KR20220164757A - 마이크로바이옴-연관 질환 또는 장애의 예방, 치료 또는 치유를 위한 마이크로바이옴의 유전자 요법에 의한 미생물총 기능의 조절 - Google Patents
마이크로바이옴-연관 질환 또는 장애의 예방, 치료 또는 치유를 위한 마이크로바이옴의 유전자 요법에 의한 미생물총 기능의 조절 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 원위치에서, 박테리아, 바람직하게 천연 발생 박테리아를 변형시키기 위한 조성물, 키트, 및 방법을 포괄한다. 이들은 특별한 방식으로 마이크로바이옴의 박테리아 개체군이 발현 및/또는 분비하는 분자를 조절하여 마이크로바이옴-연관 질환 또는 장애를 치료하거나, 예방하거나, 또는 치유하는데 사용될 수 있다. 게놈 변형은 숙주 건강에 대한 그들의 유해한 잠재성을 감소시키는 방식으로 이들 개체군의 일부 또는 전부 및 숙주 간 상호작용을 변형시킬 수 있다. 본 발명의 조성물, 키트, 및 방법은 이들 개체군의 직접 사멸 또는 그들 성장의 직접 유의한 억제를 일으키지 않는다. 본 발명은 박테리아에서 유전자 변형을 스크리닝하고, 이들 유전자 돌연변이 유도에서 벡터의 효율을 결정하며, 박테리아 성장에 대한 이들 돌연변이의 효과를 결정하기 위한 방법을 더 포함한다.
Description
본 발명은 박테리아, 바람직하게 천연적으로 발생되는 박테리아를 원위치에서 변형시키기 위한 조성물, 키트, 및 방법에 관한 것이다.
인간 미생물총은 우리 신체에서 살고있는 박테리아, 고세균, 바이러스, 및 미생물 진핵생물을 포함한다. 이들 공동체의 분류학적 구성은 광범위하게 연구되어 왔고, 다양한 질환 및 형질과 상당히 연관되어 있다. 실제로 이러한 미생물총은 마이크로바이옴이라고 불리는 수천억개의 유전자를 보유하는 수천종의 상이한 박테리아 종으로 이루어진다. 이러한 마이크로바이옴은 그들 숙주에게 필수적이고 유리한 다양한 분자 (단백질, 지질, 당류, RNA 등) 및 기능, 예를 들어, 글리칸 물질대사, 아미노산 및 제노바이오틱스의 농축뿐만 아니라 우리 면역계의 조절을 코딩한다. 또한 미생물 및 인간 속성의 융합을 나타내는 인간 전체 물질대사를 일으키는 비타민, 이소프레노이드 및 다른 영양분의 합성을 담당한다.
시퀀싱 기술의 광범위 배치는 대부분의 박테리아 종이 숙주 사이에서뿐만 아니라, 종종 시간 경과에 따라 숙주 내에서도, 심지어 소정 시점에 숙주 내에서도 광범위한 유전자 변이를 보유한다는 것을 밝혀주었다.
수많은 균주의 단리 및 시퀀싱은 단일 박테리아 종 내에서 유전적 이종성을 강조한다. 단일 박테리아 종 내에 상이한 균주 간에, 이러한 변이는 중복, 결실, 삽입, 역위뿐만 아니라 수평적 유전자 전달 예컨대 프로파지 또는 플라스미드 획득 및 이러한 외생성 DNA와의 재조합 사건을 포함한, 단일-뉴클레오티드 변이체, 짧은 삽입 및 결실 (indel), 및 더 큰 구조적 변이체를 포함한다.
이러한 변이 덕분에, 이러한 균주는 단일 숙주에 공존할 때, 종종 특별한 마이크로바이옴 니쉐에서 그들 존재에 대해 서로 경쟁한다.
흥미롭게도, 특별한 균주 (및 그러므로 마이크로바이옴 중 특별한 유전자 서명)의 존재가 자가면역, 감염, 염증, 신경퇴행성 질환 또는 종양형성을 포함한, 수많은 병상과 직접적으로 연관될 수 있다는 것을 입증하는 메가게놈 시퀀싱을 기반으로 최근 연구의 양이 증가하고 있다.
마이크로바이옴-연관 질환 또는 장애를 치료하기 위해서, 현재 접근법은 유해한 박테리아뿐만 아니라 비-유해한 박테리아도 사멸시키게 되는, 감산 방법, 예컨대 복제성 파지, 리신을 사용하여 원치않는 박테리아 (및 그러므로 그들이 보유하는 유해한 유전자)를 제거하고자 시도한다.
이러한 전략들은 전체 박테리아 개체군의 부하를 상당히 감소시켜서 단기간에는 유리한 것으로 증명되었지만,
- 강력한 군집붕괴를 유도할 수 있고 비-표적화된 유해한 박테리아 종 또는 균주의 단기간 과성장을 초래할 수 있다. 예를 들어, 박테리아 예컨대 클로스트리듐 디피실 (Clostridium difficile)은 항생제 치료로 인해 야기된 박테리아 공극을 채우는 것으로 알려져 있다. 따라서, 마이크로바이옴 내에 특정한 표적화된 박테리아 종 또는 균주의 사멸은 단기간 및 장기간에 해로운 박테리아에 의해 채워질 수 있는 공극을 야기할 수 있다. 이들 박테리아는 표적화된 종과 동일한 종일 수 있거나 또는 상이한 종일 수 있다.
- 장기간 항미생물제 내성의 출현을 초래하고 그러므로 병상과 연관된 유전자 구성요소를 보유하는 종 또는 균주(들)를 배제하는데 비효율적이게 만든다. 예를 들어, 항생제 사용은 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)의 항생제-민감성 균주의 스타필로코쿠스 아우레우스의 항생제-내성 균주로의 대체와 연관되었다. 그러므로, 마이크로바이옴 중에 생착된 박테리아 개체군의 항구적 제거는 달성하기 어려울 수 있는데, 마이크로바이옴이 상이한 지리학적 및 물질대사적 니쉐를 차지하는 상이한 개체군 (균주 또는 종)과 자연적으로 천연 상태에 있기 때문이다. 항생제처럼 비-특이적 치료는 전형적으로 수 주 또는 수 개월 이후에 치료전에 존재한 평형 상태로 복귀를 초래한다. 가끔식, 평형은 더 긴 시간 기간 동안 교란되어서 군집붕괴가 발생될 수 있다. 파지 요법 (야생형 파지에서 조작된 파지로, 패키징된 파지미드), 리신, 항미생물성 펩티드, 또는 임의의 다른 표적화된 사멸 접근법에 의한 개체군의 표적화 제거는 표적화된 박테리아 생존자가 빠르게 재성장하여 비어진 채로 남아있는 니쉐를 차지하는 경향이 있어서 마찬가지로 어려울 수 있다.
마이크로바이옴 중 박테리아 개체군의 항구적 제거는 달성하기가 어려울 수 있는데, 마이크로바이옴은 상이한 지리학적 및 물질대사적 니쉐를 차지하는 상이한 개체군 (균주 또는 종)과 자연적으로 평형 상태에 있기 때문이다. 항생제처럼 비-특이적 치료는 전형적으로 수 주 또는 수 개월 이후에 치료 전에 존재한 평형 상태로 복귀를 초래한다. 가끔, 평형 상태는 더 긴 시간 기간 동안 교란되어서 군집붕괴가 발생될 수 있다. 파지 요법 (야생형 파지에서 조작된 파지로, 패키징된 파지미드), 리신, 항미생물성 펩티드, 또는 임의의 다른 표적화된 사멸 접근법에 의한 개체군의 표적화 제거는 표적화된 박테리아 생존자가 빠르게 재성장하여 빈 채로 남은 니쉐를 차지하는 경향이 있으므로 동등하게 어려울 수 있다.
이들 이유때문에, 균주 수준이건 또는 종 수준이건 간에, 원위치에서 표적 박테리아 개체군의 유전자 변형은 흥미로운 대안일 수 있다. 표적 박테리아를 사멸시키지 않고, 일부 경우에 심지어 이의 적합도에 영향을 미치지 않으므로 이의 생태계의 평형을 방해하지 않으면서, 이의 유해한 효과를 제거하도록 유해한 개체군의 변형을 초래할 수 있다.
이러한 방식으로, 해로운 박테리아가 채워질 수 있는 공극을 생성시키지도 않고 치료 내성을 초래하지도 않을 것이다. 이러한 접근법은 특히 장기간 또는 만성 병상의 사례에서, 다수의 마이크로바이옴-연관 질환 또는 장애를 치료하거나, 예방하거나, 또는 치유하기 위한 매우 강력하고 정교한 접근법을 나타낸다. 본 발명은 이러한 요구를 충족시킨다.
본 발명은 원위치에서 천연 발생 박테리아를 변형시키기 위한 방법, 키트, 및 조성물에 관한 것이다. 일 구현예에서, 방법, 특히 비-치료적 방법은 DNA 서열에 이중 가닥 파괴를 도입시키지 않고 원위치에서 천연 발생 박테리아의 DNA 서열을 유전자 변형시키는 단계를 포함한다. 바람직하게, 유전자 변형은 박테리아의 사멸을 초래하지 않는다.
일 구현예에서, 방법, 특히 비-치료적 방법은 상기 천연 발생 박테리아를 유전자 변형을 유도시키기 위한 효소 또는 시스템을 코딩하는 벡터와 접촉시키는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 원위치 및/또는 생체내에서 천연 발생 박테리아를 변형시키는 치료적 방법에서 사용을 위한, 유전자 변형을 유도시키기 위한 효소 또는 시스템을 코딩하는 벡터에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 벡터는 표적화된 박테리아에서 불활성이지만 도너 박테리아 세포에서 활성인 조건적 복제 기원을 더 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 조건적 복제 기원은 그의 복제가 소정 단백질, 펩티드, 핵산, RNA, 분자 또는 이의 임의 조합의 존재에 의존하는 복제 기원이다. 특정 구현예에서, 상기 조건적 복제 기원은 상기 도너 박테리아 세포가 상기 소정 단백질, 펩티드, 핵산, RNA, 분자 또는 이의 임의 조합을 발현하기 때문에 상기 도너 박테리아 세포에서 활성적이다. 특정 구현예에서, 상기 조건적 복제 기원은 파지-유도성 염색체 섬 (PICI)으로부터 유래되는 복제 기원이다. 특정 구현예에서, 상기 조건적 복제 기원은 상기 도너 박테리아 세포가 rep 단백질, 특히 프리마제-헬리카제를 발현하기 때문에 상기 도너 박테리아 세포에서 활성적이다. 특정 구현예에서, 상기 조건적 복제 기원은 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli) 균주 CFT073의 PICI로부터의 복제 기원으로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 상기 조건적 복제 기원은 SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 8의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
일 구현예에서, 상기 벡터는 항생제 내성 마커가 없다.
일 구현예에서, 상기 벡터는 박테리아로 벡터의 전달을 허용하는 전달 비히클 내부, 보다 특히 박테리아 바이러스 입자 내부에 위치된다. 일 구현예에서, 방법은 상기 천연 발생 박테리아를 박테리아로 벡터의 전달을 허용하는 전달 비히클 내부에 위치하는 벡터와 접촉시키는 단계를 포함한다. 바람직하게, 전달 비히클 내부에 위치된 벡터는 파지미드이고, 바람직하게, 전달 비히클은 박테리아 바이러스 입자 또는 캡시드이다.
특정 구현예에서, 상기 벡터는 박테리아 바이러스 입자 내부에 존재하고, 보다 특히 패키징된 파지미드의 형태이다. 일 구현예에서, 방법은 상기 천연 발생 박테리아에 패키징된 파지미드를 형질도입시키는 단계를 포함한다. 바람직하게, 파지미드는 이의 DNA 결합 능력을 보유하면서 DNA 이중 가닥 파괴를 수행할 수 없도록 변형되고, 다른 유형의 기능을 수행하기 위한 도메인, 예컨대, 예를 들어 염기 편집을 수행하기 위한 도메인에 융합된 변형된 뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 바람직하게, 파지미드는 RNA 가이드된 뉴클레아제인 뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 바람직하게, 파지미드는 dCas9 (dead-Cas9) 또는 nCas9 (닉카제 Cas9)를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 파지미드는 dCas9 및 디아미나제 도메인, 또는 nCas9 및 디아미나제 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 유전자 변형은 적어도 하나의 점 돌연변이(들)이다.
일 구현예에서, 유전자 변형은 적어도 하나의 삽입 또는 적어도 하나의 결실이다.
일 구현예에서, 유전자 변형은 프레임시프트 돌연변이를 초래하는 코딩 서열 내부의 적어도 하나의 점 돌연변이(들), 삽입 및/또는 결실이다.
일 구현예에서, 유전자 변형을 갖는 박테리아는 유전자 변형이 없는 동일 박테리아와 비교하여 감소된 생체내 성장률 및/또는 적합도를 갖지 않는다.
일 구현예에서, 유전자 변형은 박테리아 독소 유전자 내에 있다. 일 구현예에서, 유전자 변형은 pks+ 이. 콜라이 (E. coli)의 ClbP 유전자 내에 있고, 단일 아미노산 돌연변이 및 콜리박틴 독소의 유전독성 활성의 불활성화를 일으키지만, 길항적 활성은 유지한다. 바람직하게, 유전자 변형은 ClbP 유전자의 S95 또는 K98에 존재한다. 보다 바람직하게, 유전자 변형은 S95A, S95R 및 K98T로 이루어진 군으로부터 선택된다1.
일 구현예에서, 유전자 변형은 박테로이데스 파에시스 (Bacteroides faecis) 또는 박테로이데스 세타이오타오미크론 (Bacteroides thetaiotaomicron) 베타-갈락토시다제 유전자에 존재하고, 상기 베타-갈락토시다제 유전자는 전형적으로 SEQ ID NO: 2322 서열이고, 전형적으로 SEQ ID NO: 2323 서열의 단백질을 코딩한다. 바람직하게, 유전자 변형을 갖는 박테로이데스 파에시스 또는 박테로이데스 세타이오타오미크론 베타-갈락토시다제 단백질은 유전자 변형이 없는 박테로이데스 파에시스 또는 박테로이데스 세타이오타오미크론 베타-갈락토시다제 단백질과 비교하여, 인간 MYH6 심장 펩티드와 보다 낮은 상동성을 보이고, 상기 인간 MYH6 심장 펩티드는 전형적으로 SEQ ID NO: 2324 서열이다2.
일 구현예에서, 방법은 대상체에서, 특히 인간에서 원위치에서 천연 발생 박테리아의 적어도 하나의 DNA 서열 또는 유전자를 유전자 변형시키는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 방법은 원위치에서 천연 발생 박테리아를 유전자 변형시켜서 숙주 - 마이크로바이옴 상호작용을 조절하는 단계를 포함하고, 상기 천연 발생 박테리아는 마이크로바이옴 연관된 장애 또는 질환에 관여된다.
일 구현예에서, 방법은 DNA 서열에 이중 가닥 파괴를 도입시키지 않고 원위치에서 천연 발생 박테리아의 마이크로바이옴 연관된 장애 또는 질환에 대한 원인이 되는 DNA 서열을 유전자 변형시키는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 유전자 변형은 마이크로바이옴 연관된 장애 또는 질환의 효과를 감소시키고, 유전자 변형은 박테리아의 사멸을 초래하지 않는다. 바람직하게, 유전자 변형을 갖는 박테리아는 유전자 변형이 없는 동일 박테리아와 비교하여 감소된 생체내 성장률을 갖지 않는다.
일 구현예에서, 방법은 숙주 마이크로바이옴의 박테리아 개체군의 면역원성 프로파일을 변형시켜서 취약 숙주에서 자가-면역 질환 또는 반응의 과정 중에 예방하거나 또는 중재하기 위한 것이다. 일 구현예에서, 방법은 박테리아 개체군을 DNA 서열의 절단없이 상기 개체군의 적어도 일부 박테리아에서 박테리아에 의해 발현되거나 또는 분비되는 면역원성 성분을 코딩하는 DNA 서열에 유전자 변형을 생성시키는 벡터와 접촉시키는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 취약 숙주에서 자가-면역 질환 또는 반응의 과정 중에 예방하거나 또는 중재하는데 사용을 위한, DNA 서열 절단없이 숙주 마이크로바이옴의 박테리아 개체군의 적어도 일부 박테리아에서 박테리아에 의해 발현되거나 또는 분비되는 면역원성 성분을 코딩하는 DNA 서열에 유전자 변형을 생성시키는 벡터에 관한 것으로서, 상기 벡터는 상기 박테리아 개체군의 면역원성 프로파일을 변형시킨다. 바람직하게, 면역원성 성분을 코딩하는 DNA 서열의 유전자 변형은 상기 면역원성 성분의 면역원성 효과의 상실을 일으키고, 상기 유전자 변형은 박테리아의 직접 사멸을 초래하지 않는다. 바람직하게, 면역원성 성분을 코딩하는 DNA 서열의 유전자 변형은 면역원성 성분을 인식하는 면역계의 불능을 일으킨다. 바람직하게, 유전자 변형을 갖는 박테리아는 유전자 변형이 없는 동일 박테리아와 비교하여 감소된 생체내 성장률을 갖지 않는다.
일 구현예에서, 방법은 상기 천연 발생 박테리아를 유전자 변형을 유도시키기 위한 효소 또는 시스템을 코딩하는 벡터와 접촉시키는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 벡터는 표적화된 박테리아에서 불활성이지만 도너 박테리아 세포에서 활성인 조건적 복제 기원을 더 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 조건적 복제 기원은 그의 복제가 소정 단백질, 펩티드, 핵산, RNA, 분자 또는 이의 임의 조합의 존재에 의존하는 복제 기원이다. 특정 구현예에서, 상기 조건적 복제 기원은 상기 도너 박테리아 세포가 상기 소정 단백질, 펩티드, 핵산, RNA, 분자 또는 이의 임의 조합을 발현하기 때문에 상기 도너 박테리아 세포에서 활성적이다. 특정 구현예에서, 상기 조건적 복제 기원은 파지-유도성 염색체 섬 (PICI)로부터 유래되는 복제 기원이다. 특정 구현예에서, 상기 조건적 복제 기원은 상기 도너 박테리아 세포가 rep 단백질, 특히 프리마제-헬리카제를 발현하기 때문에 상기 도너 박테리아 세포에서 활성적이다. 특정 구현예에서, 상기 조건적 복제 기원은 에스케리치아 콜라이 균주 CFT073의 PICI로부터의 복제 기원으로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 상기 조건적 복제 기원은 SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 8 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
일 구현예에서, 상기 벡터는 항생제 내성 마커가 없다.
다른 일 구현예에서, 상기 벡터는 영양요구성 마커를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 벡터는 박테리아로 벡터의 전달을 허용하는 전달 비히클 내부에, 보다 특히 박테리아 바이러스 입자 내부에 위치된다.
일 구현예에서, 방법은 상기 천연 발생 박테리아를 박테리아로 벡터의 전달을 허용하는 전달 비히클 내부에 위치하는 벡터와 접촉시키는 단계를 포함한다.
바람직하게, 벡터를 갖는 전달 비히클은 패키징된 파지미드이다.
특정 구현예에서, 상기 패키징된 파지미드는 상기 박테리아의 게놈을 변형시키는 효소를 코딩하는 파지미드를 포함한다. 바람직하게, 상기 효소는 염기 편집자 또는 프라임 편집자이다.
일 구현예에서, 방법은 상기 박테리아에 상기 박테리아의 게놈을 변형시키는 효소를 코딩하는 파지미드를 포함하는 패키징된 파지미드를 형질도입시키는 단계를 포함한다. 바람직하게, 방법은 상기 박테리아에 염기 편집자인 효소를 코딩하는 파지미드를 포함하는 패키징된 파지미드를 형질도입시키는 단계를 포함한다. 바람직하게, 방법은 상기 박테리아에 프라임 편집자인 효소를 코딩하는 파지미드를 포함하는 패키징된 파지미드를 형질도입시키는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 변형은 모방 펩티드 중 아미노산 변화를 일으키고 모방 펩티드가 면역원성이 아니게, 즉 면역계에 의해 인식되지 않게 만드는 단백질-코딩 핵산 서열 중 적어도 하나의 점 돌연변이(들)이다.
다른 일 구현예에서, 유전자 변형은 박테리아 막 상에서 당 프로파일의 변화를 일으킨다.
다른 일 구현예에서, 유전자 변형은 단백질 서열 중 아미노산의 변화를 일으키고 이것은 박테리아 막 상에서 당 프로파일의 변화를 일으킨다.
다른 일 구현예에서, 유전자 변형은 박테리아 막 상에서 지질 프로파일의 변화를 일으킨다.
다른 일 구현예에서, 유전자 변형은 단백질 서열 중 아미노산의 변화를 일으키고 이것은 박테리아 막 상에서 지질 프로파일의 변화를 일으킨다.
일 구현예에서, 유전자 변형은 촉매 부위를 불활성화되게 한다. 일 구현예에서, 유전자 변형은 인간 세포 수용체와의 결합 부위를 비기능성이 되게 한다.
일 구현예에서, 유전자 변형은 모방 펩티드 중 아미노산의 변화를 일으키고 모방 펩티드가 면역원성이 되게, 즉 면역계에 의해 인식되지 않게 만드는 점 돌연변이(들)이다.
일 구현예에서, 단백질 서열 상에 아미노산의 변화를 일으키는 유전자 변형(들)은 단일 유전자 돌연변이가 변형된 아미노산을 다시 본래로 반전시킬 수 없도록 선택된다.
본 발명은 박테리아에서 유전자 변형에 대해 스크리닝하는 방법을 포괄한다. 일 구현예에서, 방법은
● 상기 DNA 서열에 이중 가닥 파괴의 도입없이 천연 발생 박테리아의 유전자 또는 DNA 서열 중 관심 DNA 서열의 적어도 하나의 염기를 유전자 변형시키도록 디자인된 벡터를 대상체에게 투여하는 단계,
● 후속하여 대상체로부터 박테리아 샘플을 수집하는 단계, 및
● 상기 박테리아 샘플 중 관심 DNA 서열의 상기 적어도 하나의 염기에 유전자 변형을 함유하는 박테리아의 수준을 정량하는 단계
를 포함한다.
일 구현예에서, 방법은 관심 DNA 서열의 적어도 하나의 염기에 유전자 변형을 함유하지 않는 박테리아의 수준을 정량하는 단계를 포함한다.
본 발명은 원위치에서 유전자 돌연변이를 유도하는 벡터의 효율을 결정하기 위한 방법을 포괄하고, 방법은
● 상기 DNA 서열에 이중 가닥 파괴의 도입없이 천연 발생 박테리아의 유전자 또는 DNA 서열 중 관심 DNA 서열의 적어도 하나의 염기를 유전자 변형시키도록 디자인된 벡터를 대상체에게 투여하는 단계,
● 후속하여 대상체로부터 박테리아 샘플을 수집하는 단계,
● 상기 박테리아 샘플 중 관심 DNA 서열의 상기 적어도 하나의 염기에 유전자 변형을 함유하는 박테리아의 수준을 정량하고, 관심 DNA 서열의 상기 적어도 하나의 염기에 유전자 변형을 함유하지 않는 박테리아의 수준을 정량하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 대상체에서 원위치에서 천연 발생 박테리아를 변형시키기 위한 방법을 포괄하고, 상기 방법은
● 대상체의 마이크로바이옴으로부터 박테리아 샘플을 수집하는 단계,
● 상기 박테리아 샘플을 상기 DNA 서열에 이중 가닥 파괴의 도입없이 천연 발생 박테리아의 유전자 또는 DNA 서열 중 관심 DNA 서열의 적어도 하나의 염기를 유전자 변형시키도록 디자인된 벡터와 접촉시키는 단계,
● 상기 박테리아 샘플 중 관심 DNA 서열의 상기 적어도 하나의 염기에 유전자 변형을 함유하는 박테리아의 수준을 정량하고, 관심 DNA 서열의 상기 적어도 하나의 염기에 유전자 변형을 함유하지 않는 박테리아의 수준을 정량하고, 그리하여 상기 대상체에서 유전자 돌연변이를 유도시키는 상기 벡터의 효율을 결정하는 단계, 및
● 특히 상기 결정된 효율이 소정 값 이상일 때, 상기 DNA 서열에 이중 가닥 파괴의 도입없이 천연 발생 박테리아의 유전자 또는 DNA 서열 중 관심 DNA 서열의 적어도 하나의 염기를 유전자 변형시키도록 디자인된 상기 벡터를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 박테리아 성장에 대한 유전자 돌연변이의 효과를 결정하기 위한 방법을 포괄하고, 방법은
● 상기 DNA 서열에 이중 가닥 파괴의 도입없이, 천연 발생 박테리아의 유전자 또는 DNA 서열 중 관심 DNA 서열의 적어도 하나의 염기를 유전자 변형시키도록 디자인된 벡터를 대상체에게 투여하는 단계,
● 후속하여 대상체로부터 적어도 2회 순차적 박테리아 샘플을 수집하는 단계,
● 상기 박테리아 샘플 중 관심 DNA 서열의 상기 적어도 하나의 염기에 유전자 변형을 함유하는 박테리아의 수준을 정량하고, 관심 DNA 서열의 상기 적어도 하나의 염기에 유전자 변형을 함유하지 않는 박테리아의 수준을 정량하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 유전자 변형은 단일-아미노산 돌연변이 및 콜리박틴 독소의 유전독성 활성의 불활성화를 일으키지만 길항적 활성은 유지하는 pks+ 이. 콜라이의 ClbP 유전자의 유전자 변형이다.
본 발명은 원위치에서 천연 발생 박테리아를 변형시키기 위한 박테리오파지, 박테리아 바이러스 입자 또는 패키징된 파지미드를 포괄하고, 상기 박테리오파지, 박테리아 바이러스 입자 또는 패키징된 파지미드는 혼합된 박테리아 개체군 중 표적 박테리아의 형질전환을 위한 유전자 편집 효소/시스템을 코딩하는 핵산을 포함하고, 상기 유전자 편집 효소/시스템은 DNA 서열에 이중 가닥 파괴의 도입없이 상기 표적 박테리아의 게놈을 변형시키지만, 표적 박테리아의 사멸을 초래하지 않는다. 본 발명은 상기 박테리오파지, 박테리아 바이러스 입자 또는 패키징된 파지미드의 용도를 포괄하고, 유전자 편집 효소/시스템은 질환 또는 장애에 대한 직접적 또는 간접적 원인이 되는 단백질을 코딩하는 표적 박테리아 내 DNA 서열 또는 유전자를 표적화한다. 본 발명은 상기 질환 또는 장애를 예방 및/또는 치료하는데 사용을 위한, 혼합된 박테리아 개체군 중 표적 박테리아의 형질전환을 위한 유전자 편집 효소/시스템을 코딩하는 핵산을 포함하는 박테리오파지, 박테리아 바이러스 입자 또는 패키징된 파지미드를 포괄하고, 상기 유전자 편집 효소/시스템은 DNA 서열에 이중 가닥 파괴의 도입없이 질환 또는 장애에 대해 직접적으로 또는 간접적으로 원인이 되는 단백질을 코딩하는 상기 표적 박테리아 내 DNA 서열 또는 유전자를 변형시킨다.
더 나아가서, 대상체의 마이크로바이옴은 약물, 식품 보조제, 프리바이오틱 또는 심지어 화장품, 또는 숙주에 의해 투여되거나 또는 생산되거나 또는 숙주의 다른 박테리아에 의해 생산되는 임의의 화합물의 물질대사에 영향을 미칠 수 있거나, 또는 숙주와 이러한 화합물의 상호작용 또는 숙주에 대한 이러한 화합물의 작용에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 본 발명은 대상체의 마이크로바이옴으로부터의 박테리아와 상기 대상체에게 투여되거나 또는 그에 의해 생산되거나 또는 상기 대상체의 다른 박테리아에 의해 생산되는 화합물의 상호작용을 원위치에서 변형시키기 위한 방법에 관한 것으로서, 상기 박테리아와 상기 화합물의 상호작용에 관여하는 적어도 하나의 박테리아 DNA 서열을 변형시키는 것에 의하고, 상기 박테리아 DNA 서열은 숙주 마이크로바이옴의 박테리아 개체군에 의해 발현되고, 상기 방법은
박테리아 개체군을 DNA 서열에 이중 가닥 파괴의 도입없이 상기 개체군의 박테리아의 적어도 일부에서, 상기 박테리아와 상기 화합물의 상호작용에 관여하는, 박테리아의 상기 적어도 하나의 DNA 서열에 유전자 변형을 생성시키는 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하고,
상기 적어도 하나의 DNA 서열의 유전자 변형은 박테리아와 상기 화합물의 상호작용의 변형을 일으키고;
유전자 변형은 박테리아의 직접 사멸을 초래하지 않는다.
대상체에게 투여되거나 또는 그에 의해 생성되거나 또는 상기 대상체의 다른 박테리아에 의해 생성되는 화합물과 박테리아의 상기 상호작용은 (i) 상기 박테리아에 의한 상기 화합물의 변형 및/또는 (ii) 상기 대상체로부터의 리간드에 대한 상기 화합물 및 상기 박테리아에 의해 생성 및/또는 분비되는 분자 간 경쟁 및/또는 (iii) 상기 박테리아에 의한 상기 화합물의 결합/흡착을 포괄한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 숙주 마이크로바이옴의 박테리아 개체군에 의해 발현되는 적어도 하나의 약물-표적화 효소를 변형시켜서, 상기 약물로 처리된 숙주에서 소정 약물의 물질대사를 변형시키기 위한 방법에 관한 것으로서,
박테리아 개체군을 DNA 서열에 이중 가닥 파괴의 도입없이 상기 개체군의 박테리아의 적어도 일부에서 박테리아에 의해 발현 또는 분비되는 약물-표적화 효소를 코딩하는 DNA 서열에 유전자 변형을 생성시키는 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하고,
약물-표적화 효소를 코딩하는 DNA 서열의 유전자 변형은 숙주에서 약물 물질대사의 변형을 일으키고;
유전자 변형은 박테리아의 직접 사멸을 초래하지 않는다.
소정 약물의 물질대사의 상기 변형은 숙주에 유독한 화합물로 소정 약물의 변형을 방지하는 변형, 소정 약물의 가수분해를 방지하여서 상기 약물의 장기간 활성을 초래하는 변형, 소정 약물의 효소적 변형으로서 상기 약물의 증가되고/되거나 연장된 활성을 초래하는 변형, 상기 소정 약물의 활성 또는 보다 활성 화합물로의 변환, 소정 약물로부터 해독된 화합물의 재활성화를 방지하는 변형으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 원위치에서 유전자 변형된 표적 박테리아와 변형이 발생되지 않은 표적 박테리아를 구별하도록 프로그램된 뉴클레아제의 전달 덕분에, 변형이 발생되지 않은 것의 특이적 사멸을 초래하는, 마이크로바이옴 개체군 내 모든 표적화된 박테리아의 강건한 변경을 보장하기 위한 조성물 및 방법을 포괄한다. 따라서, 본 발명은 또한 마이크로바이옴 개체군 내 모든 표적화된 박테리아의 강건한 변경을 보장하기 위한 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 상기 마이크로바이옴 개체군을 원위치에서 유전자 변형된 표적화된 박테리아 및 변형이 발생되지 않은 표적화된 박테리아를 구별하도록 프로그램된 뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 프로그램된 뉴클레아제는 변형이 발생되지 않은 표적화된 박테리아의 특이적 사멸을 가능하게 한다. 특정 구현예에서, 이러한 뉴클레아제의 전달은 염기-편집 뉴클레아제를 함유하는 것과 동일한 DNA 페이로드, 또는 상이한 페이로드 상에 있다. 다른 말로, 특정 구현예에서, 상기 프로그램된 뉴클레아제를 코딩하는 핵산은 염기-편집 뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 포함하는 것과 동일한 벡터 또는 상이한 벡터에 위치된다. 특정 구현예에서, 이러한 뉴클레아제의 전달은 염기-편집을 함유하는 페이로드의 전달과 동시에 또는 그 이후이다. 다른 말로, 특정 구현예에서, 상기 프로그램된 뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 포함하는 상기 벡터는 염기-편집 뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터와 동시에 또는 그 이후에 투여된다. 동시에 전달되면, 페이로드는 프로그램된 뉴클레아제에 대한 지연된 표적화 과정을 갖도록 조작될 수 있어서 DNA 이중 가닥 파괴를 초래할 수 있다.
본 명세서에 개시된 대상 주제를 더욱 잘 이해하고 실제로 어떻게 수행될 수 있는가를 예시하기 위해서, 비제한적인 예로, 첨부된 도면을 참조하여, 구현예를 기술할 것이다. 도면을 특히 참조하여, 표시된 세부사항은 예로서 본 발명의 구현예의 예시적인 논의의 목적을 위한 것임을 강조한다.
도 1은 천연 발생 박테리아 원위치에서에서 천연 발생 박테리아를 변형시키기 위한 방법을 도시한다. 치료의 부재 하에서 박테리아는 병원성 예컨대 염증을 초래하는 분자를 생산한다. 비-효율적인 표적 세포 변형의 경우에서 치료 시, 박테리아 개체군의 오직 일부분만이 유전자 변형되어 비병원성인 변형된 분자를 발현하는 반면 유전자 비변형된 박테리아는 여전히 병원성 변이체를 생산한다. 이러한 이종성 박테리아 개체군 및 그들 연관된 분자는 비치료 사례와 비교하여 경미한 질환 상태를 초래한다. 마지막으로, 모든 개체군 또는 대다수의 효율적인 표적 세포 변형의 경우에, 분자의 병원성 변이체는 더 이상 존재하지 않거나 또는 병원성이 없고 건강한 상태에 도달하도록 충분히 적은 양으로 존재한다.
도 2는 박테리아 항원이 인간 단백질을 모방하는 원위치에서 천연 발생 박테리아의 박테리아 항원을 변형시키기 위한 방법을 도시한다. 박테리아 항원은 항원 제시 세포 (APC)에 의해서 T 세포에게 제시되어 이의 활성화 및 한편으로는 박테리아 항원 및 다른 한편으로는 인간 단백질 또는 자가 항원에 대한 면역 반응을 초래하게 되고 따라서 자가-면역 반응을 초래하게 된다.
도 3은 원위치에서 천연 발생 박테리아의 변형에 대한 스크리닝 방법을 도시한다. 치료 전에 환자는 잠재적 박테리아 표적을 검출하고 정량하기 위해서 임의로 샘플을 채취한다. 다음으로 치료는 표적 마이크로바이옴 국재화에 의존하여 상이한 형태 (경구, 전신, 국소)로 투여된다. 치료 이후에 환자는 박테리아 표적 및 치료에 의해 유도된 유전자 변형을 검출하고/하거나 정량하기 위해 샘플 채취된다.
도 4는 시험관내에서 형질전환 이후에 이. 콜라이 게놈에 대한 mCherry의 염기 편집을 보여주는 그래프를 표시한다. A) mCherry의 아데닌 염기 편집 (ABE = ABE8e). 실험은 mCherry의 활성 부위를 표적화하는 가이드RNA의 존재 (48개 콜로니 분석됨) 또는 부재 (2개 콜로니 분석됨) 하에서 수행되었다 (트리펩티드: M71, Y72, G73). B) mCherry의 시토신 염기 편집 (CBE = evoAPOBEC1-nCas9-UGI). 실험은 mCherry에 중지 코돈을 삽입하는 가이드RNA의 존재 (48개 콜로니 분석됨) 또는 부재 (2개 콜로니 분석됨) 하에서 수행되었다. 형광도는 개별 콜로니의 유세포측정에 의해 측정되었다 (임의 단위 a.u.) (1개 도트는 한천 플레이트 상에서 밤샘 인큐베이션 이후 단일 콜로니를 나타냄).
도 5는 시험관내 파지미드 형질도입 이후에 이. 콜라이 게놈 상에서 β-락타마제의 염기 편집을 보여주는 히스토그램 및 그래프를 표시한다. A) 염기 편집자 페이로드를 포함하는 람다 패키징된 파지미드의 역가 (ABE = ABE8e, CBE = evoAPOBEC1-nCas9-UGI). B) 게놈 상에서 β-락타마제 유전자 (K71E)의 활성 부위를 표적화하는 감염 다중도 (MOI)-의존적 아데닌 염기 편집 (ABE). C) β-락타마제의 감염 다중도 (MOI)-의존적 시토신 염기 편집 (CBE). β-락타마제의 활성 부위의 편집은 카르베니실린 플레이트 상에서 세포 성장을 감소시킨다.
도 6은 올리고MM 마우스에 생체내에서 이. 콜라이로 형질도입 이후에 β-락타마제의 아데닌 염기 편집을 보여주는 히스토그램을 표시한다. 생체내 실험에 대한 패키징된 파지미드 역가는 1.5 Х109 형질도입 단위 (tu)/㎕였다. 분변 샘플은 형질도입 이후 0시간, 6시간, 및 48시간에 분석되었다 (각각 48개, 96개, 88개 콜로니). 세포는 전달 및 편집 효율을 분석하기 위해서 스트렙토마이신, 클로람페니콜, 및 카르베니실린 플레이트 상에 플레이팅되었다. β-락타마제의 활성 부위 (K71)의 편집 결과로 카르베니실린 플레이트 상에서 세포 성장의 상실이 야기된다.
도 7 및 도 8은 구축된 염기 편집자의 플라스미드 지도를 도시한다. 아데닌 염기 편집은 ABE8e에 의해서 예시적으로 수행되었다 (도 7; SEQ ID NO: 2). ABE8e는 nCas9 (D10A)에 융합된 진화된 TadA* 유전자를 포함한다. 시토신 염기 편집은 evoAPOBEC1-nCas9-UGI에 의해 예시적으로 수행되었다 (도 8; SEQ ID NO: 4). nCas9 (D10A)에 융합된 UGI는 U:G 불일치가 C:G 염기쌍으로 다시 복구되는 것을 방지한다. DNA 페이로드는 람다 파지미드 입자로 패키징을 위한 cos 부위를 보유한다.
도 9는 시험관내에서 이. 콜라이 게놈에 대한 적색 형광 단백질 (RFP)의 프라임 편집을 보여주는 히스토그램을 표시한다. 게놈 RFP 유전자는 18개 개별 콜로니로부터 증폭되었고 최종 PCR 단편을 시퀀싱하였다. 편집 효율은 이들 데이터로부터 계산되었다.
도 10은 프리마제-헬리카제를 기반으로 비-복제성 페이로드를 사용하여 시험관내에서 패키징된 파지미드 형질도입 이후에 이. 콜라이 게놈에 대한 β-락타마제의 아데닌 염기 편집을 보여주는 그래프를 표시한다. β-락타마제 유전자를 코딩하는 MG1655 균주는 세포 내부에서 발현되는 프리마제-헬리카제 단백질의 존재 또는 부재 하에서 형질도입시켰다. 형질도입된 세포는 상이한 감염 다중도 (MOI)에서 형질도입 후 2시간에 LB 및 LB (카르베니실린) 플레이트 상에 플레이팅하였다. 다음 날에, 염기 편집 효율은 콜로니 계측을 통해서 분석하였다.
도 11은 트랜스로 유도성 프리마제 RBS 라이브러리를 보유하는 생산 균주에서 프리마제-복제 기원을 함유하는 2.3 kb 페이로드의 형질전환을 보여주는 도면을 표시한다.
도 12는 7개의 상이한 프리마제 RBS에 대해 시험된 생산 균주에서 프리마제-ori를 함유하는 플라스미드로 수득된 패키징된 파지미드 역가를 비교하는 히스토그램을 표시한다. 검은색의 우측 컬럼, p15a-유래 복제 기원을 갖는 대조군 플라스미드. 표시된 역가는 10X 농축 이후이다.
도 13 은 25 ㎍/mL 클로람페니콜이 더해진 LB 한천 상에서 프리마제-ori 플라스미드 (상단 행) 및 p15a-기반 패키징된 파지미드가 형질도입된 세포를 비교하는 사진을 표시한다.
도 14 는 프리마제-헬리카제를 기반으로 비-복제성 페이로드를 사용한 10마리 올리고MM 마우스에서 이. 콜라이로 패키징된 파지미드 형질도입 이후에 β-락타마제의 아데닌 염기 편집을 보여주는 히스토그램을 표시한다. 생체내에서 아데닌 염기 편집의 전달 및 편집 효율. 생체내 실험에 대한 패키징된 파지미드 역가는 1.5*1010 tu/㎕였다. 분변 샘플은 형질도입 이후 24시간에 분석되었다. 세포는 편집 효율을 분석하기 위해서 스트렙토마이신 및 스트렙토마이신/카르베니실린 상에 플레이팅되었다 (마우스 당 20개 콜로니). β-락타마제의 활성 부위 (K71)의 편집 결과로 카르베니실린 플레이트 상에서 세포 성장의 상실이 야기되었다. 24시간 이후에, 염기 편집 효율은 평균적으로 전체 개체군의 ∼75%였다.
표 1 은 후보 모방 펩티드를 보유하는 장내 박테리아 종, 관련 모방 펩티드의 아미노산 서열, 및 각각의 모방 펩티드를 함유하는 박테리아 및 인간 단백질의 Uniprot ID를 표시한다.
표 2 는 약물-물질대사 유전자 생성물을 코딩하는 핵산 서열 (열거된 contig에서 출발 뉴클레오티드 및 종료 뉴클레오티드로 확인됨)을 표시한다.
도 1은 천연 발생 박테리아 원위치에서에서 천연 발생 박테리아를 변형시키기 위한 방법을 도시한다. 치료의 부재 하에서 박테리아는 병원성 예컨대 염증을 초래하는 분자를 생산한다. 비-효율적인 표적 세포 변형의 경우에서 치료 시, 박테리아 개체군의 오직 일부분만이 유전자 변형되어 비병원성인 변형된 분자를 발현하는 반면 유전자 비변형된 박테리아는 여전히 병원성 변이체를 생산한다. 이러한 이종성 박테리아 개체군 및 그들 연관된 분자는 비치료 사례와 비교하여 경미한 질환 상태를 초래한다. 마지막으로, 모든 개체군 또는 대다수의 효율적인 표적 세포 변형의 경우에, 분자의 병원성 변이체는 더 이상 존재하지 않거나 또는 병원성이 없고 건강한 상태에 도달하도록 충분히 적은 양으로 존재한다.
도 2는 박테리아 항원이 인간 단백질을 모방하는 원위치에서 천연 발생 박테리아의 박테리아 항원을 변형시키기 위한 방법을 도시한다. 박테리아 항원은 항원 제시 세포 (APC)에 의해서 T 세포에게 제시되어 이의 활성화 및 한편으로는 박테리아 항원 및 다른 한편으로는 인간 단백질 또는 자가 항원에 대한 면역 반응을 초래하게 되고 따라서 자가-면역 반응을 초래하게 된다.
도 3은 원위치에서 천연 발생 박테리아의 변형에 대한 스크리닝 방법을 도시한다. 치료 전에 환자는 잠재적 박테리아 표적을 검출하고 정량하기 위해서 임의로 샘플을 채취한다. 다음으로 치료는 표적 마이크로바이옴 국재화에 의존하여 상이한 형태 (경구, 전신, 국소)로 투여된다. 치료 이후에 환자는 박테리아 표적 및 치료에 의해 유도된 유전자 변형을 검출하고/하거나 정량하기 위해 샘플 채취된다.
도 4는 시험관내에서 형질전환 이후에 이. 콜라이 게놈에 대한 mCherry의 염기 편집을 보여주는 그래프를 표시한다. A) mCherry의 아데닌 염기 편집 (ABE = ABE8e). 실험은 mCherry의 활성 부위를 표적화하는 가이드RNA의 존재 (48개 콜로니 분석됨) 또는 부재 (2개 콜로니 분석됨) 하에서 수행되었다 (트리펩티드: M71, Y72, G73). B) mCherry의 시토신 염기 편집 (CBE = evoAPOBEC1-nCas9-UGI). 실험은 mCherry에 중지 코돈을 삽입하는 가이드RNA의 존재 (48개 콜로니 분석됨) 또는 부재 (2개 콜로니 분석됨) 하에서 수행되었다. 형광도는 개별 콜로니의 유세포측정에 의해 측정되었다 (임의 단위 a.u.) (1개 도트는 한천 플레이트 상에서 밤샘 인큐베이션 이후 단일 콜로니를 나타냄).
도 5는 시험관내 파지미드 형질도입 이후에 이. 콜라이 게놈 상에서 β-락타마제의 염기 편집을 보여주는 히스토그램 및 그래프를 표시한다. A) 염기 편집자 페이로드를 포함하는 람다 패키징된 파지미드의 역가 (ABE = ABE8e, CBE = evoAPOBEC1-nCas9-UGI). B) 게놈 상에서 β-락타마제 유전자 (K71E)의 활성 부위를 표적화하는 감염 다중도 (MOI)-의존적 아데닌 염기 편집 (ABE). C) β-락타마제의 감염 다중도 (MOI)-의존적 시토신 염기 편집 (CBE). β-락타마제의 활성 부위의 편집은 카르베니실린 플레이트 상에서 세포 성장을 감소시킨다.
도 6은 올리고MM 마우스에 생체내에서 이. 콜라이로 형질도입 이후에 β-락타마제의 아데닌 염기 편집을 보여주는 히스토그램을 표시한다. 생체내 실험에 대한 패키징된 파지미드 역가는 1.5 Х109 형질도입 단위 (tu)/㎕였다. 분변 샘플은 형질도입 이후 0시간, 6시간, 및 48시간에 분석되었다 (각각 48개, 96개, 88개 콜로니). 세포는 전달 및 편집 효율을 분석하기 위해서 스트렙토마이신, 클로람페니콜, 및 카르베니실린 플레이트 상에 플레이팅되었다. β-락타마제의 활성 부위 (K71)의 편집 결과로 카르베니실린 플레이트 상에서 세포 성장의 상실이 야기된다.
도 7 및 도 8은 구축된 염기 편집자의 플라스미드 지도를 도시한다. 아데닌 염기 편집은 ABE8e에 의해서 예시적으로 수행되었다 (도 7; SEQ ID NO: 2). ABE8e는 nCas9 (D10A)에 융합된 진화된 TadA* 유전자를 포함한다. 시토신 염기 편집은 evoAPOBEC1-nCas9-UGI에 의해 예시적으로 수행되었다 (도 8; SEQ ID NO: 4). nCas9 (D10A)에 융합된 UGI는 U:G 불일치가 C:G 염기쌍으로 다시 복구되는 것을 방지한다. DNA 페이로드는 람다 파지미드 입자로 패키징을 위한 cos 부위를 보유한다.
도 9는 시험관내에서 이. 콜라이 게놈에 대한 적색 형광 단백질 (RFP)의 프라임 편집을 보여주는 히스토그램을 표시한다. 게놈 RFP 유전자는 18개 개별 콜로니로부터 증폭되었고 최종 PCR 단편을 시퀀싱하였다. 편집 효율은 이들 데이터로부터 계산되었다.
도 10은 프리마제-헬리카제를 기반으로 비-복제성 페이로드를 사용하여 시험관내에서 패키징된 파지미드 형질도입 이후에 이. 콜라이 게놈에 대한 β-락타마제의 아데닌 염기 편집을 보여주는 그래프를 표시한다. β-락타마제 유전자를 코딩하는 MG1655 균주는 세포 내부에서 발현되는 프리마제-헬리카제 단백질의 존재 또는 부재 하에서 형질도입시켰다. 형질도입된 세포는 상이한 감염 다중도 (MOI)에서 형질도입 후 2시간에 LB 및 LB (카르베니실린) 플레이트 상에 플레이팅하였다. 다음 날에, 염기 편집 효율은 콜로니 계측을 통해서 분석하였다.
도 11은 트랜스로 유도성 프리마제 RBS 라이브러리를 보유하는 생산 균주에서 프리마제-복제 기원을 함유하는 2.3 kb 페이로드의 형질전환을 보여주는 도면을 표시한다.
도 12는 7개의 상이한 프리마제 RBS에 대해 시험된 생산 균주에서 프리마제-ori를 함유하는 플라스미드로 수득된 패키징된 파지미드 역가를 비교하는 히스토그램을 표시한다. 검은색의 우측 컬럼, p15a-유래 복제 기원을 갖는 대조군 플라스미드. 표시된 역가는 10X 농축 이후이다.
도 13 은 25 ㎍/mL 클로람페니콜이 더해진 LB 한천 상에서 프리마제-ori 플라스미드 (상단 행) 및 p15a-기반 패키징된 파지미드가 형질도입된 세포를 비교하는 사진을 표시한다.
도 14 는 프리마제-헬리카제를 기반으로 비-복제성 페이로드를 사용한 10마리 올리고MM 마우스에서 이. 콜라이로 패키징된 파지미드 형질도입 이후에 β-락타마제의 아데닌 염기 편집을 보여주는 히스토그램을 표시한다. 생체내에서 아데닌 염기 편집의 전달 및 편집 효율. 생체내 실험에 대한 패키징된 파지미드 역가는 1.5*1010 tu/㎕였다. 분변 샘플은 형질도입 이후 24시간에 분석되었다. 세포는 편집 효율을 분석하기 위해서 스트렙토마이신 및 스트렙토마이신/카르베니실린 상에 플레이팅되었다 (마우스 당 20개 콜로니). β-락타마제의 활성 부위 (K71)의 편집 결과로 카르베니실린 플레이트 상에서 세포 성장의 상실이 야기되었다. 24시간 이후에, 염기 편집 효율은 평균적으로 전체 개체군의 ∼75%였다.
표 1 은 후보 모방 펩티드를 보유하는 장내 박테리아 종, 관련 모방 펩티드의 아미노산 서열, 및 각각의 모방 펩티드를 함유하는 박테리아 및 인간 단백질의 Uniprot ID를 표시한다.
표 2 는 약물-물질대사 유전자 생성물을 코딩하는 핵산 서열 (열거된 contig에서 출발 뉴클레오티드 및 종료 뉴클레오티드로 확인됨)을 표시한다.
본 발명은 원위치에서 천연 발생 박테리아를 변형시키기 위한, 조성물, 키트 및 방법, 특히 비-치료적 방법을 포괄한다. 본 발명은 원위치에서 비-천연 발생 박테리아, 예컨대 생체외 유전자 변형을 갖는 것을 변형시키기 위한, 조성물, 키트, 및 방법, 특히 비-치료적 방법을 더 포괄한다. 본 발명의 조성물, 키트 및 방법은 숙주 마이크로바이옴 내에서 유해한 박테리아 균주를 유전자 변형시켜서 이들 균주를 직접적으로 사멸시키지 않고 숙주에 비-유해한 균주로 그들을 전환시킨다.
본 발명은 비유해한 박테리아를 개선시키거나 또는 기능화시키는 변형을 더 포괄한다. 본 발명은 박테리아에서 유전자 변형에 대해 스크리닝하고, 이들 유전자 돌연변이를 유도하는 벡터의 효율을 결정하고, 박테리아 성장 또는 임의의 박테리아 기능에 대한 이들 돌연변이의 효과를 결정하고, 원위치에서 변형된 박테리아 대 비-변형된 박테리아의 비율을 증가시키고, 이러한 접근법이 환자에서 긍정적 결과를 초래하는 기회를 증가시키는 방법을 더 포함한다.
바람직하게, 유전자 변형은 DNA 서열에 이중 가닥 파괴를 도입시키지 않는 원위치에서 천연 발생 박테리아 중 DNA 서열의 변형이다. 따라서, 방법은 DNA 서열 중에 절단을 생성시키지 않는 단계, DNA 서열의 한 가닥에 닉을 생성시키는 단계, 또는 DNA 서열에 이중 가닥 파괴를 초래하지 않는, DNA 서열의 양쪽 가닥 중 스태거드 닉을 생성시키는 단계를 포함한다.
본 명세서는 마이크로바이옴의 박테리아 개체군에 의해서 발현 및/또는 분비되는 분자 또는 그들 발현/분비 수준을, 숙주 건강에 대한 그들 유해한 잠재성을 감소시키는 방식으로 이들 개체군의 일부분 및 전부 및 숙주 간 상호작용의 변형을 일으키고, 이들 개체군의 직접 사멸, 그들 성장의 직접 유의한 억제 또는 주요한 박테리아 기능의 손상을 일으키지 않는 특별한 방식으로, 조절하여 마이크로바이옴-연관 질환 또는 장애를 치료하거나, 예방하거나 또는 치유하는 조성물, 키트, 및 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 마이크로바이옴의 박테리아 개체군에 의해 발현 및/또는 분비되는 분자 또는 그들 발현/분비 수준을, 특히 숙주 건강에 대한 그들의 유해한 잠재성을 감소시키는 방식으로 이들 개체군의 일부분 또는 전부 및 숙주 간 상호작용의 변형을 일으키고, 이들 개체군의 직접 사멸, 그들 성장의 직접 유의한 억제 또는 주요한 박테리아 기능의 손상을 일으키지 않는 특별한 방식으로, 조절하여, 마이크로바이옴-연관 질환 또는 장애를 치료하거나, 예방하거나 또는 치유하기 위해 사용을 위한 원위치에서 천연 발생 박테리아에서 유전자 변형을 유도하기 위한 효소 또는 시스템을 코딩하는 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 천연 발생 박테리아 원위치에서 마이크로바이옴의 박테리아 개체군에 의해 발현 및/또는 분비되는 분자 또는 그들 발현/분비 수준을, 특히 숙주 건강에 대한 그들 유해한 잠재성을 감소시키는 방식으로 이들 개체군의 일부분 또는 전부 및 숙주 간 상호작용의 변형을 일으키고, 이들 개체군의 직접 사멸, 그들 성장의 직접 유의한 억제 또는 주요한 박테리아 기능의 손상을 일으키지 않는 특별한 방식으로, 조절하여 마이크로바이옴-연관 질환 또는 장애를 치료하거나, 예방하거나 또는 치유하기 위해 의도된 약물의 제조에서, 원위치에서 천연 발생 박테리아에 유전자 변형을 유도시키기 위한 효소 또는 시스템을 코딩하는 벡터의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 DNA 또는 유전자 서열을 변형시키는 외생성 효소의 발현을 허용하는 마이크로바이옴 내 박테리아 개체군으로, 핵산, 바람직하게 플라스미드 또는 파지미드를 높은 효율로 형질도입시키는 벡터의 용도를 포괄한다. 박테리아 개체군은 동일한 종의 상이한 균주를 포함하는, 혼합된 박테리아 개체군일 수 있고; 대안적으로, 박테리아 개체군은 상이한 종의 상이한 균주를 포함하는, 혼합된 박테리아 개체군일 수 있다. 일부 구현예에서, DNA 서열 또는 유전자는 숙주와 박테리아의 상호작용에 대해 직접 또는 간접 효과를 갖는다. 따라서, 본 발명은 박테리아 개체군에게 핵산, 바람직하게 플라스미드 또는 파지미드를 높은 효율로 형질도입시키는데 사용을 위한 벡터를 포괄한다.
일부 구현예에서, 직접 효과를 갖는 DNA 서열 또는 유전자는 숙주 세포와 상호작용하는 독소, 또는 숙주 단백질 또는 펩티드에 존재하는 아미노산의 서열을 모방하는 아미노산의 서열을 포함하는 박테리아 단백질 또는 펩티드를 발현하는 DNA 서열 또는 유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 간접 효과를 갖는 DNA 서열 또는 유전자는 박테리아의 내부에 존재하거나, 박테리아의 막 상에서 발현 또는 디스플레이되거나, 박테리아에 의해 분비되거나, 또는 박테리아에 의해 이입되는 당, 지질, 대사산물 또는 단백질의 내부 생산 또는 변형에 관여되는, 박테리아에 의해 발현되거나, 막 상에 디스플레이되거나 또는 분비되는 효소를 코딩하는 DNA 서열 또는 유전자를 포함한다.
바람직하게, DNA 서열 또는 유전자 서열의 정확한 변형은 이의 생물학적 환경에서 성장하고 다른 미생물과 상호작용하는 능력에 대한 임의 효과를 최소화하지만, 치료 동안 숙주와 이의 상호작용 또는 이의 성장 또는 내성 잠재성을 변형시키도록 수행된다.
유전자 변형 방법
본 발명은 원위치에서 천연 발생 박테리아를 변형시키는 방법을 포괄한다. 바람직하게, 유전자 변형은 박테리아의 사멸을 초래하지 않는다. 보다 바람직하게, 유전자 변형은 유전자 변형으로 인해서 생체내에서 변형된 박테리아의 5%, 10%, 20%, 또는 50% 미만의 성장 단점을 일으킨다. 보다 더 바람직하게, 유전자 변형은 변형으로 인해서 생체내에서 변형된 박테리아의 임의의 성장 단점을 일으키지 않는다. 바람직하게, 유전자 변형은 DNA 서열에 이중 가닥 파괴의 도입없이 원위치에서 천연 발생 박테리아 중 DNA 서열의 변형이다.
바람직한 구현예에서, 박테리아는 원위치에서 박테리아에 핵산을 높은 효율로 전달할 수 있는 벡터와 접촉하여 박테리아에서 외생성 효소를 발현하고 그 결과로 유전자 변형이 일어난다. 바람직한 구현예에서, 외생성 효소는 dCas9 (dead-Cas9) 또는 nCas9 (닉카제 Cas9)를 시토신 또는 아데노신 디아미나제 도메인에 융합시키고 표적 서열로 유도하여 바람직한 변형을 만드는 염기 편집 전략을 통해서 이러한 유전자 변형을 일으킬 수 있다.
바람직한 구현예에서, 외생성 효소는 dCas9 (dead-Cas9) 또는 nCas9 (닉카제 Cas9)를 역전사효소 도메인에 융합시키고 표적 서열로 유도하여 pegRNA (프라임 편집 가이드 RNA)의 도움으로 바람직한 변형을 만드는 프라임 편집 전략을 통해서 이러한 유전자 변형을 일으킬 수 있다.
유전자 변형은 점 돌연변이(들), 결실(들), 삽입(들) 또는 이의 임의 조합일 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 변형은 DNA 서열 또는 유전자의 발현을 불활성화시킬 수 있거나, 감소시킬 수 있거나, 증가시킬 수 있거나, 또는 유도시킬 수 있다. 유전자 변형은 유전자의 번역 또는 비번역 영역에 존재할 수 있다. 유전자 변형은 유전자의 프로모터 영역에 또는 유전자 조절에 관여하는 임의의 다른 영역 내에 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, DNA 서열 또는 유전자 불활성화는 코딩 서열 (출발 코돈에서 출발하고, 중지 코돈에서 중지됨) 내부 점 돌연변이(들)일 수 있다. 보다 정확하게, DNA 서열 또는 유전자 불활성화는 하나 또는 몇개의 코돈을 중지 코돈 (TAA, TAG, TGA)으로 전환시키는 점 돌연변이(들)에 의해 수행될 수 있다. 대안적으로, DNA 서열 또는 유전자 불활성화는 출발 코돈 (ATG, GTG, TTG) 또는 5 bp, 10 bp, 20 bp, 50 bp, 100 bp의 예상 출발 코돈 중 임의의 인-프레임 출발 코돈을 비-출발 코돈 또는 중지 코돈으로 전환시키는 점 돌연변이(들)에 의해 수행될 수 있다. 대안적으로, DNA 서열 또는 유전자 불활성화는 코돈 서열 내부에 희귀 코돈을 도입시키는 점 돌연변이(들)에 의해 수행될 수 있다. 대안적으로, DNA 서열 또는 유전자 불활성화는 촉매 부위에 비-동의 아미노산 변화(들)를 도입시켜서 이러한 촉매 부위와 연관된 기능에 대해 단백질을 불활성이게 만드는 점 돌연변이(들)에 의해 수행될 수 있다. 대안적으로, DNA 서열 또는 유전자 불활성화는 단백질 활성에 상호작용이 필수적인 다른 분자와의 결합에 관여되는 부위에 비-동의 아미노산 변화(들)를 도입하는 점 돌연변이(들)에 의해 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, DNA 서열 또는 유전자 불활성화는 코딩 서열 외부의 점 돌연변이(들)일 수 있다. 점 돌연변이(들)는 유전자의 프로모터 영역 (예를 들어, -35 bp 영역, -10 bp 영역, 전사 출발 부위 (TSS))에, 유전자의 리보솜 결합 부위 (RBS)에, 또는 조절에 관여되는 임의의 다른 영역 (예를 들어, 전사 인자 결합 부위, 오퍼레이터 결합 부위, 리보스위치...) 내에 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 변형은 DNA 서열 또는 유전자 활성화를 초래할 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 변형은 유전자 또는 경로의 활성을 불활성화, 감소 또는 증가시키는 이전에 특징규명된 돌연변이를 반전시키는 점 돌연변이(들)일 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 변형은 DNA 서열 또는 유전자 발현 및 조절의 조정을 초래하는 점 돌연변이(들)일 수 있다. 점 돌연변이(들)는 유전자의 프로모터 영역 (예를 들어, -35 bp 영역, -10 bp 영역, 전사 출발 부위 (TSS))에, 유전자의 리보솜 결합 부위 (RBS)에, 조절에 관여하는 임의의 다른 영역 (예를 들어, 전사 인자 결합 부위, 오퍼레이터 결합 부위, RNAse 인식 부위, 리보스위치, 메틸화 부위 등) 내에, 또는 관심 DNA 서열 또는 유전자를 조절하는 임의의 다른 DNA 서열 또는 유전자 예컨대 리프레서, 안티센스 RNA, 활성인자일 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 변형은 번역후 변형(들) (예를 들어, 인산화, 글리코실화, 아세틸화, 푸필화 등)의 조절을 초래하는 점 돌연변이(들)일 수 있다. 보다 특히 변형은 번역후 변형 부위에 점 돌연변이일 수 있다. 대안적으로, 유전자 변형은 번역후 변형(들)이 원인이 되는 DNA 서열 또는 유전자를 파괴할 수 있다.
다른 구현예에서, 유전자 변형은 병원성의 증가를 초래하는 돌연변이를 반전시키는 점 돌연변이(들)이다.
특정 구현예에서, 유전자 변형은 파지 게놈 또는 외생성 DNA를 숙주 박테리아 염색체 또는 내생성 플라스미드(들)에 통합시키지 않는다. 특정 구현예에서, 유전자 변형은 숙주 박테리아 염색체 또는 내생성 플라스미드(들)에서 통합된 외생성 DNA로부터 외생성 단백질의 발현을 일으키지 않는다. 보다 특정한 구현예에서, 유전자 변형은 숙주 박테리아의 NHEJ 또는 HR 내생성 복구 기전을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 유전자 변형은 상이한 아미노산에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200, 500개 등의 아미노산에서 변화를 일으킨다.
본 발명은 원위치에서 천연 발생 박테리아를 유전자 변형시켜서 숙주 - 마이크로바이옴 상호작용을 조절하는 방법, 특히 비-치료적 방법을 포괄한다. 바람직하게, 천연 발생 박테리아는 마이크로바이옴 연관된 장애 또는 질환에 관여된다. 바람직한 구현예에서, 방법은 원위치에서 천연 발생 박테리아에서 마이크로바이옴 연관된 장애 또는 질환의 원인이 되는 DNA 서열을 유전자 변형시키는 단계를 포함하고, 유전자 변형은 마이크로바이옴 연관된 장애 또는 질환의 효과를 감소시키고, 유전자 변형은 박테리아의 사멸을 초래하지 않는다. 본 발명은 마이크로바이옴 연관된 장애 또는 질환의 효과를 감소시키기 위한 방법에서 사용을 위한, 원위치에서 천연 발생 박테리아에서 유전자 변형을 유도시키기 위한 효소 또는 시스템을 코딩하는 벡터를 더 포괄하고, 상기 벡터는 상기 마이크로바이옴 연관된 장애 또는 질환의 원인이 되는, 천연 발생 박테리아의 DNA 서열을, 원위치에서 유전자 변형시키고, 유전자 변형은 박테리아의 사멸을 초래하지 않는다. 바람직하게, 유전자 변형을 갖는 박테리아는 유전자 변형이 없는 동일 박테리아와 비교하여 감소된 생체내 성장률을 갖지 않는다.
일부 구현예에서, 유전자 변형은 병독성 인자를 코딩하는 병원성 박테리아 DNA 서열 또는 유전자 내에서 발생되어서, 사실상 박테리아의 적합도를 감소시킬 수 있는데, 병독성 인자가 종종 이의 박테리아 경쟁인자에 비해서 병원성 박테리아의 적합도 장점을 부여하기 때문이다. 예를 들어, 이것은 더 낮은 성장률을 초래할 수도 있다.
다른 구현예에서, 유전자 변형은 편리공생 박테리아 또는 기회 병원체 내에서 발생되고, 변형은 편리공생 박테리아로서 이러한 박테리아의 성장률에 대한 영향이 미미하거나 또는 전혀 없다.
본 발명은 인간 또는 동물 마이크로바이옴의 박테리아 개체군의 면역원성 프로파일을 변형시켜서 취약 숙주에서 자가-면역 질환 또는 반응의 과정 중에 예방하거나 또는 중재하기 위한 방법을 포괄한다. 바람직한 구현예에서, 방법은 박테리아 개체군을 상기 개체군의 박테리아의 적어도 일부에서 박테리아에 의해 발현되거나 또는 분비되는 면역원성 성분을 코딩하는 DNA 서열에 유전자 변형을 생성시키는 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하고, 면역원성 성분을 코딩하는 DNA 서열의 유전자 변형은 상기 면역원성 성분의 면역원성 효과의 상실을 일으키고, 유전자 변형은 박테리아의 직접 사멸을 초래하지 않는다. 본 발명은 인간 또는 동물 마이크로바이옴의 박테리아 개체군의 면역원성 프로파일을 변형시켜서 취약 숙주에서 자가-면역 질환 또는 반응의 과정에서 예방하거나 또는 중재하기 위한 방법에서 사용을 위한, 유전자 변형을 유도하기 위한 효소 또는 시스템을 코딩하는 벡터를 더 포괄한다. 바람직한 구현예에서, 상기 벡터는 상기 개체군의 박테리아의 적어도 일부에서 박테리아에 의해 발현되거나 또는 분비되는 면역원성 성분을 코딩하는 DNA 서열에 유전자 변형을 생성시키고, 면역원성 성분을 코딩하는 DNA 서열의 유전자 변형은 면역원성 성분의 면역원성 효과의 상실을 일으키고, 유전자 변형은 박테리아의 직접 사멸을 초래하지 않는다.
바람직하게, 유전자 변형을 갖는 박테리아는 유전자 변형이 없는 동일 박테리아와 비교하여 감소된 생체내 성장률을 갖지 않는다.
일부 구현예에서, 유전자 변형은 모방 펩티드 중 아미노산의 변화를 일으키고 모방 펩티드가 면역원성이 아니게 만들거나 또는 면역계에 의해 인식되지 않게 만든다. 일부 구현예에서, 유전자 변형은 박테리아 막 상에서 당 프로파일의 변화를 일으키지 않는다. 일부 구현예에서, 유전자 변형은 박테리아 막에서 당 프로파일의 변화를 일으키는 단백질 서열 중 아미노산의 변화를 일으킨다. 일부 구현예에서, 유전자 변형은 박테리아 막 상에서 지질 프로파일의 변화를 일으킨다. 일부 구현예에서, 유전자 변형은 박테리아 막 상에서 지질 프로파일의 변화를 일으키는 단백질 서열 중 아미노산의 변화를 일으킨다. 일부 구현예에서, 유전자 변형은 불활성 촉매 부위를 초래하는 단백질 서열 수준에서의 변화를 일으킨다. 일부 구현예에서, 유전자 변형은 인간 세포 수용체와의 결합 부위를 비기능성이게 만든다. 일부 구현예에서, 유전자 변형은 인간 면역 세포에 의한 검출에 대해서 박테리아를 더 민감하게 만든다.
박테리아 독소 유전자 서열의 변형
일부 구현예에서, 유전자 변형은 독소가 여전히 생산, 발현 및/또는 분비되지만 이의 독성발생성 효과를 무효로 만들도록 독소 유전자 서열에 만들어지고, 그 결과로 효소의 촉매 부위의 하나 또는 다수 아미노산의 변형을 일으켜서 숙주 세포에 대해 이의 독성발생성 효과를 발휘할 수 없게 된다.
대안적으로, 유전자 변형은 독소 유전자 서열이 발현되지 않거나 또는 파괴되도록 독소 유전자 서열에 만들어져서, 그 결과로 독소의 불활성화를 일으킨다.
표적화된 박테리아 독소는 외독소 또는 내독소일 수 있다. 외독소는 생성되어 활성적으로 분비되고; 내독소는 박테리아의 일부로 남아있는다. 박테리아 독소에 대한 반응은 중증 염증을 포함할 수 있고 패혈증을 초래할 수 있다.
바람직한 독소는 이. 콜라이의 콜리박틴, 독소 A 및 참조로 본 명세서에 편입되는 [Tam and Torres, Microbiol Spectr. 2019 Mar; 7(2)]에 기술된 바와 같은 스타필로코쿠스 아우레우스 유래의 다른 효소 (예를 들어, 헤모리신, 류코톡신, 박탈성 독소, 장독소, 및 독성-쇼크 증후군 독소-1 (TSST-1)), 및 박테로이데스 프라질리스 (Bacteroides fragilis)의 장독성발생성 (ETBF) 균주 유래의 프라질리신 (Bft), 보툴리눔 신경독소, 파상풍 독소, 디프테리아 독소, 탄저균 독소, 알파 독소, 백일해 독소, 시가 독소, 열-안정성 장독소 (이. 콜라이 ST), 또는 Henkel 등 (독소 from Bacteria in EXS. 2010; 100: 1-29, 참조로 본 명세서에 편입됨)에 기술된 임의 독소를 포함한다.
"콜리박틴"이란 본 명세서에서 엔테로박테리아세아에 (Enterobacteriaceae)에서 비-리보솜 펩티드 신써타제-폴리케티드 신타제 (NRPS-PKS) 조립 라인을 코딩하는 유전자 섬인, 54-kb 병원성 pks 섬에 존재하는 clbA-S 유전자에 의해 합성되는 2차 대사산물을 의미한다. 콜리박틴은 전형적으로 유출 펌프 ClbM에 의해 주변세포질로 이출된 다음에 펩티다제 활성을 갖는 주변세포질 막-결합된 ClbP 단백질에 의해 가수분해되는 프로드러그 모이어티로서 생산되어, 활성 콜리박틴을 방출한다.
바람직한 구현예에서, 유전자 변형은 이전에 기술된 바와 같이 독소 유전자 파괴를 초래하는 점 돌연변이(들)이다.
바람직하게, 유전자 변형을 갖는 박테리아는 유전자 변형이 없는 동일 박테리아와 비교하여 감소된 생체내 성장률을 갖지 않는다.
바람직하게, 유전자 변형(들)은 단일 유전자 돌연변이가 독소의 활성을 반전시킬 수 없도록 수행된다. 이것은 단일 치환에 의해 본래로 반전될 수 없는 다른 아미노산으로 본래 아미노산을 변화시켜서 획득될 수 있다.
일 구현예에서, 방법은 pks+ 이. 콜라이의 ClbP 유전자에 유전자 변형을 만들어서 단일-아미노산 돌연변이 및 콜리박틴 독소의 유전독성 활성의 불활성화를 일으키지만, 길항적 활성은 유지하는 것인 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 유전자 변형은 pks+ 이. 콜라이의 ClbP 유전자에 존재하고, 단일-아미노산 돌연변이 및 콜리박틴 독소의 유전독성 활성의 불활성화를 일으키지만, 이의 길항적 활성은 유지한다.
본 명세서에서 사용되는, ClbP 유전자는 전형적으로 SEQ ID NO: 2316 서열이고, 전형적으로 SEQ ID NO: 2317 서열의 단백질을 코딩한다.
바람직하게, 유전자 변형은 ClbP 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 아미노산 S95 또는 K98을 코딩하는 ClbP 유전자의 코돈에, 특히 SEQ ID NO: 2317의 아미노산 S95 또는 K98을 코딩하는 ClbP 유전자의 코돈에 존재한다. 가장 바람직하게, 유전자 변형은 ClbP 유전자의 돌연변이 S95A, S95R 또는 K98T이다.
일부 구현예에서, 유전자 변형은 시겔라 (Shigella) 독소 유전자 예컨대, 제한없이, stx1 및 stx2에 만들어진다. 일부 구현예에서, 유전자 변형은 이. 콜라이 독소 유전자 예컨대, 제한없이, Stx1 (VT1), Stx2 (VT2), Stx2a (VT2a), Stx2b (VT2b), Stx2c (VT2c), Stx2d (VT2d), Stx2e (VT2e) 및 Stx2f (VT2f), Stx2h (VT2h), stx2k에 만들어진다.
다른 박테리아 병독성 유전자 서열의 변형
일 구현예에서, 변형은 병독성 인자에 만들어질 수 있고 병독성 인자를 불활성화시킬 수 있다. 병독성 인자는 숙주에 대해 일어나는 손상 정도를 증가시켜서 숙주-병원체 상호작용을 변경시키는 병원체에 의해 생산되는 임의 물질일 수 있다. 병독성 인자는 숙주의 면역 반응을 회피하거나, 숙주 세포로 진입 및 그로부터 배출을 촉진하거나, 숙주로부터 영양분을 수득하거나, 또는 숙주에서 다른 생리적 과정을 억제하기 위해서, 예를 들어, 세포 부착 또는 숙주 내 니쉐의 군집화를 포함한, 많은 방식으로 병원체에 의해 사용된다. 병독성 인자는 효소, 내독소, 부착 인자, 운동 인자, 보체 회피 관여 인자, 소거 인자 및 생물막 형성 촉진 인자를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 변형은 이. 콜라이 병독성 인자 유전자 예컨대, 제한없이, EHEC-HlyA, fimA, fimF, fimH, neuC, kpsE, sfa, foc, iroN, aer, iha, papC, papGI, papGII, papGIII, hlyC, cnf1, hra, sat, ireA, usp ompT, ibeA, malX, fyuA, irp2, traT, afaD, ipaH, eltB, estA, bfpA, eaeA, espA, aaiC, aatA, TEM, CTX, SHV, csgA, csgB, csgC, csgD, csgE, csgF, csgG, csgH, 또는 T1SS, T2SS, T3SS, T4SS, T5SS, T6SS (분비 시스템) 내 유전자에 만들어진다.
일 구현예에서, 방법은 이. 콜라이의 FimH 유전자에 유전자 변형을 만들어서 하기 돌연변이의 반전을 일으키는 단계를 포함한다: AEIC 균주와 연관된 N70S 및 S78N3. 특정 구현예에서, 유전자 변형은 이. 콜라이의 FimH 유전자에 만들어진다.
본 발명의 상황에서, FimH 유전자는 전형적으로 1형 핌브린 D-만노스 특이적 어드헤신을 코딩한다. FimH는 전형적으로 SEQ ID NO: 2319 서열이고, 전형적으로 SEQ ID NO: 2318 서열의 단백질을 코딩한다.
일 구현예에서, 유전자 변형은 이. 콜라이의 FimH 유전자에 만들어지고, 바람직하게 AEIC 균주와 연관된 돌연변이 N70S 및 S78N의 반전을 일으킨다.
일 구현예에서, 방법은 유전자의 blc 유전자에 유전자 변형을 만들어서 장 염증과 잠재적으로 연관된 돌연변이 G84E (뉴클레오티드 수준에서 G251A)의 반전을 일으킨다4.
본 발명의 상황에서, blc 유전자는 전형적으로 외막 리포단백질 Blc를 코딩한다. bcl 유전자는 전형적으로 SEQ ID NO: 2321 서열이고, 전형적으로 SEQ ID NO: 2320 서열의 단백질을 코딩한다.
일 구현예에서, 유전자 변형은 이. 콜라이의 blc 유전자에 만들어지고, 바람직하게 장 염증과 잠재적으로 연관된 돌연변이 G84E (뉴클레오티드 수준에서 G251A)의 반전을 일으킨다.
일부 구현예에서, 유전자 변형은 여시니아 페스티스 (Yersinia pestis) 병독성 인자 유전자 예컨대, 제한없이, yscF (플라스미드-유래 (pCDl) T3SS 외부 바늘 서브유닛)에 만들어진다.
일부 구현예에서, 유전자 변형은 여시니아 페스티스 병독성 인자 유전자 예컨대, 제한없이, yscF (플라스미드-유래 (pCDl) T3SS 외부 바늘 서브유닛)에 만들어진다.
일부 구현예에서, 유전자 변형은 프란시셀라 툴라렌시스 (Francisella tularensis) 병독성 인자 유전자 예컨대, 제한없이, fslA에 만들어진다.
일부 구현예에서, 유전자 변형은 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis) 병독성 인자 유전자 예컨대, 제한없이, pag (탄저균 독소, 세포-결합 보호성 항원)에 만들어진다.
일부 구현예에서, 유전자 변형은 비브리오 콜레라 (Vibrio cholera) 병독성 인자 유전자 예컨대, 제한없이, ctxA 및 ctxB (콜레라 독소), tcpA (독소 공조절 선모), 및 toxT (마스터 병독성 조절인자)에 만들어진다.
일부 구현예에서, 유전자 변형은 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) 병독성 인자 유전자 예컨대, 제한없이, 피오베르딘 (예를 들어, 시그마 인자 pvdS, 생합성 유전자 pvdL, pvdl, pvdJ, pvdH, pvdA, pvdF, pvdQ, pvdN, pvdM, pvdO, pvdP, 수송체 유전자 pvdE, pvdR, pvdT, opmQ), 시데로포어 피오켈린 (예를 들어, pchD, pchC, pchB, pchA, pchE, pchF 및 pchG, 및 독소 (예를 들어, exoU, exoS 및 exoT)에 만들어진다.
일부 구현예에서, 유전자 변형은 클렙시엘라 뉴모니아에 (Klebsiella pneumoniae) 병독성 인자 유전자 예컨대, 제한없이, fimA (부착, I형 섬모 주요 서브유닛), 및 cps (캡슐 다당류)에 만들어진다.
일부 구현예에서, 유전자 변형은 아시네토박터 바우만니이 (Acinetobacter baumannii) 병독성 인자 유전자 예컨대, 제한없이, ptk (캡슐 중합) 및 epsA (조립)에 만들어진다.
일부 구현예에서, 유전자 변형은 살모넬라 엔테리카 티피 (Salmonella enterica Typhi) 병독성 인자 유전자 예컨대, 제한없이, MIA (침윤, SPI-1 조절인자), ssrB (SPI-2 조절인자), 및 유출 펌프 유전자 acrA, acrB 및 tolC를 포함한, 담즙 내성과 연관된 것들에 만들어진다.
일부 구현예에서, 유전자 변형은 푸소박테리움 뉴클레아툼 (Fusobacterium nucleatum) 병독성 인자 유전자 예컨대, 제한없이, FadA 및 TIGIT에 만들어진다.
일부 구현예에서, 유전자 변형은 박테로이데스 프라질리스 병독성 인자 유전자 예컨대, 제한없이, bft에 만들어진다.
일부 구현예에서, 유전자 변형은 쿠티박테리움 아크네스 (Cutibacterium acnes) 포르피린 유전자, CAMP-인자 (CAMP1, CAMP2, CAMP3, CAMP4), 히알루로네이트 리아제 (HYL-IB/II, HYL-IA), 리파제 (GehA, GehB), 헤모리신, 시알리다제, 엔도글리코세라미다제, 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제, 더마탄 술페이트 어드헤신 (DsA1, DsA2), 프롤린-트레오닌 반복 (PTR) 또는 여드름 연관 게놈 유전자좌 1, 2, 3 (플라스미드), 4에 포함된 임의의 병독성 인자 예컨대 조밀 부착 유전자좌 (tad), 스트렙토리신 S-연관 유전자 (sag), 참조로 본 명세서에 기술된 바와 같은 Tomida 등5 에 기술된 바와 같은 비리보솜 펩티드 신써타제 (NRPS)에 만들어진다.
모방 펩티드 유전자 서열의 변형
일부 구현예에서, 유전자 변형은 모방 펩티드 유전자 서열에 만들어져서 인간 펩티드 서열과의 상동성이 감소되고, 그러므로 숙주 면역계에 의해 더 이상 인식되지 않는 모방 펩티드를 생성시킨다. 특정 관심의 모방 펩티드는자가-면역 질환, 예를 들어, 참조로 본 명세서에 편입되는 Negi 등6에 언급된 것들과 연관된 박테리아 모방 펩티드이다. 특히 관심있는 것은 Negi 등의 S1 표의 임의의 모방 펩티드를 코딩하는 유전자 서열이다.
특정 구현예에서, 모방 펩티드는 하기 표 1에 개시된 후보 모방 펩티드 중 하나이다. 특정 구현예에서, 상기 모방 펩티드는 SEQ ID NO: 19 내지 2313 서열의 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 구현예에서, 모방 펩티드는 프로테오박테리아 (Proteobacteria) 또는 퍼미큐테스 (Firmicutes) 유래이다. 특히 관심있는 것은 저분자량 포스포티로신 단백질 포스파타제, 알데히드 데히드로게나제 패밀리 3 구성원 B1, 말레일아세토아세테이트 이소머라제 및 우라실-DNA 글리코실라제로부터의 4개 인간 펩티드와 상동성을 갖는 Negi 등이 확인한 24개 장 박테리아 펩티드를 코딩하는 유전자 서열이다. 이들 유전자 서열은 인간 서열과 상동성을 감소시키고 인간 대응물과 숙주 면역계에 의해 인식되는 것들의 교차-반응성을 방지하기 위해 변형될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 유전자 변형은 박테로이데스 파에시스 또는 박테로이데스 세타이오타오미크론 베타-갈락토시다제 유전자에 존재한다. 바람직하게, 유전자 변형을 갖는 박테로이데스 파에시스 또는 박테로이데스 세타이오타오미크론 베타-갈락토시다제 단백질은 유전자 변형 없는 박테로이데스 파에시스 또는 박테로이데스 세타이오타오미크론 베타-갈락토시다제 단백질과 비교하여 인간 MYH6 심장 펩티드와 더 낮은 상동성을 보인다2. 바람직하게 유전자 변형은 인간 면역계에 의해 에피토프로서 인식되는 펩티드 단편에서 수행되어서 인간 면역계에 의한 에피토프 인식의 부재 또는 더 약화를 초래한다2.
바람직한 구현예에서, 유전자 변형은 Ro60 오솔로그 유전자를 코딩하는 인간 편리공생 박테리아에 존재한다. 바람직하게, 유전자 변형에 의한 Ro60 단백질은 본래 단백질과 비교하여 인간 Ro60 펩티드와 더 낮은 상동성을 보인다. 바람직하게 유전자 변형은 인간 면역계에 의해 에피토프로서 인식되는 펩티드 단편에 상응하는 DNA 서열에서 수행되어서 인간 면역계에 의한 에피토프 인식의 부재 또는 더 약화를 초래한다. 바람직하게 인간 유전자 변형에 대해 표적화되는 편리공생하는 인간 박테리아는 프로피오니박테리움 프로피오니쿰 (Propionibacterium propionicum), 코리네박테리움 아미콜라툼 (Corynebacterium amycolatum), 악티노마이세스 마실리엔시스 (Actinomyces massiliensis), 박테로이데스 세타이오타오미크론 (Bacteroides thetaiotaomicron)이다. 보다 더 바람직하게 유전자 변형에 대해 표적화되는 편리공생하는 인간 박테리아는 프로피오니박테리움 프로피오니쿰 (Propionibacterium propionicum)이다7.
바람직한 구현예에서, 유전자 변형은 인슐린 B 9-25, 1형 당뇨병에 관여되는 자가-에피토프를 모방하는 펩티드를 코딩하는 인간 편리공생 박테리아 DNA 서열에 존재한다8. 유전자 돌연변이는 인슐린 B9-25 에피토프 SHLVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 9)에 대한 상동성을 감소시킨다. 바람직한 구현예에서, 표적 박테리아는 퍼미큐테스 문에 속한다. 바람직한 구현예에서, 표적 박테리아의 표적 유전자는 트랜스케톨라제 N 수퍼패밀리의 일부이다8.
바람직한 구현예에서, 유전자 변형은 자가항원 β2-당단백질 I의 에피토프 (β2GPI)로서, 항인지질 증후군 (APS)에 관여하는 자가-에피토프를 모방하는 펩티드를 코딩하는 로세부리아 인테스티날리스 (Roseburia intestinalis)에 존재한다. 유전자 돌연변이는 T 세포 (β2GPI) 에피토프 KVSFFCKNKEKKCSY (SEQ ID NO: 10) 및/또는 B 세포 에피토프 VSRGGMRKFIC (SEQ ID NO: 11)에 대한 상동성을 감소시킨다28.
항생제-내성 유전자 서열의 변형
일부 구현예에서, 변형은 관련 항생제의 부재 하에서 박테리아에 대한 직접 선택압을 발휘하지 않고 박테리아를 항생제에 민감하게 만들기 위해, 염색체 또는 플라스미드 상에 보유되는, 항생제-내성 유전자 서열에 만들어진다.
일부 구현예에서, 유전자 변형은 예컨대 RpoB 리팜피신 내성 돌연변이체, 23S rRNA 에리쓰로마이신 내성 돌연변이체, GyrA (플루오로) 퀴놀론 내성 돌연변이체, GyrB (플루오로) 퀴놀론 내성 돌연변이체, RpsL 스트렙토마이신 내성 돌연변이체, DHFR 트리메토프림 내성 돌연변이체, fusA 후시드산 내성 돌연변이체, fmt 악티노닌 내성 돌연변이체, gidB 스트렙토마이신 내성 돌연변이체, ompR 다제 내성 돌연변이체, marR 다제 내성 돌연변이체, lon 다제 내성 돌연변이체, mgrB 콜리스틴 내성 돌연변이체, pmrA 콜리스틴 내성 돌연변이체, acrR 다제 내성 돌연변이체, cysB 암디노실린 내성 돌연변이체, 16S rRNA 메틸트랜스퍼라제 같은, 항생제에 대한 내성을 부여하는, 그들 중 일부는 박테리아에 필수적인, 내생성 유전자 중 돌연변이를 반전시키기 위해 만들어진다.
일부 구현예에서, 항생제 내성 유전자는 제한없이, GyrB, ParE, ParY, AAC(1), AAC(2'), AAC(3), AAC(6'), ANT(2"), ANT(3"), ANT(4'), ANT(6), ANT(9), APH(2"), APH(3"), APH(3'), APH(4), APH(6), APH(7"), APH(9), ArmA, RmtA, RmtB, RmtC, Sgm, AER, BLA1, CTX-M, KPC, SHV, TEM, BlaB, CcrA, IMP, NDM, VIM, ACT, AmpC, CMY, LAT, PDC, OXA β-락타마제, mecA, Omp36, OmpF, PIB, bla (blaI, blaR1) 및 mec (mecI, mecR1) 오페론, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT), 클로람페니콜 포스포트랜스퍼라제, 에탐부톨-내성 아라비노실트랜스퍼라제 (EmbB), MupA, MupB, 막 내재 단백질 MprF, Cfr 23S rRNA 메틸트랜스퍼라제, 리팜핀 ADP-리보실트랜스퍼라제 (Arr), 리팜핀 글리코실트랜스퍼라제, 리팜핀 모노옥시게나제, 리팜핀 포스포트랜스퍼라제, DnaA, RbpA, RNA 중합효소의 리팜핀-내성 베타-서브유닛 (RpoB), Erm 23S rRNA 메틸트랜스퍼라제, Lsa, MsrA, Vga, VgaB, 스트렙토그라민 Vgb 리아제, Vat 아세틸트랜스퍼라제, 플루오로퀴놀론 아세틸트랜스퍼라제, 플루오로퀴놀론-내성 DNA 토포이소머라제, 플루오로퀴놀론-내성 GyrA, GyrB, ParC, 퀴놀론 내성 단백질 (Qnr), FomA, FomB, FosC, FosA, FosB, FosX, VanA, VanB, VanD, VanR, VanS, 린코사미드 뉴클레오티딜트랜스퍼라제 (Lin), EreA, EreB, GimA, Mgt, Ole, 마크롤리드 포스포트랜스퍼라제 (MPH), MefA, MefE, Mel, 스트렙토트리신 아세틸트랜스퍼라제 (sat), Sul1, Sul2, Sul3, 술폰아미드-내성 FolP, 테트라사이클린 불활성화 효소 TetX, TetA, TetB, TetC, Tet30, Tet31, TetM, TetO, TetQ, Tet32, Tet36, MacAB-TolC, MsbA, MsrA,VgaB, EmrD, EmrAB-TolC, NorB, GepA, MepA, AdeABC, AcrD, MexAB-OprM, mtrCDE, EmrE, adeR, acrR, baeSR, mexR, phoPQ, mtrR, 또는 card. mcmaster.ca/의 종합 항생제 내성 데이터베이스 (Comprehensive Antibiotic Resistance Database)에 기술된 임의의 항생제 내성 유전자일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 항생제는 페니실린 예컨대 페니실린 G, 페니실린 K, 페니실린 N, 페니실린 O, 페니실린 V, 메티실린, 벤질페니실린, 나프실린, 옥사실린, 클록사실린, 디클록사실린, 암피실린, 아목시실린, 피밤피실린, 헤타실린, 바캄피실린, 메탐피실린, 탈람피실린, 에피실린, 카르베니실린, 티카르실린, 테모실린, 메즐로실린, 및 피페라실린; 세팔로스포린 예컨대 세파세트릴, 세파드록실, 세팔렉신, 세팔로글리신, 세팔로늄, 세팔로리딘, 세팔로틴, 세파피린, 세파트리진, 세파자플루르, 세파제돈, 세파졸린, 세프라딘, 세프록사딘, 세프테졸, 세파클로르, 세포니시드, 세프프로질, 세푸록심, 세푸조남, 세프메타졸, 세포테탄, 세폭시틴, 로라카르베프, 세프부페라존, 세프미녹스, 세포테탄, 세폭시틴, 세포티암, 세프카펜, 세프달록심, 세프디니르, 세프디토렌, 세페타메트, 세픽심, 세프메톡심, 세포디짐, 세포탁심, 세포베신, 세프피미졸, 세프포독심, 세프테람, 세프타메르, 세프티부텐, 세프티오푸르, 세프티올렌, 세프티족심, 세프트리악손, 세포페라존, 세프타지딤, 라타목세프, 세프클리딘, 세페핌, 세플루프레남, 세포셀리스, 세포조프란, 세프피롬, 세프퀴놈, 플로목세프, 세프토비프롤, 세프타롤린, 세프톨로잔, 세팔로람, 세파파롤, 세프카넬, 세페드롤로르, 세펨피돈, 세페트리졸, 세피비트릴, 세프마틸렌, 세프메피디움, 세폭사졸, 세프로틸, 세프수미드, 세프티옥시드, 세푸라세팀, 및 니트로세핀; 폴리믹신 예컨대 폴리스포린, 네오스포린, 폴리믹신 B, 및 폴리믹신 E, 리팜피신 예컨대 리팜피신, 리파펜틴, 및 리팍시민; 피닥소미신; 퀴놀론 예컨대 시녹사신, 날리딕산, 옥솔린산, 피로미드산, 피페미드산, 로속사신, 시프로플록사신, 에녹사신, 플레록사신, 로메플록사신, 나디플록사신, 노르플록사신, 오플록사신, 퍼플록사신, 루플록사신, 발로플록사신, 그레파플록사신, 레보플록사신, 파주플록사신, 테마플록사신, 토수플록사신, 클리나플록사신, 가티플록사신, 제미플록사신, 목시플록사신, 시타플록사신, 트로바플록사신, 프룰리플록사신, 델라플록사신, 네모녹사신, 및 자보플록사신; 술폰아미드 예컨대 술파푸라졸, 술파세타미드, 술파디아진, 술파디미딘, 술파푸라졸, 술피소미딘, 술파독신, 술파메톡사졸, 술파목솔, 술파니트란, 술파디메톡신, 술파메톡시피리다진, 술파메톡시디아진, 술파독신, 술파메토피라진, 및 테레프틸; 마크롤리드 예컨대 아지트로마이신, 클라리트로마이신, 에리쓰로마이신, 피닥소미신, 텔리트로마이신, 카르보마이신 A, 조사마이신, 키타사마이신, 미데카마이신, 올레안도마이신, 솔리트로마이신, 스피라마이신, 트롤레안도마이신, 틸로신, 및 록시트로마이신; 케톨리드 예컨대 텔리트로마이신, 및 세트로마이신; 플루오로케톨리드 예컨대 솔리트로마이신; 린코사미드 예컨대 린코마이신, 클린다마이신, 및 필리마이신; 테트라사이클린 예컨대 데메클로사이클린, 독시사이클린, 미노사이클린, 옥시테트라사이클린, 및 테트라사이클린; 아미노글리코시드 예컨대 아미카신, 디베카신, 젠타미신, 카나마이신, 네오마이신, 네틸미신, 시소미신, 토브라마이신, 파로모마이신, 및 스트렙토마이신; 안사마이신 예컨대 젤다나마이신, 허비마이신, 및 리팍시민; 카르바세펨 예컨대 로라카르베프; 카르바페넴 예컨대 에르타페넴, 도리페넴, 이미페넴 (또는 실라스타틴), 및 페로페넴; 글리코펩티드 예컨대 테이코플라닌, 반코마이신, 텔라반신, 달바반신, 및 오리타반신; 린코사미드 예컨대 클린다마이신 및 린코마이신; 리포펩티드 예컨대 답토마이신; 모노박탐 예컨대 아즈트레오남; 니트로퓨란 예컨대 퓨라졸리돈, 및 니트로퓨란토인; 옥사졸리디논 예컨대 리네졸리드, 포시졸리드, 라데졸리드, 및 토레졸리드; 테익소박틴, 클로파지민, 답손, 카프레오마이신, 사이클로세린, 에탐부톨, 에티온아미드, 이소니아지드, 피라진아미드, 리파부틴, 아르스펜아민, 클로람페니콜, 포스포마이신, 후시드산, 메트로니다졸, 무피로신, 플라텐시마이신, 퀴누프리스틴 (또는 달포프리스틴), 티암페니콜, 티게시클린, 티니다졸, 트리메토프림, 알라트로플록사신, 피닥소미신, 날리딕산, 리팜핀, 이의 유도체 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
보존된 서열에 대한 변형
일부 구현예에서, 아미노산 서열의 변형은 편집된 서열이 동일 종, 또는 관련 종, 또는 동일 속, 또는 마이크로바이옴으로부터의 임의의 다른 박테리아로부터의 하나 또는 다수의 상이한 균주로부터 발생되는 동일하거나 또는 관련된 단백질/기능 활성을 코딩하는 아미노산 서열에 상응하도록 만들어진다. 편집된 서열은 본래 서열의 파라로그, 오솔로그 또는 유사체에 상응할 수 있다.
이러한 변형은 동일한 정확한 아미노산 서열을 갖지 않지만 비교적 유사한 기능을 보장하여 편집된 박테리아에 적용되는 잠재적인 선택압을 감소시킬 수 있다.
대상체에게 투여되거나 또는 그에 의해 생산되거나 또는 다른 박테리아에 의해 생산되는 화합물 및 박테리아 간 상호작용에 관여되는 DNA 서열의 변형
본 발명은 또한 대상체의 마이크로바이옴으로부터의 박테리아와 상기 대상체에게 투여되거나 또는 그에 의해 생산되거나 또는 상기 대상체로부터의 다른 박테리아에 의해 생산되는 화합물의 상호작용을, 상기 화합물과 상기 박테리아의 상호작용에 관여하는 적어도 하나의 박테리아 DNA 서열을 변형시켜서, 원위치에서 변형시키기 위한 방법에 관한 것으로서, 상기 박테리아 DNA 서열은 숙주 마이크로바이옴의 박테리아 개체군에 의해 발현되고, 상기 방법은
박테리아 개체군을 DNA 서열에 이중 가닥 파괴의 도입없이 상기 개체군의 박테리아의 적어도 일부에서, 상기 화합물과 상기 박테리아의 상호작용에 관여되는, 박테리아의 상기 적어도 하나의 DNA 서열에서 유전자 변형을 생성시키는 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하고;
상기 적어도 하나의 DNA 서열의 유전자 변형은 상기 화합물과 박테리아의 상호작용의 변형을 일으키고;
유전자 변형은 박테리아의 직접 사멸을 초래하지 않는다.
"대상체에게 투여되거나 또는 그에 의해 생산되거나 또는 상기 대상체로부터의 다른 박테리아에 의해 생산되는 화합물과 박테리아의 상호작용"이란, 상기 화합물의 구조 및/또는 활성에 변형을 유도하거나 또는 유도하지 않고, 상기 박테리아의 임의 위치 (예를 들어, 막, 캡슐, 세포질 등)에서 박테리아의 임의 성분 (효소, 수용체, 채널, 당, 지질 등 포함)을 포함하는, 임의 유형의 상호작용을 의미한다. 대상체에게 투여되거나 또는 그에 의해 생산되거나 또는 다른 박테리아에 의해 생산되는 화합물과 박테리아의 상기 상호작용은 (i) 상기 박테리아에 의한 상기 화합물의 변형 및/또는 (ii) 상기 대상체로부터의 리간드에 대한 상기 박테리아에 의해서 생산 및/또는 분비되는 분자 및 상기 화합물 간 경쟁 및/또는 (iii) 상기 박테리아에 의한 상기 화합물의 결합/흡착을 포괄한다.
"리간드"란 본 명세서에서 관심 화합물에 결합하는, 특히 특이적으로 결합하는 물질을 의미한다. 본 발명의 상황에서, 대상체로부터의 리간드는 상기 관심 화합물에 결합할 수 있는 수용체, 효소, 면역 분자 등을 포괄한다.
상기 대상체에게 투여되는 상기 화합물은 임의 유형의 화합물 예컨대 약물, 프리바이오틱, 화장품, 식품 보조제 등일 수 있다.
대상체에 의해 생산되는 상기 화합물은 제한없이, 담즙산 (예컨대 타우로콜산, 글리코콜산, 타우로케노데옥시콜산, 글리코케노데옥시콜산, 데옥시콜산, 리토콜산, 및 콜산, 케노데옥시콜산 및 데옥시콜산의 유도체), 호르몬 (예컨대 아드레날린 (또는 에피네프린), 멜라토닌, 노르아드레날린 (또는 노르에피네프린), 트리아이오도타이로닌, 타이록신, 도파민, 프로스타글란딘, 류코트리엔, 프로스타사이클린, 트롬복산, 아밀린, 항-뮐러 호르몬 (또는 뮐러-억제 인자/호르몬), 아디포넥틴, 부신피질자극 호르몬 (또는 코르티코트로핀), 안지오텐시노겐, 안지오텐신, 항이뇨 호르몬 (또는 바소프레신, 아르기닌 바소프레신), 심방 나트륨이뇨 펩티드 (또는 아트리오펩틴), 뇌 나트륨이뇨 펩티드, 칼시토닌, 콜레시스토키닌, 코르티코트로핀-방출 호르몬, 코르티스타틴, 엔케팔린, 엔도텔린, 에리쓰로포이어틴, 난포-자극 호르몬, 갈라닌, 위 억제 폴리펩티드, 가스트린, 그렐린, 글루카곤, 글루카곤-유사 펩티드-1, 고나도트로핀-방출 호르몬, 성장 호르몬-방출 호르몬, 헵시딘, 인간 융모막 고나도트로핀, 인간 태반 락토겐, 성장 호르몬, 인히빈 펩티드, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자 (또는 소마토메딘), 렙틴, 리포트로핀, 황체형성 호르몬, 멜라노사이트 자극 호르몬, 모틸린, 오렉신, 오스테오칼신, 옥시토신 (또는 피토신), 췌장 폴리펩티드, 부갑상선 호르몬, 뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제-활성화 펩티드, 프로락틴 (또는 황체자극 호르몬), 프로락틴-방출 호르몬, 렐락신, 레닌, 세크레틴, 소마토스타틴 (또는 성장 호르몬-억제 호르몬 또는 성장 호르몬 바출-억제 호르몬 또는 소마토트로핀 방출-억제 인자 또는 소마토트로핀 바출-억제 호르몬), 트롬보포이어틴, 갑상선-자극 호르몬 (또는 타이로트로핀), 타이로트로핀-방출 호르몬, 혈관활성 장 펩티드, 구아닐린, 우로구아닐린, 테스토스테론, 데히드로에피안드로스테론, 안드로스틴디온, 디히드로테스토스테론, 알도스테론, 에스트라디올, 에스트론, 에스트리올, 코르티솔, 프로게스테론, 칼시트리올 또는 칼시디올) 또는 땀 화합물일 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 숙주 마이크로바이옴의 박테리아 개체군에 의해 발현되는 적어도 하나의 약물-표적화 효소를 변형시켜서, 상기 약물로 처리된 숙주에서 소정 약물의 물질대사를 변형시키기 위한 방법에 관한 것으로서,
박테리아 개체군을 DNA 서열에 이중 가닥 파괴의 도입없이 상기 개체군의 박테리아의 적어도 일부에서 박테리아에 의해 발현 또는 분비되는, 약물-물질대사 유전자 생산물, 특히 약물-표적화 효소를 코딩하는 DNA 서열에서 유전자 변형을 생성시키는 벡터를 접촉시키는 단계를 포함하고,
약물-물질대사 유전자 단백질, 특히 약물-표적화 효소를 코딩하는 유전자의 유전자 변형은 숙주에서 약물 물질대사의 변형을 일으키고;
유전자 변형은 박테리아의 직접 사멸을 초래하지 않는다.
본 명세서에서 "약물 물질대사"란, 체내에서 약학 물질의 생체변환을 의미한다. 본 발명의 상황에서, 약물 물질대사는 약물의 제거를 초래하는 경로 및 대상체에서 상기 대상체에게 투여된 것의 약물 활성의 보다 일반적인 진화 둘 모두를 포괄한다.
소정 약물의 물질대사의 상기 변형은 숙주에게 유독한 화합물로 소정 약물의 전환의 방지, 소정 약물의 가수분해를 방지하여 상기 약물의 장기간 활성의 초래, 상기 약물의 증가 및/또는 연장된 활성을 초래하는 소정 약물의 효소적 변형, 활성 또는 보다 활성인 화합물로 상기 소정 약물의 전환, 소정 약물로부터 해독된 화합물의 재활성화 방지로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 소정 약물은 니카르디핀·HCl, 리스페리돈, 톨카폰, 아자티오프린, 엔타카폰, 엑세메스탄, 니모디핀, 캅사이신, 덱사메타손, 에타크린산, 리팜핀 (리팜피신), 술린닥, 보리노스타트, 돌라세트론, 마이코페놀레이트 모페틸, 지도부딘 (3'-아지도-3'-데옥시티미딘), 알로푸리놀, 베타메타손, 비사코딜, 에스트라디올, 팜시클로비르, 플루타미드, 히드로코르티손, 히드로코르티손 아세테이트, 메틸프레드니솔론, 메트로니다졸, 나부메톤, 판토프라졸, 프레드니솔론, 프로게스테론, 프레드니손, 스피로노락톤, 술파살라진, 티니다졸, 플루옥세틴·HCl, 미소프로스톨, 메게스트롤 아세테이트, 카페시타빈, 케노디올 (케노데옥시콜산), 클로파지민, 클로나제팜, 코르티손 아세테이트, 단트롤렌·Na, 둘록세틴, 플루드로코르티손 아세테이트, 일로페리돈, 로라제팜, 닐루타미드, 니티시논, 니트로퓨란토인, 옥사제팜, 팔리페리돈, 프라수그렐, 프로베네시드, 리파부틴, 술파메톡사졸, 우르소디올, 오메프라졸, 테나토프라졸, 아르테미시닌, 다나졸, 올메사르탄 메독소밀, 페나조피리딘, 니트렌디핀, 라세카드로틸, 페노피브레이트, 플루페나진, 텔미사르탄, 벤즈프로마론, 옥세타자인, 메플로퀸, 퀴나크린, 피모지드, 록사핀 숙시네이트, 시클로벤자프린, 에토프로파진, 프로메타진, 클레미졸 및 피리메타민으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 소정 약물은 또한 아바카비르 술페이트, 아세부톨롤, 아데카이니드, 알푸조신, 알모트립탄, 알프레놀롤, 아만타딘, 아미노글루테티미드, 아미술프리드, 아나그렐리드, 아나스트로졸, 안타졸린 포스페이트, 아포모르핀, 아르테미시닌, 아테놀롤, 아토르바스타틴 칼슘, 아자타딘 말레에이트, 밤부테롤, 베나제프릴, 벤즈프로마론, 벤즈티아지드, 베타메타손 아세테이트, 베타메타손 발레레이트, 베탁살롤, 벤자피브레이트, 비칼루타미드, 비페리덴, 비사코딜, 비소프롤롤 푸마레이트, 브로모크립틴 메실레이트, 부데소니드, 부프로피온, 부라메이트, 부스피론, 카밀로핀 디히드로클로라이드, 카페시타빈, 카르베타펜탄 시트레이트, 카르비녹사민 말레에이트, 카리소프로돌, 카르베딜롤, 셀레콕십, 세티리진, 클로르메자논, 시메티딘, 시탈로프람 히드로브로마이드, 클레마스틴 푸마레이트, 클레미졸, 클렌부테롤, 클리디늄 브로마이드, 클로니딘, 클로피도그렐 술페이트, 클로자핀, 콜키신, 시클로벤자프린, 시클로포스파미드, 시프로테론 아세테이트, 다비가트란 에텍실레이트 메실레이트, 다나졸, 다리페나신 히드로브로마이드, 다사티닙, 데플라자코르트, 데스벤라팍신 숙시네이트, 덱사메타손, 덱스트로메토르판 히드로브로마이드, 디아세타메이트, 디시클로민, 디플로라손 디아세테이트, 디지톡신, 디곡신, 딜티아젬, 디페로돈, 디페닐피랄린, 디피리다몰, 디소피라미드 포스페이트, 돔페리돈, 독사조신 메실레이트, 독세핀, 독실아민 숙시네이트, 드로스피레논, 둘록세틴, 엘레트립탄 히드로브로마이드, 에날라프릴 말레에이트, 엔타카폰, 에르고노빈 말레에이트, 에르고타민 타르트레이트, 에스조피클론, 에토프로파진, 에톡스졸라미드, 에티노디올 디아세테이트, 에토돌락, 에제티미브, 팜시클로비르, 팜프로파존, 페북소스타트, 페노피브레이트, 펜스피리드, 펙소페나딘, 피나스테리드, 플루코나졸, 플루옥세틴, 플루페나진, 플루복사민 말레에이트, 갈란타민, 글리클라지드, 글리피지드, 그리세오풀빈, 구안파신, 할로페리돌, 히오스시아민, 이데베논, 이마티닙, 인다파미드, 인도메타신, 일베사르탄, 일소글라딘 말레에이트, 이스라디핀, 이트라코나졸, 케토롤락 트로메타민, 케토티펜 푸마레이트, 라베탈롤, 라모트리진, 레트로졸, 레바미솔, 레보노르게스트렐, 리나글립틴, 로펙시딘, 로페라미드, 로사르탄, 로바스타틴, 록사핀 숙시네이트, 메벤다졸, 멥히드롤린 나프탈렌술포네이트, 메플로퀸, 메게스트롤 아세테이트, 멜팔란, 메만틴, 메탁살론, 메토카르바몰, 메톡스살렌, 메트숙시미드, 메틸페니데이트, 메티세르기드 말레에이트, 메티크레인, 메티테핀 말레에이트, 메토클로프라미드, 메톨라존, 메토프롤롤 타르트레이트, 메바스타틴, 미안세린, 미페프리스톤, 밀나시프란, 마이코페놀레이트 모페틸, 나돌롤, 나프로닐 옥살레이트, 나프토피딜, 날록손, 나프록센(+), 나테글리니드, 네파조돈, 네포팜, 네오스티그민 브로마이드, 네비라핀, 니세르골린, 니트렌디핀, 니자티딘, 노레틴드론 아세테이트, 노르게스티메이트, 노스카핀, 올란자핀, 올메사르탄 메독소밀, 오메프라졸, 오르페나드린 시트레이트, 옥사프로진, 옥스카르바제핀, 옥세타자인, 옥시부티닌 클로라이드, 파클리탁셀, 팔리페리돈, 판토프라졸, 파파베린, 파록세틴, 펜부톨롤 술페이트, 펜톡시필린, 페르골리드 메실레이트, 페리시아진, 페린도프릴 엘부민, 페나세틴, 페나조피리딘, 페니토인 나트륨, 피도티모드, 피모지드, 피타바스타틴 칼슘, 프라노프로펜, 프라조신, 프레드니손, 피리디놀 메탄술포네이트, 프리마퀸 포스페이트, 프로카르바진, 프로메타진, 피리메타민, 쿠에티아핀, 퀴나크린, 퀴나프릴, 퀴닌 술페이트, 라세카도트릴, 라멜테온, 라미프릴, 라니티딘, 라놀라진, 레바미피드, 레파글리니드, 레세르핀, 릴루졸, 리만타딘, 리스페리돈, 리토나비르, 리바스티그민 타르트레이트, 리자트립탄 벤조에이트, 로피니롤, 로시글리타존 말레에이트, 로수바스타틴 칼슘, 록사티딘 아세테이트, 세르트랄린, 실데나필 시트레이트, 솔리페나신 숙시네이트, 소탈롤, 스피페론, 술파살라진, 술핀피라존, 술린닥, 술피리드, 수마트립탄 숙시네이트, 타크린, 타크롤리무스, 타달라필, 삼술로신 히드로클로라이드, 테가세로드 말레에이트, 텔미사르탄, 테나토프라졸, 테녹시캄, 테라조신, 터비나핀, 티아벤다졸, 티오틱센, 티아프리드, 티몰롤 말레에이트, 티니다졸, 톨라자미드, 토포테칸, 트란돌라프릴, 트라닐라스트, 트라조돈, 트리헥시페니딜, 트리메부틴 말레에이트, 트리메타지딘 디히드로클로라이드, 트리메토벤자미드, 트리미프라민 말레에이트, 트리프롤리딘, 트로피세트론, 트로스피움 클로라이드, 발사르탄, 벤라팍신, 베라파밀, 빌라조돈, 빈포세틴, 보리코나졸, 와파린, 잘레플론, 지도부딘 [azt], 지프라시돈 메실레이트 및 졸피뎀으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
특정 구현예에서, 특히 상기 소정 약물이 상기 약물 목록으로부터 선택될 때, 상기 약물-물질대사 유전자 생산물은 하기 표 2에 열거된 핵산 서열에 의해 코딩되는 유전자 생산물로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 하기 표 2에 열거된 핵산 서열에 의해 코딩되는 유전자 생산물 중 하나와 적어도 90% 동일하고, 특히 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열의 유전자 생산물이다.
특정 구현예에서, 특히 상기 소정 약물이 상기 약물의 목록으로부터 선택될 때, 상기 약물-물질대사 유전자 생산물은 하기 표 2에 열거된 박테리아로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리아에 의해 발현되거나 또는 분비된다.
특정 구현예에서, 상기 약물-표적화 효소는 산화, 탈아미노화, 이성질체화, 에스테르화, 축합, 환원, 가수분해 및/또는 재배열 활성을 갖는 효소로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 상기 약물-표적화 효소는 β-글루쿠로니다제, 니트로리덕타제 및 술폭시드 리덕타제로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 상기 소정 약물은 단트롤렌, 클로나제팜, 및/또는 니카르디핀이고, 상기 약물-표적화 효소는 니트로-환원 활성을 갖는 효소이다.
대안적인 구현예에서, 상기 소정 약물은 리스페리돈이고, 상기 약물-표적화 효소는 가수분해 활성을 갖는 효소, 특히 리스페리돈의 이속사졸 모이어티를 가수분해하는 효소이다.
대안적인 구현예에서, 상기 소정 약물은 술파살라진이고, 상기 약물-표적화 효소는 아조환원 활성을 갖는 효소이다.
대안적인 구현예에서, 상기 소정 약물은 디곡신이고, 상기 약물-표적화 효소는 시토크롬 글리코시드 리덕타제이고, 상기 약물-표적화 효소를 발현하는 상기 박테리아는 바람직하게 에게르텔라 렌타 (Eggerthella lenta)이다.
대안적인 구현예에서, 상기 소정 약물은 레보도파 (L-DOPA)이고, 상기 약물-표적화 효소는 바람직하게 엔테로코쿠스 패칼리스 (Enterococcus faecalis), 엔테로코쿠스 패시움 (Enterococcus faecium) 및/또는 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis)에 의해 발현되는 티로신 데카르복실라제 및/또는 바람직하게 에게르텔라 렌타에 의해 발현되는 도파민 데히드롤라제이다. 보다 특정한 구현예에서, 상기 티로신 데카르복실라제를 코딩하는 DNA 서열 중 상기 유전자 변형은 상기 효소의 불활성화를 유도하여, 파킨슨 병을 앓고 있고 레보도파로 치료된 대상체에서, 상기 효소에 의한 L-DOPA의 탈카르복실화를 방지할 수 있고, 그리하여 불활성화할 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 소정 약물은 레보도파 (L-DOPA)이고, 상기 약물-표적화 효소는 바람직하게 클로스트리듐 스포로게네스 (Clostridium sporogenes)에 의해 발현되는, DHPAA 신타제이다. 보다 특정한 구현예에서, DHPAA 신타제를 코딩하는 DNA 서열 중 상기 유전자 변형은 상기 효소의 불활성화를 유도하여, L-DOPA의 탈아미노화를 방지할 수 있고, 그리하여 L-DOPA를 3,4-디히드록시페닐아세트알데히드 (DHPAA)로 전환시킬 수 있고, 파킨슨병을 앓고 있고 레보도파로 치료된 대상체에서 변비를 예방 및/또는 감소시킬 수 있다.
대안적인 구현예에서, 상기 소정 약물은 젬시타빈이고, 상기 약물-표적화 효소는 시티딘 디아미나제이고, 상기 약물-표적화 효소를 발현하는 상기 박테리아는 바람직하게 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli) 및/또는 감마프로테오박테리아 (Gammaproteobacteria)이다.
대안적인 구현예에서, 상기 소정 약물은 프론토실이고, 상기 약물-표적화 효소는 아조-환원에 의해서 프론토실을 p-아미노벤젠술폰아미드로 전환시키는 효소이다.
대안적인 구현예에서, 상기 소정 약물은 술파살라진, 입살라지드 및 발살라지드로부터 선택되고, 상기 약물-표적화 효소는 상기 약물을 5-아미노살리실산으로 전환시키는 효소이다.
대안적인 구현예에서, 상기 소정 약물은 비스테로이드 항염증성 약물이고, 상기 약물-표적화 효소는 β-글루쿠로니다제이다.
특정 구현예에서, 상기 화합물은 L-DOPA이고, 상호작용의 상기 변형은 전형적으로 상기 흡착에 관여하는 에이치, 피롤리 (H. pylori)로부터의 박테리아 어드헤신을 변형시켜서, 헬리코박터 피롤리 (Helicobacter pylori)에 의한 L-DOPA의 흡착의 변형이다.
특정 구현예에서, 상기 화합물은 아세트아미노펜이고, 상호작용의 상기 변형은 전형적으로 씨. 디피실 (C. difficile)에 의한 p-크레솔의 생산 및/또는 분비에 관여하는 DNA 서열을 변형시켜서, 씨. 디피실에 의해 생산되는 p-크레솔 및 아세트아미노펜 간 경쟁의 변형이다.
따라서, 본 발명은 또한 이를 필요로 하는 대상체의 치료 방법에 관한 것으로서,
- 약물을 상기 대상체에게 투여하는 단계, 및
- 상기 약물의 상기 투여 이전에, 그와 동시에, 또는 그 이후에, DNA 서열에 이중 가닥 파괴의 도입없이 상기 개체군의 박테리아의 적어도 일부에서 박테리아에 의해 발현 또는 분비되는 약물-표적화 효소를 코딩하는 DNA 서열에서 유전자 변형을 유도하기 위한 효소 또는 시스템을 코딩하는 벡터를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고,
약물-표적화 효소를 코딩하는 DNA 서열의 유전자 변형은 대상체에서 약물 물질대사의 변형을 일으키고;
유전자 변형은 박테리아의 직접 사멸을 초래하지 않는다.
따라서, 본 발명은 또한 대상체의 치료에서 동시, 순차적 또는 개별 사용을 위한, DNA 서열에 이중 가닥 파괴의 도입없이 상기 개체군의 박테리아의 적어도 일부에서 박테리아에 의해 발현 또는 분비되는 약물-표적화 효소를 코딩하는 DNA 서열에 유전자 변형을 유도하기 위한 효소 또는 시스템을 코딩하는 벡터 및 약물을 포함하는 약학 병용물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 이를 필요로 하는 대상체에서 약물 치료의 효율을 증가시키기 위한 방법에 관한 것으로서,
- 상기 대상체에게 약물을 투여하는 단계, 및
- 상기 약물의 상기 투여 이전에, 그와 동시에, 또는 그 이후에, DNA 서열에 이중 가닥 파괴의 도입없이 상기 개체군의 박테리아의 적어도 일부에서 박테리아에 의해 발현 또는 분비되는 약물-표적화 효소를 코딩하는 DNA 서열에서 유전자 변형을 유도하기 위한 효소 또는 시스템을 코딩하는 벡터를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고,
약물-표적화 효소를 코딩하는 DNA 서열의 유전자 변형은 대상체에서 약물 물질대사의 변형을 일으키고;
유전자 변형은 박테리아의 직접 사멸을 초래하지 않는다.
박테리아 성장의 억제 결여
유전자 변형을 갖는 박테리아는 시험관내에서 또는 생체내에서 유전자 변형이 없는 동일 박테리아와 비교하여 박테리아 성장의 임의 억제에 대해 평가될 수 있다. 이것은 바람직하게 적어도 2개 시점에 유전자 변형이 존재 및 부재하는 박테리아의 백분율을 평가하고 유전자 변형을 갖는 박테리아가 이후 시점에 감소된 백분율을 갖지 않는다는 것을 결정하여 수행된다.
시험관내 비교는 고형 또는 액상 배양으로 박테리아를 성장시키고 시간 경과에 따라 박테리아의 각 유형의 백분율을 결정하여 수행될 수 있다. ELISA, PCR, 고해상 용융, 및 핵산 시퀀싱을 포함하는 통상의 진단 절차를 통해서 백분율을 결정할 수 있다.
생체내 비교는 시간 경과에 따라 샘플 (예를 들어, 분변 또는 면봉)을 수집하고, 시간 경과에 따라 박테리아의 각 유형의 백분율을 결정하여 수행될 수 있다. 면역검출 (예를 들어, ELISA), 핵산 증폭 (예를 들어, PCR), 고해상 용융, 및 핵산 시퀀싱을 적용하는 통상의 진단 과정을 통해서 백분율을 결정할 수 있다.
유전자 변형을 갖는 박테리아의 바람직한 백분율은 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 99.99%, 및 100%이다.
변형을 유도하기 위한 효소 및 시스템
일부 구현예에서, 유전자 변형은 하기 효소 및 시스템 중 하나 이상으로 만들어진다.
참조로 본 명세서에 편입되는, [Rees et al.]9 에 기술된 바와 같은, 시토신 염기 편집자 (CBE) 및 아데노신 염기 편집자 (ABE).
지금까지 기술된 7개 유형의 DNA 염기 편집자가 존재한다:
● C:G를 T:A로 전환시키는 시토신 염기 편집자 (CBE)32
● A:T를 G:C로 전환시키는 아데닌 염기 편집자 (ABE)33
● C:G를 G:C로 전환시키는 시토신 구아닌 염기 편집자 (CGBE)29,30
● C:G를 A:T로 전환시키는 시토신 아데닌 염기 편집자 (CABE)31
● A:T를 C:G로 전환시키는 아데닌 시토신 염기 편집자 (ACBE)34
● A:T를 T:A로 전환시키는 아데닌 티민 염기 편집자 (ATBE)35
● T:A를 A:T로 전환시키는 티민 아데닌 염기 편집자 (TABE)36-38
염기 편집자는 염기 변형 효소가 상이하다. CBE는 APOBEC1, rAPOBEC1, APOBEC1 돌연변이체 또는 진화된 형태 (evoAPOBEC1), 및 APOBEC 상동체 (APOBEC3A (eA3A), Anc689), 시티딘 디아미나제 1 (CDA1), evoCDA1, FERNY, evoFERNY 중의 ssDNA 시티딘 디아미나제에 의존한다.
ABE는 직렬 융합 TadA-TadA*의 데옥시아데노신 데아미나제 활성에 의존하고, 여기서 TadA*는 ssDNA 상에서 아데노신을 이노신으로 전환시킬 수 있는, TadA의 진화된 형태, 이. 콜라이 tRNA 아데노신 데아미나제 효소이다. TadA*는 TadA-8a-e 및 TadA-7.10을 포함한다.
염기 변형 효소를 제외하고, 또한 편집 효율, 정확도 및 양상을 증가시키기 위해 염기 편집자에 대해 구현된 변형이 존재하였다:
● 염기 편집을 반전시키기 위한 염기 절제 복구 기전을 방지하도록 1개 또는 2개 우라실 DNA 글리코실라제 억제제 도메인 (UGI)의 첨가.
● 세포에서 비-상동성 말단 연결 기전 (NHEJ)을 억제하여 삽입-결실 속도를 감소시키는 Mu-GAM의 첨가.
● 비-편집된 가닥 상에 닉을 생성시켜서, 이의 복구 및 결론적으로 편집된 염기의 고정을 촉진하는 닉카제 활성 Cas9 (nCas9 D10A)의 사용.
● 예를 들어, 상이한 유기체, 상이한 PAM 모티프 또는 상이한 충실도 또는 상이한 패밀리를 갖는 돌연변이체로부터의 상이한 Cas 단백질 (예를 들어, Cas12a)의 사용.
DNA-기반 편집자 단백질의 비제한적인 예는 BE1, BE2, BE3, BE4, BE4-GAM, HF-BE3, 스나이퍼-BE3, 표적-AID, 표적-AID-NG, ABE, EE-BE3, YE1-BE3, YE2-BE3, YEE-BE3, BE-PLUS, SaBE3, SaBE4, SaBE4-GAM, Sa(KKH)-BE3, VQR-BE3, VRER-BE3, EQR-BE3, xBE3, Cas12a-BE, Ea3A-BE3, A3A-BE3, TAM, CRISPR-X, ABE7.9, ABE7.10, ABE7.10*, xABE, ABESa, VQR-ABE, VRER-ABE, Sa(KKH)-ABE, ABE8e, SpRY-ABE, SpRY-CBE, SpG-CBE4, SpG-ABE, SpRY-CBE4, SpCas9-NG-ABE, SpCas9-NG-CBE4, enAsBE1.1, enAsBE1.2, enAsBE1.3, enAsBE1.4, AsBE1.1, AsBE1.4, CRISPR-Abest, CRISPR-Cbest, eA3A-BE3, AncBE4를 포함한다.
시토신 구아닌 염기 편집자 (CGBE)는 하기에 융합되는 닉카제 CRISPR로 이루어진다:
a. 시토신 데아미나제 (rAPOBEC) 및 염기 절제 복구 단백질 (예를 들어, rXRCC1).29, 41
b. 래트 APOBEC1 변이체 (R33A) 단백질 및 이. 콜라이-유래 우라실 DNA N-글리코실라제 (eUNG).30
시토신 아데닌 염기 편집자 (CABE)는 Cas9 닉카제, 시티딘 디아미나제 (예를 들어, AID), 및 우라실-DNA 글리코실라제 (Ung)로 이루어진다.31
ACBE는 핵산 프로그램가능한 DNA-결합 단백질 및 아데닌 옥시다제를 포함한다.34
ATBE는 Cas9 닉카제 및 하나 이상의 아데노신 데아미나제 또는 옥시다제 도메인으로 이루어진다.35
TABE는 Cas9 닉카제 및 아데노신 메틸트랜스퍼라제, 티민 알킬트랜스퍼라제, 또는 아데노신 디아미나제 도메인으로 이루어진다.36-38
염기 편집자 분자는 또한 Cas 단백질에 융합된 상기 열거된 편집자 효소 중 둘 이상으로 이루어질 수 있다 (예를 들어, ABE 및 CBE의 조합). 이들 생분자는 이중 염기 편집자로 명명되고 2개 상이한 염기의 편집을 가능하게 한다.39,40
특정 구현예에서, 유전자 변형은 상기 정의된 바와 같은 시토신 염기 편집자 (CBE) 및/또는 아데노신 염기 편집자 (ABE)를 사용해 만들어진다.
참조로 본 명세서에 편입되는, [Anzalone et al.]10 에 기술된 바와 같은 프라임 편집자 (PE)는 프라임 편집 RNA (pegRNA; 역전사를 위한 주형 영역을 포함하는 가이드 RNA)와 조합하여 사용되는 역전사효소에 융합된 nCas9로 이루어진다.
프라임 편집은 삽입, 결실 (indel), 및 12개 염기-대-염기 전환의 도입을 허용한다. 프라임 편집은 Cas 단백질에 의해 생성된 닉 부위에서 프라임 편집 가이드 RNA (pegRNA)가 가져오는 RNA 서열을 DNA로 전환시키는, Cas 닉카제 변이체에 융합된, 역전사효소 (RT)의 능력에 의존한다. 이러한 과정으로부터 생성된 DNA 플랩이 포함되거나 또는 표적화 DNA 서열에 존재하지 않는다.
프라임 편집 시스템은 다음을 포함한다:
● 역전사효소 도메인 예컨대 M-MLV RT 또는 이의 돌연변이체 형태 (M-MLV RT(D200N), M-MLV RT(D200N/L603W), M-MLV RT(D200N/L603W/T330P/ T306K/W313F)에 융합된 Cas 닉카제 변이체 예컨대 Cas9-H840A.
● 프라임 편집 가이드 RNA (pegRNA).
편집을 촉진하기 위해서, 프라임 편집 시스템은 이상적으로 오직 본래 가닥이 아닌 편집된 가닥과 어닐링하도록 sgRNA를 디자인하여서 편집된 가닥 플랩의 분해 이후에만 비-편집된 DNA에 대한 Cas 닉카제 활성을 표적화하는 추가적인 sgRNA의 발현을 포함할 수 있다.
프라임 편집 시스템의 비제한적인 예는 PE1, PE1-M1, PE1-M2, PE1-M3, PE1-M6, PE1-M15, PE1-M3inv, PE2, PE3, PE3b를 포함한다.
CRISPEY (Cas9 Retron precISe Parallel Editing via homologY)로서, sgRNA에 융합되고, Cas9 및 적어도 역전사효소를 포함하는 레트론 (retron) 단백질과 함께 발현되는 레트론 RNA11.
SCRIBE 전략: 단일 가닥 어닐링 단백질 (SSAP)이라고도 알려진, 단일 가닥 DNA의 조합을 촉진하는 리콤비나제와 조합하여 발현되는 레트론 시스템12. 이러한 리콤비나제는 파지 리콤비나제 예컨대 람다 red, recET, Sak, Sak4, 및 참조로 본 명세서에 편입되는 [Wannier et al.]13 에 기술된 새롭게 기술된 SSAP를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
참조로 본 명세서에 편입되고, 많은 박테리아 종에 대해 적합화된, [Karberg et al.]14 에 기술된 그룹 II 인트론을 기반으로 하는 타겟트론 (targetron) 시스템.
다른 레트론 기반 유전자 표적화 접근법은 참조로 본 명세서에 편입되는 [Simon et al.]15 에 기술된다.
CRISPR-Cas. CRISPR 시스템은 2개의 별도 구성요소, 즉 i) 엔도뉴클레아제로서, 이러한 경우에 CRISPR 연관 뉴클레아제 (Cas 또는 "CRISPR 연관 단백질") 및 ii) 가이드 RNA를 함유한다. CRISPR 시스템의 유형에 의존하여, 가이드 RNA는 CRISPR (crRNA) 박테리아 RNA 및 tracrRNA (트랜스-활성화 RNA CRISPR)16 의 조합으로 이루어진 키메라 RNA의 형태일 수 있다. 가이드 RNA는 CAS 단백질에 대한 가이드로서 제공되는 "스페이싱 서열"에 상응하는 crRNA의 표적화 특이성, 및 단일 전사물 중 tracrRNA의 입체배열 성질을 조합한다. 가이드 RNA 및 Cas 단백질이 세포에서 동시에 발현될 때, 표적 게놈 서열은 영구적으로 파괴 (그리고 위치에 의존하여, 세포 사멸 및/또는 표적화 및 주변 서열의 소멸을 야기)되거나 또는 변형된다. 변형은 복구 매트릭스에 의해 가이드될 수 있다.
CRISPR 시시ㅡ템은 뉴클레아제 작용 기전에 의존하여 2개 주요 클래스를 포함한다:
- 클래스 1은 다수-서브유닛 이펙터 복합체로 만들어지고 I형, III형, 및 IV형을 포함한다.
- 클래스 2는 단일-유닛 이펙터 모듈, 예컨대 Cas9 뉴클레아제로 만들어지고, II형 (II-A,II-B,II-C,II-C 변이체), V형 (V-A,V-B,V-C,V-D,V-E,V-U1,V-U2,V-U3,V-U4,V-U5) 및 VI형 (VI-A,VI-B1,VI-B2,VI-C,VI-D)을 포함한다.
본 발명에 따른 관심 서열은 바람직하게 Cas 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 다양한 CRISPR 효소는 본 발명에 따른 벡터 상에서 관심 서열로서 사용을 위해 이용가능하다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 II형 CRISPR 효소, II-A형 또는 II-B형 CRISPR 효소이다. 다른 구현예에서, CRISPR 효소는 I형 CRISPR 효소 또는 III형 CRISPR 효소이다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 DNA 변형을 촉매한다. 일부 다른 구현예에서, CRISPR 효소는 RNA 변형을 촉매한다. 예를 들어, Cas13-데아미나제 융합이 RNA 염기 편집과 따라서 RNA를 변형시키는데 사용되었다17. 일 구현예에서, CRISPR 효소는 가이드 RNA 또는 단일 가이드 RNA (sgRNA)에 커플링될 수 있다. 일정 구현예에서, 가이드 RNA 또는 sgRNA는 항생제 내성 유전자, 병독성 단백질 또는 인자 유전자, 독소 단백질 또는 인자 유전자, 박테리아 수용체 유전자, 막 단백질 유전자, 구조 단백질 유전자, 분비형 단백질 유전자, 일반 약물에 대한 내성을 발현하는 유전자 및 숙주에 대해 유해한 효과를 야기하는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 DNA 서열 또는 유전자를 표적으로 한다. 바람직하게, CRISPR 효소는 이중 가닥 파괴를 만들지 않는다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 단일 가닥 파괴 또는 닉을 만든다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 DNA 또는 RNA에 임의의 파괴를 만들지 않는다. 일 구현예에서, Cas13-데아미나제 융합은 RNA를 염기 편집하는데 사용된다.
관심 서열은 단독으로 또는 벡터에 의해 코딩되는 Cas 단백질 및/또는 가이드 RNA와 조합하여, 표적화된 박테리아에 대해 내생성인 Cas 단백질을 가이드하기 위해 가이드 RNA 또는 sgRNA를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
다수-서브유닛 이펙터 또는 단일-유닛 이펙터의 일부로서 Cas 단백질의 비제한적인 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (Csn1 및 Csx12로도 알려짐), Cas10, Cas11 (SS), Cas12a (Cpf1), Cas12b (C2c1), Cas12c (C2c3), Cas12d (CasY), Cas12e (CasX), C2c4, C2c8, C2c5, C2c10, C2c9, Cas13a (C2c2), Cas13b (C2c6), Cas13c (C2c7), Cas13d, Csa5, Csc1, Csc2, Cse1, Cse2, Csy1, Csy2, Csy3, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, Csm1, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csn2, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx13, Csx1, Csx15, SdCpf1, CmtCpf1, TsCpf1, CmaCpf1, PcCpf1, ErCpf1, FbCpf1, UbcCpf1, AsCpf1, LbCpf1, 이의 상동체, 이의 오솔로그, 이의 변이체, 또는 이의 변형된 형태를 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 부위에서 표적 핵산의 양쪽 가닥을 절단한다.
다양한 구현예에서, 관심 핵산은 Cas9 (예를 들어, Cas9 닉카제) 도메인 및 디아미나제 도메인을 포함하는 융합 단백질을 코딩한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 Cas9 및 시토신 데아미나제 효소, 예컨대 APOBEC 효소, 또는 아데노신 데아미나제 효소, 예컨대 예를 들어, 참조로 본 명세서에 편입되는, 미국 특허 출원 공개번호 제2015/0166980호에 개시된 바와 같은 ADAT 효소를 포함한다. 일 구현예에서, 데아미나제는 ACF1/ASE 데아미나제이다.
다양한 구현예에서, APOBEC 데아미나제는 APOBEC1 데아미나제, APOBEC2 데아미나제, APOBEC3A 데아미나제, APOBEC3B 데아미나제, APOBEC3C 데아미나제, APOBEC3D 데아미나제, APOBEC3F 데아미나제, APOBEC3G 데아미나제, 및 APOBEC3H 데아미나제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예에서, 융합 단백질은 Cas9 도메인, 시토신 디아미나제 도메인, 및 우라실 글리코실라제 억제제 (UGI) 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 데아미나제는 예를 들어, 참조로 본 명세서에 편입되는 미국 특허 제10,113,163호에 개시된 바와 같이, DNA에서 아데노신을 탈아미노화시키는 아데노신 데아미나제이다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 염기 복구의 억제제, 예컨대 예를 들어, 미국 특허 제10,113,163호에 개시된 바와 같이, 뉴클레아제 사멸 이노신 특이적 뉴클레아제 (dISN)를 더 포함한다. 다양한 구현예에서, 관심 핵산은 예를 들어, 참조로 본 명세서에 편입되는, [Anzalone et al.]10 에 기술된 바와 같이, 표적 부위를 특정하고 바람직한 편집을 코딩하는 프라임 편집 가이드 RNA (pegRNA)에 의해 프로그램된, 조작된 역전사효소에 융합된 촉매적으로 손상된 Cas9 엔도뉴클레아제를 포함하는 융합 단백질을 코딩한다.
특정 구현예에서, CRISPR 효소는 임의의 Cas9 단백질, 예를 들어, 임의의 천연 발생 박테리아 Cas9를 비롯하여, 이의 임의의 변이체, 상동체 또는 오솔로그이다.
"Cas9"란, 단백질 Cas9 (Csn1 또는 Csx12라고도 함) 또는 이의 기능성 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드 단편을 의미하고, 즉 가이드 RNA(들)와 상호작용할 수 있고 표적 게놈의 DNA의 이중 가닥 절단을 수행하도록 허용하는 효소 활성 (뉴클레아제)을 발휘할 수 있는 것을 의미한다. 따라서 "Cas9"는 예를 들어, 단백질의 사전정의된 기능에 필수적이지 않은 단백질의 도메인, 특히 gRNA (들)와의 상호작용에 필수적이지 않은 도메인을 제거하도록 절두된, 변형된 단백질을 의미할 수 있다. 바람직하게, Cas9는 이중 가닥 DNA 절단 활성이 결여된 dCas9 (dead-Cas9) 또는 nCas9 (닉카제 Cas9)이다.
본 발명의 상황에서 사용되는 Cas9 (전체 단백질 또는 이의 단편)를 코딩하는 서열은 임의의 기지 Cas9 단백질로부터 수득될 수 있다18-20. 본 발명에서 유용한 Cas9 단백질의 예는 스트렙토코쿠스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes) (SpCas9), 스트렙토코쿠스 써모필레스 (Streptococcus thermophiles)(St1Cas9, St3Cas9), 스트렙토코쿠스 뮤탄스 (Streptococcus mutans), 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) (SaCas9), 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) (CjCas9), 프란시셀라 노비시다 (Francisella novicida)(FnCas9) 및 네이세리아 메닌지티데스 (Neisseria meningitides) (NmCas9)의 Cas9 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상황에서 사용되는 Cpf1 (Cas12a) (전체 단백질 또는 이의 단편)을 코딩하는 서열은 임의의 기지 Cpf1 (Cas12a) 단백질로부터 수득될 수 있다18,19. 본 발명에서 유용한 Cpf1(Cas12a) 단백질의 예는 아시다미노코쿠스 (Acidaminococcus) sp, 라크노스피라세아에 박테리우 (Lachnospiraceae bacteriu) 및 프란시셀라 노비시다 (Francisella novicida)의 Cpf1(Cas12a) 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상황에서 사용되는 Cas13a (전체 단백질 또는 이의 단편)를 코딩하는 서열은 임의의 기지 Cas13a (C2c2) 단백질로부터 수득될 수 있다21. 본 발명에서 유용한 Cas13a (C2c2) 단백질의 예는 렙토트리키아 와데이 (Leptotrichia wadei) (LwaCas13a)의 Cas13a (C2c2) 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상황에서 사용되는 Cas13d (전체 단백질 또는 이의 단편)를 코딩하는 서열은 임의의 기지 Cas13d 단백질로부터 수득될 수 있다 (Yan et al. (2018) Mol Cell 70(2):327-339). 본 발명에서 유용한 Cas13d 단백질의 예는 유박테리움 시라에움 (Eubacterium siraeum) 및 루미노코쿠스 (Ruminococcus) sp.의 Cas13d 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 다른 프로그램가능한 뉴클레아제가 사용될 수 있다. 이들은 조작된 TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nuclease; 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제) 및 변이체, 조작된 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 변이체, 천연, 진화 또는 조작된 메가뉴클레아제 또는 리콤비나제 변이체, 및 프로그램가능한 뉴클레아제의 임의 조합 또는 하이브리드를 포함한다. 따라서, 본 명세서에 제공되는 프로그램가능한 뉴클레아제는 관심 DNA 서열 또는 유전자 예컨대, 예를 들어, 독소 유전자, 병독성 인자 유전자, 항생제 내성 유전자, 리모델링 유전자 또는 조절 유전자를 코딩하는 DNA를 선택적으로 변형시키는데 사용될 수 있다 (참조: WO2014124226 및 US2015/0064138).
일부 구현예에서, 유전자 변형은 RNA 수준에서 만들어진다. RNA 염기 편집은 DNA 염기 편집과 동일한 원리를 기반으로 하는데, RNA 염기의 다른 것으로의 전환을 촉매하는 효소는 국소적으로 이의 전환을 수행하기 위해 표적 염기에 가깝게 와야한다. 일 구현예에서, RNA 편집에 사용되는 효소는 dsRNA 구조 중 이노신으로 아데노신을 전환시키는 ADAR 패밀리의 아데노신 데아미나제이다. 몇몇 중요한 연구들은 dsRNA에 대한 이러한 특이성을 이용하였고 국소 RNA 염기 편집을 프로그래밍하기 위해서 안티센스 올리고에 ADAR 디아미나제 도메인 (ADARDD)을 융합시켰다. 보다 최근에 RNA 분자에 결합하는 일부 CRISPR-Cas 시스템의 능력은 RNA 편집으로 용도변경되었다. ADAR2 디아미나제 도메인의 과활성 돌연변이에 융합된 촉매적으로 죽은 Cas13b 효소 (dPspCas13b) (REPAIRv1 경우 ADAR2DD-E488Q 및 REPAIRv2 경우 ADAR2DD-E488Q-T375G)를 사용하여 Cox 등은 이전 RNA 편집 전략과 비교하여 특이성 및 효율을 개선시켰다.
RNA 기반 편집자 단백질의 비제한적인 예는 REPAIRv1, REPAIRv2를 포함한다.
변형을 유도하기 위한 벡터
다양한 구현예에서, 하나 이상의 하기 벡터가 외생성 효소를 도입시키는데 사용되어 유전자 변형을 일으킬 수 있다:
- 조작된 파지
- 조작된 박테리아
- 플라스미드 (예를 들어, 숙주 세포로 전달될 수 있는 접합성 플라스미드), 파지, 파지미드 또는 프로파지.
- 각각의 벡터는 상기 기술된 바와 같이, 예를 들어, 주입을 통해 파지 입자 (조작되거나 또는 야생형인 파지)에 의해서 또는 접합을 통해 도너 박테리아에 의해서 도입될 수 있는, 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 파지 또는 숙주 세포로 도입될 수 있는 접합 플라스미드일 수 있다. 일례에서, 벡터는 항생제 (예를 들어, 베타-락탐 항생제) 및/또는 임의의 다른 작용제와 조합된다.
- 혼합 박테리아 개체군 중 표적 박테리아의 형질전환을 위한 유전자 편집 효소/시스템을 코딩하는 핵산을 포함하는 원위치에서 천연 발생 박테리아를 변형시키기 위한 박테리오파지로서, 상기 유전자 편집 효소/시스템은 상기 표적 박테리아의 게놈을 변형시키지만, 표적 박테리아의 사멸을 초래하지 않는다.
본 발명은 유전자 편집 효소/시스템이 질환 또는 장애에 직접적으로 또는 간접적으로 원인이 되는 단백질을 코딩하는 표적 박테리아 내 DNA 서열 또는 유전자를 표적하는 것인 이들 벡터의 용도를 포괄한다.
특정 구현예에서, 상기 벡터는 표적화된 박테리아에서 복제되지 않는다.
복제 기원
바람직한 구현예에서 벡터의 DNA는 표적화된 박테리아에 대한 복제 기원을 포함하게 된다. 당분야에 공지된 복제 기원은 종-특이적 플라스미드 DNA (예를 들어, CoIE1, Rl, pT181, pSC101, pMB1, R6K, RK2, p15a 등), 박테리아 바이러스 (예를 들어, φX174, M13, F1 및 P4) 및 박테리아 염색체 복제 기원 (예를 들어, oriC)으로부터 확인되었다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 벡터는 표적화된 박테리아에서 기능성인 박테리아 복제 기원을 포함한다.
대안적으로, 본 발명에 따른 벡터는 임의의 기능성 박테리아 복제 기원을 포함하지 않거나 또는 표적화된 박테리아에서 불활성인 복제 기원을 함유한다. 다라서, 본 발명의 벡터는 박테리아 바이러스 입자에 의해 박테리아에 도입되면 그 자체로 복제될 수 없다.
일 구현예에서, 패키징하려는 벡터 상의 복제 기원은 표적화된 박테리아에서 불활성인데, 이러한 복제 기원이 박테리아 바이러스 입자에 의해 표적화되는 박테이아에서 기능성이 아니므로, 원치 않는 벡터 복제를 방지한다는 것을 의미한다.
일 구현예에서, 벡터는 박테리아 바이러스 입자의 생산에 사용되는 박테리아에서 기능성인 박테리아 복제 기원을 포함한다.
박테리아-특이적 복제 기원
플라스미드 복제는 숙주 효소 및 플라스미드-제어된 시스 및 트랜스 결정인자에 의존한다. 예를 들어, 일부 플라스미드는 거의 모든 그람-음성 박테리아에서 인식되고 복제 개시 및 조절 동안 각 숙주에서 올바르게 작용하는 결정인자를 갖는다. 다른 플라스미드는 오직 일부 박테리아에서만 이러한 능력을 보유한다 (Kues, U and Stahl, U 1989 Microbiol Rev 53:491-516).
플라스미드는 3개 일반 기전, 즉 세타 유형, 가닥 치환, 및 복제 기원에서 출발하는 롤링 써클에 의해 복제된다 (참조: Del Solar et al. 1998 Microhio and Molec Biol. Rev 62:434-464). 이러한 복제 기원은 플라스미드 및/또는 숙주 코딩된 단백질의 상호작용에 필요한 부위를 함유한다.
본 발명의 벡터에서 사용되는 복제 기원은 중간 카피수, 예컨대 pBR322 (세포 당 15-20 카피) 또는 R6K 플라스미드 (세포 당 15-20 카피)의 ColE1 ori일 수 있거나 또는 고 카피수, 예를 들어 pUC ori (세포 당 500-700 카피), pGEM ori (세포 당 300-400 카피), pTZ ori (세포 당 >1000 카피) 또는 pBluescript ori (세포 당 300-500 카피)일 수 있다.
일 구현예에서, 박테리아 복제 기원은 ColE1, pMB1 및 변이체 (pBR322, pET, pUC 등), p15a, ColA, ColE2, pOSAK, pSC101, R6K, IncW (pSa 등), IncFII, pT181, P1, F IncP, IncC, IncJ, IncN, IncP1, IncP4, IncQ, IncH11, RSF1010, CloDF13, NTP16, R1, f5, pPS10, pC194, pE194, BBR1, pBC1, pEP2, pWVO1, pLF1311, pAP1, pWKS1, pLS1, pLS11, pUB6060, pJD4, pIJ101, pSN22, pAMbeta1, pIP501, pIP407, ZM6100(Sa), pCU1, RA3, pMOL98, RK2/RP4/RP1/R68, pB10, R300B, pRO1614, pRO1600, pECB2, pCM1, pFA3, RepFIA, RepFIB, RepFIC, pYVE439-80, R387, 파실, RA1, TF-FC2, pMV158 및 pUB113으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
보다 바람직하게, 박테리아 복제 기원은 ColE1, pMB1 및 변이체 (pBR322, pET, pUC 등), p15a, ColA, ColE2, pOSAK, pSC101, R6K, IncW (pSa 등), IncFII, pT181, P1, F IncP, IncC, IncJ, IncN, IncP1, IncP4, IncQ, IncH11, RSF1010, CloDF13, NTP16, R1, f5, pPS10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 이. 콜라이 복제 기원이다.
보다 바람직하게, 박테리아 복제 기원은 pC194, pE194, BBR1, pBC1, pEP2, pWVO1, pLF1311, pAP1, pWKS1, pLS1, pLS11, pUB6060, pJD4, pIJ101, pSN22, pAMbeta1, pIP501, pIP407, ZM6100(Sa), pCU1, RA3, pMOL98, RK2/RP4/RP1/R68, pB10, R300B, pRO1614, pRO1600, pECB2, pCM1, pFA3, RepFIA, RepFIB, RepFIC, pYVE439-80, R387, 파실, RA1, TF-FC2, pMV158 및 pUB113으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
보다 더 바람직하게, 박테리아 복제 기원은 ColE1 및 p15a이다.
일 구현예에서, 박테리아 복제 기원은 프로피오니박테리움 (Propionibacterium) 및 쿠티박테리움 (Cutibacterium), 보다 특별히 프로피오니박테리움 프로이덴레이키이 (Propionibacterium freudenreichii) 및 쿠티박테리움 아크네스 (Cutibacterium acnes)에서 기능성이고, pLME108, pLME106, p545, pRGO1, pZGX01, pPG01, pYS1, FRJS12-3, FRJS25-1, pIMPLE-HL096PA1,A_15_1_R1로부터 선택된다.
파지 복제 기원
본 발명에 따른 벡터는 완전하거나 또는 변형된 파지 게놈의 시스 또는 트랜스 상보성으로, 상이한 캡시드로 이후 캡슐화를 위한 페이로드의 복제를 시작할 수 있는 파지 복제 기원을 포함할 수 있다.
파지 기원은 또한 임의의 파지 입자의 패키징 필요없이 박테리아 복제 기원으로서 작용하도록 조작될 수 있다.
본 발명의 페이로드에 포함되는 파지 복제 기원은 파지에 존재하는 임의의 복제 기원일 수 있다.
바람직하게, 파지 복제 기원은 M13, f1, φX174, P4, 람다, P2, 186, 람다-유사, HK022, mEP237, HK97, HK629, HK630, mEP043, mEP213, mEP234, mEP390, mEP460, mEPx1, mEPx2, phi80, mEP234, T2, T4, T5, T7, RB49, phiX174, R17, PRD1 Pl-유사, P2-유사, P22, P22-유사, N15 및 N15-유사 박테리오파지의 야생형 또는 비-야생형 서열일 수 있다.
보다 바람직하게, 파지 복제 기원은 M13, f1, φX174, P4, 및 람다의 파지 복제 기원으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 파지 복제 기원은 P4 복제 기원이다.
특정 구현예에서, 파지 복제 기원은 프로피오니박테리움 파지: BW-유사 파지 예컨대 두세트, B22, E6, G4, BV-유사 파지 예컨대 아나톨, E1, B3, BX-유사 파지 예컨대 PFR1 및 PFR2, 섬유상 B5 파지, BU-유사 파지 (쿠티박테리움 아크네스 파지) 유래이다.
조건적 복제 기원
특정 구현예에서, 벡터는 표적화된 박테리아에서 불활성이지만 도너 박테리아 세포에서 활성인 조건적 복제 기원을 포함한다.
본 발명의 상황에서, "조건적 복제 기원"은 그의 기능성이 특별한 분자의 존재에 의해 제어될 수 있는 복제 기원을 의미한다.
특정 구현예에서, 조건적 복제 기원은 그의 복제가 하나 이상의 소정 단백질, 펩티드, RNA, 핵산, 분자 또는 이의 임의 조합의 존재에 의존하는 것인 복제 기원이다.
특정 구현예에서, 상기 복제 기원의 복제는, 상기 복제를 활성화시키기 위한, 예컨대 전사같은 과정에 더욱 의존할 수 있다.
본 발명의 상황에서, 상기 조건적 복제 기원은 표적화된 박테리아에서 불활성인데 상기 표적화된 박테리아에서 상기 소정 단백질, 펩티드, RNA, 핵산, 분자 또는 이의 임의 조합의 부재때문이다.
특정 구현예에서, 상기 조건적 복제 기원은 상기 도너 박테리아 세포에서 활성인데, 상기 도너 박테리아 세포가 상기 소정 단백질, 펩티드, RNA, 핵산, 분자 또는 이의 임의 조합 특정을 발현하기 때문이다. 구현예에서, 상기 단백질, 펩티드, RNA 핵산, 분자 또는 이의 임의 조합은 상기 도너 박테리아 세포에서 트랜스로 발현된다.
"트랜스로 (in trans)"란 본 명세서에서 상기 단백질, 펩티드, RNA, 핵산, 분자 또는 이의 임의 조합이 복제 기원을 포함하는 것과 동일한 핵산 분자 상에서 코딩되지 않는 것을 의미한다. 특정 구현예에서, 상기 단백질, 펩티드, RNA, 핵산, 분자 또는 이의 임의 조합은 염색체 또는 벡터, 특히 플라스미드 상에서 코딩된다. 특정 구현예에서, 상기 벡터는 항생제 내성 마커를 포함한다. 대안적인 구현예에서, 상기 벡터는 항생제 내성 마커가 없다.
상기 조건적 복제 기원이 표적화된 박테리아에서, 상기 표적화된 박테리아에 상기 소정 단백질, 펩티드, RNA, 핵산, 분자 또는 이의 임의 조합의 부재 때문에 불활성이므로, 상기 조건적 복제 기원은 표적화하려는 특별한 박테리아에 의존하여 선택될 수 있다.
본 명세서에 개시된 조건적 복제 기원은 바람직하게 하기 특징을 공유하는 플라스미드, 박테리오파지 또는 PICI로부터 기원할 수 있다: 그들은 그들의 복제 기원 반복 서열, 또는 이테론을 함유하고, 그들은 그들 자신에 특이적인 상기 복제 기 원과 상호작용하는 적어도 하나의 단백질 (즉, Rep, 단백질 O, 단백질 P, pri)을 코딩한다.
예로서, 하기 플라스미드 및 박테리오파지의 조건적 복제 시스템을 언급할 수 있다: RK2, R1, pSC101, F, Rts1, RSF1010, P1, P4, 람다, phi82, phi80.
특정 구현예에서, 상기 조건적 복제 기원은 R6Kλ DNA 복제 기원 및 이의 유도체, IncPα oriV 복제 기원 및 이의 유도체, 유도성 프로모터 하에 있도록 변형된 ColE1 복제 기원, 및 파지-유도성 염색체 섬 (PICI) 유래 복제 기원 및 이의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 상기 조건적 복제 기원은 숙주 마이크로바이옴의 박테리아중 50% 미만, 또는 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만에 존재하는 복제 기원이다.
다른 특정 구현예에서, 상기 조건적 복제 기원은 숙주 마이크로바이옴의 박테리아, 특히 숙주 마이크로바이옴의 50% 초과, 보다 특히 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 90% 초과 또는 95% 초과를 대표하는 박테리아의 복제 기원의 서열과 80% 미만으로 동일한, 특히 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만 또는 1% 미만으로 동일한 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "파지-유도성 염색체 섬" 또는 "PICI"는 보존된 유전자 구성을 갖고, PICI 마스터 리프레서를 포함한, 분기 조절 유전자의 쌍을 코딩하는 이동성 유전자 구성요소를 의미한다. 전형적으로, 그람-양성 박테리아에서, rpr의 좌측에 있고, 동일 방향으로 전사되는, PICI는 인테그라제 (int) 유전자를 포함하는 작은 세트의 유전자를 코딩하고; rpr의 우측에서, 반대 방향으로 전사되는, PICI는 절제 기능 (xis), 및 프리마제 상동체 (pri) 및 때때로 융합되는, 임의로 복제 개시자 (rep)로 이루어지는 복제 모듈을 코딩하고, 복제 기원 (ori) 이후에, 이들 유전자 옆에 있는, 역시 동일한 방향으로 전사되는, PICI는 파지 간섭에 관여되는 유전자, 및 임의로 터미나제 소형 서브유닛 상동체 (terS)를 코딩한다.
특정 구현예에서, 상기 조건적 복제 기원은 파지-유도성 염색체 섬 (PICI)으로부터 기원하는 복제 기원이다.
특히 프리마제-헬리카제 및 PICI 유래 복제 기원을 기반으로, 신규한 조건적 복제 벡터를 유도시키는 것이 가능한 것으로 확인되었다. 이들 기원은 표적 균주에서 상대적으로 드물 수 있고, 보다 유리하게 프리마제-ori 쌍은 각 PICI에 대해 고유하여, 비바람직한 재조합 또는 페이로드 확산 사건의 확률을 유의하게 감소시킬 수 있다. 그들은 재조합 기회를 더욱 제한하고 제한효소 부위를 제거하여 표적 박테리아 방어 시스템을 우회하도록 더욱 변형될 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 조건적 복제 기원은 [Fillol-Salom et al. (2018) The ISME Journal 12:2114-2128]에 개시된, 에스케리치아 콜라이 균주 CFT073의 PICI 유래 복제 기원으로부터 유래된다.
특정 구현예에서, 상기 조건적 복제 기원은 전형적으로 SEQ ID NO: 12 서열의 에스케리치아 콜라이 균주 CFT073의 PICI로부터의 프리마제 ori이다.
다른 특정 구현예에서, 상기 조건적 복제 기원은 GAAABCC, GCCGGC, RCCGGY, GCNGC, TWCANNNNNNTGG (SEQ ID NO: 13), TGGCCA, ACCYAC, YGGCCR, AGACC, GCWGC, GGGANGC, GKAGATD, GCCGGYYD, GGCYAC, RGCCGGYYD, 및 VGCCGGYBD로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15 또는 적어도 16 제한효소 부위(들)가 없는, 에스케리치아 콜라이 균주 CFT073의 PICI로부터의 프리마제 ori이다 .
특정 구현예에서, 상기 조건적 복제 기원은 제한효소 부위 GAAABCC가 없는, 에스케리치아 콜라이 균주 CFT073의 PICI로부터의 프리마제 ori이다. 바람직하게, 상기 조건적 복제 기원은 SEQ ID NO: 7의 서열이다.
다른 특정 구현예에서, 상기 조건적 복제 기원은 제한효소 부위 GAAABCC, GCCGGC, RCCGGY, GCNGC, TWCANNNNNNTGG (SEQ ID NO: 13), TGGCCA, ACCYAC, YGGCCR, AGACC, GCWGC, GGGANGC, GKAGATD, GCCGGYYD, GGCYAC, RGCCGGYYD, 및 VGCCGGYBD가 없는, 에스케리치아 콜라이 균주 CFT073의 PICI로부터의 프리마제 ori이다. 바람직하게, 상기 조건적 복제 기원은 SEQ ID NO: 8의 서열이다.
특정 구현예에서, 상기 복제 기원이 파지-유도성 염색체 섬 (PICI)으로부터 유래되는 것인, 상기 조건적 복제 기원은 상기 도너 박테리아 세포에서 활성인데 상기 도너 박테리아 세포는 rep 단백질, 특히 프리마제-헬리카제, 특히 전형적으로 SEQ ID NO: 15 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지는 핵산에 의해 코딩되는, SEQ ID NO: 14 서열의 프리마제-헬리카제를 발현하기 때문이다.
이들 특이적 조건적 복제 기원은 특히 람다-기반 패키징과 상용성이어서, 미생물총-관련 적용분야에 필요한 충분히 높은 역가 (>1010/mL)를 초래하는 것으로 입증되었다.
특정 구현예에서, 상기 벡터가 파지미드일 때, 상기 복제 기원은 상기 파지미드를 패키징하는 캡시드의 구조 구성요소를 코딩하는데 사용되는 것과 상이한 미생물로부터 유래될 수 있다.
"도너 박테리아 세포"란, 본 명세서에서 상기 정의된 바와 같은 벡터를 수용할 수 있고/있거나, 상기 정의된 바와 같은 벡터를 생산할 수 있고/있거나, 다른 박테리아에게 상기 정의된 바와 같은 상기 벡터를 전달할 수 있는 박테리아를 의미한다. 특정 구현예에서, 상기 벡터는 파지미드일 수 있고, 그러면 상기 도너 박테리아 세포는 상기 파지미드를, 보다 특히 패키징된 파지미드의 형태로 생산할 수 있는 박테리아 세포일 수 있다. 대안적인 구현예에서, 상기 벡터는 플라스미드, 보다 특히 접합 플라스미드일 수 있고, 그러면 상기 도너 박테리아 세포는 특히 접합에 의해서, 다른 박테리아에게 상기 접합 플라스미드를 전달할 수 있는 박테리아일 수 있다.
바람직하게, 상기 도너 박테리아 세포는 안정하게 상기 벡터를 포함하고 상기 벡터를 복제할 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 벡터의 조건적 복제 기원이 그의 복제가 소정 단백질, 펩티드, 핵산, RNA, 분자 또는 이의 임의 조합의 존재에 의존하는 것인 복제 기원일 때, 상기 도너 박테리아 세포는 상기 단백질, 펩티드, 핵산, RNA, 분자 또는 이의 임의 조합을 발현한다. 바람직하게, 상기 단백질, 펩티드, 핵산, RNA, 분자 또는 이의 임의 조합은 상기 정의된 바와 같이, 트랜스로 발현된다.
특정 구현예에서, 상기 도너 박테리아 세포는 상기 단백질, 펩티드, 핵산, RNA, 분자 또는 이의 임의 조합을 코딩하는 핵산을 안정하게 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 복제 기원이 파지-유도성 염색체 섬 (PICI)로부터 유래될 때, 상기 조건적 복제 기원은 상기 도너 박테리아 세포에서 활성인데 상기 도너 박테리아 세포가 rep 단백질, 특히 프리마제-헬리카제, 특히 프리마제-헬리카제 of 서열 SEQ ID NO: 14 서열의 프리마제-헬리카제를 발현하기 때문이다.
특정 구현예에서, 상기 도너 박테리아 세포는 상기 rep 단백질, 특히 상기 프리마제-헬리카제를 코딩하는 핵산을 안정하게 포함하고, 상기 핵산은 전형적으로 SEQ ID NO: 15 서열을 포함하거나 또는 그로 이루얼진다.
특정 구현예에서, 상기 도너 박테리아 세포는 생산 세포주, 특히 본 발명의 벡터를 포함하는 패키징된 파지미드를 생산하는 세포주이다.
생산 세포주에 의한 패키징된 파지미드 및 박테리오파지 입자의 생성은 당업자에게 충분히 공지된 통상의 기술이다. 일 구현예에서, 위성 파지 및/또는 헬퍼 파지가 본 명세서에 개시된 전달 비히클 중 벡터의 패키징을 촉진하는데 사용될 수 있다. 헬퍼 파지는 트랜스로 기능을 제공하고 당업자에게 충분히 공지되어 있다. 헬퍼 파지는 파지미드를 패키징하는데 필수적인 구조적 및 기능적 단백질을 코딩하는 모든 유전자를 포함한다 (즉, 헬퍼 파지는 전달 비히클의 조립에 필수적인 모든 유전자 생산물을 제공함). 헬퍼 파지는 결함성 복제 기원 또는 패키징 신호를 함유할 수 있거나, 또는 후자가 완전히 결여되고, 그러한 이유로 자가-패키징을 할수 없어서, 벡터 또는 플라스미드를 보유하는 박테리아 전달 입자만이 생산될 것이다. 헬퍼 파지는 그들이 전달 입자 생산에 사용되는 박테리아 세포의 용해를 유도할 수 없도록 선택될 수 있다. 당업자는 일부 박테리오파지가 결함성이고 페이로드 패키징에 헬퍼 파지를 필요로 한다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 박테리아 전달 입자를 제조하기 위해 생산된 박테리오파지에 의존하여, 당업자는 혈파 파지가 필요한지 여부를 알 수 있다. 패키징된 페이로드의 조립 또는 생산에 필수적인 하나 이상의 단백질 또는 조절 과정을 코딩하는 서열은 트랜스로 공급될 수 있다. 예를 들어, STF, gpJ 및 gpH 단백질은 유도성 프로모터의 제어 하에 있거나 또는 항상적으로 발현되는 벡터 또는 플라스미드에 제공될 수 있다. 이러한 경우에, 파지 야생형 서열은 트랜스로 공급되는 유전자 또는 서열의 결실을 함유할 수 있거나 또는 그렇지 않을 수도 있다. 추가로, 새로운 기능을 코딩하는 키메라 또는 변형된 파지 서열, 예컨대 조작된 STF, gpJ 또는 gpH 단백질은 헬퍼의 게놈 중 바람직한 위치에 직접적으로 삽입될 수 있고, 그리하여 트랜스로 변형된 서열을 제공해야 하는 필요성을 피할 수 있다. 벡터 또는 플라스미드의 형태로 트랜스로 서열 또는 단백질을 공급하기 위한 방법뿐만 아니라, 직접 게놈 삽입, 변형, 및 돌연변이를 생성시키는 방법은 당업자에게 충분히 공지되어 있다.
자가 번식 불가한 전달 비히클
특정 구현예에서, 본 발명의 벡터를 포함하는, 전달 비히클, 특히 박테리오파지, 박테리아 바이러스 입자 또는 패키징된 파지미드는 자가 번식할 수 없다.
본 발명의 상황에서, "자가 번식"은 "자가 복제"와 상이한데, "자가 복제"는 핵산을 복제할 수 있는 능력을 의미하는 반면, "자가 번식"은 특히 새로운 전달 비히클을 생산하는 자손을 갖는 능력을 의미하며, 상기 전달 비히클은 빈 상태로 생산되거나 또는 관심 핵산이 패키징된 상태로 생산된다.
본 명세서에서 "자가 번식 불가한 전달 비히클"은 상기 전달 비히클을 생산하는데 필요한 적어도 하나, 몇개 또는 모든 기능성 유전자(들)이 상기 전달 비히클 (및 상기 전달 비히클에 포함된 상기 벡터)에 부재한 것을 의미한다. 바람직한 구현예에서, 상기 전달 비히클을 생산하는데 필요한 상기 적어도 하나, 몇개 또는 모든 기능성 유전자(들)는 상기 정의된 바와 같은 도너 세포, 바람직하게 상기 도너 세포에서 상기 전달 비히클을 생산할 수 있는, 상기 정의된 바와 같은 도너 세포에 존재하는 플라스미드, 염색체 또는 헬퍼 파지에 존재한다.
본 발명의 상황에서, 전달 비히클을 생산하는데 필요한 상기 기능성 유전자는 (i) 상응하는 유전자의 부재 또는 (ii) 상응하는 유전자이지만 비기능성 형태의 존재를 통해 부재할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 전달 비히클을 생산하는데 필요한 상기 유전자의 서열은 상기 전달 비히클에 부재한다. 바람직한 구현예에서, 상기 전달 비히클을 생산하는데 필요한 상기 유전자의 서열은 관심 핵산 서열, 특히 상기 정의된 바와 같은 유전자 변형을 유도하기 위한 효소 또는 시스템을 코딩하는 핵산 서열에 의해 치환되었다.
대안적으로, 상기 전달 비히클을 생산하는데 필요한 상기 유전자는 비기능성 형태로, 예를 들어, 돌연변이체 비기능성 형태로, 또는 비발현성 형태로, 예를 들어 결실 또는 돌연변이된 비기능성 조절인자와 함께, 상기 전달 비히클에 존재한다. 바람직한 구현예에서, 상기 전달 비히클을 생산하는데 필요한 상기 유전자는 표적 세포에서 비기능성이 되게 만들면서, 도너 세포에서 기능성인 채로 남아있는 돌연변이체 형태로 상기 전달 비히클에 존재한다.
본 발명의 상황에서, 상기 전달 비히클을 생산하는데 필요한 유전자는 상기 전달 비히클의 생산에 필요한 임의의 코딩 또는 비-코딩 핵산을 포괄한다.
상기 전달 비히클을 생산하는데 필요한 유전자의 예는 파지 구조 단백질을 코딩하는 유전자; 유전자 발현의 제어에 관여하는 파지 유전자; 전사 및/또는 번역 조절에 관여하는 파지 유전자; 파지 DNA 복제에 관여하는 파지 유전자; 파지 단백질의 생산에 관여하는 파지 유전자; 파지 단백질 폴딩에 관여하는 파지 유전자; 파지 DNA 패키징에 관여하는 파지 유전; 및 박테리아 세포 용해에 관여하는 단백질을 코딩하는 파지 유전자를 포함한다.
프로모터 제어하의 관심 서열
벡터는 적어도 하나의 프로모터의 제어 하에 관심 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 관심 서열은 표적화된 박테리아로 전달하려는 프로그램가능한 뉴클레아제 회로이다. 이러한 프로그램가능한 뉴클레아제 회로는 관심 표적 유전자 (예를 들어, 인간에 유해한 유전자)를 함유하는 박테리아의 생체내 서열-특이적 제거를 매개할 수 있다. 본 개시의 일부 구현예는 스트렙토코쿠스 피오게네스의 II형 CRISPR-Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR-associated) 시스템의 조작된 변이체에 관한 것이다. 사용할 수 있는 다른 프로그램가능한 뉴클레아제는 다른 CRISPR-Cas 시스템, 조작된 TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nucelase) 변이체, 조작된 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 변이체, 천연, 진화 또는 조작된 메가뉴클레아제 또는 리콤비나제 변이체, 및 프로그램가능한 뉴클레아제의 임의 조합 또는 하이브리드를 포함한다. 따라서, 본 명세서에서 제공되는 조작된 자율적으로 분포된 회로는 관심 유전자 예컨대, 예를 들어, 독소 유전자, 병독성 인자 유전자, 항생제 내성 유전자, 리모델링 유전자 또는 조절 유전자를 코딩하는 DNA를 선택적으로 변형시키는데 사용될 수 있다 (참조: WO2014124226 및 US2015/0064138).
바람직하게, 프로그램가능한, 다른 관심 서열이 표적화된 박테리아에 전달하기 위해 벡터에 첨가될 수 있다.
바람직하게, 페이로드에 첨가되는 관심 서열 회로는 박테리아 사멸을 초래하지 않는다. 예를 들어, 관심 서열은 발광 또는 형광 신호를 일으키는 리포터 유전자를 코딩할 수 있다. 대안적으로, 관심 서열은 예컨대 박테리아의 물질대사, 이의 환경 조성을 변형시키거나, 또는 숙주에 영향을 미치는 유용한 기능을 달성한 단백질 및 효소를 포함할 수 있다. 보다 특히 관심 서열은 숙주 면역 반응을 촉발하는 항원일 수 있다. 특이적 항원이 표적 세포의 용해 유도 이후에 환경으로 방출될 수 있거나 또는 예를 들어, [Costa et al]22 및 [Anne et al]23 에 기술된 바와 같이, 표적 세포에 의해 분비될 수 있다
특정 구현예에서, 핵산 관심 서열은 Cas 뉴클레아제, Cas9 뉴클레아제, 가이드 RNA, 단일 가이드 RNA (sgRNA), CRISPR 유전자좌, 효소 예컨대 뉴클레아제 또는 키나제, TALEN, ZFN, 메가뉴클레아제, 리콤비나제, 박테리아 수용체, 막 단백질, 구조 단백질, 분비 단백질을 발현하는 유전자, 항생제 또는 일반 약물에 내성을 발현하는 유전자, 독성 단백질 또는 독성 인자를 발현하는 유전자 및 병독성 단백질 또는 병독성 인자, 박테리아 분비 단백질 또는 수송체, 박테리아 포어를 발현하는 유전자 또는 임의의 그들 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이들 단백질은 또한 추가의 특성, 예컨대 비제한적인 예로서, 기능의 첨가 또는 제거 (예를 들어, dCas9), 정상적으로 분비되지 않는 단백질의 분비 신호의 첨가, 루프의 외생성 펩티드의 첨가를 포함하도록 변형 또는 조작될 수 있다.
표적화된 박테리아
벡터, 전달 입자, 박테리오파지, 도너 세포, 박테리아 바이러스 입자 또는 패키징된 파지미드에 의해 표적화되는 박테리아는 포유동물 유기체, 식물 또는 환경에 존재하는 임의의 박테리아일 수 있다. 미생물총 또는 마이크로바이옴의 임의의 편리공생, 공생, 또는 병원성 박테리아일 수 있다.
마이크로바이옴은 다양한 내생성 박테리아 종을 포함할 수 있고, 이들 중 임의의 것들은 본 개시에 따라 표적화될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적화되는 내생성 박테리아 세포의 속 및/또는 종은 박테리아 바이러스 입자를 제조하는데 사용되는 박테리오파지의 유형에 의존할 수 있다. 예를 들어, 일부 박테리오파지는 박테리아의 특별한 숙주 종에 대한 향성을 나타내거나, 또는 그를 우선적으로 표적화한다. 다른 박테리오파지는 이러한 향성을 나타내지 않고 내생성 박테리아 세포의 다수의 상이한 속 및/또는 종을 표적화하는데 사용될 수 있다.
박테리아 세포의 예는 제한없이, 속 여시니아 (Yersinia) spp., 에스케리치아 (Escherichia) spp., 클렙시엘라 (Klebsiella) spp., 아시네토박터 (Acinetobacter) spp., 보르데텔라 (Bordetella) spp., 네이세리아 (Neisseria) spp., 아에로모나스 (Aeromonas) spp., 프란시셀라 (Franciesella) spp., 코리네 박테리움 (Corynebacterium) spp., 시트로박터 (Citrobacter) spp., 클라미디아 (클라미디아) spp., 헤모필러스 (Hemophilus) spp., 브루셀라 (Brucella) spp., 마이코박테리움 (Mycobacterium) spp., 레지오넬라 (Legionella) spp., 로도코쿠스 (Rhodococcus) spp., 슈도모나스 (Pseudomonas) spp., 헬리코박터 (Helicobacter) spp., 비브리오 (Vibrio) spp., 바실러스 (Bacillus) spp., 에리시펠로트릭스 (Erysipelothrix) spp., 살모넬라 (Salmonella) spp., 스트렙토마이세스 (Streptomyces) spp., 스트렙토코쿠스 (Streptococcus) spp., 스타필로코쿠스 (Staphylococcus) spp., 박테로이데스 (Bacteroides) spp., 프레보텔라 (Prevotella) spp., 클로스트리듐 (Clostridium) spp., 비피도박테리움 (Bifidobacterium) spp., 클로스트리듐 (Clostridium) spp., 브레비박테리움 (Brevibacterium) spp., 락토코쿠스 (Lactococcus) spp., 류코노스톡 (Leuconostoc) spp., 악티노바실러스 (Actinobacillus) spp., 셀로모나스 (Selnomonas) spp., 시겔라 (Shigella) spp., 자이모나스 (Zymonas) spp., 마이코플라스마 (Mycoplasma) spp., 트레포네마 (Treponema) spp., 류코노스톡 (Leuconostoc) spp., 코리네박테리움 (Corynebacterium) spp., 엔테로코쿠스 (Enterococcus) spp., 엔테로박터 (Enterobacter) spp., 파이로코쿠스 (Pyrococcus) spp., 세라티아 (Serratia) spp., 모르게넬라 (Morganella) spp., 파르비모나스 (Parvimonas) spp., 푸소박테리움 (Fusobacterium) spp., 악티노마이세스 (Actinomyces) spp., 포르피로모나스 (Porphyromonas) spp., 미크로코쿠스 (Micrococcus) spp., 바르토넬라 (Bartonella) spp., 보렐리아 (Borrelia) spp., 브루셀리아 (Brucelia) spp., 캄필로박터 (Campylobacter) spp., 힐라미도필리아 (hlamydophilia) spp., 쿠티박테리움 (Cutibacterium) spp., 프로피오니박테리움 (Propionibacterium) spp., 가르드네렐라 (Gardnerella) spp., 에를리키아 (Ehrlichia) spp., 해모필러스 (Haemophilus) spp., 렙토스피라 (Leptospira) spp., 리스테리아 (Listeria) spp., 마이코플라스마 (Mycoplasma) spp., 노카르디아 (Nocardia) spp., 리켓치아 (Rickettsia) spp., 우레아플라스마 (Ureaplasma) spp., 락토바실러스 (Lactobacillus) spp. 및 이의 혼합물의 박테리아 유래 세포를 포함한다.
따라서, 벡터, 전달 입자, 박테리오파지, 박테리아 바이러스 입자 또는 패키징된 파지미드는 본 발명에 따른 페이로드를 특이적으로 전달하기 위해 전술된 박테리아 속 중 어느 하나 이상으로부터의 박테리아 세포를 표적화 (예를 들어, 특이적으로 표적화)할 수 있다.
바람직하게, 표적화된 박테리아는 여시니아 spp., 에스케리치아 spp., 클렙시엘라 spp., 아시네토박터 spp., 슈도모나스 spp., 헬리코박터 spp., 비브리오 spp, 살모넬라 spp., 스트렙토코쿠스 spp., 스타필로코쿠스 spp., 박테로이데스 spp., 클로스트리듐 spp., 시겔라 spp., 엔테로코쿠스 spp., 엔테로박터 spp., 리스테리아 spp., 쿠티박테리움 spp., 프로피오니박테리움 spp., 푸소박테리움 spp., 포르피로모나스 spp. 및 가르드네렐라 spp.로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 박테리아 세포는 혐기성 박테리아 세포 (예를 들어, 성장에 산소를 요구하지 않는 세포)이다. 혐기성 박테리아 세포는 조건부 혐기성 세포 예컨대 제한없이 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 슈와넬라 오네이덴시 (Shewanella oneidensi), 가르드네렐라 바지날리스 (Gardnerella vaginalis) 및 리스테리아 (Listeria)를 포함한다. 혐기성 박테리아 세포는 또한 절대 혐기성 세포, 예컨대, 예를 들어, 박테로이데스, 클로스트리듐, 쿠티박테리움, 프로피오니박테리움, 푸소박테리움, 및 포르피로모나스 종을 포함한다. 인간에서, 혐기성 박테리아는 위장관에서 가장 흔히 발견된다. 일부 특정 구현예에서, 따라서 표적화된 박테리아는 위장관에서 가장 흔하게 발견되는 박테리아이다. 박테리아 바이러스 입자를 제조하는데 사용된 박테리오파지, 및 박테리아 바이러스 입자는 페이로드를 특이적으로 전달하기 위해 당업자에게 공지된 그들의 특별한 스펙트럼에 따라서 혐기성 박테리아를 표적화 (예를 들어, 특이적으로 표적화)할 수 있다.
일부 구현예에서, 표적화된 박테리아 세포는, 제한없이, 박테로이데스 파에시스 (Bacteroides faecis), 박테로이데스 세타이오타오미크론 (Bacteroides thetaiotaomicron), 박테로이데스 프라질리스 (Bacteroides fragilis), 박테로이데스 디스타소니스 (Bacteroides distasonis), 박테로이데스 불가투스 (Bacteroides vulgatus), 클로스트리듐 렙툼 (Clostridium leptum), 클로스트리듐 코코이데스 (Clostridium coccoides), 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 클로스트리듐 부티리쿰 (Clostridium butyricum), 브레비박테리움 락토퍼멘툼 (Brevibacterium lactofermentum), 스트렙토코쿠스 아갈락티아에 (Streptococcus agalactiae), 락토코쿠스 락티스 (Lactococcus lactis), 류코노스톡 락티스 (Leuconostoc lactis), 악티노바실러스 악티노비세템코미탄스 (Actinobacillus actinobycetemcomitans), 시아노박테리아 (cyanobacteria), 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 헬리코박터 피롤리 (Helicobacter pylori), 셀노모나스 루미나티움 (Selnomonas ruminatium), 시겔라 소네이 (Shigella sonnei), 자이모모나스 모빌리스 (Zymomonas mobilis), 마이코플라스마 마이코이데스 (Mycoplasma mycoides), 트레포네마 덴티콜라 (Treponema denticola), 바실러스 투린지엔시스 (Bacillus thuringiensis), 스타필로코쿠스 루그두넨시스 (Staphilococcus lugdunensis), 류코노스톡 오에노스 (Leuconostoc oenos), 코리네박테리움 세로시스 (Corynebacterium xerosis), 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 카세이 (Lactobacillus casei), 락토바실러스 악시도필러스 (Lactobacillus acidophilus), 엔테로코쿠스 패칼리스 (Enterococcus faecalis), 바실러스 코아굴란스 (Bacillus coagulans), 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus), 바실러스 포필라에 (Bacillus popillae), 시네코시스티스 (Synechocystis) 균주 PCC6803, 바실러스 리퀘파시엔스 (Bacillus liquefaciens), 파이로코쿠스 아비시 (Pyrococcus abyssi), 셀레노모나스 노미난티움 (Selenomonas nominantium), 락토바실러스 힐가르디이 (Lactobacillus hilgardii), 스트렙토코쿠스 페루스 (Streptococcus ferus), 락토바실러스 펜토서스 (Lactobacillus pentosus), 박테로이데스 프라질리스 (Bacteroides fragilis), 스타필로코쿠스 에피더미디스 (Staphylococcus epidermidis), 스트렙토마이세스 파에크로모게네스 (Streptomyces phaechromogenes), 스트렙토마이세스 가나에니스 (Streptomyces ghanaenis), 클렙시엘라 뉴모니아에 (Klebsiella pneumoniae), 엔테로박터 클로아카에 (Enterobacter cloacae), 엔테로박터 아에로게네스 (Enterobacter aerogenes), 세라티아 마르세센스 (Serratia marcescens), 모르가넬라 모르가니이 (Morganella morganii), 시트로박터 프레운디이 (Citrobacter freundii), 프로피오니박테리움 프로이덴레이키이 (Propionibacterium freudenreichii), 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aerigunosa), 파르비모나스 미크라 (Parvimonas micra), 프레보텔라 인테르메디아 (Prevotella intermedia), 푸소박테리움 뉴클레아툼 (Fusobacterium nucleatum), 프레보텔라 니그레센스 (Prevotella nigrescens), 악티노마이세스 이스라엘리이 (Actinomyces israelii), 포르피로모나스 엔도돈탈리스 (Porphyromonas endodontalis), 포르피로모나스 진지발리스 (Porphyromonas gingivalis), 미크로코쿠스 루테우스 (Micrococcus luteus), 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium), 아에로모나스 히드로필라 (Aeromonas hydrophila), 아에로모나스 카비아에 (Aeromonas caviae), 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis), 바르토넬라 헨셀라에 (Bartonella henselae), 바르토넬라 퀸타나 (Bartonella Quintana), 보르데텔라 퍼투시스 (Bordetella pertussis), 보렐리아 부르그도르페리 (Borrelia burgdorferi), 보렐리아 가리니이 (Borrelia garinii), 보렐리아 아프젤리이 (Borrelia afzelii), 보렐리아 레쿠렌티스 (Borrelia recurrentis), 브루셀라 아보르투스 (Brucella abortus), 브루셀라 카니스 (Brucella canis), 브루셀라 멜리텐시스 (Brucella melitensis), 브루셀라 수이스 (Brucella suis), 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni), 캄필로박터 콜라이 (Campylobacter coli), 캄필로박터 페투스 (Campylobacter fetus), 클라미디아 뉴모니아에 (Chlamydia pneumoniae), 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis), 클라미도필라 프시타시 (Chlamydophila psittaci), 클로스트리듐 보툴리눔 (Clostridium botulinum), 클로스트리듐 디피실 (Clostridium difficile), 클로스트리듐 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens), 클로스트리듐 테타니 (Clostridium tetani), 코리네박테리움 디프테리아 (Corynebacterium diphtheria), 쿠티박테리움 아크네스 (Cutibacterium acnes) (이전명 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionibacterium acnes)), 에를리키아 카니스 (Ehrlichia canis), 에를리키아 카페엔시스 (Ehrlichia chaffeensis), 엔테로코쿠스 패시움 (Enterococcus faecium), 프란시셀라 툴라렌시스 (Francisella tularensis), 해모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenza), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 렙토스피라 인테로간스 (Leptospira interrogans), 렙토스피라 산타로사이 (Leptospira santarosai), 렙토스피라 웨일리이 (Leptospira weilii), 렙토스피라 노구치이 (Leptospira noguchii), 리스테리아 모노시토게네스 (Listeria monocytogenes), 마이코박테리움 레프라에 (Mycobacterium leprae), 마이코박테리움 튜버큘로시스 (Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 울세란스 (Mycobacterium ulcerans), 마이코플라스마 뉴모니아 (Mycoplasma pneumonia), 네이세리아 모노로에아에 (Neisseria gonorrhoeae), 네이세리아 메닌지티데스 (Neisseria meningitides), 노카르디아 아스테로이드스 (Nocardia asteroids), 리켓치아 리켓치아 (Rickettsia rickettsia), 살모넬라 엔테리티디스 (Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피 (Salmonella typhi), 살모넬라 파라티피 (Salmonella paratyphi), 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium), 시겔라 플레스네리이 (Shigella flexnerii), 시겔라 디센테리아에 (Shigella dysenteriae), 스타필로코쿠스 사프로피티쿠스 (Staphylococcus saprophyticus), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 (Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코쿠스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes), 카르드네렐라 바지날리스 (Gardnerella vaginalis), 스트렙토코쿠스 비리단스 (Streptococcus viridans), 트레포네마 팔리둠 (Treponema pallidum), 우레아플라스마 우레알리티쿰 (Ureaplasma urealyticum), 비브리오 콜레라 (Vibrio cholera), 비브리오 파라해몰리티쿠스 (Vibrio parahaemolyticus), 여시니아 페스티스 (Yersinia pestis), 여시니아 엔테로콜리티카 (Yersinia enterocolitica), 여시니아 슈도튜버큘로시스 (Yersinia pseudotuberculosis), 악티노박터 바우만니이 (Actinobacter baumanii), 슈도모나스 애리구노사 (Pseudomonas aerigunosa), 및 이의 혼합물이고, 바람직하게 관심 박테리아는 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 엔테로코쿠스 패시움 (Enterococcus faecium), 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 클렙시엘라 뉴모니아에 (Klebsiella pneumoniae), 아시네토박터 바우마니이 (Acinetobacter baumanii), 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 엔테로박터 클로아카에 (Enterobacter cloacae), 및 엔테로박터 아에로게네스 (Enterobacter aerogenes), 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 표적화된 박테리아 세포는, 제한없이, 아나에로트룬쿠스 (Anaerotruncus), 아세타나에로박테리움 (Acetanaerobacterium), 아세티토마쿨룸 (Acetitomaculum), 아세티비브리오 (Acetivibrio), 아나에로코쿠스 (Anaerococcus), 아나에로필룸 (Anaerofilum), 아나에로시누스 (Anaerosinus), 아나에로스티페스 (Anaerostipes), 아나에로보락스 (Anaerovorax), 부티리비브리오 (Butyrivibrio), 클로스트리듐 (Clostridium), 카프라코쿠스 (Capracoccus), 데할로박터 (Dehalobacter), 디알리스터 (Dialister), 도레아 (Dorea), 엔테로코쿠스 (Enterococcus), 에타놀리게네스 (Ethanoligenens), 파에칼리박테리움 (Faecalibacterium), 푸소박테리움 (Fusobacterium), 크라실리박터 (Gracilibacter), 구겐헤이멜라 (Guggenheimella), 헤스펠리아 (Hespellia), 라크노박테리움 (Lachnobacterium), 라크노스피라 (Lachnospira), 락토바실러스 (Lactobacillus), 류코노스톡 (Leuconostoc), 메가모나스 (Megamonas), 모리엘라 (Moryella), 미추오켈라 (Mitsuokella), 오리박테리움 (Oribacterium), 옥소박터 (Oxobacter), 파필리박터 (Papillibacter), 프로프리오니스피라 (Proprionispira), 슈도부티리비브리오 (Pseudobutyrivibrio), 슈도라미박터 (Pseudoramibacter), 로세부리아 (Roseburia), 루미노코쿠스 (Ruminococcus), 사르시나 (Sarcina), 세이노넬라 (Seinonella), 셔틀워티아 (Shuttleworthia), 스포로박터 (Sporobacter), 스포로박테리움 (Sporobacterium), 스트렙토코쿠스 (Streptococcus), 서브돌리그라눌룸 (Subdoligranulum), 신트로포코쿠스 (Syntrophococcus), 써모바실러스 (Thermobacillus), 투리박터 (Turibacter), 웨이셀라 (Weisella), 클로스트리듐 (Clostridium), 박테로이데스 (Bacteroides), 루미노코쿠스 (Ruminococcus), 파에칼리박테리움 (Faecalibacterium), 트레포네마 (Treponema), 파스콜락토박테리움 (Phascolarctobacterium), 메가스파에라 (Megasphaera), 파에칼리박테리움 (Faecalibacterium), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 락토바실러스 (Lactobacillus), 수터렐라 (Sutterella), 및/또는 프레보텔라 (Prevotella)이다.
다른 구현예에서, 표적화된 박테리아 세포는, 제한없이, 아크로모박터 자일로속시단스 (Achromobacter xylosoxidans), 아시다미노코쿠스 퍼멘탄스 (Acidaminococcus fermentans), 아시다미노코쿠스 인테스티니 (Acidaminococcus intestini), 아시다미노코쿠스 (Acidaminococcus) sp., 아시네토박터 바우만니이 (Acinetobacter baumannii), 아시네토박터 주니이 (Acinetobacter junii), 아시네토박터 로피이 (Acinetobacter lwoffii), 악티노바실러스 캅술라투스 (Actinobacillus capsulatus), 악티노마이세스 나에슬룬디이 (Actinomyces naeslundii), 악티노마이세스 네우이이 (Actinomyces neuii), 악티노마이세스 오돈톨리티쿠스 (Actinomyces odontolyticus), 악티노마이세스 라딘가에 (Actinomyces radingae), 아들러크루트지아 에쿠올리파시엔스 (Adlercreutzia equolifaciens), 아에로미크로비움 마실리엔스 (Aeromicrobium massiliense), 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans), 아가커만시아 무시니필라 (Akkermansia muciniphila), 알리아가리보란스 마리누스 (Aliagarivorans marinus), 알리스티페스 피네골디이 (Alistipes finegoldii), 알리스티페스 인디스팅투스 (Alistipes indistinctus), 알리스티페스 이놉스 (Alistipes inops), 알리스티페스 온데돈키이 (Alistipes onderdonkii), 알리스티페스 푸트레디니스 (Alistipes putredinis), 알리스티페스 세네갈렌시스 (Alistipes senegalensis), 알리스티페스 샤히이 (Alistipes shahii), 알리스티페스 티모넨시스 (Alistipes timonensis), 알로스카르도비아 옴니콜렌스 (Alloscardovia omnicolens), 아나에로박터 폴리엔도스포루스 (Anaerobacter polyendosporus), 아나에로바쿨룸 히드로게니포르만스 (Anaerobaculum hydrogeniformans), 아나에로코쿠스 히드로게날리스 (Anaerococcus hydrogenalis), 아나에로코쿠스 프레보티이 (Anaerococcus prevotii), 아나에로코쿠스 세네갈렌시스 (Anaerococcus senegalensis), 아나에로푸스티스 스테르코리호미니스 (Anaerofustis stercorihominis), 아나에로스티페스 카카에 (Anaerostipes caccae), 아나에로스티페스 하드루스 (Anaerostipes hadrus), 아나에로트룬쿠스 콜리호미니스 (Anaerotruncus colihominis), 아네우리니바실러스 아네우리닐리티쿠스 (Aneurinibacillus aneurinilyticus), 바실러스 리케니포르미스 (Bacillus licheniformis), 바실러스 마실리오아노렉시우스 (Bacillus massilioanorexius), 바실러스 마실리오세네갈렌시스 (Bacillus massiliosenegalensis), 바실러스 심플렉스 (Bacillus simplex), 바실러스 스미티이 (Bacillus smithii), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 투린지엔시스 (Bacillus thuringiensis), 바실러스 티모넨시스 (Bacillus timonensis), 박테로이데스 자일라니솔벤스 (Bacteriodes xylanisolvens), 박테로이데스 악시디파시엔스 (Bacteroides acidifaciens), 박테로이데스 카카에 (Bacteroides caccae), 박테로이데스 카필로수스 (Bacteroides capillosus), 박테로이데스 셀룰로실리티쿠스 (Bacteroides cellulosilyticus), 박테로이데스 클라루스 (Bacteroides clarus), 박테로이데스 코프로콜라 (Bacteroides coprocola), 박테로이데스 코프로필루스 (Bacteroides coprophilus), 박테로이데스 도레이 (Bacteroides dorei), 박테로이데스 에게르티이 (Bacteroides eggerthii), 박테로이데스 파에시스 (Bacteroides faecis), 박테로이데스 피네골디이 (Bacteroides finegoldii), 박테로이데스 플룩수스 (Bacteroides fluxus), 박테로이데스 프라질리스 (Bacteroides fragilis), 박테로이데스 갈리나룸 (Bacteroides gallinarum), 박테로이데스 인테스티날리스 (Bacteroides intestinalis), 박테로이데스 노르디이 (Bacteroides nordii), 박테로이데스 올레이시플레누스 (Bacteroides oleiciplenus), 박테로이데스 오바투스 (Bacteroides ovatus), 박테로이데스 펙티노필루스 (Bacteroides pectinophilus), 박테로이데스 플레베이우스 (Bacteroides plebeius), 박테로이데스 살라니트로니스 (Bacteroides salanitronis), 박테로이데스 살리에르시아에 (Bacteroides salyersiae), 박테로이데스 (Bacteroides) sp., 박테로이데스 스테르코리스 (Bacteroides stercoris), 박테로이데스 세타이오타오미크론 (Bacteroides thetaiotaomicron), 박테로이데스 유니포르미스 (Bacteroides uniformis), 박테로이데스 불가투스 (Bacteroides vulgatus), 박테로이데스 자이라니솔벤스 (Bacteroides xylanisolvens), 박테로이데스 펙티노필루스 (Bacteroides pectinophilus) ATCC, 바르네시엘라 인테스티니호미니스 (Barnesiella intestinihominis), 바바리이코쿠스 세일레리 (Bavariicoccus seileri), 비피도박테리움 아돌레센티스 (Bifidobacterium adolescentis), 비피도박테리움 안굴라툼 (Bifidobacterium angulatum), 비피도박테리움 아니말리스 (Bifidobacterium animalis), 비피도박테리움 비피둠 (Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 브레베 (Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 카테눌라툼 (Bifidobacterium catenulatum), 비피도박테리움 덴티움 (Bifidobacterium dentium), 비피도박테리움 갈리쿰 (Bifidobacterium gallicum), 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 (Bifidobacterium pseudocatenulatum), 비피도박테리움 스테르코리스 (Bifidobacterium stercoris), 빌로필라 와드스워티아 (Bilophila wadsworthia), 블라우티아 파에시스 (Blautia faecis), 블라우티아 한세니이 (Blautia hansenii), 블라우티아 히드로게노트로피카 (Blautia Hydrogenotrophica), 블라우티아 루티 (Blautia luti), 블라우티아 오베움 (Blautia obeum), 블라우티아 프로덕타 (Blautia producta), 블라우티아 웩슬레라에 (Blautia wexlerae), 브라키모나스 키로노미 (Brachymonas chironomi), 브레비박테리움 세네갈렌스 (Brevibacterium senegalense), 브리안텔라 포르마텍시겐스 ( Bryantella formatexigens), 부티레이트-생성 박테리움, 부티리시코쿠스 풀리카에코룸 (Butyricicoccus pullicaecorum), 부티리시모나스 비로사 (Butyricimonas virosa), 부티리비브리오 크로소투스 (Butyrivibrio crossotus), 부티리비브리오 피브리솔벤스 (Butyrivibrio fibrisolvens), 칼디코프로박터 파에칼리스 (Caldicoprobacter faecalis), 캄필로박터 콘시수스 (Campylobacter concisus), 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni), 캄필로박터 웁살리엔시스 (Campylobacter upsaliensis), 카테니박테리움 미추오카이 (Catenibacterium mitsuokai), 세데세아 다비사에 (Cedecea davisae), 셀룰로모나스 마실리엔시스 (Cellulomonas massiliensis), 세토박테리움 소메라에 (Cetobacterium somerae), 시트로박터 브라아키이 (Citrobacter braakii), 시트로박터 프레운디이 (Citrobacter freundii), 시트로박터 파스테우리이 (Citrobacter pasteurii), 시트로박터 (Citrobacter) sp., 시트로박터 윤가에 (Citrobacter youngae), 클로아시바실러스 에브리엔시스 (Cloacibacillus evryensis), 클로스트리디알레스 (Clostridiales) 박테리움, 클로스트리디오이데스 디피실 (Clostridioides difficile), 클로스트리듐 아스파라기포르메 (Clostridium asparagiforme), 클로스트리듐 바틀레티이 (Clostridium bartlettii), 클로스트리듐 볼리비엔시스 (Clostridium boliviensis), 클로스트리듐 볼테아에 (Clostridium bolteae), 클로스트리듐 하테와이이 (Clostridium hathewayi), 클로스트리듐 히라노니스 (Clostridium hiranonis), 클로스트리듐 힐레모나에 (Clostridium hylemonae), 클로스트리듐 렙툼 (Clostridium leptum), 클로스트리듐 메틸펜토숨 (Clostridium methylpentosum), 클로스트리듐 넥실 (Clostridium nexile), 클로스트리듐 오르비신덴스 (Clostridium orbiscindens), 클로스트리듐 라모숨 (Clostridium ramosum), 클로스트리듐 신덴스 (Clostridium scindens), 클로스트리듐 (Clostridium) sp, 클로스트리듐 (Clostridium) sp., 클로스트리듐 스피로포르메 (Clostridium spiroforme), 클로스트리듐 스포로게네스 (Clostridium sporogenes), 클로스트리듐 심비오숨 (Clostridium symbiosum), 콜린셀라 아에로파시엔스 (Collinsella aerofaciens), 콜린셀라 인테스티날리스 (Collinsella intestinalis), 콜린셀라 스테르코리스 (Collinsella stercoris), 콜린셀라 타나카에이 (Collinsella tanakaei), 코프로바실러스 카테니포르미스 (Coprobacillus cateniformis), 코프로박터 파스티디오수스 (Coprobacter fastidiosus), 코프로코쿠스 카투스 (Coprococcus catus), 코프로코쿠스 코메스 (Coprococcus comes), 코프로코쿠스 유탁투스 (Coprococcus eutactus), 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 아미콜라툼 (Corynebacterium amycolatum), 코리네박테리움 슈도디프테리티쿰 (Corynebacterium pseudodiphtheriticum), 쿠티박테리움 아크네스 (Cutibacterium acnes), 더마박터 호미니스 (Dermabacter hominis), 데술피토박테리움 하프니엔스 (Desulfitobacterium hafniense), 데술포비브리오 파일피엘덴시스 (Desulfovibrio fairfieldensis), 데술포비브리오 피거 (Desulfovibrio piger), 디알리스터 숙시나티필루스 (Dialister succinatiphilus), 디엘마 파스티디오사 (Dielma fastidiosa), 도레아 포르미시게네란스 (Dorea formicigenerans), 도레아 론지카테나 (Dorea longicatena), 디스고노모나스 카프노시토파고이데스 (Dysgonomonas capnocytophagoides), 디스고노모나스 가데이 (Dysgonomonas gadei), 디스고노모나스 모시이 (Dysgonomonas mossii), 에드워드시엘라 타르다 (Edwardsiella tarda), 에게르텔라 렌타 (Eggerthella lenta), 데이센베르기엘라 타이이 (Eisenbergiella tayi), 에노르마 마실리엔시스 (Enorma massiliensis), 엔테로박터 아에로게네스 (Enterobacter aerogenes), 엔테로박터 아스부리아에 (Enterobacter asburiae), 엔테로박터 칸세로게누스 (Enterobacter cancerogenus), 엔테로박터 클로아카에 (Enterobacter cloacae), 엔테로박터 마실리엔시스 (Enterobacter massiliensis), 엔테로코쿠스 카셀리플라부스 (Enterococcus casseliflavus), 엔테로코쿠스 두란스 (Enterococcus durans), 엔테로코쿠스 패칼리스 (Enterococcus faecalis), 엔테로코쿠스 패시움 (Enterococcus faecium), 엔테로코쿠스 플라베센스 (Enterococcus flavescens), 엔테로코쿠스 갈리나룸 (Enterococcus gallinarum), 엔테로코쿠스 (Enterococcus) sp., 엔테로비브리오 니그리칸스 (Enterovibrio nigricans), 에리시펠라토클로스트리듐 라모숨 ( Erysipelatoclostridium ramosum), 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 에스케리치아 (Escherichia) sp., 유박테리움 비포르메 (Eubacterium biforme), 유박테리움 돌리쿰 (Eubacterium dolichum), 유박테리움 할리이 (Eubacterium hallii), 유박테리움 리모숨 (Eubacterium limosum), 유박테리움 라물루스 (Eubacterium ramulus), 유박테리움 렉탈레 (Eubacterium rectale), 유박테리움 시라에움 (Eubacterium siraeum), 유박테리움 벤트리오숨 (Eubacterium ventriosum), 엑시구오박테리움 마리눔 (Exiguobacterium marinum), 엑시구오박테리움 운다에 (Exiguobacterium undae), 파에칼리박테리움 (Faecalibacterium) cf, 파에칼리박테리움 프라우스니트지이 (Faecalibacterium prausnitzii), 파에칼리탈레아 시린드로이데스 (Faecalitalea cylindroides), 페리모나스 발레아리카 (Ferrimonas balearica), 피네골디아 마그나 (Finegoldia magna), 플라보박테리움 대전넨스 (Flavobacterium daejeonense), 플라보니프락토르 플라우티이 (Flavonifractor plautii), 푸시카테니박터 사카리보란스 (Fusicatenibacter saccharivorans), 푸소박테리움 고니디아포르만스 (Fusobacterium gonidiaformans), 푸소박테리움 모르티페룸 (Fusobacterium mortiferum), 푸소박테리움 네크로포룸 (Fusobacterium necrophorum), 푸소박테리움 뉴클레아툼 (Fusobacterium nucleatum), 푸소박테리움 페리오돈티쿰 (Fusobacterium periodonticum), 푸소박테리움 (Fusobacterium) sp., 푸소박테리움 울세란스 (Fusobacterium ulcerans), 푸소박테리움 바리움 (Fusobacterium varium), 갈리박테리움 아나티스 (Gallibacterium anatis), 겜미거 포르미실리스 (Gemmiger formicilis), 고르도니박터 파멜라에아에 (Gordonibacter pamelaeae), 하프니아 알베이 (Hafnia alvei), 헬리코박터 빌리스 (Helicobacter bilis), 헬리코박터 빌스 (Helicobacter bills), 헬리코박터 카나덴시스 (Helicobacter canadensis), 헬리코박터 카니스 (Helicobacter canis), 헬리코박터 시나에디 (Helicobacter cinaedi), 헬리코박터 마카카에 (Helicobacter macacae), 헬리코박터 파메텐시스 (Helicobacter pametensis), 헬리코박터 풀로룸 (Helicobacter pullorum), 헬리코박터 피롤리 (Helicobacter pylori), 헬리코박터 로덴티움 (Helicobacter rodentium), 헬리코박터 윙하멘시스 (Helicobacter winghamensis), 허바스피릴룸 마실리엔스 (Herbaspirillum massiliense), 홀더마넬라 비포르미스 (Holdemanella biformis), 홀데마니아 프디포르미드 (Holdemania fdiformis), 홀데마니아 필리포르미스 (Holdemania filiformis), 홀데마니아 마실리엔시스 (Holdemania massiliensis), 홀데마니아 필리포르미스 (Holdemania filiformis), 훈가텔라 하테와이 (Hungatella hathewayi), 인테스티니박터 바틀티 (Intestinibacter bartlettii), 인테스티니모나스 부티리시프로두센스 (Intestinimonas butyriciproducens), 클렙시엘라 옥시토카 (Klebsiella oxytoca), 클렙시엘라 뉴모니아에 (Klebsiella pneumoniae), 커티아 마실리엔시스 (Kurthia massiliensis), 라크노스피라 펙티노스키자 (Lachnospira pectinoschiza), 락토바실러스 악시도필루스 (Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 아밀로리티쿠스 (Lactobacillus amylolyticus), 락토바실러스 아미날리스 (Lactobacillus animalis), 락토바실러스 안트리 (Lactobacillus antri), 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis), 락토바실러스 부크네리 (Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 카세이 (Lactobacillus casei), 락토바실러스 커바투스 (Lactobacillus curvatus), 락토바실러스 델브루엑키이 (Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 퍼멘툼 (Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 가세리 (Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 헬베티쿠스 (Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 힐가르디이 (Lactobacillus hilgardii), 락토바실러스 이네르스 (Lactobacillus iners), 락토바실러스 인테스티날리스 (Lactobacillus intestinalis), 락토바실러스 존소니이 (Lactobacillus johnsonii), 락토바실러스 무리누스 (Lactobacillus murinus), 락토바실러스 파라카세이 (Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 플란타럼 (Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 레우테리 (Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 루미니스 (Lactobacillus ruminis), 락토바실러스 사케이 (Lactobacillus sakei), 락토바실러스 살리바리우스 (Lactobacillus salivarius), 락토바실러스 울투넨시스 (Lactobacillus ultunensis), 락토바실러스 바지날리스 (Lactobacillus vaginalis), 락토바실러스 플란타럼 (Lactobacillus plantarum) subsp., 류코노스톡 메센테로이데스 (Leuconostoc mesenteroides), 류코노스톡 슈도메센테로이데스 (Leuconostoc pseudomesenteroides), 리스테리아 그라이 (Listeria grayi), 리스테리아 이노쿠아 (Listeria innocua), 만헤이미아 그라눌로마티스 (Mannheimia granulomatis), 마빈브리안티아 포르마텍시겐스 (Marvinbryantia formatexigens),메가모나스 푸니포르미스 (Megamonas funiformis), 메가모나스 히퍼메갈 (Megamonas hypermegal), 메타노브레비박터 스미티이 (Methanobrevibacter smithii), 메타노브레비박터 스미티이 (Methanobrevibacter smithii) Fl, 미크로코쿠스 루테우스 (Micrococcus luteus), 미크로비르굴라 아에로데니트리피칸스 (Microvirgula aerodenitrificans), 미츠오켈라 잘랄루디니이 (Mitsuokella jalaludinii), 미츠오켈라 물타시다 (Mitsuokella multacida), 몰리쿠테스 (Mollicutes) 박테리움, 무리모나스 인테스티니 (Murimonas intestini), 네이세리아 마카카에 (Neisseria macacae), 니트릴리룹토르 알칼리필루스 (Nitriliruptor alkaliphilus), 오세아노바실러스 마실리엔시스 (Oceanobacillus massiliensis), 오도리박터 라네우스 (Odoribacter laneus), 오도리박터 스플란크니쿠스 (Odoribacter splanchnicus), 오르니토박테리움 리노트라케알레 (Ornithobacterium rhinotracheale), 옥살로박터 포르미게네스 (Oxalobacter formigenes), 파에니바실러스 바렌골트지이 (Paenibacillus barengoltzii), 파에니바실러스 키티놀리티쿠스 (Paenibacillus chitinolyticus), 파에니바실러스 라우투스 (Paenibacillus lautus), 파에니바실러스 모토부엔시스 (Paenibacillus motobuensis), 바에니바실러스 세네갈렌시스 (Paenibacillus senegalensis), 파에니스포로사르시나 퀴스퀼리아룸 (Paenisporosarcina quisquiliarum), 파라박테로이데스 디스타소니스 (Parabacteroides distasonis), 파라박테로이데스 골드스테이니이 (Parabacteroides goldsteinii), 파라박테로이데스 고르도니이 (Parabacteroides gordonii), 파라박테로이데스 존소니이 (Parabacteroides johnsonii), 파라박테로이데스 메르다에 (Parabacteroides merdae), 파라프레보텔라 자일라니필라 (Paraprevotella xylaniphila), 파라수테렐라 엑스크레멘티호미니스 (Parasutterella excrementihominis), 파르비모나스 미크라 (Parvimonas micra), 페디오코쿠스 아시딜락티시 (Pediococcus acidilactici), 펩토클로스트리듐 디피실 (Peptoclostridium difficile), 펩토니필루스 하레이 (Peptoniphilus harei), 펩토니필루스 오베시 (Peptoniphilus obesi), 펩토니필루스 세네갈렌시스 (Peptoniphilus senegalensis), 펩토니필루스 티모넨시스 (Peptoniphilus timonensis), 파스콜락토박테리움 숙시나투텐스 (Phascolarctobacterium succinatutens), 포르피로모나스 아사카롤리티카 (Porphyromonas asaccharolytica), 포르피로모나스 유에노니스 (Porphyromonas uenonis), 프레보텔라 바로니아에 (Prevotella baroniae), 프레보텔라 비비아 (Prevotella bivia), 프레보텔라 코프리 (Prevotella copri), 프레보텔라 덴탈리스 (Prevotella dentalis), 프레보텔라 미칸스 (Prevotella micans), 프레보텔라 멀티사카리보락스 (Prevotella multisaccharivorax), 프레보텔라 오랄리스 (Prevotella oralis), 프레보텔라 살리바에 (Prevotella salivae), 프레보텔라 스테르코레아 (Prevotella stercorea), 프레보텔라 베로랄리스 (Prevotella veroralis), 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionibacterium acnes), 프로피오니박테리움 아비둠 (Propionibacterium avidum), 프로피오니박테리움 프로이덴레이키이 (Propionibacterium freudenreichii), 프로피오니미크로비움 림포필룸 (Propionimicrobium lymphophilum), 프로테우스 미라빌리스 (Proteus mirabilis), 프로테우스페네리 (Proteuspenneri) ATCC, 프로비덴시아 알칼리파시엔스 (Providencia alcalifaciens), 프로비덴시아 레트게리 (Providencia rettgeri), 프로비덴시아 루스티지아니이 (Providencia rustigianii), 프로비덴시아 스투아르티이 (Providencia stuartii), 슈도플라보니프락토르 카필로수스 (Pseudoflavonifractor capillosus), 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 루테올라 (Pseudomonas luteola), 랄스토니아 픽케티이 (Ralstonia pickettii), 레인헤이메라 퍼루시다 (Rheinheimera perlucida), 레인헤이메라 텍사센시스 (Rheinheimera texasensis), 리에메렐라 콜룸비나 (Riemerella columbina), 롬보우트시아 리투세부렌시스 (Romboutsia lituseburensis), 로세부리아 파에시스 (Roseburia faecis), 로세부리아 인테스티날리스 (Roseburia intestinalis), 로세부리아 이눌리니보란스 (Roseburia inulinivorans), 루미노코쿠스 비실쿠란스 (Ruminococcus bicirculans), 루미노코쿠스 브로미이 (Ruminococcus bromii), 루미노코쿠스 칼리두스 (Ruminococcus callidus), 루미노코쿠스 캄파넬렌시스 (Ruminococcus champanellensis), 루미노코쿠스 파에시스 (Ruminococcus faecis), 루미노코쿠스 그나부스 (Ruminococcus gnavus), 루미노코쿠스 락타리스 (Ruminococcus lactaris), 루미노코쿠스 오베움 (Ruminococcus obeum), 루미노코쿠스 (Ruminococcus) sp, 루미노코쿠스 (Ruminococcus) sp., 루미노코쿠스 토르케스 (Ruminococcus torques), 사르시나 벤트리쿨리 (Sarcina ventriculi), 셀리모나스 인테스티날리스 (Sellimonas intestinalis), 세네갈리마실리아 아나에로비아 (Senegalimassilia anaerobia), 시겔라 손네이 (Shigella sonnei), 슬락키아 피리포르미스 (Slackia piriformis), 스타필로코쿠스 에피더미디스 (Staphylococcus epidermidis), 스타필로코쿠스 렌투스 (Staphylococcus lentus), 스타필로코쿠스 네팔렌시스 (Staphylococcus nepalensis), 스타필로코쿠스 슈딘테르메디우스 (Staphylococcus pseudintermedius), 스타필로코쿠스 자일로수스 (Staphylococcus xylosus), 스테노트로포모나스 말토필리아 (Stenotrophomonas maltophilia), 스트렙토코쿠스 아갈락티아에 (Streptococcus agalactiae), 스트렙토코쿠스 안지노수스 (Streptococcus anginosus), 스트렙토코쿠스 아우스트랄리스 (Streptococcus australis), 스트렙토코쿠스 카발리 (Streptococcus caballi), 스트렙토코쿠스 카스토레우스 (Streptococcus castoreus), 스트렙토코쿠스 디델피스 (Streptococcus didelphis), 스트렙토코쿠스 에퀴누스 (Streptococcus equinus), 스트렙토코쿠스 고르도니이 (Streptococcus gordonii), 스트렙토코쿠스 헨리이 (Streptococcus henryi), 스트렙토코쿠스 히요바지날리스 (Streptococcus hyovaginalis), 스트렙토코쿠스 인판타리우스 (Streptococcus infantarius), 스트렙토코쿠스 인판티스 (Streptococcus infantis), 스트렙토코쿠스 루테티엔시스 (Streptococcus lutetiensis), 스트렙토코쿠스 메리오니스 (Streptococcus merionis), 스트렙토코쿠스 미티스 (Streptococcus mitis), 스트렙토코쿠스 뮤탄스 (Streptococcus mutans), 스트렙토코쿠스 오랄리스 (Streptococcus oralis), 스트렙토코쿠스 오비스 (Streptococcus ovis), 스트렙토코쿠스 파라산퀴니스 (Streptococcus parasanguinis), 스트렙토코쿠스 플루렉스토룸 (Streptococcus plurextorum), 스트렙토코쿠스 포르시 (Streptococcus porci), 스트렙토코쿠스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes), 스트렙토코쿠스 살리바리우스 (Streptococcus salivarius), 스트렙토코쿠스 소브리누스 (Streptococcus sobrinus), 스트렙토코쿠스 써모필루스 (Streptococcus thermophilus), 스트렙토코쿠스 토랄텐시스 (Streptococcus thoraltensis), 스트렙토카이세스 알부스 (Streptomyces albus), 서브돌리그라눌룸 바리아빌 (Subdoligranulum variabile), 숙시나티모나스 히페이 (Succinatimonas hippei), 수테렐라 파르비루브라 (Sutterella parvirubra), 수테렐라 와드스워텐시스 (Sutterella wadsworthensis), 테리스포로박터 글리콜리쿠스 (Terrisporobacter glycolicus), 테리스포로박터 마이옴베이 (Terrisporobacter mayombei), 탈라소바실러스 데보란스 (Thalassobacillus devorans), 티모넬라 세네갈렌시스 (Timonella senegalensis), 투리시박터 산귀니스 (Turicibacter sanguinis), 불명 sp, 불명 sp., 바리바쿨룸 캄브리엔스 (Varibaculum cambriense), 베일로넬라 아티피카 (Veillonella atypica), 베일로넬라 디스파르 (Veillonella dispar), 베일로넬라 파르불라 (Veillonella parvula), 비브리오 신신나티엔시스 (Vibrio cincinnatiensis), 비르지바실러스 살렉시겐스 (Virgibacillus salexigens), 및 (Weissella paramesenteroides)이다.
다른 구현예에서, 표적화된 박테리아 세포는 피부 미생물총에서 통상적으로 발견되는 것들이고, 제한없이 아세토박터 파리날리스 (Acetobacter farinalis), 아세토박터 말로룸 (Acetobacter malorum), 아세토박터 올레아넨시스 (Acetobacter orleanensis), 아세토박터 시세라에 (Acetobacter sicerae), 아크로모박터 안시퍼 (Achromobacter anxifer), 아크로모박터 데니트리피칸스 (Achromobacter denitrificans), 아크로모박터 마르플라텐시스 (Achromobacter marplatensis), 아크로모박터 스파니우스 (Achromobacter spanius), 아크로모박터 자일로속시단스 (Achromobacter xylosoxidans) subsp. 자일로속시단스 (xylosoxidans), 악시도보락스 콘자시 (Acidovorax konjaci), 악시도보락스 라시디스 (Acidovorax radicis), 아시네토박터 존소니이 (Acinetobacter johnsonii), 악티노마두라 시트레아 (Actinomadura citrea), 악티노마두라 코에룰레아 (Actinomadura coerulea), 악티노마두라 피브로사 (Actinomadura fibrosa), 악티노마두라 풀베센스 (Actinomadura fulvescens), 악티노마두라 지아오헤엔시스 (Actinomadura jiaoheensis), 악티노마두라 루테오플루오레센스 (Actinomadura luteofluorescens), 악티노마두라 멕시카나 (Actinomadura mexicana), 악티노마두라 니트리티게네스 (Actinomadura nitritigenes), 악티노마두라 베루코소스포라 (Actinomadura verrucosospora), 악티노마두라 유마엔시스 (Actinomadura yumaensis), 악티노마이세스 오돈톨리티쿠스 (Actinomyces odontolyticus), 악티노마이세토스포라 아티피카 (Actinomycetospora atypica), 악티노마이세토스포라 코르티시콜라 (Actinomycetospora corticicola), 악티노마이세토스포라 리조필라 (Actinomycetospora rhizophila), 악티노마이세토스포라 리시리엔시스 (Actinomycetospora rishiriensis), 아에로모나스 아우스트랄리엔시스 (Aeromonas australiensis), 아에로모나스 베스티아룸 (Aeromonas bestiarum), 아에로모나스 비발비움 (Aeromonas bivalvium), 아에로모나스 엔켈레이아 (Aeromonas encheleia), 아에로모나스 유크레노필라 (Aeromonas eucrenophila), 아에로모나스 히드로필라 (Aeromonas Hydrophila) subsp. 히드로 필라 (Hydrophila), 아에로모나스 피시콜라 (Aeromonas piscicola), 아에로모나스 아에로모나스 포포피이 (Aeromonas popoffii), 아에로모나스 리불리 (Aeromonas rivuli), 아에로모나스 살모니시다 (Aeromonas salmonicida) subsp. 펙티놀리티카 (pectinolytica), 아에로모나스 살모니시다 (Aeromonas salmonicida) subsp. 스미티아 (smithia), 아마리코쿠스 카플리센시스 (Amaricoccus kaplicensis), 아마리코쿠스 베로넨시스 (Amaricoccus veronensis), 아미노박터 아가노엔시스 (Aminobacter aganoensis), 아미노박터 시세로네이 (Aminobacter ciceronei), 아미노박터 리사렌시스 (Aminobacter lissarensis), 아미노박터 니이가타엔시스 (Aminobacter niigataensis), 안실로박터 폴리모르푸스 (Ancylobacter polymorphus), 아녹시바실러스 플라비써무스 (Anoxybacillus flavithermus) subsp. 윤난넨시스 (yunnanensis), 아쿠아미크로비움 아에로라툼 (Aquamicrobium aerolatum), 아르칸지움 제피라 (Archangium gephyra), 아르칸지우 제피라 (Archangium gephyra), 아르칸지움 미누스 (Archangium minus), 아르칸지움 비오라세움 (Archangium violaceum), 아르트로박터 비스코수스 (Arthrobacter viscosus), 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis), 바실러스 아우스트랄리마리스 (Bacillus australimaris), 바실러스 드렌텐시스 (Bacillus drentensis), 바실러스 미코이데스 (Bacillus mycoides), 바실러스 슈도미코이데스 (Bacillus pseudomycoides), 바실러스 푸밀루스 (Bacillus pumilus), 바실러스 사펜시스 (Bacillus safensis), 바실러스 발리스모르티스 (Bacillus vallismortis), 보세아 티오옥시단스 (Bosea thiooxidans), 브라디리조비움 후안후아이하이엔스 (Bradyrhizobium huanghuaihaiense), 브라디리조비움 자포니쿰 (Bradyrhizobium japonicum), 브레분디모나스 아우란티아카 (Brevundimonas aurantiaca), 브레분디모나스 인테르메디아 (Brevundimonas intermedia), 버크홀데리아 아스팔라티 (Burkholderia aspalathi), 버크홀데리아 코이카 (Burkholderia choica), 버크홀데리아 코르도벤시스 (Burkholderia cordobensis), 버크홀데리아 디푸사 (Burkholderia diffusa), 버크홀데리아 인술라 (Burkholderia insulsa), 버크홀데리아 린코시아에 (Burkholderia rhynchosiae), 버크홀데리아 테레스트리스 (Burkholderia terrestris), 버크홀데리아 우데이스 (Burkholderia udeis), 부티아욱셀라 가비니아에 (Buttiauxella gaviniae), 카에니모나스 테라에 (Caenimonas terrae), 카프노시토파가 진지발리스 (Capnocytophaga gingivalis), 키티노파가 딘후엔시스 (Chitinophaga dinghuensis), 크리세오박테리움 글레움 (Chryseobacterium gleum), 크리세오박테리움 그린란덴스 (Chryseobacterium greenlandense), 크리세오박테리움 제주엔스 (Chryseobacterium jejuense), 크리세오박테리움 피스시움 (Chryseobacterium piscium), 크리세오박테리움 세디미니스 (Chryseobacterium sediminis), 크리세오박테리움 트룩타에 (Chryseobacterium tructae), 크리세오박테리움 우레일리티쿰 (Chryseobacterium ureilyticum), 크리세오박테리움 비에트나멘스 (Chryseobacterium vietnamense), 코리네박테리움 아콜렌스 (Corynebacterium accolens), 코리네박테리움 아페르멘탄스 (Corynebacterium afermentans) subsp. 리포필룸 (lipophilum), 코리네박테리움 미누티시뭄 (Corynebacterium minutissimum), 코리네박테리움 순드스발렌스 (Corynebacterium sundsvallense), 쿠프리아비두스 메탈리두란스 (Cupriavidus metallidurans), 쿠프리아비두스 난톤겐시스 (Cupriavidus nantongensis), 쿠프리아비두스 네카토르 (Cupriavidus necator), 쿠프리아비두스 팜파에 (Cupriavidus pampae), 쿠프리아비두스 연천엔시스 (Cupriavidus yeoncheonensis), 커토박테리움 플락쿰파시엔스 (Curtobacterium flaccumfaciens), 데보시아 에피더미디히루디니스 (Devosia epidermidihirudinis), 데보시아 리보플라비나 (Devosia riboflavina), 데보시아 리보플라비나 (Devosia riboflavina), 디아포로박터 오리자에 (Diaphorobacter oryzae), 디에트지아 피크랄칼리필라 (Dietzia psychralcaliphila), 엔시퍼 아드하에렌스 (Ensifer adhaerens), 엔시퍼 아메리카누스 (Ensifer americanus), 엔테로코쿠스 말로도라투스 (Enterococcus malodoratus), 엔테로코쿠스 슈도아비움 (Enterococcus pseudoavium), 엔테로코쿠스 비익키엔시스 (Enterococcus viikkiensis), 엔테로코쿠스 시안판겐시스 (Enterococcus xiangfangensis), 어위니아 라폰티시 (Erwinia rhapontici), 팔시로도박터 할로톨레란스 (Falsirhodobacter halotolerans), 팔르보박테리움 아라우카나눔 (Flavobacterium araucananum), 플라보박테리움 프리지디마리스 (Flavobacterium frigidimaris), 글루코노박터 프라테우리이 (Gluconobacter frateurii), 글루코노박터 타일란디쿠스 (Gluconobacter thailandicus), 고르도니아 알카니보란스 (Gordonia alkanivorans), 할로모나스 아쿠아마리나 (Halomonas aquamarina), 할로모나스 악시알렌시스 (Halomonas axialensis), 할로모나스 메리디아나 (Halomonas meridiana), 할로모나스 올리바리아 (Halomonas olivaria), 할로모나스 송네넨시스 (Halomonas songnenensis), 할로모나스 바리아빌리스 (Halomonas variabilis), 허바스피릴룸 클로로페놀리쿰 (Herbaspirillum chlorophenolicum), 허바스피릴룸 프리신겐스 (Herbaspirillum frisingense), 허바스피릴룸 힐트네리 (Herbaspirillum hiltneri), 허바스피릴룸 후티엔스 (Herbaspirillum huttiense) subsp. 푸테이 (putei), 허바스피릴룸 루시타눔 (Herbaspirillum lusitanum), 허미니이모나스 폰티콜라 (Herminiimonas fonticola), 히드로게노파가 인테르메디아 (Hydrogenophaga intermedia), 히드로게노파가 슈도플라바 (Hydrogenophaga pseudoflava), 클렙시엘라 옥시토카 (Klebsiella oxytoca), 코사코니아 사카리 (Kosakonia sacchari), 락토바실러스 델브루엑키이 (Lactobacillus delbrueckii) subsp. 불가리쿠스 (bulgaricus), 락토바실러스 모데스티살리톨레란스 (Lactobacillus modestisalitolerans), 락토바실러스 프란타룸 (Lactobacillus plantarum) subsp. 아르겐토라텐시스 (argentoratensis), 락토바실러스 시안판겐시스 (Lactobacillus xiangfangensis), 레케발리에리아 로셀리니아에 (Lechevalieria roselyniae), 렌트제아 알비다 (Lentzea albida), 렌트제아 칼리포르니엔시스 (Lentzea californiensis), 류코노스톡 카르노숨 (Leuconostoc carnosum), 류코노스톡 시트레움 (Leuconostoc citreum), 류코노스톡 겔리둠 (Leuconostoc gelidum) subsp. 가시코미타툼 (gasicomitatum), 류코노스톡 메센테로이데스 (Leuconostoc mesenteroides) subsp. 수이오니쿰 (suionicum), 루테이모나스 아에스투아리이 (Luteimonas aestuarii), 리소박터 안티비오티쿠스 (Lysobacter antibioticus), 리소박터 코레엔시스 (Lysobacter koreensis), 리소박터 오리자에 (Lysobacter oryzae), 마그네토스피릴룸 모스코비엔스 (Magnetospirillum moscoviense), 마리노모나스 알카라지이 (Marinomonas alcarazii), 마리노모나스 프리모리엔시스 (Marinomonas primoryensis), 마실리아 아우레아 (Massilia aurea), 마실리아 제주엔시스 (Massilia jejuensis), 마실리아 키온기엔시스 (Massilia kyonggiensis), 마실리아 티모나에 (Massilia timonae), 메소리조비움 아카시아에 (Mesorhizobium acaciae), 메소리조비움 킹센지이 (Mesorhizobium qingshengii), 메소리조비움 쇼넨스 (Mesorhizobium shonense), 메틸로박테리움 하플로클라디이 (Methylobacterium haplocladii), 메틸로박테리움 플라타니 (Methylobacterium platani), 메틸로박테리움 슈도사시콜라 (Methylobacterium pseudosasicola), 메틸로박테리움 자트만니이 (Methylobacterium zatmanii), 미크로박테리움 옥시단 (Microbacterium oxydan), 미크로모노스포라 카이야푸멘시스 (Micromonospora chaiyaphumensis), 미크로모노스포라 칼세아 (Micromonospora chalcea), 미크로모노스포라 시트레아 (Micromonospora citrea), 미크로모노스포라 콕센시스 (Micromonospora coxensis), 미크로모노스포라 에키노푸스카 (Micromonospora echinofusca), 미크로모노스포라 할로피티카 (Micromonospora halophytica), 미크로모노스포라 캉레이파켄시스 (Micromonospora kangleipakensis), 미크로모노스포라 마리티마 (Micromonospora maritima), 미크로모노스포라 니그라 (Micromonospora nigra), 미크로모노스포라 푸르푸레오크로모게네 (Micromonospora purpureochromogene), 미크로모노스포라 리조스파에라에 (Micromonospora rhizosphaerae), 미크로모노스포라 사엘리세센시스 (Micromonospora saelicesensis), 미크로비르가 서브테라네아 (Microvirga subterranea), 미크로비르가 잠비엔시스 (Microvirga zambiensis), 마이코박테리움 알베이 (Mycobacterium alvei), 마이코박테리움 아비움 (Mycobacterium avium) subsp. 실바티쿰 (silvaticum), 마이코박테리움 콜롬비엔스 (Mycobacterium colombiense), 마이코박테리움 콘셉티오넨스 (Mycobacterium conceptionense), 마이코박테리움 콘셉티오넨스 (Mycobacterium conceptionense), 마이코박테리움 파시노게네스 (Mycobacterium farcinogenes), 마이코박테리움 포르투이툼 (Mycobacterium fortuitum) subsp. 포르투이툼 (fortuitum), 마이코박테리움 구디이 (Mycobacterium goodii), 마이코박테리움 인수브리쿰 (Mycobacterium insubricum), 마이코박테리움 일라트제렌스 (Mycobacterium llatzerense), 마이코박테리움 네오아우룸 (Mycobacterium neoaurum), 마이코박테리움 뉴올레안센스 (Mycobacterium neworleansense), 마이코박테리움 오부엔스 (Mycobacterium obuense), 마이코박테리움 페레그리눔 (Mycobacterium peregrinum), 마이코박테리움 사오파울렌스 (Mycobacterium saopaulense), 마이코박테리움 셉티쿰 (Mycobacterium septicum), 마이코박테리움 세텐스 (Mycobacterium setense), 마이코박테리움 스메그마티스 (Mycobacterium smegmatis), 네이세리아 서브플라바 (Neisseria subflava), 노카르디아 리지안겐시스 (Nocardia lijiangensis), 노카르디아 타일란디카 (Nocardia thailandica), 노보스핀고비움 바르카이미이 (Novosphingobium barchaimii), 노보스핀고비움 린다니클라스티쿰 (Novosphingobium lindaniclasticum), 노보스핀고비움 린다니클라스티쿰 (Novosphingobium lindaniclasticum), 노보스핀고비움 마투렌스 (Novosphingobium mathurense), 오크로박트룸 슈도그리그노넨스 (Ochrobactrum pseudogrignonense), 옥살리시박테리움 솔루비스 (Oxalicibacterium solurbis), 파라버크홀데리아 글라테이 (Paraburkholderia glathei), 파라버크홀데리아 후미 (Paraburkholderia humi), 파라버크홀데리아 페나지니움 (Paraburkholderia phenazinium), 파라버크홀데리아 피토피르만스 (Paraburkholderia phytofirmans), 파라버크홀데리아 솔디디콜라 (Paraburkholderia sordidicola), 파라버크홀데리아 테리콜라 (Paraburkholderia terricola), 파라버크홀데리아 제노보란스 (Paraburkholderia xenovorans), 파라코쿠스 라에비글루코시보란스 (Paracoccus laeviglucosivorans), 파툴리박터 진센지테라에 (Patulibacter ginsengiterrae), 폴리모르포스포라 루브라 (Polymorphospora rubra), 포르피로박터 콜림비 (Porphyrobacter colymbi), 프레보텔라 제주니 (Prevotella jejuni), 프레보텔라 멜라니노게니카 (Prevotella melaninogenica), 프로피오니박테리움 아크네 (Propionibacterium acnes) subsp.엘론가툼 (elongatum), 프로테우스 불가리스 (Proteus vulgaris), 프로비덴시아 루스티기아니이 (Providencia rustigianii), 슈도알테로모나스 아가리보란스 (Pseudoalteromonas agarivorans), 슈도알테로모나스 아틀란티카 (Pseudoalteromonas atlantica), 슈도알테로모나스 파라고르기콜라 (Pseudoalteromonas paragorgicola), 슈도모나스 아스플레니이 (Pseudomonas asplenii), 슈도모나스 아수엔시스 (Pseudomonas asuensis), 슈도모나스 벤제니보란스 (Pseudomonas benzenivorans), 슈도모나스 칸나비나 (Pseudomonas cannabina), 슈도모나스 시시콜라 (Pseudomonas cissicola), 슈도모나스 콘젠란스 (Pseudomonas congelans), 슈도모나스 코스탄티니이 (Pseudomonas costantinii), 슈도모나스 피쿠세렉타에 (Pseudomonas ficuserectae), 슈도모나스 프레데릭스베르겐시스 (Pseudomonas frederiksbergensis), 슈도모나스 그라미니스 (Pseudomonas graminis), 슈도모나스 제세니이 (Pseudomonas jessenii), 슈도모나스 코레엔시스 (Pseudomonas koreensis), 슈도모나스 코레엔시스 (Pseudomonas koreensis), 슈도모나스 쿤민겐시스 (Pseudomonas kunmingensis), 슈도모나스 마르기날리스 (Pseudomonas marginalis), 슈도모나스 무시도렌스 (Pseudomonas mucidolens), 슈도모나스 파나시스 (Pseudomonas panacis), 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(Rhodococcus enclensis), 로도페락스 사이덴바켄시스 (Rhodoferax saidenbachensis), 리켓치아 카나덴시스 (Rickettsia canadensis), 리켓치아 헤일론지안겐시스 (Rickettsia heilongjiangensis), 리켓치아 호네이 (Rickettsia honei), 리켓치아 라오울티이 (Rickettsia raoultii), 로세아텔레스 아쿠아틸리스 (Roseateles aquatilis), 로세아텔레스 아쿠아틸리스 (Roseateles aquatilis), 살모넬라 엔테리카 (Salmonella enterica) subsp. 살라마에 (salamae), 세라티아 피카리아 (Serratia ficaria), 세라티아 미오티스 (Serratia myotis), 세라티아 베스퍼틸리오니스 (Serratia vespertilionis), 슈와넬라 아에스투아리이 (Shewanella aestuarii), 슈와넬라 데콜로라티오니스 (Shewanella decolorationis), 스핀고비움 아미엔스 (Sphingobium amiense), 스핀고비움 바데리 (Sphingobium baderi), 스핀고비움 바타이이 (Sphingobium barthaii), 스핀고비움 클로로페놀리쿰 (Sphingobium chlorophenolicum), 스핀고비움 쿠프리레시스텐스 (Sphingobium cupriresistens), 스핀고비움 체헨스 (Sphingobium czechense), 스핀고비움 풀리기니스 (Sphingobium fuliginis), 스핀고비움 인디쿰 (Sphingobium indicum), 스핀고비움 인디쿰 (Sphingobium indicum), 스핀고비움 자포니쿰 (Sphingobium japonicum), 스핀고비움 락토수텐스 (Sphingobium lactosutens), 스핀고모나스 독도넨시스 (Sphingomonas dokdonensis), 스핀고모나스 슈도산귀니스 (Sphingomonas 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(Aggregatibacter aphrophilus), 아그레가티박터 세그니스 (Aggregatibacter segnis), 아그로코쿠스 발드리 (Agrococcus baldri), 알비박터 메틸로보란스 (Albibacter Methylovorans), 알칼리게네스 패칼리스 (Alcaligenes faecalis) subsp. 패칼리스 (faecalis), 알고리파구스 라트코우스키이 (Algoriphagus ratkowskyi), 알칼리박테리움 올리바포블리티쿠스 (Alkalibacterium olivapovliticus), 알칼리박테리움 펠라기움 (Alkalibacterium pelagium), 알칼리박테리움 펠라기움 (Alkalibacterium pelagium), 알로프레보텔라 라바 (Alloprevotella rava), 알소박터 메탈리두란스 (Alsobacter metallidurans), 아마리코쿠스 카플리센시스 (Amaricoccus kaplicensis), 아마리코쿠스 베로넨시스 (Amaricoccus veronensis), 아나에로코쿠스 히드로게날리스 (Anaerococcus Hydrogenalis), 아나에로코쿠스 락톨리티쿠스 (Anaerococcus lactolyticus), 아나에로코쿠스 무르도키이 (Anaerococcus murdochii), 아나에로코쿠스 옥타비우스 (Anaerococcus octavius), 아나에로코쿠스 프레보티이 (Anaerococcus prevotii), 아나에로코쿠스 바지날리스 (Anaerococcus vaginalis), 아쿠아박테리움 시트라티필룸 (Aquabacterium citratiphilum), 아쿠아박테리움 올레이 (Aquabacterium olei), 아쿠아박테리움 올레이 (Aquabacterium olei), 아쿠아박테리움 파르븀 (Aquabacterium parvum), 아퀸콜라 터티아리카르보니스 (Aquincola tertiaricarbonis), 아르코박터 베네루피스 (Arcobacter 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포르피로모나스 벤노니스 (Porphyromonas bennonis), 포르피로모나스 엔도돈탈리스 (Porphyromonas endodontalis), 포르피로모나스 진지발리스 (Porphyromonas gingivalis), 포르피로모나스 진지비카니스 (Porphyromonas gingivicanis), 포르피로모나스 파스테리 (Porphyromonas pasteri), 포르피로모나스 포고나에 (Porphyromonas pogonae), 포르피로모나스 소메라에 (Porphyromonas somerae), 포발리박터 우바룸 (Povalibacter uvarum), 프레보텔라 아우란티아카 (Prevotella aurantiaca), 프레보텔라 바로니아에 (Prevotella baroniae), 프레보텔라 비비아 (Prevotella bivia), 프레보텔라 부카에 (Prevotella buccae), 프레보텔라 부칼리스 (Prevotella buccalis), 프레보텔라 코프리 (Prevotella copri), 프레보텔라 코르포리스 (Prevotella corporis), 프레보텔라 덴티콜라 (Prevotella denticola), 프레보텔라 에노에카 (Prevotella enoeca), 프레보텔라 히스티콜라 (Prevotella histicola), 프레보텔라 인테르메디아 (Prevotella intermedia), 프레보텔라 제주니 (Prevotella jejuni), 프레보텔라 제주니 (Prevotella jejuni), 프레보텔라 마쿨로사 (Prevotella maculosa), 프레보텔라 멜라니노게니카 (Prevotella melaninogenica), 프레보텔라 멜라니노게니카 (Prevotella melaninogenica), 프레보텔라 미칸스 (Prevotella micans), 프레보텔라 멀티포르미스 (Prevotella multiformis), 프레보텔라 난세이엔시스 (Prevotella nanceiensis), 프레보텔라 니그레센스 (Prevotella nigrescens), 프레보텔라 오리스 (Prevotella oris), 프레보텔라 오울로룸 (Prevotella oulorum), 프레보텔라 팔렌스 (Prevotella pallens), 프레보텔라 플레우리티디스 (Prevotella pleuritidis), 프레보텔라 사카롤리티카 (Prevotella saccharolytica), 프레보텔라 살리바에 (Prevotella salivae), 프레보텔라 샤히이 (Prevotella shahii), 프레보텔라 티모넨시스 (Prevotella timonensis), 프레보텔라 베로랄리스 (Prevotella veroralis), 프로피오니박테리움 악시디파시엔스 (Propionibacterium acidifaciens), 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionibacterium acnes) subsp. 아크네스 (acnes), 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionibacterium acnes) subsp. 아크네스 (acnes), 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionibacterium acnes) subsp. 엘론가툼 (elongatum), 프로피오니박테리움 그라눌로숨 ((Propionibacterium granulosum), 프로피오니미크로비움 림포필룸 (Propionimicrobium lymphophilum), 프로피오니스피라 아르쿠아타 (Propionispira arcuata), 슈도키네오코쿠스 루시타누스 (Pseudokineococcus lusitanus), 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 쳉두엔시스 (Pseudomonas chengduensis), 슈도노카르디아 벤제니보란스 (Pseudonocardia benzenivorans), 슈도로도플라네스 시누스페르시시 (Pseudorhodoplanes sinuspersici), 사이크로박터 산귀니스 (Psychrobacter sanguinis), 람리박터 진세노시디뮤탄스 (Ramlibacter ginsenosidimutans), 레인헤이메라 아쿠이마리스 (Rheinheimera aquimaris), 리조비움 알베이 (Rhizobium alvei), 리조비움 대전엔스 (Rhizobium daejeonense), 리조비움 라리모오레이 (Rhizobium larrymoorei), 리조비움 리조리자에 (Rhizobium rhizoryzae), 리조비움 솔라이 (Rhizobium soli), 리조비움 타이바이샤넨스 (Rhizobium taibaishanense), 리조비움 비그나에 (Rhizobium vignae), 로다노박터 글리시니스 (Rhodanobacter glycinis), 로도박터 벨드캄피이 (Rhodobacter veldkampii), 로도코쿠스 엔클렌시스 (Rhodococcus enclensis), 로도코쿠스 파시안스 (Rhodococcus fascians), 로도코쿠스 파시안스 (Rhodococcus fascians), 로도바리우스 리포시클리쿠스 (Rhodovarius lipocyclicus), 리비콜라 핑툰겐시스 (Rivicola pingtungensis), 로세부리아 이눌리니보란스 (Roseburia inulinivorans), 로센베르지엘라 넥타레아 (Rosenbergiella nectarea), 로세오모나스 아에릴라타 (Roseomonas aerilata), 로세오모나스 아쿠아티카 (Roseomonas aquatica), 로세오모나스 무코사 (Roseomonas mucosa), 로세오모나스 로세아 (Roseomonas rosea), 로세오모나스 비나세아 (Roseomonas vinacea), 로티아 아에리아 (Rothia aeria), 로티아 아마라에 (Rothia amarae), 로티아 덴토카리오사 (Rothia dentocariosa), 로티아 엔도피티카 (Rothia endophytica), 로티아 무실라기노사 (Rothia mucilaginosa), 로티아 나시무리움 (Rothia nasimurium), 루벨리미크로비움 메소필룸 (Rubellimicrobium mesophilum), 루벨리미크로비움 로세움 (Rubellimicrobium roseum), 루브로박터 브라카렌시스 (Rubrobacter bracarensis), 루다에아 셀룰로실리티카 (Rudaea cellulosilytica), 루미노코쿠스 그나부스 (Ruminococcus gnavus), 루넬라 제아에 (Runella zeae), 사카로폴리스포라 렉티비르굴라 (Saccharopolyspora rectivirgula), 살리니코쿠스 킹다오넨시스 (Salinicoccus qingdaonensis), 스카르도비아 위그시아에 (Scardovia wiggsiae), 세디미니박테리움 진센지솔라이 (Sediminibacterium ginsengisoli), 셀레노모나스 아르테미디스 (Selenomonas artemidis), 세레노모나스 인펠릭스 (Selenomonas infelix), 셀레노모나스 녹시아 (Selenomonas noxia), 셀레노모나스 스푸티게나 (Selenomonas sputigena), 슈와넬라 아에스투아리이 (Shewanella aestuarii), 슈틀워티아 사텔레스 (Shuttleworthia satelles), 시몬시엘라 무엘레리 (Simonsiella muelleri), 스케르마넬라 아에롤라타 (Skermanella aerolata), 스케르마넬라 스티비이레시스텐스 (Skermanella stibiiresistens), 슬락키아 엑시구아 (Slackia exigua), 스마라그디코쿠스 니이가텐시스 (Smaragdicoccus niigatensis), 스네아티아 산귀네겐스 (Sneathia sanguinegens), 솔리루브로박터 솔라이 (Solirubrobacter soli), 스핀고박테리움 카에니 (Sphingobacterium caeni), 스핀고박테리움 대전엔스 (Sphingobacterium daejeonense), 스핀고박테리움 호타넨스 (Sphingobacterium hotanense), 스핀고박테리움 기온기엔스 (Sphingobacterium kyonggiense), 스핀고박테리움 멀티보룸 (Sphingobacterium multivorum), 스핀고박테리움 네마토시다 (Sphingobacterium nematocida), 스핀고박테리움 스피리티보룸 (Sphingobacterium spiritivorum), 스핀고비움 아미엔스 (Sphingobium amiense), 스핀고비움 인디쿰 (Sphingobium indicum), 스핀고비움 락토수텐스 (Sphingobium lactosutens), 스핀고비움 서브테라네움 (Sphingobium subterraneum), 스핀고모나스 아바사이 (Sphingomonas abaci), 스핀고모나스 아에스투아리이 (Sphingomonas aestuarii), 스핀고모나스 카나덴시스 (Sphingomonas canadensis), 스핀고모나스 다에충엔시스 (Sphingomonas daechungensis), 스핀고모나스 독도엔시스 (Sphingomonas dokdonensis), 스핀고모나스 에키노이데스 (Sphingomonas echinoides), 스핀고모나스 폰티콜라 (Sphingomonas fonticola), 스핀고모나스 폰티콜라 (Sphingomonas fonticola), 스핀고모나스 포르모센시스 (Sphingomonas formosensis), 스핀고모나스 게이 (Sphingomonas gei), 스핀고모나스 한쿡엔시스 (Sphingomonas hankookensis), 스핀고모나스 한쿡엔시스 (Sphingomonas hankookensis), 스핀고모나스 코레엔시스 (Sphingomonas koreensis), 스핀고모나스 경기엔시스 (Sphingomonas kyeonggiensis), 스핀고모나스 라테라리아에 (Sphingomonas laterariae), 스핀고모나스 무코시시마 (Sphingomonas mucosissima), 스핀고모나스 올리고페놀리카 (Sphingomonas oligophenolica), 스핀고모나스 슈도산귀니스 (Sphingomonas pseudosanguinis), 스핀고모나스 세디미니콜라 (Sphingomonas sediminicola), 스핀고모나스 얀틴겐시스 (Sphingomonas yantingensis), 스핀고모나스 윤나넨시스 (Sphingomonas yunnanensis), 스핀고픽시스 인디카 (Sphingopyxis indica), 스피로소마 리구이 (Spirosoma rigui), 스포라세티게니움 메소필룸 (Sporacetigenium mesophilum), 스포로시토파가 믹소코코이데스 (Sporocytophaga myxococcoides), 스타필로코쿠스 아우리쿨라리스 (Staphylococcus auricularis), 스타필로코쿠스 에피더미디스 (Staphylococcus epidermidis), 스타필로코쿠스 에피더미디스 (Staphylococcus epidermidis), 스타필로코쿠스 호미니스 (Staphylococcus hominis) subsp. 노보비오셉티쿠스 (novobiosepticus), 스타필로코쿠스 루그두넨시스 (Staphylococcus lugdunensis), 스타필로코쿠스 페텐코페리 (Staphylococcus pettenkoferi), 스테노트로포모나스 코레엔시스 (Stenotrophomonas koreensis), 스테노트로포모나스 리조필라 (Stenotrophomonas rhizophila), 스테노트로포모나스 리조필라 (Stenotrophomonas rhizophila), 스트렙토코쿠스 아갈락티아에 (Streptococcus agalactiae), 스트렙토코쿠스 카니스 (Streptococcus canis), 스트렙토코쿠스 크리스타투스 (Streptococcus cristatus), 스트렙토코쿠스 고르도니이 (Streptococcus gordonii), 스트렙토코쿠스 인판티스 (Streptococcus infantis), 스트렙토코쿠스 인테르메디우스 (Streptococcus intermedius), 스트렙토코쿠스 뮤탄스 (Streptococcus mutans), 스트렙토코쿠스 올리고페르멘탄스 (Streptococcus oligofermentans), 스트렙토코쿠스 오랄리스 (Streptococcus oralis), 스트렙토코쿠스 산귀니스 (Streptococcus sanguinis), 스트렙토마이세스 이코니엔시스 (Streptomyces iconiensis), 스트렙토마이세스 얀리엔시스 (Streptomyces yanglinensis), 타브리지콜라 아쿠아티카 (Tabrizicola aquatica), 타히박터 카에니 (Tahibacter caeni), 탄네렐라 포르시티아 (Tannerella forsythia), 테피디셀라 자비에리 (Tepidicella xavieri), 테피디모나스 폰티칼디 (Tepidimonas fonticaldi), 테라코쿠스 루테우스 (Terracoccus luteus), 테사라코쿠스 플라베센스 (Tessaracoccus flavescens), 써무스 써모필루스 (Thermus thermophilus), 티안웨이타니아 세디미니스 (Tianweitania sediminis), 티안웨이타니아 세디미니스 (Tianweitania sediminis), 트레포네마 아밀로보룸 (Treponema amylovorum), 트레포네마 덴티콜라 (Treponema denticola), 트레포네마 레시티놀리티쿰 (Treponema lecithinolyticum), 트레포네마 메디움 (Treponema medium), 투리셀라 오티티디스 (Turicella otitidis), 투리시박터 산귀니스 (Turicibacter sanguinis), 운디박테리움 올리고카르보니필룸 (Undibacterium oligocarboniphilum), 운디박테리움 스퀼라룸 (Undibacterium squillarum), 바고코쿠스 살모니나룸 (Vagococcus salmoninarum), 바리바쿨룸 캄브리엔스 (Varibaculum cambriense), 비브리오 메츠니코비이 (Vibrio metschnikovii), 잔토박터 타게티디스 (Xanthobacter tagetidis), 제노필루스 아에로라투스 (Xenophilus aerolatus), 제노필루스 아르세니시레시스텐스 (Xenophilus arseniciresistens), 이멜라 루테아 (Yimella lutea), 짐머만넬라 알바 (Zimmermannella alba), 짐머만넬라 비피다 (Zimmermannella bifida) 및/또는 주글로에아 카에니 (Zoogloea caeni)이다.
다른 구현예에서, 표적화된 박테리아 세포는 질 미생물총에서 통상적으로 발견되는 것들이고, 제한없이, 아시네토박터 안티비랄리스 (Acinetobacter antiviralis), 아시네토박터 바우만니이 (Acinetobacter baumannii), 아시네토박터 칼코아세티쿠스 (Acinetobacter calcoaceticus), 아시네토박터 존소니이 (Acinetobacter johnsonii), 악티노바쿨룸 마실리엔스 (Actinobaculum massiliense), 악티노바쿨룸 스카알리이 (Actinobaculum schaalii), 악티노마이세스 유로파에우스 (Actinomyces europaeus), 악티노마이세스 그라에베니트지이 (Actinomyces graevenitzii), 악티노마이세스 이스라엘리이 (Actinomyces israelii), 악티노마이세스 메이에리 (Actinomyces meyeri), 악티노마이세스 나에스룬디이 (Actinomyces naeslundii), 악티노마이세스 네우이이 (Actinomyces neuii), 악티노마이세스 오돈톨리티쿠스 (Actinomyces odontolyticus), 악티노마이세스 투리센시스 (Actinomyces turicensis), 악티노마이세스 우로게니탈리스 (Actinomyces urogenitalis), 악티노마이세스 비스코수스 (Actinomyces viscosus), 아에로코쿠스 크리스텐세니이 (Aerococcus christensenii), 아에로코쿠스 우리나에 (Aerococcus urinae), 아에로코쿠스 비리단스 (Aerococcus viridans), 아에로모나스 엔켈레이아 (Aeromonas encheleia), 아에로모나스 살모니시다 (Aeromonas salmonicida), 아피피아 마실리엔시스 (Afipia massiliensis), 아그로박테리움 투머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens), 알고리파구스 아쿠아틸리스 (Algoriphagus aquatilis), 알리이비브리오 우다니스 (Aliivibrio wodanis), 알리스티페스 피네골디이 (Alistipes finegoldii), 알로이오코쿠스 오티티스 (Alloiococcus otitis), 알로프레보텔라 탄네라에 (Alloprevotella tannerae), 알로스카르도비아 옴니콜렌스 (Alloscardovia omnicolens), 알테레리트로박터 에폭시디보란스 (Altererythrobacter epoxidivorans), 암모니필루스 옥살리필루스 (Ammoniphilus oxalaticus), 암니박테리움 키온기엔스 (Amnibacterium kyonggiense), 아나에로코쿠스 히드로게날리스 (Anaerococcus hydrogenalis), 아나에로코쿠스 락톨리티쿠스 (Anaerococcus lactolyticus), 아나에로코쿠스 무르도키이 (Anaerococcus murdochii), 아나에로코쿠스 오베시엔시스 (Anaerococcus obesiensis), 아나에로코쿠스 프레보티이 (Anaerococcus prevotii), 아나에로코쿠스 테트라디우스 (Anaerococcus tetradius), 아나에로코쿠스 바지날리스 (Anaerococcus vaginalis), 아나에로글로부스 게미나투스 (Anaeroglobus geminatus), 아녹시바실러스 푸시키노엔시스 (Anoxybacillus pushchinoensis), 아쿠아박테리움 파르븀 (Aquabacterium parvum), 아르카노박테리움 포카에 (Arcanobacterium phocae), 아트로박터 아우레센스 (Arthrobacter aurescens), 아스티카카울리스 엑센트리쿠스 (Asticcacaulis excentricus), 아토포비움 미누툼 (Atopobium minutum), 아토포비움 파르불룸 (Atopobium parvulum), 아토포비움 리마에 (Atopobium rimae), 아토포비움 바지나에 (Atopobium vaginae), 아비박테리움 갈리나룸 (Avibacterium gallinarum), 바실러스 악시디콜라 (Bacillus acidicola), 바실러스 아트로파에우스 (Bacillus atrophaeus), 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus), 바실러스 시바이 (Bacillus cibi), 바실러스 코아후일렌시스 (Bacillus coahuilensis), 바실러스 가에모켄시스 (Bacillus gaemokensis), 바실러스 메타놀리쿠스 (Bacillus methanolicus), 바실러스 올레로니우스 (Bacillus oleronius), 바실러스 푸밀루스 (Bacillus pumilus), 바실러스 사클레토니이 (Bacillus shackletonii), 바실러스 스포로써모두란스 (Bacillus sporothermodurans), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 와코엔시스 (Bacillus wakoensis), 바실러스 웨이헨스테파넨시스 (Bacillus weihenstephanensis), 박테로이데스 바르네시아에 (Bacteroides barnesiae), 박테로이데스 코아굴란스 (Bacteroides coagulans), 박테로이데스 도레이 (Bacteroides dorei), 박테로이데스 파에시스 (Bacteroides faecis), 박테로이데스 포르시투스 (Bacteroides forsythus), 박테로이데스 프라질리스 (Bacteroides fragilis), 박테로이데스 노르디이 (Bacteroides nordii), 박테로이데스 오바투스 (Bacteroides ovatus), 박테로이데스 살리에르시아에 (Bacteroides salyersiae), 박테로이데스 스테르코리스 (Bacteroides stercoris), 박테로이데스 유니포르미스 (Bacteroides uniformis), 박테로이데스 불가투스 (Bacteroides vulgatus), 박테로이데스 자일라니솔벤스 (Bacteroides xylanisolvens), 박테로이데스 주글레오포르만스 (Bacteroides zoogleoformans), 바르네시엘라 비스세리콜라 (Barnesiella viscericola), 바르가바에아 세셈벤시스 (Bhargavaea cecembensis), 비피도박테리움 알돌레센티스 (Bifidobacterium adolescentis), 비피도박테리움 비피둠 (Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 브레베 (Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 덴티움 (Bifidobacterium dentium), 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium logum) subsp. 인판티스 (infantis), 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 (Bifidobacterium pseudocatenulatum), 비피도박테리움 스카르도비이 (Bifidobacterium scardovii), 빌로필라 와드스워티아 (Bilophila wadsworthia), 블라우티아 히드로게노트로피카 (Blautia Hydrogenotrophica), 브라우티아 오베움 (Blautia obeum), 블라우티아 프로덕타 (Blautia producta), 브란키박테리움 패시움 (Brachybacterium faecium), 브라디리조비움 자포니쿰 (Bradyrhizobium japonicum), 브레비박테리움 맥브렐네리 (Brevibacterium mcbrellneri), 브레비박테리움 오티티디스 (Brevibacterium otitidis), 브레비박테리움 파우시보란스 (Brevibacterium paucivorans), 불레이디아 엑스트룩타 (Bulleidia extructa), 버크홀데리아 푼고룸 (Burkholderia fungorum), 버크홀데리아 페놀리럽틱스 (Burkholderia phenoliruptix), 칼디셀룰로시럽토르 사카롤리티쿠스 (Caldicellulosiruptor saccharolyticus), 칼디모나스 타이와넨시스 (Caldimonas taiwanensis), 캄필로박터 그라실리스 (Campylobacter gracilis), 캄필로박터 호미니스 (Campylobacter hominis), 캄필로박터 스푸토룸 (Campylobacter sputorum), 캄필로박터 우레올리티쿠스 (Campylobacter ureolyticus), 카프노시토파가 오크라세아 (Capnocytophaga ochracea), 카르디오박테리움 호미니스 (Cardiobacterium hominis), 카토넬라 모르비 (Catonella morbi), 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis), 클라미도필라 아보르투스 (Chlamydophila abortus), 콘드로마이세스 로부스투스 (Chondromyces robustus), 크리세오박테리움 아쿠아티쿰 (Chryseobacterium aquaticum), 시트로박터 윤가에 (Citrobacter youngae), 클로아시박테리움 노르마넨스 (Cloacibacterium normanense), 클로스트리듐 카벤디시이 (Clostridium cavendishii), 클로스트리듐 콜리카니스 (Clostridium colicanis), 클로스트리듐 제주엔스 (Clostridium jejuense), 클로스트리듐 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens), 클로스트리듐 라모숨 (Clostridium ramosum), 클로스트리듐 소르델리이 (Clostridium sordellii), 클로스트리듐 비리데 (Clostridium viride), 코마모나스 테리게나 (Comamonas terrigena), 코리네박테리움 아콜렌스 (Corynebacterium accolens), 코리네박테리움 아펜디시스 (Corynebacterium appendicis), 코리네박테리움 코일레아에 (Corynebacterium coyleae), 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(Olsenella uli), 파에니바실러스 아밀롤리티쿠스 (Paenibacillus amylolyticus), 파에니바실러스 후미쿠스 (Paenibacillus humicus), 파에니바실러스 파불리 (Paenibacillus pabuli), 파에니바실러스 파사데넨시스 (Paenibacillus pasadenensis), 파에니바실러스 피니 (Paenibacillus pini), 파에니바실러스 발리두스 (Paenibacillus validus), 판토에아 아글로머란스 (Pantoea agglomerans), 파라박테로이데스 메르다에 (Parabacteroides merdae), 파라버크홀데리아 카리오필리 (Paraburkholderia caryophylli), 파라코쿠스 이에이 (Paracoccus yeei), 파라스트렙토마이세스 압세수스 (Parastreptomyces abscessus), 파르비모나스 미크라 (Parvimonas micra), 펙토박테리움 베타바스쿨로룸 (Pectobacterium betavasculorum), 펙토박테리움 카로토보룸 (Pectobacterium carotovorum), 페디오코쿠스 아시딜락티시 (Pediococcus acidilactici), 페디오코쿠스 에타놀리두란스 (Pediococcus ethanolidurans), 페도박터 알루비오니스 (Pedobacter alluvionis), 페도박터 완주엔스 (Pedobacter wanjuense), 펠로모나스 아쿠아티카 (Pelomonas aquatica), 펩토코쿠스 니거 (Peptococcus niger), 펩토니필루스 아사카롤리티쿠스 (Peptoniphilus asaccharolyticus), 펩토니필루스 고르바키이 (Peptoniphilus gorbachii), 펩토니필루스 하레이 (Peptoniphilus harei), 펩토니필루스 인돌리쿠스 (Peptoniphilus indolicus), 펩토니필루스 라크리말리스 (Peptoniphilus lacrimalis), 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disiens), 프레보텔라 인테르메디아 (Prevotella intermedia), 프레보텔라 로에스케이 (Prevotella loescheii), 프레보텔라 마르시이 (Prevotella marshii), 프레보텔라 멜라니노게니카 (Prevotella melaninogenica), 프레보텔라 미칸스 (Prevotella micans), 프레보텔라 니그레센스 (Prevotella nigrescens), 프레보텔라 오리스 (Prevotella oris), 프레보텔라 프레우리티디스 (Prevotella pleuritidis), 프레보텔라 루미니콜라 (Prevotella ruminicola), 프레보텔라 샤히이 (Prevotella shahii), 프레보텔라 스테르코레아 (Prevotella stercorea), 프레보텔라 티모넨시스 (Prevotella timonensis), 프레보텔라 베로랄리스 (Prevotella veroralis), 프로피오니미크로비움 림포필룸 (Propionimicrobium lymphophilum), 프로테우스 미라빌리스 (Proteus mirabilis), 슈도모나스 아비에타니필라 (Pseudomonas abietaniphila), 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 아미그달리 (Pseudomonas amygdali), 슈도모나스 아조토포르만스 (Pseudomonas azotoformans), 슈도모나스 클로로라피스 (Pseudomonas chlororaphis), 슈도모나스 쿠아트로시에네가센시스 (Pseudomonas cuatrocienegasensis), 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 풀바 (Pseudomonas fulva), 슈도모나스 루테아 (Pseudomonas lutea), 슈도모나스 무시돌렌스 (Pseudomonas mucidolens), 슈도모나스 올레오보란스 (Pseudomonas oleovorans), 슈도모나스 오리엔탈리스 (Pseudomonas orientalis), 슈도모나스 슈도알칼리게네스 (Pseudomonas pseudoalcaligenes), 슈도모나스 사이크로필라 (Pseudomonas psychrophila), 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida), 슈도모나스 신산타 (Pseudomonas synxantha), 슈도모나스 시린가에 (Pseudomonas syringae), 슈도모나스 톨라아시이 (Pseudomonas tolaasii), 슈도프로피오니박테리움 프로피오니쿰 (Pseudopropionibacterium propionicum), 라넬라 아쿠아틸리스 (Rahnella aquatilis), 랄스토니아 픽케티이 (Ralstonia pickettii), 랄스토니아 솔라나세아룸 (Ralstonia solanacearum), 라오울텔라 플란티콜라 (Raoultella planticola), 리조박터 다우시 (Rhizobacter dauci), 리조비움 에틀리 (Rhizobium etli), 로도코쿠스 파시안스 (Rhodococcus fascians), 로도슈도모나스 팔루스트리스 (Rhodopseudomonas palustris), 로세부리아 인테스티날리스 (Roseburia intestinalis), 로세부리아 이눌리니보란스 (Roseburia inulinivorans), 로티아 무실라기노사 (Rothia mucilaginosa), 루미노코쿠스 브로미이 (Ruminococcus bromii), 루미노코쿠스 그나부스 (Ruminococcus gnavus), 루미노코쿠스 토르케스 (Ruminococcus torques), 산귀박터 케디에이 (Sanguibacter keddieii), 세디미니박테리움 살모네움 (Sediminibacterium salmoneum), 셀레노모나스 보비스 (Selenomonas bovis), 세라티아 폰티콜라 (Serratia fonticola), 세라티아 리케파시엔스 (Serratia liquefaciens), 세라티아 마르세센스 (Serratia marcescens), 슈와넬라 알가에 (Shewanella algae), 슈와넬라 아마조넨시스 (Shewanella amazonensis), 시겔라 보이디이 (Shigella boydii), 시겔라 손네이 (Shigella sonnei), 슬락키아 엑시구아 (Slackia exigua), 스네아티아 암니이 (Sneathia amnii), 스테아티아 산귀네겐스 (Sneathia sanguinegens), 솔로박테리움 무레이 (Solobacterium moorei), 소란기움 셀룰로숨 (Sorangium cellulosum), 스핀고비움 아미엔스 (Sphingobium amiense), 스핀고비움 자포니쿰 (Sphingobium japonicum), 스핀고비움 야노이쿠야에 (Sphingobium yanoikuyae), 스핀고모나스 위티치 (Sphingomonas wittichii), 스포로사르시나 아퀴마리나 (Sporosarcina aquimarina), 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 스타필로코쿠스 아우리쿨라리스 (Staphylococcus auricularis), 스타필로코쿠스 카피티스 (Staphylococcus capitis), 스타필로코쿠스 에피더미디스 (Staphylococcus epidermidis), 스타필로코쿠스 해몰리티쿠스 (Staphylococcus haemolyticus), 스타필로코쿠스 호미니스 (Staphylococcus hominis), 스타필로코쿠스 루그두넨시스 (Staphylococcus lugdunensis), 스타필로코쿠스 사프로피티쿠스 (Staphylococcus saprophyticus), 스타필로코쿠스 슬레이페리 (Staphylococcus schleiferi), 스타필로코쿠스 시미아에 (Staphylococcus simiae), 스타필로코쿠스 시물란스 (Staphylococcus simulans), 스타필로코쿠스 와르네리 (Staphylococcus warneri), 스테노트로포모나스 말토필리아 (Stenotrophomonas maltophilia), 스테녹시박터 아세티보란스 (Stenoxybacter acetivorans), 스트렙토코쿠스 아갈락티아에 (Streptococcus agalactiae), 스트렙토코쿠스 안지노수스 (Streptococcus anginosus), 스트렙토코쿠스 아우스탈리스 (Streptococcus australis), 스트렙토코쿠스 에퀴누스 (Streptococcus equinus), 스트렙토코쿠스 갈롤리티쿠스 (Streptococcus gallolyticus), 스트렙토코쿠스 인판티스 (Streptococcus infantis), 스트렙토코쿠스 인테르메디우스 (Streptococcus intermedius), 스트렙토코쿠스 루테티엔시스 (Streptococcus lutetiensis), 스트렙토코쿠스 마리마말리움 (Streptococcus marimammalium), 스트렙토코쿠스 미티스 (Streptococcus mitis), 스트렙토코쿠스 뮤탄스 (Streptococcus mutans), 스트렙토코쿠스 오랄리스 (Streptococcus oralis), 스트렙토코쿠스 파라산귀니스 (Streptococcus parasanguinis), 스트렙토코쿠스 포카에 (Streptococcus phocae), 스트렙토코쿠스 슈도뉴모니아에 (Streptococcus pseudopneumoniae), 스트렙토코쿠스 살리바리우스 (Streptococcus salivarius), 스트렙토코쿠스 산귀니스 (Streptococcus sanguinis), 스트렙토코쿠스 써모필루스 (Streptococcus thermophilus), 수테렐라 와드스워텐시스 (Sutterella wadsworthensis), 탄네렐라 포르시티아 (Tannerella forsythia), 테라해모필루스 아로마티시보란스 (Terrahaemophilus aromaticivorans), 트레포네마 덴티콜라 (Treponema denticola), 트레포네마 말토필룸 (Treponema maltophilum), 트레포네마 파르븀 (Treponema parvum), 트레포네마 빈센티이 (Treponema vincentii), 트루에페렐라 베르나르디아에 (Trueperella bernardiae), 투리셀라 오티티디스 (Turicella otitidis), 우레아플라스마 파르븀 (Ureaplasma parvum), 우레아플라스마 우레알리티쿰 (Ureaplasma urealyticum), 바리바쿨룸 캄브리엔스 (Varibaculum cambriense), 바리오보락스 파라독수스 (Variovorax paradoxus), 베일로넬라 아티피카 (Veillonella atypica), 베일로넬라 디스파르 (Veillonella dispar), 베일로넬라 몬트펠리에렌시스 (Veillonella montpellierensis), 베일로넬라 파르불라 (Veillonella parvula), 비르기바실러스 프루미이 (Virgibacillus proomii), 비리디바실러스 아레노시 (Viridibacillus arenosi), 비리디바실러스 아르비 (Viridibacillus arvi), 웨이셀라 시바리아 (Weissella cibaria), 웨이셀라 솔라이 (Weissella soli), 잔토모나스 감페스트리스 (Xanthomonas campestris), 잔토모나스 베시카토리아 (Xanthomonas vesicatoria), 조벨리아 라미나리아에 (Zobellia laminariae) 및/또는 주글로에아 라미게라 (Zoogloea ramigera)이다.
일 구현예에서, 표적화된 박테리아는 에스케리치아 콜라이 (에스케리치아 coli)이다.
일 구현예에서, 표적화된 박테리아는 쿠티박테리움 아크네스 (Cutibacterium acnes), 보다 특히 계통군 IA1 또는 RT4, RT5, RT8, RT9, RT10 또는 클론 복합체(CC) CC1, CC3, CC4, 보다 특히 ST1, ST3, ST4로부터의 여드름 관련 쿠니박테리움 아크네스이다.
박테리아 바이러스 입자 예컨대 패키징된 파지미드를 제조하는데 사용된 박테리오파지는 페이로드를 특이적으로 전달하기 위해 개시된 박테리아의 속 및/또는 종 중 어느 하나 이상으로부터의 박테리아 세포를 표적화 (예를 들어, 특이적으로 표적화)할 수 있다.
일 구현예에서, 표적화된 박테리아는 병원성 박테리아이다. 표적화된 박테리아는 병독성 박테리아일 수 있다.
표적화된 박테리아는 바람직하게 확장-스펙트럼 베타-락타마제-생산 (ESBL) 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), ESBL 클렙시엘라 뉴모니아에 (Klebsiella pneumoniae), 반코마이신-내성 엔테로코쿠스 (Enterococcus) (VRE), 메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) (MRSA), 다제-내성 (MDR) 아시네토박터 바우만니이 (Acinetobacter baumannii), MDR 엔테로박터 (Enterobacter) spp., 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항박테리아 내성 박테리아일 수 있다. 바람직하게, 표적화된 박테리아는 확장-스펙트럼 베타-락타마제-생산 (ESBL) 에스케리치아 콜라이 균주로 이루어진 군으로부터 선택되는 항박테리아 내성 박테리아일 수 있다.
대안적으로, 표적화된 박테리아는 소정 종의 마이크로바이옴의 박테리아, 바람직하게 인간 미생물총의 박테리아일 수 있다.
박테리아 바이러스
박테리아 바이러스 입자는 박테리아 바이러스로부터 제조된다. 박테리아 바이러스는 표적화된 박테리아로 페이로드를 도입시킬 수 있게 선택된다.
박테리아 바이러스는 바람직하게 박테리오파지이다. 박테리오파지는 숙주 생합성 기구의 일부 또는 전부를 끌어들여서 박테리아 내부에서 증식하는 절대 세포내 기생체이다. 파지 게놈은 다양한 크기 및 형상 (예를 들어, 선형 또는 원형)이다. 대부분의 파지는 직경이 24-200 nm 크기 범위이다. 파지는 핵산 (즉, 게놈) 및 단백질을 함유하고, 지질막에 의해 내포될 수 있다. 파지에 따라서, 핵산 게놈은 DNA 또는 RNA일 수 있고, 원형 또는 선형 형태로 존재할 수 있다. 파지 게놈의 크기는 파지에 따라 다양하다. 가장 단순한 파지는 크기가 단지 수천 뉴클레오티드인 게놈을 갖는 반면, 보다 복잡한 파지는 그들 게놈에 100,000 초과의 뉴클레오티드, 드문 예에서는, 1,000,000 초과의 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 파지 입자 중 개별 유형의 단백질의 수 및 양은 파지에 따라 다양할 것이다.
임의로, 박테리오파지는 [Krupovic et al, Arch Virol, 2015]의 분류학을 기반으로, 다음으로 이루어진 카우도비랄레스 (Caudovirales) 목으로부터 선택된다:
- 미오비리다에 (Myoviridae) 과 (예컨대, 제한없이, 속 Cp220바이러스, Cp8바이러스, Ea214바이러스, 펠릭소1바이러스, 무글바이러스, 수스프바이러스, Hp1바이러스, P2바이러스, 카이바이러스, P100바이러스, 실비아바이러스, 스포1바이러스, 챠르봄바바이러스, 트워트바이러스, Cc31바이러스, Jd18바이러스, Js98바이러스, Kp15바이러스, 문바이러스, Rb49바이러스, Rb69바이러스, S16바이러스, 스키조트4바이러스, Sp18바이러스, T4바이러스, Cr3바이러스, Se1바이러스, V5바이러스, 아보우오바이러스, 아게이트바이러스, 아그리칸357바이러스, Ap22바이러스, Arv1바이러스, B4바이러스, 바스티유바이러스, Bc431바이러스, Bcep78바이러스, 비셉무바이러스, 비콰르타바이러스, Bxz1바이러스, Cd119바이러스, Cp51바이러스, Cvm10바이러스, Eah2바이러스, 엘바이러스, 하푸나바이러스, 짐머바이러스, Kpp10바이러스, M12바이러스, 마키나바이러스, 마샤바이러스, Msw3바이러스, 뮤바이러스, 미오할로바이러스, Nit1바이러스, P1바이러스, 파크푸나바이러스, 프부나바이러스, Phikz바이러스, Rheph4바이러스, Rsl2바이러스, Rsluna바이러스, 세쿤다5바이러스, Sep1바이러스, Spn3바이러스, 스부나바이러스, Tg1바이러스, Vhml바이러스 및 Wph바이러스)
- 포도비리다에 (Pdoviridae) 과 (예컨대, 제한없이, 속 Fri1바이러스, Kp32바이러스, Kp34바이러스, Phikmv바이러스, 프라도바이러스, Sp6바이러스, T7바이러스, Cp1바이러스, P68바이러스, Phi29바이러스, 노나33바이러스, Pocj바이러스, Tl2011바이러스, Bcep22바이러스, Bpp1바이러스, Cba41바이러스, Dfl12바이러스, Ea92바이러스, 엡실론15바이러스, F116바이러스, G7c바이러스, Jwalpha바이러스, Kf1바이러스, Kpp25바이러스, Lit1바이러스, Luz24바이러스, Luz7바이러스, N4바이러스, 노나나바이러스, P22바이러스, 페이지바이러스, 피에코32바이러스, Prtb바이러스, Sp58바이러스, 우나961바이러스 및 Vp5바이러스)
-시포비리다에 (Siphoviridae) 과 (예컨대, 제한없이, 속 캄바이러스, 리카바이러스, R4바이러스, 아카디안바이러스, 쿠퍼바이러스, Pg1바이러스, 파이프피시바이러스, 로세부시바이러스, 브루히타바이러스, Che9c바이러스, 호크아이바이러스, Plot바이러스, 저지바이러스, K1g바이러스, Sp31바이러스, Lmd1바이러스, 우나4바이러스, 봉고바이러스, 레이바이러스, 버터스바이러스, 찰리바이러스, 레디바이러스, 박스터바이러스, 님파도라바이러스, 비그누즈바이러스, 피시번바이러스, 파이욘스바이러스, Kp36바이러스, 로그1바이러스, Rtp바이러스, T1바이러스, Tls바이러스, Ab18바이러스, 아미고바이러스, 아나톨바이러스, 안드로메다바이러스, 아티스바이러스, 반야드바이러스, 베르날13바이러스, 비셉티마바이러스, 브론바이러스, C2바이러스, C5바이러스, Cba181바이러스, Cbast바이러스, 세시바이러스, Che8바이러스, Chi바이러스, Cjw1바이러스, 콘독바이러스, 크로누스바이러스, D3112바이러스, D3바이러스, 데쿠로바이러스, 데모스테네스바이러스, 두세트바이러스, E125바이러스, 에이아우바이러스, Ff47바이러스, 가이아바이러스, 자일스바이러스, 고르돈바이러스, Gordtnk바이러스, 해리슨바이러스, Hk578바이러스, Hk97바이러스, 젠스트바이러스, Jwx바이러스, 켈레지오바이러스, 코라바이러스, L5바이러스, 람다바이러스, 라로이에바이러스, 리에피에바이러스, 마빈바이러스, 머드캣바이러스, N15바이러스, 노나그바이러스, Np1바이러스, 오메가바이러스, P12002바이러스, P12024바이러스, P23바이러스, P70바이러스, Pa6바이러스, Pamx74바이러스, 페이션스바이러스, Pbi1바이러스, Pepy6바이러스, Pfr1바이러스, Phic31바이러스, Phicbk바이러스, 피에타바이러스, Phif엘바이러스, Phijl1바이러스, Pis4a바이러스, Psa바이러스, 프시무나바이러스, Rdjl바이러스, Rer2바이러스, Sap6바이러스, Send513바이러스, 셉티마3바이러스, 쇠라바이러스, 섹스택바이러스, Sfi11바이러스, Sfi21dt1바이러스, 시타라바이러스, Sk1바이러스, 슬래시바이러스, 스무디바이러스, 수프스바이러스, Spbeta바이러스, Ssp2바이러스, T5바이러스, 탱크바이러스, 틴2바이러스, 티탄바이러스, Tm4바이러스, Tp21바이러스, Tp84바이러스, 트리아바이러스, 트리진타두오바이러스, 베가스바이러스, 벤데타바이러스, Wbeta바이러스, 와일드캣바이러스, 위저드바이러스, 오우스바이러스, Xp10바이러스, Ydn12바이러스 및 유아바이러스)
-악커만비리다에 (Ackermannviridae) 과 (예컨대, 제한없이, 속 Ag3바이러스, 라임스톤바이러스, Cba120바이러스 및 Vi1바이러스)
임의로, 박테리오파지는 카우도비랄레스 목의 일부는 아니지만 미지정목의 과 예컨대, 제한없이, 텍티비리다에 (Tectiviridae) 과 (예컨대 속 알파텍티바이러스, 베타텍티바이러스), 코르티코비리다에 (Corticoviridae) 과 (예컨대 속 코르티코바이러스), 패밀리 이노비리다에 (Inoviridae) 과 (예컨대 속 피브로바이러스, 하베니바이러스, 이노바이러스, 리네아바이러스, 플렉트로바이러스, 사에티바이러스, 베스퍼틸리오바이러스), 시스토비리다에 (Cystoviridae) 과 (예컨대 속 시스토바이러스), 레비비리다에 (Leviviridae) 과 (예컨대 속 알ㄹ로레비바이러스, 레비바이러스), 미크로비리다에 (Microviridae) 과 (예컨대 속 알파3미크로바이러스, G4미크로바이러스, Phix174미크로바이러스, 브델로미크로바이러스, 클라미디아미크로바이러스, 스피로미크로바이러스) 및 플라스마비리다에 (Plasmaviridae) 과 (예컨대 속 플라스마바이러스)이다.
임의로, 박테리오파지는 고세균을 표적으로 하지만 카우도비랄레스 목의 일부는 아니나 미지정 목의 과 예컨대, 제한없이, 암풀라비리다에 (Ampullaviridae), 푸셀로비리다에 (FuselloViridae), 글로불로비리다에 (Globuloviridae), 구타비리다에 (Guttaviridae), 리포트릭스비리다에 (Lipothrixviridae), 플레올리포비리다에 (Pleolipoviridae), 루디비리다에 (Rudiviridae), 살터프로바이러스 및 비카우다비리다에 (Bicaudaviridae)이다.
박테리아 속 및 그들 기지의 숙주-특이적 박테리아 바이러스의 비제한적인 목적을 하기 단락에 표시한다. 동의어 및 철자 변형은 괄호 안에 표시된다. 동음이의어는 그들이 발생할 때마다 반복된다 (예를 들어, D, D, d). 무명의 파지는 그들 속 옆에 "NN"로 표시되고, 그들 번호는 괄호 안에 제공된다.
악티노마이세스 (Actinomyces) 속의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염될 수 있다: Av-I, Av-2, Av-3, BF307, CTl, CT2, CT3, CT4, CT6, CT7, CT8 및 1281.
아에로모나스 (Aeromonas) 속의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염될 수 있다: AA-I, Aeh2, N, PMl, TP446, 3, 4, 11, 13, 29, 31, 32, 37, 43, 43-10T, 51, 54, 55R.1, 56, 56RR2, 57, 58, 59.1, 60, 63, Aehl, F, PM2, 1, 25, 31, 40RR2.8t, (syn= 44R), (syn= 44RR2.8t), 65, PM3, PM4, PM5 및 PM6.
바실러스 (Bacillus) 속의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염될 수 있다: A, aizl, Al-K-I, B, BCJAl, BCl, BC2, BLLl, BLl, BP142, BSLl, BSL2, BSl, BS3, BS8, BS15, BS18, BS22, BS26, BS28, BS31, BS104, BS105, BS106, BTB, B1715V1, C, CK-I, Coll, Corl, CP-53, CS-I, CSi, D, D, D, D5, entl, FP8, FP9, FSi, FS2, FS3, FS5, FS8, FS9, G, GH8, GT8, GV-I, GV-2, GT-4, g3, gl2, gl3, gl4, gl6, gl7, g21, g23, g24, g29, H2, kenl, KK-88, Kuml, Kyul, J7W-1, LP52, (syn= LP-52), L7, Mexl, MJ-I, mor2, MP-7, MPlO, MP12, MP14, MP15, Neol, N°2, N5, N6P, PBCl, PBLA, PBPl, P2, S-a, SF2, SF6, Shal, Sill, SP02, (syn= ΦSPP1), SPβ, STI, STi, SU-Il, t, TbI, Tb2, Tb5, TbIO, Tb26, Tb51, Tb53, Tb55, Tb77, Tb97, Tb99, Tb560, Tb595, Td8, Td6, Tdl5, TgI, Tg4, Tg6, Tg7, Tg9, TgIO, TgIl, Tgl3, Tgl5, Tg21, Tinl, Tin7, Tin8, Tinl3, Tm3, Tocl, Togl, toll, TP-I, TP-10vir, TP-15c, TP-16c, TP-17c, TP-19, TP35, TP51, TP-84, Tt4, Tt6, A형, B형, C형, D형, E형, Tφ3, VA-9, W, wx23, wx26, Yunl, α, γ, pl l, φmed-2, φT, φμ4, φ3T, φ75, φlO5, (syn= φlO5), IA, IB, 1-97A, 1-97B, 2, 2, 3, 3, 3, 5, 12, 14, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 41C, 51, 63, 64, 138D, I, II, IV, NN-Bacillus (13), alel, ARl, AR2, AR3, AR7, AR9, Bace-11, (syn= 11), 바스티유, BLl, BL2, BL3, BL4, BL5, BL6, BL8, BL9, BP124, BS28, BS80, Ch, CP-51, CP-54, D-5, darl, denl, DP-7, entl, FoSi, FoS2, FS4, FS6, FS7, G, gall, 감마, GEl, GF-2, GSi, GT-I, GT-2, GT-3, GT-4, GT-5, GT-6, GT-7, GV-6, gl5, 19, 110, ISi, K, MP9, MP13, MP21, MP23, MP24, MP28, MP29, MP30, MP32, MP34, MP36, MP37, MP39, MP40, MP41, MP43, MP44, MP45, MP47, MP50, NLP-I, No.l, N17, N19, PBSl, PKl, PMBl, PMB12, PMJl, S, SPOl, SP3, SP5, SP6, SP7, SP8, SP9, SPlO, SP-15, SP50, (syn= SP-50), SP82, SST, subl, SW, Tg8, Tgl2, Tgl3, Tgl4, thul, thuΛ, thuS, Tin4, Tin23, TP-13, TP33, TP50, TSP-I, V형, VI형, V, Vx, β22, φe, φNR2, φ25, φ63, 1, 1, 2, 2C, 3NT, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 12, 17, 18, 19, 21, 138, III, 4 (비. 메가테리운 (B. megateriwn)), 4 (비. 스파에리커스 (B. sphaericus)), AR13, BPP-IO, BS32, BS107, Bl, B2, GA-I, GP-IO, GV-3, GV-5, g8, MP20, MP27, MP49, Nf, PP5, PP6, SF5, Tgl8, TP-I, 베르사이유, φl5, φ29, 1-97, 837/IV, m-Bacillus (1), BatlO, BSLlO, BSLI l, BS6, BSI l, BS16, BS23, BSlOl, BS102, gl8, morl, PBLl, SN45, thu2, thu3, TmI, Tm2, TP-20, TP21, TP52, F형, G형, IV형, HN-BacMus (3), BLE, (syn= θc), BS2, BS4, BS5, BS7, BlO, B12, BS20, BS21, F, MJ-4, PBA12, AP50, AP50-04, AP50-11, AP50-23, AP50-26, AP50-27 및 Bam35. 하기 바실러스-특이적 파지는 결함성이다: DLP10716, DLP-11946, DPB5, DPB12, DPB21, DPB22, DPB23, GA-2, M, No. IM, PBLB, PBSH, PBSV, PBSW, PBSX, PBSY, PBSZ, phi, SPa, 1형 및 μ.
박테로이데스 (Bacteroides) 속의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염될 수 있다: crAss-파지, ad I2, Baf-44, Baf-48B, Baf-64, Bf-I, Bf-52, B40-8, Fl, βl, φAl, φBrOl, φBrO2, 11, 67.1, 67.3, 68.1, mt-박테로이데스 (3), Bf42, Bf71, HN-브델로비브리오 (1) 및 BF-41.
보르데텔라 (Bordetella) 속의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염될 수 있다: 134 및 NN-보르데텔라 (3).
보렐리아 (Borrellia) 속의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염될 수 있다: NN-보렐리아 (1) 및 NN-보렐리아 (2).
브루셀라 (Brucella) 속의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염될 수 있다: A422, Bk, (syn= 버클리), BM29, FOi, (syn= FOl), (syn= FQl), D, FP2, (syn= FP2), (syn= FD2), Fz, (syn= Fz75/13), (syn= 피렌체 75/13), (syn= Fi), Fi, (syn= Fl), Fim, (syn= FIm), (syn= Fim), FiU, (syn= FlU), (syn= FiU), F2, (syn= F2), F3, (syn= F3), F4, (syn= F4), F5, (syn= F5), F6, F7, (syn= F7), F25, (syn= F25), (syn= £25), F25U, (syn= F25u), (syn= F25U), (syn= F25V), F44, (syn- F44), F45, (syn= F45), F48, (syn= F48), I, Im, M, MC/75, M51, (syn= M85), P, (syn= D), S708, R, Tb, (syn= TB), (syn= 트빌리시), W, (syn= Wb), (syn= 웨이브릿지), X, 3, 6, 7, 10/1, (syn= 10), (syn= F8), (syn= F8), 12m, 24/11, (syn= 24), (syn= F9), (syn= F9), 45/111, (syn= 45), 75, 84, 212/XV, (syn= 212), (syn= Fi0), (syn= FlO), 371/XXIX, (syn= 371), (syn= Fn), (syn= Fl l) 및 513.
버크홀데리아 (Burkholderia) 속의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염될 수 있다: CP75, NN-버크홀데리아 (1) 및 42.
캄필로박터 (Campylobacter)의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염될 수 있다: C형, NTCC12669, NTCC12670, NTCC12671, NTCC12672, NTCC12673, NTCC12674, NTCC12675, NTCC12676, NTCC12677, NTCC12678, NTCC12679, NTCC12680, NTCC12681, NTCC12682, NTCC12683, NTCC12684, 32f, 111c, 191, NN-캄필로박터 (2), Vfi-6, (syn= V19), VfV-3, V2, V3, V8, V16, (syn= Vfi-1), V19, V20(V45), V45, (syn= V-45) 및 NN-캄필로박터 (1).
클라미디아 (클라미디아) 속의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염될 수 있다: Chpl.
클로스트리듐 (Clostridium) 속의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염될 수 있다: CAKl, CA5, Ca7, CEβ, (syn= 1C), CEγ, Cldl, c-n71, c-203 Tox-, DEβ, (syn= ID), (syn= lDt0X+), HM3, KMl, KT, Ms, NAl, (syn= Naltox+), PA135Oe, Pfo, PL73, PL78, PL81, Pl, P50, P5771, P19402, lCt0X+, 2Ct0X\ 2D3 (syn= 2Dt0X+), 3C, (syn= 3Ctox+), 4C, (syn= 4Ct0X+), 56, III-l, NN-클로스트리듐 (61), NBlt0X+, αl, CAl, HMT, HM2, PFl5 P-23, P-46, Q-05, Q-oe, Q-16, Q-21, Q-26, Q-40, Q-46, S111, SA02, WA01, WA03, Wm, W523, 80, C, CA2, CA3, CPTl, CPT4, cl, c4, c5, HM7, H11/A1, H18/Ax, FWS23, Hi58ZA1, K2ZA1, K21ZS23, ML, NA2t0X; Pf2, Pf3, Pf4, S9ZS3, S41ZA1, S44ZS23, α2, 41, 112ZS23, 214/S23, 233/Ai, 234/S23, 235/S23, II-l, II-2, II-3, NN-클로스트리듐 (12), CAl, Fl, K, S2, 1, 5 및 NN-클로스트리듐 (8).
코리네박테리움 (Corynebacterium) 속의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염될 수 있다: CGKl (결함성), A, A2, A3, AlOl, A128, A133, A137, A139, A155, A182, B, BF, B17, B18, B51, B271, B275, B276, B277, B279, B282, C, capi, CCl, CGl, CG2, CG33, CL31, Cog, (syn= CG5), D, E, F, H, H-I, hqi, hq2, 11ZH33, Ii/31, J, K, K, (syn= Ktox"), L, L, (syn= Ltox+), M, MC-I, MC-2, MC-3, MC-4, MLMa, N, O, ovi, ov2, ov3, P, P, R, RP6, RS29, S, T, U, UB1, ub2, UH1, UH3, uh3, uh5, uh6, β, (syn= βtox+), βhv64, βvir, γ, (syn= γtoχ-), γl9, δ, (syn= δ'ox+), p, (syn= ptoχ-), Φ9, φ984, ω, IA, 1/1180, 2, 2/1180, 5/1180, 5ad/9717, 7/4465, 8/4465, 8ad/10269, 10/9253, 13Z9253, 15/3148, 21/9253, 28, 29, 55, 2747, 2893, 4498 및 5848.
엔테로코쿠스 (Enterococcus) 속의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: DF78, Fl, F2, 1, 2, 4, 14, 41, 867, Dl, SB24, 2BV, 182, 225, C2, C2F, E3, E62, DS96, H24, M35, P3, P9, SBlOl, S2, 2BII, 5, 182a, 705, 873, 881, 940, 1051, 1057, 21096C, NN-엔테로코쿠스 (1), PEl, Fl, F3, F4, VD13, 1, 200, 235 및 341.
에리시펠로트릭스 (Erysipelothrix) 속의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염될 수 있다: NN-에이시펠로트릭스 (1).
에스케리치아 (에스케리치아) 속의 박테리아는 파지 하기에 의해 감염될 수 있다: BW73, B278, D6, D108, E, El, E24, E41, FI-2, FI-4, FI-5, HI8A, Ffl8B, i, MM, Mu, (syn= mu), (syn= MuI), (syn= Mu-I), (syn= MU-I), (syn= MuI), (syn= μ), 025, PhI-5, Pk, PSP3, Pl, PlD, P2, P4 (결함성), Sl, Wφ, φK13, φR73 (결함성), φl, φ2, φ7, φ92, ø (결함성), 7 A, 8φ, 9φ, 15 (결함성), 18, 28-1, 186, 299, HH-에스케리치아 (2), AB48, CM, C4, C16, DD-VI, (syn= Dd-Vi), (syn= DDVI), (syn= DDVi), E4, E7, E28, FIl, FI3, H, Hl, H3, H8, K3, M, N, ND-2, ND-3, ND4, ND-5, ND6, ND-7, Ox-I (syn= OXl), (syn= HF), Ox-2 (syn= 0x2), (syn= 0X2), Ox-3, Ox-4, Ox-5, (syn= 0X5), Ox-6, (syn= 66F), (syn= φ66t), (syn= φ66t-)5 0111, PhI-I, RB42, RB43, RB49, RB69, S, SaI-I, Sal-2, Sal-3, Sal-4, Sal-5, Sal-6, TC23, TC45, TuII*-6, (syn= TuII*), TuIP-24, TuII*46, TuIP-60, T2, (syn= ganuTia), (syn= γ), (syn= PC), (syn= P.C.), (syn= T-2), (syn= T2), (syn= P4), T4, (syn= T-4), (syn= T4), T6, T35, αl, 1, IA, 3, (syn= Ac3), 3A, 3T+, (syn= 3), (syn= Ml), 5φ, (syn= φ5), 9266Q, CFO103, HK620, J, K, KlF, m59, no. A, no. E, no. 3, no. 9, N4, sd, (syn= Sd), (syn= SD), (syn= Sa)3 (syn= sd), (syn= SD), (syn= CD), T3, (syn= T-3), (syn= T3), T7, (syn= T-7), (syn= T7), WPK, W31, ΔH, φC3888, φK3, φK7, φK12, φV-1, Φ04-CF, Φ05, Φ06, Φ07, φl, φl.2, φ20, φ95, φ263, φlO92, φl, φll, (syn=φW), Ω8, 1, 3, 7, 8, 26, 27, 28-2, 29, 30, 31, 32, 38, 39, 42, 933W, NN-에스케리치아 (1), Esc-7-11, AC30, CVX-5, Cl, DDUP, ECl, EC2, E21, E29, Fl, F26S, F27S, Hi, HK022, HK97, (syn= ΦHK97), HK139, HK253, HK256, K7, ND-I, no.D, PA-2, q, S2, Tl, (syn= α), (syn= P28), (syn= T-I), (syn= Tx), T3C, T5, (syn= T-5), (syn= T5), UC-I, w, β4, γ2, λ (syn= 람다), (syn= Φλ), ΦD326, φγ, Φ06, Φ7, Φ10, φ80, χ (syn= χi), (syn= φχ), (syn= φχi), 2, 4, 4A, 6, 8A, 102, 150, 168, 174, 3000, AC6, AC7, AC28, AC43, AC50, AC57, AC81, AC95, HK243, KlO, ZG/3A, 5, 5A, 21EL, H19-J, 933H, O157 타이핑 파지 1 내지 16, JES-2013, 121Q, 172-1, 1720a-02, ADB-2, AKFV33, av-05, bV_EcoS_AHP42, bV_EcoS_AHP24, bC_EcoS_AHS24, bV_EcoS_AKS96, CBA120.
푸소박테리움 (Fusobacterium) 속의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: NN-푸소박테리움 (2), fv83-554/3, fv88-531/2, 227, fv2377, fv2527 및 fv8501.
해모필러스 (Haemophilus) 속의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: HPl, S2 및 N3.
헤릴코박터 (Helicobacter) 속의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: HPl 및 ^^-헬리코박터 (1).
클렙시엘라 (Klebsiella) 속의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: AIO-2, KI4B, Kl6B, Kl9, (syn= K19), Kl14, Kl15, Kl21, Kl28, Kl29, KI32, Kl33, Kl35, Kl106B, Kl171B, Kl181B, Kl832B, AIO-I, AO-I, AO-2, AO-3, FC3-10, K, Kl1, (syn= KIl), Kl2, (syn= K12), Kl3, (syn= K13), (syn= Kl 70/11), Kl4, (syn= K14), Kl5, (syn= K15), Kl6, (syn= K16), Kl7, (syn= K17), Kl8, (syn= K18), Kl19, (syn= K19), Kl27, (syn= K127), Kl31, (syn= K131), Kl35, Kl171B, II, VI, IX, CI-I, Kl4B, Kl8, Kl11, Kl12, Kl13, Kl16, Kl17, Kl18, Kl20, Kl22, Kl23, Kl24, Kl26, Kl30, Kl34, Kl106B, KIi65B, Kl328B, KLXI, K328, P5046, 11, 380, III, IV, VII, VIII, FC3-11, Kl2B, (syn= K12B), Kl25, (syn= K125), Kl42B, (syn= K142), (syn= K142B), Kl181B, (syn= KIl 81), (syn= K1181B), Kl765/!, (syn= K1765/1), Kl842B, (syn= K1832B), Kl937B, (syn= K1937B), Ll, φ28, 7, 231, 483, 490, 632 및 864/100.
레피토스피라 (Lepitospira) 속의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: LEl, LE3, LE4 및 ∼NN-렙토스피라 (1).
리스테리아 (Listeria) 속의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: A511, 01761, 4211, 4286, (syn= BO54), A005, A006, A020, A500, A502, A511, Al 18, A620, A640, B012, B021, B024, B025, B035, B051, B053, B054, B055, B056, BlOl, BI lO, B545, B604, B653, C707, D441, HSO47, HlOG, H8/73, H19, H21, H43, H46, H107, H108, HI lO, H163/84, H312, H340, H387, H391/73, H684/74, H924A, PSA, U153, φMLUP5, (syn= P35), 00241, 00611, 02971A, 02971C, 5/476, 5/911, 5/939, 5/11302, 5/11605, 5/11704, 184, 575, 633, 699/694, 744, 900, 1090, 1317, 1444, 1652, 1806, 1807, 1921/959, 1921/11367, 1921/11500, 1921/11566, 1921/12460, 1921/12582, 1967, 2389, 2425, 2671, 2685, 3274, 3550, 3551, 3552, 4276, 4277, 4292, 4477, 5337, 5348/11363, 5348/11646, 5348/12430, 5348/12434, 10072, 11355C, 11711A, 12029, 12981, 13441, 90666, 90816, 93253, 907515, 910716 및 NN-리스페리아 (15).
모르가넬라 (Morganella) 속의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: 47.
마이코박테리움 (Mycobacterium) 속의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: 13, AGl, ALi, ATCC 11759, A2, B.C3, BG2, BKl, BK5, butyricum, B-I, B5, B7, B30, B35, Clark, Cl, C2, DNAIII, DSP1, D4, D29, GS4E, (syn= GS4E), GS7, (syn= GS-7), (syn= GS7), IPa, 락티콜라, 레장드르, Leo, L5, (syn= ΦL-5), MC-I, MC-3, MC-4, 미네티, MTPHI l, Mx4, MyF3P/59a, phlei, (syn= phlei 1), phlei 4, 폴로누스 II, 라비노비츠, 스메그마티스, TM4, TM9, TMlO, TM20, Y7, YlO, φ630, IB, IF, IH, 1/1, 67, 106, 1430, Bl, (syn= Bol), B24, D, D29, F-K, F-S, HP, 폴로누스 I, Roy, Rl, (syn= Rl-Myb), (syn= Ri), 11, 31, 40, 50, 103a, 103b, 128, 3111-D, 3215-D 및 NN-마이코박테리움 (1).
네이세리아 (Neisseria) 속의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다e: 그룹 I, 그룹 II 및 NPl.
노카르디아 (Nocardia) 속의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: MNP8, NJ-L, NS-8, N5 및 TtiN-노카르디아.
프로테우스 (Proteus) 속의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: Pm5, 13vir, 2/44, 4/545, 6/1004, 13/807, 20/826, 57, 67b, 78, 107/69, 121, 9/0, 22/608, 30/680, PmI, Pm3, Pm4, Pm6, Pm7, Pm9, PmIO, PmI l, Pv2, пl, φm, 7/549, 9B/2, 10A/31, 12/55, 14, 15, 16/789, 17/971, 19A/653, 23/532, 25/909, 26/219, 27/953, 32A/909, 33/971, 34/13, 65, 5006M, 7480b, VI, 13/3a, 클리키 12, п2600, φχ7, 1/1004, 5/742, 9, 12, 14, 22, 24/860, 2600/D52, Pm8 및 24/2514.
프로비덴시아 (Providencia) 속의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: PL25, PL26, PL37, 9211/9295, 9213/921 Ib, 9248, 7/R49, 7476/322, 7478/325, 7479, 7480, 9000/9402 및 9213/921 Ia.
슈도모나스 (Pseudomonas) 속의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: PfI, (syn= Pf-I), Pf2, Pf3, PP7, PRRl, 7s, im-슈도모나스 (1), AI-I, AI-2, B 17, B89, CB3, Col 2, Col 11, Col 18, Col 21, C154, C163, C167, C2121, E79, F8, ga, gb, H22, K1, M4, N2, Nu, PB-I, (syn= PBl), pfl6, PMN17, PPl, PP8, Psal, PsPl, PsP2, PsP3, PsP4, PsP5, PS3, PS17, PTB80, PX4, PX7, PYOl, PYO2, PYO5, PYO6, PYO9, PYOlO, PYO13, PYO14, PYO16, PYO18, PYO19, PYO20, PYO29, PYO32, PYO33, PYO35, PYO36, PYO37, PYO38, PYO39, PYO41, PYO42, PYO45, PYO47, PYO48, PYO64, PYO69, PYO103, PlK, SLPl, SL2, S2, UNL-I, wy, Yai, Ya4, Yan, φBE, φCTX, φC17, φKZ, (syn=ΦKZ), φ-LT, Φmu78, φNZ, φPLS-1, φST-1, φW-14, φ-2, 1/72, 2/79, 3, 3/DO, 4/237, 5/406, 6C, 6/6660, 7, 7v, 7/184, 8/280, 9/95, 10/502, 11/DE, 12/100, 12S, 16, 21, 24, 25F, 27, 31, 44, 68, 71, 95, 109, 188, 337, 352, 1214, NN-슈도모나스 (23), A856, B26, CI-I, CI-2, C5, D, gh-1, Fl 16, HF, H90, K5, K6, Kl 04, K109, K166, K267, N4, N5, O6N-25P, PE69, Pf, PPN25, PPN35, PPN89, PPN91, PP2, PP3, PP4, PP6, PP7, PP8, PP56, PP87, PPl 14, PP206, PP207, PP306, PP651, Psp231a, Pssy401, Pssy9220, psi, PTB2, PTB20, PTB42, PXl, PX3, PXlO, PX12, PX14, PYO70, PYO71, R, SH6, SH133, tf, Ya5, Ya7, φBS, ΦKf77, φ-MC, ΦmnF82, φPLS27, φPLS743, φS-1, 1, 2, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 12B, 13, 14, 15, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 20, 21, 21, 22, 23, 23, 24, 25, 31, 53, 73, 119x, 145, 147, 170, 267, 284, 308, 525, NN-슈도모나스 (5), af, A7, B3, B33, B39, BI-I, C22, D3, D37, D40, D62, D3112, F7, FlO, g, gd, ge, gξ, Hwl2, Jb 19, KFl, L°, OXN-32P, O6N-52P, PCH-I, PC13-1, PC35-1, PH2, PH51, PH93, PH132, PMW, PM13, PM57, PM61, PM62, PM63, PM69, PM105, PMl 13, PM681, PM682, PO4, PPl, PP4, PP5, PP64, PP65, PP66, PP71, PP86, PP88, PP92, PP401, PP711, PP891, Pssy41, Pssy42, Pssy403, Pssy404, Pssy420, Pssy923, PS4, PS-IO, Pz, SDl, SLl, SL3, SL5, SM, φC5, φCl l, φCl l-1, φC13, φC15, φMO, φX, φO4, φl l, φ240, 2, 2F, 5, 7m, 11, 13, 13/441, 14, 20, 24, 40, 45, 49, 61, 73, 148, 160, 198, 218, 222, 236, 242, 246, 249, 258, 269, 295, 297, 309, 318, 342, 350, 351, 357-1, 400-1, HN-슈도모나스 (6), GlOl, M6, M6a, Ll, PB2, Pssyl5, Pssy4210, Pssy4220, PYO12, PYO34, PYO49, PYO50, PYO51, PYO52, PYO53, PYO57, PYO59, PYO200, PX2, PX5, SL4, φO3, φO6 및 1214.
리켓치아 (Rickettsia) 속의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: NN-리켓치아.
살모넬라 (Salmonella) 속의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: b, 벡클레스, CT, d, 던디, f, FeIs 2, GI, GUI, GVI, GVIII, k, K, i, j, L, 01, (syn= 0-1), (syn= O1), (syn= O-I), (syn= 7), 02, 03, P3, P9a, PlO, Sab3, Sab5, SanlS, Sanl7, SI, 타운톤, ViI, (syn= ViI), 9, im살모넬라 (1), N-I, N-5, N-IO, N-17, N-22, 11, 12, 16-19, 20.2, 36, 449C/C178, 966A/C259, a, B.A.O.R., e, G4, GUI, L, LP7, M, MG40, N-18, PSA68, P4, P9c, P22, (syn= P22), (syn= PLT22), (syn= PLT22), P22al, P22-4, P22-7, P22-11, SNT-I, SNT-2, SP6, Villi, ViIV, ViV, ViVI, ViVII, 워크솝, Sj5, ε34, 1,37, 1(40), (syn= φl[40]), 1,422, 2, 2.5, 3b, 4, 5, 6,14(18), 8, 14(6,7), 10, 27, 28B, 30, 31, 32, 33, 34, 36, 37, 39, 1412, SNT-3, 7-11, 40.3, c, C236, C557, C625, C966N, g, GV, G5, Gl 73, h, IRA, 저지, MB78, P22-1, P22-3, P22-12, Sabl, Sab2, Sab2, Sab4, Sanl, San2, San3, San4, San6, San7, San8, San9, Sanl3, Sanl4, Sanl6, Sanl8, Sanl9, San20, San21, San22, San23, San24, San25, San26, SasLl, SasL2, SasL3, SasL4, SasL5, SlBL, SII, ViII, φl, 1, 2, 3a, 3al, 1010, Ym-살모넬라 (1), N-4, SasL6 및 27.
세라티아 (Serratia) 속의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: A2P, PS20, SMB3, SMP, SMP5, SM2, V40, V56, ic, ΦCP-3, ΦCP-6, 3M, 10/la, 20A, 34CC, 34H, 38T, 345G, 345P, 501B, SMB2, SMP2, BC, BT, CW2, CW3, CW4, CW5, Lt232, L2232, L34, L.228, SLP, SMPA, V.43, σ, φCWl, ΦCP6-1, ΦCP6-2, ΦCP6-5, 3T, 5, 8, 9F, 10/1, 2OE, 32/6, 34B, 34CT, 34P, 37, 41, 56, 56D, 56P, 6OP, 61/6, 74/6, 76/4, 101/8900, 226, 227, 228, 229F, 286, 289, 290F, 512, 764a, 2847/10, 2847/1Oa, L.359 및 SMBl.
시겔라 (시겔라) 속의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: Fsa, (syn=a), FSD2d, (syn= D2d), (syn= W2d), FSD2E, (syn= W2e), fv, F6, f7.8, H-Sh, PE5, P90, SfII, Sh, SHm, SHrv, (syn= HIV), SHvi, (syn= HVI), SHVvm, (syn= HVIII), SKγ66, (syn= 감마 66), (syn= yββ), (syn= γ66b), SKm, (syn= SIIIb)5 (syn= UI), SKw, (syn= Siva), (syn= IV), SIC™, (syn= SIVA.), (syn= IVA), SKvi, (syn= KVI), (syn= Svi), (syn= VI), SKvm, (syn= Svm), (syn= VIII), SKVÐIA, (syn= SvmA), (syn= VIIIA), STvi, STK, STx1, STxn, S66, W2, (syn= D2c), (syn= D20), φl, φIVb 3-SO-R, 8368-SO-R, F7, (syn= FS7), (syn= K29), FlO, (syn= FSlO), (syn= K31), I1, (syn= alfa), (syn= FSa), (syn= Kl 8), (syn= α), I2, (syn= a), (syn= K19), SG33, (syn= G35), (syn= SO-35/G), SG35, (syn= SO-55/G), SG3201, (syn= SO-3201/G), SHn, (syn= HII), SHv, (syn= SHV), SHx, SHX, SKn, (syn= K2), (syn= KII), (syn= Sn), (syn= SsII), (syn= II), SKrv, (syn= Sm), (syn= SsIV), (syn= IV), SK1Va, (syn= Swab), (syn= SsIVa), (syn= IVa), SKV, (syn= K4), (syn= KV), (syn= SV), (syn= SsV), (syn= V), SKx, (syn= K9), (syn= KX), (syn= SX), (syn= SsX), (syn= X), STV, (syn= T35), (syn= 35-50-R), STvm, (syn= T8345), (syn= 8345-SO-S-R), W1, (syn= D8), (syn= FSD8), W2a, (syn= D2A), (syn= FS2a), DD-2, Sf6, FSi, (syn= Fl), SF6, (syn= F6), SG42, (syn= SO-42/G), SG3203, (syn= SO-3203/G), SKF12, (syn= SsF12), (syn= F12), (syn= F12), STn, (syn= 1881-SO-R), γ66, (syn= 감마 66a), (syn= Ssγ66), φ2, BIl, DDVII, (syn= DD7), FSD2b, (syn= W2B), FS2, (syn= F2), (syn= F2), FS4, (syn= F4), (syn= F4), FS5, (syn= F5), (syn= F5), FS9, (syn= F9), (syn= F9), FI l, P2-S0-S, SG36, (syn= SO-36/G), (syn= G36), SG3204, (syn= SO-3204/G), SG3244, (syn= SO-3244/G), SHi, (syn= HI), SHvп, (syn= HVII), SHK, (syn= HIX), SHx1, SHxп, (syn= HXn), SKI, KI, (syn= S1), (syn= SsI), SKVII, (syn= KVII), (syn= Svп), (syn= SsVII), SKIX, (syn= KIX), (syn= S1x), (syn= SsIX), SKXII, (syn= KXII), (syn= Sxn), (syn= SsXII), STi, STffl, STrv, STVi, STvп, S70, S206, U2-S0-S, 3210-SO-S, 3859-SO-S, 4020-SO-S, φ3, φ5, φ7, φ8, φ9, φlO, φl l, φl3, φl4, φl8, SHm, (syn= Hпi), SHχi, (syn= HXt) 및 SKxI, (syn= KXI), (syn= Sχi), (syn= SsXI), (syn= XI).
스타필로코쿠스 (Staphylococcus) 속의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: A, EW, K, Ph5, Ph9, PhIO, Phl3, Pl, P2, P3, P4, P8, P9, PlO, RG, SB-i, (syn= Sb-I), S3K, 트워트, ΦSK311, φ812, 06, 40, 58, 119, 130, 131, 200, 1623, STCl, (syn=stcl), STC2, (syn=stc2), 44AHJD, 68, ACl, AC2, A6"C", A9"C", b581, CA-I, CA-2, CA-3, CA-4, CA-5, DI l, L39x35, L54a, M42, Nl, N2, N3, N4, N5, N7, N8, NlO, Ni l, N12, N13, N14, N16, Ph6, Phl2, Phl4, UC-18, U4, U15, Sl, S2, S3, S4, S5, X2, Z1, φB5-2, φD, ω, 11, (syn= φl l), (syn= P11-M15), 15, 28, 28A, 29, 31, 31B, 37, 42D, (syn= P42D), 44A, 48, 51, 52, 52A, (syn= P52A), 52B, 53, 55, 69, 71, (syn= P71), 71A, 72, 75, 76, 77, 79, 80, 80α, 82, 82A, 83 A, 84, 85, 86, 88, 88A, 89, 90, 92, 95, 96, 102, 107, 108, 111, 129-26, 130, 130A, 155, 157, 157A, 165, 187, 275, 275A, 275B, 356, 456, 459, 471, 471A, 489, 581, 676, 898, 1139, 1154A, 1259, 1314, 1380, 1405, 1563, 2148, 2638A, 2638B, 2638C, 2731, 2792A, 2792B, 2818, 2835, 2848A, 3619, 5841, 12100, AC3, A8, AlO, A13, b594n, D, HK2, N9, N15, P52, P87, Sl, S6, Z4, φRE, 3A, 3B, 3C, 6, 7, 16, 21, 42B, 42C, 42E, 44, 47, 47A5 47C, 51, 54, 54x1, 70, 73, 75, 78, 81, 82, 88, 93, 94, 101, 105, 110, 115, 129/16, 174, 594n, 1363/14, 2460 및 mS-스타필로코쿠스 (1).
스트렙토코쿠스 (Streptococcus) 속의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: EJ-I, NN-스트렙토코카이스 (1), a, Cl, FL0Ths, H39, Cp-I, Cρ-5, Cp-7, Cp-9, Cp-IO, AT298, A5, alO/Jl, alO/J2, alO/J5, alO/J9, A25, BTI l, b6, CAl, c20-l, c20-2, DP-I, Dp-4, DTl, ET42, elO, FA101, FEThs, Fκ, FKKIOI, FKLIO, FKP74, FKH, FLOThs, FyIOl, fl, F10, F20140/76, g, GT-234, HB3, (syn= HB-3), HB-623, HB-746, M102, O1205, φO1205, PST, PO, Pl, P2, P3, P5, P6, P8, P9, P9, P12, P13, P14, P49, P50, P51, P52, P53, P54, P55, P56, P57, P58, P59, P64, P67, P69, P71, P73, P75, P76, P77, P82, P83, P88, sc, sch, sf, SfIl 1, (syn= SFiI l), (syn= φSFill), (syn= ΦSfil l), (syn= φSfil l), sfil9, (syn= SFil9), (syn= φSFil9), (syn= φSfil9), Sfi21, (syn= SFi21), (syn= φSFi21), (syn= φSfi21), ST0, STX, st2, ST2, ST4, S3, (syn= φS3), s265, Φ17, φ42, Φ57, φ80, φ81, φ82, φ83, φ84, φ85, φ86, φ87, φ88, φ89, φ90, φ91, φ92, φ93, φ94, φ95, φ96, φ97, φ98, φ99, φlOO, φlOl, φlO2, φ227, Φ7201, ωl, ω2, ω3, ω4, ω5, ω6, ω8, ωlO, 1, 6, 9, 1OF, 12/12, 14, 17SR, 19S, 24, 50/33, 50/34, 55/14, 55/15, 70/35, 70/36, 71/ST15, 71/45, 71/46, 74F, 79/37, 79/38, 80/J4, 80/J9, 80/ST16, 80/15, 80/47, 80/48, 101, 103/39, 103/40, 121/41, 121/42, 123/43, 123/44, 124/44, 337/ST17 및 m스트렙토코쿠스 (34).
트레포네마 (Treponema) 속의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: NN-트레포네마 (1).
비브리오 (Vibrio) 속의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: CTXΦ, fs, (syn= si), fs2, Ivpf5, Vfl2, Vf33, VPIΦ, VSK, v6, 493, CP-Tl, ET25, 카파, K139, 라볼) XN-69P, OXN-86, O6N-21P, PB-I, P147, rp-1, SE3, VA-I, (syn= VcA-I), VcA-2, VPl, VP2, VP4, VP7, VP8, VP9, VPlO, VP17, VP18, VP19, X29, (syn= 29 데렐), t, ΦHAWI-1, ΦHAWI-2, ΦHAWI-3, ΦHAWI-4, ΦHAWI-5, ΦHAWI-6, ΦHAWI-7, XHAWI-8, ΦHAWI-9, ΦHAWI-10, ΦHCl-1, ΦHC1-2, ΦHC1-3, ΦHC1-4, ΦHC2-1, >HC2-2, ΦHC2-3, ΦHC2-4, ΦHC3-1, ΦHC3-2, ΦHC3-3, ΦHD1S-1, ΦHD1S-2, ΦHD2S-1, ΦHD2S-2, ΦHD2S-3, ΦHD2S-4, ΦHD2S-5, ΦHDO-1, ΦHDO-2, ΦHDO-3, ΦHDO-4, ΦHDO-5, ΦHDO-6, ΦKL-33, ΦKL-34, ΦKL-35, ΦKL-36, ΦKWH-2, ΦKWH-3, ΦKWH-4, ΦMARQ-1, ΦMARQ-2, ΦMARQ-3, ΦMOAT-1, ΦO139, ΦPEL1A-1, ΦPEL1A-2, ΦPEL8A-1, ΦPEL8A-2, ΦPEL8A-3, ΦPEL8C-1, ΦPEL8C-2, ΦPEL13A-1, ΦPEL13B-1, ΦPEL13B-2, ΦPEL13B-3, ΦPEL13B-4, ΦPEL13B-5, ΦPEL13B-6, ΦPEL13B-7, ΦPEL13B-8, ΦPEL13B-9, ΦPEL13B-10, φVP143, φVP253, Φ16, φl38, 1- II, 5, 13, 14, 16, 24, 32, 493, 6214, 7050, 7227, II, (syn= 그룹 II), (syn== φ2), V, VIII, ∼m-비브리오 (13), KVP20, KVP40, nt-1, O6N-22P, P68, el, e2, e3, e4, e5, FK, G, I, K, nt-6, Nl, N2, N3, N4, N5, O6N-34P, OXN-72P, OXN-85P, OXN-100P, P, Ph-I, PL163/10, Q, S, T, φ92, 1-9, 37, 51, 57, 70A-8, 72A-4, 72A-10, 110A-4, 333, 4996, I (syn= 그룹 I), III (syn= 그룹 III), VI, (syn= A-사라토브), VII, IX, X, HN-비브리오 (6), pAl, 7, 7-8, 70A-2, 71A-6, 72A-5, 72A-8, 108A-10, 109A-6, 109A-8, l lOA-1, 110A-5, 110A-7, hv-1, OXN-52P, P13, P38, P53, P65, P108, Pill, TPl3 VP3, VP6, VP12, VP13, 70A-3, 70A-4, 70A-10, 72A-1, 108A-3, 109-B1, 110A-2, 149, (syn= φl49), IV, (syn= 그룹 IV), NN-비브리오 (22), VP5, VPIl, VP15, VP16, αl, α2, α3a, α3b, 353B 및 HN-비브리오 (7).
여시니아 (Yersinia) 속의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: H, H-I, H-2, H-3, H-4, 루카스 110, 루카스 303, 루카스 404, YerA3, YerA7, YerA20, YerA41, 3/M64-76, 5/G394-76, 6/C753-76, 8/C239-76, 9/F18167, 1701, 1710, PST, 1/F2852-76, 데렐, EV, H, 코틀랴로바, PTB, R, Y, YerA41, φYerO3-12, 3, 4/C1324-76, 7/F783-76, 903, 1/M6176 및 Yer2AT.
보다 바람직하게, 박테리오파지는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 살모넬라 바이러스 SKML39, 시겔라 바이러스 AG3, 딕케야 바이러스 라임스톤, 딕케야 바이러스 RC2014, 에스케리치아 바이러스 CBA120, 에스케리치아 바이러스 PhaxI, 살모넬라 바이러스 38, 살모넬라 바이러스 Det7, 살모넬라 바이러스 GG32, 살모넬라 바이러스 PM10, 살모넬라 바이러스 SFP10, 살모넬라 바이러스 SH19, 살모넬라 바이러스 SJ3, 에스케리치아 바이러스 ECML4, 살모넬라 바이러스 마샬, 살모넬라 바이러스 메이나드, 살모넬라 바이러스 SJ2, 살모넬라 바이러스 STML131, 살모넬라 바이러스 ViI, 어위니아 바이러스 Ea2809, 클렙시엘라 바이러스 0507KN21, 세라티아 바이러스 IME250, 세라티아 바이러스 MAM1, 캄필로박터 바이러스 CP21, 캄필로박터 바이러스 CP220, 캄필로박터 바이러스 CPt10, 캄필로박터 바이러스 IBB35, 캄필로박터 바이러스 CP81, 캄필로박터 바이러스 CP30A, 캄필로박터 바이러스 CPX, 캄필로박터 바이러스 NCTC12673, 어위니아 바이러스 Ea214, 어위니아 바이러스 M7, 에스케리치아 바이러스 AYO145A, 에스케리치아 바이러스 EC6, 에스케리치아 바이러스 HY02, 에스케리치아 바이러스 JH2, 에스케리치아 바이러스 TP1, 에스케리치아 바이러스 VpaE1, 에스케리치아 바이러스 wV8, 살모넬라 바이러스 펠릭소1, 살모넬라 바이러스 HB2014, 살모넬라 바이러스 머시룸, 살모넬라 바이러스 UAB87, 시트로박터 바이러스 무글, 시트로박터 바이러스 모르딘, 에스케리치아 바이러스 SUSP1, 에스케리치아 바이러스 SUSP2, 아에로모나스 바이러스 phiO18P, 해모필러스 바이러스 HP1, 해모필러스 바이러스 HP2, 파스퇴렐라 바이러스 F108, 비브리오 바이러스 K139, 비브리오 바이러스 카파, 버크홀데리아 바이러스 phi52237, 버크홀데리아 바이러스 phiE122, 버크홀데리아 바이러스 phiE202, 에스케리치아 바이러스 186, 에스케리치아 바이러스 P4, 에스케리치아 바이러스 P2, 에스케리치아 바이러스 Wphi, 만헤이미아 바이러스 PHL101, 슈도모나스 바이러스 phiCTX, 랄스토니아 바이러스 RSA1, 살모넬라 바이러스 Fels2, 살모넬라 바이러스 PsP3, 살모넬라 바이러스 SopEphi, 여시니아 바이러스 L413C, 스타필로코쿠스 바이러스 G1, 스타필로코쿠스 바이러스 G15, 스타필로코쿠스 바이러스 JD7, 스타필로코쿠스 바이러스 K, 스타필로코쿠스 바이러스 MCE2014, 스타필로코쿠스 바이러스 P108, 스타필로코쿠스 바이러스 Rodi, 스타필로코쿠스 바이러스 S253, 스타필로코쿠스 바이러스 S25-4, 스타필로코쿠스 바이러스 SA12, 리스테리아 바이러스 A511, 리스테리아 바이러스 P100, 스타필로코쿠스 바이러스 레무스, 스타필로코쿠스 바이러스 SA11, 스타필로코쿠스 바이러스 Stau2, 바실러스 바이러스 캠프호크, 바실러스 바이러스 스포1, 바실러스 바이러스 BCP78, 바실러스 바이러스 챠르봄바, 스타필로코쿠스 바이러스 트워트, 엔테로코쿠스 바이러스 phiEC24C, 락토바실러스 바이러스 Lb338-1, 락토바실러스 바이러스 LP65, 엔테로박터 바이러스 PG7, 에스케리치아 바이러스 CC31, 클렙시엘라 바이러스 JD18, 클렙시엘라 바이러스 PKO111, 에스케리치아 바이러스 Bp7, 에스케리치아 바이러스 IME08, 에스케리치아 바이러스 JS10, 에스케리치아 바이러스 JS98, 에스케리치아 바이러스 QL01, 에스케리치아 바이러스 VR5, 엔테로박터 바이러스 Eap3, 클렙시엘라 바이러스 KP15, 클렙시엘라 바이러스 KP27, 클렙시엘라 바이러스 마티스, 클렙시엘라 바이러스 미로, 시트로박터 바이러스 멀린, 시트로박터 바이러스 문, 에스케리치아 바이러스 JSE, 에스케리치아 바이러스 phi1, 에스케리치아 바이러스 RB49, 에스케리치아 바이러스 HX01, 에스케리치아 바이러스 JS09, 에스케리치아 바이러스 RB69, 시겔라 바이러스 UTAM, 살모넬라 바이러스 S16, 살모넬라 바이러스 STML198, 비브리오 바이러스 KVP40, 비브리오 바이러스 nt1, 비브리오 바이러스 ValKK3, 에스케리치아 바이러스 VR7, 에스케리치아 바이러스 VR20, 에스케리치아 바이러스 VR25, 에스케리치아 바이러스 VR26, 시겔라 바이러스 SP18, 에스케리치아 바이러스 AR1, 에스케리치아 바이러스 C40, 에스케리치아 바이러스 E112, 에스케리치아 바이러스 ECML134, 에스케리치아 바이러스 HY01, 에스케리치아 바이러스 Ime09, 에스케리치아 바이러스 RB3, 에스케리치아 바이러스 RB14, 에스케리치아 바이러스 T4, 시겔라 바이러스 Pss1, 시겔라 바이러스 Shfl2, 여시니아 바이러스 D1, 여시니아 바이러스 PST, 아시네토박터 바이러스 133, 아에로모나스 바이러스 65, 아에로모나스 바이러스 Aeh1, 에스케리치아 바이러스 RB16, 에스케리치아 바이러스 RB32, 에스케리치아 바이러스 RB43, 슈도모나스 바이러스 42, 크로노박터 바이러스 CR3, 크로노박터 바이러스 CR8, 크로노박터 바이러스 CR9, 크로노박터 바이러스 PBES02, 벡토박테리움 바이러스 phiTE, 크로노박터 바이러스 GAP31, 에스케리치아 바이러스 4MG, 살모넬라 바이러스 SE1, 살모넬라 바이러스 SSE121, 에스케리치아 바이러스 FFH2, 에스케리치아 바이러스 FV3, 에스케리치아 바이러스 JES2013, 에스케리치아 바이러스 V5, 브레비바실러스 바이러스 아보우오, 브레비바실러스 바이러스 데이비스, 바실러스 바이러스 아게이트, 바실러스 바이러스 Bobb, 바실러스 바이러스 Bp8pC, 어위니아 바이러스 데이모스, 어위니아 바이러스 Ea35-70, 어위니아 바이러스 RAY, 어위니아 바이러스 Simmy50, 어위니아 바이러스 스페셜G, 아시네토박터 바이러스 AB1, 아시네토박터 바이러스 AB2, 아시네토박터 바이러스 AbC62, 아시네토박터 바이러스 AP22, 아르트로박터 바이러스 ArV1, 아르트로박터 바이러스 트리나, 바실러스 바이러스 아베소브모어, 바실러스 바이러스 B4, 바실러스 바이러스 빅버샤, 바실러스 바이러스 릴리, 바실러스 바이러스 스포크, 바실러스 바이러스 트롤, 바실러스 바이러스 바스티유, 바실러스 바이러스 CAM003, 바실러스 바이러스 Bc431, 바실러스 바이러스 Bcp1, 바실러스 바이러스 BCP82, 바실러스 바이러스 BM15, 바실러스 바이러스 딥블루, 바실러스 바이러스 JBP901, 버크홀데리아 바이러스 Bcep1, 버크홀데리아 바이러스 Bcep43, 버크홀데리아 바이러스 Bcep781, 버크홀데리아 바이러스 BcepNY3, 잔토모나스 바이러스 OP2, 버크홀데리아 바이러스 비셉무, 버크홀데리아 바이러스 phiE255, 아에로모나스 바이러스 44RR2, 마이코박테리움 바이러스 앨리스, 마이코박테리움 바이러스 Bxz1, 마이코박테리움 바이러스 단델리온, 마이코박테리움 바이러스 HyRo, 마이코박테리움 바이러스 I3, 마이코박테리움 바이러스 나피, 마이코박테리움 바이러스 세바타, 클로스트리듐 바이러스 phiC2, 클로스트리듐 바이러스 phiCD27, 클로스트리듐 바이러스 phiCD119, 바실러스 바이러스 CP51, 바실러스 바이러스 JL, 바실러스 바이러스 샤네트, 에스케리치아 바이러스 CVM10, 에스케리치아 바이러스 ep3, 어위니아 바이러스 아세시노, 어위니아 바이러스 EaH2, 슈도모나스 바이러스 EL, 할로모나스 바이러스 HAP1, 비브리오 바이러스 VP882, 브레비바실러스 바이러스 짐머, 브레비바실러스 바이러스 오시리스, 슈도모나스 바이러스 Ab03, 슈도모나스 바이러스 KPP10, 슈도모나스 바이러스 PAKP3, 시노리조비움 바이러스 M7, 시노리조비움 바이러스 M12, 시노리조비움 바이러스 N3, 어위니아 바이러스 마키나, 아르트로박터 바이러스 브렌트, 아르트로박터 바이러스 존스키, 아르트로박터 바이러스 마샤, 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SpV4, 아콜레플라스마 바이러스 L2, 슈도모나스 바이러스 PR4, 슈도모나스 바이러스 PRD1, 바실러스 바이러스 AP50, 바실러스 바이러스 Bam35, 바실러스 바이러스 GIL16, 바실러스 바이러스 Wip1, 에스케리치아 바이러스 phi80, 에스케리치아 바이러스 RB42, 에스케리치아 바이러스 T2, 에스케리치아 바이러스 T3, 에스케리치아 바이러스 T6, 에스케리치아 바이러스 VT2-Sa, 에스케리치아 바이러스 VT1-사카이, 에스케리치아 바이러스 VT2-사카이, 에스케리치아 바이러스 CP-933V, 에스케리치아 바이러스 P27, 에스케리치아 바이러스 Stx2phi-I, 에스케리치아 바이러스 Stx1phi, 에스케리치아 바이러스 Stx2phi-II, 에스케리치아 바이러스 CP-1639, 에스케리치아 바이러스 BP-4795 기반, 에스케리치아 바이러스 86, 에스케리치아 바이러스 Min27, 에스케리치아 바이러스 2851, 에스케리치아 바이러스 1717, 에스케리치아 바이러스 YYZ-2008, 에스케리치아 바이러스 EC026_P06, 에스케리치아 바이러스 ECO103_P15, 에스케리치아 바이러스 ECO103_P12, 에스케리치아 바이러스 ECO111_P16, 에스케리치아 바이러스 ECO111_P11, 에스케리치아 바이러스 VT2phi_272, 에스케리치아 바이러스 TL-2011c, 에스케리치아 바이러스 P13374, 에스케리치아 바이러스 Sp5.
일 구현예에서, 박테리아 바이러스 입자는 이. 콜라이를 표적화하고, BW73, B278, D6, D108, E, El, E24, E41, FI-2, FI-4, FI-5, HI8A, Ffl8B, i, MM, Mu, 025, PhI-5, Pk, PSP3, Pl, PlD, P2, P4, Sl, Wφ, φK13, φl, φ2, φ7, φ92, 7 A, 8φ, 9φ, 18, 28-1, 186, 299, HH-에스케리치아 (2), AB48, CM, C4, C16, DD-VI, E4, E7, E28, FIl, FI3, H, Hl, H3, H8, K3, M, N, ND-2, ND-3, ND4, ND-5, ND6, ND-7, Ox-I, Ox-2, Ox-3, Ox-4, Ox-5, Ox-6, PhI-I, RB42, RB43, RB49, RB69, S, SaI-I, Sal-2, Sal-3, Sal-4, Sal-5, Sal-6, TC23, TC45, TuII*-6, TuIP-24, TuII*46, TuIP-60, T2, T4, T6, T35, αl, 1, IA, 3, 3A, 3T+, 5φ, 9266Q, CFO103, HK620, J, K, KlF, m59, no. A, no. E, no. 3, no. 9, N4, sd, T3, T7, WPK, W31, ΔH, φC3888, φK3, φK7, φK12, φV-1, Φ04-CF, Φ05, Φ06, Φ07, φl, φl.2, φ20, φ95, φ263, φlO92, φl, φll, Ω8, 1, 3, 7, 8, 26, 27, 28-2, 29, 30, 31, 32, 38, 39, 42, 933W, NN-에스케리치아 (1), Esc-7-11, AC30, CVX-5, Cl, DDUP, ECl, EC2, E21, E29, Fl, F26S, F27S, Hi, HK022, HK97, HK139, HK253, HK256, K7, ND-I, PA-2, q, S2, Tl), T3C, T5, UC-I, w, β4, γ2, λ, ΦD326, φγ, Φ06, Φ7, Φ10, φ80, χ, 2, 4, 4A, 6, 8A, 102, 150, 168, 174, 3000, AC6, AC7, AC28, AC43, AC50, AC57, AC81, AC95, HK243, KlO, ZG/3A, 5, 5A, 21EL, H19-J 및 933H로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리오파지의 캡시드를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 벡터는 프로바이오틱과 조합하여 사용될 수 있다. 프리바이오틱은 아미노산, 바이오틴, 프룩토-올리고당, 갈락토-올리고당, 헤미셀룰로스 (예를 들어, 아라비녹실란, 자일란, 자일로글루칸, 및 글루코만난), 이눌린, 키틴, 락툴로스, 만난 올리고당, 올리고프룩토스-농축 이눌린, 검 (예를 들어, 구아르 검, 검 아라빅, 및 카라기난), 올리고프룩토스, 올리고덱스트로스, 타가토스, 저항 말토덱스트린 (예를 들어, 저항 전분), 트랜스-갈락토올리고당, 펙틴 (예를 들어, 자일로갈락토우로난, 시트러스 펙틴, 사과 펙틴, 및 람노갈락투로난-I), 식이 섬유 (예를 들어, 대두 섬유, 사탕무 섬유, 완두콩 섬유, 옥수수겨, 및 오트 섬유) 및 자일로올리고당을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
다른 구현예에서, 본 명세서에 개시된 벡터는 프로바이오틱과 조합하여 사용될 수 있다. 프로바이오틱은 락토바실라이 (lactobacilli), 비피도박테리아 (bifidobacteria), 스트렙토코사이 (streptococci), 엔테로코사이 (enterococci), 프로피오니박테리아 (propionibacteria), 사카로마이세테스 (saccaromycetes), 락토바실라이 (lactobacilli), 비피도박테리아 (bifidobacteria), 또는 프로토박테리아 (proteobacteria)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
스크리닝 방법
본 발명은 박테리아에서 유전자 변형에 대해 스크리닝하기 위한 방법을 포괄한다. 일 구현예에서, 방법은 천연 발생 박테리아의 유전자에서 관심 DNA의 적어도 하나의 염기를 유전자 변형시키도록 디자인된 벡터를 대상체에게 투여하는 단계, 후속하여 대상체로부터 박테리아 샘플을 수집하는 단계, 상기 박테리아 샘플에서 관심 DNA의 상기 적어도 하나의 염기에 유전자 변형을 함유하는 박테리아의 수준을 정량하는 단계를 포함한다. 방법은 관심 DNA의 상기 적어도 하나의 염기에 유전자 변형을 함유하지 않는 박테리아의 수준을 정량하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 내생성 변형 대 비변형 박테리아의 비율을 정량한다. 유전자 변형을 갖는 박테리아의 바람직한 백분율은 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 99.99%, 및 100%이다.
일 구현예에서, 비변형된 내생성 박테리아의 수는 벡터를 투여하기 전에 정량된다. 환자는 또한 환자가 보유하는 균주의 유전자 서명을 결정하기 위해서 사전 스크리닝될 수 있다. 이것은 환자가 보유하는 균주의 유전자 서명을 기반으로 치료적 페이로드를 전달하는데 적합한 캡시드의 선택을 허용하게 된다.
바람직한 구현예에서, 벡터는 약학 및 수의학 조성물에 존재한다. 바람직하게 벡터는 박테리오파지이다.
벡터는 대상체 내에서 또는 대상체 상에서 벡터 및 표적 박테리아의 기대 위치에 의존하여, 당분야에 공지된 임의의 투여 기술을 통해서 대상체에게 투여될 수 있다.
박테리아 샘플은 당분야에 공지된 임의 수단, 예컨대 생검, 채혈, 소변 샘플, 분변 샘플, 또는 구강/비강 면봉을 통해서 수집될 수 있다.
관심 DNA의 염기에 유전자 변형을 함유하거나 또는 함유하지 않는 박테리아의 수준은 당업자에게 공지된 임의의 기술, 예컨대 ELISA, PCR, 고해상 용융, 및 핵산 시퀀싱을 포함하는 통상의 진단 절차를 통해서 결정할 수 있다.
본 발명은 원위치에서 유전자 돌연변이를 유도하는 벡터의 효율을 결정하기 위한 방법을 포괄한다. 일 구현예에서, 방법은 천연 발생 박테리아의 유전자에서 관심 DNA의 적어도 하나의 염기를 유전자 변형하도록 디자인된 벡터를 대상체에게 투여하는 단계, 후속하여 대상체로부터 박테리아 샘플을 수집하는 단계, 관심 DNA의 상기 적어도 하나의 염기에 유전자 변형을 함유하는 박테리아의 수준을 정량하는 단계, 및 상기 박테리아 샘플에서 관심 DNA의 상기 적어도 하나의 염기에 유전자 변형을 함유하지 않는 박테리아의 수준을 정량하는 단계를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 벡터는 약학 및 수의학 조성물에 존재한다. 바람직하게 벡터는 박테리오파지이다.
벡터는 대상체 내에서 또는 대상체 상에서 벡터 및 표적 박테리아의 기대 위치에 의존하여, 당업자에게 공지된 임의의 투여 기술을 통해서 대상체에게 투여될 수 있다.
박테리아 샘플은 당분야에 공지된 임의의 수단, 예컨대 생검, 채혈, 소변 샘플, 분변 샘플, 또는 구강/비강 면봉 등에 의해 수집될 수 있다.
관심 DNA의 염기에 유전자 변형을 함유하거나 또는 함유하지 않는 박테리아의 수준은 당업자에게 공지된 임의의 기술, 예컨대 ELISA, PCR, 고해상 용융, 및 핵산 시퀀싱을 포함한 통상의 진단 절차를 통해서 결정할 수 있다.
본 발명은 박테리아 성장에 대한 유전자 돌연변이의 효과를 결정하기 위한 방법을 포괄한다. 일 구현예에서, 방법은 천연 발생 박테리아의 유전자에서 관심 DNA의 적어도 하나의 염기를 유전자 변형시키도록 디자인된 벡터를 대상체에게 투여하는 단계, 후속하여 대상체로부터 적어도 2회 순차적 박테리아 샘플을 수집하는 단계, 관심 DNA의 상기 적어도 하나의 염기에 유전자 변형을 함유하는 박테리아의 수준을 정량하는 단계, 및 상기 박테리아 샘플에서 관심 DNA의 상기 적어도 하나의 염기에 유전자 변형을 함유하지 않는 박테리아의 수준을 정량하는 단계를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 벡터는 약학 및 수의학 조성물에 존재한다. 바람직하게, 벡터는 박테리오파지이다.
벡터는 대상체 내에서 또는 대상체 상에서 벡터 및 표적 박테리아의 기대 위치에 의존하여, 당업자에게 공지된 임의의 투여 기술을 통해서 대상체에게 투여될 수 있다.
박테리아 샘플은 당분야에 공지된 임의 수단, 예컨대 생검, 채혈, 소변 샘플, 분변 샘플, 또는 구강/비강 면봉 등을 통해서 수집될 수 있다. 샘플은 임의의 순차적 시점에 수집될 수 있다. 바람직하게, 이들 수집들 간 시간은 적어도 3시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간 또는 7일, 14일, 30일, 60일, 120일, 또는 365일이다.
관심 DNA의 염기에 유전자 변형을 함유하거나 또는 함유하지 않는 박테리아의 수준은 당업자에게 공지된 임의의 기술, 예컨대 ELISA, PCR, 고해상 용융, 및 핵산 시퀀싱을 포함한, 통상의 진단 절차를 통해서 결정할 수 있다.
본 발명의 모든 스크리닝 방법은 본 발명의 임의의 유전자 변형에 대해 스크리닝하기 위해 본 발명의 임의의 벡터 및 효소/시스템을 사용할 수 있다.
본 발명의 모든 스크리닝 방법은 박테리아 샘플에서 관심 DNA의 염기에 유전자 변형을 함유하지 않는 박테리아의 수준과 관심 DNA의 염기에 유전자 변형을 함유하는 박테리아의 수준을 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 모든 스크리닝 방법은 액상 또는 고형 배양으로 박테리아와 벡터를 접촉시키는 단계 및 상기 박테리아 샘플에서 관심 DNA의 상기 적어도 하나의 염기에 유전자 변형을 함유하는 박테리아의 수준을 정량하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 관심 DNA의 상기 적어도 하나의 염기에 유전자 변형을 함유하지 않는 박테리아의 수준을 정량하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 방법은 천연 발생 박테리아의 유전자 중 관심 DNA의 적어도 하나의 염기를 유전자 변형하도록 디자인된 벡터를 제공하는 단계를 포함한다. 방법은 액상 또는 고형 배양의 박테리아와 벡터를 접촉시키는 단계 및 상기 박테리아 샘플에서 관심 DNA의 상기 적어도 하나의 염기에 유전자 변형을 함유하는 박테리아의 수준을 정량하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 관심 DNA의 상기 적어도 하나의 염기에 유전자 변형을 함유하지 않는 박테리아의 수준을 정량하는 단계를 더 포함할 수 있다. 관심 DNA의 염기에 유전자 변형을 함유하지 않는 박테리아의 수준은 배양 중인 시간 경과에 따른 관심 DNA의 염기에 유전자 변형을 함유하지 않는 박테리아의 수준과 비교될 수 있다. 바람직하게, 이들 비교들 간 시간은 적어도 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 또는 96시간이다.
약학 및 수의학 조성물 및 원위치에서 투여 방법
본 발명은 본 발명의 벡터를 포함하는 약학 및 수의학 조성물을 포괄한다.
본 발명은 대상체에서 박테리아에 약학 또는 수의학 조성물의 원위치 투여를 포괄한다. 당업자에게 공지된 임의의 방법은 벡터를 원위치에서 박테리아 표적과 접촉시키는데 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 또는 수의학 조성물은 약학적으로 허용가능한 비히클을 더 포함할 수 있다. 고형의 약학적으로 허용가능한 비히클은 풍미제, 윤활제, 가용화제, 현탁제, 염료, 충전제, 활택제, 압착 보조제, 불활성 결합제, 감미제, 보존제, 염료, 코팅제, 또는 정제-붕해제로서도 작용할 수 있는 하나 이상의 물질을 포함할 수 있다. 적합한 고형 비히클은 예를 들어 칼슘 포스페이트, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 당류, 락토스, 덱스트린, 전분, 젤라틴, 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 저용융 왁스 및 이온 교환 수지를 포함한다.
약학 또는 수의학 조성물은 멸균수, 염수, 또는 다른 적절한 멸균 주사가능 매질을 사요해 투여 시점에 현탁될 수 있는 멸균 고형 조성물로서 제조될 수 있다. 본 발명의 약학 또는 수의학 조성물은 다른 용질 또는 현탁제 (예를 들어, 충분한 염수 또는 용액을 등장성으로 만드는 포도당), 담즙산염, 아카시아, 젤라틴, 솔비탄 모놀레에이트, 폴리솔베이트 (에틸렌 옥시드와 공중합된 솔비톨의 올레에이트 에스테르 및 이의 무수물) 등을 함유하는 멸균 용액 또는 현탁액의 형태로 경구로 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 입자는 또한 액상 또는 고형 조성물 형태로 경구로 투여될 수 있다. 경구 투여에 적합한 조성물은 고체 형태, 예컨대 알약, 캡슐, 과립, 정제, 및 분말, 및 액체 형태, 예컨대 용액, 시럽, 엘릭시르, 및 현탁액을 포함한다. 장 투여에 유용한 형태는 멸균 용액, 에멀션, 및 현탁액을 포함한다.
본 발명에 따른 박테리아 바이러스 입자는 약학적으로 허용가능한 액상 비히클, 예컨대 물, 유기 용매, 이 둘의 혼합물 또는 약학적으로 허용가능한 오일 또는 지방에 용해 또는 현탁될 수 있다. 액상 비히클은 다른 적합한 약학적 첨가제 예컨대 가용화제, 유화제, 완충제, 보존제, 감미제, 풍미제, 현탁제, 증점제, 착색제, 점도 조절제, 안정화제 또는 삼투압 조절제를 함유할 수 있다. 경구 및 장 투여를 위한 액상 비히클의 적합한 예는 물 (상기와 같은 첨가제, 예를 들어, 셀룰로스 유도체, 바람직하게 소듐 카르복시메틸 셀룰로스 용액을 부분적으로 함유), 알콜 (1가 알콜 및 다가 알콜, 예를 들어 글리콜 포함) 및 그들 유도체, 및 오일 (예를 들어, 분별 코코넛 오일 및 아라키스 오일)을 포함한다. 비경구 투여 경우, 비히클은 또한 유성 에스테르 예컨대 에틸 올레에이트 및 이소프로필 미리스테이트일 수 있다. 멸균 액상 비히클은 장 투여를 위한 멸균 액체 형태 조성물에 유용하다. 가압 조성물용 액상 비히클은 할로겐화 탄수화물 또는 다른 약학적을오 허용가능한 추진제일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 지연 또는 점진적 장 방출을 위해 제제화된 약학 또는 수의학 조성물을 포괄한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 제제 또는 약학 조제물은 말단 소장 및/또는 결장으로 벡터의 전달을 위해 제제화된다. 제제는 벡터가 위산 및 췌장 효소 및 담즙을 통해 통과하여, 말단 소장 및 결장에서 생존하도록 손상없이 도달할 수 있게 허용할 수 있다.
일부 구현예에서, 약학 또는 수의학 조성물은 미세-캡슐화되고/되거나, 정제로 형성되고/되거나, 캡슐에 위치되고, 바람직하게 장용 코팅 캡슐이다.
일부 구현예에서, 약학 또는 수의학 조성물은 셀룰로스 아세테이트 (CA) 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 사용하여, 지연 또는 점진적 장 방출을 위해 제제화된다. 일부 구현예에서, 약학 또는 수의학 조성물은 히드록시프로필메틸셀룰로스 (HPMC), 미세결정질 셀룰로스 (MCC) 및 마그네슘 스테아레이트를 사용하여 지연 또는 점진적 장 방출을 위해 제제화된다. 약학 또는 수의학 조성물은 예를 들어, 폴리(메타)크릴레이트, 예를 들어 메타크릴산 공중합체 B, 메틸 메타크릴레이트 및/또는 메타크릴산 에스테르, 또는 폴리비닐피롤리돈 (PVP)을 사용하여 지연 또는 점진적 장 방출을 위해 제제화된다.
일부 구현예에서, 약학 또는 수의학 조성물은 방출-지연 매트릭스 재료 예컨대: 아크릴계 중합체, 셀룰로스, 왁스, 지방산, 쉘락, 제인, 수첨 식물성 오일, 수첨 피마자유, 폴리비닐피롤리돈, 비닐 아세테이트 공중합체, 비닐 알콜 공중합체, 폴리에틸렌 옥시드, 아크릴산 및 메타크릴산 공중합체, 메틸 메타크릴레이트 공중합체, 에톡시에틸 메타크릴레이트 중합체, 시아노에틸 메타크릴레이트 중합체, 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체, 폴리(아크릴산), 폴리(메타크릴산), 메타크릴산 알킬아미드 공중합체, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(메타크릴산 언히드라이드), 메틸 메타크릴레이트 중합체, 폴리메타크릴레이트, 폴리(메틸 메타크릴레이트) 공중합체, 폴리아크릴아미드, 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체, 글리시딜 메타크릴레이트 공중합체, 메틸 셀룰로스, 에틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 히드록시메틸 셀룰로스, 히드록시에틸 셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스, 가교 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 가교 히드록시프로필셀룰로스, 천연 왁스, 합성 왁스, 지방 알콜, 지방산, 지방산 에스테르, 지방산 글리세리드, 수소화 지방, 탄화수소 왁스, 스테아르산, 스테아릴 알콜, 밀랍, 글리코왁스, 피마자 왁스, 카르나우바 왁스, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 락트산 및 글리콜산의 공중합체, 카르복시메틸 전분, 포타슘 메타크릴레이트/디비닐벤젠 공중합체, 가교 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알콜, 폴리비닐알콜 공중합체, 폴리에틸렌 글리콜, 비가교 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐 아세테이트, 폴리비닐아세테이트 공중합체 또는 이의 임의 조합을 사용하여 지연 또는 점진적 장 방출을 위해 제제화된다.
일부 구현예에서, 약학 또는 수의학 조성물은 경구 투여용 연장 방출 약학 조성물을 기술하고, 친수성 중합체, 소수성 재료 및 소수성 중합체 또는 이의 혼합물과 미세환경 pH 개질제를 사용하는, 미국 특허 출원 공개 번호 제20110218216호에 기술된 바와 같은 지연 또는 점진적 장 방출을 위해 제제화된다. 소수성 중합체는 에틸셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스 프로피오네이트, 셀룰로스 부티레이트, 메타크릴산 -아크릴산 공중합체 또는 이의 혼합물일 수 있다. 친수성 중합체는 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필셀룰로스, 메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸 셀룰로스, 폴리에틸렌 옥시드, 아크릴산 공중합체 또는 이의 혼합물일 수 있다. 소수성 재료는 수첨 식물성 오일, 수첨 피마자유, 카르나우바 왁스, 칸델리아 왁스, 밀랍, 파라핀 왁스, 스테아르산, 글리세릴 베헤네이트, 세틸 알콜, 세토스테아릴 알콜 또는 및 이의 혼합물일 수 있다. 미세환경 pH 개질제는 무기산, 아미노산, 유기산 또는 이의 혼합물일 수 있다. 대안적으로, 미세환경 pH 개질제는 라우르산, 미리스트산, 아세트산, 벤조산, 팔미트산, 스테아르산, 옥살산, 말론산, 숙신산, 아디프산, 세박산, 푸마르산, 말레산; 글리콜산, 락트산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 소듐 2수소 시트레이트, 글루콘산, 살리실산, 토실산, 메실산 또는 말산 또는 이의 혼합물일 수 있다.
일부 구현예에서, 약학 또는 수의학 조성물은 정제 또는 좌제에 포함될 수 있는 분말이다. 대안적인 구현예에서, 본 발명의 제제 또는 약학 조제물은 마시거나 또는 달리 투여되는 액체로서 '재구성용 분말'일 수 있다.
일부 구현예에서, 약학 또는 수의학 조성물은 크림, 겔, 로션, 액제, 사료, 또는 에어로졸 스프레이로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 박테리오파지는 당분야에 공지된 임의의 물질 및 당분야에 공지된 임의의 기술, 예를 들어, 제한없이, 참조로 본 명세서에 편입되는 미국 특허 제7,482,115호에 요약된 기술을 사용한 중합성 비드 상에 박테리오파지의 고정을 사용해 고체 표면 상에 고정된다. 파지는 적절한 크기의 중합성 비드 상에 고정되어서 코팅된 비드가 에어로졸, 크림, 겔 또는 액제에 첨가될 수 있다. 중합성 비드의 크기는 약 0.1 ㎛ 내지 500 ㎛, 예를 들어 50 ㎛ 내지 100 ㎛일 수 있다. 코팅된 중합성 비드는 펠렛형 사료 및 임의의 다른 형태의 사료를 포함하여, 동물 사료에 혼입될 수 있고, 파지를 동물에게 제공하는데 사용되는 임의의 다른 식용 장치에 혼입되고, 동물에게 제공되는 용기에 담긴 물에 첨가되어, 급수 시스템을 통해 동물에게 제공된다. 일부 구현예에서, 조성물은 크림, 겔, 에어로졸 스프레이 등을 사용하여 표면 상처 및 다른 표면 감염의 치료에 사용된다.
일부 구현예에서, 약학 또는 수의학 조성물은 흡입에 의해서, 좌제 또는 페서리의 형태로, 국소적으로 (예를 들어, 로션, 액제, 크림, 연고 또는 살포제의 형태), 표피 또는 경피로 (예를 들어, 피부 패치를 사용하여), 경구로 (예를 들어, 부형제 예컨대 전분 또는 락토스를 함유할 수 있는 정제로서), 캡슐, 질좌제, 엘릭시르, 액제, 또는 현탁액 (각각은 임의로 풍미제, 착색제 및/또는 부형재를 함유)으로서 투여될 수 있거나, 또는 그들은 비경구로 (예를 들어, 정맥내, 근육내 또는 피하로) 주사될 수 있다. 비경구 투여 경우에, 조성물은 다른 물질, 예를 들어 용액을 혈액과 등장성이게 만들기에 충분한 염 또는 단량체를 함유할 수 있는 멸균 수용액의 형태로 사용될 수 있다. 구강 또는 설하 투여 경우에, 조성물은 통상의 방식으로 제제화될 수 있는 정제 또는 로젠지의 형태로 투여될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 박테리오파지 및/또는 폴리펩티드는 본 명세서에 기술되거나 또는 당분야에 공지된 바와 같이, 단독 작용제로서, 또는 다른 항생제 치료와 병용하여 국소로 투여된다.
일부 구현예에서, 약학 또는 수의학 조성물은 또한 피부로 또는 경피로 투여될 수 있다. 피부에 국소 도포를 위해, 약학 또는 수의학 조성물은 이에 제한되지 않지만, 수성 액체, 알콜 베이스 액체, 수용성 겔, 로션, 연고, 비수성 액체 베이스, 미네랄유 베이스, 미네랄유 및 바셀린의 블렌드, 라놀린, 리포솜, 단백질 담체 예컨대 혈청 알부민 또는 젤라틴, 분말 셀룰로스 카멜, 및 이의 조합을 포함할 수 있는, 하나의 담체 또는 담체의 조합과 조합될 수 있다. 국소 전달 방식은 도말, 스프레이, 붕대, 시간-방출 패치, 액체-흡수 와이프, 및 이의 조합을 포함할 수 있다. 약학 또는 수의학 조성물은 직접적으로 또는 담체(들) 중의 패치, 와이프, 붕대 등에 도포될 수 있다. 패치, 와이프, 붕대 등은 축축하거나 또는 건조될 수 있고, 여기서 파지 및/또는 폴리펩티드 (예를 들어, 리신)는 패치 상에 동결건조 형태로 존재한다. 국소 조성물의 담체는 중합체 증점제, 물, 보존제, 활성 계면활성제, 또는 유화제, 항산화제, 일광 차단제, 및 용매 또는 혼합 용매계를 포함한 반-고체 및 겔-유사 비히클을 포함할 수 있다. 미국 특허 제5,863,560호는 약물에 피부의 노출을 보조할 수 있는 다수의 상이한 담체 조합을 개시하고, 이의 내용을 본 명세서에 편입시킨다.
비내 또는 흡입에 의한 투여 경우에, 약학 또는 수의학 조성물은 적합한 추진제, 예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 히드로플루오로알칸 예컨대 1,1,1,2-테트라플루오로에탄 또는 1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로프로판, 이산화탄소, 또는 다른 적합한 가스를 사용한 가압 용기, 펌프, 스프레이, 또는 네뷸라이저로부터 에어로졸 스프레이 제시형태 또는 건주 분말 흡입기의 형태로 편리하게 전달된다. 가압 에어로졸의 경우에, 계량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공하여 용량 단위를 결정할 수 있다. 가압 용기, 펌프, 스프레이, 또는 네뷸라이저는 윤활제, 예를 들어, 솔비탄 트리올레에이트를 추가로 함유할 수 있는, 예를 들어 용매로서 추진제 및 에탄올의 혼합눌을 사용해, 활성 화합물의 용액 또는 현탁액을 함유할 수 있다. 흡입기 또는 취입기에 사용을 위한 캡슐 및 카트리지 (예를 들어, 젤라틴으로 제조)는 본 발명의 박테리오파지 및/또는 폴리펩티드의 분말 믹스 및 적합한 분말 베이스 예컨대 락토스 또는 전분을 함유하여 제제화될 수 있다.
좌제 또는 페서리의 형태로 투여를 위해서, 약학 또는 수의학 조성물은 겔, 히드로겔, 로션, 액제, 크림, 연고, 또는 살포제의 형태로 국소로 도포될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 안구 경로를 통해서 투 여될 수 있다. 안과적으로 사용을 위해서, 본 발명의 조성물은 등장성, pH 조정, 멸균 염수 중 미분 현탁액으로서, 또는 바람직하게 임의로 보존제 예컨대 벤질알코늄 클로라이드와 조합하여, 등장성, pH 조정, 멸균 염수 중 용액으로서 제제화될 수 있다. 대안적으로, 그들은 연고, 예컨대 바셀린에 제제화될 수 있다.
본 발명의 약학 및 수의학 조성물 조성물들의 용량 및 바람직한 약물 농도는 특정 용도에 의존하여 다양할 수 있다. 적절한 용량 또는 투여 경로의 결정은 일반 의사의 기술 내에 있다. 동물 실험은 인간 요법에서 유효한 용량이 결정을 위한 신뢰할만한 지침을 제공할 수 있다.
경피 투여 경우에, 약학 또는 수의학 조성물은 연고, 크림 또는 겔 형태로 제제화될 수 있고, 적절한 침투제 또는 세제, 예컨대 디메틸 술폭시드, 디메틸아세타미드 및 디메틸포름아미드가 투과를 용이하게 하는데 사용될 수 있다.
경점막 투여를 위해, 비강 스프레이, 직장 또는 질 좌제가 사용될 수 있다. 활성 화합물은 당분야에 공지된 방법을 통해서 임의의 기지 좌제 베이스에 혼입될 수 있다. 이러한 베이스의 예는 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜 (카보왁스), 폴리에틸렌 솔비탄 모노스테아레이트, 및 용융점 또는 용해율을 변형시키기 위한 다른 상용성 재료와 이들의 혼합물을 포함한다.
질환 치료
본 발명은 박테리아에 의해 야기되는 질환 및 물질대사 장애의 치료를 포괄한다. 박테리아에 의해 야기되는 질환 또는 장애는 피부 만성 염증 예컨대 여드름 (심상성 여드름), 진행성 반상 저색소증, 복부 경련, 급성 후두개염, 관절염, 균혈증, 혈리, 보툴리누스 중독, 브루셀라증, 뇌농양, 심근병증, 연성 성병, 클라미디아, 크론병, 결막염, 담낭염, 직결장암, 용종증, 군집붕괴, 라임병, 설사, 디프테리아, 십이지장 궤양, 심내막염, 홍반증, 장열, 열병, 사구체신염, 위장염, 위궤양, 길랑-바레 증후군, 파상풍, 임질, 치은염, 염증성 장 질환, 과민성 장 증후군, 헵토스피라증, 나병, 리스테리아증, 결핵, 레이디 와이더미어 증후군, 재향군인병, 뇌수막염, 점액성 결막염, 다제 내성 박테리아 감염, 다제 내성 박테리아 보균, 심근염, 근괴사-가스 괴저, 마이코박테리움 아비움 복합체, 신생아 괴사성 장염, 노카르디아증, 원내감염, 이염, 치주염, 인두염, 폐렴, 복막염, 자반열, 록키산 반점열, 이질, 매독, 부비동염, 구불창자염, 패혈증, 피하 농양, 야토병, 기관기관지염, 편도선염, 장티푸스, 궤양성 대장염, 요로 감염, 백일해, 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD), 비알콜성 지방간염 (NASH)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
박테리아에 의해 야기되는 감염은 감염, 바람직하게 장 감염 예컨대 식도염, 위염, 장염, 대장염, 구불창자염, 직장염, 및 복막염, 요로 감염, 질 감염, 여성 상부 생식기 감염 예컨대 난관염, 자궁내막염, 난소염, 자궁근염, 자궁주위염 및 골반 복막 감염, 호흡기 감염 예컨대 폐렴, 양막내 감염, 치성 감염, 근관 감염, 섬유증, 뇌수막염, 혈류 감염, 원내감염 예컨대 카테터-관련 감염, 병원 감염성 폐렴, 산후 감염, 병원 감염성 위장염, 병원 감염성 요로 감염, 또는 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게, 본 발명에 따른 감염은 항생제 내성을 나타내는 박테리아에 의해 야기된다. 특정 구현예에서, 감염은 표적화된 박테리아에서 상기 열거된 바와 같은 박테리아에 의해 야기된다.
본 개시는 또한 예를 들어, 비만, 2형 당뇨병 및 비알콜성 지방간 질환을 포함한, 물질대사 장애의 치료를 위한 본 발명의 약학 또는 수의학 조성물에 관한 것이다. 실제로, 최근에 나온 증거는 이들 장애가 장내 미생물총 조성 및 이의 대사산물의 변경을 특징으로 한다는 것을 의미한다 (Tilg et al., Nature Reviews Immunology, volume 20, pages 40-54, 2020). 따라서 약학 또는 수의학 조성물은 (예를 들어, 상기 박테리아에 의한 일부 분자, 예를 들어 물질대사성 염증에 대해 유리한 역할을 갖는 분자의 발현, 과발현 또는 분비를 유도하여) 장내 미생물총 조성 또는 이의 대사산물을 변경할 수 있는 관심 핵산을 일부 장내 박테리아에서 전달하는데 사용될 수 있다. 본 개시는 또한 예를 들어, 비만, 2형 당뇨병 및 비알콜성 지방간 질환을 포함한 물질대사 장애의 치료를 위한 약물의 제조를 위한 본 발명의 약학 또는 수의학 조성물의 용도에 관한 것이다. 또한, 예를 들어, 비만, 2형 당뇨병 및 비알콜성 지방간 질환을 포함한, 물질대사 장애를 치료하기 위한 방법에 관한 것으로서, 제공된 약학 또는 수의학 조성물, 특히 제공된 약학 또는 수의학 조성물의 치료적 유효량을 치료를 필요로 하는 물질대사 장애를 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 인간 마이크로바이옴의 박테리아가 관여하는 병상, 예컨대 염증성 및 자가-면역 질환, 암, 감염 또는 뇌장애의 치료에서 사용을 위한 약학 또는 수의학 조성물에 관한 것이다. 실제로, 임의의 감염을 촉발하지 않고, 마이크로바이옴의 일부 박테리아는 염증성 또는 자가-면역 질환 또는 암 발생을 유도하고/하거나 증강시키는 분자를 분비할 수 있다. 보다 특히, 본 발명은 예를 들어, CAR-T (키메라 항원 수용체 T) 세포, TIL (종양 침윤성 림프구) 및 억제제 T 세포로도 알려진 Treg (조절성 T 세포)를 기반으로 하는 면역요법의 효능을 개선시키기 위해 마이크로바이옴 조성을 조절하는 것에 관한 것이다. 면역요법의 효능을 개선시키기 위해 마이크로바이옴 조성의 조절은 또한 당 분야에 충분히 공지된 면역 체크포인트 억제제 예컨대, 제한없이, PD-1 (프로그램된 세포 사멸 단백질 1) 억제제, PD-L1 (프로그램된 사멸 리간드 1) 억제제 및 CTLA-4 (세포독성 T 림프구 연관 단백질 4)의 사용을 포함할 수 있다.
마이크로바이옴의 일부 박테리아는 또한 뇌에 영향을 치지게 되는 분자를 분비할 수 있다.
그러므로, 본 발명의 추가 목적은 대상체의 마이크로바이옴을 제어하기 위한 방법, 특히 비치료적 방법으로서, 상기 대상체에서 본 명세서에 개시된 바와 같은 약학 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 추가 목저은 대상체의 마이크로바이옴을 제어하기 위해 추가로 사용되는 본 발명의 약학 조성물이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 또한 박테리아 감염에 대한 치료를 필요로 하는 개체에 대한 개인맞춤형 치료 방법에 관한 것으로서, i) 개체로부터 생물학적 샘플을 수득하고 샘플로부터 박테리아 DNA 서열 그룹을 결정하는 단계; ii) 서열의 결정을 기반으로, 샘플에 존재한 하나 이상의 병원서 박테리아 균주 또는 종을 확인하는 단계; 및 iii) 샘플에서 확인된 각각의 병원성 박테리아 균주 또는 종을 인식할 수 있는 본 발명에 따른 약학 조성물을 개체에게 투여하고 패키징된 페이로드를 전달하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 박테리아 감염에 대한 치료를 필요로 하는 개체에 대한 개인맞춤형 치료 방법에서 사용을 위한 본 발명의 약학 조성물에 관한 것으로서, 상기 방법은 i) 개체로부터 생물학적 샘플을 수득하고 샘플로부터 박테리아 DNA 서열 그룹을 결정하는 단계; ii) 서열의 결정을 기반으로, 샘플에 존재한 하나 이상의 병원성 박테리아 균주 또는 종을 확인하는 단계를 포함하고; 약학 조성물은 샘플에서 확인된 각각의 병원성 박테리아 균주 또는 종을 인식할 수 있고 패키징된 페이로드를 전달할 수 있다.
바람직하게, 생물학적 샘플은 병리학적 및 비병리학적 박테리아 종을 포함하고, 개체에게 본 발명에 따른 약학 또는 수의학 조성물을 투여한 이후에, 개체 상에서 또는 개체 내에서 병원성 박테리아의 양이 감소되지만, 비병원성 박테리아의 양은 감소되지 않는다.
다른 특정 구현예에서, 본 발명은 약물의 유효성을 개선시키기 위해 사용을 위한 본 발명에 따른 약학 또는 수의학 조성물에 관한 것이다. 실제로, 그 자체로 병원성이 없는, 마이크로바이옴의 일부 박테리아는 약물을 물질대사할 수 있고 그들을 유효하지 않거나 또는 유해한 분자로 변형시킬 수 있는 것으로 알려져 있다.
다른 특정 구현예에서, 본 발명은 치료 화합물 예컨대 포유동물에 대한 예방적 및 치료적 백신을 포함한, 임의의 관심 화합물의 원위치 박테리아 생산에 관한 것이다. 관심 화합물은 표적화된 박테리아 내부에서 생산될 수 있거나, 표적화된 박테리아로부터 분비될 수 있거나 또는 표적화된 박테리아의 표면 상에서 발현될 수 있다. 보다 특정한 구현예에서, 항원은 예방적 및/또는 치료적 백신접종을 위해 표적화된 박테리아의 표면 상에서 발현된다.
원위치에서 반대-선택을 위한 방법
특정 구현예에서, 벡터는 원위치에서 유전자 변형된 표적화된 박테리아 및 변형이 발생되지 않은 표적화된 박테리아를 구별할 수 있어서, 변형이 발생되지 않은 표적화된 박테리아의 특이적 사멸을 초래할 수 있는 DNA 변형 효소, 특히 프로그램된 뉴클레아제를 코딩한다.
특정 구현예에서, 뉴클레아제는 RNA-가이드된 뉴클레아제일 수 있다.
특정 구현예에서, 벡터의 디자인은 상기 프로그램된 뉴클레아제에 의해 매개되는 사멸 효과가 지연되는 기회를 증가시켜서, 표적 DNA 서열이 염기-편집 또는 프라임-편집 효소/시스템에 의해 편집되도록 충분한 시간을 제공한다.
본 발명은 또한 원위치에서 유전자 변형된 표적화된 박테리아와 변형이 발생되지 않은 표적화된 박테리아를 구별하도록 프로그램된 뉴클레아제의 전달 덕분에, 마이크로바이옴 개체군 내에서 모든 표적화된 박테리아의 강건한 변경을 보장하여, 변형이 발생되지 않은 것들의 특이적 사멸을 초래하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 따라서, 본 발명의 벡터는 원위치에서 유전자 변형된 표적화된 박테리아 및 변형이 발생되지 않은 표적화된 박테리아를 구별하도록 프로그램된 뉴클레아제를 코딩하는 핵산과 조합하여 사용되어, 변형이 발생되지 않은 것들의 특이적 사멸을 초래한다. 특정 구현예에서, 이러한 프로그램된 뉴클레아제의 전달은 염기-편집 뉴클레아제를 보유하는 것과 동일한 벡터, 또는 상이한 벡터 상에서 존재한다. 특정 구현예에서, 이러한 프로그램된 뉴클레아제의 전달은 염기-편집 뉴클레아제를 코딩하는 벡터와 동시에 또는 그 이후에 구현된다. 동시에 전달되면, 벡터는 이중 가닥 파괴를 초래하는 프로그램된 뉴클레아제에 대한 지연된 표적화 방법을 갖도록 조작될 수 있다.
비치료적 용도
본 발명은 또한 본 발명의 박테리아 전달 입자의 비치료적 용도에 관한 것이다. 예를 들어, 비치료적 용도는 대상체, 특히 질환을 앓지 않는 대상체의 웰빙을 개선시키기 위한 용도 또는 미용적 용도일 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 박테리아 전달 입자를 포함하는 비치료적 조성물 또는 미용 조성물에 관한 것이다.
대상체, 용법, 및 투여
본 발명에 따른 대상체는 동물, 바람직하게 포유동물, 보다 더 바람직하게 인간이다. 그러나, 용어 "대상체"는 또한 치료를 필요로 하는, 비-인간 동물, 특히 포유동물 예컨대 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 양, 당나귀, 토끼, 페럿, 저빌, 햄스터, 친칠라, 래트, 마우스, 기니 피그, 및 비-인간 영장류, 또는 비-포유동물 예컨대 가금류를 의미할 수 있다.
본 발명에 따른 인간 대상체는 태아기, 신생아, 소아, 유아, 청소년, 또는 임의 연령의 성인인 인간일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 대상체는 바람직하게 박테리아로 인한 감염, 장애, 및/또는 질환을 갖는 것으로 진단되었거나, 또는 그것이 발생될 위험성이 있다. 이러한 감염, 장애, 및/또는 질환의 진단 방법은 당업자에게 충분히 공지되어 있다.
특정 구현예에서, 감염, 장애, 및/또는 질환은 치료에 대한 내성을 나타내고, 바람직하게 감염, 장애, 또는 질환은 항생제 내성을 나타낸다.
특정 구현예에서, 대상체는 본 발명에 따른 전달 비히클, 바람직하게 본 발명에 따른 벡터, 특히 본 발명에 따른 전달 비히클로 패키징된 페이로드, 바람직하게 본 발명에 따른 박테리아 바이러스 입자로 패키징된 플라스미드 또는 파지미드, 또는 본 발명에 따른 약학 또는 수의학 조성물의 투여 이전에 임의의 투여를 받은 적이 없다.
특정 구현예에서, 대상체는 본 발명에 따른 전달 비히클, 바람직하게 본 발명에 따른 벡터, 특히 본 발명에 따른 전달 비히클로 패키징된 페이로드, 바람직하게 본 발명에 따른 박테리아 바이러스 입자로 패키징된 플라스미드 또는 파지미드, 또는 본 발명에 따른 약학 또는 수의학 조성물의 투여 이전에, 적어도 하나의 치료 라인, 바람직하게 몇개 치료 라인을 이미 받았다.
바람직하게, 치료는 정기적으로, 바람직하게 매일 내지 매월, 보다 바람직하게 매일 내지 2주마다, 보다 바람직하게 매일 내지 매주 투여되고, 보다 더 바람직하게 치료는 매일 투여된다. 특정 구현예에서, 치료는 1일 수회, 바람직하게 1일 2회 또는 3회, 보다 더 바람직하게 1일 3회 투여된다.
본 발명에 따른 전달 비히클, 바람직하게 본 발명에 따른 벡터, 특히 본 발명에 따른 전달 비히클로 패키징된 페이로드, 바람직하게 본 발명에 따른 박테리아 바이러스 입자로 패키징된 플라스미드 또는 파지미드, 또는 본 발명에 따른 약학 또는 수의학 조성물에 의한 치료 지속기간은 바람직하게 1일 내지 20주, 보다 바람직하게 1일 내지 10주, 여전히 더 바람직하게 1일 내지 4주, 보다 더 바람직하게 1일 내지 2주를 포함한다. 특정 구현예에서, 치료의 지속기간은 약 1주이다. 대안적으로 치료는 감염, 장애, 및/또는 질환이 지속되는 한 지속될 수 있다.
본 발명에 따른 전달 비히클, 바람직하게 본 발명에 따른 벡터, 특히 본 발명에 따른 전달 비히클로 패키징된 페이로드, 바람직하게 본 발명에 따른 박테리아 바이러스 입자로 패키징된 플라스미드 또는 파지미드, 또는 본 발명에 따른 약학 또는 수의학 조성물의 약학 또는 수의학 조성물의 형태, 투여의 경로, 및 투여의 용량은 감염의 유형 및 중증도 (예를 들어, 질환, 장애 및/또는 감염에 관여되는 박테리아 종, 및 환자 또는 대상체 신체 내 이의 위치에 의존함), 및 환자 또는 대상체, 특히 이의 연령, 체중, 성별, 및 일반 신체 상태에 따라서 당업자가 조정할 수 있다.
특히, 투여되는, 본 발명에 따른 전달 비히클, 바람직하게 본 발명에 따른 벡터, 특히 본 발명에 따른 전달 비히클로 패키징된 페이로드, 바람직하게 본 발명에 따른 박테리아 바이러스 입자로 패키징된 플라스미드 또는 파지미드, 또는 본 발명에 따른 약학 또는 수의학 조성물의 양은 당업자에게 충분히 공지된 표준 절차를 통해서 결정되어야 한다. 환자 또는 대상체 (예를 들어, 연령, 크기, 및 체중)의 생리적 데이터 및 투여 경로는 치료적 유효량을 환자 또는 대상체에게 투여되도록 적절한 용량을 결정하는데 고려되어야 한다.
예를 들어, 각 투여에 대한, 전달 비히클, 특히 본 발명에 따른 전달 비히클로 패키징된 페이로드, 바람직하게 본 발명에 따른 박테리아 바이러스 입자에 패키징된 플라스미드 또는 파지미드의 총량은 104 내지 1015 전달 비히클을 포함한다.
정의
≪벡터≫
본 명세서에서 사용되는 용어 "벡터"는 소정 숙주 세포에서 폴리펩티드를 발현할 수 있는 서열의 임의 구성체를 의미한다. 벡터가 사용되면 벡터의 선택은 당업자에게 충분히 공지된 바와 같이 숙주 박테리아를 형질전환시키는데 사용되는 방법에 의존한다. 벡터는 제한없이, 플라스미드 벡터 및 재조합 파지 벡터, 또는 표적 박테리아에 본 발명의 폴리펩티드를 전달하는데 적합한 임의의 다른 벡터를 포함할 수 있다. 당업자는 본 발명의 임의의 단리된 뉴클레오티드 또는 핵산 서열을 포함하는 숙주 세포를 성공적으로 형질전환시키고, 선택하고, 전파시키기 위해서 벡터에 존재해야만 하는 유전자 구성요소를 잘 알고 있다.
≪전달 비히클≫
본 명세서에서 사용되는 용어 ≪전달 비히클≫은 박테리아에 페이로드 또는 벡터의 전달을 허용하는 임의의 비히클을 의미한다.
제한없이, 박테리오파지 스캐폴드, 바이러스 스캐폴드, 박테리아 바이러스 입자, 화학 기반 전달 비히클 (예를 들어, 사이클로덱스트린, 칼슘 포스페이트, 양이온성 중합체, 양이온성 리포솜), 단백질-기반 또는 펩티드-기반 전달 비히클, 지질-기반 전달 비히클, 나노입자-기반 전달 비히클, 비-화학-기반 전달 비히클 (예를 들어, 형질전환, 전기천공, 초음파천공, 광학 형질감염), 입자-기반 전달 비히클 (예를 들어, 유전자총, 마그네토펙션, 임팔러펙션, 입자 충격, 세포-침투 펩티드) 또는 도너 박테리아 (접합)를 포함한, 본 발명에 포괄되는 몇개 유형의 전달 비히클이 존재한다.
전달 비히클의 임의 조합이 또한 본 발명에 포괄된다.
전달 비히클은 박테리오파지 유래 스캐폴드를 의미할 수 있고, 천연, 진화, 또는 조작된 캡시드로부터 수득될 수 있다.
일부 구현예에서, 전달 비히클은 박테리아가 천연적으로 그들 자체로 환경으로부터 페이로드 또는 벡터를 흡수하는 능력이 있으므로 페이로드 또는 벡터이다.
≪페이로드≫
본 명세서에서 사용되는, 용어 ≪페이로드≫는 전달 비히클에 의해 박테리아에 전달되는 임의의 핵산 서열 또는 아미노산 서열, 또는 둘 모두의 조합 (예컨대, 제한없이, 펩티드 핵산 또는 펩티드-올리고뉴클레오티드 접합체)을 의미한다.
용어 ≪페이로드≫는 또한 플라스미드, 벡터, 또는 카고를 의미할 수 있다.
페이로드는 천연, 진화 또는 조작된 박테리오파지 게놈으로부터 수득된 파지미드 또는 파스미드일 수 있다. 페이로드는 또한 천연, 진화 또는 조작된 박테리오파지 게놈으로부터 수득된 파지미드 또는 파스미드의 일부로서만 구성될 수도 있다.
일부 구현예에서, 페이로드는 박테리아가 천연적으로 그들 자체로 환경으로부터 페이로드를 흡수하는 능력이 있으므로 전달 비히클이다.
≪핵산≫
본 명세서에서 사용되는 용어 "핵산"은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있거나 또는 단일 가닥 및 이중 가닥 서열 둘 모두의 일부를 함유하는 함께 공유적으로 연결된 적어도 2개의 뉴클레오티드의 서열을 의미한다. 본 발명의 핵산은 천연 발생일 수 있거나, 재조합일 수 있거나 또는 합성일 수 있다. 핵산은 원형 서열 또는 선형 서열의 형태, 또는 둘 형태의 조합일 수 있다. 핵산은 DNA, 게놈 또는 cDNA, 또는 RNA 또는 둘 모두의 조합일 수 있다. 핵산은 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드의 임의 조합, 및 우라실, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 잔틴, 하이포잔틴, 이소시토신, 5-히드록시메틸시토신 및 이소구아닌을 포함한, 염기의 임의 조합을 함유할 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 변형된 염기의 다른 예는 [Chemical Reviews 2016, 116 (20) 12655-12687]에 상술되어 있다. 용어 "핵산"은 또한 제한없이, 포스포르아미드, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, O-메틸포스포로아미다이트 연결 및/또는 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드 핵산을 포함한 다른 골격을 함유할 수 있는 임의의 핵산 유사체를 포괄한다. 핵산의 상기 특성의 임의 조합이 또한 본 발명에 포괄된다.
"파지미드" 및 "패키징된 파지미드"
본 발명에서 사용되는 용어 "파지미드" 또는 "파스미드"는 동등하고, 박테리오파지 게놈의 적어도 하나의 서열을 포함하고 바람직하게 자손을 생산할 수 없는 재조합 DNA 벡터, 보다 특히 플라스미드 및 박테리오파지 게놈 둘 모두로부터 유래된 벡터를 의미한다. 본 개시의 파지미드는 파지 패키징 부위 및 임의로 복제 기원 (ori), 특히 박테리아 및/또는 파지 복제 기원을 포함한다. 일 구현예에서, 파지미드는 복제 기원을 포함하지 않고, 따라서 박테리아에 주입되면 그 자체로 복제될 수 없다. 대안적으로, 파지미드는 플라스미드 복제 기원, 특히 박테리아 및/또는 파지 복제 기원을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "패키징된 파지미드"는 박테리오파지 스캐폴드, 박테리아 바이러스 입자 또는 캡시드에 캡시드화된 파지미드를 의미한다. 특히, 야생형 박테리오파지 게놈이 없는 박테리오파지 스캐폴드, 박테리아 바이러스 입자 또는 캡시드를 의미한다. 패키징된 파지미드는 당업자에게 충분히 공지된 헬퍼 파지 전략으로 생산될 수 있다. 헬퍼 파지는 캡시드화하려는 본 발명에 따른 파지미드에 필수불가결한 구조적 및 기능적 단백질을 코딩하는 모든 유전자를 포함한다. 패키징된 파지미드는 당업자에게도 역시 공지된, 위성 바이러스 전략으로 생산될 수 있다. 위성 바이러스는 하위 바이러스 작용제이고,모든 형태발생적 기능에 대한 헬퍼 바이러스로 숙주 세포의 동시-감염에 의존하는 핵산으로 구성되는 반면, 모든 이의 에피솜 기능 (통합 및 면역력, 다중카피 플라스미드 복제)의 경우에 위성은 헬퍼로부터 완전하게 자율적이다. 일 구현예에서, 위성 유전자는 이의 더 작은 게놈에 맞추기 위해 P2 캡시드 크기를 제어하는 P4 Sid 단백질에 대해 기술된 바와 같이, 헬퍼 파지의 캡시드 크기 감소를 촉진하는 단백질을 코딩할 수 있다.
≪펩티드≫
본 명세서에서 사용되는 용어 "펩티드"는 서로 간에 연결된 적어도 2개 아미노산의 짧은 사슬, 및 단백질의 일부, 서브세트 또는 단편을 의미하고, 이러한 일부, 서브세트 또는 단편은 단백질의 나머지와 독립적으로 발현되지 않는다. 일부 예에서, 펩티드는 단백질이다. 일부 다른 예에서, 펩티드는 단백질이 아니고, 펩티드는 오직 단백질의 일부, 서브세트 또는 단편만을 의미한다. 바람직하게, 펩티드는 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 아미노산 내지 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 20개, 25개, 30개, 40개, 50개, 100개, 200개 아미노산 크기이다.
"상동성" 및 "동일성"
"상동성"이란, 본 명세서에서 둘 이상의 아미노산 분자의 아미노산 서열이 부분적으로 또는 완전히 동일한 것을 의미한다. 일정 구현예에서 상동성 아미노산 서열은 기준 아미노산 서열과 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 서열 유사성 또는 동일성을 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 2개 서열 간 퍼센트 상동성은 2개 서열 간 퍼센트 동일성과 동등하다. 퍼센트 동일성은 그의 서열이 정렬된 중합체 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드)에 대해서 계산된다. 2개 서열 간 퍼센트 동일성은 2개 서열의 최적 정렬을 위해 도입할 필요가 있는, 갭의 개수, 및 각 갭의 길이를 고려하여, 서열이 공유하는 동일한 위치의 개수의 함수이다 (즉, % 상동성 = 동일한 위치의 #/위치의 총 # x 100). 서열들의 비교 및 2개 서열 간 퍼센트 동일성의 결정은 하기 비제한적인 예에서 기술된 바와 같이, 수학 알고리즘을 사용해 수행될 수 있다.
2개 아미노산 서열 간 퍼센트 동일성은 PAM120 가중치 잔기 표, 12의 갭 길이 패널티 및 4의 갭 패널티를 사용하여, ALIGN 프로그램 (version 2.0)에 통합된 E. Meyers 및 W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17 (1988))의 알고리즘을 사용해 결정할 수 있다. 또한, 2개 아미노산 서열 간 퍼센트 동일성은 BLOSUM62 매트릭스, BLOSUM30 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치를 사용하여, GCG 소프트웨어 패키지의 GPA 프로그램 (www.gcg.com에서 입수가능)에 통합된 Needleman 및 Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) 알고리즘을 사용해 결정할 수 있다. 특별한 구현예에서, BLOSUM30 매트릭스는 12의 갭 개방 패널티 및 4의 갭 연장 패널티로 사용된다.
서열의 간략한 설명
실시예
실시예 1 - 직결장암을 예방하기 위한 방법
파지미드는 파지 패키징 부위, 유전자 변형을 유도하기 위해 디아미나제 도메인에 융합된 dCas9 또는 nCas9를 함유하는 염기 편집자 효소 또는 유전자 변형을 유도하기 위해 역전사효소 도메인에 융합된 dCas9 또는 nCas9를 함유하는 프라이머 편집자 효소를 함유하는 것이 생성된다.
패키징된 파지미드는 표준 열 유도 프로토콜에 따라 생산된다26.
박테리아와 접촉된 패키징된 파지미드는 그 결과로 pks+ 이. 콜라이에서 ClbP 유전자에 단일-아미노산 돌연변이 및 콜리박틴 독소의 유전독성 활성의 불활성화를 일으키지만, 독소의 길항적 활성은 유지한다. pks+ 이. 콜라이에서 ClbP 유전자의 단일-아미노산 돌연변이는 S95A, S95R 및 K98T로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 변형이다1. 박테리오파지 벡터는 이. 콜라이에서 높은 역가로 생산되고, 약학 조성물이 제조된다. 약학 조성물은 환자의 pks+ 이. 콜라이의 원위치 유전자 변형을 생성시키기 위해 인간 환자에게 투여된다. 투여 결과로 콜리박틴 독소의 유전독성 활성이 불활성화되었지만, 독소의 길항적 활성이 유지되는 환자 내 이. 콜라이의 개체군을 생성시킨다. 시간 경과에 따른 추가 투여는 추가로 유전독성 활성이 없는 콜리박틴 독소를 갖는 환자에서 이. 콜라이의 백분율을 증가시키면서, 유전독성 활성을 갖는 콜리박틴 독소를 갖는 환자에서 이. 콜라이의 백분율의 감소를 일으킨다. 이러한 방식으로, 콜리박틴 독소의 유전독소 활성의 음성 효과에 대한 환자의 노출을 최소화할 수 있다.
실시예 2 - 심근염의 진행을 중지시키기 위한 방법
인간 MYH6 심장 펩티드와 높은 상동성을 보이는 박테로이데스 파에시스 (Bacteroides faecis) 또는 박테로이데스 세타이오타오미크론 (Bacteroides thetaiotaomicron) 베타-갈락토시다제의 펩티드 서열의 원위치에서의 유전자 변형에 의해 치명적인 심근병증으로 심근염의 진행을 중지시키기 위한 방법을 개발한다2.
파지미드는 파지 패키징 부위, 유전자 변형을 유도하기 위해 디아미나제 도메인에 융합된 dCas9 또는 nCas9를 함유하는 염기 편집자 효소, 또는 유전자 변형을 유도하기 위해 역전사효소 도메인에 융합된 dCas9 또는 nCas9를 함유하는 프라이머 편집자 효소를 함유하는 것이 생성된다.
패키징된 파지미드는 표준 열 유도 프로토콜에 따라 생산된다26.
박테리아와 접촉된 패키징된 파지미드는 인간 MYH6 심장 펩티드와 이의 상동성을 감소시키지만, 효소의 활성은 유지하는 박테로이데스 파에시스 또는 박테로이데스 세타이오타오미크론 베타-갈락토시다제의 펩티드 서열에 단일-아미노산 돌연변이를 일으킨다. 다수의 단일-아미노산 돌연변이는 보존성 돌연변이에서 출발하여, 분석된다. 박테리오파지 벡터는 높은 역가로 이. 콜라이로 생산되고 약학 조성물이 제조된다. 약학 조성물은 환자의 박테로이데스의 원위치 유전자 변형을 생성시키기 위해 인간 환자에게 투여된다. 투여 결과로 박테로이데스 파에시스 또는 박테로이데스 세타이오타오미크론 베타-갈락토시다제의 펩티드 서열이 인간 MYH6 심장 펩티드와의 감소된 상동성을 갖는 환자에서의 박테로이데스의 개체군이 생성된다. 시간 경과에 따른 추가 투여는 인간 MYH6 심장 펩티드와 높은 상동성을 갖는 박테로이데스 베타-갈락토시다제의 펩티드 서열을 갖는 환자에서의 박테로이데스의 백분율의 감소를 더 일으키지만, 인간 MYH6 심장 펩티드와 낮은 상동성을 갖는 박테로이데스 베타-갈락토시다제의 펩티드 서열을 갖는 환자에서 박테로이데스의 백분율은 증가시킨다. 이러한 방식으로, 박테로이데스 단백질 및 인간 MYH6 심장 펩티드의 면역 교차-반응성에 의해 야기된 음성 자가-면역 효과에 대한 환자의 노출을 최소화할 수 있다.
실시예 3 - 벡터의 스크리닝
파지미드는 파지 패키징 부위, 유전자 변형을 유도하기 위해 디아미나제 도메인에 융합된 dCas9 또는 nCas9를 함유하는 염기 편집자 효소, 또는 유전자 변형을 유도하기 위해 역전사효소 도메인에 융합된 dCas9 또는 nCas9를 함유하는 프라이머 편집자 효소를 함유하는 것을 생성시킨다.
패키징된 파지미드는 표준 열 유도 프로토콜에 따라 생산된다26.
박테리아 개체군을 접촉한 패키징된 파지미드는 pks+ 이. 콜라이에서 ClbP 유전자의 단일-아미노산 돌연변이 및 콜리박틴 독소의 유전독성 활성의 불활성화을 일으킨다. pks+ 이. 콜라이에서 ClbP 유전자의 단일-아미노산 돌연변이는 S95A, S95R 및 K98T로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 변형일 것이다1.
파지미드는 시험관내에서 pks+ 이. 콜라이와 접촉될 것이다. 변형 및 비변형 이. 콜라이의 성장은 시험관내에서 성장에 대한 변형의 효과를 결정하기 위해 통상의 배양 기술을 사용해 액상 및 고형 배양으로 시험될 것이다.
파지미드 벡터는 높은 역가로 이. 콜라이에서 생산될 것이고 약학 조성물이 제조될 것이다.
약학 조성물은 마우스의 pks+ 이. 콜라이의 원위치 유전자 변형을 생성시키기 위해 대상체 마우스에게 투여될 것이다.
분변 샘플은 매일 시점에 수집될 것이고 PCR 및 시퀀싱으로 시험되어 변형 및 미변형 이. 콜라이의 수준을 정량하여 각 시간의 백분율을 결정하게 될 것이다. 시간 경과에 따른 변형 및 미변형 이. 콜라이의 수준의 비교는 이들 유전자 돌연변이를 유도시키는 벡터의 효율을 결정하고, 박테리아 성장에 대한 이들 돌연변이의 효과를 결정하기 위해서, 박테리아에서 유전자 변형에 대한 스크리닝을 허용한다.
실시예 4 - 전신 홍반성 루푸스 (SLE) 또는 아급성 피부 홍반성 루푸스(SCLE) 예방 또는 치료를 위해 Ro60 오솔로그를 발현하는 편리 공생 박테리아의 편집
박테리아 Ro60 오솔로그, 보다 특히 이들 오솔로그의 에피토프의 원위치 유전자 변형을 통해서, 전신 홍반성 루푸스 (SLE) 또는 아급성 피부 홍반성 루푸스(SCLE)의 출현 또는 진행을 중지시키기 위한 방법.
파지미드는 파지 패키징 부위, 유전자 변형을 유도하기 위해 디아미나제 도메인에 융합된 dCas9 또는 nCas9를 함유하는 염기 편집자 효소 또는 유전자 변형을 유도하기 위해 역전사효소 도메인에 융합된 dCas9 또는 nCas9를 함유하는 프라이머 편집자 효소를 함유하는 것이 생성된다.
패키징된 파지미드는 표준 열 유도 프로토콜에 따라 생산된다26.
박테리아 개체군과 접촉된 패키징된 파지미드는 인간 Ro60 펩티드와 이의 상동성을 감소시키지만7, 효소의 활성은 유지하는 박테리아 Ro60 오솔로그의 펩티드 서열의 아미노산 돌연변이를 일으킨다. 다수의 단일-아미노산 돌연변이는 보존성 돌연변이에서 출발하여, 분석된다. 박테리오파지 벡터는 높은 역가로 생산되고 약학 조성물이 제조된다. 약학 조성물은 환자의 원위치 유전자 변형을 생성시키기 위해 인간 환자에게 투여된다. 투여는 하나 또는 몇몇의 편리 공생 박테리아 예컨대 프로피오니박테리움 프로피오니쿰에 대한 R060 오솔로그의 에피토프 영역에 하나 또는 몇개 아미노산 돌연변이를 일으킨다.
돌연변이는 하기에서의 하나 또는 몇개의 비-동의 돌연변이이다:
● Ro60 B 세포 에피토프 (aa 169-190) (TKYKQRNGWSHKDLLRLSHLKP, SEQ ID NO: 16), 보다 특히 아미노산 변화는 (KY-R-GW-H-DLLRL-H)에 존재할 것이다.
● Ro60 T 세포 에피토프 (aa 316-335) (KARIHPFHILIALETYKTGH, SEQ ID NO: 17) 보다 특히 아미노산 변화는 아미노산 (-AR-HP---L--A--TY--G-)에 존재할 것이다.
● Ro60 T 세포 에피토프 (aa 369-383) (KRFLAAVDVSASMNQ, SEQ ID NO: 18), 보다 특히 아미노산 변화는 아미노산 (-R----DVS-SM--)에 존재할 것이다.
그의 게놈이 Ro60 오솔로그를 함유하는 인간 편리 공생 박테리아의 비제한적인 목록은 하기와 같다: 악티노마이세스 마실리엔시스 F0489 (Actinomyces massiliensis)(HMPREF1318_2237), 악티노마이세스 (Actinomyces) sp. 경구 분류군 414 (AM609_00765), 코리네박테리움 아미콜라툼 (Corynebacterium amycolatum) SK46 (CORAM0001_1910), 마이코박테리움 스메그마티스 (Mycobacterium smegmatis) (균주 ATCC 700084/mc(2)155) (MSMEG_1193), 파라스카르도비아 덴티콜렌스 (Parascardovia denticolens) IPLA 20019 (A200_07914), 프로피오니박테리움 프로프 (Propionibacterium prop) F0230a (HMPREF9154_0590), 세그닐리파루스 루고서스 (Segniliparus rugosus) ATCC BAA-974 (HMPREF9336_02315), 스트렙토마이세스 (Streptomyces) sp. HGB0020 (HMPREF1211_06263), 박테로이데스 세타 (Bacteroides theta) 7330 (Btheta7330_01248), 크리세오박테리움 글레움 (Chryseobacterium gleum) ATCC 35910 (HMPREF0204_10833), 프레보텔라 (Prevotella) sp. CAG:1092 (BN465_02442), 클로스트리듐 (Clostridium) sp. BL8 (M918_10850), 파에니바실러스 (Paenibacillus) ssp. HGF7 (HMPREF9413_2200), 파에니바실러스 (Paenibacillus) sp. HGH0039 (HMPREF1207_01859), 에이케넬라 코로덴스 (Eikenella corrodens) ATCC 23834 (EIKCOROL_00065), 킨겔라 오랄리스 (Kingella oralis) ATCC 51147 (GCWU000324_03050), 네이세리아 엘론가타 (Neisseria elongata) subsp. 글리콜리티카 ATCC 29315 (NEIELOOT_02899), 네이세리아 플라베센스 (Neisseria flavescens) 균주 CD-NF1 (TV01_0020), 네이세리아 마카카에 (Neisseria macacae) ATCC 33926 (HMPREF9418_1500), 네이세리아 무코사 (Neisseria mucosa) 균주 C6A (ES17_04055), 네이세리아 샤이에가니이 (Neisseria shayeganii) 871 (HMPREF9371_0707), 네이세리아 시카 (Neisseria sicca) ATCC 29256 (NEISICOT_02760), 네이세리아 (Neisseria) sp. GT4A_CT1 (HMPREF1028_01178), 네이세리아 (Neisseria) sp. 경구 분류군 020 str. F0370 (HMPREF9120_02756), 네이세리아 서브플라바 (Neisseria subflava) NJ9703 (NEISUBOT_04391), 카르디오박테리움 발바럼 (Cardiobacterium valvarum) F0432 (HMPREF9080_02018), 시네르기스테스 (Synergistes) sp. 3_1_syn1 (HMPREF1006_01942).
보다 바람직하게 박테리오파지 벡터에 의해 표적화되는 인간 편리 공생 박테리아는 프로피오니박테리움 프로피오니쿰 (Propionibacterium propionicum), 코리네박테리움 아미콜라툼 (Corynebacterium amycolatum), 악티노마이세스 마실리엔시스 (Actinomyces massiliensis), 박테로이데스 세타이오타오미크론 (Bacteroides thetaiotaomicron)이다.
실시예 5 - 원위치에서 병원성 에스케리치아 콜라이의 편집
이. 콜라이는 편리 공생 엔테로박테리아이지만 특별한 균주들은 장의 내부 및 외부에서 수많은 병상 특히 염증성 장 질환(IBD), 요로 감염 (UTI), 용혈성 요독 증후군 (HUS), 위장염 또는 직결장암과 연관되었다. 이들 특별한 균주의 병원성은 그들 중 일부는 수평적 유전자 전달 예컨대 용원성 파지에 의해 운반되는 시가 독소 유전자 (stx)같이 수평적 유전자 전달에 의해서 또는 특별한 유전자 내 돌연변이에 의해서 획득되는 병독성 유전자로부터 기원한다.
병독성 유전자 특히 이. 콜라이의 염증성 성질에 관여하는 유전자의 펩티드 서열의 원위치 유전자 변형에 의해 장 박테리아 에스케리치아 콜라이의 병원성 성질을 감소시키거나 또는 제거하기 위한 방법이 하기에 기술된다.
파지미드는 파지 패키징 부위, 유전자 변형을 유도하기 위해 디아미나제 도메인에 융합된 dCas9 또는 nCas9를 함유하는 염기 편집자 효소 또는 유전자 변형을 유도하기 위해 역전사효소 도메인에 융합된 dCas9 또는 nCas9를 함유하는 프라이머 편집자 효소를 함유하는 것이 생성된다. 패키징된 파지미드는 표준 열 유도 프로토콜에 따라 생산된다26.
파지미드는 박테리아 개체군과 접촉하여 하기 유전자에 하나 또는 몇개의 비-동의 돌연변이의 돌연변이를 일으킨다:
● 하기 돌연변이의 반전을 일으키는 FimH 유전자: AEIC 균주와 연관된 N70S 및 AEIC 균주3.
● 하기 돌연변이의 반전을 일으키는 ChiA 유전: K362Q, K370E, A378V, E388V, V548E24
● 하기 돌연변이의 반전을 일으키는 OmpA 유전자: A200V25
● 하기 돌연변이의 반전을 일으키는 OmpC 유전자: V220I, D232A25
● 하기 돌연변이의 반전을 일으키는 OmpF 유전자: E51V, M60K25
● 하기 돌연변이의 반전을 일으키는 이. 콜라이의 blc 유전자: 장 염증과 잠재적으로 연관된 G84E (뉴클레오티드 수준에서 G251A4
실시예 6 - 원위치에서 스타필로코쿠스 에피더미디스 (
Staphylococcus epidermidis
)의 편집
스타필로코쿠스 에피더미디스는 쿠티박테리움 아크네스 (Cutibacterium acnes)와 함께 인간 피부에서 가장 우세하고 풍부한 2종 편리 공생 박테리아 중 하나이다. 이와 같이, 이의 밀접하게 관련된 스타필로코쿠스 아우레우스처럼 병원성 박테리아에 의한 군집화를 예방하거나, 피부 암을 예방하거나 또는 인간 면역계를 조절하는 것으로 확인되었다. 그러나, 또한 이의 기회 병원성 특징 및 이의 증가되는 항생제 내성으로 인해 점점 우려되고 있다. 에스. 에피더미스 (S. epidermis)의 이들 병원성 형질은 특별한 병독성 유전자에서 코딩될 수 있거나 또는 이들 중 일부는 수평적 유전자 전달을 통해서 균주 전반에서 확산될 수 있다.
병독성 유전자의 펩티드 서열의 윈워치 유전자 변형에 의해 에스. 에피더미디스 (S. epidermidis)의 병원성 성질을 감소시키거나 또는 제거하기 위한 방법이 하기에 기술된다.
파지미드는 파지 패키징 부위, 유전자 변형을 유도하기 위해 디아미나제 도메인에 융합된 dCas9 또는 nCas9를 함유하는 염기 편집자 효소 또는 유전자 변형을 유도하기 위해 역전사효소 도메인에 융합된 dCas9 또는 nCas9를 함유하는 프라이머 편집자 효소를 함유하는 것이 생성된다.
패키징된 파지미드는 표준 열 유도 프로토콜에 따라 생산된다26.
박테리아 개체군과 접촉된 패키징된 파지미드는 병원성의 감소 또는 제거를 초래하는 하나 또는 몇개의 유전자 돌연변이를 일으킨다. 이것은 예를 들어, 비동의 돌연변이, 유전자 파괴를 초래하는 돌연변이 예컨대 중지 코돈의 도입 또는 조절 서열 예컨대 프로모터, 전사 결합 부위의 돌연변이에 의해 수행될 수 있다.
유전자 돌연변이는 [Meric et al]27 에 기술되고 본 명세서에 열거된 바와 같은 에스. 에피더미디스 감염과 연관된 하나 또는 몇개 유전자에 대해 표적화된다: id1001_1081, SE_p608, SE0037, SE0038, SE_p609, id1001_1086, SE0058, SE_p205, SE_p603, SEA0027, SE0036, SE0033, SE0053, SE0055, SE_p522, SE_p610, SE_p611, id1001_1083, id1067_0124, id268_0008, SE0090, SE2153, id1001_0181, id1067_0123, id1074_1993, SE0023, SE0030, SE0103, SE0120, SE0129, SE_p607, SEA0003, id1001_2175, id1001_2181, SE0031, SE0069, SE0076, SE0107, SE0115, SE_p602, SE_p606, SEA0022, SEA0030, id2_1533, id1001_0179, id1001_0180, id1001_0186, id1001_0194, id1001_0203, id1001_2173, id1001_2184, id1001_2209, id1067_0125, id1067_0126, id1074_0268, id1075_0004, id1092_0129, SE0004, SE0020, SE0114, SE0127, SE0282, SE1013, SE1106, SE1292, SE2395, SE_p605, SEA0004, SEA0008, id1001_0187, id1001_2183, id1001_2208, id1021_0918, id1074_0267, SE0005, SE0021, SE0050, SE0063, SE0118, SE1588, SE1632, SE1920, SE_p507, SEA0002, SEA0020, SEA0021, id1001_0910, id1001_2159, id1001_2206, id1021_0613, id1032_2361, id1032_2362, id1067_0112, id1067_0226, id1067_0227, id1067_1124, id429_2314, SE0045, SE0051, SE0054, SE0101, SE0109, SE0112, SE0116, SE0119, SE0145, SE0175, SE0803, SE0852, SE1092, SE1102, SE1103, SE1107, SE1118, SE1128, SE1429, SE1455, SE1587, SE1607, SE1983, SE2011, SE2079, SE2208, SE2251, SE2260, SE2409, SE_p103, SE_p508, SE_p521, SEA0005, id1001_0007, id1001_0010, id1001_0183, id1001_0191, id1001_0199, id1001_0912, id1001_1283, id1001_2163, id1001_2164, id1001_2169, id1001_2174, id1001_2185, id1031_0178, id1067_0113, id1074_2138, id429_2315, id429_2316, id429_2317, id429_2319, SE0001, SE0009, SE0016, SE0032, SE0071, SE0102, SE0104, SE0106, SE0108, SE0111, SE0122, SE0146, SE0148, SE0182, SE0197, SE0230, SE0231, SE0240, SE0263, SE0273, SE0306, SE0629, SE0800, SE0804, SE0805, SE0815, SE0817, SE0825, SE0828, SE1037, SE1094, SE1096, SE1105, SE1458, SE1605, SE1606, SE1613, SE1728, SE1917, SE1919, SE1921, SE2160, SE2192, SE2220, SE2257, SE_p410, id1001_0011, id1001_0182, 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SEA0029, id2_1530, id1001_0188, id1001_0911, id1001_1285, id1001_1982, id1005_1719, id1021_0758, id1021_0930, id1021_1658, id1021_1663, id1021_2114, id1031_1153, id1031_1190, id1031_1202, id1031_1222, id1031_1428, id1067_1094, id1067_1098, id1067_1099, id1067_1106, id1067_1135, id1091_2272, id1120_2061, id262_0707, id262_0708, id304_0202, id53_0678, SE0013, SE0015, SE0022, SE0121, SE0126, SE0135, SE0142, SE0149, SE0152, SE0185, SE0194, SE0196, SE0212, SE0226, SE0232, SE0237, SE0242, SE0243, SE0259, SE0262, SE0269, SE0272, SE0274, SE0275, SE0276, SE0278, SE0279, SE0281, SE0299, SE0305, SE0355, SE0435, SE0456, SE0604, SE0673, SE0689, SE0701, SE0704, SE0705, SE0707, SE0716, SE0779, SE0782, SE0808, SE0814, SE0818, SE0836, SE0839, SE0990, SE1082, SE1097, SE1108, SE1109, SE1122, SE1136, SE1138, SE1196, SE1207, SE1288, SE1456, SE1464, SE1546, SE1574, SE1580, SE1585, SE1589, SE1603, SE1604, SE1643, SE1735, SE1773, SE1827, SE1836, SE1899, SE1914, SE1915, SE1938, SE1946, SE2005, SE2022, SE2036, SE2041, SE2043, SE2052, SE2071, SE2074, SE2090, SE2116, SE2148, SE2149, SE2154, SE2167, SE2175, SE2194, SE2198, SE2199, SE2210, SE2215, SE2223, SE2225, SE2229, SE2259, SE2306, SE2314, SE2333, SE2337, SE2342, SE2379, SE2388, SE2394, SE_p411, SEA0006, id1001_0185, id1001_2167, id1001_2190, id1005_0702, id1005_0703, id1005_0704, id1005_1752, id1021_0787, id1021_1631, id1021_1651, id1021_1652, id1021_1667, id1021_1669, id1021_1671, id1021_1673, id1031_1154, id1031_1160, id1031_1169, id1031_1173, id1031_1179, id1031_1182, id1031_1431, id1031_2369, id1032_2377, id1036_1869, id1036_1871, id1067_1096, id1067_1097, id1067_1104, id1067_1117, id1067_1130, id1068_0108, id1068_0584, id1074_1751, id1074_2133, id1091_2269, id1092_1189, id267_0755, id324_1262, SE0014, SE0066, SE0117, SE0123, SE0134, SE0144, SE0163, SE0180, SE0195, SE0223, SE0229, SE0250, SE0251, SE0255, SE0261, SE0280, SE0301, SE0410, SE0444, SE0450, SE0455, SE0615, SE0637, SE0657, SE0663, SE0664, SE0669, SE0670, SE0683, SE0684, SE0690, SE0700, SE0706, SE0713, SE0785, SE0790, SE0797, SE0813, SE0816, SE0832, SE0909, SE1075, SE1080, SE1085, SE1089, SE1121, SE1132, SE1133, SE1175, SE1183, SE1184, SE1210, SE1212, SE1311, SE1348, SE1397, SE1408, SE1442, SE1460, SE1470, SE1516, SE1577, SE1581, SE1629, SE1635, SE1726, SE1727, SE1779, SE1785, SE1932, SE1949, SE1953, SE1954, SE1957, SE1959, SE1978, SE2012, SE2019, SE2023, SE2037, SE2046, SE2053, SE2054, SE2075, SE2085, SE2087, SE2088, SE2093, SE2094, SE2095, SE2114, SE2186, SE2191, SE2197, SE2213, SE2228, SE2230, SE2232, SE2242, SE2245, SE2247, SE2252, SE2253, SE2255, SE2256, SE2258, SE2298, SE2380, SE2384, SE2393, SE2396, SE2397, SE2406, SE2407, SE2411, SE2412, SE2415, SE_p409, SEA0033, id2_0245, id1001_0986, id1001_2165, id1021_0310, id1021_1615, id1021_1628, id1021_1635, id1021_1638, id1021_1654, id1021_1655, id1021_1659, id1021_1668, id1031_1165, id1031_1170, id1031_1171, id1031_1172, id1031_1174, id1031_1178, id1031_1181, id1031_1183, id1031_1224, id1031_1432, id1032_2373, id1067_1146, id1068_0610, id1074_0173, id1121_0371, id267_0744, id267_0753, id268_1096, id277_0533, id277_0629, id284_0382, id312_1160.
바람직하게 유전자 돌연변이는 하기 목록의 에스. 에피더미디스 감염과 연관된 하나 또는 몇개 유전자에 대해 표적화된다: SE0023, SE0101, SE0121, SE0128, SE0275, SE0281, SE0307, SE1105, SE1128, SE1459, SE2197, SE2245, SE2259, SE_p521, id1001_2159, id1068_0108, id1091_1647, SE0197, SE0704, SE0705, SE0706, SE0707, SE1632, SE2201, id1001_0010, SE0004, SE0030, SE0031, SE0033, SE0036, SE0050, SE0053, SE0055, SE0076, SE0090, SE0111, SE1897, id1067_0123, id1067_0124, id1067_0125, id1067_0126, id1067_0226, id1067_0227, SE0102, SE0103, SE0104, SE0105, SE0106, SE0107, SE0108, SE0110, SE0117, SE0157, SE0175, SE0673, SE0818, SE0828, SE1311, SE1637, id1067_1493, id324_1262.
실시예 7 - 시험관내에서 형질전환 이후 이. 콜라이 게놈 상에서 mCherry의 염기 편집
이 실시예는 염기 편집자를 코딩하는 DNA 페이로드로 형질전환 이후에 이. 콜라이 MG1655 게놈 상에서 형광 단백질 mCherry (SEQ ID NO: 5)를 코딩하는 핵산 서열의 염기 편집을 위한 방법을 제공한다. 형광도는 형질전환 및 클로람페니콜 플레이트 상에서 밤샘 선택 이후에 개별 콜로니의 유세포측정을 통해서 측정되었다.
도 4A에 도시된 바와 같이, 아데닌 염기 편집자 ABE8e (SEQ ID NO: 1, 도 7에 도시된 플라스미드 맵)는 전체-길이 단백질의 번역은 가능하면서 mCherry (트리펩티드: M71, Y72, G73)의 활성 부위를 탈활성화시켰다.
도 4B에 도시된 바와 같이, 시토신 염기 편집자 (evoAPOBEC1-nCas9-UGI; SEQ ID NO: 3, 도 8에 도시된 플라스미드 맵)는 중지 코돈 (Q114)을 표적 유전자 mCherry에 삽입하여서 형광 상실을 일으켰다.
대조군으로서, 염기 편집자는 형광 mCherry 발현을 초래하는 가이드RNA (2 콜로니 분석)의 부재 하에서 형질전환되었다.
동일 가이드RNA를 통해서 mCherry를 표적화하는 모든 48개의 분석된 콜로니는 성공적으로 편집되어서, 형광 상실을 초래하였다. 5개 콜로니의 mCherry 유전자를 시퀀싱하여 성공적인 염기 편집을 확인하였다.
실시예 8 - 시험관내에서 패키징된 파지미드 형질도입 이후에 이. 콜라이 게놈 상에서 β-락타마제의 염기 편집
이 실시예는 시험관내에서 패키징된 파지미드 형질도입 이후에 이. 콜라이 MG1655 게놈 상에서 β-락타마제 (SEQ ID NO: 6)를 코딩하는 핵산 서열의 염기 편집을 위한 방법을 제공한다. 도 5A에 도시된 바와 같이, 염기 편집자 (ABE 또는 CBE) 및 게놈 상에서 β-락타마제 유전자 (K71E)의 활성 부위를 표적화하는 전사된 가이드RNA를 코딩하고, 람다 패키징 서열, 클로람페니콜 내성 마커, 및 p15A 복제 기원을 더 보유하는 패키징된 람다 파지미드 (MG1655 균주에서 형질도입을 가능하게 하는 A8 gpJ 단백질 및 P2 STF 단백질을 포함하는 박테리아 전달 비히클 내)의 생산으로 ㎕ 당 ∼108 형질도입 단위 (tu)의 역가를 생성시켰다.
세포는 염기 편집 효율을 분석하기 위해서 형질도입 이후 2시간에 카르베니실린 플레이트 상에 플레이팅되었다.
도 5B에 도시된 바와 같이, 게놈 상에서 β-락타마제 유전자의 활성 부위 (K71E)를 표적화하는 아데닌 염기 편집 (ABE8e; SEQ ID NO: 2 사용)의 효율은 감염 다중도 (MOI)-의존적이었다. 박테리아 게놈 상의 β-락타마제 유전자에 주지 코돈을 삽입하는 시토신 염기 편집 (evoAPOBEC1-nCas9-UGI; SEQ ID NO: 4 사용)의 효율도 역시 MOI-의존적이었다 (도 5C). ABE 또는 CBE는 각각 높은 MOI에서 세포 성장의 ∼4 log 또는 ∼3 log 감소를 일으켰다.
실시예 9 - 생체내 올리고MM 마우스에서 이. 콜라이로 형질도입 이후 β-락타마제의 아데닌 염기 편집
이 실시예는 생체내에 올리고-마우스-미생물총 모델에서 이. 콜라이로 파지미드 형질도입 이후에 표적 유전자 (β-락타마제; SEQ ID NO: 6)의 아데닌 염기 편집 (ABE8e, SEQ ID NO: 2 사용)을 위한 방법을 제공한다.
생체내 실험을 위한 패키징된 파지미드 역가 (MG1655 균주에 형질도입할 수 있는 A8 gpJ 단백질 및 P2 STF 단백질을 포함하는 박테리아 전달 비히클 내)는 ㎕ 당 1.5 Х 109 형질도입 단위 (tu/㎕)였다. 상기 파지미드는 SrpR 프로모터 하에서 발현된 아데닌 염기 편집자 ABE8e 및 게놈 상에서 β-락타마제 유전자의 활성 부위 (K71E)를 표적화하는 항상적으로 전사된 가이드RNA를 보유한다. 더 나아가서, 상기 파지미드는 람다 패키징 서열, 클로람페니콜 내성 마커, 및 p15A 복제 기원을 보유한다.
β-락타마제 유전자를 보유하는 이. 콜라이 균주는 마우스 당 107 CFU로 7주령의 10마리 개별 마우스에게 투여되었다. 2개 패키징된 파지미드 용량 (마우스 당 100 ㎕ 패키징된 파지미드 + 100 ㎕ 수크로스 바이카보네이트)은 0시간 및 30시간에 마우스에게 경구로 투여되었다. 분변 샘플은 초기 파지미드 형질도입 이후 0시간, 6시간, 및 48시간에 분석되었다 (각각 48개, 96개, 88개 콜로니).
세포는 전달 및 편집 효율을 분석하기 위해서 스트렙토마이신, 클로람페니콜, 및 카르베니실린 플레이트 상에 플레이팅하였다. β-락타마제의 활성 부위 (K71E)의 편집은 카르베니실린 플레이트 상에서 세포 성장의 상실을 일으켰다.
도 6에 도시된 바와 같이, 48시간 후에, 표적화된 박테리아 개체군의 ∼49%는 DNA 페이로드를 보유하였고 전체 개체군의 ∼30%는 생체내에서 염기 편집되었다. 페이로드 전달의 백분율은 더 높은 파지미드 역가 및/또는 누적 용량만큼 더 증가될 수 있었다.
실시예 10 - 시험관내에서 이. 콜라이 게놈 상에서 적색 형광 단백질 (RFP)의 프라임 편집.
이 실시예는 DNA 페이로드로 형질전환 이후에 이. 콜라이 게놈 상에서 적색 형광 단백질 RFP (SEQ ID NO: 2314)를 코딩하는 핵산 서열의 프라임 편집을 위한 방법을 제공한다 (도 9). 페이로드는 프라임 편집자 (PE; 서열 SEQ ID NO: 2315의 페이로드), 전사된 프라임 편집 가이드 RNA (pegRNA), 람다 패키징 서열, 클로람페니콜 내성 마커, 및 p15A 복제 기원을 코딩한다. pegRNA는 박테리아 게놈 상에서 RFP의 아미노산 E16 (GAA)을 중지 코돈 (TAA)으로 치환하기 위해서 역전사효소 서열 및 프라임 결합 부위를 함유하는 연장된 단일 가이드 RNA로 이루어진다.
프라임 편집자 (PE; 서열 SEQ ID NO: 2315의 페이로드)는 표적 유전자 RFP의 위치 E16에서 중지 코돈을 삽입시키기 위해 조작되어서 적색 형광의 상실을 일으켰다.
대조군으로서, 프라임 편집자는 형광 RFP 생산을 초래하는 pegRNA의 부재 하에서 형질전환되었다.
게놈 RFP 유전자는 형질전환 및 밤새 클로람페니콜 플레이트 상에서 선택 이후에 18개 개별 콜로니로부터 증폭되었다. 최종적인 PCR 단편은 시퀀싱하였고 편집 효율을 계산하였다.
도 9에 도시된 바와 같이, 중지 코돈은 이들 개별 콜로니 중 4개 (박테리아 개체군의 ∼22%)에 존재하여 성공적인 프라임 편집을 확인하였다.
실시예 11: 비-복제성 페이로드에 사용된 시스템의 설명
본 발명자는 282-bp 프리마제 기원을 함유하고 프리마제 단백질이 트랜스로 공급되는 시스템을 개발하였다 (SEQ ID NO: 8 및 SEQ ID NO: 14). 조작 과정을 단순화하기 위해서, PICI 프리마제 유전자는 이. 콜라이 CFT073의 게놈으로부터 추출하여, 유도성 시스템의 제어 하의 플라스미드에 클로닝하였으며, RBS (리보솜-결합 부위) 라이브러리를 생성시켰다. 이러한 일련의 플라스미드는 람다 생산 균주 s1965에 클로닝하였다. 다음으로, 본 발명자는 p15a-기반 복제 기원 대신에 프리마제-ori를 보유하는 소형 페이로드를 구축하여서 2.3 kb 페이로드를 산출하였다. 이러한 플라스미드는 원칙적으로, 비-복제성이고, 유도성 프리마제 구성체의 RBS 라이브러리를 보유하는 s1965의 컴피턴트 세포가 만들어졌으므로, 플라스미드를 그에 형질전환시키고, 유도제 DAPG (트랜스로 프리마제의 발현을 유도하기 위함)의 존재 하에서 LB 한천 + 카나마이신 및 클로람페니콜에 플레이팅하였다. 다음 날에, 본 발명자는 플레이트가 수백개의 콜로니를 함유한 것을 관찰하여서, 프리마제-기원 시스템이 트랜스로 작용된다는 것을 시사한다 (도 11).
몇개 콜로니를 시퀀싱하여서 플라스미드가 p15a-기반 기원을 함유하지 않고, 그들이 또한 라이브러리로부터 온 RBS를 갖는 온전한 프리마제 유전자를 함유하였음을 검증하였다.
그 이후에, 이들 클론 중 7개는 밤새 성장시켰고 람다 생산은 카나마이신, 클로람페니콜 및 DAPG의 존재 하에서 수행하였다. 대조군으로서, 발명자는 역가를 비규하기 위해서 p15a 복제 기원의 유도체를 함유하는 본래 2.8 kb 플라스미드를 포함시켰다.
수득된 RBS 변이체의 서열을 검증하기 위해서, 시험된 7개 클론 중 유도성 프리마제를 코딩하는 플라스미드를 미니프렙하였고 시퀀싱하였다. 그들은 또한 MG1655 세포 (s003)를 형질전환시켰고, 이들 균주는 수득된 역가를 검증하는데 사용되었는데, 페이로드가 트랜스로 공급된 프리마제 단백질의 부재 하에서 복제되지 않아야 하기 때문이다.
도 12에 도시된 바와 같이, 트래스로 프리마제 플라스미드를 함유하는 MG1655에서 측정된, 7개 프리마제-함유 샘플 중 5개의 역가는 본래 변형된 p15a 기원을 보유하는 패키징된 파지미드의 것과 동일하였다.
마지막으로, 본 발명자들은 프리마제-ori 함유 페이로드가 트랜스로 프리마제 플라스미드없이 MG1655 균주에서 복제될 수 있는지 여부를 시험하였다. 이를 수행하기 위해서, p15a-기원 대조군이 더해진, 상이한 프리마제 RB를 갖는 생산 균주로부터 온 프리마제-ori 함유 플라스미드의 연속 5X 희석물은 MG1655의 조밀한 배양물 (OD600 ∼0.8)에 형질도입하였고, 클로람페니콜을 함유하는 LB 한천 플레이트 상에 플레이팅되었다. 도 13에서 확인할 수 있듯이, 15a-기원 대조군이 마지막 희석까지 건강한 콜로니를 보여서, 활성 플라스미드 복제를 의미하는데 반해서, 프리마제-함유 메이로드를 함유하는 샘플은 높은 MOI에서만 콜로니를 보이는데, 균주가 분열에 따라 페이로드를 상실하게 되기 때문이고, 높은 수의 형질도입된 박테리아를 함유하는 액적들은 분열이 높은 세포 밀도에서 분열이 중단되므로 밀집된 반점으로서 보이게 될 것이고, MOI가 감소되면서, 반점이 보다 투명하게 되어, 단일 콜로니를 구별하기 어려워서, 세포가 플라스미드 상실 및 항생제 노출로 인해 사멸하는 것을 의미한다. 이것은 또한 활성 복제의 부재 하에서, 시간 경과에 따라 희석되게 되는, 형질도입 시, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 유전자의 발현 파괴를 의미하고, 이것은 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제의 세포내 농도가 항생제-보충 배지에서 성장을 지원하는 임계 수준 이하로 하락할 때까지 일정 시간량 동안 수용 세포가 생존할 수 있게 할 것이다.
실시예 12 - 비-복제성 페이로드를 사용해 시험관내에서 패키징된 파지미드 형질도입 이후에 이. 콜라이 게놈 상에서 β-락타마제의 아데닌 염기 편집.
이 실시예는 실시예 11에 개시된 바와 같은 프리마제-헬리카제를 기반으로 하는 비-복제성 페이로드를 사용한 시험관내 패키징된 파지미드 형질도입 이후에 이. 콜라이 MG1655 게놈 상에서 β-락타마제를 코딩하는 핵산 서열 (SEQ ID NO: 6)의 염기 편집을 위한 방법을 제공한다 (도 10). 비-복제성 페이로드는 아데닌 염기 편집자 (ABE8e), 게놈 상에서 β-락타마제 유전자의 활성 부위 (K71E)를 표적화하는 전사된 가이드RNA , 람다 패키징 서열, 클로람페니콜 내성 마커, 및 서열 SEQ ID NO: 8의 조건적 복제 기원 (프리마제-헬리카제의 존재에 의존)으로 이루어진다. 이. 콜라이 MG1655에 전달을 위해 A8 gpJ 단백질 및 p2 STF 단백질을 포함하는 박테리아 전달 비히클 내에 패키징된 람다 파지미드의 생산은 ㎕ 당 7.4 Х 107 형질도입 단위 (tu/㎕)의 역가를 생성시켰다.
형질도입된 세포는 상이한 감염 다중도 (MOI)로 형질도입 후 2시간에 LB 및 LB (카르베니실린) 상에 플레이팅하였다. 다음 날에, 염기 편집 효율은 콜로니 계측을 통해서 분석되었다.
도 10에서 확인할 수 있듯이, 게놈 상에서 β-락타마제 유전자의 활성 부위 (K71E)를 표적화하는 아데닌 염기의 효율은 감염 다중도 (MOI)-의존적이었다. > 4 log의 염기 편집 효율이 비-복제성 페이로드를 사용하여 높은 MOI에서 수득되어서, 표적화된 이. 콜라이 MG1655 박테리아 내부에서 페이로드의 복제를 방지하는 조건적 복제 기원 사용에서의 염기 편집 효율을 확인하였다.
실시예 13 - 프리마제-헬리카제를 기반으로 하는 비-복제성 페이로드를 사용한 생체내에 올리고MM 마우스에서 파지미드 형질도입 이후에 이. 콜라이 게놈 상의 β-락타마제의 염기 편집.
이 실시예는 마우스 군집화 모델에서 이. 콜라이로 패키징된 파지미드 생체내 형질도입 이후에 표적 유전자 (예를 들어, β-락타마제; SEQ ID NO: 6)의 아데닌 염기 편집 (ABE8e-프리마제, SEQ ID NO: 2)을 위한 방법을 제공한다. 생체내 실험을 위한 패키징된 파지미드 역가는 정제 이후에 ㎕ 당 1.5 x 1010 형질도입 단위 (tu/㎕)였다.
게놈에 β-락타마제 유전자를 보유하는 이. 콜라이 균주는 마우스 당 107 CFU로 7주령 10마리 암컷 마우스에게 경구로 투여되었다. 1.5 x 1012 tu (즉, 100 ㎕의 수크로스 바이카보네이트로 완충된, 100 ㎕)의 패키징된 파지미드 용량이 마우스에게 경구로 투여되었다 (T0). 분변 샘플은 이러한 투여 직전을 비롯하여, 이후 24시간 (T24h)에 수집되었다. 분변 균질물을 선택 배지 상에 플레이팅하였고, 개별 코로니는 편집 효율을 분석하기 위해서 카르베니실린 존재 또는 부재의 한천 플레이트 상에 추가로 재패치하였다 (마우스 당 및 시점 당 20개 콜로니). β-락타마제의 활성 부위 (K71E)의 편집은 카르베니실린 플레이트 상에서 박테리아 성장의 상실을 일으켰다. T24h에, 전체 개체군의 ∼75%가 평균적으로 염기-편집되었다 (도 14 참조).
실시예 14 - 시험관내 파지미드 형질도입 이후에 이. 콜라이 게놈 상에서 β-락타마제의 프라임 편집.
이 실시예는 DNA 페이로드로 형질도입 이후에 이. 콜라이 게놈 상에서 적색 형광 단백질 RFP를 코딩하는 핵산 서열 (SEQ ID NO: 2314)의 프라임 편집을 위한 방법을 제공한다. 페이로드 (SEQ ID NO: 2325)는 프라임 편집자 (PE), 유도성 프로모터 pBetI 하에 전사된 프라임 편집 가이드 RNA (pegRNA), 람다 패키징 서열, 클로람페니콜 내성 마커, 및 p15A 복제 기원을 코딩한다. pegRNA는 박테리아 게놈 상에서 RFP의 아미노산 E16 (GAA)을 중지 코돈 (TAA)으로 치환하기 위해서 역전사효소 서열 및 프라이머 결합 부위를 함유하는 연장된 단일 가이드 RNA로 이루어진다.
프라임 편집자는 표적 유전자 RFP의 위치 E16에서 중지 코돈을 삽입시키도록 조작되어서 적색 형광의 상실을 일으켰다.
이. 콜라이 MG1655로 전달을 위해 A8 gpJ 단백질 및 p2 STF 단백질을 포함하는 패키징된 파지미드의 생산은 ㎕ 당 2.6 Х 107 형질도입 단위 (tu/㎕)의 역가를 생성시켰다.
콜로니의 형광도는 클로람페니콜 및 10 mM 콜린 클로라이드 상에서 밤샘 선택 및 클로람페니콜 플레이트 상에 재패치 이후 유세포측정으로 분석하였다. 게놈 RFP는 비-형과 콜로니로부터 증폭되었고, 최종 PCR 단편을 시퀀싱하였고 편집 효율을 계산하였다. 중지 코돈은 이들 개별 콜로니 중 하나에 존재하여서 파지미드 형질도입 후 성공적인 프라임 편집을 확인하였다.
실시예 15 - 파킨슨병을 앓는 대사체의 치료 시 L-DOPA 불활성화 예방을 위해 티로신 데카르복실라제를 발현하는 이. 패칼리스 (
E. faecalis
), 이. 패시움 (
E. faecium
), 및/또는 엘. 브레비스 (
L. brevis
)의 편집.
최근 몇년 간, 장 미생물 유기체의 일부인 미생물 데카르복실라제는 L-DOPA (레보도파)를 물질대사할 수 있는 것으로 보인다고 확인되었다. 티로신 데카르복실라제 (tyrDC)에 의한 신규 박테리아 L-DOPA 물질대사는 엔테로코쿠스 패칼리스 (Enterococcus faecalis) (Maini Rekdal et al. Science 2019;364)를 비롯하여, 이. 패시움 및 엘. 브레비스에 의해 우성적으로 구동되는 것으로 확인되었다. 이. 패칼리스, 이. 패시움 및/또는 엘. 브레비스에서 이들 tyrDC의 돌연변이는 이러한 박테리아의 L-DOPA에서 도파민으로의 물질대사를 차단할 수 있어서, 약물 효율을 개선시킬 수 있다.
상기 티로신 데카르복실라제를 코딩하는 유전자 서열의 원위치 유전자 변형에 의한 엔테로코쿠스 패칼리스, 이. 패시움 및/또는 엘. 브레비스의 기능성 티로신 데카르복실라제의 발현을 방지하기 위한 방법이 하기에 기술된다.
파지미드는 파지 패키징 부위, 유전자 변형을 유도하기 위해 디아미나제 도메인에 융합된 dCas9 또는 nCas9를 함유하는 염기 편집자 효소 또는 유전자 변형을 유도하기 위해 역전사효소 도메인에 융합된 dCas9 또는 nCas9를 함유하는 프라임 편집자 효소, 및 티로신 데카르복실라제의 촉매 부위를 표적화하는 전사된 가이드RNA를 함유하는 것이 생성된다. 가이드RNA는 상기 효소의 촉매 부위에 중지 코돈을 도입시켜서, 불활성이게 만들도록 디자인된다.
패키징된 파지미드는 표준 열 유도 프로토콜에 따라 생산된다26.
파지미드는 박테테리아 개체군과 접촉하여 적어도 하나의 돌연변이를 생성시켜 티로신 데카르복실라제의 촉매 부위에 중지 코돈을 생성시킨다.
이러한 패키징된 파지미드와 조합하여 L-DOPA로 파킨슨병을 앓는 환자의 치료는 L-DOPA의 더 나은 효율을 초래한다.
실시예 16 - 파킨슨병을 앓는 대상체의 치료 시 L-DOPA 탈아미노화를 예방하기 위해 DHPAA 신타제를 발현하는 클로스트리듐 스포로게네스 (
Clostridium sporogenes
)의 편집.
레보도파는 소장에서 흡수되지만, 흡수되지 않은 "잔류" L-도파민의 9-10%는 장에서 더욱 대사분해된다 (이러한 백분율은 연령 및 투여된 약물 용량에 따라 증가됨). 이러한 반응으로 생성된 대사산물 - DHPPA-은 장 운동성 및 변비에 영향을 미친다. 이러한 탈아미노화는 DHPAA 신타제를 발현하는 클로스트리듐 스포로게네스에 의해 매개될 수 있다. 변비는 알려진 레보도파의 부작용이고, 이러한 탈아미노화의 억제제는 유리할 수 있다.
상기 DHPAA 신타제를 코딩하는 유전자 서열의 원위치 유전자 변형에 의해 씨. 스포로게네스 (C. sporogenes)의 기능성 DHPAA 신타제의 발현을 방지하기 위한 방법이 하기에 기술된다.
파지미드는 파지 패키징 부위, 유전자 변형을 유도하기 위해 디아미나제 도메인에 융합된 dCas9 또는 nCas9를 함유하는 염기 편집자 효소, 또는 유전자 변형을 유도하기 위해 역전사효소 도메인에 융합된 dCas9 또는 nCas9를 함유하는 프라임 편집자 효소, 및 DHPAA 신타제의 촉매 부위를 표적화하는 전사된 가이드RNA를 함유하는 것이 생성된다. 가이드RNA는 상기 효소의 촉매 부위에 중지 코돈을 도입시켜서, 이를 불활성으로 만들게 디자인된다.
패키징된 파지미드는 표준 열 유도 프로토콜에 따라 생산된다26.
파지미드는 박테리아 개체군과 접촉하여 적어도 하나의 돌연변이를 생성시켜 촉매 부위 DHPAA 신타제에 중지 코돈을 생성시킨다.
이러한 패키징된 파지비드와 조합하여 L-DOPA로 파킨슨병을 앓는 환자의 치료는 감소된 부작용, 특히 감소된 변비를 초래한다.
표 1: 후보 모방 펩티드를 보유하는 장내 박테리아 종, 관련 모방 펩티드의 아미노산 서열, 및 각각의 모방 펩티드를 함유하는 박테리아 및 인간 단백질의 Uniprot ID
표 2: 약물-물질대사 유전자 생산물을 코딩하는 핵산 서열 ([Zimmermann et al. (2019) Nature 570(7762): 462-467]에 개시된 바와 같이, 언급된 박테리아 종에서 열거된 contig의 출발 뉴클레오티드 및 종료 뉴클레오티드로 확인).
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targeting mCherry
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cgcaggataa gtaaggggag taagtgatcg aacgaatcag aagtgacaat atacttaggc 60
tggatctcgt cccgtgaatc ccaaccctca ccaactacga gataagaggt aagccaaaaa 120
tcgacttggt ggcgaccaac gactgttccc cccctgtaac taatcgttcc gtcaaaacct 180
gacttacttc aaggccaatt ccaagcgcaa acaataccgt cctagttctt cggttaagtt 240
tccgaagtag gagtgagcct acctccgttt gcgtcttgtt accactgacc cagctattta 300
ctttgtattg cctgcaatcg aatttctgaa ctctcagata gtggggataa cgggaaagtt 360
cctatatttg cgaactaact tagccgtcca cctcgaagct acctactcac acccaccccg 420
cgcggggtaa ataaggcact aatcccagct gagagctggc gtagcactta gccacaagtt 480
aattaacagt tgtctggtag tttggcggta ttaggaagat cctagaagca aggcagagtt 540
agttctaacc taaagccaca aataagacag gttgccaaag cccgccggaa attaaatctt 600
gctcagttcg gtaacggagt ttccctcccg cgtacttaat tcccaataag aaacgcgccc 660
aagtcctatc aggcaaaatt cagccccttc ccgtgttaga acgagggtaa aaatacaagc 720
cgattgaaca agggttgggg gcttcaaatc gtcgtttacc ccactttaca acggagatta 780
agtagttcac cctatagtac gaagcagaac tatttcgagg ggcgtgcaat aatcgaatct 840
tctgcggttg acttaacacg ctagggacgt gccctcgatt caatcgaagg tactcctact 900
cagactgcct cacacccagc tagtcactga gcgataaaat tgacccgccc tctagggaag 960
cgagtacgtc ccaaagggct ccggacaggg ctatatagga gagtttgatc tcgccccgac 1020
aactgcaacc ctcaactccc ttagataata ttgttagccg aagttgcacg acccgccgtc 1080
cacggactgc tcttagggtg tggctcctta atctgacaac gtgcaacccc tatcgaagtc 1140
gattgtttct gcgaaaggtg ttgtcctaat agtcccgaaa tttggccctt gtaggtgtga 1200
aaccacttag cttcgcgccg tagtcctaaa ggcccaccta ttgactttgt ttcgggtagc 1260
actaggaatc ttaacaattt gaatttggac gtggaacgcg tacaccttaa tctccgaata 1320
attctaggga tttggaagtc ctctacgttg acacacctac actgctcgaa gtaaatatac 1380
gaataacgcg ggcctcgcgg agccgttccg aatcgtcacg tgttcgttta ctgttaattg 1440
gtggcaaata agcaatatcg tagtccgtca ggcccagccc tgttatccac ggcgttattt 1500
gtcaaattgc gtagaactgg attgactgcc tgacaatacc taattatcgg tacgaagtcc 1560
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atttatccac gctcccgtct ttgggacgaa taccgctaca agtggacaga ggatcggtac 1680
gggcctctaa taaatccaac actctacgcc ctcttcaaga gctagaagaa cagggtgcag 1740
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acgattggaa gtaggaatag tttctaacca cggttactaa tcctaataac ggaacgctgt 1860
ctgatagatt agtgtcagcg ctcggtacca aagaaaaata aaaagacgct gaaaagcgtc 1920
tttttatttt tcggtccagt gtaactcagg caaaagcacg taatattcgt actttcttcc 1980
tccgtaagcg tcacccacat tccttaaaga gtgcatgtgc atattttgtt atcaataaaa 2040
aaggccgcga tttgcggcct tattgttcgt cttgccggat tacgccccgc cctgccactc 2100
atcgcagtat tgttgtaatt cattaagcat tctgccgaca tggaagccat cacaaacggc 2160
atgatgaact tggatcgcca gtggcattaa caccttgtcg ccttgcgtat aatattttcc 2220
catagtgaaa acgggggcga agaagttgtc catatttgct acgtttaaat caaaactggt 2280
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gaaatcgtcg tggtattctg accagagcga tgaaaacgtt tcagtttgct catggaaaac 2460
ggtgtaacaa gggtgaacac tatcccatat caccagctca ccgtctttca ttgccatacg 2520
aaactccgga tgtgcattca tcaggcgggc aagaatgtga ataaaggccg gataaaactt 2580
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ataggtgcac tgagcaactg actggaatgc ctcaaaatgt tctttacgat gccattgact 2700
tatatcaact gtagtatatc cagtgatttt tttctccatt ttagcttcct tagcttgcga 2760
aatctcgata actcaaaaaa tagtagtgat cttatttcat tatggtgaaa gttgtcttac 2820
gtgcaacatt ttcgcaaaaa gttggcgctt tatcaacact gtcggaatga caaatggttc 2880
caattattga acacccttcg gggtgttttt ttgtttctgg tttcccgagg ccggcctgcg 2940
ctagcggagt gtatactggc ttactatgtt ggcactgatg agggtgtaag tgaagtgctt 3000
catgtggcag gagaaaaaag gctgcatcgg tgcgtcagca gaatatgtga tacaggatat 3060
attccgcttc ctcgctcact gactcgctac gctcggtcgt tcgactgtgg cgagcggaaa 3120
tggcttacga acggggcgga gatttcctgg aagatgccag gaagatactt aacagggaag 3180
tgagagggtc gcggcaaagc cgtttttcca taggctccgc ccccctgaca agcatcacga 3240
aatctgacgc tcaaatcagt ggtggcgaaa cctgacagga ctataaagat accaggcgtt 3300
tccccctggc ggctccctcg tgcgctctcc tgttcctgcc tttcggtttg ccggtgtcat 3360
tcctctgtta cggccgagtt tgtctcattc cacgcctgac actcagttcc gggtaggcag 3420
ttcgctccaa gctggactgt atgcacgaac cccccgttca gtccgaccgc tgcgccttat 3480
ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg aaagacatgc aaaagcacca ctggcagcag 3540
ccactggtaa ttgatttaga ggagttagtc ttgaagtcat gcgccggata aggctaaact 3600
gaaaggacaa gttttggcga ctgcgctcct ccaagccagt tacctcggtt caaagagttg 3660
gtagctcaga gaaccttcga aaaaccgccc tgcaaggcgg ttttttcgtt ttcagagcaa 3720
gagattacgc gcagaccaaa acgatctcaa gaagatcatc ttattaatca gataaaatat 3780
ttctagattt cagtgcaatt tatctcttca aatgtagcac cggcgcgccg tgaccaatta 3840
ttgaaggccg ctaacgcggc ctttttttgt ttctggtatc ccgaatggag cgacttctcc 3900
ccaaaaagcc tcgctttcag cacctgtcgt ttcctttctt ttcagagggt attttaaata 3960
aaaacattaa gttatgacga agaagaacgg aaacgcctta aaccggaaaa ttttcataaa 4020
tagcgaaaac ccgcgaggtc gccgccccgt aacctgtcgg atcaccggaa aggacccgta 4080
aagtgataat gattatcatc tacatatcac aacgtgcgta aagggtaagt atgaaggtcg 4140
tgtactccat cgctaccaaa ttccagaaaa cagacgcttt cgagcgtctt ttttcgtttt 4200
ggtcacgacg tacggtggaa gattcgttac caattgacag ctagctcagt cctaggtata 4260
tacatacatg cttgtttgtt tgtaaactac tagaagagcg attgggctct tcaatgaagc 4320
gtaccgccga tggcagcgag tttgaatctc cgaagaaaaa gcgtaaggtc agcgaagttg 4380
agttcagcca cgaatactgg atgcgtcacg ctttaaccct ggctaaacgc gcgcgcgacg 4440
agcgcgaagt accagtgggg gcggtgctgg tgttaaacaa ccgcgtaatc ggcgaaggct 4500
ggaaccgtgc aatcgggtta catgacccga ccgcccatgc cgagatcatg gccctgcgcc 4560
agggggggct ggtcatgcag aattaccgtc tgatcgacgc gacgttgtat gtcacattcg 4620
agccatgcgt gatgtgtgcg ggggcaatga ttcactctcg cattggtcgc gtcgtgtttg 4680
gcgttcgtaa tagtaaacgc ggcgctgctg gctccttaat gaatgttctg aattatccgg 4740
gtatgaacca ccgtgtcgaa attacagaag gtatcttagc agatgaatgt gccgcactgc 4800
tgtgtgactt ctaccgcatg ccgcgccaag tattcaacgc ccaaaaaaaa gctcagtcct 4860
caattaactc tggtggtagt agtggcggct ctagcggctc cgagacgcct ggtacgtcgg 4920
aatcggctac gcctgagtcg agcggtgggt cctctggcgg ctctgacaag aaatatagca 4980
tcggcctggc catcggcaca aatagcgtcg gatgggcggt gatcactgat gaatataaag 5040
ttccgtctaa aaagttcaag gtactgggta atacagatcg ccatagtatc aaaaagaact 5100
taatcggtgc gcttctgttc gattccggcg aaaccgcaga agcaacacgt ctgaaacgca 5160
ccgctcgtcg ccgttacacc cgtcgtaaaa accgcatctg ctacctgcaa gaaatcttct 5220
ctaacgaaat ggctaaagta gatgacagct tttttcaccg tctggaagaa tcatttctgg 5280
tggaagaaga taaaaagcac gaacgtcatc caatcttcgg caacattgtg gacgaagtag 5340
cgtatcacga aaaatacccg actatctatc acctgcgcaa aaagctggtc gattcgacgg 5400
ataaggccga tctgcgtctg atctatctgg ccttagcgca tatgattaag ttccgtggtc 5460
atttcctgat cgaaggcgac ctgaatccag acaacagcga tgtagacaaa ctgttcatcc 5520
agctggtgca aacctataac cagctgtttg aagaaaaccc aattaatgct agcggtgttg 5580
acgcgaaagc gatcttgtcc gcacgcctgt ccaaatcccg tcgtctggaa aacttaattg 5640
cgcaactgcc gggtgagaag aaaaacggac tgttcggcaa tctgatcgct cttagcttgg 5700
gactgacccc gaacttcaaa agcaacttcg atctggcaga ggacgcaaaa cttcaactta 5760
gcaaagatac gtatgacgat gacttggata acttactggc ccagatcgga gatcagtacg 5820
ctgatctgtt tctggcggca aagaacttat cagacgctat tctcctgtct gatattcttc 5880
gtgtgaatac cgaaatcacc aaagcaccgc tttctgcatc catgattaaa cgctatgacg 5940
aacatcacca agatctgact cttctgaaag cgctggtacg gcaacaactg ccggagaagt 6000
acaaggagat cttctttgac caatccaaaa acggctacgc gggttatatt gacgggggtg 6060
caagccaaga ggagttctac aaattcatca agccaatctt agaaaaaatg gatggcacgg 6120
aagaattact tgttaaactg aatcgtgagg atctgcttcg taaacagcgt accttcgaca 6180
acggtagcat tccgcaccag atccacttag gtgaactgca cgctatcctg cgtcgccaag 6240
aggattttta cccgttcctg aaagataatc gtgaaaaaat cgaaaaaatc ctgacctttc 6300
gtatcccgta ttatgtcggc ccgctggcgc gtggcaactc ccgtttcgcg tggatgactc 6360
gcaaatccga agaaactatt accccgtgga acttcgagga agtggttgac aaaggcgcaa 6420
gcgcccaatc cttcatcgag cgcatgacta actttgataa aaacctgccg aacgaaaagg 6480
tactgccgaa acactccctt ctgtacgaat acttcaccgt gtacaacgag ctgactaaag 6540
taaagtatgt gactgagggc atgcgtaaac ctgcattcct gagcggtgaa cagaaaaaag 6600
caattgttga tttactgttt aaaaccaacc gtaaagtaac cgttaaacag ctgaaagagg 6660
actacttcaa gaaaatcgaa tgcttcgact ccgtcgagat tagtggagtt gaagatcgtt 6720
ttaatgcaag tttaggcacg tatcacgatt tattaaagat cattaaagac aaagatttct 6780
tggacaacga agaaaatgag gacatcttag aggacatcgt cctgaccctg actctgttcg 6840
aagatcgtga aatgattgaa gaacgcctta agacgtatgc tcacctgttt gacgataaag 6900
taatgaaaca actgaaacgt cgccgttata ctggctgggg ccgtctgagc cgtaaactga 6960
ttaacggtat ccgtgacaaa cagtccggta aaactattct ggacttcctg aaatctgacg 7020
gcttcgcaaa ccgtaacttc atgcaactga ttcacgacga ttccctgacc ttcaaagagg 7080
acatccagaa agctcaggtt tctggtcaag gtgattctct gcacgagcat atcgccaatt 7140
tagcaggtag tccggcgatc aaaaaaggta tcctgcaaac cgtgaaagtg gtggatgagc 7200
ttgtgaaagt tatgggtcgt cacaaaccgg aaaacattgt tatcgagatg gctcgtgaaa 7260
accaaacgac ccagaaggga cagaaaaact cccgcgaacg catgaaacgt atcgaggagg 7320
gtattaaaga acttggctct cagattctga aagaacaccc tgttgaaaat acccaactgc 7380
aaaatgaaaa actgtacctg tactacctgc aaaatggtcg tgacatgtat gtagatcagg 7440
agctggacat caaccgcctc tccgattacg acgttgacca cattgttccg cagtcttttc 7500
tgaaagatga ttccattgat aacaaagtac tcacccgtag cgataaaaac cgtgggaaga 7560
gtgacaacgt tccatcggaa gaagtagtta agaaaatgaa gaactattgg cgtcaactgc 7620
ttaacgcgaa actgattact caacgtaaat ttgataacct gaccaaagct gaacgtggcg 7680
gtttgtctga gctggataag gcgggtttta ttaaacgtca actggtagaa actcgccaga 7740
ttacaaaaca tgttgctcag attctggact ctcgtatgaa cactaaatac gatgaaaatg 7800
acaaactgat ccgcgaagtt aaggttatta ccctgaaatc taagctggtt tccgacttcc 7860
gtaaagattt ccaattctat aaagtgcgcg agattaacaa ctatcaccac gcgcacgacg 7920
catatctgaa tgcagttgtt ggcacggcac tgatcaaaaa atatccgaaa ctggaaagcg 7980
aatttgtgta cggcgattat aaagtttacg acgtgcgcaa aatgatcgcc aaatctgaac 8040
aggaaattgg caaagcaacc gctaaatact ttttctactc aaacattatg aatttcttca 8100
aaaccgaaat caccttagcg aatggcgaaa ttcgtaaacg ccctctgatc gaaaccaacg 8160
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tgtccatgcc tcaagtaaac atcgttaaaa agactgaggt acagactggc ggtttcagca 8280
aggaatccat tctgccgaaa cgcaactccg acaaactgat cgcgcgtaag aaagactggg 8340
atccgaagaa atacggtggc ttcgattctc caaccgtggc atacagcgtt ctggtagtcg 8400
ccaaagtcga aaagggtaaa tcaaaaaaac tgaaatcagt gaaagaactt ttaggcatca 8460
ccattatgga acgtagctct ttcgaaaaaa acccgattga cttcctcgaa gcgaaggggt 8520
acaaggaagt aaagaaagat ctgattatca aactgccgaa gtattccctg ttcgaactgg 8580
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acgagattat tgaacagatt tctgagttta gcaaacgcgt aattctggcg gacgcgaatc 8820
tggataaagt cctgagcgcc tacaataaac accgtgataa accgatccgt gaacaggcag 8880
aaaacatcat tcacctgttc acgctgacta atcttggtgc tccggcagcc ttcaaatact 8940
tcgacaccac gatcgatcgt aaacgttaca cctccactaa agaagtctta gatgcaactc 9000
ttattcacca gagcatcact ggcctgtatg aaactcgtat tgatctgagt cagttgggcg 9060
gtgactaatg tatgcttaag cagctcggta ccaaagacga acaataagac gctgaaaagc 9120
gtcttttttc gttttggtcc tgttgcggcg cgatagtgtg aacatgctat agacttctgg 9180
tgctacccga ctgacaatta atcatccggc tcgtataatg ctagccgtac ataaattgcg 9240
ggctcgtttt agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa 9300
aaagtggcac cgagtcggtg ctttttttaa tccattcgaa tcacgtccga cgaacaataa 9360
ggcctcccta acggggggcc ttttttattg ataacaaaag taacttcgag cttgtctacc 9420
tcctagcacc attattgcaa ttaataaaca actaacggac aattctacct aacagttttc 9480
atatatgacg agcagttaag tgatgagtaa aggtgaggaa ttatttactg gtgttgttcc 9540
gatcttagtt gaactggacg gcgatgttaa cggtcataaa ttcagtgttc gtggtgaagg 9600
tgaaggtgat gcaaccaacg gtaagctgac cctgaaattc atctgcacta ctggaaaatt 9660
accagtaccg tggcctactc tggtgactac cctgacctat ggtgttcagt gtttttctcg 9720
ttaccctgac cacatgaagc aacatgattt cttcaaatct gcaatgccgg aaggttatgt 9780
acaggagcgc accatttctt tcaaagacga tggcacgtat aaaacccgtg cagaggttaa 9840
atttgaaggt gacactctgg tgaatcgtat tgaactgaaa ggcattgatt tcaaagagga 9900
cggcaatatt ttaggccaca aactggaata taacttcaac tcccataacg tttacatcac 9960
cgcagacaaa cagaagaacg gtatcaaagc taacttcaaa attcgccata acgttgaaga 10020
tggtagcgta cagctggcgg atcattacca acagaacact ccgattggag atgctcctgt 10080
tttactgccg gataaccact acctgtccac ccagtctaaa ctgtcgaagg atccgaacga 10140
aaagcgcgac cacatggtgt tattagagtt cgttaccgct agtggtatca cgcacggtat 10200
ggatgaactc tacaaataag acgaacaata aggggagcgg gaaaccgctc ccctttttta 10260
ttgataacaa aagtaaattg cacgctgata gtctcccaat tgcgaaggac caaaacgaaa 10320
aaacaccctt tcgggtgtct tttctggaat ttggtaccga gtactaggta tcgtgtaagt 10380
agcgaaggcc cgtacgcgag ataaactgct aggcaaccgc gactctacga ctggtgctcg 10440
atttaatttc gctgacgtaa agaaattatc ggcagtgcgt caactgccgt atctttatct 10500
taattaggta gttggacaag cccttgaaag aaatagcaag agcctgcctc tctattgaag 10560
tcacggcgaa agtcgggtag aaatcaaaga aagcagaaat taaatcggag taacactaag 10620
gtgggataac tccgtaactg actacgcctt tctctagact ttacttgacc agatacactg 10680
tctttgacac gttgaaggat tagagcaatc aaatccaaga ctggctaagc acgaagcaac 10740
tcttgagtgt taaaaagtta tctcctgtat tcgggaagcg ggtactagaa gattgcaggg 10800
actccgacgt taagtaaatt acaaagtaat aagtatcgtt caggatcacg ttaccgcaat 10860
aagaagcgag aataatataa tttccgaagt gcttacccca gtagtgacta ttcctataac 10920
ccttctgagt gtccggaggc ggaaatttgc cacgaaagag aaagtatttc cccgacaata 10980
ataaaggggc gctcctcagc ttttccactt ggttgggtaa gctaggcaac tctgaaagga 11040
gtttcggcga attgaagccg acagctttga attgttttag gggcgttatt cgagggcaat 11100
cggagctaac ttcaagacta cttctttgtt gaatactaaa tagtgcaaag gtcgtgtttc 11160
ctcaaggata ctccgctaac aatataggat tccaatcaga ttcagcactg gcggtacggg 11220
tgttgcggtg aggcgttcgg gtttacggct cgaagctagc acggtagg 11268
<210> 2
<211> 11257
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Payload encoding Adenine base editor (ABE8e) and guideRNA
targeting beta-lactamase
<400> 2
cgcaggataa gtaaggggag taagtgatcg aacgaatcag aagtgacaat atacttaggc 60
tggatctcgt cccgtgaatc ccaaccctca ccaactacga gataagaggt aagccaaaaa 120
tcgacttggt ggcgaccaac gactgttccc cccctgtaac taatcgttcc gtcaaaacct 180
gacttacttc aaggccaatt ccaagcgcaa acaataccgt cctagttctt cggttaagtt 240
tccgaagtag gagtgagcct acctccgttt gcgtcttgtt accactgacc cagctattta 300
ctttgtattg cctgcaatcg aatttctgaa ctctcagata gtggggataa cgggaaagtt 360
cctatatttg cgaactaact tagccgtcca cctcgaagct acctactcac acccaccccg 420
cgcggggtaa ataaggcact aatcccagct gagagctggc gtagcactta gccacaagtt 480
aattaacagt tgtctggtag tttggcggta ttaggaagat cctagaagca aggcagagtt 540
agttctaacc taaagccaca aataagacag gttgccaaag cccgccggaa attaaatctt 600
gctcagttcg gtaacggagt ttccctcccg cgtacttaat tcccaataag aaacgcgccc 660
aagtcctatc aggcaaaatt cagccccttc ccgtgttaga acgagggtaa aaatacaagc 720
cgattgaaca agggttgggg gcttcaaatc gtcgtttacc ccactttaca acggagatta 780
agtagttcac cctatagtac gaagcagaac tatttcgagg ggcgtgcaat aatcgaatct 840
tctgcggttg acttaacacg ctagggacgt gccctcgatt caatcgaagg tactcctact 900
cagactgcct cacacccagc tagtcactga gcgataaaat tgacccgccc tctagggaag 960
cgagtacgtc ccaaagggct ccggacaggg ctatatagga gagtttgatc tcgccccgac 1020
aactgcaacc ctcaactccc ttagataata ttgttagccg aagttgcacg acccgccgtc 1080
cacggactgc tcttagggtg tggctcctta atctgacaac gtgcaacccc tatcgaagtc 1140
gattgtttct gcgaaaggtg ttgtcctaat agtcccgaaa tttggccctt gtaggtgtga 1200
aaccacttag cttcgcgccg tagtcctaaa ggcccaccta ttgactttgt ttcgggtagc 1260
actaggaatc ttaacaattt gaatttggac gtggaacgcg tacaccttaa tctccgaata 1320
attctaggga tttggaagtc ctctacgttg acacacctac actgctcgaa gtaaatatac 1380
gaataacgcg ggcctcgcgg agccgttccg aatcgtcacg tgttcgttta ctgttaattg 1440
gtggcaaata agcaatatcg tagtccgtca ggcccagccc tgttatccac ggcgttattt 1500
gtcaaattgc gtagaactgg attgactgcc tgacaatacc taattatcgg tacgaagtcc 1560
ccgaatctgt cgggctattt cactaatact ttccaaacgc cccgtatcca agaagaacga 1620
atttatccac gctcccgtct ttgggacgaa taccgctaca agtggacaga ggatcggtac 1680
gggcctctaa taaatccaac actctacgcc ctcttcaaga gctagaagaa cagggtgcag 1740
ttggaaaggg aattatttcg taaggcgagc caataccgta attaattcgg aagagttaac 1800
acgattggaa gtaggaatag tttctaacca cggttactaa tcctaataac ggaacgctgt 1860
ctgatagatt agtgtcagcg ctcggtacca aagaaaaata aaaagacgct gaaaagcgtc 1920
tttttatttt tcggtccagt gtaactcagg caaaagcacg taatattcgt actttcttcc 1980
tccgtaagcg tcacccacat tccttaaaga gtgcatgtgc atattttgtt atcaataaaa 2040
aaggccgcga tttgcggcct tattgttcgt cttgccggat tacgccccgc cctgccactc 2100
atcgcagtat tgttgtaatt cattaagcat tctgccgaca tggaagccat cacaaacggc 2160
atgatgaact tggatcgcca gtggcattaa caccttgtcg ccttgcgtat aatattttcc 2220
catagtgaaa acgggggcga agaagttgtc catatttgct acgtttaaat caaaactggt 2280
gaaactcacc cacggattgg cactgacgaa aaacatattt tcgataaacc ctttagggaa 2340
atatgctaag ttttcaccgt aacacgccac atcttgacta tatatgtgta gaaactgccg 2400
gaaatcgtcg tggtattctg accagagcga tgaaaacgtt tcagtttgct catggaaaac 2460
ggtgtaacaa gggtgaacac tatcccatat caccagctca ccgtctttca ttgccatacg 2520
aaactccgga tgtgcattca tcaggcgggc aagaatgtga ataaaggccg gataaaactt 2580
gtgcttattt ttctttacgg tttttaaaaa ggccgtaata tccagctgaa cggtttggtt 2640
ataggtgcac tgagcaactg actggaatgc ctcaaaatgt tctttacgat gccattgact 2700
tatatcaact gtagtatatc cagtgatttt tttctccatt ttagcttcct tagcttgcga 2760
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caattattga acacccttcg gggtgttttt ttgtttctgg tttcccgagg ccggcctgcg 2940
ctagcggagt gtatactggc ttactatgtt ggcactgatg agggtgtaag tgaagtgctt 3000
catgtggcag gagaaaaaag gctgcatcgg tgcgtcagca gaatatgtga tacaggatat 3060
attccgcttc ctcgctcact gactcgctac gctcggtcgt tcgactgtgg cgagcggaaa 3120
tggcttacga acggggcgga gatttcctgg aagatgccag gaagatactt aacagggaag 3180
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aatctgacgc tcaaatcagt ggtggcgaaa cctgacagga ctataaagat accaggcgtt 3300
tccccctggc ggctccctcg tgcgctctcc tgttcctgcc tttcggtttg ccggtgtcat 3360
tcctctgtta cggccgagtt tgtctcattc cacgcctgac actcagttcc gggtaggcag 3420
ttcgctccaa gctggactgt atgcacgaac cccccgttca gtccgaccgc tgcgccttat 3480
ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg aaagacatgc aaaagcacca ctggcagcag 3540
ccactggtaa ttgatttaga ggagttagtc ttgaagtcat gcgccggata aggctaaact 3600
gaaaggacaa gttttggcga ctgcgctcct ccaagccagt tacctcggtt caaagagttg 3660
gtagctcaga gaaccttcga aaaaccgccc tgcaaggcgg ttttttcgtt ttcagagcaa 3720
gagattacgc gcagaccaaa acgatctcaa gaagatcatc ttattaatca gataaaatat 3780
ttctagattt cagtgcaatt tatctcttca aatgtagcac cggcgcgccg tgaccaatta 3840
ttgaaggccg ctaacgcggc ctttttttgt ttctggtatc ccgaatggag cgacttctcc 3900
ccaaaaagcc tcgctttcag cacctgtcgt ttcctttctt ttcagagggt attttaaata 3960
aaaacattaa gttatgacga agaagaacgg aaacgcctta aaccggaaaa ttttcataaa 4020
tagcgaaaac ccgcgaggtc gccgccccgt aacctgtcgg atcaccggaa aggacccgta 4080
aagtgataat gattatcatc tacatatcac aacgtgcgta aagggtaagt atgaaggtcg 4140
tgtactccat cgctaccaaa ttccagaaaa cagacgcttt cgagcgtctt ttttcgtttt 4200
ggtcacgacg tacggtggaa gattcgttac caattgacag ctagctcagt cctaggtata 4260
tacatacatg cttgtttgtt tgtaaacgga tagaaatggg agatgaagcg taccgccgat 4320
ggcagcgagt ttgaatctcc gaagaaaaag cgtaaggtca gcgaagttga gttcagccac 4380
gaatactgga tgcgtcacgc tttaaccctg gctaaacgcg cgcgcgacga gcgcgaagta 4440
ccagtggggg cggtgctggt gttaaacaac cgcgtaatcg gcgaaggctg gaaccgtgca 4500
atcgggttac atgacccgac cgcccatgcc gagatcatgg ccctgcgcca gggggggctg 4560
gtcatgcaga attaccgtct gatcgacgcg acgttgtatg tcacattcga gccatgcgtg 4620
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agtaaacgcg gcgctgctgg ctccttaatg aatgttctga attatccggg tatgaaccac 4740
cgtgtcgaaa ttacagaagg tatcttagca gatgaatgtg ccgcactgct gtgtgacttc 4800
taccgcatgc cgcgccaagt attcaacgcc caaaaaaaag ctcagtcctc aattaactct 4860
ggtggtagta gtggcggctc tagcggctcc gagacgcctg gtacgtcgga atcggctacg 4920
cctgagtcga gcggtgggtc ctctggcggc tctgacaaga aatatagcat cggcctggcc 4980
atcggcacaa atagcgtcgg atgggcggtg atcactgatg aatataaagt tccgtctaaa 5040
aagttcaagg tactgggtaa tacagatcgc catagtatca aaaagaactt aatcggtgcg 5100
cttctgttcg attccggcga aaccgcagaa gcaacacgtc tgaaacgcac cgctcgtcgc 5160
cgttacaccc gtcgtaaaaa ccgcatctgc tacctgcaag aaatcttctc taacgaaatg 5220
gctaaagtag atgacagctt ttttcaccgt ctggaagaat catttctggt ggaagaagat 5280
aaaaagcacg aacgtcatcc aatcttcggc aacattgtgg acgaagtagc gtatcacgaa 5340
aaatacccga ctatctatca cctgcgcaaa aagctggtcg attcgacgga taaggccgat 5400
ctgcgtctga tctatctggc cttagcgcat atgattaagt tccgtggtca tttcctgatc 5460
gaaggcgacc tgaatccaga caacagcgat gtagacaaac tgttcatcca gctggtgcaa 5520
acctataacc agctgtttga agaaaaccca attaatgcta gcggtgttga cgcgaaagcg 5580
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ggtgagaaga aaaacggact gttcggcaat ctgatcgctc ttagcttggg actgaccccg 5700
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ctggcggcaa agaacttatc agacgctatt ctcctgtctg atattcttcg tgtgaatacc 5880
gaaatcacca aagcaccgct ttctgcatcc atgattaaac gctatgacga acatcaccaa 5940
gatctgactc ttctgaaagc gctggtacgg caacaactgc cggagaagta caaggagatc 6000
ttctttgacc aatccaaaaa cggctacgcg ggttatattg acgggggtgc aagccaagag 6060
gagttctaca aattcatcaa gccaatctta gaaaaaatgg atggcacgga agaattactt 6120
gttaaactga atcgtgagga tctgcttcgt aaacagcgta ccttcgacaa cggtagcatt 6180
ccgcaccaga tccacttagg tgaactgcac gctatcctgc gtcgccaaga ggatttttac 6240
ccgttcctga aagataatcg tgaaaaaatc gaaaaaatcc tgacctttcg tatcccgtat 6300
tatgtcggcc cgctggcgcg tggcaactcc cgtttcgcgt ggatgactcg caaatccgaa 6360
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<213> Artificial Sequence
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<223> Payload encoding Cytosine base editor (evoAPOBEC1-nCas9-UGI) and
guideRNA targeting mCherry
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caactcttat tcaccagagc atcactggcc tgtatgaaac tcgtattgat ctgagtcagt 9240
tgggcggtga cagtgggggc agcggaggta gcggaggcag cactaatttg tcggatatta 9300
ttgagaagga aacaggaaag caattggtta tccaggaatc cattttaatg cttccggaag 9360
aagtggaaga ggtgatcgga aataagccag agagcgatat cttagttcat acggcctatg 9420
atgaaagcac tgacgagaac gttatgctgt taacatcgga cgctcccgag tacaagccgt 9480
gggccctggt tatccaggac agtaatggcg aaaataaaat taaaatgtta taatgtatgc 9540
ttaagcagct cggtaccaaa gacgaacaat aagacgctga aaagcgtctt ttttcgtttt 9600
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cggtgctttt tttaatccat tcgaatcacg tccgacgaac aataaggcct ccctaacggg 9840
gggccttttt tattgataac aaaagtaact tcgagcttgt ctacctccta gcaccattat 9900
tgcaattaat aaacaactaa cggacaattc tacctaacag ttttcatata tgacgagcag 9960
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caacggtaag ctgaccctga aattcatctg cactactgga aaattaccag taccgtggcc 10140
tactctggtg actaccctga cctatggtgt tcagtgtttt tctcgttacc ctgaccacat 10200
gaagcaacat gatttcttca aatctgcaat gccggaaggt tatgtacagg agcgcaccat 10260
ttctttcaaa gacgatggca cgtataaaac ccgtgcagag gttaaatttg aaggtgacac 10320
tctggtgaat cgtattgaac tgaaaggcat tgatttcaaa gaggacggca atattttagg 10380
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gaacggtatc aaagctaact tcaaaattcg ccataacgtt gaagatggta gcgtacagct 10500
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aattgcacgc tgatagtctc ccaattgcga aggaccaaaa cgaaaaaaca ccctttcggg 10800
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gcgagataaa ctgctaggca accgcgactc tacgactggt gctcgattta atttcgctga 10920
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ggtagaaatc aaagaaagca gaaattaaat cggagtaaca ctaaggtggg ataactccgt 11100
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aggattagag caatcaaatc caagactggc taagcacgaa gcaactcttg agtgttaaaa 11220
agttatctcc tgtattcggg aagcgggtac tagaagattg cagggactcc gacgttaagt 11280
aaattacaaa gtaataagta tcgttcagga tcacgttacc gcaataagaa gcgagaataa 11340
tataatttcc gaagtgctta ccccagtagt gactattcct ataacccttc tgagtgtccg 11400
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tcagcttttc cacttggttg ggtaagctag gcaactctga aaggagtttc ggcgaattga 11520
agccgacagc tttgaattgt tttaggggcg ttattcgagg gcaatcggag ctaacttcaa 11580
gactacttct ttgttgaata ctaaatagtg caaaggtcgt gtttcctcaa ggatactccg 11640
ctaacaatat aggattccaa tcagattcag cactggcggt acgggtgttg cggtgaggcg 11700
ttcgggttta cggctcgaag ctagcacggt agg 11733
<210> 4
<211> 11731
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Payload encoding Cytosine base editor (evoAPOBEC1-nCas9-UGI) and
guideRNA targeting beta-lactamase
<400> 4
cgcaggataa gtaaggggag taagtgatcg aacgaatcag aagtgacaat atacttaggc 60
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gacttacttc aaggccaatt ccaagcgcaa acaataccgt cctagttctt cggttaagtt 240
tccgaagtag gagtgagcct acctccgttt gcgtcttgtt accactgacc cagctattta 300
ctttgtattg cctgcaatcg aatttctgaa ctctcagata gtggggataa cgggaaagtt 360
cctatatttg cgaactaact tagccgtcca cctcgaagct acctactcac acccaccccg 420
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gctcagttcg gtaacggagt ttccctcccg cgtacttaat tcccaataag aaacgcgccc 660
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agtagttcac cctatagtac gaagcagaac tatttcgagg ggcgtgcaat aatcgaatct 840
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catgtggcag gagaaaaaag gctgcatcgg tgcgtcagca gaatatgtga tacaggatat 3060
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gagattacgc gcagaccaaa acgatctcaa gaagatcatc ttattaatca gataaaatat 3780
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tagcgaaaac ccgcgaggtc gccgccccgt aacctgtcgg atcaccggaa aggacccgta 4080
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gttgacgcga aagcgatctt gtccgcacgc ctgtccaaat cccgtcgtct ggaaaactta 5820
attgcgcaac tgccgggtga gaagaaaaac ggactgttcg gcaatctgat cgctcttagc 5880
ttgggactga ccccgaactt caaaagcaac ttcgatctgg cagaggacgc aaaacttcaa 5940
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cttcgtgtga ataccgaaat caccaaagca ccgctttctg catccatgat taaacgctat 6120
gacgaacatc accaagatct gactcttctg aaagcgctgg tacggcaaca actgccggag 6180
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ggtgcaagcc aagaggagtt ctacaaattc atcaagccaa tcttagaaaa aatggatggc 6300
acggaagaat tacttgttaa actgaatcgt gaggatctgc ttcgtaaaca gcgtaccttc 6360
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caggagctgg acatcaaccg cctctccgat tacgacgttg accacattgt tccgcagtct 7680
tttctgaaag atgattccat tgataacaaa gtactcaccc gtagcgataa aaaccgtggg 7740
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ctgcttaacg cgaaactgat tactcaacgt aaatttgata acctgaccaa agctgaacgt 7860
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tacttcgaca ccacgatcga tcgtaaacgt tacacctcca ctaaagaagt cttagatgca 9180
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attacaaagt aataagtatc gttcaggatc acgttaccgc aataagaagc gagaataata 11340
taatttccga agtgcttacc ccagtagtga ctattcctat aacccttctg agtgtccgga 11400
ggcggaaatt tgccacgaaa gagaaagtat ttccccgaca ataataaagg ggcgctcctc 11460
agcttttcca cttggttggg taagctaggc aactctgaaa ggagtttcgg cgaattgaag 11520
ccgacagctt tgaattgttt taggggcgtt attcgagggc aatcggagct aacttcaaga 11580
ctacttcttt gttgaatact aaatagtgca aaggtcgtgt ttcctcaagg atactccgct 11640
aacaatatag gattccaatc agattcagca ctggcggtac gggtgttgcg gtgaggcgtt 11700
cgggtttacg gctcgaagct agcacggtag g 11731
<210> 5
<211> 711
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mCherry gene
<400> 5
atggtttcca agggcgagga ggataacatg gctatcatta aagagttcat gcgcttcaaa 60
gttcacatgg agggttctgt taacggtcac gagttcgaga tcgaaggcga aggcgagggc 120
cgtccgtatg aaggcaccca gaccgccaaa ctgaaagtga ctaaaggcgg cccgctgcct 180
tttgcgtggg acatcctgag cccgcaattt atgtacggtt ctaaagctta tgttaaacac 240
ccagcggata tcccggacta tctgaagctg tcttttccgg aaggtttcaa gtgggaacgc 300
gtaatgaatt ttgaagatgg tggtgtcgtg accgtcactc aggactcctc cctgcaggat 360
ggcgagttca tctataaagt taaactgcgt ggtactaatt ttccatctga tggcccggtg 420
atgcagaaga agacgatggg ttgggaggcg tctagcgaac gcatgtatcc ggaagatggt 480
gcgctgaaag gcgaaattaa acagcgcctg aaactgaaag atggcggcca ttatgacgct 540
gaagtgaaaa ccacgtacaa agccaagaaa cctgtgcagc tgcctggcgc gtacaatgtg 600
aatattaaac tggacatcac ctctcataat gaagattata cgatcgtaga gcaatatgag 660
cgcgcggagg gtcgtcattc taccggtggc atggatgagc tgtacaaata a 711
<210> 6
<211> 861
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> beta-lactamase gene
<400> 6
atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct 60
gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagacg ctgaggatca gttgggagcc 120
cgtgtgggtt acatcgagct ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc 180
gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc 240
cgtgttgatg ccggacaaga gcaacttggt cgccgtatac actattctca gaatgacttg 300
gttgagtact caccagttac cgaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta 360
tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac acggcagcca acttacttct gacaacgatc 420
ggagggccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt 480
gatcgttggg agccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg 540
cccgcagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct 600
tctcgtcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggccc acttctgcgt 660
tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagcaggcga gcgtggatct 720
cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac 780
acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgca 840
tcactgatta agcattggta a 861
<210> 7
<211> 282
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primase ori deltaGAAABCC
<400> 7
tttgttgcaa tggctgtcta ccctgtctac ctgagtaaag aaaaatacat ttaattcagt 60
acattaactt gggtagacag ccttttttta ctgtctacct actatctacc ctctctacct 120
gattttacct gaatcagaca gggaggtaga tacggggtag atagtggata aaagcactct 180
accccactga aagcagcgcc attactggca tggtggccag taaggtagat aaggtagaca 240
aggggaggca caactcaaaa ctttttaaac gagggggtaa aa 282
<210> 8
<211> 282
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primase ori devoid of restriction sites
<400> 8
tttgttgcaa tggctgtcta ccctgtctac ctgagtaaag aaaaatacat ttaattcagt 60
atattaactt gggtagacag ccttttttta ctgtctacct tctgtctacc ctctctacct 120
gattttacct gaatcagaca gggaggtaga cacggggtag acagtggata aaagcactct 180
accccactga aagcagtgcc attactggca tggttgccag taaggttgat aaggtagaca 240
aggggaggga caactcaaaa ctttttaaac gagggggtaa aa 282
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> insulin B9-25 epitope
<400> 9
Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe
1 5 10 15
Phe
<210> 10
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T cell (beta2GPI) epitope
<400> 10
Lys Val Ser Phe Phe Cys Lys Asn Lys Glu Lys Lys Cys Ser Tyr
1 5 10 15
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> B cell epitope
<400> 11
Val Ser Arg Gly Gly Met Arg Lys Phe Ile Cys
1 5 10
<210> 12
<211> 282
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primase ori from the PICI of the Escherichia coli strain CFT073
<400> 12
tttgttgcaa tggctgtcta ccctgtctac ctgagtaaag aaaaatacat ttaattcagt 60
acattaactt gggtagacag ccttttttta ctgtctacct actatctacc ctctctacct 120
gattttacct gaatcagaca gggaggtaga tacggggtag atagtggata aaagcactct 180
accccactga aagccgcgcc attactggca tggtggccag taaggtagat aaggtagaca 240
aggggaggca caactcaaaa ctttttaaac gagggggtaa aa 282
<210> 13
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(10)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 13
twcannnnnn tgg 13
<210> 14
<211> 584
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PICI primase-helicase
<400> 14
Met Lys Leu Ala Pro Asn Val Lys Gln Gln Ser Arg Gly Ile Lys His
1 5 10 15
Lys Glu Thr Glu Val Ile Ile Phe Ala Gly Ser Asp Ala Trp Ser His
20 25 30
Ala Lys Gln Trp Gln Glu His Asp Ala Arg Met Ala Gly Asp Asn Glu
35 40 45
Pro Pro Val Trp Leu Gly Glu Gln Gln Leu Ser Glu Leu Asp Lys Leu
50 55 60
Gln Ile Val Pro Glu Gly Arg Lys Ser Val Arg Ile Phe Arg Ala Gly
65 70 75 80
Tyr Leu Ala Pro Val Met Ile Lys Ala Ile Gly Gln Lys Leu Ala Ala
85 90 95
Ala Gly Val Gln Asp Ala Asn Phe Tyr Pro Asp Gly Met His Gly Gln
100 105 110
Lys Val Glu Asn Trp Arg Glu Tyr Leu Ala Arg Glu Arg Gln Asn Leu
115 120 125
Ser Asp Gly Leu Val Ile Glu Leu Pro Val Lys Gln Lys Ala Gln Leu
130 135 140
Ser Gln Met Ala Asp Ser Glu Arg Ala Gln Leu Leu Ala Asp Arg Phe
145 150 155 160
Asp Gly Val Cys Val His Pro Glu Ser Glu Ile Val His Val Trp Cys
165 170 175
Gly Gly Val Trp Cys Pro Val Ser Thr Met Glu Leu Ser Arg Glu Met
180 185 190
Val Ala Ile Tyr Ser Glu His Arg Ala Thr Phe Ser Lys Arg Val Ile
195 200 205
Asn Asn Ala Val Glu Ala Leu Lys Val Ile Ala Glu Pro Met Gly Glu
210 215 220
Pro Ser Gly Asp Leu Leu Pro Phe Ala Asn Gly Ala Leu Asp Leu Lys
225 230 235 240
Thr Gly Glu Phe Ser Pro His Thr Pro Glu Asn Trp Ile Thr Thr His
245 250 255
Asn Gly Ile Glu Tyr Thr Pro Pro Ala Pro Gly Glu Asn Ile Arg Asp
260 265 270
Asn Ala Pro Asn Phe His Lys Trp Leu Glu His Ala Ala Gly Lys Asp
275 280 285
Pro Arg Lys Met Met Arg Ile Cys Ala Ala Leu Tyr Met Ile Met Ala
290 295 300
Asn Arg Tyr Asp Trp Gln Met Phe Ile Glu Ala Thr Gly Asp Gly Gly
305 310 315 320
Ser Gly Lys Ser Thr Phe Thr His Ile Ala Ser Leu Leu Ala Gly Lys
325 330 335
Gln Asn Thr Val Ser Ala Glu Met Thr Ser Leu Asp Asp Ala Gly Gly
340 345 350
Arg Ala Gln Val Val Gly Ser Arg Leu Ile Val Leu Ala Asp Gln Pro
355 360 365
Lys Tyr Thr Gly Glu Gly Thr Gly Ile Lys Lys Ile Thr Gly Gly Asp
370 375 380
Pro Val Glu Ile Asn Pro Lys Tyr Glu Lys Arg Phe Thr Ala Val Ile
385 390 395 400
Arg Ala Val Val Leu Ala Thr Asn Asn Asn Pro Met Ile Phe Thr Glu
405 410 415
Arg Ala Gly Gly Val Ala Arg Arg Arg Val Ile Phe Arg Phe Asp Asn
420 425 430
Ile Val Ser Glu Ala Glu Lys Asp Arg Glu Leu Pro Glu Lys Ile Ala
435 440 445
Ala Glu Ile Pro Val Ile Ile Arg Arg Leu Leu Ala Asn Phe Ala Asp
450 455 460
Pro Glu Lys Ala Arg Ala Leu Leu Ile Glu Gln Arg Asp Gly Asp Glu
465 470 475 480
Ala Leu Ala Ile Lys Gln Gln Thr Asp Pro Val Ile Glu Phe Cys Gln
485 490 495
Phe Leu Asn Phe Leu Glu Glu Ala Arg Gly Leu Met Met Gly Gly Gly
500 505 510
Gly Asp Ser Val Lys Tyr Thr Thr Arg Asn Ser Leu Tyr Arg Val Tyr
515 520 525
Leu Ala Phe Met Ala Tyr Ala Gly Arg Ser Lys Pro Leu Asn Val Asn
530 535 540
Asp Phe Gly Lys Ala Met Lys Pro Ala Ala Lys Val Tyr Gly His Glu
545 550 555 560
Tyr Ile Thr Arg Lys Val Lys Gly Val Thr Gln Thr Asn Ala Ile Thr
565 570 575
Thr Asp Asp Cys Asp Ala Phe Leu
580
<210> 15
<211> 1752
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PICI primase-helicase
<400> 15
atgaaactgg caccgaacgt aaaacagcag tcacgcggca taaaacacaa agaaacagaa 60
gtcattattt ttgcgggtag tgatgcctgg tcacacgcaa aacaatggca ggaacatgac 120
gcgcgtatgg ccggagataa tgagcctcct gtgtggcttg gggagcagca gttatccgaa 180
ctggataagc tgcaaattgt gccggaaggc agaaaatccg tgcgcatatt cagggccgga 240
tatcttgcgc cagtaatgat aaaggcgatt ggtcagaagc tggcggcggc aggcgtacag 300
gatgcaaatt tttaccctga tggtatgcac ggtcagaagg tggagaactg gcgcgaatat 360
ctggcccgtg agcgccagaa tctttctgat ggtctggtca ttgagcttcc ggtaaagcaa 420
aaggcgcaac tttcgcagat ggcggacagt gagcgcgcgc agctgcttgc cgatcgcttt 480
gatggcgttt gcgtacatcc tgaaagtgaa atcgttcacg tatggtgcgg cggggtatgg 540
tgtccggtca gcacaatgga gctgagccgc gaaatggtgg cgatctattc agagcacagg 600
gccactttca gcaagcgcgt aatcaataac gccgtggaag cgttaaaagt tattgccgaa 660
ccaatgggcg agccgtccgg cgatttgctg ccgttcgcca atggtgcgct tgacctgaaa 720
acgggggaat tttccccgca cacgccggag aactggatca ccacgcacaa cggcattgag 780
tacacgccac cagcacccgg ggagaacatc cgcgataacg cgccaaactt tcataaatgg 840
cttgagcacg cagccggaaa agacccgcgc aagatgatgc gtatatgtgc cgcgctgtac 900
atgattatgg cgaaccggta cgactggcag atgtttattg aggccaccgg agacggcggg 960
agcggtaaaa gtacattcac acacatagcc agccttctgg cagggaaaca aaacacggta 1020
agcgctgaaa tgacatcgct tgatgatgct ggtgggcgtg cgcaggttgt cgggagtcgt 1080
cttatcgtcc tggcagacca gccgaaatat acaggcgaag gaacgggcat caagaaaatc 1140
acgggcggcg accccgtgga aattaacccg aaatatgaaa agcgttttac ggcggtaatc 1200
agggcggtgg tgctggcaac caataacaat ccgatgatat tcaccgaacg ggccggaggt 1260
gtggcacgtc gtcgggtgat attccggttc gataacatcg taagcgaggc agaaaaagac 1320
agggagctac cggaaaagat cgcggctgaa atccctgtca ttatccgccg cttgctggcg 1380
aactttgccg accctgaaaa ggcacgggct ttactcattg aacagcgtga cggtgatgaa 1440
gcactggcaa taaagcaaca gacggatccg gttattgagt tttgccagtt cctgaatttt 1500
ctggaggaag cacgcggcct gatgatgggc ggcggtggcg attcagtgaa gtacacgacc 1560
agaaacagcc tttaccgcgt ctatctggcg tttatggcgt acgcaggcag gagcaaaccg 1620
ctaaacgtaa atgactttgg caaggctatg aagccagccg cgaaagttta cggacatgaa 1680
tatattacgc ggaaagttaa aggagtaacg cagactaacg caataacaac agacgattgc 1740
gacgcgtttt ta 1752
<210> 16
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ro60 B cell epitope
<400> 16
Thr Lys Tyr Lys Gln Arg Asn Gly Trp Ser His Lys Asp Leu Leu Arg
1 5 10 15
Leu Ser His Leu Lys Pro
20
<210> 17
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ro60 T cell epitope (aa 316-335)
<400> 17
Lys Ala Arg Ile His Pro Phe His Ile Leu Ile Ala Leu Glu Thr Tyr
1 5 10 15
Lys Thr Gly His
20
<210> 18
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ro60 T cell epitope (aa 369-383)
<400> 18
Lys Arg Phe Leu Ala Ala Val Asp Val Ser Ala Ser Met Asn Gln
1 5 10 15
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> candidate mimic peptide
<400> 19
Ala Ala Ala Lys His Leu Thr Pro
1 5
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> candidate mimic peptide
<400> 20
Ala Ala Cys Glu Ala Ala Val Gly Leu
1 5
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> candidate mimic peptide
<400> 21
Ala Ala Gly Met Asn Ala Ala Val Arg
1 5
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> candidate mimic peptide
<400> 22
Ala Ala His Gly Asn Ser Leu Arg Gly Ile
1 5 10
<210> 23
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> candidate mimic peptide
<400> 23
Ala Ala Leu Gly Ser Asp Thr Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 24
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> candidate mimic peptide
<400> 24
Ala Ala Pro Phe Gly Gly Val Lys Gln Ser Gly
1 5 10
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> candidate mimic peptide
<400> 25
Ala Ala Pro Gly Ser Lys Thr Thr Gln
1 5
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> candidate mimic peptide
<400> 26
Ala Ala Pro Gly Thr Ile Arg Gly Asp
1 5
<210> 27
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> candidate mimic peptide
<400> 27
Ala Ala Pro Gly Thr Ile Arg Gly Asp Phe
1 5 10
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> candidate mimic peptide
<400> 28
Ala Ala Val Glu Met Arg Asp Asn Pro
1 5
<210> 29
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> candidate mimic peptide
<400> 29
Ala Ala Val Pro Ser Gly Ala Ser Thr Gly
1 5 10
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> candidate mimic peptide
<400> 30
Ala Cys Gly Thr Ser Tyr His Ala Gly
1 5
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> candidate mimic peptide
<400> 31
Ala Asp Phe Ile Gly Lys Gln Ala Leu
1 5
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> candidate mimic peptide
<400> 32
Ala Asp Ile Gly Trp Ile Thr Gly His
1 5
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> candidate mimic peptide
<400> 33
Ala Asp Ile Ile Thr Pro Asn Gln Phe Glu
1 5 10
<210> 34
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> candidate mimic peptide
<400> 34
Ala Asp Ile Val Thr Thr Thr Thr His Lys Thr Leu Arg Gly
1 5 10
<210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> candidate mimic peptide
<400> 35
Ala Asp Val Gly Leu Val Gly Phe Pro
1 5
<210> 36
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> candidate mimic peptide
<400> 36
Ala Asp Val Gly Leu Val Gly Phe Pro Asn
1 5 10
<210> 37
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> candidate mimic peptide
<400> 37
Ala Asp Val Gly Leu Val Gly Phe Pro Asn Ala Gly Lys Ser
1 5 10
<210> 38
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> candidate mimic peptide
<400> 38
Ala Asp Tyr Leu Val Val Asn Val Ser Ser Pro Asn Thr
1 5 10
<210> 39
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> candidate mimic peptide
<400> 39
Ala Glu Ala Tyr Asp Val Leu Ser Asp Pro
1 5 10
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> candidate mimic peptide
<400> 40
Ala Glu Asp Tyr His Gln Gln Tyr Leu
1 5
<210> 41
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> candidate mimic peptide
<400> 41
Ala Glu Ile Glu Thr Asp Lys Ala Thr
1 5
<210> 42
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> candidate mimic peptide
<400> 42
Ala Glu Ser Gly Trp Asp Phe Ser Ser Arg Trp
1 5 10
<210> 43
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> candidate mimic peptide
<400> 43
Ala Glu Ser Trp Asp Asn Val Gly Leu Leu
1 5 10
<210> 44
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> candidate mimic peptide
<400> 44
Ala Glu Thr Glu Ala Gln Arg Arg Gln Ala
1 5 10
<210> 45
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> candidate mimic peptide
<400> 45
Ala Phe Asp Arg Ile Leu Ala Ser Arg Met Gly
1 5 10
<210> 46
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> candidate mimic peptide
<400> 46
Ala Phe Asp Arg Ile Leu Ala Ser Arg Met Gly Val
1 5 10
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> candidate mimic peptide
<400> 47
Ala Phe Gly Phe Met Thr Arg Val Ala
1 5
<210> 48
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> candidate mimic peptide
<400> 48
Ala Phe Gly Phe Met Thr Arg Val Ala Leu
1 5 10
<210> 49
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> candidate mimic peptide
<400> 49
Ala Phe Leu Thr Val Ser Gly Gln Leu
1 5
<210> 50
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> candidate mimic peptide
<400> 50
Ala Phe Met Leu Pro Val Ala Thr Pro Pro Asn Ala Ile Val Phe
1 5 10 15
<210> 51
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> candidate mimic peptide
<400> 51
Ala Gly Ala Glu Ser Gly Trp Asp Phe Ser Ser Arg Trp Leu
1 5 10
<210> 52
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> candidate mimic peptide
<400> 52
Ala Gly Ala Met Glu Asn Trp Gly Leu Val Thr Tyr Arg Glu
1 5 10
<210> 53
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> candidate mimic peptide
<400> 53
Ala Gly Ala Ser Leu Val Gln Leu Tyr
1 5
<210> 54
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> candidate mimic peptide
<400> 54
Ala Gly Ala Ser Leu Val Gln Leu Tyr Thr
1 5 10
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> candidate mimic peptide
<400> 55
Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr
1 5
<210> 56
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> candidate mimic peptide
<400> 56
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<223> candidate mimic peptide
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Tyr Ser Ala Val Asn Gln Gly His Cys His Pro Lys Ile
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<213> Artificial Sequence
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<223> candidate mimic peptide
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Tyr Thr Ala Ile Glu Ala Pro Lys Gly Glu
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<211> 10
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<213> Artificial Sequence
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<223> candidate mimic peptide
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Tyr Thr His Phe Thr Ser Pro Ile Arg Arg
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Tyr Thr Pro Tyr Gln Pro Glu Val Ser Gln Gly Arg Leu Glu
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Tyr Thr Pro Tyr Gln Pro Glu Val Ser Gln Gly Arg Leu Glu Ser Leu
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Leu Asn
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Tyr Thr Arg Arg Glu Pro Leu Gly Val Cys
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Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Gly Met Pro Lys Gly
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Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Gly Arg Pro Lys Gly Val
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Tyr Thr Ser Gly Thr Thr Gly Leu Pro Lys Gly
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Tyr Thr Ser Gly Thr Thr Gly Asn Pro Lys Gly
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Tyr Thr Ser Val Leu Lys Arg Ala Ile Arg Thr Leu
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Tyr Val Glu Gly Glu Ser Leu Leu Met
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Tyr Val Gly Cys Gly Glu Arg Gly Asn Glu Met
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Tyr Val His Arg Ile Gly Arg Thr Gly Arg
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<213> Artificial Sequence
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<223> candidate mimic peptide
<400> 2309
Tyr Val His Arg Val Gly Arg Thr Ala Arg Ala Gly
1 5 10
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<223> candidate mimic peptide
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Tyr Val Asn Asp Ala Phe Gly Thr Ala His Arg Ala His
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Tyr Val Tyr Ile Ile Tyr Gly Met Tyr
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> candidate mimic peptide
<400> 2312
Tyr Trp His Phe Val Asp Val Val Trp
1 5
<210> 2313
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> candidate mimic peptide
<400> 2313
Tyr Trp Leu Ser Gly Leu Thr Cys Thr Glu Gln Asn Phe Ile
1 5 10
<210> 2314
<211> 669
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RFP gene
<400> 2314
atggaggacg ttatcaaaga gttcatgcgt ttcaaagttc gtatggaagg tagcgttaac 60
ggtcacgagt tcgaaatcga aggtgagggt gaaggtcgtc cgtacgaagg tactcaaacc 120
gctaaactga aagttaccaa aggtggccct ctgccgttcg cttgggacat cctgtccccg 180
cagttccagt acggtagcaa ggcttacgtt aaacatccgg ctgacattcc ggactactta 240
aagctgtcct ttccggaagg tttcaaatgg gagcgtgtta tgaacttcga ggacggcggt 300
gttgttaccg ttacgcagga ctcctccctg caagacggtg agttcatcta caaagttaaa 360
ctgcgtggta cgaacttccc gtccgacggc ccggttatgc agaaaaaaac tatgggttgg 420
gaggcttcca ccgaacgtat gtatccggag gacggtgcgc tgaaaggtga aatcaaaatg 480
cgtctgaaac tgaaagacgg cggtcactac gacgcggaag ttaaaactac ctacatggct 540
aaaaaacctg ttcaactgcc gggcgcttac aaaaccgaca tcaaactgga catcacctcc 600
cacaacgagg actataccat cgttgaacag tacgaacgcg cggaaggtcg tcactccact 660
ggtgcttaa 669
<210> 2315
<211> 12822
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Payload encoding prime editor (PE) and pegRNA targeting RFP
<400> 2315
gtccccgaat ctgtcgggct atttcactaa tactttccaa acgccccgta tccaagaaga 60
acgaatttat ccacgctccc gtctttggga cgaataccgc tacaagtgga cagaggatcg 120
gtacgggcct ctaataaatc caacactcta cgccctcttc aagagctaga agaacagggt 180
gcagttggaa agggaattat ttcgtaaggc gagccaatac cgtaattaat tcggaagagt 240
taacacgatt ggaagtagga atagtttcta accacggtta ctaatcctaa taacggaacg 300
ctgtctgata gattagtgtc agcgctcggt accaaagaaa aataaaaaga cgctgaaaag 360
cgtcttttta tttttcggtc cagtgtaact caggcaaaag cacgtaatat tcgtactttc 420
ttcctccgta agcgtcaccc acattcctta aagagtgcat gtgcatattt tgttatcaat 480
aaaaaaggcc gcgatttgcg gccttattgt tcgtcttgcc ggattacgcc ccgccctgcc 540
actcatcgca gtattgttgt aattcattaa gcattctgcc gacatggaag ccatcacaaa 600
cggcatgatg aacttggatc gccagtggca ttaacacctt gtcgccttgc gtataatatt 660
ttcccatagt gaaaacgggg gcgaagaagt tgtccatatt tgctacgttt aaatcaaaac 720
tggtgaaact cacccacgga ttggcactga cgaaaaacat attttcgata aaccctttag 780
ggaaatatgc taagttttca ccgtaacacg ccacatcttg actatatatg tgtagaaact 840
gccggaaatc gtcgtggtat tctgaccaga gcgatgaaaa cgtttcagtt tgctcatgga 900
aaacggtgta acaagggtga acactatccc atatcaccag ctcaccgtct ttcattgcca 960
tacgaaactc cggatgtgca ttcatcaggc gggcaagaat gtgaataaag gccggataaa 1020
acttgtgctt atttttcttt acggttttta aaaaggccgt aatatccagc tgaacggttt 1080
ggttataggt gcactgagca actgactgga atgcctcaaa atgttcttta cgatgccatt 1140
gacttatatc aactgtagta tatccagtga tttttttctc cattttagct tccttagctt 1200
gcgaaatctc gataactcaa aaaatagtag tgatcttatt tcattatggt gaaagttgtc 1260
ttacgtgcaa cattttcgca aaaagttggc gctttatcaa cactgtcgga atgacaaatg 1320
gttccaatta ttgaacaccc ttcggggtgt ttttttgttt ctggtttccc gaggccggcc 1380
tgcgctagcg gagtgtatac tggcttacta tgttggcact gatgagggtg taagtgaagt 1440
gcttcatgtg gcaggagaaa aaaggctgca tcggtgcgtc agcagaatat gtgatacagg 1500
atatattccg cttcctcgct cactgactcg ctacgctcgg tcgttcgact gtggcgagcg 1560
gaaatggctt acgaacgggg cggagatttc ctggaagatg ccaggaagat acttaacagg 1620
gaagtgagag ggtcgcggca aagccgtttt tccataggct ccgcccccct gacaagcatc 1680
acgaaatctg acgctcaaat cagtggtggc gaaacctgac aggactataa agataccagg 1740
cgtttccccc tggcggctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc tgcctttcgg tttgccggtg 1800
tcattcctct gttacggccg agtttgtctc attccacgcc tgacactcag ttccgggtag 1860
gcagttcgct ccaagctgga ctgtatgcac gaaccccccg ttcagtccga ccgctgcgcc 1920
ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggaaagac atgcaaaagc accactggca 1980
gcagccactg gtaattgatt tagaggagtt agtcttgaag tcatgcgccg gataaggcta 2040
aactgaaagg acaagttttg gcgactgcgc tcctccaagc cagttacctc ggttcaaaga 2100
gttggtagct cagagaacct tcgaaaaacc gccctgcaag gcggtttttt cgttttcaga 2160
gcaagagatt acgcgcagac caaaacgatc tcaagaagat catcttatta atcagataaa 2220
atatttctag atttcagtgc aatttatctc ttcaaatgta gcaccggcgc gccgtgacca 2280
attattgaag gccgctaacg cggccttttt ttgtttctgg tatcccgaat ggagcgactt 2340
ctccccaaaa agcctcgctt tcagcacctg tcgtttcctt tcttttcaga gggtatttta 2400
aataaaaaca ttaagttatg acgaagaaga acggaaacgc cttaaaccgg aaaattttca 2460
taaatagcga aaacccgcga ggtcgccgcc ccgtaacctg tcggatcacc ggaaaggacc 2520
cgtaaagtga taatgattat catctacata tcacaacgtg cgtaaagggt aagtatgaag 2580
gtcgtgtact ccatcgctac caaattccag aaaacagacg ctttcgagcg tcttttttcg 2640
ttttggtcac gacgtacggt ggaagattcg ttaccaattg acagctagct cagtcctagg 2700
tatatacata catgcttgtt tgtttgtaaa ctactagaag agcgattggg ctcttcaatg 2760
gataagaaat acagcatagg cttagacatc ggcacaaata gcgtcggatg ggcggtgatc 2820
actgatgaat ataaagttcc gtctaaaaag ttcaaggtac tgggtaatac agatcgccat 2880
agtatcaaaa agaacttaat cggtgcgctt ctgttcgatt ccggcgaaac cgcagaagca 2940
acacgtctga aacgcaccgc tcgtcgccgt tacacccgtc gtaaaaaccg catctgctac 3000
ctgcaagaaa tcttctctaa cgaaatggct aaagtagatg acagcttttt tcaccgtctg 3060
gaagaatcat ttctggtgga agaagataaa aagcacgaac gtcatccaat cttcggcaac 3120
attgtggacg aagtagcgta tcacgaaaaa tacccgacta tctatcacct gcgcaaaaag 3180
ctggtcgatt cgacggataa ggccgatctg cgtctgatct atctggcctt agcgcatatg 3240
attaagttcc gtggtcattt cctgatcgaa ggcgacctga atccagacaa cagcgatgta 3300
gacaaactgt tcatccagct ggtgcaaacc tataaccagc tgtttgaaga aaacccaatt 3360
aatgctagcg gtgttgacgc gaaagcgatc ttgtccgcac gcctgtccaa atcccgtcgt 3420
ctggaaaact taattgcgca actgccgggt gagaagaaaa acggactgtt cggcaatctg 3480
atcgctctta gcttgggact gaccccgaac ttcaaaagca acttcgatct ggcagaggac 3540
gcaaaacttc aacttagcaa agatacgtat gacgatgact tggataactt actggcccag 3600
atcggagatc agtacgctga tctgtttctg gcggcaaaga acttatcaga cgctattctc 3660
ctgtctgata ttcttcgtgt gaataccgaa atcaccaaag caccgctttc tgcatccatg 3720
attaaacgct atgacgaaca tcaccaagat ctgactcttc tgaaagcgct ggtacggcaa 3780
caactgccgg agaagtacaa ggagatcttc tttgaccaat ccaaaaacgg ctacgcgggt 3840
tatattgacg ggggtgcaag ccaagaggag ttctacaaat tcatcaagcc aatcttagaa 3900
aaaatggatg gcacggaaga attacttgtt aaactgaatc gtgaggatct gcttcgtaaa 3960
cagcgtacct tcgacaacgg tagcattccg caccagatcc acttaggtga actgcacgct 4020
atcctgcgtc gccaagagga tttttacccg ttcctgaaag ataatcgtga aaaaatcgaa 4080
aaaatcctga cctttcgtat cccgtattat gtcggcccgc tggcgcgtgg caactcccgt 4140
ttcgcgtgga tgactcgcaa atccgaagaa actattaccc cgtggaactt cgaggaagtg 4200
gttgacaaag gcgcaagcgc ccaatccttc atcgagcgca tgactaactt tgataaaaac 4260
ctgccgaacg aaaaggtact gccgaaacac tcccttctgt acgaatactt caccgtgtac 4320
aacgagctga ctaaagtaaa gtatgtgact gagggcatgc gtaaacctgc attcctgagc 4380
ggtgaacaga aaaaagcaat tgttgattta ctgtttaaaa ccaaccgtaa agtaaccgtt 4440
aaacagctga aagaggacta cttcaagaaa atcgaatgct tcgactccgt cgagattagt 4500
ggagttgaag atcgttttaa tgcaagttta ggcacgtatc acgatttatt aaagatcatt 4560
aaagacaaag atttcttgga caacgaagaa aatgaggaca tcttagagga catcgtcctg 4620
accctgactc tgttcgaaga tcgtgaaatg attgaagaac gccttaagac gtatgctcac 4680
ctgtttgacg ataaagtaat gaaacaactg aaacgtcgcc gttatactgg ctggggccgt 4740
ctgagccgta aactgattaa cggtatccgt gacaaacagt ccggtaaaac tattctggac 4800
ttcctgaaat ctgacggctt cgcaaaccgt aacttcatgc aactgattca cgacgattcc 4860
ctgaccttca aagaggacat ccagaaagct caggtttctg gtcaaggtga ttctctgcac 4920
gagcatatcg ccaatttagc aggtagtccg gcgatcaaaa aaggtatcct gcaaaccgtg 4980
aaagtggtgg atgagcttgt gaaagttatg ggtcgtcaca aaccggaaaa cattgttatc 5040
gagatggctc gtgaaaacca aacgacccag aagggacaga aaaactcccg cgaacgcatg 5100
aaacgtatcg aggagggtat taaagaactt ggctctcaga ttctgaaaga acaccctgtt 5160
gaaaataccc aactgcaaaa tgaaaaactg tacctgtact acctgcaaaa tggtcgtgac 5220
atgtatgtag atcaggagct ggacatcaac cgcctctccg attacgacgt tgacgccatt 5280
gttccgcagt cttttctgaa agatgattcc attgataaca aagtactcac ccgtagcgat 5340
aaaaaccgtg ggaagagtga caacgttcca tcggaagaag tagttaagaa aatgaagaac 5400
tattggcgtc aactgcttaa cgcgaaactg attactcaac gtaaatttga taacctgacc 5460
aaagctgaac gtggcggttt gtctgagctg gataaggcgg gttttattaa acgtcaactg 5520
gtagaaactc gccagattac aaaacatgtt gctcagattc tggactctcg tatgaacact 5580
aaatacgatg aaaatgacaa actgatccgc gaagttaagg ttattaccct gaaatctaag 5640
ctggtttccg acttccgtaa agatttccaa ttctataaag tgcgcgagat taacaactat 5700
caccacgcgc acgacgcata tctgaatgca gttgttggca cggcactgat caaaaaatat 5760
ccgaaactgg aaagcgaatt tgtgtacggc gattataaag tttacgacgt gcgcaaaatg 5820
atcgccaaat ctgaacagga aattggcaaa gcaaccgcta aatacttttt ctactcaaac 5880
attatgaatt tcttcaaaac cgaaatcacc ttagcgaatg gcgaaattcg taaacgccct 5940
ctgatcgaaa ccaacggcga aacgggtgag atcgtgtggg acaaaggtcg tgatttcgct 6000
actgtccgca aagttctgtc catgcctcaa gtaaacatcg ttaaaaagac tgaggtacag 6060
actggcggtt tcagcaagga atccattctg ccgaaacgca actccgacaa actgatcgcg 6120
cgtaagaaag actgggatcc gaagaaatac ggtggcttcg attctccaac cgtggcatac 6180
agcgttctgg tagtcgccaa agtcgaaaag ggtaaatcaa aaaaactgaa atcagtgaaa 6240
gaacttttag gcatcaccat tatggaacgt agctctttcg aaaaaaaccc gattgacttc 6300
ctcgaagcga aggggtacaa ggaagtaaag aaagatctga ttatcaaact gccgaagtat 6360
tccctgttcg aactggaaaa tggtcgtaaa cgtatgttag cgtctgcggg tgaactgcaa 6420
aaagggaacg aattggccct tccgtccaag tacgtgaact tcctgtatct ggcctcgcac 6480
tacgagaaac tgaaaggtag tccggaagat aatgagcaga aacagctgtt cgtggaacag 6540
cacaaacact atctggacga gattattgaa cagatttctg agtttagcaa acgcgtaatt 6600
ctggcggacg cgaatctgga taaagtcctg agcgcctaca ataaacaccg tgataaaccg 6660
atccgtgaac aggcagaaaa catcattcac ctgttcacgc tgactaatct tggtgctccg 6720
gcagccttca aatacttcga caccacgatc gatcgtaaac gttacacctc cactaaagaa 6780
gtcttagatg caactcttat tcaccagagc atcactggcc tgtatgaaac tcgtattgat 6840
ctgagtcagt tgggcggtga ctcgggcggc tccagcgggg gcagcagcgg ctcggaaact 6900
cccggcacat ctgagtctgc cacccccgaa tcgagtggtg gaagctccgg cggctcgtca 6960
actctgaaca tcgaagacga gtaccgtctt catgagacga gcaaagagcc tgacgtctcc 7020
ttagggtcaa catggttatc tgactttccg caggcgtggg ctgagacagg cgggatgggg 7080
ctggcagttc gtcaagcacc gttaattatt ccactgaaag cgacctctac tccggtatct 7140
attaaacaat accccatgag tcaggaagcg cgtttaggta tcaagcccca tattcagcgc 7200
ctgttagatc aaggaatcct tgtcccatgc cagagcccgt ggaatacccc ccttctgcca 7260
gtgaagaaac cgggtacgaa tgactaccgc cctgtgcagg acttgcgtga agtaaacaag 7320
cgcgtagagg atattcaccc tactgtacca aacccttata atttattaag cggtttacct 7380
ccgtcgcatc agtggtatac tgttttagat ttaaaggacg cgtttttttg tctgcgtttg 7440
caccctacaa gccagcccct tttcgccttt gagtggcgcg accccgaaat gggaattagc 7500
ggtcaactga cttggacccg tctgcctcag ggatttaaaa attccccaac gcttttcaat 7560
gaagcgctgc atcgtgattt ggcggatttt cgcattcaac acccagatct gattctgctg 7620
caatacgtgg atgacttgct tttggcggcg acaagcgagt tggactgcca acaaggcaca 7680
cgtgcccttt tgcagacctt aggaaacctg ggatatcgtg cttcggcgaa gaaagcacaa 7740
atttgccaaa aacaggtgaa gtatctggga tacctgctta aagaggggca acgttggtta 7800
acggaagccc gcaaagaaac cgtaatgggt cagcctacgc ctaagactcc ccgtcagctt 7860
cgcgagtttt tgggaaaggc gggattttgc cgtttattta ttccagggtt tgccgagatg 7920
gctgcgccat tgtacccgtt gactaagccc ggcacgctgt tcaactgggg gcccgaccaa 7980
caaaaagcat accaagagat taaacaagca ttattgactg cgcccgcgtt agggctgcca 8040
gatttgacca aaccttttga attgttcgtc gatgaaaagc aggggtatgc caaaggggta 8100
cttacccaga aattaggacc gtggcgtcgc ccagtggctt atttgtccaa aaaattggat 8160
ccagtggcag cgggttggcc cccatgcttg cgtatggtag ccgcaatcgc cgtgttaaca 8220
aaggatgccg gaaaattgac tatgggtcag ccgctggtga ttttagctcc acatgcagtc 8280
gaggctcttg ttaaacaacc tccagaccgt tggctgagta atgcacgcat gacacactac 8340
caggccttac ttttggacac tgatcgtgtg cagtttggac ctgtggtagc ccttaacccg 8400
gcaaccctgt taccacttcc tgaagagggg ctgcaacata actgtttaga catccttgct 8460
gaagctcacg gaactcgccc agatcttact gatcaacctc ttcccgatgc cgaccatact 8520
tggtatacgg atggctcgtc gttgctgcaa gaaggtcagc gtaaagctgg agccgctgtc 8580
acgaccgaaa cggaggttat ttgggcgaaa gctttgccag cgggaactag cgcccagcgc 8640
gcagagttaa tcgcgttgac tcaagctctg aagatggcgg agggtaaaaa actgaacgtg 8700
tacaccgata gccgttacgc tttcgcgacg gcccatattc atggggaaat ctatcgccgc 8760
cgtggttggc tgacgtccga gggcaaggaa atcaaaaaca aggatgagat cttagcgtta 8820
cttaaggctt tattcttgcc caagcgtctt tcaatcattc attgcccggg acatcaaaag 8880
ggccactccg cagaggcgcg tggcaatcgc atggcggatc aagcggcgcg taaagccgct 8940
atcacagaaa cgcccgatac gtctactctg ctgattgaga actcgtcgcc atcgggggga 9000
tctaagcgta cggcggacgg ctcagagttt gagtaatgta tgcttaagca gctcggtacc 9060
aaagacgaac aataagacgc tgaaaagcgt cttttttcgt tttggtcctg ttgcggcgcg 9120
atagtgtgaa catgctatag acttctggtg ctacccgact gacaattaat catccggctc 9180
gtataatgct agccgtttca aagttcgtat ggagttttag agctagaaat agcaagttaa 9240
aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct aacgctacct 9300
tacatacgaa ctttgaaact ttttttaatc cattcgaatc acgtccgacg aacaataagg 9360
cctccctaac ggggggcctt ttttattgat aacaaaagta acttcgagct tgtctacctc 9420
ctagcaccat tattgcaatt aataaacaac taacggacaa ttctacctaa cagttttcat 9480
atatgacgag cagttaagtg atgagtaaag gtgaggaatt atttactggt gttgttccga 9540
tcttagttga actggacggc gatgttaacg gtcataaatt cagtgttcgt ggtgaaggtg 9600
aaggtgatgc aaccaacggt aagctgaccc tgaaattcat ctgcactact ggaaaattac 9660
cagtaccgtg gcctactctg gtgactaccc tgacctatgg tgttcagtgt ttttctcgtt 9720
accctgacca catgaagcaa catgatttct tcaaatctgc aatgccggaa ggttatgtac 9780
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ttgaaggtga cactctggtg aatcgtattg aactgaaagg cattgatttc aaagaggacg 9900
gcaatatttt aggccacaaa ctggaatata acttcaactc ccataacgtt tacatcaccg 9960
cagacaaaca gaagaacggt atcaaagcta acttcaaaat tcgccataac gttgaagatg 10020
gtagcgtaca gctggcggat cattaccaac agaacactcc gattggagat gctcctgttt 10080
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atgaactcta caaataagac gaacaataag gggagcggga aaccgctccc cttttttatt 10260
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<213> Escherichia coli
<400> 2316
Met Thr Ile Met Glu His Val Ser Ile Lys Thr Leu Tyr His Leu Leu
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Cys Cys Met Leu Leu Phe Ile Ser Ala Met Cys Ala Leu Ala Gln Glu
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His Glu Pro Ile Gly Ala Gln Asp Glu Arg Leu Ser Thr Leu Ile His
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Gln Arg Met Gln Glu Ala Lys Val Pro Ala Leu Ser Val Ser Val Thr
50 55 60
Ile Lys Gly Val Arg Gln Arg Phe Val Tyr Gly Val Ala Asp Val Ala
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Ser Gln Lys Ala Asn Thr Leu Asp Thr Val Tyr Glu Leu Gly Ser Met
85 90 95
Ser Lys Ala Phe Thr Gly Leu Val Val Gln Ile Leu Ile Gln Glu Gly
100 105 110
Arg Leu Arg Gln Gly Asp Asp Ile Ile Thr Tyr Leu Pro Glu Met Arg
115 120 125
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Val Leu Gly Ala Val Ile Glu Asn Val Thr Gly Lys Thr Phe Thr Glu
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Val Ile Ala Glu Arg Leu Thr Gln Pro Leu Gly Met Ser Ala Thr Val
210 215 220
Ala Val Lys Gly Asp Glu Ile Ile Val Asn Lys Ala Ser Gly Tyr Lys
225 230 235 240
Leu Gly Phe Gly Lys Pro Val Leu Phe His Ala Pro Leu Ala Arg Asn
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His Val Pro Ala Ala Tyr Ile His Ser Thr Leu Pro Asp Met Glu Ile
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Trp Ile Asp Ala Trp Leu His Arg Lys Ala Leu Pro Ala Thr Leu Arg
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Glu Ala Met Ser Asn Ser Trp Arg Gly Asn Ser Asp Val Pro Leu Ala
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Gln Gly Pro Tyr Ile Ser His Gly Gly Gln Asn Pro Asn Phe Ser Ser
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Cys Ile Ala Leu Arg Pro Asp Gln Gln Ile Gly Ile Val Ala Leu Ala
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Asn Met Asn Ser Asn Leu Ile Leu Gln Leu Cys Ala Asp Ile Asp Asn
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Ala Thr Asp Thr Leu Phe Val Tyr Leu Thr Leu Leu Leu Cys Phe Trp
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Gly Ala Val Val Val Val Arg Gly Ala Phe Arg Val Tyr Arg Ala Thr
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Val Trp Gly Pro Ser Ser Val Leu Ala Ile Pro Phe Gly Ile Ile Leu
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Leu Ala Phe Val Leu Thr Leu Asn His Gln Ile Lys Arg Ile Leu Leu
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His Asn Lys Glu Trp Asp Asp Glu
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<213> Escherichia coli
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Met Lys Arg Val Ile Thr Leu Phe Ala Val Leu Leu Met Gly Trp Ser
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Val Asn Ala Trp Ser Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile
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Pro Ile Gly Gly Gly Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val
35 40 45
Val Asn Val Gly Gln Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe
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Gly Val Gly Val Gln Leu Thr Arg Asn Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn
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<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 2320
Met Arg Leu Leu Pro Leu Val Ala Ala Ala Thr Ala Ala Phe Leu Val
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Val Ala Cys Ser Ser Pro Thr Pro Pro Arg Gly Val Thr Val Val Asn
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Pro Asp Arg Gly Met Trp Gln Gln Ser Glu Gly Lys Ala Tyr Phe Thr
85 90 95
Gly Ala Pro Thr Arg Ala Ala Leu Lys Val Ser Phe Phe Gly Pro Phe
100 105 110
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115 120 125
Leu Val Cys Gly Pro Asp Arg Asp Tyr Leu Trp Ile Leu Ser Arg Thr
130 135 140
Pro Thr Ile Ser Asp Glu Val Lys Gln Glu Met Leu Ala Val Ala Thr
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Ser
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<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 2321
atgcgcctgc tccctctcgt tgccgcagcg acagctgcat ttctggtcgt tgcctgcagt 60
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accgcaacat acagcctgcg tgatgacggc ggcctgaatg tcattaataa aggctataac 240
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cgggaagggt ttgatgtcag taaatttatt tgggtacagc agcctggtag ttag 534
<210> 2322
<211> 1022
<212> PRT
<213> Bacteroides thetaiotaomicron
<400> 2322
Met Lys Leu Lys Lys Arg Thr Phe Leu Ile Leu Met Ala Ala Leu Thr
1 5 10 15
Ala Thr Phe Ala Ser Ala Gln Lys Gln Pro Leu Pro Glu Trp Gln Ser
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Gln Tyr Ala Val Gly Leu Asn Lys Leu Ala Pro His Thr Tyr Val Trp
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Pro Tyr Ala Asp Ala Ser Asp Ile Gly Lys Pro Gly Gly Tyr Glu Gln
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Ser Pro Tyr Tyr Met Ser Leu Asn Gly Lys Trp Lys Phe Asn Trp Val
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100 105 110
Gly Tyr Gly Thr Ala Ile Tyr Val Asn Glu Thr Tyr Glu Phe Asp Asp
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130 135 140
Asn Glu Val Gly Ser Tyr Arg Arg Thr Phe Lys Val Pro Ala Asp Trp
145 150 155 160
Lys Gly Arg Arg Val Val Leu Cys Cys Glu Gly Val Ile Ser Phe Tyr
165 170 175
Tyr Val Trp Val Asn Gly Lys Leu Leu Gly Tyr Asn Gln Gly Ser Lys
180 185 190
Thr Ala Ala Glu Trp Asp Ile Thr Asp Val Leu Ser Glu Gly Glu Asn
195 200 205
Val Val Ala Leu Glu Val Tyr Arg Trp Ser Ser Gly Ala Tyr Leu Glu
210 215 220
Cys Gln Asp Met Trp Arg Leu Ser Gly Ile Glu Arg Asp Val Tyr Leu
225 230 235 240
Tyr Ser Thr Pro Lys Gln Tyr Ile Ala Asp Tyr Lys Val Ser Ala Ser
245 250 255
Leu Asp Lys Glu Lys Tyr Lys Glu Gly Ile Phe Asn Leu Glu Val Thr
260 265 270
Val Glu Gly Pro Ser Ala Thr Ala Ser Ser Ile Ala Tyr Thr Leu Lys
275 280 285
Asp Ala Ser Gly Lys Ala Val Leu Gln Asp Ala Ile Asn Ile Lys Ser
290 295 300
Arg Gly Leu Ser Asn Phe Ile Ala Phe Asp Glu Lys Lys Ile Ala Glu
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Val Lys Ala Trp Asn Ala Glu His Pro Asn Leu Tyr Thr Leu Val Leu
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Glu Leu Lys Asp Ala Gln Gly Lys Val Thr Glu Leu Thr Gly Cys Glu
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Gly Val Pro Val Leu Val Lys Gly Thr Asn Arg His Glu His Ser Gln
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Leu Gly Arg Thr Val Ser Lys Glu Leu Met Glu Gln Asp Ile Arg Leu
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Met Lys Gln His Asn Ile Asn Met Val Arg Asn Ser His Tyr Pro Thr
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His Pro Tyr Trp Tyr Gln Leu Cys Asp Arg Tyr Gly Leu Tyr Met Ile
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Asp Glu Ala Asn Ile Glu Ser His Gly Met Gly Tyr Gly Pro Ala Ser
435 440 445
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Gly Lys Trp Tyr Trp Thr Tyr Gly Gly Asp Tyr Gly Pro Glu Gly Ile
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Lys Gly Glu Asp Gly Thr Val Leu Ala Glu Gly Thr Lys Glu Val Asp
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Cys Glu Pro His Ala Thr Val Asp Val Thr Leu Gly Ala Val Lys Leu
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755 760 765
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Ala Arg Leu Trp Arg Lys Ala Gly Leu Asn Asn Leu Thr Gln Lys Val
805 810 815
Val Ser Leu Lys Glu Glu Lys Thr Ser Ala Thr Val Arg Ala Glu Ile
820 825 830
Leu Asn Gly Lys Gly Gln Lys Val Gly Met Ala Asp Phe Val Tyr Ala
835 840 845
Leu Asp Lys Asn Gly Ala Leu Lys Val Arg Thr Thr Phe Gln Pro Asp
850 855 860
Thr Ala Ile Val Lys Ser Met Ala Arg Leu Gly Leu Thr Phe Arg Met
865 870 875 880
Ala Asp Ala Tyr Asn Gln Val Ser Tyr Leu Gly Arg Gly Asp His Glu
885 890 895
Thr Tyr Ile Asp Arg Asn Gln Ser Gly Arg Ile Gly Leu Tyr Asp Thr
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930 935 940
Gly Val Phe Met Glu Ser Asn Arg Pro Phe Gln Phe Ser Ile Ile Pro
945 950 955 960
Phe Ser Asp Val Leu Leu Glu Lys Ala His His Ile Asn Glu Leu Glu
965 970 975
Arg Asp Gly Met Ile Thr Ile His Leu Asp Ala Glu Gln Ala Gly Val
980 985 990
Gly Thr Ala Thr Cys Gly Pro Gly Val Leu Pro Gln Tyr Leu Val Pro
995 1000 1005
Val Lys Lys Gln Ser Phe Glu Phe Thr Leu Tyr Pro Val Lys
1010 1015 1020
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<211> 3069
<212> DNA
<213> Bacteroides thetaiotaomicron
<400> 2323
atgaaattaa agaaacgaac gtttttaatc ttgatggcag cactgactgc taccttcgct 60
tcggctcaga aacagccttt gccggagtgg cagagccagt atgcggtagg actgaataaa 120
ctcgctcctc atacctatgt atggccttac gccgacgctt ccgatattgg aaagccggga 180
ggatatgaac agtctcctta ttatatgagt ctgaacggga agtggaaatt taactgggtg 240
aagaacccgg acaaccgtcc gaaggacttt taccagccct cttattatac cggagggtgg 300
gcggatatta atgttcccgg caactgggaa cggcaaggct acggaacagc tatctatgtc 360
aacgaaactt atgagtttga cgacaagatg ttcaacttca agaagaatcc gccattggtt 420
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<210> 2324
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MYH6 614-629
<400> 2324
Arg Ser Leu Lys Leu Met Ala Thr Leu Phe Ser Thr Tyr Ala Ser Ala
1 5 10 15
Asp Arg
<210> 2325
<211> 12861
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Payload encoding prime editor (PE) and pegRNA targeting RFP and
containing an inducible promoter
<400> 2325
gtccccgaat ctgtcgggct atttcactaa tactttccaa acgccccgta tccaagaaga 60
acgaatttat ccacgctccc gtctttggga cgaataccgc tacaagtgga cagaggatcg 120
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gcagttggaa agggaattat ttcgtaaggc gagccaatac cgtaattaat tcggaagagt 240
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ttcccatagt gaaaacgggg gcgaagaagt tgtccatatt tgctacgttt aaatcaaaac 720
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cctgtattcg ggaagcgggt actagaagat tgcagggact ccgacgttaa gtaaattaca 10860
aagtaataag tatcgttcag gatcacgtta ccgcaataag aagcgagaat aatataattt 10920
ccgaagtgct taccccagta gtgactattc ctataaccct tctgagtgtc cggaggcgga 10980
aatttgccac gaaagagaaa gtatttcccc gacaataata aaggggcgct cctcagcttt 11040
tccacttggt tgggtaagct aggcaactct gaaaggagtt tcggcgaatt gaagccgaca 11100
gctttgaatt gttttagggg cgttattcga gggcaatcgg agctaacttc aagactactt 11160
ctttgttgaa tactaaatag tgcaaaggtc gtgtttcctc aaggatactc cgctaacaat 11220
ataggattcc aatcagattc agcactggcg gtacgggtgt tgcggtgagg cgttcgggtt 11280
tacggctcga agctagcacg gtaggcgcag gataagtaag gggagtaagt gatcgaacga 11340
atcagaagtg acaatatact taggctggat ctcgtcccgt gaatcccaac cctcaccaac 11400
tacgagataa gaggtaagcc aaaaatcgac ttggtggcga ccaacgactg ttccccccct 11460
gtaactaatc gttccgtcaa aacctgactt acttcaaggc caattccaag cgcaaacaat 11520
accgtcctag ttcttcggtt aagtttccga agtaggagtg agcctacctc cgtttgcgtc 11580
ttgttaccac tgacccagct atttactttg tattgcctgc aatcgaattt ctgaactctc 11640
agatagtggg gataacggga aagttcctat atttgcgaac taacttagcc gtccacctcg 11700
aagctaccta ctcacaccca ccccgcgcgg ggtaaataag gcactaatcc cagctgagag 11760
ctggcgtagc acttagccac aagttaatta acagttgtct ggtagtttgg cggtattagg 11820
aagatcctag aagcaaggca gagttagttc taacctaaag ccacaaataa gacaggttgc 11880
caaagcccgc cggaaattaa atcttgctca gttcggtaac ggagtttccc tcccgcgtac 11940
ttaattccca ataagaaacg cgcccaagtc ctatcaggca aaattcagcc ccttcccgtg 12000
ttagaacgag ggtaaaaata caagccgatt gaacaagggt tgggggcttc aaatcgtcgt 12060
ttaccccact ttacaacgga gattaagtag ttcaccctat agtacgaagc agaactattt 12120
cgaggggcgt gcaataatcg aatcttctgc ggttgactta acacgctagg gacgtgccct 12180
cgattcaatc gaaggtactc ctactcagac tgcctcacac ccagctagtc actgagcgat 12240
aaaattgacc cgccctctag ggaagcgagt acgtcccaaa gggctccgga cagggctata 12300
taggagagtt tgatctcgcc ccgacaactg caaccctcaa ctcccttaga taatattgtt 12360
agccgaagtt gcacgacccg ccgtccacgg actgctctta gggtgtggct ccttaatctg 12420
acaacgtgca acccctatcg aagtcgattg tttctgcgaa aggtgttgtc ctaatagtcc 12480
cgaaatttgg cccttgtagg tgtgaaacca cttagcttcg cgccgtagtc ctaaaggccc 12540
acctattgac tttgtttcgg gtagcactag gaatcttaac aatttgaatt tggacgtgga 12600
acgcgtacac cttaatctcc gaataattct agggatttgg aagtcctcta cgttgacaca 12660
cctacactgc tcgaagtaaa tatacgaata acgcgggcct cgcggagccg ttccgaatcg 12720
tcacgtgttc gtttactgtt aattggtggc aaataagcaa tatcgtagtc cgtcaggccc 12780
agccctgtta tccacggcgt tatttgtcaa attgcgtaga actggattga ctgcctgaca 12840
atacctaatt atcggtacga a 12861
Claims (50)
- 원위치에서 천연 발생 박테리아를 변형시키는 방법으로서,
DNA 서열에 이중 가닥 파괴의 도입없이 원위치에서 천연 발생 박테리아의 DNA 서열을 유전자 변형시키는 단계를 포함하고,
상기 유전자 변형은 박테리아의 사멸을 초래하지 않는 것인, 변형 방법. - 제1항에 있어서, 상기 천연 발생 박테리아를 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 변형 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 천연 발생 박테리아를 전달 비히클 내부에 위치하는 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 변형 방법.
- 제3항에 있어서, 전달 비히클 내부에 위치하는 상기 벡터는 파지미드인 변형 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 천연 발생 박테리아를 패키징된 파지미드로 형질도입시키는 단계를 포함하는 것인 변형 방법.
- 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 파지미드는 dCas9 (dead-Cas9) 또는 nCas9 (닉카제 Cas9)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 변형 방법.
- 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 파지미드는 dCas9 및 디아미나제 도메인, 또는 nCas9 및 디아미나제 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 변형 방법.
- 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 파지미드는 dCas9 및 역전사효소 도메인, 또는 nCas9 및 역전사효소 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 변형 방법.
- 제2항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 벡터 또는 파지미드는 표적화된 천연 발생 박테리아에서 불활성이지만, 도너 박테리아 세포에서 활성인 조건적 복제 기원을 더 포함하는 것인 변형 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 조건적 복제 기원은 이의 복제가 소정 단백질, 펩티드, 핵산, RNA, 분자 또는 이의 임의 조합의 존재에 의존하는 것인 복제 기원인 변형 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 조건적 복제 기원은 상기 도너 박테리아 세포가 상기 소정 단백질, 펩티드, 핵산, RNA, 분자 또는 이의 임의 조합을 발현하기 때문에 상기 도너 박테리아 세포에서 활성인 변형 방법.
- 제9항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 조건적 복제 기원은 파지-유도성 염색체 섬 (PICI)으로부터 유래되는 복제 기원인 변형 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 조건적 복제 기원은 상기 도너 박테리아 세포가 rep 단백질, 특히 프리마제-헬리카제를 발현하기 때문에 상기 도너 박테리아 세포에서 활성인 변형 방법.
- 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 조건적 복제 기원은 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli) 균주 CFT073의 PICI로부터의 복제 기원으로부터 유래되는 것인 변형 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 조건적 복제 기원은 SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 8 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지는 것인 변형 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 유전자 변형은 점 돌연변이인 변형 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 유전자 변형은 유전자 파괴를 초래하는 점 돌연변이인 변형 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 유전자 변형을 갖는 박테리아는 유전자 변형이 없는 동일 박테리아와 비교하여 감소된 생체내 성장률을 갖지 않는 것인 변형 방법.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 유전자 변형은 박테리아 독소 유전자에 존재하는 것인 변형 방법.
- 제19항에 있어서, 단일-아미노산 돌연변이 및 콜리박틴 독소의 유전독성 활성의 불활성화를 일으키지만, 길항적 활성은 유지하는 pks+ 이. 콜라이의 ClbP 유전자의 유전자 변형을 포함하는 것인 변형 방법.
- 제20항에 있어서, ClbP 유전자의 S95 또는 K98에 유전자 변형을 포함하는 것인 변형 방법.
- 제21항에 있어서, S95A, S95R 또는 K98T의 유전자 변형을 포함하는 것인 변형 방법.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 유전자 변형은 박테로이데스 파에시스 (Bacteroides faecis) 또는 박테로이데스 세타이오타오미크론 (Bacteroides thetaiotaomicron) 베타-갈락토시다제 유전자에 존재하는 것인 변형 방법.
- 제16항에 있어서, 유전자 변형을 갖는 박테로이데스 파에시스 또는 박테로이데스 세타이오타오미크론 베타-갈락토시다제 단백질은 유전자 변형이 없는 박테로이데스 파에시스 또는 박테로이데스 세타이오타오미크론 베타-갈락토시다제 단백질과 비교하여 인간 MYH6 심장 펩티드와 더 낮은 상동성을 보이는 것인 변형 방법.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 유전자 변형은 프로피오니박테리움 프로피오니쿰 (Propionibacterium propionicum) Ro60 오솔로그에 존재하는 것인 변형 방법.
- 제25항에 있어서, 유전자 변형은 인간 면역계에 의한 더 약하거나 또는 전무한 인식을 초래하는 적어도 하나의 프로피오니박테리움 프로피오니쿰 Ro60 오솔로그 에피토프에 존재하는 것인 변형 방법.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 하나의 항에 있어서, 인간에서 원위치에서 천연 발생 박테리아의 적어도 하나의 유전자를 유전자 변형시키는 단계를 포함하는 것인 변형 방법.
- 원위치에서 천연 발생 박테리아를 유전자 변형시켜서 숙주 - 마이크로바이옴 상호작용을 조절하는 방법으로서, 상기 천연 발생 박테리아는 마이크로바이옴 연관된 장애 또는 질환에 관여하고,
DNA 서열에 이중 가닥 파괴의 도입없이 원위치에서 천연 발생 박테리아에서 마이크로바이옴 연관된 장애 또는 질환의 원인이 되는 DNA 서열을 유전자 변형시키는 단계를 포함하고,
상기 유전자 변형은 마이크로바이옴 연관된 장애 또는 질환의 효과를 감소시키고,
상기 유전자 변형은 박테리아의 사멸을 초래하지 않는 것인 조절 방법. - 제28항에 있어서, 유전자 변형을 갖는 박테리아는 유전자 변형이 없는 동일 박테리아와 비교하여 감소된 생체내 성장률을 갖지 않는 것인 조절 방법.
- 숙주 마이크로바이옴의 박테리아 개체군의 면역원성 프로파일을 변형시켜서 취약 숙주에서 자가-면역 질환/반응의 과정 중에 예방하거나 또는 중재하는 방법으로서,
박테리아 개체군을 DNA 서열에 이중 가닥 파괴의 도입없이 상기 개체군의 박테리아의 적어도 일부에서 박테리아에 의해 발현 또는 분비되는 면역원성 성분을 코딩하는 DNA 서열에 유전자 변형을 생성시키는 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하고,
면역원성 성분을 코딩하는 유전자의 유전자 변형은 이의 면역원성 성분의 상실을 일으키고;
유전자 변형은 박테리아의 직접 사멸을 초래하지 않는 것인 예방 또는 중재 방법. - 제30항에 있어서, 유전자 변형을 갖는 박테리아는 유전자 변형이 없는 동일 박테리아와 비교하여 감소된 생체내 성장률을 갖지 않는 것인 예방 또는 중재 방법.
- 제30항에 있어서, 상기 박테리아를 상기 박테리아의 게놈을 변형시키는 효소를 코딩하는 파지미드와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 예방 또는 중재 방법.
- 제30항에 있어서, 상기 박테리아를 염기-편집자인 효소를 코딩하는 파지미드와 접촉시키는 단계를 포함하는 예방 또는 중재 방법.
- 제30항에 있어서, 상기 박테리아를 프라임-편집자인 효소를 코딩하는 파지미드와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 예방 또는 중재 방법.
- 제28항 또는 제30항에 있어서, 유전자 변형은 모방 펩티드의 아미노산의 변화를 일으키고 모방 펩티드를 면역원성이 아니고/아니거나 면역계에 의해 인식되지 않게 만드는 점 돌연변이인 예방 또는 중재 방법.
- 제28항에 있어서, 유전자 변형은 박테리아 막 상에서 당 프로파일의 변화를 일으키는 것인 예방 또는 중재 방법.
- 제28항에 있어서, 유전자 변형은 단백질 서열의 아미노산의 변화를 일으켜서, 박테리아 막 상에서 당 프로파일의 변화를 일으키는 것인 예방 또는 중재 방법.
- 제28항에 있어서, 유전자 변형은 박테리아 막 상에서 지질 프로파일의 변화를 일으키는 것인 예방 또는 중재 방법.
- 제28항에 있어서, 유전자 변형은 단백질 서열의 아미노산의 변화를 일으켜서, 박테리아 막 상에서 지질 프로파일의 변화를 일으키는 것인 예방 또는 중재 방법.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 하나의 항에 있어서, 유전자 변형은 촉매 부위를 불활성으로 만드는 것인 방법.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 하나의 항에 있어서, 유전자 변형은 인간 세포 수용체와의 결합 부위를 비기능성으로 만드는 것인 방법.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 하나의 항에 있어서, 유전자 변형은 박테리아를 인간 면역 세포에 의한 검출에 더 민감성이게 만드는 것인 방법.
- 박테리아에서 유전자 변형에 대해 스크리닝하기 위한 방법으로서,
● DNA 서열에 이중 가닥 파괴의 도입없이 천연 발생 박테리아의 유전자의 관심 DNA 서열의 적어도 하나의 염기를 유전자 변형하도록 디자인된 벡터를 대상체에게 투여하는 단계,
● 후속하여 대상체로부터 박테리아 샘플을 수집하는 단계, 및
● 상기 박테리아 샘플 중 관심 DNA 서열의 상기 적어도 하나의 염기에 유전자 변형을 함유하는 박테리아의 수준을 정량하는 단계
를 포함하는 것인 스크리닝 방법. - 제43항에 있어서, 관심 DNA 서열의 상기 적어도 하나의 염기에 유전자 변형을 함유하지 않는 박테리아의 수준을 정량하는 단계를 더 포함하는 것인 스크리닝 방법.
- 원위치에서 유전자 돌연변이를 유도하는 벡터의 효율을 결정하기 위한 방법으로서,
● DNA 서열에 이중 가닥 파괴의 도입없이 천연 발생 박테리아의 유전자의 관심 DNA 서열의 적어도 하나의 염기를 유전자 변형시키도록 디자인된 벡터를 대상체에게 투여하는 단계,
● 후속하여 대상체로부터 박테리아 샘플을 수집하는 단계,
● 상기 박테리아 샘플 중 관심 DNA 서열의 상기 적어도 하나의 염기에 유전자 변형을 함유하는 박테리아의 수준을 정량하고, 관심 DNA 서열의 상기 적어도 하나의 염기에 유전자 변형을 함유하지 않는 박테리아의 수준을 정량하는 단계
를 포함하는 결정 방법. - 박테리아 성장에 대한 유전자 돌연변이의 효과를 결정하기 위한 방법으로서,
● DNA 서열에 이중 가닥 파괴의 도입없이, 천연 발생 박테리아의 유전자의 관심 DNA 서열의 적어도 하나의 염기를 유전자 변형시키도록 디자인된 벡터를 대상체에게 투여하는 단계,
● 후속하여 대상체로부터 적어도 2회 순차적 박테리아 샘플을 수집하는 단계,
● 상기 박테리아 샘플 중 관심 DNA 서열의 상기 적어도 하나의 염기에 유전자 변형을 함유하는 박테리아의 수준을 정량하고, 관심 DNA 서열의 상기 적어도 하나의 염기에 유전자 변형을 함유하지 않는 박테리아의 수준을 정량하는 단계
를 포함하는 결정 방법. - 제43항 내지 제46항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단일-아미노산 돌연변이 및 콜리박틴 독소의 유전독성 활성의 불활성화를 일으키지만, 길항적 활성은 유지하는, pks+ 이. 콜라이의 ClbP 유전자의 유전자 변형을 포함하는 것인 방법.
- 혼합된 박테리아 개체군 중 표적 박테리아의 형질도입을 위한 유전자 편집 효소/시스템을 코딩하는 핵산을 포함하는, 원위치에서 천연 발생 박테리아를 변형시키기 위한 조작된 박테리오파지로서, 상기 유전자 편집 효소/시스템은 DNA 서열에 이중 가닥 파괴의 도입없이 상기 표적 박테리아의 게놈을 변형시키지만, 표적 박테리아의 사멸을 초래하지 않는 것인 조작된 박테리오파지.
- 제48항에 있어서, 질환 또는 장애를 치료하는데 사용하기 위한 것이고, 유전자 편집 효소/시스템은 상기 질환 또는 장애에 직접적으로 또는 간접적으로 원인이 되는 단백질을 코딩하는 표적 박테리아 내 유전자를 표적으로 하는 것인 조작된 박테리오파지.
- 숙주 마이크로바이옴의 박테리아 개체군에 의해 발현되는 적어도 하나의 약물-표적화 효소를 변형시켜서, 소정 약물로 치료된 숙주에서 소정 약물의 물질대사를 변형시키는 방법으로서,
박테리아 개체군을 DNA 서열에 이중 가닥 파괴의 도입없이 상기 개체군의 박테리아의 적어도 일부에서 박테리아에 의해 발현 또는 분비되는 약물-표적화 효소를 코딩하는 DNA 서열에 유전자 변형을 생성시키는 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하고,
약물-표적화 효소를 코딩하는 DNA 서열의 유전자 변형은 숙주에서 약물 물질대사의 변형을 일으키고,
유전자 변형은 박테리아의 직접 사멸을 초래하지 않는 것인 변형 방법.
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