KR20230126218A - 병원성 표적에 대한 루프 매개형 등온 증폭 (lamp)분석 - Google Patents

병원성 표적에 대한 루프 매개형 등온 증폭 (lamp)분석 Download PDF

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Abstract

본 발명은 pH 의존성 출력 신호를 이용하는 루프 매개형 등온 증폭 (LAMP) 분석을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 상기 조성물은 pH 민감성 염료 및 복수의 비간섭성 LAMP 시약을 포함할 수 있다. 상기 방법은 고체상 매질과 조성물의 어셈블리를 제공하는 단계, 생체 샘플을 고체상 매질 상에 침착시키는 단계, 및 LAMP 반응을 촉진하기에 충분한 등온 온도로 상기 어셈블리를 가열하는 단계를 포함할 수 있다.

Description

병원성 표적에 대한 루프 매개형 등온 증폭 (LAMP) 분석
관련 출원
본 출원은 2021년 1월 15일자로 출원된 미국 가출원 63/138,314호의 이익을 주장하며, 이 출원은 인용에 의해 그 전문이 본원에 포함된다.
기술분야
본 발명은 LAMP 분석을 사용하여 표적 뉴클레오타이드를 검출하는데 사용하기 위한 기술 (예컨대, 조성물, 방법, 시스템 및 어셈블리)에 관한 것이다.
중합효소 연쇄 반응 (PCR)은 다양한 분석 목적을 위해 뉴클레오타이드를 증폭할 수 있는 분자 생물학 기술이다. 정량적 PCR (qPCR)은 표적 뉴클레오타이드의 증폭을 모니터링할 수 있는 PCR을 개조한 것이다. 진단용 qPCR은 전염병, 암 및 유전적 비이상성을 나타내는 뉴클레오타이드를 검출하는데 사용되어 왔다. 역전사 PCR (RT-PCR)은 qPCR을 개조하여 표적 RNA 뉴클레오타이드의 검출을 가능하게 한 것이다. 이러한 능력 때문에, RT-PCR은 바이러스 병원체들을 검출하는데 매우 적합하다. 그러나, RT-PCR은 크기가 꽤 큰 장비를 사용하여 어떤 현장 의료 진단 환경에서는 이용할 수가 없다. 또한, RT-PCR은 숙련된 인원, 상당한 샘플 제제와 시간을 사용하여 수행되어 결과를 얻는다.
이와는 대조적으로, 루프 매개형 등온 증폭 (LAMP, Loop-Mediated Isothermal Amplification)은 표적 뉴클레오타이드의 진단적 확인에 대한 보다 단순한 접근 방식이다. 특히, LAMP는 특정 뉴클레오타이드 서열들을 증가시키는 1회 작업 (one-operation)의 핵산 증폭 방법이다. LAMP는 등온 가열 공정을 사용하는 것 외에도, PCR에서 사용하는 복잡한 형광 지시약이 아닌, 색상 변화와 같은 간단한 시각적 출력 검사 지시약을 사용할 수 있다. 역전사 LAMP (RT-LAMP)는 RNA로부터 표적 뉴클레오타이드를 확인하기 위해 RT-PCR처럼 사용할 수 있으며, 바이러스 병원체의 유무를 확인하는 진단용으로도 사용할 수 있다. LAMP는 더 단순하기 때문에, 더 적은 장비와 샘플 준비로 수행할 수 있으므로, 진료소, 응급실, 심지어 자동차로 이동하는 중과 같은 현장 의료 진단 환경에서 사용하기가 더 쉽다.
본 발명은 LAMP 분석을 사용하여 표적 뉴클레오타이드를 검출하는데 사용하기 위한 기술 (예컨대, 조성물, 방법, 시스템 및 어셈블리)에 관한 것이다. 일부 양태에서, 표적 뉴클레오타이드는 관심대상 병원체에 존재할 수 있다. 병원체가 바이러스인 경우, LAMP 분석은 RT-LAMP 분석일 수 있다.
발명의 일부 실시형태에서, 병원체 표적의 루프 매개형 등온 증폭 (LAMP) 검출을 위한 타액 샘플을 준비하는 방법이 제공된다. 한 양태에서, 이러한 방법은 검사 대상체로부터 소정량의 타액을 제공하는 단계, 및 병원체 표적의 검출이 가능하게 충분한 농도를 유지하면서 타액의 완충능을 감소시키는 정도로 상기 타액을 물에 희석하는 단계를 포함할 수 있다.
한 양태에서, 본 방법은 원래 점도에 비해 타액의 점도를 감소시키는 단계를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 점도는 희석, 여과, 또는 이들의 조합 중 하나 이상에 의해 감소될 수 있다. 또 다른 양태에서, 점도는 여과를 사용하여 감소시킬 수 있다. 추가의 양태에서, 점도는 10-마이크론 필터를 사용하여 감소시킬 수 있다. 또 다른 양태에서, 점도는 원래 점도와 비교하였을 때 고체상 매질을 통해 유동성을 증가시키는 정도로 감소될 수 있다. 또 다른 양태에서, 점도는 약 1.0 센티푸아즈 (cP) 내지 약 50 cP 범위로 감소될 수 있다.
한 양태에서, 이러한 방법은 타액 샘플 pH를 검사 샘플 대상 범위로 조정하는 정도로 타액 샘플을 여과하는 단계를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 검사 샘플 대상 범위는 약 7.2 내지 약 8.6일 수 있다. 또 다른 양태에서, 물은 6.0 초과의 pH를 가질 수 있고, 오염물이 실질적으로 없을 수 있다. 또 다른 양태에서, 타액 샘플은 필수적으로 타액과 물로 이루어질 수 있다. 또 다른 추가의 양태에서, 스폰지를 기반으로 한 수집을 사용하여 타액을 수집할 수 있다.
한 양태에서, 타액은 물과 타액을 약 1:1 내지 약 1:20의 비율로 희석될 수 있다. 또 다른 양태에서, 타액은 해당 샘플에 0.2 미만의 600 nm에서의 광학 밀도 (OD600)를 제공하는 정도로 물에 희석될 수 있다. 추가의 양태에서, 타액의 부피는 약 50 ㎕ 내지 약 100 ㎕이다. 또 다른 양태에서, 타액 샘플의 부피는 약 100 ㎕ 내지 약 1 ㎖ 범위이다.
추가의 양태에서, 병원체 표적은 바이러스 병원체, 박테리아 병원체, 진균 병원체 또는 원생동물 병원체를 포함할 수 있다. 한 양태에서, 병원체 표적은 바이러스 표적일 수 있다. 또 다른 양태에서, 바이러스 표적은 dsDNA 바이러스, ssDNA 바이러스, dsRNA 바이러스, 양성 가닥 ssRNA 바이러스, 음성 가닥 ssRNA 바이러스, ssRNA-RT 바이러스 또는 ds-DNA-RT 바이러스를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 바이러스 표적은 H1N1, H2N2, H3N2, H1N1pdm09 또는 SARS-CoV-2일 수 있다.
일부 양태에서, LAMP 검출은 역전사 LAMP (RT-LAMP) 검출을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태에서, LAMP 분석을 위한 검사 샘플 조성물이 개시되며, 이는 다음을 포함할 수 있다: LAMP 분석을 통해 병원체 표적을 검출하기에 충분한 검사 대상체의 소정량의 타액과 상기 타액의 완충능을 감소시키는 소정량의 물.
한 양태에서, 조성물의 점도는 약 1.0 cP 내지 약 50 cP일 수 있다. 또 다른 양태에서, 조성물의 pH는 약 7.2 내지 약 8.6일 수 있다. 또 다른 양태에서, 조성물의 타액 대 물의 비율은 약 1:1 내지 약 1:20일 수 있다. 또 다른 양태에서, 조성물은 0.2 미만의 600 nm에서의 광학 밀도 (OD600)를 가질 수 있다. 또 다른 양태에서, 물은 6.0 초과의 pH를 가질 수 있고, 오염물이 실질적으로 없을 수 있다. 한 양태에서, 조성물은 필수적으로 타액과 물로 이루어질 수 있다. 또 다른 양태에서, 타액의 부피는 약 50 ㎕ 내지 약 100 ㎕ 범위일 수 있다. 또 다른 양태에서, 타액 샘플의 부피는 약 100 ㎕ 내지 약 1 ㎖ 일 수 있다.
한 양태에서, 병원체 표적은 바이러스 병원체, 박테리아 병원체, 진균 병원체 또는 원생동물 병원체를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 병원체 표적은 바이러스 표적일 수 있다. 또 다른 양태에서, 바이러스 표적은 dsDNA 바이러스, ssDNA 바이러스, dsRNA 바이러스, 양성 가닥 ssRNA 바이러스, 음성 가닥 ssRNA 바이러스, ssRNA-RT 바이러스 또는 ds-DNA-RT 바이러스를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 바이러스 표적은 H1N1, H2N2, H3N2, H1N1pdm09 또는 SARS-CoV-2를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 조성물의 완충능은 5 mM 미만일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 고체상 매질 상에서 LAMP 분석을 위한 조성물은 하나 이상의 표적 프라이머, DNA 중합효소 및 재가용화제를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 이러한 조성물은 고체상 매질을 변색시킬 수 있는 pH에 민감하지 않은 제제들이 실질적으로 없을 수 있다. 한 양태에서, 조성물은 항산화제를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 조성물은 휘발성 제제가 실질적으로 없을 수 있다. 또 다른 양태에서, 조성물은 흡습제가 실질적으로 없을 수 있다. 다른 한 양태에서, 조성물은 역전사효소를 추가로 포함할 수 있다.
한 양태에서, 흡습제는 25℃에서 약 40% 내지 약 90%의 상대 습도 (RH)일 때 약 10 중량% 이상을 흡수할 수 있다.또 다른 양태에서, 흡습제는 글리세롤, 에탄올, 메탄올, 염화칼슘, 염화칼륨, 황산칼슘 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 재가용화제는 계면활성제일 수 있다. 또 다른 양태에서, 재가용화제는 소혈청 알부민 (BSA), 카제인, 폴리소르베이트 20 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
한 양태에서, 표적 프라이머는 바이러스 병원체, 박테리아 병원체, 진균 병원체 또는 원생동물 병원체를 포함할 수 있는 병원체를 표적으로 삼을 수 있다. 한 양태에서, 병원체는 바이러스 병원체일 수 있다. 또 다른 양태에서, 바이러스 병원체는 dsDNA 바이러스, ssDNA 바이러스, dsRNA 바이러스, 양성 가닥 ssRNA 바이러스, 음성 가닥 ssRNA 바이러스, ssRNA-RT 바이러스 또는 ds-DNA-RT 바이러스를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 바이러스 병원체는 H1N1, H2N2, H3N2, H1N1pdm09 또는 SARS-CoV-2를 포함할 수 있다.
한 양태에서, 조성물은 변색 방지용 (non-discoloration) 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 변색 방지용 첨가제는 당, 완충제, 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 조성물은 지시약을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 고체상 매질 상에서 LAMP 분석을 위한 방법은 고체상 매질과 본원에 언급된 조성물의 어셈블리를 제공하는 단계, 생체 샘플을 고체상 매질 상에 침착시키는 단계, 및 LAMP 반응을 촉진하기에 충분한 등온 온도로 상기 어셈블리를 가열하는 단계를 포함할 수 있다. 한 양태에서, 생체 샘플은 타액, 점액, 혈액, 소변, 대변, 땀, 호기 응축물 (exhaled breath condensate), 또는 이들의 조합 중 하나 이상일 수 있다. 또 다른 양태에서, 생체 샘플은 타액이다. 한 양태에서, LAMP 분석은 역전사효소 LAMP (RT-LAMP)일 수 있다. 또 다른 양태에서, 본 방법은 바이러스 병원체를 검출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태에서, LAMP 분석을 수행하기 위한 시스템은 본원에 언급된 조성물과 상기 조성물이 침착되는 고체상 매질을 포함할 수 있다.
본 발명의 추가의 실시형태에서, 루프 매개형 등온 증폭 (LAMP) 분석을 위한 조성물은 pH 민감성 염료와 복수의 비간섭성 LAMP 시약을 포함할 수 있는 pH 의존성 출력 신호를 이용할 수 있다. 한 양태에서, LAMP 분석은 RT-LAMP일 수 있다.
한 양태에서, pH 민감성 염료는 페놀 레드, 페놀프탈레인, 아졸리트민, 브로모티몰 블루, 나프톨프탈레인, 크레졸 레드, 또는 이들의 조합 중 적어도 하나일 수 있다. 또 다른 양태에서, 복수의 비간섭성 LAMP 시약에는 휘발성 시약, pH 간섭성 시약, 마그네슘 간섭성 시약 또는 이들의 조합이 실질적으로 없을 수 있다.
한 양태에서, 복수의 비간섭성 LAMP 시약에는 마그네슘, 황산암모늄 및 탄산암모늄이 실질적으로 없을 수 있다. 한 양태에서, 복수의 비간섭성 LAMP 시약은 DNA 중합효소, 역전사효소, 표적 프라이머 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 조성물은 항산화제를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 조성물은 운반체 RNA, 운반체 DNA, RNase 억제제, DNase 억제제, 구아니딘 염산염 또는 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 한 양태에서, 조성물은 고체상 매질을 추가로 포함할 수 있다.
한 양태에서, 조성물은 당, 완충제, 차단제 또는 이들의 조합을 포함할 수 있는 변색 방지용 첨가제를 포함할 수 있다. 한 양태에서, 당은 트레할로스, 글루코스, 수크로스, 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 차단제는 소혈청 알부민, 카제인 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태에서, pH 의존성 출력 신호를 사용하는 LAMP 분석을 수행하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 고체상 매질과 본원에 언급된 조성물의 어셈블리를 제공하는 단계, 생체 샘플을 고체상 매질 상에 침착시키는 단계, 및 LAMP 반응을 촉진하기에 충분한 등온 온도로 상기 어셈블리를 가열하는 단계를 포함할 수 있다. 한 양태에서, LAMP 분석은 RT-LAMP일 수 있다. 한 양태에서, 생체 샘플은 타액, 점액, 혈액, 소변, 대변, 땀, 호기 응축물 및 이들의 조합 중 하나 이상일 수 있다. 한 양태에서, 생체 샘플은 타액일 수 있다. 또 다른 양태에서, 본 방법은 바이러스 병원체를 검출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 추가의 실시형태에서, pH 의존성 LAMP 분석에서 출력 신호의 정확도를 최대화하는 방법은 신호 출력 매질에서 비-LAMP 반응이 일으킨 변색을 최소화하는 시약 혼합물을 제공하는 단계 및 LAMP 반응을 수행하는 단계를 포함할 수 있다. 한 양태에서, 본 방법은 비-LAMP 반응에서 양성자의 생성을 제어하는 단계를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 본 방법은 비-LAMP 반응에서 산화를 제어하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태에서, pH 의존성 LAMP 분석에서 출력 신호의 정확도를 최대화하는 방법은 신호 출력 매질에서 비-LAMP 반응이 일으킨 변색을 실질적으로 제거하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태에서, pH 의존성 LAMP 분석에서 검출 한계 (LOD)를 최대화하는 방법은 신호 출력 매질에서 비-LAMP 반응이 일으킨 변색을 실질적으로 제거하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 특징과 이점들은, 본 발명의 특징들을 예를 들어서 함께 도시하는 첨부된 도면들과 함께, 아래의 상세한 설명을 본다면 분명하게 이해할 수 있을 것이다:
도 1은 예시적인 실시형태에 따라 병원체 표적의 루프 매개형 등온 증폭 (LAMP) 검출을 위한 타액 샘플을 준비하는 방법을 도시한 것이고;
도 2는 예시적인 실시형태에 따른 LAMP 분석 방법을 도시한 것이며;
도 3은 예시적인 실시형태에 따른 pH 의존성 LAMP 분석에서 출력 신호의 정확도를 최대화하는 방법을 도시한 것이고;
도 4는 예시적인 실시형태에 따른 루프 매개형 등온 증폭 (LAMP)이 타액 샘플에서 달성될 수 있음을 도시한 것이며;
도 5a는 예시적인 실시형태에 따른 스폰지를 기반으로 한 수집 장치를 도시한 것이고;
도 5b는 예시적인 실시형태에 따른 수동식 침 수집 장치를 도시한 것이며;
도 6a는 예시적인 실시형태에 따른 다양한 농도의 샘플과 다양한 수집 장치에 대한 검출 한계를 도시한 것이고;
도 6b는 예시적인 실시형태에 따른 RT-LAMP 비색 반응에 대한 다양한 농도의 주형에서의 RNase 억제제의 효과를 도시한 것이며;
도 6c는 예시적인 실시형태에 따른 비색 LoD에 대한 타액 처리 기술의 효과를 도시한 것이고;
도 6d는 예시적인 실시형태에 따른 비색 RT-LAMP 반응에 대한 운반체 DNA 농도의 효과를 도시한 것이며;
도 6e는 예시적인 실시형태에 따른 RT-LAMP 비색 반응에 대한 구아니딘 HCl의 효과를 도시한 것이고;
도 6f는 예시적인 실시형태에 따른 엔드-포인트 (end-point) RT-LAMP 비색 반응에 대한 UDG의 효과를 도시한 것이며;
도 6g는 예시적인 실시형태에 따른 비색 반응에 대한 타액 처리의 효과를 도시한 것이고;
도 7은 예시적인 실시형태에 따른 동결된 타액 샘플들의 안정성을 도시하는 차트이며;
도 8은 예시적인 실시형태에 따른 신선한 타액의 검출 한계를 도시한 것이고;
도 9는 예시적인 실시형태에 따른 소 비강 면봉에서의 검출 한계를 도시한 것이며;
도 10은 예시적인 실시형태에 따른 종이 상의 검출 한계를 도시한 것이고;
도 11은 예시적인 실시형태에 따른 페놀 레드에 대한 비색 변화를 도시한 것이며;
도 12는 예시적인 실시형태에 따른 종이 기반 분석에 사용되는 완충제를 도시한 것이고;
도 13a는 예시적인 실시형태에 따른 종이 LAMP 유효성 검증을 도시한 것이며;
도 13b도 예시적인 실시형태에 따른 종이 LAMP 유효성 검증을 도시한 것이고;
도 14a는 예시적인 실시형태에 따른 0분의 시점에서 종이 상의 낮은 주형 농도 LAMP를 도시한 것이며;
도 14b는 예시적인 실시형태에 따른 60분의 시점에서 종이 상의 낮은 주형 농도 LAMP를 도시한 것이고;
도 15는 예시적인 실시형태에 따른 열 불활성화된 SARS-CoV-2 바이러스로 처리되지 않은 전체 타액을 도시한 것이며;
도 16은 예시적인 실시형태에 따른 비색 및 형광 RT-LAMP 반응의 비교를 도시한 것이고;
도 17a는 예시적인 실시형태에 따른 LAMP 비색 지시약으로서 칼마자이트 (calmagite)의 사용을 도시한 것이며;
도 17b는 예시적인 실시형태에 따른 LAMP 지시약으로서 EBT의 사용을 도시한 것이고;
도 17c는 예시적인 실시형태에 따른 비색 리포터로서 EBT를 사용하는 크로마토그래피 종이 상의 LAMP를 도시한 것이며;
도 17d는 예시적인 실시형태에 따른 지시약으로서 EBT를 사용하는 다양한 종이 상의 LAMP의 비색 반응을 도시한 것이고;
도 17e는 예시적인 실시형태에 따른 비색 지시약으로서 EBT를 사용하는 바이오다인 A 양쪽성 종이 상의 LAMP 검출을 도시한 것이며;
도 17f는 예시적인 실시형태에 따른 LAMP 비색 반응에 대한 크리스탈 바이올렛 농도의 효과를 도시한 것이고;
도 17g는 예시적인 실시형태에 따른 종이에 다양한 농도의 크리스탈 바이올렛을 사용하는 비색 LAMP를 도시한 것이며;
도 17h는 예시적인 실시형태에 따른 RT-LAMP에 대한 비색 리포터로서 pH 지시자를 도시한 것이고;
도 17i는 예시적인 실시형태에 따른 LAMP 반응의 비색 반응에 대한 크레졸 레드 농도의 효과를 도시한 것이며;
도 17j는 예시적인 실시형태에 따른 RT-LAMP 반응의 비색 반응에 대한 다양한 pH 지시자의 농도 효과를 도시한 것이고;
도 17k는 예시적인 실시형태에 따른 pH 지시자를 사용하는 RT-LAMP 생성물의 겔 전기영동 스캔을 도시한 것이며;
도 17l은 예시적인 실시형태에 따른 페놀 레드를 사용한 RT-LAMP 비색 반응에 대한 초기 pH의 효과를 도시한 것이고;
도 18은 예시적인 실시형태에 따른 건조 공정의 색상 안정성을 도시한 것이며;
도 19a는 예시적인 실시형태에 따른 건조 공정 후에 종이의 초기 색상에 대한 단일 반응물 제거의 효과를 도시한 것이고;
도 19b는 예시적인 실시형태에 따른 RT-LAMP 비색 반응에 대한 트레할로오스 및 Tween 20의 효과를 도시한 것이다.
이제 도시된 예시적인 실시형태들에 대하여 설명할 것인데, 이들에 대해 설명하기 위해 특정 용어들이 본원에 사용될 것이다. 그렇지만, 이로써 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.
본 발명의 실시형태들에 대하여 설명하기 전에, 본 개시내용은 본원에 개시된 특정 구조, 공정 단계 또는 재료들에 국한되지 않고, 관련 기술 분야의 통상의 기술자가 인식하는 그의 균등물까지 확장되는 것으로 이해해야 한다. 또한, 본원에 사용되는 용어는 특정 실시예 또는 실시형태를 설명하기 위한 목적으로만 사용되는 것이지, 본 발명을 한정하려는 것이 아님도 이해해야 한다. 또한, 서로 다른 도면들에서 나타나는 동일한 참조 번호는 동일한 요소를 나타낸다. 흐름도 (flow chart)와 공정에 나와 있는 숫자들은 단계 및 작업들을 명확하게 보여주기 위해 제공되는 것이지, 반드시 특정 순서나 차례를 나타내는 것은 아니다.
또한, 설명된 특징, 구조, 또는 특성들은 하나 이상의 실시형태에서 임의의 적절한 방식으로 조합될 수도 있다. 하기의 설명에서, 다양한 발명 실시형태들의 완전한 이해를 제공하기 위해 구체적인 여러가지 세부사항들, 예컨대 조성물, 제형, 치료제 등을 제공한다. 그러나, 관련 기술 분야의 숙련자라면 누구나, 이러한 상세한 실시형태들이 본원에 설명된 전반적인 본 발명의 개념을 한정하는 것이 아니라 단지 이를 대표한다는 것을 이해할 것이다.
정의
본원에서, 단수 형태 ("a", "an" 및 "the")는 문맥상 명백하게 다른 언급이 없는 한, 복수의 지시대상물도 포함한다. 따라서, 예를 들어 "부형제"에 대한 언급은 하나 이상의 이러한 부형제들에 대한 언급도 포함하고, "담체"에 대한 언급은 하나 이상의 이러한 담체들에 대한 언급도 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "제형 (제제)" 및 "조성물"은 상호교환적으로 사용되며, 2종 이상의 화합물, 요소, 또는 분자들의 혼합물을 의미한다. 일부 양태에서, 용어 "제형 (제제)" 및 "조성물"은 하나 이상의 활성제와 담체 또는 다른 부형제들과의 혼합물을 지칭하는데 사용될 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "가용성"은 해당 물질 또는 제제의 주어진 용매에 용해되는 능력과 관련된 척도 또는 특성이다. 조성물의 특정 성분에서 어떤 물질이나 제제의 용해도는 명시된 온도, 예컨대 약 25℃ 또는 약 37℃에서 용해되어 육안으로 보기에 투명한 용액을 형성하는 해당 물질 또는 제제의 양을 지칭한다.
본원에 사용되는 용어 "친유성"은 물에 자유로이 용해되지 않는 화합물을 의미한다. 반대로, "친수성"이라는 용어는 물에 용해되는 화합물을 의미한다.
본원에 사용되는 "대상체"는 동물을 의미한다. 한 양태에서, 동물은 포유동물일 수 있다. 또 다른 양태에서, 포유동물은 인간일 수 있다.
본원에 개시된 조성물의 상태를 지칭하는데 사용되는 "비-액체"는 반고체 또는 고체인 조성물의 물리적 상태를 지칭한다.
본원에서 "고체" 및 "반고체"는 표준 온도와 압력에서 자체 중량을 지탱하여 자유로이 흐르지 않는 적절한 점도나 구조를 갖는 조성물의 물리적 상태를 가리킨다. 반고체 물질은 가해진 압력 하에서 용기의 모양에 합치될 수 있다.
본원에서 사용되는 "고체상 매질", "고체상 베이스", "고체상 기질", "고체상 시험 기질" 등은 비-액체 매질, 장치, 시스템 또는 환경을 가리킨다. 일부 양태에서, 비-액체 매질은 실질적으로 액체가 없거나 액체가 전혀 없을 수 있다. 한 예에서, 비-액체 매질은 다공성 물질 또는 다공성 표면을 갖는 물질이거나 이를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 비-액체 매질은 섬유질 물질 또는 섬유질 표면을 갖는 물질이거나 이를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 비-액체 매질은 종이일 수 있다.
본원에서 사용된 "변색 방지용 (non-discoloration) 첨가제"란, LAMP 반응의 뉴클레오타이드 증폭 이외의 이유로, 고체상 매질의 색상이 원래 또는 출발 색상에서 다른 색상으로 색상 변화가 일어나는 것을 최소화하거나 이를 방지하는 첨가제를 의미한다. 예를 들어, 한 실시형태에서, 이러한 색상 변화는 변색 방지용 첨가제가 존재하지 않을 때 발생하는 색상 변화에 비해 최소화되거나 감소될 수 있다.
본원에서 "비-LAMP 반응이 일으킨 변색"은 LAMP 반응의 뉴클레오타이드 증폭의 결과가 아닌 고체상 매질의 임의의 변색 (예컨대, 원래 색상에서 다른 색상으로의 색상 변화)을 의미한다. 일부 예에서, 비-LAMP 반응이 일으킨 변색은 휘발성 제제, 마그네슘 간섭성 제제, 산화제, LAMP 반응의 증폭 이외의 원인으로 인한 pH 변화, 건조, 또는 이들의 조합 중 하나 이상으로 초래된 고체상 매질의 변색을 의미할 수 있다.
본원에서 "휘발성 제제"는 증기압이 높거나 끓는점이 낮은 조성물을 포함하는 제제를 의미한다. 한 예로서, 황산암모늄은 암모니아가 휘발되어 황산을 남길 수 있기 때문에 휘발성 제제가 될 수 있다. 한 예로서, 조성물, 성분 또는 구성요소는 해당 조성물이 약 30℃ 이상의 온도에서 기체상으로 존재할 때 높은 증기압을 가질 수 있다. 한 예로서, 조성물이 약 80℃ 미만의 온도에서 기체상으로 형성될 때 해당 조성물은 낮은 끓는점을 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 "pH 간섭성 시약"은 LAMP 반응의 증폭 이외의 이유로 반응, 시스템 또는 환경의 pH에 영향을 미칠 수 있는 시약이다. 한 예로서, 암모늄 이온은 황산암모늄에서 휘발될 수 있고, 황산 이온은 반응하여 황산을 형성하여 LAMP 반응의 증폭 없이도 반응의 pH에 영향을 미칠 수 있다.
본 출원에서, "~을 포함하다 (comprise)", "~을 포함하는 (comprising)", "~을 함유하는 (containing)" 및 "~을 갖는 (having)" 등은 미국 특허법에서 부여된 의미를 가질 수 있으며, "~을 포함하다(include)", "~을 포함하는 (including)" 등을 의미할 수 있고, 일반적으로 개방형 용어 (open ended term)로 해석된다. "~로 이루어지는 (consisting of)" 또는 "~로 이루어지다 (consist of)"라는 용어는 배타적 용어 (closed term)로, 이러한 용어들과 함께 구체적으로 열거된 성분, 구조, 단계 등 뿐만 아니라, 미국 특허법에 따라 기재된 것들도 포함한다. "~로 필수적으로 이루어지는 (consisting essentially of)" 또는 "~로 필수적으로 이루어지다 (consists essentially of)"는 미국 특허법에 의해 일반적으로 부여된 의미를 갖는다. 특히, 상기 용어들은 일반적으로 배타적 용어이지만, 단 예외적으로, 이러한 용어와 함께 열거된 항목(들)의 기본적이고 새로운 특성이나 기능에 중대한 영향을 미치지 않는 추가 항목들, 재료들, 구성요소들, 단계들, 또는 요소들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물에 존재하지만 조성물의 성질 또는 특성에 영향을 미치지 않는 미량 원소들은, "~로 필수적으로 이루어지는"이라는 용어가 나와 있는 경우, 이러한 용어와 함께 열거된 항목들의 목록에 명시적으로 언급되어 있지 않더라도 허용될 수 있다. 명세서의 상세한 설명에서 "~를 포함하는 (comprising)" 또는 "~를 포함하는 (including)"과 같은 개방형 용어를 사용하는 경우, "~로 이루어지는"이라는 용어 뿐만 아니라 "~로 필수적으로 이루어지는"이라는 용어에도 명시적으로 언급된 것처럼 직접적인 뒷받침이 제공되는 것으로 이해하며, 그 반대도 마찬가지이다.
명세서 및 청구범위에서 "제1", "제2", "제3", 및 "제4" 등의 용어가 있는 경우에는, 이들은 유사한 구성요소들을 구별하기 위해 사용되는 것이지, 반드시 특정한 차례라든지 시간적 순서를 설명하려는 것은 아니다. 이렇게 사용된 용어들은 적절한 상황 하에서는 서로 교환될 수 있어, 본 명세서에 설명된 실시형태들이 예를 들어, 본원에 예시되거나 달리 설명된 것과는 다른 순서로 작동할 수 있음을 이해해야 한다. 이와 유사하게, 본원에서 어떤 방법이 일련의 단계들을 포함하는 것으로 기재되어 있는 경우에, 본원에 제시된 이러한 단계들의 순서는 반드시 이러한 단계들이 수행될 수 있는 유일한 순서는 아니며, 언급된 단계들 중 특정 단계가 생략될 수 있고/있거나 본원에 기재되어 있지 않은 다른 특정 단계들이 해당 방법에 추가될 수도 있다.
본원에 사용된 "증가된 (increased)", "감소된 (decreased)", "더 나은 (better)", "더 나쁜 (worse)", "더 높은 (higher)", "더 낮은 (lower)", "향상된 (enhanced)", "최대화된 (maximized)", "최소화된 (minimized)" 등과 같은 비교 용어들은, 주위 또는 인접 영역에 존재하거나, 단일 장치 또는 조성물에 또는 다수의 비교가능한 장치 또는 조성물에 존재하거나, 하나의 그룹 또는 클래스에 존재하거나, 다수의 그룹 또는 클래스들에 존재하는 다른 장치, 구성요소, 조성물 또는 활성과는 측정가능한 정도로 다른 장치, 구성요소, 조성물 또는 활성의 속성을 가리키거나, 또는 공지된 최신 기술에 비해 측정가능한 정도로 다른 장치, 구성요소, 조성물 또는 활성의 속성을 지칭하는 말이다.
본원에서 "결합된"이라는 용어는 화학적, 기계적, 전기적 또는 비전기적 방식으로 직접 또는 간접적으로 연결된 것으로 정의된다. 본원에서 서로 "인접한" 것으로 기술된 물체들은 해당 어구가 사용되는 문맥상 적절하게, 서로 물리적으로 접촉하고 있거나, 서로 매우 근접하여 있거나, 서로 동일한 공통 영역 또는 부위에 존재하고 있을 수 있다. 본원에서 "한 실시형태에서" 또는 "한 양태에서"라는 어구의 출현이 반드시 모두 동일한 실시형태나 양태를 말하는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "실질적으로"는 작용, 특성, 속성, 상태, 구조, 항목, 또는 결과의 완전하거나 거의 완전한 정도 또는 수준을 의미한다. 예를 들어 "실질적으로" 둘러싸여 있는 물체라고 하면, 해당 물체가 완전히 둘러싸여 있거나 거의 완전히 둘러싸여 있음을 의미할 것이다. 경우에 따라서는, 절대적 완전성에서 허용가능한 정확한 편차의 수준은 특정 상황에 따라 달라질 수도 있다. 그러나, 일반적으로 거의 완성이라고 말하면, 마치 절대적이고 완전한 완성을 얻은 것과 동일한 전체적인 결과를 얻도록 하는 것이다. "실질적으로"의 사용은 작용, 특성, 속성, 상태, 구조, 항목, 또는 결과의 완전하거나 거의 완전한 결핍을 나타내는 부정적인 의미로 사용될 때도 동일하게 적용될 수 있다. 예를 들어, 입자들이 "실질적으로 없는" 조성물은 입자들이 완전히 없거나, 또는 입자들이 거의 없어서 그 효과가 입자들이 완전히 없는 것과 동일한 것이다. 다시 말해서, 성분 또는 구성요소가 "실질적으로 없는" 조성물은, 그의 측정가능한 효과가 없는 한, 사실상 이러한 항목을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "약"은 주어진 값이 해당 끝점을 "약간 상회"하거나 "약간 하회"할 수 있는 단서를 제공하여, 해당 끝점의 수치 범위에 유연성을 제공하기 위해 사용된다. 달리 언급하지 않는 한, 특정 숫자 또는 수치 범위에 따른 용어 "약"의 사용은 해당 용어 "약"이 없더라도 이러한 수치 용어 또는 범위에 대한 뒷받침을 제공하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 편리함과 간결성의 관점에서, "약 50 옹스트롬 내지 약 80 옹스트롬"의 수치 범위는 "50 옹스트롬 내지 80 옹스트롬"의 범위에 대한 뒷받침을 제공하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 명세서에서 "약"이라는 용어가 함께 사용되는 경우에도 실제 수치에 대한 뒷받침이 제공되는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, "약" 30에 대한 언급은 30을 약간 상회하고 약간 하회하는 값에 대한 뒷받침을 제공할 뿐만 아니라 실제 수치인 30에 대한 뒷받침도 제공하는 것으로 해석되어야 한다.
본원에서, 복수의 항목, 구조적 요소, 조성적 성분 및/또는 재료들은 편의상 공통의 목록에 제공될 수 있다. 그러나, 이러한 목록은 해당 목록의 각 구성원이 별도의 고유한 구성원으로서 개별적으로 식별되는 것처럼 해석되어야 한다. 따라서, 이러한 목록의 각 구성원은, 다른 설명이 없다면, 공통의 그룹에 나타나 있다는 것만으로 동일한 목록의 다른 임의의 구성원과 실질적으로 동등한 것으로 해석되어서는 안 된다.
농도, 양, 수준 및 기타 수치 데이터는 본원에서 범위 형식으로 표현되거나 제공될 수 있다. 이러한 범위 형식은, 단지 편리함과 간결성을 위해 사용되는 것이기 때문에, 해당 범위의 한계로 명시적으로 언급된 수치 값들을 포함할 뿐만 아니라 해당 범위 내에 포함된 모든 개별 수치 값들 또는 하위범위들을, 마치 상기 각 수치 값과 하위범위들이 명시적으로 언급되어 있는 것처럼 포함하도록 유연하게 해석되어야 함을 이해해야 한다. 실례로서, "약 1 내지 약 5"의 수치 범위는 명시적으로 언급된 약 1 내지 약 5의 값들을 포함할 뿐만 아니라, 나타낸 범위 내의 개별 값들과 하위범위들도 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 이 수치 범위에는 2, 3, 및 4와 같은 개별 값들과 1-3, 2-4, 및 3-5 등과 같은 하위범위들 뿐만 아니라, 1, 2, 3, 4 및 5도 각각 포함된다. 이러한 원칙은 최소값 또는 최대값으로 단 하나의 수치 값만을 언급하는 범위에도 동일하게 적용된다. 또한, 이러한 해석은 기재되는 범위의 폭이나 특징과는 무관하게 적용되어야 한다.
본 명세서 전반에 걸쳐 "한 예 (an example)"에 대한 언급은, 해당 예와 관련하여 설명된 구체적인 특징, 구조, 또는 특성이 적어도 하나의 실시형태에 포함되어 있음을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전반의 다양한 곳에서 "한 예로서"라는 어구의 출현이 반드시 모두 동일한 실시형태를 지칭하는 것은 아니다.
실시형태
병원체 (예: COVID-19를 유발하는 바이러스인 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2))에 대한 여러가지 분자 시험들은 실험실에만 국한될 것이기에, 어떤 결과를 제공하기까지 상당히 시간이 지연되어 (>24시간), 이들의 현장 진료 환경에서의 채택은 방해를 받게 된다. SARS-CoV-2에 대한 현장 진단 검사를 개발하려는 여러가지 시도에도 불구하고, 다음과 같은 몇 가지 제약이 남아있다: i) 확장성 (검사에 대한 수요는 주당 수백만 건 정도인데, 해당 규모로 새로운 검사를 만드는 것은 어려움), ii) 샘플 처리 (여전히 많은 검사에서 타액을 사용할 때 추출 작업을 사용함), 및 iii) 판독 가능도 (분자 시험은 형광을 사용하는 경우가 많으므로, 형광 판독기를 사용하여 결과를 기록함).
현재의 검사 방법은, 희석된 타액 (예: 물중에 5% v/v)을 샘플로 사용하여 병원체 (예: SARS-CoV-2)가 존재하면 60분 이내에 색상 변화를 나타내는 역전사 루프 매개형 등온 증폭 (RT-LAMP)과 종이 기반 장치를 이용하는 현장 진료 검사를 통해 극복될 수 있다. RT-LAMP는 특히 감염의 급성기 동안에 적절한 진단 성능으로 일정한 온도에서 수행되는 핵산 증폭 기술이다. RT-LAMP는 일정한 온도에서 전도될 수 있기 때문에, 고가의 열 순환 장비가 사용되지 않는다. 또한, 기존의 LAMP 생성물용 비색 리포터는 형광 판독기를 사용하지 않는다. 결과적으로, 이 검사는 현장 진료 환경에서 사용하기에 적절하고 신속한 개발과 확장이 가능하여, 공중 보건 응급 상황에서 사용하기에 적합하다.
RT-LAMP는 다양한 병원체 (예: SARS-CoV-2)를 감지하는 미세유체 종이 기반 분석 장치 (μPAD) 상에서 구현될 수 있는데, 이때 휴대용 전자 장치를 통해 이미지 분석을 수행하여 양성 반응과 음성 반응을 구별할 수 있다. 한 예로서, 종이 상의 고-대비 RT-LAMP 반응은 육안으로 볼 수 있는 색상 변화를 제공할 수 있다. 또한, 인쇄 영역을 정확하게 정렬하여 시약을 분배하는 왁스 프린팅을 사용하는 대신에, 폴리스티렌 스페이서를 사용하여 샘플들 간의 크로스토크 (crosstalk)를 방지할 수 있다. 폴리스티렌 스페이서는 생산 규모 확대를 위해 롤-투-롤 (roll-to-roll) 제조가 가능할 수 있다.
핵산 기반의 COVID-19 진단 방법은 전처리를 통해 결과를 제공한다. 본원에 개시된 바와 같이, SARS-CoV-2의 종이 상의 비색 검출은 최소한의 전처리로 수행될 수 있다. 이 장치는 사전 증폭 없이도 종이 상에서 SARS-CoV-2를 감지할 수 있는 감도와 특이성을 가질 수 있다. 용액 중에서 수행되는 다른 분석들은 종이 기반 분석만큼 제조 공정 중에 확장이 불가할 수 있다. 또한, 본원에 개시된 분석법은 수초 만에 완료될 수 있는 희석 작업을 사용하는 반면에, 다른 분석법들은 SARS-CoV-2를 검출하기 위해 프로테아제 처리, 열 불활성화 및/또는 RNA 추출과 같은 다양한 작업을 활용한다 (작업은 적어도 10분 안에 추가의 장비를 사용하여 완료됨).
LAMP 분석을 위한 샘플 수집과 특성
타액은 LAMP 반응과 관련하여 어려움을 초래할 수 있는 다양한 물리적, 화학적 및 항균 특성을 가지고 있다. 예를 들어, 한 물리적 특성으로, 타액은 LAMP 반응을 방해할 수 있는 치석으로부터 유기산을 희석 및 제거할 수 있다. 일부 화학적 특성 (pH 변화를 최소화하는 전해질 및 완충 분자)도 LAMP 반응을 방해할 수 있다. 뮤신, 아밀라아제, 라이소자임 및 퍼옥시다아제 효소와 같은 타액 중의 항균제도 문제를 야기한다. 예를 들어, 퍼옥시다제 효소는 박테리아 세포에서 자유 라디칼 화합물을 형성하여 상기 세포들의 아폽토시스와 유사한 사멸을 초래할 수도 있다. 그러나, 이러한 반응은 LAMP 반응을 복잡하게 만들 수 있는 불안정한 산화환원 환경을 제공할 수도 있다.
상술한 배경을 염두에 두고, 도 1의 흐름도에 도시된 바와 같이, 병원체 표적의 루프 매개형 등온 증폭 (LAMP) 검출을 위한 타액 샘플을 준비하는 방법 (100)이 제공된다. 검사 결과, 예를 들어, 광학적으로 감지된 pH 기반의 색상 변화를 나타내기 위해 선택된 최종 신호 출력에 따라, 샘플 중의 타액이 전체 샘플 pH를 중성에서 크게 벗어나지 않도록 하는 것이 바람직할 수 있다. 샘플 중 타액의 완충능 또는 영향을 확인하거나 그렇지 않으면 이를 제한하기 위해 다양한 기술과 공정을 수행할 수 있다. 과량의 완충능은 pH 기반 색상 변화를 감지하는데 사용되는 pH의 변동을 방지할 수 있다.
타액의 완충능을 감소시키는 한 가지 방법으로는 희석을 포함할 수 있다. 한 실시형태에서, 이러한 방법은 검사 대상체로부터 소정량의 타액을 제공하는 단계 (블록 110으로 나타냄), 및 병원체 표적의 검출이 가능하게 충분한 농도를 유지하면서 타액의 완충능을 감소시키는 정도로 상기 타액을 물에 희석하는 단계 (블록 120으로 나타냄)를 포함할 수 있다.
타액 중에 존재하는 단백질은 또 다른 문제를 제공한다. 예를 들어, 점성이 과도한 샘플은 고체 기반 또는 고체상 매질에서 검사하기 어려울 수 있다. 고체 기반 매질의 느린 유속은 반응 시간을 증가시키고, 퍼짐의 균일성을 감소시키며, 결과의 변동성을 증가시키고, 결과의 무효성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 점성 형태의 타액이 고체 기반 매질 전체에 고르게 퍼지지 않는다면, 색상 기반의 표시를 판독하기 어려울 수 있다. 균일한 퍼짐이 감소하는 것도 결과 판독에 불확실성을 부가하여 결과의 변동성을 증가시킬 수 있다. 기술자마다 결과를 다르게 해석할 수도 있다. 경우에 따라서는, 색상 변화가 모호하거나 없기 때문에 결과를 판독하기가 불가능할 수도 있다. 따라서, 타액의 점도를 조절하면, 발생할 수 있는 다양한 문제들을 방지할 수 있다.
따라서, 또 다른 실시형태에서, 본 방법은 원래의 점도와 비교하였을 때 타액의 점도를 감소시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 한 양태에서, 타액의 점도는 희석, 여과 등, 또는 이들의 조합 중 하나 이상에 의해 감소될 수 있다. 한 양태에서, 타액의 점도가 희석을 사용하여 감소되는 경우, 타액은 약 1:1 내지 약 1:20의 타액 대 물의 비율로 물에 희석될 수 있다. 또 다른 양태에서, 타액의 점도는 약 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:10, 1:12, 1:14, 1:16, 1:18 또는 1:20의 타액 대 물의 비율로 물에 희석될 수 있다. 한 양태에서, 타액은 샘플 중에 약 0.2 미만의 600 nm에서의 광학 밀도 (OD600)를 제공하는 정도로 물에 희석될 수 있다. 한 양태에서, 타액은 약 50 ㎕ 내지 약 100 ㎕의 부피 범위를 가질 수 있다. 또 다른 양태에서, 타액 샘플은 약 100 ㎕ 내지 약 1 ㎖ 범위의 부피를 가질 수 있다.
경우에 따라서는, 타액 샘플을 희석하면, 타액의 완충능과 점도에서 발생하는 효과의 영향을 감소시킬 수 있다. 타액 점도의 영향을 감소시키는 또 다른 방법으로는 여과를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 점도는 약 2 마이크론 내지 50 마이크론 등급을 갖는 필터를 사용하여 감소될 수 있다. 한 예로서, 필터 등급은 2 마이크론, 5 마이크론, 8 마이크론, 10 마이크론, 15 마이크론, 20 마이크론, 25 마이크론, 40 마이크론 또는 50 마이크론 중 하나 이상일 수 있다. 한 양태에서, 필터 등급은 해당 필터가 특정 입자 크기의 적어도 약 98.7%를 제거할 수 있는 절대 마이크론 등급일 수 있다. 희석만 하는 것보다는 타액을 여과하면, LAMP 반응을 방해할 수 있는 타액 단백질 (예: 뮤신, 아밀라아제, 라이소자임 및 퍼옥시다아제 효소)도 제거할 수 있다.
희석, 여과 또는 양자 모두의 조합을 통해, 점도를 특정 범위 내에 있도록 제어할 수 있다. 또 다른 양태에서, 점도는 원래 점도와 비교하였을 때 고체상 매질을 통해 유동성을 증가시키는 정도로 감소될 수 있다. 한 예로서, 타액의 점도는 희석 또는 여과 전에 약 1 센티푸아즈 (cP) 내지 약 100 cP의 범위를 가질 수 있다. 한 예로서, 타액의 점도는 희석 또는 여과 후에 약 1.0 cP 내지 약 50 cP 범위로 감소될 수 있다. 또 다른 예로서, 타액의 점도는 희석 또는 여과 후에 약 1.0 cP 내지 약 10 cP 범위로 감소될 수 있다.
타액을 여과하면, pH 범위를 원하는 수준으로 조정할 수도 있다. 예를 들어, 일부 pH 지시약은 특정 pH 범위 (예: 7.2 내지 약 8.6) 내에서 색상 변화를 나타낼 수 있다. 따라서, 사용하는 pH 지시약의 종류에 따라 타액을 검사 샘플의 대상 범위로 여과할 수 있다. 그러나, 검사 샘플 대상 범위를 생리학적 조건 내로 유지하면, LAMP 반응 결과의 균일성을 높일 수 있다. 한 양태에서, 타액을 여과하여 타액 샘플 pH를 검사 샘플 대상 범위로 조정할 수 있다. 한 예로서, 검사 샘플 대상 범위는 약 7.2 내지 약 8.6의 pH 범위를 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, 검사 샘플 대상 범위는 약 7.6 내지 약 8.2의 pH 범위를 포함할 수 있다.
검사 샘플 대상 범위를 원하는 수준으로 조정하는 것은 LAMP 반응에서 pH 변화 (또는 다른 비색 표시)를 감지하는데 충분치 않을 수 있다. 또 다른 예로서, 타액은 pH 표시가 검출될 수 있도록 물로 희석하기 전의 완충능에 비해 해당 조성물의 완충능이 감소되는 정도로 물로 희석될 수 있다. 한 예로서, 완충능은 산 또는 염기가 첨가될 때 pH 변화에 저항하는 용액 (예: 타액, 물 또는 물로 희석된 타액)의 능력으로 정의될 수 있다. 한 예로서, 완충능은 pH를 한 단위 변경하기 위해 용액 1리터에 첨가되어야 하는 강산 또는 강염기의 양 (그램 당량)으로 정의될 수 있다. 한 양태에서, 타액의 완충능은 물로 희석하기 전에 0.03 mg/㎖ 내지 약 0.30 mg/㎖ 일 수 있고, 타액 희석수 (saliva diluted water)의 완충능은 물로 희석한 후에 약 0.003 mg/㎖ 내지 약 0.03 mg/㎖ 일 수 있다. 또 다른 예로서, 타액 희석수의 완충능은 약 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM 또는 1 mM 미만일 수 있다.
샘플을 희석하는 데 사용되는 물에는 LAMP 반응을 방해할 수 있는 오염 물질이나 특성이 없어야 한다. 예를 들어, 너무 산성인 pH는, 해당 pH가 pH 기반의 표시 변화를 방해하는 경우, LAMP 반응이 감지되는 것을 방해할 수 있다. 한 양태에서, 타액은 물에 희석될 수 있으며, 이때 물은 약 6.0 초과의 pH를 가질 수 있다. 또 다른 양태에서, 물은 약 8.0 미만의 pH를 가질 수 있다. 한 예에서, 물은 RNase 및 DNase와 같은 오염 물질이 실질적으로 없는 분자 등급의 물일 수 있다. RNase는 검출하고자 하는 타액 중의 RNA를 분해할 수 있으며, DNase는 LAMP 반응 중에 형성된 DNA를 분해할 수 있다. 또 다른 예로서, 타액 샘플은 필수적으로 타액과 물로 이루어질 수 있다.
바람직하지 않은 타액 단백질의 존재를 최소화하는 것은 특정한 타액 수집 방법을 사용하여 달성할 수 있다. 한 양태에서, 타액은 스폰지를 기반으로 한 수집 방법 또는 수동식 침 수집 방법 중 하나 이상을 사용하여 수집할 수 있다. 스폰지를 기반으로 한 수집 방법을 사용하여 타액을 수집하면, 해당 타액의 뮤신과 고분자량의 단백질은 스펀지에 흡수되지 않기 때문에 본질적으로 타액으로부터 뮤신과 고분자량의 단백질을 여과하는 이점을 제공할 수 있어서, 이로써 고체 기반 매질 상에서 사용하는 경우에 타액의 점도를 감소시키고 타액의 신속성, 균일성 및 신뢰성을 높일 수 있다. 타액을 침을 흘리는 방법을 사용하여 수집하는 경우에, 여과되지 않은 타액은 더 큰 점성을 가질 수 있으므로, 고체 기반 매질에서 흡수와 분포가 감소할 수 있다. 그 결과, 타액을 침을 흘리는 방법을 사용하여 수집하는 일부 실시형태에서, 타액을 후속적으로 여과시켜 점액과 기타 잔해물들을 제거하여 점도를 감소시킬 수 있다.
선택된 병원체 표적은 타액으로부터 검출될 수 있다. 한 양태에서, 병원체 표적은 바이러스 병원체, 박테리아 병원체, 진균 병원체, 원생동물 병원체 등, 또는 이들의 조합 중 하나 이상일 수 있다. 타액 중의 병원체 표적은 해당 병원체 표적의 핵산이 세포벽, 세포막, 단백질 코트 등에서 방출될 수 있을 때 검출될 수 있다.
보다 구체적으로, 한 양태에서, 병원체 표적은 바이러스 표적일 수 있다. 일부 양태에서, 바이러스 표적은 H1N1, H2N2, H3N2, H1N1pdm09, 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 1 (SARS-CoV-1), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2), 중동 호흡기 증후군 (MERS), 인플루엔자 등 또는 이들의 조합일 수 있다.
바이러스 표적은 다수의 서로 다른 바이러스 종들로부터 선택될 수 있다. 한 예로서, 바이러스 표적은 인간 코로나바이러스 229E, 인간 코로나바이러스 OC43, 인간 코로나바이러스 HKU1, 인간 코로나바이러스 NL63, MERS-코로나바이러스, 인간 레스피로바이러스 1, 인간 루불라바이러스 2, 인간 레스피로바이러스 3, 인간 루불라바이러스 4, 인간 엔테로바이러스, 인간 호흡기 바이러스, 라이노바이러스 A, 라이노바이러스 B, 라이노바이러스 C, 또는 이들의 조합일 수 있다.
바이러스 표적은 인플루엔자의 한 형태일 수도 있다. 한 양태에서, 인플루엔자는 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 인플루엔자 C 또는 인플루엔자 D 중 임의의 인플루엔자일 수 있다. 한 양태에서, 바이러스 표적은 니도바이러스 목에서 선택된 바이러스일 수 있다. 한 양태에서, 바이러스 표적은 니도바이러스 목의 알파, 베타, 감마 또는 델타 속으로부터 선택될 수 있다.
탐지할 수 있는 다양한 과의 바이러스가 존재한다. 한 양태에서, 바이러스 표적은 하기를 포함하는 과의 그룹으로부터 선택된 DNA 바이러스일 수 있다: 아데노바이러스과 (Adenoviridae), 파포바바이러스과 (Papovaviridae), 파르보바이러스과 (Parvoviridae), 헤르페스바이러스과 (Herpesviridae), 폭스바이러스과 (Poxviridae), 아넬로바이러스과 (Anelloviridae), 플레이리포바이러스과 (Pleolipoviridae) 등 및 이들의 조합. 또 다른 양태에서, 바이러스 표적은 하기를 포함하는 과의 그룹으로부터 선택되는 RNA 바이러스일 수 있다: 레오바이러스과 (Reoviridae), 피코르나바이러스과 (Picornaviridae), 칼리시바이러스과 (Caliciviridae), 토가바이러스과 (Togaviridae), 아레나바이러스과 (Arenaviridae), 플라비바이러스과 (Flaviviridae), 오르토믹소바이러스과 (Orthomyxoviridae), 파라믹소바이러스과 (Paramyxoviridae), 버냐바이러스과 (Bunyaviridae), 랍도바이러스과 (Rhabdoviridae), 필로바이러스과 (Filoviridae), 코로나바이러스과 (Coronaviridae), 아스트로바이러스과 (Astroviridae), 보르나바이러스과 (Bornaviridae) 등 및 이들의 조합. 또 다른 양태에서, 바이러스 표적은 하기를 포함하는 과의 그룹으로부터 선택된 역전사 바이러스일 수 있다: 레트로바이러스과, 카울리모바이러스과, 헤파드나바이러스과 등 및 이들의 조합.
보다 일반적으로, 바이러스 표적은 볼티모어 분류에 의해 분류된 바이러스일 수 있다. 한 양태에서, 바이러스 표적은 RNA 바이러스 (예를 들어, 인플루엔자 A, 지카, C형 간염)일 수 있다. 한 양태에서, 바이러스 표적은 DNA 바이러스 (예를 들어, 엡스타인 바, 천연두)일 수 있다. 한 양태에서, 바이러스 표적은 양성 센스 RNA 바이러스 (예를 들어, A형 간염, 풍진)일 수 있다. 한 양태에서, 바이러스 표적은 음성 센스 RNA 바이러스 (예를 들어, 에볼라, 홍역, 볼거리)일 수 있다. 또 다른 양태에서, 바이러스 표적은 dsDNA 바이러스 (예: 수두, 헤르페스), ssDNA 바이러스, dsRNA 바이러스 (예: 로타바이러스), 양성 가닥 ssRNA 바이러스, 음성 가닥 ssRNA 바이러스, ssRNA-RT 바이러스 (예: 레트로바이러스) 또는 ds-DNA-RT 바이러스 (예: B형 간염)일 수 있다.
바이러스 표적 이외에, 또 다른 양태에서, 병원체 표적은 박테리아 표적일 수도 있다. 일부 예에서, 박테리아 표적은 다음을 포함하는 속으로부터 선택될 수 있다: 바실러스, 바르토넬라, 보르데텔라, 보렐리아, 브루셀라, 캄필로박터, 클라미디아 (Chlamydia), 클라미도필라 (Chlamydophila), 클로스트리디움 (Clostridium), 코리네박테리움, 엔테로코커스, 에쉐리키아, 프란시셀라 (Francisella), 헤모필루스, 헬리코박터, 레지오넬라, 렙토스피라 (Leptospira), 리스테리아, 마이코박테리움, 마이코플라즈마, 나이세리아 (Neisseria), 슈도모나스, 리케치아 (Rickettsia), 살모넬라, 시겔라 (Shigella), 스타필로코커스, 스트렙토코커스, 트레포네마 (Treponema), 유레아플라즈마 (Ureaplasma), 비브리오, 예르시니아 (Yersinia) 등 및 이들의 조합. 또 다른 예에서, 박테리아 표적은 다음을 포함하는 종으로부터 선택될 수 있다: 악티노마이세스 이스라엘리 (Actinomyces israelii), 바실루스 안트라시스 (Bacillus anthracis), 보르데텔라 페르투시스 (Bordetella pertussis), B. 아보르투스 (abortus), B. 캐니스 (canis), B. 멜리텐시스 (melitensis), B. 수이스 (suis), 코리네박테리움 디프테리아에, 이. 콜라이, 장독소성 이. 콜라이, 장병원성 이. 콜라이, 장침습성 이. 콜라이, 헤모필루스 인플루엔자, 헬리코박터 파일로리, 클렙시엘라 뉴모니아에 (Klebsiella pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라, M. 투버컬로시스, 마이코플라즈마 뉴모니아, N. 메닝기티디스 (meningitidis), S. 티피 (typhi), S. 손네이 (sonnei), S. 디센테리아에 (dysenteriae), 스트렙토코커스 뉴모니아에, 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 비리단스, 비브리오 콜레라에, 에르시니아 페스티스 등 및 이들의 조합. 또 다른 양태에서, 병원체 표적은 다음을 포함하는 종으로부터 선택될 수 있다: 클라미디아 뉴모니아에 (Chlamydia pneumoniae), 뉴모시스티스 지로베시이 (Pneumocystis jirovecii), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코커스 에피더미스 (Staphylococcus epidermis), 스트렙토코커스 살리바리우스 (Streptococcus salivarius) 등 및 이들의 조합.
병원체 표적은 다양한 유형의 진균류도 포함할 수 있다. 한 양태에서, 병원체 표적은 진균 표적일 수 있다. 일부 예에서, 진균 표적은 다음을 포함하는 속에서 선택될 수 있다: 아스페르길루스 (Aspergillus), 히스토플라스마 (Histoplasma), 뉴모시스티스 (Stachybotrys), 스타치보트리스 (Stachybotrys) 등 및 이들의 조합. 또 다른 양태에서, 병원체 표적은 원생생물 표적일 수 있다. 일부 예에서, 원생생물 표적은 플라스모디움 (plasmodium), 트리파노좀 (trypanosomes) 등 및 이들의 조합을 포함하는 속으로부터 선택될 수 있다.
타액 중의 병원체 표적이 RNA를 포함하는 경우, RNA는 역전사될 수 있다. 따라서, 또 다른 양태에서, LAMP 검출은 역전사 LAMP (RT-LAMP)일 수 있다. 이러한 예에서, cDNA는 역전사 효소를 사용하여 표적 RNA에서 생성될 수 있다. cDNA는 검출가능한 양으로 증폭될 수 있다. 병원체 표적이 DNA로부터 직접 검출될 수 있는 경우라면, RNA를 DNA로 역전사하지 않고도 LAMP를 사용하여 검출가능한 양으로 DNA를 증폭할 수 있다.
또 다른 양태에서, 검출될 특정 표적 뉴클레오타이드 서열은 인간 바이오마커에 상응하는 표적 뉴클레오타이드일 수 있다. 어떤 질병에 대한 인간 바이오마커에 해당하는 표적 뉴클레오타이드를 갖는 임의의 질병은 감지될 수 있다. 유방암, 췌장암, 결장직장암, 난소암, 위장관암, 자궁경부암, 폐암, 방광암, 여러 유형의 암종, 침샘암, 신장암, 간암, 림프종, 백혈병, 흑색종, 전립선암, 갑상선암, 위암 등, 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 비롯한 다양한 유형의 질병을 감지할 수 있다. 예를 들어, 다양한 유형의 질병에 대한 바이오마커는 하기 중 하나 이상에 해당하는 표적 뉴클레오타이드를 감지함으로써 검출될 수 있다: 알파 태아단백질, CA15-3 및 CA27-29, CA19-9, C1-125, 칼시토닌, 칼레티닌, 암배아 항원, CD34, CD99MIC 2, CD117, 크로모그라닌, 염색체 3, 7, 17 및 9p21, 시토케라틴, 세스민, 상피막 항원, 인자 VIII, CD31 FL1, 신경 교섬유질 산성 단백질, 총 낭포성 질환 유체 단백질 (gross cystic disease fluid protein), hPG80, HMB-45, 인간 융모성 생식선 자극호르몬, 면역글로불린, 인히빈, 케라틴, 림프구 마커, MART-1, Myo D1, 근육 특이적 액틴, 신경필라멘트, 신경 특이적 에놀라제, 태반 알칼리성 포스파타아제, 전립선 특이적 항원, PTPRC, S100 단백질, 평활근 작용, 시냅토피신, 티미딘 키나제, 티로글로불린, 갑상선 전사 인자-1, 종양 M2-PK, 비멘틴 등 또는 이들의 조합.
또 다른 실시형태에서, 루프 매개형 등온 증폭 (LAMP) 분석을 위한 검사 샘플 조성물은, 타액의 완충능을 감소시키는 양의 물과 함께, LAMP 분석을 통해 병원체 표적을 검출하기에 충분한 양의 검사 대상체의 타액을 포함할 수 있다. 한 양태에서, 조성물의 점도는 약 1.0 cP 내지 약 50 cP일 수 있다. 또 다른 양태에서, 조성물의 pH는 약 7.2 내지 약 8.6일 수 있다. 이러한 각 범위 내에서 점도와 pH를 선택하면 pH에서의 변화 및 이에 따른 pH 기반 지시약으로 인한 색상 변화가 향상될 수 있다.
타액을 물로 희석하여 상기 열거한 범위 내에서 점도와 pH를 조정할 수 있다. 한 양태에서, 타액은 약 1:1 내지 약 1:20의 타액 대 물의 비율로 소정량의 물과 혼합될 수 있다. 또 다른 양태에서, 타액 대 물의 비율은 약 1:1, 1:2, 1:4, 1:6, 1:8, 1:10, 1:12, 1:14, 1:16, 1:18 또는 1:20일 수 있다. 또 다른 양태에서, 타액은 해당 샘플에 0.2 미만의 600 nm에서의 광학 밀도 (OD600)를 제공하는 정도로 소정량의 물과 혼합될 수 있다.
타액의 양에 검출가능한 양의 바이러스가 포함되도록 하기 위해, 수집된 타액의 양은 임계량보다 높게할 수 있다. 한 양태에서, 타액은 약 50 ㎕ 내지 약 100 ㎕의 부피 범위를 가질 수 있다. 또 다른 양태에서, 타액 샘플은 약 100 ㎕ 내지 약 1 ㎖ 범위의 부피를 가질 수 있다.
또한, 타액은 LAMP 반응을 촉진할 수 있는 다양한 화학적 특성 (예: pH 및 완충능)을 가질 수도 있다. 한 양태에서, 물은 약 6.0 초과의 pH를 가질 수 있고, RNase 및 DNase와 같은 오염 물질이 실질적으로 없을 수 있다. 다른 양태에서, 물은 약 8.0 미만의 pH를 가질 수 있고 실질적으로 오염 물질이 없을 수 있다. 또 다른 양태에서, 조성물은 필수적으로 타액과 물로 이루어질 수 있다. 한 양태에서, 조성물의 완충능은 약 0.003 mg/㎖ 내지 약 0.03 mg/㎖ 일 수 있다. 또 다른 예에서, 조성물의 완충능은 약 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM 또는 1 mM 미만일 수 있다.
앞서 개시한 바와 같이, 병원체 표적은 바이러스 병원체, 박테리아 병원체, 진균 병원체 또는 원생동물 병원체를 포함할 수 있다. 병원체 표적은 바이러스 표적일 수 있다. 바이러스의 볼티모어 분류에 기초하면, 바이러스 표적은 dsDNA 바이러스, ssDNA 바이러스, dsRNA 바이러스, 양성 가닥 ssRNA 바이러스, 음성 가닥 ssRNA 바이러스, ssRNA-RT 바이러스 또는 ds-DNA-RT 바이러스를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 바이러스 표적은 H1N1, H2N2, H3N2, H1N1pdm09 또는 SARS-CoV-2를 포함할 수 있다.
시약 조성물
설계된 시스템의 시험 매질, 판독 유형 및 전반적인 환경에 따라 다양한 시약들을 LAMP 분석에 사용할 수 있다. 또한, 검출하고자 하는 특정 표적 뉴클레오타이드 서열, 확인하고자 하는 유기체 등을 고려하여 프라이머 및 효소와 같은 반응 성분들을 선택할 수도 있다. 나아가, 액체 환경, 무수 환경, 하우징, 기질 등과 같은 검사 환경의 특성들은 물론이고, LAMP 분석의 기초가 되는 반응에 수반될 특정 시약들을 선택하는 경우에 보관과 같은 안정성에 대한 기타 필요 사항들도 고려할 수 있다.
한 실시형태에서, 고체상 매질 상의 루프 매개형 등온 증폭 (LAMP) 분석을 위한 조성물은 하나 이상의 표적 프라이머, DNA 중합효소 및 재가용화제를 포함할 수 있다. 한 양태에서, 상기 조성물은 고체상 매질을 변색시킬 수 있는 pH에 민감하지 않은 제제 (non-pH sensitive agent)들이 실질적으로 없을 수 있다.
고체상 매질에서 LAMP 분석을 수행하는 경우, 액체상 매질에서 LAMP 분석을 수행할 때에 비해서 시약의 농도를 증가시킬 수 있다. 한 양태에서, 고체상 매질에서 사용될 때 DNA 중합효소의 농도는 액체 매질에서 사용될 때의 DNA 중합효소 농도의 적어도 2배일 수 있다. 또 다른 양태에서, 고체상 매질에서 사용될 때 DNA 중합효소의 농도는 액체 매질에서 사용될 때의 DNA 중합효소 농도의 적어도 3배일 수 있다. 한 예로서, DNA 중합효소의 농도는 고체상 매질에서 사용될 때 약 300 U/㎖ 내지 약 1000 U/mL일 수 있다. 또 다른 예로서, DNA 중합효소의 농도는 고체상 매질에서 사용될 때 약 600 U/mL 내지 약 1000 U/mL일 수 있다. 또 다른 예에서, DNA 중합효소의 농도는 고체상 매질에서 사용될 때 약 620 U/mL 내지 약 680 U/mL일 수 있다.
LAMP 분석이 역전사효소 LAMP (RT-LAMP)를 수반하는 경우, 조성물은 역전사효소를 추가로 포함할 수 있다. 역전사효소는 RNA 기반 바이러스의 검출을 도울 수 있다. 한 양태에서, 고체상 매질에서 사용될 때의 역전사효소의 농도는 액체 매질과 함께 사용될 때의 역전사효소 농도의 적어도 2배일 수 있다. 또 다른 양태에서, 역전사효소의 농도는 액체 매질과 함께 사용될 때의 역전사효소 농도의 적어도 3배일 수 있다. 한 예로서, 역전사효소의 농도는 고체상 매질에서 사용될 때 약 200 U/mL 내지 약 600 U/mL일 수 있다. 또 다른 예에서, 역전사효소의 농도는 고체상 매질에서 사용될 때 약 250 U/mL 내지 약 500 U/mL일 수 있다. 또 다른 예에서, 역전사효소의 농도는 고체상 매질에서 사용될 때 약 290 U/mL 내지 약 310 U/mL일 수 있다.
표적 프라이머, DNA 중합효소 및 역전사효소 이외에, 조성물은 재가용화제를 포함할 수 있다. 재가용화제는 타액 샘플이 고체 기반 매질에 침착되는 경우에 고체 기반 매질에서 LAMP 시약의 재수화를 도울 수 있다. 한 양태에서, 재가용화제는 계면활성제일 수 있다. 예를 들어, 재가용화제는 소혈청 알부민 (BSA), 카제인, 폴리소르베이트 20 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. BSA와 카제인은 건조된 시약이 재수화될 때 DNA 중합효소, 역전사효소 및 기타 관련 효소들의 재가용화를 촉진할 수 있다. 폴리소르베이트 20은 건조된 시약들의 재가용화를 도울 수도 있는 계면활성제이다. 한 예에서, 재가용화제의 농도는 고체상 매질에 사용될 때 약 0.05 중량% 내지 약 5 중량%일 수 있다. 또 다른 예에서, 재가용화제의 농도는 약 0.5 중량% 내지 약 3 중량%일 수 있다. 또 다른 예에서, 재가용화제의 농도는 약 0.5 중량% 내지 약 1.5 중량%일 수 있다.
조성물은 반응 속도를 빠르게 하거나, 감도를 증가시키거나, 또는 이들의 조합을 행할 수 있는 제제를 추가로 포함할 수 있다. 한 예로서, BSA는 반응 속도를 높이고 감도를 증가시키기 위해 포함될 수 있다. 그러나, BSA를 포함시키면 해당 결과의 판독 가능도를 저해할 수 있는 pH 변동이 발생할 수도 있다. 따라서, 일부 예에서, 재가용화제는 카제인, 폴리소르베이트 20 등, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
휘발성 제제는 LAMP 반응을 방해할 수 있다. 예를 들어, 휘발성 화합물은 다수의 이온들로 이온화될 수 있고, 이러한 이온들 중 하나는 비등점이 낮을 수 있다. 비등점이 낮은 이온이 증발하게 되면, 나머지 이온들이 더 반응할 수 있다. 일부 추가 반응에는 산화환원 반응, 산-염기 반응, 또는 pH 기반 신호의 해석에 영향을 미칠 수 있는 기타 반응들이 포함될 수 있다. 한 양태에서, 조성물은 휘발성 제제가 실질적으로 없을 수 있다. 한 예에서, 휘발성 제제의 제거는, 해당 휘발성 제제가 포함되는 경우의 색상 대비 및 반응 시간과 비교하였을 때, 색상 대비를 증가시키고 고체 기반 매질의 반응 시간을 감소시킬 수 있다. 한 양태에서, 조성물은 다음 중 하나 이상을 해당 함량 미만으로 함유할 수 있다: 1.0 중량%, 0.5 중량%, 0.1 중량% 또는 0.01 중량%의 휘발성 제제.
휘발성 제제는 고체 기반 매질에서 불안정성을 유발할 수 있다. 일부 예에서, 황산암모늄과 같은 휘발성 화합물을 포함하는 LAMP 반응은, 암모늄 이온이 황산암모늄을 부분적으로 암모늄으로 전환할 때 (휘발하여 황산염을 남길 수 있음) 고체 기반 매질에서 불안정성을 야기할 수 있다. 황산염은 황산이 되어 pH를 감소시켜 pH 기반 지시약의 판독에 영향을 줄 수 있다 (예컨대, LAMP 반응이 일어나지 않는 경우라 하더라도 페놀 레드 지시약을 빨간색에서 노란색으로 변화시킴). 황산암모늄을 베타인으로 대체하면, 비-LAMP 반응에 의한 변색을 방지하여, 보관시 변색을 방지함으로써 고체 기반의 매질을 안정화시킬 수 있다.
이와 같이, 조성물에서 휘발성 제제의 존재를 감소시키면, LAMP 반응과 pH 기반 지시약을 통한 이의 판독에 대한 방해의 정도를 감소시킬 수 있다. 한 양태에서, LAMP 조성물은 저분자량인 중성 전하의 4급 암모늄, 또는 저분자량인 중성 전하의 아미드 화합물 등, 또는 이들의 조합을 포함하는 비휘발성 제제를 포함할 수 있다. 한 예로서, 비휘발성 제제로는, 이에 제한되지는 않지만, N-포르밀우레아, 우레아, L-아스파라긴, 트리메틸글리신 (베타인), 3-(사이클로헥실아미노)-1-프로판설폰산 (CAPS), 3-(1-피리디니오)-1-프로판설포네이트 (NDSB-201), N-메틸우레아, 아세트아미드, 프로피온아미드, 이소부티르아미드, 피라세탐, 1,3-디메틸우레아, 1,1-디메틸우레아, 글리콜아미드, 2-클로로아세트아미드, 숙신이미드, 2-이미다졸리돈, 염화콜린, 염화아세틸콜린, 염화베타네콜, L-카르니틴 내염, O-아세틸-L-카르니틴 염산염, 4-(사이클로헥실아미노)-1-부탄설폰산 (CABS), 디메틸에틸암모늄프로판 설포네이트 (NDSB-195), 3-(1-메틸피페리디늄)-1-프로판 설포네이트 (NDSB-221), 3-(벤질디메틸암모니오)프로판 설포네이트 (NDSB-256), 및 디메틸-2-하이드록시에틸암모늄-1-프로판 설포네이트 (NDSB-211) 등, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
한 예로서, 저분자량인 중성 전하의 4급 암모늄 또는 저분자량인 중성 전하의 아미드 화합물을 비롯한 비휘발성 제제의 농도는 고체 상에 매질에 사용될 때 약 1 mM 내지 약 200 mM일 수 있다. 또 다른 예에서, 비휘발성 제제의 농도는 고체상 매질에서 사용될 때 약 10 mM 내지 약 50 mM일 수 있다. 또 다른 예에서, 비휘발성 제제의 농도는 고체상 매질에서 사용될 때 약 15 mM 내지 약 25 mM일 수 있다.
휘발성 제제 이외에도, 흡습제도 LAMP 반응을 방해할 수 있다. 흡습제는 과량의 물을 보유하여, 건조를 늦추거나 방해하여 고체 기반 매질에서 시약을 불안정하게 만들 수 있다. 한 양태에서, 조성물은 흡습제가 실질적으로 없을 수 있다. 일부 예에서, 글리세롤과 같은 흡습제를 포함하는 LAMP 반응은 해당 흡습제가 물을 끌어당길 수 있기 때문에 고체 기반 매질에서 시약 불안정성의 원인이 될 수 있다. 한 예로서, 흡습제는 25℃에서 약 40% 내지 약 90%의 상대 습도 (RH)일 때 약 10 중량% 이상을 흡수할 수 있다. 한 예로서, 흡습제는 이에 제한되지는 않지만, 글리세롤, 에탄올, 메탄올, 염화칼슘, 염화칼륨, 황산칼슘 등, 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 한 양태에서, 조성물은 다음 중 하나 이상을 해당 함량 미만으로 함유할 수 있다: 1.0 중량%, 0.5 중량%, 0.1 중량%, 또는 0.01 중량%의 흡습제.
직전의 LAMP 반응, 프라이머 이합체화, 비특이적 증폭 또는 이들의 조합의 이월 (carryover) 오염을 방지하기 위해 일부 추가의 제제들이 포함될 수 있다. 이월 오염은 LAMP 반응에 디옥시우리딘 트리포스페이트 (dUTP), 우라실 DNA 글리코실라제 (UDG) 또는 이들의 조합을 포함시켜 방지할 수 있다. 이러한 제제들은 우라실을 포함하는 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA에서 유리 우라실의 방출을 촉진할 수 있다.
페놀 레드와 같이 항산화 효과가 있는 일부 pH 기반 지시약들은 항산화 활성이 어느 정도 감소된 다른 pH 기반 지시약들과에 비해서 대비와 균일성이 증가될 수 있음이 밝혀졌다. 한 양태에서, 조성물은 항산화제를 추가로 포함할 수 있다. 한 예에서, 항산화제의 농도는 고체상 매질에서 사용될 때 약 0.1 mM 내지 약 1 mM일 수 있다. 또 다른 예에서, 항산화제의 농도는 고체상 매질에서 사용될 때 약 0.2 mM 내지 약 0.8 mM일 수 있다. 또 다른 예에서, 항산화제의 농도는 고체상 매질에서 사용될 때 약 0.2 mM 내지 약 0.3 mM일 수 있다. 항산화제는 산화-환원 반응을 방지함으로써 고체 기반 매질에서 시약들을 안정화시킬 수 있다.
하기를 포함하되 이에 국한되지 않는 다양한 항산화제들이 사용될 수 있다: N-아세틸-시스테인, 하이드록시타이로솔 (HXT), 수퍼옥사이드 디스뮤타제 (SOD), 카탈라아제, 비타민 A, 비타민 C, 비타민 E, 코엔자임 Q10, 망간, 요오드화물, 멜라토닌, 알파-카로틴, 아스타잔틴, 베타-카로틴, 칸타잔틴, 크립토잔틴, 루테인, 리코펜, 제아잔틴, 아피게닌, 루테올린, 탕게리틴, 이소람네틴, 캠페롤, 미리세틴, 프로안토시아니딘, 케르세틴, 에리오딕티올, 헤스페레틴, 나린게닌, 카테킨, 갈로카테킨, 에피카테킨, 에피갈로카테킨, 테아플라빈, 테아루비긴, 다이제인, 제니스테인, 글리시테인, 레스베라트롤, 프테로스틸벤, 시아니딘, 델피니딘, 말비딘, 펠라르고니딘, 페오니딘, 페투니딘, 치코르산, 클로로겐산, 계피산, 엘라그산, 엘라기탄닌, 갈산, 갈로탄닌, 로즈마린산, 살리실산, 커큐민, 플라보놀리그난, 크산톤, 유제놀, 캡사이신, 빌리루빈, 시트르산, 옥살산, 피트산, R-알파-리포산 등, 또는 이들의 조합.
지금까지는 pH 기반 지시약들에 대해 논의했지만, 다른 지시약들도 사용할 수 있다. 한 양태에서, 조성물은 지시약을 추가로 포함할 수 있다. 한 예에서, 지시약은 고체 기반 매질과 함께 사용되는 경우 pH 기반 지시약, 예컨대 페놀 레드일 수 있다. 페놀 레드는 다른 염료에는 없는 항산화 특성을 가지고 있다. 페놀 레드 분자는 항산화 특성에도 기여할 수 있는 공액 결합 시스템이다. 한 예에서, 지시약의 농도는 고체상 매질에서 사용될 때 약 0.1 mM 내지 약 1 mM일 수 있다. 또 다른 예에서, 지시약의 농도는 고체상 매질에서 사용될 때 약 0.2 mM 내지 약 0.8 mM일 수 있다. 또 다른 예에서, 지시약의 농도는 고체상 매질에서 사용될 때 약 0.2 mM 내지 약 0.3 mM일 수 있다.
일부 다른 지시약들도 적절한 비색 신호를 제공할 수 있다. 또 다른 예에서, 지시약은 (i) 마그네슘 비색 지시약, (ii) pH 비색 지시약, 또는 (iii) DNA 삽입 (intercalating) 비색 지시약 중 하나 이상일 수 있다. 지시약이 마그네슘 비색 지시약인 경우, 마그네슘 농도를 모니터링하여 마그네슘을 약 0.01 mM 내지 약 2 mM 범위로 유지해야 한다. 또한, 마그네슘의 농도를 모니터링하여 DNA 중합효소를 간섭하는 것을 방지해야 한다. DNA 중합효소의 보조인자인 마그네슘은 마그네슘 농도가 목표 범위를 벗어나면 DNA 중합효소를 방해할 수 있다.
또한, LAMP 반응은 다양한 유형의 표적 프라이머들을 사용할 수도 있다. 일부 표적 프라이머들은 약 4개 또는 6개의 프라이머를 포함할 수 있는데, 이들은 각각 게놈 내의 6개 또는 8개 영역을 표적화할 수 있다. 한 양태에서, 표적 프라이머의 농도는 고체상 매질에서 사용될 때 약 0.05 μM 내지 약 5 μM의 농도를 가질 수 있다. 또 다른 예에서, 표적 프라이머의 농도는 고체상 매질에서 사용될 때 약 0.1 μM 내지 약 3 μM일 수 있다. 또 다른 예에서, 표적 프라이머의 농도는 고체상 매질에서 사용될 때 약 0.2 μM 내지 약 1.6 μM일 수 있다.
표적 프라이머는 다양한 병원체의 게놈을 표적화하기 위해 선택될 수 있다. 한 양태에서, 표적 프라이머는 바이러스 병원체, 박테리아 병원체, 진균 병원체 또는 원생동물 병원체를 포함할 수 있는 병원체를 표적으로 삼을 수 있다. 또 다른 양태에서, 병원체 표적은 바이러스 표적일 수 있다. 또 다른 양태에서, 바이러스 표적은 dsDNA 바이러스, ssDNA 바이러스, dsRNA 바이러스, 양성 가닥 ssRNA 바이러스, 음성 가닥 ssRNA 바이러스, ssRNA-RT 바이러스 또는 ds-DNA-RT 바이러스를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 바이러스 표적은 H1N1, H2N2, H3N2, H1N1pdm09 또는 SARS-CoV-2를 포함할 수 있다. 요컨대, 표적 프라이머는 거의 모든 병원체 표적, 특히 본원에 개시된 표적 병원체들을 표적으로 할 수 있다.
고체 기반 매질이 과량의 휘발성 제제, 산화제, pH 간섭성 제제, 마그네슘 간섭성 제제 등, 또는 이들의 조합을 포함하는 경우라면, 고체 기반 매질의 색상은 LAMP 반응의 증폭이 없으면 영향을 받을 수 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 또 다른 양태에서, 조성물은 변색 방지용 첨가제를 포함할 수 있다. 한 양태에서, 변색 방지용 첨가제의 농도는 고체상 매질에서 사용될 때 약 0.01 mM 내지 약 1 M일 수 있다. 또 다른 예에서, 변색 방지용 첨가제의 농도는 고체상 매질에서 사용될 때 약 10 mM 내지 약 500 mM일 수 있다. 또 다른 예에서, 변색 방지용 첨가제의 농도는 고체상 매질에서 사용될 때 약 200 mM 내지 약 400 mM일 수 있다.
LAMP 반응이 일으킨 증폭의 부재하에 고체 기반 매질의 색상을 보존하여 LAMP 반응이 일으킨 증폭이 발생할 때 대비를 잠재적으로 증가시킬 수 있는 다양한 변색 방지용 첨가제들이 존재한다. 한 예에서, 변색 방지용 첨가제는 당, 완충제 등, 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
한 예에서, 당과 같은 변색 방지용 첨가제는 고체 기반 매질을 안정화시켜 장기간 보관 조건에서도 변색을 방지할 수 있다. 예를 들어, 트레할로스는 동결 건조 조건에서 또는 상온에서 건조시 효소의 안정성을 보존할 수 있다. 한 양태에서, 당은 글루코스, 수크로스, 트레할로스, 덱스트란 등, 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 한 양태에서, 당의 농도는 고체상 매질에서 사용될 때 약 0.01 mM 내지 약 1 M일 수 있다. 또 다른 예에서, 당의 농도는 고체상 매질에서 사용될 때 약 10 mM 내지 약 500 mM일 수 있다. 또 다른 예에서, 당의 농도는 고체상 매질에서 사용될 때 약 200 mM 내지 약 400 mM일 수 있다.
LAMP 반응에는 다른 시약들도 포함될 수 있다. 한 양태에서, 조성물은 효소, 핵산, 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 한 예에서, 효소는 RNase 억제제 또는 DNase 억제제일 수 있다. RNase 억제제를 포함시키면 RNA 표적의 분해를 늦춰 검출 한계를 높일 수 있다. DNase 억제제를 포함시키면 DNA 표적의 분해를 늦춰 이 역시 검출 한계를 높일 수 있다. 한 양태에서, 조성물은 운반체 DNA 또는 운반체 RNA를 포함할 수 있다. 운반체 DNA 또는 운반체 RNA는 각각 DNase 또는 RNase의 활성을 봉쇄하는 유인체 (decoy) 기질을 제공할 수 있다. 또 다른 예에서, 구아니딘 염산염의 선택된 양은 RNA 분자의 변성 및 노출을 자극할 수 있고, 이로써 LAMP 반응을 추가로 안정화시킬 수 있다.
한 양태에서, RNase 또는 DNase 억제제의 농도는 고체상 매질에서 사용될 때 타액 샘플 1 mL당 약 0.01 ㎕ 내지 타액 샘플 1 mL당 약 5 ㎕일 수 있다. 또 다른 예에서, RNase 또는 DNase 억제제의 농도는 고체상 매질에서 사용될 때 타액 샘플 1 mL당 약 0.1 ㎕ 내지 타액 샘플 1 mL당 약 1 ㎕일 수 있다. 또 다른 예에서, RNase 또는 DNase 억제제의 농도는 고체상 매질에서 사용될 때 타액 샘플 1 mL당 약 0.5 ㎕ 내지 타액 샘플 1 mL당 약 1.5 ㎕일 수 있다.
한 양태에서, 운반체 RNA 또는 운반체 DNA의 농도는 고체상 매질에서 사용될 때 약 0.01 ng/㎕ 내지 약 10 ng/㎕일 수 있다. 또 다른 예에서, 운반체 RNA 또는 운반체 DNA의 농도는 고체상 매질에서 사용될 때 약 0.1 ng/㎕ 내지 약 1 ng/㎕일 수 있다. 또 다른 예에서, 운반체 RNA 또는 운반체 DNA의 농도는 고체상 매질에서 사용될 때 약 0.2 ng/㎕ 내지 약 0.4 ng/㎕일 수 있다.
전술한 것 외에도, 본원에 인용된 LAMP 반응을 수행하기에 적합한 조성물에는 다수의 다른 제제 또는 성분들이 사용될 수 있다. 예를 들어, 또 다른 양태에서, 조성물은 등장화제, pH 조절제, 보존제, 물 등, 또는 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 이러한 성분/제제들을 사용하여 해당 조성물에 구체적으로 원하는 다양한 특성을 제공할 수 있다. 한 양태에서, 조성물의 등장성은 약 250 내지 약 350 밀리오스몰/리터 (mOsm/L)일 수 있다. 또 다른 양태에서, 조성물의 등장성은 약 270 내지 약 330 mOsm/L일 수 있다. 등장화제는 다양한 양으로 조성물에 존재할 수 있다. 한 양태에서, 등장화제는 조성물 중에서 약 0.1 중량%, 약 0.5 중량%, 또는 약 1 중량% 내지 약 2 중량%, 약 5 중량%, 또는 약 10 중량%의 농도를 가질 수 있다.
조성물에는 pH 간섭성 시약이 실질적으로 없어야 하지만, LAMP 반응 전에 pH 조절제를 사용하여 해당 조성물의 초기 pH를 선택할 수 있다. 또한, LAMP 반응 결과를 해석할 때 pH 조절제의 효과가 보강될 수 있는 경우에도 pH 조절제를 사용할 수 있다. pH 조절제의 비제한적 예로는 염산, 인산, 시트르산, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘 등과 같은 다수의 산, 염기 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. pH 조절제를 사용하여 해당 조성물에 적절한 pH를 제공할 수 있다. 한 양태에서, pH는 약 5.5 내지 약 8.5일 수 있다. 한 양태에서, pH는 약 5.8 내지 약 7.8일 수 있다. 또 다른 양태에서, pH는 약 6.5 내지 약 7.8일 수 있다. 또 다른 예에서, pH는 약 7.0 내지 약 7.6일 수 있다. pH 조절제는 다양한 양으로 조성물 중에 존재할 수 있다. 한 양태에서, pH 조절제는 조성물 중에 약 0.01 중량%, 약 0.05 중량%, 약 0.1 중량%, 또는 약 0.5 중량% 내지 약 1 중량%, 약 2 중량%, 약 5 중량%, 또는 약 10 중량%의 농도를 가질 수 있다.
보존제를 사용하여 해당 조성물의 보존 기간을 향상시킬 수 있다. 보존제의 비제한적 예로는 염화벤잘코늄 (BAK), 세트리모늄, 과붕산나트륨, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) 및 이의 다양한 염 형태, 클로로부탄올 등을 포함할 수 있다. 보존제는 다양한 양으로 조성물 중에 존재할 수 있다. 한 양태에서, 보존제는 약 0.001 중량%, 약 0.005 중량%, 약 0.01 중량%, 또는 약 0.05 중량% 내지 약 0.1 중량%, 약 0.25 중량%, 약 0.5 중량%, 또는 약 1 중량%의 농도를 가질 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 도 2에 도시된 바와 같이, 고체상 매질에서 LAMP 분석을 위한 방법 (200)은, 블록 210에 나타낸 바와 같이, 고체상 매질 및 그와 조합된 반응 조성물, 예를 들어 본원에 언급한 임의의 성분 또는 조성물의 어셈블리를 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 한 양태에서, 본 방법은 블록 220에 나타낸 바와 같이, 고체상 매질 상에 생체 샘플을 침착시키는 단계를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 방법은 블록 230에 도시된 바와 같이, LAMP 반응을 촉진하기에 충분한 등온 온도로 상기 어셈블리를 가열하는 단계를 포함할 수 있다.
한 양태에서, 생체 샘플은 타액, 점액, 혈액, 소변, 대변, 땀, 호기 응축물 등, 또는 이들의 조합 중 하나 이상일 수 있다. 또 다른 양태에서, 생체 샘플은 타액일 수 있다. 한 양태에서, 본 방법은 바이러스 병원체를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 한 양태에서, 바이러스 병원체는 본원에 개시된 병원체일 수 있다. 또 다른 양태에서, LAMP 분석은 역전사효소 LAMP (RT-LAMP)일 수 있다.
또 다른 양태에서, LAMP 반응을 촉진하기에 충분한 등온 온도는 약 50℃ 내지 약 70℃의 온도 범위일 수 있다. 또 다른 양태에서, LAMP 반응을 촉진하기에 충분한 등온 온도는 약 60℃ 내지 약 70℃의 온도 범위일 수 있다. 또 다른 양태에서, LAMP 반응을 촉진하기에 충분한 등온 온도는 약 60℃ 내지 약 65℃의 온도 범위일 수 있다. 등온 온도는 DNA 중합효소, 역전사효소, 또는 이들의 조합의 활성 중 하나 이상을 기초로 선택될 수 있다.
또 다른 예에서, LAMP 반응을 촉진하기에 충분한 온도는 약 60℃ 내지 약 70℃의 온도 범위일 수 있다. 다른 예에서, 등온 온도는 5℃ 미만으로 차이가 나는 범위 내의 온도일 수 있다.
또 다른 실시형태에서, LAMP 분석을 수행하는 시스템은 본 발명에 언급한 조성물을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 상기 시스템은 해당 조성물이 침착되는 고체상 매질을 포함할 수 있다.
pH 민감성 신호 출력을 최대화하기
LAMP 반응을 수행할 때, 다양한 지시약을 사용하여 반응 결과를 판독할 수 있다. 3가지 유형의 비색 지시약으로 마그네슘 비색 지시약, pH 비색 지시약 및 DNA 삽입 비색 지시약을 포함한다. 마그네슘은 DNA 중합효소에 대한 보조인자일 수 있고 그 농도를 정밀하게 제어해야 하기 때문에, 마그네슘 기반 지시약은 LAMP 반응과 관련하여 사용될 때 다양한 한계에 직면할 수도 있다. DNA 삽입 지시약은 나타날 수 있는 변수들의 수가 많기 때문에 한계에 직면할 수도 있다. 이 3가지 지시약들을 모두 LAMP 반응에 사용할 수 있지만, pH 기반 지시약이 변수가 적을 수 있다.
한 실시형태에서, pH 의존성 출력 신호를 활용하는 루프 매개형 등온 증폭 (LAMP) 분석을 위한 조성물은 pH 민감성 염료 및 다수의 비간섭성 LAMP 시약을 포함할 수 있다. 한 양태에서, LAMP 분석은 역전사 LAMP (RT-LAMP)일 수 있다.
pH 민감성 염료의 선택은 pH와 상관된 비색 범위, 색상 변화간 대비의 정도, 색상 변화의 pH 수준, 색상 변화의 균일성, 색상 변화의 재현성 등과 같은 다양한 요인들에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 페놀 레드는 pH 약 6.8과 약 7.4 사이의 비색 범위를 가질 수 있다. 약 pH 6.8 미만에서, 페놀 레드는 노란색으로 변할 수 있고, pH 약 7.4 초과에서는 페놀 레드가 빨간색으로 변할 수 있다. 노란색과 빨간색 간의 차이의 정도는 쉽게 판독할 수 있고, pH 변화는 생리학적 조건을 모방한 pH 수준에서 나타날 수 있다.
한 양태에서, pH 민감성 염료는 약 pH 6.5에서 색상이 변화하여 일관되고 대조적인 색상 변화를 달성하는 pH 지시약일 수 있다 (예: 페놀 레드). 한 양태에서, pH 민감성 염료는 페놀 레드, 리트머스, 브로모티몰 블루, 니트라진 옐로우, 크레졸 레드, 커큐민, 브릴리언트 옐로우, m-크레졸 퍼플, α-나프톨프탈레인, 페놀프탈레인, 뉴트럴 레드, 산성 푹신, 아졸리트민 등, 또는 이들의 조합 중 적어도 하나일 수 있다. 한 양태에서, pH 민감성 염료의 농도는 고체상 매질에서 사용될 때 약 0.1 mM 내지 약 1 mM일 수 있다. 또 다른 예에서, pH 민감성 염료의 농도는 고체상 매질에서 사용될 때 약 0.2 mM 내지 약 0.8 mM일 수 있다. 또 다른 예에서, pH 민감성 염료의 농도는 고체상 매질에서 사용될 때 약 0.2 mM 내지 약 0.3 mM일 수 있다.
pH 민감성 신호 출력을 최대화하기 위해서, LAMP 반응에는 해당 LAMP 반응을 방해하거나 (예컨대, DNA 중합효소를 방해하거나) 또는 해당 LAMP 반응의 신호 (예: pH 신호)를 방해함으로써 신호에 불확실성을 주는 시약들이 실질적으로 없어야 한다. 한 양태에서, 복수의 비간섭성 LAMP 시약들은 DNA 중합효소, 역전사효소, 표적 프라이머 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 복수의 비간섭성 LAMP 시약에는 휘발성 시약, pH 간섭성 시약, 마그네슘 간섭성 시약 또는 이들의 조합이 실질적으로 없을 수 있다.
한 예에서, 복수의 비간섭성 LAMP 시약에는 마그네슘, 황산암모늄 또는 탄산암모늄이 실질적으로 없을 수 있다. DNA 중합효소의 보조인자인 마그네슘은 정밀하게 모니터링하여 LAMP 반응이 고안한 대로 진행될 수 있도록 해야 한다. 황산암모늄은 암모늄 이온으로 이온화되는데, 이는 반응하여 황산을 형성할 수 있는 황산염 이온을 남길 수 있다. 탄산암모늄도 암모늄 이온으로 이온화되는데, 역시 반응하여 탄산을 형성할 수 있는 탄산염을 남길 수 있다. 따라서, 다수의 비간섭성 LAMP 시약들에는 이러한 물질들이 실질적으로 없어야 한다.
휘발성 제제는, 반응하여 산 또는 염기를 형성할 수 있는 조성물을 남겨 이것이 LAMP 반응의 pH 의존성 신호를 방해할 수 있기 때문에, 휘발성 제제는 최소화되어야 한다. 한 예에서, 복수의 비간섭성 LAMP 시약에는 황산암모늄, 탄산암모늄 등, 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 국한되지 않는 휘발성 시약들이 실질적으로 없을 수 있다. 한 양태에서, 조성물은 다음 중 하나 이상을 해당 함량 미만으로 함유할 수 있다: 1.0 중량%, 0.5 중량%, 0.1 중량% 또는 0.01 중량%의 휘발성 시약.
또한, pH 간섭성 시약이 보강되지 않는 경우, 어떤 pH 간섭성 시약이라도 pH 의존성 신호 출력을 방해할 수 있다. 한 예에서, 다수의 비간섭성 LAMP 시약에는 많은 산, 염기 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 국한되지 않는 pH 간섭성 시약이 실질적으로 없을 수 있다. 한 양태에서, 조성물은 다음 중 하나 이상을 해당 함량 미만으로 함유할 수 있다: 1.0 중량%, 0.5 중량%, 0.1 중량% 또는 0.01 중량%의 pH 간섭성 시약.
pH가 모니터링된 경우라 할지라도, LAMP 반응이 방해를 받은 경우에는 pH 의존성 신호 출력은 부정적인 영향을 받을 수 있다. 예를 들어, DNA 중합효소의 보조인자로서의 마그네슘은, 농도가 선택한 범위를 벗어는 경우, LAMP 반응의 증폭을 방해할 수 있다. 한 예에서, 복수의 비간섭성 LAMP 시약에는 마그네슘 간섭성 제제가 실질적으로 없을 수 있다. 마그네슘 간섭성 제제는 하기를 포함하지만 이에 국한되지 않는 마그네슘 함유 제제를 포함할 수 있다: Mg2+, Mg1+, 탄산마그네슘, 염화마그네슘, 시트르산마그네슘, 수산화마그네슘, 산화마그네슘, 황산마그네슘, 황산마그네슘 칠수화물 등 또는 이들의 조합. 한 양태에서, 조성물은 다음 중 하나 이상을 해당 함량 미만으로 함유할 수 있다: 1.0 중량%, 0.5 중량%, 0.1 중량% 또는 0.01 중량%의 마그네슘. 또 다른 예에서, 마그네슘 간섭성 제제는 마그네슘을 방해하는 킬레이트제를 포함할 수 있다.
pH가 모니터링되었고 LAMP 반응이 적절하게 작동하는 경우라 할지라도, 장기간의 보관과 같은 다른 요인들로 인해 고체상 매질의 변색이 발생할 수 있다. 한 양태에서, 조성물은 변색 방지용 첨가제를 포함할 수 있다. 한 예에서, 변색 방지용 첨가제는 당, 완충제, 차단제 등, 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 한 예에서, 당은 고체 기반 매질을 안정화하여 장기간의 보관 조건에서 변색을 방지할 수 있다. 한 양태에서, 당은 글루코스, 수크로스, 트레할로스, 덱스트란 등, 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
한 양태에서, 당의 농도는 고체상 매질에서 사용될 때 약 0.01 mM 내지 약 1 M일 수 있다. 또 다른 예에서, 당의 농도는 고체상 매질에서 사용될 때 약 10 mM 내지 약 500 mM일 수 있다. 또 다른 예에서, 당의 농도는 고체상 매질에서 사용될 때 약 200 mM 내지 약 400 mM일 수 있다.
완충제는 타액 샘플에서 변동성을 제거함으로써 LAMP 반응의 안정화를 촉진할 수 있다. 한 예에서, 완충제는 인산염 완충 식염수 (PBS), 둘베코의 PBS, 알세버 (Alsever's) 용액, 트리스-완충 식염수 (TBS), HEPES, BICINE, 물, 균형염 용액 (BSS), BSS, 얼 (Earle's)의 BSS, 그레이 (Grey's)의 BSS, 퍽 (Puck's)의 BSS, 심 (Simm's)의 BSS, 타이로드 (Tyrode's)의 BSS, BSS Plus, 링거의 젖산염 용액, 일반 식염수 (즉, 0.9% 식염수), ½ 일반 식염수 등, 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 한 양태에서, 완충제의 농도는 고체상 매질에서 사용될 때 약 10 μM 내지 약 20 mM일 수 있다. 또 다른 예에서, 완충제의 농도는 고체상 매질에서 사용될 때 약 100 μM 내지 약 10 mM일 수 있다. 또 다른 예에서, 완충제의 농도는 고체상 매질에서 사용될 때 약 100 μM 내지 약 500 μM일 수 있다.
차단제는 RNase 기반 분해, DNase 기반 분해 또는 기타 효소적 분해의 양을 감소시킬 수 있다. 한 예에서, 차단제는 소혈청 알부민, 카제인, 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 한 양태에서, 차단제의 농도는 고체상 매질에 사용될 때 약 0.01 중량% 내지 약 5 중량%일 수 있다. 또 다른 예에서, 차단제의 농도는 고체상 매질에 사용될 때 약 0.01 중량% 내지 약 1 중량%일 수 있다. 또 다른 예에서, 차단제의 농도는 고체상 매질에 사용될 때 약 0.02 중량% 내지 약 0.06 중량%일 수 있다.
항산화제는 산화 반응과 관련된 변수를 제거함으로써 고체상 매질에서 pH 의존성 신호의 균일성과 대비를 증가시킬 수 있다. 한 예에서, 조성물은 본원에 개시된 항산화제를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 예에서, 조성물은 고체상 매질을 추가로 포함할 수 있다. 고체상 매질은 유리 섬유, 나일론, 셀룰로오스, 폴리설폰, 폴리에테르설폰, 셀룰로오스 아세테이트, 니트로셀룰로오스, 폴리에스테르, 친수성 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE), 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다.
어떤 첨가제들은 LAMP 반응의 안정성과 균일성을 증가시킬 수 있다. 한 양태에서, 조성물은 본원에 개시된 효소, 핵산, 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 한 예에서, 효소는 RNase 억제제 또는 DNase 억제제일 수 있다. 또 다른 양태에서, 조성물은 운반체 DNA 또는 운반체 RNA를 포함할 수 있다. 운반체 DNA 또는 운반체 RNA는 각각 DNase 또는 RNase의 활성을 봉쇄하는 유인체 (decoy) 기질을 제공할 수 있다.
또 다른 예에서, 선택된 양의 구아니딘 염산염은 RNA 분자의 변성 및 노출을 자극할 수 있다. 한 양태에서, 구아니딘 염산염의 농도는 고체상 매질에서 사용될 때 약 1 mM 내지 약 200 mM일 수 있다. 또 다른 예에서, 구아니딘 염산염의 농도는 고체상 매질에서 사용될 때 약 10 mM 내지 약 100 mM일 수 있다. 또 다른 예에서, 구아니딘 염산염의 농도는 고체상 매질에서 사용될 때 약 20 mM 내지 약 60 mM일 수 있다.
또한, pH 의존성 출력 신호의 최대화도 본원에 개시된 다른 실시형태들과 함께 사용될 수 있다. 한 실시형태에서, pH 의존성 출력 신호로 LAMP 분석을 수행하는 방법은 고체상 매질 및 본원에 언급된 조성물의 어셈블리를 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 생체 샘플을 고체상 매질 상에 침착시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 LAMP 반응을 촉진하기에 충분한 등온 온도로 상기 어셈블리를 가열하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 개시된 바와 같이, 한 양태에서, 생체 샘플은 타액, 점액, 혈액, 소변, 대변, 땀, 호기 응축물 등, 또는 이들의 조합 중 하나 이상일 수 있다. 또 다른 양태에서, 생체 샘플은 타액일 수 있다. 한 양태에서, 본 방법은 바이러스 병원체를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 한 양태에서, 바이러스 병원체는 본원에 다른 방식으로 개시된 바와 같은 병원체일 수 있다.
한 예에서, LAMP 반응을 촉진하기에 충분한 온도는 약 60℃ 내지 약 70℃의 온도 범위일 수 있다. 다른 예에서, 등온 온도는 5℃ 미만으로 차이가 나는 범위 내의 온도일 수 있다.
또 다른 양태에서, LAMP 반응을 촉진하기에 충분한 등온 온도는 약 50℃ 내지 약 70℃의 온도 범위일 수 있다. 또 다른 양태에서, LAMP 반응을 촉진하기에 충분한 등온 온도는 약 60℃ 내지 약 70℃의 온도 범위일 수 있다. 또 다른 양태에서, LAMP 반응을 촉진하기에 충분한 등온 온도는 약 60℃ 내지 약 65℃의 온도 범위일 수 있다. 등온 온도는 DNA 중합효소, 역전사효소, 또는 이들의 조합의 활성 중 하나 이상을 기초로 선택될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 도 3에 도시된 바와 같이, pH 의존성 LAMP 분석에서 출력 신호의 정확도를 최대화하는 방법 (300)은, 블록 310에서와 같이, 신호 출력 매질에서 비-LAMP 반응이 일으킨 변색을 최소화하는 시약 혼합물을 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은, 블록 320에 나타낸 바와 같이, LAMP 반응을 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 한 양태에서, 본 방법은 비-LAMP 반응에서 양성자의 생성을 제어하는 단계를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 본 방법은 비-LAMP 반응에서 산화를 제어하는 단계를 포함할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, pH 의존성 LAMP 분석에서 출력 신호의 정확도를 최대화하는 방법은 신호 출력 매질에서 비-LAMP 반응이 일으킨 변색을 실질적으로 제거하는 단계를 포함할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, pH 의존성 LAMP 분석에서 검출 수준 (LOD)을 최대화하는 방법은 신호 출력 매질에서 비-LAMP 반응이 일으킨 변색을 실질적으로 제거하는 단계를 포함할 수 있다. 한 양태에서, 타액을 물로 5-10%로 희석함으로써, 검출 한계에 영향을 미치지 않으면서 색상 대비를 향상시킬 수 있고 샘플 변동성도 완화시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 타액을 본원에 다른 방식으로 개시된 필터로 여과함으로써, 검출 한계에 영향을 미치지 않으면서 색상 대비를 향상시킬 수 있고 샘플 변동성도 완화시킬 수 있다.
실시예
하기 실시예들은 본 발명의 특정 실시형태들에 대해 더욱 명확한 이해를 돕기 위해 제공되는 것이지, 어떠한 식으로든 본 발명을 제한하려는 것이 아니다.
희석된 타액 샘플에서 바이러스 표적에 대한 종이 LAMP 분석
실시예 1 - DNase/RNase 무함유 증류수
DNase/RNase 무함유 증류수는 0.1 μm의 막으로 여과해 준비하고 DNase 및 RNase 활성을 시험한다. DNase 및 RNase 활성은 주사용수 (WFI)에 대한 현행 미국 약전 (USP) 논문 시험 표준에 따라 시험한다. DNase, RNase 또는 프로테아제 활성이 없는 것으로 확인되면, 물은 오염물이 없는 것으로 간주하여 타액 샘플 준비에 사용할 준비가 된 것이다.
실시예 2 - 타액의 증폭
도 4에 도시된 바와 같이, 타액 샘플의 뉴클레오타이드 증폭을 확인하기 위한 양성 대조군으로서 타액 내의 RNaseP를 표적으로 하는 핵산 서열 프라이머를 설계하였다. 도 4A는 열 불활성화된 SARS-CoV-2의 반응당 105개의 게놈 균등물로 스파이킹된 18% 타액에서 RNaseP POP7을 표적으로 하는 프라이머 세트에 대한 형광측정 RT-qLAMP 결과를 도시한 것이다. 도 4B는 0.2 ng의 합성 RNaseP POP7 RNA를 함유한 물에서 RNaseP POP7을 표적으로 하는 프라이머 세트에 대한 형광측정 RT-qLAMP 결과를 도시한 것이다.
도 4A에 도시된 바와 같이, 열 불활성화된 SARS-CoV-2의 반응당 105개의 게놈 균등물로 스파이킹된 18% 타액을 분석하였다. 좌측 도면에서는, 증폭이 일어나지 않았는데, 그 이유는 RNaseP의 p20 서브유닛을 암호화하는 POP7 유전자에 대한 mRNA 서열을 사용하여 RNaseP를 표적으로 삼도록 설계된 프라이머 (RNaseP.I)는 낮은 수준의 RNaseP를 적절히 감지하지 못했기 때문이다. 중간 도면에서는, 검은색 선과 중복되지 않으면서 파란색 선에서 보는 것과 같이 증폭이 일어났는데, 그 이유는 프라이머 (RNaseP.II)가 주형없는 대조군 (no template control)을 증폭하지 않고도 RNaseP의 수준을 검출할 수 있었기 때문이다. 우측 도면에서는, 검은색 선과 파란색 선 모두에 대해 증폭이 일어났는데, 그 이유는 프라이머 (RNaseP.III)가 이합체화되었기 때문이다 (예를 들어, 주형없는 대조군 검은색 선에서 증폭을 나타냄).
도 4B에 도시된 바와 같이, 0.2 ng의 합성 RNaseP POP7 RNA를 함유한 물을 분석하였다. 좌측 도면에서는, 파란색 선과 검은색 선에서 증폭이 일어났는데, 그 이유는 프라이머 (RNaseP.I)가 이합체화되었기 때문이다 (예컨대, 주형없는 대조군을 증폭함). 중간 도면에서는, 검은색 선과 중복되지 않으면서 파란색 선에서 보는 것과 같이 증폭이 일어났는데, 그 이유는 프라이머 (RNaseP.II)가 주형없는 대조군을 증폭하지 않고도 RNaseP의 수준을 검출할 수 있었기 때문이다. 우측 도면에서는, 파란색 선에서는 증폭이 발생했지만 검은색 선에서는 증폭되지 않았는데, 그 이유는 프라이머 (RNaseP.III)가 주형없는 대조군을 증폭하지 않고도 RNaseP를 증폭했기 때문이다.
실시예 3 - 타액 수집 장치
타액 수집 장치의 유형에 따라 LAMP 반응에서 타액 샘플을 촉진시킬 수 있다. 경우에 따라, 작업자는 공기 중의 물방울 (예: 에어로졸 바이러스)을 통해 확산될 수 있는 병원체로부터 보호하기 위해 보호 장비를 사용할 수 있다. 따라서, 작업자는 에어로졸 바이러스와의 우발적인 접촉을 방지하기 위해 개인 보호 장비를 착용할 수 있다. 어떤 타액 수집 장치는 의료 전문가의 안내에 따라서 대상체가 자가 관리를 할 수도 있다. 타액 수집 장치는 효능이 입증되었으며, 도 5a와 도 5b에 도시된 바와 같이, 스폰지 기반의 수집과 수동식 침 수집의 2가지 범주로 분류될 수 있다.
스폰지 수집 장치 (500a)는 스폰지형 수집 패드 (504)를 사용하여 타액을 흡수하며, 충분량이 수집되었을 때를 나타내는 샘플 부피 적절성 표시기 (512)를 포함하고 있다. 일단 스폰지가 포화되면, 스폰지는 압축 튜브 (506)로 삽입되어 타액을 수집 튜브로 걸러내는 필터에 대해 압축된다. 이 여과 작업의 이유는 이 작업이 타액으로부터 뮤신과 고분자량의 단백질을 걸러내어 표본의 점도를 크게 감소시키기 때문이다. 그 결과, 고체상 매질은 타액을 더 신속하고, 균일하며, 신뢰할 수 있는 방식으로 흡수하고 분배할 수 있다. 또한, 스폰지 수집 장치 (500a)는 다음을 포함할 수 있다: 압축 튜브와 밀봉을 형성하기 위한 압축 튜브 (506) 상의 압축 밀봉부 (508); 압축 튜브 (506)를 압축하는 핸들 (510); 및 충분한 타액이 수집되었을 때를 확인하기 위한 샘플 부피 적절성 표시기 (512).
수동식 침흘리기 장치 (500b)는 샘플의 흡수와 분배를 느리게 하는 점도가 있는 여과되지 않은 타액을 제공할 수 있다. 수동식 침흘리기 장치 (500b)는 타액을 수집하기 위한 수집용 깔때기 (522); 충분한 타액이 수집되었을 때를 나타내는 표시선 (528); 타액을 수집하는 수집 튜브 (524); 튜브 캡 (526); 부피 표시기 (530); 및 튜브 캡 보관소 (532)를 포함한다.
2가지 유형의 수집 장치는 모두 작업자에 대한 노출에 대한 잔존 위험도가 최소화된다. 스폰지 기반 장치를 사용하면, 특히 사용자가 압축 과정에서 특히 갑작스럽게 할 경우에, 압축 작업 중에 에어로졸이 방출될 가상의 위험이 존재한다. 의료 종사자는 노출 위험을 제어하기 위해 이 작업을 수행할 수 있다. 수집 장치는 에어로졸 역류를 방지하기 위해 압축 밀봉부를 포함할 수 있다. 수동식 침 수집을 사용하면, 해당 장치의 외부가 새어나온 타액으로 오염될 위험이 있을 수 있어서, 적절히 취급하지 않으면 작업자에게 교차 오염을 전달할 수 있다. 두 경우 모두, 노출 위험은 타액 샘플의 환자 자신의 수집으로 완화된다.
시판중인 3가지의 타액 수집 장치를 선택하여 타액에서 이들의 RT-LAMP 반응에 미치는 영향을 평가하였다. 그 3개의 장치는 StatSure Diagnostic Systems, Inc.에서 제조한 "Saliva Sampler™", Oasis Diagnostics에서 제조한 "PureㆍSAL™", 및 역시 Oasis Diagnostics에서 제조한 "SuperㆍSAL™"이었다. StatSure Saliva Sampler™는 환자의 타액을 수집하는데 사용되는 완충제 (예: Buffer 2000)를 함유하는 튜브를 제공한다. SuperㆍSAL은 원통형 흡수 패드와 수집 튜브를 사용하여 임의의 고형 오염물과 점액성 물질을 제거함으로써 타액의 수집을 표준화한다. PureㆍSAL은 유사한 메커니즘으로 작동하지만 오염물을 제거하기 위해 수집 튜브에 추가의 필터를 포함한다.
처리된 타액 샘플들에서 타액 pH를 측정한 후, 처리된 타액 샘플들을 사용하여 비색 분석과 형광 RT-LAMP LOD 분석을 실행하였다. 이 데이터를 도 6a에 제시하였다. 이 데이터는 서로 다른 타액 수집 장치들 (Pure-Sal, Super-Sal, Stat-sure)을 사용하여 처리된 타액의 LoD를 보여주고 있다. 마스터 믹스를 0.6 ㎕의 HCl로 처리하였다. PureㆍSAL™ 및 SuperㆍSAL 타액 수집 장치는 보다 광범위한 범위의 농도 (열 불활성화된 SARS-CoV-2의 반응당 1 내지 10k 게놈 균등물)에 대한 더 넓은 범위의 비색 반응을 보여주고 있다.
실시예 4 - 타액 수집 공정
대상체가 자가 검사를 하는 경우, 대상체는 의료 전문가의 안내에 따라 첨가제가 포함되지 않은 특수 수집 용기에 타액 표본을 수집하므로 대상체가 수집하는데 사용하기에 안전하다. 수집된 타액의 부피는 약 100 ㎕이다. 예를 들어, 스폰지 채취기를 대상체의 입에 삽입하여 스폰지 채취기 상의 표시기 색상이 변화할 때까지 타액을 수집한다. 그런 다음, 스폰지 채취기를 수집 튜브에 삽입한다. 그 후, 스폰지를 압축해서 타액 (약 100 ㎕)을 짜내어 타액을 희석하기 위해 일정량의 물을 함유하고 있는 수집 튜브에 넣는다. 타액은 약 1:1 내지 약 1:20의 타액 대 물의 비율로 물에 희석된다. 타액을 수집 튜브에서 검사소로 옮긴다.
실시예 5 - 타액에 대한 RNase 억제제 효과
처리되지 않은 타액에 RNase 억제제를 타액 1 mL당 1 ㎕의 농도로 첨가하여 RT-LAMP 반응에 대한 RNase 억제제의 첨가 효과를 측정하였다.
갓 수집한 타액 (5%)에 대한 RNAsecure™ (AM7006, Invitrogen™)의 효과를 시험하여 현장 진료 RT-LAMP 반응을 위한 단일 작업 공정으로서의 적합성을 판단하였다. 1X RNAsecure™는 1 ㎖ 의 타액을 사용하여 25X 스톡에서 희석하였다. 처리된 타액을 매트릭스로 사용하여 40 mM의 구아니딘 염산염 및 0.3 ng/㎕의 운반체 DNA와 함께 (pH 7.6) Warmstart™ 비색분석용 마스터 믹스에 반응당 1000 복제수 내지 62.5 복제수의 농도 범위로 열 불활성화된 SARS-CoV-2를 스파이킹하였다. RNAsecure™ 처리된 RT-LAMP를 65℃에서 항온배양하여 반응을 개시하였다. RNAsecure™ 없이 이러한 조건 하의 신선한 타액을 대조군으로서 검사하였다.
5 ㎕의 열 불활성화된 바이러스를 5%의 처리된 타액 (즉, 최종 반응 농도)에 희석하고 RT-LAMP 반응에 첨가하여 25 ㎕의 최종 반응 부피에 대해 표시된 농도를 제공하였다. 음성 반응의 경우, 희석한 열 불활성화된 바이러스 대신에 처리된 타액 (5% 최종 반응 농도) 5 ㎕를 첨가하여 25 ㎕의 동일한 반응 부피를 제공하였다. 항온배양기에서 65℃로 60분간 가열을 수행하였다. 비색 스캔은 RT-LAMP 반응 전후에 평판 스캐너를 사용하여 수행하였다. 1250 ㎕의 NEB 비색분석용 마스터 믹스에 0.5 ㎕의 남극 열불안정성 (Antarctic Thermolabile) UDG, 3.5 ㎕의 dUTP를 보충하였다.25X RNase 억제제 (RNASecure™)를 5% 타액으로 희석하는 반응에 첨가하기 전에 전체 타액 중에서 희석하여 1X 농도가 되도록 하였다.
RNAsecure™은, 도 6b에 도시된 바와 같이, 반응의 LoD에서 어떠한 유의한 증가도 나타내지 않았다. 즉, RNase 억제제의 첨가는 RT-LAMP 반응의 측정된 매개변수들 (예를 들어, 반응 속도, 위양성률 또는 검출 한계)에서 눈에 띄는 증가를 유도하지 않았다.
실시예 6 - 냉동 타액 샘플
경우에 따라서는, 물류, 운송 필요성 등으로 인해 타액 샘플을 분석하기 전에 일정 기간 동안 타액 샘플을 냉동하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 상황들은 본원에 언급된 LAMP 분석을 수행할 때 특별한 주의를 기울여야 할 수 있다. 도 7에 도시된 바와 같이, 냉동된 타액 샘플의 pH는 해당 타액 샘플이 해동되어 검사되기 전에 -20℃에서의 일수에 따라 달라질 수 있다. 한 예로서, 기증자 1의 타액 샘플의 pH는 수집과 검사 사이에 일수가 없는 pH 7.21에서부터 수집/냉동과 검사 사이에 6일 후인 경우 pH 7.46으로 다양하였다. 또 다른 예로서, 기증자 2의 타액 샘플의 pH는 수집과 검사 사이에 일수가 없는 pH 7.00에서부터 수집/냉동과 검사 사이에 6일 후인 경우 pH 6.98로 다양하였다. 한 예로서, 기증자 3의 타액 샘플의 pH는 수집과 검사 사이에 일수가 없는 pH 7.18에서부터 수집/냉동과 검사 사이에 6일 후인 경우 pH 7.18로 다양하였다. 한 예로서, 기증자 4의 타액 샘플의 pH는 수집과 검사 사이에 일수가 없는 pH 7.35에서부터 수집/냉동과 검사 사이에 6일 후인 경우 pH 7.47로 다양하였다. 한 예로서, 기증자 1의 타액 샘플의 pH는 수집과 검사 사이에 일수가 없는 pH 7.22에서부터 수집/냉동과 검사 사이에 6일 후인 경우 pH 7.24로 다양하였다.
실시예 7 - 신선한 타액에서의 검출 한계
도 8은 신선한 타액의 검출 한계를 도시한 것이다. 침흘리기 방법을 사용하여 신선한 타액을 수집하고 1:3 비율로 물에 희석하여 25% 타액과 75% 물을 얻었다. 열 불활성화된 SARS-CoV-2를 대조군으로서 단계 희석한 25% 타액에 스파이킹하였다. 5 ㎕의 25% 타액을 20 ㎕의 RT-LAMP 시약에 첨가하여 타액의 최종 농도가 5%가 되도록 하였다. 65℃로 1시간 동안 항온배양한 후 색상이 변화되었다. y축 상의 복제수는 희석하지 않은 100% 타액의 원래 농도를 나타낸다. 프라이머에 대한 검출 한계 (LOD)는 25 ㎕의 부피에서 반응당 250 복제수였는데, 이는 타액 1 mL당 약 200k 복제수에 해당한다.
따라서, 타액을 핵산효소 무함유 물로 25%로 희석하고 RT-LAMP 반응에 첨가시 5% 타액의 최종 농도로 추가로 희석하면 60분 이내에 결과를 얻을 수 있는 것으로 판단되었다. 희석은 타액의 완충능을 감소시켰고 억제성 성분들의 농도를 감소시켰으니, 이는 모두 비색 보고를 지연시킬 것이다. 타액의 억제성 성분을 불활성화시키기 위한 다양한 연구에서 발견되는 다른 전처리 작업들, 예컨대 프로테아제, Chelex® 100 또는 RNA 추출 작업을 사용하는 전처리에 비해서, 최종 사용자에게는 희석이 덜 복잡하다.
PureㆍSAL™을 사용하여 처리한 5% 타액의 비색 분석의 LoD는 반응당 1000 복제수 (반응 부피 25 ㎕)인데, 이는 희석을 고려한 후에 환자 타액 1 ㎕당 800 복제수에 해당한다 (도 6c).
도 6c에 도시된 바와 같이, 다양한 타액 수집 장치 (PureㆍSAL™, Super-Sal™, Stat-sure™)들은 서로 다른 LoD를 유도할 수 있다. 물로 5% 희석된 타액을 모든 처리 기술에 대해 검사하였다. 프라이머 세트 orf1ab.2를 사용하였다. 5%의 처리된 타액 (최종 반응 농도)에 희석시킨 5 ㎕의 열 불활성화된 바이러스를 RT-LAMP 반응에 첨가하여 25 ㎕의 최종 반응 부피와 표시된 농도를 유도하였다. 음성 반응의 경우, 희석한 열 불활성화된 바이러스 대신에 처리된 타액 (5% 최종 반응 농도) 5 ㎕를 첨가하여 25 ㎕의 동일한 반응 부피를 제공하였다. 항온배양기에서 65℃로 60분간 가열을 수행하였다. 비색 스캔은 RT-LAMP 반응 전후에 평판 스캐너를 사용하여 수행하였다. 반응은 NEB 2X 비색분석용 마스터 믹스 12.5 ㎕, 프라이머 믹스 2.5 ㎕, 물 5 ㎕와 샘플 5 ㎕로 구성되었다.
이 LoD는 RT-PCR 분석 또는 RNA 추출을 활용하는 다른 분석들보다 수 자릿수가 더 높다 (반응당 1 복제수 정도). 그러나, 이러한 다른 분석들에는 보고된 LoD를 달성하기 위한 전처리 프로토콜 및/또는 RNA 추출 작업이 수반되었다.
이 LoD를 향상시키기 위해, RNase 억제제, 구아니딘 HCl 및 운반체 DNA의 사용을 연구하였다. RNase 억제제의 첨가는 5% 타액에서 LoD를 낮추었는데 (도 6b), 이는 타액에서 RT-LAMP 분석이 RNase 억제제를 활용하여 LoD를 증가시켰다는 문헌 보고와는 모순되는 것으로; 이러한 불일치는 사용된 RNase 억제제의 종류에 기인한 것일 수 있다. 구아니딘 HCl과 운반체 DNA는 모두 LoD를 증가시켰으므로 (도 6d 및 도 6e), 비색 용액 반응을 위한 우리의 RT-LAMP 반응 제제에 첨가하였다. 이러한 성분들은 종이 상에서 건조시 색상 변화 때문에 포함시키지 않았다.
도 6d에 도시된 바와 같이, 5%의 처리된 타액 (최종 반응 농도)에 희석시킨 5 ㎕의 열 불활성화된 바이러스를 RT-LAMP 반응에 첨가하여 25 ㎕의 최종 반응 부피와 표시된 농도를 유도하였다. 음성 반응의 경우, 희석한 열 불활성화된 바이러스 대신에 처리된 타액 (5% 최종 반응 농도) 5 ㎕를 첨가하여 25 ㎕의 동일한 반응 부피를 유도하였다. 프라이머 세트 orf1ab.2를 사용하였다. 항온배양기 (Fisherbrand™ Isotemp™)에서 65℃로 60분간 가열을 수행하였다. 비색 스캔은 RT-LAMP 반응 전후에 평판 스캐너를 사용하여 수행하였다. 1250 ㎕의 NEB 비색분석용 마스터 믹스에 0.5 ㎕의 남극 열불안정성 UDG, 3.5 ㎕의 dUTP 및 운반체 DNA를 보충하여 표시된 최종 반응 농도를 만들었다.
도 6e에 도시된 바와 같이, 5%의 처리된 타액 (최종 반응 농도)에 희석시킨 5 ㎕의 열 불활성화된 바이러스를 RT-LAMP 반응에 첨가하여 25 ㎕의 최종 반응 부피와 표시된 농도를 유도하였다. 음성 반응의 경우, 희석한 열 불활성화된 바이러스 대신에 처리된 타액 (5% 최종 반응 농도) 5 ㎕를 첨가하여 25 ㎕의 동일한 반응 부피를 유도하였다. 프라이머 세트 orf1ab.2를 사용하였다. 항온배양기 (Fisherbrand™ Isotemp™)에서 65℃로 60분간 가열을 수행하였다. 비색 스캔은 RT-LAMP 반응 전후에 평판 스캐너를 사용하여 수행하였다. 1250 ㎕의 NEB 비색분석용 마스터 믹스에 0.5 ㎕의 남극 열불안정성 UDG, 3.5 ㎕의 dUTP 및 구아니딘 HCl (40 mM)을 보충하였다.
마지막으로, 이월 오염을 감소시키기 위해 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG) 및 데옥시우리딘 트리포스페이트 (dUTP) (도 6f)를 포함시켰다. 도 6f에 도시된 바와 같이, UDG 및 dUTP를 첨가하거나 첨가하지 않고 써모믹서와 항온배양기 상에서 25 ㎕ 반응을 위해 65℃에서 60분간 항온배양한 후 비색 스캔을 수행하였다. 사용된 프라이머 세트는 orf1ab.II였다. 주형은 표시된 농도의 열 불활성화된 바이러스였다. UDG와의 반응을 위해, 1250 ㎕의 NEB 2x 비색분석용 마스터 믹스에 0.5 ㎕의 남극 열불안정성 UDG, 3.5 ㎕의 dUTP를 보충하였다. 다른 모든 반응에는 NEB 2x 비색분석용 마스터 믹스를 사용하였다.
구아니딘 HCl, 운반체 DNA 및 UDG를 포함시키는 경우, 용액 중 5% 처리된 타액에서 RT-LAMP 비색 분석의 LoD는 250 복제수/반응으로 증가되었다 (도 6g). 도 6g에 도시된 바와 같이, PureㆍSALTM으로 처리한 타액과 처리하지 않은 타액을 이용한 RT-LAMP 비색 LoD. 플레이트들을 60분간 65℃로 설정한 항온배양기에서 가열하였다. 사용된 프라이머 세트는 orf1ab.II였고, 주형은 표시된 농도 (양성 반응)의 열 불활성화 바이러스 또는 핵산효소 무함유 물 (음성 반응)이었다. 항온배양기 (Fisherbrand™ Isotemp™)에서 65℃로 60분간 가열을 수행하였다. 비색 스캔은 RT-LAMP 반응 전후에 평판 스캐너를 사용하여 수행하였다. 1250 ㎕의 NEB 비색분석용 마스터 믹스에 0.5 ㎕의 남극 열불안정성 UDG, 3.5 ㎕의 dUTP, 운반체 DNA (0.3 ng/㎕) 및 구아니딘 HCl (40 mM)을 보충하였다.
실시예 8 - 동물 비강 면봉에서의 검출 한계
도 9는 약 1 mL의 물에 재현탁시킨 소 비강 면봉에서의 검출 한계를 도시한 것이다. 열 불활성화된 SARS-CoV-2를 백그라운드 점액과 마이크로바이옴이 재현탁된 물에 스파이킹시켜 타액을 사용한 이전 실시예에서와 같이 동일한 수의 복제수/반응을 얻었다. 5 ㎕의 샘플을 20 ㎕의 RT-LAMP에 첨가하였다. 65℃에서 약 1시간 동안 항온배양한 후, 색상이 변화하였다. 프라이머의 LOD는 25 ㎕ 부피에서 반응당 약 250 복제수였는데, 이는 비강 면봉 재현탁액 1 mL당 약 5k 복제수에 해당한다.
실시예 9 - 종이 상의 검출 한계
도 10은 종이 상의 검출 한계를 도시한 것이다. RT-LAMP 시약 20 ㎕를 1등급 크로마토그래피 종이에 첨가하였다. 열 불활성화된 SARS-CoV-2를 바이러스의 단계 희석액과 함께 100% 모인 (pooled) 타액에 첨가하였다. 약 100% 타액 15 ㎕를 각 종이에 첨가하였다. 65℃에서 90분간 항온배양한 후, 색상이 변화하였다. 프라이머의 LOD는 15 ㎕ 타액 부피에서 약 3k 복제수/반응이었는데, 이는 타액 1 mL당 약 20k 복제수에 해당한다.
종이 상에서 LAMP 분석을 용이하게 하는 시약 조성물
실시예 10 - 샘플 시약
한 예에서, 시약들은 표 A-1에 나타낸 바와 같이 포함시켰다. 또 다른 예에서, 시약들은 표 A-2에 표시된 대로 포함시켰다.
실시예 11 - 완충제 선택과 농도
타액의 pH는 샘플마다 다를 수 있기 때문에, 종이 기반 장치에 완충제를 사용하여 일정한 시작 pH를 유지하였다. 페놀 레드의 경우, pH 7.6은 도 11에 도시된 바와 같은 비색 변화를 향상시키기에 적합한 출발점이었다. pKa가 약 8인 몇 완충제들을 스크리닝하였는데, 그 이유는 증폭이 일어나는 경우에 7.6의 시작 pH가 색상 변화를 허용하는 완충 범위의 한계점에 근접하였기 때문이다. 10 mM의 BICINE 완충제를 도 12에 도시된 바와 같이 종이 기반 분석에 사용하였다.
실시예 12 - 반응 속도에 대한 프라이머의 효과
RT-LAMP 반응 속도를 증가시키기 위해, 형광 RT-LAMP 반응 믹스에 다수의 프라이머 세트를 포함시키는 것에 대하여 연구하였다. 본 연구는 형광측정 지시약으로서 NEB LAMP 형광 염료를 사용하여 물에서 수행하였다. 다수의 프라이머 세트를 포함시키는 것은 반응 속도를 크게 증가시키지 않는 것으로 보였다. 오히려, 단독으로 사용하였을 때 반응 시간이 가장 빨랐던 프라이머 세트의 속도로 주로 반응을 진행하였다.
실시예 13 - 샘플 LAMP 프로토콜, 시약, 유효성 검사 및 문제 해결
샘플 LAMP 프로토콜 13-A:
프라이머 믹스
1. 냉동고에서 모두 6개의 희석된 프라이머를 꺼낸다. 2. FIP 80 ㎕, BIP 80 ㎕, FB 20 ㎕, LB 20 ㎕, F3 10 ㎕ 및 B3 10 ㎕를 튜브에서 혼합한다. 3. 500 ㎕가 될 때까지 PCR 등급의 물을 충분히 첨가한다.
LAMP
1. NEB Bst 2.0 Warmstart 키트와 프라이머 믹스를 입수한다. 2. 시약이 해동되는 동안 최소 5분간 DNA Away를 분무한 후, Kimwipe로 표면을 닦는다. 3. 사용할 DNA 샘플과 프라이머에 필요한 모든 PCR 튜브들에 라벨을 붙인다. DNA가 첨가되지 않은 음성 대조군을 추가하도록 한다. 4. 반응당 5 ㎕의 PCR 등급 물 (또는 염료), 12.5 ㎕의 NEB Bst 2.0 Warmstart 키트 및 2.5 ㎕의 프라이머 믹스를 첨가한다. 많은 반응들이 실행되더라도 마스터 믹스를 만들 수 있다. 5. 5 ㎕의 EBT 염료를 첨가하는 경우, 최종 농도가 300 μM이 되도록 1500 μM 농도이어야 한다. 6. DNA가 없는 반응에는 추가로 5 ㎕의 PCR 등급 물이 추가되어야 하며, 겔에 로딩되어야 할 때까지 다시 개봉하지 않아야 한다. 7. 일단 준비가 되면, PCR 튜브들을 앞서 통과 챔버에 남겨둔 PCR 트레이에 넣고 BRK 2037로 옮겨야 한다. 8. 일단 BRK 2037에 들어가면, -20℃ 냉동고에서 샘플 DNA를 꺼낸다. 9. 손에 DNA Away 스프레이를 뿌리고 DNA 샘플 튜브 주위를 손으로 문질러서 스프레이 물질로 덮이도록 한다. 10. 적절한 곳에 5 ㎕의 DNA 샘플을 첨가하고 튜브를 닫는다. 절대 2개의 DNA 튜브를 동시에 열지 말고, DNA를 첨가한 직후 PCR 튜브들을 닫는다. 11. 샘플들을 65℃에서 1시간, 80℃에서 5분으로 설정한 열순환기에 넣는다 (샘플들은 이 작업 후 밤새 -20℃로 보관할 수 있음).
샘플 시약 농도 13-B:
비색분석용 RT-LAMP 마스터 믹스는 하기일 수 있다: KCl (50 mM), MgSO4 (8 mM), dNTP 혼합물 (dNTP당 1.4 mM), Bst 2.0 WarmStart® DNA 중합효소 (0.32 U/㎕), WarmStart® RTx 역전사효소 (0.3 U/㎕), 페놀 레드 (0.25 mM), dUTP (0.14 mM), 남극 열불안정성 UDG (0.0004U/㎕), Tween® 20 (1% v/v), 베타인 (20 mM), BSA (500 μg/mL) 및 트레할로스 (10% w/v).
이러한 성분들은 종이 LAMP 분석을 위해 각각 0.25X 액체 농도에서부터 5X 이상으로 적정하였다. 농도는 LAMP 반응의 속도, 60분의 반응 시간에서 양성 및 음성 LAMP 결과의 대비, 및 비특이적인 증폭의 감소량에 의해 결정하였다.
단백질 안정화 첨가제의 농도를 결정하기 위해, D-(+)-트레할로스 이수화물을 5% 증분으로 0%에서 15% w/v로 적정하고, 동결건조된 BSA를 0.2 mg/mL 증분으로 0에서 1.25 mg/mL로 적정하였다. 트레할로오스와 BSA의 농도는 각각 10% w/v 및 0.626 mg/mL였다.
샘플 LAMP 프로토콜 13-C:
시약
실시예 10의 표 A-2에 나타낸 바와 같은 시약들.
장비
겸자, 0.5-10 ㎕의 피펫, 2-20 ㎕의 피펫, 20-200 ㎕의 피펫, 100-1000 ㎕의 피펫, 알스트롬-문크스조 (Ahlstrom-Munksjoe) 등급 222, pH 프로브, 65℃까지 도달할 수 있는 열 공급원 (예: 항온배양기, 수조), PCR 후드.
위생처리:
피펫과 모든 작업대 (PCR 후드) 표면에 RNase AWAY를 분사한다. RNase AWAY를 도포한 후, 잘 닦아낸다. RNase AWAY는 남아 있는 경우, 반응을 방해할 수 있다. 교차 오염의 방지를 돕기 위해, 종이 기반 장치를 제조하고 샘플을 로딩하는 별도의 공간을 사용한다. 5 mm×6 mm 크로마토그래피 용지를 미리 절단한다.
LAMP 준비:
1. 표 13B-1에 표시된 대로 PCR 후드 안에 2X LAMP 믹스를 준비한다. 2. 1M KOH (약 1-2 ㎕)로 pH를 ~7.5-8.0 (빨간색고 핑크색은 아님)으로 조정한다. 정확할 필요는 없다. pH를 조정한 후, 2X LAMP 믹스를 -20℃에서 보관할 수 있다.
3. 표 13B-2에 따라 마스터 믹스를 준비한다.
4. 0.1 M KOH로 pH를 8.0으로 조정한다. 마이크로 pH 전극을 사용한다. 5. 완전하게 혼합한다. PCR 후드 내부의 깨끗한 표면에 종이 패드를 펼쳐 놓는다. 미리 절단해 놓은 등급 222 종이 패드에 30 ㎕의 완전 믹스를 첨가한다. 6. 실온에서 60분간 PCR 후드에서 건조시킨다. 7. 건조 후, 종이 패드를 깨끗한 원심분리용 튜브 또는 깨끗한 재밀봉가능한 비닐 봉지에 수집한다.
샘플 로딩
1. 작업대에 RNase AWAY를 뿌리고 와이퍼로 청소한다. 2. 냉동고에서 주형 (DNA, RNA, 열 불활성화된 바이러스)을 꺼낸다. 3. 깨끗한 표면에 반응 패드를 펼쳐 놓는다. 패드를 새 투명 필름 위에 놓고, 사용 후에 폐기할 수 있다. 4. 먼저 음성 대조군 패드를 준비한다. 25 ㎕의 비-주형 용매 (물, 타액)로 패드를 재구성한다. 재구성 과정은 부드럽게 해야 하며, 패드에서 시약들을 씻어내는 것은 피한다. 5. 겸자를 사용하여 깨끗한 용기 (예: 1"×1" 재밀봉가능한 비닐 봉투, 원심분리용 튜브) 안에 음성 대조군 패드를 넣는다. 6. 주형을 용매로 원하는 농도로 희석한다. 7. 반응 패드를 더 배치하고 25 ㎕의 희석된 주형으로 패드를 재구성한다. 8. 겸자를 사용하여 깨끗한 용기 (예: 1"×1" 재밀봉가능한 비닐 봉투, 원심분리용 튜브) 안에 양성 대조군 패드를 넣는다. 9. 작업공간을 정리하고 이미지 촬영 및 항온배양을 위한 패드를 가져온다.
이미지 촬영 및 항온배양:
참고: 여러가지 이미지 촬영 방법들 (예: 저속 촬영 비디오, 스캐닝)과 열 공급원 (예: 항온배양기, 수조)이 있다. 이 프로토콜에서는, 탁상용 스캐너와 미생물 항온배양기를 사용할 수 있다. 1. 스캐너 위에 패드를 펼쳐놓는다. 반응 전에 패드를 스캔한다 (0분). 2. 항온배양기를 65℃로 예열한다. 3. 패드를 항온배양기에 넣는다. 패드를 분리한다. 가열 균일성은 결과의 일관성에 영향을 줄 수 있다. 4. 패드를 꺼내 다른 시점 (보통 매 30분마다)에서 스캔을 반복한다. 5. 최종 스캔 후, 생물학적 유해 폐기물 안에 반응 패드를 폐기한다.
유효성 검증:
LAMP 증폭의 발생을 확인하기 위해, 각 반응 패드를 깨끗한 1.5 mL의 마이크로원심분리기 튜브로 옮겼다. 100 ㎕의 완충제 EB를 각 튜브에 첨가하였다. 핵산을 용출시키기 위해 반응 패드를 완충제 EB 중에 밤새 담갔다. 용리액에 대해 겔 전기영동 (2% 아가로스 겔)을 실시하여 LAMP 증폭의 발생을 확인하였다. 래더형 패턴 (전형적인 LAMP 생성물 패턴)이 각 양성 패드 레인에 나타났던 반면, 각 음성 레인에는 명확한 밴드가 보이지 않았다 (도 13a 및 13b).
도 13a 및 도 13b에 도시된 바와 같이, 종이 LAMP 유효성 검증을 수행하였다. 도 13a에 도시된 바와 같이, 2가지 조건 (반응 믹스에 BSA를 첨가한 경우와 첨가하지 않은 경우)으로 종이 상의 LAMP를 수행하였다. 도 13b에 도시된 바와 같이, 관련 겔 전기영동 (2% 아가로스)을 수행하였다. SARS-CoV-2를 표적으로 하는 orf7ab.1 프라이머 세트를 사용하였다. 음성 반응 패드들을 핵산효소 무함유 물 25 ㎕로 재구성하였다. 양성 반응 패드들을 1 ㎕당 400 복제수의 열 불활성화된 SARS-CoV-2 바이러스 25 ㎕로 재구성하였다. 65℃로 설정된 항온배양기에서 가열을 수행하였고 평판 스캐너에서 스캔하였다.
BSA는 LAMP 믹스에 사용할 수 있는 시약이다. BSA를 첨가하면, 도 14a 및 도 14b에 도시된 바와 같이, 반응 속도를 증가시키고 감도를 높일 수 있다. 이러한 반응에서, 종이 상의 낮은 주형 농도 LAMP르 2가지 조건 (반응 믹스에 BSA를 첨가한 경우와 첨가하지 않은 경우)에 따라 수행하였다. 도 14a는 0분 시점을 나타낸 것이다. 도 14b는 60분 시점을 나타낸 것이다. 이 실험에서는 orf7ab.1 프라이머를 사용하였다. 음성 반응 패드들을 핵산효소 무함유 물 25 ㎕로 재구성하였다. 양성 반응 패드들을 각각 (200 복제수/반응과 400 복제수/반응의 최종 농도에 도달하기 위해) 8 복제수/㎕ 및 16 복제수/㎕의 열 불활성화된 SARS-CoV-2 바이러스 25 ㎕로 재구성하였다.
그러나, BSA는 해당 장치에 pH 변화를 일으킬 수도 있다. 도 13a와 도 14b는 항온배양 (60분) 후 BSA를 함유하는 음성 종이 패드들이 노란색을 띤 가장자리가 생겼음을 나타낸 것이다. 겔 전기영동으로 용리액을 용출시켜 구동한 후에, 도 13b에 나타낸 바와 같이, 겔에는 DNA 생성물이 보이지 않았는데, 이는 가장자리의 노란색이 표적외 증폭 또는 오염으로 인해 유발되지 않았음을 의미하는 것이다. BSA의 이질적 분포로 인해 가열시 가장자리가 노란색으로 변할 수 있다.
문제해결:
종이 패드 상의 예외적인 핑크색: LAMP 종이 패드를 준비하는 과정에서, 주변 색상과 다른 예외적인 핑색 반점이 있을 수 있는데, 이는 잔류 RNase AWAY가 패드 상에 직접 분사되거나 겸자를 통해 전달되어 발생할 수 있다. RNase AWAY는 첨가된 임의의 RNA/DNA 주형을 분해할 수 있다. 이러한 경우, 모든 장비와 표면을 완전히 건조시키고, 5×6 mm의 새 종이 패드를 절단하여 작업 5의 'LAMP 준비' 섹션을 다시 시작한다.
패드 재구성 후 시약의 넘침: 샘플 로딩 작업 중에, 패드는 재구성을 위해 첨가된 전체 샘플 부피를 흡수하지 못할 수 있다. 주형 농도는 흘러 넘친 패드로 인해 정확하게 제시되지 못할 수 있다. 넘침은 패드의 건조가 불충분하여 발생할 수 있다. 이러한 경우: 1) 장시간 건조시키거나, 2) 열 건조 (37℃의 깨끗한 미생물 항온배양기에 놓고; Bst 2.0 WarmStart® 중합효소의 활성화를 방지하기 위해 온도를 45℃보다 높게 설정하지 않음) 또는 대류 건조 (건조 도중에 공기 흐름을 향상시키기 위해 작은 팬을 사용함)와 같은 강화된 건조 방법을 사용하거나, 또는 3) 재구성 부피를 20 ㎕로 감소시킨다.
음성 대조군은 색상 변화를 나타낸다: 이미지 촬영 및 항온배양 작업 중에, 음성 패드는 샘플 함유 패드와 동시에 또는 직후에 변화될 수 있다. 이는 프라이머 이합체화/비특이적 증폭 또는 직전 LAMP 반응의 이월 오염물로 인해 발생할 수 있다. 이를 해결하려면, 이들을 종이 상에 사용하기 전에 액체 기반 LAMP에서 프라이머를 검증한다. 이월 오염을 제어하기 위해서는, 1) 모든 LAMP 반응에서 dUTP 및 UDG를 도입하고, 2) LAMP 혼합물 준비와 샘플 첨가를 위한 별도의 작업장을 유지하며, 3) 시약 스톡을 분취하여 오염이 발생한 것으로 의심되는 경우에 새로운 분취량을 사용한다. 해당 반응을 과도하게 항온배양하게 되면, 비특이적 증폭을 유도할 수도 있다. 75분의 항온배양 시간을 초과하지 않는다.
샘플 pH와 완충능은 비색 판독치에 영향을 미칠 것이다: 페놀 레드는 pH 지시약이기 때문에, 샘플의 pH와 완충능은 분석에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 5-10% v/v (물로 희석)의 타액 농도가 본원에 제시된 시약 조성물과 잘 작용하는 것으로 확인되었다. 5% 타액을 선택한 이유는 그 농도가 반응 시간이 더 빠르며 일관된 결과를 나타내기 때문이다. 사람의 타액에는 중탄산염, 인산염 및 단백질을 포함하는 정교한 완충 시스템이 있어서, 높은 타액 농도에서 pH 변화 (이에 따른 색상 변화)를 방지한다. 비강 면봉을 물에 재현탁한 종이 LAMP 장치를 시험한 결과 샘플 매트릭스에서 어떠한 억제도 나타나지 않았다. 비색 판독치는 완충염 용액 (예: 운송 매질)에 의해 방해를 받을 수도 있다.
실시예 14 - 불활성화된 바이러스로 처리되지 않은 타액의 종이 상의 검출 한계.
도 15에 도시된 바와 같이, 열 불활성화된 SARS-CoV-2 바이러스로 처리되지 않은 전체 타액은 타액 1 ㎕당 약 20복제수의 검출 한계를 검증하였다. 모인 타액의 분취량 (30개 분취량)을 음성 샘플로서 사용하여 다양한 샘플 농도, 예컨대 20 복제수/㎕ (1x LoD - 10개 샘플), 40 복제수/㎕ (2x LoD - 10개 샘플), 100 복제수/㎕ (2개 샘플), 1000 복제수/㎕ (2개 샘플), 10,000 복제수/㎕ (2개 샘플), 100,000 복제수/㎕ (2개 샘플), 1,000,000 복제수/㎕(2개 샘플)를 생성하였다. 이미지 처리를 통해 결과를 확인하였다.
PH 민감성 신호 출력을 최대화하는 시약 조성물
실시예 15 - 샘플 LAMP 염료
실시예 16 -
형광 리포터는 특수한 장비 없이 판독할 추가의 자외선 (UV) 광원을 사용한다. 그러나, 페놀 레드를 지시약으로 사용하는 비색 분석은 UV 광을 사용하지 않고, 육안으로 해석할 수 있다. DNA의 중합은 양성자를 생성하며 페놀 레드는 pH에 반응한다. pH 변화를 측정하기 위해 희석된 타액 (최종 농도 5%)을 사용하여 타액의 완충능을 극복하였다. 타액을 5% 최종 농도로 희석하면 간섭 물질 (예: RNase)의 농도도 감소된다.
또한, 운반체 DNA와 구아니딘 염산염을 통합하였더니, LoD가 향상되고 물과 타액에서 유사한 비색 반응을 제공하였다. 운반체 DNA가 LAMP 결과를 증가시키는 메커니즘은 명확하지 않았다. NEB 1kb DNA 사다리 (NEB-N3232L)를 사용하여 이 메커니즘을 연구하였다. 다양한 농도의 운반체 DNA (0.3 ng/㎕ 및 0.75 ng/㎕)를 사용하여 LoD에 미치는 영향을 연구하였다. 염화구아니딘 (40 mM)도 사용하였다. 완전한 마스터 믹스의 pH는 7.6으로 유지하였고, 동일한 조건을 운반체 DNA 없이도 시험하였다. pH 6.5의 신선한 타액 (5%)을 사용하여 열 불활성화된 SARS-CoV-2 및 염화구아니딘와 함께 반응당 1000 복제수 내지 62.5 복제수의 농도 범위에서 운반체 DNA의 효과를 시험하였다 (도 6d).
구아니딘 염산염은 LAMP의 민감도를 증가시키는 것으로 나타났다. pH 7.6의 NEB Warmstart™ 비색 마스터 믹스에 구아니딘 염산염 40 mM을 첨가하여 우리의 프라이머 세트의 성능을 시험하였다. pH 6.5의 모은 타액 (5%)을 사용하여 열 불활성화된 SARS-CoV-2와 염화구아니딘의 효과를 반응당 1000 복제수 내지 62.5 복제수의 농도 범위에서 시험하였다. 또한, 이 동일한 조성물을 대조군으로서 염화구아니딘을 첨가하지 않고도 시험하였다. 염화구아니딘은 반복실험의 감도를 증가시켰고 반복실험에 걸쳐 일관된 증폭을 보였다 (도 6e).
페놀 레드와 형광 염료가 LAMP 기반 핵산 증폭을 보이는 서로 다른 메커니즘으로 인해, 시간의 경과에 따른 신호 측정에서의 이러한 차이를 연구하였다. Warmstart™ 비색분석용 LAMP 2x 마스터 믹스와 LAMP 형광 염료의 조합으로 FrameStar 96-웰 스커트형 (skirted) 광학 바닥 플레이트에서 반응을 준비하고, Thermo Scientific™ 접착 플레이트 씰로 밀봉한 후, 항온배양 및 흡광도와 형광 강도 측정을 위해 Clariostar™ Plus 마이크로플레이트 판독기 (BMG)에 배치하였다. 시간의 경과에 따른 색상 변화는 A432 nm /A560 nm의 비율로 나타내었다. 흡광도 값은 A432 nm와 A560 nm에서 A620 nm를 차감하여 기저선 보정을 하였다.
도 16에 기초하면, 반응에서의 색상 변화는 형광 변화에 비해서는 늦게 일어났다. 비색 및 형광측정 데이터는 BMG CLARIOstar® Plus 플레이트 판독기에서 수집하였다. 반응 베이스 믹스는 NEB 2x 비색측정용 LAMP 마스터 믹스, 2.5 ㎕의 프라이머 믹스, NEB LAMP 형광 염료 (NEB B1700A)의 1:100 희석액 5 ㎕로 구성되었다. 플레이트 판독기의 챔버 온도는 플레이트를 삽입하기 전에 65℃로 평형을 이루도록 하였다. 물에 희석시킨 5 ㎕의 열 불활성화된 바이러스를 반응 베이스 믹스에 첨가하여 표시된 대로 최종 반응 농도를 생성하였다 (양성 반응). NTC 반응의 경우, 핵산효소 무함유 물 5 ㎕를 반응 베이스 믹스에 첨가하였다. 이러한 변화에서의 차이는, pH 기반 리포터가 형광 리포터보다 LAMP 기반 DNA 증폭에 대해 더 느린 반응을 제공한다는 것을 시사하였다.
실시예 17 -
종이는 수백만 개의 장치까지 확장시킬 수 있지만, RT-LAMP 시약을 종이에 놓았을 경우, 증폭이 발생하지 않았음에도 불구하고 음성 대조군을 사용한 경우에도 종이 색상이 변화하였다. 이 색상 변화에 대한 한 가지 가능성은 RT-LAMP 혼합물에 존재하는 황산암모늄의 산화 특성과 열로 인한 셀룰로오스의 산화이다. 이러한 색상 변화에 대한 또 다른 가능성은 RT-LAMP 혼합물의 암모니아의 가스 제거로 인한 시약의 산성화이다. 황산암모늄을 제거하면 음성 대조군의 색상이 유지되었다. 항산화제 역할을 하는 페놀 레드의 농도를 증가시키면, 도 11에 도시된 바와 같이 음성 대조군의 색도 유지되었다.
실시예 18 - 비색분석용 염료의 스크리닝
다음 세 부류의 비색 지시약을 종이 기반 분석에서 평가하였다: (i) 마그네슘 비색 지시약, (ii) pH 비색 지시약 및 (iii) DNA 삽입 비색 지시약.
마그네슘 지시약의 경우, 칼마자이트 (CAS# 3147-14-6), 크실리딜 블루 I (CAS# 14936-97-1), 클로로포스포나조 III (CAS# 1914-99-4), o-크레졸프탈레인 컴플렉손 (CAS# 2411-89-4), Eriochrome® Black T (EBT, CAS# 1787-61-7) 및 하이드록시 나프톨 블루 (HNB, CAS# 63451-35-4)를 스크리닝하였다.
pH 지시약의 경우, 브로모티몰 블루 (CAS# 76-59-5), 산성 푹신(CAS# 3244-88-0), 니트라진 옐로우 (CAS# 5423-07-4), 크레졸 레드 (CAS# 1733-2-6), 크레졸 레드 나트륨염 (CAS# 62625-29-0), 커큐민 (CAS# 458-37-7), 페놀 레드 (CAS# 143-74-8), 페놀 레드 나트륨염 (CAS# 34487-61-1), 브릴리언트 옐로우 (CAS# 3051-11-4), o-크레졸프탈레인 (CAS# 596-27-0), m-크레졸 퍼플 (CAS# 2303-01-7), m-크레졸 퍼플 나트륨염 (CAS #62625-31-4), α-나프톨프탈레인 (CAS# 596-01-0) 및 뉴트럴 레드 (CAS# 553-24-2)를 스크리닝하였다.
DNA 삽입 염료의 경우, 크리스탈 바이올렛 (CAS# 548-62-9)을 스크리닝하였다.
많은 마그네슘 지시약들은 종이에서 일관된 색상 변화를 일으키지 않았다. 금속 이온 지시약 (칼마자이트 및 EBT)은 폴리머라제 반응의 부산물인 피로인산마그네슘의 형성으로 인해 RT-LAMP 실험 전반에 걸쳐 농도가 감소한 용액 중에서 마그네슘(II) 이온과 상호작용하였다.
도 17a는 게놈 DNA를 주형으로 사용하는 LAMP 반응 전반에 걸쳐 다양한 농도에서 칼마자이트의 비색 반응을 나타낸 것이다. LAMP 검출은 칼마자이트 (마그네슘 지시약)의 농도를 증가시키면서 수행하였다. 히스토필루스 솜니 (Histophilus somni) 게놈 DNA를 표적으로 하는 lolB.3 프라이머 세트를 사용하였다. 양성 반응은 0.2 ng/㎕ 농도의 HS gDNA 5 ㎕로 스파이킹하였다. 음성 반응에는 핵산효소 무함유 물 5 ㎕를 사용하였다. 총 반응 부피는 25 ㎕였다. 12.5 ㎕의 NEB Warmstart 2x 마스터 믹스, 2.5 ㎕의 프라이머 믹스, 상기 주형 (양성 반응) 또는 물 (음성) 5 ㎕, 및 물에 준비된 칼마자이트 5 ㎕를 사용해 반응을 준비하여 표시된 최종 농도를 맞추었다.
시험한 농도에서, LAMP 반응 동안 시각적인 변화는 감지되지 않았다. EBT는 LAMP 반응의 0분과 60분 시점 사이에 보라색에서 진한 파란색으로 감지할 수 있는 색상 변화를 나타냈지만; 그 색상 변화가 명확하지 않아서 임상적 환경에서의 해석을 방해할 수 있다.
도 17b에 도시된 바와 같이, LAMP 검출은 Eriochrome® Black T (마그네슘 지시약)의 농도를 증가시키면서 수행하였다. 히스토필루스 솜니 게놈 DNA (gDNA)를 표적으로 하는 lolB.3 프라이머 세트를 사용하였다. 양성 반응은 0.2 ng/㎕ 농도의 HS gDNA 5 ㎕로 스파이킹하였다. 음성 반응에는 핵산효소 무함유 물 5 ㎕를 사용하였다. 총 반응 부피는 25 ㎕이다. 12.5 ㎕의 NEB Warmstart 2x 마스터 믹스, 2.5 ㎕의 프라이머 믹스, 상기 주형 (양성 반응) 또는 물 (음성) 5 ㎕, 및 물에서 제조된 EBT 5 ㎕를 사용해 반응을 준비하여 표시된 최종 농도를 맞추었다.
추가로, EBT를 이용해 종이 상에서 LAMP를 사용하면 감지할 수 있는 색상 변화가 나타나지 않았다. 도 17c에 도시된 바와 같이, LAMP 검출은 PCR 튜브의 크로마토그래피 종이에서 Eriochrome® Black T의 농도를 증가시키면서 수행하였다. 히스토필루스 솜니 게놈 DNA를 표적으로 하는 lolB.3 프라이머 세트를 사용하였다. 양성 반응은 0.2 ng/㎕ 농도의 H. 솜니 gDNA 5 ㎕로 스파이킹하였다. 음성 반응에는 핵산효소 무함유 물 5 ㎕를 사용하였다. 총 반응 부피는 25 ㎕였다. 12.5 ㎕의 NEB Warmstart 2x 마스터 믹스, 2.5 ㎕의 프라이머 믹스, 상기 주형 (양성 반응) 또는 물 (음성) 5 ㎕, 및 핵산효소 무함유 물에서 제조된 EBT (300 μM) 5 ㎕를 사용해 반응을 준비하였다. EBT 반응의 경우, 반응은 핵산효소 무함유 물에서 제조된 25 ㎕의 EBT (300 μM)로 구성되었다.
수개의 서로 다른 유형의 종이를 스크리닝하여 PES와 폴리설폰 BTS 0.8에서 증폭이 일어나고 있음을 겔 전기영동을 통해 확인한 결과, 어떤 종이에서도 비색 변화를 검출할 수 없었다 (도 17d 및 도 17e).
도 17d에 도시된 바와 같이, LAMP 검출은 다수의 종이에 대해 수행되었다: 크로마토그래피 1등급, 음이온 교환 나일론, 양이온 교환 나일론, 폴리에테르 설폰 막, 비대칭형 초미립자 폴리설폰 (BTS 0.8), 비대칭 초미립자 폴리설폰 (BTS 100) 및 하이드록실화 나일론 1.2. b) 60분에 패널 a의 종이에 대한 엔드포인트 스캔 (Endpoint scan, 단 1회의 스캔) 및 c) 60분에 추출된 LAMP 생성물의 겔 전기영동 (2% 아가로스) 스캔. 히스토필루스 솜니 (HS) 게놈 DNA를 표적으로 하는 lolB.3 프라이머 세트를 사용하였다. 양성 반응은 0.2 ng/㎕ 농도의 H. 솜니 gDNA 5 ㎕로 스파이킹하였다. 음성 반응에는 핵산효소 무함유 물 5 ㎕를 사용하였다. 총 반응 부피는 25 ㎕이다. 12.5 ㎕의 NEB Warmstart 2x 마스터 믹스, 2.5 ㎕의 프라이머 믹스, 상기 주형 (양성 반응) 또는 물 (음성) 5 ㎕, 및 핵산효소 무함유 물에서 제조된 EBT (300 μM) 5 ㎕를 사용해 반응을 준비하였다. (표시된) 종이를 25 ㎕의 반응물이 들어 있는 PCR 튜브에 넣고 반응 과정 동안 종이로 흡수하였다. 60분 후, 종이를 꺼내어 스캔하였다. 겔은 30을 사용하여 추출하였다.
도 17e에 도시된 바와 같이, 결과는 a) PCR 튜브, b) 60분에 종이에서 추출된 DNA의 겔 전기영동 (2% 아가로스) 및 c) 60분에 스캔된 종이에서 시간 경과에 따라 생성되었다. 히스토필루스 솜니 (HS) 게놈 DNA를 표적으로 하는 lolB.3 프라이머 세트를 사용하였다. 양성 반응은 0.2 ng/㎕ 농도의 H. 솜니 gDNA 5 ㎕로 스파이킹하였다. 음성 반응에는 핵산효소 무함유 물 5 ㎕를 사용하였다. 총 반응 부피는 25 ㎕이다. 12.5 ㎕의 NEB Warmstart 2x 마스터 믹스, 2.5 ㎕의 프라이머 믹스, 상기 주형 (양성 반응) 또는 물 (음성) 5 ㎕, 및 핵산효소 무함유 물에서 제조된 EBT (300 μM) 5 ㎕를 사용해 반응을 준비하였다. 바이오다인 A 양쪽성 종이를 25 ㎕의 반응물이 들어 있는 PCR 튜브에 넣고 반응 과정 동안 종이로 흡수하였다. 60분 후, 종이를 꺼내어 스캔하였다.
부수적으로, RT-LAMP 반응을 위한 용액에서 크리스탈 바이올렛 지시약을 안정화하는 것은 어려웠다. 크리스탈 바이올렛의 불안정한 유도체인 류코 (Leuco) 크리스탈 바이올렛 (LCV)의 경우, 용액 중에서 무색으로 안정성을 유지하기 위해 과량의 아황산나트륨을 사용하였다. 물에 용해시키기 위해, LCV는 아황산나트륨 (SS)과 베타-사이클로덱스트린 (BCD)을 사용하였다. dsDNA에 결합시, LCV는 크리스탈 바이올렛 (예컨대, 용액 중의 바이올렛)으로 다시 변환된다. 그 결과, RT-LAMP 반응 내내 증폭의 결과로서 더 많은 dsDNA가 생성되었고, 용액의 색상이 무색에서 보라색으로 변할 것으로 예상하였다. 그러나, 다양한 농도의 CV에서 LAMP 반응을 수행했을 경우, 양성 반응과 음성 반응 모두에서 색상의 변화가 발생하였다.
도 17f에 도시된 바와 같이, 용액 중의 삽입 염료인 크리스탈 바이올렛 및 b) 60분에서 생성물의 관련 겔 전기영동 (2% 아가로스) 스캔으로 LAMP 검출을 수행하였다. H. 솜니 gDNA를 표적으로 하는 lolB.3 프라이머 세트를 사용하였다. 양성 반응은 0.2 ng/㎕ 농도의 H. 솜니 gDNA 5 ㎕로 스파이킹하였다. 음성 반응에는 핵산효소 무함유 물 5 ㎕를 사용하였다. 총 반응 부피는 25 ㎕였다. 12.5 ㎕의 NEB Warmstart 2x 마스터 믹스, 2.5 ㎕의 프라이머 믹스, 상기 주형 (양성 반응) 또는 물 (음성) 5 ㎕, 및 핵산효소 무함유 물에서 제조된 크리스탈 바이올렛 5 ㎕를 사용해 반응을 준비하여 표시된 최종 농도를 맞추었다. 종이를 25 ㎕의 반응물이 들어 있는 PCR 튜브에 넣고 반응 과정 동안 종이로 흡수하였다. 60분 후, 종이를 꺼내어 스캔하였다. 아황산나트륨과 사이클로덱스트린을 사용하여 크리스탈 바이올렛을 가용화시켰다.
양성 반응에서는 증폭이 일어나고 음성 반응에서는 그렇지 않음을 확인하기 위해, RT-LAMP 용액을 2% 아가로스 겔에서 구동하였는데, 여기서 상기 양성 반응은 검사된 CV의 모든 농도에서 증폭을 나타냈던 반면에, 상기 음성 반응은 검사된 CV의 어떤 농도에서도 증폭되지 않았음이 나타났다. 이에 따라, 음성 반응에서의 색상 변화는, 증폭된 DNA의 결합 때문이 아니라, LCV에서 CV로의 분해에 의해 야기되었다.
다양한 농도의 CV, SS 및 BCD에서 종이 상의 CV에 대한 추가의 검사는 음성 반응과 양성 반응을 구분할 수 없었던 결과를 제공하였다. 도 17g에 도시된 바와 같이, 종이 상에서, 삽입 염료인 크리스탈 바이올렛 (CV)을 사용하는 LAMP 검출에 대해 엔드포인트 비색 스캔을 수행하였다. 아황산나트륨 (SS)과 베타-사이클로덱스트린 (BCD)을 사용하여 CV를 가용화시켰다. 12.5 ㎕의 NEB Warmstart™ 2x 마스터 믹스, 2.5 ㎕의 프라이머 믹스, 상기 주형 (양성 반응) 또는 물 (음성) 5 ㎕, 및 핵산효소 무함유 물에서 표시된 농도로 제조된 CV 5 ㎕를 사용해 제조된 25 ㎕의 LAMP 반응물을 종이에 로딩하였다.
마지막으로, 약 7.0의 색 전이 pH를 갖는 약 2 pH 단위의 범위를 커버하는 수개의 비색 pH 지시약을 검사하여 RT-LAMP 반응의 예상되는 pH 범위 변화와 전이점과 매칭시켰다. 이러한 범위들은 우리의 LAMP 비색 마스터 믹스의 초기의 시작 pH를 기반으로 선택하기도 하였지만, 타액의 완충능을 극복하기 위해서도 선택하였다. 상기 선택 과정에서 한 가지 예외가 있었다면 산성 푹신이었는데, 이것은 3.0 pH의 범위를 커버하며 5.0의 색 전이 pH를 가진다. 도 17h 내지 17k는 선택된 pH 지시약의 다양한 농도와 함께 60분에 LAMP 반응의 관련 겔 전기영동 결과를 함께 나타낸 것이다.
도 17h에 도시된 바와 같이, RT-LAMP 검출은 용액 중에서 크레졸 레드 나트륨염, 뉴트럴 레드, 페놀 레드 나트륨염, m-크레졸 퍼플, 및 m-크레졸 퍼플 나트륨염 (pH 지시약)의 농도를 증가시키면서 수행하였다. SARS-CoV-2의 N 유전자를 표적으로 하는 N.10 프라이머 세트를 사용하였다. 0.2 ng/㎕의 농도에서 시험관내 전사된 N 유전자 RNA 5 ㎕로 양성 반응을 스파이크하였다. 음성 반응에는 핵산효소 무함유 물 5 ㎕를 사용하였다. 총 반응 부피는 25 ㎕였다. 12.5 ㎕의 NEB Warmstart™ 2x 마스터 믹스, 2.5 ㎕의 프라이머 믹스, 상기 주형 (양성 반응) 또는 물 (음성) 5 ㎕, 및 핵산효소 무함유 물중의 지정된 농도에서 표시된 pH 지시약 5 ㎕를 사용해 반응을 준비하였다. 반응은 항온배양기에서 수행하였으며 평판 스캐너를 사용하여 매 20분마다 스캔하였다.
도 17i에 도시된 바와 같이, 크레졸 레드 (pH 지시약)의 농도를 증가시키면서 LAMP 검출을 수행하였다. H. 솜니 gDNA를 표적으로 하는 lolB.3 프라이머 세트를 사용하였다. 양성 반응은 0.2 ng/㎕ 농도의 H. 솜니 gDNA 5 ㎕로 스파이킹하였다. 음성 반응에는 핵산효소 무함유 물 5 ㎕를 사용하였다. 총 반응 부피는 25 ㎕이다. 12.5 ㎕의 NEB Warmstart™ 2x 마스터 믹스, 2.5 ㎕의 프라이머 믹스, 표시된 최종 반응 농도를 유도하는 5 ㎕의 크레졸 레드, 및 상기 주형 (양성 반응) 또는 물 (음성) 5 ㎕를 사용해 반응을 준비하였다.
도 17j에 도시된 바와 같이, RT-LAMP 검출은 용액 중에서 크레졸 레드, 나트륨염, m-크레졸 퍼플, 브로모티몰 블루 및 산성 푹신의 농도를 증가시키면서 수행하였으며, b) 60분에 생성물의 관련 겔 전기영동 (2% 아가로스) 스캔을 수행하였다. SARS-CoV-2의 N 유전자를 표적으로 하는 N.10 프라이머 세트를 사용하였다. 0.2 ng/㎕의 농도에서 시험관내 전사된 N 유전자 RNA 5 ㎕로 양성 반응을 스파이크하였다. 음성 반응에는 핵산효소 무함유 물 5 ㎕를 사용하였다. 12.5 ㎕의 NEB Warmstart 2x 마스터 믹스, 2.5 ㎕의 프라이머 믹스, 상기 주형 (양성 반응) 또는 물 (음성) 5 ㎕, 및 표시된 pH 지시약 5 ㎕를 사용해 반응을 준비하여 표시된 최종 반응 농도를 맞추었다. 65℃로 설정된 항온배양기에서 가열을 수행하였고 평판 스캐너에서 20분마다 스캔하였다.
도 17k에 도시된 바와 같이, RT-LAMP 생성물의 엔드포인트 겔 전기영동 스캔 (60분)을 2% 아가로스 겔에서 수행하였다.
도시된 대로, 양성 반응과 음성 반응 사이에 뚜렷한 비색 반응을 생성하는 하나의 pH 지시약은 크레졸 레드였다. 추가로, 해당 용액에 HCl 및 KOH를 첨가하여 발생하는 다양한 초기 pH 값과 관련하여 페놀 레드 (NEB의 비색 RT-LAMP 키트에 사용되는 pH 지시약)도 평가하여 표시된 초기 pH 값을 제공하였다.
도 17l에 도시된 바와 같이, 용액 중 pH 8.1, 8.5 및 8.8에서 페놀 레드 (pH 지시약)로 RT-LAMP 검출을 수행하였다. 주형 RNA를 첨가하기 전에 HCl 및 KOH로 조정하였다. SARS-CoV-2의 N 유전자를 표적으로 하는 N.10 프라이머 세트를 사용하였다. 0.2 ng/㎕의 농도에서 시험관내 전사된 N 유전자 RNA 5 ㎕로 양성 반응을 스파이크하였다. 음성 반응에는 핵산효소 무함유 물 5 ㎕를 사용하였다. 반응물은 상술한 대로 20 ㎕의 마스터 믹스와 5 ㎕의 주형 (양성) 또는 핵산효소 무함유 물 (음성)로 구성되었다. (NH4)2SO4 (20 mM), KCl (100 mM), MgSO4 (16 mM), dNTP 믹스 (dNTP당 28 mM), tween 20 (0.2% v/v)으로 마스터 믹스 10 mL를 제조하였다. 이에 따르면, 페놀 레드는 크레졸 레드와 비교했을 때 양성 반응과 음성 반응 간에 대비 수준이 더 높았다.
결과적으로, pH 6.5 부근에서 색상 변화가 있는 pH 지시약은 가장 일관되고 가장 대조적인 색상 변화를 나타냈다 (예: 페놀 레드).
실시예 19 - 종이에 대한 시작 pH의 영향
우리의 방법에 건조 과정을 도입한 경우에 대한 색상 안정성을 평가하기 위해, LAMP 마스터 믹스의 pH를 8.0, 8.5로 조정하거나, 또는 조정하지 않은 상태 (예: 7.6)로 유지하고, 재수화에 사용된 물 또는 합성 RNA (N 유전자, 0.2 ng/㎕)도 8.0, 8.5로 조정하거나, 또는 조정하지 않은 상태 (예: 5.5)로 유지하였다.
도 18에 도시된 바와 같이, pH 7.6은 RT-LAMP 반응 혼합물의 조정되지 않은 pH이다. 습식 설정이란 5 ㎕의 합성 RNA (N 유전자, 0.2 ng/㎕, '+') 또는 물 ('-')이 20 ㎕의 LAMP 반응 마스터 믹스를 첨가한 직후에 첨가되었음을 의미한다. 건식 설정이란 20 ㎕의 LAMP 마스터 믹스를 적용한 후 실온에서 30분간 종이 스트립을 건조시킨 후, 25 ㎕의 합성 RNA ('+') 또는 물 ('-')로 재수화했음을 의미한다.
pH를 8.0으로 조정하였더니, 음성 대조군에서 색상 안정성이 더 좋아졌던 반면에, pH 8.5는 너무 높아서 120분의 항온배양 후 표준 및 건식 설정에서 식별가능한 색상 변화가 있지 않았다. pH를 조정하지 않은 상태로 두었던 경우, 대조군을 로딩한 경우에도 색상이 변화되었다.
실시예 20 - RT-LAMP 비색 반응에 대한 트레할로스 및 Tween 20의 영향
도 19b는 주어진 농도에서 트레할로스 또는 Tween 20을 포함한 경우에 대한 비색 RT-LAMP 결과를 나타낸 것이다. orf1ab.II 프라이머 세트를 사용하였다. KCl (50 mM), MgSO4 (8 mM), 등몰의 dNTP 혼합물 (dNTP당 1.4 mM), WarmStart BST 2.0 (0.32 U/㎕), WarmStart RTx (0.3 U/㎕), 페놀 레드 (0.25 mM), dUTP (0.14 mM), 남극 UDG (0.0004 U/㎕), Tween 20 (표시된 경우, 1% v/v), 베타인 (20 mM), BSA (40 mg/mL) 및 트레할로스 (표시된 경우, 10% w/v)의 기본 제제를 함유하는 RT-LAMP 마스터 믹스 20 ㎕를 1등급 크로마토그래피 용지 (5 mm×20 mm)에 첨가하고 PCR 준비 후드 안에서 60분 동안 건조시켰다. 25% 처리된 타액 (양성 반응) 또는 핵산효소 무함유 물 (음성 반응) 중에서 반응당 1×105 개의 복제수의 최종 농도로 열 불활성화된 SARS-CoV-2 25 ㎕를 건조 반응 패드에 첨가하였다. 상기 패드를 65℃로 설정된 항온배양기에서 60분간 가열한 후, 평판 스캐너를 사용하여 스캔하였다.
황산암모늄을 포함시켰더니, 주형이 없었던 경우에 RT-LAMP 시약 건조시 빨간색에서 노란색으로 색상이 변하였다. 이러한 색상 변화는 페놀 레드 농도를 증가시키고 황산암모늄을 베타인으로 대체함으로써 방지되었다 (도 19a). 또한, 트레할로오스와 소 혈청 알부민 (BSA)의 첨가는 반응 속도를 증가시키고 LoD도 증가시켰다 (도 19b).
예시적 실시형태
한 실시예에서, pH 민감성 염료; 및 다수의 비간섭성 LAMP 시약을 포함하는, pH 의존성 출력 신호를 활용하는 루프 매개형 등온 증폭 (LAMP) 분석을 위한 조성물이 제공된다.
pH 의존성 출력 신호를 이용하는 루프 매개형 등온 증폭 (LAMP) 분석을 위한 조성물의 한 예에서, pH 민감성 염료는 페놀 레드, 페놀프탈레인, 아졸리트민, 브로모티몰 블루, 나프톨프탈레인, 크레졸 레드, 또는 이들의 조합 중 적어도 하나일 수 있다.
pH 의존성 출력 신호를 이용하는 루프 매개형 등온 증폭 (LAMP) 분석을 위한 조성물의 한 예에서, 복수의 비간섭성 LAMP 시약에는 휘발성 시약, pH 간섭성 시약, 마그네슘 간섭성 시약, 또는 이들의 조합이 실질적으로 없을 수 있다.
pH 의존성 출력 신호를 이용하는 루프 매개형 등온 증폭 (LAMP) 분석을 위한 조성물의 한 예에서, 복수의 비간섭성 LAMP 시약에는 마그네슘, 황산암모늄 또는 탄산암모늄이 실질적으로 없을 수 있다.
pH 의존성 출력 신호를 이용하는 루프 매개형 등온 증폭 (LAMP) 분석을 위한 조성물의 한 예에서, 복수의 비간섭성 LAMP 시약은 DNA 중합효소, 역전사효소, 표적 프라이머 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
pH 의존성 출력 신호를 이용하는 루프 매개형 등온 증폭 (LAMP) 분석을 위한 조성물의 한 예에서, 조성물은 항산화제를 추가로 포함할 수 있다.
pH 의존성 출력 신호를 이용하는 루프 매개형 등온 증폭 (LAMP) 분석을 위한 조성물의 한 예에서, 조성물은 운반체 RNA, 운반체 DNA, RNAase 억제제, DNAase 억제제, 구아니딘 염산염 또는 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있다.
pH 의존성 출력 신호를 이용하는 루프 매개형 등온 증폭 (LAMP) 분석을 위한 조성물의 한 예에서, LAMP 분석은 역전사 LAMP (RT-LAMP)일 수 있다.
pH 의존성 출력 신호를 이용하는 루프 매개형 등온 증폭 (LAMP) 분석을 위한 조성물의 한 예에서, 조성물은 고체상 매질을 추가로 포함할 수 있다.
pH 의존성 출력 신호를 이용하는 루프 매개형 등온 증폭 (LAMP) 분석을 위한 조성물의 한 예에서, 조성물은 당, 완충제, 차단제, 또는 이들의 조합을 포함하는 변색 방지용 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
pH 의존성 출력 신호를 이용하는 루프 매개형 등온 증폭 (LAMP) 분석을 위한 조성물의 한 예에서, 조성물은 트레할로스, 글루코스, 수크로스, 덱스트란, 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 포함하는 당을 추가로 포함할 수 있다.
pH 의존성 출력 신호를 이용하는 루프 매개형 등온 증폭 (LAMP) 분석을 위한 조성물의 한 예에서, 조성물은 소혈청 알부민, 카세인 또는 이들의 조합을 포함하는 차단제를 추가로 포함할 수 있다.
한 예에서, pH 의존성 출력 신호를 이용하여 LAMP 분석을 수행하는 방법으로서, 상기 방법이 고체상 매질과 본원에 언급된 조성물의 어셈블리를 제공하는 단계, 생체 샘플을 고체상 매질 상에 침착시키는 단계, 및 LAMP 반응을 촉진하기에 충분한 등온 온도로 상기 어셈블리를 가열하는 단계를 포함하는 것인, 방법이 제공된다.
한 예에서, pH 의존성 출력 신호를 이용하여 LAMP 분석을 수행하는 방법에서, 생체 샘플은 타액, 점액, 혈액, 소변, 대변, 땀, 호기 응축물, 또는 이들의 조합 중 하나 이상일 수 있다.
한 예에서, pH 의존성 출력 신호를 이용하여 LAMP 분석을 수행하는 방법에서, 생체 샘플은 타액일 수 있다.
한 예에서, pH 의존성 출력 신호를 이용하여 LAMP 분석을 수행하는 방법은 바이러스 병원체를 검출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
한 예에서, pH 의존성 출력 신호를 이용하여 LAMP 분석을 수행하는 방법에서, 상기 LAMP 분석은 역전사 LAMP (RT-LAMP)일 수 있다.
한 예에서, pH 의존성 LAMP 분석에서 출력 신호의 정확도를 최대화하는 방법으로서, 상기 방법이 신호 출력 매질에서 비-LAMP 반응이 일으킨 변색을 최소화하는 시약 혼합물을 제공하는 단계 및 LAMP 반응을 수행하는 단계를 포함하는 것인, 방법이 제공된다.
또 다른 예에서, pH 의존성 LAMP 분석에서 출력 신호의 정확도를 최대화하는 방법에서, 상기 방법은 비-LAMP 반응에서 양성자의 생성을 제어하는 단계를 포함할 수 있다.
한 예에서, pH 의존성 LAMP 분석에서 출력 신호의 정확도를 최대화하는 방법에서, 상기 방법은 비-LAMP 반응에서 산화를 제어하는 단계를 포함할 수 있다.
한 예에서, pH 의존성 LAMP 분석에서 출력 신호의 정확도를 최대화하는 방법으로서, 상기 방법이 신호 출력 매질에서 비-LAMP 반응이 일으킨 변색을 실질적으로 제거하는 단계를 포함하는 것인, 방법이 제공된다.
한 예에서, pH 의존성 LAMP 분석에서 검출 수준 (LOD)을 최대화하는 방법으로서, 상기 방법이 신호 출력 매질에서 비-LAMP 반응이 일으킨 변색을 실질적으로 제거하는 단계를 포함하는 것인, 방법이 제공된다.
전술한 방법들은 본 발명의 일부 실시형태들에 대한 예시일 뿐이라는 것을 이해해야 한다. 본 발명의 개념과 범위를 벗어나지 않으면서 당업자라면 누구나 이에 대한 수많은 변형과 대안적 방식들이 고안될 수 있으며, 첨부된 청구범위는 이러한 변형과 방식들도 망라하고자 한다. 따라서, 현재 본 발명 중에서 가장 실용적이고 바람직한 실시형태들로 간주되는 것과 관련해서 구체적이고 상세하게 본 발명을 상술하였으나, 본원에 기재된 원리와 개념에서 벗어나지 않으면서 이를 포함하는 변형태들을 실행할 수 있음은 당업자라면 누구나 이해할 수 있을 것이다.

Claims (22)

  1. pH 의존성 출력 신호를 이용하는 루프 매개형 등온 증폭 (LAMP, loop-mediated isothermal amplification) 분석용 조성물로서,
    pH 민감성 염료; 및
    복수의 비간섭성 LAMP 시약을 포함하는 것인, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 pH 민감성 염료가 페놀 레드, 페놀프탈레인, 아졸리트민, 브로모티몰 블루, 나프톨프탈레인, 크레졸 레드, 또는 이들의 조합 중 적어도 하나인 것인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 복수의 비간섭성 LAMP 시약에는 휘발성 시약, pH 간섭성 시약, 마그네슘 간섭성 시약 또는 이들의 조합이 실질적으로 없는 것인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 복수의 비간섭성 LAMP 시약에는 마그네슘, 황산암모늄 또는 탄산암모늄이 실질적으로 없는 것인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 복수의 비간섭성 LAMP 시약이 DNA 중합효소, 역전사효소, 표적 프라이머 또는 이들의 조합을 포함하는 것인, 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 항산화제를 추가로 포함하는, 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 운반체 RNA, 운반체 DNA, RNAase 억제제, DNAase 억제제, 구아니딘 염산염 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는, 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 LAMP 분석이 역전사 LAMP (RT-LAMP)인 것인, 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 고체상 매질을 추가로 포함하는, 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 당, 완충제, 차단제 또는 이들의 조합을 포함하는 변색 방지용 (non-discoloration) 첨가제를 추가로 포함하는, 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 트레할로스, 글루코스, 수크로스, 덱스트란, 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 포함하는 당을 추가로 포함하는, 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 소혈청 알부민, 카제인 또는 이들의 조합을 포함하는 차단제를 추가로 포함하는, 조성물.
  13. pH 의존성 출력 신호를 사용하여 LAMP 분석을 수행하는 방법으로서,
    고체상 매질과 제1항에 기재된 조성물의 어셈블리를 제공하는 단계;
    상기 고체상 매질에 생체 샘플을 침착시키는 단계; 및
    LAMP 반응을 촉진하기에 충분한 등온 온도로 상기 어셈블리를 가열하는 단계를 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 생체 샘플이 타액, 점액, 혈액, 소변, 대변, 땀, 호기 응축물 (exhaled breath condensate), 또는 이들의 조합 중 하나 이상인 것인, 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 생체 샘플이 타액인 것인, 방법.
  16. 제13항에 있어서, 바이러스 병원체를 검출하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  17. 제13항에 있어서, 상기 LAMP 분석이 역전사 LAMP (RT-LAMP)인 것인, 방법.
  18. pH 의존성 LAMP 분석에서 출력 신호의 정확도를 최대화하는 방법으로서,
    신호 출력 매질에서 비-LAMP 반응이 일으킨 변색을 최소화하는 시약 혼합물을 제공하는 단계; 및
    LAMP 반응을 수행하는 단계를 포함하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 비-LAMP 반응에서 양성자의 생성을 제어하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  20. 제18항에 있어서, 비-LAMP 반응에서 산화를 제어하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  21. pH 의존성 LAMP 분석에서 출력 신호의 정확도를 최대화하는 방법으로서,
    신호 출력 매질에서 비-LAMP 반응이 일으킨 변색을 실질적으로 제거하는 단계를 포함하는, 방법.
  22. pH 의존성 LAMP 분석에서 검출 수준 (LOD)을 최대화하는 방법으로서,
    신호 출력 매질에서 비-LAMP 반응이 일으킨 변색을 실질적으로 제거하는 단계를 포함하는, 방법.
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