KR20210141999A - Dna-결합 리프레서를 사용한 원핵생물 세포의 전사 제어 - Google Patents

Dna-결합 리프레서를 사용한 원핵생물 세포의 전사 제어 Download PDF

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Abstract

본 개시는 일반적으로 유전자 회로를 하나의 원핵생물 세포 ("도너 세포")로부터 다른 원핵생물 세포 (본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 "수령체 세포" 또는 "표적 세포")로 전달하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 보다 특히, 본 개시는 (i) 관심 유전자 회로 및 (ii) 하나 이상의 발현된 전사 리프레서 단백질을 포함하는 원핵생물 도너 세포 및 원핵생물 수령체 세포로 유전자 회로의 효율적인 전달에서 상기 도너 세포의 용도에 관한 것이다. 유전자 회로는 관심 RNA 분자 또는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.

Description

DNA-결합 리프레서를 사용한 원핵생물 세포의 전사 제어
본 개시는 일반적으로 하나의 원핵생물 세포 ("도너 세포")에서 다른 원핵생물 세포 (본 명세서에서 상호교환가능하게 사용되는 "수령체 세포" 또는 "표적 세포")로 유전자 회로를 전달하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
소정 프로모터로부터 전사를 제어하는 유도성 시스템은 분자 생물학에서 유용한 도구이다 [1]-[3]. 일반적으로, 이들 시스템은 이의 동족 DNA 오퍼레이터에 대한 그의 결합이 유도인자의 존재에 의존적인 단백질 리프레서로 구성된다. 유도인자의 부재 하에서, 리프레서는 이의 오퍼레이터를 인식할 수 있어서, 프로모터로부터의 전사를 방지하고; 유도인자가 존재할 때, 리프레서는 리프레서의 도메인에 유도인자의 결합에 의해서 또는 이의 3D 입체형태를 변화시켜서, 이의 오퍼레이터를 더 이상 인식할 수 없어서, 전사를 활성화시킨다. 유도인자는 화학적 (IPTG, 당류, 소형 분자, 단백질 등) 또는 물리적 (열, 빛, 압력, pH 등)일 수 있다. 전사를 방지하거나 또는 세포에서 만들어지는 단백질의 양을 감소시키는 많은 다른 방식들: 단백질의 조건적 분해, 생산 균주에서 플라스미드 카피수의 감소 등이 존재한다. 이들은 그 자체로 프로모터를 억제하지 않지만 유전자 회로의 다른 성분에 대해 작용한다 [22].
일부 예에서, 숙주에서 특별한 유전자의 전사/번역을 제어하는 한편 유도인자의 부재 하에 표적 박테리아에서 이를 활성화시킬 수 있는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 표적 박테리아에 독성인 단백질 및/또는 핵산, 예컨대 예를 들어 CRISPR-Cas9-함유 회로의 파지미드 형질도입의 경우에 [14], 입자를 생산하는데 사용되는 균주가 회로에 의해 코딩되는 독성 단백질 및/또는 핵산을 발현하지 않을 것이 필요한데: 그렇지 않으면, 생산 균주는 사멸되거나 또는 위태롭게 손상될 수 있다. 그러나, 독성 단백질 및/또는 핵산은 세포 사멸 예컨대 서열-특이적 세포 사멸 또는 표적 균주에서 임의의 다른 유형의 바람직한 기능을 유도하기 위해 표적 균주에서 발현/전사되는 것이 필요하다. 이것은 또한 역시 생산 균주에 대해 독성을 야기할 수 있는, 표적 균주에 주입되는 임의의 다른 독성 성분의 경우에 사실일 것이다. 추가로, 유전자 회로의 성분의 항상적 발현은, 특히 그들이 부담 (예컨대 독성 성분, 또는 생산 균주에서 원치않는 기능을 갖는 임의 성분)을 부과하면, 세포에서 불리하고 그들이 결실 또는 돌연변이되는 경향이 있어서, 디자인 및 성분의 원치않는 파괴를 초래하는 것으로 확인되었다 [15]. 그러한 의미에서, 생산 균주에서만 작용하는 조건적 리프레서가 조작/제작 관점에서 유리하다.
유전자 회로 형질도입의 특별한 경우에 대해 제안된 해법이 제공되었고 양성 조절인자 (파지 중합효소 및 이의 동족 프로모터)가 포함된다. 표적 세포는 프로모터 또는 중합효소만을 함유할 수 있고, 다른 성분은 파지미드에 의해 형질도입된다 [12][13]. 그러나, 이것은 성분 중 하나를 형질도입시키는 어려움때문에, 야생형 균주를 사용하거나, 또는 회로 성분 중 하나를 표적 세포에 사전 로딩하는 것이 불가능한 환경 (예를 들어, 소화관 환경)에서 작업할 때 실질적인 접근법이 안된다.
이에 대한 다른 가능한 해법은 트랜스로 독성 성분의 발현을 제어하는, 즉 패키징되는 회로에서 코딩되지 않는 리프레서를 발현하는 것이다. 이러한 경우에, 리프레서는 표적 균주가 아닌 생산 균주에서만 존재하게 된다. 그러나, 이러한 접근법과 연관된 주요 문제가 존재하는데, 파지미드를 생산하는데 사용되는 균주는 표적화가 필요한 것과 동일한 (또는 적어도 매우 밀접하게 연관된) 종이므로, 사용되는 리프레서를 신중하게 선택할 필요가 있다. 예를 들어, AraC 또는 LacI의 사용은 트랜스로 생산 균주에서 독성 성분의 전사를 효과적으로 억제하고, 이러한 방식으로 생산된 파지미드는 "나형" 항상성 프로모터를 표적 균주에 주입하게 된다. 그러나, 이들이 야생형 균주이면, 그들은 아마도 LacI 또는 AraC에 대한 그들 자신의 유전자를 함유할 것이므로, 주입된 프로모터는 즉시 억제될 것이다. 심지어 항생제-유도된 시스템, 예컨대 TetR도 많은 야생형 균주에 매우 흔하게 존재한다. 파지 마스터-리프레서-프로모터 쌍을 사용할 때도 동일하게 발생될 수 있는데, 야생형 균주는 그들 게놈에 다수의 프로파지를 보유하고, 이들 중 많은 것들이 사용되는 프로모터를 인식하는 리프레서를 코딩할 수 있다.
본 명세서는 원핵생물 세포 (본 명세서에서 "도너 세포"라고함)로부터 다른 원핵생물 세포 (본 명세서에서 "수령체 세포" 또는 "표적 세포"라고 함)로 관심 유전자 회로를 전달하는데 사용을 위한 신규한 방법 및 조성물을 기술한다. 일정 양태에서, 원핵생물 세포는 박테리아 세포이다. 또한, 유전자 회로는 리프레서 결합 서열 (본 명세서에서 또한 프로모터/오퍼레이터라고 함)의 전사 제어 하에 있는 관심 핵산을 포함한다. 상기 관심 핵산 서열은 관심 단백질 또는 RNA를 코딩할 수 있다.
개시된 방법 및 조성물은 도너 세포에서 하나 이상의 리프레서 서열의 발현, 및 도너 세포에 존재할 때 관심 핵산 서열의 전사를 억제하는 기능을 하는 유전자 회로 내에 위치하는 리프레서 결합 서열의 존재를 기반으로 한다. 유전자 회로는 상기 하나 이상의 리프레서 단백질을 코딩하지 않는다. 따라서, 수령체 세포로 유전자 회로의 전달 시에, 상기 수령체 세포는 상기 하나 이상의 리프레서 단백질의 발현의 이의 결여에 대해 선택되고, 이어서 관심 핵산 서열이 전사된다.
도너 세포로부터 수령체 또는 표적 세포로 유전자 회로의 전달을 위한 방법이 제공된다. 상기 전달은 다양한 상이한 방법으로 획득될 수 있다. 예컨대 전달의 비제한적인 예는 박테리아 형질도입, 접합, 및 형질전환을 포함한다. 일 특정 양태에서, 박테리아 전달 비히클, 예컨대 박테리오파지 스캐폴드는 수령체 또는 표적 세포로 유전자 회로의 효율적인 전달을 위한 수단으로서 도너 세포에서 조립된다. 이러한 예에서, 도너 세포는 박테리오파지 입자로 유전자 회로의 조립을 위해 필요한, 캡시드 단백질같은, 박테리오파지 성분을 트랜스로 제공하는 프로파지 서열을 포함한다. 또한, 유전자 회로는 캡시드로 유전자 회로의 캡시드화를 매개하는 시스 작용성 패키징 신호를 함유하도록 조작된다.
따라서, 본 발명은 표적 세포로 유전자 회로의 전달을 허용하기에 충분한 시간량 동안 표적 세포와 도너 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 도너 세포로부터 표적 세포로 유전자 회로를 전달하는 방법에 관한 것이고, 상기 도너 세포는 유전자 회로에 의해 코딩되지 않고 표적 세포에 부재하는 리프레서 단백질을 발현하고, 유전자 회로는 리프레서 결합 서열의 전사 제어 하에 관심 핵산 서열을 포함한다. 도너 세포는 박테리아 도너 세포일 수 있고 표적 세포는 박테리아 표적 세포일 수 있다. 유전자 회로는 전달 이전에 박테리아 전달 비히클 내에 패키징될 수 있다. 바람직하게, 전달 비히클에 패키징되는 유전자 회로는 패키징된 파지미드이다. 관심 핵산 서열은 관심 단백질 및/또는 관심 RNA 분자를 코딩할 수 있다. 특히, 관심 핵산 서열은 (i) 독성 단백질로서, 바람직하게 박테리아 세포, 특히 표적 세포에 독성인 단백질, 보다 특히 홀린, 엔도리신, 제한 효소 및 표적 세포의 생존 또는 성장에 영향을 미치는 독소로 이루어진 군으로부터 선택되는 독성 단백질, (ii) 뉴클레아제, 바람직하게 CRISPR 뉴클레아제, 및/또는 치료 단백질인, 단백질을 코딩할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 관심 핵산 서열은 특히 mRNA, crRNA, tRNA, iRNA, asRNA, 리보자임 RNA, 가이드 RNA 및 RNA 압타머로 이루어진 군으로부터 선택되는, 관심 RNA 분자를 코딩할 수 있다. 특정 구현예에서, 관심 핵산 서열은 CRISPR 뉴클레아제를 코딩하고 유전자 회로는 가이드 RNA를 코딩하는 핵산 서열을 더 포함하고, 바람직하게 상기 가이드 RNA를 코딩하는 핵산 서열은 항상성 프로모터의 전사 제어 하에 있다. 일부 구현예에서, 관심 핵산 서열은 RNA 예컨대 mRNA, crRNA, tRNA, iRNA (간섭 RNA), asRNA (안티-센스 RNA), 리보자임 RNA, RNA 압타머 또는 가이드 RNA을 코딩하는 핵산, CRISPR 유전자좌, 독소 유전자, 효소 예컨대 뉴클레아제 또는 키나제를 코딩하는 유전자, Cas 뉴클레아제, Cas9 뉴클레아제, TALEN, ZFN 및 메가뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레아제를 코딩하는 유전자, 리콤비나제, 박테리아 수용체, 막 단백질, 구조 단백질 또는 분비 단백질을 코딩하는 유전자, 항생제 또는 일반 약물에 대한 내성을 코딩하는 유전자, 독성 단백질 또는 독성 인자를 코딩하는 유전자, 및 병독성 단백질 또는 병독성 인자를 코딩하는 유전자, 또는 임의의 그들 조합이다. 보다 특히, 관심 핵산 서열은 하기 중 하나 이상을 코딩하는 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다: Cas 뉴클레아제, Cas9 뉴클레아제, 가이드 RNA, CRISPR 유전자좌, 독소, 효소, 뉴클레아제, 키나제, TALEN, ZFN, 메가뉴클레아제, 리콤비나제, 박테리아 수용체, 막 단백질, 구조 단백질, 분비 단백질, 항생제 또는 약물 내성 부여 단백질, 독성 단백질 또는 독성 인자, 병독성 단백질, 및 병독성 인자. 바람직하게, 리프레서 단백질은 표 1에 열거된 리프레서 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게 PhlF, SrpR, LitR, PsrA, AmeR, McbR, QacR, TarA, ButR, Orf2 및 ScbR로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또한 예를 들어, 수령체 또는 표적 세포로 바람직한 유전자 회로의 효율적인 전달에서 사용을 위한, 박테리아 전달 비히클, 패키징된 파지미드의 생산을 위한 방법이 제공된다. 본 개시는 관심 박테리아 전달 비히클의 생산 동안, 관심 핵산, 예컨대 독성 또는 원치않는 단백질 및/또는 RNA 분자를 코딩하는 핵산의 제어된 발현을 위한 하나 이상의 리프레서 단백질을 발현하는, 본 명세서에 기술된 바와 같은 도너 세포의 용도에 관한 것이다. 도너 세포에서 관심 핵산의 억제된 전사는 관심 핵산에 밀접하게 근접하는 리프레서 결합 서열의 기능적 위치화에 기인할 수 있다. 대안적으로, 도너 세포에서 관심 핵산의 억제된 전사는 관심 핵산으로부터 떨어진 곳에서 리프레서 결합 서열의 기능적 위치화에 기인할 수 있다. 대조적으로, 수령체 또는 표적 세포로 전달되면, 관심 핵산은 상기 세포에서 상기 하나 이상의 리프레서 단백질의 부재 및 유전자 회로 내에서 상기 리프레서 단백질(들)을 코딩하는 핵산 서열(들)의 부재에 기인하여 전사된다.
일 양태에서, 본 발명의 도너 세포를 사용하여 전달 비히클을 제조하는 방법이 제조된다. 일정 구현예에서, 전달 비히클은 전달 비히클의 형성을 허용하는 조건 하에서 도너 세포로 본 명세서에 기술된 관심 유전자 회로를 도입시키는 단계를 통해서 제조된다. 예를 들어, 일정 구현예에서, 방법은 (i) 도너 세포로 관심 유전자 회로를 도입시키는 단계; 및 (ii) 관심 유전자 회로의 복제 및 전달 비히클로 유전자 회로의 패키징을 위한 충분한 시간량을 허용하는 단계를 포함한다. 일 양태에서, 방법은 전달 비히클을 수집하는 단계, 및 임의로 전달 비히클을 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다. 특히, 본 발명은 i) 리프레서 단백질을 발현하는 도너 세포로 유전자 회로를 도입시키는 단계로서, 상기 유전자 회로는 상기 리프레서 단백질에 의해 인식되는 리프레서 결합 서열의 전사 제어 하에 있는 관심 핵산을 포함하고, 리프레서 단백질은 유전자 회로에 의해 코딩되지 않는 것인 단계; 및 관심 유전자 회로의 복제 및 전달 비히클로 유전자 회로의 패키징을 위한 충분한 시간량을 허용하는 단계를 포함하는, 전달 비히클을 제조하는 방법에 관한 것이다. 방법은 전달 비히클을 수집하는 단계 및 임의로 전달 비히클을 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 방법에서, 도너 세포, 바람직하게 박테리아 도너 세포는 전달 비히클로 유전자 회로의 조립을 위해 트랜스로 요구되는 단백질을 코딩하는 프로파지 서열을 포함한다. 바람직하게, 유전자 회로는 파지미드이고/이거나 전달 비히클은 박테리아 전달 비히클, 보다 바람직하게 박테리오파지이다. 특히, 전달 비히클은 리프레서 단백질을 발현하지 않는, 표적 세포, 바람직하게 박테리아 표적 세포에서 사용하기 위한 것일 수 있다. 본 발명은 또한 상기 방법으로 수득된 전달 비히클에 관한 것이다. 본 발명은 또한 리프레서 단백질에 의해 제어되는 전사 프로모터 및 상기 전사 프로모터의 제어 하에 위치하는 관심 핵산 서열을 포함하는 유전자 회로에 관한 것으로서, 상기 유전자 회로는 리프레서 단백질을 코딩하지 않고 박테리아 전달 비히클 내에 패키징된다. 바람직하게 상기 유전자 회로는 파지미드이다. 또한 도너 세포로부터 표적 세포로 유전자 회로를 전달하기 위한 전달 비히클 또는 유전자 회로의 용도에 관한 것으로서, 도너 세포는 리프레서 단백질을 발현하고 표적 세포는 상기 리프레서 단백질을 발현하지 않는다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 발현된 리프레서 단백질 및 관심 유전자 회로를 포함하는 도너 세포를 제공한다. 바람직하게, 관심 유전자 회로는 하나 이상의 발현된 리프레서 단백질에 의해 인식되는 리프레서 결합 서열의 전사 제어 하에 위치하는 관심 핵산 서열을 포함한다. 또한, 일정 구현예에서 전달 비히클이 생산되는 경우에, 도너 세포는 또한 전달 비히클로 관심 유전자 회로의 조립을 위해 트랜스로 요구되는 단백질을 코딩하는 프로파지 서열을 포함할 수 있다. 이러한 단백질은 예를 들어, 구조 박테리오파지 단백질, 예를 들어, 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 특정 양태에서, 본 발명은 상기 도너 세포에 의해 발현되지만 유전자 회로에 의해 코딩되지 않는 리프레서 단백질에 의해 제어되는 전사 프로모터를 포함하는 유전자 회로를 포함하는 도너 세포에 관한 것이다. 바람직하게 유전자 회로는 전사 프로모터의 제어 하에 위치하는 관심 핵산 서열을 포함한다. 도너 세포는 박테리오파지 입자로 유전자 회로의 조립을 위해 요구되는 박테리오파지 성분을 트랜스로 제공하는 프로파지 서열을 더 포함할 수 있다. 유전자 회로는 캡시드로 유전자 회로의 캡시드화를 매개하는 시스 작용성 패키징 신호를 더 포함할 수 있다.
본 개시의 도너 세포는 관심 유전자 회로를 포함한다. 본 발명의 일정 구현예에서, 유전자 회로는 리프레서 결합 서열의 전사 제어 하에 관심 핵산을 갖는 발현 또는 전사 카세트를 포함한다. 이러한 관심 핵산은 예를 들어, RNA 예컨대 mRNA, crRNA, tRNA, iRNA (간섭 RNA), asRNA (안티-센스 RNA), 리보자임 RNA, RNA 압타머 또는 가이드 RNA를 코딩하는 핵산, CRISPR 유전자좌, 독소 유전자, 효소 예컨대 뉴클레아제 또는 키나제를 코딩하는 유전자, Cas 뉴클레아제, Cas9 뉴클레아제, TALEN, ZFN 및 메가뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레아제를 코딩하는 유전자, 리콤비나제, 박테리아 수용체, 막 단백질, 구조 단백질 또는 분비 단백질을 코딩하는 유전자, 항생제 또는 일반 약물에 대한 내성을 코딩하는 유전자, 독성 단백질 또는 독성 인자를 코딩하는 유전자, 및 병독성 단백질 또는 병독성 인자를 코딩하는 유전자, 또는 임의의 그들 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 일 구현예에서, 관심 핵산은 치료 단백질을 코딩한다. 다른 구현예에서, 핵산은 안티-센스 핵산 분자를 코딩한다. 일부 구현예에서, 관심 핵산은 둘 이상의 관심 분자를 코딩한다. 특히, 이들 분자 중 하나는 뉴클레아제, 예를 들어, Cas 뉴클레아제일 수 있고, 다른 것은 핵산 분자 예컨대 가이드 RNA일 수 있다. 일 양태에서, 관심 핵산은 수령체 또는 표적 세포 게놈 또는 수령체 또는 표적 세포 플라스미드의 절단을 수행하는 뉴클레아제를 코딩한다. 일부 양태에서, 절단은 항생제 내성 유전자에서 발생된다. 본 발명의 다른 구현예에서, 관심 핵산은 수령체 또는 표적 세포 게놈의 절단을 표적화하는 뉴클레아제를 코딩하고, 상기 뉴클레아제는 세포의 게놈으로 관심 핵산의 삽입을 위해 상동성 재조합 사건을 자극하도록 디자인된다.
바람직하게, 본 발명의 방법 또는 본 발명의 도너 세포에서, 유전자 회로는 파지미드이고/이거나, 도너 세포는 박테리아 세포, 보다 바람직하게 이. 콜라이 (E.coli) 종 유래의 박테리아 세포이다.
본 개시는 또한 도너 세포, 또는 상기 도너 세포에서 조립된 하나 이상의 박테리아 전달 비히클, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 또는 수의학 조성물을 제공한다. 또한 본 발명의 전달 비히클 및/또는 유전자 회로, 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 또는 수의학 조성물을 제공한다. 또한 박테리아, 바람직하게 박테리아 감염으로 초래되는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 방법을 제공하고, 방법은 치료를 필요로 하는 상기 질환 또는 장애를 갖는 대상체에게 제공된 약학 또는 수의학 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 또한, (i) 특히 박테리아, 바람직하게 박테리아 감염으로 초래된 질환 또는 장애의 치료에서, 약물로서 사용을 위한 본 명세서에 개시된 바와 같은 약학 또는 수의학 조성물, 및 (ii) 박테리아, 바람직하게 박테리아 감염에 의해 초래된 질환 또는 장애를 치료하기 위한 약물의 제조를 위한 본 명세서에 개시된 바와 같은 약학 또는 수의학 조성물의 용도를 제공한다. 특히 박테리아 감염을 갖는 대상체에서, 박테리아 개체군 중 병독성 및/또는 항생제 내성 박테리아의 양을 감소시키기 위한 방법이 제공되고, 방법은 본 명세서에 개시된 조성물과 박테리아 개체군을 접촉시키는 단계를 포함한다. 또한, 특히 박테리아 감염을 갖는 대상체에서, 박테리아 개체군 중 병독성 및/또는 항생제 내성 박테리아의 양을 감소시키기 위한 약물의 제조를 위한 본 명세서에 개시된 바와 같은 약학 또는 수의학 조성물의 용도를 제공한다.
본 개시는 도너 세포로부터 수령체 또는 표적 세포로 관심 유전자 회로의 전달에서 사용을 위한 키트가 또한 제공된다. 일 구현예에서, 키트는 (i) 리프레서 단백질을 발현하는 도너 세포; 및 (ii) 관심 유전자 회로를 포함한다. 상기 유전자 회로는 상기 리프레서 단백질에 의해 인식되는 리프레서 결합 서열에 기능적 근접성으로 삽입될 수 있는 발현 카세트를 포함할 수 있다. 임의로, 키트의 도너 세포는 전달 비히클의 조립을 위한 프로파지 서열, 예를 들어, 관심 유전자 회로의 패키징을 위한 박테리오파지 단백질을 함유할 수 있다. 키트는 수령체 또는 표적 세포를 더 포함할 수 있고, 상기 수령체 또는 표적 세포는 리프레서 단백질을 발현하는데 실패하여서, 상기 세포로 전달 이후에 관심 핵산의 발현을 허용한다.
본 명세서에 개시된 대상 주제를 더욱 잘 이해하고 이를 실제로 수행할 수 있는 방법을 예시하기 위해서, 첨부된 도면을 참조하여, 비제한적인 예로서, 구현예들을 이제 설명할 것이다. 도면을 특별히 참조하여, 도시된 상세 사항은 본 발명의 구현예의 예시적인 설명의 목적을 위한 것이고 예시라는 것을 강조한다.
도 1 은 종간 리프레서에 의한 조건적 전사 제어를 도시한다. 좌측은, 패키징 프로파지 및 트랜스의 PhlF 리프레서를 함유하는 도너 균주이다. 유전자 회로는 PphlF 프로모터의 제어 하에 있는 관심 핵산 (액츄에이터 단백질을 코딩) 및 패키징 신호를 보유한다. 유전자 회로의 패키징 시에, 표적 또는 수령체 세포가 형질도입될 수 있고, PphlF 프로모터는 수령체 세포가 PhlF 리프레서 (이. 콜라이에는 존재하지 않음)가 결여되어 있으므로 활성화될 것이다. PhlF 리프레서는 프로모터 표적화 dCas9 + gRNA, RBS 또는 액츄에이터의 서열로 대체될 수 있다는 것을 유의한데.
도 2 는 Cas9-함유 유전자 회로의 형질도입을 도시한다. PphlF 프로모터 제어 하의 Cas9 및 lacZ 표적화 항상성 sgRNA 가이드를 함유하는 플라스미드로 MG1655 (좌측 패널) 또는 MG1656 (우측 패널)을 형질전환시켰다. 빈 세포 (임의의 다른 플라스미드를 보유하지 않음)는 상단에 도시되고; PhlF 리프레서를 코딩하는 여분의 플라스미드를 함유하는 형질전환된 세포는 하단에 도시된다.
도 3 은 Cas9-함유 유전자 회로의 형질도입을 도시한다. PphlF 프로모터 제어 하의 Cas9 및 lacZ 표적화 항상성 sgRNA 가이드를 함유하는 파지미드는 MG1655 (좌측 패널), 플라스미드에서 코딩되는 PhlF 리프레서를 갖는 MG1655 (가운데) 또는 MG1656 (우측 패널)에 형질도입되었다.
도 4 는 Cpf1-함유 유전자 회로의 형질전환을 도시한다. PsrpR 프로모터 제어 하의 Cpf1 및 lacZ 표적화 항상성 crRNA 가이드 (p455)를 함유하는 플라스미드로 MG1655 (좌측 패널) 또는 MG1656 (우측 패널)을 형질전환시켰다. 빈 세포 (임의의 다른 플라스미드를 보유하지 않음)는 상단 줄에 도시되고, SrpR 리프레서를 코딩하는 여분의 플라스미드 (pRARE4-SrpR-1.0)를 함유하는 형질전환된 세포는 하단에 도시된다.
도 5 는 MG1655 (좌측 패널), 플라스미드 (가운데, pRARE4-SrpR-1.0)에서 코딩되는 SrpR 리프레서를 갖는 MG1655, 또는 MG1656 (우측 패널)에 형질도입된 PsrpR 프로모터 제어 하의 Cpf1 및 lacZ 표적화 항상성 crRNA 가이드 (p455)를 함유하는 패키징된 파지미드를 도시한다. 
도 6 은 SrpR 리프레서가 존재하거나 또는 부재하는 균주의 콜로니 크기의 비교를 도시한다. 양쪽 균주는 PsrpR-Cpf1-LacZ 유전자 회로 (p841)로 형질전환되었다. 상단 패널, 게놈에 SrpR을 함유하는 세포. 하단 패널, SrpR 리프레서가 부재하는 세포. 인큐베이션 시간은 상단에 도시되어 있다.
본 명세서는 수령체 또는 표적화 세포로 유전자 회로의 전달을 위한 신규 접근법을 개시한다. 일 구현예에서, 표적 세포로 바람직한 유전자 회로의 효율적인 전달에서 사용을 위한 박테리아 전달 비히클의 생산을 위한 신규 방법이 제공된다. 본 개시의 방법 및 조성물은 단백질, 예컨대 독성 단백질, 및/또는 핵산, 예컨대 RNA 분자의 제어된 발현을 위해 하나 이상의 리프레서 단백질을 발현하는 도너 세포의 사용을 기반으로 한다. 이것은 유전자 회로가 독성 단백질 및/또는 RNA 분자를 발현하도록 디자인될 때 특히 중요하다.
하나 이상의 리프레서 단백질을 발현하는 도너 세포가 제공된다. 바람직한 구현예에서, 용어 "도너 세포"는 도너 박테리아 세포를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 "리프레서 단백질"은 특별한 부위 (본 명세서에서는 "리프레서 결합 서열") 또는 핵산에 결합하여 근처 유전자의 전사를 방지하는 단백질을 지칭한다. 전형적으로, 리프레서 단백질은 리프레서 결합 서열 (오퍼레이터)에 이의 결합을 통해서 프로모터에 RNA 중합효소의 부착을 차단하여서, 유전자의 전사를 방지하는 DNA-결합 단백질이다. 상기 도너 세포는 하나 이상의 리프레서 단백질을 천연적으로 발현하는 세포일 수 있다. 대안적으로, 도너 세포는 하나 이상의 리프레서 단백질을 발현하도록 재조합적으로 조작될 수 있다. 추가로, 제공된 도너 세포는 관심 유전자 회로를 포함하고, 상기 유전자 회로는 리프레서 결합 서열의 전사 조절 하에 관심 핵산을 함유하고 상기 리프레서 결합 서열에 결합할 수 있는 리프레서 단백질을 코딩하는 핵산을 함유하지 않는다. 도너 세포에 의해 발현되는 적어도 하나의 리프레서 단백질은 상기 리프레서 결합 서열에 결합할 수 있어서, 관심 핵산의 전사를 방지한다. 상기 관심 핵산은 관심 단백질 및/또는 RNA를 코딩할 수 있다.
도너 세포에서 이용할 수 있는 리프레서 단백질은 예를 들어, 표 1에 열거된 것들을 포함한다. 일 구현예에서, 도너 세포는 표 1에 열거된 리프레서 단백질로부터 선택되는 리프레서 단백질을 발현하고 유전자 회로 내에 함유된 관심 핵산은 상기 리프레서 단백질이 결합하는 리프레서 결합 서열의 전사 조절 하에 있다.
표 1
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
이러한 리프레서 단백질에 상응하는 리프레서 결합 서열은 당분야에서 충분히 공지되어 있고 당업자는 리프레서 단백질/리프레서 결합 서열의 기능적 쌍을 쉽게 선택할 수 있을 것이다. 일부 구현예에서, 도너 세포는 유전자 회로에 함유된 하나 또는 몇 개의 리프레서 결합 서열에 상응하는 하나 또는 몇 개의 리프레서 단백질을 발현한다. 유전자 회로 상에 포함된 리프레서 결합 서열(들) 및/또는 도너 세포에 의해 발현되는 리프레서 단백질(들)은 도너 세포에 이종성일 수 있는데, 즉 상기 도너 세포에서 천연적으로 존재하지 않는다. 특히, 유전자 회로 상에 포함되는 리프레서 결합 서열(들) 및/또는 도너 세포에 의해 발현되는 리프레서 단백질(들)은 도너 세포와 상이한 박테리아 종, 바람직하게 상이한 박테리아 종에서 유래될 수 있다. 바람직하게, 유전자 회로 상에 포함되는 리프레서 결합 서열(들) 및/또는 도너 세포에 의해 발현되는 리프레서 단백질(들)은 도너 세포에 내생성이고, 즉, 상기 도너 세포에서 천연적으로 존재한다.
다른 구현예에서, 리프레서 단백질은 뉴클레아제 활성이 없는 CRISPR 뉴클레아제이다. 이러한 구현예에서, 리프레서 단백질은 관심 핵산의 전사에 요구되는 서열을 표적화하는 가이드 RNA와 조합하여 사용된다. 이러한 구현예에서, 따라서, 도너 세포는 또한 리프레서 단백질로서 작용하는 CRISPR 뉴클레아제 이외에도 상기 가이드 RNA를 발현한다. 특히, 가이드 RNA는 제어 서열 예컨대 관심 핵산에 작동적으로 연결된 프로모터, RBS 또는 리프레서 결합 서열을 표적화할 수 있다. 대안적으로, 가이드 RNA는 비 제어 서열 예컨대 관심 핵산의 코딩 영역을 표적화할 수 있다. 이러한 경우에, 상기 비 제어 서열은 리프레서 결합 서열로서 간주되어야 한다. 이러한 가이드 RNA 덕분에, 뉴클레아제 활성이 없는 CRISPR 뉴클레아제는 임의의 파손을 유도하지 않고 표적화된 서열에 결합할 수 있어서, 유전자 회로의 무결성을 변경시키지 않고 관심 핵산의 전사를 방지한다. 뉴클레아제 활성이 없는 CRISPR 뉴클레아제 예컨대 데드 Cas9 (dCas9)는 당업자에게 충분히 공지되어 있다.
리프레서 단백질의 발현 이외에도, 도너 세포는 박테리아 전달 비히클, 예컨대 예를 들어 박테리오파지 스캐폴드의 조립을 위해 필요한 성분을 트랜스로 제공하는 패키징 프로파지를 더 포함할 수 있다. 생산되면, 전달 비히클은 수령체 또는 표적 세포로 관심 유전자 회로를 전달하는데 유리하게 사용될 수 있다. 수령체 또는 표적화 세포에서 리프레서 단백질의 부재는 전달된 관심 유전자 회로의 발현을 일으킨다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유전자 회로 (genetic circuit)"는 바람직하게 전사 프로모터 ("프로모터") 및 리프레서 결합 서열 (도너 세포에 의해 발현되는 적어도 하나의 리프레서 단백질에 의해 인식)을 포함하는 제어 서열에 작동적으로 연결된 하나 이상의 관심 핵산을 포함하는, 핵산 구성체, 바람직하게 선형 또는 원형 이중 가닥 DNA 분자를 지칭한다. 유전자 회로는 전사 프로모터를 포함하는 하나 또는 몇 개의 제어 서열에 작동적으로 연결된 하나 이상의 추가 핵산 서열을 더 포함할 수 있다. 특히, 유전자 회로는 프로모터 및 리프레서 결합 서열 (도너 세포에 의해 발현되는 적어도 하나의 리프레서 단백질에 의해 인식)을 포함하는 제어 서열에 작동적으로 연결된 하나 이상의 관심 핵산, 및 항상성 프로모터에 작동적으로 연결된 하나 이상의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 유전자 회로는 프로모터 및 리프레서 결합 서열 (도너 세포에 의해 발현되는 적어도 하나의 리프레서 단백질에 의해 인식)을 포함하는 제어 서열에 작동적으로 연결된 CRISPR 뉴클레아제를 코딩하는 관심 핵산, 및 항상성 프로모터에 작동적으로 연결된 가이드 RNA를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 용어 "작동적으로 연결된"은 제어 서열이 상기 핵산의 발현을 유도하는 방식으로, 관심 핵산에 대해 적절한 위치에 제어 서열이 위치되는 구성을 의미한다. 임의로, 유전자 회로는 다른 제어 서열 예컨대 리더 서열, 폴리아데닐화 서열, 프로펩티드 서열, 리보자임, 헤어핀-형성 서열, 리보솜 결합 부위, 신호 펩티드 서열 및/또는 전사 종결인자를 포함할 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 유전자 회로는 플라스미드 또는 파지미드로서, 즉, 패키징을 위해 신호전달하는 유전자 서열을 포함한다. 보다 바람직하게, 유전자 회로는 파지미드이다.
일 양태에서, 본 발명의 도너 세포주를 사용하여 전달 비히클을 제조하는 방법이 제공된다. 본 발명에서 사용되는, 용어 "전달 비히클"은 바람직하게 세포로 유전자 회로의 전달을 허용하는 임의 수단을 지칭한다. 바람직하게, 전달 비히클은 박테리아 세포로 유전자 회로의 전달 ("박테리아 전달 비히클")을 허용한다. 일정 구현예에서, 전달 비히클은 전달 비히클의 형성을 허용하는 조건 하에서 적합한 도너 세포로 본 명세서에 기술된 유전자 회로를 도입시켜서 제조된다. 예를 들어, 일정 구현예에서, 방법은 (i) 도너 세포로 관심 유전자 회로를 도입시키는 단계; 및 (ii) 유전자 회로의 복제 및 전달 비히클로 유전자 회로의 패키징을 위한 충분한 시간량을 허용하는 단계를 포함한다. 보다 특히, 전달 비히클을 제조하는 방법은 (i) 상기 정의된 바와 같은 관심 유전자 회로 및 전달 비히클로 유전자 회로의 조립을 위해 트랜스로 요구되는 단백질 (예를 들어, 박테리오파지 스캐폴드화 단백질)을 코딩하는 프로파지 서열를 포함하는, 상기 정의된 바와 같은 도너 세포, 바람직하게 박테리아 도너 세포로 도입시키는 단계; 및 (ii) 유전자 회로의 복제 및 박테리아 전달 비히클로 유전자 회로의 패키징을 위해 충분한 시간량을 허용하는 단계를 포함할 수 있다. 일 양태에서, 방법은 전달 비히클의 수집 단계, 및 임의로 전달 비히클의 정제 단계를 더 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 리프레서 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 리프레서 단백질 발현 카세트를 포함하는 도너 세포를 제공한다. 도너 세포는 리프레서 단백질을 코딩하는 서열 또는 몇 개 리프레서 단백질을 코딩하는 몇 개 서열을 포함하는 리프레서 단백질 발현 카세트를 포함할 수 있다. 또한, 임의의 이들 구현예에서, 도너 세포는 전달 비히클로 유전자 회로 (또는 이의 전체로서 유전자 회로)에 포함된 관심 핵산 페이로드의 패키징을 위해 트랜스로 요구되는 단백질을 코딩하는 프로파지 서열을 포함할 수 있다. 이러한 단백질은 예를 들어, 구조 박테리오파지 단백질, 예를 들어 캡시드 단백질을 포함한다.
관심 단백질 또는 RNA 분자를 코딩하는 관심 핵산을 포함하는 유전자 회로를 도너 세포로부터 바람직한 수령체 또는 표적 세포로 전달할 수 있는 방법이 제공된다. 유전자 회로 및 도너 세포는 상기 정의된 바와 같다. 표적 세포는 바람직하게 박테리아 세포이고 유전자 회로에 함유된 관심 핵산의 전사를 음성적으로 조절하도록 도너 세포에 존재하는 리프레서 단백질(들)을 발현하지 않는다. 상기 방법은 유전자 회로의 전달에 충분한 시간 동안 상기 수령체 또는 표적 세포와 상기 도너 세포를 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 대안적으로, (예를 들어, 박테리오파지 스캐폴드를 포함하는 도너 세포를 사용하여) 박테리아 전달 비히클이 생산되는 경우에, 방법은 도너 세포에서 생산되는 박테리아 전달 비히클과 상기 수령체 또는 표적 세포를 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 전달된 유전자 회로는 도너 세포 발현된 리프레서 단백질에 의해 음성적으로 조절되는 리프레서 결합 서열의 제어 하에 관심 핵산을 포함한다. 이러한 예에서, 관심 단백질 또는 RNA 분자를 코딩하는 관심 핵산의 전사는 도너 세포에서 리프레서 단백질의 발현을 통해 억제된다. 본 명세서에서 제공하는 방법은 하나 이상의 관심 단백질 또는 RNA 분자를 코딩하는 핵산을 포함하는, 유전자 회로를, 리프레서 단백질을 발현하지 않고, 바람직하게 천연적으로 결여되어서, 관심 페이로드의 전사를 허용하는 바람직한 표적 숙주 세포로 전달할 수 있다.
본 발명의 일정 구현예에서, 관심 핵산은 RNA 예컨대 mRNA, crRNA, tRNA, iRNA (간섭 RNA), asRNA (안티-센스 RNA), 리보자임 RNA, RNA 압타머 또는 가이드 RNA를 코딩하는 핵산, CRISPR 유전자좌, 독소 유전자, 효소 예컨대 뉴클레아제 또는 키나제를 코딩하는 유전자, Cas 뉴클레아제, Cas9 뉴클레아제, TALEN, ZFN 및 메가뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레아제를 코딩하는 유전자, 리콤비나제, 박테리아 수용체, 막 단백질, 구조 단백질 또는 분비 단백질을 코딩하는 유전자, 항생제 또는 일반 약물에 대한 내성을 코딩하는 유전자, 독성 단백질 또는 독성 인자를 코딩하는 유전자, 및 병독성 단백질 또는 병독성 인자를 코딩하는 유전자, 또는 임의의 그들 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 관심 핵산은 또한 박테리아 수송체 또는 박테리아 포어 또는 분비 시스템을 코딩할 수 있다. 관심 핵산에 의해 코딩되는 단백질은 기능의 첨가 또는 제거 (예를 들어, dCas9), 정상적으로 분비되지 않는 단백질에 분비 신호의 첨가, 또는 루프에 외생성 펩티드의 첨가같은, 여분의 특성을 포함하도록 변형 또는 조작될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 관심 핵산은 치료 단백질을 코딩한다. 다른 구현예에서, 관심 핵산은 안티-센스 핵산 분자를 코딩한다. 일부 구현예에서, 관심 핵산는 둘 이상의 관심 분자를 코딩한다. 특히, 이들 분자 중 하나는 뉴클레아제, 예를 들어, Cas 뉴클레아제일 수 있고, 다른 분자는 핵산 분자 예컨대 가이드 RNA일 수 있다. 일 양태에서, 본 명세서에서 제공되는 방법 및 조성물은 숙주 박테리아 세포 게놈 또는 숙주 박테리아 세포 플라스미드의 절단을 표적화하는 뉴클레아제를 코딩하는 관심 핵산을 포함하는 유전자 회로의 전달을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제 매개 절단은 항생제 내성 유전자에서 발생된다. 일부 다른 구현예에서, 박테리아 세포 게놈의 뉴클레아제 매개 절단은 박테리아 세포의 게놈으로 관심 핵산의 삽입을 위해 상동성 재조합 사건을 자극하도록 디자인된다.
바람직한 표적 또는 수령체 세포로, 관심 단백질 또는 RNA 분자를 코딩하는 관심 핵산을 포함하는 유전자 회로의 전달을 가능하게 하는 방법 및 조성물이 제공된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "전달"은 수령체 또는 표적 세포로 유전자 회로의 전달을 허용하는 임의 수단을 의미한다. 이러한 수단은 예를 들어, 형질도입, 접합, 및 형질전환을 포함한다. 일부 구현예에서, 전달 비히클은 도너 세포로부터 표적 세포로 유전자 회로를 전달하는데 사용될 수 있다. 본 발명에 의해 포괄되는 전달 비히클은 제한없이, 박테리오파지 스캐폴드, 바이러스 스캐폴드, 화학 기반 전달 비히클 (예를 들어, 시클로덱스트린, 칼슘 포스페이트, 양이온성 중합체, 양이온성 리포솜), 단백질-기반 또는 펩티드-기반 전달 비히클, 지질-기반 전달 비히클, 나노입자-기반 전달 비히클, 비화학-기반 전달 비히클 (예를 들어, 형질전환, 전기천공, 초음파천공, 광학 형질감염), 입자-기반 전달 비히클 (예를 들어, 유전자 총, 마그네토펙션, 임팔러펙션, 입자 충돌, 세포-침투성 펩티드) 또는 도너 박테리아 (접합)를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 전달 비히클은 박테리오파지 스캐폴드로서, 다시 말해, 천연, 또는 진화되거나 또는 조작된 캡시드서 수득된다.
전달 비히클의 임의 조합이 또한 본 발명에 포괄된다. 전달 비히클은 박테리오파지 유래 스캐폴드를 지칭할 수 있고 천연, 진화되거나 또는 조작된 캡시드로부터 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 전달 비히클은 박테리아가 그들 스스로 환경으로부터 페이로드를 흡수하는데 천연적으로 적격하므로 페이로드 (예를 들어, 유전자 회로)이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "페이로드"는 전달 비히클에 의해 수령체 또는 표적 세포로 전달되는 임의의 하나 이상의 핵산 서열, 예컨대 본 명세서에 개시된 유전자 회로, 및/또는 아미노산 서열, 또는 이들 둘의 조합 (예컨대, 제한없이, 펩티드 핵산 또는 펩티드-올리고뉴클레오티드 접합체)을 의미한다. 용어 "페이로드"는 또한 플라스미드, 벡터, 또는 카고를 의미할 수 있다. 페이로드는 천연, 진화 또는 조작된 박테리오파지 게놈으로부터 수득된 파지미드 또는 플라스미드일 수 있다. 페이로드는 또한 천연, 진화 또는 조작된 박테리오파지 게놈으로부터 수득된 파지미드 또는 파지미드의 일부만으로 구성될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "핵산"은 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있거나 또는 단일-가닥 및 이중-가닥 서열 둘 모두의 일부를 함유하는 함께 공유적으로 연결된 적어도 2개 뉴클레오티드의 서열을 의미한다. 본 발명의 핵산은 천연 발생, 재조합 또는 합성일 수 있다. 핵산은 원형 서열 또는 선형 서열 또는 두 형태의 조합의 형태일 수 있다. 핵산은 DNA, 게놈 또는 cDNA, 또는 RNA 또는 둘 모두의 조합일 수 있다. 핵산은 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드의 임의 조합, 및 우라실, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 자타닌, 하이포자타닌, 이소시토신, 5-히드록시메틸시토신 및 이소구아닌을 포함한, 염기의 임의 조합을 함유할 수 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 변형 염기의 다른 예는 [Chemical Reviews 2016, 116 (20) 12655-12687]에 상술되어 있다. 용어 "핵산"은 또한 제한없이, 포스포르아미드, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, O-메틸포스포로아미다이트 연결 및/또는 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드 핵산을 포함한, 다른 골격을 함유할 수 있는 임의의 핵산 유사체를 포괄한다. 상기 특징의 핵산의 임의 조합이 또한 본 발명에 포괄된다.
본 발명에서 사용되는 유전자 회로는 또한 복제 기원을 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물에서 사용을 위한, 복제 기원은 당분야에 공지되어 있고, 종-특이적 플라스미드 DNA (예를 들어, CoIE1, Rl, pT181, pSC101, pMB1, R6K, RK2, p15a 등), 박테리아 바이러스 (예를 들어, φ174, M13, F1 및 P4) 및 박테리아 염색체 복제 기원 (예를 들어, oriC)으로부터 동정되었다. 이러한 서열은 예를 들어, 박테리아 세포, 예를 들어, 도너 세포 및/또는 표적화 세포에서 유전자 회로의 복제를 허용한다. 일 구현예에서, 본 개시에 따른 파지미드 (유전자 회로)는 도너, 표적 또는 수령체 세포에서 기능성인 박테리아 복제 기원을 포함한다.
대안적으로, 본 개시에 따른 유전자 회로는 임의의 기능성 박테리아 복제 기원을 포함하지 않거나 또는 표적화 박테리아에서 불활성인 복제 기원을 함유한다. 따라서, 본 개시의 유전자 회로는 표적 또는 수령체 세포로 도입되면 그 자체로 복제될 수 없다.
일 구현예에서, 전달 비히클에 패키징하려는 유전자 회로, 또는 플라스미드 상의 복제 기원은 표적화 박테리아에서 불활성인데, 이 복제 기원이 표적화 세포에서 기능성이 아니라서, 원치않는 플라스미드 복제를 방지한다는 것을 의미한다.
일 구현예에서, 유전자 회로 또는 플라스미드는 도너 박테리아 세포, 예를 들어, 박테리아 바이러스 입자의 생산에 사용되는 도너 박테리아 세포에서 기능성인 박테리아 복제 기원을 포함한다.
유전자 회로 또는 플라스미드 복제는 숙주 효소 및 유전자 회로 또는 플라스미드-제어된 시스 및 트랜스 결정인자에 의존한다. 예를 들어, 일부 유전자 회로 또는 플라스미드는 거의 모든 그람-음성 박테리아에서 인식되고 복제 개시 및 조절 동안 각 숙주에서 올바르게 작용하는 결정인자를 가질 수 있다. 다른 유전자 회로 또는 플라스미드는 일부 박테리아에서만 그들 능력을 보유할 수 있다 (Kues, U and Stahl, U 1989 Microbiol Rev 53:491-516).
유전자 회로 또는 플라스미드는 복제 기원에서 출발하여 3개의 일반 기전, 즉 세타 유형, 가닥 치환, 및 롤링 써클에 의해 복제될 수 있다 (참조: Del Solar et al. 1998 Microhio and Molec Biol. Rev 62:434-464). 이들 복제 기원은 유전자 회로 또는 플라스미드 및/또는 숙주 코딩된 단백질의 상호작용에 요구되는 부위를 함유한다.
본 명세서에서 사용되는 복제 기원은 중간 카피수, 예컨대 pBR322 (세포 당 15-20 카피수) 또는 R6K 플라스미드 (세포 당 15-20 카피수) 유래 colE1일 수 있거나 또는 높은 카피수, 예를 들어 pUC ori (세포 당 500-700 카피수), pGEM ori (세포 당 300-400 카피수), pTZ ori (세포 당 >1000 카피수) 또는 pBluescript ori (세포 당 300-500 카피수)일 수 있다.
일 구현예에서, 유전자 회로에 포함되는 박테리아 복제 기원은 ColE1, pMB1 및 변이체 (pBR322, pET, pUC 등), p15a, ColA, ColE2, pOSAK, pSC101, R6K, IncW (pSa 등), IncFII, pT181, P1, F IncP, IncC, IncJ, IncN, IncP1, IncP4, IncQ, IncH11, RSF1010, CloDF13, NTP16, R1, f5, pPS10, pC194, pE194, BBR1, pBC1, pEP2, pWVO1, pLF1311, pAP1, pWKS1, pLS1, pLS11, pUB6060, pJD4, pIJ101, pSN22, pAMbeta1, pIP501, pIP407, ZM6100(Sa), pCU1, RA3, pMOL98, RK2/RP4/RP1/R68, pB10, R300B, pRO1614, pRO1600, pECB2, pCM1, pFA3, RepFIA, RepFIB, RepFIC, pYVE439-80, R387, phasyl, RA1, TF-FC2, pMV158 및 pUB113으로 이루어진 군에서 선택된다.
보다 바람직하게, 박테리아 복제 기원은 ColE1, pMB1 및 변이체 (pBR322, pET, pUC 등), p15a, ColA, ColE2, pOSAK, pSC101, R6K, IncW (pSa 등), IncFII, pT181, P1, F IncP, IncC, IncJ, IncN, IncP1, IncP4, IncQ, IncH11, RSF1010, CloDF13, NTP16, R1, f5 및 pPS10으로 이루어진 군에서 선택되는 이. 콜라이 복제 기원이다.
보다 바람직하게, 박테리아 복제 기원은 pC194, pE194, BBR1, pBC1, pEP2, pWVO1, pLF1311, pAP1, pWKS1, pLS1, pLS11, pUB6060, pJD4, pIJ101, pSN22, pAMbeta1, pIP501, pIP407, ZM6100(Sa), pCU1, RA3, pMOL98, RK2/RP4/RP1/R68, pB10, R300B, pRO1614, pRO1600, pECB2, pCM1, pFA3, RepFIA, RepFIB, RepFIC, pYVE439-80, R387, phasyl, RA1, TF-FC2, pMV158 및 pUB113으로 이루어진 군에서 선택된다.
보다 더 바람직하게, 박테리아 복제 기원은 ColE1 및 p15A이다.
유전자 회로는 파지 복제 기원을 포함할 수 있다. 특히, 본 개시에 따라서 전달된 핵산 서열은 완전한 파지 게놈의 상보체로, 상이한 캡시드에 이후 캡슐화를 위해 전달된 핵산 서열의 복제를 개시할 수 있는 파지 복제 기원을 포함할 수 있다. 파지 복제 기원은 또한 임의의 파지 입자를 패키징하기 위한 필요성없이 박테리아 복제 기원으로서 작용하도록 조작될 수 있다.
본 개시의 유전자 회로 또는 전달된 핵산 서열에 포함되는 파지 복제 기원은 파지에 존재하는 임의의 복제 기원일 수 있다.
바람직하게, 파지 복제 기원은 M13, f1, φX174, P4, 람다, P2, 186, 람다-유사, HK022, mEP237, HK97, HK629, HK630, mEP043, mEP213, mEP234, mEP390, mEP460, mEPx1, mEPx2, phi80, mEP234, T2, T4, T5, T7, RB49, phiX174, R17, PRD1 P1-유사, P2-유사, P22, P22-유사, N15 및 N15-유사 박테리오파지의 야생형 또는 비-야생형 서열일 수 있다.
보다 바람직하게, 파지 복제 기원은 M13, f1, φX174, P4, 및 람다의 파지 복제 기원으로 이루어진 군에서 선택된다.
특정 구현예에서, 파지 복제 기원은 람다 또는 P4 복제 기원이다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 유전자 회로는 리프레서 결합 서열의 전사 제어 하에 관심 핵산 서열을 포함한다. 개시된 방법에서, 관심 핵산의 전사는 표적화된 세포에서 활성이면서 도너 세포에서 억제된다. 일 구현예에서, 관심 핵산은 표적화된 세포로 전달하려는 프로그램가능한 뉴클레아제 회로이고, 즉 관심 핵산은 표적화된 세포로 전달하려는 프로그램가능한 뉴클레아제 시스템을 코딩한다. 프로그램가능한 뉴클레아제 시스템은 프로그램가능한 뉴클레아제, 즉 표적화된 세포에서 관심 표적 유전자의 서열-특이적 제거를 매개할 수 있는 뉴클레아제를 포함한다. 특히, 이러한 프로그램가능한 뉴클레아제 시스템은 관심 표적 유전자 (예를 들어, 인간에 유해한 유전자)를 함유하는 박테리아의 생체내 서열-특이적 제거를 매개할 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 프로그램가능한 뉴클레아제는 예를 들어, CRISPR 뉴클레아제 (또한 "CRISPR-연관 단백질" 또는 "Cas 뉴클레아제"), 바람직하게 I형, II형 CRISPR 뉴클레아제, TALEN 뉴클레아제, ZFN 뉴클레아제, 메가뉴클레아제 및 리콤비나제 및 이의 임의 변이체 (진화 또는 조작된 변이체)를 포함한다. 이들 뉴클레아제는 별도로 또는 조합하여 사용될 수 있고, 다시 말해서, 프로그램가능한 뉴클레아제 시스템은 하나 또는 몇 개 프로그램가능한 뉴클레아제를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 프로그램가능한 뉴클레아제는 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes)의 II형 CRISPR-Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR-associated) 시스템의 조작된 변이체로부터 선택된다. 사용할 수 있는 다른 프로그램가능한 뉴클레아제는 다른 CRISPR-Cas 시스템, 조작된 TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nuclease) 변이체, 조작된 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 변이체, 천연, 진화 또는 조작된 메가뉴클레아제 또는 리콤비나제 변이체, 및 프로그램가능한 뉴클레아제의 임의 조합 또는 하이브리드를 포함한다. 방법에서 사용되는 뉴클레아제의 유형에 의존하여, 프로그램가능한 뉴클레아제 시스템은 하나 또는 몇 개 추가 성분을 더 포함할 수 있다. 특히, CRISPR 뉴클레아제에서 프로그램가능한 뉴클레아제일 때, 프로그램가능한 뉴클레아제 시스템은 바람직하게 표적화된 서열을 찾고 선택적으로 절단하도록 가이드 RNA를 더 포함한다. 따라서, 본 명세서에 제공된 조작된 독자적으로 분포된 뉴클레아제 회로는 표적 세포에서 관심 유전자, 예컨대, 예를 들어, 독소 유전자, 병독성 인자 유전자, 항생제 내성 유전자, 리모델링 유전자 또는 조절 유전자를 코딩하는 DNA를 선택적으로 절단하는데 사용될 수 있다 (참조: WO2014124226).
관심, 바람직하게 프로그램가능한 다른 서열이 표적화된 세포로 전달하기 위해서 전달된 핵산 서열에 포함될 수 있다. 일 구현예에서, 관심 핵산은 표적화된 세포, 바람직하게 표적 박테리아의 생존 또는 성장에 영향을 미치는 분자를 코딩한다. 표적 세포가 박테리아인 구현예에서, 이러한 분자는 세포 사멸을 야기 (살균 효과)시키거나 또는 상기 박테리아의 성장을 방지 (정균 효과)하기 위해서 선택될 수 있다. 예를 들어, 관심 핵산 서열은 홀린, 엔도리신, 제한 효소 또는 표적 세포에 영향을 미치고, 바람직하게 표적 세포의 생존 또는 성장에 영향을 미치는 독소를 코딩할 수 있다.
특정 구현예에서, 관심 핵산은 박테리오신을 코딩한다. 박테리오신은 다른 박테리아의 성장을 사멸 또는 억제시키기 위해서 박테리아에 의해서 생산되는 단백질성 독소일 수 있다. 박테리오신은 생산 균주, 공통 내성 기전, 및 사멸 기전을 포함하여, 몇가지 방식으로 분류된다. 이러한 박테리오신은 그람 음성 박테리아 (예를 들어, 마이크로신, 콜리신-유사 박테리오신 및 테일로신) 및 그람 양성 박테리아 (예를 들어, 클래스 I, 클래스 II, 클래스 III 또는 클래스 IV 박테리오신)로부터 기술되었다. 관심 핵산은 또한 세포외 공간으로 독소를 분비하는데 필요한 수송체를 코딩할 수 있다.
보다 특정한 구현예에서, 관심 핵산은 마이크로신, 콜리신-유사 박테리오신, 테일로신, 클래스 I, 클래스 II, 클래스 III 및 클래스 IV 박테리오신으로 이루어진 군에서 선택되는 독소를 코딩하는 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상응하는 면역력 폴리펩티드 (즉, 항-독소)는 전달된 핵산 서열 생산 및 캡시드화 목적을 위해서 박테리아 세포를 보호하는데 사용될 수 있지만 (그 전문이 참조로 본 명세서에 편입되는, [Cotter et al., Nature Reviews Microbiology 11: 95, 2013] 참조), 관심 핵산이 전달되는 표적화 박테리아 및 약학 조성물에는 부재한다.
일부 다른 구현예에서, 표적 세포에서 전달된 관심 핵산의 발현은 세포 사멸을 야기하지 않는다. 예를 들어, 관심 핵산은 예를 들어 발광 또는 형광 신호를 야기하는 리포터 유전자를 코딩할 수 있다.
일부 다른 구현예에서, 관심 핵산은 표적 세포에서 유용한 기능을 획득하는, 예컨대 표적 세포의 물질대사, 이의 환경 조성을 변형시키거나, 또는 표적 세포를 포함하는 숙주에 영향을 미치는, 단백질, 특히 효소를 코딩할 수 있다.
특정 구현예에서, 관심 핵산 서열은 RNA 예컨대 mRNA, crRNA, tRNA, iRNA (간섭 RNA), asRNA (안티-센스 RNA), 리보자임 RNA, RNA 압타머 또는 가이드 RNA (gRNA)를 코딩하는 핵산, CRISPR 유전자좌, 효소 예컨대 뉴클레아제 또는 키나제를 코딩하는 유전자, Cas 뉴클레아제, Cas9 뉴클레아제, TALEN, ZFN 또는 메가뉴클레아제로 이루어진 군에서 선택되는 뉴클레아제를 코딩하는 유전자, 리콤비나제, 박테리아 수용체, 막 단백질, 구조 단백질, 분비 단백질, 또는 항생제 또는 일반 약물에 대한 내성을 코딩하는 유전자, 독성 단백질 또는 독성 인자를 코딩하는 유전자, 및 병독성 단백질, 병독성 인자, 박테리아 수송체 또는 박테리아 포어를 코딩하는 유전자, 및 임의의 그들 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 관심 핵산에 의해 코딩되는 단백질은 또한 기능의 첨가 또는 제거 (예를 들어, dCas9), 정상적으로 분비되지 않는 단백질에 분비 신호의 첨가, 루프에 외생성 펩티드의 첨가 등과 같은, 여분의 특성을 포함하도록 변형 또는 조작될 수 있다.
일부 구현예에서, 관심 핵산은 CRISPR 시스템을 코딩한다. 전형적으로, CRISPR 시스템은 2종의 별도 성분, 즉, i) CRISPR 연관 뉴클레아제 (Cas 또는 "CRISPR 연관 단백질")의 경우, 엔도뉴클레아제, 및 ii) 가이드 RNA를 함유한다. 가이드 RNA의 구조는 Cas 뉴클레아제의 성질에 의존적일 수 있다. 특히, 가이드 RNA (gRNA 또는 sgRNA)는 CRISPR (RNAcr) 박테리아 RNA 및 RNAtracr (trans-activating RNA CRISPR)의 조합으로 이루어진 키메라 RNA의 형태일 수 있다 (Jinek et al., Science 2012). gRNA는 단일 전사물에서 Rtracr의 입체형태적 성질, 및 Cas 단백질에 대해 가이드로서 제공되는 "스페이싱 서열"에 상응하는 cRNA의 표적화 특이성을 조합한다. 이러한 가이드 RNA는 예를 들어 Cas 뉴클레아제가 Cas9일 때 요구된다. 대안적으로, 가이드 RNA는 오직 RNAcr 만을 포함할 수 있다. 이러한 가이드 RNA는 예를 들어 Cas 뉴클레아제가 Cpf1일 때 요구된다. gRNA 및 Cas 단백질이 세포에서 동시에 발현될 때, 표적 게놈 서열은 영구적으로 중단 (및 위치에 따라서, 표적화 및 주변 서열 및/또는 세포 사멸의 소멸 야기) 또는 변형될 수 있다. 변형은 복구 매트릭스에 의해 가이드될 수 있다. 일반적으로, CRISPR 시스템은 뉴클레아제 작용 기전에 의존하여 2개 주요 클래스를 포함한다. 클래스 1은 다수-서브유닛 이펙터 복합체로 만들어지고, I형, III형, 및 IV형을 포함한다. 클래스 2는 Cas9 뉴클레아제같은 단일-유닛 이펙터 모듈로 만들어지고, II형 (II-A,II-B,II-C,II-C 변이체), V형 (V-A,V-B,V-C,V-D,V-E,V-U1,V-U2,V-U3,V-U4,V-U5) 및 VI형 (VI-A,VI-B1,VI-B2,VI-C,VI-D)을 포함한다.
본 개시에 따른 관심 핵산은 Cas 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 다양한 CRISPR 효소는 플라스미드 상에서 관심 서열로서 사용에 이용가능하다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 II형 CRISPR 효소이다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 DNA 절단을 촉매한다. 일부 다른 구현예에서, CRISPR 효소는 RNA 절단을 촉매한다. 일 구현예에서, CRISPR 효소는 sgRNA에 커플링될 수 있다. 일정 구현예에서, sgRNA는 항생제 내성 유전자, 병독성 단백질 또는 인자 유전자, 독소 단백질 또는 인자 유전자, 박테리아 수용체 유전자, 막 단백질 유전자, 구조 단백질 유전자, 분비 단백질 유전자, 일반 약물에 대한 내성을 발현하는 유전자 또는 숙주 (표적 세포를 포함하는 숙주)에 유해한 효과를 초래하는 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 유전자를 표적화한다.
다수-서브유닛 이펙터 또는 단일-유닛 이펙터의 일부로서 Cas 단백질의 비제한적인 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (Csn1 및 Csx12로도 알려짐), Cas10, Cas11 (SS), Cas12a (Cpf1), Cas12b (C2c1), Cas12c (C2c3), Cas12d (CasY), Cas12e (CasX), C2c4, C2c8, C2c5, C2c10, C2c9, Cas13a (C2c2), Cas13b (C2c6), Cas13c (C2c7), Cas13d, Csa5, Csc1, Csc2, Cse1, Cse2, Csy1, Csy2, Csy3, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csn2, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx13, Csx1, Csx15, SdCpf1, CmtCpf1, TsCpf1, CmaCpf1, PcCpf1, ErCpf1, FbCpf1, UbcCpf1, AsCpf1, LbCpf1, 이의 상동체, 이의 오솔로그, 이의 변이체, 또는 이의 변형된 형태를 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 부위에서 표적 핵산의 양쪽 가닥을 절단한다.
특정 구현예에서, CRISPR 효소는 임의의 Cas9 단백질, 예를 들어, 임의의 천연-발생 박테리아 Cas9를 비롯하여 이의 임의의 변이체, 상동체, 또는 오솔로그이다.
"Cas9"란 다시 말해서, 가이드 RNA(들)와 상호작용할 수 있고, 표적 게놈의 DNA의 이중 가닥 절단을 수행할 수 있게 허용하는 효소적 활성 (뉴클레아제)을 발휘할 수 있게 하는, 단백질 Cas9 (Csn1 또는 Csx12라고도 함) 또는 이의 기능성 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드 단편을 의미한다. 따라서, "Cas9"는 변형된 단백질을 의미할 수 있는데, 예를 들어, 단백질의 사전정의된 기능에 필수적이지 않은 단백질의 도메인, 특히 gRNA(들)와 상호작용에 필수적이지 않은 도메인을 제거하도록 절두될 수 있다.
본 개시의 문맥에서 사용되는 Cas9 (전체 단백질 또는 이의 단편)를 코딩하는 서열은 임의의 기지 Cas9 단백질로부터 수득될 수 있다 (Fonfara et al., Nucleic Acids Res 42 (4), 2014; Koonin et al., Nat Rev Microbiol 15(3), 2017). 본 개시에서 유용한 Cas9 단백질의 예는 제한없이, 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes) (SpCas9), 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophiles) (St1Cas9, St3Cas9), 스트렙토코커스 뮤탄스 (Streptococcus mutans), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) (SaCas9), 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) (CjCas9), 프란시셀라 노비시다 (Francisella novicida) (FnCas9) 및 네이세리아 메닌지티데스 (Neisseria meningitides) (NmCas9)의 Cas9 단백질을 포함한다.
다른 특정 구현예에서, CRISPR 효소는 임의의 Cas12a, Cas13a 또는 Cas13d 단백질, 예를 들어, 임의의 천연-발생 박테리아 Cas12a, Cas13a 또는 Cas13d를 비롯하여, 이의 임의의 변이체, 상동체 또는 오솔로그이다.
본 개시의 문맥에서 사용되는 Cpf1 (Cas12a) (전체 단백질 또는 이의 단편)을 코딩하는 서열은 임의의 기지 Cpf1 (Cas12a) 단백질 (Koonin et al., 2017)로부터 수득될 수 있다. 본 개시에서 유용한 Cpf1(Cas12a) 단백질의 예는 제한없이, 악시다미노코커스 (Acidaminococcus) sp, 라크노스피라세아에 박테리우 (Lachnospiraceae bacteriu), 및 프란시셀라 노비시다 (Francisella novicida)의 Cpf1(Cas12a) 단백질을 포함한다.
Cas13a (전체 단백질 또는 이의 단편)를 코딩하는 서열은 임의의 기지 Cas13a (C2c2) 단백질 (Abudayyeh et al., 2017)로부터 수득될 수 있다. 본 개시에서 유용한 Cas13a (C2c2) 단백질의 예는 제한없이, 렙토트리키아 와데이 (Leptotrichia wadei)의 Cas13a (C2c2) 단백질 (LwaCas13a)을 포함한다.
Cas13d (전체 단백질 또는 이의 단편)를 코딩하는 서열은 임의의 기지 Cas13d 단백질 (Yan et al., 2018)로부터 수득될 수 있다. 본 개시에서 유용한 Cas13d 단백질의 예는 제한없이 유박테리움 시라에움 (Eubacterium siraeum) 및 루미노코커스 (Ruminococcus sp)의 Cas13d 단백질을 포함한다.
특정 구현예에서, 관심 핵산은 항생제 내성 유전자, 병독성 인자 또는 단백질 유전자, 독소 인자 또는 단백질 유전자, 박테리아 수용체, 막 단백질, 구조 단백질, 분비 단백질을 발현하는 유전자, 일반 약물에 대한 내성을 발현하는 유전자 또는 숙주에 유해한 효과를 초래하는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 불활성화 또는 유전자 발현의 감소를 위해서, CRISPR/Cas 시스템, 바람직하게 CRISPR/Cas9 시스템을 코딩한다.
일 구현예에서, CRISPR 시스템은 병독성 인자를 표적화하고 불활성화시키는데 사용된다. 병독성 인자는 숙주에 가해지는 손상 정도를 증가시켜서 숙주-병원체 상호작용을 변경시키는 병원체에 의해 생산되는 임의 물질일 수 있다. 병독성 인자는 예를 들어, 숙주에서 세포 부착 또는 니쉐의 군집화에서, 숙주의 면역 반응을 회피하거나, 숙주 세포로 진입 및 배출을 촉진하기 위해서, 숙주로부터 영양소를 수득하기 위해서, 또는 숙주에서 다른 생리적 과정을 억제하기 위해서를 포함한, 많은 방식으로 병원체에 의해 사용된다. 병독성 인자는 효소, 내독소, 부착 인자, 운동 인자, 보체 회피에 관여되는 인자, 및 바이오필름 형성을 촉진하는 인자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 표적화된 병독성 인자 유전자는 이. 콜라이 병독성 인자 유전자 예컨대, 제한없이, EHEC-HlyA, Stx1 (VT1), Stx2 (VT2), Stx2a (VT2a), Stx2b (VT2b), Stx2c (VT2c), Stx2d (VT2d), Stx2e (VT2e) 및 Stx2f (VT2f), Stx2h (VT2h), stx2k, fimA, fimF, fimH, neuC, kpsE, sfa, foc, iroN, aer, iha, papC, papGI, papGII, papGIII, hlyC, cnf1, hra, sat, ireA, usp ompT, ibeA, malX, fyuA, irp2, traT, afaD, ipaH, eltB, estA, bfpA, eaeA, espA, aaiC, aatA, TEM, CTX, SHV, csgA, csgB, csgC, csgD, csgE, csgF, csgG, csgH, T1SS, T2SS, T3SS, T4SS, T5SS, T6SS (분비 시스템)일 수 있다. 예를 들어, 이러한 표적화된 병독성 인자 유전자는 시겔라 디센테리아에 (Shigella dysenteriae) 병독성 인자 유전자 예컨대, 제한없이, stx1 및 stx2일 수 있다. 예를 들어, 이러한 표적화된 병독성 인자 유전자는 여시니아 페스티스 (Yersinia pestis) 병독성 인자 유전자 예컨대, 제한없이, yscF (플라스미드-유래 (pCDl) T3SS 외부 바늘 서브유닛)일 수 있다. 예를 들어, 이러한 표적화된 병독성 인자 유전자는 프란시셀라 툴라렌시스 (Francisella tularensis) 병독성 인자 유전자 예컨대, 제한없이, fslA일 수 있다. 예를 들어, 이러한 표적화된 병독성 인자 유전자는 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis) 병독성 인자 유전자 예컨대, 제한없이, pag (탄저균 독소, 세포-결합 보호 항원)일 수 있다. 예를 들어, 이러한 표적화된 병독성 인자 유전자는 비브리오 콜레라 (Vibrio cholera) 병독성 인자 유전자 예컨대, 제한없이, ctxA 및 ctxB (콜레라 독소), tcpA (독소 공-조절 선모), 및 toxT (마스터 병독성 조절인자)일 수 있다. 예를 들어, 이러한 표적화된 병독성 인자 유전자는 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) 병독성 인자 유전자 예컨대, 제한없이, 피오베르딘 (예를 들어, 시그마 인자 pvdS, 생합성 유전자 pvdL, pvdl, pvdJ, pvdH, pvdA, pvdF, pvdQ, pvdN, pvdM, pvdO, pvdP, 수송체 유전자 pvdE, pvdR, pvdT, opmQ), 시데로포어 피오켈린 (예를 들어, pchD, pchC, pchB, pchA, pchE, pchF 및 pchG), 및 독소 (예를 들어, exoU, exoS 및 exoT)일 수 있다. 예를 들어, 이러한 표적화된 병독성 인자 유전자는 클렙시엘라 뉴모니아에 (Klebsiella pneumoniae) 병독성 인자 유전자 예컨대, 제한없이, fimA (부착, I형 섬모 주요 서브유닛), 및 cps (캡슐 다당류)일 수 있다. 예를 들어, 이러한 표적화된 병독성 인자 유전자는 악시네토박터 바우만니이 (Acinetobacter baumannii) 병독성 인자 유전자 예컨대, 제한없이, ptk (캡슐 중합) 및 epsA (조립)일 수 있다. 예를 들어, 이러한 표적화된 병독성 인자 유전자는 살모넬라 엔테리카 티피 (Salmonella enterica Typhi)는 병독성 인자 유전자 예컨대, 제한없이, MIA (침윤, SPI-1 조절인자), ssrB (SPI-2 조절인자), 및 배출 펌프 유전자 acrA, acrB 및 tolC를 포함한, 담즙 내성과 연관된 것들일 수 있다. 예를 들어, 이러한 표적화된 병독성 인자 유전자는 푸소박테리움 뉴클레아툼 (Fusobacterium nucleatum) 병독성 인자 유전자 예컨대, 제한없이, FadA 및 TIGIT일 수 있다. 예를 들어, 이러한 표적화된 병독성 인자 유전자는 박테로이데스 프라질리스 (Bacteroides fragilis) 병독성 인자 유전자 예컨대, 제한없이, bft일 수 있다.
다른 구현예에서, CRISPR 시스템, 바람직하게 CRISPR/Cas9 시스템은 항생제 내성 유전자 예컨대, 제한없이, GyrB, ParE, ParY, AAC(1), AAC(2'), AAC(3), AAC(6'), ANT(2"), ANT(3"), ANT(4'), ANT(6), ANT(9), APH(2"), APH(3"), APH(3'), APH(4), APH(6), APH(7"), APH(9), ArmA, RmtA, RmtB, RmtC, Sgm, AER, BLA1, CTX-M, KPC, SHV, TEM, BlaB, CcrA, IMP, NDM, VIM, ACT, AmpC, CMY, LAT, PDC, OXA, β-락타마제, mecA, Omp36, OmpF, PIB, bla (blaI, blaR1) 및 mec (mecI, mecR1) 오페론, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT), 클로람페니콜 포스포트랜스퍼라제, 에탐부톨-내성 아라비노실트랜스퍼라제 (EmbB), MupA, MupB, 통합 막 단백질 MprF, Cfr 23S rRNA 메틸트랜스퍼라제, 리팜핀 ADP-리보실트랜스퍼라제 (Arr), 리팜핀 글리코실트랜스퍼라제, 리팜핀 모노옥시게나제, 리팜핀 포스포트랜스퍼라제, DnaA, RbpA, RNA 중합효소의 리팜핀-내성 베타-서브유닛 (RpoB), Erm 23S rRNA 메틸트랜스퍼라제, Lsa, MsrA, Vga, VgaB, 스트렙토그라민 Vgb 리아제, Vat 아세틸트랜스퍼라제, 플루오로퀴놀론 아세틸트랜스퍼라제, 플루오로퀴놀론-내성 DNA 토포이소머라제, 플루오로퀴놀론-내성 GyrA, GyrB, ParC, 퀴놀론 내성 단백질 (Qnr), FomA, FomB, FosC, FosA, FosB, FosX, VanA, VanB, VanD, VanR, VanS, 린코사미드 뉴클레오티딜트랜스퍼라제 (Lin), EreA, EreB, GimA, Mgt, Ole, 마크롤리드 포스포트랜스퍼라제 (MPH), MefA, MefE, Mel, 스트렙토트리신 아세틸트랜스퍼라제 (sat), Sul1, Sul2, Sul3, 술폰아미드-내성 FolP, 테트라사이클린 불활성화 효소 TetX, TetA, TetB, TetC, Tet30, Tet31, TetM, TetO, TetQ, Tet32, Tet36, MacAB-TolC, MsbA, MsrA,VgaB, EmrD, EmrAB-TolC, NorB, GepA, MepA, AdeABC, AcrD, MexAB-OprM, mtrCDE, EmrE, adeR, acrR, baeSR, mexR, phoPQ, mtrR, 또는 종합 항생제 내성 데이터베이스 (Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD https://card.mcmaster.ca/))에 기술된 임의의 항생제 내성 유전자를 표적화하고 불활성화하는데 사용된다.
다른 구현예에서, CRISPR 시스템, 바람직하게 CRISPR/Cas9 시스템은 박테리아 독소 유전자를 표적화하여 불활성화시키는데 사용된다. 박테리아 독소는 외독소 또는 내독소로서 분류될 수 있다. 외독소는 생성되어 활성적으로 분비되고; 내독소는 박테리아의 일부로 남아있는다. 박테리아 독소에 대한 반응은 중증 염증을 포함할 수 있고 패혈증을 초래할 수 있다. 이러한 독소는 예를 들어 보툴리늄 신경독소, 파상풍 독소, 스타필로코커스 독소, 디프테리아 독소, 탄저병 독소, 알파 독소, 백일해 독소, 시가 독소, 열-안정성 장독소 (이. 콜라이 ST), 콜리박틴, BFT (비. 프라질리스 (B. fragilis) 독소) 또는 Henkel 등 (Toxins from Bacteria in EXS. 2010; 100: 1-29)에 기술된 임의 독소일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "도너 세포", "표적 세포", 및 "수령체 세포"는 원핵생물 세포, 보다 바람직하게 박테리아 세포를 지칭한다. 특히, 본 명세서에 개시된 "도너", "표적", 또는 "수령체" 세포는 포유동물 유기체에 존재하거나 또는 존재할 수 있는 임의의 박테리아일 수 있다. 이것은 미생물총 또는 마이크로바이옴의 임의의 편리공생, 상리공생, 또는 병원성 박테리아일 수 있다.
마이크로바이옴은 다양한 내생성 박테리아 종을 포함할 수 있고, 이들 중 임의 것은 본 개시에 따라 표적화될 수 있다. 일부 구현예에서, 박테리아 전달 비히클이 사용되는 경우에, 표적화된 내생성 박테리아 세포의 속 및/또는 종은 박테리아 전달 비히클을 제조하는데 사용되는 박테리오파지의 유형에 의존적일 수 있다. 예를 들어, 일부 박테리오파지는 박테리아의 특이적 숙주 종에 향성을 나타낼 수 있거나, 또는 우선적으로 표적화한다. 다른 박테리오파지는 이러한 향성을 나타내지 않고 내생성 박테리아 세포의 다수의 상이한 속 및/또는 종을 표적화하는데 사용될 수 있다.
도너 세포 또는 표적 세포로서 사용할 수 있는 박테리아 세포의 예는 제한없이, 속 여시니아 (Yersinia) spp., 에스케리치아 (Escherichia) spp., 클렙시엘라 (Klebsiella) spp., 아시네토박터 (Acinetobacter) spp., 보르데텔라 (Bordetella) spp., 네이세리아 (Neisseria) spp., 애로모나스 (Aeromonas) spp., 프란시셀라 (Franciesella) spp., 코리네박테리움 (Corynebacterium) spp., 시트로박터 (Citrobacter) spp, 클라미디아 (Chlamydia) spp., 헤모필러스 (Hemophilus) spp., 브루셀라 (Brucella) spp., 마이코박테리움 (Mycobacterium) spp., 레지오넬라 (Legionella) spp., 로도코커스 (Rhodococcus) spp., 슈도모나스 (Pseudomonas) spp., 헬리코박터 (Helicobacter) spp., 비브리오 (Vibrio) spp., 바실러스 (Bacillus) spp., 에리시펠로트릭스 (Erysipelothrix) spp., 살모넬라 (Salmonella) spp., 스트렙토마이세스 (Streptomyces) spp., 스트렙토코커스 (Streptococcus) spp., 스타필로코커스 (Staphylococcus) spp., 박테로이데스 (Bacteroides) spp., 프레보텔라 (Prevotella) spp., 클로스트리듐 (Clostridium) spp., 비피도박테리움 (Bifidobacterium) spp., 클로스트리듐 (Clostridium) spp., 브레비박테리움 (Brevibacterium) spp., 락토코커스 (Lactococcus) spp., 류코노스톡 (Leuconostoc) spp., 악티노바실러스 (Actinobacillus) spp., 셀노모나스 (Selnomonas) spp., 시겔라 (Shigella) spp., 자이모나스 (Zymonas) spp., 마이코플라스마 (Mycoplasma) spp., 트레포네마 (Treponema) spp., 류코노스톡 (Leuconostoc) spp., 코리네박테리움 (Corynebacterium) spp., 엔테로코커스 (Enterococcus) spp., 엔테로박터 (Enterobacter) spp., 파이로코커스 (Pyrococcus) spp., 세라티아 (Serratia) spp., 모르가넬라 (Morganella) spp., 파르비모나스 (Parvimonas) spp., 푸소박테리움 (Fusobacterium) spp., 악티노마이세스 (Actinomyces) spp., 포르피로모나스 (Porphyromonas) spp., 마이크로코커스 (Micrococcus) spp., 바르토넬라 (Bartonella) spp., 보렐리아 (Borrelia) spp., 브루셀리아 (Brucelia) spp., 캄필로박터 (Campylobacter) spp., 클라미도필리아 (Chlamydophilia) spp., 큐티박테리움 (Cutibacterium) spp., 프로피오니박테리움 (Propionibacterium) spp., 가르드네렐라 (Gardnerella) spp., 엘리키아 (Ehrlichia) spp., 해모필러스 (Haemophilus) spp., 렙토스피라 (Leptospira) spp., 리스테리아 (Listeria) spp., 마이코플라스마 (Mycoplasma) spp., 노카르디아 (Nocardia) spp., 리켓치아 (Rickettsia) spp., 우레아플라스마 (Ureaplasma) spp., 및 락토바실러스 (Lactobacillus) spp.의 박테리아, 및 이의 혼합물로부터 유래하는 세포를 포함한다.
바람직하게, 박테리아는 여시니아 (Yersinia) spp., 에스케리치아 (Escherichia) spp., 클렙시엘라 (Klebsiella) spp., 아시네토박터 (Acinetobacter) spp., 슈도모나스 (Pseudomonas) spp., 헬리코박터 (Helicobacter) spp., 비브리오 (Vibrio) spp, 살모넬라 (Salmonella) spp., 스트렙토코커스 (Streptococcus) spp., 스타필로코커스 (Staphylococcus) spp., 박테로이데스 (Bacteroides) spp., 클로스트리듐 (Clostridium) spp., 시겔라 (Shigella) spp., 엔테로코커스 (Enterococcus) spp., 엔테로박터 (Enterobacter) spp., 리스테리아 (Listeria) spp., 큐티박테리움 (Cutibacterium) spp., 프로피오니박테리움 (Propionibacterium) spp., 푸소박테리움 (Fusobacterium) spp., 포르피로모나스 (Porphyromonas) spp. 및 가르드네렐라 (Gardnerella) spp. 로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 도너 세포 또는 표적 세포로서 사용할 수 있는 본 개시의 박테리아 세포는 혐기성 박테리아 세포 (예를 들어, 성장에 산소를 요구하지 않는 세포)이다. 혐기성 박테리아 세포는 조건적 혐기성 세포, 예컨대 제한없이, 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 슈와넬라 오네이덴시스 (Shewanella oneidensis), 가르드네렐라 바지날리스 (Gardnerella vaginalis) 및 리스테리아 (Listeria)를 포함한다. 혐기성 박테리아 세포는 또한 절대 혐기성 세포 예컨대, 예를 들어, 박테로이데스 (Bacteroides), 클로스트리듐 (Clostridium), 큐티박테리움 (Cutibacterium), 프로피오니박테리움 (Propionibacterium), 푸소박테리움 (Fusobacterium) 및 포르피로모나 (Porphyromona) 종을 포함한다. 인간에서, 혐기성 박테리아는 위장관에서 가장 일반적으로 존재한다. 일부 특정 구현예에서, 따라서 표적화된 박테리아 (표적 세포)는 위장관에서 가장 일반적으로 발견되는 박테리아이다. 박테리아 바이러스 입자, 및 다음으로 박테리아 바이러스 입자를 제조하는데 사용되는 박테리아 전달 비히클, 바람직하게 박테리오파지는 특별히 플라스미드를 전달하기 위해서 당업자에게 공지된 그들의 특별한 스펙트럼에 따라서 혐기성 박테리아 세포를 표적화 (예를 들어, 특이적으로 표적화)할 수 있다.
일부 구현예에서, 도너 세포 또는 표적 세포로서 사용할 수 있는 박테리아 세포는 제한없이, 박테로이데스 세타이오타오미크론 (Bacteroides thetaiotaomicron), 박테로이데스 프라질리스 (Bacteroides fragilis), 박테로이데스 디스타소니스 (Bacteroides distasonis), 박테로이데스 불가투스 (Bacteroides vulgatus), 클로스트리듐 렙툼 (Clostridium leptum), 클로스트리듐 코코이데스 (Clostridium coccoides), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 클로스트리듐 부티리컴 (Clostridium butyricum), 브레비박테리움 락토페르멘툼 (Brevibacterium lactofermentum), 스트렙토코커스 아갈락티아에 (Streptococcus agalactiae), 락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis), 류코노스톡 락티스 (Leuconostoc lactis), 악티노바실러스 악티노비세템코미탄스 (Actinobacillus actinobycetemcomitans), 시아노박테리아 (cyanobacteria), 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 헬리코박터 필로리 (Helicobacter pylori), 셀노모나스 루미나티움 (Selnomonas ruminatium), 시겔라 손네이 (Shigella sonnei), 자이모모나스 모빌리스 (Zymomonas mobilis), 마이코플라스마 마이코이데스 (Mycoplasma mycoides), 트레포네마 덴티콜라 (Treponema denticola), 바실러스 투린지엔시스 (Bacillus thuringiensis), 스타필로코커스 루그두넨시스 (Staphilococcus lugdunensis), 류코노스톡 오에노스 (Leuconostoc oenos), 코리네박테리움 제로시스 (Corynebacterium xerosis), 락토바실러스 플란타럼 (Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 카세이 (Lactobacillus casei), 락토바실러스 악시도필러스 (Lactobacillus acidophilus), 엔테로코커스 파에칼리스 (Enterococcus faecalis), 바실러스 코아굴란스 (Bacillus coagulans), 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus), 바실러스 포필라에 (Bacillus popillae), 시네코시스티스 (Synechocystis) 균주 PCC6803, 바실러스 리케파시엔스 (Bacillus liquefaciens), 피로코커스 아비시 (Pyrococcus abyssi), 셀레노모나스 노미난티움 (Selenomonas nominantium), 락토바실러스 힐가르디이 (Lactobacillus hilgardii), 스트렙토코커스 페루스 (Streptococcus ferus), 락토바실러스 펜토서스 (Lactobacillus pentosus), 박테로이데스 프라질리스 (Bacteroides fragilis), 스타필로코커스 에피더미디스 (Staphylococcus epidermidis), 스트렙토마이세스 파에크로모게네스 (Streptomyces phaechromogenes), 스트렙토마이세스 가나에니스 (Streptomyces ghanaenis), 크렙시엘라 뉴모니아에 (Klebsiella pneumoniae), 엔테로박터 클로아카에 (Enterobacter cloacae), 엔테로박터 애로게네스 (Enterobacter aerogenes), 세라티아 마르세센스 (Serratia marcescens), 모르가넬라 모르가니이 (Morganella morganii), 시트로박터 프룬디이 (Citrobacter freundii), 프로피오니박테리움 프루덴레이키이 (Propionibacterium freudenreichii), 슈도모나스 애리구노사 (Pseudomonas aerigunosa), 파르비모나스 미크라 (Parvimonas micra), 프레보텔라 인테르메디아 (Prevotella intermedia), 푸소박테리움 뉴클레아텀 (Fusobacterium nucleatum), 프레보텔라 니그레센스 (Prevotella nigrescens), 악티노마이세스 이스라엘리이 (Actinomyces israelii), 포르피로모나스 엔도돈탈리스 (Porphyromonas endodontalis), 포르피로모나스 진지발리스 (Porphyromonas gingivalis), 마이크로코커스 루테우스 (Micrococcus luteus), 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium), 애로모나스 히드로필라 (Aeromonas hydrophila), 애로모나스 카비아에 (Aeromonas caviae), 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis), 바르토넬라 헨셀라에 (Bartonella henselae), 바르토넬라 퀸타나 (Bartonella Quintana), 보르데텔라 페투시스 (Bordetella pertussis), 보렐리아 부르그도르페리 (Borrelia burgdorferi), 보렐리아 가리니이 (Borrelia garinii), 보렐리아 아프젤리이 (Borrelia afzelii), 보렐리아 레쿠렌티스 (Borrelia recurrentis), 브루셀라 아보르투스 (Brucella abortus), 브루셀라 카니스 (Brucella canis), 브루셀라 멜리텐시스 (Brucella melitensis), 브루셀라 수이스 (Brucella suis), 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni), 캄필로박터 콜라이 (Campylobacter coli), 캄필로박터 페투스 (Campylobacter fetus), 클라미디아 뉴모니아에 (Chlamydia pneumoniae), 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis), 클라미도필라 사이타시 (Chlamydophila psittaci), 클로스트리듐 보툴리넘 (Clostridium botulinum), 클로스트리듐 디피실 (클로스트리듐 difficile), 클로스트리듐 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens), 클로스트리듐 테타니 (Clostridium tetani), 코리네박테리움 디프테리아 (Corynebacterium diphtheria), 큐티박테리움 아크네스 (Cutibacterium acnes) (이전에 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionibacterium acnes)), 엘리키아 카니스 (Ehrlichia canis), 엘리키아 카페엔시스 (Ehrlichia chaffeensis), 엔테로코커스 파에시움 (Enterococcus faecium), 프란시셀라 툴라렌시스 (Francisella tularensis), 해모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenza), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 렙토스피라 인테로간스 (Leptospira interrogans), 렙토스피라 산타로사이 (Leptospira santarosai), 렙토스피라 웨일리이 (Leptospira weilii), 렙토스피라 노구치이 (Leptospira noguchii), 리스테리아 모노시토게네스 (Listeria monocytogenes), 마이코박테리움 레프라에 (Mycobacterium leprae), 마이코박테리움 튜버쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 울세란스 (Mycobacterium ulcerans), 마이코플라스마 뉴모니아 (Mycoplasma pneumonia), 네이세리아 고노로에아에 (Neisseria gonorrhoeae), 네이세리아 메닌지티데스 (Neisseria meningitides), 노카르디아 아스테로이드 (Nocardia asteroids), 리켓치아 리켓치아 (Rickettsia rickettsia), 살모넬라 엔테리티디스 (Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피 (Salmonella typhi), 살모넬라 파라티피 (Salmonella paratyphi), 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium), 시겔라 플렉스네리이 (Shigella flexnerii), 시겔라 디센테리아에 (Shigella dysenteriae), 스타필로코커스 사프로피티커스 (Staphylococcus saprophyticus), 스트렙토코커스 뉴모니아에 (Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes), 가르드네렐라 바지날리스 (Gardnerella vaginalis), 스트렙토코커스 비리단스 (Streptococcus viridans), 트레포네마 팔리덤 (Treponema pallidum), 우레아플라스마 우레알리티컴 (Ureaplasma urealyticum), 비브리오 콜레라 (Vibrio cholera), 비브리오 파라해몰리티커스 (Vibrio parahaemolyticus), 여시니아 페스티스 (Yersinia pestis), 여시니아 엔테로콜리티카 (Yersinia enterocolitica), 여시니아 슈도튜버큘로시스 (Yersinia pseudotuberculosis), 악티노박터 바우만니이 (Actinobacter baumanii), 슈도모나스 애리구노사 (Pseudomonas aerigunosa), 및 이의 혼합물이고, 바람직하게, 도너 세포 또는 표적 세포로서 사용할 수 있는 박테리아 세포는 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 엔테로코커스 패시움 (Enterococcus faecium), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 클렙시엘라 뉴모니아에 (Klebsiella pneumoniae), 아시네토박터 바우만니이 (Acinetobacter baumanii), 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 엔테로박터 클로아카에 (Enterobacter cloacae), 및 엔테로박터 애로게네스 (Enterobacter aerogenes), 및 이의 혼합물이다.
일 구현예에서, 도너 세포 또는 표적 세포로서 사용할 수 있는 박테리아는 에스케리치아 콜라이이다.
일 구현예에서, 도너 세포 또는 표적 세포로서 사용할 수 있는 박테리아는 병원성 박테리아이다. 박테리아는 병독성 박테리아일 수 있다.
도너 세포 또는 표적 세포로서 사용할 수 있는 박테리아는 바람직하게 연장된-스펙트럼 베타-락타마제-생산 (ESBL) 에스케리치아 콜라이, ESBL 클렙시엘라 뉴모니아에, 반코마이신-내성 엔테로코커스 (VRE), 메티실린-내성 스타필로코커스 아우레우스 (MRSA), 다제-내성 (MDR) 아시네토박터 바우만니이, MDR 엔테로박터 spp., 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는, 항박테리아 내성 박테리아일 수 있다. 바람직하게, 박테리아는 연장된-스펙트럼 베타-락타마제-생산 (ESBL) 에스케리치아 콜라이 균주로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
일부 특정 구현예에서, 도너 세포 및/또는 표적 세포는 프로바이오틱이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "프로파이오틱"은 바람직하게 제한없이, 박터락토바실리 (bacterlactobacilli), 비피도박테리아 (bifidobacteria), 스트렙토콕사이 (streptococci), 엔테로콕사이 (enterococci), 프로피오니박테리아 (propionibacteria), 사카로마이세테스 (saccaromycetes), 락토바실리 (lactobacilli), 비피도박테리아 (bifidobacteria), 또는 프로테오박테리아 (proteobacteria)를 포함한다.
대안적으로, 도너 세포 또는 표적 세포로서 사용될 수 있는 박테리아는 소정 종의 마이크로바이옴의 박테리아, 바람직하게 인간 미생물총의 박테리아일 수 있다.
일부 구현예에서, 도너 세포 및 표적 세포는 계통발생적으로 밀접한데, 바람직하게 동일한 문, 강, 목, 과, 속, 또는 종, 보다 바람직하게 동일한 속 또는 종이다.
일정 구현예에서, 본 개시는 본 명세서에 기술된 바와 같은 유전자 회로를 함유하는 박테리아 전달 비히클의 생산을 통해서 도너 세포로부터 표적 또는 수령체 세포로 유전자 회로의 전달을 위한 방법에 관한 것이다. 박테리아 전달 비히클은 박테리아 바이러스로부터 제조될 수 있다. 박테리아 전달 비히클은 유전자 회로를 표적화된 박테리아 세포로 도입시킬 수 있기 위해서 선택된다. 박테리아 전달 비히클은 특별한 박테리아를 표적화하도록 조작될 수 있다 (예를 들어, 각각이 그들 전문으로 본 명세서에 편입되는, 미국 가출원 제62/771,761호; 제62/802,777호; 및 제62/783,258호).
박테리아 전달 비히클이 유래될 수 있는, 박테리아 바이러스는 바람직하게 박테리오파지이다. 임의로, 박테리오파지는 [Krupovic et al, Arch Virol, 2015]의 분류체계를 기반으로, 이루어진 목 카우도비랄레스 (Caudovirales)로부터 선택된다:
박테리오파지는 미오비리다에 (Myoviridae) 과 (예컨대, 제한없이, 속 Cp220바이러스, Cp8바이러스, Ea214바이러스, 펠릭소1바이러스, 무글바이러스, 수스프바이러스, Hp1바이러스, P2바이러스, 카이바이러스, P100바이러스, 실비아바이러스, 스포1바이러스, 차르봄바바이러스, 트워트바이러스, Cc31바이러스, Jd18바이러스, Js98바이러스, Kp15바이러스, 문바이러스, Rb49바이러스, Rb69바이러스, S16바이러스, 스키조트4바이러스, Sp18바이러스, T4바이러스, Cr3바이러스, Se1바이러스, V5바이러스, 아보우오바이러스, 아게이트바이러스, 아그리칸357바이러스, Ap22바이러스, Arv1바이러스, B4바이러스, 바스티유바이러스, Bc431바이러스, Bcep78바이러스, 비셉무바이러스, 비콰르타바이러스, Bxz1바이러스, Cd119바이러스, Cp51바이러스, Cvm10바이러스, Eah2바이러스, El바이러스, 하푸나바이러스, 짐머바이러스, Kpp10바이러스, M12바이러스, 마키나바이러스, 마르타바이러스, Msw3바이러스, 뮤바이러스, 미오할로바이러스, Nit1바이러스, P1바이러스, 파크푸나바이러스, 프부나바이러스, Phikz바이러스, Rheph4바이러스, Rsl2바이러스, Rsl우나바이러스, 세쿤다5바이러스, Sep1바이러스, Spn3바이러스, 스부나바이러스, Tg1바이러스, Vhml바이러스 및 Wph바이러스)로부터 선택될 수 있다.
박테리오파지는 포도비리다에 (Podoviridae) 과 (예컨대, 제한없이, 속 Fri1바이러스, Kp32바이러스, Kp34바이러스, Phikmv바이러스, 프라도바이러스, Sp6바이러스, T7바이러스, Cp1바이러스, P68바이러스, Phi29바이러스, 노나33바이러스, Pocj바이러스, T12011바이러스, Bcep22바이러스, Bpp1바이러스, Cba41바이러스, Dfl12바이러스, Ea92바이러스, 엡실론15바이러스, F116바이러스, G7c바이러스, Jw알파바이러스, Kf1바이러스, Kpp25바이러스, Lit1바이러스, Luz24바이러스, Luz7바이러스, N4바이러스, 노나나바이러스, P22바이러스, 페이지바이러스, 피에코32바이러스, Prtb바이러스, Sp58바이러스, 우나961바이러스 및 Vp5바이러스)로부터 선택될 수 있다.
박테리오파지는 시포비리다에 (Siphoviridae) 과 (예컨대, 제한없이, 속 캄바이러스, 리카바이러스, R4바이러스, 아카디안바이러스, 쿠퍼바이러스, Pg1바이러스, 파이퍼피시바이러스, 로즈부시바이러스, 브루지타바이러스, Che9c바이러스, 호크아이바이러스, 플로트바이러스, 저지바이러스, K1g바이러스, Sp31바이러스, Lmd1바이러스, 우나4바이러스, 본고바이러스, 레이바이러스, 버터스바이러스, 찰리바이러스, 레디바이러스, 박스터바이러스, 님파도라바이러스, 비그누즈바이러스, 피시부르네바이러스, 파이온스바이러스, Kp36바이러스, 로게1바이러스, Rtp바이러스, T1바이러스, Tls바이러스, Ab18바이러스, 아미고바이러스, 아나톨바이러스, 안드로메다바이러스, 아티스바이러스, 반야드바이러스, 베르날13바이러스, 비셉티마바이러스, 브론바이러스, C2바이러스, C5바이러스, Cba181바이러스, Cbast바이러스, 세시바이러스, Che8바이러스, Chi바이러스, Cjw1바이러스, 콘독바이러스, 크로너스바이러스, D3112바이러스, D3바이러스, 데쿠로바이러스, 데모스테네스바이러스, 두세트바이러스, E125바이러스, 에이아우바이러스, Ff47바이러스, 가이아바이러스, 길스바이러스, 고든바이러스, Gordtnk바이러스, 해리슨바이러스, Hk578바이러스, Hk97바이러스, 젠스트바이러스, Jwx바이러스, 켈레지오바이러스, 코라바이러스, L5바이러스, 람다바이러스, 라로이어바이러스, 리에피에바이러스, 마빈바이러스, 머드캣바이러스, N15바이러스, 노나그바이러스, Np1바이러스, 오메가바이러스, P12002바이러스, P12024바이러스, P23바이러스, P70바이러스, Pa6바이러스, Pamx74바이러스, 페이션스바이러스, Pbi1바이러스, Pepy6바이러스, Pfr1바이러스, Phic31바이러스, Phicbk바이러스, 피에타바이러스, 피펠바이러스, Phijl1바이러스, Pis4a바이러스, Psa바이러스, 사이무나바이러스, Rdjl바이러스, Rer2바이러스, Sap6바이러스, Send513바이러스, 셉티마3바이러스, 쇠라바이러스, 섹스택바이러스, Sfi11바이러스, Sfi21dt1바이러스, 시타라바이러스, Sk1바이러스, 슬래시바이러스, 스무티바이러스, 수프스바이러스, Sp베타바이러스, Ssp2바이러스, T5바이러스, 탱크바이러스, 틴2바이러스, 티탄바이러스, Tm4바이러스, Tp21바이러스, Tp84바이러스, 트리아바이러스, 트리긴타두오바이러스, 베가스바이러스, 벤데타바이러스, W베타바이러스, 와일드캣바이러스, 위저드바이러스, 우스바이러스, Xp10바이러스, Ydn12바이러스 및 위아바이러스)로부터 선택될 수 있다.
박테리오파지는 악커만비리다에 (Ackermannviridae) 과 (예컨대, 제한없이, 속 Ag3바이러스, 라임스톤바이러스, Cba120바이러스 및 Vi1바이러스)로부터 선택될 수 있다.
임의로, 박테리오파지는 카우도비랄레스 목의 일부가 아니지만 미지정된 목의 과 예컨대, 제한없이, 덱티비리다에 (Tectiviridae) 과 (예컨대 속 알파텍티바이러스, 베타텍티바이러스), 코르티코비리다에 (orticovridae) 과 (예컨대 속 코르티코바이러스), 이노비리다에 (Inoviridae) 과 (예컨대 속 피브로바이러스, 하베니바이러스, 이노바이러스, 리네아바이러스, 플렉트로바이러스, 사에티바이러스, 베스페르틸리오바이러스), 시스토비리다에 (Cystoviridae) 과 (예컨대 속 시스토바이러스), 레비비리다에 (Leviviridae) 과 (예컨대 속 알로레비바이러스, 레비바이러스), 마이크로비리다에 (Microviridae) 과 (예컨대 속 알파3마이크로바이러스, G4마이크로바이러스, Phix174마이크로바이러스, 비델로마이크로바이러스, 클라미디아마이크로바이러스, 스피로마이크로바이러스) 및 플라스마비리다에 (Plasmaviridae) 과 (예컨대 속 플라스마바이러스) 유래일 수 있다.
임의로, 박테리오파지는 카우도비랄레스 목의 일부는 아니지만 미지정 목의 과, 예컨대, 제한없이, 암풀라비리다에 (Ampullaviridae), 푸셀로비리다에 (FuselloViridae), 글로불로비리다에 (Globuloviridae), 구타비리다에 (Guttaviridae), 리포트릭스비리다에 (Lipothrixviridae), 플레오리포비리다에 (Pleolipoviridae), 루디비리다에 (Rudiviridae), 살터프로바이러스 (Salterprovirus) 및 비카우다비리다에 (Bicaudaviridae) 과 유래의 고세균을 표적화한다.
박테리아 속 및 그들의 기지의 숙주-특이적 박테리아 바이러스의 비제한적인 목록은 하기 단락에 제시된다. 본 명세서에 개시된 박테리아 전달 비히클은 비제한적인 예로서, 하기 파지로부터, 조작될 수 있다. 동의어 및 철자 변형은 괄호에 표시된다. 동음이의어는 존재하는 만큼 자주 반복된다 (예를 들어, D, D, d). 무명의 파지는 그들 속 옆에 "NN"으로 표시되고 그들 번호는 괄호로 제공된다.
속 악티노마이세스 (Actinomyces)의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염될 수 있다: Av-I, Av-2, Av-3, BF307, CTl, CT2, CT3, CT4, CT6, CT7, CT8 및 1281.
속 애로모나스 (Aeromonas)의 박테리아는 하기 파지로 감염될 수 있다: AA-I, Aeh2, N, PMl, TP446, 3, 4, 11, 13, 29, 31, 32, 37, 43, 43-10T, 51, 54, 55R.1, 56, 56RR2, 57, 58, 59.1, 60, 63, Aehl, F, PM2, 1, 25, 31, 40RR2.8t, (syn= 44R), (syn= 44RR2.8t), 65, PM3, PM4, PM5 및 PM6.
속 바실러스 (Bacillus)의 박테리아는 하기 파지로 감염될 수 있다: A, aizl, Al-K-I, B, BCJAl, BCl, BC2, BLLl, BLl, BP142, BSLl, BSL2, BSl, BS3, BS8, BS15, BS18, BS22, BS26, BS28, BS31, BS104, BS105, BS106, BTB, B1715V1, C, CK-I, Coll, Corl, CP-53, CS-I, Csi, D, D, D, D5, entl, FP8, FP9, Fsi, FS2, FS3, FS5, FS8, FS9, G, GH8, GT8, GV-I, GV-2, GT-4, g3, gl2, gl3, gl4, gl6, gl7, g21, g23, g24, g29, H2, kenl, KK-88, Kuml, Kyul, J7W-1, LP52, (syn= LP-52), L7, Mexl, MJ-I, mor2, MP-7, MplO, MP12, MP14, MP15, Neol, N°2, N5, N6P, PBCl, PBLA, PBPl, P2, S-a, SF2, SF6, Shal, Sill, SP02, (syn= ΦSPP1), SPβ, STI, Sti, SU-Il, t, TbI, Tb2, Tb5, TbIO, Tb26, Tb51, Tb53, Tb55, Tb77, Tb97, Tb99, Tb560, Tb595, Td8, Td6, Tdl5, TgI, Tg4, Tg6, Tg7, Tg9, TgIO, TgIl, Tgl3, Tgl5, Tg21, Tinl, Tin7, Tin8, Tinl3, Tm3, Tocl, Togl, toll, TP-I, TP-10vir, TP-15c, TP-16c, TP-17c, TP-19, TP35, TP51, TP-84, Tt4, Tt6, A형, B형, C형, D형, E형, Tφ3, VA-9, W, wx23, wx26, Yunl, α, γ, pll, φmed-2, φT, φμ-4, φ3T, φ75, φ1O5, (syn= φ15), IA, IB, 1-97A, 1-97B, 2, 2, 3, 3, 3, 5, 12, 14, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 41C, 51, 63, 64, 138D, I, II, IV, NN-바실러스 (13), alel, Arl, AR2, AR3, AR7, AR9, Bace-11, (syn= 11), 바스티유, BLl, BL2, BL3, BL4, BL5, BL6, BL8, BL9, BP124, BS28, BS80, Ch, CP-51, CP-54, D-5, darl, denl, DP-7, entl, FoSi, FoS2, FS4, FS6, FS7, G, gall, 감마, Gel, GF-2, Gsi, GT-I, GT-2, GT-3, GT-4, GT-5, GT-6, GT-7, GV-6, gl5, 19, 110, Isi, K, MP9, MP13, MP21, MP23, MP24, MP28, MP29, MP30, MP32, MP34, MP36, MP37, MP39, MP40, MP41, MP43, MP44, MP45, MP47, MP50, NLP-I, No.l, N17, N19, PBSl, PKl, PMBl, PMB12, PMJl, S, SPOl, SP3, SP5, SP6, SP7, SP8, SP9, SplO, SP-15, SP50, (syn= SP-50), SP82, SST, subl, SW, Tg8, Tgl2, Tgl3, Tgl4, thul, thuΛ, thuS, Tin4, Tin23, TP-13, TP33, TP50, TSP-I, V형, VI형, V, Vx, β22, φe, φNR2, φ25, φ63, 1, 1, 2, 2C, 3NT, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 12, 17, 18, 19, 21, 138, III, 4 (비. 메가테리윈 (B. megateriwn)), 4 (비. 스파에리쿠스 (B. sphaericus)), AR13, BPP-IO, BS32, BS107, Bl, B2, GA-I, GP-IO, GV-3, GV-5, g8, MP20, MP27, MP49, Nf, PP5, PP6, SF5, Tgl8, TP-I, 베르사이유, φ15, φ29, 1-97, 837/IV, mi-바실러스 (1), BatlO, BSLlO, BSLI l, BS6, BSI l, BS16, BS23, BslOl, BS102, gl8, morl, PBLl, SN45, thu2, thu3, TmI, Tm2, TP-20, TP21, TP52, F형, G형, IV형, HN-BacMus (3), BLE, (syn= θc), BS2, BS4, BS5, BS7, BlO, B12, BS20, BS21, F, MJ-4, PBA12, AP50, AP50-04, AP50-11, AP50-23, AP50-26, AP50-27 및 Bam35. 하기 바실러스-특이적 파지는 결함성이다: DLP10716, DLP-11946, DPB5, DPB12, DPB21, DPB22, DPB23, GA-2, M, No. IM, PBLB, PBSH, PBSV, PBSW, PBSX, PBSY, PBSZ, phi, Spa, 1형 및 μ.
속 박테리오데스 (Bacteriodes)의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염될 수 있다: crAss-파지, ad I2, Baf-44, Baf-48B, Baf-64, Bf-I, Bf-52, B40-8, Fl, β1, φA1, φBrOl, φBrO2, 11, 67.1, 67.3, 68.1, mt-박테로이데스 (3), Bf42, Bf71, HN-비델로비브리오 (1) 및 BF-41.
속 보르데텔라 (Bordetella)의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염될 수 있다: 134 및 NN-보르데텔라 (3).
속 보렐리아 (Borrellia)의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염될 수 있다: NN-보렐리아 (1) 및 NN-보렐리아 (2).
속 브루셀라 (Brucella)의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염될 수 있다: A422, Bk, (syn= 버클리), BM29, FOi, (syn= FO1), (syn= FQ1), D, FP2, (syn= FP2), (syn= FD2), Fz, (syn= Fz75/13), (syn= 피렌체 75/13), (syn= Fi), Fi, (syn= Fl), Fim, (syn= FIm), (syn= Fim), FiU, (syn= FlU), (syn= FiU), F2, (syn= F2), F3, (syn= F3), F4, (syn= F4), F5, (syn= F5), F6, F7, (syn= F7), F25, (syn= F25), (syn= £25), F25U, (syn= F25u), (syn= F25U), (syn= F25V), F44, (syn= F44), F45, (syn= F45), F48, (syn= F48), I, Im, M, MC/75, M51, (syn= M85), P, (syn= D), S708, R, Tb, (syn= TB), (syn= 트빌리시), W, (syn= Wb), (syn= 웨이브릿지), X, 3, 6, 7, 10/1, (syn= 10), (syn= F8), (syn= F8), 12m, 24/11, (syn= 24), (syn= F9), (syn= F9), 45/111, (syn= 45), 75, 84, 212/XV, (syn= 212), (syn= Fi0), (syn= FlO), 371/XXIX, (syn= 371), (syn= Fn), (syn= Fll) 및 513.
속 버크홀데리아 (Burkholderia)의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염될 수 있다: CP75, NN-버크홀데리아 (1) 및 42.
속 캄필로박터 (Campylobacter)의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염될 수 있다: C형, NTCC12669, NTCC12670, NTCC12671, NTCC12672, NTCC12673, NTCC12674, NTCC12675, NTCC12676, NTCC12677, NTCC12678, NTCC12679, NTCC12680, NTCC12681, NTCC12682, NTCC12683, NTCC12684, 32f, 111c, 191, NN-캄필로박터 (2), Vfi-6, (syn= V19), VfV-3, V2, V3, V8, V16, (syn= Vfi-1), V19, V20(V45), V45, (syn= V-45) 및 NN-캄필로박터 (1).
속 클라미디아 (Chlamydia)의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염될 수 있다: Chpl.
속 클로스트리듐 (Clostridium)의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염될 수 있다: CAKl, CA5, Ca7, Ceβ (syn= 1C), Ceγ, Cldl, c-n71, c-203 Tox-, Deβ (syn= ID), (syn= lDt0X+), HM3, KMl, KT, Ms, Nal, (syn= Naltox+), PA135Oe, Pfo, PL73, PL78, PL81, Pl, P50, P5771, P19402, lCt0X+, 2Ct0X\2D3 (syn= 2Dt0X+), 3C, (syn= 3Ctox+), 4C, (syn= 4Ct0X+), 56, III-l, NN-클로스트리듐 (61), NBlt0X+, α1, Cal, HMT, HM2, PFl5 P-23, P-46, Q-05, Q-oe, Q-16, Q-21, Q-26, Q-40, Q-46, S111, SA02, WA01, WA03, Wm, W523, 80, C, CA2, CA3, CPTl, CPT4, cl, c4, c5, HM7, H11/A1, H18/Ax, FWS23, Hi58ZA1, K2ZA1, K21ZS23, ML, NA2t0X; Pf2, Pf3, Pf4, S9ZS3, S41ZA1, S44ZS23, α2, 41, 112ZS23, 214/S23, 233/Ai, 234/S23, 235/S23, II-l, II-2, II-3, NN-클로스트리듐 (12), Cal, Fl, K, S2, 1, 5 및 NN-클로스트리듐 (8).
속 코리네박테리움 (Corynebacterium)의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염될 수 있다: CGKl (결함성), A, A2, A3, AlOl, A128, A133, A137, A139, A155, A182, B, BF, B17, B18, B51, B271, B275, B276, B277, B279, B282, C, capi, CCl, CGl, CG2, CG33, CL31, Cog, (syn= CG5), D, E, F, H, H-I, hqi, hq2, 11ZH33, Ii/31, J, K, K, (syn= Ktox"), L, L, (syn= Ltox+), M, MC-I, MC-2, MC-3, MC-4, MLMa, N, O, ovi, ov2, ov3, P, P, R, RP6, RS29, S, T, U, UB1, ub2, UH1, UH3, uh3, uh5, uh6, β (syn= βox+), βhv64, βvir, γ, (syn= γtoχ-), γl9, δ (syn= δ'ox+), p, (syn= ptoχ-), Φ9, φ984, ω, IA, 1/1180, 2, 2/1180, 5/1180, 5ad/9717, 7/4465, 8/4465, 8ad/10269, 10/9253, 13Z9253, 15/3148, 21/9253, 28, 29, 55, 2747, 2893, 4498 및 5848.
속 (엔테로코커스)의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: DF78, Fl, F2, 1, 2, 4, 14, 41, 867, Dl, SB24, 2BV, 182, 225, C2, C2F, E3, E62, DS96, H24, M35, P3, P9, SblOl, S2, 2BII, 5, 182a, 705, 873, 881, 940, 1051, 1057, 21096C, NN-엔테로코커스 (1), Pel, Fl, F3, F4, VD13, 1, 200, 235 및 341.
속 에리시펠로트릭스 (Erysipelothrix)의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염될 수 있다: NN-에리시펠로트릭스 (1).
속 에스케리치아 (Escherichia)의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염될 수 있다: BW73, B278, D6, D108, E, El, E24, E41, FI-2, FI-4, FI-5, HI8A, Ffl8B, i, MM, Mu, (syn= mu), (syn= MuI), (syn= Mu-I), (syn= MU-I), (syn= MuI), (syn= μ), 025, PhI-5, Pk, PSP3, Pl, PlD, P2, P4 (결함성), Sl, Wφ, φK13, φR73 (결함성), φ1, φ2, φ7, φ92, ψ (결함성), 7 A, 8φ, 9φ, 15 (결함성), 18, 28-1, 186, 299, HH-에스케리치아 (2), AB48, CM, C4, C16, DD-VI, (syn= Dd-Vi), (syn= DDVI), (syn= DDVi), E4, E7, E28, fIl, FI3, H, Hl, H3, H8, K3, M, N, ND-2, ND-3, ND4, ND-5, ND6, ND-7, Ox-I (syn= oXl), (syn= HF), Ox-2 (syn= 0x2), (syn= 0X2), Ox-3, Ox-4, Ox-5, (syn= 0X5), Ox-6, (syn= 66F), (syn= φ66t), (syn= φ66t-)5 0111, PhI-I, RB42, RB43, RB49, RB69, S, SaI-I, Sal-2, Sal-3, Sal-4, Sal-5, Sal-6, TC23, TC45, TuII*-6, (syn= TuII*), TuIP-24, TuII*46, TuIP-60, T2, (syn= ganuTia), (syn= γ), (syn= PC), (syn= P.C.), (syn= T-2), (syn= T2), (syn= P4), T4, (syn= T-4), (syn= T4), T6, T35, α1, 1, IA, 3, (syn= Ac3), 3A, 3T+, (syn= 3), (syn= M1), 5φ (syn= φ5), 9266Q, CFO103, HK620, J, K, KlF, m59, no. A, no. E, no. 3, no. 9, N4, sd, (syn= Sd), (syn= SD), (syn= Sa)3 (syn= sd), (syn= SD), (syn= CD), T3, (syn= T-3), (syn= T3), T7, (syn= T-7), (syn= T7), WPK, W31, ΔH, φC3888, φK3, φK7, φK12, φV-1, Φ04-CF, Φ05, Φ06, Φ07, φ1, φ1.2, φ20, φ95, φ263, φ1O92, φ1, φ1l, (syn= φW), Ω8, 1, 3, 7, 8, 26, 27, 28-2, 29, 30, 31, 32, 38, 39, 42, 933W, NN-에스케리치아 (1), Esc-7-11, AC30, CVX-5, Cl, DDUP, eCl, EC2, E21, E29, Fl, F26S, F27S, Hi, HK022, HK97, (syn= ΦHK97), HK139, HK253, HK256, K7, ND-I, no.D, PA-2, q, S2, Tl, (syn= α), (syn= P28), (syn= T-I), (syn= Tx), T3C, T5, (syn= T-5), (syn= T5), UC-I, w, β4, γ2, λ (syn= 람다), (syn= Φλ), ΦD326, φγ, Φ06, Φ7, Φ10, φ80, χ (syn= χi), (syn= φχ), (syn= φχi), 2, 4, 4A, 6, 8A, 102, 150, 168, 174, 3000, AC6, AC7, AC28, AC43, AC50, AC57, AC81, AC95, HK243, KlO, ZG/3A, 5, 5A, 21EL, H19-J, 933H, O157 타이핑 파지 1 내지 16, JES-2013, 121Q, 172-1, 1720a-02, ADB-2, AKVF33, av-05, bV_EcoS_AHP42, bV_EcoS_AHP24, bC_EcoS_AHS24, bV_EcoS_AKS96 및 CBA120.
속 푸소박테리움 (Fusobacterium)의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: NN-푸소박테리움 (2), fv83-554/3, fv88-531/2, 227, fv2377, fv2527 및 fv8501.
속 해모필러스 (Haemophilus)의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: HPl, S2 및 N3.
속 헬리코박터 (Helicobacter)의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: HP1 및 ^^-헬리코박터 (1).
속 클렙시엘라 (Klebsiella)의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: AIO-2, KI4B, Kl6B, Kl9, (syn= K19), Kl14, Kl15, Kl21, Kl28, Kl29, KI32, Kl33, Kl35, Kl106B, Kl171B, Kl181B, Kl832B, AIO-I, AO-I, AO-2, AO-3, FC3-10, K, Kl1, (syn= kIl), Kl2, (syn= K12), Kl3, (syn= K13), (syn= Kl 70/11), Kl4, (syn= K14), Kl5, (syn= K15), Kl6, (syn= K16), Kl7, (syn= K17), Kl8, (syn= K18), Kl19, (syn= K19), Kl27, (syn= K127), Kl31, (syn= K131), Kl35, Kl171B, II, VI, IX, CI-I, Kl4B, Kl8, Kl11, Kl12, Kl13, Kl16, Kl17, Kl18, Kl20, Kl22, Kl23, Kl24, Kl26, Kl30, Kl34, Kl106B, kIi65B, Kl328B, KLXI, K328, P5046, 11, 380, III, IV, VII, VIII, FC3-11, Kl2B, (syn= K12B), Kl25, (syn= K125), Kl42B, (syn= K142), (syn= K142B), Kl181B, (syn= kIl 81), (syn= K1181B), Kl765/!, (syn= K1765/1), Kl842B, (syn= K1832B), Kl937B, (syn= K1937B), Ll, φ28, 7, 231, 483, 490, 632 및 864/100.
속 레피토스피라 (Lepitospira)의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: lEl, LE3, LE4 및 ~NN-렙토스피라 (1).
속 리스테리아 (Listeria)의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: A511, 01761, 4211, 4286, (syn= BO54), A005, A006, A020, A500, A502, A511, Al 18, A620, A640, B012, B021, B024, B025, B035, B051, B053, B054, B055, B056, BlOl, BI lO, B545, B604, B653, C707, D441, HSO47, HlOG, H8/73, H19, H21, H43, H46, H107, H108, HI lO, H163/84, H312, H340, H387, H391/73, H684/74, H924A, PSA, U153, φMLUP5, (syn= P35), 00241, 00611, 02971A, 02971C, 5/476, 5/911, 5/939, 5/11302, 5/11605, 5/11704, 184, 575, 633, 699/694, 744, 900, 1090, 1317, 1444, 1652, 1806, 1807, 1921/959, 1921/11367, 1921/11500, 1921/11566, 1921/12460, 1921/12582, 1967, 2389, 2425, 2671, 2685, 3274, 3550, 3551, 3552, 4276, 4277, 4292, 4477, 5337, 5348/11363, 5348/11646, 5348/12430, 5348/12434, 10072, 11355C, 11711A, 12029, 12981, 13441, 90666, 90816, 93253, 907515, 910716 및 NN-리스페리아 (15).
속 모르가넬라 (Morganella)의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: 47.
속 마이코박테리움 (Mycobacterium)의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: 13, aGl, aLi, ATCC 11759, A2, B.C3, BG2, BKl, BK5, 부티리컴, B-I, B5, B7, B30, B35, Clark, Cl, C2, DNAIII, DSP1, D4, D29, GS4E, (syn= GS4E), GS7, (syn= GS-7), (syn= GS7), iPa, 락티콜라, 레장드르, 레오, L5, (syn= ΦL-5), MC-I, MC-3, MC-4, 미네티, MTPHI l, Mx4, MyF3P/59a, phlei, (syn= phlei 1), phlei 4, 폴로누스 II, 라비노비츠키, 스메그마티스, TM4, TM9, tMlO, TM20, Y7, YlO, φ630, IB, IF, IH, 1/1, 67, 106, 1430, Bl, (syn= Bol), B24, D, D29, F-K, F-S, HP, 폴로누스 I, Roy, Rl, (syn= Rl-Myb), (syn= Ri), 11, 31, 40, 50, 103a, 103b, 128, 3111-D, 3215-D 및 NN-마이코박테리움 (1).
속 네이세리아 (Neisseria)의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: 그룹 I, 그룹 II 및 NPl.
속 노카르디아 (Nocardia)의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: MNP8, NJ-L, NS-8, N5 및 TtiN-노카르디아.
속 프로테우스 (Proteus)의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: Pm5, 13vir, 2/44, 4/545, 6/1004, 13/807, 20/826, 57, 67b, 78, 107/69, 121, 9/0, 22/608, 30/680, PmI, Pm3, Pm4, Pm6, Pm7, Pm9, PmIO, PmI 1, Pv2, πl, φm, 7/549, 9B/2, 10A/31, 12/55, 14, 15, 16/789, 17/971, 19A/653, 23/532, 25/909, 26/219, 27/953, 32A/909, 33/971, 34/13, 65, 5006M, 7480b, VI, 13/3a, 클리시 12, π2600, φχ7, 1/1004, 5/742, 9, 12, 14, 22, 24/860, 2600/D52, Pm8 및 24/2514.
속 프로비덴시아 (Providencia)의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: PL25, PL26, PL37, 9211/9295, 9213/921 Ib, 9248, 7/R49, 7476/322, 7478/325, 7479, 7480, 9000/9402 및 9213/921 Ia.
속 슈도모나스 (Pseudomonas)의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: PfI, (syn= Pf-I), Pf2, Pf3, PP7, PRRl, 7s, im-슈도모나스 (1), AI-I, AI-2, B 17, B89, CB3, Col 2, Col 11, Col 18, Col 21, C154, C163, C167, C2121, E79, F8, ga, gb, H22, K1, M4, N2, Nu, PB-I, (syn= PBl), pfl6, PMN17, PPl, PP8, Psal, PsPl, PsP2, PsP3, PsP4, PsP5, PS3, PS17, PTB80, PX4, PX7, PYOl, PYO2, PYO5, PYO6, PYO9, PYOlO, PYO13, PYO14, PYO16, PYO18, PYO19, PYO20, PYO29, PYO32, PYO33, PYO35, PYO36, PYO37, PYO38, PYO39, PYO41, PYO42, PYO45, PYO47, PYO48, PYO64, PYO69, PYO103, PlK, SLPl, SL2, S2, UNL-I, wy, Yai, Ya4, Yan, φBE, φCTX, φC17, φKZ, (syn=ΦKZ), φ-LT, Φmu78, φNZ, φPLS-1, φST-1, φW-14, φ-2, 1/72, 2/79, 3, 3/DO, 4/237, 5/406, 6C, 6/6660, 7, 7v, 7/184, 8/280, 9/95, 10/502, 11/DE, 12/100, 12S, 16, 21, 24, 25F, 27, 31, 44, 68, 71, 95, 109, 188, 337, 352, 1214, HN-슈도모나스 (23), A856, B26, CI-I, CI-2, C5, D, gh-1, Fl 16, HF, H90, K5, K6, K104, K109, K166, K267, N4, N5, O6N-25P, PE69, Pf, PPN25, PPN35, PPN89, PPN91, PP2, PP3, PP4, PP6, PP7, PP8, PP56, PP87, PPl 14, PP206, PP207, PP306, PP651, Psp231a, Pssy401, Pssy9220, psi, PTB2, PTB20, PTB42, PXl, PX3, pXlO, PX12, PX14, PYO70, PYO71, R, SH6, SH133, tf, Ya5, Ya7, φBS, ΦKf77, φ-MC, ΦmnF82, φPLS27, φPLS743, φS-1, 1, 2, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 12B, 13, 14, 15, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 20, 21, 21, 22, 23, 23, 24, 25, 31, 53, 73, 119x, 145, 147, 170, 267, 284, 308, 525, NN-슈도모나스 (5), af, A7, B3, B33, B39, BI-I, C22, D3, D37, D40, D62, D3112, F7, FlO, g, gd, ge, gξ Hwl2, Jb 19, KF1, L°, OXN-32P, O6N-52P, PCH-I, PC13-1, PC35-1, PH2, PH51, PH93, PH132, PMW, PM13, PM57, PM61, PM62, PM63, PM69, PM105, PMl 13, PM681, PM682, PO4, PPl, PP4, PP5, PP64, PP65, PP66, PP71, PP86, PP88, PP92, PP401, PP711, PP891, Pssy41, Pssy42, Pssy403, Pssy404, Pssy420, Pssy923, PS4, PS-IO, Pz, SDl, SLl, SL3, SL5, SM, φC5, φC11, φC11-1, φC13, φC15, φMO, φX, φO4, φ11, φ240, 2, 2F, 5, 7m, 11, 13, 13/441, 14, 20, 24, 40, 45, 49, 61, 73, 148, 160, 198, 218, 222, 236, 242, 246, 249, 258, 269, 295, 297, 309, 318, 342, 350, 351, 357-1, 400-1, HN-슈도모나스 (6), GlOl, M6, M6a, Ll, PB2, Pssyl5, Pssy4210, Pssy4220, PYO12, PYO34, PYO49, PYO50, PYO51, PYO52, PYO53, PYO57, PYO59, PYO200, PX2, PX5, SL4, φO3, φO6 및 1214.
속 리켓치아 (Rickettsia)의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: NN-리켓치아.
속 살모넬라 (Salmonella)의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: b, 베클, CT, d, 던디, f, FeIs 2, GI, GUI, GVI, GVIII, k, K, i, j, L, 01, (syn= 0-1), (syn= O1), (syn= O-I), (syn= 7), 02, 03, P3, P9a, PlO, Sab3, Sab5, SanlS, Sanl7, SI, 톤턴, ViI, (syn= ViI), 9, im살모넬라 (1), N-I, N-5, N-IO, N-17, N-22, 11, 12, 16-19, 20.2, 36, 449C/C178, 966A/C259, a, B.A.O.R., e, G4, GUI, L, LP7, M, MG40, N-18, PSA68, P4, P9c, P22, (syn= P22), (syn= PLT22), (syn= PLT22), P22al, P22-4, P22-7, P22-11, SNT-I, SNT-2, SP6, Villi, ViIV, ViV, ViVI, ViVII, 워크솝, Sj5, ε34, 1,37, 1(40), (syn= φ1[40]), 1,422, 2, 2.5, 3b, 4, 5, 6,14(18), 8, 14(6,7), 10, 27, 28B, 30, 31, 32, 33, 34, 36, 37, 39, 1412, SNT-3, 7-11, 40.3, c, C236, C557, C625, C966N, g, GV, G5, Gl 73, h, IRA, 저지, MB78, P22-1, P22-3, P22-12, Sab1, Sab2, Sab2, Sab4, Sanl, San2, San3, San4, San6, San7, San8, San9, San13, San14, San16, San18, San19, San20, San21, San22, San23, San24, San25, San26, SasL1, SasL2, SasL3, SasL4, SasL5, SlBL, SII, ViII, φ1, 1, 2, 3a, 3al, 1010, Ym-살모넬라 (1), N-4, SasL6 및 27.
속 세라티아 (Serratia)의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: A2P, PS20, SMB3, SMP, SMP5, SM2, V40, V56, ic, ΦCP-3, ΦCP-6, 3M, 10/la, 20A, 34CC, 34H, 38T, 345G, 345P, 501B, SMB2, SMP2, BC, BT, CW2, CW3, CW4, CW5, Lt232, L2232, L34, L.228, SLP, SMPA, V.43, σ, φCWl, ΦCP6-1, ΦCP6-2, ΦCP6-5, 3T, 5, 8, 9F, 10/1, 2OE, 32/6, 34B, 34CT, 34P, 37, 41, 56, 56D, 56P, 6OP, 61/6, 74/6, 76/4, 101/8900, 226, 227, 228, 229F, 286, 289, 290F, 512, 764a, 2847/10, 2847/1Oa, L.359 및 SMB1.
속 시겔라 (Shigella)의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: Fsa, (syn=a), FSD2d, (syn= D2d), (syn= W2d), FSD2E, (syn= W2e), fv, F6, f7.8, H-Sh, PE5, P90, SfII, Sh, SHm, SHrv, (syn= HIV), sHvi, (syn= HVI), SHVvm, (syn= HVIII), SKγ66, (syn= 감마 66), (syn= yββ), (syn= γ66b), SKm, (syn= SIIIb)5 (syn= UI), SKw, (syn= Siva), (syn= IV), SIC™ (syn= SIVA.), (syn= IVA), sKvi, (syn= KVI), (syn= Svi), (syn= VI), SKvm, (syn= Svm), (syn= VIII), SKVIIIA, (syn= SvmA), (syn= VIIIA), sTvi, STK, STx1, STxn, S66, W2, (syn= D2c), (syn= D20), φ1, φIVb 3-SO-R, 8368-SO-R, F7, (syn= FS7), (syn= K29), FlO, (syn= fSlO), (syn= K31), I1, (syn= 알파), (syn= fSa), (syn= Kl 8), (syn= α), I2, (syn= a), (syn= K19), SG33, (syn= G35), (syn= SO-35/G), SG35, (syn= SO-55/G), SG3201, (syn= SO-3201/G), SHn, (syn= HII), SHv, (syn= SHV), SHx, SHX, SKn, (syn= K2), (syn= KII), (syn= Sn), (syn= SsII), (syn= II), SKrv, (syn= Sm), (syn= SsIV), (syn= IV), SK1Va, (syn= Swab), (syn= SsIVa), (syn= iVa), SKV, (syn= K4), (syn= KV), (syn= SV), (syn= SsV), (syn= V), SKx, (syn= K9), (syn= KX), (syn= SX), (syn= SsX), (syn= X), STV, (syn= T35), (syn= 35-50-R), STvm, (syn= T8345), (syn= 8345-SO-S-R), W1, (syn= D8), (syn= FSD8), W2a, (syn= D2A), (syn= FS2a), DD-2, Sf6, fSi, (syn= Fl), SF6, (syn= F6), SG42, (syn= SO-42/G), SG3203, (syn= SO-3203/G), SKF12, (syn= SsF12), (syn= F12), (syn= F12), STn, (syn= 1881-SO-R), γ66, (syn= 감마 66a), (syn= Ssγ66), φ2, bIl, DDVII, (syn= DD7), FSD2b, (syn= W2B), FS2, (syn= F2), (syn= F2), FS4, (syn= F4), (syn= F4), FS5, (syn= F5), (syn= F5), FS9, (syn= F9), (syn= F9), FI l, P2-S0-S, SG36, (syn= SO-36/G), (syn= G36), SG3204, (syn= SO-3204/G), SG3244, (syn= SO-3244/G), sHi, (syn= HI), SHvπ (syn= HVII), SHK, (syn= HIX), SHx1, SHxπ (syn= HXn), SKI, KI, (syn= S1), (syn= SsI), SKVII, (syn= KVII), (syn= Svπ), (syn= SsVII), SKIX, (syn= KIX), (syn= S1x), (syn= SsIX), SKXII, (syn= KXII), (syn= Sxn), (syn= SsXII), sTi, STffl, STrv, STVi, STvπ, S70, S206, U2-S0-S, 3210-SO-S, 3859-SO-S, 4020-SO-S, φ3, φ5, φ7, φ8, φ9, φ10, φ13, φ14, φ18, SHm, (syn= Hπi), sHχi, (syn= HXt) 및 sKxI, (syn= KXI), (syn= Sχi), (syn= SsXI), (syn= XI).
속 스타필로코커스 (Staphylococcus)의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: A, EW, K, Ph5, Ph9, PhIO, Phl3, Pl, P2, P3, P4, P8, P9, P10, RG, SB-i, (syn= Sb-I), S3K, 트워트, ΦSK311, φ812, 06, 40, 58, 119, 130, 131, 200, 1623, STCl, (syn=stcl), STC2, (syn=stc2), 44AHJD, 68, aCl, AC2, A6"C", A9"C", b581, CA-I, CA-2, CA-3, CA-4, CA-5, DIl, L39x35, L54a, M42, Nl, N2, N3, N4, N5, N7, N8, NlO, Ni l, N12, N13, N14, N16, Ph6, Phl2, Phl4, UC-18, U4, U15, Sl, S2, S3, S4, S5, X2, Z1, φB5-2, φD, ω, 11, (syn= φ11), (syn= P11-M15), 15, 28, 28A, 29, 31, 31B, 37, 42D, (syn= P42D), 44A, 48, 51, 52, 52A, (syn= P52A), 52B, 53, 55, 69, 71, (syn= P71), 71A, 72, 75, 76, 77, 79, 80, 80α, 82, 82A, 83 A, 84, 85, 86, 88, 88A, 89, 90, 92, 95, 96, 102, 107, 108, 111, 129-26, 130, 130A, 155, 157, 157A, 165, 187, 275, 275A, 275B, 356, 456, 459, 471, 471A, 489, 581, 676, 898, 1139, 1154A, 1259, 1314, 1380, 1405, 1563, 2148, 2638A, 2638B, 2638C, 2731, 2792A, 2792B, 2818, 2835, 2848A, 3619, 5841, 12100, AC3, A8, AlO, A13, b594n, D, HK2, N9, N15, P52, P87, Sl, S6, Z4, φRE, 3A, 3B, 3C, 6, 7, 16, 21, 42B, 42C, 42E, 44, 47, 47A5 47C, 51, 54, 54x1, 70, 73, 75, 78, 81, 82, 88, 93, 94, 101, 105, 110, 115, 129/16, 174, 594n, 1363/14, 2460 및 mS-스타필로코커스 (1).
속 스트렙토코커스 (Streptococcus)의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: EJ-I, NN-스트렙토코카이스 (1), a, Cl, FL0Ths, H39, Cp-I, Cρ-5, Cp-7, Cp-9, Cp-IO, AT298, A5, alO/Jl, alO/J2, alO/J5, alO/J9, A25, BTI 1, b6, cAl, c20-1, c20-2, DP-I, Dp-4, DT1, ET42, elO, FA101, FEThs, Fκ, FKKIOI, FKLIO, FKP74, FKH, FLOThs, FyIOl, f1, F10, F20140/76, g, GT-234, HB3, (syn= HB-3), HB-623, HB-746, M102, O1205, φO1205, PST, PO, Pl, P2, P3, P5, P6, P8, P9, P9, P12, P13, P14, P49, P50, P51, P52, P53, P54, P55, P56, P57, P58, P59, P64, P67, P69, P71, P73, P75, P76, P77, P82, P83, P88, sc, sch, sf, SfIl 1, (syn= sFiI l), (syn= φSFill), (syn= φSfil 1), (syn= φSfil 1), sfil9, (syn= sFil9), (syn= φSFil9), (syn= φSfil9), Sfi21, (syn= sFi21), (syn= φSFi21), (syn= φSfi21), ST0, STX, st2, ST2, ST4, S3, (syn= φS3), s265, Φ17, φ42, Φ57, φ80, φ81, φ82, φ83, φ84, φ85, φ86, φ87, φ88, φ89, φ90, φ91, φ92, φ93, φ94, φ95, φ96, φ97, φ98, φ99, φ1OO, φ1Ol, φ1O2, φ227, Φ7201, ω1, ω2, ω3, ω4, ω5, ω6, ω8, ω1O, 1, 6, 9, 1OF, 12/12, 14, 17SR, 19S, 24, 50/33, 50/34, 55/14, 55/15, 70/35, 70/36, 71/ST15, 71/45, 71/46, 74F, 79/37, 79/38, 80/J4, 80/J9, 80/ST16, 80/15, 80/47, 80/48, 101, 103/39, 103/40, 121/41, 121/42, 123/43, 123/44, 124/44, 337/ST17 및 m스트렙토코커스 (34).
속 트레포네마 (Treponema)의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: NN-트레포네마 (1).
속 비브리오 (Vibrio)의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: CTXΦ, fs, (syn= si), fs2, Ivpf5, Vfl2, Vf33, VPIΦ, VSK, v6, 493, CP-Tl, ET25, 카파, K139, Labol, )XN-69P, OXN-86, O6N-21P, PB-I, P147, rp-1, SE3, VA-I, (syn= VcA-I), VcA-2, VPl, VP2, VP4, VP7, VP8, VP9, vPlO, VP17, VP18, VP19, X29, (syn= 29 데렐), t, ΦHAWI-1, ΦHAWI-2, ΦHAWI-3, ΦHAWI-4, ΦHAWI-5, ΦHAWI-6, ΦHAWI-7, XHAWI-8, ΦHAWI-9, ΦHAWI-10, ΦHCl-1, ΦHC1-2, ΦHC1-3, ΦHC1-4, ΦHC2-1, >HC2-2, ΦHC2-3, ΦHC2-4, ΦHC3-1, ΦHC3-2, ΦHC3-3, ΦHD1S-1, ΦHD1S-2, ΦHD2S-1, ΦHD2S-2, ΦHD2S-3, ΦHD2S-4, ΦHD2S-5, ΦHDO-1, ΦHDO-2, ΦHDO-3, ΦHDO-4, ΦHDO-5, ΦHDO-6, ΦKL-33, ΦKL-34, ΦKL-35, ΦKL-36, ΦKWH-2, ΦKWH-3, ΦKWH-4, ΦMARQ-1, ΦMARQ-2, ΦMARQ-3, ΦMOAT-1, ΦO139, ΦPEL1A-1, ΦPEL1A-2, ΦPEL8A-1, ΦPEL8A-2, ΦPEL8A-3, ΦPEL8C-1, ΦPEL8C-2, ΦPEL13A-1, ΦPEL13B-1, ΦPEL13B-2, ΦPEL13B-3, ΦPEL13B-4, ΦPEL13B-5, ΦPEL13B-6, ΦPEL13B-7, ΦPEL13B-8, ΦPEL13B-9, ΦPEL13B-10, φVP143, φVP253, Φ16, φ138, 1-II, 5, 13, 14, 16, 24, 32, 493, 6214, 7050, 7227, II, (syn= 그룹 II), (syn== φ2), V, VIII, ~m-비브리오 (13), KVP20, KVP40, nt-1, O6N-22P, P68, el, e2, e3, e4, e5, FK, G, I, K, nt-6, Nl, N2, N3, N4, N5, O6N-34P, OXN-72P, OXN-85P, OXN-100P, P, Ph-I, PL163/10, Q, S, T, φ92, 1-9, 37, 51, 57, 70A-8, 72A-4, 72A-10, 110A-4, 333, 4996, I (syn= 그룹 I), III (syn= 그룹 III), VI, (syn= A-Saratov), VII, IX, X, HN-비브리오 (6), pAl, 7, 7-8, 70A-2, 71A-6, 72A-5, 72A-8, 108A-10, 109A-6, 109A-8, llOA-1, 110A-5, 110A-7, hv-1, OXN-52P, P13, P38, P53, P65, P108, Pill, TPl3 VP3, VP6, VP12, VP13, 70A-3, 70A-4, 70A-10, 72A-1, 108A-3, 109-B1, 110A-2, 149, (syn= φ149), IV, (syn= 그룹 IV), NN-비브리오 (22), VP5, VPIl, VP15, VP16, α1, α2, α3a, α3b, 353B 및 HN-비브리오 (7).
속 여시니아 (Yersinia)의 박테리아는 하기 파지에 의해 감염된다: H, H-I, H-2, H-3, H-4, 루카스 110, 루카스 303, 루카스 404, YerA3, YerA7, YerA20, YerA41, 3/M64-76, 5/G394-76, 6/C753-76, 8/C239-76, 9/F18167, 1701, 1710, PST, 1/F2852-76, 데렐, EV, H, 코틀랴로바, PTB, R, Y, YerA41, φYerO3-12, 3, 4/C1324-76, 7/F783-76, 903, 1/M6176 및 Yer2AT.
보다 바람직하게, 박테리아 전달 비히클로서 사용되는 박테리오파지는 하기로 이루어진 군에서 선택된다: 살모넬라 바이러스 SKML39, 시겔라 바이러스 AG3, 딕케야 바이러스 라임스톤, 딕케야 바이러스 RC2014, 에스케리치아 바이러스 CBA120, 에스케리치아 바이러스 PhaxI, 살모넬라 바이러스 38, 살모넬라 바이러스 Det7, 살모넬라 바이러스 GG32, 살모넬라 바이러스 PM10, 살모넬라 바이러스 SFP10, 살모넬라 바이러스 SH19, 살모넬라 바이러스 SJ3, 에스케리치아 바이러스 ECML4, 살모넬라 바이러스 마샬, 살모넬라 바이러스 메이나드, 살모넬라 바이러스 SJ2, 살모넬라 바이러스 STML131, 살모넬라 바이러스 ViI, 어위니아 바이러스 Ea2809, 클렙시엘라 바이러스 0507KN21, 세라티아 바이러스 IME250, 세라티아 바이러스 MAM1, 캄필로박터 바이러스 CP21, 캄필로박터 바이러스 CP220, 캄필로박터 바이러스 CPt10, 캄필로박터 바이러스 IBB35, 캄필로박터 바이러스 CP81, 캄필로박터 바이러스 CP30A, 캄필로박터 바이러스 CPX, 캄필로박터 바이러스 NCTC12673, 어위니아 바이러스 Ea214, 어위니아 바이러스 M7, 에스케리치아 바이러스 AYO145A, 에스케리치아 바이러스 EC6, 에스케리치아 바이러스 HY02, 에스케리치아 바이러스 JH2, 에스케리치아 바이러스 TP1, 에스케리치아 바이러스 VpaE1, 에스케리치아 바이러스 wV8, 살모넬라 바이러스 FelixO1, 살모넬라 바이러스 HB2014, 살모넬라 바이러스 머쉬룸, 살모넬라 바이러스 UAB87, 시드로박터 바이러스 무글, 시드로박터 바이러스 모르딘, 에스케리치아 바이러스 SUSP1, 에스케리치아 바이러스 SUSP2, 아에로모나스 바이러스 phiO18P, 해모필러스 바이러스 HP1, 해모필러스 바이러스 HP2, 파스퇴렐라 바이러스 F108, 비브리오 바이러스 K139, 비브리오 바이러스 Kappa, 버크홀데리아 바이러스 phi52237, 버크홀데리아 바이러스 phiE122, 버크홀데리아 바이러스 phiE202, 에스케리치아 바이러스 186, 에스케리치아 바이러스 P4, 에스케리치아 바이러스 P2, 에스케리치아 바이러스 Wphi, 만헤이미아 바이러스 PHL101, 슈도모나스 바이러스 phiCTX, 랄스토니아 바이러스 RSA1, 살모넬라 바이러스 Fels2, 살모넬라 바이러스 PsP3, 살모넬라 바이러스 SopEphi, 여시니아 바이러스 L413C, 스타필로코커스 바이러스 G1, 스타필로코커스 바이러스 G15, 스타필로코커스 바이러스 JD7, 스타필로코커스 바이러스 K, 스타필로코커스 바이러스 MCE2014, 스타필로코커스 바이러스 P108, 스타필로코커스 바이러스 Rodi, 스타필로코커스 바이러스 S253, 스타필로코커스 바이러스 S25-4, 스타필로코커스 바이러스 SA12, 리스테리아 바이러스 A511, 리스테리아 바이러스 P100, 스타필로코커스 바이러스 레무스, 스타필로코커스 바이러스 SA11, 스타필로코커스 바이러스 Stau2, 바실러스 바이러스 캠프호크, 바실러스 바이러스 SPO1, 바실러스 바이러스 BCP78, 바실러스 바이러스 챠르봄바, 스타필로코커스 바이러스 Twort, 엔테로코커스 바이러스 phiEC24C, 락토바실러스 바이러스 Lb338-1, 락토바실러스 바이러스 LP65, 엔테로박터 바이러스 PG7, 에스케리치아 바이러스 CC31, 클렙시엘라 바이러스 JD18, 클렙시엘라 바이러스 PKO111, 에스케리치아 바이러스 Bp7, 에스케리치아 바이러스 IME08, 에스케리치아 바이러스 JS10, 에스케리치아 바이러스 JS98, 에스케리치아 바이러스 QL01, 에스케리치아 바이러스 VR5, 엔테로박터 바이러스 Eap3, 클렙시엘라 바이러스 KP15, 클렙시엘라 바이러스 KP27, 클렙시엘라 바이러스 마티스, 클렙시엘라 바이러스 Miro, 시드로박터 바이러스 멀린, 시드로박터 바이러스 Moon, 에스케리치아 바이러스 JSE, 에스케리치아 바이러스 phi1, 에스케리치아 바이러스 RB49, 에스케리치아 바이러스 HX01, 에스케리치아 바이러스 JS09, 에스케리치아 바이러스 RB69, 시겔라 바이러스 UTAM, 살모넬라 바이러스 S16, 살모넬라 바이러스 STML198, 비브리오 바이러스 KVP40, 비브리오 바이러스 nt1, 비브리오 바이러스 ValKK3, 에스케리치아 바이러스 VR7, 에스케리치아 바이러스 VR20, 에스케리치아 바이러스 VR25, 에스케리치아 바이러스 VR26, 시겔라 바이러스 SP18, 에스케리치아 바이러스 AR1, 에스케리치아 바이러스 C40, 에스케리치아 바이러스 E112, 에스케리치아 바이러스 ECML134, 에스케리치아 바이러스 HY01, 에스케리치아 바이러스 Ime09, 에스케리치아 바이러스 RB3, 에스케리치아 바이러스 RB14, 에스케리치아 바이러스 T4, 시겔라 바이러스 Pss1, 시겔라 바이러스 Shfl2, 여시니아 바이러스 D1, 여시니아 바이러스 PST, 아시네토박터 바이러스 133, 아에로모나스 바이러스 65, 아에로모나스 바이러스 Aeh1, 에스케리치아 바이러스 RB16, 에스케리치아 바이러스 RB32, 에스케리치아 바이러스 RB43, 슈도모나스 바이러스 42, 크로노박터 바이러스 CR3, 크로노박터 바이러스 CR8, 크로노박터 바이러스 CR9, 크로노박터 바이러스 PBES02, 펙토박테리움 바이러스 phiTE, 크로노박터 바이러스 GAP31, 에스케리치아 바이러스 4MG, 살모넬라 바이러스 SE1, 살모넬라 바이러스 SSE121, 에스케리치아 바이러스 FFH2, 에스케리치아 바이러스 FV3, 에스케리치아 바이러스 JES2013, 에스케리치아 바이러스 V5, 브레비바실러스 바이러스 아보우오, 브레비바실러스 바이러스 데이비스, 바실러스 바이러스 아게이트, 바실러스 바이러스 Bobb, 바실러스 바이러스 Bp8pC, 어위니아 바이러스 데이모스, 어위니아 바이러스 Ea35-70, 어위니아 바이러스 RAY, 어위니아 바이러스 Simmy50, 어위니아 바이러스 SpecialG, 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바이러스 phi8, 슈도모나스 바이러스 phi12, 슈도모나스 바이러스 phi13, 슈도모나스 바이러스 phi2954, 슈도모나스 바이러스 phiNN, 슈도모나스 바이러스 phiYY, 비브리오 바이러스 fs1, 비브리오 바이러스 VGJ, 랄스토니아 바이러스 RS603, 랄스토니아 바이러스 RSM1, 랄스토니아 바이러스 RSM3, 에스케리치아 바이러스 M13, 에스케리치아 바이러스 I22, 살모넬라 바이러스 IKe, 아콜레플라스마 바이러스 L51, 비브리오 바이러스 fs2, 비브리오 바이러스 VFJ, 에스케리치아 바이러스 If1, 프로피오니박테리움 바이러스 B5, 슈도모나스 바이러스 Pf1, 슈도모나스 바이러스 Pf3, 랄스토니아 바이러스 PE226, 랄스토니아 바이러스 RSS1, 스피로플라스마 바이러스 SVTS2, 스테노트로포모나스 바이러스 PSH1, 스테노트로포모나스 바이러스 SMA6, 스테노트로포모나스 바이러스 SMA7, 스테노트로포모나스 바이러스 SMA9, 비브리오 바이러스 CTXphi, 비브리오 바이러스 KSF1, 비브리오 바이러스 VCY, 비브리오 바이러스 Vf33, 비브리오 바이러스 VfO3K6, 잔토모나스 바이러스 Cf1c, 스피로플라스마 바이러스 C74, 스피로플라스마 바이러스 R8A2B, 스피로플라스마 바이러스 SkV1CR23x, 에스케리치아 바이러스 FI, 에스케리치아 바이러스 Q베타, 에스케리치아 바이러스 BZ13, 에스케리치아 바이러스 MS2, 에스케리치아 바이러스 알파3, 에스케리치아 바이러스 ID21, 에스케리치아 바이러스 ID32, 에스케리치아 바이러스 ID62, 에스케리치아 바이러스 NC28, 에스케리치아 바이러스 NC29, 에스케리치아 바이러스 NC35, 에스케리치아 바이러스 phiK, 에스케리치아 바이러스 St1, 에스케리치아 바이러스 WA45, 에스케리치아 바이러스 G4, 에스케리치아 바이러스 ID52, 에스케리치아 바이러스 탈모스, 에스케리치아 바이러스 phiX174, 브델로비브리오 바이러스 MAC1, 브델로비브리오 바이러스 MH2K, 클라미디아 바이러스 Chp1, 클라미디아 바이러스 Chp2, 클라미디아 바이러스 CPAR39, 클라미디아 바이러스 CPG1, 스피로플라스마 바이러스 SpV4, 아콜레플라스마 바이러스 L2, 슈도모나스 바이러스 PR4, 슈도모나스 바이러스 PRD1, 바실러스 바이러스 AP50, 바실러스 바이러스 Bam35, 바실러스 바이러스 GIL16, 바실러스 바이러스 Wip1, 에스케리치아 바이러스 phi80, 에스케리치아 바이러스 RB42, 에스케리치아 바이러스 T2, 에스케리치아 바이러스 T3, 에스케리치아 바이러스 T6, 에스케리치아 바이러스 VT2-Sa, 에스케리치아 바이러스 VT1-사카이, 에스케리치아 바이러스 VT2-사카이, 에스케리치아 바이러스 CP-933V, 에스케리치아 바이러스 P27, 에스케리치아 바이러스 Stx2phi-I, 에스케리치아 바이러스 Stx1phi, 에스케리치아 바이러스 Stx2phi-II, 에스케리치아 바이러스 CP-1639, 에스케리치아 바이러스 BP-4795, 에스케리치아 바이러스 86, 에스케리치아 바이러스 Min27, 에스케리치아 바이러스 2851, 에스케리치아 바이러스 1717, 에스케리치아 바이러스 YYZ-2008, 에스케리치아 바이러스 EC026_P06, 에스케리치아 바이러스 ECO103_P15, 에스케리치아 바이러스 ECO103_P12, 에스케리치아 바이러스 ECO111_P16, 에스케리치아 바이러스 ECO111_P11, 에스케리치아 바이러스 VT2phi_272, 에스케리치아 바이러스 TL-2011c, 에스케리치아 바이러스 P13374, 에스케리치아 바이러스 Sp5.
일 구현예에서, 박테리아 전달 비히클은 이. 콜라이를 표적화하고 하기로 이루어진 군에서 선택되는 박테리오파지의 캡시드를 포함한다: BW73, B278, D6, D108, E, El, E24, E41, FI-2, FI-4, FI-5, HI8A, Ffl8B, i, MM, Mu, 025, PhI-5, Pk, PSP3, Pl, PlD, P2, P4, Sl, Wφ, φK13, φ1, φ2, φ7 φ92, 7 A, 8φ, 9φ, 18, 28-1, 186, 299, HH-에스케리치아 (2), AB48, CM, C4, C16, Dd-VI, E4, E7, E28, FIl, FI3, H, H1, H3, H8, K3, M, N, ND-2, ND-3, ND4, ND-5, ND6, ND-7, Ox-I, Ox-2, Ox-3, Ox-4, Ox-5, Ox-6, PhI-I, RB42, RB43, RB49, RB69, S, SaI-I, Sal-2, Sal-3, Sal-4, Sal-5, Sal-6, TC23, TC45, TuII*-6, TuIP-24, TuII*46, TuIP-60, T2, T4, T6, T35, α1, 1, IA, 3, 3A, 3T+, 5φ, 9266Q, CFO103, HK620, J, K, KlF, m59, no. A, no. E, no. 3, no. 9, N4, sd, T3, T7, WPK, W31, ΔH, φC3888, φK3, φK7, φK12, φV-1, Φ04-CF, Φ05, Φ06, Φ07, φ1, φ1.2, φ20, φ95, φ263, φ1O92, φ1, φl1, Ω8, 1, 3, 7, 8, 26, 27, 28-2, 29, 30, 31, 32, 38, 39, 42, 933W, NN-에스케리치아 (1), Esc-7-11, AC30, CVX-5, Cl, DDUP, ECl, EC2, E21, E29, Fl, F26S, F27S, Hi, HK022, HK97, HK139, HK253, HK256, K7, ND-I, PA-2, q, S2, Tl), T3C, T5, UC-I, w, β4, γ2, λ, ΦD326, φγ, Φ06, Φ7, Φ10, φ80, χ, 2, 4, 4A, 6, 8A, 102, 150, 168, 174, 3000, AC6, AC7, AC28, AC43, AC50, AC57, AC81, AC95, HK243, KlO, ZG/3A, 5, 5A, 21EL, H19-J 및 933H.
유전자 회로가 박테리아 전달 비히클에 패키징되는 구현예에서, 상기 유전자 회로는 패키징을 위해 신호전달하는 핵산 서열을 포함할 수 있고, 도너 세포는 박테리오파지 스캐폴딩 단백질을 발현할 수 있다. 패키징을 위해 신호전달하는 상기 서열 및 상기 박테리오파지 스캐폴딩 단백질은 박테리아 전달 비히클로서 사용되는 박테리오파지의 성질에 따라서 당업자가 선택한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 박테리아 도너 세포 및/또는 박테리아 수령체 세포는 그들 성장 또는 박테리아 도너 세포 및/또는 박테리아 수령체 세포의 임의의 다른 바람직한 기능을 향상시키도록 프리바이오틱스의 존재 하에서 사용될 수 있다. 프리바이오틱스는 아미노산, 바이오틴, 프룩토-올리고당, 갈락토-올리고당, 헤미셀룰로스 (예를 들어, 아라비노실란, 실란, 실로글루칸, 및 글루코만난), 인슐린, 키틴, 락툴로스, 만난 올리고당, 올리고프룩토스-농축 이눌린, 검 (예를 들어, 구아르 검, 검 아라빅, 및 카리기난), 올리고프룩토스, 올리고덱스트로스, 타가토스, 저항성 말토덱스트린 (예를 들어, 저항성 전분), 트랜스-갈락토올리고당, 펙틴 (예를 들어, 실로갈락토우로난, 시트러스 펙틴, 사과 펙틴, 및 람노갈락투로난-I), 식이성 섬유 (예를 들어, 콩 섬유, 사탕무 섬유, 완두콩 섬유, 옥수수겨, 및 귀리 섬유) 및 자일로올리고당을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
추가 구현예에서, 유전자 회로에 함유되고 리프레서 결합 서열의 전사 제어 하에 위치하는 관심 핵산 서열은 항생제에 대한 내성을 부여하는 단백질을 코딩한다. 본 명세서에서 사용되는 "항생제"는 바람직하게 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 항생제를 지칭한다: 페니실린 예컨대 페니실린 G, 페니실린 K, 페니실린 N, 페니실린 O, 페니실린 V, 메티실린, 벤질페니실린, 나프실린, 옥사실린, cl옥사실린, 디클록사실린, 암피실린, 아목시실린, 피밤피실린, 헤타실린, 바캄피실린, 메탐피실린, 탈람피실린, 에피실린, 카르베니실린, 티카르실린, 테모실린, 메즐로실린, 및 피페라실린; 세팔로스포린 예컨대 세파세트릴, 세파드록실, 세팔렉신, 세팔로글리신, 세팔로늄, 세팔로리딘, 세팔로틴, 세파피린, 세파트리진, 세파자플루어, 세파제돈, 세파졸린, 세프라딘, 세프록사딘, 세프테졸, 세파클로어, 세포니시드, 세프프로질, 세푸록심, 세푸조남, 세프메타졸, 세포테탄, 세폭시틴, 로라카르베프, 세프부페라존, 세프미녹스, 세포테탄, 세폭시틴, 세포티암, 세프카펜, 세프달록심, 세프디니르, 세프디토렌, 세페타메트, 세픽심, 세프메녹심, 세포디짐, 세포탁심, 세포벡신, 세프피미졸, 세프포독심, 세프테람, 세프타메르, 세프티부텐, 세프티오푸어, 세프티올렌, 세프티족심, 세프트리악손, 세포페라존, 세프타지딤, 라타목세프, 세프클리딘, 세페핌, 세플루프레남, 세포셀리스, 세포조프란, 세프피롬, 세프퀴놈, 플로목세프, 세프토비프롤, 세프타롤린, 세프톨로잔, 세팔로람, 세파파롤, 세프카넬, 세페드롤로어, 세펨피돈, 세페트리졸, 세피비트릴, 세프마틸렌, 세프메피디움, 세폭사졸, 세프로틸, 세프수미드, 세프티옥시드, 세푸라세팀, 및 니트로세핀; 폴리믹신 예컨대 폴리스포린, 네오스포린, 폴리믹신 B, 및 폴리믹신 E, 리팜피신 예컨대 리팜피신, 리파펜틴, 및 리팍시민; 피닥소미신; 퀴놀론 예컨대 시녹사신, 날리딕산, 옥솔린산, 피로미드산, 피페미드산, 로속사신, 시프로플록사신, 에녹사신, 플레록사신, 로메플록사신, 나디플록사신, 노르플록사신, 오프록사신, 페플록사신, 루플록사신, 발로플록사신, 그레파플록사신, 레보플록사신, 파주플록사신, 테마플록사신, 토수플록사신, 클리나플록사신, 가티플록사신, 제미플록사신, 목시플록사신, 시타플록사신, 트로바플록사신, 프룰리플록사신, 델라플록사신, 네모녹사신, 및 자보플록사신; 술폰아미드 예컨대 술파푸라졸, 술파세타미드, 술파디아진, 술파디미딘, 술파푸라졸, 술피소미딘, 술파독신, 술파메톡사졸, 술파목솔, 술파니트란, 술파디메톡신, 술파메톡시피리다진, 술파메톡시디아진, 술파독신, 술파메토피라진, 및 테레프틸; 마크롤리드 예컨대 아지트로마이신, 클라리트로마이신, 에리트로마이신, 피닥소미신, 텔리트로마이신, 카르보마이신 A, 조사마이신, 키타사마이신, 메디카마이신, 올레안도마이신, 솔리트로마이신, 피라마이신, 트롤레안도마이신, 틸로신, 및 록시트로마이신; 케톨리드 예컨대 텔리트로마이신, 및 세트로마이신; 루오로케톨리드 예컨대 솔리트로마이신; 린코사미드 예컨대 린코마이신, 클린다마이신, 및 필리마이신; 테트라사이클린 예컨대 데메클로사이클린, 독시사이클린, 미노사이클린, 옥시테트라사이클린, 및 테트라사이클린; 아미노글리코시드 예컨대 아미카신, 디베카신, 젠타미신, 카나마이신, 네오마이신, 네틸미신, 시소미신, 토브라마이신, 파로모마이신, 및 스트렙토마이신; 안사마이신 예컨대 젤다나마이신, 허비마이신, 및 리팍시민; 카르바세펨 예컨대 로라카르베프; 카르바페넴 예컨대 엘타페넴, 도리페넴, 이미페넴 (또는 실라스타틴), 및 메로페넴; 글리코펩티드 예컨대 테이코플라닌, 반코마이신, 텔라반신, 달바반신, 및 오리타반신; 린코사미드 예컨대 클린다마이신, 및 린코마이신; 리포펩티드 예컨대 답토마이신; 모노박탐 예컨대 아즈트레오남; 니트로퓨란 예컨대 퓨라졸리돈, 및 니트로퓨란토인; 옥사졸리디논 예컨대 리네졸리드, 포시졸리드, 라데졸리드, 및 토레졸리드; 테익소박틴, 클로파지민, 답손, 카프레오마이신, 시클로세린, 에탐부톨, 에티온아미드, 이소니아지드, 피라진아미드, 리파부틴, 아르스펜아민, 클로람페니콜, 포스포마이신, 푸시드산, 메트로니다졸, 무피로신, 플라텐시마이신, 퀴누프리스틴 (또는 달포프리스틴), 티암페니콜, 티게사이클린, 티니다졸, 트리메토프림, 알라트로플록사신, 피닥소마이신, 날리딕스산, 리팜핀, 이의 유도체, 및 조합. 특히, 용어 "항생제에 대한 내성을 부여하는 단백질"은 임의의 이들 항생제에 대한 내성을 부여하는 단백질을 의미할 수 있다.
본 발명은 본 명세서에 개시된 바와 같은 도너 세포를 사용하여, 바람직하게 박테리아 전달 비히클을 제조하기 위한 본 발명의 방법을 사용하여 제조된 하나 이상의 박테리아 전달 비히클, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 또는 수의학 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 수령체 또는 표적 세포, 예컨대 예를 들어 프로바이오틱, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 또는 수의학 조성물을 제공하고, 여기서 유전자 회로가 본 명세서에 개시된 바와 같이 전달되었다. 본 발명은 또한 본 명세서에 개시된 바와 같은, 즉, 유전자 회로를 포함하고 리프레서 단백질을 발현하는, 도너 세포, 예컨대 예를 들어 프로바이오틱, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 또는 수의학 조성물을 제공한다. 일반적으로, 약학 용도를 위해서, 박테리아 전달 비히클은 적어도 하나의 박테리아 전달 비히클 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제, 및 임의로 하나 이상의 추가의 약학적으로 활성인 화합물을 포함하는 약학 조제물 또는 조성물로서 제제화될 수 있다. 이러한 제제는 경구 투여, 비경구 투여 (예컨대 정맥내, 근육내, 또는 피하 주사 또는 정맥내 주입), 국소 투여, 흡입에 의한 투여, 피부 팻치, 임플란트, 좌제 등에 적합한 형태일 수 있다. 이러한 투여 형태는 투여 방식 및 경로에 의존하여, 고형, 반고형, 또는 액상일 수 있다. 예를 들어, 경구 투여를 위한 제제는 제제 내 합성 박테리아 전달 비히클이 위 환경에 내성이어서 장으로 통과할 수 있게 하는 장용성 제피가 제공될 수 있다. 보다 일반적으로, 경구 투여를 위한 합성 박테리아 전달 비히클 제제는 위장관의 임의의 바람직한 부분에 전달을 위해 적합하게 제제화될 수 있다. 또한, 적합한 좌제는 위장관으로 전달을 위해 사용될 수 있다. 박테리아 전달 비히클 조성물에서 유용한 다양한 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 및 부형제는 당업자에게 공지되어 있다.
본 개시에 따른 약학 또는 수의학 조성물은 약학적으로 허용가능한 비히클을 더 포함할 수 있다. 고형의 약학적으로 허용가능한 비히클은 풍미제, 윤활제, 가용화제, 현탁제, 염료, 충전제, 활택제, 압착 보조제, 불활성 결합제, 감미제, 보존제, 염료, 코팅제, 또는 정제-붕해제로서도 작용할 수 있는 하나 이상의 물질을 포함할 수 있다. 적합한 고형 비히클은 예를 들어 칼슘 포스페이트, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 당류, 락토스, 덱스트린, 전분, 젤라틴, 셀룰로스, 폴리비닐피롤리딘, 저용융 왁스, 및 이온 교환 수지를 포함한다.
약학 또는 수의학 조성물은 멸균된 물, 염수, 또는 다른 적절한 멸균된 주사용 매질을 사용하여 투여 시에 현탁시킬 수 있는 멸균 고형 조성물로서 제조될 수 있다. 본 개시의 약학 또는 수의학 조성물은 다른 용질 또는 현탁제 (예를 들어, 용액을 등장성으로 만들기에 충분한 염수 또는 포도당), 담즙염, 아카시아, 젤라틴, 솔비탄 모놀레에이트, 폴리솔베이트 80 (에틸렌 옥시드와 공중합된 솔비톨의 올레에이트 에스테르 및 이의 무수물) 등을 함유하는 멸균 용액 또는 현탁액의 형태로 경구로 투여될 수 있다. 본 개시에 따른 입자는 또한 액상 또는 고형 조성물 형태로 경구로 투여될 수 있다. 경구 투여에 적합한 조성물은 고체 형태, 예컨대 알약, 캡슐, 과립, 정제, 및 분말, 및 액체 형태, 예컨대 용액, 시럽, 엘릭시르, 및 현탁액을 포함한다. 장 투여에 유용한 형태는 멸균 용액, 에멀션, 및 현탁액을 포함한다.
본 명세서에 개시된 제조 방법에 따라서 제조된, 박테리아 전달 비히클은 약학적으로 허용가능한 액상 비히클 예컨대 물, 유기 용매, 둘 모두 또는 약학적으로 허용가능한 오일 또는 지방의 혼합물에 용해 또는 현탁될 수 있다. 액상 비히클은 다른 적합한 약학 첨가제 예컨대 가용화제, 유화제, 완충제, 보존제, 감미제, 풍미제, 현탁제, 증점제, 착색제, 점도 조절제, 안정화제, 또는 삼투-조절제를 함유할 수 있다. 경구 및 장 투여를 위한 액상 비히클의 적합한 예는 물 (상기와 같은 첨가제, 예를 들어, 셀룰로스 유도체, 바람직하게 소듐 카르복시메틸 셀룰로스 용액을 부분적으로 함유), 알콜 (1가 알콜 및 다가 알콜, 예를 들어, 글리콜을 포함) 및 그들 유도체, 및 오일 (예를 들어, 분별 코코넛 오일 및 땅콩 오일)을 포함한다. 비경구 투여의 경우, 비히클은 또한 유성 에스테르 예컨대 에틸 올레에이트 및 이소프로필 미리스테이트일 수 있다. 멸균 액상 비히클은 장 투여를 위한 멸균된 액상 형태 조성물에서 유용하다. 가압 조성물을 위한 액상 비히클은 할로겐화된 탄화수소 또는 다른 약학적으로 허용가능한 추진제일 수 있다.
경피 투여의 경우, 약학 또는 수의학 조성물은 연고, 크림, 또는 겔 형태로 제제화될 수 있고, 적절한 침투제 또는 세제, 예컨대 디메틸 술폭시드, 디메틸 아세타미드, 및 디메틸포름아미드를 사용하여 침투를 촉진시킬 수 있다.
경점막 투여의 경우, 비강 분무기, 직장 또는 질 좌제가 사용될 수 있다. 활성 화합물은 당분야에 공지된 방법을 통해서 임의의 기지의 좌제 베이스에 혼입될 수 있다. 이러한 베이스의 예는 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜 (카보왁스), 폴리에틸렌 솔비탄 모노스테아레이트, 및 이들과 용융점 또는 용해율을 변형시키기 위한 다른 상용성 물질의 혼합물을 포함한다.
또한 본 명세서에 개시된 조성물을 사용하여, 박테리아에 의해 초래된 질환 또는 질병, 바람직하게 박테리아 감염을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 양태에서, 관심 핵산을 포함하는 유전자 회로는 질환 또는 질병을 초래하는 하나 이상의 박테리아, 즉, 표적 세포에 전달된다. 방법은 본 명세서에 개시된 약학 또는 수의학 조성물, 바람직하게 본 명세서에 개시된 약학 또는 수의학 조성물의 치료적 유효량을, 치료를 필요로 하는, 박테리아에 의해 초래된 질환 또는 장애, 바람직하게 박테리아 감염을 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 또한 특히, 박테리아에 의해 초래된 질환 또는 질병의 치료, 바람직하게 박테리아 감염의 치료에서, 약물로서 사용을 위한 본 명세서에 개시된 바와 같은 약학 또는 수의학 조성물을 제공한다. 또한 박테리아에 의해 초래된 질환 또는 질병, 바람직하게 박테리아 감염을 치료하기 위한 약물의 제조를 위한 본 명세서에 개시된 바와 같은 약학 또는 수의학 조성물의 용도를 제공한다.
일부 구현예에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 특정 구현예에서, 대상체는 인간이다.
박테리아에 의해 야기된 질환 또는 질병은 복부 경련, 여드름, 급성 후두개염, 관절염, 균혈증, 혈성 설사, 보툴리누스 중독증, 브루셀라병, 뇌농양, 연성하감 성병, 클라미디아, 클론병, 결막염, 담낭염, 직결장암, 폴립증, 군집붕괴, 라임병, 설사, 디프테리아, 십이지장 궤양, 심내막염, 에리시펠로트리코시스 (erysipelothricosis), 장티푸스, 열병, 사구체신염, 위장염, 위 궤양, 길랑-바레 증후군, 파상풍, 임질, 치은염, 염증성 장 질환, 과민성 장 증후군, 렙토스피라증, 한센병, 리스테리아증, 결핵, 레이디 위더미어 증후군, 재향군인병, 뇌수막염, 점액농성 결막염, 다제 내성 박테리아 감염, 다제 내성 박테리아 운반, 근괴사-가스 괴저, 마이코박테리움 아비움 (Mycobacterium avium) 복합체, 신생아 괴사성 장염, 노카르디아증, 원내감염, 이염, 치주염, 인두염, 폐렴, 복막염, 자반열, 록키산 홍반열, 시겔라증, 매독, 부비강염, 구불결장염, 패혈증, 피하 농양, 야생토끼병, 기관 기관지염, 편도염, 장티푸스, 궤양성 결장염, 요로 감염, 및 백일해로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
박테리아 감염은 피부 감염 예컨대 여드름, 장 감염 예컨대 식도염, 위염, 장염, 결장염, 구불결장염, 직장염, 및 복막염, 요로 감염, 질 감염, 여성 상부 생식기 감염, 예컨대 난관염, 자궁내막염, 난소염, 자궁근염, 자궁주위염 및 골반 복막의 감염, 호흡기 감염 예컨대 폐렴, 양막내 감염, 치원성 감염, 치내 감염, 섬유증, 뇌수막염, 혈류 감염, 병원내 감염 예컨대 카테터-관련 감염, 병원 획득 폐렴, 산후 감염, 병원 획득 위장염, 병원 획득 요로 감염, 또는 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게, 본 개시에 따른 박테리아 감염은 항생제 내성이 존재하는 박테리아에 의해 초래된다. 특정 구현예에서, 감염은 상기 열거된 바와 같은 박테리아, 도너 또는 표적 세포로서 사용할 수 있는 박테리아에 의해 초래된다.
또한, 치료를 필요로 하는 박테리아 감염을 갖는 대상체에게 제공된 약학 또는 수의학 조성물, 특히 제공된 약학 또는 수의학 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 박테리아 감염을 치료하기 위한 방법을 제공한다. "치료적 유효량"은 대상체에게 투여할 때, 표적화된 질환 또는 질병을 치료하거나, 또는 바람직한 효과를 생성시키는데 필요한, 예를 들어, 박테리아에 의해 초래된 질환 또는 질병, 특히 박테리아 감염을 치료하는데 필요한 양이다.
특히 박테리아 감염을 갖는 대상체에서, 박테리아 개체군 중 병독성 및/또는 항생제 내성 박테리아의 양을 감소시키기 위한 방법이 제공되고, 방법은 박테리아 개체군을 본 명세서에 개시된 바와 같은 약학 또는 수의학 조성물 또는 본 명세서에 개시된 박테리아 전달 비히클을 접촉시키는 단계를 포함한다. 또한 특히 박테리아 감염을 갖는 대상체에서, 박테리아 개체군 중 병독성 및/또는 항생제 내성 박테리아의 양을 감소시키기 위한 약물의 제조를 위한 본 명세서에 개시된 바와 같은 약학 또는 수의학 조성물 또는 본 명세서에 개시된 박테리아 전달 비히클의 용도를 제공한다.
본 개시는 또한 예를 들어, 비만, 2형 당뇨병 및 비알콜성 지방간 질환을 포함한, 대사 장애의 치료에서 사용을 위한 본 발명의 약학 또는 수의학 조성물에 관한 것이다. 실제로, 신생 증거는 장 미생물총 조성 및 이의 대사산물의 변경을 통해서 이들 질병을 특징규명한다는 것을 의미한다 [31]. 따라서 약학 또는 수의학 조성물은 장 미생물총 조성 (예를 들어, 일부 박테리아의 사멸을 유도하여) 또는 이의 대사산물 (예를 들어, 상기 박테리아에 의한 일부 분자, 예를 들어 물질대사 염증에 대해 유익한 역할을 갖는 분자의 발현, 과발현 또는 분비를 유도하여)을 변경할 수 있는 관심 핵산을 일부 장 박테리아에서 전달하는데 사용될 수 있다. 본 개시는 또한 예를 들어, 비만, 2형 당뇨병 및 비알콜성 지방간 질환을 포함한, 대사 장애의 치료를 위한 약물의 제조를 위한 본 발명의 약학 또는 수의학 조성물의 용도에 관한 것이다. 또한, 치료를 필요로 하는 대사 장애를 갖는 대상체에게, 제공된 약학 또는 수의학 조성물, 특히 제공된 약학 또는 수의학 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 예를 들어, 비만, 2형 당뇨병 및 비알콜성 지방간 질환을 포함하는 대사 장애를 치료하기 위한 방법에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 개시는 염증성 및 자가-면역 질환, 암, 감염, 또는 뇌 장애같은, 인간 마이크로바이옴의 박테리아가 관여하는 병변의 치료에서 사용을 위한 본 발명의 약학 또는 수의학 조성물에 관한 것이다. 본 개시는 또한 상기 병변을 갖고 치료를 필요로 하는 대상체에게 제공된 약학 또는 수의학 조성물, 특히 제공된 약학 또는 수의학 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 인간 마이크로바이옴의 박테리아가 관여하는 병변을 치료하기 위한 방법에 관한 것이고, 인간 마이크로바이옴의 박테리아가 관여하는 병변을 치료하기 위한 약물의 제조를 위한 본 명세서에 개시된 약학 또는 수의학 조성물의 용도에 관한 것이다. 실제로, 임의의 감염을 촉발하지 않고, 마이크로바이옴의 일부 박테리아는 염증성 또는 자가-면역 질환 또는 암 발병을 유도 및/또는 증강시키게 되는 분자를 분비할 수 있다. 보다 특히, 본 개시는 또한 예를 들어, CAR-T (Chimeric Antigen Receptor T) 세포, TIL (Tumor Infiltrating Lymphocytes) 및 억제인자 T 세포로도 알려진 Treg (Regulatory T cells)를 기반으로 하는 면역요법의 효능을 개선시키기 위한 마이크로바이옴 조성의 조절에 관한 것이다. 면역요법의 효능을 개선시키기 위한 마이크로바이옴 조성의 조절은 또한 당분야에 충분히 공지된 면역 체크포인트 억제제 예컨대, 제한없이, PD-1 (programmed cell death 단백질 1) 억제제, PD-L1 (programmed death ligand 1) 억제제 및 CTLA-4 (cytotoxic T lymphocyte associated protein 4)의 사용을 포함할 수 있다.
마이크로바이옴의 일부 박테리아는 또한 뇌에 영향을 미치게 되는 분자를 분비할 수 있다.
그러므로, 본 개시의 추가 목적은 대상체의 마이크로바이옴을 제어하는 방법으로서, 상기 대상체에서 본 명세서에 개시된 바와 같은 약학 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 개시는 또한 박테리아 감염에 대한 치료를 필요로 하는 개체를 위한 개인 맞춤 치료 방법에 관한 것으로서, 방법은 i) 개체로부터 생물학적 샘플을 수득하고 샘플로부터 박테리아 DNA 서열의 그룹을 결정하는 단계; ii) 서열 결정을 기반으로, 샘플에 존재된 하나 이상의 병원성 박테리아 균주 또는 종을 동정하는 단계; 및 iii) 샘플에서 동정된 각각의 병원성 박테리아 균주 또는 종을 인식할 수 있고 패키징된 유전자 회로를 전달할 수 있는 본 개시에 따른 약학 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
바람직하게, 생물학적 샘플은 병리학적 및 비병리학적 박테리아 종을 포함하고, 개체에게 본 개시에 따른 약학 또는 수의학 조성물을 투여하는 단계 이후에, 개체 상에서 또는 개체 내에서 병원성 박테리아의 양이 감소되지만, 비-병원성 박테리아의 양은 감소되지 않는다.
다른 특정 구현예에서, 본 개시는 약물의 효율성을 개선시키기 위해서 사용을 위한 본 개시에 따른 약학 또는 수의학 조성물에 관한 것이다. 실제로, 그들 자체로 병원성이 없는, 마이크로바이옴의 일부 박테리아는 약물을 물질대사시킬 수 있고 그들을 비효율적이거나 또는 유해한 분자로 개질시킬 수 있다고 알려져 있다.
다른 특정 구현예에서, 본 개시는 치료적 화합물 예컨대 포유동물을 위한 예방적 및 치료적 백신을 포함한, 임의의 관심 화합물의 제자리 (in-situ) 박테리아 제조에 관한 것이다. 유전자 회로에 포함되는 관심 핵산에 의해 코딩된, 관심 화합물은 표적화된 박테리아 내부에서 생산될 수 있거나, 표적화된 박테리아로부터 분비될 수 있거나 또는 표적화된 박테리아의 표면 상에서 발현될 수 있다. 보다 특정한 구현예에서, 관심 화합물은 예방적 및/또는 치료적 백신접종을 위해 표적화된 박테리아의 표면 상에서 발현되는 항원이다.
본 개시는 또한 본 명세서에 개시된 조성물의 비-치료적 용도에 관한 것이다. 예를 들어, 비-치료적 용도는 대상체, 특히 질환을 앓지 않는 대상체의 웰빙을 개선시키기 위한 용도 또는 미용 용도일 수 있다. 따라서, 본 개시는 또한 본 개시의 조성물을 포함하는 비-치료적 조성물 또는 미용 조성물에 관한 것이다.
본 개시는 또한 도너 세포로부터 수령체 또는 표적 세포로 관심 유전자 회로의 전달에서 사용을 위한 키트를 제공한다. 일 구현예에서, 키트는 (i) 리프레서 단백질을 발현하는 도너 세포; 및 (ii) 관심 유전자 회로를 포함한다. 상기 유전자 회로는 상기 정의된 바와 같을 수 있고, 특히, 관심 핵산이 리프레서 단백질에 의해 인식되는 리프레서 결합 서열에 기능적으로 근접하여 삽입 (작동적으로 연결)될 수 있는 발현 카세트를 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에서 또는 추가로, 키트의 도너 세포는 전달 비히클의 생성을 위해, 예를 들어, 관심 유전자 회로의 패키징을 위해 프로파지 서열을 함유할 수 있다. 키트는 수령체 또는 표적 세포를 더 포함할 수 있고, 상기 수령체 또는 표적 세포는 리프레서 단백질을 발현하는데 실패하여서, 상기 세포로 전달 이후에 관심 핵산의 발현을 허용한다.
본 명세서에 개시된 대상 주제를 더욱 잘 이해하고 이를 실제로 수행할 수 있는 방법을 예시하기 위해서, 첨부된 도면을 참조하여, 비제한적인 예로서, 구현예들을 이제 설명할 것이다.
실시예 1
실시예를 특별히 참조하여, 도시된 상세 사항은 본 발명의 구현예의 예시적인 설명의 목적을 위한 것이고 예시라는 것을 강조한다.
하기 실시예는 전달 비히클의 제조를 위한 신규 시스템에서 사용을 위한 종간 프로모터-리프레서 쌍의 사용을 입증한다. 이러한 경우에, 생산 균주에서 트랜스로 발현되는 리프레서는 상이한 박테리아 종, 이상적으로 계통발생적으로 상이한 종으로부터 유래된다. 종간 리프레서의 사용은 이종성 리프레서를 트랜스로 함유하는 균주에서만 소정 단백질의 발현 또는 유전자 회로 성분의 전사를 제어하기 위한 매우 유리한 도구이다. 그럼에도, 이러한 접근법을 따를 때 신중할 필요가 있고 트립토판 합성 리프레서같이, 편재하여 존재할 수 있는 리프레서를 사용하지 않아야 하는데, 그들을 다른 종에 전달할 때 그들이 직교적이지 않은 것으로 확인되었기 때문이다 [16]. 그러나 박테리아가 상이한 특징을 갖는 환경에서 서식하므로, 그들은 다른 유기체에 전혀 존재하지 않을 수 있는 특정 신호를 인식하는 특이적 리프레서를 진화시켜왔다. 2종의 최근 공개물은 이. 콜라이에서 종간 리프레서의 사용이 가능하다는 것을 보여주며, [10] [17], 유도인자가 알려지지 않았더라도, 잠재적 종간 리프레서-오퍼레이터 쌍의 공급원을 나타낸다. 마지막으로, 다른 해법은 불활성 Cas9 분자 (dCas9) 및 프로모터 표적화 gRNA/tracrRNA, RBS 또는 독성 성분의 코딩 서열의 발현을 포함한다. dCas9는 뉴클레아제 활성을 갖지 않지만 gRNA에 의해 표적화되는 영역에 결합할 수 있고 그 영역으로부터의 전사를 차단할 수 있다 [18] [19].
도 1은 종간 리프레서에 의한 조건적 전사 제어를 도시한다. 좌측에는, 패키징 프로파지 및 PhlF (종간) 리프레서를 트랜스로 함유하는, 생산 균주이다. 페이로드는 PphlF 프로모터의 제어 하에 패키징 신호 및 바람직한 서열 (액츄에이터)을 보유한다. 파지미드 입자의 패키징 시에, 표적 균주는 형질도입될 수 있고 그들은 PhlF 리프레서 (이. 콜라이에 부재)가 결여되어 있으므로 PphlF 프로모터는 활성일 것이다. PhlF 리프레서는 프로모터 표적화 dCas9 + gRNA, RBS 또는 액츄에이터의 서열로 대체될 수 있다는 것을 유의한다.
개념의 증명으로서, PphlF 프로모터 제어 하의 Cas9 (SEQ ID NO: 3), LacZ 표적화 sgRNA 및 람다 파지 cos 신호를 함유하는 플라스미드를 구축하였다. LacZ 표적화 Cas9는 상이한 상황에서 이전에 사용되었었다 [20]. 이. 콜라이의 2개 균주: MG1655 (wt 균주) 및 MG1656 (lacZ에 결실을 함유)로 플라스미드의 형질전환을 먼저 시도하였다. 예상대로, MG1655의 형질전환은 콜로니를 산출하지 않았는데, Cas9 회로가 이의 게놈을 표적화하여 유독했기 때문이다. 대조적으로, MG1656으로의 형질전환은 콜로니를 제공하였다 (도 2). 게다가, 다른 플라스미드에서 트랜스로 발현되는 PhlF 리프레서 (SEQ ID NO:1, 코딩 서열: SEQ ID NO:2)를 함유하는 세포로의 형질전환은 양쪽 경우에서 콜로니를 제공하였는데, 리프레서는 Cas9 활성에 대한 보호성을 부여하기 때문이다. 크기 차이는 Cas9의 항상성 발현은 유독한 것으로 확인된 사실에 기인할 수 있다 [21].
도 2는 Cas9-함유 회로의 형질전환을 도시한다. PphlF 프로모터 제어 하의 Cas9 및 lacZ 표적화 항상성 sgRNA 가이드 (SEQ ID NO:4)를 함유하는 플라스미드로 MG1655 (좌측 패널) 또는 MG1656 (우측 패널)을 형질전환시켰다. 빈 세포 (임의의 다른 플라스미드를 보유하지 않음)는 상단에 도시되어 있고; PhlF 리프레서 (SEQ ID NO:5)를 코딩하는 여분의 플라스미드를 함유하는 형질전환된 세포는 하단에 도시되어 있다.
이러한 시스템이 또한 형질도입될 수 있는가를 시험하기 위해서, lacZ 유전자가 역시 결여되고, 그리하여, Cas9에 의해 표적화되지 않는, 생산 균주의 게놈에 PhlF 리프레서를 통합시켰다. 이러한 플라스미드를 갖는 생산 균주는 정상으로 성장하였다 (데이터 미도시). 파지미드는 표준 열 유도 프로토콜-[23]을 따라서 제조하였고 MG1655 및 MG1656 상에서 적정하였다 (도 3). MG1655로 Cas9-LacZ 회로의 형질도입은 형질전환의 경우에서 처럼, 콜로니를 제공하지 않았는데 반해, MG1656의 경우에 콜로니가 회수되었다.
도 3은 Cas9-함유 회로의 형질도입을 입증한다. PphlF 프로모터 제어 하의 CAs9 및 lacZ 표적화 항상성 sgRNA 가이드 (SEQ ID NO:4)를 함유하는 파지미드를 MG1655 (좌측 패널), PhlF 리프레서가 플라스미드에서 코딩되는 MG1655 (가운데) (SEQ ID NO:5) 또는 MG1656 (우측 패널)로 형질도입시켰다.
PhlF 리프레서가 이. 콜라이에서 천연적으로 존재하지 않으므로, 이러한 시스템은 다른 이. 콜라이 균주에서 발현을 허용하면서 생산 균주에서 독성 단백질 (이 경우, Cas9)의 발현을 억제하는데 사용될 수 있다. 이러한 특별한 경우에, 생산 균주를 표적화하지 않는 sgRNA 가이드를 사용하였지만, Cas9가 억제되므로, 시스템은 또한 이의 게놈을 표적화하는 sgRNA를 코딩하는 파지미드 입자의 생산을 허용할 것이다.
실시예 2
PsrpR 프로모터 (SEQ ID NO:8) 제어 하의 Cpf1 뉴클레아제, LacZ 표적화 crRNA 및 람다 파지 cos 신호 (p455, SEQ ID NO:9)를 함유하는 플라스미드를 구축하였다. MG1655 (야생형 균주) 및 MG1656 (lacZ 유전자에 결실을 함유)의 이. 콜라이 2개 균주로 이들 플라스미드의 형질전환이 먼저 수행되었다. 예상대로, MG1655의 형질전환은 콜로니를 산출하지 않았는데, Cpf1 회로가 이의 게놈을 표적화하여 이것이 유독하기 때문이다. 대조적으로, MG1656으로의 형질전환은 콜로니를 제공하였다 (도 4). 게다가, 다른 플라스미드 (pRARE4-SrpR-1.0, SEQ ID NO:10)에서 트랜스로 발현되는 SrpR 리프레서를 함유하는 세포로 형질전환은 양쪽 경우에 콜로니를 제공하였는데, 리프레서가 Cpf1 활성에 대해 보호성을 부여하기 때문이다 (도 4).
이러한 시스템이 또한 형질도입될 수 있는가를 시험하기 위해서, SrpR 리프레서 (SEQ ID NO:6, 코딩 서열: SEQ ID NO:7)는 역시 lacZ 유전자가 결여되어서, Cpf1에 의해 표적화되지 않는, 생산 균주의 게놈으로 통합되었다. 패키징된 파지미드는 PhlF 리프레서 데이터에 대해 표시된 바와 같이 표준 열 유도 프로토콜에 따라서 생산되었고 트랜스로 공급되는 SrpR 리프레서를 함유하거나 또는 없는 MG1655 및 MG1656 상에서 적정되었다 (도 5). MG1655로 Cpf1-LacZ 회로의 형질도입은 회수된 콜로니 수에서 거의 4 log의 감소를 제공하여, 회로의 높은 독성을 반영하였는데 반해, lacZ 표적을 함유하지 않는 세포 (MG1656)와 유사한 수까지 SrpR 리프레서가 보충된 MG1655의 경우에 콜로니가 회수되었다.
마지막으로, 트랜스로 페이로드를 억제할 수 있는 생산 균주의 게놈에 리프레서의 첨가는 달리 항상적으로 발현되는 회로의 부담을 감소시키는데 도움을 줄 수 있을 것이다. 세포는 더 작을 것인데, 그들 배가 시간이 특별한 OD에 도달하는데 필요한 더 긴 인큐베이션 시간에 기인하여 업스케일링에 유해할 수 있는, 플라스미드 부담으로 인해 감소되기 때문이다. 게다가, 아마도, 보다 중요하게, 항상적으로 발현되는 성분을 함유하는 회로는 불안정하고 빠르게 파괴되는 경향이 있는데, 세포가 물질대사 부담을 제거하기 위한 방법을 찾을 것이기 때문이다 [24]-[30]. 이것은 이들 발현 수준이 높으면, 예컨대 상기 표시된 Cpf1 회로의 경우에, 특히 사실인데, 회로가 대규모 발효배양 동안 파괴되면, 이것은 큰 경제적 손실을 초래할 수 있다.
도 6은 Cpf1의 발현이 도 4 및 5 (p841, SEQ ID NO:11)에 비해 더 높은 Cpf1-LacZ 회로를 코딩하는 생산 균주에 이득을 부여하는 SrpR 리프레서의 첨가를 도시한다. SrpR 리프레서를 함유하거나 또는 그렇지 않은 생산 균주로 PsrpR-Cpf1-LacZ 회로의 형질전환 이후에 콜로니 크기를 모니터링하였다. 세포는 형질전환시켰고 30℃에서 밤새 클로람페니콜 LB 한천 상에서 인큐베이션시켰고 콜로니의 크기는 15시간, 17시간, 19시간 및 22시간 이후에 추적하였다. 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 콜로니는 게놈 SrpR 리프레서를 함유하는 생산 균주에서 17시간에 분명하게 보였지만, 없는 것에서는 그렇지 않았다. 22시간 인큐베이션 이후에도, 리프레서가 없는 생산 균주의 콜로니는 SrpR을 함유하는 것에 비해서 눈에 띄게 더 작아서, 트랜스로 리프레서의 도입이 생산 균주에서 물질대사 부담을 감소시킨 것을 보여준다.
인용된 참조 문헌 목록
명세서에 인용된 임의의 참조 문헌은 그들 전체로 본 명세서에 참조로 편입된다.
Figure pct00004
Figure pct00005
<110> ELIGO BIOSCIENCE <120> TRANSCRIPTIONAL CONTROL IN PROKARYOTIC CELLS USING DNA-BINDING REPRESSORS <130> B3216PC00 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 200 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PhlF repressor protein <400> 1 Met Ala Arg Thr Pro Ser Arg Ser Ser Ile Gly Ser Leu Arg Ser Pro 1 5 10 15 His Thr His Lys Ala Ile Leu Thr Ser Thr Ile Glu Ile Leu Lys Glu 20 25 30 Cys Gly Tyr Ser Gly Leu Ser Ile Glu Ser Val Ala Arg Arg Ala Gly 35 40 45 Ala Ser Lys Pro Thr Ile Tyr Arg Trp Trp Thr Asn Lys Ala Ala Leu 50 55 60 Ile Ala Glu Val Tyr Glu Asn Glu Ser Glu Gln Val Arg Lys Phe Pro 65 70 75 80 Asp Leu Gly Ser Phe Lys Ala Asp Leu Asp Phe Leu Leu Arg Asn Leu 85 90 95 Trp Lys Val Trp Arg Glu Thr Ile Cys Gly Glu Ala Phe Arg Cys Val 100 105 110 Ile Ala Glu Ala Gln Leu Asp Pro Ala Thr Leu Thr Gln Leu Lys Asp 115 120 125 Gln Phe Met Glu Arg Arg Arg Glu Met Pro Lys Lys Leu Val Glu Asn 130 135 140 Ala Ile Ser Asn Gly Glu Leu Pro Lys Asp Thr Asn Arg Glu Leu Leu 145 150 155 160 Leu Asp Met Ile Phe Gly Phe Cys Trp Tyr Arg Leu Leu Thr Glu Gln 165 170 175 Leu Thr Val Glu Gln Asp Ile Glu Glu Phe Thr Phe Leu Leu Ile Asn 180 185 190 Gly Val Cys Pro Gly Thr Gln Arg 195 200 <210> 2 <211> 600 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence encoding PhlF repressor protein <400> 2 atggcacgta ccccgtcacg tagtagcatt ggtagcctgc gtagtccgca tacccataaa 60 gcaattctga ccagtaccat cgagatcctg aaagaatgtg gttatagcgg actgagcatt 120 gaaagcgttg cacgtcgtgc cggagcaagc aaaccgacca tttatcgttg gtggacgaat 180 aaagcagcac tgattgccga agtgtatgaa aatgaaagcg aacaggtgcg taaatttccg 240 gatctgggta gctttaaagc agatctggat tttttactgc gtaatttatg gaaagtttgg 300 cgtgaaacta tttgcggtga agcatttcgt tgtgttattg cagaagctca gctggatcct 360 gcaaccctga cccagttaaa ggatcaattt atggaacgtc gtcgtgagat gccgaaaaaa 420 ctggttgaaa atgccattag caatggtgaa ctgccgaaag ataccaatcg tgaacttctt 480 ctggatatga tttttggttt ttgttggtat cgcctgttaa ccgaacagct gaccgttgaa 540 caggatattg aagaatttac cttccttctg attaatggtg tttgtccggg tactcagcgt 600 600 <210> 3 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PhlF promoter-operator sequence <400> 3 tctgattcgt taccaattga catgatacga aacgtaccgt atcgttaagg t 51 <210> 4 <211> 6504 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasmid containing Cas9 under the control of a PphlF promoter and a constitutive sgRNA guide targeting lacZ <400> 4 ttttgccgtt acgcactact ttagtcagtt ccgcagtacc gtcagtagct gaacaggagg 60 gacagtgttg ataaagcgcc aactttttgc gaaaatgttg cacgtaagac aactttcacc 120 ataatgaaat aagatcacta ctattttttg agttatcgag atttcgcaag ctaaggaagc 180 taaaatggag aaaaaaatca ctggatatac tacagttgat ataagtcaat ggcatcgtaa 240 agaacatttt gaggcattcc agtcagttgc tcagtgcacc tataaccaaa ccgttcagct 300 ggatattacg gcctttttaa aaaccgtaaa gaaaaataag cacaagtttt atccggcctt 360 tattcacatt cttgcccgcc tgatgaatgc acatccggag tttcgtatgg caatgaaaga 420 cggtgagctg gtgatatggg atagtgttca cccttgttac accgttttcc atgagcaaac 480 tgaaacgttt tcatcgctct ggtcagaata ccacgacgat ttccggcagt ttctacacat 540 atatagtcaa gatgtggcgt gttacggtga aaacttagca tatttcccta aagggtttat 600 cgaaaatatg tttttcgtca gtgccaatcc gtgggtgagt ttcaccagtt ttgatttaaa 660 cgtagcaaat atggacaact tcttcgcccc cgttttcact atgggaaaat attatacgca 720 aggcgacaag gtgttaatgc cactggcgat ccaagttcat catgccgttt gtgatggctt 780 ccatgtcggc agaatgctta atgaattaca acaatactgc gatgagtggc agggcggggc 840 gtaatccggc aaggaaacac tgaaaaaagc ccgcacctga cagtgcgggc tttttttttc 900 gaccaaaggt atgcacatgc tatagacttc tggtgctacc cgactgacag ctagctcagt 960 cctaggtata atgctagccg tcgtgactgg gaaaacccgt tttagagcta gaaatagcaa 1020 gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt 1080 tgagatcaaa catccactag tccctttacg cacgttgtga tatgtagatg ataatcatta 1140 tcactttacg ggtcctttcc ggtgatccga caggttacgg ggcggcgacc tcgcgggttt 1200 tcgctattta tgaaaatttt ccggtttaag gcgtttccgt tcttcttcgt cataacttaa 1260 tgtttttatt taaaataccc tctgaaaaga aaggaaacga caggtgctga aagcgaggct 1320 ttttggggcg ttcggctaaa cccaaaagta aaaacccgcc gaagcgggtt ttaacgtaaa 1380 acaggtgaaa ctgactttaa cgttattagt caccgcccaa ctgactcaga tcaatacgag 1440 tttcatacag gccagtgatg ctctggtgaa taagagttgc atctaagact tctttagtgg 1500 aggtgtaacg tttacgatcg atcgtggtgt cgaagtattt gaaggctgcc ggagcaccaa 1560 gattagtcag cgtgaacagg tgaatgatgt tttctgcctg ttcacggatc ggtttatcac 1620 ggtgtttatt gtaggcgctc aggactttat ccagattcgc gtccgccaga attacgcgtt 1680 tgctaaactc agaaatctgt tcaataatct cgtccagata gtgtttgtgc tgttccacga 1740 acagctgttt ctgctcatta tcttccggac tacctttcag tttctcgtag tgcgaggcca 1800 gatacaggaa gttcacgtac ttggacggaa gggccaattc gttccctttt tgcagttcac 1860 ccgcagacgc taacatacgt ttacgaccat tttccagttc gaacagggaa tacttcggca 1920 gtttgataat cagatctttc tttacttcct tgtacccctt cgcttcgagg aagtcaatcg 1980 ggtttttttc gaaagagcta cgttccataa tggtgatgcc taaaagttct ttcactgatt 2040 tcagtttttt tgatttaccc ttttcgactt tggcgactac cagaacgctg tatgccacgg 2100 ttggagaatc gaagccaccg tatttcttcg gatcccagtc tttcttacgc gcgatcagtt 2160 tgtcggagtt gcgtttcggc agaatggatt ccttgctgaa accgccagtc tgtacctcag 2220 tctttttaac gatgtttact tgaggcatgg acagaacttt gcggacagta gcgaaatcac 2280 gacctttgtc ccacacgatc tcacccgttt cgccgttggt ttcgatcaga gggcgtttac 2340 gaatttcgcc attcgctaag gtgatttcgg ttttgaagaa attcataatg tttgagtaga 2400 aaaagtattt agcggttgct ttgccaattt cctgttcaga tttggcgatc attttgcgca 2460 cgtcgtaaac tttataatcg ccgtacacaa attcgctttc cagtttcgga tattttttga 2520 tcagtgccgt gccaacaact gcattcagat atgcgtcgtg cgcgtggtga tagttgttaa 2580 tctcgcgcac tttatagaat tggaaatctt tacggaagtc ggaaaccagc ttagatttca 2640 gggtaataac cttaacttcg cggatcagtt tgtcattttc atcgtattta gtgttcatac 2700 gagagtccag aatctgagca acatgttttg taatctggcg agtttctacc agttgacgtt 2760 taataaaacc cgccttatcc agctcagaca aaccgccacg ttcagctttg gtcaggttat 2820 caaatttacg ttgagtaatc agtttcgcgt taagcagttg acgccaatag ttcttcattt 2880 tcttaactac ttcttccgat ggaacgttgt cactcttccc acggttttta tcgctacggg 2940 tgagtacttt gttatcaatg gaatcatctt tcagaaaaga ctgcggaaca atgtggtcaa 3000 cgtcgtaatc ggagaggcgg ttgatgtcca gctcctgatc tacatacatg tcacgaccat 3060 tttgcaggta gtacaggtac agtttttcat tttgcagttg ggtattttca acagggtgtt 3120 ctttcagaat ctgagagcca agttctttaa taccctcctc gatacgtttc atgcgttcgc 3180 gggagttttt ctgtcccttc tgggtcgttt ggttttcacg agccatctcg ataacaatgt 3240 tttccggttt gtgacgaccc ataactttca caagctcatc caccactttc acggtttgca 3300 ggataccttt tttgatcgcc ggactacctg ctaaattggc gatatgctcg tgcagagaat 3360 caccttgacc agaaacctga gctttctgga tgtcctcttt gaaggtcagg gaatcgtcgt 3420 gaatcagttg catgaagtta cggtttgcga agccgtcaga tttcaggaag tccagaatag 3480 ttttaccgga ctgtttgtca cggataccgt taatcagttt acggctcaga cggccccagc 3540 cagtataacg gcgacgtttc agttgtttca ttactttatc gtcaaacagg tgagcatacg 3600 tcttcaagcg ttcttcaatc atttcacgat cttcgaacag agtcagggtc aggacgatgt 3660 cctctaagat gtcctcattt tcttcgttgt ccaagaaatc tttgtcttta atgatcttta 3720 ataaatcgtg atacgtgcct aaacttgcat taaaacgatc ttcaactcca ctaatctcga 3780 cggagtcgaa gcattcgatt ttcttgaagt agtcctcttt cagctgttta acggttactt 3840 tacggttggt tttaaacagt aaatcaacaa ttgctttttt ctgttcaccg ctcaggaatg 3900 caggtttacg catgccctca gtcacatact ttactttagt cagctcgttg tacacggtga 3960 agtattcgta cagaagggag tgtttcggca gtaccttttc gttcggcagg tttttatcaa 4020 agttagtcat gcgctcgatg aaggattggg cgcttgcgcc tttgtcaacc acttcctcga 4080 agttccacgg ggtaatagtt tcttcggatt tgcgagtcat ccacgcgaaa cgggagttgc 4140 cacgcgccag cgggccgaca taatacggga tacgaaaggt caggattttt tcgatttttt 4200 cacgattatc tttcaggaac gggtaaaaat cctcttggcg acgcaggata gcgtgcagtt 4260 cacctaagtg gatctggtgc ggaatgctac cgttgtcgaa ggtacgctgt ttacgaagca 4320 gatcctcacg attcagttta acaagtaatt cttccgtgcc atccattttt tctaagattg 4380 gcttgatgaa tttgtagaac tcctcttggc ttgcaccccc gtcaatataa cccgcgtagc 4440 cgtttttgga ttggtcaaag aagatctcct tgtacttctc cggcagttgt tgccgtacca 4500 gcgctttcag aagagtcaga tcttggtgat gttcgtcata gcgtttaatc atggatgcag 4560 aaagcggtgc tttggtgatt tcggtattca cacgaagaat atcagacagg agaatagcgt 4620 ctgataagtt ctttgccgcc agaaacagat cagcgtactg atctccgatc tgggccagta 4680 agttatccaa gtcatcgtca tacgtatctt tgctaagttg aagttttgcg tcctctgcca 4740 gatcgaagtt gcttttgaag ttcggggtca gtcccaagct aagagcgatc agattgccga 4800 acagtccgtt tttcttctca cccggcagtt gcgcaattaa gttttccaga cgacgggatt 4860 tggacaggcg tgcggacaag atcgctttcg cgtcaacacc gctagcatta attgggtttt 4920 cttcaaacag ctggttatag gtttgcacca gctggatgaa cagtttgtct acatcgctgt 4980 tgtctggatt caggtcgcct tcgatcagga aatgaccacg gaacttaatc atatgcgcta 5040 aggccagata gatcagacgc agatcggcct tatccgtcga atcgaccagc tttttgcgca 5100 ggtgatagat agtcgggtat ttttcgtgat acgctacttc gtccacaatg ttgccgaaga 5160 ttggatgacg ttcgtgcttt ttatcttctt ccaccagaaa tgattcttcc agacggtgaa 5220 aaaagctgtc atctacttta gccatttcgt tagagaagat ttcttgcagg tagcagatgc 5280 ggtttttacg acgggtgtaa cggcgacgag cggtgcgttt cagacgtgtt gcttctgcgg 5340 tttcgccgga atcgaacaga agcgcaccga ttaagttctt tttgatacta tggcgatctg 5400 tattacccag taccttgaac tttttagacg gaactttata ttcatcagtg atcaccgccc 5460 atccgacgct atttgtgccg atgtctaagc ctatgctgta tttcttatcc atagaaactt 5520 tctccttttt aagctccagt aaccttaacg atacggtacg tttcgtatca tgtcaattgg 5580 taacgaatca gattcagtac gtcgcgtgct acatttgaag agataaattg cactgaaatc 5640 tagaaatatt ttatctgatt aataagatga tcttcttgag atcgttttgg tctgcgcgta 5700 atctcttgct ctgaaaacga aaaaaccgcc ttgcagggcg gtttttcgaa ggttctctga 5760 gctaccaact ctttgaaccg aggtaactgg cttggaggag cgcagtcgcc aaaacttgtc 5820 ctttcagttt agccttatcc ggcgcatgac ttcaagacta actcctctaa atcaattacc 5880 agtggctgct gccagtggtg cttttgcatg tctttccggg ttggactcaa gacgatagtt 5940 accggataag gcgcagcggt cggactgaac ggggggttcg tgcatacagt ccagcttgga 6000 gcgaactgcc tacccggaac tgagtgtcag gcgtggaatg agacaaacgc ggccataaca 6060 gcggaatgac accggtaaac cgaaaggcag gaacaggaga gcgcacgagg gagccgccag 6120 ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcaggtttcg ccaccactga tttgagcgtc 6180 agatttcgtg atgcttgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacggcttt gccgcggccc 6240 tctcacttcc ctgttaagta tcttcctggc atcttccagg aaatctccgc cccgttcgta 6300 agccatttcc gctcgccgca gtcgaacgac cgagcgtagc gagtcagtga gcgaggaagc 6360 ggaatatatc ctgtatcaca tattctgctg acgcaccggt gcagcctttt ttctcctgcc 6420 acatgaagca cttcacttac accctcatca gtgccaacat agtaagccag tatacactcc 6480 gctagcgctg atgtccggcg gtgc 6504 <210> 5 <211> 4024 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> plasmid encoding the PhlF repressor protein <400> 5 agcgatcgcg tatttcgtct cgctcaggcg caatcacgaa tgaataacgg tttggttgat 60 gcgagtgatt ttgatgacga gcgtaatggc tggcctgttg aacaagtctg gaaagaaatg 120 cataagcttt tgccattctc accggattca gtcgtcactc atggtgattt ctcacttgat 180 aaccttattt ttgacgaggg gaaattaata ggttgtattg atgttggacg agtcggaatc 240 gcagaccgat accaggatct tgccatccta tggaactgcc tcggtgagtt ttctccttca 300 ttacagaaac ggctttttca aaaatatggt attgataatc ctgatatgaa taaattgcag 360 tttcatttga tgctcgatga gtttttctaa atcagaattg gttaattggt tgtggaaacg 420 taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa 480 tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt 540 gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gttgatgata ccgctgcctt actgggtgca 600 ttagccagtc tgaatgacct gtcacgggat aatccgaagt ggtcagactg gaaaatcaga 660 gggcaggaac tgctgaacag caaaaagtca gatagcacca catagcagac ccgccataaa 720 acgccctgag aagcccgtga cgggcttttc ttgtattatg ggtagtttcc ttgcatgaat 780 ccataaaagg cgcctgtagt gccatttacc cccattcact gccagagccg tgagctgacc 840 aaaacgaaaa aagacgctcg aaagcgtctg ttttctggaa tttggtagcg attatggcct 900 agttaacgct gagtacccgg acaaacacca ttaatcagaa ggaaggtaaa ttcttcaata 960 tcctgttcaa cggtcagctg ttcggttaac aggcgatacc aacaaaaacc aaaaatcata 1020 tccagaagaa gttcacgatt ggtatctttc ggcagttcac cattgctaat ggcattttca 1080 accagttttt tcggcatctc acgacgacgt tccataaatt gatcctttaa ctgggtcagg 1140 gttgcaggat ccagctgagc ttctgcaata acacaacgaa atgcttcacc gcaaatagtt 1200 tcacgccaaa ctttccataa attacgcagt aaaaaatcca gatctgcttt aaagctaccc 1260 agatccggaa atttacgcac ctgttcgctt tcattttcat acacttcggc aatcagtgct 1320 gctttattcg tccaccaacg ataaatggtc ggtttgcttg ctccggcacg acgtgcaacg 1380 ctttcaatgc tcagtccgct ataaccacat tctttcagga tctcgatggt actggtcaga 1440 attgctttat gggtatgcgg actacgcagg ctaccaatgc tactacgtga cggggtacgt 1500 gccatagtac ctttctcctc tttaatgatt cgctagcatt gtacctagga ctgagctagc 1560 cgtaaaatcg tgctacattt gaagagataa attgcactga aatctagaaa tattttatct 1620 gattaataag atgatcttct tgagatcgtt ttggtctgcg gtcatctgcg tgaccgccta 1680 cggcggctgc ggcgccctac gggcttgctc tccgggcttc gccctgcgcg gtcgctgcgc 1740 tcccttgcca gcccgtggat atgtggacga tggccgcgag cggccaccgg ctggctcgct 1800 tcgctcggcc cgtggacaac cctgctggac aagctgatgg acaggctgcg cctgcccacg 1860 agcttgacca cagggattgc ccaccggcta cccagccttc gaccacatac ccaccggctc 1920 caactgcgcg gcctgcggcc ttgccccatc aattttttta attttctctg gggaaaagcc 1980 tccggcctgc ggcctgcgcg cttcgcttgc cggttggaca ccaagtggaa ggcgggtcaa 2040 ggctcgcgca gcgaccgcgc agcggcttgg ccttgacgcg cctggaacga cccaagccta 2100 tgcgagtggg ggcagtcgaa gggcgaagcc cgcccgcctg ccccccgagc ctcacggcgg 2160 cgagtgcggg ggttccaagg gggcagcgcc accttgggca aggccgaagg ccgcgcagtc 2220 gatcaacaag ccccggaggg gccacttttt gccggagggg gagccgcgcc gaaggcgtgg 2280 gggaaccccg caggggtgcc cttctttggg caccaaagaa ctagatatag ggcgaaatgc 2340 gaaagactta aaaatcaaca acttaaaaaa ggggggtacg caacagctca ttgcggcacc 2400 ccccgcaata gctcattgcg taggttaaag aaaatctgta attgactgcc acttttacgc 2460 aacgcataat tgttgtcgcg ctgccgaaaa gttgcagctg attgcgcatg gtgccgcaac 2520 cgtgcggcac ccctaccgca tggagataag catggccacg cagtccagag aaatcggcat 2580 tcaagccaag aacaagcccg gtcactgggt gcaaacggaa cgcaaagcgc atgaggcgtg 2640 ggccgggctt attgcgagga agcccacggc ggcaatgctg ctgcatcacc tcgtggcgca 2700 gatgggccac cagaacgccg tggtggtcag ccagaaaaca ctttccaagc tcatcggacg 2760 ttctttgcgg acggtccaat acgcagtcaa ggacttggtg gccgagcgct ggatctccgt 2820 cgtgaagctc aacggccccg gcaccgtgtt ggcctacgtg gtcaatgacc gcgtggcgtg 2880 gggccagccc cgcgaccagt tgcgcctgtc ggtgttcagt gccgccgtgg tggttgatca 2940 cgacgaccag gacgaatcgc tgttggggca tggcgacctg cgccgcatcc cgaccctgta 3000 tccgggcgag cagcaactac cgaccggccc cggcgaggag ccgcccagcc agcccggcat 3060 tccgggcatg gaaccagacc tgccagcctt gaccgaaacg gaggaatggg aacggcgcgg 3120 gcagcagcgc ctgccgatgc ccgatgagcc gtgttttctg gacgatggcg agccgttgga 3180 gccgccgaca cgggtcacgc tgccgcgccg gtagcacttg ggttgcgcag caacccgtaa 3240 gtgcgctgtt ccagactatc ggctgtagcc gcctcgccgc cctatacctt gtctgcctcc 3300 ccgcgttgcg tcgcggtgca tggagccggg ccacctcgac ctgaatggaa gccggcggca 3360 cctcgctaac ggattcaccg ttactgcacg gcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc 3420 actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcaggc ctccgaaatc 3480 ctgcagggaa agccacgttg tgtctcaaaa tctctgatgt tacattgcac aagataaaaa 3540 tatatcatca tgaacaataa aactgtctgc ttacataaac agtaatacaa ggggtgttat 3600 gagccatatt caacgggaaa cgtcttgctc gaggccgcga ttaaattcca acatggatgc 3660 tgatttatat gggtataaat gggctcgcga taatgtcggg caatcaggtg cgacaatcta 3720 tcgattgtat gggaagcccg atgcgccaga gttgtttctg aaacatggca aaggtagcgt 3780 tgccaatgat gttacagatg agatggtcag actaaactgg ctgacggaat ttatgcctct 3840 tccgaccatc aagcatttta tccgtactcc tgatgatgca tggttactca ccactgcgat 3900 ccccgggaaa acagcattcc aggtattaga agaatatcct gattcaggtg aaaatattgt 3960 tgatgcgctg gcagtgttcc tgcgccggtt gcattcgatt cctgtttgta attgtccttt 4020 taac 4024 <210> 6 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SrpR repressor protein <400> 6 Met Ala Arg Lys Thr Ala Ala Glu Ala Glu Glu Thr Arg Gln Arg Ile 1 5 10 15 Ile Asp Ala Ala Leu Glu Val Phe Val Ala Gln Gly Val Ser Asp Ala 20 25 30 Thr Leu Asp Gln Ile Ala Arg Lys Ala Gly Val Thr Arg Gly Ala Val 35 40 45 Tyr Trp His Phe Asn Gly Lys Leu Glu Val Leu Gln Ala Val Leu Ala 50 55 60 Ser Arg Gln His Pro Leu Glu Leu Asp Phe Thr Pro Asp Leu Gly Ile 65 70 75 80 Glu Arg Ser Trp Glu Ala Val Val Val Ala Met Leu Asp Ala Val His 85 90 95 Ser Pro Gln Ser Lys Gln Phe Ser Glu Ile Leu Ile Tyr Gln Gly Leu 100 105 110 Asp Glu Ser Gly Leu Ile His Asn Arg Met Val Gln Ala Ser Asp Arg 115 120 125 Phe Leu Gln Tyr Ile His Gln Val Leu Arg His Ala Val Thr Gln Gly 130 135 140 Glu Leu Pro Ile Asn Leu Asp Leu Gln Thr Ser Ile Gly Val Phe Lys 145 150 155 160 Gly Leu Ile Thr Gly Leu Leu Tyr Glu Gly Leu Arg Ser Lys Asp Gln 165 170 175 Gln Ala Gln Ile Ile Lys Val Ala Leu Gly Ser Phe Trp Ala Leu Leu 180 185 190 Arg Glu Pro Pro Arg Phe Leu Leu Cys Glu Glu Ala Gln Ile Lys Gln 195 200 205 Val Lys Ser Phe Glu 210 <210> 7 <211> 639 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence encoding SrpR repressor protein <400> 7 atggcacgta aaaccgcagc agaagcagaa gaaacccgtc agcgtattat tgatgcagca 60 ctggaagttt ttgttgcaca gggtgttagt gatgcaaccc tggatcagat tgcacgtaaa 120 gccggtgtta cccgtggtgc agtttattgg cattttaatg gtaaactgga agttctgcag 180 gcagttctgg caagccgtca gcatccgctg gaactggatt ttacaccgga tctgggtatt 240 gaacgtagct gggaagcagt tgttgttgca atgctggatg cagttcatag tccgcagagc 300 aaacagttta gcgaaattct gatttatcag ggtctggatg aaagcggtct gattcataat 360 cgtatggttc aggcaagcga tcgttttctg cagtatattc atcaggttct gcgtcatgca 420 gttacccagg gtgaactgcc gattaatctg gatctgcaga ccagcattgg tgtttttaaa 480 ggtctgatta ccggtctgct gtatgaaggt ctgcgtagca aagatcagca ggcacagatt 540 atcaaagttg cactgggtag cttttgggca ctgctgcgtg aaccgcctcg ttttctgctg 600 tgtgaagaag cacagattaa acaggtgaaa tccttcgaa 639 <210> 8 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SrpR promoter-operator sequence <400> 8 gattcgttac caattgacag ctagctcagt cctaggtata tacatacatg cttgtttgtt 60 tgtaaac 67 <210> 9 <211> 7393 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasmid p455 containing the Cpf1 nuclease under the control of the PsrpR promoter, a crRNA targeting LacZ and a Lambda phage cos signal <400> 9 gacagctttg aattgtttta ggggcgttat tcgagggcaa tcggagctaa cttcaagact 60 acttctttgt tgaatactaa atagtgcaaa ggtcgtgttt cctcaaggat actccgctaa 120 caatatagga ttccaatcag attcagcact ggcggtacgg gtgttgcggt gaggcgttcg 180 ggtttacggc tcgaagctag cacggtagga agcctgacaa tcaccaagca aaagggccgt 240 cgaaggccca caagatacga aagctctcga agccttatcc ttgaccgatc cacctattta 300 ggcagttacg cacaaaagct acccaataat ccgtgacagg cacaatatca cggaacaaaa 360 ccgaaaactc tcgtacacgg ttaggttttc gctaggaaga ataaacctct atcttgatta 420 taagaaggct ccccaagcac ccccaaaacc gaaatagcgg tttgcaataa gggacaagtt 480 acgagtgtag acacgcagaa ttatccagcc tttagtcttt aggaaggcaa agctattgta 540 cgcggtagcc gtcgtagcaa tttaccaact gtagaattat tggacacacg taggaagggc 600 ttacagttga agtttaataa ggtcacacgc aaaaccgcta aggaataatc gcaccgttag 660 cgaaagaata tttcagagcg gttagtaaag gttgagtaaa gtgagattcc aaagtgagcc 720 tttataaaaa gtaaagagct ataataaaac cgtcgagcag aaaacaatcg cctgaaatct 780 caagcacgtt gccctttcta acgtcgctaa ggtttcgtaa acccgtttga ttaggaagaa 840 gaataagtaa cccgattagg tttgagatcg cgggttatcg gtttggatta aaagtggata 900 ccagcggagt caacgccgac gcaaacgtac agtgatccaa tcctgttgca cggtcaagca 960 caatcagctc gcaagatctt ggaatagtgt gcccaacagt ttagttgagg gccacgttcc 1020 gactacaagt tgcttcaaga ggggaatttg gatttggcgg caaaagcacc gccggacatc 1080 agcgctagcg gagtgtatac tggcttacta tgttggcact gatgagggtg taagtgaagt 1140 gcttcatgtg gcaggagaaa aaaggctgca ccggtgcgtc agcagaatat gtgatacagg 1200 atatattccg cttcctcgct cactgactcg ctacgctcgg tcgttcgact gcggcgagcg 1260 gaaatggctt acgaacgggg cggagatttc ctggaagatg ccaggaagat acttaacagg 1320 gaagtgagag ggccgcggca aagccgtttt tccataggct ccgcccccct gacaagcatc 1380 acgaaatctg acgctcaaat cagtggtggc gaaacctgac aggactataa agataccagg 1440 cgtttccccc tggcggctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc tgcctttcgg tttaccggtg 1500 tcattccgct gttatggccg cgtttgtctc attccacgcc tgacactcag ttccgggtag 1560 gcagttcgct ccaagctgga ctgtatgcac gaaccccccg ttcagtccga ccgctgcgcc 1620 ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggaaagac atgcaaaagc accactggca 1680 gcagccactg gtaattgatt tagaggagtt agtcttgaag tcatgcgccg gataaggcta 1740 aactgaaagg acaagttttg gcgactgcgc tcctccaagc cagttacctc ggttcaaaga 1800 gttggtagct cagagaacct tcgaaaaacc gccctgcaag gcggtttttt cgttttcaga 1860 gcaagagatt acgcgcagac caaaacgatc tcaagaagat catcttatta atcagataaa 1920 atatttctag atttcagtgc aatttatctc ttcaaatgta gcacgcgacg tacggtggaa 1980 gattcgttac caattgacag ctagctcagt cctaggtata tacatacatg cttgtttgtt 2040 tgtaaactac tttcgagtac taacaaagct ggtttgaatg tccatctatc aggagtttgt 2100 taacaagtat tccctgtcta aaaccctgcg ttttgaactg atcccgcagg gcaaaacttt 2160 ggaaaacatt aaagcgcgtg gcctgattct ggatgacgaa aaacgtgcaa aggattacaa 2220 gaaagctaaa cagatcatcg acaaatatca ccagttcttt atcgaagaaa ttctgtcgtc 2280 ggtgtgcatc agtgaggatc tgttacagaa ttattctgat gtatacttta aacttaaaaa 2340 gtccgatgac gataatctgc aaaaagattt caagtcagcc aaagatacca tcaagaaaca 2400 gatctcagaa tatattaaag atagcgaaaa gttcaaaaac ctgtttaacc aaaacctcat 2460 tgatgctaag aaaggccaag aatctgacct gatcttatgg ctgaaacaga gcaaagataa 2520 cggcattgaa ctgttcaaag ctaatagcga catcaccgat attgatgaag cgctcgaaat 2580 catcaagtct ttcaaaggct ggacgacgta tttcaaaggt tttcatgaaa accgtaagaa 2640 tgtatattcg agcaacgata ttccgacctc tattatttat cgtatcgtgg acgacaacct 2700 gccgaagttt ctggaaaaca aagcgaaata tgaatctctg aaagacaaag caccggaagc 2760 tattaactat gaacagatca agaaagatct ggcggaagaa ctgaccttcg acatcgacta 2820 taaaacctcc gaagttaacc agcgtgtttt ctcactggac gaggttttcg aaatcgctaa 2880 tttcaacaat tacctgaatc aatctggcat caccaaattc aacaccatta ttggtggcaa 2940 atttgttaac ggcgaaaaca ccaagcgtaa gggcatcaac gaatacatta acctgtatag 3000 ccaacaaatc aacgacaaaa ccctgaaaaa gtataaaatg tccgttctgt ttaaacagat 3060 tttatcggac accgaatcta aatccttcgt aattgataaa ctggaagatg atagcgacgt 3120 tgtcaccacg atgcagagct tttatgagca gattgcggcg ttcaaaaccg tggaagagaa 3180 atctattaaa gaaactctgt ccctgctctt tgacgacctc aaagcgcaga aactagatct 3240 gtctaagatt tactttaaaa acgacaaatc tctgaccgat ctcagtcaac aagttttcga 3300 tgactatagc gtgatcggca cggcagtttt ggaatacatc acccaacaaa tcgcgccgaa 3360 aaatctggac aacccgtcca agaaggaaca ggaactgatt gcaaagaaaa cagaaaaagc 3420 taaatacctg agcttagaaa ctatcaaact ggcacttgag gaatttaata aacatcgtga 3480 tattgataaa cagtgtcgtt ttgaggaaat tctggcgaac tttgcggcaa tcccgatgat 3540 cttcgacgaa attgctcaaa acaaagacaa tctggcgcag atctctatca agtaccagaa 3600 tcagggtaag aaagatctgc ttcaagcatc tgcggaggac gatgtgaaag caattaaaga 3660 cttattagat cagacgaata acttattaca caagctcaaa atcttccaca tcagccagag 3720 cgaggacaag gcgaacattc tggataaaga tgaacacttc tatctggtgt tcgaagaatg 3780 ttacttcgaa ctggcaaaca tcgtccctct ctacaataaa atccgcaact acatcacgca 3840 gaagccttac tctgacgaga aattcaaact gaacttcgaa aacagcacgc tggcgaacgg 3900 ctgggataag aacaaagagc cggacaacac cgcaatcctg ttcatcaaag acgacaaata 3960 ctatctgggc gtaatgaaca agaagaacaa caagatcttc gacgataaag cgatcaaaga 4020 aaacaagggt gaaggctata agaaaatcgt gtacaagctc ctgccgggtg cgaataaaat 4080 gttaccgaaa gtgttctttt ccgcgaaaag catcaaattc tacaacccgt ctgaggatat 4140 tctgcgcatc cgcaatcata gcacgcacac taaaaacggt agcccgcaga aagggtatga 4200 aaaattcgaa tttaatatag aggactgccg taagttcatc gacttctata aacagagcat 4260 ttccaaacat ccggaatgga aagacttcgg cttccgtttc tctgacactc agcgctataa 4320 tagcatcgac gagttctacc gcgaagtgga gaatcagggc tataaactga ccttcgagaa 4380 cattagtgag tcgtacatcg actccgttgt gaatcagggt aaactgtacc tgtttcagat 4440 ctataataaa gactttagcg cgtacagcaa aggccgtccg aatctgcaca ccctttactg 4500 gaaagcatta tttgacgaac gtaacctgca agatgtggtg tataaactga acggtgaggc 4560 ggaacttttc taccgtaaac agagtatccc gaagaaaatc acgcatccgg caaaagaagc 4620 tattgccaac aaaaacaaag acaacccgaa gaaagaatca gtattcgaat atgacctgat 4680 caaagataaa cgtttcaccg aagataagtt ctttttccac tgtccgatta ccatcaactt 4740 caaatctagc ggtgcgaaca agttcaacga tgaaattaac ttattactga aagagaaagc 4800 taatgacgta cacatcttat ctattgatcg cggtgaacgt catttagcat actatacact 4860 ggtagatggt aaaggtaata ttattaaaca ggatactttc aatattatcg gtaatgaccg 4920 tatgaaaacc aactatcacg ataagctggc ggcgatcgaa aaagatcgtg attctgcgcg 4980 taaagattgg aagaaaatta acaatatcaa agaaatgaaa gaaggctatc tgagccaagt 5040 ggtgcacgag atcgcaaaac tggtgattga atataacgct atcgtggttt tcgaagatct 5100 gaactttggt tttaaacgtg gtcgcttcaa agtagaaaaa caggtgtacc aaaaactgga 5160 aaaaatgctg attgaaaaac tgaactatct ggtttttaaa gacaacgaat ttgacaaaac 5220 gggtggcgta ctccgtgcct atcagctgac cgctccgttc gaaacgttca agaaaatggg 5280 taaacaaacg gggattatct attatgtgcc agctggtttc acctccaaga tttgtccagt 5340 tacgggcttc gttaaccagc tgtacccgaa atacgagagc gttagcaaat ctcaagaatt 5400 tttcagcaaa ttcgacaaga tctgctataa tctggataaa ggctatttcg agttcagctt 5460 cgattacaaa aacttcggcg ataaagcggc taaaggtaag tggactattg ctagctttgg 5520 tagccgtctg attaactttc gcaactccga caaaaaccat aattgggaca cgcgtgaagt 5580 gtatccgacc aaagaactgg aaaaattact gaaagactat tccatcgaat atggtcatgg 5640 ggagtgcatt aaagcggcga tttgcggtga atccgataag aaatttttcg ccaaactgac 5700 cagcgtgctt aacaccattc tgcaaatgcg taattctaaa acgggtacgg agctggacta 5760 cctgatttct ccggtagccg acgttaacgg caacttcttc gattctcgtc aagcaccgaa 5820 aaatatgcca caagacgcgg atgccaacgg tgcataccat atcggcttaa aaggcttaat 5880 gttattaggc cgtatcaaga ataatcagga gggcaagaaa ttaaatctgg ttatcaaaaa 5940 cgaagaatac ttcgagttcg ttcagaatcg taacaattaa tgtatgctta agcagctcgg 6000 taccaaagac gaacaataag acgctgaaaa gcgtcttttt tcgttttggt cctgttgcgg 6060 cgcgatagtg tgaacatgct atagacttct ggtgctaccc gactgacaat taatcatccg 6120 gctcgtataa tgctagcaat ttctactgtt gtagatgcca gctggcgtaa tagcgaagag 6180 tcgagacgaa caataaggcc tccctaacgg ggggcctttt ttattgataa caaaagtaaa 6240 gccgaacgcc ccaaaaagcc tcgctttcag cacctgtcgt ttcctttctt ttcagagggt 6300 attttaaata aaaacattaa gttatgacga agaagaacgg aaacgcctta aaccggaaaa 6360 ttttcataaa tagcgaaaac ccgcgaggtc gccgccccgt aacctgtcgg atcaccggaa 6420 aggacccgta aagtgataat gattatcatc tacatatcac aacgtgcgta aagggactag 6480 tggattgcat acctttggtc gaaaaaaaaa gcccgcactg tcaggtgcgg gcttttttca 6540 gtgtttcctt gccggattac gccccgccct gccactcatc gcagtattgt tgtaattcat 6600 taagcattct gccgacatgg aagccatcac aaacggcatg atgaacttgg atcgccagtg 6660 gcattaacac cttgtcgcct tgcgtataat attttcccat agtgaaaacg ggggcgaaga 6720 agttgtccat atttgctacg tttaaatcaa aactggtgaa actcacccac ggattggcac 6780 tgacgaaaaa catattttcg ataaaccctt tagggaaata tgctaagttt tcaccgtaac 6840 acgccacatc ttgactatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg tattctgacc 6900 agagcgatga aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat 6960 cccatatcac cagctcaccg tctttcattg ccatacgaaa ctccggatgt gcattcatca 7020 ggcgggcaag aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc tttacggttt 7080 ttaaaaaggc cgtaatatcc agctgaacgg tttggttata ggtgcactga gcaactgact 7140 ggaatgcctc aaaatgttct ttacgatgcc attgacttat atcaactgta gtatatccag 7200 tgattttttt ctccatttta gcttccttag cttgcgaaat ctcgataact caaaaaatag 7260 tagtgatctt atttcattat ggtgaaagtt gtcttacgtg caacattttc gcaaaaagtt 7320 ggcgctttat caacactgtc cctcctgttc agctactgac ggtactgcgg aactgactaa 7380 agtagtgcgt aac 7393 <210> 10 <211> 5119 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> plasmid encoding the SrpR repressor protein <400> 10 gtaaaccagc aatagacata agcggctatt taacgaccct gccctgaacc gacgaccggg 60 tcatcgtggc cggatcttgc ggcccctcgg cttgaacgaa ttgttagaca ttatttgccg 120 actaccttgg tgatctcgcc tttcacgtag tggacaaatt cttccaactg atctgcgcgc 180 gaggccaagc gatcttcttc ttgtccaaga taagcctgtc tagcttcaag tatgacgggc 240 tgatactggg ccggcaggcg ctccattgcc cagtcggcag cgacatcctt cggcgcgatt 300 ttgccggtta ctgcgctgta ccaaatgcgg gacaacgtaa gcactacatt tcgctcatcg 360 ccagcccagt cgggcggcga gttccatagc gttaaggttt catttagcgc ctcaaataga 420 tcctgttcag gaaccggatc aaagagttcc tccgccgctg gacctaccaa ggcaacgcta 480 tgttctcttg cttttgtcag caagatagcc agatcaatgt cgatcgtggc tggctcgaag 540 atacctgcaa gaatgtcatt gcgctgccat tctccaaatt gcagttcgcg cttagctgga 600 taacgccacg gaatgatgtc gtcgtgcaca acaatggtga cttctacagc gcggagaatc 660 tcgctctctc caggggaagc cgaagtttcc aaaaggtcgt tgatcaaagc tcgccgcgtt 720 gtttcatcaa gccttacggt caccgtaacc agcaaatcaa tatcactgtg tggcttcagg 780 ccgccatcca ctgcggagcc gtacaaatgt acggccagca acgtcggttc gagatggcgc 840 tcgatgacgc caactacctc tgatagttga gtcgatactt cggcgatcac cgcttccctc 900 atctagtagg tttcctgtgt gactctagta ttattcgaag gatttcacct gtttaatctg 960 tgcttcttca cacagcagaa aacgaggcgg ttcacgcagc agtgcccaaa agctacccag 1020 tgcaactttg ataatctgtg cctgctgatc tttgctacgc agaccttcat acagcagacc 1080 ggtaatcaga cctttaaaaa caccaatgct ggtctgcaga tccagattaa tcggcagttc 1140 accctgggta actgcatgac gcagaacctg atgaatatac tgcagaaaac gatcgcttgc 1200 ctgaaccata cgattatgaa tcagaccgct ttcatccaga ccctgataaa tcagaatttc 1260 gctaaactgt ttgctctgcg gactatgaac tgcatccagc attgcaacaa caactgcttc 1320 ccagctacgt tcaataccca gatccggtgt aaaatccagt tccagcggat gctgacggct 1380 tgccagaact gcctgcagaa cttccagttt accattaaaa tgccaataaa ctgcaccacg 1440 ggtaacaccg gctttacgtg caatctgatc cagggttgca tcactaacac cctgtgcaac 1500 aaaaacttcc agtgctgcat caataatacg ctgacgggtt tcttctgctt ctgctgcggt 1560 tttacgtgcc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct 1620 catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagcta gctcactcgg 1680 tcgctacgct ccgggcgtga gactgcggcg ggcgctgcgg acacatacaa agttacccac 1740 agattccgtg gataagcagg ggactaacat gtgaggcaaa acagcagggc cgcgccggtg 1800 gcgtttttcc ataggctccg ccctcctgcc agagttcaca taaacagacg cttttccggt 1860 gcatctgtgg gagccgtgag gctcaaccat gaatctgaca gtacgggcga aacccgacag 1920 gacttaaaga tccccaccgt ttccggcggg tcgctccctc ttgcgctctc ctgttccgac 1980 cctgccgttt accggatacc tgttccgcct ttctccctta cgggaagtgt ggcgctttct 2040 catagctcac acactggtat ctcggctcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgta 2100 agcaagaact ccccgttcag cccgactgct gcgccttatc cggtaactgt tcacttgagt 2160 ccaacccgga aaagcacggt aaaacgccac tggcagcagc cattggtaac tgggagttcg 2220 cagaggattt gtttagctaa acacgcggtt gctcttgaag tgtgcgccaa agtccggcta 2280 cactggaagg acagatttgg ttgctgtgct ctgcgaaagc cagttaccac ggttaagcag 2340 ttccccaact gacttaacct tcgatcaaac cacctcccca ggtggttttt tcgtttacag 2400 ggcaaaagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc actcttcctt 2460 tttcaatatt attgaacctg aggtctgttt atcgaattaa ttgcagatat aaaaaaacca 2520 accgtaaggg ttggtttttt cttgggattt ttggtcggca cgagaggatt tgaacctccg 2580 acccccgaca ccccatgacg gtgcgctacc aggctgcgct acgtgccgac tcgtggctgc 2640 taatactacc gttttccaca ccgattgcaa gtaagatatt tcgctaactg atttataatt 2700 aatcagttag cgataaaacg cttctcgtac aacgctttct ggtgaatggt gcgggaggcg 2760 agacttgaac tcgcacacct tgcggcgcca gaacctaaat ctggtgcgtc taccaatttc 2820 gccactcccg caaaaaaaga tggtggctac gacgggattc gaacctgtga ccccatcatt 2880 atgagtgatg tgctctaacc aactgagcta cgtagccatc ttttttttcg cgatacctta 2940 tcggcgttgc ggggcgcatt atgcgtatag agccttgcag cgtcaacctc tttttcaagg 3000 aaaattgctc gaaagtgact gtttggttag gttgcgaaca gcgaaccatg acgaactgta 3060 aatctacgga atgcttgata ttcaggggat ttttgcggac tggtacggat gggagcgaac 3120 tgataaatgg tgtcccctgc aggaatcgaa cctgcaatta gcccttagga ggggctcgtt 3180 atatccattt aactaagagg acaatgcggc atgagtatac ccgctaatgg agtgcggggt 3240 aagtacgttg ccgctcgatt gcttaaaccc tcgccattta tgccgggttt ttataatttt 3300 tcttaatgtt ttccgcacgt tctgcttttt ggacgtcatc gattgtccct ctaagacacg 3360 gataaatcgg tgatatcacc acatcaacca ggcaacatgc ccgacttgtt gaatgcaata 3420 aacagaagga aaaaacaggg aggagaaaag aagtggtgct gataggcaga ttcgaactgc 3480 cgacctcacc cttaccaagg gtgcgctcta ccaactgagc tatatcagca catcttggag 3540 cgggcagcgg gaatcgaacc cgcatcatca gcttggaagg ctgaggtaat agccattata 3600 cgatgcccgc atcctggaac tcggctacct gattttcatt ctgcactgaa tatcgagaga 3660 agctctcttt attcgagccg gtaagcgaac ttatcgtctc gggctacgcc atcgcgtggc 3720 cgaaattggt ggtgggggaa ggattcgaac cttcgaagtc tgtgacggca gatttacagt 3780 ctgctccctt tggccgctcg ggaaccccac cggacttgat ggtgccgact accggaatcg 3840 aactggtgac ctactgatta caagtcagtt gctctaccta ctgagccaag tcggcatcaa 3900 gtagcgcgca ctctatggag acatgcgagt tcatgcaact aaaaaattgc ataatttgtt 3960 ttattggtca cattttatgc gacacgatga agaaacagcc taggtacctc atgagcccga 4020 agtggcgagc ccgatcttcc ccatcggtga tgtcggcgat ataggcgcca gcaaccgcac 4080 ctgtggcgcc ggtgatgccg gccacgatgc gtccggcgta gaggatccgt cacataccaa 4140 ggcggctaag cgagcagatg gaacatcaac gcctgcggtc aggaagatgc gcatcgacag 4200 caagacatca tggctatcag cttgtcgtcg tgcaggaatt gaagatttcc gtttccatga 4260 cctcagacac acctgggcaa gctggctgat tcagtcaggc gtcccattat cagtgcttca 4320 ggaaatgggc ggatgggagt ccatagaaat ggttcgtagg tatgctcacc ttgcgcctaa 4380 tcatttgaca gagcatgcga ggaaaataga cgacattttt ggtgataatg tcccaaatat 4440 gtcccactct gaaattatgg aggatataaa gaaggcgtaa ctgattgaat tgtaatggcg 4500 cgccctgcag gattcgaacc tgcggcccac gacttagaag gtcgttgctc tatccaactg 4560 agctaagggc gcgttgatac cgcaatgcgg tgtaatcgcg tgaattatac ggtcaaccct 4620 tgctgagtca atggcttttg atctggttgc tgaacaagtg aacgaccgcg tctgattttc 4680 tgatttattt cgctatagcg gcaaacaaac gcacaccgct gcgcgtctga atcaagaaaa 4740 cccgtatttt catgtatcaa agtgacctgc agccaagctt ggattgcgac acggagttac 4800 tttataatcc aatcgattgg ccccttagct cagtggttag agcaggcgac tcataatcgc 4860 ttggtcgctg cttcaagtcc agcaggggcc accagcggcc gcaaaggctg acgagaaatc 4920 gtcagccttt ttaagcttta agccgaattc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc 4980 cgagctcggt accaagctta tcgatgataa gctgtcaaac atgagaatta caacttatat 5040 cgtatggggc tgacttcagc tgaaacctca ggcatttgag aagcacacgg tcacactgct 5100 tccggtagtc aataaaccg 5119 <210> 11 <211> 12335 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasmid comprising the PsrpR-Cpf1-LacZ circuit <400> 11 ctaatctctt gcccccgccc gtaatagcct ccaagagatt gaagatagta aagggcaaga 60 gctgattcgg cgttgaagga tagcggactt tcggtcaacc acaattcccc actcgacaaa 120 accagccgtg cgaataactc tgaaagtaca agcaacccaa gagggctgag cctaaactca 180 gctaattcct aagtgagcta aagactcgaa gtgacagctc ttaataaata gagcgggaac 240 gtcgaacggt cgtgaaagta atagtacaac gggtattaac ttactgagga tattgcttga 300 agctgtaccg ttttattggg tgaacgaata agatccagca attcagccaa agaagctacc 360 aatttttagt ttaagagtgt cacgtctgac ctcgcgggta gattgccgaa cgtagagctt 420 acgagccagc ggaaacagta gccgcaggat aagtaagggg agtaagtgat 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ttcaatcgaa ggtactccta ctcagactgc ctcacaccca gctagtcact gagcgataaa 1380 attgacccgc cctctaggga agcgagtacg tcccaaaggg ctccggacag ggctatatag 1440 gagagtttga tctcgccccg acaactgcaa ccctcaactc ccttagataa tattgttagc 1500 cgaagttgca cgacccgccg tccacggact gctcttaggg tgtggctcct taatctgaca 1560 acgtgcaacc cctatcgaag tcgattgttt ctgcgaaagg tgttgtccta atagtcccga 1620 aatttggccc ttgtaggtgt gaaaccactt agcttcgcgc cgtagtccta aaggcccacc 1680 tattgacttt gtttcgggta gcactaggaa tcttaacaat ttgaatttgg acgtggaacg 1740 cgtacacctt aatctccgaa taattctagg gatttggaag tcctctacgt tgacacacct 1800 acactgctcg aagtaaatat acgaataacg cgggcctcgc ggagccgttc cgaatcgtca 1860 cgtgttcgtt tactgttaat tggtggcaaa taagcaatat cgtagtccgt caggcccagc 1920 cctgttatcc acggcgttat ttgtcaaatt gcgtagaact ggattgactg cctgacaata 1980 cctaattatc ggtacgaagt ccccgaatct gtcgggctat ttcactaata ctttccaaac 2040 gccccgtatc caagaagaac gaatttatcc acgctcccgt ctttgggacg aataccgcta 2100 caagtggaca gaggatcggt acgggcctct aataaatcca acactctacg ccctcttcaa 2160 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Claims (44)

  1. 유전자 회로를 도너 세포로부터 표적 세포로 전달하는 방법으로서, 표적 세포로 유전자 회로의 전달을 허용하기에 충분한 시간량 동안 표적 세포와 도너 세포를 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 도너 세포는 유전자 회로에 의해 코딩되지 않고, 표적 세포에 부재하는 리프레서 단백질을 발현하고, 유전자 회로는 리프레서 결합 서열의 전사 제어 하에 관심 핵산 서열을 포함하는 것인 전달 방법.
  2. 제1항에 있어서, 도너 세포는 박테리아 도너 세포이고 표적 세포는 박테리아 표적 세포인 전달 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 유전자 회로는 전달 이전에 박테리아 전달 비히클에 패키징되는 것인 전달 방법.
  4. 제3항에 있어서, 전달 비히클에 패키징된 유전자 회로는 패키징된 파지미드인 전달 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 핵산 서열은 관심 단백질 및/또는 관심 RNA 분자를 코딩하는 것인 전달 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 핵산 서열은 관심 단백질을 코딩하는 것인 전달 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 관심 단백질은 독성 단백질인 전달 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 독성 단백질은 박테리아 세포, 바람직하게 표적 세포에 독성인 전달 방법.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 뉴클레아제, 바람직하게 CRISPR 뉴클레아제인 전달 방법.
  10. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 독성 단백질은 홀린, 엔도리신, 제한 효소 또는 표적 세포의 생존 또는 성장에 영향을 미치는 독소로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 전달 방법.
  11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 단백질은 치료 단백질인 전달 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 핵산 서열은 관심 RNA 분자를 코딩하는 것인 전달 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 관심 RNA 분자는 mRNA, crRNA, tRNA, iRNA, asRNA, 리보자임 RNA, 가이드 RNA 및 RNA 압타머로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 전달 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 관심 RNA 분자는 asRNA인 전달 방법.
  15. 제12항에 있어서, 상기 관심 RNA 분자는 가이드 RNA인 전달 방법.
  16. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 핵산 서열은 CRISPR 뉴클레아제를 코딩하고 유전자 회로는 가이드 RNA를 코딩하는 핵산 서열을 더 포함하는 것인 전달 방법.
  17. 제16항에 있어서, 가이드 RNA를 코딩하는 핵산 서열은 항상성 프로모터의 전사 제어 하에 있는 것인 전달 방법.
  18. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 핵산 서열은 RNA 예컨대 mRNA, crRNA, tRNA, iRNA (간섭 RNA), asRNA (안티-센스 RNA), 리보자임 RNA, RNA 압타머 또는 가이드 RNA를 코딩하는 핵산, CRISPR 유전자좌, 독소 유전자, 효소 예컨대 뉴클레아제 또는 키나제를 코딩하는 유전자, Cas 뉴클레아제, Cas9 뉴클레아제, TALEN, ZFN 및 메가뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레아제를 코딩하는 유전자, 리콤비나제, 박테리아 수용체, 막 단백질, 구조 단백질 또는 분비 단백질을 코딩하는 유전자, 항생제 또는 일반 약물에 대한 내성을 코딩하는 유전자, 독성 단백질 또는 독성 인자를 코딩하는 유전자, 및 병독성 단백질 또는 병독성 인자를 코딩하는 유전자, 또는 임의의 그들 조합인 전달 방법.
  19. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 핵산 서열은 다음 중 하나 이상을 코딩하는 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 전달 방법: Cas 뉴클레아제, Cas9 뉴클레아제, 가이드 RNA, CRISPR 유전자좌, 독소, 효소, 뉴클레아제, 키나제, TALEN, ZFN, 메가뉴클레아제, 리콤비나제, 박테리아 수용체, 막 단백질, 구조 단백질, 분비 단백질, 항생제 또는 약물 내성 부여 단백질, 독성 단백질 또는 독성 인자, 병독성 단백질, 및 병독성 인자.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 리프레서 단백질은 표 1에 열거된 리프레서 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게 PhlF, SrpR, LitR, PsrA, AmeR, McbR, QacR, TarA, ButR, Orf2 및 ScbR로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 전달 방법.
  21. 도너 세포로서, 상기 도너 세포에 의해 발현되지만 유전자 회로에 의해 코딩되지 않는 리프레서 단백질에 의해 제어되는 전사 프로모터를 포함하는 유전자 회로를 포함하는 것인 도너 세포.
  22. 제21항에 있어서, 유전자 회로는 전사 프로모터 제어 하에 위치된, 특히 제5항 내지 제19항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은, 관심 핵산 서열을 포함하는 것인 도너 세포.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 도너 세포는 박테리오파지 입자로 유전자 회로의 조립을 위해 요구되는 박테리오파지 성분을 트랜스로 제공하는 프로파지 서열을 포함하는 것인 도너 세포.
  24. 제23항에 있어서, 유전자 회로는 캡시드로 유전자 회로의 캡시드화를 매개하는 시스 작용성 패키징 신호를 포함하는 것인 도너 세포.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 회로는 파지미드인 전달 방법 또는 도너 세포.
  26. 제1항 내지 25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 도너 세포는 박테리아 세포인 전달 방법 또는 도너 세포.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 도너 세포는 이. 콜라이 (E.coli) 종으로부터의 박테리아 세포인 전달 방법 또는 도너 세포.
  28. 제3항의 방법으로 수득된 유전자 회로를 포함하는 전달 비히클.
  29. 제28항에 있어서, 상기 전달 비히클은 박테리아 전달 비히클, 바람직하게 박테리오파지인 전달 비히클.
  30. 전달 비히클을 제조하는 방법으로서,
    (i) 리프레서 단백질을 발현하는 도너 세포로 유전자 회로를 도입시키는 단계로서, 상기 유전자 회로는 상기 리프레서 단백질에 의해 인식되는 리프레서 결합 서열의 전사 제어 하의 관심 핵산을 포함하고 리프레서 단백질은 유전자 회로에 의해 코딩되지 않는 것인, 단계; 및
    (ii) 관심 유전자 회로의 복제 및 전달 비히클로 유전자 회로의 패키징을 위한 충분한 시간량을 허용하는 단계
    를 포함하는 것인 제조 방법.
  31. 제30항에 있어서, 전달 비히클을 수집하는 단계를 더 포함하는 것인 제조 방법.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 전달 비히클을 정제하는 단계를 더 포함하는 것인 제조 방법.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 도너 세포, 바람직하게 박테리아 도너 세포는 전달 비히클로 유전자 회로의 조립을 위해 트랜스로 요구되는 단백질을 코딩하는 프로파지 서열을 포함하는 것인 제조 방법.
  34. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 회로는 파지미드인 제조 방법.
  35. 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 전달 비히클은 박테리아 전달 비히클, 바람직하게 박테리오파지인 제조 방법.
  36. 제30항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 전달 비히클은 리프레서 단백질을 발현하지 않는, 표적 세포, 바람직하게 박테리아 표적 세포에서 사용하기 위한 것인 제조 방법.
  37. 제30항 내지 제36항 중 어느 한 항의 방법으로 수득된 전달 비히클.
  38. 리프레서 단백질에 의해 제어되는 전사 프로모터 및 상기 전사 프로모터의 제어 하에 위치되는 관심 핵산 서열을 포함하는 유전자 회로로서, 상기 유전자 회로는 리프레서 단백질을 코딩하지 않고 박테리아 전달 비히클 내에 패키징되는 것인 유전자 회로.
  39. 제38항에 있어서, 상기 유전자 회로는 파지미드인 유전자 회로.
  40. 유전자 회로를 도너 세포로부터 표적 세포로 전달하기 위한, 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항의 전달 비히클 또는 유전자 회로의 용도로서, 도너 세포는 리프레서 단백질을 발현하고, 표적 세포는 상기 리프레서 단백질을 발현하지 않는 것인, 용도.
  41. 제28항, 제29항 또는 제37항 중 어느 한 항의 전달 비히클, 및/또는 제38항 또는 제39항의 유전자 회로, 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 또는 수의학 조성물.
  42. 관심 전달 비히클을 제조하기 위한 키트로서, 상기 키트는 (i) 리프레서 단백질을 발현하는 도너 세포; 및 (ii) 관심 핵산이 삽입되는 발현 카세트 및 리프레서 단백질이 결합하여 관심 핵산의 발현을 억제하는 리프레서 결합 서열을 포함하는 유전자 회로를 포함하는 것인 키트.
  43. 제42항에 있어서, 리프레서 단백질을 발현하지 않아서, 표적 세포로 전달 후 관심 핵산의 발현을 허용하는 것인 표적 세포를 더 포함하는 것인 키트.
  44. 관심 핵산이 삽입되는 발현 카세트 및 리프레서 단백질이 결합하여 관심 핵산의 발현을 억제하는 리프레서 결합 서열을 포함하는 유전자 회로를, 도너 세포로부터 표적 세포로 전달을 위한, 제42항 또는 제43항에 따른 키트의 용도로서, 상기 도너 세포는 리프레서 단백질을 발현하고 상기 표적 세포는 상기 리프레서 단백질을 발현하지 않는 것인, 용도.
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