 10C)。図10Cに示したとおり、各ミニPPR蛋白質の結合塩基特異性は、HCF152/2&3、5&6、9&10はA>G>Uであり、特にAに強く結合した。HCF152/7&8もAに強く結合するが、その結合塩基特異性はA>U>G、であった。一方、HCF152/3&4はGに良く結合し、その結合塩基特異性はG>U>A、であった。
　前述のとおり、ミニPPR蛋白質を構成するPPRモチーフの結合塩基特異性は、モチーフ中の1、4番アミノ酸で決定されると考えられた。そこで各ミニPPR蛋白質の1、4番アミノ酸に注目した(図11)。各PPRモチーフの1、4番アミノ酸は多様であったため、6種の維管束植物より、シロイヌナズナのHCF152蛋白質の潜在的相同蛋白質をNCBI BLASTを用いて検索し、当該アミノ酸の多型を解析した(図12)。その結果、1番アミノ酸がイソロイシン、4番アミノ酸がアスパラギン(IN)の場合(第7番目及び第10番目のPPRモチーフ)、1番アミノ酸にバリン(V)、アラニン(A)の多型がが見られ; また1番アミノ酸がバリン、4番アミノ酸がトレオニン(VT)の場合(第6番目のPPRモチーフ)、一番アミノ酸にイソロイシン(I)の多型が見られた(図12)。すなわち、これら多型アミノ酸は同一機能を担うアミノ酸であることが示唆される。
　これらの結果を統合すると、1番及び4番アミノ酸が、バリン及びトレオニン(VT)、又はイソロイシン及びトレオニン(IT)の場合、そのモチーフはAに強く結合し、次にU、その次にGを好む結合配列特異性を有すること； 1番及び4番アミノ酸が、バリン及びアスパラギン(VN)、イソロイシン及びアスパラギン(IN)又はアラニン及びアスパラギン(AN)の場合、そのモチーフはAに強く結合し、次にG、その次にUに結合する特異性を有すること；また、1番及び4番アミノ酸が、ロイシン及びアスパラギン(LN)の場合、そのモチーフはGに強く結合し、次にT、その次にAに結合する特異性を有することが示唆された。
　実験で用いているミニPPR蛋白質は2個のPPRモチーフで構成されているが、第一番目のPPRモチーフの性質が大きく出ていると考えられた。PPRモチーフ中の1、4番アミノ酸の働きを詳細に調べるために、異なるPPR蛋白質であるCRR4(at2g45350、配列番号: 176、177)を用いて、PPRモチーフ1個で構成される蛋白質を調製し、解析した。図13に示したとおり、1番、4番アミノ酸にイソロイシン、アスパラギン(I、N)をもつ蛋白質CRR4/6は、Aを好んで結合するが、1番アミノ酸をロイシンに改変し、1番、4番アミノ酸にロイシン、アスパラギン(I、N)蛋白質CRR4/6(I1A)はAに結合せず、Gと良く結合した。
　すなわち、1番及び4番アミノ酸それぞれのRNA認識コードに対応したPPRモチーフを用いることで、各塩基に結合する蛋白質を調製できること、また連結することで連続した当該塩基をもつRNA配列に結合する蛋白質の構築が可能であることを意味している。
　［実施例で引用した文献］
　参照文献1：Meierhoff, K., Felder, S., Nakamura, T., Bechtold, N., and Schuster, G. (2003). HCF152, an Arabidopsis RNA binding pentatricopeptide repeat protein
involved in the processing of chloroplast psbB-psbT-psbH-petB-petD RNAs. Plant Cell 15, 1480-1495.
　参照文献2：Nakamura, T., Meierhoff, K., Westhoff, P., and Schuster, G. (2003).
RNA-binding properties of HCF152, an Arabidopsis PPR protein involved in the processing of chloroplast RNA. Eur. J. Biochem. 270, 4070-4081.
　参照文献3：Edwards, T.A., Pyle, S.E., Wharton, R.P., and Aggarwal, A.K. (2001). Structure of Pumilio reveals similarity between RNA and peptide binding motifs. Cell 105, 281-289.

Claims (11)

  1. 　式Iで表される30～38アミノ酸長のポリペプチドからなるPPRモチーフを、1個以上(好ましくは2個以上、より好ましくは2～14個)有するPPR蛋白質の、RNA結合特性の改変方法であって
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     (式中：
    　Helix Aは、12アミノ酸長の、αへリックス構造を形成可能な部分であり、Helix Aは式II
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     で表され(A1～A12は、それぞれ独立に、アミノ酸を表わす。)；
    　Helix Bは、11～13アミノ酸長の、αへリックス構造を形成可能な部分であり；
    　Xi～iiiは、それぞれ独立に、1～9アミノ酸長からなる部分であるか、又は存在しない。)
    　一又は複数のPPRモチーフにおいて、A1、A4、A8、A9及びA12からなる群(好ましくはA1、A4、A8及びA12からなる群)から選択される一又は複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸に置換する工程を含む、方法。
  2. 　請求項1に記載の方法であって、PPR蛋白質がPPRモチーフを2個以上有し、下記のいずれかの工程を含む、PPR蛋白質のRNA結合活性を向上させるための方法：
    　第一番目のPPRモチーフのA1を、塩基性アミノ酸、好ましくはアルギニンとする置換；
    　第二番目のPPRモチーフのA4を、中性アミノ酸、好ましくはスレオニンとする置換；
    　第一番目のPPRモチーフのA8を、塩基性アミノ酸、好ましくはリジンとする置換、又は酸性アミノ酸、好ましくはアスパラギン酸とする置換；及び
    　第一番目のPPRモチーフのA12及び／又は第二番目のPPRモチーフのA12の置換であって、いずれか一方を塩基性アミノ酸とし、かつ他方を中性アミノ酸又は疎水性アミノ酸とする置換。
  3. 　請求項1又は2に記載の方法であって、一又は複数のPPRモチーフにおける下記を考慮した改変を含む、方法：
    　あるモチーフのA1と、同じモチーフのA4との協同、及び／又は
    　あるモチーフのA8と、同じモチーフのA12との協同。
  4. 　A8及びA12に塩基性アミノ酸又は酸性アミノ酸を有する請求項1に定義されたPPRモチーフを用いる、RNA結合特性を有する蛋白質の設計方法。
  5. 　RNA中の対象塩基に特異的に結合可能な蛋白質の設計方法であって：
    　請求項1に定義されたPPRモチーフを用い、このときA1とA4とを、対象塩基が特異的に結合される組み合わせとし、そのモチーフの塩基結合特異性を向上させることを含む、方法。
  6. 　対象塩基がアデニン、ウラシル又はグアニン(好ましくはアデニン又はウラシル、より好ましくはアデニン)であり、A1及びA4の組み合わせが、バリン及びトレオニン、又はイソロイシン及びトレオニンであるか；
    　対象塩基がアデニン、グアニン又はウラシル(好ましくはアデニン又はグアニン、より好ましくはアデニン)であり、A1及びA4の組み合わせが、順に、バリン及びアスパラギン、イソロイシン及びアスパラギン又はアラニン及びアスパラギンであるか；又は
    　対象塩基がグアニン、チミン又はアデニン(好ましくはグアニン又はチミン、より好ましくはグアニン)であり、A1及びA4の組み合わせが、順に、ロイシン及びアスパラギンである、請求項5に記載の方法。
  7. 　請求項5又は6に記載の方法であって、
    　RNA中の2以上の対象塩基それぞれに対応したPPRモチーフを用い、このとき、
    　一のモチーフのA1とA4とを、対応する対象塩基が特異的に結合される組み合わせとし、そのモチーフの結合特異性を向上させ；かつ
    　別のモチーフのA1とA4とを、対応する対象塩基が特異的に結合される組み合わせとし、各モチーフの塩基結合特異性を向上させることを含む、方法。
  8. 　配列番号：90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、168、170、172又は174のアミノ酸配列からなるポリペプチドの全部又はRNA結合活性を有する一部を含む、蛋白質。
  9. 　請求項8に定義されたRNA結合性蛋白質をコードする、ポリヌクレオチド。
  10. 配列番号：89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、169、171、173又は175の塩基配列を有する、請求項9に記載のポリヌクレオチド。
  11. 　請求項1～3のいずれか１項に記載の方法で改変されたPPR蛋白質、請求項4～7のいずれか１項に記載の方法で設計された蛋白質、又は請求項8に記載の蛋白質を用いる、RNAの機能の制御方法。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013058404A1 (ja) 2011-10-21 2013-04-25 国立大学法人九州大学 Pprモチーフを利用したrna結合性蛋白質の設計方法及びその利用
WO2013155555A1 (en) * 2012-04-16 2013-10-24 The University Of Western Australia Peptides for the binding of nucleotide targets
WO2014175284A1 (ja) 2013-04-22 2014-10-30 国立大学法人九州大学 Ｐｐｒモチーフを利用したｄｎａ結合性タンパク質およびその利用
JP5848853B2 (ja) * 2013-03-26 2016-01-27 株式会社ニッピ タンパク質の製造方法
WO2017209122A1 (ja) * 2016-06-03 2017-12-07 国立大学法人九州大学 標的ｍＲＮＡからのタンパク質発現量を向上させるための融合タンパク質
WO2018030488A1 (ja) * 2016-08-10 2018-02-15 和光純薬工業株式会社 Ｐｐｒモチーフを利用したｄｎａ結合性タンパク質およびその利用
JPWO2020241876A1 (ja) * 2019-05-29 2020-12-03

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3613854A1 (en) 2014-03-05 2020-02-26 National University Corporation Kobe University Genomic sequence modification method for specifically converting nucleic acid bases of targeted dna sequence, and molecular complex for use in same
DK3216867T3 (da) 2014-11-04 2020-06-22 Univ Kobe Nat Univ Corp Fremgangsmåde til at modificere genomsekvens for at introducere specifik mutation i tilsigtet dna-sekvens ved base-fjernelsesreaktion og molekylekompleks anvendt dertil
ES2938623T3 (es) 2015-09-09 2023-04-13 Univ Kobe Nat Univ Corp Método para convertir una secuencia del genoma de una bacteria gram-positiva mediante una conversión específica de una base de ácido nucleico de una secuencia de ADN seleccionada como diana y el complejo molecular utilizado en el mismo
KR102061438B1 (ko) 2015-11-27 2019-12-31 고쿠리츠다이가쿠호진 고베다이가쿠 표적화 dna 서열 중의 핵산 염기가 특이적으로 전환되어 있는 단자엽식물 게놈 서열을 전환시키는 방법, 및 그것에 사용되는 분자 복합체
EP3447139B1 (en) 2016-04-21 2022-06-08 National University Corporation Kobe University Method for increasing mutation introduction efficiency in genome sequence modification technique, and molecular complex to be used therefor
CN106591367B (zh) * 2017-01-19 2019-05-07 中国人民解放军第二军医大学 一种在体内获得并纯化大量目的LncRNA的方法
US11472855B2 (en) 2017-03-17 2022-10-18 Takashi Sera RNA-binding protein
CN110446782B (zh) 2017-03-22 2024-03-01 国立大学法人神户大学 一种改变细胞所具有的dna的靶向部位的方法以及用于该方法的复合体
CA3082922C (en) 2017-11-22 2024-02-13 National University Corporation Kobe University Complex for genome editing having stability and few side-effects, and nucleic acid coding same
WO2019189147A1 (ja) 2018-03-26 2019-10-03 国立大学法人神戸大学 細胞の有する二本鎖ｄｎａの標的部位を改変する方法
JP7367974B2 (ja) 2018-07-31 2023-10-24 国立大学法人 東京大学 膜タンパク質活性測定法
CA3194019A1 (en) 2020-09-04 2022-03-10 National University Corporation Kobe University Miniaturized cytidine deaminase-containing complex for modifying double-stranded dna

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101933022A (zh) * 2007-06-20 2010-12-29 新英格兰生物实验室公司 识别期望特异性序列的结合蛋白的合理设计

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MEIERHOFF, K. ET AL.: "HCF152, an Arabidopsis RNA Binding Pentatricopeptide Repeat Protein Involved in the Processing of Chloroplast psbB-psbT-psbH-petB-petD RNAs.", THE PLANT CELL, vol. 15, 2003, pages 1480 - 1495 *
NAKAMURA, T. ET AL.: "RNA-binding properties of HCF152, an ArabidopsisPPR protein involved in the processing of chloroplast RNA.", EUR. J. BIOCHEM., vol. 270, 2003, pages 4070 - 4081 *
OKUDA, K. ET AL.: "A Pentatricopeptide Repeat Protein Is a Site Recognition Factor in Chloroplast RNA Editing.", J. BIOL. CHEM., vol. 281, no. 49, 2006, pages 37661 - 37667 *
SMALL, I. D. ET AL.: "The PPR motif - a TPR-related motif prevalent in plant organellar proteins.", TRENDS BIOCHEM. SCI., vol. 25, 2000, pages 46 - 47 *

Cited By (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9513283B2 (en) 2011-10-21 2016-12-06 Kyushu University, National University Corporation Method for designing RNA binding protein utilizing PPR motif, and use thereof
AU2017254874B2 (en) * 2011-10-21 2019-09-12 Kyushu University, National University Corporation Method for designing rna binding protein utilizing ppr motif, and use thereof
US10340028B2 (en) 2011-10-21 2019-07-02 Kyushu University, Nat'l University Corporation Method for designing RNA binding protein utilizing PPR motif, and use thereof
JPWO2013058404A1 (ja) * 2011-10-21 2015-04-02 国立大学法人九州大学 Ｐｐｒモチーフを利用したｒｎａ結合性蛋白質の設計方法及びその利用
US11742056B2 (en) 2011-10-21 2023-08-29 Kyushu University, National University Corporation Method for designing RNA-binding protein utilizing PPR motif, and use thereof
JP7157483B2 (ja) 2011-10-21 2022-10-20 国立大学法人九州大学 Ｐｐｒモチーフを利用したｒｎａ結合性蛋白質の設計方法及びその利用
AU2019280013B2 (en) * 2011-10-21 2022-03-31 Kyushu University, National University Corporation Method for designing rna binding protein utilizing ppr motif, and use thereof
JP2021130678A (ja) * 2011-10-21 2021-09-09 国立大学法人九州大学 Ｐｐｒモチーフを利用したｒｎａ結合性蛋白質の設計方法及びその利用
JP7381133B2 (ja) 2011-10-21 2023-11-15 国立大学法人九州大学 Ｐｐｒモチーフを利用したｒｎａ結合性蛋白質の設計方法及びその利用
JP2017148078A (ja) * 2011-10-21 2017-08-31 国立大学法人九州大学 Ｐｐｒモチーフを利用したｒｎａ結合性蛋白質の設計方法及びその利用
US10943671B2 (en) 2011-10-21 2021-03-09 Kyushu University, National University Corporation Method for designing RNA-binding protein utilizing PPR motif, and use thereof
JP2017192391A (ja) * 2011-10-21 2017-10-26 国立大学法人九州大学 Ｐｐｒモチーフを利用したｒｎａ結合性蛋白質の設計方法及びその利用
WO2013058404A1 (ja) 2011-10-21 2013-04-25 国立大学法人九州大学 Pprモチーフを利用したrna結合性蛋白質の設計方法及びその利用
US10679731B2 (en) 2011-10-21 2020-06-09 Kyushu University, National University Corporation Method for designing RNA binding protein utilizing PPR motif, and use thereof
JP2018042569A (ja) * 2011-10-21 2018-03-22 国立大学法人九州大学 Ｐｐｒモチーフを利用したｒｎａ結合性蛋白質の設計方法及びその利用
JP2018078896A (ja) * 2011-10-21 2018-05-24 国立大学法人九州大学 Ｐｐｒモチーフを利用したｒｎａ結合性蛋白質の設計方法及びその利用
US9984202B2 (en) 2011-10-21 2018-05-29 Kyushu University, National University Corporation Method for designing RNA binding protein utilizing PPR motif, and use thereof
EP3611261A1 (en) 2011-10-21 2020-02-19 Kyushu University, National University Corporation Method for designing rna binding protein uitilizing ppr motif, and use thereof
WO2013155555A1 (en) * 2012-04-16 2013-10-24 The University Of Western Australia Peptides for the binding of nucleotide targets
US9884897B2 (en) 2013-03-26 2018-02-06 Nippi, Incorporated Method for producing protein
US10442843B2 (en) 2013-03-26 2019-10-15 Nippi, Incorporated Method for producing protein
JP5848853B2 (ja) * 2013-03-26 2016-01-27 株式会社ニッピ タンパク質の製造方法
KR20210066947A (ko) 2013-04-22 2021-06-07 고쿠리쓰다이가쿠호진 규슈다이가쿠 피피알 모티프를 가지는 디앤에이 결합성 단백질을 포함하는 융합 단백질
KR102326842B1 (ko) 2013-04-22 2021-11-15 고쿠리쓰다이가쿠호진 규슈다이가쿠 피피알 모티프를 가지는 디앤에이 결합성 단백질을 포함하는 융합 단백질
JP5896547B2 (ja) * 2013-04-22 2016-03-30 国立大学法人九州大学 Ｐｐｒモチーフを利用したｄｎａ結合性タンパク質およびその利用
KR102606057B1 (ko) 2013-04-22 2023-11-23 고쿠리쓰다이가쿠호진 규슈다이가쿠 피피알 단백질을 이용하여 dna 염기 또는 특정 염기서열을 가지는 dna를 동정, 인식 또는 표적화하는 방법
WO2014175284A1 (ja) 2013-04-22 2014-10-30 国立大学法人九州大学 Ｐｐｒモチーフを利用したｄｎａ結合性タンパク質およびその利用
EP3696186A1 (en) 2013-04-22 2020-08-19 Kyushu University, National University Corporation Dna-binding protein using ppr motif, and use thereof
AU2018271425B2 (en) * 2013-04-22 2020-11-26 Hiroshima University Dna-binding protein using ppr motif, and use thereof
KR20160007541A (ko) 2013-04-22 2016-01-20 고쿠리쓰다이가쿠호진 규슈다이가쿠 피피알 모티프를 이용한 디앤에이 결합성 단백질 및 그의 이용
JP7290233B2 (ja) 2013-04-22 2023-06-13 国立大学法人九州大学 Ｐｐｒモチーフを利用したｄｎａ結合性タンパク質およびその利用
JP2022089859A (ja) * 2013-04-22 2022-06-16 国立大学法人九州大学 Ｐｐｒモチーフを利用したｄｎａ結合性タンパク質およびその利用
JP2021045158A (ja) * 2013-04-22 2021-03-25 国立大学法人九州大学 Ｐｐｒモチーフを利用したｄｎａ結合性タンパク質およびその利用
KR20210037757A (ko) 2013-04-22 2021-04-06 고쿠리쓰다이가쿠호진 규슈다이가쿠 피피알 모티프를 가지는 디앤에이 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질의 설계방법
US10189879B2 (en) 2013-04-22 2019-01-29 Kyushu University, Nat'l University Corporation DNA-binding protein using PPR motif, and use thereof
KR20230164213A (ko) 2013-04-22 2023-12-01 고쿠리쓰다이가쿠호진 규슈다이가쿠 피피알 단백질을 이용하는 dna 결합성 단백질 및 그의 이용
JP2019115347A (ja) * 2013-04-22 2019-07-18 国立大学法人九州大学 Ｐｐｒモチーフを利用したｄｎａ結合性タンパク質およびその利用
JP2016039810A (ja) * 2013-04-22 2016-03-24 国立大学法人九州大学 Ｐｐｒモチーフを利用したｄｎａ結合性タンパク質およびその利用
JP7057983B2 (ja) 2013-04-22 2022-04-21 国立大学法人九州大学 Ｐｐｒモチーフを利用したｄｎａ結合性タンパク質およびその利用
KR102390485B1 (ko) 2013-04-22 2022-04-22 고쿠리쓰다이가쿠호진 규슈다이가쿠 피피알 모티프를 가지는 디앤에이 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질의 설계방법
KR20220076478A (ko) 2013-04-22 2022-06-08 고쿠리쓰다이가쿠호진 규슈다이가쿠 피피알 단백질을 이용하여 dna 염기 또는 특정 염기서열을 가지는 dna를 동정, 인식 또는 표적화하는 방법
KR102407776B1 (ko) 2016-06-03 2022-06-10 고쿠리쓰다이가쿠호진 규슈다이가쿠 표적 mRNA로부터의 단백질 발현량을 향상시키기 위한 융합 단백질
KR20190015374A (ko) * 2016-06-03 2019-02-13 고쿠리쓰다이가쿠호진 규슈다이가쿠 표적 mRNA로부터의 단백질 발현량을 향상시키기 위한 융합 단백질
WO2017209122A1 (ja) * 2016-06-03 2017-12-07 国立大学法人九州大学 標的ｍＲＮＡからのタンパク質発現量を向上させるための融合タンパク質
WO2018030488A1 (ja) * 2016-08-10 2018-02-15 和光純薬工業株式会社 Ｐｐｒモチーフを利用したｄｎａ結合性タンパク質およびその利用
EP3498726A4 (en) * 2016-08-10 2020-03-25 Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation DNA-BINDING PROTEIN WITH PPR MOTIF AND USE OF THE DNA-BINDING PROTEIN
JPWO2018030488A1 (ja) * 2016-08-10 2019-06-13 富士フイルム和光純薬株式会社 Ｐｐｒモチーフを利用したｄｎａ結合性タンパク質およびその利用
WO2020241876A1 (ja) * 2019-05-29 2020-12-03 エディットフォース株式会社 効率的なｐｐｒタンパク質の作製方法及びその利用
JPWO2020241876A1 (ja) * 2019-05-29 2020-12-03

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