KR20230159466A - 구아이안계 세스퀴테르펜 유도체 및 이의 제약 용도 - Google Patents

구아이안계 세스퀴테르펜 유도체 및 이의 제약 용도 Download PDF

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Abstract

구아이안계 세스퀴테르펜 유도체 및 이의 제약 용도를 개시하며, 구아이안계 세스퀴테르펜 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 일반식 I로 표시된다. 파르테놀라이드, 데히드로코스투스락톤 등 풍부한 천연 성분을 원료로 사용하여, 구조 최적화를 통해 NLPR3 염증소체 활성화에 대해 억제 활성을 가지며, 화학적 안정성, 수용성 및 경구 생체이용률이 현저하게 향상된 신규한 구아이안계 세스퀴테르펜 유도체를 발견하였다. 또한 실험을 통해 NLRP3 염증소체 활성 억제 작용을 가지는 것으로 입증되어, 제약 응용 분야에서 잠재력이 크다.

Description

구아이안계 세스퀴테르펜 유도체 및 이의 제약 용도
본 발명은 화합물 유도체 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 구아이안계 세스퀴테르펜 유도체 및 이의 제약 용도에 관한 것이다.
염증소체는 대식세포, 단핵구 및 수지상 세포와 같은 선천성 면역 세포 내에서 PAMPs(병원체 연관 패턴 분자) 또는 DAMPs(손상 연관 패턴 분자)를 인식할 수 있는 단백질 복합체이다[Front Immunol, 2019, 10: 2538.]. NLRP1, NLRP3, NLRC4, Pyrin, NLRP6 및 AIM2 등과 같은 상이한 유형의 염증소체는 염증 반응을 매개하고, 세포 염증 인자의 방출을 촉진하며, 면역계에 신호를 전달할 수 있는 염증의 개시자로, 자연 면역과 획득 면역의 가교 역할을 한다[Cell, 2016, 165:792-800.]. 특이적 DAMPs나 PAMPs를 인식하는 다른 유형의 염증소체와 달리, NLRP3 염증소체는 상이한 유래의 DAMPs와 PAMPs를 광범위하게 인식할 수 있어, NLRP3 염증소체에 대한 연구는 다양한 분야에서 주목을 받고 있으며, 현재 가장 심도 있게 연구되는 염증소체로, 다양한 만성 염증 질환의 발생 및 진행에 관여하는 것으로 확인되었다[Nat Rev Drug Discov, 2018, 17:588-606.].
NLRP3 염증소체는 수용체 단백질 NLRP3, 조절 단백질 ASC 및 이펙터 단백질 pro-Caspase-1의 세 부분으로 구성된다[Immunol Rev, 2015, 265:35-52.]. NLRP3 염증소체 활성화는 두 단계로 나누어진다. 첫 번째 단계는, TLR4 수용체가 PAMPs, DAMPs 또는 외인성 스트레스 분자 등 첫 번째 신호를 인식하고, NF-κB 경로를 활성화하여 NLRP3, pro-IL-1β 및 pro-IL-18의 단백질 발현을 상향 조절하는 것이다. 두 번째 단계는, 수용체 단백질 NLRP3가 PAMPs, DAMPs 또는 세포 내 스트레스 분자 등 두 번째 신호를 인식하고, 어댑터 단백질 ASC에 결합하고 pro-Caspase-1을 활성화한 다음 pro-IL-1β 및 pro-IL-18을 분해 및 활성화하고, IL-1β 및 IL-18의 성숙과 분비를 촉진시키는 것이다[Int J Mol Sci, 2019, 20:3328.]. IL-1β는 자가분비 및 측분비 경로를 통해 NF-κB 신호 경로를 추가로 활성화하고, IL-1β, TNF-α, IL-6 및 IL-8 등 사이토카인의 분비를 촉진하며, 염증성 연쇄 반응을 유발하며 만성의 발생과 진행을 초래한다[Front Immunol, 2019, 10:276.].
NLRP3 염증소체의 과도한 활성화는 다양한 질병의 발생 및 진행과 밀접한 관련이 있으며, 여기에는 면역 질환, 자가면역 질환, 악성 종양, 피부 질환, 심혈관 질환, 간 관련 질환, 신장계 관련 질환, 위장관 관련 질환, 중추신경계 질환, 대사 질환, 내분비계 질환, 호흡기 질환, 림프계 질환, 염증, 전염병, 안과 질환, 정신 장애, 통증 등이 포함된다[Nat Med,2015,21:248-255;J Clin Invest,2020, 130:1961-1976;Cell Metab, 2020, 31:580-591; Circ Res,2018, 122:1722-1740; J Hepatol,2017, 66:1037-1046; Ageing Res Rev,2020, 64:101192;Autophagy, 2019, 15:1860-1881;Brain,2020, 143:1414-1430; Mucosal Immunol, 2019, 12:1150-1163;J Clin Invest, 2018, 128:1793-1806;Immunology, 2020, 160:78-89;J Inflamm (Lond), 2015, 12:41;Nat Commun, 2020, 11:4243;Front Immunol, 2020, 11:570251;BiochemBiophys Res Commun, 2016, 477:329-335;Pharmaceutics, 2020, 12:867;Arthritis Rheumatol, 2020, 72:1192-1202;Food Chem Toxicol, 2020, 144:111588;EMBO Rep, 2020, 21:e49666;Int Immunopharmacol, 2020, 81:106257;Cells, 2019, 8: 1389;Cell Prolif, 2021, 54: e12973.]. 따라서 NLRP3 염증소체의 활성화를 억제함으로써 상기 질환을 예방 및/또는 치료할 수 있다.
아르글라빈의 구조식은 다음과 같다.
.
Abderrazak A 연구진은 구아이안계 세스퀴테르페노이드 아르글라빈(arglabin)이 NLPR3 염증소체 활성화 억제 활성(EC50=10nM)을 가지며, 아르글라빈이 NLPR3 염증소체 관련 염증을 경감시키고, 췌장 β 세포를 보호하며, 제2형 당뇨병을 예방할 수 있음을 발견했다[Circulation, 2015, 131:1061-1070;J Pharmacol Exp Ther, 2016, 357:487-494.]. 아르글라빈은 카자흐스탄의 식물 쓴쑥(쑥)에서 유래하며, 함량은 약 0.27%로 비교적 낮다[J Nat Prop, 1999, 62: 1068-1071.]. 물에 대한 용해도는 7.9μg/mL에 불과하고, 위액 환경에서의 화학적 안정성이 낮으며, 8시간 내 분해율이 50%에 달하고, 경구 생체이용률이 5%에 불과한데, 이러한 약품성 측면의 단점으로 인해 임상 적용이 제한되고 있다. 따라서 이러한 유형의 화합물의 화학적 안정성, 수용성, 경구 생체이용률 및 자원 가용성의 경제성을 더욱 개선할 필요가 있다.
본 발명의 목적은 구아이안계 세스퀴테르펜 유도체를 제공함으로써, 상기와 같은 화합물의 화학적 안정성, 수용성 및 경구 생체 이용률을 개선하는 데에 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 NLRP3 염증소체 관련 질병의 치료를 위한 약물의 제조에서 상기 화합물의 용도를 제공하는 데에 있다.
일반식 I로 표시되는 구아이안계 세스퀴테르펜 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 있어서,
R1 및 R2가 함께 이중 결합을 형성하거나, R1은 수소 또는 중수소이고, R2는 이며, 여기에서 R3 및 R4는 각각 수소, 알킬 또는 시클로알킬이고, R3, R4 및 N 원자는 3 내지 9원 고리 구조를 형성하고, 고리는 알킬, 에스테르, 아릴, 알킬아릴, 아릴알킬, 아릴알케닐, 아릴알키닐 또는 헤테로시클릴을 포함하는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있다.
R5와 R6은 단일 결합으로 연결되어 시클로프로판을 형성할 수 있으며, R5와 R6이 시클로프로판을 형성하지 않는 경우, R5는 메틸이고, R6은 히드록실, 알콕시, 에스테르 또는 할로겐 등이고, R6이 히드록실, 알콕시, 에스테르 또는 할로겐이 아닌 경우, 인접한 탄소 원자와 각각 이중 결합을 형성할 수 있다.
R7은 수소 또는 히드록실이다.
R8과 R9는 단일 결합으로 연결되어 시클로프로판을 형성할 수 있고, R10은 수소이고, R8과 R9가 시클로프로판을 형성하지 않는 경우, R8은 메틸이고 R9와 R10은 직접 연결되어 시클로프로판을 형성한다.
더욱 바람직하게는, 상기 구아이안계 세스퀴테르펜 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 다음 화합물로부터 선택된다.
바람직하게는, 상기 구아이안계 세스퀴테르펜 유도체의 약학적으로 허용 가능한 염은, 이와 무기산 또는 유기산과 형성하는 약학적으로 허용 가능한 염을 의미하며, 여기에는 염산염, 황산염, 인산염, 말레산염, 푸마르산, 구연산염 등이 포함된다.
더 나아가, 상기 약학적으로 허용 가능한 염은 다음으로부터 선택된다.
본 출원은 상기 구아이안계 세스퀴테르펜 유도체의 제조 방법을 더 개시한다.
본 출원은 유효 성분으로 상기 구아이안계 세스퀴테르펜 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로부터 선택된 하나 이상을 치료 유효량으로 포함하는 약학 조성물을 더 개시한다. 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 보조제 또는 부형제를 더 포함한다.
본 출원은 NLPR3 염증소체 관련 질병 예방 또는 치료용 약물의 제조에서 상기 구아이안계 세스퀴테르펜 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 약학 조성물의 용도를 더 개시한다.
본 출원은 NLPR3 염증소체 관련 질병 예방 또는 치료용 약물 제조에서 기타 약학적으로 허용 가능한 치료제, 특히 기타 NLRP3 염증소체 억제제와 병용되는 상기 구아이안계 세스퀴테르펜 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용도를 더 개시한다.
본 발명은 NLPR3 염증소체 관련 질병의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 치료가 필요한 환자에게 치료 유효량의 본 발명에 따른 구아이안계 세스퀴테르펜 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로부터 선택된 하나 이상, 또는 본 발명에 따른 치료 유효량의 본 발명에 따른 구아이안계 세스퀴테르펜 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로부터 선택된 하나 이상을 유효 성분으로 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
상기 NLPR3 염증소체 관련 질병에는 면역 질환, 자가면역 질환, 악성 종양, 피부 질환, 심혈관 질환, 간 관련 질환, 신장계 관련 질환, 위장관 관련 질환, 중추신경계 질환, 대사 질환, 내분비계 질환, 호흡기 질환, 림프계 질환, 염증, 전염병, 안과 질환, 정신 질환, 통증 등이 포함된다.
구체적으로, (1) Cryopyrin 단백질 관련 주기성 증후군(CAPS): 머클-웰스 증후군(MWS), 가족성 한냉 자가염증 증후군(FCAS) 및 만성 영아 피부 신경관절 증후군(NOMID)); (2) 자가염증 질환: 가족성 지중해열(FMF), TNF 수용체 관련 주기성 증후군(TRAPS), 메발론산 키나아제 결핍증(MKD), 고면역 글로불린 D 및 주기성 발열 증후군(HIDS), 인터루킨 1 수용체(DIRA) 결핍증, Majeed 증후군, 화농성 관절염, 농가진 괴저 및 여드름(PAPA), A20 반수체 부족(HA20), 소아 육아종성 관절염(PGA), PLCG2 관련 항체 결핍 및 면역 조절 장애(PLAID), PLCG2 관련 자발 염증, 항체 결핍 및 면역 조절 장애(APLAID), 철적혈모구 빈혈 수반 B세포 면역 결핍, 주기성 발열 및 발달 지연(SIFD); (3) Sweet's 증후군: 만성 비세균성 골수염(CNO), 만성 재발성 다초점 골수염(CRMO), 윤활막염, 여드름, 농포증, 골증식 및 골염 증후군(SAPHO); (4) 자가면역 질환: 다발성 경화증(MS), 제1형 당뇨병, 건선, 류마티스 관절염, Behcet's 병, Sjogren's 증후군, Schnitzler 증후군; (5) 호흡기 질환: 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 스테로이드 내성 천식, 석면폐증, 규폐증 및 낭포성 섬유증; (6) 중추신경계 질환: 파킨슨병, 알츠하이머병, 운동 신경 질환, Huntington's 병, 뇌말라리아 및 폐렴구균수막염으로 인한 뇌손상; (7) 대사 질환: 제2형 당뇨병, 동맥경화증, 비만, 통풍, 가성통풍; (8) 안과 질환: 안구상피, 연령 관련 황반변성(AMD), 각막감염, 포도막염 및 안구건조증; (9) 신장 관련 질환: 만성 신장질환, 옥살산신증 및 당뇨병성 신장병; (10) 간 관련 질환: 비알코올성 지방간염 및 알코올성 간질환; (11) 피부 관련 염증 반응: 접촉성 알레르기 및 일광화상; (12) 관절 관련 염증 반응: 뼈 관절, 전신성 소아 특발성 관절염, 성인 Still's 병, 재발성 다발연골염; (13) 바이러스성 감염: 뎅기열 바이러스 및 지카 바이러스, 인플루엔자, HIV; (14) 화농성 땀샘염(HS) 및 기타 낭포를 유발하는 피부질환; (15) 암: 폐암, 췌장암, 위암, 골수이형성증후군, 복부 대동맥류 및 백혈병; (16) 다발성 근염, 결장염, 심낭염, 유충 감염, 세균 감염, 상처 유합, 우울증, 중풍, 심근경색, 고혈압, Dressler's 증후군, 허혈 재관류 손상 등 질환이 포함된다.
상기 결장염에는 궤양성 결장염이 포함된다.
상기 NLRP3 염증소체 관련 질병은 급성 통풍성 관절염을 포함한다.
본 출원은 종래 기술에 비해 파르테놀라이드(parthenolide), 데히드로코스투스락톤(dehydrocostuslactone) 등 풍부한 천연성분을 원료로 사용하고, 표적화된 구조 변형을 통해 일반식 I로 표시되는 구아이안계 세스퀴테르펜 유도체를 높은 입체선택성으로 합성하였으며, 수득된 화합물의 시클로프로판 구성은 모두 α 구성이다. 실험 결과에 따르면 NLPR3 염증소체 활성화에 대한 이러한 화합물의 억제 활성이 유지되었으며, 화학적 안정성, 수용성 및 경구 생체이용률이 크게 향상되어, 개발 및 응용 전망이 우수하였다.
도 1은 HEPES 7.4 용액에서 화합물 1 및 화합물 25의 시간 경과에 따른 농도 변화를 도시한 것이다.
도 2는 마우스 혈장 내 화합물 1 및 화합물 25의 시간 경과에 따른 농도 변화를 도시한 것이다.
이하에서는 구체적인 실시예를 참조하여 본 출원을 상세하게 설명한다.
실시예 1: 파르테놀라이드, 데히드로코스투스락톤의 제조
파르테놀라이드의 제조. 델라바이 목련(Magnolia delavayi Franch.) 건조 뿌리 껍질 5kg을 취하여 굵은 분말로 분쇄하고, 10배량의 95% 에탄올로 12시간 동안 침지시키고, 가열 및 환류하여 매회 2시간씩 2회 추출하고, 여과하고 여액을 합쳐 감압 농축하여 건조함으로써 델라바이 목련 조 추출물을 수득하였다. 이어서 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하고, 석유 에테르-에틸 아세테이트 구배로 용출하여, 파르테놀라이드, 코스투놀라이드가 풍부한 분획을 단계적으로 수집하여 합치고 농축하며, 재결정화하여 파르테놀라이드를 수득하였다. 제조 수율은 4.0%이고, 순도는 96.3%였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3):δ 6.31 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 5.62 (d, J = 3.4 Hz, 1H), 5.20 (d, J = 11.8 Hz, 2H), 3.85 (t, J = 8.6 Hz, 1H), 2.78 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 2.45-2.32(m, 2H), 2.22-2.10 (m, 4H), 1.70 (s, 3H), 1.69-1.66 (m, 1H), 1.29 (s, 3H), 1.27 - 1.18 (m, 1H). ESI-MS (m/z): [M+H]- = 249.1 (calcd: 249.1).
데히드로코스투스락톤의 제조. 운목향(Saussurea lappa) 약재 5kg을 취하여 굵은 분말로 분쇄하고, 8배량의 석유 에테르로 12시간 동안 침지시키고, 가열 및 환류하여 매회 2시간씩 2회 추출하고, 여과하고 여액을 합쳐 감압 농축하여 건조함으로써 운목향 조 추출물을 수득하였다. 이어서 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하고, 석유 에테르-에틸 아세테이트 구배로 용출하여, 데히드로코스투스락톤이 풍부한 분획을 단계적으로 수집하여 합치고 농축하며, 재결정화하여 데히드로코스투스락톤을 수득하였다. 제조 수율은 1.0%이고, 순도는 96.8%였다. 1H NMR (500 MHz):δ6.22 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 5.49 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 5.27 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.07 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 4.90 (s, 1H), 4.82 (s, 1H), 3.97-3.94 (m, 1H), 2.95-2.88 (m, 2H), 2.87 (dd, J = 9.3, 3.0 Hz, 1H), 2.24-2.22 (m, 1H), 2.16-2.13 (m, 1H), 1.99-1.96 (m, 2H), 1.88-1.86 (m, 2H), 1.42-1.40 (m, 2H). ESI-MS (m/z): [M+H]+ = 231.1 (calcd: 231.1).
실시예 2: 화합물 1 내지 9의 합성
아르글라빈은 NLPR3 염증소체 활성화에 대해 강한 억제 효과가 있지만, 그 구조의 에폭시 고리는 산성 조건에서 가수분해되어 고리가 열릴 수 있으며, 시험 결과 8시간 이내 분해율이 50%에 도달한 것으로 나타났다. 따라서, 우리는 활성을 유지하면서 화학적 안정성을 향상시키기 위해 아르글라빈 중의 에폭시 고리를 시클로프로판으로 치환하였다.
화합물 1의 합성:
150mL 둥근 바닥 플라스크에 디클로로메탄(50mL), p-톨루엔술폰산(125mg, 0.73mmol), 파르테놀라이드(5g, 20.16mmol)를 차례로 넣고, TLC 검출에서 반응이 완료될 때까지 실온에서 교반하였다. 반응액은 물(10mL×3)과 포화 식염수(10mL×3)로 차례로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압 농축하고, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 중간체 메킬리아 락톤 MCL을 수득하였으며, 수율은 90%였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3):δ 6.21 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 5.51 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 3.81 (t, J = 10.5 Hz, 1H), 2.73 (d, J= 10.5 Hz, 1H), 2.68-2.64 (m, 2H), 2.42-2.37 (m, 1H), 2.26-2.16 (m, 3H), 2.11-2.08 (m, 1H), 1.83-1.75 (m, 2H), 1.69 (s, 3H), 1.31 (s, 3H), 1.27-1.25 (m, 1H). ESI-MS (m/z): [M+Na]+ = 271.1 (calcd: 271.1).
얼음욕 및 질소 보호 조건 하에서 무수 디클로로메탄(67mL)에 에틸렌 글리콜 디메틸 에테르(1.67mL, 21.26mmol)를 넣고, 균일하게 교반한 후 디에틸아연 용액(1M n-헥산 용액) 13.3mL를 천천히 첨가하고, 디요오도메탄(2.67mL, 3.11mmol)을 천천히 적가하고 10분 동안 교반하여 시클로프로판화 시약을 제조하였다. 다른 둥근 바닥 플라스크를 취하여, 메킬리아 락톤 MCL(300mg, 1.21mmol), 무수 디클로로메탄(5mL)을 넣고, 교반하여 용해시킨 후 질소로 보호하고 얼음욕에 넣었다. 상기 시클로프로판화 시약을 기질 용액에 적가하고 적가 완료 후 1시간 동안 반응을 계속한 후 실온으로 옮겨 밤새 반응시켰다. 반응액은 포화 염화암모늄으로 담금질하고, 여과 후 물(10mL×3)과 포화 식염수(10mL×3)로 차례로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압 농축하고, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 화합물 1을 수득하였으며, 수율은 75%였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3):δ 6.14 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 5.45 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 3.82 (t, J = 10.5 Hz, 1H), 2.52-2.48 (m, 1H), 2.26-2.21 (m, 1H), 2.09-1.99 (m, 2H), 1.93-1.89 (m, 1H), 1.88-1.86 (m, 1H, H5), 1.85-1.83 (m, 1H), 1.55 (s, 3H), 1.52-1.44 (m, 2H), 1.26-1.14 (m, 2H), 1.11 (s, 3H), 0.81 (d, J = 4.0 Hz, 1H, H16a), 0.54 (d, J = 4.0 Hz, 1H, H16b). ROESY 스펙트럼은 H5와 H16a에 신호 상관관계가 있음을 나타냈으며, 시클로프로판이 α 구성임을 확인하였다. ESI-MS (m/z): [M+Na]+ = 285.2 (calcd: 285.2).
화합물 2의 제조:
둥근 바닥 플라스크에 화합물 1(200mg, 0.81mmol) 및 무수 피리딘(10mL)을 순차적으로로 넣고, 질소 보호 하에서 얼음욕으로 용해시키며, 옥시염화인(1242mg, 8.10mmol)을 적가하고, 적가 완료 후 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응용액을 얼음물에 붓고 에틸 아세테이트(10mL×3)로 추출하며, 유기층에 포화 황산구리 용액(10mL×6), 물(10mL×3), 포화 식염수(10mL×3)을 순차적으로 사용하여 세척하였으며, 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압 농축하고, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리하여, 화합물 2를 수득하였으며, 수율은 65%였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3):δ 6.14 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 5.59-5.57 (m,1H), 5.44 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 3.90 (t, J = 10.5 Hz, 1H), 2.74-2.71 (m, 1H), 2.51-2.46 (m, 1H), 2.32-2.28 (m, 2H), 2.04-2.00 (m, 1H), 1.97 (s, 3H), 1.81-1.77 (m, 1H, H5), 1.54-1.46 (m, 1H), 1.18-1.14 (m, 1H), 1.13 (s, 3H), 0.61 (d, J = 4.0 Hz, 1H, H16a), 0.50 (d, J = 4.0 Hz, 1H, H16b). ROESY 스펙트럼은 H5와 H16a에 신호 상관관계가 있음을 나타냈으며, 시클로프로판이 α 구성임을 확인하였다. ESI-MS (m/z): [M+Na]+ = 267.1 (calcd: 267.2).
화합물 3의 제조:
둥근 바닥 플라스크에 m-클로로퍼옥시벤조산(267.5mg, 1.55mmol)과 무수 디클로로메탄(20mL)을 차례로 넣고, 화합물 2(248mg, 1.00mmol)의 디클로로메탄 용액(5mL)을 천천히 첨가한 후 밤새 교반하였다. 포화 티오황산나트륨 용액을 담금질한 후, 포화 중탄산나트륨(10mL×3), 물(10mL×3), 포화 식염수(10mL×3)로 순차적으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시킨 후 감압 농축하였으며, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 화합물 3-1을 수득하였고, 수율은 83%였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3):δ 6.18 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 5.48 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 3.79 (t, J = 10.5 Hz, 1H, H6), 2.53-2.48 (m, 1H), 2.28-2.24 (m, 1H, H3), 2.16-2.10 (m, 2H), 2.04-2.01 (m, 1H, H5), 1.73 (s, 3H), 1.56-1.45 (m, 3H), 1.12-1.09 (m, 1H), 1.08 (s, 3H), 0.57 (d, J = 4.0 Hz, 1H, H16a), 0.49 (d, J = 4.0 Hz, 1H, H16b). ROESY 스펙트럼은 H5와 H16a, H3과 H6에 신호 상관관계가 있는 것으로 나타나, 시클로프로판은 α 구성, 프로필렌옥시드는 α 구성으로 확인하였다. ESI-MS (m/z): [M+Na]+ = 283.1 (calcd: 283.1).
둥근 바닥 플라스크에 중간체 3-1(260mg, 1.00mmol), 메탄올(10mL), p-톨루엔술폰산(172mg, 1.00mmol)을 차례로 넣고 밤새 교반하였다. 반응액을 농축시킨 후, 에틸 아세테이트(10mL×3)로 추출하며, 유기층에 포화 중탄산나트륨(10mL×3), 물(10mL×3), 포화 식염수(10mL×3)을 순차적으로 사용하여 세척하였으며, 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압 농축하고, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리하여, 화합물 3을 수득하였으며, 수율은 85%였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3):δ 6.15 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 5.44 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 4.25 (t, J = 10.5 Hz, 1H, H6), 3.64-3.62 (m, 1H, H3), 3.41 (s, 3H, H17), 2.55-2.48 (m, 1H, H7), 2.41 (s, 1H), 2.22-2.18 (m, 1H), 2.08 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 2.06-2.01 (m, 1H), 1.98-1.94 (m, 1H), 1.80-1.75 (m, 1H, H5), 1.61-1.55 (m, 1H), 1.49 (s, 3H), 1.47-1.42 (m, 1H), 1.10 (s, 3H), 0.57 (d, J = 4.0 Hz, 1H, H16a), 0.49 (d, J = 4.0 Hz, 1H, H16b). ROESY는 H3과 H6, H5와 H16a, H7과 H17이 신호 상관관계가 있음을 보여주며 시클로프로판은 α 구성, 3-OH와 4-OMe는 α 구성으로 확인하였다. ESI-MS (m/z): [M+Na]+ = 315.1 (calcd: 315.1).
화합물 4의 제조:
둥근 바닥 플라스크에 테트라히드로푸란(5mL)과 물(1mL)을 넣고 p-톨루엔술폰산(272mg, 1.00mmol), 중간체 3-1(260mg, 1.00mmol)을 넣어 밤새 교반하였다. 반응액을 농축시킨 후, 에틸 아세테이트(10mL×3)로 추출하며, 유기층에 포화 중탄산나트륨(10mL×3), 물(10mL×3), 포화 식염수(10mL×3)을 순차적으로 사용하여 세척하였으며, 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압 농축하고, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리하여, 화합물 4를 수득하였으며, 수율은 47%였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3):δ6.16 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 5.46 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 4.33 (t, J = 10.5 Hz, 1H, H6), 4.12-4.09 (m, 1H, H3), 2.54-2.47 (m, 1H, H6), 2.24-2.19 (m, 1H), 2.10-2.02 (m, 4H), 2.00 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 1.87-1.83 (m, 1H, H5), 1.61-1.54 (m, 2H), 1.51 (s, 3H), 1.12 (s, 3H), 0.80 (d, J = 4.0 Hz, 1H, H16a), 0.50 (d, J = 4.0 Hz, 1H, H16b). ROESY는 H3과 H6, H6와 H14, H5과 H16a에 신호 상관관계가 있음을 보여주며 시클로프로판은 α 구성, 3-OH와 4-OH는 α 구성으로 확인하였다. ESI-MS (m/z): [M+Na]+ =301.2 (calcd: 301.2).
화합물 5의 제조:
둥근 바닥 플라스크에 화합물 1(124mg, 0.50mmol)과 디클로로메탄(5mL)을 첨가하고, 질소 보호 하에 -78℃에서 교반하여 용해시키며, DAST 시약(161mg, 1.00mmol)을 천천히 적가하고, 적가 완료 후 10 내지 15분 동안 계속 교반하였다. 반응액은 물을 첨가하여 담금질하고, 디클로로메탄으로 희석한 후 물(10mL×3)과 포화 식염수(10mL×3)로 차례로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압 농축하고, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 화합물 5를 수득하였으며, 수율은 55%였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3):δ 6.14 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 5.43 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 4.11 (t, J = 10.5 Hz, 1H), 2.45-2.40 (m, 1H), 2.35-2.31 (m, 1H), 2.23-2.17 (m, 1H), 2.09-2.03 (m, 2H), 2.02-1.97 (m, 1H), 1.85-1.74 (m, 1H, H5), 1.65 (d, J = 21.5 Hz, 3H), 1.54-1.46 (m, 1H), 1.24-1.20 (m, 1H), 1.17 (s, 3H), 1.15-1.12 (m, 1H), 0.80 (d, J = 4.0 Hz, 1H, H16a), 0.50 (d, J = 4.0 Hz, 1H, H16b).19F NMR(470MHz, CDCl3): δ -148.17. ROESY 스펙트럼은 H5와 H16a에 신호 상관관계가 있는 것으로 나타났으며, 시클로프로판이 α 구성임을 확인하였다. ESI-MS (m/z): [M+Na]+ = 287.2 (calcd: 287.2).
화합물 6의 제조:
둥근 바닥 플라스크에 Burgess 시약(282mg, 1.10mmol)과 무수 테트라히드로푸란(10mL)을 넣고 질소로 보호한 후 얼음욕에 넣었다. 화합물 1(262mg, 1.00mmol)을 첨가하고, 20분 동안 교반한 후, 실온으로 옮기고, 3시간 동안 계속 교반하였다. 반응액은 농축시키고, 에틸 아세테이트(10mL×3)로 추출하고, 유기층은 물(10mL×3)과 포화 식염수(10mL×3)로 차례로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압 농축하고, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 화합물 6을 수득하였으며, 수율은 75%였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3):δ 6.14 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 5.60-5.58 (m, 1H), 5.44 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 3.90 (t, J = 10.0 Hz, 1H), 2.75-2.71 (m, 1H), 2.52-2.46 (m, 1H), 2.32-2.29 (m, 2H), 2.05-2.00 (m, 1H), 1.98 (s, 3H), 1.81-1.77 (m, 1H), 1.55-1.47 (m, 1H) 1.18-1.14 (m, 1H), 1.13 (s, 3H), 0.63 (d, J = 5.0 Hz, 1H) , 0.51 (d, J = 5.0 Hz, 1H). ESI-MS (m/z): [M+Na]+ = 267.3 (calcd: 267.3).
화합물 7의 제조:
둥근 바닥 플라스크에 화합물 1(262mg, 1.00mmol)을 넣고 질소로 보호한 후 3mL의 무수 디클로로메탄과 트리에틸아민(2.7g, 27.0mmol)을 차례로 첨가하고 얼음욕에 넣은 후, 프로피오닐 클로라이드를 적가하고, 실온으로 승온시켜 밤새 반응시켰다. 반응액을 얼음물에 붓고, 에틸 아세테이트(10mL×3)로 추출하고, 유기층은 물(10mL×3)과 포화 식염수(10mL×3)로 차례로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압 농축하고, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 화합물 7을 수득하였으며, 수율은 51%였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3):δ 6.16 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 5.47 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 3.82 (t, J = 10.5 Hz, 1H), 2.52-2.48 (m, 1H), 2.27-2.23 (m, 2H), 2.21-2.02 (m, 2H), 1.95-1.92 (m, 1H), 1.90-1.88 (m, 1H), 1.87-1.85 (m, 1H, H5), 1.57 (s, 3H), 1.53-1.49 (m, 2H), 1.24 (t, J = 10.0 Hz, 3H), 1.23-1.14 (m, 2H), 1.11 (s, 3H), 0.59 (d, J = 4.0 Hz, 1H, H16a), 0.38 (d, J = 4.0 Hz, 1H, H16b). ROESY 스펙트럼은 H5와 H16a에 신호 상관관계가 있음을 나타냈으며, 시클로프로판이 α 구성임을 확인하였다. ESI-MS (m/z): [M+Na]+ = 341.2 (calcd: 341.2).
화합물 8의 제조:
얼음욕 및 질소 보호 조건 하에서 무수 디클로로메탄(67mL)에 에틸렌 글리콜 디메틸 에테르(1.67mL, 21.26mmol)를 넣고, 균일하게 교반한 후 디에틸아연 용액(1M n-헥산 용액) 13.3mL를 천천히 첨가하고, 디요오도메탄(2.67mL, 3.11mmol)을 천천히 적가하고 10분 동안 교반하여 시클로프로판화 시약을 제조하였다. 또 다른 둥근 바닥 플라스크에 데히드로코스투스락톤(dehydrocostus lactone, 300mg, 1.21mmol)과 무수 디클로로메탄(5mL)을 넣고, 교반하여 용해한 후 질소로 보호하고 얼음욕에 넣었다. 상기 시클로프로판화 시약을 기질 용액에 적가하고 적가 완료 후 1시간 동안 반응을 계속한 후 실온으로 옮겨 밤새 반응시켰다. 반응액은 포화 염화암모늄으로 담금질하고, 여과 후 물(10mL×3)과 포화 식염수(10mL×3)로 차례로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압 농축하고, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 화합물 8을 수득하였으며, 수율은 65%였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3):δ 6.24 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 5.45 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 4.24 (dd, J = 10.8, 8,8 Hz, 1H), 2.79-2.74 (m, 1H), 2.22-2.20 (m, 1H), 2.10-2.06 (m, 1H), 1.95 (dd, J= 10.4, 8,8 Hz, 1H), 1.73-1.67 (m, 2H), 1.63-1.57 (m, 2H), 1.50-1.45 (m, 1H), 1.38-1.35 (m, 2H), 0.98 (s, 1H), 0.64 (s, 1H), 0.50-0.48 (m, 1H), 0.42-0.40 (m, 1H), 0.37-0.27 (m, 4H). ESI-MS (m/z): [M+Na]+ = 259.4 (calcd: 259.4).
화합물 9의 제조:
얼음욕 및 질소 보호 조건 하에서 디클로로메탄 2.5mL에 디에틸아연 용액(1M n-헥산 용액) 5mL를 넣고, 트리플루오로아세트산(570mg, 5.00mmol)을 디클로로메탄 0.8mL에 용해시켜 상기 용액에 적가하고, 20분간 교반하였으며, 디요오도메탄(1.34g, 5.00mmol)을 디클로로메탄 0.8mL에 용해시켜 상기 용액에 적가하고 20분간 교반하였으며, MCL(248mg, 1.00mmol)을 디클로로메탄 0.8mL에 용해시키고 상기 용액에 첨가하여, 교반하여 5시간 동안 반응시켰다. 반응액에 포화 염화암모늄을 첨가하여 담금질하고, 에틸 아세테이트(10mL×3)로 추출하고, 유기층은 물(10mL×3)과 포화 식염수(10mL×3)로 차례로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압 농축하고, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 화합물 9를 수득하였으며, 수율은 12%였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3):δ 6.14 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 5.44 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 3.83 (t, J = 10.5 Hz, 1H), 3.23 (s, 3H), 2.50-2.46 (m, 1H), 2.28-2.23 (m, 1H), 2.02-1.97 (m, 4H), 1.78-1.71 (m, 1H, H5), 1.53 (s, 3H), 1.51-1.39 (m, 2H), 1.13-1.07 (m, 1H), 1.09 (s, 3H), 0.70 (d, J = 4.0 Hz, 1H, H16a), 0.46 (d, J = 4.0 Hz, 1H, H16b). ROESY 스펙트럼은 H5와 H16a에 신호 상관관계가 있음을 나타냈으며, 시클로프로판이 α 구성임을 확인하였다. ESI-MS (m/z): [M+Na]+ = 299.2 (calcd: 299.2).
실시예 3: 화합물 1 내지 9의 안정성 시험
2.00mg의 화합물 1 내지 9를 정밀하게 칭량하고, 샘플을 500μL의 크로마토그래피 메탄올에 용해시키고, 1500μL의 인공 위액을 첨가하여, 균일하게 혼합한 후 초음파 처리하여 완전히 용해시켰다. 50μL의 상기 용액을 정밀하게 취하고, 200μL의 크로마토그래피 메탄올을 첨가하여 희석시키고 여과하여, HPLC로 분석하였다. HPLC 분석 조건은 이동상: 65% 메탄올-35% 물, 유속: 0.8mL/min, 컬럼 온도: 25℃이며, 초기 피크 면적을 기록하였다. 상기 용액을 37℃의 항온 수조에 넣고 각각 8시간, 16시간, 24시간에 샘플을 취하여 HPLC로 분석하였다. 각각의 피크 면적을 계산함으로써 인공 위액 환경에서 8시간, 16시간, 24시간일 때 샘플의 안정성 데이터를 획득할 수 있다.
표 1에 나타난 바와 같이, 화합물 1 내지 9의 안정성은 아르글라빈 및 데히드로코스투스락톤에 비해 현저히 향상되었다.
표 1. 인공 위장액 환경에서 화합물의 안정성
실시예 4: 전구약물의 제조(전구약물에는 염이 포함됨)
화합물 10의 제조:
둥근 바닥 플라스크에 화합물 1(262mg, 1.00mmol), 디클로로메탄(30mL), 디메틸아민 염산염(815mg, 10.00mmol) 및 탄산칼륨(2764mg, 20mmol)을 넣고 4시간 동안 교반하였다. 반응액을 여과하고, 물(10mL×3)과 포화 식염수(10mL×3)로 차례로 세척한 후, 무수 황산나트륨으로 건조하여 감압 농축하였으며, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(석유 에테르:에틸 아세테이트:트리에틸아민=1:1:0.02)로 분리하여 화합물 10을 수득하였고, 수율은 85%였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3):δ3.92 (t, J = 10.5 Hz, 1H), 3.55-3.47 (m, 1H), 3.33-3.29 (m, 1H), 2.38-2.34 (m, 1H), 2.28 (s, 6H), 2.21-2.16 (m, 2H), 1.98 (d, J = 15.0 Hz, 2H), 1.88 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 1.72 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 1.60-1.52 (m, 2H), 1.50 (s, 3H), 1.20 (t, J = 5.0 Hz, 1H), 1.12 (s, 3H), 1.08-1.04 (m, 1H), 0.76 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 0.53 (d, J = 5.0 Hz, 1H). ESI-MS (m/z): [M+Na]+ = 330.2 (calcd: 330.2).
화합물 11의 제조:
출발 물질로는 화합물 2와 디메틸아민 염산염을 사용하였으며, 제조 방법은 화합물 10과 동일하고, 화합물 11의 수율은 80%였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3):δ5.52-5.46 (m, 1H), 3.98 (t, J = 10.0 Hz, 1H),3.41-3.32 (m, 1H), 3.20-3.16 (m, 1H), 2.98-2.92 (m, 1H),2.28 (s, 6H), 2.22-2.19 (m, 1H), 2.10 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 2.06-2.02 (m, 1H), 1.98-1.94 (m, 1H), 1.91 (s, 3H), 1.84-1.80 (m, 2H), 1.62-1.56 (m, 1H), 1.19 (s, 3H), 1.14-1.08 (m, 1H), 0.69 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 0.51 (d, J = 5.0 Hz, 1H). ESI-MS (m/z): [M+Na]+ = 312.2 (calcd: 312.2).
화합물 12의 제조:
출발 물질로는 화합물 3과 디메틸아민 염산염을 사용하였으며, 제조 방법은 화합물 10과 동일하고, 화합물 12의 수율은 95%였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3):δ 3.96 (t, J= 10.0 Hz, 1H), 3.28-3.23 (m, 1H), 3.15-3.10 (m, 1H), 2.94 (s, 3H), 2.70-2.65 (m, 1H), 2.28 (s, 6H), 2.03-1.99 (m, 1H), 1.91-1.88 (m, 1H), 1.86-1.76 (m, 4H), 1.62-1.56 (m, 1H), 1.48 (s, 3H), 1.28-1.24 (m, 1H), 1.12 (s, 3H), 1.09-1.05 (m, 1H), 0.70 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 0.54 (d, J = 5.0 Hz, 1H). ESI-MS (m/z): [M+Na]+ = 360.4 (calcd: 360.5).
화합물 13의 제조:
출발 물질로는 화합물 4와 디메틸아민 염산염을 사용하였으며, 제조 방법은 화합물 10과 동일하고, 화합물 13의 수율은 90%였다. 1H NMR (500 MHz,CDCl3):δ3.94 (t, J= 10.0 Hz, 1H), 3.38-3.36 (m, 1H), 3.23-3.18 (m, 1H), 3.19-3.15 (m, 2H), 2.78-2.70 (m, 1H), 2.28 (s, 6H), 2.13-2.09 (m, 1H), 1.97-1.92 (m, 1H), 1.90-1.86 (m, 1H), 1.82-1.79 (m, 1H), 1.77-1.75 (m, 1H), 1.62-1.59 (m, 1H), 1.51 (s, 3H), 1.18 (s, 3H), 1.11-1.07 (m, 1H), 0.70 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 0.48 (d, J = 5.0 Hz, 1H). ESI-MS (m/z): [M+Na]+ = 368.4 (calcd: 368.4).
화합물 14의 제조:
출발 물질로는 화합물 5와 디메틸아민 염산염을 사용하였으며, 제조 방법은 화합물 10과 동일하고, 화합물 14의 수율은 83%였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3):δ3.96 (t, J = 10.0 Hz, 1H), 3.35-3.30 (m, 2H), 2.80-2.76 (m, 1H), 2.30 (s, 6H), 2.29-2.19 (m, 2H), 2.08 (t, J = 10.0 Hz, 1H), 1.96-1.90 (m, 1H), 1.84-1.82 (m, 2H), 1.81-1.77 (m, 2H), 1.58 (d,J = 21.5 Hz, 3H) 1.46-1.39 (m, 1H), 1.18 (s, 3H), 1.16-1.12 (m, 1H), 0.62 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 0.58 (d, J = 5.0 Hz, 1H). ESI-MS (m/z): [M+Na]+ = 332.4 (calcd: 332.4).
화합물 15의 제조:
출발 물질로는 화합물 6과 디메틸아민 염산염을 사용하였으며, 제조 방법은 화합물 10과 동일하고, 화합물 15의 수율은 91%였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3):δ 3.99 (t, J= 10.0 Hz, 1H),3.41-3.36 (m, 1H), 3.20-3.18 (m, 1H), 2.82-2.77 (m, 1H), 2.28 (s, 6H), 2.22-2.19 (m, 1H), 2.16-2.10 (m, 2H), 1.98-1.94 (m, 1H), 1.91 (s, 3H), 1.84-1.80 (m, 1H), 1.78-1.75 (m, 1H), 1.62-1.56 (m, 2H), 1.15 (s, 3H), 1.11-1.07 (m, 1H), 0.64 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 0.50 (d, J = 5.0 Hz, 1H). ESI-MS (m/z): [M+Na]+ = 312.4 (calcd: 312.4).
화합물 16의 제조:
출발 물질로는 화합물 7과 디메틸아민 염산염을 사용하였으며, 제조 방법은 화합물 10과 동일하고, 화합물 16의 수율은 80%였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3):δ3.92 (t, J= 10.0 Hz, 1H), 3.40-3.30 (m, 2H), 2.83-2.79 (m, 1H), 2.30 (s, 6H),2.19-2.13 (m, 2H), 2.04-1.97 (m, 2H), 1.95-1.90 (m, 2H), 1.86-1.82 (m, 1H), 1.76-1.73 (m, 1H), 1.60 (s, 3H), 1.56-1.52 (m, 1H), 1.33-1.25 (m, 1H), 1.14 (s, 3H), 1.02 (t, J = 10.0 Hz, 3H), 1.00-0.95 (m, 1H), 0.88-0.82 (m, 1H), 0.48 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 0.40 (d, J = 5.0 Hz, 1H). ESI-MS (m/z): [M+Na]+ = 386.5 (calcd: 386.5).
화합물 17의 제조:
출발 물질로는 화합물 8과 디메틸아민 염산염을 사용하였으며, 제조 방법은 화합물 10과 동일하고, 화합물 17의 수율은 78%였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3):δ 4.15 (dd, J = 9.6, 10.0 Hz, 1H), 2.70 (dd, J = 12.8, 4.8 Hz, 1H), 2.48 (dd, J = 12.8, 4.8 Hz, 1H), 2.36 -2.28 (m, 2H), 2.22 (s, 6H), 2.02-1.98 (m, 2H), 1.84-1.80 (m, 1H), 1.70-1.67 (m, 1H), 1.45-1.30 (m, 5H), 1.11-1.06 (m, 1H), 1.01-0.98 (m, 1H), 0.70-0.68 (m, 1H), 0.46-0.42 (m, 1H), 0.37-0.28 (m, 4H), 0.15-0.11 (m, 2H). ESI-MS (m/z): [M+Na] = 327.3 (calcd: 327.3).
화합물 18의 제조:
출발 물질로는 화합물 1과 피페리딘을 사용하였으며, 제조 방법은 화합물 10과 동일하고, 화합물 18의 수율은 89%였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3):δ 3.79 (t, J = 10.5 Hz, 1H), 2.79-2.75 (m, 1H), 2.56-2.53 (m, 1H), 2.46-2.40 (m, 3H), 2.39-2.32 (m, 3H), 2.19-2.08 (m, 4H), 1.94-1.85 (m, 3H), 1.77 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 1.54 (s, 6H), 1.45-1.39 (m, 4H), 1.12 (s, 3H), 1.09-1.04 (m, 1H), 0.79 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 0.52 (d, J = 4.0 Hz, 1H). ESI-MS (m/z): [M+Na]+ = 326.3 (calcd: 326.3).
화합물 19의 제조:
출발 물질로는 화합물 1과 테트라히드로피롤을 사용하였으며, 제조 방법은 화합물 10과 동일하고, 화합물 19의 수율은 87%였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3):δ 3.79 (t, J = 10.5 Hz, 1H), 2.89-2.80 (m, 2H), 2.57-2.51 (m, 4H), 2.37-2.32 (m, 1H), 2.15-2.06 (m, 3H), 1.94-1.87 (m, 3H), 1.78-1.76 (m, 5H), 1.55 (s, 3H), 1.51-1.39 (m, 3H), 1.11 (s, 3H), 1.09-1.03 (m, 1H), 0.77 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 0.51 (d, J = 4.0 Hz, 1H). ESI-MS (m/z): [M+Na]+ =356.3 (calcd: 356.2).
화합물 20의 제조:
출발 물질로는 화합물 1과 테트라히드로피롤을 사용하였으며, 제조 방법은 화합물 10과 동일하고, 화합물 20의 수율은 76%였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3):δ 3.81 (t, J = 10.5 Hz, 1H), 3.74-3.67 (m, 3H), 2.82-2.79 (m, 1H), 2.65-2.61 (m, 1H), 2.53-2.44 (m, 5H), 2.40-2.35 (m, 1H), 2.21-2.17 (m, 1H), 2.13-2.07 (m, 2H), 1.95-1.86 (m, 3H), 1.78 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 1.55 (s, 3H), 1.52-1.39 (m, 2H), 1.31-1.27 (m, 1H), 1.12 (s, 3H), 1.09-1.04 (m, 1H), 0.80 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 0.54 (d, J = 4.0 Hz, 1H). ESI-MS (m/z): [M+Na]+ = 372.2 (calcd: 372.2).
화합물 21의 제조:
출발 물질로는 화합물 1과 피페라진을 사용하였으며, 제조 방법은 화합물 10과 동일하고, 화합물 21의 수율은 74%였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3):δ 3.79 (t, J = 10.5 Hz, 1H), 2.82-2.79 (m, 1H), 2.64-2.60 (m, 1H), 2.55-2.42 (m, 5H), 2.38-2.34 (m, 2H), 2.29 (s, 3H), 2.20-2.16 (m, 1H), 2.15-2.05 (m, 2H), 1.93-1.83 (m, 3H), 1.76 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 1.54 (s, 3H), 1.49-1.38 (m, 2H), 1.29-1.25 (m, 1H), 1.12 (s, 3H), 1.09-1.03 (m, 1H), 0.78 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 0.52 (d, J = 4.0 Hz, 1H). ESI-MS (m/z): [M+Na]- = 371.2 (calcd: 371.2).
화합물 22의 제조:
출발 물질로는 화합물 1과 피페라진을 사용하였으며, 제조 방법은 화합물 10과 동일하고, 화합물 22의 수율은 74%였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3):δ 3.79 (t, J = 10.5 Hz, 1H), 2.83-2.74 (m, 3H), 2.59-2.55 (m, 1H), 2.39-2.35 (m, 2H), 2.20-2.07 (m, 4H), 1.96-1.83 (m, 4H), 1.78 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 1.55 (s, 3H), 1.51-1.23 (m, 5H), 1.21-1.15 (m, 2H), 1.13 (s, 3H), 1.10-1.05 (m, 1H), 0.93 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.79 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 0.52 (d, J = 4.0 Hz, 1H). ESI-MS (m/z): [M+Na]+ = 384.3 (calcd: 384.3).
화합물 23의 제조:
출발 물질로는 화합물 1과 N-Boc-피페라진을 사용하였으며, 제조 방법은 화합물 10과 동일하고, 화합물 23의 수율은 65%였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3):δ 3.81 (t, J = 10.5 Hz, 1H), 2.83-2.79 (m, 1H), 2.66-2.62 (m, 2H), 2.42-2.35 (m, 4H), 2.21-2.16 (m, 1H), 2.13-2.07 (m, 2H), 1.94-1.84 (m, 3H), 1.78 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 1.55 (s, 3H), 1.48 (s, 9H), 1.46-1.44 (m, 1H), 1.40-1.39 (m, 1H), 1.32-1.25 (m, 3H), 1.13 (s, 3H), 1.10-1.04 (m, 2H), 0.92-0.85 (m, 1H), 0.80 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 0.54 (d, J = 4.0 Hz, 1H). ESI-MS (m/z): [M+Na]+ = 471.3 (calcd: 471.3).
화합물 10의 염산염 24의 제조
화합물 10(307mg, 1mmol)을 디클로로메탄(2mL)에 용해시키고, 실온에서 2시간 동안 교반한 후, pH가 4 내지 5가 될 때까지 염산 용액을 적가하였으며, 여과하고, 수득된 고체는 디클로로메탄으로 세척하였다. 수득된 흰색 고체가 화합물 10의 염산염(화합물 24)이며, 수율은 90%였다. 1H NMR (500 MHz, CD3OD):δ4.15-4.10 (m, 1H, H6), 3.42-3.37 (m, 1H),3.31-3.26 (m, 1H), 3.04-2.98 (m, 1H, H11),2.91 (s, 6H), 2.21-2.12 (m, 2H), 2.02 (d, J = 15.0 Hz, 2H), 1.88 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 1.78 (d, J = 10.0 Hz, 1H, H5), 1.64-1.54 (m, 2H), 1.52 (s, 3H), 1.26 (t, J = 5.0 Hz, 1H), 1.14 (s, 3H), 1.10-1.05 (m, 1H), 0.76 (d, J = 5.0 Hz, 1H, H16a), 0.53 (d, J = 5.0 Hz, 1H, H16b). ROESY 스펙트럼은 H5와 H16a의 수소, 및 H6과 H11의 수소가 신호 상관관계가 있음을 보여 주었으며, 시클로프로판이 α 구성이고, 11-H가 β 구성임을 확인하였다. ESI-MS (m/z): [M+H]+ = 344.9(calcd: 344.9).
화합물 10의 푸마르산염 25의 제조
염산 대신 푸마르산을 사용하였고, 화합물 10 염산염의 제조 방법을 참조하여 푸마르산염 화합물 25를 제조하였다. 수율은 80%였다. 1H NMR (500 MHz, CD3OD):δ6.72 (s, 2H), 4.13 (t, J = 10.0 Hz, 1H, H6), 3.41-3.39 (m, 1H), 3.30-3.27 (m, 1H), 3.03-2.98 (m, 1H, H11), 2.91 (s, 6H), 2.21-2.12 (m, 2H), 1.94-1.91 (m, 1H), 1.88 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 1.84-1.80 (m, 1H), 1.78 (d, J = 15.0 Hz, 1H, H5), 1.64-1.54 (m, 2H), 1.52 (s, 3H), 1.14 (s, 3H), 1.10-1.04 (m, 1H), 0.75 (d, J = 5.0 Hz, 1H, H16a), 0.52 (d, J = 5.0 Hz, 1H, H16b). ROESY 스펙트럼은 H5와 H16a, 및 H6과 H11이 신호 상관관계가 있음을 보여 주었으며, 시클로프로판이 α 구성이고, 11-H가 β 구성임을 확인하였다. ESI-MS (m/z): [M+H]+ = 424.5 (calcd: 424.5).
화합물 11의 염산염 26의 제조
화합물 11을 출발 물질로 사용하여, 화합물 10 염산염의 제조 방법을 참조하여 화합물 26을 제조할 수 있으며 수율은 95%였다. 1H NMR (500 MHz, CD3OD):δ5.62-5.58 (m, 1H), 4.19 (t, J = 10.0 Hz, 1H, H6), 3.51-3.46 (m, 1H), 3.40-3.36 (m, 1H), 3.12-3.07 (m, 1H, H11), 2.98 (s, 6H), 2.82-2.79 (m, 1H), 2.30 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 2.26-2.12 (m, 1H), 1.98-1.94 (m, 1H), 1.91 (s, 3H), 1.84-1.82 (m, 2H), 1.80-1.78 (m, 1H, H5), 1.66-1.59 (m, 1H), 1.17 (s, 3H), 1.16-1.10 (m, 1H), 0.61 (d, J = 5.0 Hz, 1H, H16a), 0.48 (d, J = 5.0 Hz, 1H, H16b). ROESY 스펙트럼은 H5와 H16a, 및 H6과 H11이 신호 상관관계가 있음을 보여 주었으며, 시클로프로판이 α 구성이고, 11-H가 β 구성임을 확인하였다. ESI-MS (m/z): [M+H]+ = 326.9 (calcd: 326.9).
화합물 12의 염산염 27의 제조
화합물 12를 출발 물질로 사용하여, 화합물 10 염산염의 제조 방법을 참조하여 화합물 27을 제조할 수 있으며 수율은 95%였다. 1H NMR (500 MHz, CD3OD):δ4.39 (t, J= 10.0 Hz, 1H, H6), 3.48-3.43 (m, 1H, H7), 3.40-3.36 (m, 1H), 3.34 (s, 3H, H17), 3.10-3.05 (m, 1H, H11), 2.98 (s, 6H), 2.23-2.19 (m, 1H, H3), 2.11-2.08 (m, 1H), 1.87-1.80 (m, 3H), 1.79-1.77 (m, 1H, H5),1.65-1.56 (m, 1H), 1.51 (s, 3H), 1.27-1.25 (m, 1H), 1.15 (s, 3H), 1.13-1.08 (m, 1H), 0.74 (d, J = 5.0 Hz, 1H, H16a), 0.51 (d, J= 5.0 Hz, 1H, H16b). ESI-MS (m/z): [M+H]+ = 374.9 (calcd: 374.9).
화합물 13의 염산염 28의 제조
화합물 13을 출발 물질로 사용하여, 화합물 10 염산염의 제조 방법을 참조하여 화합물 28을 제조할 수 있으며 수율은 85%였다. 1H NMR (500 MHz, CD3OD):δ4.47 (t, J = 10.0 Hz, 1H, H6), 3.88-3.86 (m, 1H), 3.63-3.58 (m, 1H), 3.49-3.45 (m, 2H), 3.10-3.06 (m, 1H, H11), 3.00 (s, 6H), 2.23-2.19 (m, 1H), 1.97-1.92 (m, 1H), 1.90-1.81 (m, 3H), 1.66-1.59 (m, 1H, H5), 1.52 (s, 3H), 1.14 (s, 3H), 1.12-1.10 (m, 1H), 0.73 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 0.50 (d, J = 5.0 Hz, 1H). ESI-MS (m/z): [M+H]+ = 360.9 (calcd: 360.9).
화합물 14의 염산염 29의 제조
화합물 14를 출발 물질로 사용하여, 화합물 10 염산염의 제조 방법을 참조하여 화합물 29를 제조할 수 있으며 수율은 83%였다. 1H NMR (500 MHz, CD3OD):δ4.36 (t, J = 10.0 Hz, 1H, H6), 3.50-3.40 (m, 2H), 3.15-3.11 (m, 1H, H11), 3.00 (s, 6H), 2.29-2.19 (m, 2H), 2.11 (t, J = 10.0 Hz, 1H), 2.06-2.00 (m, 1H), 1.94-1.87 (m, 2H), 1.84-1.82 (m, 1H), 1.81-1.78(m,1H, H5) 1.60 (d,J = 21.5 Hz, 3H) 1.60-1.51 (m, 1H), 1.20 (s, 3H), 1.18-1.15 (m, 1H), 0.54 (d, J = 5.0 Hz, 1H, H16a), 0.50 (d, J = 5.0 Hz, 1H, H16b). ESI-MS (m/z): [M+H]+ = 346.9(calcd: 346.9).
화합물 15의 염산염 30의 제조
화합물 15를 출발 물질로 사용하여, 화합물 10 염산염의 제조 방법을 참조하여 화합물 30을 제조할 수 있으며 수율은 80%였다. 1H NMR (500 MHz, CD3OD):δ4.19 (t, J = 10.0 Hz, 1H, H6), 3.51-3.46 (m, 1H), 3.40-3.36 (m, 1H), 3.12-3.07 (m, 1H, H11), 2.98 (s, 6H), 2.82-2.79 (m, 1H), 2.26-2.12 (m, 2H), 1.98-1.94 (m, 1H), 1.91 (s, 3H), 1.84-1.80 (m, 2H), 1.66-1.59 (m, 2H), 1.17 (s, 3H), 1.16-1.10 (m, 1H), 0.61 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 0.48 (d, J = 5.0 Hz, 1H). ESI-MS (m/z): [M+H]+ = 326.9 (calcd: 326.9).
화합물 16의 염산염 31의 제조
화합물 16을 출발 물질로 사용하여, 화합물 10 염산염의 제조 방법을 참조하여 화합물 31을 제조할 수 있으며 수율은 76%였다. 1H NMR (500 MHz, CD3OD):δ4.22 (t, J = 10.0 Hz, 1H, H6), 3.50-3.38 (m, 2H), 3.13-3.09 (m, 1H, H11), 2.99 (s, 6H), 2.69-2.63 (m, 2H), 2.24-2.17 (m, 2H), 1.99-1.93 (m, 2H), 1.86-1.82 (m, 1H, H5), 1.68-1.59 (m, 1H), 1.54-1.45 (m, 1H), 1.36-1.30 (m, 1H), 1.27 (s, 3H), 1.14 (s, 3H), 1.06 (t, J = 10.0 Hz, 3H), 1.04-1.00 (m, 1H), 0.93-0.88 (m, 1H), 0.42 (d, J = 5.0 Hz, 1H, H16a), 0.36 (d, J = 5.0 Hz, 1H, H16b). ESI-MS (m/z): [M+H]+ = 400.1(calcd: 400.0).
화합물 17의 염산염 32의 제조
화합물 17을 출발 물질로 사용하여, 화합물 10 염산염의 제조 방법을 참조하여 화합물 32를 제조할 수 있으며 수율은 88%였다. 1H NMR (500 MHz, CD3OD):δ 4.44-4.40 (m, 1H, H6), 3.38-3.33 (m, 1H), 3.26-3.22 (m, 1H), 2.94 -2.90 (m, 1H, H11), 2.88 (s, 6H), 2.26-1.98 (m, 2H), 1.96-1.92 (m, 1H), 1.84-1.80 (m, 1H), 1.78-1.75 (m, 1H), 1.58-1.41 (m, 5H), 1.25-1.20 (m, 1H), 1.13-1.08 (m, 1H), 1.01-0.98 (m, 1H), 0.70-0.68 (m, 1H), 0.46-0.42 (m, 1H), 0.33-0.18 (m, 4H), 0.15-0.11 (m, 2H). ROESY 스펙트럼은 H6과 H11에 신호 상관관계가 있음을 나타냈으며, 11-H가 β 구성임을 확인하였다. ESI-MS (m/z): [M+H]+ = 340.8 (calcd: 340.9).
실시예 5: 혈장 및 HEPES에서 화합물 25를 화합물 1로 전환
실험방법
HEPES 7.4 용액 제조: 증류수 90mL에 NaCl 1.6g, KCl 0.074g, Na2HPO4 0.027g, 포도당 0.2g 및 4-히드록시에틸피페라진에탄술폰산(HEPES) 용액 1g을 첨가하고, 0.5M NaOH를 사용하여 pH 값을 7.4로 조절한 다음, 증류수를 넣어 100mL로 맞추었다.
혈장 제조: 마우스 혈장을 취하여 헤파린 나트륨이 미리 채워진 EP 튜브에 넣고 4℃에서 10분간 8000rpm으로 원심분리한 후 상청액을 취하였다.
샘플 분석: 0.6mg의 화합물 25를 탈이온수 250μl에 용해하였다. 샘플에 250μL의 마우스 혈청 또는 HEPES7.4의 용액을 첨가하고, 37℃ 항온에서 배양하고, 상이한 시점에서 샘플을 취하고, 20μL의 샘플을 EP 튜브에 넣고, 60μL 메탄올을 첨가하였으며, 볼텍스 혼합하여 4℃에서 10분 동안 12000rpm으로 원심분리하였다. 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간에 상청액을 각각 취하고, 샘플을 HPLC로 분석하였으며, 샘플 주입량은 10μL이고, 상응하는 피크 면적을 기록하였다. 크로마토그래피 조건: 크로마토그래피 컬럼은 Hanbang C18(4.6×250mm, 5μm), 이동상은 아세토니트릴: 10mmol/mL 포름산암모늄 용액 = 60:40, 유속 1.0mL/min, 검출 파장 210nm, 컬럼 온도 30℃이다.
실험결과
도 1에 도시된 바와 같이, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간일 때, HEPES 완충액 중 화합물 1의 함량이 점차 증가하였으며, 함량은 각각 5.36%, 11.05%, 19.64%, 39.29%, 55.36%였다. 상기 실험 결과는 HEPES 완충 용액에서 화합물 25가 전구약물로서 원래 화합물 1로 전환될 수 있음을 보여준다. 도 2에 도시된 바와 같이, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간일 때, 마우스 혈장 중 화합물 1의 함량이 점차 증가하였으며, 함량은 각각 5.77%, 11.05%, 18.86%, 39.42%, 55.88%였다. 상기 실험 결과는 마우스 혈장에서 화합물 25가 전구약물로서 원래 화합물 1로 전환될 수도 있음을 보여준다.
마찬가지로, 기타 전구약물 화합물도 혈장 및 HEPES에서 상응하는 원래 약물 화합물로 전환될 수 있다.
실시예 6: 원래 및 이의 전구약물의 물 용해도 시험
화합물 1 내지 9 각 20μg과 화합물 24 내지 32 각 10mg을 정밀하게 칭량하여, 탈이온수 1mL를 첨가하고, 초음파 처리하여 완전히 용해시켰다. 포화 용액을 제조하여 여과한 후 HPLC를 이용하여 샘플을 분석하였으며, 샘플 주입량은 순차적으로 1 μL, 3 μL, 5 μL, 10 μL, 15 μL, 20 μL이며, 대응하는 화합물의 표준곡선을 제도하였다.
상기 화합물의 불포화 용액을 제조하고 초음파로 4시간 동안 용해시켜 37℃ 수욕조에 1시간 동안 방치하고, 수득된 불포화 용액을 원심분리하여 상청액 30 μL를 제거하고, 200μL 탈이온수를 첨가하여 희석한 후, 여과하여 HPLC로 샘플을 분석하였다. 관련 데이터를 상기 측정된 표준 곡선에 대입하면, 시험 화합물 1 내지 9와 24 내지 32의 용해도를 획득할 수 있다.
표 2. 화합물의 수용해도
표 1에 나타난 바와 같이, 아르글라빈, 데히드로코스투스락톤 및 상응하는 원래 약물과 비교하여, 전구약물 염 24 내지 32의 수용성은 적어도 100배 이상 향상되었다.
실시예 7: 등몰 용량의 화합물 1 및 25의 약동학적 특성 비교
실험재료
실험시약
본 발명의 약물은 상기 실시예 1에 따라 제조: 톨부타미드(내부 표준, internal standard, IS), Meilunbio사; 디메틸 설폭시드, Shanghai Titan Scientific사; 생리식염수, Cisen Pharmaceutical사; 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스, Aladdin사; 메탄올, 아세토니트릴 및 포름산, Merck사; 순수, Wahaha Group사.
실험기구
냉동 원심분리기, eppendorf사; 볼텍스 진탕기, scientific industries사; 디지털 초음파 세척기, Kunshan초음파기기유한회사; 전자 저울, Sartorius사; 자기 교반기, IKA사; 전자 저울, Changzhou Xingyun Electronic Equipments사: H-Class/Xevo TQ-S 마이크로 액체 질량 분석기, waters사.
실험동물
무게 200 ± 20g의 SPF 등급 수컷 SD 래트는 난징 장닝구의 Qinglongshan Animal Breeding Farm에서 제공하였다. 구입 후 주위 온도 23 내지 26℃, 습도 40 내지 60%에서 7일 동안 사육하였으며, 이 기간 동안 자유 섭식시켰고, 동물생산 허가번호는 SCXK(zhe(浙))2019-0002이다.
실험방법
UPLC-MS/MS 측정 방법의 구축
크로마토그래피 조건: Waters Acquity UPLC® BEH C18 컬럼(2.1 × 50mm, 1.7μm) 사용; 구배 용출을 위해 이동상 A로 0.1% 포름산 수용액, 이동상 B로 아세토니트릴 사용(0-1.0분, 5%-30% B; 1.0-2.0분, 30%-80% B; 2.0-3.0분, 80%-80% B; 3.0-4.0분, 80%-5% B; 4.0-5.0분, 5%-5% B), 총 실행 시간: 5분, 유속: 0.3mL/분, 컬럼 온도: 30℃, 샘플 주입량: 2μL.
질량 분석 조건: 전기 분무 이온화(ESI) 채택, 양이온 모니터링 모드, 스캐닝 방식은 다반응 검출(MRM) 모드, 검출에 사용된 이온: m/z 263.1→227.2(화합물 1), m/z 308.2 →116.0(화합물 24), m/z 270.9 →91.0(IS). MS 작업 매개변수 설정: 모세관 전압은 1000V, 탈용매 온도는 600℃, 탈용매 유속은 1000L/Hr. 화합물 1, 화합물 25 및 IS의 콘 전압은 각각 26V, 48V 및 14V이고 충돌 에너지는 각각 44V, 18V 및 30V이다. Masslynx 4.2를 사용하여 데이터 수집 및 분석을 수행하였다.
혈장 샘플 처리
방법적 고찰을 거친 후, 1:3 단백질 침전법으로 혈장 샘플 전처리를 수행하였으며, 메탄올을 단백질 침전제로 선택하였다. 50μL 래트 혈장 샘플을 취하고, 150μL 내부 표준 메탄올 용액(0.67 ng/mL)을 첨가하고, 14000rpm/min, 4℃ 조건 하에서 10분간 원심분리를 수행하고, 상청액을 취하여 2μL 샘플을 주입하고 LC-MS/MS 분석을 수행하였다.
약동학 연구
총 24마리의 SD 래트(수컷)를 무작위로 위내 투여군과 꼬리정맥 주사군(화합물 1 및 화합물 25)으로 나누어 각 군에 6마리씩 두었다. 래트에 각각 등몰량의 화합물 1(0.345mmol/kg)과 화합물 25(0.345mmol/kg)를 위내 투여하고, 0.5% 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스(10% DMSO 함유)를 용매로 사용하였다. 또한 등몰량의 화합물 1(0.024mmol/kg) 및 화합물 25(0.024mmol/kg)를 정맥 주사하고, 생리식염수(5% DMSO 함유)를 용매로 사용하였다. 위내 투여 후의 래트는 투여 후 0.167, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12 및 24시간에 안와 채혈을 수행하였다. 또한 꼬리정맥 주사 후의 래트는 투여 후 0.033, 0.083, 0.167, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2, 4, 6, 8, 10, 12 및 24시간에 안와 채혈을 수행하였다. 안와정맥총에서 채취한 전혈을 헤파린 나트륨 용액으로 처리한 1.5mL EP 튜브에 넣고, 8000rpm/min, 4℃ 조건에서 10분간 원심분리하여 혈장을 획득하였으며, -20℃에 보관하여 준비하였다.
데이터 분석
약동학적 매개변수에는 소실 반감기(t 1/2 ), 농도-시간 곡선하 면적(AUC), 평균 체류 시간(MRT), 겉보기 분포 용적(V z/F) 및 혈장 청소율(CL z/F)이 포함되며, DAS(약물과 통계, 3.0버전) 소프트웨어의 비구획 모델을 통해 계산하였다. 농도-시간 곡선을 기반으로 최대 농도(C max )와 최대 농도에 도달하는 시간(T max )을 측정하였다. 모든 데이터는 평균값±표준편차(SD)로 나타낸다.
실험결과
표 3에 나타낸 바와 같이, 동일한 몰수의 화합물 1 및 화합물 25를 위내 투여하고, 25 위내 투여 후 혈중 화합물 1의 AUC 값은 1 위내 투여 후 혈중 화합물 1의 AUC 값의 거의 2배였다. 25 위내 투여 후 혈중 화합물 1의 Cmax 값은 1 위내 투여 후 혈중 화합물 1의 Cmax 값의 10배였다. 이는 전구약물이 화합물 1의 경구 흡수를 현저하게 향상시켰음을 나타낸다.
표 3. 화합물 1(0.345mmol/kg) 및 25(0.345mmol/kg)의 위내 투여 후 래트 혈중 화합물 1의 주요 약동학적 매개변수
실시예 8: NLRP3 염증소체 활성화를 억제하는 화합물의 활성 시험
NLRP3는 중요한 패턴 인식 수용체로, 어댑터 단백질 ASC와 pro-caspase-1을 통해 NLRP3 염증소체를 형성할 수 있으며, NLRP3 염증소체가 활성화된 후 caspase-1의 활성화를 매개하여 IL-1β의 성숙과 분비를 촉진할 수 있다. 제조된 구아이안계 세스퀴테르펜 화합물 1 내지 9가 NLRP3 염증소체 활성화를 억제할 수 있는지 확인하기 위해, LPS와 ATP를 사용하여 NLRP3 염증소체 활성화를 유도하여, 화합물 1 내지 9가 NLRP3 염증소체 활성화로 인한 IL-1β 수준에 미치는 영향을 관찰하였다.
실험재료
실험시약
본 발명의 약물은 상기 실시예 1에 따라 제조; 지질다당류(Lipopolysaccharide, LPS)와 아데노신 트리포스페이트(Adenosine triphosphate, ATP), Sigma사; 재조합 마우스 대식세포 콜로니 자극 인자(recombinant mouse macrophage colony stimulating factor, rmM-CSF), PeproTech사; RPMI 1640 배지, DMEM 배지 및 소 태아 혈청(Fetal bovine Serum, FBS).
실험동물
6 내지 8주령의 중량이 18 내지 20g인 C57BL/6 암컷 마우스는 난징 장닝구의 Qinglongshan Animal Breeding Farm에서 제공하였으며, 생산 허가 번호는 SCXK(Su(蘇)) 2017-0001이다.
실험방법
마우스 골수 유래 대식 세포(BMDM)의 분리 및 배양
C57BL/6 마우스를 취하여, 경추 탈구로 마우스를 희생시킨 후 75% 알코올에 5 내지 10분 동안 침지시킨 후, 가위로 마우스의 두 뒷다리를 제거한 다음 살을 제거하고 다리 뼈를 남겨 PBS로 마우스 다리 뼈를 3회 세척하였다. 1mL 주사기 내에 무혈청 RPMI 1640 배지를 가득 채우고, 핀셋으로 뼈를 집어 가위로 양단을 잘라낸 후, 주사기로 골수를 15mL 원심분리관에 불어넣는다. 골수가 완전히 빠져나와 뼈가 붉은색에서 흰색으로 변할 때까지 여러 번 반복하였다. 이어서, 1500rpm으로 5분간 원심분리하고 상청액을 버리고 1mL의 적혈구 용해액으로 재현탁하고 반복적으로 피펫팅한 후 7분간 방치하여 적혈구를 용해시켰다. 1500rpm에서 5분간 원심분리하여 상청액을 버리고, 100ng/mLrmM-CSF가 함유된 RPMI 1640 배지로 재현탁한 후, 6웰 배양 플레이트로 옮겨 배양하였다. 6 내지 7일 후, 세포 상태를 관찰할 수 있는데, 긴 방추 모양을 나타내며, 이는 상태가 양호하고 후속 실험에 사용할 수 있음을 나타낸다.
NLRP3 염증소체 활성화 모델 구축
1% FBS와 100ng/mL LPS가 함유된 DMEM 배지를 준비하고, 상기 6웰 배양 플레이트 중의 BMDMs를 취하고, 제조된 배지를 첨가하여 사전 자극을 수행하며, 자극 시간은 3시간이다. 이어서, 아르글라빈(1, 3, 10, 30, 60, 120nM)을 첨가하여 1시간 동안 배양하고, ATP(5mM)를 첨가하여 1시간 동안 자극하였다. 상청액을 1.5mL EP 튜브에 수집하여 후속적으로 IL-1β 수준 검출에 사용하였다.
표 4. 유도체 1 내지 9 및 이의 전구약물에 의한 NLRP3 염증소체 활성화의 억제 작용
비고: +는 80nM <IC50<100nM을 나타내고, ++는 40nM<IC50<80nM을 나타내고, +++는 IC50<40nM을 나타낸다.
BMDMs에서 LPS와 ATP를 사용하여 NLRP3 염증소체 활성화 모델을 유도하여, IL-1β 발현 수준에 대한 화합물 1 내지 9 및 24 내지 32의 영향을 조사하였다. 표 4에 나타난 바와 같이, 유도체 1 내지 9는 모두 더 나은 IL-1β 억제 활성을 가지며, 이는 양성 화합물인 아르글라빈에 가깝고, 전구약물 활성은 약간 감소하였다.
실시예 9: 화합물 1 및 이의 디메틸 푸마르산염 전구약물 25의 항궤양성 결장염 활성 시험
실험시약
본 발명의 약물은 상기 실시예 1에 따라 제조: 덱스트란 황산 나트륨(dextran sulfate sodium, DSS), MP Biomedicals사; 메살라진 서방성 과립(5-aminosalicylic acid, 5-ASA), France Ethypharm Pharmaceuticals사; 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스(CMC-Na), Xilong Chemical사; 골수 과산화효소(myeloperoxidase, MPO) 키트; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute; o-톨루이딘, Shanghai Jingchun Biochemical Technology사; 과산화수소(H2O2) 및 빙초산, Nanjing Chemical Reagent사.
실험동물
6 내지 8주령의 중량이 18 내지 20g인 C57BL/6 암컷 마우스는 난징 장닝구의 Qinglongshan Animal Breeding Farm에서 제공하였으며, 생산 허가 번호는 SCXK(Su(蘇)) 2017-0001이다. 동물은 자유 섭식하였으며, 표준 과립 사료로 사육하였고, 실내 온도는 22±2℃, 습도는 45±10%였다. 환경에 3일간 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
실험방법
마우스 결장염 모델 구축 및 군별 투여
마우스를 무작위로 7개군으로 나누었으며, 그 중 1군은 정상군으로, 나머지 6개군은 각각 모델군, 아르글라빈(20nmol/kg), 화합물 1(20, 40nmol/kg), 화합물 25(20, 40nmol/kg)군으로 임의 선택하였으며, 각 군에 6마리씩 배정하였다. 정상군을 제외한 나머지 마우스는 7일 동안 2.5% DSS를 자유 음용하였으며, 이어서 3일 동안 단일 증류수로 바꾸어 음용하여, UC 모델을 구축하였다. 모델링 1일차부터 아르글라빈(20nmol/kg/d), 화합물 1(20, 40nmol/kg/d) 및 화합물 25(20, 40nmol/kg/d)를 연속 10일 동안 각각 위내 투여하였다. 정상군과 모델군 마우스에게 동량의 0.5% CMC-Na 용매를 위내 투여하였다.
질병 활동 지수 점수
각 군 마우스의 일반적인 생활 상태를 관찰하고 질병 활동 지수(DAI)를 평가하였다. 구체적인 일일 관찰 지표는 마우스의 체중, 대변 상태 및 잠혈 상태이며, 이어서 체중 감소, 대변 상태 및 잠혈 상태의 점수를 합산하고 평균값을 구하여, 각 마우스의 DAI 점수, 즉 DAI = (체중 감소 점수 + 대변 상태 점수 + 잠혈 점수)/3을 획득하여, 질병 활동 상태를 평가하였다.
표 5에 나타낸 바와 같이, 점수 기준은 다음과 같다.
표 5. 질병 활동 지수 점수
잠혈 시험 방법: o-톨루이딘법을 이용하여 24웰 배양 플레이트에서 면봉을 사용하여 소량의 대변을 채취한 후, 먼저 o-톨루이딘 빙초산 용액 200μL를 적가한 후, 신속하게 3% 과산화 용액 200μL를 첨가하고, 2분 이내에 갈색을 나타내면 양성이다.
표본 수집
마지막 투여 1시간 후, 안저 정맥총에서 채혈하여 실온에서 2시간 방치한 후 3000rpm에서 20분간 원심분리하고, 혈청을 흡인하여 분취한 후 -70℃에서 냉동 보관하여 준비하였다. 채혈 완료 후, 마우스를 경추 탈구시켜 희생시킨 후, 복강을 열고 항문에서 1cm 떨어진 곳에서 결장 조직을 취하고, 미리 냉각된 PBS로 2회 세척한 후, -70℃에서 냉동시켜 준비하였다.
결장 길이 측정
결장 길이 단축은 DSS 유도의 UC 모델 마우스의 주요 특징 중 하나이다. UC 마우스 복강을 절개한 후 결장 및 원위 회장 조직을 유리시켰다. 결장 조직의 외부 형태학적 변화 상태를 관찰하고 측정하였으며, 길이를 기록하고 사진을 촬영하였다.
MPO 활력 측정
각 군 마우스 결장 조직 40mg을 취하고, 미리 냉각된 생리식염수 400μL을 첨가하여, 조직 균질액을 제조하였다. 4℃에서 5분 동안 1200rpm으로 원심분리한 후 상청액을 수집하였다. 키트 설명서에 기재된 방법에 따라, 다양한 시약을 순차적으로 첨가한 후, 최종적으로 마이크로플레이트 리더를 이용하여 파장 460nm에서 각 웰의 흡광도 값을 측정하여 MPO 활력을 계산하였다.
MPO 활력(U/g 습윤 중량) = (측정 튜브 OD 값 - 대조 튜브 OD 값)/11.3×샘플링량(g)
데이터 통계
모든 데이터는 Means ± S.E.M.으로 표시하였으며, 분산 분석을 채택하여, 차이의 유의성을 분석하였고, 분산분석에서 유의한 차이가 있는 데이터에 대해서는 추가로 일원분산분석(one-way ANOVA)과 Dunnett's test를 이용하여 군 간 차이를 비교하였다. 0.05 미만의 P 값을 유의한 차이로 간주하였다.
실험결과
Normal군 마우스는 활동적이고 배변이 정상적이며 체중이 천천히 증가하였다. DSS를 투여한 마우스는 실험 기간 동안 묽은 변 및 반형성된 들러붙지 않는 항문 대변 등 증상이 나타났으며, 활동량이 감소하고 체중이 현저하게 감소하였다. 매일 마우스 체중 감소, 대변 상태 및 혈변 상태를 관찰함으로써, 질병 활동 지수를 평가하였다. 표 6에 나타난 바와 같이, DSS군과 비교하여, 화합물 25(40nmol/kg)는 DSS로 인한 결장염 DAI 점수 상승이 유의하게 낮아졌으며, 동일 용량의 전구약물 25의 활성이 원래 약물 1보다 현저하게 강하였다.
DAI 점수에 미치는 영향
표 6. DAI 점수
비고: Normal군과 비교하여 ##P<0.01, DSS군과 비교하여 *P<0.05, **P<0.01이다.
결장 길이에 미치는 영향
표 7. 결장 길이
비고: Normal군과 비교하여 ##P<0.01, DSS군과 비교하여 **P<0.01이다.
표 7에 나타난 바와 같이, Normal군 마우스와 비교하여, DSS군 마우스의 결장 길이가 현저히 단축되었다. 화합물 25(40 nmol/kg)의 위내 투여는 마우스 결장 길이의 단축을 유의하게 억제했으며, 동일 용량에서 전구약물 25의 활성은 원래 약물 1의 활성보다 현저하게 강했다.
결장 조직 MPO 활력에 대한 영향
과립구는 혈액 순환에 유입되기 전에 골수에서 골수 과산화효소 MPO를 합성할 수 있으며, 후자는 아주르 친화성 과립(azurophilic granules)에 저장된다. MPO는 차아염소산을 생성하여 병원성 미생물을 죽이고 염증 반응을 조절할 수 있다. MPO는 세포 건조 중량의 약 5%를 차지하며, 이 특징을 이용하여 조직 내 호중구 수를 측정할 수 있다. 표 8에 나타난 바와 같이, Normal군 마우스와 비교하여, DSS군 마우스의 결장 조직 MPO 활력이 현저히 상승하였다. 약물 25(40 nmol/kg)의 위내 투여는 마우스 결장 조직의 MPO 활력을 유의하게 저하시켰으며, 동일 용량에서 전구약물 25의 활성은 원래 약물 1의 활성보다 현저하게 강했다.
표 8. 결장 조직 MPO 활력
비고: Normal군과 비교하여 ##P<0.01, DSS군과 비교하여 **P<0.01이다.
실시예 10: 화합물 25의 항급성 통풍성 관절염 활성 시험
실험시약
본 발명의 약물은 상기 실시예 2에 따라 제조: 콜히친정, Banna Pharmaceutical Industry사; 프레드니솔론정, Tianjin Xinyi Jinjin Pharmaceutical사; 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스(CMC-Na), Sinopharm Chemical Reagent사; 펜토바비탈나트륨, Sinopharm Chemical Reagent Shanghai사; 요산나트륨(MSU), Sigma-Aldrich; IL-1β 방사면역분석 키트, IL-18 방사면역분석 키트, Beijing sinouk institute of biological technology.
실험동물
체중 200 내지 220g의 SPF 등급 SD 암컷 래트는 항저우 의과대학이 제공하였으며, 생산 허가 번호는 SCXK(zhe(浙)) 2019-0002였다. 동물 사용 허가 번호: SYXK(su(蘇)) 2019-0004였다. 동물은 자유 섭식 및 음용하였으며, 표준 과립 사료로 사육하였고, 실내 온도는 22±2℃, 습도는 45±10%였다. 환경에 3일간 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
실험방법
래트 급성 통풍성 관절염 모델
적응적 섭식 기간 동안 2% 펜토바비탈나트륨을 0.25mL/100g의 용량으로 복강내 주사하여 래트를 마취시키고, 래트의 원래 왼쪽 뒷다리 발목 관절 둘레를 측정하였다. 적응적 사육 종료 후 2% 펜토바비탈나트륨을 0.25mL/100g의 용량으로 복강내 주사하여 마취시켰다. 마취 후, 8마리를 무작위로 블랭크군으로 선정하여 이들의 왼쪽 뒷다리 관절강에 생리식염수를 주사하였고, 다른 래트의 왼쪽 뒷다리 관절강에는 200μL의 요산나트륨을 주사하여 모델링하였다. 모델링 6시간 후 펜토바비탈나트륨으로 마취시키고, 2mm 폭의 종이 스트립으로 관절 둘레를 측정하고, 관절 부종률에 따라 래트를 7군으로 나누었다. 블랭크군(동일 용량 CMC-Na); 모델 및 양성 대조군(동일 용량 CMC-Na), 콜히친군(0.5mg/kg), 프레드니솔론군(3.125mg/kg), 화합물 25 저, 중, 고 3개 용량군(1.5, 5.0, 15mg/kg)이며, 블랭크군은 8마리이고, 나머지 각 군은 10마리이다.
군별 투여
모델링 후 10.5시간 및 22.5시간에 각각 1회 투여하였다. 블랭크군, 모델군 래트에 CMC-Na(0.5%)를 위내 투여하고, 콜히친군 래트에 콜히친 용액을 위내 투여하고, 프레드니솔론군 래트에 프레드니솔론 용액을 위내 투여했으며, 화합물 25의 각 용량군 래트에 상이한 농도의 화합물 25를 10mL/kg의 투여량으로 위내 투여하였다.
관절 부종 평가
관절 부종은 MSU에 의해 유도된 급성 통풍성 관절염 모델 래트의 주요 특징 중 하나이다. 모델링 전, 모델링 후 6시간, 12시간, 24시간에 왼쪽 뒷다리 발목 관절 둘레를 각각 측정하여 관절 부종률을 계산하였다. 폭 2mm의 종이 스트립과 자를 이용하여 각 군 래트의 왼쪽 뒷발 발목 관절 아래 0.5mm 지점의 둘레값을 측정하였으며, 이를 2회 반복하여 평균값을 취하여 관절 부종률 계산하였다.
관절 부종률 = (측정시점 관절둘레 - 초기 관절둘레) / 초기 관절둘레
데이터 통계
모든 데이터는 Means ± S.E.M.으로 표시하였으며, 분산 분석을 채택하여, 차이의 유의성을 분석하였고, 분산 분석에서 유의한 차이가 있는 데이터에 대해서는 추가로 일원분산분석(one-way ANOVA)과 Dunnett's test를 이용하여 군 간 차이를 비교하였다. 0.05 미만의 P 값을 유의한 차이로 간주하였다.
실험결과
표 9. 화합물 1이 래트 관절 부종률에 미치는 영향(Mean±SEM)
비고: 블랭크군과 비교하여, ##P<0.01, 모델군과 비교하여 *P<0.05, **P<0.01이다.
MSU에 의해 유발된 관절 부종률에 미치는 영향
표 9에 나타난 바와 같이, 모델링 6시간, 12시간, 24시간 후 모델군 래트 발목 관절 부종률은 대조군에 비해 모두 유의하게 높았으며, 1차 투여 약 1.5시간 후(모델링 12시간 후) 각 투여군 래트 발목 관절 부종률은 모두 감소하였으나 유의하지 않았고, 2차 투여 약 1.5시간 후(모델링 24시간 후) 각 투여군 래트 발목 관절의 부종률은 유의하게 감소하였으며, 이는 화합물 25가 MSU에 의해 유발된 급성 통풍성 관절염 래트 발목 관절 부종률을 유의하게 낮출 수 있음을 시사한다.

Claims (10)

  1. 일반식 I로 표시되는 구아이안계 세스퀴테르펜 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 있어서,

    R1 및 R2가 함께 이중 결합을 형성하거나, R1은 수소 또는 중수소이고, R2는 이며, 여기에서 R3 및 R4는 각각 수소, 알킬 또는 시클로알킬이고, 또는 R3, R4 및 N 원자는 3 내지 9원 고리 구조를 형성하고, 고리는 알킬, 에스테르, 아릴, 알킬아릴, 아릴알킬, 아릴알케닐, 아릴알키닐 또는 헤테로시클릴 치환기를 포함하고;
    R5와 R6은 단일 결합으로 연결되어 시클로프로판을 형성하고, 또는 R5와 R6이 시클로프로판을 형성하지 않는 경우, R5는 메틸이고, R6은 히드록실, 알콕시, 에스테르, 할로겐이거나 인접한 탄소 원자와 이중 결합을 형성하고;
    R7은 수소 또는 히드록실이고;
    R8은 메틸이고, R9와 R10은 연결되어 시클로프로판을 형성하는 것을 특징으로 하는 구아이안계 세스퀴테르펜 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  2. 제1항에 있어서,
    다음 화합물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 구아이안계 세스퀴테르펜 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.

  3. 제1항에 있어서,
    상기 약학적으로 허용 가능한 염은 염산염, 황산염, 인산염, 말레산염, 푸마르산, 구연산염이 포함되는 것을 특징으로 하는 구아이안계 세스퀴테르펜 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 약학적으로 허용 가능한 염은 염산염, 푸마르산염으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 구아이안계 세스퀴테르펜 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  5. 약학 조성물에 있어서,
    제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 구아이안계 세스퀴테르펜 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 이의 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  6. NLRP3 염증소체 관련 질병을 치료하는 약물의 제조에서 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 구아이안계 세스퀴테르펜 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 제5항에 따른 약학 조성물의 용도.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 NLRP3 염증소체 관련 질병에는 면역 질환, 자가면역 질환, 악성 종양, 피부 질환, 심혈관 질환, 간 관련 질환, 신장계 관련 질환, 위장관 관련 질환, 중추신경계 질환, 대사 질환, 내분비계 질환, 호흡기 질환, 림프계 질환, 염증, 전염병, 안과 질환, 정신 질환, 통증 등이 포함되는 것을 특징으로 하는 용도.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 NLRP3 염증소체 관련 질병에는,
    (1) Cryopyrin 단백질 관련 주기성 증후군(CAPS): 머클-웰스 증후군(MWS), 가족성 한냉 자가염증 증후군(FCAS) 및 만성 영아 피부 신경관절 증후군(NOMID)); (2) 자가염증 질환: 가족성 지중해열(FMF), TNF 수용체 관련 주기성 증후군(TRAPS), 메발론산 키나아제 결핍증(MKD), 고면역 글로불린 D 및 주기성 발열 증후군(HIDS), 인터루킨 1 수용체(DIRA) 결핍증, Majeed 증후군, 화농성 관절염, 농가진 괴저 및 여드름(PAPA), A20 반수체 부족(HA20), 소아 육아종성 관절염(PGA), PLCG2 관련 항체 결핍 및 면역 조절 장애(PLAID), PLCG2 관련 자발 염증, 항체 결핍 및 면역 조절 장애(APLAID), 철적혈모구 빈혈 수반 B세포 면역 결핍, 주기성 발열 및 발달 지연(SIFD); (3) Sweet's 증후군: 만성 비세균성 골수염(CNO), 만성 재발성 다초점 골수염(CRMO), 윤활막염, 여드름, 농포증, 골증식 및 골염 증후군(SAPHO); (4) 자가면역 질환: 다발성 경화증(MS), 제1형 당뇨병, 건선, 류마티스 관절염, Behcet's 병, Sjogren's 증후군, Schnitzler 증후군; (5) 호흡기 질환: 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 스테로이드 내성 천식, 석면폐증, 규폐증 및 낭포성 섬유증; (6) 중추신경계 질환: 파킨슨병, 알츠하이머병, 운동 신경 질환, Huntington's 병, 뇌말라리아 및 폐렴구균수막염으로 인한 뇌손상; (7) 대사 질환: 제2형 당뇨병, 동맥경화증, 비만, 통풍, 가성통풍; (8) 안과 질환: 안구상피, 연령 관련 황반변성(AMD), 각막감염, 포도막염 및 안구건조증; (9) 신장 관련 질환: 만성 신장질환, 옥살산신증 및 당뇨병성 신장병; (10) 간 관련 질환: 비알코올성 지방간염 및 알코올성 간질환; (11) 피부 관련 염증 반응: 접촉성 알레르기 및 일광화상; (12) 관절 관련 염증 반응: 뼈 관절, 전신성 소아 특발성 관절염, 성인 Still's 병, 재발성 다발연골염; (13) 바이러스성 감염: 뎅기열 바이러스 및 지카 바이러스, 인플루엔자, HIV; (14) 화농성 땀샘염(HS) 및 기타 낭포를 유발하는 피부질환; (15) 암: 폐암, 췌장암, 위암, 골수이형성증후군, 복부 대동맥류 및 백혈병; (16) 다발성 근염, 결장염, 심낭염, 유충 감염, 세균 감염, 상처 유합, 우울증, 중풍, 심근경색, 고혈압, Dressler's 증후군, 허혈 재관류 손상이 포함되는 것을 특징으로 하는 용도.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 결장염에는 궤양성 결장염이 포함되는 것을 특징으로 하는 용도.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 NLRP3 염증소체 관련 질병은 급성 통풍성 관절염을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
KR1020237034832A 2021-05-28 2022-05-26 구아이안계 세스퀴테르펜 유도체 및 이의 제약 용도 KR20230159466A (ko)

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