KR20230097306A

KR20230097306A - 3,5-디카페오일퀴닌산을 유효성분으로 함유하는 항아토피, 항여드름 또는 항염 조성물

Info

Publication number: KR20230097306A
Application number: KR1020210186685A
Authority: KR
Inventors: 임미혜
Original assignee: 주식회사 피프틴디그리즈
Priority date: 2021-12-24
Filing date: 2021-12-24
Publication date: 2023-07-03

Abstract

본 발명은 3,5-디카페오일퀴닌산을 유효성분으로 함유하는 항아토피, 항여드름 또는 항염 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 3,5-디카페오일퀴닌산(3,5-caffeoylquinic acid; 3,5-DCQA)을 유효성분으로 함유함으로써 항염 특성이 우수하고, 특히 항아토피, 항여드름 또는 항염 활성이 매우 우수한 기능성을 발휘할 수 있는 조성물에 관한 것이다. 이러한 본 발명의 조성물은 화장료 조성물, 건강식품 조성물 또는 약제 조성물로 유용하다.

Description

3,5-디카페오일퀴닌산을 유효성분으로 함유하는 항아토피, 항여드름 또는 항염 조성물{Anti-atopic, anti-acne or anti-inflammatory composition containing 3,5-dicaffeoylquinic acid as an active ingredient}

본 발명은 3,5-디카페오일퀴닌산을 유효성분으로 함유하는 항아토피, 항여드름 또는 항염 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 3,5-디카페오일퀴닌산(3,5-caffeoylquinic acid; 3,5-DCQA)을 유효성분으로 함유함으로써 항염 특성이 우수하고, 특히 항아토피, 항여드름 또는 항염 활성이 매우 우수한 기능성을 발휘할 수 있는 조성물에 관한 것이다.

국내에서 자생하는 천연자원은 다양한 효과를 가지고 있어서 바이오 소재로서 각광받고 있다.

한국에서 자생하는 식품로서 곰취 추출물은 화장료 조성물이나 약학적 조성물 등으로 다양하게 활용되고 있다.

특히, 곰취 추출물은 한국특허등록 제10-2041485호, 제10-0824595호 등에서는 3,4-디카페오일퀴닌산 등의 폴리페놀 성분을 다량 함유하고 있으며, 피부에 유용하므로 미세먼지 보호용이나 다양한 기능의 화장료 조성물로 활용할 수 있는 것으로 알려져 있다.

그 외에도 한국특허공개 제10-2007-0016261호에서는 곰취 추출물을 이용한 모발 손상 방지 및 육모용 화장료 조성물, 미국특허공개 제2016-0228394호에서는 퀴닌산 복합체가 노화방지에 효과가 있는 것으로 제안하고 있다.

그러나 이러한 곰취 추출물을 비롯한 기존의 천연 조성물의 경우 부작용이 비교적 적거나 없는 점은 고무적이지만, 대부분 피부개선 효과를 제대로 기대하기 어려운 경우가 대부분이고, 일부는 그 제조공정이 복잡하거나 고가의 가격 부담까지 있어서 제대로 제품화하기 어렵다.

한국특허등록 제10-2041485호 한국특허등록 제10-0824595호 한국특허등록 제10-2007-0016261호 미국특허공개 제2016-0228394호

본 발명은 상기와 같은 종래 기술에서 나타나는 문제점을 개선하기 위하 천연 식물성 소재로부터 피부에 대한 활성이 우수하고 활용도가 높은 활성성분을 찾아내는 것을 해결과제로 한다,

이러한 과제를 해결하기 위해 이러한 천연 바이오 소재를 탐색하던 중 오랜 연구 끝에 곰취 추출물을 효소처리하는 경우 나타나는 다량의 특정 성분이 항아토피와 항여드름 및 항염에 특별히 매우 유용한 효과를 나타낸다는 놀라운 사실을 발명하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 항아토피와 항여드름 또는 항염에 특별히 매우 유용한 효과를 나타내는 조성물을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 3,5-디카페오일퀴닌산을 유효성분으로 함유하는 항아토피, 항여드름 또는 항염 조성물을 제공하는데 있다.

위와 같은 본 발명의 과제 해결을 위하여, 본 발명은 3,5-O-디카페오일퀴닌산(3,5-O-caffeoylquinic acid; 3,5-DCQA)을 유효성분으로 함유하는 항아토피, 항여드름 또는 항염용 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 3,5-O-디카페오일퀴닌산은 3,5-O-디카페오일퀴닌산을 1-50mg/ml 함유하는 효소 처리된 곰취추출물 형태로 함유할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 효소처리된 곰취 추출물은 폴리페놀 총량을 10-150mg/ml로 함유할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 항아토피, 항여드름 또는 항염용 조성물을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항아토피, 항여드름 또는 항염용 조성물을 포함하는 건강식품 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 항아토피, 항여드름 또는 항염용 조성물을 포함하는 약제 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 조성물은 추가로 3,4-디카페오일퀴닌산을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 조성물은 추가로 곰취추출물을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 조성물은 추가로 산양삼을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 항아토피, 항여드름 또는 항염 조성물은 식품으로 섭취 가능한 천연 원료에 함유되어 있는 성분이므로 경구 투여나 피부 적용 등으로 항아토피, 항여드름 또는 항염 기능성을 작용하도록 적용시 부작용이 없이 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 기존의 곰취 추출물과는 달리 효소처리된 곰취추출물의 형태로 함유할 수 있으며, 이 경우 기존의 효소처리하지 않은 곰취추출물에 비해 매우 우수한 항아토피, 항여드름 또는 항염 효과를 발휘할 수 있다.

특히, 본 발명에서는 곰취 추출물 중에서도 3,5-DCQA 성분이 항아토피, 항여드름 또는 항염 효과가 있는 것임을 최초로 확인하여, 3,5-DCQA의 새로운 용도를 발명한 것으로서, 이러한 새로운 용도 발견은 기존의 천연물을 사용하는 경우에 비해 바이오 소재로서 화장품은 물론 건강식품이나 의약품 등에서 그 활용성을 크게 높이는 효과가 있다.

도 1은 본발명의　일　실시예에　따른　곰취　에탄올　추출물에　의한 DPPH　라디칼　소거능을　측정한　결과이다.
도　2는　본　발명의　일　실시예에　따른　곰취　에탄올　추출물에　의한　ABTS　라디칼소거능을　측정한　결과이다.
도　3은　본　발명의　일　실시예에　따른　곰취　에탄올　추출물에　의한　MC/9　세포의세포생존율을　측정한　결과이다.
도　4는　본　발명의　일　실시예에　따른　곰취　에탄올　추출물에　의한　IL4　유전자의　mRNA　발현량을　측정한　결과이다.
도　5는　본　발명의　일　실시예에　따른　곰취　에탄올　추출물에　의한　IL31　유전자의　mRNA　발현량을　측정한　결과이다.
도　6은　본　발명의　일　실시예에　따른　곰취　에탄올　추출물에　의한　IL-4의　단백질　발현량을　측정한　결과이다.
도　7은　본　발명의　일　실시예에　따른　곰취　에탄올　추출물에　의한　IL-31의　단백질　발현량을　측정한　결과이다.
도　8은　본　발명의　일　실시예에　따른　곰취　에탄올　추출물에　의한　히스타민의 단백질　발현량을　측정한　결과이다.
도　9는　본　발명의　일　실시예에　따른　곰취　에탄올　추출물에　의한　RAW264.7　세포의　세포생존율을　측정한　결과이다.
도　10은　본　발명의　일　실시예에　따른　곰취　에탄올　추출물에　의한　NOS2　유전자의　mRNA　발현량을　측정한　결과이다.
도　11은　본　발명의　일　실시예에　따른　곰취　에탄올　추출물에　의한　PTGS2　유전자의　mRNA　발현량을　측정한　결과이다.
도　12는　본　발명의　일　실시예에　따른　곰취　에탄올　추출물에　의한　IL1B　유전자의　mRNA　발현량을　측정한　결과이다.
도　13은　본　발명의　일　실시예에　따른　곰취　에탄올　추출물에　의한　IL6　유전자의　mRNA　발현량을　측정한　결과이다.
도　14는　본　발명의　일　실시예에　따른　곰취　에탄올　추출물에　의한　TNFA　유전자의　mRNA　발현량을　측정한　결과이다.
도　15는　본　발명의　일　실시예에　따른　곰취　에탄올　추출물에　의한　ERK의　단백질　발현량을　측정한　결과이다.
도　16은　본　발명의　일　실시예에　따른　곰취　에탄올　추출물에　의한　JNK의　단백질　발현량을　측정한　결과이다.
도　17은　본　발명의　일　실시예에　따른　곰취　에탄올　추출물에　의한　P38의　단백질　발현량을　측정한　결과이다.
도　18은　본　발명의　일　실시예에　따른　곰취　에탄올　추출물에　의한　NO　생성량을　측정한　결과이다.
도　19는　본　발명의　일　실시예에　따른　곰취　에탄올　추출물에　의한　PGE2　생성량을　측정한　결과이다.
도　20은　본　발명의　일　실시예에　따른　곰취　에탄올　추출물에　의한　IL-1β　생성량을　측정한　결과이다.
도　21은　본　발명의　일　실시예에　따른　곰취　추출물에　의한　IL-6　생성량을　측정한　결과이다.
도　22는　본　발명의　일　실시예에　따른　곰취　추출물에　의한　TNF-a　생성량을　측정한　결과이다.

이하, 본 발명을 하나의 구현예로서 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 천연 성분에서 추출 가능한 폴리페놀 성분으로서, 특히 카페오일퀴닌산을 유효성분으로 함유하는 항아토피, 항여드름 또는 항염용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 조성물은 특히 피부에 직접 적용하여 항아토피, 항여드름 또는 항염 중에서 하나 이상의 효과를 바람직하게 발휘할 수 있다.

본 발명에서 항아토피, 항여드름 또는 항염용 조성물은 경구 투여도 가능하나 피부에 직접 적용하는 경우 보다 바람직하다. 예컨대, 본 발명의 조성물은 화장료 조성물, 이너뷰티용 조성물, 건강식품 조성물, 약제 조성물 등으로 피부에 적용하거나 경구 투여하여 우수한 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명에서 유효성분으로 사용되는 3,5-O-디카페오일퀴닌산은 바람직하게는 곰취추출물에서 유래될 수 있으며, 하기 화학식 1의 구조를 가지는 화합물로서 합성될 수도 있다.

[화학식 1]

본 발명에서는 3,5-O-디카페오일퀴닌산을 유효성분으로 함유하지만 여기에 추가로 다른 카페오일퀴닌산 유도체를 더 포함할 수 있다. 바람직하게는 3,4-디카페오일퀴닌산을 추가로 함유할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기와 같은 3,5-O-디카페오일퀴닌산과 곰취 추출물을 혼합 사용하는 경우 3.5-O-디카페오일퀴닌산을 포함하여 폴리페놀 총량이 10-150mg/ml, 더욱 바람직하게는 70-80mg/ml 함유할 수 있다.

본 발명에서는 유효성분으로서 3.5-O-디카페오일퀴닌산 1-50mg/ml로 함유된 효소 처리된 곰취추출물이 바람직하게 사용될 수 있다.

본 발명의 유효성분을 함유하는 것으로 3,5-O-디카페오일퀴닌산을 함유하는 천연성분으로 가장 유력하게 제안될 수 있는 곰취(Ligularia　fischeri)는초롱꽃목　국화과의　쌍떡잎식물.　여러해살이　풀로,　줄기　높이가　1　~　2　m이며,　뿌리줄기가　굵고　털이　없으나　뿌리　위에　나는　잎에는　긴　잎자루가　있고,　잎몸은　심장　모양이며　가장자리에　고른　톱니가　있다.

곰취의 잎　앞면은　녹색이며　뒷면은　엷은　녹색이다.　줄기에는　3개의　잎이　있고,　맨　아래　잎은　작고　잎자루의　밑부분이　줄기를　싸고　있다.　이러한　곰취는　한국을　비롯한　일본, 중국,　사할린　등지에　분포하며,　주로　어린잎은　먹으며　한방에서는뿌리줄기를　말려 해수·백일해,　천식,　요통,　관절통,　타박상　등에　처방하는　약재로　사용하는　것이 알려져　있다.

특히 최근에는 화장료 조성물로 적용되거나 피부 질환에 적용을 시도하고 있는데,　곰취 추출물은 항산화능 뿐만 아니라 인간 섬유아세포 활성효과, 피부 잔주름 개선효과, 미백효과, 육모효과, 피부 자극 완화 효과가 있으므로 이 물질을 이용하여 각종 기능성 화장료를 제조할 수 있는 것으로 알려져 있다.

특히, 최근 본 발명자는 곰취 추출물의 여러 활성성분 중에서도, 효소처리에 의해 그 성분이 현저하게 향상되는 성분이 존재하고, 이러한 성분으로서 3,5-O-카페오일퀴닌산이 항아토피, 항여드름 또는 항염에 탁월한 효과가 있음을 밝혀냈다. 이러한 특정 성분인 3,5-O-카페오일퀴닌산의 이러한 효과는 새롭게 알려진 용도이다.

본 발명에 의하면, 본 발명에서 유효성분으로 사용하고 있는 3,5-O-카페오일퀴닌산은 이러한 곰취 추출물에서는 기대하기 어렵지만 곰취추출물을 효소 처리한 결과물에서 현저하게 대량 함유되어 있음을 알게 되었다.

본 발명에 따르면, 특히 3,5-O-카페오일퀴닌산을 유효성분으로 함유하고, 여기에 추가적으로 곰취 추출물을 혼합하여 사용할 수도 있다.

본 발명에서 　"효소처리된 곰취　추출물"은　곰취의　추출　처리에　의하여 얻어지는　추출액,　추출액의　희석액이나　농축액,　추출액을　건조하여　얻어지는　건조물,　추출액의　조정제물이나　정제물,　또는　이들의　혼합물　등,　추출액　자체　및　추출액을　이용하여 특정 효소로 처리하여 생산된 결과물을 의미한다.　

본 발명에서 3,5-O-카페오일퀴닌산을 사용하기 이해 효소처리된　곰취　추출물을 사용할 수 있는데, 여기서 곰취는　자연에서　채취하거나　상업적으로　재배,　판매하는　곰취를　이용할　수　있다. 또,　이때　곰취는　가공하지　않은　날　것이거나　동결,　건조 등의　가공을　거친　상태일　수　있으며,　곰취의　잎,　잎자루,　줄기,　뿌리　등을　선택적으로　사용하거나　또는　이들을　모두　사용하여　얻은　것일　수　있으나,　이에　제한되지 않는다.

본　발명의　일　구현예에　따르면,　상기　곰취　추출물은　당　업계에　공지된　추출　방법을　제한　없이　사용하여　얻은　것일　수　있다.　상기　추출　방법은　일례로, 냉침　추출,　초음파　추출,　환류　냉각　추출,　열수　추출,　가압　추출,　용매　추출　등을 예로 들 수　있으며,　효과적인　활성성분　추출을　위해　2종　이상의　추출　방법을　조합하여 사용할 수 있다.

본　발명의　일　구현예에　따르면,　상기　곰취　추출물은　물,　탄소수　1 내지　4개의　알코올,　프로필렌글라이콜,　부틸렌글라이콜,　글리세린,　아세톤,　에틸아세테이트,　부틸아세테이트,　클로로포름,　다이에틸에테르,　다이클로로메탄,　헥산　및 이들의　혼합물로　이루어진　군에서　선택되는　용매로　추출된　것일　수　있다.

본 발명의　일　구현예에　따르면,　상기　곰취　추출물은　감압　농축　및　동결건조　또는　분무　건조　등과　같은　추가적인　과정에　의해　분말　상태로　제조된　것일　수 있다.

본　발명의　일　구현예에　따르면,　상기　곰취　추출물은　상술한　추출　방법에　의한　추출물뿐만　아니라　통상적인　정제　과정을　거친　추출물도　포함한다.　예를 들어,　일정한　분자량　컷-오프(cut-off)　값을　갖는　한외　여과막을　이용한　분리,　다양한　크로마토그래피　(크기,　전하,　소수성　또는　친화성에　따른　분리를　위해　제작된 것)에　의한　분리　등,　추가적으로　실시한　다양한　정제　방법을　통해　얻어진　분획도 본　발명의　추출물에　포함될　수　있다.

본　발명의　일　실시예에　따르면,　상기　곰취　추출물은　곰취와　5　내지 20배, 더 바람직하게는,　10　내지　15배　의　용매를　혼합한　후　0.5　내지　8시간, 바람직하게는　1　내지　5시간 동안 환류　추출한　후　여과액을　감압　농축하고,　동결　건조하여　얻은　것일　수　있다.

본 발명에서는 이러한 곰취추출물을 효소처리하여 사용하는 경우, 효소처리는 효소로 아밀라아제, 프로테아제 등의 통상의 효소를 사용하여 40-70℃, 더 바람직하게는 55-65℃에서 2-6시간 효소처리하여 농축액을 제조하는 방법으로 시행할 수 있다.

이러한　효소처리 곰취　추출물은　총　플라보노이드　및　폴리페놀을　다량　함유하며,　특히 3,5-O-카페오일퀴닌산을 다량 함유하여 본 발명의 조성물에 용이하게　사용될　수　있다.

본 발명에 의하면,　상기　효소처리된 곰취　추출물은　곰취 추출물 자체가 다량의　폴리페놀　과　플라보노이드를 함유하여　우수한　DPPH　및　ABTS　라디칼　소거능을　나타내며,　아토피 등을 유발하는 면역세포에 대해　세포　독성이　없고,　면역세포에서　분비하는　IL-1β,　IL-6,　TNF-a,　산화질소,　프로스타글란딘을　유전자　및 단백질　수준에서　발현을　유의적으로　억제하여　항아토피, 항여드름, 항염 등을　효과적으로　완화　또는　경감시킬　수　있다.

그러나 본 발명에 따른 항아토피, 항여드름, 항염용 조성물은 본질적으로 곰취추출물이 아닌 3,5-O-디카페오일퀴닌산을 유효성분으로 함유하는 것이다. 그 함량은 바람직하게는 0.01-30중량%로서 그 함량이 너무 적으면 본 발명의 효과를 달성할 수 없다.

특히, 본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 곰취 추출물로부터 유래된 3,5-O-디카페오일퀴닌산을 적용하는 경우 곰취추출물 분획에서 이를 순수물질로 얻을 수 있다. 그러나 곰취 추출물에서 3,5-O-디카페오일퀴닌산의 함량이 미미하면 항아토피, 항여드름, 항염용 조성물로서 그 효과를 제대로 발휘할 수 없으므로 본 발명의 목적 달성이 어렵다. 그러므로 본 발명에서는 곰취추출물을 효소처리함으로써 3,5-O-디카페오일퀴닌산의 함량을 현저하게 향상시킬 수 있다

또한, 본 발명의 조성물은 유효성분인 3,5-O-디카페오일퀴닌산에 추가적으로 산양삼을 포함할 수 있다. 이렇게 산양삼을 추가하는 경우 본래의 효과가 배가되는 놀라운 상승효과를 기대할 수 있다.

산양삼은 한방에서는 강심제나 이뇨제로 사용되어 왔으며, 특히 삼 사포닌은 다른 식물에서 발견되는 사포닌과는 다른 특이한 화학구조를 가지고 있으며 약리 효능도 특이하여 인삼(Ginseng) 배당체(Glycoside)란 의미로 '진세노사이드(Ginsenoside)'라고 부른다. 산양삼의 주요 효능으로는 중추신경계 질환 치료효과, 신경보호 효과, 파골세포 분화 억제효과, 당뇨병 치료효과, 항염증 효능, 뇌경색 치료, 신경세포 수명 연장, 허혈성 뇌졸중(뇌경색) 개선효과, 피부 재생 효과, 산화 효과, 간보호 효과, 알츠하이머 개선 효과 등을 들 수 있다.

본 발명에서 추가로 사용될 수 있는 산양삼은 예컨대 통상의 방법으로 추출된 것이거나 발효처리, 효소처리된 것이 사용될 수 있다. 예를 들면 상기 곰취 추출물과 비슷한 방법으로 추출물로 제조하여 이용될 수 있다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니다.

본　발명에　따른　항아토피, 항여드름 또는 항염용 조성물은　용액,　외용연고,　크림,　폼,　유연수,　유액,　현탁액,　유탁액,　페이스트,　겔,　로션,　파우더,　스프레이제 등으로　이루어진　군으로부터　선택되는　제형으로　제조할　수　있으나,　이에　제한되는　것은　아니다. 또한, 경구제로서 그래뉼, 펠릿, 과립, 캡슐, 정제 등으로 제조될 수 있다.

본　발명의　일　구현예에　따르면,　상기　조성물은　항아토피, 항여드름, 항염용 조성물로서 화장료 조성물이나 외피용 약제, 경구용 약제 등에　배합되는　제약학적 또는 건강식품으로　허용　가능한　담체를　1　종　이상　추가로　포함할　수 있으며,　통상의　성분으로　예를　들면　유분,　물,　계면활성제,　보습제,　저급　알콜,　증점제,　킬레이트제,　색소,　방부제,　향료, 부형제　등을　적절히　배합할　수　있으나,　이에　제한되는　것은　아니다.

본　발명의　일　구현예에　따른　조성물의　제형이　연고,　페이스트,　크림　또는　젤인　경우에는,　담체　성분으로서　동물성　유,　식물성　유,　왁스,　파라핀,　전분,　트라가칸트,　셀룰로오스　유도체,　폴리에틸렌글라이콜,　실리콘,　벤토나이트,　실리카,　탈크,　징크옥사이드　또는　이들의　혼합물이　이용될　수　있다.

본　발명의　일　구현예에　따른　조성물의　제형이　용액　또는　유탁액인　경우에는,　담체　성분으로서　용매,　용해화제　또는　유탁화제가　이용되며,　예컨대　물,　에탄올,　아이소프로판올,　다이에틸카보네이트,　에틸아세테이트,　벤질알코올,　벤질벤조에이트,　프로필렌글라이콜,　1,3-부틸렌글라이콜,　오일이　이용될　수　있으며,　특히,　목화씨　오일,　땅콩　오일,　옥수수　배종　오일,　올리브오일,　피마자　오일 및　참깨　오일,　글리세롤지방족에스터,　폴리에틸렌글라이콜　또는　솔비탄의　지방산에스터가　이용될　수　있다.

본　발명의　일　구현예에　따른　조성물의　제형이　현탁액인　경우에는,　담체　성분으로서　물,　에탄올　또는　프로필렌글라이콜과　같은　액상의　희석제, 에톡실화　아이소스테아릴알코올,　폴리옥시에틸렌　솔비톨에스터　및　폴리옥시에틸렌 솔비탄　에스터와　같은　현탁제,　미소결정성　셀룰로오스,　알루미늄메타하드록사이드, 벤토나이트,　아가　또는　트라가칸트　등이　이용될　수　있다.

본 발명의 조성물을 외용 화장품이나 약제조성물로 적용하는 경우 일반 외피용 겔제, 용액제, 크림제, 스프레이제 등으로 제형화하여 사용할 수 있고, 경구투여의 경우 나이,　성별,　체중에　따라　달라질　수　있으며,　일반적으로는　체중　1kg　당 0.001　㎎　내지　1,000　㎎,　0.01　㎎　내지　100　㎎, 200mg, 500mg,　또는　0.1　㎎　내지　10　㎎을　매일　또는　격일　투여하거나　1일　1　내지　3회로　나누어　투여할　수　있다.　

본 발명의 항아토피, 항여드름, 항염용 조성물은 전형적으로는 외피 적용이 바람직하나, 경구제로 적용하여 이너뷰티 또는 건강식품 등으로 적용할 수 있다.

본　발명의　항아토피, 항여드름, 항염용　조성물은　경구제로 적용하는 경우 약제학적으로　허용　가능한　첨가제를　더　포함할　수　있다.　상기　첨가제는　전분,　젤라틴화　전분,　미결정셀룰로오스,　유당,　포비돈,　콜로이드실리콘다이옥사이드,　하이드록시칼슘포스페이트,　락토오스,　만니톨, 엿,　아라비아고무,　전호화전분,　옥수수전분,　분말　셀룰로오스,　하이드록시프로필셀룰로오스,　오파드라이,　전분글라이콜산나트륨,　카르나우바　납,　합성규산알루미늄, 스테아린산,　스테아린산마그네슘,　스테아린산알루미늄,　스테아린산칼슘,　백당,　덱스트로스,　솔비톨　및　탈크　등일　수　있으나,　이에　제한되지　않는다.

본　발명의　일　구현예에　따른　경구제　조성물은　약학적으로　허용되는　담체를　포함할　수　있다.　상기　담체는　약제의　제조시에　통상적으로　이용되는　것으로, 락토오스,　덱스트로오스,　수크로오스,　솔비톨,　만니톨,　트레할로스,　하이알루로닉애씨드,　전분,　아카시아고무,　칼슘포스페이트,　알지네이트,　젤라틴,　칼슘실리케이트,　미세결정성　셀룰로오스,　폴리비닐피롤리돈,　셀룰로오스,　물,　시럽,　메틸셀룰로오스,　메틸하이드록시벤조에이트,　프로필하이드록시벤조에이트,　탈크,　마그네슘스테아레이트　및　미네랄오일　등을　포함하나,　이에　한정되는　것은　아니다.

본　발명의　일　구체예에　따른　조성물은　윤활제,　습윤제, 감미제,　향미제,　유화제,　현탁제,　보존제　등을　추가로　포함할　수　있다.　적합한　약학적으로　허용되는　담체　및　제제는　Remington's　Pharmaceutical　Sciences　(22thed.,　2013)에　상세히　기재되어　있다.

본　발명의　조성물은　경구용으로 제제화할　경우에는　보통　사용하는　충전제,　증량제,　결합제,　습윤제,　붕해제,　계면활성제　등의　희석제　또는　부형제를　사용하여 조제될　수　있다.　경구투여를　위한　고형제제에는　정제,　환제,　산제,　과립제,　캡슐제 등이　포함되며,　이러한　고형　제제는　본　발명의　지용성　폴리페놀　성분이　증가된　생약　조성물에　적어도　하나　이상의　부형제를 포함할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 상세하게 설명하겠는 바, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예　1.　곰취에탄올　추출물의　제조

곰취는　평창　백옥포리　큰골에서　야생으로　키워져　2020년　7월에　수확한　것으로,　잎자루를　포함한　곰취　잎을　-4℃에서　2일간　냉동건조하여　원물로　사용하였다.　이후,　곰취　40　g에　70%　에탄올　500　㎖를　넣고　3시간　동안　환류　추출한　후, 여과액을　회전　진공　농축기(rotary　vacuum　evaporator)　(EYELA　FDU-540,　일본)로 감압　농축하였으며,　농축된　용액을　동결건조기(freeze　dryer)　(일신바이오베이스, 한국)로　동결　건조하여　곰취　에탄올　추출물(Ligularia　fischeri　ethanol　extract, 이하　'LFE'라　함)을　수득하였다.　LFE로　3.84　g　(수율　9.60%)의　분말을　획득하여　초저온　냉동고　(-80℃)에서　보관하면서　실험에　필요한　농도로　증류수에　희석해　사용하였다.

상기 에탄올 추출물에 효소로 a-아밀라아제를 사용하여 60℃에서 3-4시간 효소처리하여 얻은 곰취 추출물의 농축액을 제조하였다.

여기서 3,5-O-디카페오일퀴닌산을 분획하였다.

실험예 1. 곰취 에탄올 추출물의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량

곰취 에탄올 추출물의 총 폴리페놀(polyphenol) 및 플라보노이드(flavonoid) 함량을 측정하였다.

총 폴리페놀 측정을 위하여, LFE 1 ㎖ (농도 20 ㎎/㎖)에 50% 페놀시약(folin-Ciocalteu's phenol reagent) (Merck, 독일) 0.5 ㎖를 가하여 실온에서 3분간 반응시켰다. 반응용액에 Na2CO3 포화용액 1 ㎖와 증류수 7.5 ㎖를 차례로 혼합하여 30분간 정치시킨 뒤, 14,000 g에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 취해 760 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다. 총 페놀 함량은 갈산(gallic acid, GAE)(Sigma, 미국)을 표준물질로 이용하여 작성한 검량선에 따라 함량을 구하였다.

총 플라보노이드 측정을 위하여, LFE 0.1 ㎖ (농도 20 ㎎/㎖)과 80% 에탄올 0.9 ㎖을 혼합한 혼합물 0.5 ㎖에 10% 질산알루미늄(aluminium nitrate)와 1M 아세트산칼륨(potassium acetate) 0.1 ㎖ 그리고 80% 에탄올 4.3 ㎖을 가하여 실온에 40분 방치한 뒤 415 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였으며, 퀘르세틴(quercetin, QE)을 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였다.

그 결과, LFE의 총 폴리페놀 함량은 113.97±0.37 ㎎ GAE/g, 총 플라보노이드 함량은 29.22±2.06 ㎎ QE/ｇ인 것으로 나타났다.

실험예 2. 곰취 에탄올 추출물의 항산화 효능

곰취 에탄올 추출물의 항산화력을 평가하기 위하여, 라디칼 소거능(radical scavenging ability)을 측정하였다.

2-1. DPPH 라디칼 소거능 측정

LFE의 최종 농도가 25, 50, 100, 250, 500, 1000 ㎍/㎖의 농도로 될 수 있게 증류수로 희석시켰으며, 에탄올에 용해시킨 0.2 mM의 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl) 용액 150 ㎕와 시료를 100 ㎕씩 혼합하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 마이크로 플레이트 측정기(micro plate reader) (Molecular Devices, U.S.A.)를 통해 517 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 양성대조군으로는 아스코르브산(ascorbic acid)을, 음성대조군으로는 증류수를 넣었으며, DPPH 용액의 대조군으로는 에탄올을 넣어 보정 값을 얻었다. DPPH 자유라디칼 소거율은 하기 수학식 1에 따라 계산하였다.

[수학식 1]

그 결과, 도 1을 참조하면, LFE의 DPPH 라디칼 소거능은 농도 의존적으로 증가하였으며, 이때 IC50 값은 211.32 ㎍/㎖인 것으로 확인되었다.

2-2. ABTS 라디칼 소거능 측정

곰취 에탄올 추출물의 최종 농도가 25, 50, 100, 250, 500, 1000 ㎍/㎖의 농도로 될 수 있게 희석시켰으며, ABTS 용액은 7.4 mM ABTS(2,2-azino-bis- (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid))와 2.6 mM 과황산칼륨(potassium persulphate)을 혼합한 후, 암소(dark place)에 하루 동안 방치하여 양이온(ABTS+)을 형성시킨 다음 732 ㎚에서 흡광도를 측정하여 흡광도 값이 1.5 이하가 나오도록 증류수로 희석하고, 희석된 ABTS+ 용액 150 ㎕와 시료 5 ㎕를 혼합하고, 실온에서 10분간 반응시킨 후, 마이크로 플레이트 측정기를 통해 732 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다. LFE의 항산화능은 증류수를 대조군으로 하여 대조군에 대한 ABTS 라디칼 소거능을 백분율로 나타내었다.

그 결과, 도 2를 참조하면, LFE의 ABTS 라디칼 소거능은 농도 의존적으로 증가하였으며, 이때 IC50 값이 94.34 ㎍/㎖인 것으로 확인되었다.

실험예 3. 비만세포를 이용한 곰취 에탄올 추출물의 항가려움증 효능

비만세포인 MC/9 세포를 이용하여 곰취 에탄올 추출물의 세포 독성, 가려움증 유발 인자의 유전자 및 단백질 발현량을 측정하였다.

3-1. 비만 세포 독성

MC/9 세포는 10% FBS, 10% T-stim, 0.05 mM 2-메르캅토에탄올(mercaptoethanol) (Gibco BRL, 미국), 2 mM L-글루타민(glutamine) 및 100 ㎍/㎖ 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)이 함유된 DMEM 배지 (Gibco BRL, 미국)를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건이 유지되는 세포배양기에서 배양하였으며, 2 ~ 3일 주기로 계대 배양하여 실험을 진행하였다.

이후, MC/9 세포를 48웰 플레이트(48-well plate)에 1X10⁵cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, LFE를 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 다시 12시간 동안 배양하였다. 시료의 양성대조군으로는 아스코르브산(ascorbic acid)을, 음성대조군으로 증류수를 처리하였다. 배양 후 배양액 100 ㎕당 EZ-Cytox 용액 (Daeilab, 한국) 10 ㎕을 첨가하여 세포배양기에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 450 ㎚에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포생존율을 백분율로 표시하였다.

그 결과, 도 3을 참조하면, LFE는 100 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 MC/9 세포의 세포생존율을 약 100% 수준으로 유지하였으며, 200 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 MC/9 세포의 세포생존율을 약간 감소시킨 것으로 나타나, 세포 독성이 없는 것으로 확인되었다.

3-2. 유전자 발현량 측정

6웰 플레이트에 MC/9 세포를 2X106 cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 LFE를 25, 50, 100 ㎍/㎖의 농도로 처리하고 1시간 뒤, 1 ㎍/㎖의 DNP-IgE (Sigma-Aldrich, 미국)를 추가하여 12시간 동안 배양하였다. 이후, 총 RNA 추출 키트(total RNA prep kit) (Intronbio, 한국)를 이용하여 세포의 RNA를 추출하였다. 1,200 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 얻은 세포에 easy blue 1㎖와 클로로포름(chloroform) 200 ㎕를 넣고 볼텍싱(vortexing)한 후, 13,000 rpm, 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 상층액 400 ㎕와 결합 완충액(binding buffer) 400 ㎕를 실온에서 1분 동안 반응시킨 뒤 반응액 700 ㎕를 컬럼(column)에 주입하여 13,000 rpm에서 30초 동안 원심분리하였다. 컬럼에 세척 완충액(washing buffer) A를 700 ㎕ 넣고 13,000 rpm에서 30초 동안 원심분리 후, 세척 완충액 B를 700 ㎕ 넣고 동일하게 원심분리하였다. 컬럼 하단을 1.5 ㎖ 튜브(tube)로 교체한 후, 컬럼에용출 완충액(elution buffer)을 30 ㎕ 넣고 1분 동안 반응시킨 뒤 13,000 rpm에서 1분 동안 원심분리하여 총 RNA를 추출하였다.

역전사(reverse transcription) 반응은 RT 프리믹스 키트(accupower cyclescript RT premix kit) (Bioneer, 한국)의 혼합물(mixture) (반응완충액(reaction buffer), dNTPs 혼합물, RNase 억제제(inhibitor), 안정제(stabilizer) 및 올리고(oligo)-dT15 프라이머 포함)에 총 RNA를 1 ㎍ 넣고 DEPC-DW을 최종 부피가 20 ㎕가 되도록 첨가하였다. 이 혼합액을 잘 섞은 후, 45℃에서 60분 반응시켜 first-strand cDNA를 합성하고, 95℃에서 5분 동안 방치하여 M-ML VRT(reverse transcriptase)를 불활성화시켜 합성이 완료된 cDNA를 PCR(polymerase chain reaction)에 사용하였다.

합성이 완료된 cDNA를 증폭시키기 위하여 real-time PCR을 진행하였으며, real-time 전용 튜브에 cDNA 1 ㎕, 각 프라이머 2 ㎕, SYBR Green (Qiagen, 독일) 10 ㎕, DEPC-DW 5 ㎕씩 넣어 95℃에서 2분 동안 반응시키고 다음 95℃에서 5초, 62.5℃에서 30초를 40회 반복하여 유전자를 증폭시켰다. 유전자 발현량은 대조군과 비교하여 계산하였으며, 사용된 프라이머의 서열은 하기 표 1과 같다.

유전자	프라이머	프라이머 서열(5'-3')
IL4	정방향	CAACCCCCAGCTAGTTGTCA
IL4	역방향	TGTCGCATCCGTGGATATGG
IL31	정방향	TCAGCAGACGAATCAATACAGC
IL31	역방향	TCGCTCAACACTTTGACTTTCT
ACTB	정방향	ATCGTGGGGCGCCCCAGGCACCA
ACTB	역방향	GGGGTACTTCAGGGTGAGGA

실험 결과는 SPSS 21.0를 이용하여 평균±표준오차(mean±standard error of mean)으로 나타내었으며, ANOVA를 사용하여 다중 비교하였고 Tukey's HSD test를 통해 p＜0.05, p＜0.01 및 p＜0.001 수준에서 유의성을 검정하였다. 이후 실험 결과에 대해서도 동일한 방법으로 유의성을 검정하였다.

그 결과, 도 4 및 5를 참조하면, LFE는 농도 의존적으로 가려움증을 유발하는 IL-4 및 IL-31 유전자의 mRNA 발현량을 감소시킨 것으로 나타났다.

3-3. 단백질 발현량 측정

6웰 플레이트에 MC/9 세포를 2X106 cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 LFE를 25, 50, 100 ㎍/㎖의 농도로 처리하고 1시간 뒤, 1 ㎍/㎖의 DNP-IgE를 추가하여 6시간 동안 배양하였다. 이후, 1,200 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 얻은 세포를 D-PBS로 2회 세척하고 세포 펠렛(pellet)에 프로테아제 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail) Ⅰ (Sigma-Aldrich, 미국), 포스파타아제 억제제(phosphatase inhibitor) Ⅱ 및 Ⅲ가 포함된 RIPA 완충액(buffer) (Thermo Fisher, 미국)을 넣어 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질은 BCA 단백질 정량 키트(proein assay kit) (Thermo Fisher, 미국)를 이용하여 정량하였으며, 로딩(loading) 완충액과 섞어 95℃에서 5분간 반응시켜 준비하였다. 준비된 단백질은 10% 아크릴아마이드겔(acrylamide gel)을 통해 SDS-PAGE하여 크기별로 분리하였으며, PVDF 막(membrane)에 이동시켰다. 단백질이 옮겨진 막을 3% BSA에 담가 상온에서 2시간 반응시켰다. TBS-T 완충액을 이용하여 세척하고 1차 항체(primary antibody)로서 IL-4 항체 (Santa Cruz Biotechnology, 미국), 히스타민항체 (LSBio, 미국) 또는 IL-31 항체 (LSBio, 미국)를 넣어 4℃에서 16시간 반응시켰다. 다시 3회 세척하고 2차 항체(secondary antibody) (Jackson immunoresearch, 미국)를 넣어 상온에서 1시간 반응시켰으며, 다시 세척하고 ECL 용액(solution)을 통해 단백질을 발색시켰다. 이후, chemidoc fusion FX (Vilber Lourmat, 프랑스)를 통해 단백질 발현량을 분석하였다.

그 결과, 도 6 내지 8을 참조하면, LFE는 농도 의존적으로 IL-4, IL-31 및 히스타민의 단백질 발현량을 감소시킨 것으로 나타났다.

실험예 4. 면역세포를 이용한 곰취 에탄올 추출물의 항아토피 효능

면역세포로서 대식세포인 RAW264.7 세포를 이용하여 곰취 에탄올 추출물의 세포 독성, 아토피 유발 인자의 유전자 및 단백질 발현량, 생성량을 측정하였다.

4-1. 세포 독성

RAW264.7 세포는 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 조성된DMEM 배지 (Gibco BRL, 미국)를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건이 유지되는 세포배양기에서 배양하였으며, 2 ~ 3일 주기로 계대 배양하여 실험을 진행하였다.

이후, RAW264.7 세포를 24웰 플레이트에 1X105 cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, LFE를 50, 100, 200, 400 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 시료의 양성대조군으로는 아스코르브산(ascorbic acid)을, 음성대조군으로 증류수를 처리하였다. 배양 후 배양액 100 ㎕당 EZ-Cytox 용액 (Daeilab, 한국) 10 ㎕을 첨가하여 세포배양기에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 450 ㎚에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포생존율을 백분율로 표시하였다.

그 결과, 도 9를 참조하면, LFE는 200 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 RAW264.7 세포의 세포생존율을 약 100% 수준으로 유지하였으며, 400 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 RAW264.7 세포의 세포생존율을 약간 감소시킨 것으로 나타나, 세포 독성이 없는 것으로 확인되었다.

4-2. 유전자 발현량 측정

RAW264.7 세포를 6웰 플레이트에 2X106 cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 LFE를 50, 100, 200 ㎍/㎖의 농도로 처리하고 2시간 후, 100 ng/㎖의 LPS를처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 이후, 실험예 3과 동일한 방법으로 총 RNA 추출, cDNA 합성, 유전자 증폭하여 유전자 발현량을 측정하였다. 여기서 사용된 프라이머의 서열은 하기 표 2와 같다.

유전자	프라이머	프라이머 서열(5'-3')
NOS2	정방향	CGAAACGCTTCACTTCCAA
NOS2	역방향	TGAGCCTATATTGCTGTGGCT
PTGS2	정방향	AACCGCATTGCCTCTGAAT
PTGS2	역방향	CATGTTCCAGGAGGATGGAG
IL1B	정방향	AAGAAGAGCCCATCCTCTGT
IL1B	역방향	GGAGCCTGTAGTGCAGTTGT
IL6	정방향	AGTCCTTCCTACCCCAATTTCC
IL6	역방향	GGTCTTGGTCCTTAGCCACT
TNFA	정방향	ATGGCCTCCCTCTCATCAGT
TNFA	역방향	TTTGCTACGACGTGGGCTAC
ACTB	정방향	AACCGCATTGCCTCTGAAT
ACTB	역방향	CATGTTCCAGGAGGATGGAG

그 결과, 도 10 내지 14를 참조하면, LFE는 농도 의존적으로 가려움증이나 아토피를 유발하는 NO, 프로스타글란딘, IL-1β, IL-6 및 TNF-a 관련 유전자의 mRNA 발현량을 감소시킨 것으로 나타났다.

4-3. 단백질 발현량 측정

RAW264.7 세포를 6웰 플레이트에 2X106 cells/welll로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 LFE를 50, 100, 200 ㎍/㎖의 농도로 처리하고 2시간 후, 100 ng/㎖의 LPS를 처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 이후, 실험예 3과 동일한 방법으로 단백질 발현량을 측정하였다. 여기서 1차 항체로 p44/42 MAPK(Erk1/2)(137F5) Rabbit mAb (Cell signaling, 미국; 이하 동일함), Phospho-p44/42 MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)(D13.14.4E) XP® Rabbit mAb, SAPK/JNK 항체, Phospho-SAPK/JNK(Thr183/Tyr185)(G9) Mouse mAb, p38 MAPK 항체 또는 Phospho-p38 MAPK(Thr180/Tyr182)(D3F9) XP® Rabbit mAb를 사용하였다.

그 결과, 도 15 내지 19을 참조하면, LFE는 농도 의존적으로 사이토카인, 히스타민 등과 같은 가려움증이나 아토피 유발 인자의 발현에 관여하는 ERK, JNK 및 P38의 단백질 발현량을 감소시킨 것으로 나타났다.

4-4. 바이오마커 생성량 측정

NO 생성량을 측정하기 위하여, NO 분석 키트 (Intronbio, Korea)를 사용하였다. RAW264.7 세포를 24웰 플레이트에 4X104 cells/welll로 분주하여 24시간 동안 배양하고 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도의 LFE를 처리하고 2시간 후, 100 ng/㎖의 LPS를 하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 96웰 플레이트에 세포배양액 100 ㎕를 넣고 N1 완충액 50 ㎕를 추가하여 상온에서 10분간 반응시켰으며, 반응 후 N2 완충액 50 ㎕를 추가하여 상온에서 10분간 반응시켰다. 반응 후, 540 ㎚에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 생성량을 백분율로 표시하였다.

PGE2, IL-1β, IL-6 및 TNF-a 생성량을 측정하기 위하여, 각각 mouse PGE2 ELISA kit (R&D Systems, 미국), mouse IL-1β ELISA kit (Komabiotech, 한국), mouse IL-6 ELISA kit (Komabiotech, 한국), mouse TNF-a ELISA kit (Komabiotech, 한국)를 사용하였다. RAW264.7 세포를 6웰 플레이트에 2X106 cells/welll로 분주하여 24시간 동안 배양하고 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도의 LFE를 처리하고 2시간 후, 100 ng/㎖의 LPS를 하여 다시 24시간 동안 배양하였다.

이후, 1,200 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 얻은 세포배양액을 100 ㎕씩 넣고 상온에서 2시간 반응시켰다. 반응 후 플레이트에 있는 시약을 버리고 세척 완충액을 넣어 4회 세척하였다. 세척 후 검출 항체(detection antibody)를 100 ㎕씩 추가하여 상온에서 2시간 반응시켰다. 반응 후 플레이트에 스트렙트아비딘(streptavidin)-HRP 100 ㎕씩 추가하여 상온에서 30분 반응시켰다. 반응 후 TMB 또는 pink-ONE solution 100 ㎕씩 각 웰에 넣은 후 15분간 반응시키고 반응 정지액(stop solution) 100 ㎕를 추가하여 마이크로 플레이트 측정기를 통해 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 표준곡선(standard curve)를 기준으로 절대값으로 나타내었다.

그 결과, 도 17 내지 22를 참조하면, LFE는 농도 의존적으로 NO, PGE2, IL-1β, IL-6 및 TNF-a 생성량을 감소시킨 것으로 나타났다.

이러한 결과를 종합하면, 본 발명에 따른 곰취 추출물은 총 폴리페놀 및 플라보노이드를 다량 함유하여 항산화 효능을 나타내며, 가려움증과 아토피 증상을 유발하는 사이토카인 (IL-4, IL-31, TNF-a, IL-1β 및 IL-6), 히스타민, 산화질소 및 프로스타글란딘의 발현, 분비를 억제함으로써 아토피를 효과적으로 완화 또는 경감시킬 수 있음을 시사한다.

상기와 같이 곰취 추출물의 우수한 성능이 확인된 결과로부터, 곰취 추출물에서 추출되는 성분 중에 3,5-O-디카페오일퀴닌산의 경우 이러한 우수한 효과와 더불어서 항아토피에 대한 우수한 성능을 보이는 것으로 확인되었다.

이러한 본 발명에서의 실험결과는 곰취 추출물에 비해 3,5-O-디카페오일퀴닌산이 더욱 월등하게 우수한 효과가 있는 것으로 보인다.

실험예 5 : 3,5-O-디카페오일퀴닌산의 활성효과

5-1. 항아토피 효과실험

실시예로 준비된 효소처리된 곰취추출물에서 분획한 3,5-O-디카페오일퀴닌산에 대한 항아토피 활성을 확인하기 위해 아토피성 피부염의 2차 감염 세균인 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus : ATCC 29737)균에 대한 항균활성을 실험을 수행하였다.

실험은 페이퍼 디스크(paper disc)를 이용한 아가 확산(agar diffusion)법으로 스타필로코커스 아우레우스 균주에 상기 효소처리된 곰취추출물 및 대조 샘플을 멸균한 증류수에 녹인 후 각 농도별로 50㎕ 씩 페이퍼 디스크에 점적하고, 디스크 주위에 생성된 저해환의 직경(㎜)으로 항균력을 측정하였다.

실험결과, 하기 표에 나타낸 바와 같이 실시예의 시료에서 다른 대조샘플에 비해 월등한 항균효과를 보이는 것으로 확인되었다. 특히, 항균력이 우수한 것으로 알려진 대조샘플로 적용된 시료에 비해서도 낮지 않은 매우 우수한 항균력을 나타냄을 확인하여 항여드름 효과가 우수함을 확인하였다.

구분	3,5-DCQA(5mg/ml)				살리실산 (5mg/ml)		트리클로산 (5mg/ml)		멸균 증류수
농도(%)	0.1	1.0	10	20	10	20	10	20	멸균 증류수
저해환 직경 (mm)	10.1 ±0.67	12.4 ±0.44	14.3 ±0.32	15.2 ±0.28	13.9 ±0.23	14.8 ±0.41	14.0 ±0.31	14.9 ±0.49	7.8 ±0.31

5-2. 항여드름 효과실험

실시예로 준비된 효소처리된 곰취추출물에서 분획한 3,5-O-디카페오일퀴닌산에 대한 항여드름 활성을 확인하기 위해 여드름 원인균인 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes : ATCC 6919) 균에 대한 항균활성을 실험을 수행하였다.

실험은 페이퍼 디스크(paper disc)를 이용한 아가 확산(agar diffusion)법으로 프로피오니박테리움 아크네스 균주에 상기 효소처리된 곰취추출물 및 대조 샘플을 멸균한 증류수에 녹인 후 각 농도별로 50㎕ 씩 페이퍼 디스크에 점적하고, 디스크 주위에 생성된 저해환의 직경(㎜)으로 항균력을 측정하였다.

실험결과, 하기 표와 같이 실시예의 시료에서 다른 대조샘플에 비해 월등한 항균효과를 보이는 것으로 확인되었다. 특히, 항균력이 우수한 것으로 알려진 대조샘플로 적용된 시료와 동등수준 이상의 매우 우수한 항균력을 나타냄을 확인하여 항여드름 효과가 우수함을 확인하였다.

구분	3,5-DCQA(5mg/ml)				살리실산 (5mg/ml)		트리클로산 (5mg/ml)		멸균 증류수
농도(%)	0.1	1.0	10	20	10	20	10	20	멸균 증류수
저해환 직경 (mm)	10.4 ±0.54	12.9 ±0.31	15.1 ±0.36	15.8 ±0.47	14.1 ±0.35	15.3 ±0.42	13.8 ±0.72	15.4 ±0.51	8.1 ±0.29

5-3. 항염 효과실험

우태아 혈청(FBS)이 없는 RPMI-1640 배지에서 배양하고 있는 인간 급성 단구성 백혈병세포 THP-1(Human acute monocytic leukemia)을 96 웰 마이크로 플레이트에 5Х10⁴cells/well의 농도로 배양하고 여기에 곰취추출물 시료를 3,5-DCQA 함량 기준 농도별로 투여하여 24 시간 동안 배양하고, FBS를 포함한 배지로 3 번 씻어 추출물 시료를 농도별로 처리하여 2시간 동안 전 배양하였다.

이후, 지질다당류(Lipopolysaccharide, LPS)를 6 시간 동안 처리하고, 원심분리 후 상등액을 TNF-α ELISA Kit(BD 555212)에 분주하여 흡광도 측정기 ELISA reader로 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

또, LPS로 유도된 염증반응에서 세포의 염증 지표물질인 사이토카인(Cytokine) 중 대표적인 TNF-α의 억제 정도를 측정하였다. LPS로 유도된 염증반응에서 분비되는 사이토카인 TNF-α의 양을 측정하여 이 값을 100으로 하였을 때 추출물 시료 처리군에서 분비되는 TNF-α의 양을 %로 환산하여 나타내었다.

또한, 추출물이 LPS로 유도된 TNF-α 생성을 감소시킨 것인지, 추출물의 세포 독성으로 인해 cell population 저하를 유발한 것인지 확인하기 위해 추출물 시료의 세포 독성과 비교하였다.

실험 결과, 하기 표에서와 같이 각 시료 농도 5mg/ml(3,5-DCQA 함량 기준)를 이용하여 각 농도로 세포에 처리하였을 때 세포의 생존율이 98 % 이상인 것으로 보아 3,5-DCQA 가 세포의 생존에는 영향을 미치지 않으면서 TNF-α를 억제하여 항염 효과를 발휘하는 것을 확인하였다.

구분	3,5-DCQA
농도(%)	0.1	1.0	10	20
TNF-a inhibition activity(%)	40.3 ±2.6	76.4 ±4.8	87.2 ±4.1	91.1 ±5.2
Cell viability (%)	100.0	99.9 ±0.1	98.9 ±1.1	98.7 ±1.3

Claims

3,5-O-디카페오일퀴닌산(3,5-O-caffeoylquinic acid; 3,5-DCQA)을 유효성분으로 함유하는 항아토피, 항여드름 또는 항염용 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 3,5-O-디카페오일퀴닌산은 3,5-O-디카페오일퀴닌산을 1-50mg/ml 함유하는 효소 처리된 곰취추출물 형태로 함유하는 항아토피, 항여드름 또는 항염용 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 효소처리된 곰취 추출물은 폴리페놀 총량을 10-150mg/ml로 함유하는 항아토피, 항여드름 또는 항염용 조성물.
청구항 1, 청구항 2항 또는 청구항 3에 있어서, 추가로 3,4-디카페오일퀴닌산을 더 포함하는 항아토피, 항여드름 또는 항염용 조성물.
청구항 1, 청구항 2항 또는 청구항 3에 있어서, 추가로 곰취추출물을 더 포함하는 항아토피, 항여드름 또는 항염용 조성물.
청구항 1, 청구항 2항 또는 청구항 3에 있어서, 추가로 산양삼을 더 포함하는 항아토피, 항여드름 또는 항염용 조성물.
청구항 1, 청구항 2항 또는 청구항 3에 따른 항아토피, 항여드름 또는 항염용 조성물을 포함하는 화장료 조성물.
청구항 1, 청구항 2항 또는 청구항 3에 따른 항아토피, 항여드름 또는 항염용 조성물을 포함하는 건강식품 조성물.
청구항 1, 청구항 2항 또는 청구항 3에 따른 항아토피, 항여드름 또는 항염용 조성물을 포함하는 아토피, 여드름 또는 염증 개선용 건강식품 조성물.
청구항 1, 청구항 2항 또는 청구항 3에 따른 항아토피, 항여드름 또는 항염용 조성물을 포함하는 아토피, 여드름 또는 염증 예방 또는 치료용 건강식품 조성물.